UA125373C2 - Вектор аденоасоційованого вірусу для лікування мукополісахаридозів - Google Patents
Вектор аденоасоційованого вірусу для лікування мукополісахаридозів Download PDFInfo
- Publication number
- UA125373C2 UA125373C2 UAA201711584A UAA201711584A UA125373C2 UA 125373 C2 UA125373 C2 UA 125373C2 UA A201711584 A UAA201711584 A UA A201711584A UA A201711584 A UAA201711584 A UA A201711584A UA 125373 C2 UA125373 C2 UA 125373C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- plasmid
- mice
- vectors
- vector
- see
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 190
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 title description 12
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 title description 12
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title description 11
- 208000022018 mucopolysaccharidosis type 2 Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 126
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 115
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 101
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 67
- 102100029199 Iduronate 2-sulfatase Human genes 0.000 claims description 66
- 101710096421 Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 claims description 63
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 26
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 10
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 6
- 230000007958 sleep Effects 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 101150085094 ger gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150057323 sar gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 claims 2
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 claims 1
- 235000003913 Coccoloba uvifera Nutrition 0.000 claims 1
- 241000283014 Dama Species 0.000 claims 1
- 240000008187 Erythrina edulis Species 0.000 claims 1
- 235000002757 Erythrina edulis Nutrition 0.000 claims 1
- 241000630665 Hada Species 0.000 claims 1
- 238000001037 Mansfield, Rhim, Elleman, Vaughn pulse sequence Methods 0.000 claims 1
- 241001291562 Martes pennanti Species 0.000 claims 1
- 101100291238 Mus musculus Mia gene Proteins 0.000 claims 1
- 101800001776 Nuclear inclusion protein B Proteins 0.000 claims 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 claims 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 claims 1
- 241000036848 Porzana carolina Species 0.000 claims 1
- 240000008976 Pterocarpus marsupium Species 0.000 claims 1
- 241000750042 Vini Species 0.000 claims 1
- 206010048232 Yawning Diseases 0.000 claims 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 claims 1
- JNSGIVNNHKGGRU-JYRVWZFOSA-N diethoxyphosphinothioyl (2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetate Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC(=O)C(=N/OC)\C1=CSC(N)=N1 JNSGIVNNHKGGRU-JYRVWZFOSA-N 0.000 claims 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 23
- 201000002273 mucopolysaccharidosis II Diseases 0.000 abstract description 14
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 46
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 26
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 22
- POQOTWQIYYNXAT-UHFFFAOYSA-N 5-Acetylamino-6-amino-3-methyluracil Chemical compound CC(=O)NC1=C(N)NC(=O)N(C)C1=O POQOTWQIYYNXAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 18
- 101000840540 Homo sapiens Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 17
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 16
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 15
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 15
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 101000840537 Mus musculus Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 description 13
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 13
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 229960002396 idursulfase Drugs 0.000 description 5
- 108010072166 idursulfase Proteins 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000012346 open field test Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100025511 Anti-Muellerian hormone type-2 receptor Human genes 0.000 description 4
- 101710089052 Anti-Muellerian hormone type-2 receptor Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 230000007346 lysosomal pathology Effects 0.000 description 4
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 3
- 108010003381 Iduronidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004627 Iduronidase Human genes 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005068 bladder tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710170231 Antimicrobial peptide 2 Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000997494 Oneirodidae Species 0.000 description 2
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 2
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 2
- 231100000871 behavioral problem Toxicity 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 2
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 2
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N mmai Chemical compound C1=C(C)C(OC)=CC2=C1CC(N)C2 JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100035028 Alpha-L-iduronidase Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 101000742346 Crotalus durissus collilineatus Zinc metalloproteinase/disintegrin Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101000872559 Hediste diversicolor Hemerythrin Proteins 0.000 description 1
- 102000016870 Hexosaminidase B Human genes 0.000 description 1
- 108010053345 Hexosaminidase B Proteins 0.000 description 1
- 101001019502 Homo sapiens Alpha-L-iduronidase Proteins 0.000 description 1
- 101001045440 Homo sapiens Beta-hexosaminidase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000960969 Homo sapiens Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010023230 Joint stiffness Diseases 0.000 description 1
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 1
- XMTCKNXTTXDPJX-REOHCLBHSA-N L-3-oxoalanine Chemical compound O=C[C@H](N)C(O)=O XMTCKNXTTXDPJX-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241001406422 Leucaena retusa Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010056886 Mucopolysaccharidosis I Diseases 0.000 description 1
- 208000028781 Mucopolysaccharidosis type 1 Diseases 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- -1 NEHV Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 1
- 229910003079 TiO5 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000021022 X-linked recessive inheritance Diseases 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000808 adrenergic beta-agonist Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007177 brain activity Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940094517 chondroitin 4-sulfate Drugs 0.000 description 1
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 229940019765 dermatin Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- HDRXZJPWHTXQRI-BHDTVMLSSA-N diltiazem hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(OC)=CC=C1[C@H]1[C@@H](OC(C)=O)C(=O)N(CC[NH+](C)C)C2=CC=CC=C2S1 HDRXZJPWHTXQRI-BHDTVMLSSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- FEBLZLNTKCEFIT-VSXGLTOVSA-N fluocinolone acetonide Chemical compound C1([C@@H](F)C2)=CC(=O)C=C[C@]1(C)[C@]1(F)[C@@H]2[C@@H]2C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]2(C)C[C@@H]1O FEBLZLNTKCEFIT-VSXGLTOVSA-N 0.000 description 1
- ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N gamma-cyhalothrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](\C=C(/Cl)C(F)(F)F)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 206010019847 hepatosplenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000055228 human IL5 Human genes 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000037450 immune related reaction Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000007925 intracardiac injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 229940124625 intravenous corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000007388 microgliosis Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009251 neurologic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000015015 neurological dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940102240 option 2 Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 208000014451 palmoplantar keratoderma and congenital alopecia 2 Diseases 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007331 pathological accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009613 pulmonary function test Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000006403 short-term memory Effects 0.000 description 1
- 238000011947 six minute walk test Methods 0.000 description 1
- 231100001055 skeletal defect Toxicity 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
- C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується рекомбінантного аденовірусасоційованого вектора та фармацевтичної композиції, що його містить, для лікування розладів, а саме для лікування мукополісахаридозів типу II.
Description
(57) Реферат:
Винахід стосується рекомбінантного аденовірусасоційованого вектора та фармацевтичної композиції, що його містить, для лікування розладів, а саме для лікування мукополісахаридозів типу Ії.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується векторів, які застосовують для експресії потрібних білків, та їх застосування у генній терапії. Даний винахід також стосується векторів та нуклеїновокислотних послідовностей, які можуть сприяти лікуванню мукополісахаридозів (МР), зокрема, лікуванню мукополісахаридозів типу ІЇ або синдрому Хантера.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Лізосома є органелою, яка міститься у цитоплазмі тваринних клітин, що містить понад 50 гідролаз, які розщеплюють біомолекули під час рециклінгу зношених клітинних компонентів або після поглинання вірусів та бактерій. Ця органела містить кілька типів гідролітичних ферментів, включаючи протеази, нуклеази, глікозидази, ліпази, фосфоліпази, фосфатази та сульфатази.
Усі ферменти є кислими гідролазами.
Лізосомальні хвороби накопичення (50) викликаються генетичними порушеннями, які впливають на один або кілька лізосомальних ферментів. Ці генетичні хвороби в цілому є результатом дефіциту активності конкретного ферменту, присутнього у лізосомі. Меншою мірою ці хвороби можуть бути спричинені дефіцитом білків, задіяних у лізосомальному біогенезі.
Ї5О поодинці трапляються рідко, але у групі ці порушення серед населення в цілому є порівняно частими. Комбіноване поширення 50 становить приблизно 1 випадок на 5000 живонароджених. Див. МеїКіе Р, єї аІ., "АМА 1999; 281: 249 - 254. Однак деякі групи серед загального населення особливо страждають від високої частоти випадків 50. Наприклад, поширення хвороб Гоше та Тея-Сакса серед нащадків євреїв Центральної та Східної Європи (ашкеназів) становить 1 випадок на кожні 600 та 1 випадок на кожні 3900 живонароджених, відповідно.
Мукополісахаридози І типу (МР5БІІ), також відомий як синдромом Хантера і вперше описаний Др. Чарльзом Хантером, є хронічними, прогресуючими та мультисистемними 150, спричиненим дефіцитом або відсутністю активності ферменту ідуронат-2-сульфатази (105), що кодується геном ІЮ5 і залучений до лізосомальної поетапної деградації глікозаміногліканів (САС) гепарансульфату (Н5) і дерматансульфату (05), що призводить до їх патологічного накопичення. Див. Нипіег, Ргос К 5ос Меа. 1917; 10 (Зесї Бішау Оі5 Спа): 104-16. Внаслідок Х- пов'язаної рецесивної спадковості, майже всі пацієнти Хантера є чоловіками, хоча деякі жінки з синдромом Хантера були зафіксовані в літературі. Див. Мо55тап еї аї., Агсй Оів Сн. 1983; 58:911-915, СсиПеп-Мама!то еї аї., Огрпапеї У Ваге Оів. 2013; 25(8):92, Маївїаг еї аї., 9. ІпНегтії.
Мегар. рів. 2008; 31(2):240-52.
МРІЇ характеризується клінічно як прогресуюча невропатія центральної нервової системи (ЦНС), що виникає в дитинстві. Діти Хантера, як правило, є звичайними при народженні і симптоми розвивають до досягнення 2-річного віку. Див. Зспуагтл еї аї., Асіа Редіаніс Зиррі. 2007; 96: 63-70. Клінічний перебіг звичайно починається з повільно-прогресуючого когнітивного порушення, з яким виникають поведінкові проблеми та прогресуючий інтелектуальний спад.
Втрата рухливості відбувається пізніше. На додаток до неврологічних симптомів, пацієнти з
МРІЇ страждають на неневрологічні зміни, включаючи рецидивуючі інфекції вух, носа, горла та грудної клітки, часта діарея та запор, серцева недостатність, грубі риси обличчя, малий зріст, прогресуюча жорсткість суглобів та дегенерація, скелетні аномалії, які впливають на рухливість, а також гепатоз і спленомегалія. Див. Мешей апа Миеплег, "пе Мисороїузасспагідозев" в
Зсіімег С, єї аїЇ., Ед5., "Пе теїароїїс апа тоїіесшіаг Бавзібв ої іпнепіей дізвазе", МеаСтгам/-НІЇ
Рибріїзпіпуд Со., Мем Моїк, МУ, 05, 2001, рр. 3421 - 3452. Спектр клінічних проявів захворювання значно варіюється в залежності від залишкових рівнів активності ІО5 у пацієнта, який у свою чергу визначається основною мутацією гену ІО5, з »300 мутаціями гену ІЮ5, описаним до сьогодні (перли. пдта.сї.ас.иК/ас/депе.рпр?"депе-І05). Загалом, описано дві клінічні форми
МРІЇ. Найважча форма, починаючи від 18 місяців до 4-річного віку, у три рази частіша, ніж легка форма, і характеризується грубими рисами обличчя, скелетними деформаціями, гепатоспленомегалією та неврологічним втручанням, що призводить до розумової відсталості.
Див. Умгайй еї аїІ., ЕЄиг / Редіаїг. 2008; 167(3):267-277. Пацієнти зазвичай помирають під час другого десятиліття життя через обструктивні захворювання дихальних шляхів та серцеву недостатність. Див. Умгайй еї аї., Єиг у Реаіаїг. 2008; 167(3):267-277; Мешеїа апа Миеп2ег, вище.
Крім того, у підгрупі пацієнтів з МРОЇЇ також відзначалася більш повільно прогресуюча форма захворювання з пізнішим проявом, більш тривале виживання і мінімальна неврологічна дисфункція, відома як аттенуйований фенотип. Див. Умгайй еї а!., Єиг У Редіаїг. 2008; 167(3):267- 277, Мешеїа апа Миеп2ег, вище.
До недавнього часу не існувало спеціальної схваленої терапії для синдрому МРІЇ і єдиним доступним лікуванням було симптоматичне застосування широкого спектру неспецифічних бо препаратів для профілактики та лікування ускладнень захворювання. В останні кілька років стали доступними два основних терапевтичних варіанти: замісна терапія ферментами (ЕКТ) та трансплантація гематопоетичних стовбурових клітин (НЗСТ). Конструкція обох терапевтичних стратегій спирається на можливість крос-корекції, виходячи з того, що нормальними клітинами виділяються значні кількості маноза-6-фосфатних (МбР)-закріплених розчинних лізосомальних ферментів, таких як ІО5, які потім можуть бути узяті з позаклітинних відділень іншими клітинами через МбР рецептори на плазматичній мембрані і орієнтовані на лізосоми. Див. Епп5 еї аї.,
Мешйго5игу Босиб5. 2008; 24(3-4):Е12. Крім того, існує поріг залишкової ферментативної активності, зазвичай дуже низький, над яким клітина здатна впоратися з притоком субстрату, і суб'єкти не піддаються впливу хвороби, що свідчить про те, що відновлення нормальної активності не є необхідним для модифікації клінічного курсу. Див. Мешгеід, Аппи Кем Віоспет. 1991; 60:257-80.
З моменту схвалення Управлінням з контролю харчових продуктів та лікарських засобів (ЕОА) у 2006 р. та Європейським агентством з лікарських засобів (ЕМА) у 2007 р. рекомбінантна людська ідуронат-2-сульфатаза (Ідигзиазе, ЕГАРКАЗЕЗ?, 5йіге РпагтасешіісаІ5) призначається для лікування пацієнтів з МРБЇІЇ. Лікування проводиться щотижня у дозі 0,5 мг/кг внутрішньовенною інфузією, при середній тривалості інфузії 1-3 години. Див. Сіцдійапі еї аї.,
Сепеї Мої Віої. 2010; 33(4):589-604. ЕЇАРВАБЕ? було затверджено після рандомізованого, подвійного сліпого, плацебо-контрольованого дослідження 96 пацієнтів з синдромом Хантера, які не мали когнітивного зниження при початковому дослідженні та з помірно розвиненою хворобою. Див. Миепег еї аЇ., Сепеї Мей. 2006; 8(8):465-73; Миепег єї аіІ., Сепеї Меай. 2011; 13(2):95-101. Після одного року лікування, пацієнти, яких лікували ЕГАРКАЗЕ? показали збільшення відстані, пройденої за шість хвилин (тест на шестихвилинну ходьбу) порівняно з пацієнтами з плацебо. Див. Миепег еї аї., Сбепеї Мей. 2011; 13(2):95-101. ЕКТ з ЕГАРКАБЕ? також демонструє поліпшення діапазону руху суглобу (КОМ) та зменшення об'єму печінки та селезінки. Див. Миепег еї аї., Сепеї Мед. 2011; 13(2):95-101. Крім того, є дані про поліпшення функції легенів при нейтралізації антитіл проти ідурсульфази; про розвиток антитіл проти ІЮ5 було повідомлено у 5095 пацієнтів з тривалим періодом лікування. Див. Миепег еї аїЇ., Сепеї
Меа. 2011; 13(2):95-101.
Фаза ІЛІ дослідження у 31 пацієнта з МРІЇ, порівнювала ефективність ЕІ АРЕАЗЕЗ з другим
Зо продуктом на основі бета-ізоформи Ідурсульфази із запропонованою комерційною назвою
Нипівгазе? (МСТО1301898, пЕр://сіїпісангіа!5.дом) Обидва білки вводили внутрішньовенно в дозі 0,5 мг/кг на тиждень для ЕІ АРКАЗЕСЗ і 0,5 та 1,0 мг/кг на тиждень для Нипіегазе? протягом 24 тижнів. Результати лікування Нипіегазе? свідчать про зниження екскреції САС сечею та поліпшені показників в тесті б-хвилинної ходьби, проте жодна з доз не могла забезпечити терапевтичну дію при функції легенів, функції серця або покращити рухливість суглобів. Див.
Зопп еї а!., Огрпапеї .) Раге бів. 2013; 8:42. Нипієгазе? інфузії були, як правило, безпечними і добре переносилися, хоча було повідомлено про деякі несприятливі проявлення, такі як кропив'янка та висипання на шкірі. Див. Зопп еї а!., Огрпапеї .) Каге Оі5. 2013; 8:42. Нещодавно завершено ключове дослідження ключового РІЇ! (пЕр'://сіїпісангіа!5.дом, МСТО1645189), але результати ще не доступні.
Через підвищену чутливість до ЕІ АРВА5БЕ? медична підтримка повинна бути доступною під час введення продукту. Під час досліджень найбільш серйозними описаними побічними реакціями були анафілактичні реакції, які можуть з'явитися в будь-який час під час введення
ЕГАРВАБЕ? або протягом 24 годин після введення продукту. Див. Миеп7ег еї аЇ., Сепеї Мед. 2006; 8(8):465-73; Миеплег єї аІ., Сепеї Мед. 2011; 13(2):95-101. Ці анафілактичні реакції, які можуть скомпрометувати життя пацієнта, включають респіраторний дистрес, гіпоксію, гіпотензію, кропив'янку та/або ангіоневротичну хворобу горла і язика (пер://еІаргазе.сот)/) і можуть вимагати втручання, таких як реанімація або екстренна трахеотомія, і лікування інгаляційними бета-адренергічними агоністами, адреналіном або внутрішньовенними кортикостероїдами. Див. Вигіоп еї аІ., МоЇ Сепеї Меїар. 2011; 103(2):113-20. Інші недоліки ЕРТ включають: 1) ускладнення проведення внутрішньовенних вливань протягом 1-3 годин у педіатричних пацієнтів, багато з яких страждають психічними захворюваннями (пер:/еІаргазе.сот/), 2) той факт, що 50 95 пацієнтів, які отримували ЕІ АРБАБ5БЕ? у клінічних дослідженнях, стали позитивними щодо антитіл до ідурсульфази, клінічне значення якої ще не відоме, але яка може обмежувати ефективність препарату в довгостроковій перспективі, як це передбачають тести легеневої функції. Див. Миепег еї аї!., Мої Сепеї Меїаб. 2007; 90(3):329-37;
Миеп?ег сеї аІ., Сепеї Мей. 2006; 8(8):465-73; Миеплег еї аІ., Сепеї Мей. 2011; 13(2):95-101; 3) висока вартість терапії, яка включає також витрати на догляд удома. Див. УУуаї! еї а!., Нєапйн
Тесппої А55е5. 2012 6(39):1-543. 60 Незалежно від питань безпеки чи вартості введення ЕЕГ АРКАЗБЕ?, нездатність внутрішньовенно вводити рекомбінантну ІО5 для досягнення ЦНС, принаймні, у рекомендованій дозі 0,5 мг/кг на тиждень, ймовірно, обмежує потенційну придатність ЕКТ для лікування серйозної нейродегенерації, що спостерігається у пацієнтів з синдромом Хантера. Досягається тільки частковий порятунок мозкової активності ІЗ при щотижневому внутрішньовенному введенні 1,2 або 10 мг ЕГАРЕА5БЕ"/кг 2 або 7 місячним мишам МРІЇ, відповідно. Див. Роїйо єї аІ,, Нит Мої Сепеї. 2010; 19(24):4871-85. Крім того, навіть при цих високих дозах активність ІЮ5 у кровообігу повертається до рівня що був до лікування через 72 години після введення білка.
Див. Роїйо еї аІ., Нит Мої Сепеї. 2010; 19(24):4871-85. Дійсно, використовуючи внутрішньовенну
ЕРТ не вдалося скорегувати накопичення САС в мозку мишачої моделі МРІЇ. Див. Сагсіа еї аї.,
Мої Сепеї Меїар. 2007; 91(2):1183-90. Таким чином, призначення ЕГАРКАБЕ? обмежується лікуванням ненейрологічних симптомів захворювання.
Альтернативою внутрішньовенній доставці ЕРТ є введення екзогенного ферменту безпосередньо в ЦНС. Введення 20 мкг рекомбінантного людського ІЮ5 у боковий шлуночок 5- місячних мишей МРІЇ кожні З тижні збільшувало активність ІЮ5 в головному мозку, мозочку та соматичних органах, таких як печінка, серце, нирки та яєчка. Див. Нідиспі еї аІ., Мої Сепеї Меїар. 2012; 107(1-2):122-8. Відновлення діяльності ІЮ5 призвело до відновлення короткочасної пам'яті та опорно-рухової активності та зменшення клітинної вакуолізації та розтягування лізосом у мозочці, печінці та яєчниках. Проте терапевтична ефективність була частковою, вміст ЗАС не повністю нормалізувався, а деякі поведінкові зміни залишалися резистентними до лікування.
Див. Нідиспі еї аїЇ., Мої Сепеї Меїар. 2012; 107(1-2):122-8. Нещодавнє дослідження безпеки та дозування введення адсорбції ідурсульфази в цереброспінальній рідині (ЦСР) за допомогою пристрою для введення інтратекального препарату для прямого лікування патології ЦНС у пацієнтів з синдромом Хантера продемонструвало зниження приблизно на 80-9095 рівнів ОДО в
ЦеР після 6 місяців лікування. Див. Миеп?ег еї аї., Сепеї. Меа. 2015; доїі:10.1038/діт.2015.36 та мм. сіїпсіангіаіє.дом (МСТ00920647). Однак імплантація постійного внутрішньовенного засобу доставки, що потребує терапії, пов'язана з істотними ризиками та недоліками, і сама терапія має дуже високі економічні витрати на пацієнта на рік.
Іншим способом досягнення ЦНС за допомогою системного введення є використання молекулярного троянського коня. Прикладом такого підходу є рецептор інсуліну з антигеном-
Зо ідуронат 2-сульфатаза злитого білка (НІЕМАБ-ІО5), який може перетинати гематоенцефалічний бар'єр (ВВВ) через рецепторно-опосередкований транспорт. Внутрішньовенне введення 3, 10 та 30 мг/кг НІКМАБ-ІО5 самцям підліткам резус-мавп щотижнево протягом 26 тижнів призвело до збільшення вмісту у мозку НІЕМАБ-ІО5З на 1 95 від загальної кількості ін'єкційних доз. Див.
Воадо еї аї., Віоїеєснпо! Віоепуд. 2014; 111(11):2317-25. Дослідження також показало безпеку злитого білка, оскільки не спостерігалась реакція, пов'язана з інфузією або імунною відповіддю.
Трансплантація кровотворних стовбурових клітин (НЗСТ) із застосуванням стовбурових клітин з кісткового мозку (трансплантація кісткового мозку, ВМТ) виявилася ефективною для лікування як соматичної, так і неврологічної патології у пацієнтів з іншими МР5. Див. Реїег5 єї а!., Віоса 1996; 87(11): 4894-902, Реїег: апа 5іємага, Вопе Маїтом/ Тгтапзріапі 2003; 31(4): 229-39, та Хатада еї а|І., Вопе Маїтом/ Тгапз5ріапі 1998; 21(6): 629-34. Принцип, що лежить в основі корекції Н2СТ, полягає в тому, що моноцити донорів здатні перетинати капілярну стінку навіть гематоенцефалічного бар'єра, після чого вони диференціюються в тканинні макрофаги, мікроглії у випадку ЦНС та виділяють дефіцитний фермент для доставки до різних клітин. Див.
Киїмії еї аї., Сеї! Тгтапзріапі 1995; 4(4). 385-92. ВМТ, виконана у мишей МРІЇ, знижувала накопичення САС у різних соматичних тканинах, включаючи печінку, селезінку та легені, але не в ЦНе. Див. АКіуата єї аї!., МоЇ Сепеї Меїар. 2014; 111(2):139-46. Коли ВМТ поєднується з ЕРТ (0,5 мг ідурсульфази/кг/тиждень), протягом 7 місяців після лікування мишей МРІЇ спостерігався адитивний ефект на рівні САС у серці, нирках та легенях, проте накопичення ЗАС у ЦНС залишається на патологічному рівні. Див. АКіуата еї аЇ., МоЇ Сепеї Меїар. 2014; 111(2):139-46.
Проте свідчення клінічної ефективності не є дуже сильним у пацієнтів з МРО5ЇЇ. Наслідки 10 пацієнтів з синдромом Хантера, які одержували ВМТ у період з 1982 по 1991 рік, показали високий ступінь успіху. Див. МеПоаді еї аї., У Іппегпії Меїаб бів. 1999; 22(5):638-48. Чотири з цих пацієнтів померли протягом 100 днів після ВМТ, а ще З протягом 7 років після процедури. З З пацієнтів, які прожили більше 7 років після ВМТ, одна з них не повідомила про клінічну користь; друга зазначила мінімальне збільшення активності ІЗ у плазмі, а третя не змогла нормалізувати вміст САС, незважаючи на невелике збільшення активності ІЮ5 у плазмі. Див.
Меподі еї а!., У ІпНегії Меїар бі. 1999:22(5):638-48. Магнітно-резонансна томографія (МРТ) мозку показала невелике зменшення числа виразок кістозу через 2,5 роки після ВМТ у пацієнта з м'яким фенотипом МРБІЇ. Див. Бе еї аЇ., Апп Мешгої. 2001;50(1):79-92. Проте в одному 60 дослідженні були представлені дані про іншого пацієнта з м'яким фенотипом, який не показав ніякого поліпшення в МРТ. Див. ей еї аї., Апп Мешцгої. 2001; 50(1):79-92. Клінічні наслідки, як видається, дуже змінюються у хворих с синдромом Хантера, мабуть, через різні фактори; генотип, вік на НеСТ, клінічний стан пацієнта при НЗСТ, такий як ступінь неврологічних порушень, статус донора, домірно-химеризм, джерело стовбурових клітин та ферментна активність. Див. Сіцйдіїапі еї аі., Сепеї Мої! Віої. 2010;33(4):589-604; Маіауаппороціов еї аї.,
Веитайю|іоду. 2011;5:и49-59
При успішному застосуванні НЗСТ може сприяти досягненню деякої міри клінічної користі на соматичному рівні, знижувати поведінкові проблеми та покращувати моделі сну, однак залишається незрозумілим, чи може лікування бути посередником у значному поліпшенні когнітивних порушень. Див. сіидіїапі еї а!., Сепеї Мої Віої. 2010;33 (4):589-604; МаІауаппороціо5 еї аї., Кештаїйоіоду. 2011;5:м49-59. Загалом, цей підхід не рекомендується для пацієнтів з синдромом Хантера, через високий рівень захворюваності та смертності та змінюваність нейрокогнітивної користі. Див. сіцидіїапі єї аї!., Сепеї Мої Вісі. 2010:33(4):589-604.
Певним поясненням невдачі НЗСТ є обмежене експресії ІО5 в імплантованих клітинах, що призводить до недостатньої крос-корекції ІЮ5 в ЦНС. Леніровіальні вектори, що кодують ген ІЮ5 людини, були використані для перенесення клітин кісткового мозку перед їх трансплантацією в мишей з МРЗІЇ. Оброблені миші МР5ІЇ показали підвищену продуктивність в тесті на пам'ять в
Т-лабіринті протягом 14 тижнів після трансплантації. Див. Родеї;-Редегзеп еї аїЇ., Мої Тнег. 2013:21:51-5285.
За наявності обмежень існуючих терапевтичних підходів до лікування МРІЇ, зокрема, виникає потреба в альтернативних підходах. іп мімо генна терапія забезпечує можливість одноразового лікування МРОЇЇ та інших спадкових хвороб, з перспективою довічного сприятливого ефекту. Кілька способів генної терапії на основі застосування різних вірусних векторів у комбінації з різними шляхами введення було випробувано на тваринних моделях хвороби МРІЇ.
Опосередковане вектором аденоасоційованого вірусу (ААМ) перенесення генів, зокрема, швидко стає оптимальним підходом у багатьох випадках іп мімо генної терапії завдяки високій ефективності трансдукції та відсутності патогенності цих векторів. Вектори ААМ можуть трансдукувати постмітотичні клітини, і кілька доклінічних та клінічних досліджень
Зо продемонстрували потенціал опосередкованого вектором ААМ перенесення генів для ефективного започаткування тривалої експресії терапевтичних трансгенів при різних хворобах.
Див. Ваїпьгіаде еї аї!., М Епоі У Мед. 2008; 358(21):2231-9, Найвм/іпй еї аіІ., Нит Сепе Тег. 2008; 19(10):979-90, Мадиіге еї аІ., М Епо! У Мей. 2008; 358(21):2240-8, Міетеуеєг еї аї!., Віоса 2009; 113(4):797-806, Вімега сеї а!., Віосоа 2005; 105(4):1424-30, Маїйамапі еї а!., М Епа! У Мей. 2011; 365(25):2357-65, та Виспіїв єї а!., Віоса 2012; 119(13):3038-41.
Системне введення векторів ІЗ ААМ5-СММ-людини у скроневі вени МРЗІЇ-мишей (рг) призвело до збільшення активності ІЮ5 у серці, нирці, печінці, легенях, м'язах та селезінці та помірному збільшенні активності ІО5 у головному мозку, що призвело до зниження вмісту соматичної тканини та сечового САС до 18 місяців після введення єдиного вектора. Див. РоїЇйо еії аі., Ат У Нит Сепеї. 2009; 85(2):296-301. Крім того, це лікування запобігло розвитку патології
ЦНС, запобігаючи нейродегенерації, а також виправляючи астрогліоз і запалення. Оцінка мишей у відкритому польовому тесті 18-місячної послідовності після ін'єкції ААМ продемонструвала поліпшення в лікуванні у групі моторних фенотипів мишей МРБІЇ. Див. Роїйо еї аІ,, Ат У Нит Сіепеї. 2009; 85(2):296-301.
ААВ, що кодують серотип 8 для гену ІЮ5 людини під контролем специфічного для печінки промотора ТВО також використовували для лікування МР. До 7 місяців після внутрішньовенного введення векторів 2-місячним мишам з МРОБЇЇ спостерігалось збільшення активності сироватки, печінки, селезінки, легенів, серця, нирок та м'язів ІО5, що призвело до повної корекції зберігання САС у цих соматичних тканинах. Див. Сагдопе єї аї., Нит Мої Сепеї. 2006;15(7):1225-36. Однак для досягнення незначного підвищення активності ІЮ5 та часткового кліренсу накопичення САС у мозку, коли вектори вводили внутрішньовенно, були потрібні дуже високі дози (4 х 1012 вірусних геномів/миша). Див. Сагдопе єї аіЇ., Нит Мої Сепеї. 2006; 15(7)1225-36. Аналогічно, внутрішньовенне введення векторів ААМ8, в яких ген ІЮ5 людини знаходиться під контролем убіквітинового промотора фактора видовження 1-а (ЕЕ) у дорослих мишей МРІЇ, продемонструвало збільшення активності ІЮ5 у печінці, серці, селезінці та нирках до 24 тижнів після введення, з повною корекцією накопичення САС в цих органах. Див. Уипд єї аІ,, Мої СеїІв. 2010; 30(1):13-8. Активність ІЗ у мозку збільшувалась лише у групі тварин, принесених у жертви при короткочасному (через б тижнів після введення); проте це було недостатньо для нормалізації вмісту ЗАС в ЦНС. Див. Уипа еї а!., Мої СеїІв. 2010;30(1):1 3-8.
Жоден з вищезгаданих підходів повністю не відновив активність ідуронат-2-сульфатази, не досяг повної ерадикації інтрацитоплазматичних включень у ЦНС та соматичні тканини або скорегував усі клінічні ознаки МРІЇ. Таким чином, існує потреба в нових підходах до лікування
МРІЇ, які мають кращі профілі ефективності та безпеки.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід забезпечує нові рекомбінантні вектори для лікування хвороб, зокрема, для лікування мукополісахаридозів типу І! (МРІЇ) або синдрому Хантера.
У першому аспекті даний винахід стосується ізольованої нуклеотидної послідовності, що кодує білок ідиронат-2-сульфатазу (105), як представлено на ЗЕО ІЮ МО: 1, і має ідентичність від 75 до 90 95 з 5ЕО ІЮ МО: 2. Зокрема, ізольовані нуклеотидні послідовності відповідно до цього першого аспекту винаходу вибираються з 5ЕО ІЮО МО: 5 та ЗЕО ІО МО: 8.
Згідно з другим аспектом, даний винахід відноситься до плазміди, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок ідуронат-2-сульфатази (105), як представлено на ЗЕО ІЮ МО: 1, і, зокрема, нуклеотидну послідовність, що має принаймні 75 95 ідентичність з ЗЕ ІЮО МО: 2, переважно має від 75 95 до 90 95 ідентичності з ЗЕО ІЮ МО: 2.
У третьому аспекті винахід пропонує нові рекомбінантні вектори для лікування мукополісахаридозів типу ІІ. Згадані рекомбінантні вектори є, зокрема, адененосасоційованими вірусними векторами (ААМ), що містять нуклеотидну послідовність, що кодує білок ідуронат-2- сульфатазу (105), як представлено на 5ЕО ІЮ МО: 1, і зокрема нуклеотидну послідовність, що має принаймні 7595 ідентичність з ХЕО ІЮ МО: 2, переважно, що має ідентичність від 75 95 до 90
Фо з ЗБО ІЮО МО: 2. У переважному варіанті реалізації винаходу, аденоассоційовані вірусні вектори мають серотип 9 (ААМУ9). Вектори ААМУ за цим винаходом можуть додатково містити промотор, зв'язаний з кодуючою нуклеотидною послідовністю для контролю експресії ІО5.
Підходящим промотором є промотор САС, 5ЕО ІЮО МО: 14.
Додатковий аспект даного винаходу стосується фармацевтичної композиції, що містить терапевтично ефективну кількість нуклеотидної послідовності або плазміди або рекомбінантного вектора, описаного в цьому документі.
Ще один аспект даного винаходу стосується нуклеотидних послідовностей даного винаходу або плазміди, описаної в цьому документі, або рекомбінантного вектора, описаного в цьому
Зо документі, для застосування як лікарського засобу, зокрема для лікування мукополісахаридозів типу ЇЇ.
Даний винахід також забезпечує спосіб одержання плазмідів згідно з даним винаходом, а також спосіб одердання рекомбінантних векторів згідно з винаходом.
У наступному аспекті винахід стосується ізольованих клітин, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує ІЮ5, і, зокрема, нуклеотидну послідовність, що має принаймні 75 905 ідентичність з БЕО ІЮ МО: 2, переважно має ідентичність від 75 до 90 95 з БЕО ІО МО: 2.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фіг. 1. Одержання рдАМ-САс-пІО5 і ААМ-САС-ПІЮОЗ. (А) Схематичне зображення плазміди рААМУ-САдс-піОЗ і її компонентів. (В) Схематичне зображення геному Аденоасоційованого вектора, що містить ПІО5 кодуючу послідовність.
Фіг. 2. Одержання рдАМ-САСс-опІО5-варіант! і ААМ-САда-опІр5-варіант1!. (А) Схематичне зображення плазміди рдАМ-САС-опІр5-варіант! і її компонентів. (В) Схематичне зображення геному Аденоасоційованого вектора, що містить опІір5-варіант1 кодуючу послідовність.
Фіг. 3. Одержання рдАМ-САСс-опІО5-варіант2 і ААМ-САа-опІр5-варіант2. (А) Схематичне зображення плазміди рдАМ-САсС-опІр5-варіанта2 і її компонентів. (В) Схематичне зображення геному Аденоасоційованого вектора, що містить опІр5-варіант2 кодуючу послідовність.
Фі. 4. Одержання рААМ-САС-оті5 і ААМ-САСі-отіО5. (А) Схематичне зображення плазміди рдАМ-СА(Сі-отіОЗ і її компонентів. (В) Схематичне зображення геному
Аденоасоційованого вектора, що містить отір5 кодуючу послідовність.
Фіг. 5. Гідродинамічне вивільнення рААМ-САс-НпІр5, рдАУ-САда-опІр5-варіант! і рААУМ-САс- опІр5-варіант2 у здорових мишей. Гістограми показують активність ідуронат-2-сульфатази (105) у печінці (А) ї сироватці (В) виміряні через 48 годин після введення 30 мкг людських І05- кодуючих плазімд рдАМ-САС-пІО5, рААМ-САсі-опІО5-варіанті і рААУ-САС-опІО5-варіант2г.
Активність ОЗ у М/ мишей, яким ін'єктували салін приймали за 100 95. Значення є середніми ж
ЗЕМ у 5 мишей на групу. "Р«0,05.
Фіг. 6. Гідродинамічне вивільнення рдДАМ-САс-НпІр5, рдАУ-САда-опІр5-варіант! і рААУМ-САс- опІО5-варіант2 у МРЗІЇ мишей. (А, В) Гістограми показують активність ідуронат-2-сульфатази (05) у печінці (А) ії сироватці (В) виміряну через 1 тиждень після введення людських І05- кодуючих плазімд рдАМ-САС-пІО5, рААМ-САсі-опІО5-варіанті і рААУ-САС-опІО5-варіант2г. бо Дикий тип і салін-ін'єктованих МРБІЇ мишей використовували як контролі. Активність ІЮ5 у МУТ мишей приймали за 10095. (С) Кількісний вміст глюкозаміноглікану (ЗАС) у печінці, селезінці, серці, сечовому міхурі та семенниках через 1 тиждень після введення різних людських І05- кодуючих плазмід. Значення є середніми - 5ЕМ у 5 мишей на групу. "Р«0,05, "иРа«е0,001, пе р.0,0001.
Фіг. 7. Інтраваскулярне вивільнення ААМУ-САСІ-НІЮО5, ААМУ-САСІ-опІО5-варіант! і ААМО-
САа-опІр5-варіант2 у МРЗІЇ мишей. МРЗІЇ мишам внутрішньовенно ін'єктували 1х10'9 уд ААМЗ векторів, що кодують людський 5 дикого типу (ААМУ-САСІ-ЛПІЮОЗ) або дві різні версії оптимізованого людського 05 (ААМУ-САСІі-опІО5-варіанті і ААМ9-САС-опІО5-варіант2). Дикий тип і необроблених МР5ЗІЇ мишей використовували як контролі. (А, В) Гістограми показують активність ідуронат-2-сульфатази (105) у печінці (А) і сироватці (В). Активність ІЮ5 у М/Т мишей приймали за 100 95. (С) Кількісний вміст глюкозаміноглікану (ЗАС) у печінці тварин, яким вводили різні людські ІЮ5-кодуючі вектори. Значення є середніми х 5ЕМ у 5 мишей на групу. "раб, рОО1 і ихра«О0,001.
Фіг. 8. Інтра-ЦСР вводили ААМУ9-САС-НПІЮ5, ААМ9-САС-опІр5-варіант! і ААМ9-САС-опІО5- варіант2 МРБІЇ мишам. МРБІ! мишам віком 2 місяці у мостомозжечкову цистерну ін'єктували
Бх1019 му ААМУ векторів, що кодують людський ІЮ5 дикого типу (ААМ9-САС-ПІО5) або дві різні версії оптимізованого людського 05 (ААМУ-САСІ-опІО5-варіанті і ААМ9-САСІі-опІО5-варіантг).
Мишам дикого типу (М/Т), необробленим МРІЇ (МРІЇ) ії МРБІЇ мишам вводили некодуючі (Нуль)
ААМОУ вектори (МРБІІ-Нуль), що використовували як контролі. (А) Активність ідуронат-2- сульфатази визначали через 1,5 місяця після виділення в різних частинах мозку (Частини І-М, де Частина | являє собою найбільш ростральну частину мозку, а Частина М являє собою найбільш каудальну частину). Активність ІП5 у М/ мишей приймали за 100 95. (С) Кількісний вміст глюкозаміноглікану (САС) у тих же самих областях мозку як в (А). Результати показані як середні 5 5ЕМ у 5 мишей на групу. "Р«е0,05, РО 01, иираО 001 і ихр«О,0001.
Фіг. 9. Інтра-ЦСР вводили ААМУ9-САС-НПІр5, ААМ9-САС-опІр5-варіант! і ААМ9-САС-опІО5- варіант2 МРБІЇ мишам. МРІЇ мишам віком 2 місяці у мостомозжечкову цистерну ін'єктували
Бх109 уд ААМУ векторів, що кодують людський ІЇО5 дикого типу (ААМ-САСІ-ПІЮЗ) або дві різні версії оптимізованого людського 5 (ААМ-САС-опІО5- варіант! і ААМ-САСс-опІО5-варіантг).
Мишам дикого типу (М/Т), необробленим МРІЇ (МРІЇ) ії МРБІЇ мишам вводили некодуючі (Нуль)
Зо ААМУ вектори (МРБІІ-Нуль), що використовували як контролі. (А, В) Активність ідуронат-2- сульфатази, виражену як 95 УТ активності, у печінці (А) і сироватці (В), вимірювали після 1,5 місяців лікування. (С) Кількісний вміст глюкозаміноглікану (ЗАС) у соматичних органах.
Результати показані як середні 5 ЗЕМ у 5 мишей на групу. "Р«е0,05, Р«0,01, и Р«О,001 і пе р.0,0001.
Фіг. 10. Інтра-ЦСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМ9-САСі-отір5). (А) Активність ідуронат-2-сульфатази в різних частинах мозку (частини І-М) мишей дикого типу (здорові), необроблених мишей МРОБЇЇ і МРБОЇЇ мишей, яким вводили в ЦСР, за допомогою внутрішньоцистернальної (ІС) ін'єкції, з 5х10!9 му контрольного некодуючого вектора (ААМ9-Нуль) або ААМ9-САСі-отіор5. ІЮ5 активність М/Т приймали за 10095.
Аналіз проводили 4 місяці після введення вектора. (В) Кількісний вміст глюкозаміногліканів (САС) в тих же самих частинах мозку як в (А). Результати показані як середні - 5ЕМ від 4-5 мишей на групу. "РО, 001, ихр«0,0001 проти МРБІ-Нуль.
Фіг. 11. Інтра-ЦДСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМ9-САСІ-ОотіО5). (А) Кількісне визначення інтенсивності сигналу проводили в різних ділянках мозку після фарбування лізосомним маркером ГАМР-2 у мишей дикого типу (здорових) та МРІЇ мишей, яким вводили в мостомозжечкову цистерну або 5х1010 Уд контрольованого некодуючого вектора (ААМУ9-Нуль) або 5х10!9 му з ДААМ9-САС-отір5. Аналіз проводили 4 місяці після введення вектора. (В) Активність інших лізосомальних ферментів у екстрактах мозку. ІА, ідуронідаза, альфа-і-, 5Иа5Н, М-сульфоглукозамінсульфогідралаза,
МАСІ, /М-ацетилглюкозамінідаза, альфа, НОБЗМАТ, гепаран-альфа-глюкозамінід, - М- ацетилтрансфера, САЇМ5 галактозамін (М-ацетил)-6-сульфатаза, ЗО5В, глюкуронідаза, бета,
НЕХВ, гексозамінадаза В. Значення є середніми х 5ЕМ від 4 до 5 мишей на групу. "Р«О,01, р«0,001, ииир«О,0001 проти МРЗІІ-Нуль.
Фіг. 12. Інтра-ЦДСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМ9-САСІ-отір5). Кількісне визначення інтенсивності сигналу проводили в різних ділянках мозку після фарбування лізосомним маркером ГАМР2. Аналіз проводили у мишей дикого типу (МУ/Т) і МРБІЇ мишей з одного посліду через 8 місяців після того як останній отримав інтра-ДСР введення або 5х10!9 му контрольного некодуючого вектора (ААМО9-Нуль), або 5х1019 му ААМ9-Сда-отір5. Результати показані як середнє х ЗЕМ від 2-6 мишей на групу. "РО,05 і бо ""РО,01 проти МРБІ-Нуль.
Фіг. 13. Інтра-ЦДСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМУ-САСІ-отіО5). (А, В) Гістограми представляють інтенсивність сигналу виміряну після імунофарбування маркером астроцитів СЕАР (А) і маркером мікроглії В5І-В4 (В) лобної, тім'яної та потиличної кори, верхнього двухолмія та таламуса мишей дикого типу (здорові) та МРЗІЇ мишей, яким вводили за 4 місяці до цього в мостомозжечкову цистерну або
Бх1019 уд контрольного некодуючого вектора (ААМУ9-Нуль), або 5х1010 уд ДААМ9-САСІ-отіро.
Результати показані як середні - ЗЕМ від 5 мишей на групу. ""Р«0,01, иРО,001, ииРО,0001 проти МРОБЇ-Нуль.
Фіг. 14. Інтра-ЦДСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМУ-САСІ-отіО5). (А, В) Гістограми представляють інтенсивність сигналу виміряну після імунофарбування маркером астроцитів СЕАР (А) і маркером мікроглії В5І-В4 (В) головного мозку мишей дикого типу (здорові) та МР5ІЇ мишей з одного посліду, що отримували інтра-ДСР введення або 5х10!2 му контрольного некодуючого вектора (ААМО9-Нуль), або 5х1019 му ААМ9-Сда-отіО5. Аналіз проводили через 8 місяців після введення вектора. Результати показані як середнє хх ЗЕМ від 2-6 мишей на групу. "Р«0,05, Р«0,01, РО 001 і и р«0,0001 проти МРОБЇ-Нуль.
Фіг. 15. Інтра-ЦДСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМУ-САСІ-отіО5). (А,В) Активність ідуронат-2-сульфатази, виражену як 95 активності М/Т, у печінці (А) і сироватці (В) мишей дикого типу (здорових), необроблених МРОЇЇ мишей і МРБЗІЇ мишей, яким вводили в ЦСР або 5х10!9 му контрольного некодуючого вектора (ААМО-Нуль), або 5х10"9 уд ААМ9-САС-отіОр5 вектора у віці 2 місяців і аналізували через 4 місяці. 5 активність ММ приймали за 100 95. (С) Проводили кількісне визначення глюкозаміногліканів (БАС) в соматичних органах. Результати показані як середні - ЗЕМ від 4-5 мишей на групу. "Р«е0,01, р 001, и р«О,0001 проти МРЗБІІ-Нуль.
Фіг. 16. Інтра-ЦСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМУ-САСІ-отіО5). (А, В) Активність ідуронат-2-сульфатази, виражену як 95 активності М/Т, у легені (А) і серці (В) здорових мишей дикого типу (МУТ), необроблених МРОЇЇ (МРБІЇ) мишей і МР5ІЇ мишей, яким вводили в ЦСР або 5х10'9 му контрольного некодуючого вектора (ААМ9-Нуль), або 5х10'9 мд ААМ9-САС-отір5 вектора у віці 2 місяців і аналізували
Зо через 4 місяці. (С) Проводили кількісне визначення кількості копій геномного вектора/діплодного генома (мхд/дд) у печінці, легенях і серці у МРБІЇ мишей, яким вводили інтра-ЦДСР ААМ9-САЦ- отіО5. Тканини отримані з необроблених МРБЇЇ мишей використовували як контролі.
Результати показані як середнє їх ЗЕМ від 4-5 мишей на групу в (А їі В). "Р«0,05, ""Ра«О0,01 і ехр-0,001 МРБЇП-Нуль .
Фіг. 17. Інтра-ЦСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМ9-САСІ-оті5). (А) Повна маса печінки відносно повної маси тіла мишей дикого типу (здорових) тісе, необроблених мишей МР5БІЇ та мишей МРІЇ, яким вводили у ЦСР з 5х1019 му контрольного вектора (ААМУ9-Нуль) або 5х1010 уд ААМ9-САСі- отір5 вектора у віці двох місяців та аналізували через 4 місяця. (В) Активність інших лізосомальних ферментів у печінкових екстрактах, отриманих від тієї ж когорти тварин, є подібною до (А). (С) ВД- гексозамідіназна (В-НЕХО) активність, виражена як 9о активності УТ, у сироватці тієї ж самої когорти тварин, є подібною до (А). ІВОА, ідуронідаза, альфа-1-, 5а5Н, М-сульфоглюкозамін сульфогідролаза, МАСИ, М-ацетилглюкозамідаза, альфа, НОБМАТ, гепаран-альфа- глюкозамідін М-ацетилтрансфераза, САЇМ5 галактозамін (М-ацетил)-6-сульфатаза, ИЗВ, глюкуронідаза, бета, НЕХВ, гексозамінідаза В. М/УТ ферментні активності були встановлені до 100 95. Значення являють собою середні значення ї 5ЕМ від 4-5 мишей на групу. "Р«0,05, краб о1, ира«О0 001, ииирР«О,0001 проти МРБЇІ-Нуль.
Фіг. 18. Інтра-ДСР вводили ААМУ9 вектори, що кодують для оптимізованої мишачої ідуронат- 2-сульфатази (ААМУ-САСІі-отіО5). Оцінка локомоторної та дослідницької активності за допомогою тесту відкритого поля у мишей дикого типу (здорових), яких ще досліджували, необроблених мишей МРБІЇ та мишей МРБІЇ, яким вводили у ЦСР 5х1019 му контрольного вектора (ААМУ9-Нуль) або 5х1010 уд ААМ9-САС-отіО5 вектора у двомісячному віці та аналізували через 4 чотири місяці. (А) Час у центрі, (В) Час на периферії, (С) Входження до центра, (0) Час латентності до центра, (Е) Усього рухів, (Е) Перетнуті лінії. Значення являють собою середні значення 5 5ЕМ 17-22 від мишей на групу. "Р«0,05, "Р«0,01 проти МРОБЇІ-Нуль.
Фіг. 19. Інтра-ЦДСР вводили ААМОУ вектори, що кодують оптимізовану мишачу ідуронат-2- сульфатазу (ААМ9-САСІ-отірз5). Аналіз виживаності Каплана-Майєра у здорових мишей дикого типу (М/Т), необроблених мишей МРІЇ (МР5ІЇ) та мишей МРІЇ. Яким вводили у ЦСР 5х1079 уд контрольного некодуючого вектора (ААМУ9-Нуль) або 5х10!9 уд вектора ААМ9-САСІ-отір5. М-24 60 для М/Т, М-22 необроблених МРІЇ, М-27 для Нуль-оброблених МРІЇ та М-91 для мишей, що отримують терапевтичний вектор.
Фіг. 20. Інтра-ДСР вводили ААМО вектори, що кодують для оптимізованої мишачої ідуронат- 2-сульфатази (ААМ9-САДС-отірз) у різних дозах (1,58х109, 5х109, 1,58х1019 та 5х1019 му/миша). (А) ідуронат-2-сульфатазна активність у різних частинах мозку (частини І-М) дикого типу (здорових) мишей, необроблених мишей МРЗІЇ та мишей МРЗІЇ, яким вводили ЦСР шляхом інтрацистернального (ІС) вприскування різних доз ААМУ-САСі-отіОЗ у віці 2 місяців та аналізували через 1,5 місяця. МУТ ІЮО5 активність встановлювали до 100 95. (В) Кількісне визначення глюкозаміноглюканів (ЗАС5) у таких самих частинах мозку, як і (А). Результати зазначені як середні значення їх ЗЕМ від 5 мишей на групу. "Р«е0,05, Р«0,01, и Р«О,001, ехрО,0001 проти необроблених МРІЇ.
Фіг. 21. Інтра-ДСР вводили ААМО вектори, що кодують для оптимізованої мишачої ідуронат- 2-сульфатази (ААМ9-САСІ-отір5) у різних дозах (1,58х109, 5х109, 1,58х10719 та 5х10'9 мд/миша). (А, В) ідуронат-2-сульфатазна активність, виражена як 95 УТ активності, у печінці (А) і сироватці (В) мишей дикого типу (здорових), необроблених мишей МР5ІЇ та мишей МРІЇ, яким вводили у
ЦеСР у різних дозах ААМ9-САСі-отірз вектор у віці 2 місяців та аналізували через 1,5 місяця.
МЛ 1О5 активність встановлювали на 100 95. (С) Кількісне визначення глюкозаміноглюканів (СдО5) у соматичних органах. Результати представлені як середні значення хх ЗЕМ 5 від мишей на групу. "Р«0,05, ирР«001, РО 001, ии"РО,0001 проти необроблених МРІЇ.
Депонування мікроорганізмів
Плазміди рдАМ-САа-нпІЮОЗ (З5ЕО ІЮ МО: 3), рААМ-САСсі-опІО5-варіант 1 (ЗЕО ІО МО: 6) та рААУ-Сда-опІро-варіант 2 (5ЕО ІО МО: 9) було депоновано 18 грудня 2014 р. під номером доступу ОЗМ 29866, О5М 29867 та О5М 29868 у О5М2 - Німецькому банку мікроорганізмів та клітинних культур за адресою ІппоПепзігабе 7 В, 0-38124 Вгайп5спмеїд, Еєдега! Нерибіїс ої
Сегтапу (Інхоффенштрассе 7 Б, 0-38124 Брауншвейг, Федеративна Республіка Німеччина).
ВИЗНАЧЕННЯ
Термін "нуклеотидна послідовність" означає молекулу нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, яка містить дезоксирибонуклеотиди або рибонуклеотиди, відповідно. Нуклеїнова кислота може бути дволанцюговою, одноланцюговою або може містити частини дволанцюгової або одноланцюгової послідовності.
Термін "Фо ідентичності послідовності" означає відсоток нуклеотидів придатної послідовності, які є ідентичними нуклеотидам у послідовності для порівняння, після вирівнювання послідовностей для досягнення максимального 95 ідентичності послідовності. 95 ідентичності послідовності може визначатися з застосуванням будь-яких способів або алгоритмів, прийнятих у даній галузі, таких, як алгоритми АГІСМ, ВІ АБ5Т та ВІ А5Т 2.0. Див. Айбспиі 5, єї аї., Мис Асідв
Вев. 1977; 25: 3389 - 3402, та Аїйї5спиці 5, єї а!., У Мої Віої. 1990; 215: 403 - 410.
У контексті даного опису 95 ідентичності послідовності розраховують шляхом ділення кількості нуклеотидів, які є ідентичними після вирівнювання послідовності для порівняння та послідовності, яка розглядається, на загальну кількість нуклеотидів у послідовності для порівняння та множення результату на 100. Терміни "кодувати" або "кодування" стосуються генетичного коду, який визначає, яким чином нуклеотидна послідовність транслюється у поліпептид або білок. Порядок нуклеотидів у послідовності визначає порядок амінокислот у поліпептиді або білку.
Термін "білок" означає макромолекулу, яка складається з одного або кількох лінійних ланцюгів амінокислот або поліпептидів. Білки можуть зазнавати посттрансляційних модифікацій, таких, як перетворення цистеїнового залишку та 3-оксоаланін, глікозилювання або зв'язування з металом. Глікозилювання білка являє собою додавання різних вуглеводів, які ковалентно зв'язуються з амінокислотним ланцюгом.
Термін "ефективна кількість" означає кількість речовини, достатню для досягнення передбаченої мети. Наприклад, ефективною кількістю вектора ААМУ для підвищення активності альфа-М-ацетилглюкозамінідази (МАСІ) є кількість, достатня для зниження накопичення глікозаміноглікану. "«ерапевтично ефективною кількістю" вектора експресії для лікування від хвороби або порушення є кількість вектора експресії, яка є ефективною для зниження або усунення ознак та симптомів хвороби або порушення. Ефективна кількість даної речовини може коливатися залежно від таких чинників, як характер речовини, шлях введення, розмір та вид тварини, яка має отримувати речовину, та мета введення цієї речовини. Ефективна кількість у кожному окремому випадку може визначатися емпірично спеціалістом у даній галузі згідно зі способами, прийнятими у даній галузі.
Термін "суб'єкт" означає ссавця, в оптимальному варіанті - людину або відмінного від людини ссавця, у ще кращому варіанті - мишу, щура, інших гризунів, кроля, собаку, кота, свиню, 60 велику рогату худобу, коня або примата, у ще кращому варіанті - людину.
Термін "функціонально зв'язаний" означає функціональний зв'язок та розташування промоторної послідовності відносно потрібного гена (наприклад, промотор або енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності). Як правило, функціонально зв'язаний промотор є суміжним з потрібною послідовністю. Однак енхансер не має бути суміжним з потрібною послідовністю для контролю її експресії.
Термін "тропізм"' означає спосіб, у який різні віруси розвинулися для преференційного спрямування на види-хазяї або специфічні типи клітин у межах цих видів.
Термін "генна терапія" стосується перенесення потрібного генетичного матеріалу (наприклад, ДНК або РНК) до хазяїна для лікування або профілактики генетичної або набутої хвороби або стану. Потрібний генетичний матеріал кодує продукт (наприклад, білковий поліпептид, пептид або функціональну РНК), вироблення якого іп мімо є бажаним. Наприклад, потрібний генетичний матеріал може кодувати фермент, гормон, рецептор або поліпептид, які мають терапевтичне значення.
Терміни "рекомбінантний вірусний вектор", "вірусний вектор", "рекомбінантний вектор" або "вектор" означають, агент, одержаний з природного вірусу з застосуванням технологій генної інженерії, які дозволяють переносити потрібний генетичний матеріал (наприклад, ДНК або РНК) у клітину, в результаті чого виробляється продукт, який кодується зазначеним генетичним матеріалом (наприклад, білковий поліпептид, пептид або функціональна РНК) у клітині-мішені.
Термін "рекомбінантна плазміда" або "плазміда" означає малу, циклічну, дволанцюгову, саморепліковану молекулу ДНК, яку одержують з застосуванням технологій генної інженерії, які дозволяють переносити потрібний генетичний матеріал до клітини, в результаті чого виробляється продукт, який кодується вищезгаданим генетичним матеріалом (наприклад, білковий поліпептид, пептид або функціональна РНК) у клітині-мішені. Крім того, термін "рекомбінантна плазміда" або "плазміда" також стосується малої, циклічної, дволанцюгової, самореплікованої молекули ДНК, яку одержують з застосуванням технологій генної інженерії, які застосовують під час виробництва вірусних векторів як носіїв геному рекомбінантного вектора.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід забезпечує нові нуклеотидні послідовності для лікування
Зо мукополісахаридозів, зокрема мукополісахаридозів типу ІІ (МРІЇ), або синдрому Хантера.
Нуклеотидні послідовності за даним винаходом кодують білок ідуронат-2-сульфатазу (що має назву ІЮ5) як встановлено у 5ЕО ІЮ МО: 1, фермент, задіяний у поетапному розкладанні глюкозаміногліканів гепарансульфату та дерматинсульфату. Терміни "природна ІО5" або "ІЮ5 дикого типу" відносяться у контексті даного винаходу до нуклеотидної послідовності, отриманої або виробленої з клітин-хазяїв з використанням способів, відомих фахівцям у цій галузі, або альтернативно хімічно синтезованих як вихідні речовини кодуючої послідовності (СО5) для ІЮ5 кожного виду. Переважно, "природна ІО5" або "ІЮ5 дикого типу" хімічно синтезовані з мишачого
СО5 (що має назву тіО5) або з людських СО5З (що має назву ПІО5). Більш переважно нуклеотидну послідовність ПОЗ хімічно синтезували з людських СО5 та відповідала 5ЕО ІЮ МО: 2.
За даним винаходом, було задокументовано, що модифіковані нуклеотидні послідовності, що також називаються модифіковані нуклеотидні послідовності, опосередковують виробляння більших кількостей бажаного білку, можливо через ефективну транскрипцію іРНК або транскрипцію більш стабільної ІРНК або більш ефективному використанню кодонів. Ці послідовності у цій заявці мають назву "оптимізовані послідовності" оті5 та опІО5, якщо отримані з мишачих чи людських СО5, відповідно. переважно, оптимізовані послідовності за даним винаходом є кодон оптимізованими послідовностями.
Тому перший аспект даного винаходу відноситься до ізольованої нуклеотидної послідовності, що кодує білок ідуронат-2-сульфатазу (105) відповідно до ЗЕО ІЮ МО:1, що має
БО від 75 95 до 90 95 ідентичності з хЕО ІЮ МО:2. Зокрема, ізольована нуклеотидна послідовність за даним винаходом має 75 95, 76 95, 77 95, 78 95, 79 95, 80 95,82 95, 85 95, 87 95 або 90 95 ідентичності з «БЕО ІЮ МО:2. У переважному втіленні, ізольовані нуклеотидні послідовності за даним винаходом вибирають з опір5-варіант! відповідно до 5ЕО ІЮ МО:5 та опір5-варіант2 відповідно до ЗЕО ІЮ МО:8. Відповідно до даного винаходу, ізольовані послідовності описані у цій заявці вище можуть бути вставлені у сайт множинного клонування (МСОС5) скелетної плазміди. Зокрема, скелетна плазміда є плазмідою, що містить ІТК5 аденоассоційованого вірусу (ААМ), що у цій заявці має назву рААМм.
Другий аспект даного винаходу забезпечує плазміду, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок ідуронат-2-сульфатазу (105) відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 1 та має принаймні 75 90 60 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 2. Переважно, плазміда за даним винаходом має від 75 95 до 90 95 ідентичності з ЗЕО ІЮО МО: 2. Зокрема, плазміда за даним винаходом містить ізольовану нуклеотидну послідовність, що має 75 905, 76 905, 77 905, 78 90, 79 905, 80 905, 82 95, 85 95, 87 95 або 90 до ідентичності з БЕО ІО МО: 2. У переважному втіленні, плазміда за даним винаходом і містить нуклеотидну послідовність, вибрану з ПІ відповідно до 5ЕБЕО ІЮ МО: 2, опІО5З-варіант!1 відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 5 та опІО5-варіант2 відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 8.
Додатково до ізольованої послідовності, зазначеної вище, плазміди за даним винаходом також містять звичайні контрольні елементи, що можуть бути функціонально зв'язані з нуклеотидною послідовністю таким чином, що це дозволяє її транскрипцію, трансляцію та/або експресію у клітині, трансфектованій плазмідами. Зокрема, плазміди за даним винаходом містять промотор як контрольний елемент, функціонально зв'язану з бажаною нуклеотидною послідовністю. Велика кількість промоторів, які є нативними або химерними, конститутивними або індуцибельними, звичайними та/або специфічними для тканин, відомі в даній галузі.
Переважно, промотор, що використовується в контексті даного винаходу, є промотором САС, який відноситься до комбінації, що включає елемент раннього енхансера цитомегаловірусу та промотор курячого ЮО-актину. Він додатково включає частини курячого В-актину та інтронів О- глобіну кроля, які забезпечують стійкість до іРНК, одержаної з бажаної нуклеотидної послідовності, див. Аіехороціои А еї аІ., ВМС Сеїї Віоіюду 2008; 9 (2): 1-1. Промотор САС, що входить до плазмидів рдДАМ за даним винаходом, має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 14. Цей специфічний промотор САС дозволяє тривалу експресію відсутнього ферменту у всіх ділянках головного мозку та в печінці Як наслідок, коригується лізосомальне накопичення глікозаміноглікану (САС), таким чином запобігаючи неврологічні та соматичні зміни, характерні для МРІЇ.
У переважному втіленні, плазміда за даним винаходом є плазмідою рАдАМ-САс-пІОБ5, відповідно до 5ЕО ІЮ МО: З з номером доступу ОМ 29866.
В іншому особливо переважному втіленні, плазміда за даним винаходом є плазмідою рАддмМ-
САа-опІр5-варіант1, відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 6 з номером доступу ОМ 29867.
В іншому особливо переважному втіленні, плазміда за даним винаходом є плазмідою рАддмМ-
САа-опІр5-варіант2, відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 9 з номером доступу ОМ 29868.
Третій аспект даного винаходу відноситься до нових рекомбінантних векторів для лікування мукополісахаридозів типу ІЇ. Слід розуміти, що вектор за даним винаходом є капсидним білком, а також векторним геномом, який міститься всередині, який використовується для передачі бажаного генетичного матеріалу в клітину. Крім зазначеного бажаного генетичного матеріалу, геном вектору може також містити різні функціональні елементи, які включають контрольні елементи для транскрипції, такі як промотори або оператори, ділянки, що зв'язують фактори транскрипції, або енхансери та контрольні елементи для ініціювання або припинення трансляції.
Вектори за даним винаходом походять від аденоассоційованих вірусів (ААМ) і використовуються для перенесення бажаної нуклеотидної послідовності в клітину-мішень. Вони довели свою високу ефективність при передачі сигналу постмітотичних клітин у широкому діапазоні тканин. В контексті даного винаходу, вектори використовуються для доставки кодуючої послідовності ідуронат-2-сульфатази людини (пПІО5 з 5ЕБЕО ІЮ МО: 2) або оптимізованого варіанту кодуючої послідовності ідуронат-2-сульфатази людини (о0пІО5-варіант1
ЗЕБЕО ІЮ МО: 5 або опірзЗ-варіант2 ЗЕО ІЮО МО: 8). Адено-асоційований вектор - це вектор, одержуваний з адено-асоційованого вірусу сімейства рагмомігідае. Геном аденоасоційованих вірусів побудований з одноланцюгової дезоксирибонуклеїнової кислоти (55ДНК). Ці віруси заражають ссавців, але не патогенні (тобто не викликають хвороби). Вони можуть заразити ділення або неділення клітини, а їх тропізм змінюється в залежності від серотипу. Серотип являє собою класифікацію груп вірусів, залежно від їх капсидних антигенів. Серотип адено- асоційованого вірусу, визначеного його капсидним білком, визначає вірусний тропізму та дозволяє вводити її в специфічний тип клітин. У контексті даного винаходу, ААМ має серотип 1, 2, 5, 7, 8, 9 або 10. Бажано, ААМ має серотип 9 (ААМО), оскільки він показує найкращу здатність доставляти генетичний матеріал для мозку, а також периферичні органи при одноразовому введенні в С5Е. ААМОУ вектори за даним винаходом складаються з вірусної капсиди серотипу 9 аденоасоційованого вірусу людини та модифікованого геному, що містить інвертовані повторювані термінали (ІТК5) аденоассоційованого вірусу людини серотипу 2, промотора САС, кодуючу послідовність людського гену ідуронат-2-сульфатази (ПІБ) або його оптимізований варіант (також називають нуклеотидною послідовністю за даним винаходом), і поліА з гена бета-глобуліну кроля.
У цьому аспекті винахід відноситься до рекомбінантного ААМ, що містить нуклеотидну 60 послідовність, що кодує білок ідуронат-2-сульфатази (105) відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 1 та має принаймні 75 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 2. Переважно, рекомбінантний ААМ за даним винаходом має від 75 95 до 90 95 ідентичності з ХЕО ІЮ МО: 2. Зокрема рекомбінантний ААМ за даним винаходом містить нуклеотидну послідовність за даним винаходом що має 75 905, 76 9бо, 77 9Ув, 78 95, 79 95, 80 95, 82 95, 85 95, 87 95 або 90 95 ідентичності з ЗЕО ІЮ МО: 2. У кращому втіленні, виділені нуклеотидні послідовності, що містяться у рекомбінантному ААМ за даним винаходом, вибирають з ПІОЗ відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 2, опІО5-варіант1 відповідно до ЗЕО ІЮ
МО: 5 та опІр5-варіант2 відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 8.
У переважному втіленні даного аспекту, винахід відноситься до рекомбінантного ААМУ9, що містить нуклеотидну послідовність що кодує білок ідуронат-2-сульфатази ІО5 відповідно до БЕО
ІО МО: 1 та має принаймні 75 95 ідентичності з ЗЕО ІЮО МО: 2. Переважно, рекомбінантний ААМУ за даним винаходом містить нуклеотидну послідовність що має від 75 95 до 90 95 ідентичності з
ЗБО ІЮ МО: 2. Зокрема рекомбінантний ААМУ за даним винаходом містить нуклеотидну послідовність за даним винаходом що має?75 905, 76 905, 77 90, 78 90, 79 90, 80 Уо, 82 90, 85 Фо, 87 90 або 90 95 ідентичності з «ЗЕОЇ О МО: 2.
У переважному варіанті, рекомбінантний ААМУ за даним винаходом містить нуклеотидні послідовності, вибрані з НІОЗ відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 2, опІО5-варіант відповідно до 5ЕО ІЮ
МО: 5 та опІО5-варіант2 відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 8. Крім того, було несподівано встановлено, що асоціація капсиду ААМУ у тому ж об'єкті з нуклеотидною послідовністю, що кодує ідуронат-2- сульфатази (105) разом із вибраним промотором, особливо промотором САС, тривалу експресію відсутнього ферменту у всіх ділянках головного мозку, зокрема, коли його доставляють до спинномозкової рідини (ЦСЖ) через внутрішньосерцеву ін'єкцію.
Як наслідок, коригується лізосомальне накопичення глікозаміноглікану (ЗАС), таким чином запобігаючи неврологічні зміни, характерні для хвороби М5РІЇ. Цей ефект спостерігався навіть у нюхової бульби, яка далека від точки введення векторі (велика цистерна). Далі ААМО9 вектори за даним винаходом, доставлені в С5Е, змогли досягти системного кровообігу для перенесення у печінку. Вироблення та секреція ферменту клітинами печінки призвели до збільшення активності ідуронат-2-сульфатази (105) в сироватці крові, що в кінцевому підсумку призвело до зниження патології лізосом у багатьох соматичних тканинах. Це являє собою явну перевагу вектору за даним винаходом над існуючими підходами, які лише частково виправляють клінічні ознаки захворювання і зазвичай впливають як на мозок, так і на системний кровообіг, але не на обидва.
Відповідно, даний винахід стосується векторів ААМОУ9, що містять промотор САС, зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує білок ідуронат-2-сульфатази (105) відповідно до 5ЕО ІЮ
МО: 1.
Зокрема ААМОУ вектори за даним винаходом і містять САС промотор, зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує білок ідуронат-2-сульфатази (105) відповідно до 5ЕО ІЮ
МО: 1 та має принаймні 75 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 2. Переважно, ААМУ вектори за даним винаходом містить САС промотор, зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує білок ідуронат-2-сульфатази (105) відповідно до 5ЕО ІЮО МО:1 що має від 75 9о та 90 95 ідентичності з
ЗБО І МО: 2. Зокрема нуклеотидна послідовність, що міститься у ААМУ векторі за даним винаходом, має 75 905, 76 905, 77 90, 78 90, 79 95, 80 95, 82 95, 85 95, 87 90 або 90 95 ідентичності з
ЗЕО ІО МО: 2. У кращому втіленні, рекомбінантний вектор за даним винаходом являє собою
ААУЗ-САС-пІЮ5 (5БО ОО МО: 4) що містить нуклеотидну послідовність 5ЕБЕО ІЮ МО:2 функціонально зв'язану з САС промотором 5ЕО ІЮ МО: 14.
У переважному втіленні, рекомбінантний вектор за даним винаходом є ААМ9-САДа-опІр5- варіанті! (ЗЕО ІЮ МО: 7), що містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5 функціонально зв'язану з САС промотором 5ЕО ІЮО МО: 14.
У переважному втіленні, рекомбінантний вектор за даним винаходом є ААМ9-САа-опІр5- варіант2 (ЗЕО ІЮ МО: 10), що містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8 функціонально зв'язану з САС промотором 5ЕО ІЮО МО: 14.
Рекомбінантний вектор за даним винаходом, як визначено у цій заявці, може бути отриманий з відповідних плазмід, які також описані у цій заявці вище шляхом трансфекції
НЕК?293 клітин, за допомогою способів, відомих у цій галузі.
Даний винахід також забезпечує спосіб вироблення аденоасоційованих вірусних рекомбінантних векторів ААМ згідно з винаходом, особливо ААМ9У. Спосіб включає такі стадії: ї) забезпечення першої плазміди, який включає послідовність, яка кодує потрібний білок, розташований між першим кінцевим повтором ААМ та другим кінцевим повтором ААМ, промотор
САС, функціонально зв'язаний з послідовністю, яка кодує потрібний білок; другий вектор, який включає ген ААМ гер та ген ААМ сар, та третій вектор, який включає аденовірусний ген з бо хелперною функцією;
ії) котрансфекцію компетентних клітин векторами з стадії і); ії) культивування трансфікованих клітин з стадії ії) протягом періоду часу достатнього для виробляння вірусних частинок; і їм) очищення векторів експресії від культури з стадії її).
В оптимальному варіанті втілення першим та другим кінцевими повторами ААМ першого вектора є ІТК з ААМ серотипу 2. В іншому оптимальному варіанті втілення гени ААМ гер другого вектора належать до ААМ серотипу 2. В іншому оптимальному варіанті втілення компетентними клітинами є клітини НЕК293. В іншому оптимальному варіанті втілення, ААМ сар гени другого вектору отримані з ААМ серотипу 9.
Винахід також забезпечує спосіб одержання плазміди згідно з винаходом, який включає такі стадії: ї) вирізання послідовності, яка кодує потрібний білок, з початкової плазміди шляхом розщеплення, зокрема, з застосуванням МіІш//Есокі, ії) клонування послідовності, яка кодує потрібний білок, між двома сайтами рестрикції скелетної плазміди ААМ рААМ-САС, з одержанням, таким чином, відповідної плазміди, яка включає послідовність, яка кодує потрібний білок.
Даний винахід у додатковому аспекті передбачає фармацевтичні композиції, які містять терапевтично ефективну кількість описаних авторами векторів ААМУО або терапевтично ефективну кількість описаних в цьому документі плазмід.
Фармацевтичні композиції згідно з винаходом включають ізольовані нуклеотидні послідовності, описані у цій заявці, плазміди, описані у цій заявці, або вектори ААМ, описані у цій заявці, у фармацевтично прийнятному носії. Композиція також може включати принаймні одну допоміжну речовину. Допоміжні речовини можуть бути вибрані з-поміж носіїв, ексципієнтів, розчинників, розріджувачів або ад'ювантів. Прийнятні носії, розріджувачі або ад'юванти є нетоксичними і в оптимальному варіанті інертними у застосовуваних дозах та концентраціях, і до них належать буфери, такі, як фосфат, цитрат або інші органічні кислоти; антиоксиданти; низькомолекулярні поліпептиди, білки, такі, як альбумін сироватки, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери; амінокислоти; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатоутворювальні речовини; цукрові спирти, такі, як маніт або
Зо сорбіт, солеутворювальні протиіони, такі, як натрій; та/або неіонні поверхнево -активні речовини, такі, як блок-співполімер поліетилену-поліоксипропілену (Рійгопіс Еб682) полієтиленгліколь (РЕС).
В переважному варіанті втілення фармацевтичні композиції згідно з винаходом є придатними для парентерального введення. Прикладами парентерального введення можуть бути внутрішньовенні, підшкірні, інтрацистернальні та внутрішньом'язові ін'єкції. В оптимальному варіанті фармацевтична композиція згідно з винаходом є придатною для внутрішньовенного або інтрацистернального введення. До композицій, придатних для такого парентерального введення, належать стерильні водні розчини або дисперсії, стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних розчинів або дисперсій. В оптимальному варіанті фармацевтичні композиції згідно з винаходом є захищеними від забруднювальної дії бактерій та грибків.
Доза для людей та тварин може коливатися залежно від чинників, які грунтуються на відповідних видах, або інших чинників, таких, як вік, стать, маса або ступінь тяжкості хвороби і т. ін.
Інший аспект даного винаходу стосується терапевтичного застосування описаних у цій заявці ізольованих нуклеотидних послідовностей, описаних у цій заявці плазмід, або векторів
ААМ, особливо описаних у цій заявці векторів ААМУ. Як було згадано вище ізольовані нуклеотидні послідовності, плазміди, описані у цій заявці, або вектори ААМ, особливо вектори
ААМОУ вектори за даним винаходом опосередковують експресію відсутнього ферменту ІБ, таким чином коригуючи лизосомальне накопичення 5АС5. Це дозволяє коригувати всі клінічні ознаки мукополісахаридозів типу ЇЇ (МРОЇЇ). У цьому сенсі даний винахід також стосується описаних у цій заявці ізольованих нуклеотидних послідовностей, описаних у цій заявці плазмід, або векторів ААМ, особливо описаних у цій заявці векторів ААМУ, для їх застосування як медикаментів.
Зокрема, винахід стосується описаних у цій заявці ізольованих нуклеотидних послідовностей, описаних у цій заявці плазмід, або векторів ААМ, особливо описаних у цій заявці векторів ААМО, для підвищення ідуронат-2-сульфатазної (105) активності в організмі.
У ще одному оптимальному аспекті даний винахід стосується описаних у цій заявці ізольованих нуклеотидних послідовностей, описаних у цій заявці плазмід, або векторів ААМ,
особливо описаних у цій заявці векторів ААМУ, для лікування мукополісахаридозів типу ЇЇ (МРІЇ).
У ще одному варіанті втілення даний винахід стосується застосування описаних у цій заявці ізольованих нуклеотидних послідовностей, описаних у цій заявці плазмід, або векторів ААМ, особливо описаних у цій заявці векторів ААМО9, для виготовлення медикаменту, придатного для лікування мукополісахаридозів типу ІІ (МРОЇ!Ї).
Інший варіант втілення даного винаходу стосується способу лікування мукополісахаридозів типу ЇЇ (МРБІЇ), який включає стадії введення принаймні ізольованих нуклеотидних послідовностей, описаних у цій заявці плазмід, або векторів ААМ, особливо описаних у цій заявці векторів ДАМО, суб'єктові, який цього потребує.
Даний винахід також забезпечує виділену клітину, яка включає нуклеотидну послідовність, яка кодує ідуронат-2-сульфатазу 5ЕО ІО МО: 1. Зокрема, клітина згідно з винаходом включає нуклеотидну послідовність, яка кодує білок ідуронат-2-сульфатазу (105) відповідно до ЗЕО ІЮ
МО: 1 що має принаймні 75 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 2, та переважно від 75 905 до 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО 10 МО: 2. Зокрема, нуклеотидна послідовність, що міститься в ізольованій клітині за даним винаходом, має 75 90, 76 95, 77 о, 78 905, 79 95, 80 95, 82
Фо, 85 95, 87 95 або 90 95 ідентичності послідовності з 5ЕО ІО МО: 2. В оптимальному варіанті згідно з винаходом включають нуклеотидну послідовність ХЕО ІЮ МО: 2, яка кодує ідуронат-2- сульфатазу (105) 5ЕО ІЮО МО: 1.
У ще одному переважному варіанті втілення клітини згідно з винаходом включають нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 5 яка кодує ідуронат-2-сульфатазу (105) ЗЕО ІО МО: 1.
У ще одному переважному варіанті втілення клітини згідно з винаходом включають нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8 яка кодує ідуронат-2-сульфатазу (105) ЗЕО ІО МО: 1.
Представлені нижче приклади є лише ілюстративними і пояснюють певні варіанти втілення винаходу і не можуть розглядатись як такі, що будь-яким чином його обмежують. загальні МЕТОДИКИ 1. Рекомбінантні вектори ААМ
Описані авторами вектори ААМ одержували шляхом потрійної трансфекції. Матеріалами, які вимагалися для одержання векторів, були: клітини НЕК293 (які експресують гени ЕТ), хелперна
Зо плазміда, яка забезпечує аденовірусну функцію, плазміда, яка забезпечує гени ААМ гер з серотипу 2 та гени сар з серотипу 9 (ААМОУ), і, нарешті, скелетна плазміда та ААМ2 ІТК та потрібною послідовністю
Для вироблення експресуючих ідуронат-2-сульфатазу векторів ААМ, неоптимізовані або оптимізовані кодуючи послідовності людської чи мишачої ідуронат-2-сульфатази клонували у скелетну плазміду ААМ під контролем універсального гібридного промотора САС. Масштабне виробляння плазмід здійснювали за допомогою Епдоггеє Ріахтій Медаргер Кії (Оіадеп).
Вектори генерували шляхом здійснюваної без хелперного вірусу трансфекції клітин НЕК293 з застосуванням трьох плазмід з модифікаціями. Див. Маїзизхпйа Т, єї аІ., бепе Тег. 1998; 5:938 - 945, та Мугідні У, еї аїЇ., Мої. Тег 2005; 12: 171 - 178. Клітини культивували до 7095 конфлюентності у ролерних флаконах (КВ) (Согпіпуд, Согпіпу, МУ, США) у ОМЕМ, доповненому 1095 ЕВ5, а потім спільно трансфікували з: 1) плазмідою, яка включає експресійну касету, оточену вірусними ІТК серотипу 2 ААМ (як описано вище); 2) плазмідою, яка включає гени ААМ гер2 та сар9; та 3) плазмідою, яка включає хелперні функції аденовірусу. Вектори очищали двома послідовними градієнтами густини хлориду цезію з застосуванням оптимізованого протоколу, як описано вище. Див. Ауизо Е, єї аіІ., Сбепе ТНег. 2010; 17: 503 - 510. Вектори діалізували проти РВ5, фільтрували, титрували шляхом кількісної ПЛР і зберігали при температурі -80 "С до застосування.
Вектори згідно з даним винаходом будували згідно з технологіями молекулярної біології, які є загальновідомими серед фахівців у цій галузі. 2. Тварини
Ідуронат-2-сульфатази-дефіцитну мишачу (МРОЇЇ) модель опридбавали у Тасопіс (Септапіомл, ММ 12526 ОБА, 2оскК ТЕ1838). Уражених МРБЇЇВ та здорових контрольних мишей одержували шляхом інбридингу від гомозиготних самців та гетерозиготних самок пладників.
Генотип визначали на геномній ДНК зі зразків зі зрізаними хвостами шляхом ПЛР -аналізу, що ампліфікує послідовність, яка охоплює задану мутацію. Послідовностями відповідних смислових та антисмислових праймерів були: прямий праймер: 5- ТТ тат СТА СТО САА ССО Са -3 (ЗЕО ІО МО: 15), зворотний праймер: 5- ТИТ СТО САТ ААС дас ССА са -3 (5ЕО І МО: 16), мутація зворотного праймера: 5- 1400 СТО АСА ТТ ССА ДА СА -3' (5ЕО І МО: 17). Мишей годували ай Ірйит з застосуванням стандартного раціону (Нагіап, Текіапа)) і тримали в умовах бо 12-годинного циклу світла-темряви (світло з 9:00 ранку).
3. Гідродинамічне введення кодуючих ІО5 плазмід в організм мишей
Для гідродинамічного введення плазмід рдАУ-САС-пІЮО5, рдАМ-САСсі-опІО5-варіант 1 та рААУ-Сда-опІро-варіант 2, З двомісячні тварини з МР5БІЇ та тварини дикого типу шляхом ін'єкції у хвостову вену отримували за «5 секунд загальну дозу 30 мкг плазміди в об'ємі, який дорівнював 1095 маси тіла тварини. Ця технологія в результаті забезпечує експресію кодованих плазмідою трансгенів здебільшого у печінці. Див. (іш єї аІ., Сепе ТНег. 1990; 6(7): 1258 - 66.
Контрольна група мишей отримувала такий самий об'єм сольового розчину. Мишей розділяли на дві групи, та умертвляли через 48 годин або через 1 тиждень після гідродинамічної ін'єкції плазмід. Органи збирали, як описано у наступному розділі. 4. Введення вектора в організм мишей
Для інтрацистернального введення векторів ААМ9-САСІ-ОотіО5 в організм мишей загальну дозу 5х1079 мд вводили шляхом ін'єкції у мостомозочкову цистерну двомісячних тварин з МРІЇ.
Подібна група тварин отримувала ін'єкцію 5х10'9 уд контрольного некодуючого (ААМОУ-пиїЇ) вектора. У віці б та 10 місяців, тобто через 4 та 8 місяців після введення вектора, мишей анестезували та тканини збирали. Для внутрішньовенного введення векторів ААМ9, що містили дикого типу ПОЗ або будь-який з оптимізованих варіантів (05 кодуючої послідовності мишам, загальну дозу 1х10"9 уд вектора вприскували шляхом ін'єкції у хвостову вену 3,5-місячних МР5ЇЇ тварин. М/Т та не проліковані тварини МРЗБІЇ слугували контрольними. Через три тижні після введенні векторів, мишей піддавали анестезії та збирали тканини. 5. Збирання зразків
При умертвінні, тварин піддавали глибокій анестезії, а потім здійснювали транскардіальну перфузію 12 мл РВ5 для повного очищення крові від тканин. Весь головний мозок та різні соматичні тканини (включаючи печінку, селезінку, підшлункову залозу, нирки, легені, серце, скелетні м'язи, сім'яники, січовий міхур, та адипозні тканини) збирали й заморожували у рідкому азоті і зберігали при температурі -80 "С або занурювали у формалін для наступних гістологічних аналізів. 6. Кількісне визначення ідуронат-2-сульфатазної активності та глюкозаміноглікану
Зразки головного мозку, печінки, легенів та серця обробляли ультразвуком в очищеній з застосуванням Міїї-оО воді. Сироватку аналізували без обробки, ідуронат-2-сульфатазну
Зо активність визначали за допомогою одержаного з 4-метилумбеліферону флуорогенного субстрату (Мозсегдат Зибзігагез, Оєдзідеезі, Нідерланди), як описано вище. Див. Могпуї еї аї.,
У Іппег Меїаб бів5 2001; 24:675-680. Рівень активності у головному мозку, печінці, легенях, та серці за загальною кількістю білка, яку визначали з застосуванням способу Бредфорда (Віо-
Кад, Негсцез, СА, США). Активність у сироватці нормалізували за об'ємом.
Для визначення кількості глікозаміноглікану (ЗАС) зразки тканини зважували, а потім розщеплювали Протеїназою К і екстракти очищали шляхом центрифугування та фільтрації.
Рівень САО визначали в екстрактах тканин за допомогою комплекту Віузсап сульфатованого глікозаміноглікану (ВіосоЇог, СатіскКтегди5, Соципіу Апігіт, Великобританія) з застосуванням хондроїтин-4-сульфату як стандарту. Рівень САС нормалізували за масою вологої тканини. 7. Активність інших лізосомальних ферментів
Зразки печінки та головного мозку обробляли ультразвуком в 500 мкл МіїЇ-0О води та ферментні активності визначали в над осадових рідинах за допомогою 4 одержаних з 4- метилумбеліферону флуорогенних субстратів. Сироватку аналізували без обробки. Активність
ІШООА вимірювали у 15 мкг білка, який інкубували протягом 1 год при 37"С з 4- метилумбеліферил-а-М-індуронідом (СіІусозупій). Див. Васіег еї аїЇ., Віоса 2002:99(5)1857-9.
Активність ЗО5Н вимірювали, як описано вище. Див. Кагрома еї аїЇ., У Іппегї Меїар бів. 1996;19(3):278-285, Нашгідої еї аІ., вище. Стисло, 30 мг білка спочатку інкубували з 4-МО-асісМмо протягом 17 годин при 47 "С. Друге інкубування проводили у присутності 10 О/мл а-глюкозідази (бБідта-Аїагісн) у 0,295 ВЗА протягом 24 годин при 37 "С. Для визначення активності МАСІ І, 30 мкг екстракту білкових тканин інкубували з 4 з 4-метилумбеліферил-сс-і -індуронід-2-сульфатом (Мозсегаат 5ибрзіга(ез) протягом З год при 37 "С, як описано вище. Див. МагеП еї аї., Сіїп Сепеї. 1985; 27(3)258-62, Кірега еї аЇ. вище. НОЗМАТ активність визначали з 30 мкг білкового екстракту, інкубованого з ацетилююоферментом А та 4-метилумбеліферил-3-О-глюкозаміном (МО-ЗСІСМН2, Мозсегдат Зибзігаїгез) протягом 17 год при 37 "С. Див. Могпуї еї аї., У пп Меїар
Ріє 1993;16:465-72. (ЗАЇМ5 активність визначали за допомогою 2-етапного протоколу із застосуванням 10 мкг білкового екстракту та 4-метилумбеліферил-В-О-галактопіранозід-6- сульфат натрієвої солі (МО-ЗСіаІ-65) протягом першої інкубації при 17 год при 37 "С. Другий етап проводили, додаючи Рі-буфер (0,9М МагжНРО./0,9М МанНнегРОзбуфер, рна4,3 «ж 0,0295 (мас/об)
Ма- азид) та ВД-галактозидазу (В-СаІ-Ао, Зідта) та інкубували суміщ протягом 2 год при 37 "С. бо Див. мап Оіддеїеп еї а!., Сіїп Спіт Асіа 1990;187:131-40. Активність ОВ ферменту визначали з
10 мкг білкового екстракту, інкубованого з 4- метилумбеліферил-3-О-глюкоронідом (Зідта) при 37 "С протягом 1 год. НЕХВ активність аналізували шляхом інкубування 0,1 мкг білкового екстракту з 4-метилумбеліферил М-ацетил-В- ЮО-глюкозамідіну (Зідта) протягом 1 години при 37 "С. Після зупинення реакції шляхом підвищення рН, вивільнена флуоресценція була виміряна за допомогою фдуориметру Ріх800 (ВіоТек Іпзігитепів). Усі рівні активностей головного мозку та печінки нормалізуваливідносно загальної кількості білків, кількісно визначеної за допомогою аналізу білків Вгад'тога (Віо-Райд, Негсиіе5, СА, ОБ). 8. Гістологічний аналіз
Тканини фіксували протягом 12-24 годин у формаліні, вбудованому в парафін і розділяли.
Для імуногістохімічного виявлення (АМР2 у мозку парафінові секції піддавали вилученню епітопа, який був спричинений нагріванням, в цитратному буфері, рН 6, а потім інкубували протягом ночі при 4 С щурячим антитілом інкубували з біотинільованим кролячим анти- щурячим антитілом (ОакКо, Сіовігир, Данія) при 1: 300. Для імунозабарвлення СЕАР у зразках головного мозку парафінові секції інкубували протягом ночі при 4 "С кролячим антитілом анти-
СЕАР (Арбб73, Ареат, Кембридж, Великобританія), розбавленим при 1:1000, і потім інкубували з біотинільованим козячим анти-кролячим антитілом (31820; Месіог І арогайгіе5, Берлінгейм,
Каліфорнія, США) при 1:300. Сигнали (АМР2 та СЕАР посилювали шляхом інкубації секцій з набором для забарвлення АВС-пероксидази (Тпегто 5сіепіййс, УУайпат, Массачусетс, США) при розбавленні 1:100 та візуалізували з використанням 3,3-діамінобензидину (Зідта-Аїагісн, 51.
І оці5, Міссурі, США) як хромоген.
Щоб забарвити мікрогліальні клітини у зразках головного мозку, парафінові секції інкубували протягом ночі при 4 "С з лектином В5І-В4 (15391; бідта-АїІЯгісй, Сент-Луїс, Міссурі, США), розведеним 1:100. Сигнал В5І-84 був візуалізований, використовуючи 3,3-діамінобензидин (бБідта-Аїагісп, Сент-Луїс, Міссурі, США) як хромоген. Зображення ВгідннеЇй були отримані за допомогою оптичного мікроскопа (Есіїрзе 90і, Мікоп, Токіо, Японія).
Програмне забезпечення МІЗ5 ЕІетепіє Адмапсей Кезеагспй 2.20 було використано для кількісного вимірювання сигналів ГАМР2, СЕАР та В5І-84 в 3-4 зображеннях кожної ділянки головного мозку (оригінальне збільшення, х20) на кожну тварину, використовуючи ті ж параметри порогового сигналу для всіх тварин. Потім розраховували відсоток позитивної ділянки, тобто площу, у пікселях, з позитивним сигналом по загальній ділянці тканин на зображенні. 9. Кількісна оцінка номера копії векторного геному в тканинах
Після дигестації протягом ночі в Ргоїеіпазе К (0,2 мг/мл), загальна ДНК була виділена за допомогою набору для очищення МахзіегтРигеОМА (Ерісепіег). Кількісна ПЛР з праймерами та зондом, специфічним для послідовності НВВ2 (містяться в сегменті поліА), використовували для кількісного визначення кількості копій векторного генома в 20 нг загальної ДНК. Прямий праймер: 5-СТТ САС САТ СТО АСТ ТСТ Сас ТАА Т-3"; зворотний праймер: 5-САТ Та СОС
ТОС САТ АТО ТОО-3"; зонд: 5-20 АСТ ПАС АСА САС ААА дДАА ТТ САА САС-3. Стандартна реперна крива, побудована за допомогою послідовних розведень лінеаризованої плазміди, що містить поліА, була використана для інтерполяції кінцевих значень мд/зразок. 10. Тест відкритого поля
Поведінку б-місячних мишей аналізували за допомогою теста відкритого поля, що проводили між 9:00 і 13:00. Тварин поміщали у нижній лівий кут яскраво освітленої камери (41х41х30 см), перехрещений 2 пучками фотопроменів (ЗедаСотЗ32; Рапіар), які виявили горизонтальні та вертикальні рухи мишей. Поверхня ділянки була розділена на три квадратні концентричні ділянки: центр (14х14 см), периферія (27х27 см) та кордон (41х41 см).
Дослідницькі та рухові активності були записані протягом перших З хвилин тесту за допомогою системи відеоспостереження (Зтаїгі Уипіог, Рапіаб). 11. Статистичний аналіз
Усі результати виражено як середні значення -5ЄЕМ. Статистичні порівняння здійснювали з застосуванням однофакторного аналізу АМОМА. Множинні порівняння між контрольними та експериментальними групами мають здійснюватися з застосуванням апостеріорного критерію
Даннетта, та між усіма групами з використанням пост-експериментального теста Тьюкі.
Статистична значущість розглядалась у разі Р«0,05. Застосовують спосіб Каплана-Майєра для аналізу виживаності та логранговий критерій для порівнянь.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Побудова рдАУ-САа-нпІОЗ
Кодуючу послідовність (СО5) людської ідуронат-2-сульфатази застосовували як вихідний матеріал (стандартна послідовність МСВІ: ММ 000202.6) хімічно синтезували з цією метою
(Сепзетгірі Іпс). СО5 одержували кодовану всередині плазміди рОС57 (АтрВ) оточену сайтами рестрикції була.
СО5 фрагмент 5маІ-Зула! людської ідуронат-2-сульфатази вирізали з плазміди рОС57 та потім клонували між сайтами рестрикції Міші та ЕсоКіІ ААМ скелетної плазміди рдАМ-САС після надання 5' та 3' липкого кінця фрагменту Кіепом/ (Гептепіа5з). Т Утворена в результаті плазміда мала назву рдАМ- САС-пІО5 (номер доступу ОЗМ 29866). Див. Фіг. 1 А та БЕО ІО МО: 3.
Плазміду рдАМ-САС було попередньо генеровано, і вона містила ІТК з геному ААМ2, промотор САС та сигнал роїуА з Д-глобіну кроля, а також сайт множинного клонування для клонування потрібних СО5. Промотор САС є гібридним промотором, який складається з раннього/проміжного енхансера СММ та промотора курячого В-актину. Цей промотор є здатним до універсального започаткування ефективної експресії. Див. Зам/ісКі у еї а!., Ехрег Сеї! Вев. 1998; 244: 367 - 369, Ниапод У еї аї!., / Сепе Мед. 2003; 5: 900 - 908, ім М еї аї!., Ехр Мої Меа. 2007; 39(2): 170 - 175.
Приклад 2: Вироблення рдАУ-САсі-опІО5-варіанту!
Складали й одержували експресійні касети, які включали оптимізований варіант людської ідуронат-2-сульфатазної КДНК послідовності (0ПІО5). Оптимізацію послідовності (СепеАгі?) здійснювали для забезпечення максимальної ефективності вироблення білка ідуронат-2- сульфатази у людей через видалення прихованих ділянок сплайсингу та елементів послідовності дестабілізації РНК для поліпшення стійкості РНК, додавання елементів послідовності стабілізації РНК, оптимізації кодонів та адаптацію вмісту с/С, уникнення вторинних структур стійкої РНК та інші зміни. Те СО5 для людської ідуронат-2-сульфатази (МСВІ реперна послідовність: ММ 000202.6) використовували як вихідну точку для оптимізації послідовності (ОМА 2.0 пс). Оптимізовану СО5 отримували клонованою у плазміду руго4:191476 (АтрЕ) оточену сайтами рестрикції Міші та ЕсокКі на 5' та 3", відповідно.
МІшШи/ЕсокКІ, що оптимізувала фрагмент людської ідуронат-2-сульфатази СО5, вирізали з руг204:191476 плазміди та потім клонували між Мін! та ЕсоКІ сайтами рестрикції ААМ скелетної плазміди рдАМ-САС. Отриману в результаті плазміду називали рдАМ-САда-опІр5-варіант!1 (номер доступу ОБМ 29867). Див. Фіг. 2А та БЕО ІЮ МО: 6.
Приклад 3: Побудова рдАУ-САс-опІО5-варіанту2
Зо СО5 для людської ідуронат-2-сульфатази (МСВІ реперна послідовність: ММ 000202.6) піддавали оптимізації послідовності (зепезосгірі Іпс). Оптимізовану СО5 отримали клонуванням всередині плазміди РОС57 (АтрК), що розташована біля сайтів рестрикції Мічі та ЕсоКіІ на 5 та 3, відповідно. Плазміда рисС57-опІЮ5 перетравлювалися Міші! та ЕсокКіІ, щоб вирізати оптимізовану ідуронат-2-сульфатазну СО5. Потім цей фрагмент клонували між однаковими сайтами рестрикції рдДАМ-САС скелетної плазміди для генерування плазміди рдДАМ-САСІі-опІО5- варіант2 (номер доступу ОМ 29868). Див. Фіг. ЗА та 5ЕО ІО МО: 9.
Приклад 4: Побудова рдАМ-САСі-отір5
СО5 для мишачої ідуронат-2-сульфатази (МСВІ реперна послідовність: ММ 010498.3) піддавали оптимізації послідовності (сепеАгі; І їе ТесппоЇодіе5). Оптимізований СО5 отримали клонуванням всередині плазміди РМА-КО (АтрЕ), що розташована біля сайтів рестрикції Мі та ЕсоКІ на 5 та 3", відповідно.
Оптимізований фрагмент СО5 мишачої ідуронат-2-сульфатази (5ЕО ІО МО: 11), який був оптимізованим для Міш/ЕсоКІ, був виділений з плазміди рМА-КО, а потім клонований між сайтами рестрикції Міші та ЕсоКіІ, з ААМ скелетної плазміди рдАМ-САС. Отриману плазміду назвали рААУМ-САСі-отіюр5. Див. Фіг. 4А та ЗЕО ІЮ МО: 12.
Приклад 5: Виробляння ААМУ9-САИ-НПІЮ5
Вектори ААМ9-САС-ПІЮЗ (5ЕО ІЮО МО: 4) генерували шляхом здійснюваної без хелперного вірусу трансфекції клітин НЕК293 з застосуванням трьох плазмід з модифікаціями. Див.
Маїзизнйа єї аІ., Сепе Тег. 1998;5(7):938-45, М/гідні еї аі., Мої Тнег. 2005;12(1)171 -8. Клітини культивували до 70 9о конфлюентності у ролерних флаконах (АВ) (Согпіпд, Согпіпу, МУ, США) у
ОМЕМ, доповненому 10 95 ЕВ5, а потім спільно трансфікували з: 1) плазмідою, яка включає експресійну касету, оточену ІТЕ ААМ2 (рААМ-САСі-ПІЮ5); 2) плазмідою, яка включає гени ДАМ2 гер та ААМУ сар (рРКЕР2САРОУ); та 3) плазмідою, яка включає хелперні функції аденовірусу.
Вектори очищали двома послідовними градієнтами густини хлориду цезію з застосуванням стандартного протоколу або оптимізованого протоколу, як описано вище. Див. Ауизо, 2010, вище. Вектори діалізували проти РВ5, фільтрували, титрували шляхом кількісної ПЛР і зберігали при температурі -80 "С до застосування. Див. Фіг. 18.
Приклад 6: Виробляння ААМУ9-САСІ-опІО5-варіанту!
Вектори ААУМ9-САСІі-опІЮО5-варіант! (ЗЕО ІЮ МО: 7) генерували шляхом здійснюваної без бо хелперного вірусу трансфекції клітин НЕК293 з застосуванням трьох плазмід з модифікаціями.
Див. Маїхихпйа еї аї., апа Уугідні еї аІ., вище. Клітини культивували до 70 95 конфлюентності у ролерних флаконах (ВВ) (Сотіпо, Согпіпд, МУ, США) у ОМЕМ, доповненому 10 95 ЕВ5, а потім спільно трансфікували з: 1) плазмідою, яка включає експресійну касету, оточену ІТК ААМ2 (рРААМ-САСі-опІО5-варіанті); 2) плазмідою, яка включає гени ААМ2 гер та ААМУ сар (РКЕР2САРЗ); та 3) плазмідою, яка включає хелперні функції аденовірусу. Вектори очищали двома послідовними градієнтами густини хлориду цезію з застосуванням оптимізованого протоколу, як описано вище. Див. Ауизо, 2010, вище. Вектори діалізували проти РВ5, фільтрували, титрували шляхом кількісної ПЛР і зберігали при температурі -80 С до застосування. Див. Фіг. 28.
Приклад 7: Виробляння ААМ9-САСІ-опІО5-варіант2
Вектори ААМ9-САСІ-опІО5-варіант2 (ЗЕО ІЮ МО: 10) генерували шляхом здійснюваної без хелперного вірусу трансфекції клітин НЕК293 з застосуванням трьох плазмід з модифікаціями.
Див. Маїзизпйа еї аї., апа Мугідні еї аІ., вище. Клітини культивували до 7095 конфлюентності у ролерних флаконах (АВ) (Согпіпд, Соптіпуд, МУ, США) у ОМЕМ, доповненому 1095 ЕВ5, а потім спільно трансфікували з: 1) плазмідою, яка включає експресійну касету, оточену ІТК ААМ2 (рРААМ-САСі-опІО5-варіант2); 2) плазмідою, яка включає гени ААМ2 гер та ААМУ сар (рРКЕР2САРО); та 3) плазмідою, яка включає хелперні функції аденовірусу. Вектори очищали двома послідовними градієнтами густини хлориду цезію з застосуванням оптимізованого протоколу, як описано вище. Див. Аушзо еї а!., вище. Вектори діалізували проти РВЗ5 -- 0,001 Фо
Рішгопіс? Е68, фільтрували, титрували шляхом кількісної ПЛР і зберігали при температурі -80 20 до застосування. Див. Фіг. ЗВ.
Приклад 8: Виробляння ААМ9-САСІ-отір5
Вектори ААМ9-САС-отіО5 (5ЕБО 10 МО: 13) генерували шляхом здійснюваної без хелперного вірусу трансфекції клітин НЕК293 з застосуванням трьох плазмід з модифікаціями.
Див.Маїзизпйа еї аї!., апа Мугідні еї аІ., вище. Клітини культивували до 70 95 конфлюентності у ролерних флаконах (АВ) (Согпіпд, Соптіпуд, МУ, США) у ОМЕМ, доповненому 1095 ЕВ5, а потім спільно трансфікували з: 1) плазмідою, яка включає експресійну касету, оточену ІТК ААМ2 (рРААМ-САсі-отір5); 2) плазмідою, яка включає гени ААМ2 гер та ААМУ сар (рРЕЕР2САРУ); та 3) плазмідою, яка включає хелперні функції аденовірусу. Вектори очищали двома послідовними
Зо градієнтами густини хлориду цезію з застосуванням оптимізованого протоколу, як описано вищ.
Зеє Ауизо еї аї., вище. Вектори діалізували проти РВ5 -- 0,001 95 Рішгопіс? Е68, фільтрували, титрували шляхом кількісної ПЛР і зберігали при температурі -80 "С до застосування. Див. 48.
Приклад 9: Гідродинамічне введення рдАУ-САс-пІр5, рдАМ-САа-опІр5- варіанті та рААМ-
САа-опІр5-варіант2 здоровим мишам
Загальну дозу 30 мкг плазмід рдАМ-САСс-пІр5, рдАУМ-САсС-опІО5-варіант! та рдААУМ-САс- опІр5-варіант2, що містили різні варіанти ідуронат-2-сульфатази експресійної касети, вводили
М/Т мишам двомісячного віку вводили мишам двомісячного віку. Ця технологія забезпечує спрямування експресії доставленої плазміди у печінку. Див. Їій єї аіЇ., Сепе Тег. 1990; 6(7)1258-66.
Через сорок вісім годин після введення плазміди значне підвищення ідуронат-2- сульфатазної активності порівняно з рівнем до лікування фіксували у печінці та сироватці усіх тварин, яким вводили ідуронат-2-сульфатаза-кодуючі плазміди.
Як у печінці, так і у сироватці, рівень активності, досягнутий з експресією касет, що містять оптимізовані варіанти гена ідуронат-2-сульфатази, був вищий, ніж ті, що отримували з геном дикого типу. Крім того, у сироватці, тварини, які отримали плазміду рААМ-САС-опІр5-варіантг, показали рівні активності ідуронат-2-сульфатази, які були статистично вищими, ніж ті, що були задокументовані з іншими 2 плазмідами. Див. Фіг. 5А та 58.
Приклад 10: Гідродинамічне введення рдАУ-САс-нпІО5, рдАУМ-Сда-опІЮр5- варіанті та рАдАМ-
САа-опІр5-варіант2 МРІЇ в організм мишей
Загальну дозу 30 мкг плазміди рдАМ-САс-пІр5, рдАМ-САС-опІО5-варіант! та рААУ-САс- опІО5-варіант2, що містять різні варіанти касети експресії Ідуронат-2-сульфатази, вводили З місячним МРОБЇЇ- ураженим мишам через хвостові гідродинамічні ін'єкції хвостової вени.
Тканини збирали через 1 тиждень після доставки плазміди. Всі три плазміди, що містили ідуронат-2-сульфатазу, опосередковували значне збільшенням активності ідуронат-2- сульфатази щодо тварин МПСЇЇ, які отримували фізіологічний розчин; активність коливається від 120095 до 220095 рівня УМТ у печінці та 2000 - 5700 95 М/І в сироватці крові. Рівні активності, досягнуті з касетами експресії, що містять кодон-оптимізовані варіанти гена ідуронат-2- сульфатази, були статистично вищими, ніж ті, що опосередковані плазмідою, що містить ген дикого типу. Див. Фіг. бА та 6В. Відповідно до високого рівня активності ідуронат-2-сульфатази,
зареєстрованого в печінці та сироватці, вміст (ЗАС повністю нормалізувався у всіх тканинах, проаналізованих з усіма плазмідними конструкціями. Див. Фіг. 6.
Приклад 11: Внутрішньовенна доставка ААМУ-САС-НПІО5, ААМ9-САСІ-опІО5-варіант! та
ААУЗ-САСІ-опІр5-варіант2 МРІЇ в організм мишей
Миші МРБІЇ (3,5-місячного віку) отримували внутрішньовенну ін'єкцію через хвостову вену 1х1019 уд з ДАМУ вектором, що містить як дикого типу, так і оптимізовану послідовності ідуронат- 2-сульфатази людини. Окремі групи відповідного віку М/Т і невиліковні МРБІЇ миші служили контролем. Через три тижні після лікування тварини були умертвлені, а зразки крові та печінки були зібрані та проаналізовані.
Внутрішньовенне введення ААМОУ векторів у дозі 1х10'7 мд/умиша мішеней трансгенної експресії в основному у печінку. Див. УМи еї аї., Мої. Тег. 2006; 14(3):316-27, Іпадакі єї аї., Мої.
Тег. 2006; 14(1):45-33. Коли активність ідуронат-2-сульфатази вимірювали в печінкових екстрактах через З тижні після векторної доставки, у пацієнтів МРОЇЇ, які отримували будь-який з векторів, кодуючого ІЮ5 людини, було зафіксовано чітке підвищення ферментативної активності. Див. Фіг. 7А
Однак збільшення було значно вищим у випадку тварин МРІЇ, які отримали ААМО вектори, що містять оптимізовані послідовності ідуронат-2-сульфатази людини (ААМУ-САСаі-опІЮ5- варіанті і ААМУ9-САСІ-ОПІО5-варіант2). Рівні активності ідуронат-2-сульфатази, досягнуті у тварин, які отримували вектори з послідовністю дикого типу, були приблизно подвійними від тих, що спостерігалися у здорових тварин М/Т. Див. Фіг. 7А.
З векторами, що містять оптимізовані послідовності 05 людини, рівні активності ідуронат-2- сульфатази були в декілька разів вищі, ніж ті, що спостерігались у здорових тварин або в МРОЇЇ тварин, оброблених векторами, що містять послідовність ІО5 дикого типу. Див. Фіг. 7А
Ідуронат-2-сульфатаза є секретуючим лізосомальним ферментом, і таким чином його експресія в печінці є джерелом циркулюючого ферменту. Див. Нашигідої еї аі, вище. Як і спостереження, проведені в екстрактах печінки, рівні активності ідуронат-2-сульфатази, досягнуті при циркуляції МРЗБІЇ тварин, оброблених ААМУ векторами, що містять оптимізовані послідовності ІЮО5 людини, були у кілька разів вищі, ніж ті, що спостерігались у здорових тварин або у тварин МРІЇ, які лікувалися векторами, що містять людську послідовність |Ю5 дикого
Зо типу. Див. Фіг. 7В.
Відповідно до високого рівня активності ідуронат-2-сульфатази, задокументованого в печінці та сироватці, вміст ЗАС повністю нормалізувався в печінці мишей МРІЇ, які отримували ААМО-
САс-опІО5-варіанті та ААМУ9-СДО-опІО5-варіант2. Рівні ЗАС, однак, були лише частково зниженими в печінці тварин, які отримували однакову дозу ААМО векторів, що несуть кодуючу послідовність ІО5 дикого типу. Див. Фіг. 7С
Приклад 12: Інтрацистернальне введення ДАМ9-САС-ПІЮ5, ААМ9-САда-опІр5-варіант! та
ААУЗ-САСІ-опІр5-варіант2 мишам МРІЇ
Двомісячні МРОЇЇ-миші отримували внутрішньоклітинну ін'єкцію 5х1079 уд ААМОУ векторів, що містять як дикого типу, так і оптимізовану послідовність ідуронат-2-сульфатази людини у загальному об'ємі 5 мкл. Окремі групи відповідного віку М/УТ, необроблених МРЗІЇ мишей та
МРІЇ мишей, що отримують 5х10!9 уд некодованого вектора (ААМУ-САС-МИиЇ) служили контролем. У 3,5 місячному віці, тобто через 1,5 місяця після лікування, тварин умертвляли і зразки збирали та аналізували.
Коли активність ідуронат-2-сульфатази вимірювали в екстрактах головного мозку, чітке збільшення ферментативної активності було задокументовано у самців МРІЇ, які отримували будь-які людські кодуючи вектори ІЮО5. Див. Фіг. вА Проте, збільшення було у декілька разів вище у випадку тварин МРБІЇ, які отримали ААМУ вектори, що містять оптимізовані послідовності ідуронат-2-сульфатази людини (ААМУ-САСі-опІО5-варіанті! і ААМ9-САаі-опІЮ5- варіант2), ніж у тих МР5ЇЇ тварини, що були оброблені векторами, що містять послідовність ІЮ5 дикого типу. Див. Фіг. 8А. Рівні активності ідуронат-2-сульфатази, досягнуті у тварин, які отримували вектори з оптимізованими людськими послідовностями ідуронат-2-сульфатази, були майже такі ж, як і у М//, або навіть вище; у найбільш ростральному відділі мозку (секція І) активність ІЮ5, отриманого з вектору, що містить оптимізовані людські послідовності ідуронат-2- сульфатази, майже вдвічі перевищує рівні М/Т. Див. Фіг. вА
З урахуванням збільшення активності З у всьому головному мозку, накопичення субстрату, що характеризує цю хворобу, коригувалося у мозку оброблених мишей МРЗІЇ, про що свідчить значне зменшення вмісту (ЗАС. Див. Фіг. 8В Повна нормалізація рівнів ЗАС спостерігалась у всіх конструктах у всіх проаналізованих ділянках, за винятком секції М, в якій ефект експресії ІО5, отриманого з векторів, що містять послідовність ІО5 дикого типу, не був 60 очевидним. Див. Фіг. 84383
ААМУ вектори, що вводяться до С5БЕ, витікають до периферії та передають сигнал у печінку.
Див. Нашгідої еї аї., Сіїп Іпмев5і. 2013; 123 (8): 3254-3271, Вібега вї аіІ., Нит Мої Сепеї. 2014; 24 (7): 2078-2095. Відповідно, збільшення активності ідуронат-2-сульфатази було задокументовано у печінці та сироватці мишей МРІЇ, які отримували будь-який з кодуючи людські ІО5 векторів.
Див. Фіг. 9А та 9В. Знову ж таки, збільшення було значно вищим у випадку тварин МРЗІЇ, які отримали ААМОУ вектори, що містять оптимізовані послідовності ідуронат-2-сульфатази людини (ААУЗ-САСі-опІО5-варіанті та ААМ9-САС-опІО5-варіант2), ніж у МРЗІЇ тварин, яких лікували векторами, що містять послідовність ІЗ дикого типу. Див. Фіг. 9А та 9В. Коли ефективність терапії оцінювалася шляхом кількісного визначення вмісту САС у різних соматичних органах, повна нормалізація рівнів САС спостерігалася у всіх тканинах мишей МРІЇ, оброблених будь- яким оптимізованим вектором, що кодує ІО5 людини. Див. Фіг. 9С. Миші МРІЇ, які отримали людську послідовність ІЗ дикого типу, показали, однак, повну нормалізацію вмісту САС у печінці, серці, легенях та селезінці, але лише часткове коригування в яєчках, нирках, сечовому міхурі та жировій тканині. Див. Фіг. 9С
Приклад 13: Інтрацистернальне введення ААМ9-САСІі-отір5
Загальну дозу 5х10!92 векторних геномів вектора ААМ9-САСІ-отіЮ5 вводили шляхом ін'єкції у мостомозочкову цистерну двомісячних тварин з МРБІЇ у загальному об'ємі 5 мкл. По-перше, мишей аналізували в 6 місяців, тобто через 4 місяці після введення вектора. Внутрішньовенна доставка ААМ9-САСі-отіюрз вектора призвела до відновлення активності ідуронат-2-сульфатази в усіх аналізованих ділянках мозку, досягаючи рівнів, що в середньому дорівнювали 40 95 від тих, що спостерігались у здорових тварин у різних ділянках. Див. Фіг. 10А. Через 4 місяці після введення вектору, накопичення субстрату, характерне для захворювання, повністю відновлюється в головному мозку оброблених мишей МРБЇЇ, про що свідчить нормалізація вмісту САС у всіх аналізованих ділянках мозку. Див. Фіг. 108. Аналогічно, розмір лізосомального відділення був повністю нормалізований, як показано кількісною інтенсивністю сигналу для імунного детектування лізосомного маркера ГАМР2. Сигнал ГАМРА2 пропорційний розміру лізосомного відділення, що, у свою чергу, залежить від кількості накопиченого нерозщепленого гепарану та сульфату дерматану. Див. Фіг. 11 А. Крім того, ефект лікування на розщеплення лізосом залишався стабільним через 8 місяців після доставки (5 ААМ9-САСІ-от,
Зо що вказує на довгострокову ефективність терапії. Див. Фіг. 12.
Розрив нормального лізосомального гомеостазу внаслідок накопичення нерозщепленого субстрату може змінити активність інших лізосомальних ферментів, відмінних від того, який безпосередньо впливає на мутацію. Див. Кірега еї ам, Нит Мої сСепвеї. 2014:доі:10.1093/птд/ади727. У головному мозку необроблених мишей МРБЇЇ або МРІЇ, пролікованих контролем "нульового" вектора, активність ІА (ідуронідаза, альфа-1і -), БАН (М- сульфоглукозамін сульфогідролаза), МАСИ (М-ацетилглюкозаміназа, альфа), НОБМАТ (гепарин-альфа-глюкозамінід М-ацетилтрансфераза), САЇМ5 (галактозамін (М-ацетил)-6- сульфатаза), СОЗВ (глюкуронідаза, бета), НЕХВ (гексозамідаза В) була змінена, але лікування
ААУЗ-САСІ-отірз повернуло ці активності до рівнів, що спостерігаються у здорових тварин У/Т, що вказує на те, що вектор здатний відновити лізосомальний гомеостаз. Див. Фіг. 118.
Згідно з коригуванням лізосомальної патології, всі ознаки запалення зникли з головного мозку пролікованих мишей МРІЇ. Через чотири місяці після лікування, інтенсивність сигналу для забарвлення, використовуваних для виявлення астроцитозу (СЕАР) та мікрогліозу (В5І-В4), була схожою у пролікованих мишей МРОБЇЇ та у здорових тварин у різних ділянках головного мозку, на відміну від сигналу, зафіксованого у мишей МРЗБІЇ, яким вводили з "нульовим" контролем ААМУ вектор, що продемонструвало чітке підвищення регуляції цих маркерів нейрозапалення. Див. Фіг. 13А та 13В. Крім того, у віці 10 місяців, тобто через 8 місяців після перенесення генів, сприятливий вплив лікування ААМУ-САС-отіО5 на нейрозапалення оцінювали шляхом забарвлення як для ОГЕАР, так і для В5І-В4, що свідчить про довготривалу ліквідацію нейронального захворювання. Див. Фіг. 14А та 148.
ААМОУ вектори, що вводили до С5БЕ, витікають до периферії та передають сигнал у печінку.
Див. Нашгідої еї аї., Сіїп Іпме5і. 2013;123(8):3254-3271, Вірега єї аЇ., Нит Мої! Сепві. 2014:а01:10.1093/птд/ади727. Відповідно, збільшення активності ідуронат-2-сульфатази було задокументовано через 4 місяці після перенесення генів у печінці та сироватці мишей МРІЇ, які отримували ААМУ-САСІ-отір5, досягаючи рівнів приблизно 1700 95 та 700 95 від рівнів, що спостерігалися у здорових тварин, відповідно. Див. Фіг. 15А та 158. Коли соматична ефективність терапії оцінювалася шляхом кількісного визначення вмісту САС у різних органах, у більшості тканин, включаючи печінку, серце, легені, яєчки, селезінку та жирову тканину, була виявлена повна нормалізація, за винятком нирок та сечового міхура, в якому спостерігалося 60 зниження САС 250 95. Див. Фіг. 150
Через чотири місяці після лікування активність ІЮ5 була також збільшена в легенях і була особливо високою в серці. Див. Фіг. 16А і 168. Ці два органи, легені та серце, представляли дуже низькі значення коефіцієнту векторного генома/диплоїдного генома, що свідчить про відсутність ефективної трансдукції цих органів після доставки ВАС-ААМУ9-САСІ-отірЗ у дозі 5х1079 уд. Див. Фіг. 16С. Це відкриття запропонувало перехресну корекцію дефіциту ІЮО5 шляхом поглинання ІО5 з кровообігу.
Згідно з даними вмісту САС, вага печінки нормалізувалася у б-місячних мишей МРІЇ, які отримували ААМ9-САСІ-Оотірз у віці 2 місяців. Див. Фіг. 17А. Подальша демонстрація потенціалу внутрішньо-С5Е терапії ААМ9-САС-отіО5 для протидії лізосомальної патології у мишей МРІЇ була забезпечена вимірюванням активності інших лізосомальних ферментів у екстрактах печінки. ІШПОА, 5О5Н, МАС, НОЗМАТ, СА М5, ЗВ, НЕХВ були значно змінені щодо рівнів
М/Т в необроблених мишей МРЗ5БІЇ або у мишей МРЗ5ІЇ, пролікованих контрольним "нульовим" вектором. Лікування ААМ9-САСІ-отір5 повністю нормалізувало активність усіх цих ферментів.
Див. Фіг. 178. Крім того, активність НЕХВ у сироватці крові також зростає як наслідок лізосомальної патології, і вона була повністю нормалізована після лікування ААМ9-САСІ-отірв, див. Фіг. 17С, що свідчить про повне коригування лізосомальної функціональності.
Вплив внутрішньовенного введення С5Е на ААМ9-САС-отір5 на поведінку оцінювали у віці б місяців за допомогою відкритого польового тесту, який оцінює загальну рухову та дослідницьку активність мишей у невідомому середовищі. Непроліковані та ААМО9-нуль- проліковані МРБЇЇ миші, демонстрували знижену дослідницьку активність порівняно із здоровими мишами в термінах часу, проведеного в центрі та на периферії, кількості записів у центрі та на периферії та загальної кількості швидких рухів. Внутрішньосистемне введення
ААУЗ-САСІ-отірз повністю виправляло поведінковий дефіцит у мишей МРІЇ. Див. Фіг. 18А-РЕ.
Нарешті, терапевтична ефективність терапії внутрішньо-С5Е ААМ9-САСі-отір5 оцінювали шляхом порівняння виживання необроблених та пролікованих мишей МРЗІЇ. Генна терапія
ААУЗ-САСІ-отір5 значно збільшила тривалість життя мишей МРІЇ. Див. Фіг. 19. Протягом 17 місяців всі непроліковані або ААМУ9-САСі-нуль-проліковані МРІЇ миші помирали, 76 95 мишей
МРІЇ, які отримували лікування ААМУ-САСІ-отіЮ5, виживали. Крім того, 65 95 пролікованих тварин були ще живими у віці 22 місяців. У6 живих тварин дикого типу у цьому віці становив
Зо 7995. Див. Фіг. 19.
Приклад 14: Інтрацистернальне введення різних доз ААМ9-САС-отір5: дослідження доза- відповідь 2-місячним тваринам МРІЇ вводили чотири різні дози (1,58х109, 5х109, 1,58х1019 та 5х10'0 мд/миша) ААМ9-САСІ-отіз вектора у загальному об'ємі 5 мкл.
Через півтора місяця після введення вектора, тварин умертвляли і збирали тканини, вимірювали активність ідуронат-2-сульфатази в різних ділянках мозку (секції І-М). Активність збільшувалася з дозою і коливалася від 0,8 та 53 95 від активності М/Т у різних ділянках. Див.
Фіг. 20А. Подібна доза-відповідь спостерігалася, коли аналізували ефект лікування на зберігання ЗАС. Проте повне коригування накопичення ЗАС було зафіксовано лише у двох найбільших дозах 1,58х1072 та 5х10!? уд/миша. Див. Фіг. 208.
У печінці та сироватці крові активність також збільшується з дозою, коливається від 2095 до 430095 у печінці та від 0,4 95 до 1 100 95 в сироватці крові. Відсутність активності ІО5 не була виявлена в сироватці з 2 найменшими дозами (1,58х109, 5х109 умд/миша). Див. Фіг. 21А та 218.
Згідно з даними активності, вимірювання вмісту ЗАС у периферичних тканинах показало зменшення вмісту САС у дозі-реакції у печінці, серці, легенях, селезінці, нирках, печінці, сечовому міхурі та жировій тканині. Повна або майже повна нормалізація рівнів САС була досягнута в більшості тканин з 2 найбільшими дозами (1,58х10'9 та 5х10'9 уд/миша), за винятком легенів та сечового міхура, при яких »70 95 зменшення було задокументовано, і нирок, в яких спостерігалося приблизно 5095 зниження. Див. Фіг. 21С.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
-110» І арогаюгіоз аеї! Ог. ЕБТЕМЕ 5. А.
Опімегзнаї Аштпота де ВагсеЇопа -1205» ВЕКТОРИ АДЕНОАСОЦІЙОВАНИХ ВІРУСІВ для ЛІКУВАННЯ
МУКОПОЛІСАХАРИДОЗІВ
-130» РСТ2212.6 «1505 ЕРІ5382297 -1515 2015-06-05 -1605 17 60 «170» Раїепіп мегвіоп 3.5
«2105 1 «2115 550 «212» РВТ «213» Ното заріеп5 «4005» 1
Меї Рго Рго Рго Агу Тнг Сіу Агу Су І єи Геи Тгр І єи Су Гей Маї 151015
Ї еи Зег Зег Ма! Суз Маї Аа Геи Спу Зег Сім ТАг Сіп Аа Авп 5ег 20 25 30
ТА Тнг Азр Аа Геи Авп Маї І єи І еи Пе Пе Маї Азр Азр Гей Аг9 35 40 45
Рго Зег І єи Спу Суз Туг Спу Авр Гуз Геи Маї Агу 5ег Рго Азп Пе 50 55 60
Ар Сп Гей Аа 5ег Нів 5егіІ єи І ви Рне СіІп Авп Аа РНнеє Аїа Сіп 65 70 75 80
Сп Айа Маї Суз Аа Рго 5ег Агу Маї Зег РНе Геи ТАиг Спу Агу Ага 85 90 95
Рго Авр ТНг Тниг Аг ГГ еи Туг А5р Ре Авп 5ег Туг Тр Ага Маї Нів 100 105 110
Аа Спіу Авп Ре Зег ТАг Пе Рго Сіп Туг Рпе Гуз Спи Авп Спу Туг 115120 125 маї Тиг Меї Зег Маї Спу Гуз Маї Ре Нів Рго Спу Пе 5ег 5ег Авп 130 135 140
Ні Тиг Авр Авр 5ег Рго Туг 5ег Тгтр Зег Ре Рго Рго Туг Нів Рго 145150 155160 зЗег Зег Сім Гув Туг Си Авп Тит Гуз Тит Сувз Агу Сапу Рго Азр Сіу 165 170 175
СІМ Г еи Нів Ада Авп І еи ГГ єи Сувз Рго Маї Авр Маї Геи Авр Маї Рго 180 185 190
Ко) Сі Сіу ТА ГГ еи Рго Авр Гуз Сіп 5ег Тиг Си Сп Айа Пе Сп І еи 195 200 205
Ї єи Спи І ув Меї Гуз Тнг 5ег Аа 5ег Рго РНе Рнеє І єи Аа Маї СПУ 210 215 220
Туг Ніз Гуз Рго Нів Пе Рго РНе Аго Туг Рго Гуз Сім Ре Сп Гув 225230 235 240
Ї еи Туг Рго І еи Спи Авп Пе Тнг І еи Аа Рго Авр Рго Сім Маї Рго 245250 255
Азр СТУ Геи Рго Рго Маї Аа Туг Авп Рго Тр Меї Азвр Іе Агу Сп 260 265 270
Агоу Сі Авр Маї Сп Аїа І єи Авп Пе 5ег Маї Рго Туг Спу Рго Пе 275280 285
Рго Маї А5р Ре ап Ага Гуз Пе Ага Сіп 5ег Туг Рпє Аа 5ег Маї 290 295 300 зЗег ТугпІ єи Авр ТНиг Сіп Маї Спу Аго Ге І ви 5ег Аа Геи Авр Авр 305 310 315 320
Ї еи Сп І єи Аа Авп 5ег ТНг Іе Пе Аа Рпе ТНг Зег Авр Нів Спу 325 330 335
Тр Аа І ви Сту Сім Нів Спу Спи Тер Аа Гуз Туг 5ег Азп Рпе Авр 340 345 350
Ммаї Ага Тиг Ніз Маї Рго І єи Пе Рне Туг Маї Рго Сіпу Агу Тнг Аа 355 360 365 зег І ви Рго Сім Аа Спу Спи Гуз Гей Ре Рго Туг Геи Авр Рго Рпе 370 375 380
Ар 5ег Аа 5ег СіІп І еи Меї Сіи Рго Спіу Агу Сп бег Меї Авр І єи 385 390 395 400 маї Сім Геи мМаї 5ег ГГ еи Рне Рго Тнг І еи Аа Су І еи Аа Су І еи 405 410 415
Сп Маї Рго Рго Аг Суз Рго Маї Рго 5Бег Ре Ніз Маї Сім І еи Суб 420 425 430 (510) Аг Спи Спіу Гуз Авп Геи Г еи Гуз Нів РНе Агу Ре Аго Азвр ГГ еи Си
435 440 445
Сім Авр Ро Туг Гей Рго Сіу Азп Рго Агу Сім І єи Пе Аа Туг бег 450 455 460
Сіп Туг Рго Агу Рго 5ег Авр Іе Рго Сіп Тгр Авп Зег Авр Гуз Рго 465 470 475 480 зег І єи Гуз Авр Іе Гуз Пе Меї Стпу Туг Зег Пе Агу ТАг Пе Азр 485 490 495
Туг Агу Туг Тнг Маї Тр Маї Спу Рпє Авп Рго Азвр Сіи РНе Геи Аа 500 505 510
Азп РНе 5ег Азр Іе Нів Аа Стпу Спи Гей Туг Ре Маї Азр Зег Азр 515520 525
Рго І єи СіІп Авр Нів Азп Меї Туг Азп Авзр 5ег Сіп Спіу Спіу Авр І єи 530 535 540
РНе Сп І еи І ви Меї Рго 545 550 -21052 «2115 1653 «2125» ДНК «213» Ното зарієп5 «40052 адссдссас сссддассод9 ссдаддссії сісддсіда аїсідонсї дадсіссдіс 60 тдсдісоссс ісддаїссда аасдсадасс аасісдасса садаїдсісї даасойсй 120 сісаїсаїсу їддаїщдассі дсдссссісс сідддсції аїддддаїаа дсіддщдада 180
Іссссаааїа Ндассаасі ддсаїсссас адссіссісі Іссадааїдс сшдсодсад 240 саадсадідї дсдссссдад ссдсушсії Нсосісасід ясаддадасс Ідасассасс 300 содссідіася асіїсаасіс сіасіддада дідсасдсід дааасісіс сассаїссос 360 садіасійса аддадааща сіа(юдасс ащісддідао даааацдісії Ісасссідда 420 азйаїсійсіа ассаїассда Ідайсіссо їаїадсідаї сішссасс ЦНаїсаїссі 480
Іссісідада адіадаааа сасіаадаса іщісдаддодс сададада асіссадсс 540
Зо аассідсіїї дсссіддда шідсіддаї сйсссдадад дсассідсс Ідасааасад 600 адсасідадс аадссаїаса апонддаа аадаюаааа сдісадссад іссшесйе 660 сіддссуна одіагсаїаа дссасасаїс сссисадаї ассссаадда ашсадаад 720
Ідіаїсссі (ддадаасаї сасссіддсс сссдаїсссд аддісссіда ддассіассс 780 ссідІдоссі асаассссід даддасаїс аддсаасдду аадасдісса адсснНааас 840 аїсадідщс сдіадісс аайссідід дасцсадс ддааааїссд ссададсіас 900 шассісід ідісатацй ддагасасаяд дісддссдсс існдадщюс Шодасодаї 960 сисадсіда ссаасадсас саїсапцодса Шассісдо аїсададю досістадаї 1020 даасаддад ааюдддссаа агїасадсааї Шдашйно сіасссаїді Іссссідаїта 1080 неїащійс сіддааддас оддсіїсасії ссддаддсад асдадаадсі Шссснас 1140 сісдасссії Наайссдс сісасадну аддадссад дсаддсааїс саїддассії 1200 дюдаасня щісісни Ісссасдсею адсддаснод саддасюдса донссассі 1260 содсідссссо Неосіїсайн їісасдідад сідідсадад ааддсаадаа ссісщаад 1320 сашесдаї Іссдідасії ддаададдаї ссаїассісс сіддіааїсс ссдідаасід 1380 айдссіаїа дссадіаїсс ссддсснса дасаїсссіс адіддаайс Ідасаадссод 1440 адшааааад аїагааадаї садддсіаї Іссаїасоса ссаїадасіа їіаддіаїтасі 1500 аюїодан9 дсісааїсс Ідадаайц сіадсіаасі Шсідасаї ссаїдсадда 1560 даасщіаїй ноддайс дасссайо саддаїсаса азгащшіаїаа дайнсссаа 1620 ддаюдадаїс шіссадії айдадссі ща 1653 «2105 3 «2115» 7900 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» рААМ-САа-пІр5 «4005 З аааїтасдсді аїдссдссас сссддассда ссдадассії сістддеа дісідойнсі 60 дадсіссдіс дсодісдссс Ісддаїссда аасодсаддсс аасісдасса садаюсісі 120 даасойсії сісаїсаїсд юдаїдассі дсдссссісс сідддсідії агддадаїаа 180 дсдаїдадао іссссаааїйа йоассаасі додсаїсссас адссіссісі Іссадаадс 240 бо сшодсодсад саадсадші дсоассссдад ссасацісі Нссісасід дсаддадасс 300
ІЗасассасс сдссщіасяа асіїсаасіс сіасіддадо дідсасдсід дааасіїсіс 360 сассаїсссс садіаснса аддадааїдяо сіадюдасс ашісдаїда даааацдієсїї 420 їсасссідда аїаїсіїсіа ассаїгассда ідаїйсіссяа їіаїадсдаї сійссасс 480
Наїсаїссі Іссісідада адіаюдаааа сасіаадаса ідісдадддс садаюдада 540 асіссаїдсс аассідсій дсссідідда осіддаї сИсссдадао дсассіїдсс 600
Засааасад адсасдаєдс аадссаїаса днайоддаа аададаааа сдісадссад 660 їссшене сіддссоУноу доїасаїаа дссасасаїс сссісадаї ассссаадда 720 ашсадааяд пдіаїсссі (ддадаасаї сасссіддсс сссдаїсссу аддісссіда 780 щдассіассс ссідідассі асаассссід даддасаїс аддсаас99д9 аадасдісса 840 адссНааас аїсадідідс саїачдісс аайссідід дасшсадс ддаааассо 900 ссададсіас Шодссісід щісаїайі ддагасасад дісдассосс існдадідс 960 шодасодаї снсадсщда ссаасадсас саїсайдса Шассісда аїсадаодію 1020 досісіадої даасаддад ааддассаа аіасадсааї Шоаїдно сіасссащі 1080
Іссссідаїа йсіаїнс сіддааддас досіїсасії ссддадасад дсдадаадсі 1140
Шшесепцас сісдасссії Ндайссдс сісасадноу аддадссад дсаддсааїс 1200 саюддассії аїддаасняо щісісні Ісссасодсід дстіддасно саддасідса 1260 дунссассі сосідссссо Несісаї! їсасапдад сідідсадад ааддсаадаа 1320 сенедааяд сайісодаї Іссдщюдасії ддаададааї ссдіассісс сідаїааїсс 1380 ссддаасю апдссіаїа дссадіаїсс ссддссіїса дасаїсссіс адіддаанс 1440
Щщасаадссуд адшаааад аїагааадаї саддасіаї Іссаїасдса ссаїадасіа 1500 їаддіаїгасі діщдіддонао дснсааїсс даїдаайц сіадсіаасі Шсідасаї 1560 ссадсадад даасюай йПоїдданс дасссацно саддаїсаса азащіаїаа 1620 щайсссаа ддаддавдаїс Шіссадії андащюссі (дадаанса Шаайнсда 1680 дсісддіасс сдоддааїсаа Нсасіссіс аддідсаддс дссіаїсад ааддідаща 1740 сідчещаос сааїдсссід дсісасаааї ассасідада Існшссс ісідссаааа 1800 ацаддаода саїсадаад ссссндадс аїсщдасіс іддсіааїаа аддааацша 1860
Ішнсанодс аагадідюі (ддаанн щідісісіс асісддаада асаїаддда 1920 ддоасаааїса Шаааасаї садааюааді ашдудаша дадшоадса асаїадссс 1980 азагдсіддс юссаїдаас ааадднодс іаїааададао ісаїсадіаї аїдааасадс 2040
Зо ссссідсіді ссанссна Нсосаїадаа аадссідас Пдаданад ашшша 2100 тазшо й юна шещшаа саїсссіааа айссна садшас 2160
Тадссадаї!ї Шссіссіс Іссідасіас Ісссадісаї адсідісссї сісісНаї 2220 ддадаїсссії сдассідсад сссаадсюії адаїаадіад садсддаі Іааісайаа 2280 сіасааддаа ссссіадіда юдаднодс сасісссісі сідсдсусіс дсісдсісас 2340
З5 щадассдсс сдадсшос ссдддсодсс ісадідадсу адсдадсоса садсідсай 2400 аадааїсдад ссаасдсоаса ддадададчосо дшосоаї адсосісі Іссденосі 2460 содсісасіда сісосідсос ісадісане ддсюсодсо адсоддіаїса дсісасісаа 2520 аддсддіааї асдднаїсс асадааісад дддаїаасдс аддааадаас ашідадсаа 2580 ааддссадса аааддссадд аассдіаааа аддссдсойї асіддсдій Носагадас 2640 їссдсссссс дасдадсаї сасаааааїйс дасдсісаад іІсададощюа сдааасссда 2700 саддасіаїа аадаїассад дсдшесссс сіддаадсіс ссісдідсдс ісіссідйне 2760 сдасссідсс дснНассдда їассідіссу ссшсіссс Псдддаадс діддсдсш 2820 сісаїадсіс асодсідіадо іаїсісадії сддідтадаї сойсодсісс аадсідддсі 2880 дюїосасда ассссссдії садсссдасс дсідсдссії аїссддіаас їаїсдієну 2940 адіссаассс ддіаадасас дасцаїсдс сасіддсадс адссасідої аасаддана 3000 дсададсдад діашіаддс ддаосіасад аднсндаа дддіддссі аасіасдасі 3060 асасіадаад аасадіайці ддїаїсідсо сісідсідаа дссаднасс нсддааааа 3120 чадіддіад сісндаїсс ддсааасааа ссассдсіда їадсоддідаї ШШош 3180 дсаадсадса дапйасдсдс адааааааад даїсісаада адаїсстщу9 аїсннсїа 3240 сддддісіда сдсісадідд аасдаааасі сасунаадо даїшодіс аїдаданаї 3300 саааааддаї снсассіад аїссішаа анааааацу аадішадаа ісааїсіааа 3360 діагагацда діааасцодо ісюасацдії ассаадсії ааісадідад дсассіаїсі 3420 садсодаїсід істашсоді ісаїссаїад Поссідасі ссссдісоід їадаїаасіа 3480 сдагасддда ддоаснНасса ісіддсссса дідсідсааї даїассдсда дасссасдсі 3540 сассддсісс адашаїса дсааїааасс адссадссду аадддссдад содсадааавід 3600 діссідсаас Шаїссодсс іссаїссаді станаацо Поссдддаа осіададіаа 3660 діадіїсдсс аднааїаві Пдсдсаасд Нандссаї Ідсіасаддс аісаїдаді 3720 сасдсісдіє дшодіа дсисайса дсіссддійс ссаасдаїса аддсдадна 3780 сащдаїсссс сашюідідс аааававосод9 Надсіссії сддіссіссо аїсдйодіса 3840 60 даавдчіаадії аддссдсадід Наїсасіса юднадодс адсасюдсаї аайсісца 3900 сідісаюсс аїіссдїаада дсішсі9 щдасіддщоа діасісаасс аацдісайсі 3960 дадааїгадід їаїосддсда ссдадносі спдсссдас дісааіасду даїаатассод 4020 сдссасаїгад садаасщша ааадідсіса ісанддааа асонснсд дадсдаааас 4080
Ісїсааддаї спассдсід Ндадаїсса днсдащіа асссасісої дсасссаасі 4140 даїснсадс аїсіШасі Нсассадса Шсіддогю адсаааааса ддааддсааа 4200 адссдсааа ааадддаата адддсдасас ддаааццяа ааїасісаїа сісцеосні 4260 нсааїаца нпдааодсаї! їаїсаддаії айдісісаї дадсоддаїас аташоааї 4320 діашадаа аааіааасаа аїаддаддне сдсдсасай Іссссдаааа дідссассід 4380 асдісіаада аассацаї! аїсадасаї іІаассіаїаа аааїадодсої аїсасдадас 4440 ссшесдісії сдсдсоше дощдаюдасяа одаааассі сідасасаїд садсісссдо 4500 адасддісас адснаїсід їІаадсдда ссдддадсад асаадсссдї садддсосадї 4560 садсадаші юдсдадшюї сдддадсдас Наасіаїдс досаїсадад саданціас 4620 щададіоса ссаїадсода дідаааїас содсасадаїд сдіааддада аааіассодса 4680 ісадосодаї! ссаасаїсса аїаааїсаїа саддсаадас ааадаанад саааанаад 4740 сааіааадсс іІсададсаїа аадсіаааїс доайоіасса аааасацаї дасссідіаа 4800 тасішосо ддадаадссі Нашсаас дсааддаїаа аааншад аасссісаїа 4860 таїшаааї дсаадссію адіаащиї аддіааадаї ісааасддаї дчадаааддсс 4920 ддадасадіс аааїсассаї сааїацдага Нсаассадіїї сіадсідава аайсаїдсс 4980 ддадчадддіа дсіацно адаодадїсісї асагаадасіа іІсаддісай дссідададі 5040 сіддадсааа саададааїс дадаасодвї ааісдіаааа сіадсаїдіс ааїсаїаді 5100 ассссдацо аїааісадаа аадссссааа аасаддаада нНодїагаадс аааїашаа 5160 ацйдіаадсо Нааїації онаааанс дсонааай шонаааї садсісаші 5220
Шаассааї аддссдаааї сддсааааїйс ссЦаїаааї саааадааїа дассдадаїа 5280 ддандавід пойссаді Нддаасаад адіссасіаї їІааадаасої ддасіссаас 5340 дісааадддс дааааассої сіаїсадддс дадздсссас їасддаасс аїсасссіаа 5400 їсаааіції гддадісдад дідссдіааа осасіааас ддаасссіаа адддадсссс 5460 сдашадад снидасо99д99 ааадссдосу аасаїддсда даааддаадду даадааадсо 5520 аааддадсодяд дсодсіадддс дсіддсааді діадсодіса сдсідсдсої аассассаса 5580 сссдссдсдс Чааюсаосс дсіасадддс дсаїасіаю опосшоа содадсасдїа 5640
Зо Таасаосії ІссісдНад ааїсададсд ддадсіааас аддаддссда Пааадддаї 5700
Шадасадд аасоддіасдс садааїссід адаадідш Наїааїсад даддссасс 5760 дадіаааада дісідіссаї сасдсааай аассайцоіс дсааіаснс Нданаді 5820 ааіаасаїса сндссщад їадаадаасі сааасіаїсу дсснодсіда іааїаїссад 5880 аасаагтаца ссдсосадсса Посаасодда аїісдссайс дссансадо сідсдсаасі 5940 андадаада асдаїсо9дід сдддссісії сдстайцасду ссадсідсдс дсісдсісдс 6000 їсасідадас сдсссддодса аадсссдддс аісадддсдас стддісдс ссдассісад 6060 щдадсдадсо адсдсдсада дадддадідо ссаасіссаї сасіаддаді Ісспдіаді 6120
Тааїдайнаа сссдссаїдс їаснаїсіа сісдасацо апйайдасі аднанааї 6180 адіааісаа! їасддддіса Надісаїйа дсссаїаїаї ддаднссдс днасаїаас 6240
Насддіааа ддсссдссі ддсщдассдс ссаасдассс ссдсоссайцо асдісааїаа 6300 щасаїаці ісссаїадіа асдссааїад ддасшсса дасодісаа (даюдаді 6360 ашасоддіа аасідсссас Нодсадіас аїсаадідіа Ісаїадсса адіасдсссс 6420 сіандасдї сааюасодаї аааддсссд ссіддсана ідсссадіас агдасснаї 6480 дддасцісс їасіддсад їасаїсіасо їанадісаї сосіайасс агддісдадчо 6540 адссссас ансідсіс асісісссса ісіссссссс сіссссассс ссаайнаї 6600 ашаша!ї ншшаана Ішоюсад сдадададас чавддадаа999 чвдададчасосо 6660 сдссаддсоа доса999с99 д9сдададос д999с9999с дадосодада одіосддсоа 6720 садссааїса дадсддсосо сіссдааавді Пссішаї ддсдадосодо сддсддсдас 6780 досссіаїаа ааадсдаадс асасадсо9д99д сдддадісас їдсоноссі Ісдссссоїд 6840 ссссдсіссу ссоссоссіс дсдссодсссд ссссоддсісії дасідассдс днасіссса 6900 саддщадсо ддсдадасод ссснсіссі ссддасщіа ападсосії ддшааца 6960 соддснан сішсі9І9 дсюсаїдаа адссидада дасіссддда ддассста 7020 юсоадодода осоддсіс9д99 до9аї9союс дідо дсоддо9одад соссосоїдс 7080 дусіссдсдс дсссоддсоа сідідадсос юсадасоса дсосоддадсі Наїдсосіс 7140 з сосадідідс дсдаддадад сосоддсс999 д9содідссс сдсодідсоа дддадосіюдс 7200 дададдааса ааддсюсої двсддоаюю юсоід9999 9919а9дсадо дадіоіюдос 7260 дсдісдаїсо досідсаасс сссссдсас сссссісссс даайносіда дсасоддсссо 7320 9сісдо9ід сддоасіссо їасддадсої дососадодс ісдссоїдсс дадсоадодоа 7380 юасоодсада юададідсс дд9с9999с9 дддссоссіс дддссоддода додсісдддаа 7440 бо даддчдсдса дсддасссссу дадсдссддс досідісдад дсасддсдад ссдсадссаї 7500 дссішаї даїааісдю садададддсу сададасійс спдіссса ааїсідїдса 7560 дадссдаааї сідддадосд ссодссдсасс сссістадся ддасодсдддас дааасадідс 7620 ддсдссдаса ддааддаааї дддасаддоадад доссйсодід сдісдссдсод ссдссдіссс 7680 сцсісссіс Іссадссісу ддосідієсяЯ сддадоадаса асідссіїсд ддддадчасаа 7740 ддсададс9да дунсдасії стдсоїдтк ассдодсодсі сіададссіс Ідсіаассаї 7800 дисащссі ІсцсіІ ссіасадсіс сідддсаасо ідсідонаї гаїдсідісї 7860 саїсанно дсааадаайї дайаансод адсдаасосо 7900 «2105 4 «2115» 4319 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ААМ9-САС-НПІр5 «4005» 4 ацасдссад сідсдсодсіс дсісдсісас даддссосс саддсааадс ссдадсодісо 60 ддсдассійї ддісдсссдо ссісадщад сдадсдадсду сдсадададо дадідассаа 120 сіссаїсасі адддойссі дїаднааї данаасссу ссаюсіасі іаїсіасісд 180 асайдана Подасіадії анаагадіа аїсаацасд додісанаяд їсаїадсссе 240 азаіаюдад йссдсоуна саїааснас ддіаааддс ссдссіддсі дассдсссаа 300 сдасссссдс ссайдасої сааіаадас діашіссс агадіаасдс сааіадддас 360 шесанда содісааюда юдадіацй асодіааасі дсссаснодо садіасаїса 420 адюагсаї адссаадіа сдсссссіаї дасадїсааї дасддіаааї ддоссдссід 480 дсанащсс садіасаюа сснащдаода сшссіасі дасадіаса ісіасотай 540 адісаїсдсі анпассаща ісдаддщдад ссссасднс ідсіїсасіс іссссаїсіс 600 сссссссісс ссасссссаа Шота ашацй їаайації дсгдсадсодаї 660 99999с9999 9999999999 99с9сососс аддасоа99с9 999с9999с9 ададосо999 720 сдддасдадао сддададаїд сддсддсадс сааїісададс ддсодсодсісс дааадшісс 780 їшШшаюдосо аддсадсдас дасддсдодсс сіаїааааад сдаадсдсдс ддсда9дсо999 840 адісдсідсуд Ндсснсдс сссдідсссс дсіссдссдс сдссісасдс сдессдессс 900
Зо дусістюдасі дассдсопца сісссасада Іадсдоддсо ддасодсссі ісіссіссда 960 дсідіааца дсоснда їааїдасоддс НУШеЦ ісід9д9сІд саїдааадсс 1020 поадодосі ссдадададс ссшоюсо д9999а9с99 сісдда9о9і осоюсоюі 1080 аюшосої ддддадсодсс дсдідсддсі ссдсдсідсс сддсдасюі дадсосідса 1140 дасосддсдс ддадсщтої дсосіссоса дідідсосда ддададсося дссододаоса 1200 дідссссдсо дідс999999 д9сідсдадо ддаасааада сідсоюсоа одідіююсо 1260 щачдчадчоаоід адсаддадаї ададсосої судісдоадсії дсаасссссс сідсассосс 1320 сіссссдаді юсідадсас ддсссддсії сддаїсада осіссдїасо дадсодідосо 1380 сдадасісдс суїдссоддос дададаос досадаювдо даюссодос дадосададе 1440 содссісдддс сддададодс ісдддададо д99с9с99с99 сссссддадс дссддсодсі 1500 дісдаддсдс ддсдадссдс адссаносс ІШагодіа аїсаїдсдад аддасодсадао 1560 даснссійй дісссаааїс ідідсддадс сдааасідд дчаддсдссдс сдсасссссі 1620 сіздсдд9со9 сддодасдаад содідсодасо ссддсаддаа ддаааюдсос даддададсс 1680 нсоюсаїс дссосдссас сдіссссне ісссісісса дссісдадас іщдіссос9да 1 740 додасодасід сспсда99а9 д9асодддоса даосо9оайн сдоснсіда сощюассо 1800 дсоддсісіад адссісідсі аассаїднсе адсснсії сіищшесіа садсіссюа 1860 дсаасащсї дананоїо сідісісаїс аїшодсаа адааноаїї аансдадсяо 1920 аасоасдаааї асодсаїадс сдссассссу дассддссда досснсісі ддасіддаїсі 1980 дуансдавдс іссдісідсо Ісдсссісду аїссдааасд саддссаасі сдассасада 2040 тдсісідаас ойсісіса Ісаїсдідда ідассідсдс сссісссіда дсіонаща 2100 ддаїаадсід додаддіссс саааїанда ссаасіддса ісссасадсс іІссісйсса 2160 даащссійї дсдсадсаад садідідсдс сссдадссдс дшсшсс їІсасідасад 2220 дадассідас ассасссдсс Щщіасдасії саасісстас юдаддадс асосіддааа 2280 сісіссасс аїсссссаді асісааодда даащдасіаї дідассащюі содідддааа 2340 адісшсас ссідддаїаї сісіаасса їіассдащаї ісіссоїава дсіддієн 2400
Іссассйаї саїсснеосі сюадаацдіа Юаааасасі аадасаїдіс даддассада 2460 ддадаасіс саїдссаасс І(дсшодссс міддаіод сіддащійс ссдадддсас 2520 спдссдас ааасададса сідадсаадс саїасадно НКодаааада даааасвдіс 2580 адссадіссї Пецссідд ссондадіа іІсаїіаадсса сасаїссссі Ісадаїассс 2640 сааддааїйй садаадіої аїсссндда даасаїсасс сіддсссссо аїсссдадаї 2700 60 сссідаюдс сіасссссід дассіасаа ссссіддаїд дасаїсаддс аасдддаада 2760 сдіссаадсс Нааасаїса дідідссаїа іддіссаай ссідіддасі Нсадсддаа 2820 ааїссдссад адсіасшоу ссісюідіс аїашоддаї асасаддісд дссдссісії 2880 дадчюсшо дасдаїснс адсіддссаа садсассаїс айдсаша ссісддаїса 2940 дадідоосі стаддідаас аддадаа додссаааїас адсааіта аосіас 3000 ссаїднссс сідаїайсі анссідд ааддасоддсі Іісаснссодд аддсадасда 3060 дааасіше ссЦНассісо асссішоа Пссоссіса саайоаща адссаддсад 3120 дсааїссаїд дассідіда ааснаіціє Ісцшссс асодсіддсід дасндсадао 3180 асюсаддй ссассісдсі дссссунНос йсашсас аійдадсиі дсададаадо 3240 саадаассії сідаадсай Нсдайссо Ідаснодаа дадодаїссої ассісссідда 3300 їааїссссдї даасідацо ссіаїадсса діаїсссс9д ссіїсадаса ісссісадід 3360 даайсідас аадссдації їІіаааадагаї ааадаїсаю додсіайсса іасдсассаї 3420 адасіатада їаїасідщі дданодсії сааїссюаї даашсіад сіаасіцшіс 3480
Щасаїссаї дсаддддаас шіашої ддайсідас ссандсада аїсасааїа!ї 3540 діаїааідаї Ісссаадаю дадаїсни ссадноцно аїдссндад аайсаша 3600 айсдадсіс ддіассс9додяд ааїсаайнса сіссісадаї асаддсідсс іаїсадаадчо 3660 дашосідод ююдадссааї дсссідосіс асаааїасса сюадаїсії Шсссісід 3720 ссааааайцна юддоадасаїс аїдаадсссс Ндадсаїсі дасіїсіддс їааїааадда 3780 аашаці сайосаага дчідюонода ашшоіо ісісісасіс ддааддасаї 3840 адддаддас аааїсаша ааасаїсада ададіацйі даШададі ндасаасаї 3900 аюдсссаїаї дсіддсідсс аїдаасааад оПодсіаїга аададаісаї садіаїада 3960 аасадссссс дсідіссаї Ісспансс аїадаааадс спидаснода дайадаці 4020 пШаїай поаїшою панії сшаасаїс ссіаааайці Ісспнасаїд 4080 іїшШасіадс саданнс сіссісіссі дасіасіссс адісаїадсі дісссісце 4140
Іїснаюдад аїсссісдас сідсадссса адсщіадаї аадіадсаїд дсддайнааї 4200 санаасіас ааддаасссс іїіаддщаюда дпддссасі сссісісідс дсдсісодсіс 4260 дсісасщад дссдссс999 сшдсссдо дсддссісад щадсдадсу адсососад 4319 «21055 «2115 1653 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ОПІр5-версія! «4005» 5 адсссссас сіадаассд9 аададдаца сісіддсіса дасцогдсі діссадсою бо
З5 ддщаоссс ддосісдда аасссаддсс аасадсасса ссдасосссі даащідсід 120 сіданаїсд юддасодаїсі ссдасснсо сідддсідсі асддддаїаа дсідаїссдс 180 іссссдааїа іІсдассаасі ддсісасаї адссідсій Іссаааасдс айсдсссаа 240 саадссайї дсдссссдад ссдсоідісі Носісассу дссддсодссс ідаїасіассе 300 сдодсістасд асіїсаасад сіасіюдада дідсасдсад дааасійсіс сассайссі 360 садіасша аддадаасдо Насдісасс ададсаїда ддаадації ссасссюда 420 ашссісса ассасассда сдасісдсса їасіссіддаї ссшссссс Нассассса 480 ісаїссдада адіасдадаа сассаадасду Ідсаддддсс садасдддда асідсасдсод 540 аассіссісії дсссдаїсда юдсдадаї дідсссдаад дсасссіссс Ідасааасад 600 адсассдаас аддссаїсса одсіссісдад аададаааа сісадссіс сссойсій 660 сіддсс9іІдо дагассасаа дссдсаїаїс ссснссддї асссааадда днссадааяч 720 сідтасссдс юдадаасаї їасссіддсі ссідаїсссу аадідссдда сдассідсса 780 сссдіддсаї асаасссіу даддасаїс сдссададодд аддащцідса адсссідаас 840 аїісіссдідс саїасддісс даїсссддіс дасіїссадс ддаадайнад дсадісаїаї 900 псодсадсса ідіссіасії ддасасісад дісддасосс іІссісіссдс ісісдасдаї 960 сідсадсщда ссаасісдас санаїсдсд Нсассісду ассаїдоно дасісідддс 1020 даасасддад ааддаоссаа діасадсааї Нсдаїдісд сдасісасодї ассссідаїс 1080 нестасдідс ссддасдсас адссадсна ссідаадсдд дддаааадсі диссснас 1140 сіддаїсссі Ісдасіссос сісісаасії аїддадссад асадасадіс даїдассід 1200 дюдаасісд ідісасщії сссіасссіс дссоддієсща ссддаснса ддісссодссі 1260 сддісссда ідссдіссії ссасоїддад сідідісдсу адддааадаа ссіссідааа 1320 саснссдді Ііссдсдассі ддаддаадаї сссіасідс сдддсаассс дададаасії 1380 аїсдсаїасі сссадіассс Ісдссссісс дасаїсссдс адіддаасіс сдасаадссяд 1440 адссідаад9у асайаадаї саддадіас Іссаїссдда сіайдасіа іІсддіасасі 1500 аюїодаїсу дансаассс адададий сіддссаасі ісіссдаїа!ї ссадссдда 1560 бо дадсщіасі ісдіддасіс ддасссдсю саддассаса асащіасаа сдасісасад 1620 додсдасдасс ідйссади дсщдаюссс їда 1653 -2115» 7888 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» рААМ-САСі-опІр5-версія! «4005 6 сдсуддссас саїдссссса ссіадаассду даадададаїй дсісіддсіс ддасноюс 60
Ідіссадсої аідщідасс сідддсіс99 ааасссадас саасадсасс ассдасоассс 120 щдаащціодсі дсіданаїс сіддасоаїс Іссдассне дсіддосідс їасддддаїа 180 аасдздіссд сіссссдааї аїсдассаас юдсіїсаса їадссідсії Носаааасод 240 сайсодссса асаадссадїд іїдсдссссда дссосаїдіс Шссісасс ддссдасоасс 300 сідаїасіас ссддсісіас дасіїсааса дсіасіддад адідсасдса ддаааснсї 360 ссассайсс ісадіасій ааддадаасд днНасдісас саїдадсогю ддааадащі 420
Іссасссідд аашссісс аассасассяа асдасісдсс аїасіссідд Іссшсссс 480 сНассассс аїсаїссдад аадіасдада асассаадас дідсаддадс ссадасддда 540 аасдсасдс даассіссіс Ідсссддіса айідсідда щідсссдаа додсасссісс 600 сідасаааса дадсассдаа садодссаїсс адсіссісда даададааа асисадссі 660 ссссойсї Істдссдію ддаїассаса адссосаїаї сссснсс9да їасссааада 720 аднссадаа асідіасссу сіддадааса Масссюдс іссідаїссс даадідссда 780 асдассідсс дсссоїддса їасаасссії ддаддасаї ссдосададао чдаддайцідс 840 аадсссідаа саїсіссдід ссаїасодіс сдаїсссодді сдаснссад сддаадана 900 додсадісаїа Шсдсдісс дідіссіасі ддасасіса ддісддасос сіссісіссу 960 сісісдасда ісідсадсід дссаасісда ссанНаїсос дісассісд дассащай 1020 ддасіс4ад сдаасасдда дааїдддсса адіасадсаа Шсдаїцдіс дсдасісасд 1080 їдссссідаї сисіасоюд сссодасдса садссадсії дасстаадсд ддадаааадс 1140 тднессна ссіддаїссс йсдасіссяа ссісісаасі іаїддадсса ддсадасаді 1200 сдаюдассії ддюддаасіс дідісасіді Ісссіасссі сдссддієід ассоддасійс 1260
Зо аддісссдсс іІсддідсссо дідссдіссі Іссасдюдада дсідідісас дадддааада 1320 ассіссюаа асасцссдд Носдсдасс юдаддаада ісссіасну ссдддсаасс 1380 сдададаасі іаісдсаїас Ісссадіасс сісдссссіс сдасаїссся садіддаасі 1440 ссдасаадсс дадссдаад дасанаада ісадодіа сіссаїссдо асіайдасі 1500 аіїсддіасас щіїдоддіс ддднсаасс сададасдні ісіддссаас йсіссдаїа 1560 їссадссда ададсютас псдюддасі сддасссдсі дсаддассас аасаїщдіаса 1620 асдасісаса дддсддсдас сідйссаді дсідагсс сюадаайс дадсісодаіа 1680 сссдддааїс аайсасісс Ісадддсаяд асідссіаїс адаадащаї дасідата 1740 дссааїдссс ідасісасаа агассасіда даїснше ссісідссаа ааапйагюда 1800 дасаїсаїда адссссіїда дсаїсюасі ісіддсіаа! аааддааай ташісай 1860 дсааїадіої вчнадаайі шоїцісіс Ісасісддаа ддасаїащао дададсаааї 1920 сашаааас аїсадааюа діашоай їададшоЯд саасаїащс ссаїадсід 1980 дсдссаюда асааадоуна дсіаїааада доісаїсаді азадаааса дсссссідсі 2040 діссанссі їайссаїад аааадссно аспдадай адашни таїайної 2100 шашюйаї нИНсСій аасаїсссіа ааассі їасаЇни асіадссада 2160
ПШсСсІСс ІСіссідасі асісссадіс аїадсідісс сіснсісії аїддадаїсс 2220 сісдассдс адсссаадсі діадагаавді адсадодсда ойааїсай аасіасааду 2280 аассссіадї дзадюдадно дссасісссі сісідсосас іІсодсісодсіс асідадассо 2340 сссдуддсш дсссдадс9а ссісаддад сдадсдадсод сдсадсідса Наадааїс 2400 ддссаасаса садачадчача садшасої айодасосі сіссдсис сісдсісасі 2460 дасісдсідс асісддісді Іісддсюдсда сдадсоддіаї садсісасіс аааддсодіа 2520 азасдонаї ссасадааїс аддддаїаас дсаддааада асаїдюаєдс ааааддссад 2580 сааааддсса ддаассдіаа аааддссодса Носіддсодї шиссаїад дсіссодсссс 2640 ссідасдадс аїсасааааа іІсдасодсіса адісадададї дасдааассс дасаддасіа 2700
Тааадаїасс аддсушсес сссіддаадс ісссісдїдс дсісіссіді Іссдасссід 2760 ссдсНассод даїассідіс сдссШсіс ссісоаддаа дсодщдадсосі Неісаїадс 2820 їсасдсю'а доїаїсісад Нсоадіаїад дісонсасі ссаадсюдао сідщіосас 2880 даассссссд йсадсссда ссдсідсосс Наїссодіа асіаїсаісі Ідадіссаас 2940 ссддіаадас асдаснаїс дссасюдса дсадссасід діаасадда! їаддсададсо 3000 адодіащіад дсддідсіас адаансно аадідадаос сіаасіасд9у сіасасіада 3060 бо адаасадіаї Нодіаїсід сдсісідсід аадссадцна ссісддааа аададнодаї 3120 адсісідаї ссддсаааса аассассдсі датадсдат сш пдсаадсад 3180 саданасдс дсадаааааа аддаїсісаа даадаїссії дасте їасдддаісі! 3240 дасодсісадії ддаасдаааа сісасонаа дадашіоао ісаюадаї! аїсааааадо 3300 аїсисассі адаїсснії ааайааааа аадіша ааїсааїсіа аадіайанаї 3360 дадіааасії ддісщасад Нассааїдс Пааїсадід аддсассіаї сісадсдаїс 3420 їдістаціє дисаїссаї адндссіда сіссссдіса адаїаас іасдатасду 3480 дададсцас саїсіддссс садідсідса аїдатассдс дадасссасяа сісассддсі 3540 ссадашаї садсааіааа ссадссадсс ддааддассо адсдсадаад юдіссідса 3600 асшаїссод ссіссаїсса дісіїанааї днодссо9да аадсіададі аааїаднсо 3660 ссаднааїа дашосодсаа сонойосс аносіасад дсаїсоїдаї аїсасосісод 3720 їсдашоаїа додснсаї! садсіссдді ісссаасдаї сааддсдавдії іасада!тсс 3780 сссаїдної дсаааааадс дайадсісс псоддіссіс сдаїсоної садаадіаад 3840 пдоссосад юцпаїсасі саюодцйнаїд дсадсасідс аїаансісі Тасідісаї 3900 ссаїссдіаа даїдсішшс дющдасідаї дадіасісаа ссаадісаїйї сідадааїад 3960 щаюдсдадс дассдадно сісносссо дсдісааїас доддаїаатас сдсдссасаї 4020 адсадаасії Ідааадідсі саїсанода ааасунсії сдддосдааа асісісаадяо 4080 аїсцассдс ідндадаїс садійсдац іаасссасіс дюдсасссаа сідаїснса 4140 дсаїсішШа сшсассад соашсдда дадсааааа саддааддса аааідссодса 4200 ааааадддаа іаадддсдас асддааащі дааїасіса їасісцесі Шісааїа!ї 4260 тандаадса Шаїсадодд Чандісіс ададсддаї асаїашода ашіашад 4320 ааааатааас аааїадддаї Іссдсодсаса Шссссдаа аадідссасс юдасадісіаа 4380 дааассайа Наїсаюас айаассіаї аааааіаддс діаїсасдад дсссШеді 4440 сісдсосой Ісдаїдащда сдаїдаааас сісіасаса дсадсіссс ддадасоддіє 4500 асаадсійдіс щіаадсодда Ідссдддадс адасаадссс дісаддасос аісадсоддаї 4560 андасоадаї чісддадсі дсцаасіаї дсдасаїсад адсадацої асічададід 4620 сассаїадс ддююдаааї ассдсасада дсдіаадда даааайгасся саїсаддсда 4680 нссаасаїс сааїааагса іІасаддсаад дсааадааїї адсаааана адсааіааад 4740 ссісададса іааадсіааа ісддідіас сааааасаїй адасссіді ааїасішо 4800 сдддадаадс сшашса асосааддаї ааааацшії адаасссіса іаїайшаа 4860
Зо аюдсааїдсс щдадіааці діадаїааад айсааасдд дідадааадд ссддадасад 4920
Ісаааїсасс аїсааїаща іайсаассд Неїадсіда їааансад ссддададод 4980 їадсіації Ідададдісі сіасаааддс їіаісаддіса подссідада дісіддадса 5040 аасаададаа ісдадаасоая адіааїсдіаа аасіадса!у ісаасаїаї аіассссоді 5100
Заїааїсад аааадсссса аааасаддаа дайціаїаа дсааатацш ааанціаад 5160 сонааїай понааааї Ісдсонааа КШщШонаа аїісадсісаї НШаасса 5220 агаддссдаа аїісдосаааа ісссіагаа аіїсаааадаа іадассдада іаддоандад 5280 тднойсса дшоддааса ададіссасі анааадаас діддасісса асдісааадд 5340 дсдааааасс дісіаїсада дсдаїддссс асіасдаюдаа ссаїсасссі ааїсаадш 5400 шададісд аддідссдіа аадсасіааа іІсддаасссії ааадддадсс сссдашад 5460 адсндасда ддааадссду сдаасдіддс дадаааддаа дддаадааад сдаааддадс 5520 ддасасіадд дсдсіддсаа аідіадсодаї сасодсідсос діаассасса сасссдссдс 5580 дснаащсо ссосіасаду дсосдіасіа (доанпоусн дасдадсасо їаїаасодс 5640 шессІсдії адааісадад сдддадсіаа асаддаддсс данаааддо аїшадаса 5700 ддаасддіас дссадааїсс Іадаадці Шаїаас адідаддсса ссдадіаааа 5760 дацдісідісс аїсасдсааа Наассойцо ісдсааїасі Ісшодайа діааїаасаї 5820 сасноссід адіадаадаа сісааасіаї сддссндсі даїааїасс адаасааїаї 5880
Тассдссадс сайдсаасод дааїсдссаї Ісдссанса досідсдсаа сідндадаа 5940 ддасдаїсда дсодддссіс Нсодсіаца сдссадсідс дсосісдсіс дсісасідад 6000 дссдссс999 сааадсссо99д дсдісддаса ассшддіс дсссддссіс адідаадсдад 6060 сдадсоасоса дададддаді ддссаасісс аїсасіадда ойссідіа онаатдай 6120 аасссдссаї дсіаснаїс їасісдасаї їдананода сіаднацна агадіааїіса 6180 ацасддддї сайадіса їадсссаїаї аїддаднсс дсоНасаїа аспасоддіа 6240 ааддсссдс сіддсідасс дсссаасдас ссссдсссаї щасдісааї ааїдасадїаї 6300 дисссаїаяд іаасдссааї ададдасцс сандасадїс аа(ддада діашасодо 6360
Тааасідссс асіддсаді асаїсаадід іаіїсаїаюс саадіасдсс сссіайдас 6420 дісааїдасд діаааюдсс сассддсаї їагдсссадії асаїдассії агдддасіїї 6480 ссіаснддс адіасаїсіа соїанадіс аїсдсіана ссаюдісда ддщдадсссс 6540 асодйсідсі Ісасісіссс саїсіссссс сосіссссас ссссааші аїашаш 6600 ашшаа! таїшогдс адсдашада дсадад9999 чдаа9999с9 сдсдссадас 6660 бо дадасдд99с дадасдадод 9с9999с999 д9сдадосода дадаіюдсодс досадссааї 6720 сададсдасод сдсіссдааа дШеСНІ аїддсдаддас дасдоасдоса дсдасссіаї 6780 ааааадсдаа дсдсдсдасао ддсдадавдіс дсідсонос сісоссссо Ідссссдсіс 6840 сдссдссдсс їсдсдссдсс сдссссодсі сідасідасс дсонасісс сасададад 6900 сдддсдддас ддсссісіс сіссдддесід їаайадсдс ндДашШааї дасддснаї 6960 нсШсіЯ досідсою ааадссіда ддддсісс99 чадддсссії їдідсдадад 7020 дадсодсісд дададіосої дсаююю!ї дідсоюа99 адсоссосої дсоддсіссдс 7080 дсідсссоддс Яддсідідадс дсідсдадсо сддсодсдада сшдідсодс іссдсаднції 7140 дсасдадодо адсосддссо дадасодідс сссдсодідс д9999999сії дсдадодоаа 7200 сааадосідс дідс999919 діо9сою99 999919а9са д999919199 ососодісоді 7260 сдддсідсаа сссссссідс ассссссісс ссдадносі дадсасддсс сдасійсода 7320 юсододсіс сдіасддддс дідосос999 дсісдссою ссддас9999 дащдосодса 7380 9919999919 ссад9с9999 сододссосс ісддасс999 дададсісод д99а9999с9 7440 сддсоддсссс сддадсоссо дсдасідісд адасосдасо адссдсадсс айдссні 7500 адоіааїса дсдададодд сасададасі Іссшадісс саааїсідїд сддадссдаа 7560 аїсідддада сдссдссдса сссссісіад сддасасоада дсдааасаді дсддсодссда 7620 саддааддаа аїдадс9999 аддасснса дсдісдсса сдссдссаїс соснсіссс 7680
Істїссадссі сддадсідіс сдсдддадада сдосідссії сдддадддас ддддсадодс 7740 ддчайсддс неддсдю дассодсодо сістададсс ісідсіаасс аїднсаїдс 7800 спсНнеш посіасадс іссюдосаа сддсіоддії апотсіді сісаїсацш 7860 дасааадаа ноайаай сдадсдаа 7888 -2105 7 «2115» 4307 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ААМ9-САСІ-опІр5-версія «4005 7 ацасдссад сідсдсодсіс дсісдсісас даддссосс саддсааадс ссдадсодісо 60 ддсдассійї ддісдсссдо ссісадщад сдадсдадсду сдсадададо дадідассаа 120
Зо сіссаїсасі адддойссі дїаднааї данаасссу ссаюсіасі іаїсіасісд 180 асайдана Подасіадії анаагадіа аїсаацасд додісанаяд їсаїадсссе 240 азаіаюдад йссдсоуна саїааснас ддіаааддс ссдссіддсі дассдсссаа 300 сдасссссдс ссайдасої сааіаадас діайссс агадіаасдс сааіадддас 360 шесанда содісааюда юдадіацй асодіааасі дсссаснодо садіасаїса 420
З5 адюагсаї адссаадіа сдсссссіаї дасадїсааї дасддіаааї ддоссдссід 480 дсанащсс садіасаюа сснащдаода сшссіасі дасадіаса ісіасотай 540 адісаїсдсі анпассаща ісдаддщдад ссссасднс ідсіїсасіс іссссаїсіс 600 сссссссісс ссасссссаа Шота ашацй їаайації дсгдсадсодаї 660 99999с9999 9999999999 99с9сососс аддасоа99с9 999с9999с9 ададосо999 720 сдддасдадао сддададаїд сддсддсадс сааісададс ддсдсодсісс дааадшісс 780 їшШшаюдосо аддсадсдас дасддсдодсс сіаїааааад сдаадсдсдс ддсда9дсо999 840 адісдсідсуд Ндсснсдс сссдідсссс дсіссдссдс сдссісасдс сдессдессс 900 дусістюдасі дассдсопца сісссасада Іадсдоддсо ддасодсссі ісіссіссда 960 дсідіааца дсоснда їааїдасоддс Наше ісід9д9сІд саїдааадсс 1020 поадодосі ссдадададс ссшоюсо д9999а9с99 сісдда9о9і осоюсоюі 1080 аюшосої ддддадсодсс дсдідсддсі ссдсдсідсс сддсдасюі дадсосідса 1140 дасосддсдс ддадсщтої дсосіссоса дідідсосда ддададсося дссодадоса 1200 дідссссдсо дідс999999 д9сідсдадо ддаасааада сідсоюсоа одідіююсо 1260 щачдчадчоаоід адсаддадаї ададсосої судісдоадсії дсаасссссс сідсассосс 1320 сіссссдаді юсідадсас ддсссддсії сддаїсада осіссдїасо дадсодідосо 1380 сдадасісдс суїдссоддос дададаос досадаювдва даюссодос дадосададе 1440 содссісдддс сддададодс ісдддададо д99с9с99с99 сссссддадс дссддсодсі 1500 дісдаддсдс ддсдадссдс адссаносс ІШагодіа аїсаїдсдад аддасодсадао 1560 даснссійй дісссаааїс ідідсддадс сдааасідд дчаддсдссдс сдсасссссі 1620 з сіздсдд9со9 сддодасдаад содідсодасо ссддсаддаа ддаааюдос дадаададсс 1680 нсоюсаїс дссосдссас сдіссссне ісссісісса дссісдадас іщдіссос9да 1 740 додасодасід сспсда99а9 д9асоддоса даосо9оай сдоснсіда сощюассо 1800 дсоддсісіад адссісідсі аассаїднсе адсснсії сішесіа садсіссюд 1860 дсаасащсї дананоїо сідісісаїс аїшодсаа адааноаїї аансдадсяо 1920 бо аасосдідсс ассаїдсссс сассіадаас сддаададда Насісіддс Ісддаснаї 1980 дсідіссадс аідідида сссіддосіс ддааасссад дссаасадса ссассдасдс 2040 ссюдаацід сідсідана ісдіддасода Ісіссддссі Ісдсюдасі дсіасдддда 2100
Таадсіддіс сдсіссссда аїаїсдасса асіддсійса сагадссідс Шссаааа 2160 сдсайсодсс саасаадссяа ідідсдсссс дадссдсою ісшссіса ссддссддсао 2220 сссідаїасі асссдасісі асдасіїсаа садсіасща ададідсасду саддааасії 2280 сіссассаї! ссісадіасі Пааддадаа сдонасдіс ассаюадса ддддаадої 2340 диссасссі ддааціссі ссаассасас сдасдасісд ссаїасіссі даїссшсс 2400 сссНассас ссаїсаїссд адаадіасда даасассаад асдідсадад дсссадасдад 2460 ддаасідсас дсдаассісс ісідсссдді сдашідсю дащідсссд ааддсасссі 2520 сссідасааа сададсассд аасаддссаї ссадсіссіс дадаадаїда аааснсадс 2580 сіссссойе Шсіддссу юддодаїасса саадссосаї аїіссссісс ддіасссааа 2640 ддадіссад аадсюіасс сосіддадаа санасссід дсіссідаїс ссдаадідсс 2700 ддасдассід ссдсссаїдо саїасаассс пддаїдас аїссдссада дададоайщці 2760 дсаадсссід аасаїсіссяо ідссагасда іссдаїсссо дісдаснсс адсддаадаї 2820 тТадодсадіса їашсосодї ссдущіссіа спддасасі саддісодас дссіссісіс 2880 сосісісдас даїсідсадс Іддссаасіс дассанаїс дсдїїсассі сддассащда 2940 пддасісід ддсдаасасу дадааюддас саадіасадс аашсдаїд ісдсдасіса 3000 содссссід аїснсіасо їдсссддасу сасадссадс Носсідаад сдддадаааа 3060 осіднессі їассіддаїс ссіїсдасіс сдссісісаа спаддадс саддсадаса 3120 дісдаїдас сіддюддаас ісадідісасі днсссіасс сісдссддіс юдссодасі 3180 їсадаїссса ссісдаїдсс содідссдіс сіссасодїд даасідідієс дсдадддааа 3240 даассіссід ааасасійсс дданосдсда ссіддаддаа даїсссіасі І(дссдддсаа 3300 сссдададаа сіНагсодсаї асісссадіа сссісдсссс Іссдасаїсс сдсадюддаа 3360 сіссдасаад ссдадссіда аддасайаа даїсащада іасіссаїсс ддасіайда 3420 сіаїсодіас асідідї9дда ісддоансаа сссададад Шеїддсса аснсіссда 3480 їаїссаюсс ддададсоії асісаїдда сісддасссд сідсаддасс асаасащіа 3540 саасдасіса садддсдодсад ассіднсса дідсідад сссідадааї ісдадсісдд 3600 тТасссдддаа Ісаансасі ссісадащс адодсідссіа Ісадаадоїд дідасща 3660 щассааїдс ссіддсісас ааагассасі дадаїснци Ісссісідсс ааааана 3720
Зо дддасаїсаї даадссссії дадсаїсіда спсідасіа аїаааддааа Шацшнса 3780 подсааїаді діднадааї НІНаїціс ісісасісда ааддасаїаї дддаддасаа 3840 аїсашааа асаїсадааї дачіайодд Шададійїї ддсаасаїаї дсссаїадс 3900 щдасідссаї даасааадді (ддсіаїааа дадодісагїса діайашдааа садсссссід 3960 сідіссанс снайссаї адаааадссі щасіїдаду Надацшії Шатацші 4020 аинащії ашншсі Чаасаїссс іІаааацшіс спасації Насіадсса 4080 дчаншссі ссісіссіда сіасісссад ісаїадсіді сссіснсїс Наїддадаї 4140 сссісдассії дсадсссаад сющіадаїаа діадсаддс доадіааїса Наасіасаа 4200 ддаассссіа дідаюдаді ддссасісс сісістсас одсісосісдс ісасідадас 4260 сдсссдддсі Ндсссддос доссісадід адсдадсдад сдсоасад 4307 -2105» 8 «2115 1653 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ОПІр5-версія?2 «400» 8 ащдссіссіс сіадаасідд аададоадсе сідщаосіда ддсіддіссі дісаїсадід 60 тдідісосіс ддосіссда дасісаддса аасіссасса садасдсссі даашіосіюд 120 сідаїсано іІсдасодаїсі дсдасснсос сіддддсі асддсдасаа дсіддідада 180 іІсіссаааса іІсдаїсадсі ддснсасас адссідсіцді Іссадаадс сшосісаяд 240 саддсадідї дідсассаїс асдадісадс Нссідассу дааддадасс Ідасасіасс 300 аддсідіасд ааасіс аїзапддада дідсадссду ддаашсад сассаїссса 360 садіасша аддадаасода сіаііюдаса аїдіссдідд даааацдієсії ссассссодс 420 ацадсісса аїсаїасада содаїйсісса іасіссідді сішсссосс Наїсасссс 480 істїаддада адіасдаааа сасааааасі їдсаддддас садасддода одсідсаїдса 540 ааісідсіці дісссдюдда садіссіддаї дідсссдаад дсасасідсс Ідаїаадсад 600 адсасідадс адоассаїйса дсідсіддаа аададаааа саадідснсе асссісш 660 сіддсавдід9 даїаїісасаа ассасаїаїс сссіїсадаї аїсссаадда дшсадааа 720 сідїасссіс ддаааасаї їасісідасі сссдасссю ададссюа юдасідсса 780 60 сссдісдсаї аїаасссаїд даддасаїс сддсадсосу аддашідса ддсссідааї 840
Зо аїсадідієс спасодддсс аайсссаїд даснсосада дааадансд дсадіснас 900 шассасдса ісіссіаїсі ддаїасісаа дідддасдас дсідадсдс Іісюдасодаї 960 сідсадсща ссаасадсас саїсанодсі Псасаїссод ассасдда аасісідодда 1020 дадсаюддад ааюддодсааа діаіадсааї недащідао ссасісасодї сссасідаїс 1080
ІшШасдщс ссддссдаас сдсаїсссід ссададдсід дадааааасі дісссНас 1140 сіддасссаї Щщайсідс їадісадсід аддадссід дссдасадіс їІагддассід 1200 дюдаасідод ісадісідії сссіасасід дстддасіда саддасідса даїдссісса 1260 адаїдсссід дссаїсні ісасдісдад сідщісдда ааддсаадаа ссідсщдааа 1320 сашсадодї Ісадддассі ддаддаадаї ссцНаїсідс саддаааїсс садддадсід 1380 аїсдссіаса дісадіаїсс ссдсссіїса дасайссіс адіддаасіс сдасаадсса 1440 ісїсюдаада аїгафсааааї іаддддаїас адсаїссдса сіандайца ссдаїагасс 1500 аюїодаїс9 дансаассс сдасдадіїс сіддсааай Падіщдаїаї ссасдссдас 1560 даасщіаїй ноюдасіс адаїссісю саддассаїа асаїдіасаа дасадссад 1620 досддадаїс днссадсії дсюдаїдсса ща 1653 2105 9 -2115» 7888 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» рААМ-САСсі-опІр5-версія?г «4005» 9 сдсуюдссас саїдссіссі сстадаасід заадддадсі дсіящасю адасідадісс 60
Ідісаїсаді дідщісаосі сідддсіссу адасісаддс ааасіссасс асадасодссс 120 юдаащдіодсі дсідаїсай дісдасдаїс дсдассне ссіддоддідс їасддсдаса 180 аасюдщаая дісіссааас аїсдаїсадс ддсисаса садссідсід Нссадааю 240 сешодсіса дсаддсадід щідсассаї сасодддісад сіїссідасс ддааддадас 300 сідасасіас саддсідіас даїшаасі саїанддад адідсадсс дддаашса 360 дсассаїссс асадіасійї ааддадаасд дсіадмюас ааїдіссоїд ддаааацісєсії 420
Іссассссд9у санасдсісс ааїсаїасад асдайсісс агасіссідд Існшнсссс 480
Зо сНагїсассс сісіадідад аадіасдааа асасааааас Ндсадддда ссадасдада 540 адсюсаїдс аааїсідсід ідісссдідд асдіссюда ідідсссдаа досасасідс 600 сідаїаадса дадсасюаєд саддссайс адсідсідда ааададааа асаадіодсії 660 сасссісії Істїддсадід ддаїагсаса аассасаїаї ссссіїсада Іаіїсссаадад 720 адшсадаа асідіасссі сіддааааса Насісюдс ісссдасссії даддідссю 780
З5 аддасідсс асссдісдса Іаіаасссаї ддаддасаї ссдасадсдс даддашідс 840 аддсссідаа іаїсадідіс ссбйасдддс саайсссді ддасіссад адааадайс 900 додсадієна сшдссадс дісіссіаїс ддаїасіса адідддасода сідсідадсу 960 сісїіддасда ісідсадсід дссаасадса ссаїсайодс Шсасаїсс дассасддаї 1020 ддасіс4ад ададсаюда дааддосаа адіаїадсаа Шсдащію дссасісасд 1080
Ісссасідаї сішасоїд сссддссдаа ссдсаїсссії дссададдсі ддадааааас 1140 їднессна ссіддассса Шодансід сіадісадсі даюдадссі дассдасаді 1200 сіаюддассії ддюддаасід дісадісіці Ісссіасасі дасіддасід дсаддасідс 1260 аддідссісс аадаїдсссі дідссаїсії Нсасдісда дсюїдісдо даадасаада 1320 ассідсдаа асашсадо йсадддасс юдаддаада ісснНаїсід ссаддаааїс 1380 ссадддадсі даїсдссіас адісадіаїс сссдсоссне адасайссї садіддаасі 1440 ссдасаадсс аїсісдаад даїаїсаааа падоддаїа садсаїссдс асіандаїй! 1500 ассдаїатас сощідадіс ддднсаасс ссдасдадії ссіддсаааї Шадідаїа 1560 їссасдссдо сдаасідіаї ШОЮДасі садаїссісї дсаддассаї аасаїдіаса 1620 адасадсса ддасодадаї сідносадс юсідаїдсс ададаайс дадсісодіа 1680 сссдддааїс аайсасісс Ісадддсаяд асідссіаїс адаадащаї дасідата 1740 дссааїдссс ідасісасаа агассасіда даїснше ссісідссаа ааапйагюда 1800 дасаїсаїда адссссіїда дсаїсюасі ісіддсіаа!ї аааддааайн ташісай 1860 дсааїадіої вчнадаайі шоїцісіс Ісасісддаа ддасаїащао дададсаааї 1920 сашаааас аїсадааюа діашоай їададшоЯд саасаїащс ссаїадсід 1980 дсдссаюда асааадоуна дсіаїааада доісаїсаді аїадаааса дсссссідсі 2040 діссанссі їайссаїад аааадссно аспдадай адашни таїайної 2100 шашюйаї нИНсСій аасаїсссіа ааассі їасаЇни асіадссада 2160
ПШсСсІСс ІСіссідасі асісссадіс аїадсідісс сіснсісії аїддадаїсс 2220 сісдассідс адсссаадсі діадагаавдї адсадодсода оїааїсай аасіасаадо 2280 бо аассссіадї дзадюдадно дссасісссі сісідсосас іІсодсісодсіс асідадассо 2340 сссдуддсш дсссдадс9а ссісаддад сдадсдадсод сдсадсідса Наадааїс 2400 ддссаасаса садачадчача садшасої айодасосі сіссдсіс сісдсісасі 2460 дасісдсідс асісддісді Іісддсюдсда сдадсоддіаї садсісасіс аааддсодіа 2520 азасдонаї ссасадааїс аддддаїаас дсаддааада асаїдюаєдс ааааддссад 2580 сааааддсса ддаассдіаа аааддссодса Носіддсодї шиссаїад дсіссодсссс 2640 ссідасдадс аїсасааааа іІсдасосіса адісадададї дасдааассс дасаддасіа 2700
Тааадаїасс аддсушсес сссіддаадс ісссісдїдс дсісіссіді Іссдасссід 2760 ссдсНассод даїассідіс сдссШсіс ссісоаддаа дсодщдадсосі Неісаїадс 2820 їсасдсю'а доїаїсісад Нсоадіаїад дісонсасі ссаадсюда сідщіосас 2880 даассссссд йсадсссда ссдсідсосс Наїссодіа асіаїсдісі Ідадіссаас 2940 ссддіаадас асдаснаїс дссасюдса дсадссасід діаасадда! їаддсададсо 3000 адодіащіад дсддідсіас адаансно аадідадаос сіаасіасд9у сіасасіада 3060 адаасадіаї Ноддіаїсід сдсісідсід аадссадна ссисддааа аададнодаї 3120 адсісідаї ссддсаааса аассассдсі датадсдат сш пдсаадсад 3180 саданасдс дсадаааааа аддаїсісаа даадаїссії дасте їасдддаісі! 3240 дасодсісадії ддаасдаааа сісасонаа дадашіоао ісаюадаї! аїсааааадо 3300 аїсисассі адаїссні ааайааааа юаадіша ааїсааїсіа аадіайанаї 3360 дадіааасії ддісщасад Нассааїдс Пааїсадід аддсассіаї сісадсдаїс 3420 їдістаціє дисаїссаї адндссіда сіссссдіса адаїаас іасдатасду 3480 дададсцас саїсіддссс садідсідса аїдатассдс дадасссасяа сісассдасі 3540 ссадашаї садсааіааа ссадссадсс ддааддассо адсдсадаад юдіссідса 3600 асшаїссод ссіссаїсса дісіїанааї днодссо9да аадсіададі аааїаднсо 3660 ссаднааїа дашосодсаа сонойосс аносіасад дсаїсоїдаї аїсасосісод 3720 їсдашоаїа додснсаї! садсіссоді ісссаасдаї сааддсдавдії їасаїдаїсс 3780 сссаїдної дсаааааадс дайадсісс псоддіссіс сдаїсоної садаадіаад 3840 пдоссосад юцпаїсасі саюодцйнаїд дсадсасідс аїаансісі Тасідісаї 3900 ссаїссдіаа даїдсшс дющдасідаї дадіасісаа ссаадісаїйї сідадааіад 3960 аюдсодс дассдадно сісносссу дсдісааїас доддаїаатас сдсдссасаї 4020 адсадаасії Ідааадідсі саїсанода ааасунсії сдддосдааа асісісаадяо 4080
Зо аїсцассдс ідндадаїс садійсдац іаасссасіс дюдсасссаа сідаїснса 4140 дсаїсішШа сшсассад соашсдда дадсааааа саддааддса аааідссдса 4200 ааааадддаа іаадддсдас асддааащі дааїасіса їасісцесі Шісааїа!ї 4260 тандаадса Шаїсадодд Чандісіс ададсддаї асаїашода ашіашад 4320 ааааатааас аааїадддаї Іссдсодсаса Шссссдаа аадідссасс юдасадісіаа 4380 дааассайа Наїсаюдас айаассіаї аааааіаддс діаїсасдад дсссШеді 4440 сісдсосой Ісдаїдащда сдаїдаааас сісіасаса дсадсіссс ддадасоддіє 4500 асаадсійдіс щіаадсодда Ідссдддадс адасаадссс дісаддасос аісадсоддаї 4560 андасоадаї чісддадсі дсаасіаї дсдасаїсад адсадацої асідадавід 4620 сассаїадс ддююдаааї ассдсасада дсдіаадда даааайгасся саїсаддсда 4680 нссаасаїс сааїааагса іІасаддсаад дсааадааїї адсаааана адсааіааад 4740 ссісададса іааадсіааа ісддідіас сааааасаїй адасссіді ааїасішо 4800 сдддадаадс сшашса асосааддаї ааааацшіїї адаасссіса іІаїайшаа 4860 аюдсааїдсс щдадіааці діадаїааад айсааасдд дідадааадд ссддадасад 4920
Ісаааїсасс аїсааїаща іайсаассд Неїадсіда їааансад ссддададод 4980 їадсіації Ідададдісі сіасаааддс їіаісаддіса подссідада дісіддадса 5040 аасаададаа іІсдадаасо адіааїсдіаа аасіадсаїуд ісаасаїаї аїассссоді 5100
Заїааїсад аааадсссса аааасаддаа дайціаїаа дсааатацш ааанціаад 5160 сонааїай понааааї Ісдсонааа КШщШонаа аїісадсісаї НШаасса 5220 агаддссдаа аїісдосаааа ісссіагаа аіїсаааадаа іадассдада іаддоандад 5280 тднойсса дшоддааса ададіссасі анааадаас діддасісса асдісааадд 5340 дсдааааасс дісіаїсада дсдаїддссс асіасдаюдаа ссаїсасссі ааїсаадш 5400 шададісд аддідссдіа аадсасіааа іІсддаасссії ааадддадсс сссдашад 5460 адсндасда ддааадсс9ду сдаасуаддс дадаааддаа дддаадааад сдаааддадс 5520 ддасасіадд дсдсіддсаа аідіадсодаї сасодсідсос діаассасса сасссдссдс 5580 дснаащсо ссосіасаду дсосдіасіа (доанпоусн дасдадсасо їаїаасодс 5640 шессІсдії адааісадад сдддадсіаа асаддаддсс данаааддо ашадаса 5700 ддаасддіас дссадааїсс Іадаадці Шаїаас адідаддсса ссдадіаааа 5760 дацдісідісс аїсасдсааа Наассойцо ісдсааїасі Ісшодайа діааїаасаї 5820 сасноссід адіадаадаа сісааасіаї сддссндсі даїааїасс адаасааїаї 5880 60 Тассдссадс сайдсаасод дааїсодссаї Ісдссанса дасідсдсаа сідндадаа 5940 ддасдаїсда дсодддссіс Нсодсіаца сдссадсідс дсосісдсіс дсісасідад 6000 дссдссс999 сааадсссо99д дсдісддаса ассшддіс дсссддссіс адідаадсдад 6060 сдадсоасоса дададддаді ддссаасісс аїсасіадда ойссідіа онаатдай 6120 аасссдссаї асіаснаїс їасісдасаї Ідананода сіаднана агадіааіса 6180 ацасддддї сайадіса їадсссаїаї аїддаднсс дсоНасаїа аспасоддіа 6240 ааддсссдс сіддсідасс дсссаасдас ссссдсссаї щасдісааї ааїдасадїаї 6300 дисссаїаяд іаасдссааї ададдасцс сандасадїс аа(їддаода діашасодо 6360
Тааасідссс асіддсаді асаїсаадід іаіїсаїаюс саадіасдсс сссіайдас 6420 дісааїдасд діаааюдсс сассддсаї їагдсссадії асаїдассії агдддасіїї 6480 ссіаснддс адіасаїсіа соїанадіс аїсдсіана ссаюдісда ддщдадсссс 6540 асодйсідсі іІсасісіссс саїсіссссс сссіссссас ссссаації дташай 6600 ашшаа! таїшогдс адсдашада дсадад9999 чдаа9999с9 сдсдссадас 6660 дадасдд99с дадасдадод 9с9999с999 д9сдадосода дадаіюдсодс досадссааї 6720 сададсдасод сдсіссдааа дШеСНІ аїддсдаддас дасдоасдоса дсдасссетаї 6780 ааааадсдаа дсдсдсдасао ддсдадавдіс дсідсонос сісоссссо Ідссссдсіс 6840 сдссдссдсс їсдсдссдсс сдссссодсі сідасідасс дсонасісс сасададад 6900 сдддсдддас ддсссісіс сіссдддесід їаайадсдс ндДашШааї дасддснаї 6960 нсШсіЯ досідсою ааадссіда дддасісс99 чададсссії їшідсдадад 7020 дадсодсісд дададіосої дсаююю!ї дідсоюа99 адсоссосої дсоддсіссдс 7080 дсідсссоддс Яддсідідадс дсідсдадсо сддсодсдада сшдідсодс іссдсаднції 7140 дсасдадодо адсосддссо дадасодідс сссдсодідс д9999999сії дсдадодоаа 7200 сааадосідс дідсадав9ію іосоювдо д99919адса ддаоаіююа ососдісоді 7260 сдддсідсаа сссссссідс ассссссісс ссдадносі дадсасддсс сдасійсода 7320 юсододсіс сдіасддддс дідосос999 дсісдссою ссддас9999 дащдосодса 7380 999999919 ссад9с9999 сододссосс ісддасс999 дадодсісяд д99а9999с9 7440 сддсоддсссс сддадсоссо дсдасідісд адасосдасо адссдсадсс айдссні 7500 адоіааїса дсдададодд сасададасі Іссшадісс саааїсідїд сддадссдаа 7560 аїсідддада сдссдссдса сссссісіад сддасасоада дсдааасаді дсддсодссда 7620 саддааддаа аїдадс9999 аддасснса дсдісдсса сдссдссаїс соснсіссс 7680
Зо Істїссадссі сддадсідіс сдсдддадада сдосідссії сдддадддас ддддсадодс 7740 ддчайсддс неддсдю дассодсодо сістададсс ісідсіаасс аїднсаїдс 7800 спсНнеш посіасадс іссюдосаа сддсіодії апдугсіді сісаїсайці 7860 дасааадаа ноайаай сдадсдаа 7888 «210510 «2115» 4307 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ААМ9-САСІ-опІр5-версія?г «4005 10 ацасдссад сідсдсодсіс дсісдсісас даддссосс саддсааадс ссдадсодісо 60 ддсдассійї ддісдсссдо ссісадщад сдадсдадсду сдсадададо дадідассаа 120 сіссаїсасі адддойссі дїаднааї данаасссу ссаюсіасі іаїсіасісд 180 асайдана Подасіадії анаагадіа аїсаацасд додісанаяд їсаїадсссе 240 азаіаюдад йссдсоуна саїааснас ддіаааддс ссдссіддсі дассдсссаа 300 сдасссссдс ссайдасої сааїаадас діашнссс агадіаасдс сааїадддас 360 шесанда содісааюда юдадіацй асодіааасі дсссаснодо садіасаїса 420 адюагсаї адссаадіа сдсссссіаї дасадїсааї дасддіаааї ддоссдссід 480 дсанащсс садіасаюа сснащдаода сшссіасі дасадіаса ісіасотай 540 адісаїсдсі анпассаща ісдаддщдад ссссасднс ідсіїсасіс іссссаїсіс 600 сссссссісс ссасссссаа Шота ашацй їаайації дсгдсадсодаї 660 99999с9999 9999999999 99с9сососс аддасоа99с9 999с9999с9 ададосо999 720 сдддасдадао сддададаїд сддсддсадс сааїісададс ддасоасодсісс дааадшсс 780 їшШшаюдосо аддсадсдас дасддсдодсс сіаїааааад сдаадсдсдс ддсда9дсо999 840 адісдсідсуд Ндсснсдс сссдідсссс дсіссдссдс сдссісасдс сдессдессс 900 дусістюдасі дассдсопца сісссасада Іадсдоддсо ддасодсссі ісіссіссда 960 дсідіааца дсосндай їІааїдасоддс НУШе І ісід9д9сІд саїдааадсс 1020 поадодосі ссдадададс ссшоюсо д9999а9с99 сісдда9о9і осоюсоюі 1080 аюшосої ддддадсодсс дсдідсддсі ссдсдсідсс сддсдасюі дадсосідса 1140 бо дасосддсдас ддадсщтої дсосіссоса дідідсосда ддададсося дссододаосо 1200 дідссссдсо дідс999999 д9сідсдадо ддаасааада сідсоюсоа одідіююсо 1260 щачдчадчоаоід адсаддадаї ададсосої судісдоадсії дсаасссссс сідсассосс 1320 сіссссдаді юсідадсас ддсссддсії сддаїсада осіссдїасо дадсодідосо 1380 сдадасісдс суїдссоддос дададаос досадаювдво даюссодос дадосададе 1440
З содссісдддс сддададодс ісдддададо д99с9с99с99 сссссддадс дссддсодсі 1500 дісдаддсдс ддсдадссдс адссаносс ІШагодіа аїсаїдсдад аддасодсадао 1560 даснссійй дісссаааїс ідідсддадс сдааасідд дчаддсдссдс сдсасссссі 1620 сіздс9дд9со9 сддоасдаад содідсодасо ссддсаддаа ддаааюдсос даддададсс 1680 нсоюсаїс дссосдссас сдіссссне ісссісісса дссісдадас іщдіссос9да 1 740 ддчасоддсід ссісдддда адасодддаса авдасоадади садснса сощдідассо 1800 дсоддсісіад адссісідсі аассаїднсе адсснсії сіищшесіа садсіссідо 1860 дсаасащсї дананоїо сідісісаїс аїшодсаа адааноаїї аансдадсяо 1920 аасоасдідсс ассаїдссіс сіссіадаас даададаа сідсідіддс юадасідої 1980 ссідісаїса дідідіцісд сісіддасіс сдадасісад дсааасісса ссасадасдс 2040 ссюаайцід сідсідаїса Пдісдасоа ісідсдассі Ісссідддаї дсіасддсда 2100 саадсіддід аддісіссаа асаїсдаїса дсіддснса сасадссідс щіссадаа 2160 їдссшодсі садсаддсад щідіосасс аїсасддчвіс адснссіда ссддааддад 2220 ассідасасі ассаддсці асдашаа сісайацнодо ададіюсаїд ссдддааш 2280 садсассаїс ссасадіасі Пааддадаа сддсіащід асаайдіссо ддааааасці 2340 сіцссасссс ддсанадсі ссааїсаїас адасдацйсі ссаїасіссі даїсішсс 2400 сссНаїсас сссісіадід адаадіасда ааасасаааа асідсад9д9у дассадасода 2460 ддаасідсаї дсаааїсіодс ідідісссої ддасцдіссід дашіодссса ааддсасасі 2520 дссідаїаад сададсасід адсаддссаї Ісадсідсід даааадаюа ааасаацдідс 2580 псасссне шсіддсаяд юддодаїагса сааассасаї аїссссіїса даїаїісссаа 2640 ддаацнісад ааасідіасс сісіюдаааа сацасісід дсісссдасс стаддідсс 2700 щаїдасід ссасссдісд саїаїіаассс аюдаддас аїссдасадс дсдаддаші 2760 дсададсссід ааїагсадіу Іссснцасдд дссаанссс діддаснсс ададааадаї 2820
Ісддсадісї їіасшодсса дсадісісста іІсіюдагасі саадідддас дасідсюдад 2880 сосісіддас даїсідсадс ддссаасад сассаїсаїї дсшсасаї ссдассасдд 2940
Зо аддосісід ддададсаїд дадааіддодс ааадіаїадс аашсодаїд юддссасіса 3000 сдісссасід аїсішасод іїдсссддссд аассдсаїсс сідссададао сіддадаааа 3060 асідйсссі іІассіддасс сашдайс ідсіадісад сідададс сіддссдаса 3120 аетаюддас сідддааас іддісадісі дисссіаса сіддсіддас ддсаддасі 3180 дсаддідссі ссаадацсс сідідссаїс Шісасодіс дадсідіціє дддааддсаа 3240 даассідсю ааасашса дайсаддда ссіддаддаа даїсснаїс їдссаддааа 3300 їсссадддад сідаїсодссі асадісадіа іІссссодсссі Ісадасайс сісадіддаа 3360 сіссдасаад ссаїсісіда аддаїаісаа аацашода їасадсаїсс дсасіайда 3420
Нассдаїаї ассоію1і9дда ісддонсаа ссссдасодад йссіддсаа аїшадіда 3480
Таїссасдсс дасодаасідї авшоюда сісадаїссі сюсаддасс аїаасащіа 3540 сааюасадс садддсддад аїсіднсса дсісідаїд ссаїдадааї! Іісдадсісдо 3600 тТасссдддаа Ісаансасі ссісадащс адодсідссіа Ісадаадоїд дідасща 3660 щассааїдс ссіддсісас ааагассасі дадаїснци Ісссісідсс ааааана 3720 дддасаїсаї даадссссії дадсаїсіда спсідасіа аїаааддааа Шацшнса 3780 посаагаді чюнодааї ННаїціс ісісасісда ааддасаїаї дддаддасаа 3840 аїсашааа асаїсадааї дачіайодд Шададійїї ддсаасаїаї дсссаїадс 3900 щдасідссаї даасааадді (ддсіаїааа дадодісагїса діайашдааа садсссссід 3960 сідіссанс снайссаї адаааадссі щасіїдаду Надані Шаташі 4020 аинащії ашншсі Чаасаїссс іІаааацшіс спасації Насіадсса 4080 дчаншссі ссісіссіда сіасісссад ісаїадсіді сссіснсїс Наїддадаї 4140 сссісдассії дсадсссаад сющіадаїаа діадсаддс доадіааїса Наасіасаа 4200 ддаассссіа дідаддавді (ддссасісс сісісідсос одсісасісдс іІсасідаддс 4260 сдсссдддсі Ндсссддос доссісадід адсдадсдад сдсоасад 4307 -2105 11 «2115 1665 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» отір5 «4005 11 бо ададсссас сісссссасс сссааїсід9д сддсадсюда дсисадссі асідсідддс 60 аадсісіщдіа Ісдсссідда аадсдссаад спдсссадд адсаасадсдс сассдасдсс 120 сідаасаїсс дсідаїсаї сдддасодас сідаддссса дссідддаю сіасддсдас 180 аадсіддісс дсадссссаа саїсдассад сіюддсійсіс асадсдідсі дсйссадаас 240 дсансодсас адсаддссодї дідсдссссс адсададідї сшосюдас сддсадаадо 300 сссдасасса ссадасщіа сдасіїсаас адсіасіддс ддоаїдсасад садсаасійс 360 адсассаїсс сссадіасії сааадаааас ддсіасдюда ссаїдадсої ддасаадоїо 420 псосассссд дсаїсадсад саассасадс дасдасіасс ссіасадсід діссцссса 480 сосіассасс ссадсадсда даадіасдад аасассаада ссдсаадда ссаддасддс 540 аадсідсасд ссаассідсі дідсссюіа дасддасаяд асдідссада дддаасссід 600 ссідасаадс ададсассда ддаадссаїс адасідсща аааадаюдаа дассадсдсс 660 адсссснсі Іссідссої дддсіассас аадссссаса Іісссшсад аїассссааа 720 дадійссада адсщіассс ссіддаааас аїсасссідд сссссдассс ссасаїдсса 780 дансісідс сссссдідас сіасаасссс їддадчааїйа Іссдсдадсоу сдадаасою 840 саддсісюда асаїсадсодї дсссіасдас ссіаїссссу аддасійсса дадааадаїс 900 адасададсі асісодссад саїщдіссіас сіддасассс ааддддаса саїдсідадс 960 дсссіддасяо аїсідадасі ддсссасаас ассаїсацу ссіїсассад сдассасддс 1020 тдаосісідд дададсасда сдадіддоасс аадіасадса аснисдасої ддссассада 1080 дюссссда дсідіасодї дсссддсада ассдссссіс Ідссідссдс ддасадаад 1140 сідноссії ассдаддассс сисдасссс дссадсодаїї ддаддасодс сддсадасас 1200 ассдаддасс ддодаасі ддщісссід Носссассс Іддссоддасі ддсіддасід 1260 ссідідсссс ссадащдссс саїсссіадс йссасаїса аасідідсад ададддссад 1320 аассідсада аасаїсідса дсідсасдас сіддаададо аасссдассі дісддсаас 1380 сссадададс Ідаїсдссіа садссадіас сссадасссду ссдасіссс ссадіддаас 1440 адсдасаадс ссадссідаа сдасаїсааа ддаїддосі асадсаїсад дассоїддас 1500 їТасадаїаса ссдідіддаї сддайсдас сссадсдацді Іссіддссаа сісадсдас 1560 аїссасоассд дсдадсщіа спсоюдас адсдассссс ідсаддасса саасдідіас 1620 аасдасадсс адсасдасо99 ссідсідсас адссідадас сіда 1665 «2105 12 «2115 7914
Зо «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» рРААМ-бАСі-отір5 «4005 12 сдсуюдсіад сдссассаїд адсссассіс ссссассссс ааїісіддсдо садсідадсі 60 їсадссідсі дсідддсадс псідіаїсу сссюдааад сдссаадсії асссадддса 120 асадсдссас сдасдсссіюд аасаїссідс Ідаїсаїсдї ддасдассід аддсссадсс 180 щадайтсіа сддсдасааяд сіддіссдса дссссаасаї сдассадсід дсісісаса 240 дсоюсіції ссадаасдса нсдсасадс аддссдідід сдсссссадс ададіцісн 300
Іссідассдд садааддссс дасассасса дасідіасда сісаасадс їастасада 360 дсасадсо99д саасіїсадс ассаїссссс адіасінсаа адаааасддс їасдідасса 420 щадсодідодо саадаїіс сассссоддса Ісадсадсаа ссасадсдас дасіассссі 480 асадсіддіс спсссассс Іассасссса дсадсдадаа діасдадаас ассаадассі 540 дсаадддсса ддасддсаад сідсасдсса ассідсідід сссідіддас діддсадаса 600 дссададодо аасссідссі дасаадсада дсассдадда адссаїсада сідсюдааа 660 ададаадас садсдссадс ссспсцсс ддссоідд9 сіассасаад ссссасаїсс 720 сшсадаїа ссссааадад носадаадс ідіасссссі ддаааасайс асссіддссс 780 ссдассссса сдідссадаї ісісідсссс ссдіддссіа саассссюа аддаїгаїсс 840 дсдадсдсда ддасоюсазд дсісідааса ісадсдідсс сіасоддсссі аїссссдада 900 аснссадад ааадаїсада сададсіасі Ісдссадсодї дісстассю дасасссаад 960 щадасасодї дсюадсосс сюдасодаїс дадасюдс ссасаасасс аїсайдссі 1020
Іїсассадсда ссасоадсідо дсістдддад адсасддсда чідддссаад їасадсаасі 1080
Ісдасдіддс сассададід ссссідадс щіасодідсс сддсадаасс дссссісідс 1140 сідссдсіда асадаадсід нНосснасс дддассссії сдассссдсс адсачайода 1200 тддасдссо99 садасасасс даддассідо ддаасюаді дісссідс сссасссюад 1260 ссддасідас ддасідссі дідсссссса даїдссссаї сссіадснс сасадїсдаас 1320
Ідідсадада ддассадаас сідсадааас аісюсадсі дсасдассід даададдаас 1380 ссдассідії сддсаасссс адададсюа ісоссіасад ссадіасссс адасссдссяо 1440 аснссссса дддаасадс дасаадссса дссдаасода саїсааадід аїдддсіаса 1500 60 дсаїсаддас сдіддасіас адаїасассод юддаїсда айсдасссс адсдадійсс 1560 дассаасії садсдасаїс сасдссддса адсідіасії сдіддасадс дасссссідс 1620 аддассасаа судідіасаас дасадссадс асдасодссі дсідсасадс сідадасси 1680 дадсдассдс даансдадс іІсдаїасссд ддааїсааїй сасіссісад дідсадосід 1740 ссіаїісадаа ддащюдоасі ддадодсса адсссіддс іІсасаааїас сасідадаїс 1800 пШшсссіс дссаааааї іаддддаса іІсадаадсс ссндадсаї сідасноїд 1860 дсіааїааад дааашай нсандсаа іадічіано даашноя ідісісісас 1920 ісддааддас агадддадао дсаааїсаї! Іаааасаїса даадацдіаї Ппддашада 1980 дшддсаас агадсссаї агосіддсід ссадаасаа адднодсіа їааададдіс 2040 аїсадіаїа! дааасадссс ссідсідісс айсснайн ссагадаааа дссипдасії 2100 даданада! ШщШаїа ншнаїщо юнащції нешааса Ісссіааааї 2160 шеснаса щшішасіа дссадації іссіссісіс сдасіасіс ссадісаїад 2220 сідісссісі Ісісцащао адаїсссісд ассідсадсс саадсідіад агіаадіадса 2280 щасоадопйа аїсайнаасі асааддаасс ссіадідаїд даднодсса сісссісісі 2340 дсососісдс Ісдсісасід аддссдсссу ддаешодссс дддсдассіс ааїдадсдад 2400 сдадсоасоса дсідсацйаа юааїсддсс аасдсдсд9дад дчададдсдаї Пасаїтано 2460 доусосісне сосНссісу сісасідасі сдсідсодсіс ддісунсда сюсдосдад 2520 сддіаїсадс іІсасісааад дсоддіааїас дуанаїссас адааісадду даїаасдсад 2580 дааадаасаї дідадсаааа ддссадсааа аддссаддаа ссдіааааад ассосайдс 2640 дасащшії ссагаддсіс сдссссссід асдадсаїса саааааїсда сдсісаадіє 2700 ададдщдосяо ааасссдаса ддасіаіааа даїассаддс дШессссі ддаадсіссс 2760
Ісдідсасіс іссюйеса асссідссос Чассддаїйа ссідіссодсс Шсіссси 2820 сдддаадсодї ддсдсшсі саїадсісас дсідіаддіа ісісаднсд дїаддісод 2880 нсодсіссаа дсіддосіді дідсасдаас сссссунса дсссдассос юсосснаї 2940 ссддіаасіа ісдісндад Іссаасссод9у іІаадасасда снНаїісдсса сюдсадсад 3000 ссасіддіаа саддапнадс ададсдадаї аіаддсда сіасадад Нендааді 3060 дУщоссіаа сіасддсіас асіадаадаа садіацйіода їаісідсосі сідсідаадс 3120 саднассії сддааааада оподіасдсі сідаїсс9д9 сааасааасс ассдсідаїа 3180 асадчаш Іощшос аадсадсада Масдсдсад ааааааадда ісісаадаад 3240 аїссшоаї спнстаса ддаїсідасу сісадіддаа содаааасіса сойааддада 3300
Зо іІшндаїсаї даданаїса аааадодаїсі іІсассіадаї ссішШаааї ї(аааааюдаа 3360 дішаааїс ааісіаааєдії азатаюдадії ааасноддіс Ідасаднас саадснаа 3420 їсадщдадодс ассіаїсіса дсдаїсідіс їашсонс аїссаїадії дссідасісс 3480 ссдісдщіа даїаасіасу аїасдддада осцНассаїс Іддссссаді дсідсааюда 3540 тТассдсдада сссасдсіса ссддсіссад ашаїсадс ааіїадассад ссадссоддаа 3600 ддассдадсд садаацдідаї ссідсаасії їаїссдссіс саїссадісї айаайнон 3660 дссдддаадс їададіааді аднсдссад Нааїадні асосаасоїї днассано 3720 сіасадасаї сдіддідіса содсісдісді Кдоатадас нсансадс Іссдуносс 3780 аасдаїсаад дсдаднаса юаїссссса юнддсаа аааадсодаїй адсіссійсод 3840 діссіссдаї соайдісада адіаадідао ссдсацдіції аїсасісад днаїддсад 3900 сасюдсаїаа йсісйцасі дісаюдссаї ссдіаадат сійнсідіа асіддюдаєді 3960 асісаассаа дісансіюа дааїадшіа дсддсдасс дадносісі дсссдасої 4020 саагасоддда іааіассосо ссасаїадса даасшадаа адідсісаїс айддаааас 4080 днснсоддо дсдаааасіс Ісаадда!цсі їассдсіції дадаїссаді Ісдадіаас 4140 ссасісдідс асссаасіда ісіїсадсаї сішасіїї сассадсай іІсддащда9д 4200 сааааасадд аадосааааї дссдсааааа адддааіаад ддсдасасодд ааанодаа 4260
Тасісаїасі сцссціїї сааїанай даадсаша ісададонаї! щісісаюда 4320 дсоддаїасаї ашодааці ашадаааа агїааасаааї аддадіїссд сдсасаше 4380 сссдааааді дссассюдас дісіаадааа ссацайаї садасайца ассіаіаааа 4440 агаддсдіаї сасдаддссс Шеаісісд сдасдашеда їІдащдасоді даааассісї 4500 дасасаюса дсісссддад асддісасад спдісідіа адсодаїдсс дддадсадас 4560 аадсссдіса дддсдсдіса асадана асадашісод дадсідосії аасіаїсоа 4620 саїсададса дандіасю ададідсасс азагдсдою дааайассяо сасададса 4680 їІааддадааа аїіассдсаїс аддсдансс аасаїссааї аааїісаїаса ддсааддсаа 4740 адаанадса ааанаадса аіааадссіс ададсаїааа дсіаааїсода Поїассааа 4800 аасацаюа сссмдіааїа сішосдда адаадссій ашсаасос ааддатаааа 4860 айкшадаа сссісаїайа ІШааатс аадссідад їааіюоіад аіааадайнс 4920 ааасдддщда даааддсс9до адасадісаа аїсассаїса аїашдагзай саассодйсі 4980 адсщагїааа саїдссду адададіадс таншоад адцоісісіас аааддсіаїс 5040 аддісандс сюадацдісії ддадсаааса ададааїсда Юаасоддіаа іІсдіаааасі 5100 60 адсащдісаа ісаїащдіас сссддйЦоаї ааїсадаааа дссссааааа саддаадаїй 5160
Зб діаїаадсаа аїашаааї щіаадсоїї ааіаїщшої їаааайсдс ойааанші 5220
ІдНааагса дсісацшіїї Іаассааїад дссдаааїсд дсааааїссс Наїааайса 5280 ааадааіада ссдадатадо аідадцоії діссадші ддаасаадад Іссасіаца 5340 аадаасоддд асіссаасої саааддосда аааассдісі аїсадддсда юдсссасіа 5400 сдюаассаї сасссіааїс ааашншо додісдацдаї дссдіааадс асіаааїсдд 5460 аасссіааад ддадсссссд ашададсі дасддоадаа адссддсдаа саїддсдада 5520 ааддаадода адааадсоаа аддадсдадс дсіадддсдс ддсаадоії адсодісасод 5580 сідсдсдіаа ссассасасс соссдсосії ааїдсдссдс їасадддсодс діастааї 5640 тдсшодасо адсасдіаа асаїдсшс сісонадаа ісададс9ду адсіааасад 5700 дадассдаї!ї ааадоддай! їІадасаддаа сддіасосса дааїссідад аадіанні 5760 аїааісадід аддссассда діаааадацді сіціссаїса сдсааайаа ссундісдс 5820 ааїаснсії щайадіаа Іаасаїсасі Ідссідадіа даадаасіса аасіаїсдас 5880 спдсідаїа аїаіссадаа сааїацасс дссадссаїй дсаасддааї сдссайсдс 5940 сайсаддсі дсдсаасіді адаадоддс даїсодідсо ддссіснсд сїіайасодсс 6000 аасідсдсодс іІсдсісдсіс асідадассод сссдддсааа дсссдддсаї садасдассі 6060 пддісдссс доссісадід адсдадсдад сдсдсадада чодадідосс аасіссаїса 6120 сіададайе спдіадна аїданаасс сдссадсіа сНаїсіасі сдасандаї 6180 тайдасіад Нанааїад іааісаацна сддддісай адіїсагадс ссаїаіаао 6240 апйссдсді їасаїаасії асддіаваю дсссоссіду сідассдсосс аасдассссс 6300 дсссайдас адісааїаа!д асаїаднс ссаїгадіаас дссааіадду асшссай 6360 дасдісааїд ддаюдадіаї пасдудіааа сідсссасії ддсадіасаї саадідіаїс 6420 ааїдссаад їасдсссссі андасаїса адасоддіаа аїддсссдсс Іддсанаїд 6480 сссадіасаї дасснащчо дасшссіа спддсадіа саїсіасдіа Падісаїс 6540 сіанассаї ддісдаддід адссссасаї ісіюсйнсас ісіссссаїс Ісссссосссі 6600 ссссассссс аашоіаї йпашан Шаанан наїдсадсо агдадосоо 6660 9999999999 д999с9с9с9 ссадас9999 сдда9с9999 сдадодосо9 д9со9д99сда 6720 додсддададд юсадсодаоса дссааїсада дсддсососі ссдаааднй ссішаїда 6780 сдаддсддса дсдас9ддсода сссіаіаааа адсдаадсдс дсддсдадсо ддавдісдсід 6840 сандссне дссссдідсс ссдсіссдсс десдссісдс дссдсссдсс ссдусісіда 6900
Зо сідассдсді Іасісссаса ддададсодад сдддасддсс сісіссісс дддсщіааї 6960 їадасасндоа Шааюаса дспдшсї шсіщас (дсодідааад ссндадада 7020 сіссддададо дссстоід содадададс досісадово дідсоюсої дідідідює 7080 даюдададсо ссдсдідсда сіссдсосід сссдасодсї ададсосі садасосоддс 7140 дасодаасіїї ддсодсіссо садіаюсос дадддаадса сддссдддда соадідссссо 7200 сдаюсо9о99а9 д999сідсда ддддаасааа досіюдсдідс даавідюю соїюдодо999 7260 адсадчада чічіодасос дісддісдаа сдсаасссс сссідсассс сссіссссда 7320 анасщадс асддсссддс Нсдадідсо додсіссдїа сдддасаіда сдсдддасіс 7380 дссддссоа д9с99999919 дсдосадаю 999919сс99 9с9999с999 дссоссіс99 7440 дссдоддадо осісдддада дддасосоддс дасссссода дсоссдосодо сідісдаддс 7500 дсддсдадсс дсадссайо ссішающа іаагісоюса ададдосдса дддасійссі 7560 пдісссааа ісідідсдда ассдаааїсі дддадасосс дссосасссс сісїіадсдад 7620 сосдддосда адсддідс99 соссддсадо ааддаааюа осодаодадод сснсоюсо 7680
Ісдссдсодсс дссдіссссі Іісісссісіс садссісдду дсідіссоса дадддасдас 7740 тїдсснсдда ддадасдада саддосдада Псоддсісі ддсдаютдас сдоасоддсісі 7800 ададссісід сіаассащі іІсаїдссіс ПсИщшес їасадсіссії дддсаасоїюд 7860 сідданаца дсідісіса ісаїйодс ааадаайцйоа Наансдад сдаа 7914 «210513 «2115 4333 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ААМ9-САСІі-отір5 «4005 13 ацасдссад сідсдсодсіс дсісдсісас даддссосс саддсааадс ссдадсодісо 60 ддсдассійї ддісдсссдо ссісадщад сдадсдадсд сдсадададо дадідассаа 120 сіссаїсасі адддойссі дїаднааї данаасссу ссаюсіасі іаїсіасісд 180 асайдана Подасіадії анаагадіа аїсаацасд додісанаяд їсаїадсссе 240 азаіаюдад йссдсоуна саїааснас ддіаааддс ссдссіддсі дассдсссаа 300 сдасссссдс ссайдасої сааїаашдас діайссс агадіаасдс сааіадддас 360 60 шесанда содісааюда юдадіацй асодіааасі дсссаснодо садіасаїса 420 адюагсаї адссаадіа сдсссссіаї дасадїсааї дасддіаааї ддоссдссід 480 дсанащсс садіасаюа сснащдаода сшссіасі дасадіаса істасаїай 540 адісаїсдсі анпассаща ісдаддщдад ссссасднс ідсіїсасіс іссссаїсіс 600 сссссссісс ссасссссаа Шота ашацй їаайації дсгдсадсодаї 660
З 99999с9999 9999999999 99с9сососс аддасоа99с9 999с9999с9 ададосо999 720 сдддасдадаоа сддададаїд сддсддсадс сааісададс ддсодсодсісс дааадшсс 780 їшШшаюдосо аддсадсдас дасддсдодсс сіаїааааад сдаадсдсдс ддсда9дсо999 840 адісдсідсуд Ндсснсдс сссдідсссс дсіссдссдс сдссісасдс сдессдессс 900 дусістюдасі дассдсопца сісссасада Іадсдоддсо ддасодсссі ісіссіссда 960 дсідіааца дсосндай їааїдасддс Наше ІстущсІя саїдааадсс 1020 поадодосі ссдадададс ссшоюсо д9999а9с99 сісдда9о9і осоюсоюі 1080 аюшосої ддддадсодсс дсдідсддсі ссдсдсідсс сддсдасюі дадсосідса 1140 дасосддсдс ддадсщтої дсосіссдса дідідсосда ддададсосо дссддадоса 1200 дідссссдсо дідс999999 д9сідсдадо ддаасааада сідсоюсоа одідіююсо 1260 щачдчадчоаоід адсаддадаї ададсосої судісдоадсії дсаасссссс сідсассосс 1320 сіссссдаді юсідадсас ддсссддсії сддаїсада осіссдїасо дадсодідосо 1380 сдадасісдс суїдссоддос д99999199с д9садав9во даюссодос д999с9999с 1440 содссісдддс сддададодс ісдддададо д99с9с99с99 сссссддадс дссддсодсі 1500 дісдаддсдс ддсдадссдс адссаносс ІШагодіа аїсаїдсдад аддасодсадао 1560 даснсосійй дісссаааїс ідідсддадс сдааасідд даддсдссдс сдсасссосі 1620 сіздс9дд9со9 сддодасдаад содідсодасо ссддсаддаа ддаааюдос дадаададсс 1680 нсоюсаїс дссосдссас сдіссссне ісссісісса дссісдадас іщдіссос9да 1 740 додасодасід сспсда99а9 д9асоддоса дадсо9оай сдоснсіда сощюассо 1800 дсоддсісіад адссісідсі аассаїдне адсснси сишесіа садсіссюд 1860 дсаасащсї дананоїо сідісісаїс аїшодсаа адааноаїї аансдадсяо 1920 аасосдідсі адсдссасса дадсссасс Ісссссассс ссааїсіддс ддсадсідад 1980 сісадссід сідстддса дснсдаї сдсссіддаа адсдссаадс Носссадад 2040 саасадсодсс ассдасоссс Юдаасаїссі дсідаїсаїс діддасдасс Ідаддсссад 2100 ссідддаїдс їіасддсдаса адсіддіссд садссссаас аісдассадс щдасисіса 2160
Зо садсоаюсід йссадаасу сансдсаса дсаддссодід Ідсдссссса дсададівіс 2220
Шшессідасс дасадааддс ссдасассас садасідіас дасіїсааса дсіасіюддсо 2280 ддюсасадс досаасіса дсассаїссс ссадіасіс ааадаааасяа дсіасдідас 2340 саюадсодю досаадаці іссасссс9д9у саїсадсадс аассасадсд асдасіассс 2400 сіасадсща іссйсссас ссіассассс садсадсдад аадіасдада асассаадас 2460
З5 сідсаадддс саддасддса адсідсасдс саассідсід їдсссідідд асдюддсада 2520 сдідссадад ддаасссідс сідасаадса дадсассдад даадссаїса дасідсідда 2580 ааадаюдаад ассадсдсса дссссйсії ссддссодід досіассаса адссссасаї 2640 сссцсада їассссааад аднссадаа дсідіасссс сіддааааса іІсасссюддс 2700 ссссдасссс сасдідссад айсісідсс ссссдіддсс їасаассссі ддагдаїаї 2760 ссдсдадсоас даддасдщдс адасісідаа саїсадсдід сссіасддсс сіаїссссда 2820 ддаснссад адааадаїса дасададсіа сісодссадс дідіссіасс (ддасассса 2880 адідддасас чідсщадсо сссіддасда Іісщадасід дсссасааса ссаїсайдс 2940 сісассадс дассасдасі ддосісідда ададсасддс дадюддосса адіасадсаа 3000 спсдасаїд дссассадад дссссідаї асідіасоїд сссддсадаа ссоссссісії 3060 дссідссодсі ддасадаадс щднсссна ссдоадасссс йсдасссся ссадсдана 3120 даддасдсс ддсадасаса ссдаддассі ддаддаасія дідісссіді Іссссасссі 3180 ддссоадасід дсіддасідс сідідссссс садаїдсссс аїсссіадсі іссасаїсда 3240 асщідсада дчадддссада ассідсадаа асаїсідсад сідсасдасс ддаададда 3300 асссдассід йсддсаасс ссададасдсі даїсдссіас адссадіасс ссадасссдс 3360 сдасноссс садіддааса дсдасаадсс садссюдаас дасаїсаааяд даюдаосіа 3420 садсаїсадд ассдіддасі асадаїасас сдідідадіє ддайсодасс ссадсдадії 3480 ссіддссаас Нсадсдаса іссасдссду сдадсщіас йсдіддаса дсдасссссі 3540 дсаддассас аасдідіаса асдасадсса дсасоадсддс сідсідсаса дссідадасс 3600 пдаасоддсс дсдаансода дсісодіасс сдддааїсаа їсасіссіс аддідсадас 3660 їдссіаїсад ааддідаща сіддідюос сааїдсссід дсісасаааї ассасідада 3720 їснШшссс ісідссаааа ападаодаоа саїсадааяд ссссндаєдс аїсідасно 3780 дасіааїаа аддаааша шШісанодс ааїадютї ддааннй діоісісіс 3840 асісддаад9у асайаддда ддоасаааїса Шаааасаї садаададі ашдоащша 3900 дадшодса асаїаїдссс азадсіддс дссаюаас ааадунодс їаїааададчо 3960 бо ісаїсадіаї агдааасадс ссссідсіді ссайссйца йссагадаа ааоссіїдас 4020 пдадонад азшшщша тайна (донані шсщшаа саїсссіааа 4080 ашесна сащіщшас їіадссадай Шесіссіс Іссідасіас іІсссадісаї 4140 адсідісссі сісісцаї ддадаїсссі сдассідсад сссаадсідї адагаадчіад 4200 сащдасодаї їааісанаа сіасааддаа ссссіадіда іддаднодас сасісссісі 4260 сідсдсдсіс дсісдсісас щФададссдсс сдддсшодс ссддасодсс ісадідадсо 4320 адсдадсодсд сад 4333 «210» 14 «2115» 646 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» САС промотор «400» 14 асіаднай аагадіааїс аайасо99д9дад ісанадіїс агадсссаїа їаїддадно 60 сдсунасаї аасцасодді аааїддсссд ссіддсідас сдосссаасда сссссдссса 120 пдасдісаа іаадасаоїа йсссаїа діаасдссаа їадддасцй ссайдасаої 180 сааюдаоща адіашасо діааасюсс саснддсад їасаїсааді діагсатат 240 ссаадіасоас ссссіанда сдісааідас одіаааюддс ссдссіддса Наїдсссад 300 їТасаюассі іаїдддасиї їіссїіасідо садіасаїсі асоїацаді саїсосіайї 360 ассаюдісу адаїдадссс сасодйсідс Нсасісісс ссаїсісссс ссоссісссса 420 сссссааш шіашайн таншаа нпашоіа садсдадсаа чдосдадоадаа 480 999999999с дсососсадо сдд999с9999 сдд999сдада д9с9999с99 д9сдадасо9 540 ададдаюсод сддсадссаа іІісададсддс асасіссдаа адшссш їаїддсдада 600 сдасддсддс ддсддсссіа Іааааадсда адсдсдсоддс дадсда 646 «210515 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220»
Зо «223» Прямий праймер «4005 15
ІШощіас іссаасссся 20 «210516 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Зворотний праймер «4005 16 дісюсаїа асадсссада 20 «210517 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Мутація зворотного праймера «4005 17 дсссісасаї дссааадда 20
Claims (12)
1. Ізольована нуклеотидна послідовність, що кодує білок ідуронат-2-сульфатазу (105) відповідно до ЗЕО ІО МО:1, яка відрізняється тим, що зазначену нуклеотидну послідовність вибирають з ЗЕО ІЮ МО:5 і БЕО ІЮ МО:8.
2. Плазміда, що містить нуклеотидну послідовність за п. 1.
3. Плазміда за п. 2, що являє собою рААМ-САс-опІО5-варіант 1 з номером доступу ОБМ 29867, відповідно до 5ЕО ІЮ МО:6.
4. Плазміда за п. 2, що являє собою рдАМ-САс-опІр5-варіант 2 з номером доступу ОЗМ 29868, відповідно до 5ЕО ІЮ МО:9.
5. Рекомбінантний аденоасоційований вектор серотипу 9, ААМО9-вектор, що містить нуклеотидну послідовність за п. 1.
6. Рекомбінантний вектор за п. 5, що являє собою ААМУ-САСІ-оОпПІЮО5-варіант 1, що містить нуклеотидну послідовність 5Е0 ІЮ МО:5, зв'язану з САС-промотором 5ЕО ІЮ МО:14.
7. Рекомбінантний вектор за п. 5, що являє собою ДАМУ9-САС-опПІО5-варіант 2, що містить нуклеотидну послідовність 5Е0 ІЮ МО:8, зв'язану з САС-промотором 5ЕО ІЮ МО:14.
8. Фармацевтична композиція, що містить терапевтично ефективну кількість нуклеотидної послідовності за п. 1, плазміду за будь-яким з пп. 2-4 або рекомбінантний вектор будь-яким з пп. 5-7, для підвищення активності ідуронат-2-сульфатази.
9. Застосування нуклеотидної послідовності за п. 1, плазміди за будь-яким з пп. 2-4 або рекомбінантного вектора за будь-яким з пп. 5-7 для виготовлення медикаменту для лікування мукополісахаридозу типу ІІ.
10. Спосіб одержання векторів, визначених у будь-якому з пп. 5-7, що включає стадії: ї забезпечення першого вектора, який містить послідовність, яка кодує потрібний білок, розташований між першим кінцевим повтором ААМ та другим кінцевим повтором ААМ, промотор САС, операбельно зв'язаний з послідовністю, що кодує потрібний білок; другий вектор, який включає ген ААМ гер та ген ААМ сар, та третій вектор, який включає аденовірусний ген з хелперною функцією; ії) котрансфекцію компетентних клітин векторами із стадії і); ії) культивування трансфікованих клітин із стадії ії); та їм) очищення векторів експресії від культури зі стадії її).
11. Спосіб одержання плазміди за будь-яким з пп. 2-4, що включає стадії: ї) вирізання послідовності, яка кодує потрібний білок, з початкової плазміди шляхом розщеплення, зокрема, із застосуванням МіІшІ/ЕсоКІ, ії) клонування послідовності, яка кодує потрібний білок, між двома сайтами рестрикції скелетної плазміди ААМ рААМ-САС, з одержанням, таким чином, відповідної плазміди, яка включає послідовність, яка кодує потрібний білок.
12. Ізольована клітина, що містить нуклеотидну послідовність за п. 1. Людська г сс і М
ЕЕ. . ; о ОЗ ваду сАВНОВ |. ТО БО що Бім оо ай що ши А ЕЕ вер ще Я
Опунмізована пюдська Паб воре В що ех Ох ж ч й кох КК ЖЕ Ж тв , ши о КО я ОЙ З ШИ : н-
дв. А й Т Рей Фк Ск нвованя пюдевка НВК реи
ЕЕ. Я з і . я ТВ во с і вад оваонивно Я Ж є о У :Щ ц ЕЕ о г. ді
Сатимізована меча З й бї її з вАУ СА с о. ! тя ее 0 сх ЗК Зх є х ох КО вс ж -- С о КВ с Кая М он й З 3 ву А Фея гідводинаюмічне вивільнення ВАДУ САС, ВАДУ САС ОНОВ-ВааНІ і ВАМ САВАН. варійнт» у ЗДОБОВИХ МИЩейЙ лечінкх сироватку ТУ Ж. км БО | я, ни С КО Ех і КД 5 і у МІ Фр МТ еааюсвачнов. ГУ Е т З. ЖК о ВЖУЖОІ 000яеях о її й Е иа ЩЕ бос о жо ня а Бонн 5 БИ
Янг. 5
Грудна ВИРІ ЬКиММа РОДУ КАТ НК ВАДУ «НО Ват БАЛУ М ОПН Ван У ММЗ миши т -т х ух Й З одех з манея В кмцмюха Я ВРжь сю У вренораву миня - хЖ ДІ з сеейкунннкю - : меж я З рення М ЩЕ ев рАКЕ ме ї УК ойох дк | УЖ. см М я ї о по. ренні ту ривок
З. і о х ща ни Не з ЕХ ЕЕ до 1 х уки хі ря що я У і КОСОВІ х ще СТАВИ Хна ОО ЩО х КК хх ФОІИМ о УК ОиВНОВ х ТІ я Н МОВ в ГУ ОО ф х і Ор Нв х Ко: М Х, у зум су ря вві 5 АВ ШИ ВІ, і ОО ОБО НЯ ОН ни сс Ір Аоееюююююи я июня зу мохом. Мхохмеха соком мен Аня СУ сення м зн Вів за меча зву 00 х Н ДАХККХХ. хі З «4 т аа х ва х ; оз Ж ПИ Е ща ци що з | Б х Я СЕ Зк що їі сЗ 53 що з Ві. х
Х. ще - ПИЙ ву ка х й и щх КК з: ОКУ ж х М Я «ЯКУ КО КО 2 х ЩІ я КАК тура Те КО я 4 бообоо КК м в ЗОВ я ай Зо ВОВК пекан хо ке вк пев м се ВЕ З я ни ЕЙ з СУ ЗВ ож поннкдкнння Х іх й «кі 5 Е я -ї 155 х ОХ х ох Ж ж КК ККюю хв ПК ЖК ОК що МОЗ 1 ВО, 5 1 нн ; ШЕ Е ВА КК ВН зх Е ОКА 5 МК ТЗ ВУ ї ВОМ У БУК ЕЕ ух ЖК одоожннн ВККС нх її Ак ВК Мя
ЩЕ.
Інтравхюютциме вивільнення АВУВБОЛОНОМ, ААХВАВ» са варіан і ААУ КАС еананує У МЕ мншай й Печака в Скровинна Й Но Б ско «вим а пеня -к- себя ВЕК ААЖІ С.
ВК кккнкжкккх Ш х КЗ ЗОВ 4 | шо МЕ ОМВО КХ її Е х з ЗВ векцкі Б ВВ В ДОЯТТЯ СТВА. ре за у З г І. жк ЗЕ.
Зеров й Оосм Кос х ї; Ух во ря кі Ж зда МАХ Я ЖК МР хм а: т ЗАМ А КІ Ку м х ТУ ях ду м ХХ «щі ж жк ж З Жах хх х М ооо ГІ "я КЗ ЗК в ше Р Б Ка рю ІК Ь ак дор х.
ХУ ую Я я Оле тк 5 : ЗЕ їу хх БО Ех Ж ще У г по хх З що фе ик и КК І кю ХККККХ ож и В кн о КККлАКИА В кю В б З Ем Печінка их за пен нан» х осо я Х 5 ях Мох ЕН к УЮ Х З 5 КК ВО ВО х ОККО В В ОКУ Я У Фіт
Інтра-цев ве «ЦЕ внодяле ДАУаО в оВійб-варіанті і крук фено моні А «ОУН кнцузівнх МЕРІ Й МРЕВ вид, шШниви ИекВазєачОв М ервудахесло мов, кю МК ень шо ВОИ НИМ х БОКАХ ! ВАДА ОВ М: парох ЕН їй і Й Бе і . й ЗВ» пк Жункь ТУ У ех ї Я КЗ Н Н : з 25 ЖК і з : Н х з Н ( Й :
є. | : | !
В. ! і | Ї -- х, ї у х - З де « Н Н Н ЕЗ з ззхх | : Н ї ч55 зош о. і : КЗ У СК? «М з і І спчнннк Я п З МЕ « Н хожх і пікклтжжнн ре Яр З : жк і хх; Н РН Н - х Я ВЕ І ДОБА см. Н ів. Сх ті У: ж. я КІ ЗШ ШК НН ЗИ ж КА З щиті м Н г за С ; ва Ж. «щі ГТ ще КО А 3 : а53- йти ве 5 | де НК. | де докт СЕ А ЗИ 3 ої Н ВУ а с ВА о І ШЕ В ясен ЩІ ОНИ З
В М. ї ХК С йо їй. с КВКВ я -ВКЕК.. кв і ШЕ ; сла КК, сотню З ї сжь шЖ еВ Я ї Кежу Н «КК. . Я кош ше ши ШЕ сеейю у і 5 і а И ва Н вач ій Й : С : ВЕ - В ії В : вію ї я НИ : ВВ ВЗ : х ОКУ В : ВХ з ПК і 0 і і В щі. і зання зов Б» З т В ше ее Н ОБ: з ОБ і ОПОВ І ПЕК Я х І ВІ «г і о Еш АК я 1
5. В : 5 РЕВЕ І их у ВОЗ Ба І ОО иемчмЕ 5 е чи і й ше С с ХО в КВ Її а НО МВ ув і В Я ї 5-5 Ок - в сх я В МКК КО В В ВЕК г 3 ВИ М - 05 ЕН. ОН со БІ ВХ лож 4 КВН ї КОКО КК Ка ВН ЕК в 0 БІ І БОБ. ен В о Кт | пе СНИ і: ВЗА І ОВО Н і ПК ШО ВН КК ВО ЕК ВН ПО в т І а 5 еВ ОКО МУ: ХА ЕН ШУ ПИ х ПВ ДО кіно ВОВКА ВО ООН ї ПООВК З В М ни МО нн ОКХ РІО ВЕК У ОО ххх АК як фі. 8 Й інфе ваздизи ВАМВАСАСНІВ ВАМ АЄ. ож еацівниі РАДУ а ввріаноя МИ . з А Печінки в Широваку хо ЕЩОЄЯ Зщов с Кун шк ! | ше ск ГА Є дю Н Ка Вей Бек - в Ей Н : яви ху Ж ОУН Ба ї : ВВ НИ Кат БИ КОХ В КЗ і і нов о Бо КОНЯ зе сх Била Ех ЇЗ що Ж Я КО 0 ДІМ РВАДУВСАЄ г й ж га і ща «ВНУ денасіну Е КЕР І ТЯ 0 ДЕ ААЛУВУЯС. 3 ККУ і Н БОМ РАКУ ВЕК в ще ОКОМ в Б. БК, МОЯ ча ес і КЕ і т що КОС Я КО 3 АК У МОЯ До СА се ; паці Пачізкаи Бере Дона йсзка 5 х совки я чех 4 Ж да хі хКжх «ЩЕ КВ КЕ 155 яса Же 5 | ко мой Я ї од хі Се з : і чих Хай Ух . В ож а В кт що ще Я хі я ШЕ я В о. ЩЕ Ще В і В ЩА В я ОО щЯ і Ве в" о ві зі В ї ше о ЩІ 5 Кк т ВЖК І ХВ 8401 ВБИКЯ З Ії ж ї ВЕ з В й2 5 ВА У ж : Її 58 | ще о з КВ ам в МАМ З АВК 5 АВТ Кавселіюки» х Нирка пезовний міхув Жирова гканкна и Я 5.5 Й ка фОо-- 33 в шо ГЕ ее «А 00- : Ух КЕ З хе 7 зв ле : ей а х х 35 ! ре Як ЖК 4 Н ж Зоя Н я заз. В о. щей ШЕ МІЯ я 00 ї Б, т КУ з ОВК 51 В 5 В і ЩО в В Хвлхі 5 ак ге ОВ ат В МЕ З Ах мі ВЗ ОО т. ОВ Ва «ВІ 5 ЗОВ се з ОВК а ОЗ КА ВЕ ке. АЗВВОМСЯ рік, В інтра еВ «сптвмівнвана мищача ЩА А і В ІВ НУ М 3 Е Е і ! п'ят : і і 1 4 м йЕОж і ух зи і ге ке в ме : р І і ВО мМоьний що ! Я і Е Е Е ДУ мевААуВ. 2 Ї Н і ; ен іш ! | нших Ха й і : ! : і З і я х як ї ті БИ ех ше Е нн ш пиши шишеши шен шин ШЕЩ М Б за з : і і і і і Й Н з 3 і і Е хх : ях ї . У Є ії
С о. 1 ще і і ів . Н З і і ; хі о її Ві й. і і жо Р ВЧ 1 ВО Зі ВУ 1 Кон 1 1 ВЕК 5 і с. ЗІ о. : о. З Н же су с. ще 5 ях 1 ЗХ Н МЖК 1 я х ПКОАЖЮ о ! | ! | 1 а 3 й. щ й й о ЗІ. Фа МИЕМЦКЕ є «аптикерма миккача ВІХ А Мобсве кора бМеовниз кОм 00 гкдцкична хада Гіди» шен мова 255 3 5 Ж ха ок з ех ; | ії кв Ж і Е Н зл 4 їі мі м і | Е ! З БАК «хе РАК Року і СКУ Ж а АХ нею в МА зе в БЖ - З ша ВО АВ ут щу щковем КУ ККУ о дув З КЕ Вінки КІМ КІ Я ХКОКХ В за. І Ки КкаВ Н й ЩЕ ОВ А Ве КУ І ОК А щі Б ех 5 ше шиш ше ше ши ше ШЕ В ши ши ши ше шИшШше І Ех «МВ В і щ. ЩЕ Я Я БОНН о вай; о МОБВяжЖ дама дива НКХВ ще вера ОВ з вдтикзевана мишача МІЯ (довгострокова дов да пк вна бор Меню Єрохави Зеавчуж обома кова ЗА МВ БУХ: Порнличня кора Зоасча 05 я 5 |: 955 ма . 85- А 384 па за і 54 В 83 й 4 534 08 : З аж ас а зів за я я . сш, ЗК | 333 і х ща - щі ж 4 . й й с ця М и и В ЕЕ : а СО фнюня Оройче З й ХОМюсннян Р 0 щу меце- Кия ЩОМРОІ - ду чаОя вн. інве цО «сити кізована медика УЗ Побоза кора Тім'яна кора боемошена хори 00 бвихия коициупа Таинакує г ві Ки З Шк: За 1 ха І Й за і хв. кв за її ва т 5 | 29 | З і й З КОШЕНЯ ще Н КУН за їх : Н Н ЕХ вві зх як зе ва ях в Стх у К Я Як ї Що; ях КУ з ж кКркаах «КК ежки | ще х ях х Й й ко Кен ро Ян хо Фр б Зоя НІ ххх й ех ГЗ ят Бр мее я 0 КУ Ве8В- - аАКВаиЮВ В І лобова кора Чів'яза коре Потинична сора Яерхни КОЛІЗКУМЕ 0 Тидамув
ЯЗ. ді дя В. 4д ву ЯЗ І ря І за й 53 З х Ж ол я ї ва ща за | : тя їв 34 т за з ща ох Е : ТОК хи у ке | ІЗ тих | -х хе Ре жужх «З Аня З 3 ше ЯК ОКя - й то 8 ХЗ.
Фу. 3 зи ун Цей гууламенвана мені ЗО ідвогостроктвх АХ Педкиза кора Зім'юнау кова ПотТиличнаУ ра 0 дорхвя коляжула Жайзмує
, а. 585 Кк зд Зах гЯ : Р. 1 і 5 ї Н ЩЕ ж 8 за х зжі | З . я В КООКЕ і. Б аз В Бо Я сани вх ол ах с са . й КК: ге Км Ще ОКХ З КО З Мокін ві Ба З дк орех я бе. СР Щ вив - мг М мех я ААУВотТюх в Лобова кора Чре'яма доня уканночна хор Керхна копишуля Твязихе га Ба З 25 | 8 з за З Кз я КУ і ї Н Б Е 2 і Н ії де ее шен шу шия де Її г о 5 о: Горе Е ВК Бе нен ши ши НЕ 5 З Хо нюннн З фол 8 бонннйомня З флейти Є фею зв. 4
З тре м сви міо мишка НО в В безінях й сирозиатях ян хх тю ріж Х щи | ж вові ше вн -- 5 во Е ВО бееееькні хіба с Б Мю с ЩО вводах, х Те КУ Я КК «нок ГБ Б . СО Ех КЗ с Печінка Бе Твжи»ма Якчха мк НИ ! Ж за за х т Н ж ч Н Її зх нн ча З КУ В КІ ху ши ши шими що щшш шк о НИ 5 х З У З шк з аа о. сі | ва "| я Г х З ШЕ ОККО ї В 1 ВОВК ех ий жшшее ше й Свисвінка Мидка Сечовий міхує Жирова уконима ДЕ За 3 зах ча . її : ка 3. ве Її і я да в вся шо я о. | . З ВВ АВ Я х -1 В
Зо . | хв В хв 5 мВ о. сх в . ях о що о ях : х 5 Ша В го а г ОО з МОВІ ин. 35 інтра «опти ин мова А Петеня В Серце БУ мк ох С Уєт І ! хх ві В меав добу Е і БІ МЕеЕНиЙй їх БО сі Ж і СЕ вень з вв Е ва | | АДУВ она х ву а 5. - і й й і ша ее і р и Кк не її ГЕНИ МО Деоторний момер лансе ву анодних 185лМ гл Несчкщеннх АЖМУКВЕ: хохумния МЕЩИ Тюзкия ВЕ си Зах бле ВН за злам Жтет БОЖЕ ойож ВООЗ похо ВЮОЖ 2005 0 смее вою зи. їв інтра ЦИР я епкимізонана мициеа а А є гЗУ зв ФШирхезтка х Дачна вит ! й що зх зе км звізи ві я Вовна 5" Ей ЕЙ ОКО В КІ МР є З В х ВОК де к БОПКНКя у о о. КО МОЗ АДУв он БоОї5а о З а реко 5 с ВИЙ х В що х М ї Ж вк ї 5 п ї КСВ КО те ШЕ нс с їх вх АВМ а я пШишн- в 5 зх Пісосомна аиуканість й печінці Б ! З . й я ЕВ х КІ зах З ОВ МОН ПК о. З се» 5 ве В х. СО, мк З що ВУ я я ех як . й ЕН с. хкх є в з Я вет екв «ВЕЖ еко 5 ВХ за тв ї |і | її |і | З | і- І. :
в. о ч В. і» й 5 як В ще, ок ЗИ Мамі наЗМАТ засне ЗМ НЕХИ яка ів це я зрткмізовама мунача У ДрятТ мив БЕМеЯВЕ МР ААУВЧиВНІЯ д час цевхні в ик в периферії гам вхід жнив Ж їй 5 5 ! БТ. Кк Ж зах ї ІЗ ї аж | і | Ес: лЕ М о: яд. | . У 523 | . кое; . ява і. сх З я З а 54 ВХ хе о Міахентність еентву Є дкеклоний вух КЕ Дін перетинається
Я. що т з я Ше їх х а й
Зо. | Ж а 4 «їз х і х х й З КОТ, ЕВ 7 З ія
- З. з. Ж рі що. щ ц ; зо її. їх сс ЗА З х 5 ! КЗ її о. ї х і о а т за Є а ОО Х За КЗ я о. 35 В ж ті В о о НЕ а ін Вся в 54 Що. щ а іш о о Щщ ЗЕ сь 3. ко вата: сж в оя інтра-НСВ « вптимізованя мишача У Виживання Яд еннтктутр Макух м ме Ах Ал ОКА ЛА ТА Й Уфди 3 зе Я -- з. й ж ку ня У зе ДК ЯН х ї Ме й й ов кл КУ щі х сек ВАВ ЗНАВЦІ В В З озон хі у пеки Н зе: ДОВ ВВ КаАУ ВВ Ж Ке 5 хЕ ї ж ГУ ск ї ЕЗ й френч ючанчнкючю юю росккюккююеттт ки: зав нннннан 0 чо В; зо Вік варяч чна зр о пп нанаяня миші ча ВУ доза. ВНД Ср КУ ВЕ ААх они. КІ МЕЗО Ада ТЕЗАХ мех З ПВЕК де мя щЕмиві ДЕ Нева вини їО здесь ое Мн едткихиЇ іх у мем у й і В ЕН І У ЗЯИ з і ; : , І і ї 11 І Зх ЯН Ре НЕ іа ш Н Н ті ТІ їі З: і її | Гі З ї її трі гі а : ї їй і х 2 1 ИН Рі х Її Рі ІІ ЕЕ І Хв і ті НЕ Що Н ІЗ хі її рі хк 11 ІЗ ще Х ' ті хі Р 3531 що : хе її ЗІ і З с; Ко зв КЕ ШК ищнш. КІ 1 111 ЗЕ З РЕ ау З змі: кі м. МЕЖ що Ре ка Я Р ОБ І Я іі . Ї кН РІ ВЕ шк КО. НЕ о і ЗОВ. Ж ЗИ ЗОН УВЕНИМИ ї ОККО пе ден АКА ККУ 3 ше: ШИ. ЖЕ ЗВ ХК Н КО ЕН І в сесо ВК нняя Н чи ВА жк жу зак Ооояевдвмня З ПП ії жк НИ У З їх і 154 є о Н ак ро їн Ву "7 В То Ко -ооум і КЗ х амі ях Н Ж ї З ї Й ї пом ХЕ яку х ях і КЗ х ВУ : яку Е | Й з 8 її В. її : . Х ча ВМ Н В Ше В ха ОВ М Вк ма УВК Н ПИКВ Я ЕВ з «В ЗБ ВВА З вх в ши е А ни її ВІ ; ь ПВХ ОК КК ОКО еВ ЖИ У З | БІ КЕ Б ЗОНІ с. іх СУ щ ЕВ ПЕВ і ППоМКВ У ВИК І 2 ЕН ХХ Зо с т У Ж ПО Х ї 5 З. Ки т в о РІ їі БОКУ 1 о. НЕШЕ . х НК ЕМ ЕЕ ВЕН І ВК ще о | о. : ЕН С і КВ і КВК ВЕК ПВ ОВ ВЕ ОВУ ші Но і ЕЕ В Тр І ВЕЧЕОБЮ я ПВ Я ОКУ, БІО І ВВ РІ ОВО З «Зцехи
Верецює - опувмізонана мунияача з дода «Відпотдіх А в й ід я обо 4 Гемікта жив. Єкроватка КАК т і М з ПУ Медок Ж я хожх ГУ Н (АВК Охох «ку Є Е хіх в ї500 щу МеЗВвАьанВ Ї БІ 1 хек ГО г Под ех у п. Я 5 зо. Торо БЕ МевеАуюннюх НИ Б. З о ГББВУ НК же і х жо | Я ві ЕВ ВМБаАЄЛнНОВ хх У т ВИЙ Ух ікла му у в: 03 ха п ї | т Б Н ОО лок ве, У сово УКАКККК и й КК деоюнмини и КОХ лх Мемінку парце їнчения Вечка КК ї я А й 355 З і о як а хтеві ж зві ЩЕ 55 ВЗ ме ША КЕ що 1 З, МК ТК Е щЗ ОВ З іжхх ва ДІ 884 ВХ, ав Вінер 0 Ву, я й ру що Ні зжі ВЗ А Б п. ОДВоЗ ВЕ 5 о ІЇ . . 5 о ез І. У КВ ПИ ПІК КИ ПОВИ ще й ж ЗВ: й І В щу еще що ЗОВ 5 МБО хз фуелиацекх Марху Сжчоавня мідур Жирова кана. о Ж а Ще з це х ши кі х В | - Зі зв зві ВУ. зі Вк а х що Н ПВ Ж ек 3 С с я КК М ПЕВ ЗА КІ ек 85 Як ї з за 1 В ій вжх 355 8 З : «З Ж БЕ ОБО МЕояевх ВАЗ ВУ 8 ГЕ Се хв ВОМ а Ве пе а Б оркеях РО а, ШЕ ВН ДКС і ВИК ВЕУ З -Х КІН ВУ и й ще ТВ КЕНЕ щ й ії ще КО З В ІВ КК
«і. 3
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15382297.8A EP3101125A1 (en) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses |
| PCT/EP2016/062655 WO2016193431A1 (en) | 2015-06-05 | 2016-06-03 | Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA125373C2 true UA125373C2 (uk) | 2022-03-02 |
Family
ID=53398018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201711584A UA125373C2 (uk) | 2015-06-05 | 2016-06-03 | Вектор аденоасоційованого вірусу для лікування мукополісахаридозів |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10617771B2 (uk) |
| EP (2) | EP3101125A1 (uk) |
| JP (1) | JP6850736B2 (uk) |
| KR (1) | KR102609858B1 (uk) |
| CN (1) | CN108138154B (uk) |
| AU (1) | AU2016273343B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017025892A2 (uk) |
| CA (1) | CA2988201C (uk) |
| CL (1) | CL2017003096A1 (uk) |
| CO (1) | CO2017012562A2 (uk) |
| ES (1) | ES2790834T3 (uk) |
| IL (1) | IL255939B (uk) |
| MX (1) | MX2017015725A (uk) |
| MY (1) | MY184586A (uk) |
| PH (1) | PH12017502192A1 (uk) |
| PT (1) | PT3303576T (uk) |
| RU (1) | RU2744593C2 (uk) |
| TN (1) | TN2017000506A1 (uk) |
| UA (1) | UA125373C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016193431A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201708039B (uk) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2805170C (en) | 2010-07-12 | 2021-09-21 | Fatima Bosch Tubert | Gene therapy composition for use in diabetes treatment |
| EP2692868A1 (en) | 2012-08-02 | 2014-02-05 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue |
| WO2016041588A1 (en) | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases |
| CA2969599A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Universitat Autonoma De Barcelona | Viral vectors for the treatment of diabetes |
| WO2016110518A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-14 | Universitat Autònoma De Barcelona | Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes |
| BR112018071156A2 (pt) | 2016-04-15 | 2019-03-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | terapia de gene para tratar mucopolissacaridose tipo ii |
| IL307936A (en) | 2017-04-14 | 2023-12-01 | Regenxbio Inc | Treatment for mucopolysaccharidosis 2 with the help of recombinant human iduronate-2 suplatase (ids) produced by human neuron or glial cells |
| EP3684938A1 (en) * | 2017-09-22 | 2020-07-29 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii |
| CN108715867A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-10-30 | 深圳市免疫基因治疗研究院 | 一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 |
| CN108795985A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-13 | 深圳市免疫基因治疗研究院 | 一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 |
| WO2020023857A1 (en) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | Regenxbio Inc. | Treatment of mucopolysaccharidosis iva |
| EP3880810A1 (en) * | 2018-11-15 | 2021-09-22 | Esteve Pharmaceuticals, S.A. | Animal model of mucopolysaccharidoses type iva |
| TW202039856A (zh) * | 2019-03-28 | 2020-11-01 | 西班牙商艾斯提夫製藥股份有限公司 | 製造重組病毒載體之方法 |
| IL293684A (en) * | 2019-12-10 | 2022-08-01 | Takeda Pharmaceuticals Co | Adeno-related virus vectors for the treatment of Hunter disease |
| EP4132562A4 (en) * | 2020-04-06 | 2024-04-17 | Homology Medicines, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR IDS GENE TRANSFER AND METHODS OF USE THEREOF |
| CN111718947B (zh) * | 2020-06-18 | 2022-08-23 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于治疗ⅲa或ⅲb型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途 |
| CN114480454B (zh) * | 2020-10-27 | 2024-03-29 | 华东理工大学 | 用于治疗粘多糖贮积症ⅱ型的腺相关病毒载体、药物及其应用 |
| CA3209611A1 (en) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | Regenxbio Inc. | Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids) |
| WO2022221421A2 (en) * | 2021-04-13 | 2022-10-20 | Capsida, Inc. | Aav compositions with high brain expression for treating mucopolysaccharidosis ii |
| CN118019768A (zh) * | 2021-08-18 | 2024-05-10 | 吉尼瑞姆股份公司 | 治疗酶的靶向递送 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100762945B1 (ko) * | 2004-09-08 | 2007-10-04 | 진동규 | 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주 |
| CA2711590C (en) * | 2008-01-18 | 2021-03-23 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof |
| HUE044865T2 (hu) * | 2009-10-09 | 2019-11-28 | Armagen Inc | Eljárások és készítmények a központi idegrendszerben iduronát-2-szulfatáz-aktivitás növelésére |
| WO2011108451A1 (ja) * | 2010-03-01 | 2011-09-09 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法 |
| EP2394667A1 (en) * | 2010-06-10 | 2011-12-14 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Vectors and sequences for the treatment of diseases |
| KR101535791B1 (ko) * | 2010-11-12 | 2015-07-10 | 주식회사 녹십자 | 개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도 |
| WO2012101671A1 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase |
| EP3460064B8 (en) * | 2011-04-03 | 2024-03-20 | The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital | Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna) |
| CN104411338A (zh) * | 2012-04-02 | 2015-03-11 | 现代治疗公司 | 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸 |
| US9150841B2 (en) * | 2012-06-29 | 2015-10-06 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase |
| WO2015126729A1 (en) * | 2014-02-19 | 2015-08-27 | Bioasis Technologies, Inc. | P97-ids fusion proteins |
-
2015
- 2015-06-05 EP EP15382297.8A patent/EP3101125A1/en not_active Withdrawn
-
2016
- 2016-06-03 CN CN201680032931.7A patent/CN108138154B/zh active Active
- 2016-06-03 BR BR112017025892-7A patent/BR112017025892A2/pt active IP Right Grant
- 2016-06-03 US US15/578,366 patent/US10617771B2/en active Active
- 2016-06-03 WO PCT/EP2016/062655 patent/WO2016193431A1/en active Application Filing
- 2016-06-03 RU RU2017142006A patent/RU2744593C2/ru active
- 2016-06-03 ES ES16730716T patent/ES2790834T3/es active Active
- 2016-06-03 KR KR1020187000048A patent/KR102609858B1/ko active IP Right Grant
- 2016-06-03 AU AU2016273343A patent/AU2016273343B2/en active Active
- 2016-06-03 JP JP2017563119A patent/JP6850736B2/ja active Active
- 2016-06-03 PT PT167307164T patent/PT3303576T/pt unknown
- 2016-06-03 MY MYPI2017704615A patent/MY184586A/en unknown
- 2016-06-03 TN TNP/2017/000506A patent/TN2017000506A1/en unknown
- 2016-06-03 EP EP16730716.4A patent/EP3303576B1/en active Active
- 2016-06-03 CA CA2988201A patent/CA2988201C/en active Active
- 2016-06-03 MX MX2017015725A patent/MX2017015725A/es unknown
- 2016-06-03 UA UAA201711584A patent/UA125373C2/uk unknown
-
2017
- 2017-11-27 IL IL255939A patent/IL255939B/en active IP Right Grant
- 2017-11-27 ZA ZA2017/08039A patent/ZA201708039B/en unknown
- 2017-12-01 PH PH12017502192A patent/PH12017502192A1/en unknown
- 2017-12-04 CL CL2017003096A patent/CL2017003096A1/es unknown
- 2017-12-05 CO CONC2017/0012562A patent/CO2017012562A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180012843A (ko) | 2018-02-06 |
| TN2017000506A1 (en) | 2019-04-12 |
| IL255939A (en) | 2018-01-31 |
| JP6850736B2 (ja) | 2021-03-31 |
| CN108138154A (zh) | 2018-06-08 |
| EP3101125A1 (en) | 2016-12-07 |
| MY184586A (en) | 2021-04-06 |
| AU2016273343A1 (en) | 2017-12-21 |
| ZA201708039B (en) | 2018-11-28 |
| CO2017012562A2 (es) | 2018-02-28 |
| CA2988201A1 (en) | 2016-12-08 |
| EP3303576A1 (en) | 2018-04-11 |
| JP2018517414A (ja) | 2018-07-05 |
| RU2744593C2 (ru) | 2021-03-11 |
| CA2988201C (en) | 2024-01-16 |
| RU2017142006A3 (uk) | 2020-02-03 |
| CL2017003096A1 (es) | 2018-08-10 |
| US10617771B2 (en) | 2020-04-14 |
| WO2016193431A1 (en) | 2016-12-08 |
| PT3303576T (pt) | 2020-05-08 |
| AU2016273343B2 (en) | 2022-04-28 |
| CN108138154B (zh) | 2022-01-18 |
| EP3303576B1 (en) | 2020-02-12 |
| KR102609858B1 (ko) | 2023-12-05 |
| MX2017015725A (es) | 2018-08-15 |
| IL255939B (en) | 2021-05-31 |
| BR112017025892A2 (pt) | 2018-08-14 |
| US20180169272A1 (en) | 2018-06-21 |
| PH12017502192A1 (en) | 2018-06-11 |
| RU2017142006A (ru) | 2019-07-09 |
| ES2790834T3 (es) | 2020-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA125373C2 (uk) | Вектор аденоасоційованого вірусу для лікування мукополісахаридозів | |
| Penati et al. | Gene therapy for lysosomal storage disorders: recent advances for metachromatic leukodystrophy and mucopolysaccaridosis I | |
| US11149285B2 (en) | Adenoassociated virus vectors for the treatment of lysosomal storage disorders | |
| JP7037574B2 (ja) | 脊髄性筋萎縮症の治療に有用な組成物 | |
| US11338046B2 (en) | Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses | |
| Samaranch et al. | Adeno-associated viral vector serotype 9–based gene therapy for Niemann-Pick disease type A | |
| CN103958676A (zh) | 重组人naglu蛋白质及其用途 | |
| Ariza et al. | Central nervous system delivery of helper-dependent canine adenovirus corrects neuropathology and behavior in mucopolysaccharidosis type VII mice | |
| US20230227802A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency | |
| US20220025461A1 (en) | Methods of detecting, preventing, reversing, and treating neurological diseases | |
| Derrick-Roberts et al. | Lentiviral-mediated gene therapy results in sustained expression of β-glucuronidase for up to 12 Months in the gus mps/mps and up to 18 Months in the gus tm (L175F) sly mouse models of mucopolysaccharidosis type VII | |
| Penon-Portmann et al. | Current and new therapies for mucopolysaccharidoses | |
| Rafi et al. | Can early treatment of twitcher mice with high dose AAVrh10-GALC eliminate the need for BMT? | |
| Cardone | Prospects for gene therapy in inherited neurodegenerative diseases | |
| Poletto et al. | Effects of gene therapy on cardiovascular symptoms of lysosomal storage diseases | |
| Cosma et al. | IDS crossing of the Blood-Brain Barrier corrects CNS defects in MPSII mice |