KR102609858B1

KR102609858B1 - 점액다당류증의 치료를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터

Info

Publication number: KR102609858B1
Application number: KR1020187000048A
Authority: KR
Inventors: 마리아 파티마 보쉬 투베르트; 버지니아 아레바 하우리고트; 산드라 모타스 마욜
Original assignee: 에스테베 파마슈티칼스 에스에이; 유니버시타트 아우토노마 데 바르셀로나
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2023-12-05
Also published as: CN108138154B; IL255939A; RU2017142006A3; AU2016273343B2; JP2018517414A; US10617771B2; RU2744593C2; ZA201708039B; CA2988201A1; CO2017012562A2; CA2988201C; PT3303576T; BR112017025892A2; WO2016193431A1; MX2017015725A; EP3303576B1; CL2017003096A1; MY184586A; TN2017000506A1; RU2017142006A

Abstract

본 발명은 리소좀 저장 질환의 치료, 특히 II형 점액다당류증의 치료를 위한, 새로운 아데노-관련 바이러스-유래 벡터 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

점액다당류증의 치료를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터

본 발명은 해당 단백질의 발현에 유용한 벡터 및 유전자 치료에서의 이들의 활용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 점액다당류증(mucopolysaccharidosis, MPS), 특히 II형 점액다당류증 또는 헌터 증후군의 치료에 유용한 벡터 및 핵산 서열에 관한 것이다.

리소좀은 동물 세포의 세포질에서 발견되는 세포 소기관으로, 노후한 세포내 구성 성분을 재활용할 때 또는 바이러스 및 박테리아를 섭취한 후 생체 분자를 분해하는 50 개 이상의 가수분해효소를 포함하고 있다. 이 세포 소기관은 프로테아제, 뉴클레아제, 글리코시다제, 리파아제, 포스포리파제, 포스파타제 및 설파타제를 포함하는 여러 유형의 가수분해효소를 포함하고 있다. 모든 효소는 산 가수분해효소이다.

리소좀 저장 질환(lysosomal storage disease, LSD)은 하나 이상의 리소좀 효소에 영향을 주는 유전적 결함에 의해 발생한다. 이러한 유전병은 일반적으로 리소좀에 존재하는 특정 효소 활성의 결핍으로 인해 발생한다. 정도는 덜하지만, 이러한 질환은 리소좀 생물발생(lysosomal biogenesis)과 관련된 단백질의 결핍으로 인한 것일 수 있다.

LSD는 개별적으로 희귀하지만, 집단적으로 이러한 장애는 일반 집단에서는 상대적으로 흔하다. LSD의 복합 유병률은 출산 5,000 명당 대략 1 명이다(Meikle P, et al., JAMA 1999; 281: 249-254 참조). 그러나, 일반 집단의 일부는 LSD의 높은 발생으로 특히 고통받고 있다. 예를 들어, 중유럽 및 동유럽 유대인(아슈케나지(Ashkenazi))의 자손에서의 고셔병(Gaucher) 및 테이-삭스병(Tay-Sachs)의 발병률은 각각 600 명당 1 명, 3,900 명당 1 명이다.

헌터 증후군으로도 알려져 있고 찰스 헌터 박사가 최초로 기술한 II형 점액다당류증(MPSII)은, IDS 유전자에 의해 인코딩되고 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 헤파린 설페이트(heparan sulphate, HS) 및 데르마탄 설페이트(dermatan sulphate, DS)의 리소좀 단계적 분해에 관여하여 이들의 병리적 축적으로 유도하는 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase, IDS) 효소의 결핍 또는 부재로 인해 발생하는 만성, 진행성 및 전신성 LSD이다(Hunter, Proc R Soc Med. 1917;10 (Sect Study Dis Child):104-16 참조). X-연관 열성 유전으로 인해, 헌터 증후군을 가진 일부 여성이 문헌에 보고되었지만, 거의 모든 헌터 증후군 환자는 남성이다(Mossman et al., Arch Dis Child. 1983;58:911-915, Gullen-Navarro et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;25(8):92, Valstar et al., J. Inherit. Metab. Dis. 2008;31(2):240-52 참조).

MPSII는 임상적으로 중추 신경계(Central Nervous System, CNS)의 아동기 발병 진행성 신경병증이 특징이다. 헌터 증후군 아이들은 일반적으로 출생시 정상이며 2 세 이전에 증상을 나타낸다(Schwartz et al., Acta Paediatr Suppl. 2007;96:63-70 참조). 임상 경과는 일반적으로 점진적인 진행성 인지 장애로 시작되어 행동 장애 및 진행성 지능 저하로 이어진다. 운동 실조는 나중에 발생한다. 신경학적 증상 외에도, MPSII 환자는 재발하는 귀, 코, 목 및 흉부 감염, 빈번한 설사와 변비, 심부전, 독특한 얼굴 모양, 짧은 키, 진행성 관절 경직 및 퇴행, 이동성에 영향을 미치는 골격 이상뿐만 아니라 간 비대증 및 비장 비대증을 포함하는 비-신경학적 변화로 고통받는다(Neufeld and Muenzer, “The Mucopolysaccharidoses” in Scriver C, et al., Eds., “The metabolic and molecular basis of inherited disease”, McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452 참조). 질병의 임상 징후의 범위는 환자가 가지고 있는 IDS 활성의 잔류 수준에 따라 크게 달라지고, 이는 다시 IDS 유전자의 기저의 돌연변이에 의해 결정되며, 현재까지 300 개 이상의 IDS 유전자의 돌연변이가 개시되어 있다(http: //www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php? gene=IDS). 일반적으로, 두 가지 임상 형태의 MPSII가 개시되어 있다. 18 개월에서 4 세 사이에 발병하는 가장 심각한 형태는 경미한 형태보다 3 배 더 흔하며, 독특한 얼굴 모양, 골격 이상, 간비장비대 및 정신 지체로 이어지는 신경학적 침범이 특징이다(Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008;167(3):267-277 참조). 환자는 일반적으로 폐쇄성 기도 질환 및 심부전으로 인해 20 년 안에 사망한다(상기 Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008;167(3):267-277, Neufeld and Muenzer 참조). 또한 약화된 표현형으로 알려진, 늦게 발병하고, 오래 생존하며 최소 신경학적 기능 장애를 갖는 더욱 점진적인 진행성 형태의 질환이 MPSII 환자의 일부에서 보고되었다(상기 Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008;167(3):267-277, Neufeld and Muenzer 참조).

최근까지 MPSII 증후군에 대해 특이적인 승인된 치료법이 없었으며, 이용 가능한 유일한 치료법은 질병 합병증의 예방 및 관리를 위한 매우 다양한 비특이적 약물을 사용하는 것이었다. 지난 몇 년 동안, 효소 대체 요법(Enzyme Replacement Therapy, ERT)과 조혈 줄기 세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)이라는 두 가지 주요 치료 옵션을 사용할 수 있었다. 두 가지 치료 전략의 설계는, 정상 세포가 IDS와 같은 상당한 양의 만노오스-6-인산(mannose-6-phosphate, M6P)-태그된 용해성 리소좀 효소를 분비한다는 사실에 근거하여 교차 교정의 가능성에 의존하며, 이 효소는 이후 원형질 막에서 M6P 수용체를 통해 다른 세포에 의해 세포외 구획에서 제거되어 리소좀을 표적으로 할 수 있다(Enns et al., Neurosurg Focus. 2008;24(3-4):E12 참조). 또한, 일반적으로 매우 낮은, 잔류 효소 활성의 한계가 있는데, 이 한계 이상에서, 세포는 기질 유입에 대처할 수 있고 대상은 질병의 영향을 받지 않으며, 이는 정상 활성의 회복이 임상 경과를 수정하기 위한 필수 조건은 아니라는 것을 시사한다(Neufeld, Annu Rev Biochem. 1991;60:257-80 참조).

2006 년 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 그리고 2007 년 유럽 의약청(EMA)에 의해 승인을 얻은 후, 재조합 인간 이두로네이트-2-설파타제(이두설파제(Idursulfase), ELAPRASE^®, Shire Pharmaceuticals)가 MPSII 환자의 치료를 위해 제시되었다. 치료는 1 내지 3 시간의 평균 주입 시간으로 정맥내 주입에 의해 0.5 mg/kg의 용량으로 매주 투여된다(Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604 참조). 엘라프라제(ELAPRASE^®)는 기준선에서 인지 저하가 없고 중등증의 질환을 갖는 96 명의 헌터 증후군 환자에 대해 무작위, 이중 맹검, 위약-대조 연구 후 승인되었다(Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101 참조). 치료 1 년 후, 엘라프라제로 치료한 환자는 위약을 복용한 환자에 비해 6 분 동안 보행한 거리(6 분 보행 검사)가 증가한 것으로 나타났다(Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101 참조). 또한 엘라프라제를 사용한 ERT는 관절 운동 범위(joint range of motion, ROM)를 향상시키고 간과 비장 부피를 감소시키는 것으로 나타났다(Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101 참조). 또한, 이두설파제에 대한 중화 항체가 존재하지 않을 때 폐 기능을 개선시킨다는 증거가 있고; 장기간 치료된 환자의 50%에서 항-IDS 항체의 발현이 보고되었다(Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101 참조).

31 명의 MPSII 환자를 대상으로 한 I/II 상 임상 시험에서 엘라프라제의 효능을 헌터라제(Hunterase^®)라는 상품명의 이두설파제의 베타 아형을 기반으로 하는 제 2 제품의 효능과 비교하였다(NCT01301898, http://clinicaltrials.gov). 엘라프라제의 경우 0.5 mg/kg/주의 용량으로 그리고 헌터라제의 경우 0.5 및 1.0 mg/kg/주의 용량으로 24 주 동안 두 단백질 모두 정맥내 투여되었다. 헌터라제 치료 결과는 감소된 소변 GAG 배설 및 6 분 보행 검사에서 향상된 성능을 보였으나, 폐 기능, 심장 기능 또는 관절 운동성에서 치료 효능에 영향을 줄 수 있는 복용량은 없었다(Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;8:42 참조). 두드러기 및 피부 발진과 같은 약간의 부작용이 보고되었지만, 헌터라제 주입은 일반적으로 안전하고 내성이 좋았다(Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;8:42 참조). 중추적인 PIII 임상 시험이 최근 완료되었지만(http://clinicaltrials.gov, NCT01645189), 결과는 아직 제공되지 않았다.

엘라프라제에 대한 과민성으로 인해, 제품 투여 중에 의료 지원을 제공해야 한다. 임상 시험에서 가장 심각한 부작용은 엘라프라제 주입 중 또는 제품 투여 후 24 시간까지 언제든지 나타날 수 있는 아나필락시스 반응(anaphylactic reaction)이었다(Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101). 환자의 삶을 위태롭게 할 수 있는 아나필락시스 반응에는 호흡 곤란, 저산소증, 저혈압, 두드러기 및/또는 목이나 혀의 혈관 부종(http://elaprase.com/)이 포함되며, 인공 호흡이나 응급 기관 절개술과 같은 개입, 및 흡입용 베타-아드레날린성 작용제, 에피네프린 또는 정맥내 코르티코스테로이드를 이용하는 치료를 필요로 할 수 있다(Burton et al., Mol Genet Metab. 2011;103(2):113-20 참조). ERT의 그 밖의 단점은, 1) 대부분이 정신 질환을 앓고 있는 소아 환자에서 1-3 시간 동안의 정맥내 주입을 시행하는 어려움(http://elaprase.com/), 2) 임상 연구에서 엘라프라제로 치료한 환자의 50%가 아직 알려지지 않은 임상적 중요성을 지닌 이두설파제에 대한 항체에 대해 양성이었지만, 이는 폐 기능 검사에서 시사한 바와 같이 장기적으로 제품 효능을 제한할 수 있다는 사실(Muenzer et al., Mol Genet Metab. 2007;90(3):329-37, Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101 참조), 및 3) 재택 치료의 비용을 포함하는 높은 치료 비용을 포함한다(Wyatt et al., Health Technol Asses. 2012¸16(39):1-543 참조).

엘라프라제 투여의 안전성 문제나 비용에 상관없이, 적어도 현재 권장되는 주당 0.5 mg/kg의 용량으로 재조합 IDS를 정맥내 투여하여 CNS에 도달시킬 수 없다는 것은 헌터 증후군 환자에서 발견되는 심각한 신경 퇴화의 치료에 대한 ERT의 잠재적 적용 가능성을 제한할 수 있다. 2 개월 또는 7 개월 된 MPSII 마우스에 각각 킬로그램당 1.2 또는 10 mg의 엘라프라제의 매주 정맥내 투여로 IDS 뇌 활성의 부분적 구제만이 달성되었다(Polito et al., Hum Mol Genet. 2010;19(24):4871-85 참조). 또한, 이러한 높은 용량에서도 불구하고, IDS 활성은 단백질 투여 72 시간 후에 전처리 수준으로 다시 돌아갔다(Polito et al., Hum Mol Genet. 2010;19(24):4871-85 참조). 실제로, 정맥내 ERT는 MPSII의 쥐 모델의 뇌에서 GAG 축적을 교정하지 못하였다(Garcia et al., Mol Genet Metab. 2007;91(2):183-90 참조). 따라서, 엘라프라제는 질병의 비-신경학적 증상의 치료로 제한된다.

ERT의 정맥내 전달에 대한 대안은 외인성 효소를 CNS에 직접 제공하는 것이다. 5 개월 된 MPSII 마우스의 측 뇌실에 20 μg의 재조합 인간 IDS를 3 주마다 투여하여, 대뇌, 소뇌 및 간, 심장, 신장 및 고환과 같은 체기관(somatic orgain)의 IDS 활성을 증가시켰다(Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012;107(1-2):122-8 참조). IDS 활성의 회복은 단기 기억 및 보행성 활동량의 회복으로 이어지고 및 소뇌, 간 및 고환에서의 세포내 공포형성(cellular vacuolation) 및 리소좀 팽창의 감소로 이어졌다. 그러나, 치료 효능은 부분적이었고, GAG 함량은 완전히 정상화되지 않았으며, 일부 행동 변화는 치료가 어려운 상태로 남아있다(Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012;107(1-2):122-8 참조). 헌터 증후군 환자에서 CNS 병리학을 직접 치료하기 위해 척수강내 약물 전달 장치를 통해 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)에 이두설파제를 투여하는 것에 대한 최근의 안전성 및 용량 범위 연구는 6 개월의 치료 후 CSF GAG 수준에서 대략 80-90%의 감소를 입증하였다(Muenzer et al., Genet. Med. 2015; doi:10.1038/gim.2015.36 및 www.clincialtrials.gov (NCT00920647) 참조). 그러나, 요법이 필요로 하는 영구 척수강내 전달 장치의 이식은 상당한 위험과 단점을 수반하며, 치료 자체는 환자/년당 매우 높은 경제적 비용을 갖는다.

전신 투여로 CNS에 도달시키는 또 다른 방법은 분자 트로이 목마를 사용하는 것이다. 이러한 접근법의 일례는, 수용체-매개 전달을 통해 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 통과할 수 있는 인슐린 수용체 항체-이두로네이트 2-설파타제 융합 단백질(HIRMAb-IDS)이다. 수컷 어린 붉은털 원숭이에 매주, 26 주 동안 3, 10 및 30 mg/kg의 HIRMAb-IDS를 정맥내 투여한 결과, 총 주입량의 1%가 뇌 흡수되었다(Boado et al., Biotechnol Bioeng. 2014;111(11):2317-25 참조). 이 연구는 융합 단백질의 안전성을 입증하였는데, 주입 관련 반응이나 면역 반응이 관찰되지 않았기 때문이다.

골수 유래 줄기 세포(골수 이식, BMT)를 이용한 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)은 다른 MPS 환자에서 신체 및 신경학적 병리 모두에 효과적인 것으로 입증되었다(Peters et al., Blood. 1996;87(11):4894-902, Peters and Steward, Bone Marrow Transplant. 2003;31(4):229-39 및 Yamada et al., Bone Marrow Transplant. 1998;21(6):629-34 참조). HSCT에 의한 교정의 기초를 이루는 원리는 공여자 단핵구가 혈액-뇌 장벽에서도 모세혈관 벽을 통과할 수 있다는 것이며, 이후 이들 단핵구는 조직 대식세포, CNS의 경우 소교세포로 분화하고, 다양한 세포로의 전달을 위해 부족한 효소를 분비한다(Krivit et al., Cell Transplant. 1995;4(4):385-92 참조). MPSII 마우스에서 수행한 BMT는 간, 비장 및 폐를 포함하는 다양한 체조직(somatic tissue)에서 GAG 축적을 감소시켰지만 CNS에서는 그렇지 않았다(Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014;111(2):139-46 참조). BMT가 ERT와 결합하면(0.5 mg 이두설파제/kg/주), MPSII 마우스 치료 후 7 개월 뒤에 심장, 신장 및 폐에서의 GAG 수준에 대한 부가 효과가 관찰되지만, CNS에서의 GAG 축적은 병리학적 수준으로 유지된다(Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014;111(2):139-46 참조). 그러나, MPSII 환자에서 임상적 효능에 대한 증거는 그리 강하지 않다. 1982 년에서 1991 년 사이에 BMT를 받은 헌터 증후군 환자 10 명을 추적 관찰한 결과, 매우 다양한 성공도를 보였다.(Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999;22(5):638-48 참조). 이들 환자 중 4 명은 BMT 후 100 일 이전에 사망하였고, 3 명 이상은 수술 후 7 년 전에 사망하였다. BMT 후 7 년 이상 생존한 3 명의 환자 중 한 명은 임상적 이점이 없다고 보고되었고; 두 번째 환자는 혈장 내 IDS 활성의 최소 증가를 나타내었고, 세 번째 환자는 혈장 내 IDS 활성에서 약간의 증가를 가졌음에도 불구하고 GAG 함량을 정상화시키지 못하였다(Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999;22(5):638-48 참조). 뇌의 자기 공명 영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI)은 경증 MPSII 표현형 환자에서 BMT 후 2.5 년 뒤에 낭성 병변(cystic lesion)의 수가 약간 감소하였다(Seto et al., Ann Neurol. 2001;50(1):79-92 참조). 그러나, 동일한 연구는 MRI 하에서 어떠한 개선도 보이지 않은 경증 표현형을 가진 또 다른 환자에 대한 자료를 제공하였다(Seto et al., Ann Neurol. 2001;50(1):79-92 참조). 임상 결과는 아마도 다양한 요인으로 인해 헌터 증후군 환자들 사이에서 매우 가변적일 것으로 보이며, HSCT에서의 유전형, 연령, 신경학적 장애의 정도와 같은 HSCT에서의 환자의 임상적 상태, 기증자 상태, 기증자 키메리즘(donor chimerism), 줄기 세포 공급원 및 효소 활성 모두가 장기적인 결과에 영향을 미칠 것으로 보였다(Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011;5:v49-59 참조).

성공적인 경우, HSCT는 체세포 수준에서 어느 정도의 임상적 이익에 기여할 수 있고, 행동 문제를 감소시키며 수면 패턴을 향상시킬 수 있지만, 인지 장애의 유의한 개선을 달성할 수 있는지 여부는 불분명하다(Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011;5:v49-59 참조). 일반적으로 이러한 접근법은 높은 이환률과 사망률 및 다양한 신경 인지적 장애로 인해 헌터 증후군 환자에게는 권장되지 않았다(Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604 참조).

HSCT의 실패에 대한 그럴듯한 설명은 이식된 세포에서 제한된 IDS 발현이며, 이는 CNS에서 불충분한 IDS 교차 교정을 유도한다. 인간 IDS 유전자를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 골수 세포를 MPSII 마우스에 이식하기 전에 골수 세포에 형질 도입하였다. 처리된 MPSII 마우스는 이식 14 주 후에 T-미로 기억 검사에서 개선된 성능을 나타냈다(Podetz-Pedersen et al., Mol Ther. 2013;21:s1-s285 참조).

MPSII에 대한 현재의 치료 옵션의 한계를 감안할 때, 대안적인 접근이 필요하다. 체내 유전자 치료는 평생 동안의 유익한 효과를 기대하면서 MPSII 및 기타 유전병에 대한 일회 치료의 가능성을 제공한다. 다양한 투여 경로와 결합된 다양한 바이러스 벡터의 사용을 기반으로 하는 몇몇의 유전자 치료법이 MPSII 질병의 동물 모델에서 시험되었다.

아데노-관련 바이러스(adenoassociated virus, AAV) 벡터-매개 유전자 전달은, 높은 형질 도입 효율 및 이들 벡터의 병원성 결핍으로 인해, 많은 체내 유전자 치료 응용 분야에서 특히 선택되는 접근법으로 급부상하고 있다. AAV 벡터는 유사 분열 후 세포에 형질 도입될 수 있으며, 일부 전임상 및 임상 연구는 다양한 질병에 대한 치료적 이식 유전자의 지속적인 발현을 효율적으로 유도할 수 있는 AAV 벡터-매개된 유전자 전달의 가능성을 입증하였다(Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2231-9, Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008;19(10):979-90, Maguire et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2240-8, Niemeyer et al., Blood 2009;113(4):797-806, Rivera et al., Blood 2005;105(4):1424-30, Nathawani et al., N Engl J Med. 2011;365(25):2357-65 및 Buchlis et al., Blood 2012;119(13):3038-41 참조).

MPSII 마우스 새끼(p2)의 측두 정맥에 AAV5-CMV-인간 IDS 벡터를 전신 투여한 결과, 심장, 신장, 간, 폐, 근육 및 비장에서 IDS 활성이 증가하였고, 뇌에서 IDS 활성이 완만하게 증가하였으며, 단일 벡터 투여 후 18 개월까지 체조직 및 소변 GAG 함량의 감소로 이어졌다(Polito et al., Am J Hum Genet. 2009;85(2):296-301 참조). 또한 이 치료법은 신경 퇴행을 예방하고 성상교 세포증(astrogliosis)과 염증을 교정하여 CNS 병리학의 진행을 예방하였다. AAV 주입 후 18 개월 뒤에 오픈 필드 테스트(Open Field Test)에서 마우스를 평가한 결과, MPSII 마우스의 대근육 운동 표현형에서 치료가 개선되었음을 입증하였다(Polito et al., Am J Hum Genet. 2009;85(2):296-301 참조).

또한 MPSII를 치료하기 위해 간-특이적 TBG 프로모터의 제어 하에 인간 IDS 유전자를 인코딩하는 혈청형 8의 AAV를 사용하였다. 2개월 된 MPSII 마우스에 벡터를 정맥내 투여한 후 7 개월까지 혈청, 간, 비장, 폐, 심장, 신장 및 근육 IDS 활성의 증가가 관찰되었고, 이들 체조직에서 GAG 저장의 완전한 교정이 이루어졌다(Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006;15(7):1225-36 참조). 그러나 벡터를 정맥내 투여할 때 뇌에서 GAG 축적의 부분적 제거 및 IDS 활성의 약간의 증가를 달성하기 위해서는 매우 높은 용량(4x10¹² 바이러스 게놈/마우스)이 요구되었다(Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006;15(7):1225-36 참조). 유사하게, 인간 IDS 유전자가 편재성 신장 인자 1-a(elongation factor, EF) 프로모터의 제어 하에 있는 AAV8 벡터의 성체 MPSII 마우스로의 정맥내 투여는 투여 후 24 주까지 간, 심장, 비장 및 신장에서 IDS 활성의 증가를 나타냈고, 이들 기관에서의 GAG 축적을 완전히 교정하였다(Jung et al., Mol Cells. 2010;30(1):13-8 참조). 뇌에서의 IDS 활성은 단기(주입 후 6 주)에 희생된 동물 군에서만 증가하였으나, 이는 CNS 내의 GAG 함량을 정상화시키는데 충분하지 않았다(Jung et al., Mol Cells. 2010;30(1):13-8 참조).

상기한 접근법 중 어느 것도 이두로네이트-2-설파타제 활성을 완전히 회복시키거나, CNS 및 체조직에서 세포질 봉입체(intracytoplasmic includsion)를 완전히 제거하거나, MPSII의 모든 임상 징후를 교정하지 못하였다. 따라서, 더욱 우수한 효능 및 안전성을 갖는 MPSII의 치료에 대한 새로운 접근법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 점액다당류증, 특히 II형 점액다당류증(MPSII), 또는 헌터 증후군의 치료를 위한 새로운 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

제 1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 이러한 제 1 양태에 따른 분리된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 및 서열번호 8에서 선택된다.

제 2 양태에서, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는, 바람직하게는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

제 3 양태에서, 본 발명은 II형 점액다당류증의 치료를 위한 새로운 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 특히 서열번호 1에 기재된 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는, 바람직하게는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스 벡터(Adeno-associated Virus Vectors, AAV)이다. 바람직한 실시형태에서, 아데노-관련 바이러스 벡터는 혈청형 9(AAV9)이다. 본 발명의 AAV9 벡터는 IDS의 발현을 조절하기 위해 코딩 뉴클레오티드 서열에 연결된 프로모터를 더 포함할 수 있다. 적합한 프로모터는 CAG 프로모터, 서열번호 14이다.

본 발명의 또 다른 양태는 치료적 유효량의, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 플라스미드 또는 재조합 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는 약제로서 사용하기 위한, 특히 II형 점액다당류증의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 플라스미드 또는 본원에 기재된 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 플라스미드의 제조 방법, 및 본 발명에 따른 재조합 벡터의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 IDS를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는, 바람직하게는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 세포에 관한 것이다.

도 1. pAAV-CAG-hIDS 및 AAV-CAG-hIDS의 생성. (A) 플라스미드 pAAV-CAG-hIDS와 이의 구성 요소의 개략적인 표현. (B) hIDS 코딩 서열을 포함하는 아데노-관련 벡터 게놈의 개략적인 표현.
도 2. pAAV-CAG-ohIDS-버전1및 AAV-CAG-ohIDS-버전1의 생성. (A) 플라스미드 pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 이의 구성 요소의 개략적인 표현. (B) ohIDS-버전1 코딩 서열을 포함하는 아데노-관련 벡터 게놈의 개략적인 표현.
도 3. pAAV-CAG-ohIDS-버전2 및 AAV-CAG-ohIDS-버전2의 생성 (A) 플라스미드 pAAV-CAG-ohIDS-버전2 및 이의 구성 요소의 개략적인 표현. (B) ohIDS-버전2 코딩 서열을 포함하는 아데노-관련 벡터 게놈의 개략적인 표현.
도 4. pAAV-CAG-omIDS 및 AAV-CAG-omIDS의 생성. (A) 플라스미드 pAAV-CAG-omIDS 및 이의 구성 요소의 개략적인 표현. (B) omIDS 코딩 서열을 포함하는 아데노-관련 벡터 게놈의 개략적인 표현.
도 5. 건강한 마우스에 대한 pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2의 유체역학적 전달. 히스토그램은 30 μg의 인간 IDS-코딩 플라스미드 pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2의 투여 후 48 시간 뒤에 측정한 간(A) 및 혈청(B)에서의 이두로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 나타낸다. 식염수-주입 마우스의 IDS 활성을 100%로 설정하였다. 값은 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P<0.05.
도 6. MPSII 마우스에 대한 pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2의 유체역학적 전달. (A, B) 히스토그램은 인간 IDS-코딩 플라스미드 pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2의 투여 후 1 주 뒤에 측정한 간(A) 및 혈청(B)에서의 이두로네이트-2-설파타제(IDS)의 활성을 나타낸다. 야생형 및 식염수-주입 MPSII 마우스를 대조군으로 사용하였다. WT 마우스의 IDS 활성은 100%로 설정하였다. (C) 상이한 인간 IDS-코딩 플라스미드의 투여 후 1 주 뒤에 간, 비장, 심장, 방광 및 고환에서의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 함량의 정량화. 값은 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.0001.
도 7. MPSII 마우스에 대한 AAV9-CAG-hIDS, AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2의 혈관내 전달. MPSII 마우스에 야생형 인간 IDS(AAV9-CAG-hIDS) 또는 2 가지 다른 버전의 최적화된 인간 IDS(AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전 2)를 코딩하는 AAV9 벡터 1x10¹⁰ vg을 정맥내 주사하였다. 야생형 및 미처리 MPSII 마우스를 대조군으로 사용하였다. (A, B) 히스토그램은 간(A)과 혈청(B)에서의 이두로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 나타낸다. WT 마우스의 IDS 활성은 100%로 설정하였다. (C) 상이한 인간 IDS-코딩 벡터를 투여한 동물의 간에서의 글리코사미노글리칸(GAG) 함량의 정량화. 값은 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. *P<0.05, ** P<0.01 및 *** P<0.001.
도 8. MPSII 마우스에 대한 AAV9-CAG-hIDS, AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2의 CSF-내 전달. 2 개월 된 MPSII 마우스에 야생형 인간 IDS(AAV9-CAG-hIDS) 또는 2 가지 다른 버전의 최적화된 인간 IDS(AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2)를 코딩하는 AAV9 벡터 5x10¹⁰ vg를 대수조(cisterna magna)에 주사하였다. 야생형(WT), 미처리 MPSII(MPSII) 및 비-코딩(널(Null)) AAV9 벡터(MPSII-널)를 투여한 MPSII 마우스를 대조군으로 사용하였다. (A) 이두로네이트-2-설파타제 활성은 뇌의 다양한 부분에서의 벡터 전달 후 1.5 개월 뒤에 분석하였다(섹션 I 내지 섹션 V, 여기서 섹션 I는 뇌의 가장 앞쪽 부분을 나타내고 섹션 V는 가장 뒤쪽 부분을 나타낸다). WT 마우스의 IDS 활성은 100%로 설정하였다. (B) (A)와 동일한 뇌 영역에서 글리코사미노글리칸(GAG) 함량의 정량화. 결과는 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 및 **** P<0.0001.
도 9. MPSII 마우스에 대한 AAV9-CAG-hIDS, AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2의 CSF-내 전달. 2 개월 된 MPSII 마우스에 야생형 인간 IDS(AAV-CAG-hIDS) 또는 2 가지 다른 버전의 최적화된 인간 IDS(AAV-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV-CAG-ohIDS-버전2)를 코딩하는 AAV9 벡터 5x10¹⁰ vg를 대수조(cisterna magna)에 주사하였다. 야생형(WT), 미처리 MPSII(MPSII) 및 비-코딩(널) AAV9 벡터(MPSII-널)를 투여한 MPSII 마우스를 대조군으로 사용하였다. (A, B) 처리 후 1.5 개월 뒤에 측정하여 간(A) 및 혈청(B)에서의, WT 활성의 %로 나타낸, 이두로네이트-2-설파타제 활성. (C) 체기관의 글리코사미노글리칸(GAG) 함량의 정량화. 결과는 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 및 **** P<0.0001.
도 10. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A) 야생형(건강한) 마우스, 미처리 MPSII 마우스 및 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 AAV9-CAG-omIDS를 수조내(intracisternal, IC) 주사를 통해 CSF-내에 투여한 MPSII 마우스의 뇌의 다양한 부분(섹션 I 내지 섹션 V)에서의 이두로네이트-2-설파타제 활성. WT IDS 활성은 100%로 설정하였다. 분석은 벡터 전달 후 4 개월 뒤에 수행하였다. (B) (A)와 동일한 뇌 부분에서의 글리코사미노글리칸(GAG)의 정량화. 결과는 그룹당 4-5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. *** P<0.001, **** P<0.0001 대 MPSII-널.
도 11. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A) 야생형(건강한) 마우스 및 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS를 대수조에 투여한 MPSII 마우스에서 리소좀 마커 LAMP-2의 염색 후 뇌의 다양한 영역에서 얻어진 신호 강도의 정량화. 분석은 벡터 전달 후 4 개월 뒤에 수행하였다. (B) 뇌 추출물에서의 기타 리소좀 효소의 활성. IDUA; 이두로니다제(iduronidase), 알파-L-, SGSH; N- 설포글 루코사민 설포하이드롤라제(N- sulfoglucosamine sulfohydrolase), NAGLU; N-아세틸글루코사미니다제(N- acetylglucosaminidase), 알파, HGSNAT; 헤파린-알파- 글루코사 미나이드N-아세틸트랜스퍼라제(heparan - alpha - glucosaminide N-acetyltransferase), GALNS; 갈락토사민(N-아세틸)-6-설파타제(galactosamine(N-acetyl)-6-sulfatase), GUSB; 글루쿠로니다제(glucuronidase), 베타, HEXB; 헥소사 미니다제 B(hexosaminidase B). 값은 그룹당 4-5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001 대 MPSII-널.
도 12. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. 리소좀 마커 LAMP2에 대한 뇌 절편 염색 후 다양한 영역에서 얻은 신호 강도의 정량화. 분석은 야생형(WT) 마우스 및 대조군 5x10¹⁰ vg의 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS를 CSF-내 투여한 후 8 개월 뒤에 MPSII 한배 새끼들에서 수행하였다. 결과는 그룹당 2-6 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. * P<0.05 및 ** P<0.01 대 MPSII-널.
도 13. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A, B) 히스토그램은 야생형(건강한) 마우스 및 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS를 4 개월 전에 대수조에 투여한 MPSII 마우스의 전두 피질(frontal cortex), 두정 피질(parietal cortex), 및 후두 피질(occipital cortex), 상구(superior colliculus) 및 시상(thalamus) 절편에서 성상세포(astrocyte) 마커 GFAP(A)와 미세아교세포(microglial) 마커 BSI-B4(B)에 대한 면역 염색 후 측정한 신호 강도를 나타낸다. 결과는 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001 대 MPSII-널.
도 14. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A, B) 히스토그램은 건강한 야생형(WT) 마우스 및 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS를 CSF-내 투여한 MPSII 한배 새끼들의 뇌수(encephalon) 절편에서 성상세포 마커 GFAP(A)와 미세아교세포 마커 BSI-B4(B)에 대한 면역 염색 후 측정한 신호 강도를 나타낸다. 분석은 벡터 전달 후 8 개월 뒤에 수행되었다. 결과는 그룹당 2-6 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 표시된다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 및 **** P<0.0001 vs. MPSII-널
도 15. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A, B) 야생형(건강한) 마우스, 미처리 MPSII 마우스 및 생후 2 개월에 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS 벡터를 CSF 내에 투여하고 4 개월 후에 분석한 MPSII 마우스의 간(A) 및 혈청(B)에서의, WT 활성의 %로 나타낸, 이두로네이트-2-설파타제 활성. WT IDS 활성은 100%로 설정하였다. (C) 체기관에서의 글리코사미노글리칸(GAG)의 정량화. 결과는 그룹당 4-5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001 대 MPSII-널.
도 16. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A, B) 건강한 야생형(WT) 마우스, 미처리 MPSII(MPSII) 마우스 및 생후 2 개월에 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS 벡터를 CSF 내에 투여하고 4 개월 후에 분석한 MPSII 마우스의 폐(A) 및 심장(B)에서의, WT 활성의 %로 나타낸, 이두로네이트-2-설파타제 활성. (C) AAV9-CAG-omIDS를 CSF-내 투여한 MPSII 마우스의 간, 폐 및 심장에서의 벡터 게놈 복제 수/이배체 게놈(vg/dg)의 정량화. 미처리 MPSII 마우스에서 수득한 조직을 대조군으로 사용하였다. 결과는 (A 및 B)에서 그룹당 4-5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. * P<0.05, ** P<0.01 및 *** P<0.001 MPSII-널.
도 17. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A) 야생형(건강한) 마우스, 미처리 MPSII 마우스 및 생후 2 개월에 5x10¹⁰ vg의 대조군 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS 벡터를 CSF 내에 투여하고 4 개월 후에 분석한 MPSII 마우스의 전체 체중에 대한 간의 습윤 중량 (B) (A)와 동일한 동물 집단에서 수득한 간 추출물에서의 기타 리소좀 효소의 활성. (C) (A)와 동일한 동물 집단의 혈청에서의, WT 활성의 %로 나타낸, β-헥소사미니다제(β-HEXO) 활성. IDUA; 이두로니다제(iduronidase), 알파-L-, SGSH; N- 설포글루코사민 설포하이드롤라제(N- sulfoglucosamine sulfohydrolase), NAGLU; N-아세틸글루코사미니다제(N-acetylglucosaminidase), 알파, HGSNAT; 헤파린-알파- 글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(heparan - alpha - glucosaminide N- acetyltransferase), GALNS; 갈락토사민(N-아세틸)-6- 설파타제(galactosamine(N- acetyl)-6- sulfatase), GUSB; 글루쿠로니다제(glucuronidase), 베타, HEXB; 헥소사미니다제 B(hexosaminidase B). WT 효소 활성은 100%로 설정하였다. 값은 그룹당 4-5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001 대 MPSII-널.
도 18. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. 순수 야생형(건강한) 마우스, 미처리 MPSII 마우스 및 생후 2 개월에 5x10¹⁰ vg의 대조군 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS 벡터를 CSF 내에 투여하고 4 개월 후에 분석한 MPSII 마우스에서의 오픈 필드 테스트를 통한 이동 및 탐험 활동 평가. (A) 중심부에서의 시간, (B) 주변부에서의 시간, (C) 중심부로의 입장, (D) 중심부까지의 지연, (E) 총 움직임, (F) 교차된 선. 값은 그룹당 17-22 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P<0.05, ** P<0.01 대 MPSII-널.
도 19. 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. 건강한 야생형(WT) 마우스, 미처리 MPSII(MPSII) 마우스 및 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩 벡터(AAV9-널) 또는 5x10¹⁰ vg의 AAV9-CAG-omIDS 벡터를 CSF 내에 투여한 MPSII 마우스에서의 카플란-마이어 생존율 분석. WT의 경우 N=24, 미처리 MPSII의 경우 N=22, 널-주입 MPSII의 경우 N=27, 및 치료 벡터를 투여 받은 마우스의 경우 N=91.
도 20. 다양한 용량(1.58x10⁹, 5x10⁹, 1.58x10¹⁰ 및 5x10¹⁰ vg/마우스)으로 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A) 야생형(건강한) 마우스, 미처리 MPSII 마우스 및 생후 2 개월에 다양한 용량의 AAV9-CAG-omIDS를 수조내(intracisternal, IC) 주사를 통해 CSF 내에 투여하고 1.5 개월 후에 분석한 MPSII 마우스의 뇌의 다양한 부분(섹션 I 내지 섹션 V)에서의 이두로네이트-2-설파타제 활성. WT IDS 활성은 100%로 설정하였다. (B) (A)와 동일한 뇌 부분에서의 글리코사미노글리칸(GAG)의 정량화. 결과는 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001 대 미처리 MPSII.
도 21. 다양한 용량(1.58x10⁹ 5x10⁹, 1.58x10¹⁰ 및 5x10¹⁰ vg/마우스)으로 최적화된 쥐 이두로네이트-2-설파타제(AAV9-CAG-omIDS)를 코딩하는 AAV9 벡터의 CSF-내 전달. (A, B) 야생형(건강한) 마우스, 미처리 MPSII 마우스 및 생후 2 개월에 다양한 용량의 AAV9-CAG-omIDS를 CSF내에 투여하고 1.5 개월 후에 분석한 MPSII 마우스의 간(A) 및 혈청(B)에서의, WT 활성의 %로 나타낸, 이두로네이트-2-설파타제 활성. WT IDS 활성은 100%로 설정하였다. (C) 체기관에서의 글리코사미노글리칸(GAG)의 정량화. 결과는 그룹당 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM으로 나타내었다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001 대 미처리 MPSII.

미생물 기탁

플라스미드 pAAV-CAG-hIDS(서열번호 3), pAAV-CAG-ohIDS-버전1(서열번호 6) 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2(서열번호 9)를 수탁 번호 DSM 29866, DSM 29867 및 DSM 29868로 2014년 12월 18일 독일 연방 공화국 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig)에 기탁하였다.

정의

"뉴클레오티드 서열" 또는 "분리된 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 의미한다. 핵산은 이중 가닥, 단일 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 모두의 부분을 포함할 수 있다.

"% 서열 동일성" 또는 "% 동일성"이란 용어는 최대% 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬한 후, 참조 서열에서 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드의 백분율을 의미한다. % 서열 동일성은 ALIGN, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘과 같은 본 기술 분야에서 확립된 임의의 방법 또는 알고리즘에 의해 결정될 수 있다(Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402 및 Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410 참조).

본원에서, % 서열 동일성 또는 "% 동일성"은 참조 서열 및 후보 서열을 정렬한 후 동일한 뉴클레오티드의 수를 참조 서열의 총 뉴클레오티드 수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 계산된다.

"코딩하다" 또는 "코딩하는"이란 용어는 뉴클레오티드 서열이 어떻게 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는지를 결정하는 유전자 코드를 의미한다. 서열의 뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 또는 단백질을 따라 아미노산의 순서를 결정한다.

"단백질"이란 용어는 아미노산 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 선형 사슬로 구성된 거대 분자를 의미한다. 단백질은 시스테인 잔기의 3-옥소알라닌으로의 전환, 글리코실화 또는 금속 결합과 같은 번역 후 변형을 겪을 수 있다. 단백질의 글리코실화는 아미노산 사슬에 공유 결합된 다양한 탄수화물의 첨가이다.

"유효량"이란 용어는 의도된 목적을 달성하기에 충분한 물질의 양을 의미한다. 예를 들어, 이두로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 증가시키는 AAV9 벡터의 유효량은 글리코사미노글리칸 축적을 감소시키기에 충분한 양이다. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 발현 벡터의 "치료적 유효량"은 질환 또는 장애의 징후 및 증상을 감소시키거나 박멸시키기에 충분한 발현 벡터의 양이다. 주어진 물질의 유효량은 물질의 성질, 투여 경로, 물질을 투여받는 동물의 크기와 종 및 물질을 제공하는 목적과 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 각각의 개별 경우의 유효량은 본 기술 분야의 확립된 방법에 따라 숙련된 기술자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

"개체"라는 용어는 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 비인간 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스, 랫트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 또는 영장류, 더욱 더 바람직하게는 인간을 의미한다.

"작동 가능하게 연결된"이란 용어는 해당 유전자에 대한 프로모터 서열의 기능적 관계 및 위치를 의미한다(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다). 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 프로모터는 해당 서열에 인접한다. 그러나, 인핸서는 발현을 조절하기 위해 해당 서열에 인접할 필요는 없다.

"향성(tropism)"이라는 용어는 다양한 바이러스가 특정한 숙주 종 또는 이들 종 내의 특정 세포 유형을 우선적으로 표적하도록 진화한 방식을 의미한다.

"유전자 요법"이란 용어는 유전성 또는 후천성 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 해당 유전 물질(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 세포에 전달하는 것을 의미한다. 해당 유전 물질은 체내 생산이 바람직한 산물(예를 들어, 단백질 폴리펩티드, 펩티드 또는 기능성 RNA)을 인코딩한다. 예를 들어, 해당 유전 물질은 치료 가치의 효소, 호르몬, 수용체 또는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.

"재조합 바이러스 벡터" 또는 "바이러스 벡터"라는 용어는 해당 유전 물질(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 세포로 전달하여 표적 세포에서 상기 유전 물질(예를 들어, 단백질 폴리펩티드, 펩티드 또는 기능성 RNA)에 의해 인코딩된 산물을 생성할 수 있는 유전 공학 기술을 통해 자연 발생 바이러스에서 수득되는 물질을 의미한다.

"재조합 플라스미드" 또는 "플라스미드"라는 용어는 해당 유전 물질을 세포로 전달하여 표적 세포에서 상기 유전 물질(예를 들어, 단백질 폴리펩티드, 펩티드 또는 기능성 RNA)에 의해 인코딩된 산물을 생성할 수 있는 유전 공학 기술을 통해 수득되는 작은 원형의 이중 가닥 자가 복제 DNA 분자를 의미한다. 또한, "재조합 플라스미드" 또는 "플라스미드"라는 용어는 재조합 벡터 게놈의 캐리어로서 바이러스 벡터를 제조할 때 사용되는 유전 공학 기술을 통해 수득되는 작은 원형의 이중 가닥 자기 복제 DNA 분자를 의미한다.

본 발명은 점액다당류증, 특히 II형 점액다당류증(MPSII) 또는 헌터 증후군의 치료를 위한 새로운 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 글리코사미노글리칸 헤파린 설페이트 및 데르마탄 설페이트의 단계적 분해에 관여하는 효소인 서열번호 1에 기재된 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS 라 칭함)를 코딩한다. "천연 IDS" 또는 "야생형 IDS"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에서 수득되거나 생산된, 또는 그렇지 않으면 각각의 종의 IDS에 대한 코딩 서열(CDS)을 출발 물질로 사용하여 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 바람직하게, "천연 IDS" 또는 "야생형 IDS"는 쥐 CDS(mIDS라 칭함) 또는 인간 CDS(hIDS라 칭함 됨)로부터 화학적으로 합성된다. 더욱 바람직하게, 뉴클레오티드 서열 hIDS는 인간 CDS로부터 화학적으로 합성되며 서열번호 2에 해당한다.

본 발명에 따르면, 최적화된 뉴클레오티드 서열로도 지칭되는 변형된 뉴클레오티드 서열이, 아마도 mRNA의 효율적인 전사 또는 더욱 안정한 mRNA의 전사, 또는 코돈의 더욱 효율적인 사용으로 인해, 더욱 많은 양의 해당 단백질의 생성을 가능하게 한다는 것을 입증한다. 본원에서 이들 서열은 각각 쥐와 인간 CDS에서 수득되는 경우 "최적화된 서열"이라 칭한다. 유리하게, 본 발명에 따른 최적화된 서열은 코돈 최적화된 서열이다.

따라서, 본 발명의 제 1 양태는 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 분리된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2와 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% 또는 90%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5에 기재된 ohIDS-버전1 및 서열번호 8에 기재된 ohIDS-버전2에서 선택된다.

본 발명에 따르면, 상기한 분리된 서열은 골격 플라스미드의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)에 삽입될 수 있다. 특히, 골격 플라스미드는 본원에서 pAAV로 지칭되는 아데노-관련 바이러스(AAV)의 ITR을 포함하는 플라스미드이다.

본 발명의 제 2 양태는 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 제공한다. 유리하게, 본 발명에 따른 플라스미드는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 플라스미드는 서열번호 2와 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% 또는 90%의 동일성을 갖는 분리된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 플라스미드는 서열번호 2에 기재된 hIDS, 서열번호 5에 기재된 ohIDS-버전 1 및 서열번호 8에 기재된 ohIDS-버전2에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

상기한 분리된 서열 이외에, 본 발명에 따른 플라스미드는 또한 플라스미드로 형질 감염된 세포에서 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있는 통상적인 조절 요소를 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 플라스미드는 해당 염기 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소로서 프로모터를 포함한다. 천연 또는 키메라성이고, 구성적 또는 유도성이고, 편재성 및/또는 조직 특이적인 다수의 프로모터가 본 기술 분야에 공지되어 있다. 유리하게, 본 발명의 맥락에서 사용되는 프로모터는 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소 및 닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 조합을 의미하는 CAG 프로모터이다. 이는 또한 해당 뉴클레오티드 서열에서 유래된 mRNA에 안정성을 부여하는 닭 β-액틴 및 토끼 β-글로빈 인트론의 일부를 더 포함한다(Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11 참조). 본 발명의 pAAV 플라스미드에 포함된 CAG 프로모터는 서열번호 14의 서열을 갖는다. 이러한 특정 CAG 프로모터는 뇌의 모든 부위와 간에서 없어진 효소의 장기간 발현을 허용한다. 그 결과, 글리코사미노글리칸(GAG)의 리소좀 축적이 교정되어 MPSII의 특징인 신경학적 및 신체적 변화를 이러한 방식으로 예방한다.

특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미드는 수탁 번호가 DSM 29866인 서열번호 3에 기재된 플라스미드 pAAV-CAG-hIDS이다.

또 다른 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미드는 수탁 번호가 DSM 29867인 서열번호 6에 기재된 플라스미드 pAAV-CAG-ohIDS-version1이다.

또 다른 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미드는 수탁 번호가 DSM 29868인 서열번호 9에 기재된 플라스미드 pAAV-CAG-ohIDS-버전 2이다.

본 발명의 제 3 양태는 II형 점액다당류증의 치료를 위한 새로운 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 해당 유전 물질을 세포에 전달하는데 사용되는 캡시드 단백질뿐만 아니라 내부에 포함된 벡터 게놈인 것으로 이해되어야 한다. 상기 해당 유전 물질 외에도, 벡터 게놈은 또한 프로모터 또는 오퍼레이터와 같은 전사 조절 요소, 전사 인자 결합 영역 또는 인핸서 및 번역 개시 또는 종료를 위한 조절 요소를 포함하는 다양한 기능 요소를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses, AAV)에서 유래되어 해당 뉴클레오티드 서열을 표적 세포에 전달하는데 사용된다. 이들은 다양한 조직에서 유사 분열 후 세포에 형질 도입되는데 있어서 높은 효율을 갖는 것으로 입증되었다. 본 발명의 맥락에서, 벡터는 인간 이두로네이트-2-설파타제 코딩 서열(서열번호 2의 hIDS) 또는 최적화된 버전의 인간 이두로네이트-2-설파타제 코딩 서열(서열번호 5의 ohIDS-버전1 또는 서열번호 8의 ohidS-버전2)을 전달하는데 사용된다. 아데노-관련 벡터는 파보비리데(parvoviridae) 과의 아데노-관련 바이러스에서 유래된 벡터이다. 아데노-관련 바이러스 게놈은 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 제조된다. 이들 바이러스는 포유동물을 감염시키지만 비-병원성이다(즉, 질병을 유발하지 않는다). 이들은 분열 세포 또는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 이들의 향성은 혈청형에 따라 변한다. 혈청형은 이들의 캡시드 항원에 따른 바이러스 그룹의 분류이다. 캡시드 단백질에 의해 결정되는 아데노-관련 바이러스의 혈청형은 바이러스의 향성을 정의하고 특정 세포 유형으로의 진입을 허용한다. 본 발명의 맥락에서, AAV는 혈청형 1, 2, 5, 7, 8, 9 또는 10을 갖는다. 바람직하게, AAV는 혈청형 9(AAV9)인데, 이는 CSF에 대한 단일 투여 시 뇌뿐만 아니라 말초 기관에 유전 물질을 전달하는 최상의 능력을 보이기 때문이다. 본 발명의 AAV9 벡터는 인간 아데노-관련 바이러스 혈청형 9의 역위 말단 반복(Inverted Terminal Repeat, ITR), CAG 프로모터, 인간 이두로네이트-2-설파타제(hIDS) 유전자 또는 이의 최적화된 버전(본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열로도 지칭됨), 및 토끼 β-글로빈 유전자의 폴리A를 포함하는, 인간 아데노-관련 바이러스의 혈청형 9의 바이러스 캡시드 및 변형된 게놈으로 구성된다.

따라서, 이 양태에서, 본 발명은 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV에 관한 것이다. 유리하게, 본 발명에 따른 재조합 AAV는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 AAV는 서열번호 2와 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% 또는 90%의 동일성을 갖는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 AAV에 포함된 분리된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 기재된 hIDS, 서열번호 5에 기재된 ohIDS-버전1 및 세트 서열번호 8에 기재된 ohIDS-버전2에서 선택된다.

이 양태의 유리한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV9에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 재조합 AAV9는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 본 발명의 재조합 AAV9는 서열번호 2와 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% 또는 90%의 동일성을 갖는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 AAV9는 서열번호 2에 기재된 hIDS, 서열번호 5에 기재된 ohIDS-버전1 및 서열번호 8에 기재된 ohIDS-버전2에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

놀랍게도, 동일한 독립체에서, 선택된 프로모터, 특히 CAG 프로모터와 함께 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 AAV9 캡시드를 결합시키면, 특히 독립체가 수조내 주사를 뇌척수액(CSF)으로 전달되는 경우, 뇌의 모든 부위에서 없어진 효소의 지속적인 발현을 가능하게 한다는 것을 또한 발견하였다. 그 결과, 글리코사미노글리칸(GAG)의 리소좀 축적이 교정되어 MPSII 질환의 특징인 신경학적 변화를 이러한 방식으로 예방한다. 이러한 효과는 벡터의 투여 지점(대수조(cisterna magna))에서 멀리 떨어진 후각 신경구(olfactory bulb)에서도 관찰되었다. 또한, CSF 내에 전달된 본 발명에 따른 AAV9 벡터는 체순환계에 도달하여 간으로 형질 도입될 수 있었다. 간세포에 의한 효소의 생성 및 분비는 혈청 내 이두로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 증가시켰고, 궁극적으로는 많은 체조직에서 리소좀 병리를 감소시켰다. 이는 질병의 임상 증상을 부분적으로만 교정하고 일반적으로 뇌 또는 체순환계에서 효과를 발휘하지만 둘 모두에서는 그렇지 않은 기존의 접근법에 비해 본 발명에 따른 벡터의 명백한 이점을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 AAV9 벡터에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 AAV9 벡터는 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 적어도 75%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 CAG 프로모터를 포함한다. 유리하게, 본 발명의 AAV9 벡터는 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 CAG 프로모터를 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 AAV9 벡터에 포함된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2와 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% 또는 90%의 동일성을 갖는다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 14의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열 서열번호 2를 포함하는 AAV9-CAG-hIDS(서열번호 4)이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 14의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열 서열번호 5를 포함하는 AAV9-CAG-ohIDS-버전1(서열번호 7)이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 14의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열 서열번호 8을 포함하는 AAV9-CAG-ohIDS-버전2(서열번호 10)이다.

상기한 본 발명의 재조합 벡터는 또한 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 HEK293 세포의 형질 감염에 의해 상기한 해당 플라스미드로부터 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 아데노-관련 바이러스 벡터 AAV, 특히 AAV9의 제조 방법을 제공한다. 공정은 다음 단계로 구성된다:

i) 제 1 AAV 말단 반복과 제 2 AAV 말단 반복 사이에 개재된 해당 단백질을 코딩하는 서열, 해당 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 제 1 플라스미드; AAV rep 유전자 및 AAV cap 유전자를 포함하는 제 2 벡터; 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 유전자를 포함하는 제 3 벡터를 제공하는 단계;

ii) 수용성 세포(competent cell)를 단계 i)의 벡터와 공-형질 감염시키는 단계;

iii) 바이러스 입자를 생성하기에 충분한 시간 동안 단계 ii)의 형질 감염된 세포를 배양하는 단계; 및

iv) 단계 iii)의 배양물로부터 벡터를 정제하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 제 1 벡터의 AAV 제 1 및 제 2 말단 반복은 AAV 혈청형 2로부터의 ITR이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 제 2 벡터의 AAV rep 유전자는 AAV 혈청형 2에서 유래한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 수용성 세포는 HEK293 세포이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 제 2 벡터의 AAV 캡 유전자는 AAV 혈청형 9에서 유래한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 플라스미드의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은,

i) 분해에 의해, 특히 MluI/EcoRI를 사용하여, 해당 단백질을 코딩하는 서열을 출발 플라스미드로부터 절단하는 단계;

ii) 해당 단백질을 코딩하는 서열을 AAV 골격 플라스미드 pAAV-CAG의 2 개의 제한 부위 사이에 클로닝함으로써, 해당 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 해당 플라스미드를 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의, 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드 또는 본원에 기재된 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드 또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함한다. 조성물은 또한 적어도 하나의 보조 물질을 포함할 수 있다. 보조 물질은 담체, 부형제, 용매, 희석제 또는 보조제 중에서 선택될 수 있다. 허용 가능한 담체, 희석제 또는 보조제는 비독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이며, 인산염, 구연산염 또는 다른 유기산과 같은 완충제; 항산화제; 저분자량 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 친수성 중합체; 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염 형성 반대이온(salt forming couterion); 및/또는 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(Pluronic F68®) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 비경구 투여의 예는 정맥내, 피하, 수조내 및 근육내 주사이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 정맥내 또는 수조내 투여에 적합하다. 이러한 비경구 투여에 적합한 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액, 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 유리하게, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보호된다.

인간 및 동물에 대한 투여량은 각각의 종에서 그 근거가 있는 요인 또는 나이, 성별, 체중 또는 질병의 정도 등과 같은 기타 요인에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드, 또는 본원에 기재된 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터의 치료 용도에 관한 것이다. 상기한 바와 같이, 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 또는 AAV 벡터, 특히 본원에 따른 AAV9 벡터는 없어진 IDS 효소의 발현을 가능하게 함으로써, GAG의 리소좀 축적을 교정한다. 이는 II형 점액다당류증(MPSII)의 모든 임상 징후를 교정할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드, 또는 본원에 기재된 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 인체에서 이두로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 증가시키기 위한 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드, 또는 본원에 기재된 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 II형 점액다당류증(MPSII)의 치료를 위한 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드, 또는 본원에 기재된 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터에 관한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 II형 점액다당류증(MPSII)의 치료에 유용한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드, 또는 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 본원에 기재된 적어도 하나의 분리된 뉴클레오티드 서열, 본원에 기재된 플라스미드, 또는 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 II형 점액다당류증(MPSII)의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 이두로네이트-2-설파타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 세포는 서열번호 1에 기재되어 있고 서열번호 2와 적어도 75% 동일성을 갖는, 유리하게는 서열번호 2와 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 분리된 세포에 포함된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2와 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% 또는 90%의 동일성을 갖는다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 서열번호 1의 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 서열번호 2를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 서열번호 1의 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 서열번호 5를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 서열번호 1의 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 서열번호 8을 포함한다.

다음 실시예는 본 발명의 특정 양태를 설명하기 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 제한되는 것으로 간주될 수 없다.

일반적인 절차

1. 재조합 AAV 벡터

본원에 기재된 AAV 벡터는 삼중 형질 감염에 의해 수득되었다. 벡터를 제조하는데 필요한 물질은 다음과 같다: (아데노바이러스 E1 유전자를 발현하는) HEK293 세포, 아데노바이러스 기능을 제공하는 헬퍼 플라스미드, 혈청형 2의 AAV rep 유전자 및 혈청형 9(AVV9)의 AVV cap 유전자를 제공하는 플라스미드, 및 마지막으로 AAV2 ITR을 갖는 골격 플라스미드 및 해당 구조체.

이두로네이트-2-설파타제-발현 AAV 벡터를 생성하기 위해, 인간 또는 쥐 이두로네이트-2-설파타제의 최적화되거나 최적화되지 않은 코딩 서열을 편재성 하이브리드 CAG 프로모터의 제어 하에 AAV 골격 플라스미드에 클로닝하였다. 대규모 플라스미드 제조는 EndoFree Plasmid Megaprep 키트(Qiagen)를 사용하여 수행하였다.

변형된 세 개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스가 없는 형질 감염에 의해 벡터를 생성하였다(Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998;5:938-945 및 Wright J, et al., Mol. Ther. 2005;12:171-178 참조). 10% FBS가 보충된 DMEM 내의 롤러 병(roller bottle, RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 세포를 70% 컨플루언스로 배양한 다음, 1) (상기한) 혈청형 2 AAV의 바이러스 ITR이 측면에 위치한 발현 카세트를 갖는 플라스미드: 2) AAV rep2 및 cap9 유전자를 갖는 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드로 공-형질 감염시켰다. 상기한 바와 같이 최적화된 프로토콜을 사용하여 두 개의 연속적인 염화세슘 구배로 벡터를 정제하였다(Ayuso E, et al., Gene Ther. 2010;17:503-510 참조). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하고, 여과하고, qPCR로 적정한 다음, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

본 발명의 벡터는 본 기술 분야에 공지된 분자 생물학 기술에 따라 제작되었다.

2. 동물

이두로네이트-2-설파타제-결핍 마우스(MPSII) 모델은 Taconic(Germantown, NY 12526 USA, Stock TF1838)에서 구입하였다. MPSII에 걸린 마우스와 건강한 대조군 마우스를 반접합성(hemizygous) 수컷과 이형접합성(heterozygous) 암컷 시조(founder)로부터 근친 교배시켰다. 유전자형은 표적 돌연변이를 포함하는 서열을 증폭시키는 말단-클립된(tail-clipped) 샘플로부터의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석에 의해 결정하였다. 각각의 센스 및 안티센스 프라이머의 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머: 5'-TTT TGT GTA CTC CAA CCC CG-3'(서열번호 15), 역방향 프라이머: 5'-TGT CTC CAT AAC AGC CCA GG-3'(서열번호 16), 역방향 프라이머 돌연변이: 5'-GCC CTC ACA TTG CCA AAG GA-3'(서열번호 17). 마우스는 표준 식이(Harlan, Tekland)를 무제한 제공받았고 12 시간의 명암 주기 하에 유지되었다(오전 9:00시 에 조명이 켜짐).

3. 마우스에 대한 IDS -코딩 플라스미드의 유체역학적 전달

pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2 플라스미드의 유체역학적 전달을 위해 3 개월 된 MPSII 동물 및 야생형 동물에 5 초 이내의 꼬리 정맥 주사를 통해 동물 체중의 10%에 해당하는 양인 총 용량 30 μg의 플라스미드를 투여하였다. 이 기술은 주로 간에서 플라스미드-인코딩 이식 유전자를 발현시킨다(Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66 참조). 대조군으로서 마우스 집단에 동일한 양의 식염수를 투여하였다. 마우스를 2 개의 집단으로 나누고, 플라스미드의 유체역학적 주사 후 48 시간 또는 1 주 뒤에 희생시켰다. 다음 섹션에서 설명한 바와 같이 장기를 채취하였다.

4. 마우스에 대한 벡터 투여

마우스에 AAV9-CAG-omIDS 벡터의 CSF-내 전달하기 위해, 2 개월 된 MPSII 동물의 대수조(cisterna magna)에 총 용량 5x10¹⁰ vg으로 주사하였다. 유사한 동물 집단에 5x10¹⁰ vg의 대조군 비-코딩(AAV9-널) 벡터를 주입하였다. 생후 6 개월 및 10 개월, 즉 벡터 투여 후 4 개월 및 8 개월 뒤에, 마우스를 마취시키고 조직을 채취하였다.

마우스에 야생형 hIDS 또는 IDS 코딩 서열의 최적화된 버전 중 어느 하나를 포함하는 AAV9 벡터를 정맥내 전달하기 위해, 3.5 개월 된 MPSII 동물의 꼬리 정맥에 총 용량 1x10¹⁰ vg의 벡터를 주사하였다. WT 및 미처리 MPSII 동물을 대조군으로 사용하였다. 벡터 투여 3 주 후에 마우스를 마취시키고 조직을 채취하였다.

5. 샘플 수집

희생시킬 때, 동물을 깊게 마취시킨 다음 조직으로부터 혈액을 완전히 제거하기 위해 12 ml의 PBS로 경심(transcardially) 관류하였다. 뇌 전체 및 다수의 체조직(간, 비장, 췌장, 신장, 폐, 심장, 골격근 및 고환, 방광, 내장 및 지방 조직을 포함)을 수집하여 액체 질소에서 냉동시키고 -80℃에 보관하거나 차후의 조직학적 분석을 위해 포르말린에 침지시켰다.

6. 이두로네이트 -2- 설파타제 활성 및 글리코사미노글리칸 정량화

뇌, 간, 폐 및 심장 샘플을 밀리-Q 워터에서 초음파 처리하였다. 혈청을 처리하지 않고 분석하였다. 이두로네이트-2-설파타제 활성은 상기한 바와 같이 4-메틸움벨리페론-유래 형광발생 기질(4-methylumbelliferone-derived fluorogenic substrate; Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL)을 사용하여 측정하였다(Voznyi et al., J Inher Metab Diss 2001;24:675-680 참조). 브래드포드 단백질 정량법(Bradford protein assay; Bio-Rad, Hercules, CA, US)을 사용하여 정량화된 단백질 총량에 대해 뇌, 간, 폐 및 심장 활성 수준을 정규화하였다. 혈청 활성은 부피에 대해 정규화되었다.

글리코사미노글리칸(GAG) 정량화를 위해, 조직 샘플을 칭량한 다음 프로테이나제 K로 분해시키고, 추출물을 원심 분리 및 여과에 의해 정화시켰다. GAG 수준은 콘드로이틴 4-설페이트를 표준으로 사용하여 Blyscan 황산화 글리코사미노글리칸 키트(Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB)로 조직 추출물에서 측정하였다. GAG의 수준은 습윤 조직 중량에 대해 정규화되었다.

7. 기타 리소좀 효소의 활성

뇌 및 간 샘플을 500 μl의 밀리-Q 워터에서 초음파 처리하고, 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로나이드(Glycosynth)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양한 15 μg의 단백질에서 IDUA 활성을 검정하였다(Bacter et al., Blood 2002;99(5)1857-9 참조). SGSH 활성은 상기한 바와 같이 측정하였다(상기 Karpova et al., J Inherit Metab Dis. 1996;19(3):278-285, Haurigot et al. 참조). 간단히 말해, 30 μg의 단백질을 4-MU-αGIcNS와 함께 47℃에서 17 시간 동안 처음 배양하였다. 두 번째 배양은 37℃에서 24 시간 동안 0.2% BSA에서 10U/ml의 α-글루코시다제(Sigma-Aldrich)의 존재 하에 수행하였다. NAGLU 활성의 경우, 30 μg의 조직 단백질 추출물을 상기한 바와 같이 4-메틸움벨리페릴-α-N-아세틸-D-글루코사미나이드(Moscerdam Substrates)와 함께 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다(Marsh et al., Clin Genet. 1985;27(3):258-62, Ribera et al. 참조). HGSNAT 활성은 아세틸코엔자임 A(Acetylcoenzyme A) 및 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코사민(MU-βGlcNH₂, Moscerdam Substrates)과 함께 37℃에서 17 시간 동안 배양한 단백질 추출물 30 μg에서 결정하였다(Voznyi et al., J Inh Metab Dis 1993;16:465-72 참조). 두 번째 단계는 Pi -완충액(0.9 M Na₂HPO₄/0.9 M NaH₂PO₄ 완충액, pH 4.3 + 0.02%(w/v) Na-아지드) 및 β-갈락토시다제(β-Gal-Ao, Sigma)를 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 혼합물을 배양하여 수행하였다(van Diggelen et al., Clin Chim Acta 1990;187:131-40 참조). GUSB 효소의 활성은 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(Sigma)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양한 단백질 추출물 10 μg에서 결정하였다. HEXB 활성은 0.1 μg의 단백질 추출물을 4-메틸움벨리페릴- N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(Sigma)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양하여 검정하였다. pH를 증가시켜 반응을 정지시킨 후, 방출된 형광을 FLx800 형광 측정기(BioTek Instruments)로 측정하였다. 브래드포드 단백질 정량법(Bio-Rad, Hercules, CA, US)을 사용하여 정량화된 단백질 총량에 대해 모든 뇌와 간 활성 수준을 정규화하였다.

8. 조직학적 분석

조직을 포르말린에서 12-24 시간 동안 고정시키고, 파라핀에 포매한 후 절단하였다. 뇌에서 LAMP2의 면역조직화학적 검출을 위해, 파라핀 절편에 대해 pH 6의 구연산염 완충액에서 열-유도 에피토프 회수(heat-induced epitope retrieval)를 수행한 후, 1:1500으로 희석한 래트 항-LAMP2 항체(Ab13524; Abcam, Cambridge, UK)와 함께 4℃에서 밤새 배양하고 나서, 1:300의 비오티닐화된 토끼 항-래트 항체(Dako, Glostrup, DK)와 함께 배양하였다. 뇌 샘플에서 GFAP 면역 염색을 위해, 파라핀 절편을 1:1000으로 희석한 토끼 항-GFAP 항체(Ab6673, Abcam, Cambridge, UK)와 함께 4℃에서 밤새 배양한 후 1:300의 비오티닐화된 염소 항-토끼 항체(31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 함께 배양하였다. ABC-퍼옥시다제 염색 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA, US)를 사용하여 절편을 1:100으로 배양하여 LAMP2 및 GFAP 신호를 증폭시켰고, 발색제(chromogen)로서 3,3-디아미노벤지딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)을 사용하여 시각화하였다.

뇌 샘플에서 미세아교세포를 염색하기 위해, 파라핀 절편을 1:100으로 희석한 BSI-B4 렉틴(L5391, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 발색제로서 3,3-디아미노벤지딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)을 사용하여 BSI-B4 신호를 시각화하였다. 명시야 영상(Brightfield image)은 광학 현미경(Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP)으로 획득하였다.

NIS Elements Advanced Research 2.20 소프트웨어를 사용하여, 모든 동물에 대해 동일한 신호 임계값을 설정하여 동물당 각각의 뇌 영역(원래 배율, × 20)의 3-4 개 이미지에서 LAMP2, GFAP, 및 BSI-B4 신호를 정량화하였다. 그리고 나서, 양성 면적, 즉 이미지 내의 전체 조직 면적에 대해 양성 신호를 갖는 픽셀 단위의 면적의 백분율을 계산하였다.

9. 조직 내 벡터 게놈 복제 수의 정량화

프로테이나제 K(0.2 mg/ml)에서 밤새 조직을 분해시킨 후, MasterPureDNA 정제 키트(Epicentre)를 사용하여 총 DNA를 분리하였다. HBB2 서열(폴리A 부분에 포함됨)에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용한 정량적 PCR을 사용하여 20 ng의 총 DNA에서 벡터 게놈 복제 수를 정량화하였다. 순방향 프라이머: 5'-CTT GAG CAT CTG ACT TCT GGC TAA T-3'(서열번호 18); 역방향 프라이머: 5'-GAT TTG CCC TCC CAT ATG TCC-3'(서열번호 19); 프로브: 5'-CCG AGT GAG AGA CAC AAA AAA TTC CAA CAC-3'(서열번호 20). 폴리 A 서열을 포함하는 선형화된 플라스미드의 연속 희석에 의해 작성된 기준 표준 곡선을 사용하여 vg/샘플의 최종 값을 보간하였다.

10. 오픈 필드 테스트

오전 9 시부터 오후 1시 사이에 수행한 오픈 필드 테스트에 의해 6 개월 된 마우스의 행동을 분석하였다. 마우스의 수평 및 수직 움직임을 감지하는 두 다발의 포토빔(photobeam, SedaCom32; Panlab)이 교차하는 밝게 조명된 챔버(41 x 41 x 30 cm)의 왼쪽 아래 구석에 동물을 배치하였다. 영역 표면을 중심부(14 x 14 cm), 주변부(27 x 27 cm) 및 경계부(41 x 41 cm)의 3 개의 사각형 동심 영역으로 나누었다. 비디오 추적 시스템(SmartJunior, Panlab)을 사용하여 테스트의 처음 3 분 동안 탐험 및 운동 활동을 기록하였다.

11. 통계 분석

모든 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 이루어졌다. 대조군과 처리군 간의 여러 비교는 던넷 사후 검증(Dunnett’s post test)을 사용하여 이루어졌고, 터키 사후 검정(Tukey’s post test)을 사용하여 모든 그룹 간의 비교가 이루어졌다. 통계적 유의성은 P < 0.05인 경우로 하였다. 카플란-마이어 곡선을 사용하여 생존율을 예측하였고, 비교를 위해 로그-순위 검정(log-rank test)을 사용하였다.

실시예

실시예 1: pAAV - CAG - hIDS 의 제작

인간 이두로네이트-2-설파타제에 대한 CDS를 출발 물질(NCBI 참조 서열: NM_000202.6)로 이용하고 이를 위해 화학적으로 합성하였다(GenScript Inc). SwaI 제한 부위가 측면에 위치한 플라스미드 pUC57(AmpR) 내에 CDS를 클로닝하였다.

SwaI-SwaI 인간 이두로네이트-2-설파타제 CDS 단편을 pUC57 플라스미드로부터 절단하고, 이어서 5' 및 3' 오버행(overhang)을 클레나우 단편(Klenow fragment)(Fermentas)으로 평활화시킨 후 AAV 골격 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 및 EcoRI 제한 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-hIDS(수탁 번호 DSM 29866)로 명명하였다(도 1A 및 서열번호 3 참조).

pAAV-CAG 플라스미드는 사전에 생성하였고, 이는 AAV2 게놈, CAG 프로모터 및 토끼 β-글로빈으로부터의 폴리A 신호뿐만 아니라 해당 CDS의 클로닝을 위한 다중 클로닝 부위로부터의 ITR을 포함하였다. CAG 프로모터는 CMV 초기/중간 인핸서 인자 및 닭 β-액틴 프로모터로 구성된 하이브리드 프로모터이다. 이 프로모터는 편재하여 강한 발현을 유도할 수 있다(Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998;244:367-369, Huang J et al., J Gene Med. 2003;5:900-908, Liu Y et al., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175 참조).

실시예 2: pAAV - CAG - ohIDS - 버전1의 제작

인간 이두로네이트-2-설파타제 cDNA 서열(ohids)의 최적화된 버전을 포함하는 발현 카세트를 설계하고 제조하였다. RNA 안정성 증가를 위해 잠재 스플라이스 부위 및 RNA 불안정화 서열 요소의 제거, RNA 안정화 서열 요소의 첨가, 코돈 최적화 및 G/C 함량 적응화, 다른 변화 중에서도 안정한 RNA 2차 구조의 회피를 통해 인간에서의 이두로네이트-2-설파타제 단백질 생산의 효율을 최대화하기 위해 서열 최적화를 수행하였다. 인간 이두로네이트-2-설파타제(NCBI 참조 서열: NM_000202.6)에 대한 CDS를 서열 최적화의 출발점으로 사용하였다(DNA 2.0 Inc). 최적화된 CDS는 각각 5' 및 3'에 MluI 및 EcoRI 제한 부위가 위치한 플라스미드 pJ204: 191476(AmpR) 내에 클로닝되었다.

MluI/EcoRI 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 CDS 단편을 pJ204: 191476 플라스미드로부터 절단하고, 이어서 AAV 골격 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 및 EcoRI 제한 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-ohIDS-버전1(수탁 번호 DSM 29867)로 명명하였다(도 2A 및 서열번호 6 참조).

실시예 3: pAAV - CAG - ohIDS - 버전2의 제작

인간 이두로네이트-2-설파타제(NCBI Reference Sequence: NM_000202.6)에 대한 CDS에 서열 최적화(GeneScript Inc)를 적용하였다. 최적화된 CDS는 각각 5' 및 3'에 MluI 및 EcoRI 제한 부위가 위치한 플라스미드 pUC57(AmpR) 내에 클로닝되었다.

pUC57-ohIDS 플라스미드를 MluI 및 EcoRI로 분해하여, 최적화된 이두로네이트-2-설파 타제 CDS를 절단하였다. 이어서, pAAV-CAG 골격 플라스미드의 동일한 제한 효소 부위 사이에 이 단편을 클로닝하여 pAAV-CAG-ohIDS-버전2 플라스미드(수탁 번호 DSM 29868)를 생성하였다(도 3A 및 서열번호 9 참조).

실시예 4: pAAV - CAG - omIDS 의 제작

쥐 이두로네이트-2-설파타제(NCBI 참조 서열: NM_010498.3)에 대한 CDS에 서열 최적화(GeneArt; Life Technologies)를 적용하였다. 최적화된 CDS는 각각 5' 및 3'에 MluI 및 EcoRI 제한 부위가 위치한 플라스미드 pMA-RQ(AmpR) 내에 클로닝되었다.

MluI/EcoRI 최적화 쥐 이두로네이트-2-설파타제 CDS 단편(서열번호 11)을 pMA-RQ 플라스미드로부터 절단하고, 이어서 AAV 골격 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 및 EcoRI 제한 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-omIDS로 명명하였다(도 4A 및 서열번호 12 참조).

실시예 5: AAV9 - CAG - hIDS 의 제조

변형된 3 개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스가 없는 형질 감염에 의해 벡터 AAV9-CAG-hIDS(서열번호 4)를 생성하였다(Matsushita et al., Gene Ther. 1998;5(7):938-45, Wright et al., Mol Ther. 2005;12(1)171-8 참조). 10% FBS가 보충된 DMEM 내의 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 컨플루언스까지 세포를 배양한 다음, 1) AAV2 ITR(pAAV)이 측면에 위치한 발현 카세트를 갖는 플라스미드; 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자(pREP2CAP9)를 갖는 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드로 공-형질 감염시켰다. 상기한 바와 같이 최적화된 프로토콜을 사용하여 두 개의 연속적인 염화세슘 구배로 벡터를 정제하였다(Ayuso et al., Gene Ther. 2010;17(4):503-10 참조). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하고, 여과하고, qPCR로 적정한 다음, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다(도 1B 참조).

실시예 6: AAV9 - CAG - ohIDS - 버전1의 제조

변형된 3 개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스가 없는 형질 감염에 의해 벡터 AAV9-CAG-ohIDS-버전1(서열번호 7)을 생성하였다(상기 Matsushita et al., 및 Wright et al. 참조). 10% FBS가 보충된 DMEM 내의 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 컨플루언스까지 세포를 배양한 다음, 1) AAV2 ITR(pAAV-CAG-ohIDS-버전1)이 측면에 위치한 발현 카세트를 갖는 플라스미드; 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자(pREP2CAP9)를 갖는 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드로 공-형질 감염시켰다. 상기한 바와 같이 최적화된 프로토콜을 사용하여 두 개의 연속적인 염화세슘 구배로 벡터를 정제하였다(상기 Ayuso et al. 참조). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하고, 여과하고, qPCR로 적정한 다음, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다(도 2B 참조).

실시예 7: AAV9 - CAG - ohIDS - 버전2의 제조

변형된 3 개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스가 없는 형질 감염에 의해 벡터 AAV9-CAG-ohIDS-버전2(서열번호 10)를 생성하였다(상기 Matsushita et al., 및 Wright et al. 참조). 10% FBS가 보충된 DMEM 내의 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 컨플루언스까지 세포를 배양한 다음, 1) AAV2 ITR(pAAV-CAG-ohIDS-버전2)이 측면에 위치한 발현 카세트를 갖는 플라스미드; 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자(pREP2CAP9)를 갖는 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드로 공-형질 감염시켰다. 상기한 바와 같이 최적화된 프로토콜을 사용하여 두 개의 연속적인 염화세슘 구배로 벡터를 정제하였다(상기 Ayuso et al. 참조). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하고, 여과하고, qPCR로 적정한 다음, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다(도 3B 참조).

실시예 8: AAV9 - CAG - omIDS 의 제조

변형된 3 개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스가 없는 형질 감염에 의해 벡터 AAV9-CAG-ohIDS(서열번호 13)를 생성하였다(상기 Matsushita et al., 및 Wright et al. 참조). 10% FBS가 보충된 DMEM 내의 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 컨플루언스까지 세포를 배양한 다음, 1) AAV2 ITR(pAAV-CAG-omIDS)이 측면에 위치한 발현 카세트를 갖는 플라스미드; 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자(pREP2CAP9)를 갖는 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드로 공-형질 감염시켰다. 상기한 바와 같이 최적화된 프로토콜을 사용하여 두 개의 연속적인 염화세슘 구배로 벡터를 정제하였다(상기 Ayuso et al. 참조). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하고, 여과하고, qPCR로 적정한 다음, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다(도 4B 참조).

실시예 9: 건강한 마우스에 대한 pAAV - CAG - hIDS , pAAV - CAG - ohIDS - 버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2의 유체역학적 주사

상이한 버전의 이두로네이트-2-설파타제 발현 카세트를 포함하는 총 용량 30 μg의 플라스미드 pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2를 유체역학적 꼬리 정맥 주사를 통해 2 개월 된 WT 마우스에 투여하였다. 이 기술은 간에 전달된 플라스미드의 발현을 표적으로 한다(Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66 참조).

플라스미드 전달 후 48 시간 뒤에, 이두로네이트-2-설파타제 코딩 플라스미드를 투여한 모든 동물의 간과 혈청에서 이두로네이트-2-설파타제 활성의 기저 수준 이상으로 상당한 증가가 기록되었다. 간과 혈청 모두에서, 이두로네이트-2-설파타제 유전자의 최적화된 버전을 포함하는 발현 카세트로 달성한 활성 수준은 야생형 유전자를 통해 수득된 것보다 높았다. 또한, 혈청에서, pAAV-CAG-ohIDS-버전2 플라스미드를 투여 받은 동물은 다른 2 개의 플라스미드로 기록된 것보다 통계적으로 더 높은 이두로네이트-2-설파타제 활성 수준을 나타냈다(도 5A 및 도 5B 참조).

실시예 10: 마우스에 대한 pAAV - CAG - hIDS , pAAV - CAG - ohIDS - 버전1 및 pAAV -CAG-ohIDS-버전2의 유체역학적 주사

상이한 버전의 이두로네이트-2-설파타제 발현 카세트를 포함하는 총 용량 30 μg의 플라스미드 pAAV-CAG-hIDS, pAAV-CAG-ohIDS-버전1 및 pAAV-CAG-ohIDS-버전2를 유체역학적 꼬리 정맥 주사를 통해 3 개월 된 MPSII에 걸린 마우스에 투여하였다.

플라스미드 전달 후 1 주 뒤에 조직을 채취하였다. 3 개의 모든 이두로네이트-2-설파타제-함유 플라스미드는 식염수 주입을 받은 MPSII 동물에 대하여 이두로네이트-2-설파타제 활성의 상당한 증가를 이루어냈고; 활성은 간에서 WT 수준의 1200% 내지 2200% 범위였고 혈청에서 WT의 2000% 내지 5700% 범위였다. 이두로네이트-2-설파타제 유전자의 코돈-최적화된 버전을 포함하는 발현 카세트로 달성된 활성 수준은 야생형 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 달성된 것보다 통계적으로 더 높았다(도 6A 및 도 6B 참조).

간과 혈청에서 기록된 이두로네이트-2-설파 타제 활성의 높은 수준과 일관되게, GAG 함량은 모든 플라스미드 구조체로 분석한 모든 조직에서 완전히 정상화되었다(도 6C 참조).

실시예 11: MPSII 마우스에 대한 AAV9 - CAG - hIDS , AAV9 - CAG - ohIDS - 버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2의 정맥내 전달

MPSII 마우스(생후 3.5 개월)에 야생형 또는 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열을 포함하는 AAV9 벡터 1x10¹⁰ vg를 꼬리 정맥을 통한 정맥내 주사로 투여하였다. 동일 연령의 WT 및 미처리 MPSII 마우스의 별도의 집단을 대조군으로 사용하였다. 치료 후 3 주 뒤에, 동물을 희생시키고 혈액 및 간 샘플을 수집하고 분석하였다.

1x10¹⁰ vg/마우스 용량의 AAV9 벡터의 정맥내 투여는 주로 간으로의 이식 유전자 발현을 표적으로 한다(Wu et al., Mol. Ther. 2006; 14(3):316-27, Inagaki et al., Mol. Ther. 2006; 14(1):45-33 참조). 이두로네이트-2-설파타제의 활성을 벡터 전달 후 3 주 뒤에 간 추출물에서 측정한 결과, 임의의 인간 IDS-코딩 벡터를 투여 받은 MPSII 수컷에서 효소 활성의 명확한 증가가 기록되었다(도 7A 참조). 그러나, 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열(AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2)을 포함하는 AAV9 벡터를 투여 받은 MPSII 동물의 경우 이러한 증가는 유의하게 더 높았다. 야생형 서열을 갖는 벡터를 투여 받은 동물에서 달성된 이두로네이트-2-설파타제 활성의 수준은 건강한 WT 동물에서 관찰된 것의 대략 두 배였다(도 7A 참조). 최적화된 인간 IDS 서열을 포함하는 벡터로 인해, 이두로네이트-2-설파타제 활성의 수준은 건강한 동물 또는 야생형 IDS 서열을 포함하는 벡터로 처리한 MPSII 동물에서 관찰된 것보다 수 배 더 높았다(도 7A 참조).

이두로네이트-2-설파타제는 분비 가능한 리소좀 효소이며, 간에서의 이의 발현은 순환하는 효소의 원천이다(상기 Haurigot et al. 참조). 간 추출물에서 관찰된 것과 유사하게, 최적화된 인간 IDS 서열을 포함하는 AAV9 벡터로 처리한 MPSII 동물의 순환계에서 달성된 이두로네이트-2-설파타제 활성의 수준은 건강한 동물 또는 야생형 인간 IDS 서열을 포함하는 벡터로 처리한 MPSII 동물에서 관찰된 것보다 수 배 더 높았다(도 7B 참조).

간과 혈청에서 기록된 이두로네이트-2-설파 타제 활성의 높은 수준과 일관되게, GAG 함량은 AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2로 처리한 MPSII 마우스 간에서 완전히 정상화되었다. GAG 수준은 그러나 야생형 IDS 코딩 서열을 갖는 AAV9 벡터의 동일한 용량으로 처리한 동물의 간에서 부분적으로만 감소되었다(도 7C 참조).

실시예 12: MPSII 마우스에 대한 AAV9 - CAG - hIDS , AAV9 - CAG - ohIDS - 버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전 2의 수조내 전달

2 개월 된 MPSII 마우스에 야생형 또는 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열을 포함하는 AAV9 벡터 5x10¹⁰ vg를 5 μl의 총 부피로 수조내 주사로 투여하였다. 동일 연령의 WT, 미처리 MPSII 마우스 및 5x1010 vg의 비-코딩 벡터(AAV9-CAG-널)를 투여 받은 MPSII 마우스의 별도의 집단을 대조군으로 사용하였다. 생후 3.5 개월에, 즉 치료 후 1.5 주 뒤에, 동물을 희생시키고 샘플을 수집하고 분석하였다.

이두로네이트-2-설파타제의 활성을 뇌 추출물에서 측정한 결과, 임의의 인간 IDS-코딩 벡터를 투여 받은 MPSII 수컷에서 효소 활성의 명확한 증가가 기록되었다(도 8A 참조). 그러나, 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열(AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2)을 포함하는 AAV9 벡터를 투여 받은 MPSII 동물의 경우 이러한 증가는 야생형 IDS 서열을 포함하는 벡터로 처리한 MPSII 동물에 비해 수 배 더 높았다(도 8A 참조). 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열을 갖는 벡터를 투여한 동물에서 달성된 이두로네이트-2-설파타제 활성의 수준은 WT만큼 거의 높았고, 심지어는 더 높았으며; 뇌의 가장 앞쪽 부분(섹션 I)에서, 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열을 포함하는 벡터로부터 유도된 IDS 활성은 WT 수준의 거의 두 배였다(도 8A 참조).

뇌 전체에 걸쳐 IDS 활성이 증가함에 따라, GAG 함량의 유의한 감소로 나타난 바와 같이, 처리된 MPSII 마우스의 뇌에서 질병의 특성을 나타내는 기질의 축적이 교정되었다(도 8B 참조). 야생형 IDS 서열을 포함하는 벡터로부터 유도된 IDS의 발현 효과가 명백하지 않은 섹션 V를 제외하고, 분석된 모든 영역의 모든 구조체에서 GAG 수준의 완전한 정상화가 관찰되었다(도 8B 참조).

CSF에 투여된 AAV9 벡터는 주변으로 누출되어 간으로 형질 도입된다(Haurigot et al., Clin Invest. 2013;123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014;24(7):2078-2095 참조). 따라서, 임의의 인간 IDS-코딩 벡터로 처리한 MPSII 마우스의 간과 혈청에서 이두로네이트-2-설파타제 활성의 증가가 기록되었다(도 9A 및 도 9B 참조). 다시, 최적화된 인간 이두로네이트-2-설파타제 서열(AAV9-CAG-ohIDS-버전1 및 AAV9-CAG-ohIDS-버전2)을 포함하는 AAV9 벡터를 투여 받은 MPSII 동물의 경우 이러한 증가는 야생형 IDS 서열을 포함하는 벡터로 처리한 MPSII 동물에 비해 유의하게 더 높았다(도 9A 및 도 9B 참조). 치료 효능을 다양한 체기관에서의 GAG 함량의 정량화를 통해 평가한 결과, 임의의 최적화된 인간 IDS-코딩 벡터로 처리한 MPSII 마우스의 모든 조직에서 GAG 수준의 완전 정상화가 관찰되었다(도 9C 참조). 그러나, 야생형 인간 IDS 서열을 투여 받은 MPSII 마우스는 간, 심장, 폐 및 비장에서 GAG 함량의 완전 정상화를 보였으나, 고환, 신장, 방광 및 지방 조직에서 부분적인 교정만을 보였다(도 9C 참조).

실시예 13: AAV9 - CAG - omIDS 의 수조내 전달

AAV9-CAG-omIDS 벡터의 총 용량 5x10¹⁰의 벡터 게놈을 2 개월 된 MPSII 동물의 대수조에 5 μl의 총 부피로 주입하였다. 먼저, 생후 6 개월, 즉 벡터 투여 후 4 개월 뒤에 마우스를 분석하였다. AAV9-CAG-omIDS 벡터의 CSF-내 전달은 분석된 모든 뇌 영역에서 이두로네이트-2-설파타제 활성의 회복을 유도하여, 건강한 동물의 다른 영역에서 관찰된 수준의 평균 40%에 달하였다(도 10A 참조). 벡터 전달 후 4 개월 뒤에, 분석된 모든 뇌 영역에서 GAG 함량의 정상화로 나타난 바와 같이, 질환의 특징인 기질 축적이 처리된 MPSII 마우스의 뇌에서 완전히 복귀되었다(도 10B 참조). 마찬가지로, 리소좀 마커 LAMP2의 면역 검출에 대한 신호 강도의 정량화로 나타난 바와 같이, 리소좀 구획의 크기가 완전히 정상화되었다. LAMP2 신호는 리소좀 구획의 크기에 비례하고, 이는 분해되지 않고 축적된 헤파린과 데르마탄 설페이트의 양에 의존한다(도 11A 참조). 또한, 리소좀 팽창에 대한 치료 효과는 AAV9-CAG-omIDS 전달 후 8 개월 뒤에 안정적으로 유지되었고, 치료의 장기간 효능을 나타냈다(도 12 참조).

분해되지 않은 기질의 축적으로 인한 정상적인 리소좀 항상성의 파괴는 돌연변이에 의해 직접 영향을 받는 것과는 다른 기타 리소좀 효소의 활성을 변화시킬 수 있다(Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014;doi: 10.1093/hmg/ddu727 참조). 미처리 MPSII 마우스 또는 대조군 "널(Null)" 벡터로 처리한 MPSII 마우스의 뇌에서, IDUA(이두로니다제, 알파-L-), SGSH(N-설포글루코사민 설포하이드롤라제, NAGLU(N-아세틸글루코사미니다제, 알파), HGSNAT(헤파린-알파-글루코사미나이드N-아세틸트랜스퍼라제), GALNS(갈락토사민(N-아세틸)-6-설파타제), GUSB(글루쿠로니다제, 베타), HEXB(헥소사미니다제 B)의 활성이 변하였지만, AAV9-CAG-omIDS로 처리한 결과, 건강한 WT 동물에서 관찰된 수준으로 활성이 회복되었고, 이는 벡터가 리소좀 항상성을 회복시킬 수 있음을 시사한다(도 11B 참조).

리소좀 병리의 교정에 따라, 처리된 MPSII 마우스의 뇌에서 염증의 모든 징후가 사라졌다. 치료 후 4 개월 뒤에, 별아교세포증(GFAP)과 미세아교세포증(BSI-B4)을 검출하기 위해 사용된 염색의 신호 강도는, 신경 염증의 마커의 명확한 상향 조절을 보여주는 대조군 "널" AAV9 벡터를 투여한 MPSII 마우스에서 기록된 신호와는 대조적으로, 처리된 MPSII 마우스 및 건강한 동물의 다양한 뇌 영역에서 비슷하였다(도 13A 및 도 13B 참조). 또한, 생후 10 개월, 즉 유전자 전달 후 8 개월 뒤에, GFAP 및 BSI-B4에 대한 염색을 통해 평가한 신경 염증에 대한 AAV9-CAG-omIDS 처리의 유익한 영향이 지속되었고 이는 신경 염증의 장기적인 박멸 가능성을 보여주었다(도 14A 및 도 14B 참조).

CSF에 투여된 AAV9 벡터는 주변으로 누출되어 간으로 형질 도입된다(Haurigot et al., Clin Invest. 2013;123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014;doi: 10.1093/hmg/ddu727 참조). 따라서, 이두로네이트-2-설파타제 활성의 증가는 AAV9-CAG-omIDS로 처리한 MPSII 마우스의 간과 혈청에서의 유전자 전달 후 4 개월 뒤에 기록되었으며, 각각 건강한 동물에서 관찰된 수준의 대략 1700% 및 700% 수준에 도달하였다(도 15A 및 도 15B 참조). 치료의 신체 효능을 다양한 기관의 GAG 함량을 정량화하여 평가한 결과, GAG의 50% 이상의 감소가 관찰된 신장 및 방광을 제외하고, 간, 심장, 폐, 고환, 비장 및 지방 조직을 포함하는 대부분의 조직에서 완전 정상화가 관찰되었다(도 15C 참조).

치료 후 4 개월 뒤에, IDS 활성이 또한 폐에서 증가하였으며 특히 심장에서 높았다(도 16A 및 도 16B를 참조). 이들 두 기관인 폐와 심장은 벡터 게놈 복사 수/이배체 게놈의 매우 낮은 값을 나타내었고, 이는 5x10¹⁰ vg 용량으로 AAV9-CAG-omIDS를 CSF-내에 전달한 후 이들 기관의 효율적인 형질 도입이 부족한 것을 나타낸다(도 16C 참조). 이러한 발견은 순환계에서의 IDS의 흡수에 의한 IDS 결핍의 교차 보정을 시사한다.

GAG 함량 데이터와 일관되게, 생후 2 개월에 AAV9-CAG-omIDS로 처리한 6 개월 된 MPSII 마우스에서 간의 무게가 정상화되었다(도 17A 참조). MPSII 마우스에서 리소좀 병리에 대응하기 위한 CSF-내 AAV9-CAG-omIDS 처리의 가능성에 대한 추가적인 입증은 간 추출물에서 기타 리소좀 효소의 활성 측정에 의해 제공되었다. IDUA, SGSH, NAGLU, HGSNAT, GALNS, GUSB, HEXB 는 미처리 MPSII 마우스 또는 대조군 "널" 벡터로 처리한 MPSII 마우스에서 WT 수준에 비해 상당히 변하였다. AAV9-CAG-omIDS의 처리는 모든 효소의 활성을 완전히 정상화시켰다(도 17B 참조). 게다가, 혈청 HEXB 활성은 또한 리소좀 병리학적 결과로서 증가하고, AAV9-CAG-omIDS 처리 후에 완전히 정상화되었고(도 17C 참조), 이는 리소좀 기능의 전신 교정의 근거를 제시한다.

AAV9-CAG-omIDS의 CSF-내 투여가 행동에 미치는 영향은 미지의 환경에서 마우스의 일반적인 이동 및 탐색 활동을 평가하는 오픈 필드 테스트로 생후 6 개월에 평가하였다. 미처리 및 AAV9-널-처리 MPSII 마우스는 중심부 및 주변부에서 소비된 시간, 중심부 및 주변부에서의 입장 수 및 빠른 움직임의 총 수와 관련하여 건강한 마우스와 비교해 감소된 탐색 활동을 나타내었다. AAV9-CAG-omIDS의 수조내 투여는 MPSII 마우스에서 행동 결핍을 완전히 교정하였다(도 18A 내지 도 18F 참조).

마지막으로, CSF-내 AAV9-CAG-omIDS 처리의 치료 효능은 미처리 및 처리 MPSII 마우스의 생존을 비교함으로써 평가하였다. AAV9-CAG-omIDS 유전자 치료는 MPSII 마우스의 수명을 상당히 연장시켰다(도 19 참조). 생후 17 개월에 모든 미처리 또는 AAV9-CAG-널 처리 MPSII 마우스가 사망한 반면, AAV9-CAG-omIDS 처리를 투여 받은 받는 MPSII 마우스의 76%가 생존하였다. 또한, 처리 동물의 65%는 생후 22 개월에도 생존하였다. 이 연령에 생존한 야생형 동물의 비율은 79%이다(도 19 참조).

실시예 14: 다양한 용량의 AAV9 - CAG - omIDS 의 수조내 전달: 용량-반응 연구

AAV9-CAG-omIDS 벡터의 4 가지 용량(1.58x10⁹, 5x10⁹, 1.58x10¹⁰ 및 5x10¹⁰ vg/마우스)을 5 μl의 총 부피로 수조내 주사를 통해 2 개월 된 MPSII 동물에 투여하였다.

벡터 투여 후 한달 반 뒤에, 동물을 희생시키고 조직을 채취하였다. 이두로네이트-2-설파타제 활성은 뇌의 다양한 부분에서 측정하였다(섹션 I 내지 섹션 V). 활성은 용량에 따라 증가하였고, 다양한 영역에서 WT 활성의 0.8% 내재 53%에 이르렀다(도 20A 참조). GAG 저장에 대한 치료 효과를 분석할 때 유사한 용량-반응이 관찰되었다. 그러나, GAG 축적의 완전한 교정은 1.58x10¹⁰ 및 5x10¹⁰ vg/마우스의 두 가지 가장 높은 용량에서만 기록되었다(도 20B 참조).

간장과 혈청에서, 활성은 용량에 따라 증가하였고, 간에서 20% 내지 4300%, 혈청에서 0.4% 내지 1100%에 이르렀다. 두 가지 가장 낮은 용량(1.58x10⁹, 5x10⁹ vg/마우스)에서 혈청에서 IDS 활성이 검출되지 않았다(도 21A 및 도 21B 참조). 활성 데이터와 일관되게, 말초 조직에서 GAG 함량을 측정한 결과 간, 심장, 폐, 고환, 비장, 신장, 방광 및 지방 조직에서 GAG 함량의 용량-반응 감소를 입증하였다. 70% 이상 감소가 기록된 간과 방광 및 대략 50% 감소가 관찰된 신장을 제외하고, 대부분의 조직에서 두 가지 가장 높은 용량(1.58x10¹⁰ 및 5x10¹⁰ vg/마우스)에서 GAG 수준의 완전한 또는 거의 완전한 정상화가 달성되었다(도 21C 참조).

SEQUENCE LISTING <110> LABORATORIOS DEL DR. ESTEVE, S.A. <120> ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR THE TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSES <130> PCT2212.6 <150> EP15382297 <151> 2015-06-05 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 550 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser 20 25 30 Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg 35 40 45 Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile 50 55 60 Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln 65 70 75 80 Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His 100 105 110 Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr 115 120 125 Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn 130 135 140 His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro 145 150 155 160 Ser Ser Glu Lys 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Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe 370 375 380 Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu 385 390 395 400 Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu 405 410 415 Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys 420 425 430 Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu 435 440 445 Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser 450 455 460 Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro 465 470 475 480 Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp 485 490 495 Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala 500 505 510 Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp 515 520 525 Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu 530 535 540 Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 <210> 2 <211> 1653 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60 tgcgtcgccc 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gctcacaaat accactgaga 3720 tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc 3780 tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 3840 actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 3900 gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 3960 tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 4020 ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 4080 attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 4140 agctgtccct cttctcttat ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag 4200 catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct 4260 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4320 agcgagcgcg cag 4333 <210> 14 <211> 646 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAG promoter <400> 14 actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgg 646 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 15 ttttgtgtac tccaaccccg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 16 tgtctgcata acagcccagg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Mutation <400> 17 gccctcacat tgccaaagga 20

Claims

서열번호 1에 기재된 단백질 이두로네이트-2-설파타제(IDS)를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5 또는 서열번호 8인 것을 특징으로하는, 분리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드.
제2항에 있어서,
서열번호 6에 기재된, 수탁 번호가 DSM 29867인 pAAV-CAG-ohIDS-버전1 인 플라스미드.
제2항에 있어서,
서열번호 9에 기재된, 수탁 번호가 DSM 29868인 pAAV-CAG-ohIDS-버전2 인 플라스미드.
제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
상기 벡터는 혈청형 9(AAV9)의 아데노-관련 바이러스 벡터인, 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
폴리뉴클레오티드는 서열번호 14에 기재된 CAG 프로모터에 연결된, 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
서열번호 14의 CAG 프로모터에 연결된 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9-CAG-ohIDS-버전1인 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
서열번호 14의 CAG 프로모터에 연결된 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9-CAG-ohIDS-버전2인 재조합 벡터.
치료적 유효량의 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제2항에 따른 플라스미드 또는 제5항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 II형 점액다당류증의 치료용 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
정맥내 또는 수조내 투여를 위한 약학적 조성물.
제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제2항에 따른 플라스미드 또는 제5항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 이두로네이트-2-설파타제 활성 증가용 조성물.
제5항에서 정의된 벡터를 제조하는 방법으로서,
i) 제 1 AAV 말단 반복과 제 2 AAV 말단 반복 사이에 개재된 해당 단백질을 코딩하는 서열, 해당 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 제 1 벡터; AAV rep 유전자 및 혈청형 9의 AAV cap 유전자를 포함하는 제 2 벡터; 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 유전자를 포함하는 제 3 벡터를 제공하는 단계;
ii) 수용성 세포(competent cell)를 단계 i)의 벡터와 공-형질 감염시키는 단계;
iii) 단계 ii)의 형질 감염된 세포를 배양하는 단계; 및
iv) 단계 iii)의 배양물로부터 벡터를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
제2항에 따른 플라스미드의 제조 방법으로서,
i) 분해에 의해, 특히 MluI/EcoRI를 사용하여, 해당 단백질을 코딩하는 서열을 출발 플라스미드로부터 절단하는 단계;
ii) 해당 단백질을 코딩하는 서열을 AAV 골격 플라스미드 pAAV-CAG의 2 개의 제한 부위 사이에 클로닝함으로써, 해당 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 해당 플라스미드를 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법.
제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
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