JP7449223B2 - ムコ多糖症ii型を治療するための遺伝子療法 - Google Patents
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Description
本発明は、ハンター症候群としても知られているムコ多糖症II型(MPSII)を治療するための遺伝子療法アプローチに関する。
PSIIを有するすべての患者において、白質病変、空洞肥大、および脳萎縮を含む全般的な脳の異常を明らかにする。
内注射により投与可能である。ある実施形態では、rAAV9.hIDSは、約6.5x1010GC/g脳質量の用量で髄腔内注射により投与可能である。
量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、1.3×1011GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、1.8×1011GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、2.15×1011GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、5.5×1011GC/g脳質量である。
Neurol、1978 Oct;4(4):345-56を参照されたい。
Toddler Development、Third Ed.、BSID-IIIのBayleyスケールにより測定されることができる。神経認知および適応的行動学的評価(例えば、乳幼児発達のBayleyスケールおよびVineland適応行動スケールをそれぞれ用いて)が実施されることができる。
位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの2つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコーディング配列の発現を導くように配置された1つの遺伝子からのプロモータを有する。故に、コーディング配列に関しては、プロモータは、異種性である。
遺伝子産物をコードするAAV配列を欠失している。
(i)rAAVゲノムコピー(GC)力価は、少なくとも1.0x1013GC/mLである、
(ii)rAAVエンプティ/フル粒子比は、SDS-PAGE分析により測定されるように(実施例5Dを参照されたい)、0.01~0.05(エンプティカプシドを95%~99%含まない)、他の実施形態では、本明細書で提供されるrAAV9.hIDSは、エンプティカプシドを少なくとも約80%、少なくとも約85%、または少なくとも約90%含まない、および/または
(iii)少なくとも約4x108GC/g脳質量~約4x1011GC/g脳質量の用量のrAAV懸濁液は、効力を有する。
CNS指向遺伝子療法により、患者の欠損イズロン酸-2-スルファターゼを機能的に置換することである。本明細書に記載のrAAVベクターから発現されるとき、CSF、血清、ニューロン、または他の組織中で検出される少なくとも約2%の発現レベルは、治療的効果を提供してもよい。しかし、より高い発現レベルが成し遂げられ得る。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトIDSレベルの2%~約100%であり得る。ある実施形態では、正常な発現レベルより高いレベルが、CSF、血清、または他の組織中で検出され得る。
5.1.1.発現カセット
配列番号1のヌクレオチド配列を有することを特徴とするhIDS遺伝子(CCDS14685.1)を含有する発現カセットを含むAAVベクターが提供される。この配列は、Genbank NP000193.1をコードする公開された遺伝子配列であり、本明細書には配列番号2として含まれている。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号1に少なくとも約75%同一なヌクレオチド配列を有することを特徴とするhIDS遺伝子を含有し、機能的ヒトイズロン酸-2-スルファターゼをコードする。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号1に少なくとも約80%同一なヌクレオチド配列を有することを特徴とするhIDS遺伝子を含有し、機能的ヒトイズロン酸-2-スルファターゼをコードする。別の実施形態では、配列は、配列番号1に少なくとも約85%同一であるか、または配列番号1に少なくとも約90%同一であり、機能的ヒトイズロン酸-2-スルファターゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号1に少なくとも約95%同一であるか、配列番号1に少なくとも約97%同一であるか、または配列番号1に少なくとも約99%同一であり、機能的ヒトイズロン酸-2-スルファターゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号1に少なくとも約77%同一である。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号11のnt1937~nt3589としても示されている、配列番号8のnt1177~nt2829のhIDSコーディング配列を含有する。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号8のnt1177~nt2829(配列番号11のnt1937~nt3589としても示されている)に少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、または約99%同一であるhIDSコーディング配列を含有する。
ル)ペプチドに対応するプレプロタンパク質配列番号2の初めの25アミノ酸のすべてまたは一部が異種性リーダーペプチドで置換されている合成アミノ酸配列を含んでもよい。例えば、インターロイキン-2(IL-2)またはオンコスタチンからのリーダーペプチドなどのこのリーダーペプチドは、循環へのその分泌経路を通して細胞からの酵素の輸送を改善することができる。適切なリーダーペプチドは、必須ではないが、好ましくは、ヒト起源である。適切なリーダーペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる、proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htmから選択されてもよく、または選択されたタンパク質においてリーダー(シグナル)ペプチドを決定するための様々なコンピュータプログラムを用いて決定されてもよい。限定はされないが、そのような配列は、約15~約50のアミノ酸長、または約19~約28のアミノ酸長であってもよく、または必要に応じてそれより長くても短くてもよい。加えて、IDS酵素の酵素活性を評価するのに有用であるものとして、少なくとも1つのインビトロアッセイが記載されている[例えば、Deanら、Clinical Chemistry、2006 Apr;52(4):643-649を参照されたい]。プレプロタンパク質(配列番号2のアミノ酸1~25)のすべてまたは一部の除去に加えて、プロタンパク質(配列番号2のアミノ酸26~33)のすべてまたは一部が除去されてもよく、場合により、異種成熟ペプチドと置換されてもよい。
ィティを達成するように配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、本明細書で提供されるペプチドおよびポリペプチド領域と同一(すなわち、同じ残基)または同様(すなわち、共通の側鎖特性に基づく同じ群からのアミノ酸残基、下記を参照されたい)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。同一性パーセント(%)は、それらのヌクレオチドまたはアミノ酸配列をそれぞれ比較することにより決定されるような、2つのポリヌクレオチド間または2つのポリペプチド間の関係の尺度である。一般に、比較される2つの配列は、配列間に最大の相関を提供するようにアラインされる。2つの配列のアライメントが調べられ、2つの配列間の正確なアミノ酸またはヌクレオチド対応を与える位置の数が決定され、アライメントの全長で除算され、それに100を掛けることにより、同一性%の数字を得る。この同一性%の数字は、比較されるべき配列の全長にわたって決定されてもよく、これは、同じまたは非常に同様の長さの配列に特に適切であり、かつ高度に相同であり、またはこの同一性%の数字は、より短い定義された長さにわたって決定されてもよく、これは、長さが等しくない配列により適切であり、もしくはより低いレベルの相同性を有する。多数のアルゴリズム、およびそれらに基づくコンピュータプログラムが存在し、それらは、文献で使用されるために入手可能であり、および/またはアライメントおよびパーセントアイデンティティを実行するために公的または商業的に入手可能である。アルゴリズムまたはプログラムの選択は、本発明を限定しない。
Omega(Sievers、Fabianら、「Fast、scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.」Molecular systems biology 7.1(2011):539およびGoujon、Mickaelら、「A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.」Nucleic acids research 38.suppl 2(2010):W695-W699);Wisconsin配列分析パッケージ、バージョン9.1(Devereux J.ら、Nucleic Acids Res.、12:387-395、1984、Genetics Computer Group、Madison、Wis.、USAから入手可能)を含む。プログラムBESTFITおよびGAPは、2つのポリヌクレオチド間の同一性%および2つのポリペプチド配列間の同一性%を決定するために使用されてもよい。
sconsinパッケージに対するウェブに基づくインターフェース:Gapプログラム)。
ーロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモータ(Andersenら、(1993)Cell.Mol.Neurobiol.、13:503-15)、神経フィラメント軽鎖遺伝子(Piccioliら、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:5611-5)、およびニューロン特異的vgf遺伝子(Piccioliら、(1995)Neuron、15:373-84)。代替的には、調節可能なプロモータが選択されてもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、WO2011/126808B2を参照されたい。
一実施形態では、AAVカプシドを有し、かつそこにパッケージされたAAV逆位末端配列、遺伝子の発現を制御する調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(hIDS)遺伝子を有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子が提供され、ここで、このhIDS遺伝子は、配列番号1に示される配列(図1)を有するか、または機能的ヒトイズロン酸-2-スルファターゼをコードするそれらに少なくとも約95%同一な配列を有する。一実施形態では、hIDS発現カセットは、AAV5’ITRおよびAAV3’ITRに隣接している。別の実施形態では、AAVは、一本鎖AAVである。
10689]、ならびにrh10[WO2003/042397]、AAV3B;AAVdj[US2010/0047174]も参照されたい。特に望ましい1つのrAAVは、AAV2/8.TBG.hIDS.co.である。
(pt)/mLを得る。Pt/mLをGC/mLで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比(pt/GC)を得る。Pt/mL~GC/mLは、エンプティpt/mLを与える。エンプティpt/mLをpt/mLで除算して、次いで、x100をすることにより、エンプティ粒子のパーセンテージを得る。
えば、約20分間~約30分間)、またはより高い温度(例えば、最高約60℃)でより短時間(例えば、約5~10分間)実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約95℃で約15分間であるが、温度を下げてもよく(例えば、約70~約90℃)、時間を延ばしてもよい(例えば、約20分間~約30分間)。次いで、試料は希釈され(例えば、1000倍)、標準アッセイで記載されるように、TaqMan分析に供される。
Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14を参照されたい。
rAAV9.hIDS製剤は、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合する塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に懸濁された有効量のAAV.hIDSベクターを含有する懸濁液である。適切には、製剤は、生理学的に許容されるpH、例えば、pH6~9、またはpH6.5~7.5、pH7.0~7.7、またはpH7.2~7.8の範囲に調整される。脳脊髄液のpHは約7.28~約7.32であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のpHが望ましく、静脈内送達のためには、6.8~約7.2のpHが望ましい可能性がある。しかし、より広範囲にある他のpH、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択されてもよい。
テル、TWEEN(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル)、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択されてもよい。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「P」(ポロキサマーについて)に続いて、3桁数字を用いて命名され、初めの2桁数字x100は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字x10は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー188が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約0.0005%~約0.001%の量で存在してもよい。
5.2.1 標的患者集団
本明細書では、本明細書に記載の治療有効量のrAAV.hIDSをそれを必要とする患者へ送達することを含む、ムコ多糖症II型を治療するための方法が提供される。特に、本明細書では、本明細書に記載の治療有効量のrAAV.hIDSをそれを必要とする患者へ送達することを含む、MPSIIと診断された患者における神経認知低下を予防、治療、および/または緩和するための方法が提供される。本明細書に記載のrAAV.hIDSベクターの「治療有効量」は、以下の段落のうちのいずれか1つにおいて同定される症状のうち1つ以上を補正することができる。
在送達の前にタンパク質形態またはAAV-hIDS形態で酵素を直接全身送達することを含む様々な経路により、活性のある耐性を提供するための方法、および酵素に対する抗体形成を予防するための方法が提供される。
アルキル化剤を含む細胞分裂阻害剤、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに活性のある物質を含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、プラチナ化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、レフルノミド(Arava)、シクロホスファミド、クロラムブシル(Leukeran)、クロロキン(例えば、ヒドロキシクロロキン)、硫酸キニーネ、メフロキン、アトバコンおよびプログアニルの組み合わせ、スルファサラジン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ミトラマイシン、IL-2受容体-(CD25-)またはCD3-指向抗体、抗-IL-2抗体、アバタセプト(Orencia)、アダリムマブ(Humira)、アナキンラ(Kineret)、セルトリズマブ(Cimzia)、エタネルセプト(Enbrel)、ゴリムマブ(Simponi)、インフリキシマブ(Remicade)、リツキシマブ(Rituxan)、トシリズマブ(Actemra)、およびトファシチニブ(Xeljanz)、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、IFN-β、IFN-γ、オピオイド、またはTNF-α(腫瘍壊死因子-アルファ)結合剤、およびこれらの薬物の組み合わせを含み得る。ある実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の0、1、2、7日前、またはそれ以前に開始されてもよい。そのような療法は、同日における2つ以上の薬物の併用投与を含むことができる。一実施形態では、2つ以上の薬物は、例えば、1つ以上のコルチコステロイド(例えば、プレドネリゾン、またはプレドニゾン)、および場合により、MMFおよび/またはカルシニュリン阻害剤(例えば、タクロリムス、またはシロリムス(すなわち、ラパマイシン))であり得る。一実施形態では、2つ以上の薬物は、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)および/またはシロリムスである。別の実施形態では、2つ以上の薬物は、例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、タクロリムス、および/またはシロリムスであり得る。ある実施形態では、薬物は、ベクター送達前の0~15日間のMMFおよびタクロリムスであり、MMFを用いて約8週間維持し、および/またはフォローアップアポイントメントを通してタクロリムスを用いる。これらの薬物のうちの1つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。ある実施形態では、患者は、初めに、用量をロードするためにIVステロイド(例えば、メチルプレドニゾロン)を投与され、続いて、経口ステロイド(例えば、プレドニゾロン)を投与され、これは、患者が12週までにステロイドなしとなるように徐々に減少される。コルチコステロイド治療は、タクロリムス(24週間)および/またはシロリムス(12週間)により補足され、さらにMMFで補足されることができる。タクロリムスおよびシロリムスの両方を用いる場合、各用量は、約4ng/mL~約8ng/mlの血液中レベル、または約8ng/mL~16ng/mLのトラフレベルを維持するように調整された低用量である必要がある。ある実施形態では、これらの剤の1つのみが使用される場合、タクロリムスおよび/またはシロリムスについての総用量は、約16ng/mL~約24ng/mLの範囲であり得る。剤の1つのみが使用されるならば、ラベル用量(より高い用量)が使用されるべきである、例えば、タクロリムス、0.15~0.20mg/kg/日、12時間毎に2分割用量として投与される、およびシロリムス、1mg/m2/日、負荷用量は、3mg/m2である必要がある。MMFがレジメンに加えられるならば、タクロリムスおよび/またはシロリムスについての用量は、作用機序が異なるので、維持されることができる。これらのおよび他の療法は、約-14日目~-1日目から開始して(例えば、-2日目、0日目など)、必要に応じて、約~最高約1週間(7日)、または最高約60日間、または最高約12週間、または約16週間、または最高約24週間、または最高約48週間、またはそれ以上継続され得る。ある実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
タクロリムス:1mgのBIDを経口により、2日目から24週目まで、24~32週目の8週間にわたって、徐々に量を減らす、シロリムス:(-2日目に負荷用量、次いで、シロリムス0.5mg/m2/日を、48週目まで、BIDで分割投与。ある実施形態では、IS療法は、AAV9.hIDSの投与後48週で中止される。
●調査者または医療用モニタのいずれかの判断において研究結果の解釈を混乱させ得る、MPSIIに起因しないいずれかの神経認知欠損を有する。
●調査者の判断において、対象を危険な状況に置く可能性があるか、調査製品の評価または対象安全性または研究結果の解釈を妨害し得る、いずれかの状態(例えば、任意の病歴、任意の現在の疾患の証拠、身体検査における任意の知見、または任意の検査異常値)を有する。
●神経精神医学的状態の診断。
●蛍光画像法に対しての禁忌を含む、髄腔内/脳内治療投与に対するいずれかの禁忌を有する。
●MRIに対していずれかの禁忌を有する。
●登録時に急性水頭症を有する。
●どちらが長期であってもよいが、スクリーニング前の4週間以内に調査製品を用いた任意の他の臨床的研究に現在登録されているか、または、その臨床的研究で使用された調査製品の5半減期以内である。
●造血幹細胞移植(HSCT)を受けている。
●スクリーニング前の6ヶ月以内に髄腔内投与によりイズルスルファーゼを受けた。
●任意の時点で髄腔内イズルスルファーゼを受け、調査者および/または医療用モニタの判断では、対象を危険な状況に置く可能性のある、髄腔内投与に関連すると考えられる有意な有害効果(AE)を経験した。
患者への投与に適切な薬学的組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液、界面活性剤、および任意選択の賦形剤を含む製剤緩衝液中のrAAV.hIDSベクターの懸濁液を含む。ある実施形態では本明細書に記載の薬学的組成物は、髄腔内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、大槽内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、静脈内に投与される。ある実施形態では、薬学的組成物は、20分間(±5分間)にわたって注入により末梢静脈を介して送達される。しかし、この時間は、必要に応じて、または所望により、調整されてもよい。しかし、さらに他の投与経路が選択されてもよい。代替的または追加的に、投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
(特に、新生児の治療では、例えば、1年に4回、半年に1回、1年に1回、または必要に応じて他の回数)。場合により、注入/注射に耐えることのできる対象の年齢および能力を考慮して、治療有効量の初期用量が、分割された注入/注射セッションで投与されてもよい。しかし、安心感および治療的結果の両方の観点で患者に利点を与える、治療的用量全量の注射を毎週繰り返す必要はない。
●新生児:約1x1011~約3x1014GC、
●3~9ヶ月:約6x1012~約3x1014GC、
●9ヶ月~6歳:約6x1012~約3x1014GC、
●3~6歳:約1.2x1013~約6x1014GC、
●6~12歳:約1.2x1013~約6x1014GC、
●12歳以上:約1.4x1013~約7.0x1014GC、
●18歳以上(成人):約1.4x1013~約7.0x1014GC。
●新生児:約3.8x1012~約1.9x1014GC、
●3~9ヶ月:約6x1012~約3x1014GC、
●9~36ヶ月:約1013~約5x1013GC、
●6~12歳:約1.2x1013~約6x1014GC、
●12歳以上:約1.4x1013~約7.0x1014GC、
●18歳以上(成人):約1.4x1013~約7.0x1014GC。
脳質量の用量のrAAV懸濁液は、効力を有する。ある実施形態では、投与される用量は、少なくとも1.3×1010GC/g脳質量、少なくとも1.9x1010GC/g脳質量、少なくとも6.5×1010GC/g脳質量、または9.4x1010GC/g脳質量、または約4x1011GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、1.3×1010GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、6.5×1010GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、1.9×1010GC/g脳質量である。ある実施形態では、MPSII患者に投与される用量は、9.4×1010GC/g脳質量である。
本明細書で記載される療法の有効性は、(a)MPSII(ハンター症候群)を有する患者における神経認知低下の予防、ならびに(b)疾患のバイオマーカー、例えば、CSF、血清、および/または尿、および/または肝臓および脾臓容積におけるGAGレベルにおける減少、および/または酵素活性を評価することにより、測定することができる。神経認知は、例えば、Hurler対象のためのBayleyの乳幼児発達スケールにより測定されるような、またはHurler-Scheie対象のためのWechsler略式知能スケール(WASI)により測定されるような、知能指数(IQ)を測定することにより、測定されることができる。例えば、乳幼児発達のBayleyスケール(BSID-III)を使用して発達指数(DQ)を評価することにより、Hopkins言語学習検査を用いて、および/または可変注意力検査(TOVA)を用いて記憶を評価することにより、神経認知発達および機能の他の適切な測定が利用されてもよい。適応行動ス
ケール、視覚処理力、細かい運動、コミュニケーション、社会性、日常生活力、ならびに感情的および行動学的健康度などの他の神経心理学的機能がモニターされる。容量測定を獲得するための脳の磁気共鳴画像法(MRI)、拡散テンソル撮像法(DTI)、および休息状態データ、エコー写真による正中神経断面領域、脊髄圧縮における改善、安全性、肝臓の大きさおよび脾臓の大きさも実施される。
を検出すること、MPSII治療的の投与レベルを調整することを含む。例えば、「正常な」ヒトスペルミン濃度は、脳脊髄液中、約1ng/mL~2ng/mL、またはそれ未満である。しかし、未治療のMPSIIを有する患者は、2ng/mL~最高約100ng/mLを超えるスペルミン濃度レベルを有し得る。患者が、正常なレベルに近づいているレベルを有するならば、任意の併用薬の投与量は減少されることができる。逆に、患者が、所望のMPSIIレベルより高いレベルを有するならば、より高い用量、またはさらなる療法、例えば、ERTを患者に提供することができる。
/自然経過対照データに対して、治療された患者において15ポイント以下のDQの低下をもたらす。
hIDSの全身送達が伴うCNSへのrAAV.hIDSの遺伝子療法送達の組み合わせは、本発明の特定の実施形態に包含される。全身送達は、ERT(例えば、エラプラーゼ(登録商標)を用いて)を用いて、または肝臓に対する向性を有するrAAV.hIDS(例えば、AAV8カプシドを有するrAAV.hIDS)を用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。
一実施形態は、本明細書に記載の(実施例4、下記)、rAAV.hIDS薬学的組成物の製造を提供する。説明的な製造プロセスは、図10Aおよび10Bに提供される。rAAV.hIDSベクターは、図10Aおよび10Bに示されるフローダイアグラムにおいて示されるように製造されることができる。簡潔にいうと、細胞は、適切な細胞培養(例えば、HEK293)細胞において製造される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドDNAの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、AAVベクターであり、産生されたプラスミドは、AAVゲノムおよび目的の遺伝子をコードするAAVシス-プラスミド、AAV repおよびcap遺伝子を含有するAAVトランス-プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター産生プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAを用いた細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の血清不含培地への培地交換、ベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。
化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過によるバッファー交換、および/またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの方法工程に供され得る。
一態様では、本明細書で提供されるベクターは、このセクションで提供されるか、実施例および図11にさらに記載される方法および/またはデバイスにより髄腔内に投与されてもよい。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択されてもよい。方法は、脊椎ニードルを患者の大槽内に前進させる工程、1本の可撓性チューブを脊椎ニードルの近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結する工程と、その前進および連結工程の後、患者の脳脊髄液を用いてチューブをセルフプライム可能とした後、一定量の等張溶液を含有する第1の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結し、その後、一定量の薬学的組成物を含有する第2の容器をバルブのベクター入口ポートに連結する工程と、を含む。第1および第2容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物は脊椎ニードルを通して患者に注射され、薬学的組成物の注射後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、薬学的組成物を患者にフラッシュするために脊椎ニードル中に注射される。
作成された一連の平面断面からコンピュータにより身体構造の三次元画像が構築されるX線撮影法を指す。
端に取り付けられてもよい。
なった)、および頭部運動範囲(首屈曲の程度)の詳細なアセスメントを提供する、麻酔処置前評価が、「-28日目」~「1日目」に得られてもよい。
成人腰部穿刺(LP)キット(協会によって供給される)、
BD(Becton Dickinson)22または25ゲージx3~7インチの脊椎ニードル(Quincke bevel)、
(脊椎ニードルの導入のために)介入者の裁量で使用される、同軸導入用ニードル、
旋回式(スピン)雄型ルアーロックを伴う4方向小口径停止コック、
雌型ルアーロックアダプタを伴うT-コネクタ延長セット(チューブ)、おおよその長さ6.7インチ、
髄腔内投与のためのOmnipaque180(イオヘキソール)、
静脈内(IV)投与のためのヨウ素化コントラスト、
注射用の1%のリドカイン溶液(成人LPキット中で供給されていない場合)、
充填済み10cc通常食塩水(滅菌)フラッシュシリンジ、
放射線不透過性マーカー(複数可)、
手術準備用機器/カミソリ、
挿管された対象の正確な位置を可能とするための枕/支持、
気管内挿管用機器、全身麻酔機械、および機械式通風装置、
術中神経生理学的モニタリング(IONM)機器(および必要とされる人員)、ならびに
ベクターを含有する10ccのシリンジ、別の薬務マニュアルに従って、調整され、CT/手術室(OR)スイートに輸送される。
スタッフに彼らが対象準備に進むことができるかを確認することができる。
象は適切な麻酔後治療室に輸送される。対象が、十分に意識を回復し、安定な状態となった後、対象は、プロトコル指定の評価のために適切なフロア/ユニットに入院する。神経学的評価は、プロトコルに従って実施され、主要な調査者は、病院および研究スタッフとの共同で対象ケアを監督する。
第1および第2の容器は、別個のシリンジである。ある実施形態では、脊椎ニードルは、1本の可撓性チューブによりバルブと相互連結している。T-コネクタは、チューブを脊椎ニードルに相互連結させることができる。ある実施形態では、脊椎ニードルは、5インチ、22または24ゲージの脊椎ニードルである。ある実施形態では、デバイスはさらに、脊椎ニードルの遠位端に連結した導入用ニードルを含む。場合により、導入用ニードルは3.5インチ、18ゲージの導入用ニードルである。
この実施例は、MPSII、すなわち、ハンター症候群を有する患者のための遺伝子療法治療に関する。この実施例では、野生型hIDS酵素をコードする修飾されたhIDS遺伝子を発現する、遺伝子療法ベクター、AAV9.CB.hIDS、複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター9(AAV9)が、MPSII患者の中枢神経系(CNS)へ投与される。AAVベクターの用量は、全身麻酔下でCNSに直接注射される。治療の有効性は、本明細書に記載されるように、バイオマーカー、例えば、対象のCSFまたは血清における病原性GAGおよび/またはヘパリン硫酸(HS)濃度の減少を含む、神経認知発達および/またはサロゲートマーカーの臨床的測定を用いて評価される。
遺伝子療法ベクターは、ヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)を発現する血清型9の非複製組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり、この実施例ではAAV9.CB.IDSとして称される(図1を参照されたい)。AAV9血清型は、IC投与後にCNS中のhIDS産物の効率的な発現を可能とする。
F68)中に懸濁される。構築物は、M.Lockら、Human Gene Ther,21:1259-1271(2010)において以前記載されたように、AAV9カプシド中にパッケージされ、精製され、力価測定された。製造プロセスは、以下の実施例4でより詳細に記載される。
一連のベクターが作製された。1つのプラスミドは、コドン最適化されたIDS配列(配列番号11のnt1177~nt2829)を含有する。他の2つは、CB7プロモータ(CB6)の短縮バージョンを用いて、SUMF1[配列番号7および配列番号10]と呼ばれる第2のタンパク質を発現した。産生されたベクターゲノム、AAV.CB7.CI.hIDSco.RBGは、配列番号11のnt2~nt3967の配列を有し、AAV.CB6.hIDSco.IRES.hSUMF1coは、配列番号8のnt11~nt4964の配列を有する。プラスミドは、コドン最適化およびhIDS配列の合成に
より構築され、次いで、得られた構築物は、プラスミドpENN.AAV.CB7.CI.RBGまたはpENN.AAV.CB6.CI.RBG、CB7またはCB6、CI、およびRBG発現要素を含有するAAV2 ITRが隣接する発現カセットにクローニングされて、前述のベクターゲノムを得る。
逆位末端配列(ITR):AAV ITR(GenBank # NC001401)は、両端が同一であるが、逆方向である配列である。AAVおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、AAV2 ITR配列は、ベクターDNA複製の起源およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ITR配列は、ベクターゲノムの複製およびパッケージングのために必要とされるシス配列のみを表す。
# X00182.1)からの973bpのイントロンは、ベクター発現カセット中に存在する。イントロンは転写されるが、その両端のいずれかにある配列と合わせて、スプライシングにより成熟メッセンジャーRNA(mRNA)から除去される。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのmRNA輸送を促進し、それにより、翻訳のためのmRNAの一定レベルの蓄積を高めることが示されている。これは、遺伝子発現レベルの増大を意図した遺伝子ベクターにおいて共通の特徴である。この要素は、ベクターゲノムおよびプラスミドの両方に存在する。
4ヶ月齢以上~5歳未満の年齢の患者は、2.6x1012GC(2.0x109GG/g脳質量)(低用量)~1.3x1014GC(1.0x1011GC/g脳質量(高用量))の範囲のrAAV9.CB7.hIDSの単回髄腔内/槽内用量を受ける。患者は、1.3×1010GC/g脳質量の用量または6.5×1010GC/g脳質量の用量を用いて治療されることができる。
●新生児:約1x1011~約3x1014GC、
●3~9ヶ月:約6x1012~約3x1014GC、
●9ヶ月~6歳:約6x1012~約3x1014GC、
●3~6歳:約1.2x1013~約6x1014GC、
●6~12歳:約1.2x1013~約6x1014GC、
●12歳以上:約1.4x1013~約7.0x1014GC、
●18歳以上(成人):約1.4x1013~約7.0x1014GC。
●新生児:約3.8x1012~約1.9x1014GC、
●3~9ヶ月:約6x1012~約3x1014GC、
●9~36ヶ月:約1013~約5x1013GC、
●6~12歳:約1.2x1013~約6x1014GC、
●12歳以上:約1.4x1013~約7.0x1014GC、
●18歳以上(成人):約1.4x1013~約7.0x1014GC。
/日と、およびシロリムス(1日1回[QD]-2日目~48週目ビジットまで)とを含む。説明的なシロリムス用量は、(-2日目に6mgのPO、次いで、-1日目~48週目ビジットまで2mgのQD)を含んでもよい。シロリムス用量調整は、16~24ng/mL内の血中トラフ濃度を維持するために実施されることができる。調整は、より短期間またはより長期間薬物を送達することを含む、レジメン中の他の薬物に対しても実施されてもよい。ほとんどの対象では、用量調整は、式:新規用量=現在の用量x(標的濃度/現在の濃度)、に基づくことができる。対象は、濃度モニタリングを伴うさらなる投薬量調整前の少なくとも7~14日間、新規維持用量を継続してもよい。場合により、患者は、静脈内酵素補充療法(ERT、例えば、ALDURAZYME(商標)[ラロニダーゼ]、ならびに任意の支持的手段(例えば、身体療法)の安定なレジメンを維持することを許可されることができる。患者は、任意の有害事象についてモニターされる。重大な有害事象は、「Hy’s Law」事象と呼ばれる、ALT約3×ULNおよびビリルビン約2xULN(>35%直接)と定義される、高ビリルビン血症を伴う起こり得る薬物誘導肝障害を含み得る。
コルチコステロイド
ベクター投与の朝(1日目、投与前)、患者は、少なくとも30分間にわたってメチルプレドニゾロン10mg/kgIV(最大500mg)を受ける。メチルプレドニゾロンは、rAAV9.CB7.hIDUAの腰部穿刺および髄腔内(IC)注射の前に投与される。アセトアミノフェンおよび抗ヒスタミンを用いる前投薬は任意である。
適切な患者は、以下の年齢の男性および女性対象を含む。
●新生児、
●3~9ヶ月齢、
●9~36ヶ月齢、
●3~12歳、
●12歳以上、
●18歳以上(成人)。
主要な臨床的目的は、MPSII欠損に関連する神経認知低下を予防すること、および/または場合によりそれを逆転することを含む。臨床的目的は、例えば、Infant and Toddler Development、Third Edition、BSID-IIIのBayleyスケールにより測定されるような、神経認知を測定することにより決定されてもよい。他の適切な測定は、例えば、Vineland適応行動スケール、Second Edition(VABS-II)により測定されるような適応行動学的評価、および例えば、Infant Toddler Quality of Life Questionnaire(商標)(ITQOL)により測定されるような生活の質の測定である。
A.脳脊髄液へのAAV9送達は、CNS疾患を補正する。
ムコ多糖症II型(MPSII)は、典型的には、小児初期に骨および関節の変形、心疾患および呼吸器系疾患、ならびに発達遅延を表す、X連鎖性リソソーム貯蔵障害である。欠損酵素、イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)の全身送達は、MPSIIの多くの症状を改善するが、酵素は血液脳関門を通過しないので、中枢神経系(CNS)疾患の進行を予防するための効果的な方法が現在は存在しない。MPSIIのマウスモデルを用いて、IDS遺伝子のAAV血清型9ベクター介在送達は、CNSにおける連続的なIDS発現を達成するための一手段として評価された。IDSノックアウトマウスは、3つのベクター用量(低-3x108、中-3x109、高-3x1010のゲノムコピー)のうちの1つの脳側室への単回注射を受け、ベクター体内分布およびIDS発現のアセスメント(群あたりn=7~8マウス)のためにベクター投与の3週間後に犠牲にされ、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価するために(群n=7~8マウス)ベクター投与の3ヶ月後に犠牲にされた。IDS活性は、脳脊髄液中で検出可能であり、低用量コホートでは野生型レベルの15%に到達し、最高用量では通常の268%に到達した。脳酵素活性は、低用量コホートにおける通常の2.7%~高用量コホートにおける32%の範囲であった。ガングリオシドGM3についての染色による脳貯蔵病変の定量化は、それぞれ、低-、中-、および高-用量コホートにおいて35%、46%、および86%の減少を伴う用量依存的補正を示した。治療されたマウスはまた、新規物体認識試験において認知機能の改善を実証した。これらの知見は、髄腔内AAV介在遺伝子移入が、CNSへの持続した酵素送達のためのプラットフォームとして役立つことを示し、MPSIIを有する患者のためにこの重大で満たされていない必要性に対処する。
MPSIIのノックアウトマウスモデル(IDS-ノックアウト、IDSy/-)は、IDS遺伝子のエクソン4および5をネオマイシン耐性遺伝子で置換することにより、作製された(Garciaら、2007、J Inherit Metab Dis、30:924-34を参照されたい)。モデルは、検出可能な酵素活性をまったく示さず、MPSII患者において見出されるものと同様の組織学的貯蔵病変を発症する。IDS-ノックアウトマウスは、骨格異常を含むMPSIIの臨床的特徴のうちの多くを示す。いく
つかの研究は異常さを示しているが(Muenzerら、2001、Acta Paediatr Suppl、91(439):99-9)、マウスの神経行動学的表現型は広範囲には評価されておらず、したがって、MPSIIのための治療としてのAAV9.CB.hIDSの効果を研究するための関連モデルである。実際、これは、この集団における臨床試験を支持するMPSIIにおける酵素補充療法の効果を評価するために使用されたのと同じノックアウトマウスモデルである。このMPSIIマウスモデルにおいて実施された以下の研究は、治療的活性のあるAAV9.CB.hIDSを確立した。
ベクター。ヒトIDUAおよびIDS cDNAを、ニワトリベータアクチンプロモータ、CMVエンハンサー、イントロン、およびウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含有する発現構築物中にクローニングした。発現構築物は、AAV2逆位末端配列に隣接した。AAV9ベクターは、以前記載されたように(Lockら、(2010).Hum Gene Ther 21:1259-71)、HEK293細胞のトリプルトランスフェクションおよびイオジキサノール精製により、これらの構築物から産生された。
Oct 8;8:349)を用いてスコア付けされた。
Ther 23:1298-307)。LIMP2およびGM3についての細胞染色陽性の数が、盲検レビュアにより各動物からの4つの脳セクションにおいて定量化された。
●群1:未治療
●群2:脳室内AAV9.CB.hIDS低用量3x108GC(1.875x109GC/g脳質量)
●群3:脳室内AAV9.CB.hIDS中用量3x109GC(1.875x1010GC/g脳質量)
●群4:脳室内AAV9.CB.hIDS高用量3x1010GC(1.875x1011GC/g脳質量)
●群5:未治療の野生型同腹仔
2~3ヶ月齢の雄IDSy/-マウスは、ニワトリベータアクチンプロモータおよびサイトメガロウイルスエンハンサー(AAV9.CB.hIDS)からのヒトIDSを発現するAAV9ベクターの脳室内(ICV)注射を用いて治療された。最初のコホートでは、マウスは、3つのベクター用量[3x108、3x109、または3x1010ゲノムコピー(GC)]のうちの1つを用いて治療され、ベクター体内分布およびIDS発現のアセスメントのために、ベクター投与の3週間後に犠牲にされた。未治療IDSy/-マウスおよび野生型雄同腹仔は、対照として役立った。体内分布分析のために、組織を回収した。高用量群におけるベクター体内分布の分析は、宿主二倍体ゲノムあたり平均1つのベクターゲノムを伴う、効率的な脳標的化を実証した(図3)。CSFへのAAV送達の以前の研究と一致して、宿主二倍体ゲノムあたり1つ以上のベクターゲノムを伴う、末梢部へのベクター漏出および効率的な肝臓標的化も存在する(図3)。脳組織、CSF、および血清はすべて、IDS活性における用量-依存性増大を示し、高用量群では野生型レベルに到達したか、またはそれを超えた(図2A~2C)。ヒトIDSに対する抗体は、中-および高-用量コホートにおける何匹かの動物の血清中で検出されたが、これは、循環酵素活性に有意に影響を与えたようには見えなかった(図8)。
-マウスのさらなるコホートを、等価ベクター用量を用いて治療し、次いで、その後の時点で、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価した。ベクター投与の2ヶ月後に、マウスを行動学的および神経認知試験に供した。治療の3か月後に、動物を犠牲にし、疾患活性の組織学的および生化学的アセスメントのために組織を回収した。
Therapy、2015:23:1298-1307]。この同じアプローチをMPSIIで用いて同様の有効性が可能であるかどうかを決定するために、本発明者らは、MPSIIにおける酵素発現の効率および交差補正を調べるために、MPSIマウスにおける並行用量範囲の研究を実施した。MPSIマウスは、IDSの代わりにα-L-イズロニダーゼ(IDUA)トランスジーンを用いることを除き、IDSy/-マウスのために用いられたものと同一のベクターで治療された。MPSII研究と同様に、MPSIマウスは、2~3ヶ月齢で、3x108、3x109、または3x1010GC(群あたりn=8)の用量を用いて治療され、脳酵素活性の測定のために治療の21日後に犠牲にされ、組織学的分析のために治療の3ヶ月後に犠牲にされた。IDUAの発現が、絶対的な酵素活性および野生型発現レベルに対する酵素活性の両方において、IDSと比較して幾分より効率的であるようにみえたが、IDSy/-マウスにおいて観察されたものと同様の用量応答が脳酵素発現において存在した(図7A)。治療は、最低のベクター用量においてMPSIマウスにおいて控えめにより効率的であるようにみえたが、脳貯蔵病変の補正は、2つの疾患モデル間で同様であった(図7A~7B)。併せて、これらの結果は、MPSIIのためのIT AAV9介在遺伝子移入が、MPSIにおいて観察されたものとほとんど同様の効率で脳貯蔵病変の補正を生じることを示唆し、またこのアプローチはマウスからスケールアップされた場合になお効果的であることを示唆している。しかし、MPSIと比較して若干より高いベクター用量は、脳におけるより効率的でない酵素発現に打ち勝つためには、MPSIIにおいて必須であるかもしれない。
ウスにおけるコンテキスト恐怖条件付けにおいて同定された。IDSy/-マウスは、それらが嫌忌的刺激を受けたコンテキストを回想することができたが、それらは、野生型同腹仔と比較して有意に減少したフリーズ応答を示した。AAV9のIT送達を受けたIDSy/-マウスは、注射されていないマウスと同様のフリーズ応答を示した。したがって、回復は検出されなかった。長期記憶欠損もまた、新規物体認識において見出された。NORでは、IDSy/-マウスは、馴染みのある物体に対して新規物体への優先度を示さなかった。ベクター治療されたマウスは、未治療IDSy/-マウスにおいてみられたNOR欠損の回復を実証した。群あたり8匹の動物を伴って、研究は、行動学的エンドポイントの用量応答を評価するために十分には強力でなかったが、物体識別は、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった。2つの種類の長期記憶の回復に異なる影響を与えるAAV9のIT送達の能力は、各タスクのために必要とされる異なるニューロン基質に起因し得る。コンテキスト恐怖条件付けは、嗅周野嗅内野(perienteorhinal)皮質を必要とするNORと逆で、海馬依存的タスクである[Oliveiraら、Post-training reversible inactivation of
the hippocampus enhances novel object recognition memory.Learning&memory(Cold Spring Harbor、NY)2010;17:155-160;Abelら、Cell 1997;88:615-626]。
Therapy、2014:22:2018-2027;Hindererら、Mol
Therapy:the Journal of the Am Soc Gen Therapy、2015:23:1298-1307]、MPSIIおよびMPSIのマウスモデルにおけるAAV9送達の効率の比較は、酵素発現および組織補正が2つの疾患の間で同様であったことを示し、これは、MPSIIのためのIT AAV送達が、はるかに大きな脳サイズおよびCSF容量の文脈において広範な疾患補正をもたらすのに十分に効率的であるという証拠を提供した。興味深いことに、欠損酵素の発現は、MPSIと比較してMPSIIにおいて幾分より低い効率性であった。これは、発現構築物における制御要素は同一であるが、これらの特定のベクターの発現効率の単なる産物であった可能性があった。幾つかの研究は、IDSなどのスルファターゼの発現は、IDSの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ修飾因子、SUMF1の利用可能性により制限され得ることを示唆している[Fraldiら、Biochemical J、2007:403:305-312を参照されたい。しかし、IDSおよびSUMF1の同時発現を評価するパイロット実験は、より活性のあるIDS発現を実証しなかった(データは示されていない)。それにも関わらず、貯蔵病変の補正は、MPSIマウスとほぼ同じくらいMPSIIマウスにおいて効率的であり、これは、遺伝子移入が、MPSIおよびMPSII患者の両方について同様に効果的であるはずであることを示したが、後者の場合、控えめにより高いベクター用量が、最適な結果のために必須であり得る。
Society of Gene Therapy 2014;22:2018-2027;Hindererら、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Thera
py 2015;23:1298-1307;Gurdaら、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 2015;Higuchiら、cited above;Haurigotら、J Clin Invest、2013:123:3254-3271;Grayら、Gene Therapy、2013:20:450-459]。顕著にIT AAVベクター送達後の肝臓形質導入は、種間で実質的に変動するので、ヒトが有意な末梢発現を示すかどうかはまだ明確ではない。
成体雄アカゲザルにおけるAAV9.CB.hIDSの安全性および効果を評価するために、非ヒト霊長類(NHP)における研究を実施する。研究の目的は、髄腔内(IT)AAV9.CB.hIDSの局所的、急性、および慢性毒性を評価すること、およびベクターの体内分布を画定することである。総数21匹の雄サルが、AAV9.CB.hIDS(5.6x1011または1.875x1011GC/g脳質量)の2用量のうちの1つのAAV9.CB.hIDSのIT注射を用いて、またはビヒクル対照希釈剤を用いて、治療される。低用量は、MPSIIマウスにおけるMEDよりもおおよそ100倍多く(1.875x109GC/gのMED)、MPSIIマウスにおいて統計的に有意な組織学的改善および認知機能を反映すると考えられる神経行動学的変化をもたらす最低用量に対応する。より高い用量(おおよそ300XMED)は、ベクターが製剤化され得る最大濃度であり、CSFに安全に投与可能である注射容量(<10%CSF容量)を維持するための要件により制限される。注射手順の間、動物は、全身麻酔下で維持される。脊椎ニードルは、後頭下空間内へ配置され、配置は、蛍光透視法により確認され、用量は、全容量1mLで投与される。血清およびCSFは、注射後の0日目、3日目、7日目、14日目、21日目、および30日目、およびその後毎月、臨床的病理学評価について収集される。注射後の14日目、90日目、および180日目に、各用量群からの3匹の雄サル(1時点あたり総6匹)が、病理学および体内分布のために犠牲にされる。ビヒクル治療された動物は、対照として役立つ。すべての動物からの組織について、十分な組織病理学が実施され、ベクター体内分布の分析は、高用量コホートについて実施される。DNA抽出および定量的PCRによるベクターゲノムの検出は、以前記載されたように実施される(Chenら、2013、Hum Gene Ther Clin Dev、24(4):154-160を参照されたい)。このアッセイは、DNA1μgあたり20ベクターゲノムコピーより多い感受性を有し、スパイク対照は、個々の試料における反応効率を確認するために含まれる。体内分布、生化学、および免疫原性データは、14日目、3ヶ月、および6ヶ月で収集される。
胞応答は存在せず、LD群のみにおいてAAV9に対して最小限~中程度の応答であった。60日目のMMFの引き抜き後に、免疫応答のリバウンドは見られなかった。高用量および低用量群の両方は、最小限~軽度の脊髄白質後索および坐骨神経の軸索障害を有した。白質後索および三叉神経節に突出する後根神経節における、単核性細胞湿潤を用いた最小限~軽度のニューロン細胞体の変性。高いベクターコピー数の存在に関わらず、脳または脊髄内に炎症は見られなかった。高レベルのAAVベクターゲノムは、脳、脊髄、および後根神経節にわたって検出された。有意なベクター体内分布は、末梢、特に、肝臓においても見出された。
AAV9.CB7.hIDSは、(i)hIDSベクターゲノムプラスミドと、(ii)AAV rep2およびcap9野生型遺伝子を含有する、pAAV29と称されるAAVヘルパープラスミドと、(iii)pAdΔF6(Kan)と称されるヘルパーアデノウイルスプラスミドとを用いて、ヒトHEK293 MCB細胞のトリプルプラスミドトランスフェクションにより産生される。
的に排出することにより、使い捨てバイオプロセスバッグを用いて各HS-36から回収される。培地の回収後、約80リットルの容量にMgCl2を補足して、最終濃度2mM(ベンゾナーゼのための共同因子)とし、ベンゾナーゼヌクレアーゼ(Cat#:1.016797.0001、Merck Group)を加えて、最終濃度25ユニット/mlとした。産物(使い捨てバイオプロセスバッグ中)をインキュベータで37℃で2時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果としての回収物中に存在する残留細胞およびプラスミドDNAの酵素消化のために十分な時間を与える。この工程は、最終的なベクター中の残留DNAの量を最小限にするために、実施される。インキュベーション期間の後、NaClを加えて、最終濃度500mMとし、濾過およびダウンストリームタンジェンシャルフロー濾過の間の産物の回収を補助する。
血清型アイデンティティ、エンプティ粒子含有量、およびトランスジーン産物同一性を含む特徴付けアッセイが実施される。アッセイの記載は以下に示される。
ウイルスベクターゲノムDNAを単離し、配列を、プライマーウォーキングを用いる2倍配列決定包括度により決定した。配列アライメントを実施し、期待される配列と比較する。B.ベクターカプシドアイデンティティ:VP3のAAVカプシド質量分析
oqPCRに基づくゲノムコピー力価が、一定範囲の連続希釈にわたって決定され、同種プラスミド標準(pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR)と比較される。oqPCRアッセイは、DNase IおよびプロテアーゼKを用いる連続的消化、続いて、qPCR分析を利用して、カプシドに封入されたベクターゲノムコピーを測定することができる。DNA検出は、RBGポリA領域を標的化する配列特異的プライマーをこの同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて用いて達成される。プラスミドDNA標準曲線との比較は、PCR後のいずれの試料操作を必要することなく、力価決定を可能とする。多数の標準、確認用試料、および対照(バックグラウンドおよびDNA汚染についての)が、アッセイに導入された。アッセイは、感受性、検出限界、定性範囲、ならびにアッセイ内およびアッセイ間正確性を含むアッセイパラメータを構築および画定することにより、定性される。内部AAV9参照ロットが構築され、定性研究を実施するために使用される。本研究者らの以前の経験では、本明細書に記載の最適化されたqPCRアッセイにより得られた力価は、一般に、前臨床的データを作成するのに使用された我々の標準的なqPCR技法により成し遂げられたものよりも2.5倍高いことが示唆されていることに注目されたい。
薬物製品の全粒子含有量は、SDS-PAGE分析により決定される。イオジキサノール勾配にて精製された参照ベクター調製は、様々な方法(分析用超遠心分離、電子顕微鏡法、および260/280nmでの吸光度)により分析され、(フル)粒子を含有するゲノムを>95%含有する調製物を構築した。この参照材料は、周知のゲノムコピー数(故に拡張すると、粒子数)まで連続希釈され、各希釈液は、同様の連続希釈の薬物製品とともに、SDS PAGEゲル上でランされる。参照材料および薬物製品VP3タンパク質バンドの両方のピーク面積容量は、デンシトメトリーにより測定され、参照材料の容量は、粒子数に対してプロットされる。薬物製品の総粒子濃度は、この曲線からの外挿により決定され、次いで、ゲノムコピー(GC)力価が除算されて、エンプティ粒子力価を得る。エンプティ対フル粒子比は、GC力価に対するエンプティ粒子力価の比である。
感染ユニット(IU)アッセイを用いて、RC32細胞(rep2発現HeLa細胞)におけるベクターの生産的取込みおよび複製を測定する。96-ウェルエンドポイントフォーマットは、以前公開されたものと同様のものを利用した。簡潔に言うと、RC32細胞は、rAAVの各希釈において12レプリケートを伴う、連続希釈のrAAV9.CB.hIDS、および均一希釈のAd5により同時感染される。感染の72時間後、細胞を溶解し、qPCRを実施して、インプットにわたってrAAVベクター増幅を検出する。エンドポイント希釈TCID50算出(Spearman-Karber)は、IU/mlとして表される複製的力価を測定するために実施される。「感染性」値は、細胞と接触することになる粒子、受容体結合、内部移行、核への輸送、およびゲノム複製に依存的であるので、それらは、アッセイ幾何学、ならびに使用される細胞株における適切な受容体の存在、および結合後経路により影響を受ける。受容体および結合後経路は、不死化細胞株において通常は維持されず、故に、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の
数の絶対的尺度ではない。しかし、カプシドに封入されたGC対「感染ユニット」の比(GC/IU比として記載される)は、ロットからロットへの産物一貫性の尺度として使用されることができる。
試料は、産生プロセス間で潜在的に生じ得る複製コンピテントAAV2/9(rcAAV)の存在のために分析される。細胞に基づく増幅およびパッセージ、続いて、リアルタイムqPCRによるrcAAV DNAの検出(cap 9標的)からなる3パッセージアッセイが、開発された。細胞に基づく構成成分は、試験試料および野生型ヒトアデノウイルス型5(Ad5)の希釈を伴うHEK293細胞(P1)の単層を接種することからなる。1010GCのベクター産物は、試験した産物の最大量である。アデノウイルスの存在に起因して、複製コンピテントAAVは細胞培養にて増幅する。2日目の後、細胞可溶化物が産生され、Ad5は熱不活性化される。次いで、清浄化された可溶化液を、第2ラウンドの細胞(P2)へ移して、感受性を高める(Ad5の存在下で再び)。2日目の後、細胞可溶化物が産生され、Ad5は熱不活性化される。次いで、清浄化された可溶化液を、第3ラウンドの細胞(P3)へ移して、感受性を最大限にする(Ad5の存在下で再び)。2日目の後、細胞は溶解されて、DNAを放出し、次いで、これをqPCRに供して、AAV9 cap配列を検出する。Ad5依存的様式でのAAV9 cap配列の増幅は、rcAAVの存在を示す。AAV2 repおよびAAV9 cap遺伝子を含有するAAV2/9サロゲート陽性対照の使用により、アッセイの検出限界(LOD)が測定可能となり(0.1、1、10、および100IU)、連続希釈のrAAV9.CB.hIDSベクター(1x1010、1x109、1x108、1x107GC)を用いて、試験試料中に存在するrcAAVのおおよそのレベルが定量化されることができる。
qPCRGC力価を遺伝子発現に関連付けるために、インビトロバイオアッセイは、HEK293(ヒト胚腎臓)細胞を細胞あたり既知の多様性のGCを用いて形質導入し、次いで、形質導入の72時間後にIDS活性についての上清をアッセイすることにより、実施される。IDS活性は、0.1mLの水中に希釈された試料を0.1mLの100mmol/l 4MU-イズロン酸-2-サルフェートとともに37℃で1~3時間インキュベートすることにより、測定される。2mLの290mmol/lのグリシン、180mmol/lのクエン酸ナトリウム、pH10.9の添加により、反応を停止させ、遊離した4MUは、蛍光を4MUの標準的な希釈液と比較することにより、定量化される。より高い活性のある前臨床的および毒性ベクター調製物に対する比較により、産物活性の解釈が可能となる。
ベクター試料は、初め、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて、ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質標準曲線に対する総タンパク質について定量化される。等価部分の試料とキット中で提供されるMicro-BCA試薬とを混合することにより、決定がなされる。同じ手順は、BSA標準の希釈にも適用される。混合物は60℃でインキュベートされ、吸光度は562nmで測定される。標準曲線は、4-パラメータフィットを用いて、既知濃度の標準的な吸光度から作成される。未知の試料は、4-パラメータ回帰に従って、定量化される。
規化され、5x109GCが、還元条件下でのSDS-ポリアクリルアミド(SDS-PAGE)ゲルにて分離される。ゲルは、次いで、SYPROルビー色素を用いて染色される。任意の不純物バンドは、レーンあたり25、50、および100ngのタンパク質の同時に電気泳動されたBSA標準との比較により、デンシトメトリーにより定量化される。これらの量は、総AAVタンパク質試料の1%、2%、および4%を表す。3つのAAV特異的タンパク質VP1、VP2、およびVP3に加えて出現する染色されたバンドは、タンパク質不純物と考えられる。すべての不純物バンドは、参照タンパク質と比較され、不純物質量パーセントおよびおおよその分子量が報告される。SDS-PAGEゲルも用いられて、VP1、VP2、およびVP3タンパク質を定量化し、それらの比を決定する。
本研究では、MPSIイヌからのCSF試料の代謝物プロファイリングが実施され、これは、CSFメタボロームにおける実質的な疾患に関連する変更を明らかにした。最も著しい差異は、正常な対照と比較されたスペルミンレベルにおいて30倍を超える上昇であった。この知見は、MPSI患者試料およびMPSIのネコモデルにおいて確認され、MPSIIにおいても見出されることが期待される。スペルミンはHSに結合し、スペルミンの細胞取込みは、この相互作用に依存的である[M.Beltingら、Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338、317-323(1999);J.E.Welchら、T.H.Van Kuppevelt、M.Belting、Single chain fragment anti-heparan sulfate antibody targets the polyamine transport system and attenuates polyamine-dependent cell proliferation.International journal of oncology 32、749-756(2008)、オンライン公開EpubApr]。グリピカン-1などの細胞表面プロテオグリカンは、それらのHS部分を通してスペルミンに結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、HS鎖の細胞内切断は、結合スペルミンを細胞へ放出する(Beltingら、K.Ding、Sら、The Journal of biological chemistry 276、46779-46791(2001)、オンライン公開Epub Dec 14)。故に、インタクトなHSリサイクルは、スペルミン取込みのために必須である。MPSIでは、細胞外スペルミン蓄積が、不十分なHSリサイクルに起因するこの取込み機序の阻害を通して、またMPSにおいて蓄積する細胞外GAGへのスペルミンの単結合を通して、生じることがあり、スペルミン結合の平衡を好ましい細胞外分布へと転じる。さらなる研究は、MPSI CSFにおけるスペルミン蓄積に対するこれらの機序の相対的貢献に対処する必要がある。
Iにおける神経突起伸展成長に寄与する単一の調整因子ではないことも起こり得る。顕著には、HSを通じる多くの神経栄養性因子結合は、受容体を修飾し、細胞外マトリックスにおけるHSとの相互作用は、神経突起成長に影響し得る[D.Van Vactor、D.P.Wall、K.G.Johnson、Heparan sulfate proteoglycans and the emergence of neuronal
connectivity.Current opinion in neurobiology 16、40-51(2006);オンライン公開Epub Feb(10.1016/j.conb.2006.01.011)]。したがって、スペルミン蓄積は、MPSIにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子のうちの1つであり得る。
実験設計:この研究は、初めに、健康な対照からの試料と比較してMPSI患者CSF試料において有意に異なるレベルで存在した代謝物を検出するように設計された。MPSIHを有する小児および健康な対照からのCSF試料の限られた入手可能性に起因して、初期スクリーンは、ヒト試料における候補バイオマーカーを実質的に評価することを目的として、より多数のものが入手可能であるMPSIイヌからのCSF試料を用いて実施された。個々の未治療MPSIイヌからの総数15個のCSF試料が、分析のために入手可能であり、さらなる15個の試料が、健康な対照から得られた。予測的代謝物スクリーンにおけるMPSIイヌCSFにおけるスペルミン増大を同定した後、スペルミンは、遺伝子療法で治療されたMPSIイヌおよびネコの以前の研究からのCSF試料ならびに患者試料において回顧的に測定された。これらの分析のために各群に含まれた対象の数は、試料入手可能性により制限され、統計的考察に基づいておらず、したがって、幾つかの場合では、数は、統計的比較のために不十分である。インビトロ神経突起成長の研究のために、各状態について定量された細胞の数は、細胞あたりの分枝長さ、神経突起数、または神経突起の数における20%差異を検出するために状態あたり>30細胞が必要とされたということを示したパイロット実験に基づいた。細胞がプレーティングされ、指定の薬物で治療された後、ウェルは、コード化され、細胞画像の獲得、および神経突起長さおよび分岐化の手動定量化が、盲検レビュアにより実施された。同様の結果を伴う異なる基質[チャンバースライド(Sigma S6815)ではなくポリ-L-リジン(Sigma)コーティングされた組織培養プレート]を用いて、野生型およびMPSマウスニューロンの比較が繰り返された。同様の結果を伴う両方の基質を用いて、スペルミン付加を伴うおよび伴わない野生型ニューロンの比較を4回実施した。
変動性は、プールされたマトリックス試料の100%に存在するすべての内因性代謝物(すなわち、非器具性標準)について、中央値RSDを算出することにより、決定される。実験試料は、注射間で等しく配置されたQC試料を用いるプラットフォームランにわたって、無作為化された。
ACQUITY UPLCシステム(Waters Corp.、Milford、MA、USA)を用いて、LC分離を実施した。流速は、0.15mL/分であり、溶媒Aは、0.1%のギ酸であり、溶媒Bは、98/2のアセトニトリル/H2O(v/v)および0.1%のギ酸であった。溶出条件は以下の通りであった。0分にて2%のB、2分にて2%のB、5分にて60%のB、10分にて80%のB、11分にて98%のB、16分にて98%のB、17分にて2%のB、22分にて2%のB、35℃のカラム温度を伴う。Finnigan TSQ Quantum Ultra分析計(Thermo Fisher、San Jose、CA)を用いて、以下のパラメータを用いて、陽性イオンモードでMS/MS分析を行った:スプレー電圧4000V、キャピラリー温度270℃、シース気体圧35任意単位、イオンスイープ気体圧2任意単位、補助気体圧10任意単位、蒸発器温度200℃、チューブレンズオフセット50、キャピラリーオフセット35、およびスキマーオフセット0。以下の移行がモニターされた。スキャン幅0.002m/z、およびスキャン時間0.15sを用いる、203.1/112.1(スペルミン)、211.1/120.1(スペルミン-d8)。
the University of Minnesotaにより認可された。CSF
は、腰部穿刺により収集された。すべてのMPSI患者は、ハンター症候群の診断を受けており、試料収集前に酵素補充療法または造血幹細胞移植を受けていなかった。MPSI患者は、6~26ヶ月齢であった。健康な対照は、36および48ヶ月齢であった。
tracing and analysis in fluorescence microscopy images.Cytometry.Part A:the journal of the International Society for Analytical Cytology 58、167-176(2004);オンライン公開Epub Apr(10.1002/cyto.a.20022)]。幾つかの直径、神経突起の数、分岐点、および分枝長さは、手動でトレースされた。ニューロンJにトレースされた画像は、画像サイズに基づく変換係数を用いてマイクロメータに変換され、
2560x1920ピクセルの画像は、0.17マイクロメータ/ピクセルの変換計数を用いてマイクロメータに変換された。
data analysis.Nucleic Acids Research、(2012);オンライン公開Epub May 2、2012(10.1093/nar/gks374);J.Xiaら、MetaboAnalyst:a web server for metabolomic data analysis and interpretation.Nucleic Acids Research 37、W652-W660(2009);オンライン公開Epub July 1、2009(10.1093/nar/gkp356).J.Xiaら、MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.Nucleic Acids Research、(2015);オンライン公開Epub April 20、2015(10.1093/nar/gkv380)]。代謝物スクリーンにおける検出不可な値は、データセットにおいて観察された最小値に起因した。生ピークデータは、正常な試料の値の平均値に対して正規化され、ログ変換された。すべての他の統計的分析は、GraphPad Prism 6を用いて実施された。培養されたニューロン分枝の長さ、神経突起の数、および分岐を、ANOVA、続いて、Dunnett検定.により比較した。CSFスペルミンおよび皮質GAP43は、Kruskal-Wallis検定、続いて、Dunn検定により比較された。
1.代謝物プロファイリングによる高められたCSFスペルミンの同定
CSF代謝物の初期スクリーンが、MPSIのイヌモデルを用いて実施された。これらの動物は、IDUA遺伝子にスプライス部位変異を有し、MPSI患者のものと類似する
酵素発現の完全な喪失、ならびに臨床的および組織学的特徴の発達をもたらす[K.P.Menonら、Genomics 14、763-768(1992)、R.Shullら、The American journal of pathology 114、487(1984)]。CSF試料は、15匹の正常なイヌおよび15匹のMPSIイヌから収集された。CSF試料は、LCおよびGC-MSにより、代謝物の相対量について評価された。総数281個の代謝物が、質量分析によりCSF試料において積極的に同定されることができた。これらのうち、47個(17%)は、対照に対してMPSIイヌにおいて有意に高められており、88個(31%)は、対照に対して減少していた。群間で最も異なる50個の代謝物のヒートマップが図19Aに示される。同定された代謝物プロファイリングは、MPSIと正常なイヌとの間のポリアミン、スフィンゴ脂質、アセチル化アミノ酸、およびヌクレオチド代謝において差異を明示した。ランダムフォレストクラスター分析は、MPSIと正常なイヌとの間の代謝物差異に対する最大の寄与因子としてポリアミンスペルミンを同定した(図23)。平均して、スペルミンは、試料収集の時点で1ヶ月齢未満であった1匹のMPSIイヌを除いて、MPSIイヌにおいて30倍超高められていた。CSF中のスペルミンを定量的に測定するために、安定なアイソトープ希釈(SID)-LC-MS/MSアッセイが開発された。ハンター症候群を有する6匹の子犬(6~26ヶ月齢)、および2匹の健康な対照(36および48ヶ月齢)から、試料がスクリーニングされた。健康な対照の両方は、アッセイの定量限界(1ng/mL)未満のCSFスペルミンレベルを有したが、MPSI患者からのCSF試料は、定量限界を超える平均10倍であった(図19B)。MPSIH患者におけるスペルミン上昇は、スペルミン結合および取込みにおけるHSの周知の役割に一致しているようであった[M.Beltingら、Journal of Biological Chemistry
278、47181-47189(2003);M.Beltingら、Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338、317-323(1999);J.E.Welchら、International journal of oncology 32、749-756(2008))];正常およびMPSIイヌ脳試料は、ポリアミン合成経路における転写制御された酵素について同様のmRNA発現レベルを有したので、増大された合成は、CSFスペルミン上昇の原因とはならないようであった(図24)。スペルミン上昇が、ヘパラン硫酸貯蔵疾患の一般的な特性であるか、またはMPSIに特異的であるかを決定するために、スペルミンは、MPS VIIのイヌモデルからのCSF試料中で測定され、これは同様の上昇を示した(図25)。
軸索損傷後、ニューロンは、ポリアミン合成を上方制御し、これが神経突起伸展成長を促進する[D.Caiら、Neuron 35、711-719(2002);オンライン公開Epub Aug 15;K.Dengら、The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience 29、9545-9552(2009);オンライン公開Epub Jul 29;Y.Gaoら、Neuron 44、609-621(2004);オンライン公開Epub Nov 18;R.C.Schreiberら、Neuroscience 128、741-749(2004)]。したがって、本発明者らは、MPSニューロンにおいて記載された成長表現型にわたって異常な神経突起中のスペルミンの役割を評価した[Hocquemiller、S.ら、Journal of neuroscience research 88、202-213(2010)]。MPSIマウスからのE18皮質ニューロンの培養は、培養の4日後に、コロニーからの野生型マウスに由来するニューロンよりも多くの神経突起の数、分岐化、および総分枝長さを示した(図20A~20F)。APCHA、スペルミン合成の阻害剤を用いるMPSニューロンの治療は、有意に神経突起成長および分岐化を減少した。効果は、スペルミンを置換することにより逆転可能であった(図20A~20F)。同
じAPCHA濃度は、正常なニューロンの成長に影響を与えなかった(図26)。インビボで同定されたものと同様の濃度で、スペルミンを野生型ニューロン培養に加えることにより、神経突起成長および分岐化における有意な増大をもたらした(図20A~20F)。
GAP43、神経突起成長の中心的調整因子は、インビトロおよびインビボの両方で、MPSIIIマウスニューロンにより過剰発現されており、ニューロン培養において異常に活性化された同じ神経突起成長経路は、インビボにおいても活性がある。GAP43発現およびインビボでのスペルミン蓄積に対するIDUA欠損を評価するために、本発明者らは、未治療MPSIイヌおよびCNS指向遺伝子療法で治療されたものにおいてCSFスペルミンおよび脳GAP43レベルを測定した。本発明者らは、以前、イヌIDUA トランスジーンを有するアデノ随伴ウイルス血清型9ベクターの髄腔内注射を用いて治療された5匹のMPSIイヌについて記載した[C.Hindererら、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 23、1298-1307(2015)、オンライン公開Epub Aug]。MPSIイヌは、正常なIDUA酵素に対する抗体を産生することができ、したがって、2匹のイヌは、そのタンパク質に対する免疫耐性を誘導するために肝臓IDUA遺伝子移入を用いて新生児期に予め治療された。寛容化された両方のイヌは、AAV9治療後に正常値を十分に上回る脳IDUA活性を示した。3匹の寛容化されていないイヌは、様々なレベルの発現を示し、1匹の動物は、正常なものよりも高いレベルに到達し、他の2匹は、正常に近い発現を示した(図21A)。CSFスペルミン減少は、脳IDUA活性に反比例し、最も低いIDUA発現を伴う2匹のイヌにおいて未治療動物に対して3倍減少し、最も高い発現を伴う動物では20倍超減少した(図21A、21B~21H、および21K)。GAP43は、MPSIイヌの前頭皮質において上方制御され、発現は、すべてのベクター治療された動物において正常化された(図21I~21J)。
I in a canine model.Molecular Genetics and Metabolism、dx.doi.org/10.1016/j.ymgme.2016.06.006]。CSFスペルミンは、注射の6ヶ月後に上昇した(図22A)。CSFスペルミンの減少は、用量依存的であり、中および高ベクター用量の動物は、正常な範囲に到達し、一方で、CSFスペルミンは、低用量動物では部分的に減少したのみであった。IDUA欠損とCSFスペルミン蓄積との間の関連を独立的に確証するために、本発明者らは、MPSIのネコモデルにおけるCSFスペルミンレベルを評価した。本発明者らが以前に報告した遺伝子療法研究からのCSF試料を用いて、我々は、we found that未治療MPSIネコが高いCSFスペルミンを示したことを見出した(図22B)[C.Hinderer、P.Bell、B.L.Gurda、Q.Wang、J.P.Louboutin、Y.Zhu、J.Bagel、P.O’Donnell、T.Sikora、T.Ruane、P.Wang、M.E.Haskins、J.M.Wilson、Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of
mucopolysaccharidosis I.Molecular thera
py:the journal of the American Society of Gene Therapy 22、2018-2027(2014);オンライン公開Epub Dec(10.1038/mt.2014.135)]。フェリンIDUAを発現するAAV9ベクターの高用量の髄腔内投与は、CSFスペルミンレベルを正常化した(図22B)。
本研究では、本発明者らは、MPSIイヌからのCSF試料の代謝物プロファイリングを実施し、これは、CSFメタボロームにおける本質的な疾患に関連する変更を明らかにした。最も著しい差異は、正常な対照と比較されたスペルミンレベルにおいて30倍を超える上昇であった。この知見は、MPSI患者試料およびMPSIのネコモデルおよびMPS VIIのイヌモデルにおいて確認された。スペルミンは高い親和性を伴ってHSに直接結合し、スペルミンの細胞取込みは、この相互作用に依存的である[M.Belting、S.PERSSON、L.-A.Fransson、Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338、317-323(1999);J.E.Welchら、International journal of oncology 32、749-756(2008)]。グリピカン-1などの細胞表面プロテオグリカンは、それらのHS部分を通してスペルミンに結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、HS鎖の細胞内切断は、結合スペルミンを細胞へ放出する[Beltingら、上記引用;K.Dingら、The Journal of biological chemistry 276、46779-46791(2001);オンライン公開Epub Dec 14]。故に、インタクトなHSリサイクルは、スペルミン取込みのために必須である。IDUA欠損に起因する不十分なHSリサイクルは、このスペルミン取込み機序を阻害し、細胞外スペルミン蓄積を導くことができる。代替的には、細胞外GAGは、スペルミンを隔離し、好ましい細胞外分布へと平衡を転じ得る。この研究におけるLC-MS試料調製のために利用されるメタノール除タンパク工程は、可溶性HSも沈殿し、これは、CSF中で検出されたスペルミンが非結合であり、したがって、GAG結合ではなく取込み阻害が、細胞外スペルミン蓄積に関与していることを示唆する[N.Volpi、Journal of chromatography.B、Biomedical applications 685、27-34(1996);オンライン公開Epub Oct 11]。機能的神経ネットワークの形成および維持は、神経突起成長およびシナプス形成の正確な制御に必要である。発達中、CNS環境は、神経突起形成に対して益々阻害性となり、ミエリン関連タンパク質は、成人脳における神経突起成長を大いに遮断する。神経突起成長減少に向かうこの発達的転換は、GAP43発現における減少と並行して起こる[S.M.De la Monteら、Developmental Brain Research 46、161-168(1989);オンライン公開Epub4/1/]。持続的なGAP43発現、およびMPSニューロンにより示される誇張された神経突起伸展成長は、阻害および成長促進シグナルのこの正常なバランスを妨害し、異常な連結性および認知低下をもたらす。どのようにHS貯蔵が神経突起成長におけるこの増大を導くかということは確立されていない。多数の研究が、神経突起伸展成長におけるポリアミンの関係を指摘しており、軸索損傷後、スペルミンおよびその前駆物質プトレシンおよびスペリミジンの合成のための律速酵素が高められ、ミエリンからの阻害性シグナルの存在下でさえ強化された神経突起伸展成長が可能となる[Cia(2002)、Deng(2009)、Gao(2004)、すべて上記で引用されている]。さらに、プトレシンを用いるニューロンの治療は、CSFに直接注射される場合、神経突起成長を誘導し、これは、スペルミン合成の阻害剤により遮断される効果である(Deng(2009)、上で引用した)。ポリアミンが神経突起成長に対してそれらの効果を発揮する機序は知られていない。1つの潜在的な標的は、NMDA受容体であり、その活性化は、スペルミン結合により増強される(J.Lerma、Neuron 8、343-
352(1992);オンライン公開Epub2//(http://dx.doi.org/10.1016/0896-6273(92)90300-3))。NMDAシグナリングは、神経突起伸展成長を誘導し、受容体のスペルミン感受性サブユニットは、発達中、高度に発現される[D.Georgievら、Experimental cell research 314、2603-2617(2008);オンライン公開Epub Aug 15(10.1016/j.yexcr.2008.06.009);R.G.Kalb、Regulation of motor neuron dendrite growth by NMDA receptor activation.Development 120、3063-3071(1994);J.Zhongら、Journal of neurochemistry 64、531-539(1995)。顕著に、多くの神経栄養性因子は、HS修飾受容体を通じて結合し、細胞外マトリックス中のHSとの相互作用は、神経突起成長に影響を与えることができる(D.Van
Vactorら、Current opinion in neurobiology
16、40-51(2006);オンライン公開Epub Feb]。したがって、スペルミン蓄積は、MPSIにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子の1つであり得る。スクリーンされた15個のMPSIイヌCSF試料のうち、1つのみが、スペルミン濃度の正常な範囲内に含まれた。28日齢で、これは、研究に含まれた最も若い動物であった。この研究は、ハンター症候群を有する乳幼児では6ヶ月齢までにスペルミン濃度が既に高められていると実証しているが、この知見は、スペルミン蓄積が年齢依存的であり得ることを示す。さらなる研究は、MPS患者において長期的にCSFスペルミンレベルを評価する。ほとんどの患者が発達遅延の開始前に1~2年の正常な発達を経験するため、スペルミンがMPS患者において年齢に従って増大するならば、これは、認知低下の動力学を説明する。ニューロン成長を変更する代謝物の蓄積を誘引するためのHS代謝障害の潜在性は、MPSにおける酵素欠損および異常な神経突起成長表現型との間の新規関連性を指摘し、これは、これらの障害に関連する認知機能不全を説明することができる。さらなる研究は、MPSIIなどの他のMPSにおけるスペルミン上昇を確認する。これらの知見はまた、CSFスペルミンが、MPSのための新規CNS指向療法の薬力学を評価するための非侵襲性バイオマーカーとして有用であることを示す。CNS指向療法のためのさらなる試験は、認知的エンドポイントとCSFスペルミン変化との相関関係を評価する。
A.手順前スクリーニング評価
1.プロトコルビジット1:スクリーニング
主な調査者は、対象(または指定された介護者)がインフォームドコンセントに署名する際に十分に情報を得ることができるように、槽内(IC)手順に至るまでのスクリーニングプロセス、投与手順そのもの、およびすべての潜在的な安全性危険性を記載する。
適格性を吟味するために十分な時間を可能とするために、以下の手順が、第1のスクリーニングビジット~研究ビジット2(0日目)前の最大1週間の間の任意の時点で実施される。
●ガドリニウムを伴うおよび伴わない、頭部/頸部磁気共鳴画像法(MRI)[注意:対象は、ガドリニウムを受けるために適切な候補である候補がある(すなわち、eGFR
>30mL/分/1.73m2)。]
●頭部/頸部MRIに加えて、調査者は、屈曲/延伸研究による首のさらなるいずれか
の評価のための必要性を決定する
●MRIプロトコルは、T1、T2、DTI、FLAIR、およびCINEプロトコル画像を含む
●制度プロトコルに従う、頭部/頸部MRA/MRV(注意:●硬膜間/硬膜内処置の履歴を有する対象は、排除されてもよく、またはCSF流れの十分な評価、およびCSF空間内のコミュニケーションの起こり得る妨害または欠失の同定を可能とする、さらなる試験(例えば、放射性ヌクレオチドシステルノグラフィ)を必要としてもよい。
●神経放射線科医/神経外科医、対象の手順評価ミーティング:3部門からの代表者は、入手可能なすべての情報(スキャン、病歴、身体検査、ラボなど)に基づき、IC手順のための各対象の適格性を議論するために、電話会議(またはオンライン会議)をする。すべての試みは、IC手順を先に進めるか、または対象をスクリーンから排除するかについてのコンセンサスを成し遂げるためになされる必要がある(すなわち、各メンバーは、決断事項を受け入れるための準備がある必要がある)。
●MPS対象の特別な生理的必要性を考慮した、気道、首(短くなった/太くなった)、および頭部運動範囲(首屈曲の程度)の詳細なアセスメントを用いる、-28日目~1日目の麻酔処置前評価。
●成人腰部穿刺(LP)キット(協会によって供給される)
●BD(Becton Dickinson)22または25ゲージx3~7インチの脊椎ニードル(Quincke bevel)
●(脊椎ニードルの導入のために)介入者の裁量で使用される、同軸導入用ニードル(例えば、18G x 3.5インチ)
●旋回式(スピン)雄型ルアーロックを伴う4方向小口径停止コック
●雌型ルアーロックアダプタを伴うT-コネクタ延長セット(チューブ)、おおよその長さ6.7インチ
●髄腔内投与のためのOmnipaque180(イオヘキソール)
●静脈内(IV)投与のためのヨウ素化コントラスト
●注射用の1%のリドカイン溶液(成人LPキット中で供給されていない場合)
●充填済み10cc通常食塩水(滅菌)フラッシュシリンジ
●放射線不透過性マーカー(複数可)
●手術準備用機器/カミソリ
●挿管された対象の正確な位置を可能とするための枕/支持
●気管内挿管用機器、全身麻酔機械、および機械式通風装置
●術中神経生理学的モニタリング(IONM)機器(および必要とされる人員)
●AAV9.hIDUAベクターを含有する10ccのシリンジ、別の薬務マニュアルに従って、調整され、CT/手術室(OR)スイートに輸送される
●研究および手順のためのインフォームドコンセントを確認し、診療記録および/または研究ファイル内で文書化をする。制度上必要条件であるため、放射線科および麻酔科のスタッフからの手順についての別個の同意を得る。
●研究対象は、制度ガイドラインに従って、適切な病院治療室内に配置された静脈内アクセス(例えば、2つのIVアクセス部位)を有する。静脈内流体は、麻酔医の裁量で投与される。
●麻酔医の裁量および制度ガイドラインに従って、研究対象は、領域または手術/CT処置スイートを有する適切な患者治療室において、全身麻酔の投与とともに、気管内挿管を導入され、気管内挿管を受ける。
●腰部穿刺が実施され、初め、5ccの脳脊髄液(CSF)を除去し、引き続いて、大
槽の視覚化を補助するためにコントラスト(Omnipaque180)が髄腔内に注射される。適切な対象位置付け工作を実施して、コントラストの大槽への核酸を促進する。
●既にそうしていないならば、術中神経生理学的モニタリング(IONM)機器が、対象に取り付けられる。
●対象は、うつ伏せまたは横向き臥位で、CTスキャナ台上に配置される。
●適切であると考えられるならば、対象は、処置前評価の間安全であると判定される程度まで首を屈曲させる様式で、位置付けられ、位置付けられた後、通常の神経生理学的モニターシグナルが記録される。
●以下の研究スタッフおよび調査者(複数可)が、存在しているか、施設内に存在することが確認される:
○手順を実施する介入者/神経外科医
○麻酔科標榜医および呼吸器系技師(複数可)
○看護師および医師アシスタント
○CT(またはOR)技師
○神経生理学の技師
○研究所コーディネーター
●頭蓋底下の対象の皮膚は、適切に剃られる。
●CTスカウト画像が実施され、続いて、介入者が、標的位置をローカライズし、脈管構造を画像化することが必要と考える場合には、IVコントラストを用いる手順前プラニングCTが実施される。
●標的部位(大槽)が同定され、ニードル軌道が計画されると、制度ガイドラインに従って滅菌技法を用いて、皮膚は準備され、布を掛けられる。
●介入者により指示される場合、放射線不透過性マーカーが、標的皮膚位置に配置される。
●マーカーされた皮膚は、1%のリドカインを用いて湿潤により麻酔をかけられる。
●22Gまたは25Gの脊椎ニードルは大槽に向かって前進されるが、同軸導入用ニードルを使用する選択肢もある。
●ニードル前進の後、協会の機器を用いて実行可能な最も薄いCTスライス厚さ(理想的には≦2.5mm)を用いて、CT画像が得られる。連続的CT画像は、ニードルおよび関連する軟組織(例えば、傍脊柱筋群、骨、脳幹、および脊髄)の十分な視覚化を可能にするのに可能な最も少ない放射線量を用いる必要がある。
●正確なニードル配置が、ニードルハブ中のCSFの観察および大槽内のニードル先端の視覚化により、確認される。
●介入者は、ベクターを含有するシリンジが、滅菌野に近接しているが、滅菌野の外側に位置付けられていることを確認する。ベクターを取り扱う前またはそれを投与する前に、部門は、グローブ、マスク、および保護用メガネがあることを確認し、滅菌野の手順を補助するスタッフはそれらを装着する(滅菌野外の他のスタッフはこれらの手順を採用する必要はない)。
●短い(約6インチ)延長チューブは、挿入された脊椎ニードルに取り付けられ、これは次いで、4方向停止コックに取り付けられる。一旦、この機器が対象のCSFで「セルフプライム」されると、10ccの充填済み通常の食塩水フラッシュシリンジが、4方向停止コックに取り付けられる。
●ベクターを含有するシリンジが介入者に提供され、4方向停止コック上のポートに取り付けられる。
●ベクターを含有するシリンジに対して停止コックポートが開放されると、注射中、プランジャーへ過剰な力を適用しないように気を付けながら、シリンジ内容物が、ゆっくりと注射される(おおよそ1~2分間にわたって)。
●AAV9.hIDUAを含有するシリンジの内容物が注射されると、停止コックおよびニードルアセンブリが、取り付けられた充填済みシリンジを用いて1~2ccの通常食塩水をフラッシュできるように、停止コックが回される。
●用意ができたら、介入者は自分が対象から機器を取り出すことをスタッフに警告する。
●シリンジの動きにおいて、ニードル、延長チューブ、停止コック、およびシリンジは、ゆっくりと対象から取り出され、バイオハザード廃棄物入れまたは硬質容器(ニードルのため)へ廃棄するために手術トレイへ置かれる。
●調査者により指示されるように、ニードル挿入部位は、出血またはCSF漏出の徴候について調べられ、治療される。指示されるように、ガーゼ、手術用テープ、および/またはTegaderm手当用品を用いて、部位は手当される。
●対象は、CTスキャナから取り出され、ストレッチャー上に仰向けで配置される。
●麻酔を中止し、対象は、麻酔後ケアのための制度ガイドラインに従ってケアされる。神経生理学的モニターが研究対象から取り除かれることができる。
●対象が横たわっているストレッチャーの頭側は、回復中、若干上昇させる必要がある(約30度)。
●制度ガイドラインに従って、対象は適切な麻酔後治療室に輸送される。
●対象が、十分に意識を回復し、安定な状態となった後、対象は、プロトコル指定の評価のために適切なフロア/ユニットに入院する。神経学的評価は、プロトコルに従って実施され、主要な調査者は、病院および研究スタッフとの共同で対象ケアを監督する。
この研究の目的は、脳室内(ICV)注射、および腰部穿刺による注射を含むCSFへの投与のより慣用的な方法を評価することである。簡潔に言うと、この研究では、ICVおよびIC AAV投与がイヌにおいて比較された。ベクター投与は、非ヒト霊長類における腰部穿刺により評価され、一部の動物は、注射後にトレンデレンブルグ位置に配置され、その措置は、ベクターの頭蓋分布を促進することが示唆されている。イヌ研究では、ICVおよびICベクター投与は、脳および脊髄にわたって同様に効率的な形質導入をもたらした。しかし、トランスジーン産物に対する重度のT細胞応答に明らかに起因して、ICVコホート内の動物は脳炎を発症した。ICVコホートにおいてのみのこのトランスジーン-特異的免疫応答の発生は、トランスジーン発現の部位における注射手順からの局所的炎症の存在に関連付けられるのではないかと考えられる。非ヒト霊長類(NHP)研究では、腰椎槽へのベクター投与後の形質導入効率は、非常に大量の注射容量(総CSF容量のおおよそ40%)を用いることによる我々の以前の研究と比較して改善された。しかし、このアプローチは、IC投与よりもなお効率的でない。注射後のトレンデレンブルグでの動物の配置は、さらなる利益を提供しなかった。しかし、大量の注射容量は、ベクターの頭蓋分布を改善し得ることが見出された。
of the American Society of Gene Therapy.Oct 31 2014]。この研究では、本発明者らは、イヌにおいて緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子を発現するAAV9ベクターの脳室内および槽内投与
を比較した。我々は、脳室内送達がトランスジーン特異的免疫応答のさらなる危険性を有し得るが、両経路がCNSにわたる効果的な分布を成し遂げることを見出した。我々は、NHPにおける腰部穿刺によるベクター送達、および注射後のトレンデレンブルグ位に動物を配置することの影響も評価した。注射後の位置付けによる明確な効果は存在しなかったが、我々は、大量の注射容量がベクターの頭蓋分布を改善し得ることを見出した。
1.ベクター産生:GFPベクターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーを伴うニワトリベータアクチンプロモータ、人工イントロン、強化された緑色蛍光タンパク質cDNA、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素、およびウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを有するAAV血清型9カプシドからなる。GUSBベクターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーを伴うニワトリベータアクチンプロモータ、人工イントロン、イヌGUSB cDNA、およびウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを有するAAV血清型9カプシドからなる。以前記載されているように、ベクターは、HEK293細胞のトリプルトランスフェクションにより産生され、イオジキサノール勾配にて精製される[Lockら、Human gene therapy.Oct 2010;21(10):1259-1271]。
care and use of animals in researchの下、the National Referral Center for Animal Models of Human Genetic Disease of the School of Veterinary Medicine of the University of Pennsylvania(NIH OD P40-010939)で育てられた。
VIIイヌを含んだ。ベースラインMRIは、注射コーディネートを計画するためにすべてのICV治療されたイヌについて実施された。槽内注射は、以前に記載されているように実施した[Hindererら、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。ICV注射のために、イヌは、静脈内プロポフォールで麻酔され、気管内に挿管され、イソフルランを用いる麻酔下で維持され、定位固定フレームに配置された。皮膚は、滅菌的に準備され、注射部位にわたって切開がなされた。注射部位に単一の頭蓋穿孔をドリルで開け、そこを通して、26ゲージのニードルを予め決めた深さまで前進させた。配置は、CSFリターンにより確認された。ベクター(1mL中1.8x1013GC)は、1~2分間かけてゆ
っくりと注入された。安楽死および組織収集は、以前に記載されているように実施された[Hindererら、Molecular therapy:the journal
of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。
2011;22(11):1389-1401]。
1.イヌにおける脳室内および槽内ベクター送達の比較
リソソーム貯蔵疾患ムコ多糖症I型(MPSI)のイヌモデルを用いる我々の以前の研究は、大槽へのAAV9注射が、全脳および脊髄を効果的に標的化可能であることを実証した[Hindererら、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。この研究では、我々は、成体MPSIイヌの大槽または脳側室へ投与されたGFPレポーター遺伝子を発現するAAV9ベクターの分布を比較した。3匹のイヌは、ベクター(1.8x1013ゲノムコピー)の大槽への単回1mL注射を用いて治療された。3匹のさらなるイヌは、同じベクターの脳側室への単回ベクター注射を受けた。ICV注射により治療されたイヌのために、ベースラインMRIは、注射のためのより大きな脳側室を選択し、標的コーディネートを画定するために、実施された。指定された脳室を正確に標的化するために定位固定フレームを用いて、注射が実施された。
本発明者らは、以前、NHPの大槽または腰椎槽へのAAV9注射を比較し、腰部経路は、脊髄の標的化のために10倍効率的でなく、脳の標的化のために100倍効果的でない[C.Hindererら、Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014;1]。他の調査者は、その後、注射後に動物をトレンデレンブルグ位に配置することにより成し遂げられるベクターの頭蓋分布の改善を伴う、腰部穿刺によるAAV9投与を用いてより良好な形質導入を実証した[Myerら、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 31 2014]。このアプローチでは、ベクターは、過剰容量のコントラスト材料中に希釈されて、溶液の比重を増大し、トレンデレンブルグ位にある間に重力に駆動される分布を促進した。6匹の成体カニクイザルは、L3~4の間の空間へのGFPを発現するAAV9の単回注射(2x1013ゲノムコピー)を用いて治療された。ベクターは、イオヘキソール180コントラスト材料中、最終容量5mLに希釈された。4匹の動物を、注射後すぐに、10分間、処置台の頭側を-30°の角度で配置した。10分後、CSFにおけるコントラスト分布を確証するために、蛍光画像を獲得した。顕著に、この大量の注射容量を用いると(動物の総CSF容量のおおよそ
40%)[Reiselbachら、New England Journal of Medicine.1962;267(25):1273-1278]、コントラスト材料は、トレンデレンブルグ位に配置されていない動物においてさえ、全脊椎クモ膜下腔空間に沿って、大脳基底槽へと急速に分布した(図16Aおよび16B)。PCRによるベクターゲノム分布の分析(図17)およびGFP発現(図18A~18H)は、脳および脊髄にわたっての形質導入を実証した。形質導入された細胞の数または分布に対する注射後位置の明らかな影響は存在しなかった。以前報告されたように、髄腔内AAV投与後の末梢部へのベクター漏出および肝臓形質導入が存在した[Hindererら、Molecular Therapy-Methods&Clinical Development.12/10/online 2014;1;Haurigotら、Journal
of Clinical Investigation.Aug 2013;123(8):3254-3271]。肝臓形質導入の程度は、AAV9に対する既存の中和抗体(nAb)の存在に依存した。6匹の動物のうち4匹は、検出可能なベースラインAAV9 nAbsを有さず(力価<1:5)、2匹の動物(4051および07-11)は、1:40の力価を伴う、AAV9に対する検出可能な既存の抗体を有した。以前の結果と一致して、既存の抗体は、肝臓形質導入を遮断し、結果として脾臓への増大したベクター分布をもたらした[Wangら、Human gene therapy.Nov 2011;22(11):1389-1401が、CNS形質導入に対しては影響を有さなかった;Haurigotら、Journal of Clinical Investigation.Aug 2013;123(8):3254-3271]。
後頭下穿刺は、臨床的実施において一般的な手順ではないので、本発明者らは、脳側室および腰椎槽を含むCSFアクセスというより慣用的な部位を評価した。ここで、本発明者らは、腰部領域からの頭蓋ベクター分布を改善するために、より高い密度を有するベクター溶液を利用する方法、および注射後にトレンデレンブルグ位を利用する方法を評価した。
Neurology.Aug 2006;60(2):204-213;Hindererら、Molecular therapy:the journal of the
American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。そのような免疫応答についての潜在性は、内在的にも産生されるタンパク質を発現するベクターの送達についてトランスジーン産物が外来として認識されるかどうかに依存し、注射により引き起こされる炎症性応答でさえ、自身のタンパク質に対する耐性を打ち破ることができないことがある。内因性タンパク質
に対するトランスジーン産物の類似性は、GFPに対して観察されたT細胞応答の種類の不在に関与する可能性があるので、MPS VIIイヌにおけるICVベクター送達の研究における結果は、この概念を支持する。同じことが、トランスジーン産物に対して同様のタンパク質の産生を可能とするミスセンス変異を有する劣性疾患を有する患者についても当てはまることがある。したがって、免疫の危険性は、患者集団およびトランスジーン産物に応じて様々であり、幾つかの場合では、免疫抑制は、トランスジーンに対する破壊的T細胞応答を予防するために必要となり得る。現在の知見は、ICV投与経路ではなくICを用いることにより、有害な免疫応答が軽減される可能性があることを示唆している。
American Society of Gene Therapy.Oct 31
2014]。
アカゲザルにおける、ヒトIDSをコードするベクター、AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBGの2つの用量の髄腔内投与の安全性を評価するために設計された研究が実施されて、ヒト投与のための最小有効用量(MED)を上回る十分な安全性マージンを得た。
2のサルは、高用量の5x1013ゲノムコピー(GC)(N=3)で試験品目を受け、群3のサルは、1.7x1013GC(N=3)の低用量で投与された試験品目を受ける。一般的な安全性パネルの一部として、血液および脳脊髄液が収集される。
A.材料
試験品目-AAV9.CB7.hIDSはまた、AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBGとしても知られており、AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG.KanRとしても知られている。これらの命名は同義であり、互換的に使用されることができる。
試験系選択についての根拠:この研究は、CNS疾患のための遺伝子療法ベクターの髄腔内(IT)送達を含む。非ヒト霊長類(NHP)におけるCNSのディメンションは、我々の臨床的標的集団の裁量の代表的モデルとして機能を果たす。この研究は、IT注射後のベクターの用量関連毒性についてのデータを提供する。
CSFにおける白血球細胞数として示されるように、CSF髄液細胞増加が、高用量治療された群(群2)では3匹のうち2匹の動物で観察され、低用量治療された群(群3)では3匹のうち1匹の動物で観察された(図28)。このような髄液細胞増加は、1匹の高用量治療された動物(RA2203)を除くすべての動物において90日目に解決された。
アカゲザルにおける、ヒトIDSをコードするベクター、AAV9.CB7.hIDSの2つの用量の髄腔内投与の安全性に対する化学的に誘導された免疫抑制(IS)の影響を評価するために設計された研究が、実施される。研究は、実施例9に記載されたものに下記の修正を加えたものである。
試験品目、対照品目、それらの調製は、実施例9に記載されている。
アカゲザル(Macaca mulatta)(Rhesus macaques)を利用し、実施例9に記載されているように保持した。6匹の動物のコホート(6匹の雄)を研究のために用いる。動物を、最小ID~最高IDの1~6の番号に割り当てる。random.orgにより、番号1~6の無作為リストを作成し、無作為化されたら、動物を以下のように割り当てる:群1は、3匹の動物に割り当てられ、群2は、3匹の動物に割りてられた。
ラパマイシンは、髄腔内投与前の最低14日、および研究の90日目(90日目を含む)(+/-3日)まで、0.5~4mg/kgPO、SIDの用量で投与される。開始用量は、1mg/kgである。ラパマイシン用量は、研究期間中、可能な限り10~15μg/Lに近い標的トラフレベルを維持するように算出される。標的トラフ薬物レベルが1週間以内に達成されないならば、用量は、0.25~2mg/kg用量間隔に用量設定される。安定化期間の後、トラフレベルが2つの連続する採血について低すぎる場合は、調整がなされる。それらが高すぎる場合は、即時の調整がなされる。
MMFは、200mg/mLの濃度で、商業的に入手可能な経口溶液を用いて試験系に経口投与される。
コーティング錠剤。
各ラパマイシンピルは、錠剤の外側コーティングを溶解させるために、室温水または温水(必要ならば温水を用いて溶解を加速させる)のいずれかの希釈剤中に置かれる。おおよそ10mLの水が使用される。ピルは、黄色コーティングの下側は白色である。
of Pain Research.2012;5:31-38.doi:10.2147/JPR.S26603.]。
I.概要
ハンター症候群、ムコ多糖症II型(MPSII)は、グリコサミノグリカン(GAG)デルマタンおよびヘパラン硫酸のリソソーム異化作用に関与する酵素イズロン酸-2-スルファターゼ(I2S)の欠損により引き起こされる、X連鎖性遺伝疾患である。この欠損は、未分解GAGの細胞内蓄積に至り、結果的に進行性の重度の臨床的表現型をもたらす。遺伝子療法および体細胞療法を含む、疾患のための可能な治療的戦略を同定するために、多くの試みが、最近の20~30年でなされてきた。研究は、MPSIIのマウスモデルにおいて、ヒトI2Sを発現するAAV9ベクターであるAAV9.CB7.CI.hIDS.rBGの単回脳室内(ICV)投与の短期間(21日間)体内分布、発現、および活性を評価するために、実施された。MPSIIのマウスモデルにおいて、ICV経路を通して単回用量として投与されるAAV9.CB7.CI.hIDS.rBGの最小有効用量(MED)を決定するために、注射後(pi)3か月の観察期間を伴って、さらなる研究が設計され、実施された。研究はまた、幾つかの安全性エンドポイント(トランスジーンに対する液性免疫応答および脳組織病理学の評価)を含んだ。
A.AAV9.CB7.CI.hIDS.rBGとして同定された試験品目は、透明、無色の液体であり、qPCRにより測定された場合に1.18x1013GC/mLの、ddPCRにより測定された場合に2.057x1013GV/mLの力価を伴う。エンドトキシンは、<1.0EU/mLである。純度は100%である。試験品目は、≦-60℃で貯蔵された。
1.試験品目の調製:
試験品目は、滅菌リン酸緩衝化食塩水(PBS)を用いて、各用量群のために適切な濃度まで希釈された。希釈されたベクターは、湿った氷上で保管され、希釈の4時間後に動物へ注射された。
ハツカネズミ(Mus musculus)C57BL/6J I2Sγ/-(MPSII表現型、N=56、雄)およびC57BL/6J I2Sγ/+(野生型表現型、N
=8、雄)は、Jackson Laboratories(ストック番号024744)から元々得られたストックから、the Translational Research Laboratories(TRL)の動物施設において繁殖された。動物は、0日目(投与日)に2~3ヶ月齢であった。
1.研究W2356
0日目に、3~5群からのすべての動物(16匹の雄/群、W2356およびW2301研究を合わせて)に、AAV9.CB7.CI.hIDS.rBGをICV投与した。21日目に、マウス/3~5群からの群(8匹の雄/群、W2356研究)を安楽死させ、剖検に供し、脳、心臓、肺、肝臓、および脾臓を収集し、脳I2S活性および組織ベクター体内分布の評価のために、ドライアイス上で軽く凍結した。
0日目に、3~5群からのすべての動物(16匹の雄/群)に、AAV9.CB7.CI.hIDS.rBGをICV投与した。注射後(pi)2~3ヶ月:群1および2からの動物(8匹のマウス/群)を、オープンフィールド活動、Yメイズ活動、コンテキスト恐怖条件付け、および新規物体認識を含む一連の神経行動学的アッセイにおいて評価し、これらのエンドポイントにおいて疾患状態(MPSII遺伝子型)の効果が存在するかを決定した。疾患の明らかな効果が観察される場合、8匹のマウス/群3~5からの群もまたそのアッセイにおいて評価され、ベクターを用いた治療が応答に対して効果を有するかどうかを決定した。
ICV経路は、最小限に侵襲的であり、マウスにおいて手術処置を必要としないので(首の皮膚および筋肉の切開が必須である大槽経路と比較して)、ICV経路を選択した。マウス活動記録を含む幾つかの神経行動学的エンドポイントを含んだので、生存手術を含まない非侵襲的な注射は好ましいものであった。マウスおよび大型動物の両方において、脳脊髄液(ICVまたは大槽)へのAAV9の単回注射は、全CNS内のニューロンを標的とすることが、本発明者らおよび他者らによって以前実証された(Dirrenら、Hum.Gene.Therapy 25、109-120(2014);Snyderら、Hum.Gene Ther 22、1129-1135(2011)、Federiciら、Gene Therapy 19、852-859(2012)、Haurigotら、J Clin Invest 123、3254-3271(2013)、Bucherら、Gene Therapy 21、522-528(2014)、Hindererら、Mol Ther:22、2018-2027(2014)、およびMol
Ther-Methods&Clin Dev 1、14051(2014)]。Haurigotらにより公開されたデータ(2013)は、別のリソソーム貯蔵疾患のコンテキストにおいてICVと大槽注射との比較を詳しく述べており、2つの投与経路が、ト
ランスジーン発現および体内分布の点で等価であることを実証している。
動物は、病的状態/死亡について、毎日モニターされた。動物は、一般的な外観、毒性の徴候、行動における苦痛および変化について、毎日、ケージ横からの視覚的観察によりモニターされた。これらのデータは、この非GLP研究に記録されなかった。
オープンフィールドにおける自発的活動が、光ビーム活動システム(PAS)-オープンフィールド(San Diego Instruments)を用いて測定された。このアセスメントでは、単一の10分間トライアルの間、マウスは個別に、アリーナに配置された。一般的な運動および飼育活動を評価するために、平方向および垂直方向のビームブレイクが収集された。
Yメイズ自発的変更は、げっ歯類の新規環境を探索する意欲を測定するための行動学的試験である。試験は、互いに120°の角度で3本の白色不透明のプラスチックアームを有する、Y形状のメイズで行われた。メイズの中心に導入された後、動物は、3本のアームを自由に探索することを許可される。げっ歯類は、典型的に、以前訪問したものへ戻るよりも、メイズの新規アームを探索することを好む。複数のアームエントリの経過にわたって、対象は、最近訪問したアームへ入る回数が減る傾向を示すはずである。変更のパーセンテージを算出するために、アームエントリの数および三つ組の数を記録する。エント
リは、アーム内に四肢のすべてが存在するものとして定義される。この試験は、マウスのトランスジェニック系統における認知欠損を定量し、新規化学物質の認知を認知に対するそれらの効果について評価するために、使用される。海馬、隔膜、前脳基底膜、および前頭前皮質を含む脳の多くの部分がこのタスクに関与している。この研究では、標準的なY形状メイズ(San Diego Instruments)を用い、8分間のトライアルの間のアームエントリの順番および数を記録した。自発的変更(SA)は、以前に入れたアームを即時に引き戻すことなく、メイズのすべての3本のアームへの連続的エントリとして、定義された。アームエントリの総数(AE)は、運動活動の尺度として収集された。自発的変更パーセントは、%SA=(SA/(AE-2)*100)として算出された。
これらのタスクでは、動物は、条件付けされていない嫌忌的刺激(US)、通常はフットショックを用いる時間的関連性のために、新規環境、またはトーンなどの感情的に中立の条件付け刺激(CS)を怖がるよう学習する。同じコンテキストまたは同じCSに曝露されたとき、条件付けされた動物は、フリーズ行動を示す(Abelら、Cell 88:615-626.1997)。訓練日に、マウスに、独自の条件付けチャンバー(Med Associates Inc)を300秒間探索させた。300秒の期間のうち248~250秒間、シグナルなしの1.5mAの連続的なフットショックが加えられた。チャンバーにおいてさらなる30秒後、マウスは、各自のホームケージへ戻された。24時間後、訓練が行われるのと同じチャンバー内で、連続5分間、空間的コンテキストの回想が評価された。フリーズ行動をスコア付けするために使用されるソフトウェアを用いて、記憶が評価された(Freezescan、CleverSys Inc)。訓練セッションの2.5分間の刺激前時期(フットショックの実施前)におけるフリーズパーセントが、チャンバーに再度曝露された際のフリーズパーセントと比較される。フリージングにおける増大は、フットショックの回想(すなわち、学習が存在したこと、および動物がチャンバーとフットショックを関連付けたこと)を示す。
新規物体認識(NOR)タスクを用いて、CNS障害のげっ歯類モデルにおける認知、特に、認知記憶を評価する。この試験は、げっ歯類が馴染みにある物体よりも新規物体を探索するのにより多くの時間を過ごす自発的傾向に基づく。新規物体を探索するという選択は、学習および認知記憶の使用を反映している。新規物体認識タスクは、一般に高さおよび容積が一致しているが、形状および外観が異なっている2つの異なる種類の物体を有するオープンフィールドアリーナにおいて実施される。慣らしの間、動物は、何もないアリーナを探索することを許可される。慣らしの24時間後、動物は、等しい距離に配置された2つの同一物体を有する馴染みのあるアリーナに曝露される。翌日、長期認知記憶を試験するために、マウスは、馴染みのある物体および新規物体が存在するオープンフィールドを探索することを許可される。各物体を探索して過ごした時間と、識別指標パーセンテージとが記録される。この研究では、実験機器は、白色床上の灰色長方形アリーナ(60cmx50cmx26cm)と、金属バー3.8x3.8x15cmおよび直径3.2cmx長さ15cmのPVCパイプである2つの独特の物体から構成された。5日間の慣らし期間の間、マウスは、1~2分間/日ハンドリングされ、5分間/日、何もないアリーナを探索することが許可された。訓練期間の間、2つの同一の物体がアリーナ中に配置され、マウスは、15分間、物体を探索することが許可された。回想期間では、マウスは、馴染みのある1つの物体と1つの新規物体とを有するアリーナに戻された。正常なマウスは、優先的に新規物体を探索する。すべてのセッションが記録され、物体を探索するのに過ごした時間が、オープンソースイメージ分析プログラム[PatelらFront Behav Neurosci 8:349(2014)]。
1.血清およびCSF中のI2S活性
血清およびCSF I2S活性のための血液は、注射のおおよそ3ヶ月後の剖検時に収集された。血清は血液から分離され、血清およびCSFはドライアイス上で凍結され、分析時まで-80℃で貯蔵した。I2S活性は、10μL試料を、0.1Mの酢酸ナトリウムおよび0.01Mの酢酸鉛、pH5.0中に溶解した20μLの1.25mMの4-メチルウンベリフェリル(MU)-L-イドピラノシドウロン酸2-サルフェート(Santa Cruz Biotechnology)とともにインキュベートすることにより、測定された。37℃で2時間インキュベートした後、45μLのMcIlvain緩衝液(0.4Mのリン酸ナトリウム、0.2Mのクエン酸ナトリウム、pH4.5)および5μLの組換えヒトイズロニダーゼ(Aldurazyme、0.58mg/mL、Genzyme)を反応混合液へ加え、一晩37℃でインキュベートした。混合液をグリシン緩衝液、pH10.9で希釈し、放出された4-MUを蛍光(励起365nm、発光450nm)により定量化し、遊離4-MUの標準希釈液と比較した。
血清抗-hI2S抗体の測定のための血液が、研究W2356(21日目)および研究W2301の最終的な剖検エンドポイント(おおよそ3ヶ月)にて、心臓穿刺により収集された。血清は分離され、ドライアイス上で凍結され、分析時まで-80℃で貯蔵した。ポリスチレンプレートは、pH5.8に滴定されたPBS中の組換えヒトI2S(R&D
Systems)5μg/mLを用いて一晩コーティングされた。プレートは洗浄され、中性PBS中の2%のウシ血清アルブミン(BSA)中で1時間ブロッキングされた。次いで、プレートは、PBS中の1:1000に希釈された血清試料とともにインキュベートされた。結合された抗体は、2%のBSAを伴うPBS中の1:10,000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗-マウス抗体(Abcam)を用いて検出された。アッセイは、テトラメチルベンジジン基質を用いて発展され、450nmでの吸光度を測定する前に、2Nの硫酸を用いて停止された。力価は、恣意的に1:10,000の力価を割り当てた、陽性血清試料の連続希釈により作成された標準曲線から決定された。
Mix、Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)により実施された。
フォワードプライマー:5V-TTCCCTCTGCCAAAAATTATGG-3V、配列番号16、
リバースプライマー:5V-CCTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGCT-3V、配列番号17、
プローブ:6FAM-ACATCATGAAGCCCC-MGBNFQ、配列番号18。
Immunoresearch)であった。
オープンフィールドについては、データはエクセルに入力され、Graphpad Prismを用いて分析した。Yメイズについては、データはエクセルに入力され、Graphpad Prismを用いて分析した。CFCについては、Freezescan、CleverSys Incが使用された。NORについては、MATLAB実装およびユーザガイド:www.seas.upenn.edu/~molneuro/autotyping.htmlが利用された。
治療されたマウスおよび未治療マウスにおける組織GAG含有量、Hex活性、および脳貯蔵病変は、一元ANOVA、続いて、Dunnettの多重比較検定を用いて比較された。オープンフィールドおよびYメイズデータは、Studentのt-検定を用いて
分析された。二元ANOVAおよびDunnettの事後(post-hoc)分析を、恐怖条件付けデータに適用して、トライアルおよび遺伝子型効果を評価した。新規物体認識試験のために、各群についてt-検定を用いて、次いで、多重比較のためにBonferroni補正を用いて、馴染みのある物体を探索する時間に対する新規物体を探索する時間を比較した。
死亡は全く観察されなかった。ベクターを用いた治療に関連したと考えられた臨床的観察は存在しなかった。
C57BL/6 I2S γ/-(MPSII)マウスへの最高3x1010GC(5.2x1010GC、ddPCR方法)でのAAV9.CB7.CI.hIDS.rBGのICV投与は、十分寛容化されており、臨床的徴候または死亡を伴わず、CNSおよび末梢組織、特に肝臓への分布をもたらし、注射されたウイルス粒子のCSFから末梢血への部分的な再分布を示した。
る疾患関連形態の改善に対応して、長期記憶(新規物体認識)の1つの測定において改善が存在したが、長期記憶の他の測定、コンテキスト恐怖条件付けでは改善が存在しなかった。NORの改善では明らかな用量応答はみられなかった。CNS機能の他の試験、オープンフィールド試験およびYメイズにおけるMPSIIマウスのパフォーマンスは、野生型マウスのものに匹敵し、したがって、ベクターで治療されたマウスは、これらのアッセイで評価されなかった。
AAV9.CB7.hIDS(ヒトイズロン酸-2-スルファターゼ発現カセットを含有する組換えアデノ随伴ウイルス血清型9カプシド)。産物は、単回用量の槽内(IC)投与として送達される。2つの用量レベル、1.3×1010ゲノムコピー(GC)/g脳質量(用量1)、および6.5×1010GC/g脳質量(用量2)が評価され得る。投与された総用量は、研究対象の年齢に基づくそれらの推定脳サイズを説明するものである。投与される産物の総容積は、5mL未満であり得る。
●重度のMPSIIを有するか、または有することが予想される小児対象に投与された単回槽内(IC)用量の後の24週間にわたってAAV9.hIDS試験製品の安全性および忍容性を評価すること。
●AAV9.hIDS試験製品の長期間の安全性および忍容性を評価すること。
●脳脊髄液(CSF)、血漿、および尿におけるバイオマーカーに対するAAV9.hIDS試験製品の効果を評価すること。
●認知、行動学的、および適応機能の神経発達学的パラメータに対するAAV9.hIDS試験製品の効果を評価すること。
●CSF、血漿、および尿におけるベクター排出を評価すること。
●AAV9.hIDS試験製品の免疫原性を評価すること。
●CNSに対する物理的変化に対するAAV9.hIDS試験製品の効果を探索すること。
●疾患の全身兆候に対するAAV9.hIDS試験製品の効果を探索すること。
●聴力に対するAAV9.hIDS試験製品の効果を探索すること。
●IV ERT(エラプラーゼ(登録商標))を一時的に中止している対象における血漿および尿中のバイオマーカーに対するAAV9.hIDS試験製品の効果を探索すること。
●生活の質および睡眠測定に対するAAV9.hIDS試験製品の効果を探索すること。
年齢ごとに推定される脳質量は、公開されたデータに基づく(Dekaban Ann Neurol.1978 Oct;4(4):345-56(1978)。
主要なエンドポイント:
●24週目までの安全性:AEおよび深刻な有害事象(SAE)
二次エンドポイント:
●104週目までの安全性:AE報告、ラボ評価、バイタルサイン、ECG、身体検査、および神経学的評価
●CSF(GAG、12S活性)、血漿(GAS、I2S活性)、および尿(GAG)におけるバイオマーカー。
●認知、行動学的、および適応機能の神経発達学的パラメータ:
○乳幼児発達のBayleyスケール、3rd Edition(BSID-III)(Bayley 2005)または小児用Kaufmanアセスメント群、2nd Edition(KABC-II)(Kaufman 2004)。
○Vineland適応行動スケール、2d Edition、包括的対談形態(VABS-II)(Sparrowら、2005
AAV9.hIDSデオキシリボ核酸(DNA)に対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、CSF、血漿、および尿におけるベクター濃度。
●免疫原性測定
○CSFおよび血清中の、AAV9に対する中和抗体力価およびI2Sに対する結合抗体力価
○酵素結合免疫スポット(ELIスポット)アッセイ:AAV9およびI2Sに対するT細胞応答
○フローサイトメトリー:AAV-およびI2S-特異的調節T細胞
●脳の磁気共鳴画像法(MRI)により評価されたCNS構造異常さ
●腹部のMRIおよび超音波により評価された肝臓および脾臓サイズ
●聴覚脳幹応答(ABR)試験により測定された聴力変化
●IV ERT(エラプラーゼ(登録商標))を一時的に中止している対象における、血漿および尿総GAG、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸
●PedsQL(バージョン4)
●睡眠スケールの全体的印象
●用量1コホートに3人の対象。
●用量2コホートに3人の対象。
●IDMCは、さらなる対象を追加することを推奨してもよい。
●血漿、線維芽細胞、または白血球中で測定されるような酵素活性により確認される、MPSII診断の文書を有する。
●18ヶ月齢以上の男性であり、以下の基準のうちの1つを満たす:
○スクリーニング時に6歳未満、かつ、神経認知スコア試験≦77を有するが、スコアリング(BSID-IIIもしくはKABC-II)下限より上回る、または
○6歳未満であり、かつ、連続して>1の標準偏差の低下を有する、
○神経認知試験(BSID-IIIもしくはKABC-II)、または
○スクリーニング時に4歳未満であり、以下の基準の両方を満たす:
■IDSの完全な欠失、またはIDS遺伝子の大きな(すなわち、スパニング≧1エクソン)欠失/転位、および
■同じIDS変異を有する重度のMPSIIと診断された兄弟姉妹
●IC注射についての禁忌を有する。
●ISに対する禁忌を有する。
●脳室腹腔(VP)シャントを有する。
●造血幹細胞移植(HSCT)を受けている。
●髄腔内(IT)投与によるイズルスルファーゼ[エラプラーゼ(登録商標)]を受けた。
●スクリーニング前3ヶ月以内である。
●任意の時点でITイズルスルファーゼ(Elaprase(登録商標))を受け、PIの判断では、対象を危険な状況に置く可能性のある、IT投与に関連すると考えられる有意なAEを経験した。
●IVイズルスルファーゼ[エラプラーゼ(登録商標)]を受け、IVに関連すると推測されるアナフィキラシーを含む重大な過敏性反応を経験した。
●イズルスルファーゼ[エラプラーゼ(登録商標)]投与。(現在IVイズルスルファーゼの投与を受けていて、投与中断または週1回とは異なる投与レジメンが必要な場合には、医療用モニタを用いた議論が必要とされる)
1.対象の法的な後見人(複数可)が、研究の性質が説明された後、研究に関連する任意の手順を開始する前に、署名された書面のインフォームドコンセントを提出する意思があり、提出することが可能である。
2.18ヶ月齢以上の男性である。
3.以下の基準の1つを満たす。
a.MPSIIの診断文書を有し、かつ、4ヶ月齢以上、5歳未満であり、かつ、>55および≦77の神経認知試験スコアを有するか(BSID-IIIもしくはKABC-II)、または
b.MPSIIの診断文書を有し、≧4ヶ月および<5歳であり、かつ、連続した神経認知試験(BSID-IIIもしくはKABC-II)において≧1の標準偏差の低下を有し、>55の試験スコアを有するか、または
c.対象と同じIDS変異を有し、かつ、遺伝学者の意見ではMPSIIの重度の形態を遺伝した、重度のMPSIIを有すると相関的に診断されている
4.補助の有無に関わらず、必要とされるプロトコル試験を完了するために、十分な聴力および視力を有し、試験日に妥当な場合には、補助器具を装着することに従う
以下の排除基準のいずれかを満たす対象は、研究に参加する適格性はない。
5.以下のいずれかを含むIC注射についての禁忌を有する。
a.研究に参加する神経放射線科医/神経外科医のチーム(部門あたり1人)によるベースラインMRI試験のレビューにより、IC注射についての禁忌が示される。
b.研究に参加する神経放射線科医/神経外科医のチームによる入手可能な情報のレビューに基づき、IC注射に対する禁忌を結果としてもたらす、以前の頭部/頸部手術の経歴。
c.コンピュータ断層撮影(CT)、コントラスト物質、または全身麻酔に対して任意の禁忌を有する。
d.MRIまたはガドリニウムに対するいずれかの禁忌を有する。
6.<30mL/分/1.73m2の推定の糸球体濾過速度(eGFR)を有する、プレドニゾン、タクロリムス、またはシロリムスを用いた治療を禁忌とし得る任意の状態を有する。
7.MPSIIに起因しない任意の神経認知欠損、またはPIの意見では研究結果の解釈を混同する可能性のある神経精神医学的状態の診断を有する。
8.腰部穿刺に対していずれかの禁忌を有する。
9.室内シャントを有する。
10.造血幹細胞移植(HSCT)を受けている。
11.AAVに基づく遺伝子療法製品を用いた前治療を受けた。
12.髄腔内(IT)投与によるイズルスルファーゼ[エラプラーゼ(登録商標)]を受けた。
13.イズルスルファーゼ[エラプラーゼ(登録商標)]IVを受け、IVイズルスルファーゼ投与に関連すると推測されるアナフィキラシーを含む重大な過敏性反応を経験した。現在IVイズルスルファーゼの投与を受けていて、投与中断または週1回とは異なる投与レジメンが必要な場合には、神経認知欠損医療用モニタを用いた議論が必要とされる。
14.どちらが長期であってもよいが、インフォームドコンセントフォームICF)に署名する前の、1日目の30日以内、または5半減期以内に、任意の調査製品を受けている。
15.スクリーニングの前の少なくとも3ヶ月間で完全に寛解していない、リンパ腫の任意の病歴、または皮膚の扁平上皮細胞もしくは基底細胞癌腫以外の別の癌の病歴。
16.マイクロリットル(μL)あたり<100,000の血小板数を有する。
17.対象が、Gilbert症候群の以前に知られた病歴を有さず、総ビリルビンの<35%の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、スクリーニング時にアミノトランスフェラーゼ(ALT)もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)>3×ULN、または総ビリルビン>1.5×ULNを有する。
18.最大限の医学的治療にも関わらず、制御されていない高血圧(収縮期血圧[BP]>180mmHg、弛緩期BP>100mmHg)
19.ヒト免疫欠損ウイルス(HIV)もしくはB型肝炎もしくは肝炎ウイルス感染の病歴を有するか、またはB型肝炎表面抗原もしくはB型肝炎コア抗体、もしくはC型肝炎もしくはHIV抗体についてのスクリーニング試験で陽性を有する。
20.臨床部門の従業員、もしくは研究の実施に関与した任意の他の個人の一等親の家族であるか、または臨床部門の従業員もしくは研究の実施に関与した他の個人である。
21.PIの意見では対象の安全性を損なう可能性のある臨床的に有意なECG異常値を有する。
22.PIの意見では対象の安全性、または研究参加の成功、または研究結果の解釈を損なう可能性のある、重大なまたは不安的な医学的または心理学的状態を有する。
23.PIの意見において対象を危険な状況へと置く可能性のある制御されていない発作を有する。
免疫抑制療法に関連する排除基準。
24.タクロリムス、シロリムス、またはプレドニゾンに対する過敏反応の病歴を有する。
25.主要な免疫欠損(例えば、一般的な不定の免疫欠損症候群)、脾摘出、または対象を易感染性とする任意の基底状態の病歴を有する。
26.スクリーニングの少なくとも12週間前に完全に解決されていない、帯状疱疹(VZV)、サイトメガロウイルス(CMV)、またはEpstein-Barrウイルス(EBV)感染を有する。
27.少なくともビジット2の8週間前に解決されていない、入院または非経口抗感染薬を用いる治療を必要とする任意の感染を有する。
28.ビジット2前の10日以内に経口抗炎症薬(抗ウイルス薬を含む)を必要とする
任意の活性のある感染を有する。
29.スクリーニング中に、活動性結核(TB)、またはQuantiferon-TBゴールド試験で陽性の病歴を有する。
30.ICFに署名する前の8週間以内に任意の生ワクチンを有する。
31.ICFに署名する前の8週間以内に大手術を受けたか、または研究期間中に計画された大手術を受けた。
32.登録の6ヶ月以内にアデノイド切除術または扁桃摘出術の必要性が予期される。
33.<1.3×103/μLの絶対的好中球数を有する。
34.免疫抑制療法に適切でないとPIが考える任意の状態またはラボ的異常値を有する。
Claims (14)
- 少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療的レジメンにおいてヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(hIDS)欠損を治療するための、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含む懸濁液であって、
(a)前記複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の懸濁液が、
(i)AAV9カプシドおよびベクターゲノムを含むrAAVであって、前記ベクターゲノムが、AAV5’逆位末端配列(ITR)、および発現カセット、およびAAV3’ITRを含み、前記発現カセットが、ヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(hIDS)の発現を導く調節配列の制御下にある前記hIDSをコードする配列番号1の配列を有する核酸配列を含み、前記調節配列が、サイトメガロウイルス最初期(CMV IE)エンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモータ、ニワトリベータアクチンイントロン、およびウサギベータグロビンポリアデニル化(polyA)シグナル配列を含む、rAAV、ならびに
(ii)生理学的に適合する水性緩衝液を含む製剤緩衝液、ならびに任意選択の界面活性剤および賦形剤
を含み、
(b)前記少なくとも第1の免疫抑制剤が静脈内コルチコステロイドであり、
(c)前記少なくとも第2の免疫抑制剤が経口コルチコステロイドであり、
(d)少なくとも1つの免疫抑制剤の投与が、前記rAAVの送達の前または前記送達と同日に開始され、
(e)前記免疫抑制剤のうちの少なくとも1つの投与が、ベクター投与後少なくとも8週間継続される、前記懸濁液。 - 請求項1に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記rAAVが、配列番号3のヌクレオチド(nt)2~3967を含むベクターゲノムを含む、前記懸濁液。
- タクロリムス、シロリムス、またはそれらの組み合わせを含むマクロライドである1つ以上の免疫抑制剤がさらに併用される、請求項1または請求項2に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液。
- 請求項3に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、第1の用量のマクロライドが、前記rAAVの投与前に送達される、前記懸濁液。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記免疫抑制剤のうちの少なくとも1つの投与が、前記rAAVの投与後48週で中止される、前記懸濁液。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記懸濁液が、6~9のpHを有し、任意選択で、前記懸濁液が、6.8~7.8のpHを有する、前記懸濁液。
- 請求項1~6のいずれかに記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記rAAVが、
(i)約1.3x10 10 GC/g脳質量、
(ii)約1.9x10 10 GC/g脳質量、
(iii)約6.5x10 10 GC/g脳質量、
(iv)約9.4x10 10 GC/g脳質量、または
(v)約4x10 11 GC/g脳質量
の用量で髄腔内注射によって投与可能である、前記懸濁液。 - 請求項1~6のいずれかに記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記rAAVが、約4x10 8 GC/g脳質量~約4x10 11 GC/g脳質量の用量で髄腔内注射によって投与可能である、前記懸濁液。
- 請求項1~6のいずれかに記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記rAAVが、1.9x10 11 GC/g脳質量~5.6x10 11 GC/g脳質量の用量で髄腔内注射によって投与可能である、前記懸濁液。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、患者が初めにrAAV送達の前に静脈内コルチコステロイドを事前投与され、および/または患者がrAAV送達の後に経口コルチコステロイドを投与される、前記懸濁液。
- 請求項3、4、または10のいずれか一項に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、タクロリムスもしくはシロリムスまたはそれらの組み合わせを含む1つ以上のマクロライドが、rAAV送達の後に送達される、前記懸濁液。
- 請求項10または請求項11に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記懸濁液が、ムコ多糖症II型(MPSII)または重度のハンター症候群に罹患している患者に投与される、前記懸濁液。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記rAAVが、配列番号3のベクターゲノムを有する、前記懸濁液。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載の少なくとも第1の免疫抑制剤および少なくとも第2の免疫抑制剤を用いる治療レジメンにおいてhIDS欠損を治療するためのrAAVを含む懸濁液であって、前記懸濁液または前記rAAVが槽内注射を介してまたは脳室内(intraventricular)注射を介して、任意選択で、脳室内(intracerebroventricular)注射を介して、任意選択で、大槽への注射を介して投与される、前記懸濁液。
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