JP2020537637A - ムコ多糖症ｉｉ型を治療するための遺伝子療法 - Google Patents

ムコ多糖症ｉｉ型を治療するための遺伝子療法 Download PDF

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Abstract

ｈＩＤＳ遺伝子を含有する発現カセットのＡＡＶ９介在髄腔内／槽内および／または全身送達と、２つ以上の免疫抑制剤とを含む併用治療レジメンが、本明細書で提供される。ハンター症候群およびハンター症候群に関連する症状を治療するために有用な、これらのベクターおよび組成物を含有する方法およびキットも提供される。

Description

連邦政府支援研究についての記述
本発明は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの認可番号第Ｒ０１ＤＫ５４４８１号、第Ｐ４０ＯＤ０１０９３９号、および第Ｐ３０ＥＳ０１３５０８号の下、政府支援を受けて構築された。米国政府は、本発明において一定の権利を有することができる。
１．導入
本発明は、ハンター症候群としても知られているムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）を治療するための遺伝子療法アプローチに関する。
ハンター症候群としても知られているＭＰＳＩＩは、主に男性の、１００，０００人中１人〜１７０，０００人中１人に影響を与える、稀なＸ−連鎖劣性遺伝子疾患である。この進行性かつ破壊的な疾患は、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸のリソソーム異化作用に必要とされる酵素であるリソソーム酵素、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ、代替的にはＩ２Ｓと称される）の欠損に至る、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子における変異により引き起こされる。ＧＡＧ（グリコサミノグリカン）と呼ばれるこれらの偏在的な多糖は、ＭＰＳＩＩ患者の組織および器官に蓄積し、結果として、特徴的な貯蔵病変および多様な疾患続発症をもたらす。疾病率および死亡率は、この患者集団において高く、重度の表現型（神経認知悪化を特徴とする）を伴う患者では、平均年齢１１．７歳で死亡することが報告されており、軽度または減弱した表現型を伴う患者では、２１．７歳での死亡が報告されている。
ＭＰＳＩＩを有する患者は、出生時には正常であるように見えるが、疾患の徴候および症状は、典型的には、重度形態では、１８ヶ月齢〜４歳で出現し、減弱した形態では、４〜８歳で出現する。すべての罹患患者に共通する徴候および症状は、低身長、特徴的な顔つき、巨頭症、巨舌症、聴力喪失、肝および脾腫大、多発性骨形成性不全症（dystosis multiplex）、関節拘縮、脊椎管狭窄、ならびに手根管症候群を含む。ほとんどの患者では、頻繁な上気道および耳感染が生じ、進行性気道閉塞は、睡眠時無呼吸に至り、死亡することもあることが一般的に見出されている。心疾患は、この集団における主要な死因であり、左右室内肥大および心不全に至る弁膜機能不全を特徴とする。死亡は、一般に、閉塞性気道障害または心不全に起因する。
疾患の重度形態では、初期発達マイルストーンは満たされることがあるが、発達遅延は、１８〜２４ヶ月までには容易に明らかになる。一部の患者は、１年目の聴力スクリーニング試験で基準を満たすことができず、支持なしで座ることができる能力、歩行能力、話す能力を含む他のマイルストーンは、遅れている。発達の進行は、６．５歳あたりで平坦になり始める。ＭＰＳＩＩを有する小児の半数は、トイレトレーニングを完了することができるが、すべてではないがほとんどの小児は、疾患の進行とともに、この能力が失われることになる。
有意な神経学的関与を伴う患者は、１歳から、多動、強情さ、および攻撃性を含む重度の行動学的障害を示し始め、神経変性がこの挙動を減弱する８〜９歳まで続く。
１０歳に達する重度に罹患した患者の半数以上において、発作が報告されており、ＣＮＳ関与を伴うほとんどの患者では、死亡時までに、重度の精神障害を持ち、常時の介護を必要とする。減弱した疾患を有する患者は、正常な知的機能を示すが、ＭＲＩ画像は、Ｍ
ＰＳＩＩを有するすべての患者において、白質病変、空洞肥大、および脳萎縮を含む全般的な脳の異常を明らかにする。
組換えイズルスルファーゼ（エラプラーゼ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）を用いる酵素補充療法（「ＥＲＴ」）は、ハンター症候群のために唯一の認可された治療であり、毎週注入として投与される。しかし、現在投与されているＥＲＴ用量は、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通過せず、したがって、重度の疾患、すなわち、ＣＮＳ／神経認知および行動学的関与を伴うＭＰＳＩＩを有する患者における満たされてない必要性に対処することができない。この問題に対処するための現在の努力は、ＢＢＢを通過することができるように酵素を修飾することに向けられている。
ハンター症候群としても知られているＭＰＳＩＩと診断された患者（ヒト対象）のＣＮＳへヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（「ｈＩＤＳ」）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）の使用が、本明細書で提供される。治療の目標は、疾患を治療するための実行可能なアプローチとしてのｒＡＡＶに基づくＣＮＳ指向遺伝子療法により、患者の欠損イズロン酸−２−スルファターゼを機能的に置換することである。療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）を有する患者における神経認知低下の予防、ならびに（ｂ）疾患のバイオマーカー、例えば、ＣＳＦ、血清、および／または尿、および／または肝臓および脾臓容積におけるＧＡＧレベルにおける減少、および／または酵素活性（ＩＤＳもしくはヘキソサミニダーゼ）、を評価することにより、測定することができる。乳幼児における神経認知は、Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．、ＢＳＩＤ−ＩＩＩのＢａｙｌｅｙスケールにより測定されることができる。神経認知および適応的行動学的評価（例えば、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケールおよびＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケールをそれぞれ用いて）が実施されることができる。
ある実施形態では、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）欠損を治療するための治療的レジメンが提供され、これは、併用療法を含む。併用療法は、（ａ）複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液であって、懸濁液中、（ｉ）ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）の発現を導く調節配列の制御下にあるｈＩＤＳをコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを有し、（ｉｉ）生理学的に適合する水性緩衝液を含む髄腔内送達に適する製剤緩衝液、ならびに任意選択の界面活性剤、および賦形剤、の懸濁液、（ｂ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第１の免疫抑制剤、ならびに（ｃ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第２の免疫抑制剤、の併用投与を含み、ここで、少なくとも１つの免疫抑制剤の投与は、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳベクターの送達前または送達と同日に開始され、免疫抑制剤の少なくとも１つの投与は、ベクター投与後少なくとも８週間継続される。ある実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、配列番号３、配列番号１１、または配列番号１４から選択されるベクターゲノムを有する。ある実施形態では、患者は、初め、ベクター送達の前に、静脈内ステロイドを事前投与される。ある実施形態では、患者は、ベクター送達の後に、経口ステロイドを投与される。ある実施形態では、レジメンは、タクロリムスもしくはシロリムス、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のマクロライドを含む。ある実施形態では、第１の用量のマクロライドは、ベクターの投与前に送達される。ある実施形態では、免疫抑制レジメンは、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳの投与後４８週で中止される。ある実施形態では、懸濁液は、６〜９のｐＨ、または６．８〜７．８のｐＨを有する。ある実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、約１．９ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔
内注射により投与可能である。ある実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、約６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内注射により投与可能である。
ある実施形態では、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む懸濁液の使用が提供され、このｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）の発現を導く調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを含み、この懸濁液は、約１．３ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／ｇ脳質量または約６．５ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／ｇ脳質量の用量でｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳを含む。ある実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、配列番号３、配列番号１１、または配列番号１４から選択されるベクターゲノムを有する。ある実施形態では、使用は、２つ以上の免疫抑制剤を含む併用治療レジメン内である。ある実施形態では、２つ以上の免疫抑制剤は、コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第１の免疫抑制剤と、コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第２の免疫抑制剤と、を含む。ある実施形態では、患者は、初め、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ送達の前に、静脈内ステロイドを事前投与される。ある実施形態では、患者は、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ送達の後に、経口ステロイドを投与される。ある実施形態では、併用療法は、タクロリムスもしくはシロリムス、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のマクロライドを含む。ある実施形態では、ヒト患者は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されている。
ある実施形態では、ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）の発現を導く調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを含む複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む水性懸濁液が提供され、この懸濁液は、１．３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量または約６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量でそれらを必要とするヒトへ髄腔内注射するために製剤化される。ある実施形態では、懸濁液は、（ｉ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第１の免疫抑制剤と、（ｉｉ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第２の免疫抑制剤とを用いる併用療法における使用のためであり、ここで、免疫抑制剤の投与は、ＡＡＶベクターの送達前または送達と同日に開始され、免疫抑制剤のうちの少なくとも１つの投与は、ベクター投与後の少なくとも８週間継続される。
ある実施形態では、ＡＡＶ９カプシド内にパッケージされたヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする異種核酸を含む複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を約１．３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量または約６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内注射により用いてそれらを必要とする患者を治療する方法が提供される。ある実施形態では、患者は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されている。ある実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、配列番号３、（ｂ）配列番号１１、または（ｃ）配列番号１４から選択されるベクターゲノムを有する。ある実施形態では、投与される用量は、少なくとも１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、少なくとも１．９ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、少なくとも６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または９．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。
本発明のこれらのおよび他の態様は、本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳベクターゲノムの図式表示である。ＩＤＳ発現カセットは、逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接しており、発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよびニワトリベータアクチンプロモータ（ＣＢ７）のハイブリッドにより駆動される。トランスジーンは、ニワトリベータアクチンイントロンおよびウサギベータ−グロビンポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルを含む。 ＩＴベクター治療後のＭＰＳＩＩマウスのＣＮＳおよび血清におけるＩＤＳ発現を提供する。ＭＰＳＩＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３つの用量：３ｘ１０８ＧＣ（低）、３ｘ１０９ＧＣ（中）、または３ｘ１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を用いて治療された。動物は、注射の３週間後に犠牲にされた。ＩＤＳ活性は、ＣＳＦ（図２Ａ）、全脳ホモジェネート（図２Ｂ）、および血清（図２Ｃ）において測定された。野生型および未治療ＭＰＳＩＩマウスを対照として使用した。 ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳを投与されたＭＰＳＩＩマウスにおけるベクターＤＮＡの体内分布を提供する。ＭＰＳＩＩマウスは、３ｘ１０１０ＧＣのＡＡＶ９ベクターのＩＣＶ注射を用いて治療された。注射の３週間後、動物を犠牲にし、ベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲにより組織ＤＮＡ中で定量した。 ＭＰＳＩＩマウスにおけるＩＴベクター送達後の末梢ＧＡＧの補正を提供する。ＭＰＳＩＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３つの用量：３ｘ１０８ＧＣ（低）、３ｘ１０９ＧＣ（中）、または３ｘ１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を用いて治療された。動物は、注射の３ヶ月後に犠牲にされた。ヘキソサミニダーゼ活性は、肝臓（図４Ａ）および心臓（図４Ｂ）で測定された。貯蔵補正は、肝臓ではすべての用量で、心臓では中用量および高用量で見られた。ＧＡＧ含有量は、肝臓（図４Ｃ）および心臓（図４Ｄ）で測定された。野生型および未治療ＭＰＳＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定。 ＭＰＳＩＩマウスにおける脳貯蔵病変の用量依存的分解を提供する。ＭＰＳＩＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３つの用量：３ｘ１０８ＧＣ（低）、３ｘ１０９ＧＣ（中）、または３ｘ１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を用いて治療された。動物は、注射の３ヶ月後に犠牲にされ、リソソームメンブレンタンパク質ＬＩＭＰ２およびガングリオシドＧＭ３のために、脳を染色した。ＧＭ３（図５Ａ、５Ｃ、５Ｅ、５Ｇ、および５Ｉ）、およびＬＩＭＰ２（５Ｂ、５Ｄ、５Ｆ、５Ｈ、および５Ｊ）についての細胞染色陽性は、各動物からの４つの脳皮質セクションにおいて、盲検レビュアにより定量化された。典型的な脳皮質セクションが示される（ＧＭ３、図５Ｋ、ＬＩＭＰ２、図５Ｌ）。野生型および未治療ＭＰＳＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定。 ベクター治療されたＭＰＳＩＩマウスにおける改善された物体認識を示す。未治療ＭＰＳＩＩマウスおよびＷＴ雄同腹仔は、４〜５ヶ月齢で、行動学的試験を受けた。ＭＰＳＩＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３つの用量：３ｘ１０８ＧＣ（低）、３ｘ１０９ＧＣ（中）、または３ｘ１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を用いて治療された。注射の２ヶ月後に、動物は、行動学的試験を受けた。図６Ａは、Ｙメイズ行動を示し、図６Ｂは、コンテキスト恐怖条件付け（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）を示し、これらは、盲検レビュアにより注射の２ヶ月後に評価された。「Ｐｒｅ」は、合図なしの１．５ｍＡのフットショックを受けた２４時間後に、囲いに再度曝露された場合のフリーズ時間を示した。＊ｐ＜０．０５、二元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｓｉｄａｋ多重比較検定。図６Ｃは、長期記憶を評価するために使用される新規物体認識タスクにおいて、新規または馴染みのある物体を探索して過ごした時間のパーセンテージを示す。野生型および未治療ＭＰＳＩＩマウスを対照として使用した。＊Ｐ＜０．０５、多重比較のためにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いるｔ−検定。 ＩＴ ＡＡＶ９で治療されたＭＰＳＩマウスにおける酵素発現および脳貯蔵病変の補正の比較を提供する。ＭＰＳＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３つの用量：３ｘ１０８ＧＣ（低）、３ｘ１０９ＧＣ（中）、または３ｘ１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＵＡのＩＣＶ注射を用いて治療された。動物の１コホートを、ベクター注射の３週間後に犠牲にし、脳を、ＩＤＵＡ活性の測定のために回収した。これは、図７Ａに示される。図７Ｂは、注射の３ヶ月後に犠牲にされた動物の第２のコホートを示し、脳は、リソソームメンブレンタンパク質ＬＩＭＰ２のために染色された。ＬＩＭＰ２についての細胞染色陽性は、４つの脳皮質セクションにおいて盲検レビュアにより定量化された。野生型および未治療ＭＰＳＩＩマウスを対照として使用した。＊ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定。 ＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳを用いて治療されたＭＰＳＩＩマウスにおけるヒトＩＤＳに対する抗体応答を示す。ＭＰＳＩＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３つの用量：３ｘ１０８ＧＣ（低）、３ｘ１０９ＧＣ（中）、または３ｘ１０１０ＧＣ（高）のうちの１つでのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＣＶ注射を用いて治療された。血清は、ベクター投与後の２１日目または９０日目に犠牲にされたマウスから剖検時に収集された。ヒトＩＤＳに対する抗体は、間接ＥＬＩＳＡにより評価された。点線は、未治療動物からのナイーブ血清における平均力価より上の２ＳＤを示す。ほとんどの動物は、検出可能な抗体はまったく有さなかった（ナイーブ血清のバックグラウンドレベルにおいて）。 ＭＰＳＩＩマウスにおける正常なオープンフィールド活動およびＹメイズ挙動を示す。未治療ＭＰＳＩＩマウスおよびＷＴ雄同腹仔は、４〜５ヶ月齢で、行動学的試験を受けた。オープンフィールド活動は、水平方向の活動についてはＸＹ軸ビームブレイクにより（図９Ａ）、垂直方向の活動についてはＺ軸ビームブレイクにより（図９Ｂ）、中心活動についてはパーセント中心ビームブレイクにより（図９Ｃ）、測定された。８分間のＹメイズ試験セッションの間、アームエントリ総数（図９Ｄ）が記録された。 製造プロセスフローダイアグラムを提供する。 同軸挿入法のための任意選択の導入用ニードル（２８）を含む、薬学的組成物の槽内送達のための機器（１０）の描写であり、これは、１０ｃｃのベクターシリンジ（１２）、１０ｃｃの充填済みフラッシュシリンジ（１４）、Ｔ−コネクタ延長セット（チューブ（２０）、チューブ先端のクリップ（２２）、およびコネクタ（２４）を含む）、２２Ｇｘ５インチ脊椎ニードル（２６）、および任意選択の１８Ｇｘ３．５インチ導入用ニードル（２８）を含む。旋回式雄型ルアーロック（１６）を伴う４方向停止コックも示される。 ＩＣＶ ＡＡＶ９で治療したイヌにおける脳炎およびトランスジーン特異的Ｔ細胞応答を示す。１歳のＭＰＳＩイヌを、ＧＦＰを発現するＡＡＶ９ベクターの単回ＩＣＶまたはＩＣ注射で治療した。注射の１２日後に死亡が見出されたＩ−５６７を除き、すべての動物は、注射の１４日後に犠牲にされた。脳は、冠状断面で分割され、これは、ＩＣＶ治療された動物における注射部位（矢尻）付近の全般的病変を明らかにした（図１２Ａ〜１２Ｆ）。全般的病変周囲の脳領域からの組織セクションは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された（図１２Ｇおよび１２Ｈ）。元の倍率＝４ｘ（左パネル）、および２０ｘ（右パネル）。末梢血単核性細胞は、剖検時に１匹のＩＣＶ治療されたイヌ（Ｉ−５６５）から収集され、ＡＡＶ９カプシドおよびヒトＩＤＵＡタンパク質に対するＴ細胞応答は、インターフェロン−γＥＬＩスポットにより測定された（図１２Ｉ）。ＧＦＰトランスジーン産物に対するＴ細胞応答は、完全ＧＦＰ配列をカバーする重複１５アミノ酸ペプチドの単回プールを用いて測定された。ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むペプチドは、３つのプールに分割された（プールＡ〜Ｃと命名される）。＊＝陽性応答、バックグラウンド（非刺激細胞）の＞３倍、および百万細胞あたり５５超のスポットとして定義される。Ｔ細胞活性化のための陽性対照として役立つ、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を伴う、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびイオノマイシン。 ＩＣＶまたはＩＣ ＡＡＶ９で治療されたイヌにおけるベクター体内分布を示すバーチャートである。注射の１２日後に剖検された動物Ｉ−５６７を除き、イヌは、ＧＦＰ発現ＡＡＶ９ベクターの単回ＩＣＶまたはＩＣ注射を用いた注射の１４日後に犠牲にされた。定量的ＰＣＲにより、組織試料中のベクターゲノムを検出した。値は、二倍体細胞（ＧＣ／二倍体ゲノム）あたりのベクターゲノムコピーとして表される。海馬または大脳皮質から収集された脳試料は、ＩＣＶ治療されたイヌについては注射または非注射の脳半球として示され、ＩＣ治療された動物については、これらは、それぞれ右および左の脳半球である。試料は、動物Ｉ−５６７の注射された大脳半球からＰＣＲのために収集された。 ＩＣＶまたはＩＣ ＡＡＶ９で治療されたイヌの脳および脊髄におけるＧＦＰ発現を示す。ＧＦＰ発現は、ＧＦＰ発現ＡＡＶ９ベクターのＩＣＶまたはＩＣ注射で治療されたイヌから収集された脳および脊髄試料の直接蛍光顕微鏡法により評価された。典型的なセクションが、前頭皮質、ならびに頸部、胸部、および腰部レベルで収集された脊髄前角からの試料について示される。元の倍率＝１０ｘ。 リソソーム酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を発現するＩＣＶ ＡＡＶ９で治療されたＭＰＳ ＶＩＩイヌにおける安定なトランスジーン発現および脳炎の不在を示す。ＧＵＳＢの遺伝的欠損を有する６週齢のイヌ（ＭＰＳ ＶＩＩのモデル）は、ＧＵＳＢ発現ＡＡＶ９ベクターの単回ＩＣＶ注射で治療された。ＧＵＳＢ酵素活性は、注射時ならびに注射後７日目および２１日目で収集したＣＳＦ試料中で測定された（図１５Ａ）。イヌは、注射の３週間後に犠牲にされた。注射部位周囲の脳領域の目視および顕微鏡による評価を実施した（図１５Ｂ〜１５Ｄ）。元の倍率＝４ｘ（中央パネル）、および１０ｘ（右パネル）。ＧＵＳＢ活性は、活性ＧＵＳＢにより分解された場合に赤色産物を生じる基質を用いて、脳および脊髄セクションにおいて検出された（図１５Ｅ〜１５Ｎ）。典型的なセクションが、大脳皮質、小脳、ならびに頸部、胸部、および腰部レベルで収集された脊髄前角の試料について示される。元の倍率＝４ｘ（皮質および小脳）、ならびに１０ｘ（脊髄）。未治療ＭＰＳ ＶＩＩイヌ、正常なイヌ、およびＩＣＶ ＡＡＶ９で治療されたＭＰＳ ＶＩＩイヌから収集された大脳皮質のセクションは、ＭＰＳ ＶＩＩイヌの脳において病理学的に蓄積している、ガングリオシドＧＭ３のために染色された（図１５Ｏ〜１５Ｑ）。元の倍率＝４ｘ。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における腰部髄腔内注射後のコントラスト分布を示す。成体カニクイザルは、５ｍＬのイオヘキソール１８０中に希釈されたＡＡＶ９ベクターの腰部穿刺による髄腔内注射を受けた。脊髄に沿ったコントラスト分布は、蛍光透視法により評価された。胸部および頸部領域の典型的なイメージが示される。コントラスト材料（矢尻）は、すべての動物において、注射の１０分以内に脊髄の全長に沿って可視化できた。 髄腔内ＡＡＶ９で治療されたＮＨＰにおけるベクター体内分布を示すバーチャートである。５ｍＬのイオヘキソール１８０中に希釈されたＡＡＶ９ベクターの腰部穿刺による髄腔内注射の１４日後に、ＮＨＰは犠牲にされた。注射後１０分間、２匹の動物をトレンデレンブルグ位で配置した。定量的ＰＣＲにより、組織試料中のベクターゲノムを検出した。値は、二倍体細胞（ＧＣ／二倍体ゲノム）あたりのベクターゲノムコピーとして表される。 髄腔内ＡＡＶ９で治療したＮＨＰの脳および脊髄におけるＧＦＰ発現を示す。ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ９ベクターの髄腔内注射で治療されたＮＨＰから収集された脳および脊髄試料の直接蛍光顕微鏡法により評価された。ベクターは、腰部穿刺により投与された。注射後１０分間、２匹の動物をトレンデレンブルグ位で配置した。典型的なセクションが、前頭皮質、ならびに頸部、胸部、および腰部レベルで収集された脊髄前角からの試料について示される。いくつかのＮＨＰ組織における自己蛍光材料の存在に起因して、ＧＦＰシグナルからの自己蛍光を区別するために、赤色チャネルイメージが捕らえられた。自動蛍光イメージがマゼンタ色で重ね合わされる。元の倍率＝４ｘ（皮質）、および１０ｘ（脊髄）。 ＭＰＳＩにおける高められたＣＳＦスペルミンを示す。ＭＰＳＩイヌ（ｎ＝１５）および正常な対照（ｎ＝１５）からのＣＳＦ試料において、ハイスループットＬＣ／ＭＳおよびＧＣ／ＭＳ代謝物スクリーンが実施された。上位１００位の示差的に検出された代謝物のヒートマップ（ＡＮＯＶＡ）が示される（図１９Ａ）。ＭＰＳＩコホートにおいて最も若い動物（２８日齢）は、アスタリスクにより示される。スペルミン濃度は、ＭＰＳＩを有する６人の乳幼児および２人の正常な乳幼児からのＣＳＦ試料において定量的アイソトープ希釈ＬＣ／ＭＳアッセイにより測定された（図１９Ｂ）。 ＭＰＳＩニューロンにおけるスペルミン依存的な異常な神経突起成長を示す。Ｅ１８野生型またはＭＰＳＩマウス胚から回収された皮質ニューロンは、プレーティングの２４時間後に、スペルミン（５０ｎｇ／ｍＬ）またはスペルミンシンターゼ阻害剤ＡＰＣＨＡで治療された。フェーズコントラストイメージが、プレーティングの９６時間後に捕らえられた（図２０Ａ〜２０Ｄ）。神経突起の数、長さ、および分岐化は、治療状態あたりデュプリケート培養から無作為に選択された４５〜６５個のニューロンについて、盲検レビュアにより、定量された（図２０Ｅ＆２０Ｈ、２０Ｇ＆２０Ｊ、および２０Ｆ＆２０Ｉ）。＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。 遺伝子療法後のＭＰＳＩイヌにおけるＣＳＦスペルミンレベルおよび脳ＧＡＰ４３発現の正常化を示す。５匹のＭＰＳＩイヌは、１ヶ月齢で、イヌＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターの髄腔内注射を用いて治療された。２匹のイヌ（Ｉ−５４９、Ｉ−５５２）は、一部のＭＰＳＩイヌにおいてＩＤＵＡに対して誘導される抗体応答を予防するために、出生後１日目に、肝臓指向遺伝子療法によりＩＤＵＡに対して寛容化された。髄腔内ベクター注射の６ヶ月後、ＩＤＵＡ活性は、脳組織において測定された（図２１Ａ）。脳貯蔵病変は、リソソームメンブレンタンパク質ＬＩＭＰ２についての染色により評価された（図２１Ｂ〜２１Ｈ）。ＧＡＰ４３は、ウェスタンブロットにより脳皮質試料において測定され（図２１Ｉ）、デンシトメトリーによりβ−アクチンに対して定量化された（図２１Ｊ）。ＣＳＦスペルミンは、アイソトープ希釈ＬＣ／ＭＳにより犠牲時に測定された（図２１Ｋ）。未治療ＭＰＳＩイヌ（ｎ＝３）および正常なイヌ（ｎ＝２）は、対照として役立った。＊ｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、続いて、Ｄｕｎｎ検定）。 ＭＰＳＩにおけるＣＮＳ指向遺伝子療法の評価のためのＣＳＦバイオマーカーとしてのスペルミンの使用を示す。出生時にヒトＩＤＵＡに対して寛容化された６匹のＭＰＳＩイヌは、１ヶ月齢で、ヒトＩＤＵＡを発現する髄腔内ＡＡＶ９で治療された（１０１２ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２、１０１１ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２、１０１０ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２）。ＣＳＦスペルミンレベルは、治療の６ヶ月後に測定された（図２２Ａ）。３匹のＭＰＳＩネコは、フェリンＩＤＵＡを発現する髄腔内ＡＡＶ９で治療された（１０１２ＧＣ／ｋｇ）。ＣＳＦスペルミンは、治療の６ヶ月後に定量された（図２２Ｂ）。未治療ＭＰＳＩイヌ（ｎ＝３）および正常なイヌ（ｎ＝２）は、対照として役立った。 ランダムフォレスト分析により同定された代謝物についての平均減少正確性を示す。 ＭＰＳＩイヌ脳試料におけるポリアミン合成経路における酵素の発現を示す。 ＭＰＳ ＶＩＩイヌＣＳＦにおけるスペルミン濃度を示す。 ＷＴニューロン成長に対するＡＰＣＨＡ治療の影響はないことを示す。 様々な用量（３ｅ８、３ｘ１０８ＧＣ、３ｅ９、３ｘ１０９ＧＣ、３ｅ１０、３ｘ１０１０ＧＣ）のＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧを用いて治療されたＭＰＳＩＩマウス（ＩＤＳγ／−）におけるＭＰＳＩＩ関連の病理学的知見の用量依存的減少を示す。累積病理学的スコアが、評価され、ｙ軸上にプロットされた。ヘテロマウス（ＩＤＳγ／＋）は、対照として役立った。結果は、ＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧで治療されたＭＰＳＩＩマウスにおけるＭＰＳＩＩ関連の病理学的知見の用量依存的減少を実証した。 実施例９において記載されているアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＣＳＦ髄液細胞増加を示す。白血球細胞（白血球、ｙ軸）は、様々な日（ｘ軸、０日目、７日目、１４日目、２１日目、３０日目、４５日目、６０日目、および９０日目）において収集されたＣＳＦ試料において計数された。ダイヤモンドは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳでの治療を伴わないＲＡ２１９８からのデータを表す。四角形、三角形、およびｘは、それぞれ５ｘ１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで治療されたＲＡ１３９９、ＲＡ２２０３、およびＲＡ２２３１からのデータを表す。＊、円形、および＋は、それぞれ１．７ｘ１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで治療されたＲＡ１３５８、ＲＡ１３５６、およびＲＡ２１９７からのデータを表す。 実施例９で記載されるような６０日目のＮＨＰの血清において発達した抗ｈＩＤＳ抗体を測定するＥＬＩＳＡ結果を示す。希釈はｘ軸としてプロットされ、光学密度（ＯＤ）はｙ軸としてプロットされた。ダイヤモンドは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳでの治療を伴わないＲＡ２１９８からのデータを表す。四角形は、１．７ｘ１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳで治療されたＲＡ２１９７からのデータを表し、一方で、三角形およびｘは、５ｘ１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳでそれぞれ治療されたＲＡ２２０３およびＲＡ２２３１のデータを表す。
髄腔内注射により必要とするヒト対象に投与可能である薬学的組成物が本明細書では提供される。ある実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを含有する薬学的組成物の使用は、髄腔内注射によりそれを必要とするヒト対象に投与可能である医薬を調製する際に使用される。ヒト対象（患者）は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）または重度のハンター症候群と以前診断されていた場合がある。
効力は、インビトロ細胞培養アッセイにより、例えば、本明細書の実施例５Ｇで記載されているインビトロ効力アッセイにより測定可能であり、ここで、ＨＥＫ２９３またはＨｕｈ７細胞は、細胞あたり既知の多様性のｒＡＡＶＧＣを用いて形質導入され、上清は、４ＭＵ−イズロニド（ｉｄｕｒｏｎｉｄｅ）酵素アッセイを用いて、形質導入の７２時間後にＩＤＳ活性についてアッセイされる。
そのようなｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクター調製物は、ＣＮＳにおけるｈＩＤＳ発現の治療的レベルに到達するために、髄腔内／槽内注射により小児または成人ヒト対象に投与されることができる。治療の候補となる患者は、重度または減弱したＭＰＳＩＩ疾患を有する小児および成人患者である。重度の疾患は、平均より低い少なくとも１標準偏差の発達指数（ＤＱ）（ＢＳＩＤ−ＩＩＩ）を伴うか、または連続的な試験において１超の標準偏差の低下という病歴証拠文書を伴う、初期段階の神経認知欠損として定義される。
ハンター症候群を有する患者のための、治療的に有効な髄腔内／槽内用量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは、約１ｘ１０１１〜７．０ｘ１０１４ＧＣ（一定用量）の範囲であり、１０９〜１０１１ＧＣ／ｇ患者の脳質量と等価である。代替的には、以下の治療的に有効な一定用量が、示された年齢群の患者に投与されることができる。
ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．９×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、９．４×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。
ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．３×１０９ＧＣ／ｇ脳質
量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．８×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、２．１５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、５．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。
ある実施形態では、小児の発達初期に生じる比較的急速な脳成長のために、ＩＣ投与されるＡＡＶ９．ｈＩＤＳの総用量は、異なる年齢層にわたって推定される脳質量に依存する。研究対象の年齢による脳質量については、例えば、（ＡＳ Ｄｅｋａｂａｎ、Ａｎｎ
Ｎｅｕｒｏｌ、１９７８ Ｏｃｔ；４（４）：３４５−５６を参照されたい。
治療の目標は、疾患を治療するための実行可能なアプローチとしてのｒＡＡＶに基づくＣＮＳ指向遺伝子療法により、患者の欠損イズロン酸−２−スルファターゼを機能的に置換することである。療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）を有する患者における神経認知低下の予防、ならびに（ｂ）疾患のバイオマーカー、例えば、ＣＳＦ、血清、および／または尿、および／または肝臓および脾臓容積におけるＧＡＧレベルにおける減少、および／または酵素活性（ＩＤＳもしくはヘキソサミニダーゼ）、を評価することにより、測定することができる。乳幼児における神経認知は、Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ
Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．、ＢＳＩＤ−ＩＩＩのＢａｙｌｅｙスケールにより測定されることができる。神経認知および適応的行動学的評価（例えば、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケールおよびＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケールをそれぞれ用いて）が実施されることができる。
治療前に、ＭＰＳＩＩ患者は、ｈＩＤＳ遺伝子を送達するために使用されるｒＡＡＶベクターのカプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価されることができる。そのようなＮａｂは、形質導入効率を妨害し、治療有効性を低下させ得る。ベースライン血清Ｎａｂ力価≦１：５を有するＭＰＳＩＩ患者は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ遺伝子療法プロトコルを用いる治療のための良好な候補である。血清Ｎａｂ＞１：５の力価を有するＭＰＳＩＩ患者の治療は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクター送達での治療の前および／または治療中に、組み合わせ療法、例えば、免疫抑制剤での一時的な併用治療を必要としてもよい。場合により、免疫抑制併用療法は、ＡＡＶベクターカプシドおよび／または製剤の他の構成成分に対する中和抗体の事前アセスメントを伴うことなく、予防的手段として使用されてもよい。ある実施形態では、事前の免疫抑制療法は、特に、実質的にＩＤＳ活性レベルを有さない患者において、ｈＩＤＳトランスジーン産物に対する潜在的な有害免疫反応を予防するために望ましいものであり得、トランスジーン産物は、「外来」として見なされてもよい。動物において観察されたものと同様の反応は、ヒト対象において生じない可能性もあるが、予防的措置として、免疫抑制療法が、ｒＡＡＶ−ｈＩＤＳのすべてのレシピエントについて推奨される。
ｈＩＤＳの全身送達が伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子療法送達の組み合わせは、本発明の方法に包含される。全身送達は、イズルスルファーゼのＥＲＴ注入（例えば、エラプラーゼ（登録商標）を用いて）を用いて、または肝臓に対する向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。
ある実施形態では、ＣＮＳにおいて治療的濃度のｈＩＤＳを発現させるために、患者が乳幼児、小児、および／または成人である場合、患者は、ｈＩＤＳに対して患者を寛容化するために肝臓に指向された注射によりＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与され、患者は引き続き髄腔内注射によりＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与される。
本明細書で使用される場合、用語「髄腔内送達」または「髄腔内投与」は、脊柱管への注射による、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注射による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内、後頭下／槽内、および／またはＣ１−２穿刺を含んでもよい。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入されてもよい。別の実施例では、注射は、大槽内にされてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「槽内送達」または「槽内投与」は、大槽小脳延髄の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、または大槽内への直接注射による、永久的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、ＭＰＳＩＩの症状の１つ以上を緩和または治療するために十分な酵素の量を標的細胞に送達し、発現させる、ＡＡＶ．ｈＩＤＳ組成物の量を指す。「治療」は、ＭＰＳＩＩ症候群のうちの１つの症状の悪化の予防、および可能であればそれらの症状のうちの１つ以上の逆転を含み得る。例えば、治療的に有効な量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは、ＭＰＳＩＩを有する患者において神経認知機能を改善する量である。このような神経認知機能の改善は、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケールを用いて、対象の神経認知発達指数（ＤＱ）を評価することにより測定されてもよい。神経認知機能の改善は、例えば、Ｗｅｃｈｓｌｅｒ略式知能スケール（ＷＡＳＩ）（ＩＱ）、Ｂａｙｌｅｙ乳幼児発達スケール、Ｈｏｐｋｉｎｓ言語学習検査（記憶）、および／または可変注意力検査（ＴＯＶＡ）を含むがこれらに限定されない当該分野において知られている方法を用いて、対象の知能指数（ＩＱ）を評価することにより、測定されてもよい。別の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは、尿および／または脳脊髄液および／または血清および／または他の組織における、病原性ＧＡＧ、ヘパラン硫酸、および／またはヘキソサミニダーゼ濃度を減少させる量である。さらに他の実施形態では、角膜薄濁の補正が観察されてもよく、中枢神経系（ＣＮＳ）における病変の補正が観察され、および／または血管周囲および／または髄膜ｇａｇ貯蔵の逆転が観察される。
ある実施形態では、治療有効性は、血漿（総ＧＡＧ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、Ｉ２Ｓ活性）、ＣＳＦ（総ＧＡＧ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、Ｉ２Ｓ活性）、および尿（総ＧＡＧ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸）中のバイオマーカー、認知および適応機能の神経発達学的パラメータ、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＢＳＩＤ−ＩＩＩ）または小児用Ｋａｕｆｍａｎアセスメント群、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＫＡＢＣ−ＩＩ）、および／またはＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケール、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、包括的対談形態（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）のうちの１つ以上を用いて決定されてもよい。場合により、ウイルス排出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）は、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＣＳＦ、血漿、および尿におけるベクター濃度によりモニターされてもよい。ある実施形態では、治療有効性は、免疫原性測定、ＣＳＦおよび血清におけるＡＡＶ９に対する中和抗体力価、およびＩ２Ｓに対する結合抗体力価、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩスポット）アッセイ、ＡＡＶ９およびＩ２Ｓに対するＴ細胞応答、フローサイトメトリー、ＡＡＶ−およびＩ２Ｓ−特異的調節Ｔ細胞、脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩにより評価されるＣＮＳ構造的異常さ、腹部ＭＲＩおよび超音波により評価される肝臓および脾臓容量、聴覚脳幹応答（ＡＢＲ）試験により測定される聴覚能力変化、ＩＶ ＥＲＴ（エラプラーゼ（登録商標））を一時的に中止している対象における血漿および尿の総ＧＡＧ、ヘパラン硫酸、およびデルマタン硫酸、のうちの１つ以上によりモニターされてもよい。
「治療有効量」は、ヒト患者ではなく動物モデルに基づいて決定されてもよい。適切なマウスモデルの実施例は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、「機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ」は、ＭＰＳＩＩまたは関連する症候群を伴うことなくヒトにおいて正常に機能するヒトイズロン酸−２−スルファターゼ酵素を指す。逆に、ＭＰＳＩＩまたは関連する症候群を引き起こすヒトイズロン酸−２−スルファターゼ酵素バリアントは、非機能的であると考えられる。一実施形態では、機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（２１）：８５３１−８５３５（１９９０）により記載されている野生型ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列を有し、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１９３．１、配列番号２（５５０アミノ酸）において再生され、このプレプロタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２５）、プロペプチド（アミノ酸２６〜３３）、ならびにアミノ酸３４〜４５５（４２ｋＤａの鎖）およびアミノ酸４５６〜５５０（１４ｋＤａの鎖）からなる成熟ペプチドを含む。また、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（Ｐ２２３０４．１）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「ＮＡｂ力価」は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗−ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれほど産生されるかの尺度を指す。抗−ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ、Ｒ．ら、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ．３８１−３９０において記載されているように測定されてもよく、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、ＩＤＳ遺伝子、プロモータを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含んでもよく、そのカセットは、遺伝子要素（例えば、プラスミド）によりパッケージング宿主細胞に送達されてもよく、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）へパッケージされる。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載のＩＤＳコーディング配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含有する。
省略形「ｓｃ」は、自己相補性を指す。「自己相補的なＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有するコーディング領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計される構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞介在合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な片割れが会合して、即時の複製および転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、「Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（Ａｕｇｕｓｔ ２００１）、Ｖｏｌ ８、Ｎｕｍｂｅｒ １６、Ｐａｇｅｓ １２４８−１２５４を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、および第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々が参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列と、目的の遺伝子に対してイントランスに作用するか、または目的の遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列との両方を指す。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、用語「異種性」は、タンパク質または核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、２つ以上の配列または下
位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコーディング配列の発現を導くように配置された１つの遺伝子からのプロモータを有する。故に、コーディング配列に関しては、プロモータは、異種性である。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、ここで、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的のトランスジーンのみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給されてもよい。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ９ウイルス粒子」は、所望の遺伝子産物のための発現カセットを含む異種核酸分子がパッケージングされているカプシドであるＡＡＶ９カプシドを有するヌクレアーゼ耐性粒子（ＮＲＰ）を指す。そのような発現カセットは、典型的に、発現制御配列に作動可能に連結している遺伝子配列に隣接するＡＡＶ５’および／または３’逆位末端リピート配列を含有する。発現カセットのこれらのおよび他の適切な要素は、以下により詳細に記載されており、代替的には、トランスジーンゲノム配列として本明細書で参照され得る。これは、「フル（ｆｕｌｌ）」ＡＡＶカプシドとして参照され得る。そのようなｒＡＡＶウイルス粒子は、それが発現カセットにより保有される所望の遺伝子産物を発現可能な宿主細胞にトランスジーンを送達する場合、「薬理学的に活性のある」と称される。
多くの場合では、ｒＡＡＶ粒子は、「ＤＮａｓｅ耐性」として参照される。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンド−およびエキソ−ヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製工程において使用されてもよい。そのようなヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを分解するために選択されてもよい。そのような工程は、単一ヌクレアーゼ、または異なる標的に指向されたヌクレアーゼの混合物を含有してもよく、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。
用語「ヌクレアーゼ耐性」は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞にトランスジーンを送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計されたヌクレアーゼインキュベーション工程の間の分解（消化）からこれらのパッケージされたゲノム配列を保護する。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ９）内にパッケージされた核酸配列を指す。一般に、ＡＡＶのために、ＡＡＶ ＩＴＲは、トランスジーン産物（例えば、ｈＩＤＳ）をコードする核酸配列およびその調節配列を含む発現カセットのパッケージングを可能とするために存在する。以下の実施例では、発現カセットは、その５’最末端およびその３’最末端でＡＡＶ ＩＴＲと隣接している。適切には、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）のベクターゲノムは、複製不能ｒＡＡＶを供給するために、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするＡＡＶ配列を欠失しており、ＡＡＶ ｒｅｐ
遺伝子産物をコードするＡＡＶ配列を欠失している。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＡＡＳ９９２６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指し、ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質は、配列番号１３で再産生される。このコード配列からのいくつかのバリエーションは、本発明により包含され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＡＡＳ９９２６４、配列番号１３、およびＵＳ７９０６１１１（同様にＷＯ２００５／０３３３２１）の参照アミノ酸配列と約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列から約１％未満のバリエーション）。そのようなＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ３１もしくはｈｕ３２）、またはＡＡＶ９カプシドとアラインされた任意の他のＡＡＶカプシドの対応する位置から「募集された（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）」代替的な残基から選択されるアミノ酸置換を含むがこれらに限定されない、アミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するＡＡＶ９のバリアント、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、およびＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１に記載されているものなど、を含み得る。しかし、他の実施形態では、ＡＡＶ９、または上記の参照配列に少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ９カプシドの他のバリアントが選択されてもよい。例えば、米国公開特許出願第２０１５／００７９０３８号を参照されたい。カプシド、それ故にコーディング配列を産生する方法、ならびにｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０）、６０８１−６０８６（２００３）およびＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
用語「ＡＡＶ９中間体」または「ＡＡＶ９ベクター中間体」は、カプシド中にパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している構築されたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「エンプティ（ｅｍｐｔｙ）」カプシドと称されてもよい。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含有しなくてもよく、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含有してもよい。これらのエンプティカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を移入するために非機能的である。
用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を指す。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用される。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。用語「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成している（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。
用語「約」は、別記されない限り、±１０％以内およびそれを含むバリエーションを包含する。
本明細書中他のことが定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されているもの、および本願で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供している公開文書への参照により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
ＭＰＳＩＩと診断された患者（ヒト対象）のＣＮＳへｈＩＤＳ遺伝子を送達するための複製欠損ＡＡＶの使用が提供される。ｈＩＤＳ遺伝子（「ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ」）を送達するために使用される組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ベクターは、ＣＮＳに対して向性を有し（例えば、ＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＩＤＳトランスジーンは、特異的発現制御要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよびニワトリベータアクチンプロモータ（ＣＢ７）のハイブリッドにより制御される。ある実施形態では、生理学的に適合する水性緩衝液、界面活性剤、および任意選択の賦形剤を含む製剤緩衝液中のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの懸濁液を含む、髄腔内、槽内、および全身投与のために適切な薬学的組成物が、提供される。ｒＡＡＶ懸濁液はさらに、以下の点で特徴付けられる。
（ｉ）ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）力価は、少なくとも１．０ｘ１０１３ＧＣ／ｍＬである、
（ｉｉ）ｒＡＡＶエンプティ／フル粒子比は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定されるように（実施例５Ｄを参照されたい）、０．０１〜０．０５（エンプティカプシドを９５％〜９９％含まない）、他の実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、エンプティカプシドを少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％含まない、および／または
（ｉｉｉ）少なくとも約４ｘ１０８ＧＣ／ｇ脳質量〜約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶ懸濁液は、効力を有する。
ある実施形態では、投与される用量は、少なくとも１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、少なくとも１．９ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、少なくとも６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または９．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。
ある実施形態では、投与された用量は、免疫抑制を伴う、または伴うことなく、１．９ｘ１０１１ＧＣ／脳質量〜５．６ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、免疫抑制は、−２１日目〜２０日目であり、シロリムスである。
効力は、インビトロ細胞培養アッセイにより、例えば、実施例５Ｇで記載されているインビトロ効力アッセイにより測定可能であり、ここでＨＥＫ２９３細胞は、細胞あたり既知の多様性のｒＡＡＶＧＣを用いて形質導入され、上清は、形質導入の７２時間後にＩＤＳ活性についてアッセイされる。ｈＩＤＳの機能（活性）および／または効力は、適切なインビトロアッセイにおいて、例えば、蛍光発生基質、４−メチルウンベリフェリルアルファ−Ｌ−イズロン酸−２サルフェートを消化するためのｈＩＤＳの能力を測定する、４ＭＵ−イズロン酸酵素アッセイを用いて測定されてもよい。特異的活性は、記載された条件下で測定された場合、＞７，５００ｐｍｏｌ／分／μｇである。ｗｗｗ．ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ．の活性アッセイプロトコルを参照されたい。本明細書に記載のものを含む、酵素活性を測定する他の適切な方法が記載されている［例えば、Ｋａｋｋｉｓ、Ｅ．Ｄ．ら（１９９４）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．５：２２５−２３２；Ｒｏｍｅ、Ｌ．Ｈ．ら、（１９７９）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２３３１−２３３４］。活性は、記載されている方法、例えば、Ｅ．Ｏｕｓｓｏｒｅｎら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ＭｅＴａｂ．２０１３ Ａｕｇ；１０９（４）：３７７−８１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２０１３．０５．０１６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊｕｎ ４を用いて評価されてもよい。治療のための候補となる患者は、ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）および／またはＭＰＳＩＩに関連する症状を有する小児および成人患者である。
治療の目標は、疾患を治療するための実行可能なアプローチとしてのｒＡＡＶに基づく
ＣＮＳ指向遺伝子療法により、患者の欠損イズロン酸−２−スルファターゼを機能的に置換することである。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターから発現されるとき、ＣＳＦ、血清、ニューロン、または他の組織中で検出される少なくとも約２％の発現レベルは、治療的効果を提供してもよい。しかし、より高い発現レベルが成し遂げられ得る。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトＩＤＳレベルの２％〜約１００％であり得る。ある実施形態では、正常な発現レベルより高いレベルが、ＣＳＦ、血清、または他の組織中で検出され得る。
療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）を有する患者における神経認知低下の予防、ならびに（ｂ）疾患のバイオマーカー、例えば、ＣＳＦ、血清、および／または尿、および／または肝臓および脾臓容積におけるＧＡＧレベルにおける減少、および／または酵素活性を評価することにより、測定することができる。乳幼児における神経認知は、Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．、ＢＳＩＤ−ＩＩＩのＢａｙｌｅｙスケールにより測定されることができる。神経認知および適応的行動学的評価（例えば、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケールおよびＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケールをそれぞれ用いて）が実施されることができる。
ｈＩＤＳの全身送達が伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子療法送達の組み合わせは、特定の実施形態に包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、エラプラーゼ（登録商標）を用いて）を用いて、または肝臓に対する向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。
特定の実施形態は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ薬学的組成物の製造および特徴付けも提供する（実施例４、下記）。
５．１．ＡＡＶ．ｈＩＤＳ構築物および製剤
５．１．１．発現カセット
配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＳ遺伝子（ＣＣＤＳ１４６８５．１）を含有する発現カセットを含むＡＡＶベクターが提供される。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ０００１９３．１をコードする公開された遺伝子配列であり、本明細書には配列番号２として含まれている。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号１に少なくとも約７５％同一なヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＳ遺伝子を含有し、機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼをコードする。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号１に少なくとも約８０％同一なヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＳ遺伝子を含有し、機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼをコードする。別の実施形態では、配列は、配列番号１に少なくとも約８５％同一であるか、または配列番号１に少なくとも約９０％同一であり、機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号１に少なくとも約９５％同一であるか、配列番号１に少なくとも約９７％同一であるか、または配列番号１に少なくとも約９９％同一であり、機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号１に少なくとも約７７％同一である。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号１１のｎｔ１９３７〜ｎｔ３５８９としても示されている、配列番号８のｎｔ１１７７〜ｎｔ２８２９のｈＩＤＳコーディング配列を含有する。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ１１７７〜ｎｔ２８２９（配列番号１１のｎｔ１９３７〜ｎｔ３５８９としても示されている）に少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるｈＩＤＳコーディング配列を含有する。
別の実施形態では、機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼは、リーダー（シグナ
ル）ペプチドに対応するプレプロタンパク質配列番号２の初めの２５アミノ酸のすべてまたは一部が異種性リーダーペプチドで置換されている合成アミノ酸配列を含んでもよい。例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはオンコスタチンからのリーダーペプチドなどのこのリーダーペプチドは、循環へのその分泌経路を通して細胞からの酵素の輸送を改善することができる。適切なリーダーペプチドは、必須ではないが、好ましくは、ヒト起源である。適切なリーダーペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる、ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｚｈａｎｇ２７０．ｈｔｍから選択されてもよく、または選択されたタンパク質においてリーダー（シグナル）ペプチドを決定するための様々なコンピュータプログラムを用いて決定されてもよい。限定はされないが、そのような配列は、約１５〜約５０のアミノ酸長、または約１９〜約２８のアミノ酸長であってもよく、または必要に応じてそれより長くても短くてもよい。加えて、ＩＤＳ酵素の酵素活性を評価するのに有用であるものとして、少なくとも１つのインビトロアッセイが記載されている［例えば、Ｄｅａｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６ Ａｐｒ；５２（４）：６４３−６４９を参照されたい］。プレプロタンパク質（配列番号２のアミノ酸１〜２５）のすべてまたは一部の除去に加えて、プロタンパク質（配列番号２のアミノ酸２６〜３３）のすべてまたは一部が除去されてもよく、場合により、異種成熟ペプチドと置換されてもよい。
別の実施形態では、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ４４８７３７．１のＣＤＳ）のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５４７のヌクレオチド配列を有することにより特徴付けられるＳＵＭＦ１遺伝子をさらに含有する発現カセットを含むＡＡＶベクターが提供される。この配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿８７７４３７．２をコードする公開された遺伝子配列であり、これはまた、配列番号７および配列番号１０として本明細書に包含されている。幾つかの研究は、ＩＤＳなどのスルファターゼの発現は、ＩＤＳの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ修飾因子、ＳＵＭＦ１の利用可能性により制限され得ることを示唆している（Ｆｒａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ、２００７：４０３：３０５−３１２）。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号５のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５４７に少なくとも約８０％同一なヌクレオチド配列を有することを特徴とするＳＵＭＦ１遺伝子を含有し、機能的ヒトＳＵＭＦ１をコードする。別の実施形態では、配列は、配列番号５のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５４７に少なくとも約８５％同一であるか、または配列番号５のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５４７に少なくとも約９０％同一であり、機能的ヒトＳＵＭＦ１をコードする。一実施形態では、配列は、配列番号５のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５４７に少なくとも約９５％、約９７％、または約９９％同一であり、機能的ヒトＳＵＭＦ１をコードする。一実施形態では、配列は、配列番号５のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５４７に少なくとも約７６．６％同一である。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５５３のｈＳＵＭＦ１コーディング配列を含有する。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５５３と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一なｈＳＵＭＦ１コーディング配列を含有する。
一実施形態では、ｈＩＤＳコーディング配列およびｈＳＵＭＦ１コーディング配列を含有する発現カセットを含むＡＡＶベクターが提供される。別の実施形態では、ｈＩＤＳコーディング配列およびｈＳＵＭＦ１コーディング配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に連結している。さらなる一実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号５のｎｔ２８３０〜ｎｔ３４２２または配列番号８のｎｔ２８３０〜ｎｔ３４２２の配列を有する。別の実施形態では、発現カセットは、ｈＩＤＳコーディング配列、ＩＲＥＳ、およびｈＳＵＭＦ１コーディング配列を含む、配列番号５のｎｔ１１７７〜ｎｔ４５４７または配列番号８のｎｔ１１７７〜ｎｔ４５５３を含有する。
配列に関しての同一性または類似性は、本明細書では、最大パーセント配列アイデンテ
ィティを達成するように配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、本明細書で提供されるペプチドおよびポリペプチド領域と同一（すなわち、同じ残基）または同様（すなわち、共通の側鎖特性に基づく同じ群からのアミノ酸残基、下記を参照されたい）である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。同一性パーセント（％）は、それらのヌクレオチドまたはアミノ酸配列をそれぞれ比較することにより決定されるような、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の関係の尺度である。一般に、比較される２つの配列は、配列間に最大の相関を提供するようにアラインされる。２つの配列のアライメントが調べられ、２つの配列間の正確なアミノ酸またはヌクレオチド対応を与える位置の数が決定され、アライメントの全長で除算され、それに１００を掛けることにより、同一性％の数字を得る。この同一性％の数字は、比較されるべき配列の全長にわたって決定されてもよく、これは、同じまたは非常に同様の長さの配列に特に適切であり、かつ高度に相同であり、またはこの同一性％の数字は、より短い定義された長さにわたって決定されてもよく、これは、長さが等しくない配列により適切であり、もしくはより低いレベルの相同性を有する。多数のアルゴリズム、およびそれらに基づくコンピュータプログラムが存在し、それらは、文献で使用されるために入手可能であり、および／またはアライメントおよびパーセントアイデンティティを実行するために公的または商業的に入手可能である。アルゴリズムまたはプログラムの選択は、本発明を限定しない。
適切なアライメントプログラムの例は、例えば、Ｕｎｉｘ下の、次いで、Ｂｉｏｅｄｉｔプログラムにインポートされる、ソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｈａｌｌ、Ｔ．Ａ．１９９９、ＢｉｏＥｄｉｔ：ａ ｕｓｅｒ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５／９８／ＮＴ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５−９８）；ＥＭＢＬ−ＥＢＩから入手可能なＣｌｕｓｔａｌ
Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ、Ｆａｂｉａｎら、「Ｆａｓｔ、ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ７．１（２０１１）：５３９およびＧｏｕｊｏｎ、Ｍｉｃｋａｅｌら、「Ａ ｎｅｗ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｔ ＥＭＢＬ−ＥＢＩ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８．ｓｕｐｐｌ ２（２０１０）：Ｗ６９５−Ｗ６９９）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：３８７−３９５、１９８４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡから入手可能）を含む。プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の同一性％および２つのポリペプチド配列間の同一性％を決定するために使用されてもよい。
配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムは、例えば、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ＵＳＡから入手可能で、ＮＣＢＩのホームページｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを通じてアクセス可能であるプログラムのＢＬＡＳＴファミリー、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を含む。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０残基重量表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いることができる、ならびにＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８、１９８８、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージの一部として入手可能）。ＳｅｑＷｅｂソフトウェア（ＧＣＧ Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎパッケージに対するウェブに基づくインターフェース：Ｇａｐプログラム）。
いくつかの実施形態では、カセットは、組換えアデノ随伴ウイルスから発現されるように設計され、ベクターゲノムはまたＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含有する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、シュードタイプであり、すなわち、ＡＡＶカプシドは、ＩＴＲを提供するＡＡＶのものとは異なるＡＡＶ起源からのものである。一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかし、他の適切な起源からのＩＴＲが選択されてもよい。場合により、ＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶであり得る。
本明細書に記載の発現カセットは、ＡＡＶ５’逆位末端配列（ＩＴＲ）およびＡＡＶ３’ＩＴＲを利用した。しかし、これらの要素の他の構造も適切であり得る。Ｄ配列および最終的な分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および／または３’ＩＴＲが使用される。シュードタイプＡＡＶが産生されるべきとき、発現中のＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ起源とは異なる起源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、ＣＮＳまたはＣＮＳ内の組織もしくは細胞を標的とするための特定の効率を有するＡＡＶカプシドとともに用いるために選択されてもよい。一実施形態では、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列、またはその欠失型バージョン（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、および規制承認を加速させるために使用される。しかし、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、シュードタイプであると称され得る。しかし、ＡＡＶ ＩＴＲの他の起源が利用されてもよい。
一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液および脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現および分泌のために設計される。特に所望の一実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳおよび肝臓の両方での発現のために有用であり、それにより、ＭＰＳＩＩの全身およびＣＮＳ関連の効果の両方の治療が可能となる。例えば、本発明者らは、特定の構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ）が、髄腔内に投与された場合に、所望のレベルで発現を駆動せず、それにより、最適以下のｈＩＤＳ発現レベルをもたらすことを観察した。しかし、ニワトリベータアクチンプロモータは、髄腔内送達および全身送達の両方において良好に発現を駆動する。故に、これは、特に望ましいプロモータである。他のプロモータが選択されてもよいが、同じものを含有する発現カセットが、ニワトリベータアクチンプロモータを用いる場合の利点のすべてを有さなくてもよい。様々なニワトリベータアクチンプロモータが、単独で、または様々なエンハンサー要素、ＣＢｈプロモータ［ＳＪ Ｇｒａｙら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３−１１５３）と組み合わせて記載されている（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサー要素を伴うニワトリベータアクチンプロモータ、ＣＡＧプロモータであり、それは、プロモータ、ニワトリベータアクチンの第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびにウサギベータ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプタを含む）。
組織特異的であるプロモータの例は、とりわけ、肝臓および他の組織のために周知である（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇら、（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９；アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４）、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６）；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニュ
ーロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４）。代替的には、調節可能なプロモータが選択されてもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたい。
一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは、同じであってもよく、異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーにて存在してもよい。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分断され得る。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらに、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロン、ヒトβ−グロブリンイントロン、および／または商業的に入手可能なＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロンを含有する。他の適切なイントロンは、当該分野において周知のもの、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されているものなどを含む。
さらに、発現カセットは、適切なポリアデニル化シグナルとともに提供される。一実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロブリンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。代替的には、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、ＳＶ５０ポリＡ、または合成ポリＡ。さらなる他の慣用的な調節要素は、さらに、または場合により、発現カセットを含んでもよい。
一例示的なｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターゲノムは、配列番号３のｎｔ２〜ｎｔ３９６７、配列番号５のｎｔ１１〜ｎｔ４９６４、配列番号８のｎｔ１１〜ｎｔ４９６４、配列番号１１のｎｔ２〜ｎｔ３９６７、または配列番号１４のｎｔ２〜ｎｔ３９６５に示される。
５．１．２．ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳウイルス粒子の産生
一実施形態では、ＡＡＶカプシドを有し、かつそこにパッケージされたＡＡＶ逆位末端配列、遺伝子の発現を制御する調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）遺伝子を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子が提供され、ここで、このｈＩＤＳ遺伝子は、配列番号１に示される配列（図１）を有するか、または機能的ヒトイズロン酸−２−スルファターゼをコードするそれらに少なくとも約９５％同一な配列を有する。一実施形態では、ｈＩＤＳ発現カセットは、ＡＡＶ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲに隣接している。別の実施形態では、ＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶである。
髄腔内および／または槽内送達のために、ＡＡＶ９は、特に望ましい。場合により、本明細書に記載のようなｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳベクターは、肝臓を特異的に標的とするように設計されたベクターとともに同時投与されてもよい。肝臓向性を有する多数のｒＡＡＶベクターのいずれかが使用されることができる。ＡＡＶの例は、ｒＡＡＶのカプシドのための供給源として選択されてもよく、例えば、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８［例えば、米国公開特許出願第２００７−００３６７６０−Ａ１号、米国公開特許出願第２００９−０１９７３３８−Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい］を含む。ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他の類人猿ＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、およびＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、およびＷＯ２００６／１
１０６８９］、ならびにｒｈ１０［ＷＯ２００３／０４２３９７］、ＡＡＶ３Ｂ；ＡＡＶｄｊ［ＵＳ２０１０／００４７１７４］も参照されたい。特に望ましい１つのｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＳ．ｃｏ．である。
多くの場合では、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンド−およびエキソ−ヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製工程において使用されてもよい。そのようなヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを分解するために選択されてもよい。そのような工程は、単一ヌクレアーゼ、または異なる標的に指向されたヌクレアーゼの混合物を含有してもよく、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。
ＡＡＶに基づくベクターを調製する方法が知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国公開特許出願第２００７／００３６７６０号（２００７年２月１５日）を参照されたい。ＡＡＶ９のＡＡＶカプシドの使用は、本明細書に記載の組成物および方法のために特に十分に適する。ＡＡＶ９の配列およびＡＡＶ９カプシドに基づきベクターを産生する方法は、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１５／０３１５６１２、ＷＯ２０１２／１１２８３２に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。しかし、他のＡＡＶカプシドが選択または産生されてもよい。例えば、ＡＡＶ８の配列およびＡＡＶ８カプシドに基づきベクターを産生する方法は、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、第７，７９０，４４９号、および第８，３１８，４８０号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。このような多数のＡＡＶの配列は、上記で引用された米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、第７，７９０，４４９号、第８，３１８，４８０号、および米国特許第７，９０６，１１１号で提供されており、および／またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。ＡＡＶカプシドのいずれかの配列は、合成により、または様々な分子生物学および遺伝子工学技法を用いることにより、容易に産生することができる。適切な産生技法は、当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。代替的には、ペプチド（例えば、ＣＤＲ）をコードするオリゴヌクレオチドまたはペプチドそれ自体は、例えば、周知の固相ペプチド合成方法により、合成的に産生されることができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９６２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９６９）ｐｐ．２７−６２）。これらのおよび他の適切な産生方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明を限定するものではない。
本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、周知の技法を用いて産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；ＵＳ７５８８７７２ Ｂ２を参照されたい。このような方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）およびトランスジーンからなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能、を含有する宿主細胞を培養することを含む。
エンプティおよびフル粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配−精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた直線等式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験品目ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子
（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ〜ＧＣ／ｍＬは、エンプティｐｔ／ｍＬを与える。エンプティｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで除算して、次いで、ｘ１００をすることにより、エンプティ粒子のパーセンテージを得る。
一般に、エンプティカプシドおよびパッケージされたゲノムを伴うＡＡＶベクター粒子のためのアッセイ方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、例えば、緩衝液中３〜８％のＴｒｉｓ−アセテートを含有する勾配ゲルなどの３つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルをランさせること、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレン、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗−ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗−ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗−ＡＡＶ−２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗−ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次および二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、カラムフラクションからの試料が、採集され、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥロード用緩衝液中で加熱され、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）上で分解され得る。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ−ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。
一態様では、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ−ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理工程は、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃〜約５０℃）でより長時間（例
えば、約２０分間〜約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５〜１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０〜約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間〜約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
追加的に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子をゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを含み、ここで、ＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９中間体は、ｐＨ１０．２で平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０および約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９のためには最適未満であるが、ｐＨは、約１０．０〜１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶ９フルカプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィー工程のために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕らえられる。
ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターは、図１１に示されるフローダイアグラムに示されるように製造されることができ、これは、下記のセクション５．４および実施例４により詳細に記載される。
５．１．３．ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの薬学的製剤
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ製剤は、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合する塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に懸濁された有効量のＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターを含有する懸濁液である。適切には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６〜９、またはｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ７．０〜７．７、またはｐＨ７．２〜７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８〜約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、６．８〜約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかし、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択されてもよい。
適切な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン性界面活性剤のうちから選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエー
テル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択されてもよい。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字ｘ１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％〜約０．００１％の量で存在してもよい。
一実施形態では、製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４により記載されているようなｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により測定されるように、例えば、少なくとも約１ｘ１０９ＧＣ／ｍＬ〜３ｘ１０１３ＧＣ／ｍＬの濃度を含有してもよい。
一実施形態では、本明細書に記載の緩衝溶液中にｒＡＡＶを含有する凍結された組成物が凍結された形態で提供される。場合により、１つ以上の界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、安定化剤、または防腐剤が、この組成物中に存在する。適切には、使用のために、組成物は解凍され、適切な希釈剤、例えば、滅菌食塩水または緩衝化食塩水を用いて所望の用量に滴定される。
一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。適切には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５〜約２９０）である、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６−ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。場合により、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用されてもよく、または別の懸濁化剤および他の任意選択の賦形剤との組み合わせで使用されてもよい。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有してもよい。適切な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含んでもよい。
ある実施形態では、製剤（場合により、凍結された）中に懸濁された濃縮されたベクターを含むキットが提供され、任意選択で希釈緩衝液、ならびに髄腔内投与のために必要とされるデバイス、および他の構成成分が提供される。別の実施形態では、キットは、さらに、または代替的に、静脈内送達のための構成成分を含み得る。一実施形態では、キットは、注射を可能とするために十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、約１：１〜１：５、またはそれ以上の希釈の濃縮されたベクターを可能とし得る。他の実施形態では、より大量またはより少量の緩衝液または滅菌水が、治療する医師により、用量滴定および他の調整を可能とするために含まれる。さらに他の実施形態では、デバイスの１つ以上の構成成分がキット中に含まれる。
５．２．遺伝子療法プロトコル
５．２．１ 標的患者集団
本明細書では、本明細書に記載の治療有効量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳをそれを必要とする患者へ送達することを含む、ムコ多糖症ＩＩ型を治療するための方法が提供される。特に、本明細書では、本明細書に記載の治療有効量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳをそれを必要とする患者へ送達することを含む、ＭＰＳＩＩと診断された患者における神経認知低下を予防、治療、および／または緩和するための方法が提供される。本明細書に記載のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの「治療有効量」は、以下の段落のうちのいずれか１つにおいて同定される症状のうち１つ以上を補正することができる。
治療のための候補となる患者は、ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）および／またはＭＰＳＩＩに関連する症状を有する小児および成人患者である。ＭＰＳＩＩは、軽度／減弱した表現型または重度の表現型として特徴付けられる。重度の表現型（神経認知悪化を特徴とする）を伴う患者は平均１１．７歳で死亡し、軽度または減弱した表現型を伴う患者は２１．７歳で死亡する。患者の大部分（３分の２）は、この疾患の重度の形態を有する。ＭＰＳＩＩを有する患者は、出生時には正常であるように見えるが、疾患の徴候および症状は、典型的には、重度形態では、１８ヶ月齢〜４歳で出現し、減弱した形態では、４〜８歳で出現する。すべての罹患患者に共通する徴候および症状は、低身長、特徴的な顔つき、巨頭症、巨舌症、聴力喪失、肝および脾腫大、多発性骨形成性不全症、関節拘縮、脊椎管狭窄、ならびに手根管症候群を含む。ほとんどの患者では、頻繁な上気道および耳感染が生じ、進行性気道閉塞は、睡眠時無呼吸に至り、死亡することもあることが一般的に見出されている。心疾患は、この集団における主要な死因であり、左右室内肥大および心不全に至る弁膜機能不全を特徴とする。死亡は、一般に、閉塞性気道障害または心不全に起因する。
ＭＰＳＩＩの重度形態では、初期発達マイルストーンは満たされることがあるが、発達遅延は、１８〜２４ヶ月までには容易に明らかになる。一部の患者は、１年目の聴力スクリーニング試験で基準を満たすことができず、支持なしで座ることができる能力、歩行能力、話す能力を含む他のマイルストーンは、遅れている。発達の進行は、３〜５歳で平坦になり始め、６．５歳ごろに退行が始まることが報告されている。ＭＰＳＩＩを有する小児の約５０％は、トイレトレーニングを完了することができるが、すべてではないがほとんどでは、疾患の進行とともに、この能力が失われることになる。
有意な神経学的関与を伴う患者は、１歳から、多動、強情さ、および攻撃性を含む重度の行動学的障害を示し始め、これらは、神経変性がこの挙動を減弱する８〜９歳まで続く。
１０歳に達する重度に罹患した患者の半数以上において、発作が報告されており、ＣＮＳ関与を伴うほとんどの患者では、死亡時までに、重度の精神障害を持ち、常時の介護を必要とする。減弱した疾患を有する患者は、正常な知的機能を示すが、ＭＲＩ画像は、ＭＰＳＩＩを有するすべての患者において、白質病変、空洞肥大、および脳萎縮を含む全般的な脳の異常を明らかにする。
本発明の組成物は、軽症〜最悪のアナフィキラシーに及び得る組換え酵素に対する免疫応答に関連する長期間の酵素補充療法（ＥＲＴ）の合併症、ならびに局所および全身感染などの生涯に続く接触部周辺の合併症を回避する。ＥＲＴと対照的に、本発明の組成物は、生涯継続される毎週の注射を必要としない。理論に拘束されたくないが、本明細書に記載の治療的方法は、ＣＮＳ画分外で治療効力を提供する、連続的で高い循環ＩＤＳレベルを提供する、高い形質導入効率を伴うベクターにより提供される効率的な長期間の遺伝子移入を提供することにより、ＭＰＳＩＩ障害に関連する中枢神経系表現型を少なくとも補正するために有用であると考えられている。加えて、本明細書では、ＣＮＳへのＡＡＶ介
在送達の前にタンパク質形態またはＡＡＶ−ｈＩＤＳ形態で酵素を直接全身送達することを含む様々な経路により、活性のある耐性を提供するための方法、および酵素に対する抗体形成を予防するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、重度のＭＰＳＩＩと診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。いくつかの実施形態では、減弱したＭＰＳＩＩと診断された患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。いくつかの実施形態では、初期神経認知欠損を有するＭＰＳＩＩを伴う小児対象は、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、ハンター症候群と診断され、かつ神経認知欠損を有するか、または神経認知欠損を発症する危険性のある２歳以上の患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、重度のハンター症候群と相関することが知られている主要な転位または欠失の存在を有する２歳以上の患者は、本明細書に記載の方法に従って治療される。
ある実施形態では、新生児（３ヶ月齢またはそれより若い）が、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、３ヶ月齢〜９ヶ月齢である乳児が、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、９ヶ月齢〜３６ヶ月齢の小児が、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、３歳〜１２歳の小児が、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、１２歳〜１８歳の小児が、本明細書に記載の方法に従って治療される。ある実施形態では、１８歳以上の成人が、本明細書に記載の方法に従って治療される。
適切には、治療のために選ばれた患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する人を含み得る。血清、血漿、線維芽細胞、または白血球中で測定されるような欠失または減少したＩＤＳ酵素活性により確証されるＭＰＳＩＩ診断文書、他の神経学的または精神医学的因子のいずれかにより説明できないならば、以下のいずれかで規定される、ＭＰＳＩＩに起因する初期神経認知欠損の証拠文書。平均より低い少なくとも１標準偏差のＤＱ（ＢＳＩＤ−ＩＩＩ）、または連続的な試験において１超の標準偏差の低下という病歴証拠文書。代替的には、尿、血清、ＣＳＦ、または遺伝子検査におけるＧＡＧ増大が使用されてもよい。治療の前に、対象、例えば、乳幼児は、好ましくは、ＭＰＳＩＩ患者、すなわち、ｈＩＤＳをコードする遺伝子における変異を有する患者を同定するために遺伝子同定を受ける。治療前に、ＭＰＳＩＩ患者は、ｈＩＤＳ遺伝子を送達するために使用されるＡＡＶ血清型に対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価されることができる。そのようなＮａｂは、形質導入効率を妨害し、治療有効性を低下させ得る。ベースライン血清Ｎａｂ力価≦１：５を有するＭＰＳＩＩ患者は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ遺伝子療法プロトコルを用いる治療のための良好な候補である。血清Ｎａｂ＞１：５の力価を有するＭＰＳＩＩ患者の治療は、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクター送達での治療の前および／または治療中に、組み合わせ療法、例えば、免疫抑制剤での一時的な併用治療を必要としてもよい。場合により、免疫抑制併用療法は、ＡＡＶベクターカプシドおよび／または製剤の他の構成成分に対する中和抗体の事前アセスメントを伴うことなく、予防的手段として使用されてもよい。事前の免疫抑制療法は、特に、実質的にＩＤＵＡ活性レベルを有さない患者において、ｈＩＤＳトランスジーン産物に対する潜在的な有害免疫反応を予防するために望ましいものであり得、トランスジーン産物は、「外来」として見なされてもよい。以下に記載される、マウス、イヌ、およびＮＨＰにおける非臨床的研究の結果は、ｈＩＤＳに対する免疫応答および神経炎症の発達に一致する。同様の反応は、ヒト対象において生じない可能性もあるが、予防的措置として、免疫抑制療法が、ｒＡＡＶ−ｈＩＤＳのすべてのレシピエントについて推奨される。
そのような併用療法のための免疫抑制剤は、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンもしくはラパログ）、および
アルキル化剤を含む細胞分裂阻害剤、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに活性のある物質を含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、プラチナ化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、レフルノミド（Ａｒａｖａ）、シクロホスファミド、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）、クロロキン（例えば、ヒドロキシクロロキン）、硫酸キニーネ、メフロキン、アトバコンおよびプログアニルの組み合わせ、スルファサラジン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ−２受容体−（ＣＤ２５−）またはＣＤ３−指向抗体、抗−ＩＬ−２抗体、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、セルトリズマブ（Ｃｉｍｚｉａ）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、およびトファシチニブ（Ｘｅｌｊａｎｚ）、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、オピオイド、またはＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−アルファ）結合剤、およびこれらの薬物の組み合わせを含み得る。ある実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日前、またはそれ以前に開始されてもよい。そのような療法は、同日における２つ以上の薬物の併用投与を含むことができる。一実施形態では、２つ以上の薬物は、例えば、１つ以上のコルチコステロイド（例えば、プレドネリゾン、またはプレドニゾン）、および場合により、ＭＭＦおよび／またはカルシニュリン阻害剤（例えば、タクロリムス、またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））であり得る。一実施形態では、２つ以上の薬物は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムスである。別の実施形態では、２つ以上の薬物は、例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、タクロリムス、および／またはシロリムスであり得る。ある実施形態では、薬物は、ベクター送達前の０〜１５日間のＭＭＦおよびタクロリムスであり、ＭＭＦを用いて約８週間維持し、および／またはフォローアップアポイントメントを通してタクロリムスを用いる。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。ある実施形態では、患者は、初めに、用量をロードするためにＩＶステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）を投与され、続いて、経口ステロイド（例えば、プレドニゾロン）を投与され、これは、患者が１２週までにステロイドなしとなるように徐々に減少される。コルチコステロイド治療は、タクロリムス（２４週間）および／またはシロリムス（１２週間）により補足され、さらにＭＭＦで補足されることができる。タクロリムスおよびシロリムスの両方を用いる場合、各用量は、約４ｎｇ／ｍＬ〜約８ｎｇ／ｍｌの血液中レベル、または約８ｎｇ／ｍＬ〜１６ｎｇ／ｍＬのトラフレベルを維持するように調整された低用量である必要がある。ある実施形態では、これらの剤の１つのみが使用される場合、タクロリムスおよび／またはシロリムスについての総用量は、約１６ｎｇ／ｍＬ〜約２４ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。剤の１つのみが使用されるならば、ラベル用量（より高い用量）が使用されるべきである、例えば、タクロリムス、０．１５〜０．２０ｍｇ／ｋｇ／日、１２時間毎に２分割用量として投与される、およびシロリムス、１ｍｇ／ｍ２／日、負荷用量は、３ｍｇ／ｍ２である必要がある。ＭＭＦがレジメンに加えられるならば、タクロリムスおよび／またはシロリムスについての用量は、作用機序が異なるので、維持されることができる。これらのおよび他の療法は、約−１４日目〜−１日目から開始して（例えば、−２日目、０日目など）、必要に応じて、約〜最高約１週間（７日）、または最高約６０日間、または最高約１２週間、または約１６週間、または最高約２４週間、または最高約４８週間、またはそれ以上継続され得る。ある実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
ある実施形態では、患者は、以下のように免疫抑制を受ける：コルチコステロイド：メチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇＩＶ、１日目に１回、事前投与、および２日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／日で経口プレドニゾン開始、徐々に量を減らし、１２週までに中止する、
タクロリムス：１ｍｇのＢＩＤを経口により、２日目から２４週目まで、２４〜３２週目の８週間にわたって、徐々に量を減らす、シロリムス：（−２日目に負荷用量、次いで、シロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日を、４８週目まで、ＢＩＤで分割投与。ある実施形態では、ＩＳ療法は、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳの投与後４８週で中止される。
理論に拘束されたくないが、免疫抑制併用療法は、以下のうちの１つ以上を実施する：ＡＡＶおよび／またはトランスジーンに対するアネルギーまたは免疫寛容を誘導する、有効性を最適化するために免疫応答を遮断する、トランスジーンに対する新生の免疫応答を最小限にする、トランスジーンに対する既存の免疫応答の影響を最小限にする、ＡＡＶに対する既存の免疫応答の影響を最小限にする、免疫介在毒性を予防する、ＴＧ発現細胞の破壊を最小限にする、ＮＨＰにおける軸索障害／ＤＲＧ神経毒性を軽減する。
ある実施形態では、以下の特徴のうちの１つ以上を有する患者は、彼らの担当医の裁量によって治療から排除されてもよい。
●調査者または医療用モニタのいずれかの判断において研究結果の解釈を混乱させ得る、ＭＰＳＩＩに起因しないいずれかの神経認知欠損を有する。
●調査者の判断において、対象を危険な状況に置く可能性があるか、調査製品の評価または対象安全性または研究結果の解釈を妨害し得る、いずれかの状態（例えば、任意の病歴、任意の現在の疾患の証拠、身体検査における任意の知見、または任意の検査異常値）を有する。
●神経精神医学的状態の診断。
●蛍光画像法に対しての禁忌を含む、髄腔内／脳内治療投与に対するいずれかの禁忌を有する。
●ＭＲＩに対していずれかの禁忌を有する。
●登録時に急性水頭症を有する。
●どちらが長期であってもよいが、スクリーニング前の４週間以内に調査製品を用いた任意の他の臨床的研究に現在登録されているか、または、その臨床的研究で使用された調査製品の５半減期以内である。
●造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けている。
●スクリーニング前の６ヶ月以内に髄腔内投与によりイズルスルファーゼを受けた。
●任意の時点で髄腔内イズルスルファーゼを受け、調査者および／または医療用モニタの判断では、対象を危険な状況に置く可能性のある、髄腔内投与に関連すると考えられる有意な有害効果（ＡＥ）を経験した。
他の実施形態では、治療にあたる医師は、これらの身体的特徴（病歴）のうちの１つ以上の存在が本明細書に提供されるような治療を妨害するべきものでないことを決定することができる。
５．２．２．投薬量＆投与経路
患者への投与に適切な薬学的組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液、界面活性剤、および任意選択の賦形剤を含む製剤緩衝液中のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターの懸濁液を含む。ある実施形態では本明細書に記載の薬学的組成物は、髄腔内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、大槽内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、静脈内に投与される。ある実施形態では、薬学的組成物は、２０分間（±５分間）にわたって注入により末梢静脈を介して送達される。しかし、この時間は、必要に応じて、または所望により、調整されてもよい。しかし、さらに他の投与経路が選択されてもよい。代替的または追加的に、投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
ｒＡＡＶの単回投与は効果的であると期待されているが、投与は、繰り返されてもよい
（特に、新生児の治療では、例えば、１年に４回、半年に１回、１年に１回、または必要に応じて他の回数）。場合により、注入／注射に耐えることのできる対象の年齢および能力を考慮して、治療有効量の初期用量が、分割された注入／注射セッションで投与されてもよい。しかし、安心感および治療的結果の両方の観点で患者に利点を与える、治療的用量全量の注射を毎週繰り返す必要はない。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液は、少なくとも１．０ｘ１０１３ＧＣ／ｍＬであるｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）力価を有する。ある実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液中のｒＡＡＶのエンプティ／フル粒子比は、０．０１〜０．０５（９５％〜９９％がエンプティカプシド不含）である。いくつかの実施形態では、それらを必要とするＭＰＳＩＩ患者は、少なくとも約４ｘ１０８ＧＣ／ｇ脳質量〜約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶ懸濁液を投与される。
以下の治療的に有効な一定用量のｒＡＡＶ．ｈＩＤＳが、示された年齢群のＭＰＳＩＩ患者に投与されることができる。
●新生児：約１ｘ１０１１〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●３〜９ヶ月：約６ｘ１０１２〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●９ヶ月〜６歳：約６ｘ１０１２〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●３〜６歳：約１．２ｘ１０１３〜約６ｘ１０１４ＧＣ、
●６〜１２歳：約１．２ｘ１０１３〜約６ｘ１０１４ＧＣ、
●１２歳以上：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ、
●１８歳以上（成人）：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ。
他の実施形態では、以下の治療的に有効な一定用量が、以下の年齢群のＭＰＳ患者に投与される。
●新生児：約３．８ｘ１０１２〜約１．９ｘ１０１４ＧＣ、
●３〜９ヶ月：約６ｘ１０１２〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●９〜３６ヶ月：約１０１３〜約５ｘ１０１３ＧＣ、
●６〜１２歳：約１．２ｘ１０１３〜約６ｘ１０１４ＧＣ、
●１２歳以上：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ、
●１８歳以上（成人）：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ。
ある実施形態では、これらの範囲の１つ以上が、任意の年齢の患者のために使用される。ある実施形態では、一定用量の２．６×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）（２．０×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）が、６歳以上の患者に投与される。ある実施形態では、一定用量の１．３×１０１３ＧＣ（１．０×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）が、６歳以上の患者に投与される。いくつかの実施形態では、１２歳以上のＭＰＳＩＩ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は、１．４×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。いくつかの実施形態では、１２歳以上のＭＰＳＩＩ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は、７×１０１３ＧＣ）５．６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）である。なおさらなる一実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、少なくとも約４ｘ１０８ＧＣ／ｇ脳質量〜約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ新生児に投与される用量は、約１．４ｘ１０１１〜約１．４ｘ１０１４ＧＣの範囲であり；３〜９ヶ月の幼児に投与される用量は、約２．４ｘ１０１１〜約２．４ｘ１０１４ＧＣの範囲であり；９〜３６ヶ月齢のＭＰＳＩＩ小児に投与される用量は、約４ｘ１０１１〜４ｘ１０１４ＧＣの範囲であり；３〜１２歳のＭＰＳＩＩ小児に投与される用量は、約４．８ｘ１０１１〜約４．８ｘ１０１４ＧＣの範囲であり；１２歳以上の小児および成人に投与される用量は、約５．６ｘ１０１１〜約５．６ｘ１０１４ＧＣの範囲である。
ある実施形態では、少なくとも約４ｘ１０８ＧＣ／ｇ脳質量〜約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ
脳質量の用量のｒＡＡＶ懸濁液は、効力を有する。ある実施形態では、投与される用量は、少なくとも１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、少なくとも１．９ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、少なくとも６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または９．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または約４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、１．９×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。ある実施形態では、ＭＰＳＩＩ患者に投与される用量は、９．４×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。
ある実施形態では、小児の発達初期に生じる比較的急速な脳成長のために、ＩＣ投与されるＡＡＶ９．ｈＩＤＳの総用量は、異なる年齢層にわたって推定される脳質量に依存する。研究対象の年齢による脳質量については例えば、（ＡＳ Ｄｅｋａｂａｎ、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、１９７８ Ｏｃｔ；４（４）：３４５−５６を参照されたい。
これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者により決定されることができる。例えば、約１μＬ〜１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人のために選択されてもよい。典型的に、新生児幼児のためには、適切な容量は、約０．５ｍＬ〜約１０ｍＬ、より年齢の高い乳幼児のためには、約０．５ｍＬ〜約１５ｍＬが選択されてもよい。幼児のためには、約０．５ｍＬ〜約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。小児のためには、最高約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーン世代のためには、最高約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ〜約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ〜約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の適切な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
５．２．３．有効性モニタリング
本明細書で記載される療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）を有する患者における神経認知低下の予防、ならびに（ｂ）疾患のバイオマーカー、例えば、ＣＳＦ、血清、および／または尿、および／または肝臓および脾臓容積におけるＧＡＧレベルにおける減少、および／または酵素活性を評価することにより、測定することができる。神経認知は、例えば、Ｈｕｒｌｅｒ対象のためのＢａｙｌｅｙの乳幼児発達スケールにより測定されるような、またはＨｕｒｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｅ対象のためのＷｅｃｈｓｌｅｒ略式知能スケール（ＷＡＳＩ）により測定されるような、知能指数（ＩＱ）を測定することにより、測定されることができる。例えば、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール（ＢＳＩＤ−ＩＩＩ）を使用して発達指数（ＤＱ）を評価することにより、Ｈｏｐｋｉｎｓ言語学習検査を用いて、および／または可変注意力検査（ＴＯＶＡ）を用いて記憶を評価することにより、神経認知発達および機能の他の適切な測定が利用されてもよい。適応行動ス
ケール、視覚処理力、細かい運動、コミュニケーション、社会性、日常生活力、ならびに感情的および行動学的健康度などの他の神経心理学的機能がモニターされる。容量測定を獲得するための脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、拡散テンソル撮像法（ＤＴＩ）、および休息状態データ、エコー写真による正中神経断面領域、脊髄圧縮における改善、安全性、肝臓の大きさおよび脾臓の大きさも実施される。
場合により、有効性の他の測定は、バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のポリアミン）および臨床的結果の評価を含み得る。尿は、総ＧＡＧ含有量、クレアチニンに対するＧＡＧの濃度、およびＭＰＳＩＩ特異的ｐＧＡＧについて評価される。血清および／または血漿は、ＩＤＳ活性、抗−ＩＤＳ抗体、ｐＧＡＧ、およびヘパリン共同因子ＩＩ−トロンビン複合体の濃度、および炎症マーカーについて評価される。ＣＳＦは、ＩＤＵＡ活性、抗−ＩＤＳ抗体、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘ）活性、ならびにｐＧＡＧ（例えば、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸）について評価される。ベクター（例えば、ＡＡＶ９）に対する中和抗体および抗−ＩＤＳ抗体に対する結合抗体の存在が、ＣＳＦおよび血清中で評価されてもよい。ベクターカプシド（例えば、ＡＡＶ９）およびｈＩＤＳトランスジーン産物に対するＴ細胞応答が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価されてもよい。ＣＳＦ、血清、および尿中のＩＤＳ発現の薬物動態ならびにベクター濃度（ＡＡＶ９ ＤＮＡに対するＰＣＲ）もモニターされてもよい。
ｈＩＤＳの全身送達が伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子療法送達の組み合わせは、本発明の方法に包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、エラプラーゼ（登録商標）（イズルスルファーゼ）を用いて）を用いて、または肝臓に対する向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。
全身送達に関連する臨床的有効性のさらなる測定は、例えば、整形外科的測定、例えば、骨塩密度、骨塩含有量、骨幾何および骨強度、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）により測定される骨密度、身長（立位身長／年齢により横たわった状態での長さについてのＺスコア）、骨代謝のマーカー。血清オステオカルシン（ＯＣＮ）および骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）およびＩ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドα１鎖（ＣＴＸ）の測定、柔軟性および筋力。６分間歩行研究を含むＢｉｏｄｅｘおよび理学療法評価（Ｂｉｏｄｅｘ ＩＩＩ等速性力試験システムを用いて、各参加者についての膝および肘の力を評価する）、活動的な関節可動域（ＲＯＭ）、小児健康アセスメント問診表／健康アセスメント問診表（ＣＨＡＱ／ＨＡＱ）障害指標スコア、個人の心肺運動をモニターするための電気筋運動記録（ＥＭＧ）および／または酸素利用：運動中のピーク酸素取込み（ＶＯ２ピーク）、無呼吸／低呼吸指標（ＡＨＩ）、努力性肺活量（ＦＶＣ）、左心室質量（ＬＶＭ）を含んでもよい。
ある実施形態では、患者においてＭＰＳＩＩを診断および／または治療する方法、または治療をモニタリングする方法が提供される。方法は、本明細書で提供されるように、ＭＰＳＩＩを有する疑いのあるヒト患者から脳脊髄液または血漿試料を採取すること、試料中のスペルミン濃度レベルを検出すること、１ｎｇ／ｍＬを超えるスペルミン濃度を有する患者においてＭＰＳＩＩから選択されるムコ多糖症を有する患者を診断すること、および有効量のヒトＩＤＳを診断された患者に送達すること、を含む。
別の態様では、方法は、ＭＰＳＩＩ療法をモニタリングおよび調整することを含む。
このような方法は、ＭＰＳＩＩのための療法を受けているヒト患者から脳脊髄液または血漿試料を採取すること、質量分析を実施することにより試料中のスペルミン濃度レベル
を検出すること、ＭＰＳＩＩ治療的の投与レベルを調整することを含む。例えば、「正常な」ヒトスペルミン濃度は、脳脊髄液中、約１ｎｇ／ｍＬ〜２ｎｇ／ｍＬ、またはそれ未満である。しかし、未治療のＭＰＳＩＩを有する患者は、２ｎｇ／ｍＬ〜最高約１００ｎｇ／ｍＬを超えるスペルミン濃度レベルを有し得る。患者が、正常なレベルに近づいているレベルを有するならば、任意の併用薬の投与量は減少されることができる。逆に、患者が、所望のＭＰＳＩＩレベルより高いレベルを有するならば、より高い用量、またはさらなる療法、例えば、ＥＲＴを患者に提供することができる。
スペルミン濃度は、適切なアッセイを用いて測定することができる。例えば、Ｊ Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｌｏｐｅｚら、「Ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｉｏｎ ｐａｉｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７（２００９）：５９２−５９８、オンライン入手可能、２００９年２月２８日；ＭＲ Ｈａｋｋｉｎｅｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ 」、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、４４（２００７）：６２５−６３４に記載されているアッセイ、定量的アイソトープ希釈液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／質量分析（ＭＳ）アッセイ。他の適切なアッセイが用いられてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、初期神経認知欠損を有するＭＰＳＩＩを有する小児対象において投与後５２週目で神経認知を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、ＭＰＳＩＩ患者における神経認知に対するＣＳＦグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の関係を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、例えば、灰白質および白質ならびにＣＳＦ心室の容量即測定分析により測定されるような、ＭＰＳＩＩ患者におけるＣＮＳに対する身体変化に対する治療薬の効果を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、ＭＰＳＩＩ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、および尿中のバイオマーカー（例えば、ＧＡＧ、ＨＳ）に対する治療薬の薬力学的効果を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、ＭＰＳＩＩ患者の生活の質（ＱＯＬ）に対する治療薬の影響を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、ＭＰＳＩＩ患者の運動機能に対する治療薬の影響を評価することにより、測定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的有効性は、ＭＰＳＩＩ患者の成長および発達マイルストーンに対する治療薬の効果を評価することにより、測定される。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターから発現されるとき、ＣＳＦ、血清、または他の組織中で検出されるような少なくとも約２％のｈＩＤＳの発現レベルは、治療的効果を提供してもよい。しかし、より高い発現レベルが成し遂げられ得る。そのような発現レベルは、正常な機能的ヒトＩＤＳレベルの２％〜約１００％であり得る。ある実施形態では、正常な発現レベルより高いレベルが、ＣＳＦ、血清、または他の組織中で検出され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケールを用いて評価されるように、治療された患者における神経認知発達指数（ＤＱ）の有意な増大をもたらす。ある実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、ハンター症候群を有する患者において、未治療
／自然経過対照データに対して、治療された患者において１５ポイント以下のＤＱの低下をもたらす。
ある実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、機能的ヒトＩＤＳレベルの有意な増大をもたらす。ある実施形態では、本明細書に記載のＭＰＳＩＩおよび／またはそれらの症状を治療、予防、および／または緩和する方法は、患者の血清、尿および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料中で測定されるように、ＧＡＧレベルの有意な減少をもたらす。
５．３．組み合わせ療法
ｈＩＤＳの全身送達が伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ．ｈＩＤＳの遺伝子療法送達の組み合わせは、本発明の特定の実施形態に包含される。全身送達は、ＥＲＴ（例えば、エラプラーゼ（登録商標）を用いて）を用いて、または肝臓に対する向性を有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ）を用いるさらなる遺伝子療法を用いて、成し遂げることができる。
ある実施形態では、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳの髄腔内投与は、例えば、肝臓へ向けられた、第２のＡＡＶ．ｈＩＤＳ注射と共投与される。そのような場合では、ベクターは、同じであり得る。例えば、ベクターは、同じカプシドおよび／または同じベクターゲノム配列を有し得る。代替的には、ベクターは異なっていてもよい。例えば、ベクターストックの各々は、異なる調節配列（例えば、各々、異なる組織特異的プロモータを有する）、例えば、肝臓特異的プロモータ、およびＣＮＳ特異的プロモータを有するように設計されることができる。追加的に、または代替的には、ベクターストックの各々は、異なるカプシドを有してもよい。例えば、肝臓に指向されたベクターストックは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ１０、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｄｊから選択されるカプシドを有してもよい。そのようなレジメンでは、各ベクターストックの用量は、髄腔内に送達されるベクター全量が、約１ｘ１０８ＧＣ〜ｘ１ｘ１０１４ＧＣの範囲内であるように、調整されることができ、他の実施形態では、両方の経路により送達される合わせたベクターは、１ｘ１０１１ＧＣ〜１ｘ１０１６ＧＣの範囲である。代替的には、各ベクターは、約１０８ＧＣ〜約１０１２ＧＣ／ベクターの量で送達されてもよい。そのような用量は、実質的に同時に、または異なる時点で、例えば、約１日〜約１２週間の間隔をあけて、または約３日〜約３０日の間隔をあけて、または他の適切な時点で、投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、治療のための方法は、以下を含む。（ａ）ＭＰＳＩＩおよび／またはハンター症候群の症状を有する患者に、トランスジーン特異的耐性を誘導するために十分な量のｈＩＤＳ酵素または肝臓指向性ｒＡＡＶ−ｈＩＤＵＡを投与すること、ならびに（ｂ）ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを患者のＣＮＳへ投与すること、ここで、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳは患者において治療的レベルのｈＩＤＳの発現を導く。
さらなる実施形態では、トランスジーン特異的耐性を誘導するためにｈＩＤＳ酵素または肝臓−指向ｒＡＡＶ−ｈＩＤＳの有効量を用いてＭＰＳＩＩおよび／またはハンター症候群に関連する症状を有する患者を寛容化し、続いて、患者にｈＩＤＳのｒＡＡＶ介在送達を行うことを含む、ＭＰＳＩＩおよび／またはハンター症候群に関連する症状を有するヒト患者を治療する方法が提供される。ある実施形態では、例えば、患者が４週齢未満（新生児期）または乳幼児である場合、ＣＮＳにおいて治療的濃度のｈＩＤＳを発現させるために、患者は、ｈＩＤＳに対して患者を寛容化するために肝臓に指向された注射によりｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与され、患者が乳幼児、小児、および／または成人である場合、患者は引き続き髄腔内注射によりｒＡＡＶ．ｈＩＤＳを投与される。
一実施例では、ＭＰＳＩＩ患者は、生後約２週間以内、例えば、約０〜約１４日以内、または約１日〜１２日以内、または約３日目〜約１０日目、または約５日目〜約８日目に、すなわち、患者は、新生児期乳児である時期に、患者にｈＩＤＳを送達することにより、寛容化される。他の実施形態では、より年齢の高い乳幼児が選択されてもよい。寛容化用量のｈＩＤＳは、ｒＡＡＶにより送達され得る。しかし、別の実施形態では、用量は、酵素（酵素補充療法）の直接送達により送達される。組換えｈＩＤＳを産生する方法は、文献に記載されている。
追加的に、エラプラーゼ（登録商標）（イズルスルファーゼ）として商業的に生産された組換えｈＩＤＳは、全身送達のために有用であり得る。現在では好ましいものではないが、酵素は、「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡ、ＲＮＡ、または別の適切なベクターにより送達されてもよい。一実施形態では、酵素は、患者の静脈内および／または髄腔内に送達される。別の実施形態では、別の投与経路が使用される（例えば、筋内、皮下など）。一実施形態では、寛容化のために選択されたＭＰＳＩＩ患者は、寛容化用量を開始する前にいずれの検出可能な量のｈＩＤＳを発現することができない。組換えヒトＩＤＳ酵素が送達される場合、静脈内ｒｈＩＤＳ注射は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重からなり得る。代替的には、より高いまたはより低い用量が選択される。同様に、ベクターから発現される場合、より低い発現タンパク質レベルが送達され得る。一実施形態では、寛容化のために送達されるｈＩＤＳの量は、治療有効量よりも少ない。しかし、他の用量が選択されてもよい。
典型的に、寛容化用量の投与後に、例えば、寛容化用量後約３日〜約６ヶ月以内、より好ましくは、寛容化用量後の約７日〜約１ヶ月以内に、治療的用量が、対象に送達される。しかし、これらの範囲内の他の時点が選択されてもよく、より長いまたはより短い待機期間であってもよい。
代替として、免疫抑制療法は、ベクター投与の前、その間、および／またはその後に、ベクターに加えて実施され得る。免疫抑制療法は、上記したように、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、およびタクロリムス、またはシロリムスを含むことができる。下記のタクロリムスを含まないレジメンが好ましいことがある。
５．４．製造
一実施形態は、本明細書に記載の（実施例４、下記）、ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳ薬学的組成物の製造を提供する。説明的な製造プロセスは、図１０Ａおよび１０Ｂに提供される。ｒＡＡＶ．ｈＩＤＳベクターは、図１０Ａおよび１０Ｂに示されるフローダイアグラムにおいて示されるように製造されることができる。簡潔にいうと、細胞は、適切な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス−プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス−プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター産生プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の血清不含培地への培地交換、ベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。
粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物のダイアフィルトレーション、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液
化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過によるバッファー交換、および／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの方法工程に供され得る。
２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、ベクター薬物製品を精製し、エンプティカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という題名の第６２／２２６，３５７号により詳細が記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ８のための精製方法、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号、および２０１５年１２月１１日に出願された第６２／２６６，３４１号、ならびにｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」という題名の第６２／２６６，３４７号、ならびにＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」という第６２／２６，３５１号にあり、それらは参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
５．５．脳脊髄液への薬学的組成物の送達のための機器および方法
一態様では、本明細書で提供されるベクターは、このセクションで提供されるか、実施例および図１１にさらに記載される方法および／またはデバイスにより髄腔内に投与されてもよい。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択されてもよい。方法は、脊椎ニードルを患者の大槽内に前進させる工程、１本の可撓性チューブを脊椎ニードルの近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結する工程と、その前進および連結工程の後、患者の脳脊髄液を用いてチューブをセルフプライム可能とした後、一定量の等張溶液を含有する第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結し、その後、一定量の薬学的組成物を含有する第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結する工程と、を含む。第１および第２容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物は脊椎ニードルを通して患者に注射され、薬学的組成物の注射後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、薬学的組成物を患者にフラッシュするために脊椎ニードル中に注射される。
別の態様では、薬学的組成物の槽内送達のためのデバイスが提供される。デバイスは、一定量の薬学的組成物を含有する第１の容器、等張溶液を含有する第２の容器、および脊椎ニードルを含み、それを通して、薬学的組成物は、患者の大槽内の脳脊髄液中へデバイスから直接放出され得る。デバイスはさらに、第１の容器に相互連結した第１の入口ポート、第２の容器に相互連結した第２の入口ポート、脊椎ニードルに相互連結した出口ポート、ならびに脊椎ニードルを通る薬学的組成物および等張溶液の流れを制御するためのルアーロックを有するバルブを含む。
本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って
作成された一連の平面断面からコンピュータにより身体構造の三次元画像が構築されるＸ線撮影法を指す。
図１１に示されるような機器または医療用デバイス１０は、バルブ１６により相互連結した１つ以上の容器１２および１４を含む。容器１２および１４は、それぞれ、薬学的組成物、薬物、ベクター、または同様の物質の新鮮なソース、および食塩水などの等張溶液の新鮮なソースを提供する。容器１２および１４は、患者への流体の注射を可能とする医療用デバイスの任意の形態であり得る。
例として、各容器１２および１４は、シリンジ、カニューレなどの形態で提供されてもよい。例えば、説明された実施形態では、容器１２は、一定量の薬学的組成物を含有する別個のシリンジとして提供され、本明細書では「ベクターシリンジ」と称される。単なる例示目的として、容器１２は、約１０ｃｃの薬学的組成物などを含有してもよい。
同様に、容器１４は、一定量の食塩水溶液を含有する別個のシリンジ、カニューレなどの形態で提供されてもよく、「フラッシュシリンジ」と称される。単なる例示目的として、容器１４は、約１０ｃｃの食塩水溶液を含有してもよい。
代替として、容器１２および１４は、シリンジではない形態で提供されてもよく、単回デバイスに一体化されてもよく、例えば、一体化された医療用注射デバイスは、一対の別個のチャンバーを有し、一方は薬学的組成物用であり、他方は食塩水溶液用である。また、チャンバーまたは容器のサイズは、所望の量の流体を含有するために必要に応じて提供されてもよい。
説明された実施形態では、バルブ１６は、旋回式雄型ルアーロック１８を有する４方向停止コックとして提供される。バルブ１６は、容器１２および１４（すなわち、説明された実施形態では、ベクターシリンジおよびフラッシュシリンジ）に相互連結し、旋回式雄型ルアーロックは、容器１２および１４の各々に対して開閉されるようにバルブ１６を通る通路を可能とする。このように、バルブ１６を通る通路は、ベクターシリンジおよびフラッシュシリンジの両方に対して閉じられてもよく、またはベクターシリンジおよびフラッシュシリンジの選択された一方に対して開放されてもよい。４方向停止コックの代替として、バルブは、３方向停止コックまたは流体制御デバイスであってもよい。
説明された実施形態では、バルブ１６は、１本の延長チューブ２０などの流体用導管の一端に連結される。チューブ２０は、所望の長さまたは内部容量に基づいて選択され得る。単なる例示であるが、チューブは、約６〜７インチの長さであり得る。
説明された実施形態では、チューブ１２の逆端２２は、Ｔ−コネクタ延長セット２４に連結され、これは次に脊椎ニードル２６に連結される。例示として、ニードル２６は、５インチの２２または２５ゲージの脊椎ニードルであり得る。加えて、一選択肢として、脊椎ニードル２６は、３．５インチ、１８ゲージの導入用ニードルなどの導入用ニードル２８に連結され得る。
使用において、脊椎ニードル２６および／または任意選択の導入用ニードル２８は、患者内を大槽に向かって前進させることができる。ニードル前進の後、ニードル２６および／または２８および関連のある軟組織（例えば、傍脊柱筋群、骨、脳幹、および脊髄）の視覚化を可能にするコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像が得られてもよい。正確なニードル配置が、ニードルハブ中の脳脊髄液（ＣＳＦ）の観察および大槽内のニードル先端の視覚化により、確認される。その後、比較的短い延長チューブ２０は、挿入された脊椎ニードル２６に取り付けられてもよく、次いで、４方向停止コック１６が、チューブ２０の逆
端に取り付けられてもよい。
上記のアセンブリは、患者のＣＳＦを用いて「セルフプライム」することができる。その後、充填済み通常の食塩水フラッシュシリンジ１４は、４方向停止コック１６のフラッシュ入口ポートに取り付けられ、次いで、薬学的組成物を含有するベクターシリンジ１２は、４方向停止コック１６のベクター入口ポートに取り付けられる。その後、停止コック１６の出力ポートは、ベクターシリンジ１２に対して開放され、ベクターシリンジの内容物は、バルブ１６および組み立てられた機器を通って患者内に一定期間にわたってゆっくりと注射されてもよい。単なる例示を目的としているが、この期間は、おおよそ１〜２分間および／または任意の他の所望時間であり得る。
ベクターシリンジ１２の内容物が注射された後、停止コック１６およびニードルアセンブリが、取り付けられた充填済みフラッシュシリンジ１４を用いて所望の量の通常の食塩水をフラッシュできるように、停止コック１６上の旋回式ロック１８は、第２の位置に回される。単なる例示を目的としているが、１〜２ｃｃの通常の食塩水が用いられてもよい、しかしより大量またはより少量が必要に応じて使用されてもよい。通常の食塩水は確実に薬学的組成物のすべてまたは大部分を組み立てられたデバイスを通して患者内に注射するように強いるので、薬学的組成物はほとんどまたはまったく組み立てられたデバイス中に残らない。
組み立てられたデバイスが食塩水をフラッシュした後、ニードル（複数可）、延長チューブ、停止コック、およびシリンジを含むそのすべての組み立てられたデバイスは、ゆっくりと対象から取り出され、バイオハザード廃棄物入れまたは硬質容器（ニードル（複数可）のため）へ廃棄するために手術トレイへ置かれる。
スクリーニングプロセスは、最終的に槽内（ＩＣ）手順を導き得る主な調査者により着手されることができる。主な調査者は、対象（または指定された介護者）が十分に情報を得ることができるように、プロセス、手順、投与手順そのもの、およびすべての潜在的な安全性危険性を記載することができる。病歴、併用薬、身体検査、バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）、およびラボ検査結果が、得られてもよく、または実施されてもよく、ＩＣ手順のための対象適格性のスクリーニングアセスメントにおいて使用するために神経放射線科医、神経外科医、および麻酔科標榜医へ提供される。
適格性を吟味するために十分な時間を可能とするために、以下の手順が、第１のスクリーニングビジット〜研究ビジット前の最大１週間の間の任意の時点で実施されてもよい。例えば、「０日目」では、ガドリニウム（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を伴うおよび伴わない頭部／頸部磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が得られてもよい。頭部／頸部ＭＲＩに加えて、調査者は、屈曲／延伸研究による首のさらなるいずれかの評価が必要かどうかを決定してもよい。ＭＲＩプロトコルは、Ｔ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ、およびＣＩＮＥプロトコル画像を含み得る。
加えて、頭部／頸部ＭＲＡ／ＭＲＶは、ＣＳＦ流れの十分な評価、およびＣＳＦ空間内のコミュニケーションの起こり得る妨害または欠失の同定を可能とする、制度プロトコルにより得られてもよい（すなわち、硬膜間／硬膜内処置の履歴を有する対象は、排除されてもよく、またはさらに試験（例えば、放射性ヌクレオチドシステルノグラフィ）を必要とし得る）。
神経放射線科医、神経外科医、および麻酔科標榜医は、入手可能な情報（スキャン、病歴、身体検査、ラボなど）に基づき、最終的に議論し、ＩＣ手順のために各対象の適格性を決定する。ＭＰＳ対象の特別な生理的必要性を考慮した、気道、首（短くなった／太く
なった）、および頭部運動範囲（首屈曲の程度）の詳細なアセスメントを提供する、麻酔処置前評価が、「−２８日目」〜「１日目」に得られてもよい。
ＩＣ手順の前に、ＣＴスイートは、以下の機器および医薬が存在することを確認する。
成人腰部穿刺（ＬＰ）キット（協会によって供給される）、
ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージｘ３〜７インチの脊椎ニードル（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）、
（脊椎ニードルの導入のために）介入者の裁量で使用される、同軸導入用ニードル、
旋回式（スピン）雄型ルアーロックを伴う４方向小口径停止コック、
雌型ルアーロックアダプタを伴うＴ−コネクタ延長セット（チューブ）、おおよその長さ６．７インチ、
髄腔内投与のためのＯｍｎｉｐａｑｕｅ１８０（イオヘキソール）、
静脈内（ＩＶ）投与のためのヨウ素化コントラスト、
注射用の１％のリドカイン溶液（成人ＬＰキット中で供給されていない場合）、
充填済み１０ｃｃ通常食塩水（滅菌）フラッシュシリンジ、
放射線不透過性マーカー（複数可）、
手術準備用機器／カミソリ、
挿管された対象の正確な位置を可能とするための枕／支持、
気管内挿管用機器、全身麻酔機械、および機械式通風装置、
術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）機器（および必要とされる人員）、ならびに
ベクターを含有する１０ｃｃのシリンジ、別の薬務マニュアルに従って、調整され、ＣＴ／手術室（ＯＲ）スイートに輸送される。
手順のためのインフォームドコンセントを確認し、診療記録および／または研究ファイル内で文書化をする。制度上必要条件であるため、放射線科および麻酔科のスタッフから手順についての同意を別個に得る。対象は、制度ガイドラインに従って、適切な病院治療室内に配置された静脈内アクセス（例えば、２つのＩＶアクセス部位）を有する。静脈内流体は、麻酔医の裁量で投与される。麻酔医の裁量および制度ガイドラインに従って、対象は、領域または手術／ＣＴ処置スイートを有する適切な患者治療室において、全身麻酔の投与とともに、気管内挿管を導入され、気管内挿管を受けてもよい。
腰部穿刺が実施され、初め、５ｃｃの脳脊髄液（ＣＳＦ）を除去し、引き続いて、大槽の視覚化を補助するためにコントラスト（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ１８０）が髄腔内に注射される。適切な対象位置付け工作を実施して、コントラストの大槽への核酸を促進することができる。
術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）機器が、対象に取り付けられる。対象は、うつ伏せまたは横向き臥位で、ＣＴスキャナ台上に配置される。輸送および位置付けの間、対象の安全性を確実なものとするために、十分な人数のスタッフが存在する必要がある。適切であると考えられるならば、対象は、処置前評価の間安全であると判定される程度まで首を屈曲させる様式で、位置付けられてもよく、位置付けられた後、通常の神経生理学的モニターシグナルが記録される。
以下のスタッフが、存在するか、施設内に存在することが確認され得る：手順を実施する介入者／神経外科医、麻酔科標榜医および呼吸器系技師（複数可）、看護師および医師アシスタント、ＣＴ（またはＯＲ）技師、神経生理学的技師、および施設内コーディネーター。正確な対象、手順、部位、位置付け、および室内で必要なすべての機器の存在を確認するために、医療施設認定合同機構（Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）／病院プロトコルに従って、「タイムアウト」が完了され得る。施設内リーダー調査者は、次いで、
スタッフに彼らが対象準備に進むことができるかを確認することができる。
頭蓋底下の対象の皮膚は、適切に剃られる。ＣＴスカウト画像が実施され、続いて、介入者が、標的位置をローカライズし、脈管構造を画像化することが必要と考える場合には、ＩＶコントラストを用いる手順前プラニングＣＴが実施される。標的部位（大槽）が同定され、ニードル軌道が計画され、制度ガイドラインに従って滅菌技法を用いて、皮膚は準備され、布を掛けられる。介入者により指示される場合、放射線不透過性マーカーが、標的皮膚位置に配置される。マーカーされた皮膚は、１％のリドカインを用いて湿潤により麻酔をかけられる。次いで、２２Ｇまたは２５Ｇの脊椎ニードルは大槽に向かって前進されるが、同軸導入用ニードルを使用する選択肢もある。
ニードル前進の後、協会の機器を用いて実行可能な最も薄いＣＴスライス厚さ（理想的には≦２．５ｍｍ）を用いて、ＣＴ画像が得られる。ニードルおよび関連する軟組織（例えば、傍脊柱筋群、骨、脳幹、および脊髄）の十分な視覚化を可能にするのに可能な最も少ない放射線量を用いる連続的ＣＴ画像が、得られる。正確なニードル配置が、ニードルハブ中のＣＳＦの観察および大槽内のニードル先端の視覚化により、確認される。
介入者は、ベクターシリンジが、滅菌野に近接しているが、滅菌野の外側に位置付けられていることを確認する。ベクターシリンジ中の薬学的組成物を取り扱う前またはそれを投与する前に、滅菌野内の処置を補助するスタッフは、グローブ、マスク、および保護用メガネを装着する。
延長チューブは、挿入された脊椎ニードルに取り付けられ、これは次いで、４方向停止コックに取り付けられる。一旦、この機器が対象のＣＳＦで「セルフプライム」されると、１０ｃｃの充填済みの通常食塩水フラッシュシリンジが、４方向停止コックのフラッシュ入口ポートに取り付けられる。次いで、ベクターシリンジが介入者に提供され、４方向停止コック上のベクター入口ポートに取り付けられる。
停止コックの旋回式ロックを第１の位置に配置することにより、停止コックの出口ポートが、ベクターシリンジに対して開放された後、注射の間、シリンジのプランジャーに過度の力を加えないように気を付けながら、ベクターシリンジの内容物はゆっくりと（おおよそ１〜２分間）注射される。ベクターシリンジの内容物が注射された後、停止コックおよびニードルアセンブリが、取り付けられた充填済みフラッシュシリンジを用いて１〜２ｃｃの通常の食塩水をフラッシュできるように、停止コックの旋回式ロックは、第２の位置に回される。
用意ができたら、次いで、介入者は自分が対象から機器を取り出すことをスタッフに警告する。単一の動作で、ニードル、延長チューブ、停止コック、およびシリンジは、ゆっくりと対象から取り出され、バイオハザード廃棄物入れまたは硬質容器（ニードルのため）へ廃棄するために手術トレイへ置かれる。
調査者により指示されるように、ニードル挿入部位は、出血またはＣＳＦ漏出の徴候について調べられ、治療される。指示されるように、ガーゼ、手術用テープ、および／またはＴｅｇａｄｅｒｍ手当用品を用いて、部位は手当される。次いで、対象は、ＣＴスキャナから取り出され、ストレッチャー上に仰向けで配置される。輸送および位置付けの間、対象の安全性を確実なものとするために、十分な人数のスタッフが存在する。
麻酔を中止し、対象は、麻酔後ケアのための制度ガイドラインに従ってケアされる。神経生理学的モニターが対象から取り除かれる。対象が横たわっているストレッチャーの頭側は、回復中、若干上昇させる必要がある（約３０度）。制度ガイドラインに従って、対
象は適切な麻酔後治療室に輸送される。対象が、十分に意識を回復し、安定な状態となった後、対象は、プロトコル指定の評価のために適切なフロア／ユニットに入院する。神経学的評価は、プロトコルに従って実施され、主要な調査者は、病院および研究スタッフとの共同で対象ケアを監督する。
一実施形態では、本明細書で提供される組成物の送達のための方法は、脊椎ニードルを患者の大槽内に前進させる工程、１本の可撓性チューブを脊椎ニードルの近位ハブに連結し、可撓性チューブの近位端にバルブの出力ポートを連結する工程、そのような前進および連結工程の後、患者の脳脊髄液を用いてチューブをセルフプライム可能とした後、一定量の等張溶液を含有する第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結し、その後、一定量の薬学的組成物を含有する第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結する工程、そのような第１および第２の容器をバルブに連結した後、バルブのベクター入口ポートと出口ポートとの間の流体流れのための通路を開放し、脊椎ニードルを通じて薬学的組成物を患者に注射する工程、薬学的組成物を注射した後、バルブのフラッシュ入口ポートおよび出口ポートを通る流体流れのための通路を開放し、等張溶液を脊椎ニードルに注射して、薬学的組成物を患者内にフラッシュする工程、を含む。ある実施形態では、方法はさらに、チューブおよびバルブを脊椎ニードルのハブに連結する前に、大槽内における脊椎ニードルの遠位先端の正確な配置を確認することを含む。ある実施形態では、確認工程は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像法を用いて、大槽内で脊椎ニードルの遠位端を視覚化することを含む。ある実施形態では、確認工程は、脊椎ニードルのハブにおいて患者の脳脊髄液の存在を観察することを含む。
上記の方法では、バルブは、フラッシュ入口ポートを通る流れを同時に遮断しながら、ベクター入口ポートから出口ポートへの流れを許可する第１の位置に旋回するように適合され、またベクター入口ポートを通る流れを同時に遮断しながら、フラッシュ入口ポートから出口ポートへの流れを許可する第２の位置に旋回するように適合された旋回式ルアーロックを伴う停止コックであり得、ここで、旋回式ルアーロックは、薬学的組成物が患者に注射されるときに前述の第１の位置に位置付けられ、薬学的組成物が等張溶液によりその患者内へフラッシュされるときに前述の第２の位置へ位置付けられる。ある実施形態では、等張溶液を脊椎ニードル内へ注射して、薬学的組成物を患者内にフラッシュした後、脊椎ニードルは、患者から、チューブ、バルブ、ならびにアセンブリとしてそれに連結された第１および第２の容器とともに引き抜かれる。ある実施形態では、バルブは、旋回式雄ルアーロックを有する４方向停止コックである。ある実施形態では、第１および第２の容器は、別個のシリンジである。ある実施形態では、Ｔ−コネクタは、脊椎ニードルのハブに位置し、チューブを脊椎ニードルに相互連結する。場合により、脊椎ニードルは、脊椎ニードルの遠位端に導入用ニードルを含む。脊椎ニードルは、５インチの２２または２４ゲージの脊椎ニードルであり得る。ある実施形態では、導入用ニードルは３．５インチ、１８ゲージの導入用ニードルである。
ある態様では、方法は、最低限、一定量の薬学的組成物を含有するための第１の容器、等張溶液を含有する第２の容器、患者の大槽内の脳脊髄液へデバイスから直接薬学的組成物が放出され得る脊椎ニードル、ならびに第１の容器と相互連結した第１の入口ポートと、第２の容器に相互連結した第２の入口ポートと、脊椎ニードルに相互連結した出口ポートと、脊椎ニードルを通る薬学的組成物および等張溶液の流れを制御するためのルアーロックとを有するバルブ、からなるデバイスを利用する。ある実施形態では、バルブは、第１の入口ポートから出口ポートへの流れを許可しながら、同時に第２の入口ポートを通る流れを遮断する第１の位置に旋回するように適合され、また第２の入口ポートから出口ポートへの流れを許可しながら、同時に第１の入口ポートを通る流れを遮断する第２の位置に旋回するように適合された旋回式ルアーロックを伴う停止コックである。場合により、バルブは、旋回式雄型ルアーロックを伴う４方向停止コックである。ある実施形態では、
第１および第２の容器は、別個のシリンジである。ある実施形態では、脊椎ニードルは、１本の可撓性チューブによりバルブと相互連結している。Ｔ−コネクタは、チューブを脊椎ニードルに相互連結させることができる。ある実施形態では、脊椎ニードルは、５インチ、２２または２４ゲージの脊椎ニードルである。ある実施形態では、デバイスはさらに、脊椎ニードルの遠位端に連結した導入用ニードルを含む。場合により、導入用ニードルは３．５インチ、１８ゲージの導入用ニードルである。
この方法およびこのデバイスは、それぞれ、場合により、本明細書で提供される組成物の髄腔内送達のために使用されてもよい。代替的には、他の方法およびデバイスが、そのような髄腔内送達のために使用されてもよい。
以下の実施例は単に説明的なものであり、本明細書に記載の発明を限定するものではない。
実施例１：ヒト対象の治療のためのプロトコル
この実施例は、ＭＰＳＩＩ、すなわち、ハンター症候群を有する患者のための遺伝子療法治療に関する。この実施例では、野生型ｈＩＤＳ酵素をコードする修飾されたｈＩＤＳ遺伝子を発現する、遺伝子療法ベクター、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ、複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター９（ＡＡＶ９）が、ＭＰＳＩＩ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）へ投与される。ＡＡＶベクターの用量は、全身麻酔下でＣＮＳに直接注射される。治療の有効性は、本明細書に記載されるように、バイオマーカー、例えば、対象のＣＳＦまたは血清における病原性ＧＡＧおよび／またはヘパリン硫酸（ＨＳ）濃度の減少を含む、神経認知発達および／またはサロゲートマーカーの臨床的測定を用いて評価される。
Ａ．遺伝子療法ベクター
遺伝子療法ベクターは、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を発現する血清型９の非複製組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、この実施例ではＡＡＶ９．ＣＢ．ＩＤＳとして称される（図１を参照されたい）。ＡＡＶ９血清型は、ＩＣ投与後にＣＮＳ中のｈＩＤＳ産物の効率的な発現を可能とする。
ＩＤＳ発現カセットは、逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接しており、発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよびニワトリベータアクチンプロモータ（ＣＢ７）のハイブリッドにより駆動される。トランスジーンは、ニワトリベータアクチンイントロンおよびウサギベータ−グロビンポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルを含む。
ベクターは、製剤緩衝液（Ｅｌｌｉｏｔｓ Ｂ溶液、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ
Ｆ６８）中に懸濁される。構築物は、Ｍ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２１：１２５９−１２７１（２０１０）において以前記載されたように、ＡＡＶ９カプシド中にパッケージされ、精製され、力価測定された。製造プロセスは、以下の実施例４でより詳細に記載される。
ベクター産生：
一連のベクターが作製された。１つのプラスミドは、コドン最適化されたＩＤＳ配列（配列番号１１のｎｔ１１７７〜ｎｔ２８２９）を含有する。他の２つは、ＣＢ７プロモータ（ＣＢ６）の短縮バージョンを用いて、ＳＵＭＦ１［配列番号７および配列番号１０］と呼ばれる第２のタンパク質を発現した。産生されたベクターゲノム、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳｃｏ．ＲＢＧは、配列番号１１のｎｔ２〜ｎｔ３９６７の配列を有し、ＡＡＶ．ＣＢ６．ｈＩＤＳｃｏ．ＩＲＥＳ．ｈＳＵＭＦ１ｃｏは、配列番号８のｎｔ１１〜ｎｔ４９６４の配列を有する。プラスミドは、コドン最適化およびｈＩＤＳ配列の合成に
より構築され、次いで、得られた構築物は、プラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧまたはｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ６．ＣＩ．ＲＢＧ、ＣＢ７またはＣＢ６、ＣＩ、およびＲＢＧ発現要素を含有するＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接する発現カセットにクローニングされて、前述のベクターゲノムを得る。
ナイーブヒトＩＤＳ ｃＤＮＡを含有するなおさらなるプラスミドが作製された、これらのプラスミドは、本明細書では、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧおよびｐＡＡＶ．ＣＢ６．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＩＲＥＳ．ＳＵＭＦ１．ＲＢＧと称される。これらのプラスミドに由来するベクターゲノム［配列番号３のｎｔ２〜ｎｔ３９６７および配列番号５のｎｔ１１〜ｎｔ４９６４］は、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ隣接のｈＩＤＳ発現カセットを伴う一本鎖ＤＮＡゲノムである。トランスジーンカセットからの発現は、ＣＢ７またはＣＢ６プロモータ、ＣＭＶ最初期エンハンサー（Ｃ４）およびニワトリベータアクチンプロモータの間のハイブリッドにより駆動され、一方で、このプロモータからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在により高められる。発現カセットのためのポリＡシグナルは、ＲＢＧポリＡである。プラスミドは、ｈＩＤＳ配列の合成により構築され、次いで、得られた構築物は、プラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧまたはｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ６．ＣＩ．ＲＢＧ、またはＣＢ７、ＣＩ、およびＲＢＧ発現要素を含有するＡＡＶ２ ＩＴＲ隣接の発現カセットにクローニングされて、前述のベクターゲノムを得る。
配列要素の記載：
逆位末端配列（ＩＴＲ）：ＡＡＶ ＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ ＮＣ００１４０１）は、両端が同一であるが、逆方向である配列である。ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、ベクターＤＮＡ複製の起源およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノムの複製およびパッケージングのために必要とされるシス配列のみを表す。
ＣＭＶ最初期エンハンサー（３８２ｂｐ、Ｃ４、ＧｅｎＢａｎｋ ＃ Ｋ０３１０４．１）。この要素は、ベクターゲノムプラスミド中に存在する。
ニワトリベータアクチンプロモータ（２８２ｂｐ、ＣＢ、ＧｅｎＢａｎｋ ＃ Ｘ００１８２．１）を用いて、高レベルのｈＩＤＳ発現を駆動させる。
ニワトリベータアクチンイントロン：ニワトリベータアクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ
＃ Ｘ００１８２．１）からの９７３ｂｐのイントロンは、ベクター発現カセット中に存在する。イントロンは転写されるが、その両端のいずれかにある配列と合わせて、スプライシングにより成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から除去される。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡ輸送を促進し、それにより、翻訳のためのｍＲＮＡの一定レベルの蓄積を高めることが示されている。これは、遺伝子発現レベルの増大を意図した遺伝子ベクターにおいて共通の特徴である。この要素は、ベクターゲノムおよびプラスミドの両方に存在する。
イズロン酸−２−スルファターゼコーディング配列：ｈＩＤＳ配列は、合成された［配列番号１］。コードされたタンパク質は、本明細書の初めの方に記載されている、５５０アミノ酸［配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿０００１９３、ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（Ｐ２２３０４．１）］である。配列番号：１および２を参照されたい。コドン最適化されたｈＩＤＳコーディング配列は、配列番号８のｎｔ３４２３〜ｎｔ４５５３、および配列番号１１のｎｔ１９３７〜ｎｔ３５８９に示されている。
ポリアデニル化シグナル：１２７ｂｐのウサギベータ−グロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｖ００８８２．１）は、抗体ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためのシス配列を提供する。この要素は、転写終止、初期転写物の３’での特異的消化事象、および長いポリアデニルテイル付加のためのシグナルとして機能する。この要素は、ベクターゲノムおよびプラスミドの両方に存在する。
Ｂ．投与および投与経路
４ヶ月齢以上〜５歳未満の年齢の患者は、２．６ｘ１０１２ＧＣ（２．０ｘ１０９ＧＧ／ｇ脳質量）（低用量）〜１．３ｘ１０１４ＧＣ（１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量（高用量））の範囲のｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの単回髄腔内／槽内用量を受ける。患者は、１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量または６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量を用いて治療されることができる。
ある実施形態では、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳは、後頭下投与経路により大槽（ＩＣ）内へ注入により投与される。ニードルのＩＣへの挿入は、ＣＴガイダンスにより実施される。全身麻酔および気管内挿管は、手順の間に必要とされる。スクリーニングの間の頭部／頸部ＭＲＩを用いて、適切な解剖学的構造が示される。
ある実施形態では、腰部穿刺が実施され、初め、５ｃｃのＣＳＦを除去し、引き続いて、大槽の視覚化を補助するためにコントラストがＩＴ注射される。ＣＴ（コントラストあり）を利用して、ニードル挿入およびｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡの後頭下空間への投与をガイドする。
以下の治療的に有効な一定用量が、示された年齢群の患者に投与される。
●新生児：約１ｘ１０１１〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●３〜９ヶ月：約６ｘ１０１２〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●９ヶ月〜６歳：約６ｘ１０１２〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●３〜６歳：約１．２ｘ１０１３〜約６ｘ１０１４ＧＣ、
●６〜１２歳：約１．２ｘ１０１３〜約６ｘ１０１４ＧＣ、
●１２歳以上：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ、
●１８歳以上（成人）：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ。
他の実施形態では、以下の治療的に有効な一定用量が、以下の年齢群のＭＰＳ患者に投与される。
●新生児：約３．８ｘ１０１２〜約１．９ｘ１０１４ＧＣ、
●３〜９ヶ月：約６ｘ１０１２〜約３ｘ１０１４ＧＣ、
●９〜３６ヶ月：約１０１３〜約５ｘ１０１３ＧＣ、
●６〜１２歳：約１．２ｘ１０１３〜約６ｘ１０１４ＧＣ、
●１２歳以上：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ、
●１８歳以上（成人）：約１．４ｘ１０１３〜約７．０ｘ１０１４ＧＣ。
本明細書で議論されるように、エンプティカプシドが、患者に投与されるｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの用量から確実に除去されるように、エンプティカプシドは、ベクター精製プロセス中、塩化セシウム勾配超遠心分離、またはイオン交換クロマトグラフィーによりベクター粒子から分離される。
免疫抑制療法は、ベクターに加えて、投与されてもよい。免疫抑制療法は、−２日目に一回のコルチコステロイド（メチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ静脈内［ＩＶ］と、−１日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、徐々に量を減らし、１６週目までに中止する、経口プレドニゾンと、−２日目〜２４週目の経口によるタクロリムス（０．２ｍｇ／ｋｇ
／日と、およびシロリムス（１日１回［ＱＤ］−２日目〜４８週目ビジットまで）とを含む。説明的なシロリムス用量は、（−２日目に６ｍｇのＰＯ、次いで、−１日目〜４８週目ビジットまで２ｍｇのＱＤ）を含んでもよい。シロリムス用量調整は、１６〜２４ｎｇ／ｍＬ内の血中トラフ濃度を維持するために実施されることができる。調整は、より短期間またはより長期間薬物を送達することを含む、レジメン中の他の薬物に対しても実施されてもよい。ほとんどの対象では、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量ｘ（標的濃度／現在の濃度）、に基づくことができる。対象は、濃度モニタリングを伴うさらなる投薬量調整前の少なくとも７〜１４日間、新規維持用量を継続してもよい。場合により、患者は、静脈内酵素補充療法（ＥＲＴ、例えば、ＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）［ラロニダーゼ］、ならびに任意の支持的手段（例えば、身体療法）の安定なレジメンを維持することを許可されることができる。患者は、任意の有害事象についてモニターされる。重大な有害事象は、「Ｈｙ’ｓ Ｌａｗ」事象と呼ばれる、ＡＬＴ約３×ＵＬＮおよびビリルビン約２ｘＵＬＮ（＞３５％直接）と定義される、高ビリルビン血症を伴う起こり得る薬物誘導肝障害を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫抑制療法レジメンは、以下のとおりである。
コルチコステロイド
ベクター投与の朝（１日目、投与前）、患者は、少なくとも３０分間にわたってメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇＩＶ（最大５００ｍｇ）を受ける。メチルプレドニゾロンは、ｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡの腰部穿刺および髄腔内（ＩＣ）注射の前に投与される。アセトアミノフェンおよび抗ヒスタミンを用いる前投薬は任意である。
１２週目までにプレドニゾンを中止することを目標に、２日目に、経口プレドニゾンを開始する。プレドニゾンの用量は以下の通りである。２日目〜２週目の終わりまで：０．５ｍｇ／ｋｇ／日、３週目および４週目：０．３５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜８週目：０．２ｍｇ／ｋｇ／日、９〜１２週目：０．１ｍｇ／ｋｇ。
プレドニゾンは、１２週目後に中止される。プレドニゾンの正確な用量は、次に高い臨床的に実際的な用量へ調整されることができる。
シロリムス：ベクター投与の２日前に（−２日目）：４時間毎ｘ３用量のシロリムス１ｍｇ／ｍ２の負荷用量が投与される。−１日目〜：シロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日、標的血液レベル４〜８ｎｇ／ｍｌでの１日２回投与に分割される。シロリムスは、４８週目ビジットの後に中止される。
タクロリムス：タクロリムスは、２日目（ｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ投与の後日）に１ｍｇの１日２回用量で開始され、２４週間で血液レベル４〜８ｎｇ／ｍＬに到達するように調整される。２４週目のビジットで開始。タクロリムスは、８週間にわたって徐々に減らされる。２４週目で、用量は、おおよそ５０％まで減少される。２８週目で、用量は、おおよそ５０％までさらに減少される。タクロリムスは、３２週目で中止される。
Ｃ．患者下位集団
適切な患者は、以下の年齢の男性および女性対象を含む。
●新生児、
●３〜９ヶ月齢、
●９〜３６ヶ月齢、
●３〜１２歳、
●１２歳以上、
●１８歳以上（成人）。
Ｄ．臨床目的の測定
主要な臨床的目的は、ＭＰＳＩＩ欠損に関連する神経認知低下を予防すること、および／または場合によりそれを逆転することを含む。臨床的目的は、例えば、Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＢＳＩＤ−ＩＩＩのＢａｙｌｅｙスケールにより測定されるような、神経認知を測定することにより決定されてもよい。他の適切な測定は、例えば、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケール、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＶＡＢＳ−ＩＩ）により測定されるような適応行動学的評価、および例えば、Ｉｎｆａｎｔ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（商標）（ＩＴＱＯＬ）により測定されるような生活の質の測定である。
二次エンドポイントは、バイオマーカーおよび臨床的結果の評価を含む。場合により、聴力が、二次エンドポイントとして評価されてもよい。尿は、総ＧＡＧ含有量およびヘパラン硫酸について評価される。血清は、ＩＤＳ活性、抗−ＩＤＳ抗体、ＧＡＧ、およびヘパリン共同因子ＩＩ−トロンビン複合体の濃度について評価される。ＣＳＦは、ＧＡＧ、ＩＤＳ活性、抗−ＩＤＳ抗体、およびヘパリン硫酸について評価される。抗−ＩＤＳ抗体の存在が評価され、ＣＳＦおよび血清中のＩＤＳ発現の薬物動態学も評価される。灰白質および白質およびＣＳＦ室の容量分析も、ＭＲＩにより実施される。
実施例２：ムコ多糖症ＩＩ型のマウスモデルにおける研究−ＣＳＦへのアデノ随伴ウイルスベクターの送達は、ムコ多糖症ＩＩ型マウスにおける中枢神経系疾患を減弱化する。
Ａ．脳脊髄液へのＡＡＶ９送達は、ＣＮＳ疾患を補正する。
ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）は、典型的には、小児初期に骨および関節の変形、心疾患および呼吸器系疾患、ならびに発達遅延を表す、Ｘ連鎖性リソソーム貯蔵障害である。欠損酵素、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）の全身送達は、ＭＰＳＩＩの多くの症状を改善するが、酵素は血液脳関門を通過しないので、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の進行を予防するための効果的な方法が現在は存在しない。ＭＰＳＩＩのマウスモデルを用いて、ＩＤＳ遺伝子のＡＡＶ血清型９ベクター介在送達は、ＣＮＳにおける連続的なＩＤＳ発現を達成するための一手段として評価された。ＩＤＳノックアウトマウスは、３つのベクター用量（低−３ｘ１０８、中−３ｘ１０９、高−３ｘ１０１０のゲノムコピー）のうちの１つの脳側室への単回注射を受け、ベクター体内分布およびＩＤＳ発現のアセスメント（群あたりｎ＝７〜８マウス）のためにベクター投与の３週間後に犠牲にされ、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価するために（群ｎ＝７〜８マウス）ベクター投与の３ヶ月後に犠牲にされた。ＩＤＳ活性は、脳脊髄液中で検出可能であり、低用量コホートでは野生型レベルの１５％に到達し、最高用量では通常の２６８％に到達した。脳酵素活性は、低用量コホートにおける通常の２．７％〜高用量コホートにおける３２％の範囲であった。ガングリオシドＧＭ３についての染色による脳貯蔵病変の定量化は、それぞれ、低−、中−、および高−用量コホートにおいて３５％、４６％、および８６％の減少を伴う用量依存的補正を示した。治療されたマウスはまた、新規物体認識試験において認知機能の改善を実証した。これらの知見は、髄腔内ＡＡＶ介在遺伝子移入が、ＣＮＳへの持続した酵素送達のためのプラットフォームとして役立つことを示し、ＭＰＳＩＩを有する患者のためにこの重大で満たされていない必要性に対処する。
Ｂ．ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの薬理学的および神経行動学的効果
ＭＰＳＩＩのノックアウトマウスモデル（ＩＤＳ−ノックアウト、ＩＤＳｙ／−）は、ＩＤＳ遺伝子のエクソン４および５をネオマイシン耐性遺伝子で置換することにより、作製された（Ｇａｒｃｉａら、２００７、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ、３０：９２４−３４を参照されたい）。モデルは、検出可能な酵素活性をまったく示さず、ＭＰＳＩＩ患者において見出されるものと同様の組織学的貯蔵病変を発症する。ＩＤＳ−ノックアウトマウスは、骨格異常を含むＭＰＳＩＩの臨床的特徴のうちの多くを示す。いく
つかの研究は異常さを示しているが（Ｍｕｅｎｚｅｒら、２００１、Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｓｕｐｐｌ、９１（４３９）：９９−９）、マウスの神経行動学的表現型は広範囲には評価されておらず、したがって、ＭＰＳＩＩのための治療としてのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの効果を研究するための関連モデルである。実際、これは、この集団における臨床試験を支持するＭＰＳＩＩにおける酵素補充療法の効果を評価するために使用されたのと同じノックアウトマウスモデルである。このＭＰＳＩＩマウスモデルにおいて実施された以下の研究は、治療的活性のあるＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳを確立した。
Ｃ．材料および方法
ベクター。ヒトＩＤＵＡおよびＩＤＳ ｃＤＮＡを、ニワトリベータアクチンプロモータ、ＣＭＶエンハンサー、イントロン、およびウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含有する発現構築物中にクローニングした。発現構築物は、ＡＡＶ２逆位末端配列に隣接した。ＡＡＶ９ベクターは、以前記載されたように（Ｌｏｃｋら、（２０１０）．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９−７１）、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションおよびイオジキサノール精製により、これらの構築物から産生された。
動物手順。すべての動物プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより認可された。ＩＤＳノックアウトマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号：０２４７４４）から得られ、ハウス内で繁殖された。コロニーからの野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄は、対照として役立った。２〜３ヶ月齢で、動物は、イソフルランで麻酔され、滅菌リン酸化緩衝化食塩水中に希釈された５μＬのベクターをＩＣＶ注射された。剖検時に、ＣＳＦを、ポリエチレンチューブに連結された３２ゲージのニードルを用いて後頭下穿刺により収集した。最終的な血清試料を心臓穿刺により収集した。動物は、ケタミン／キシラジン麻酔下で大量失血させることにより、安楽死させた。頚椎脱臼により、死亡が確認された。脳、心臓、肺、肝臓、および脾臓が、ドライアイス上で収集された。組織学実験のために、脳は、ＬＩＭＰ２免疫組織化学のために固定された前方半分と、ＧＭ３免疫組織化学のために固定された後方半分とに分割された。マウスの２つのコホートを、行動実験のために使用した。遺伝子欠失が学習および記憶に影響するかを決定するために、野生型およびＩＤＳ ＫＯマウスの最初のコホートを、一連の手順において試験した。低、中、または高用量のベクター用量のＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ（それぞれ、３ｘ１０８、３ｘ１０９、または３ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ））で治療されたマウスの第２のコホートを用いて、行動欠損を救助するための戦略としてのＩＴ送達の実行可能性を調査した。
行動手順：すべての行動手順は、遺伝子型および治療群に対して盲検の操作者により実施された。
オープンフィールド活動：オープンフィールドにおける自発的活動が、光ビーム活動システム（ＰＡＳ）−オープンフィールド（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定された。単一の１０分間トライアルの間、マウスは個別に、アリーナに配置された。一般的な運動および飼育活動を評価するために、平方向および垂直方向のビームブレイクが収集された。
Ｙメイズ：標準的なＹ形状メイズ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、短期記憶を評価した。アームエントリの順序および数が、８分間トライアルの間に記録された。自発的変更（ＳＡ）は、以前に入れたアームを即時に引き戻すことなく、メイズのすべての３本のアームへの連続的エントリとして、定義された。アームエントリの総数（ＡＥ）は、運動活動の尺度として収集された。自発的変更パーセントは、％ＳＡ＝（ＳＡ／（ＡＥ−２）＊１００）として算出された。
コンテキスト恐怖条件付け：条件付け実験を、Ａｂｅｌら、Ｃｅｌｌ．１９９７ Ｍａｒ ７；８８（５）：６１５−２６により記載されているように実施した。訓練日に、マウスに、独自の条件付けチャンバー（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を３００秒間探索させた。シグナルなしの１．５ｍＡの連続的なフットショックが、２４８〜２５０秒間、加えられる。チャンバーにおいてさらなる３０秒後、マウスは、各自のホームケージへ戻された。２４時間後、訓練が行われるのと同じチャンバー内で、連続５分間、空間的コンテキストの回想が評価された。フリーズ行動をスコア付けするために使用されるソフトウェアを用いて、記憶が評価された（Ｆｒｅｅｚｅｓｃａｎ、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓｔｅｍｓ）。訓練セッションの２．５分間の刺激前時期におけるフリーズパーセントが、チャンバーに再度曝露された際のフリーズパーセントと比較される。フリーズにおける増大は、学習が存在したことを示す。
新規物体認識：実験機器は、白色の床上にある灰色の長方形アリーナ（６０ｃｍｘ５０ｃｍｘ２６ｃｍ）および２つの独特な物体：３．８ｘ３．８ｘ１５ｃｍの金属バーおよび直径３．２ｃｍｘ１５ｃｍのＰＶＣパイプから構成された。機器に曝露される前に、マウスは、５日間、１〜２分間／日、ハンドリングされた。５日間の慣らし期間の間、マウスは、５分間／日、何もないアリーナを探索することを許可された。訓練期間の間、マウスは、１５分間、２つの同じ物体を探索して、親しみを構築させた。２４時間後の回想期間では、マウスは、この時点では馴染みのある１つの物体と１つの新規物体とを有するアリーナに戻された。マウスは、優先的に新規物体を探索するだろう。新規物に対する優先度の低下は、馴染みのある物体の回想の失敗を示唆し、故に、学習欠損を示唆する。すべてのセッションが記録され、物体を探索するのに過ごした時間が、オープンソースイメージ分析プログラム（Ｐａｔｅｌら、Ｆｒｏｎｔ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４
Ｏｃｔ ８；８：３４９）を用いてスコア付けされた。
酵素およびＧＡＧアッセイ。ＧＡＧ、Ｈｅｘ、およびＩＤＵＡアッセイを、以前に記載されているように実施した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒら（２０１５）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：１２９８−３０７）。ＩＤＳ活性は、１０μＬ試料を、０．１Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０１Ｍの酢酸鉛、ｐＨ５．０中に溶解した２０μＬの１．２５ｍＭの４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イドピラノシドウロン酸２−サルフェート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートすることにより、測定された。３７℃で２時間インキュベートした後、４５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（０．４Ｍのリン酸ナトリウム、０．２Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）および５μＬの組換えヒトイズロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、０．５８ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）を反応混合液へ加え、一晩３７℃でインキュベートした。混合液をグリシン緩衝液、ｐＨ１０．９で希釈し、放出された４−ＭＵを蛍光（励起３６５ｎｍ、発光４５０ｎｍ）により定量化し、遊離４−ＭＵの標準希釈液と比較した。
組織学。脳は、ＬＩＭＰ２免疫組織化学のために固定された前方半分と、ＧＭ３免疫組織化学のために固定された後方半分とに分割された。ＬＩＭＰ２およびＧＭ３免疫組織化学を、以前に記載されているように実施した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒら（２０１５）．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ ２３：１２９８−３０７）。ＬＩＭＰ２およびＧＭ３についての細胞染色陽性の数が、盲検レビュアにより各動物からの４つの脳セクションにおいて定量化された。
ベクター体内分布。ベクター体内分布分析のための組織を素早く解剖し、ドライアイス上で凍結した。分析時まで、試料を−８０℃で貯蔵した。記載されているように、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキットを使用して、ＤＮＡを組織から単離し、ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより定量した（Ｗａｎｇら、（２０１１）．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１３８９−１４０１）。
抗−ｈＩＤＳ抗体についてのＥＬＩＳＡ。ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートは、ｐＨ５．８に滴定されたＰＢＳ中の組換えヒトＩＤＳ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５μｇ／ｍＬを用いて一晩コーティングされた。プレートは洗浄され、中性ＰＢＳ中の２％のウシ血清アルブミン中で１時間ブロッキングされた。次いで、プレートは、ＰＢＳ中の１：１０００に希釈された血清試料とともにインキュベートされた。結合された抗体は、２％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中の１：１０，０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗−マウス抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて検出された。アッセイは、テトラメチルベンジジン基質を用いて発展され、４５０ｎｍでの吸光度を測定する前に、２Ｎの硫酸を用いて停止された。力価は、恣意的に１：１０，０００の力価を割り当てた、陽性血清試料の連続希釈により作成された標準曲線から決定された。
統計。治療されたマウスおよび未治療マウスにおける組織ＧＡＧ含有量、Ｈｅｘ活性、および脳貯蔵病変は、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて比較された。オープンフィールドおよびＹメイズデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて分析された。二元ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの事後（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）分析を、恐怖条件付けデータに適用して、トライアルおよび遺伝子型効果を評価した。新規物体認識試験のために、各群についてｔ−検定を用いて、次いで、多重比較のためにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて、馴染みのある物体を探索する時間に対する新規物体を探索する時間を比較した。
雄ＩＤＳ−ノックアウトマウスの年齢を適合させた４つの群と、野生型同腹仔の１つの群（群あたり８匹のマウス（ｎ＝８））とは、２〜３ヶ月齢で以下の治療を受けた。
●群１：未治療
●群２：脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ低用量３ｘ１０８ＧＣ（１．８７５ｘ１０９ＧＣ／ｇ脳質量）
●群３：脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ中用量３ｘ１０９ＧＣ（１．８７５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）
●群４：脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ高用量３ｘ１０１０ＧＣ（１．８７５ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量）
●群５：未治療の野生型同腹仔
Ｄ．結果：
２〜３ヶ月齢の雄ＩＤＳｙ／−マウスは、ニワトリベータアクチンプロモータおよびサイトメガロウイルスエンハンサー（ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ）からのヒトＩＤＳを発現するＡＡＶ９ベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射を用いて治療された。最初のコホートでは、マウスは、３つのベクター用量［３ｘ１０８、３ｘ１０９、または３ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）］のうちの１つを用いて治療され、ベクター体内分布およびＩＤＳ発現のアセスメントのために、ベクター投与の３週間後に犠牲にされた。未治療ＩＤＳｙ／−マウスおよび野生型雄同腹仔は、対照として役立った。体内分布分析のために、組織を回収した。高用量群におけるベクター体内分布の分析は、宿主二倍体ゲノムあたり平均１つのベクターゲノムを伴う、効率的な脳標的化を実証した（図３）。ＣＳＦへのＡＡＶ送達の以前の研究と一致して、宿主二倍体ゲノムあたり１つ以上のベクターゲノムを伴う、末梢部へのベクター漏出および効率的な肝臓標的化も存在する（図３）。脳組織、ＣＳＦ、および血清はすべて、ＩＤＳ活性における用量−依存性増大を示し、高用量群では野生型レベルに到達したか、またはそれを超えた（図２Ａ〜２Ｃ）。ヒトＩＤＳに対する抗体は、中−および高−用量コホートにおける何匹かの動物の血清中で検出されたが、これは、循環酵素活性に有意に影響を与えたようには見えなかった（図８）。
ＩＤＳ遺伝子のＩＴ ＡＡＶ９介在送達の治療的潜在性を評価するために、ＩＤＳｙ／
−マウスのさらなるコホートを、等価ベクター用量を用いて治療し、次いで、その後の時点で、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価した。ベクター投与の２ヶ月後に、マウスを行動学的および神経認知試験に供した。治療の３か月後に、動物を犠牲にし、疾患活性の組織学的および生化学的アセスメントのために組織を回収した。
高レベルの血清酵素活性と一致して、ＧＡＧ貯蔵は、肝臓において減少し、心臓においてＧＡＧ貯蔵の正常化に向かう有意でない傾向が存在した（図４Ａ〜４Ｂ）。加えて、ＧＡＧ貯蔵の設定において上方制御される、リソソーム酵素ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）の活性は、両組織において正常化された（図４Ｃ〜４Ｄ）。これらのデータは、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの髄腔内投与後の潜在的な全身治療的活性を示す。
未治療ＭＰＳＩＩマウスの脳は、リソソームメンブレンタンパク質ＬＩＭＰ２の蓄積、およびＧＭ３を含むガングリオシドの二次貯蔵を含む、ニューロンにおけるリソソーム貯蔵の明確な組織学的証拠を示す（図５Ｌ）。治療されたマウスは、ＬＩＭＰ２およびＧＭ３染色の両方により、ニューロンの貯蔵病変事象における用量依存的減少を実証した（図５Ａ〜５Ｌ）。このデータに基づいて、１．８７５ｘ１０９ＧＣ／ｇの低用量は、これが、ＧＭ３およびＬＩＭＰ２貯蔵病変の両方でマウスが有意な（おおよそ５０％）減少を示した最低用量であったので、マウスにおける最小の効果的用量（ＭＥＤ）であると推定される。ＭＰＳＩＩマウスにおける他の研究は、幅広い投薬量の臨床的候補を評価し、１．３ｘ１０９ＧＣ／ｇ脳質量の最小の効果的用量（ＭＥＤ）を同定した。評価された最低用量を表すＭＥＤの選択は、Ｉ２Ｓ活性レベルにおける用量依存的変化ならびにバイオマーカー、組織病理学、および神経行動学的機能を含むＭＰＳＩＩのＣＮＳおよび末梢特徴に基づいた。
行動学的試験は、ベクター投与の２ヶ月後、マウスが４〜５ヶ月齢に到達したときに、実施された。包括的な一連の試験を実施して、全般的な行動ならびに短期および長期記憶を評価した。ＩＤＳｙ／−マウスは、オープンフィールドアリーナにおいて正常な探索活動を示した（図９Ａ〜９Ｃ）。Ｙメイズにおける自発的変更（図９Ｄ）は、短期作用記憶を評価するために使用された。ＩＤＳｙ／−マウスは、野生型同腹仔と同様のアームエントリの数、および等価な自発的変更を有し、インタクトな短期記憶を実証した。長期記憶は、古典的なコンテキスト恐怖条件付け（ＦＣ）および新規物体認識（ＮＯＲ）を用いて、評価された。ＦＣでは、特異的コンテキストを伴う嫌忌的刺激の共同により、コンテキストに再度曝露させた場合のフリーズ行動を引き起こす。すべてのマウスは、学習が生じたことを実証する、試験の回想期の間のフリーズ時間パーセントにおいて増大を示したが、ＩＤＳｙ／−マウスは、野生型同腹仔に対して減少したフリージングを示した（図６Ａ）。治療効果は、正常および未治療ＩＤＳｙ／−マウスの間の小さな差異に起因して評価することが困難だったが、治療された動物では、コンテキスト恐怖条件付けにおける明確な改善は存在しなかった（図６Ｂ）。ＮＯＲでは、マウスは、一対の同様の物体を探索することを許可される。訓練の２４時間後、今では馴染みのある１つの物体が、１つの新規物体と交換される。マウスは、新規物体を探索するという生来の傾向を有し、新規物体を探索しないということは、馴染みのある物体の認識の欠如を実証し、記憶欠損であることを示す。野生型マウスは、新規物体についての優先度を実証したが、ＩＤＳｙ／−マウスは、優先度を示さなかった。注目すべきことには、髄腔内ＡＡＶ９遺伝子療法は、ＩＤＳｙ／−マウスにおいて観察された長期間のＮＯＲ欠損を救済した（図６Ｃ）。物体識別は、すべての治療されたＩＤＳｙ／−マウスにおいて改善されたようにみえ、すべての群は、馴染みのある物体と比較して新規物体を探索する時間のパーセンテージがより大きい傾向を示した。研究は、投与群の間の行動学的欠損の救済の相対的程度を比較するためには十分強力なものではなかったが、新規物体についての優先度は、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった（図６Ａ〜６Ｃ）。
マウス疾患モデルにおけるＩＴ ＡＡＶ送達の評価の１つの欠点は、わずか０．４ｇの脳質量および４０μＬのＣＳＦ容量を有する非常に小さいマウスＣＮＳは、３，５００倍大きなヒト脳におけるベクター拡散および分泌された酵素の正確なモデルにはなることができないことである。関連するリソソーム貯蔵疾患ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）の以前の研究では、本発明者らは、この問題に対処するために天然に存在する大型疾患モデルを利用した。［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４：２２：２０１８−２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５：２３：１２９８−１３０７］。それぞれ、３０ｇおよび７２ｇの平均脳質量を有する、ＭＰＳＩネコおよびイヌは、ヒト脳における広範囲のベクターおよび酵素送達を成し遂げるための難解な問題に対処するための、はるかにより現実的なモデルとなった。これらのモデルにおいて実施された研究は、ＭＰＳＩのための ＩＴ ＡＡＶ９送達の有効性の重大な証拠を提供した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ療法：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４：２２：２０１８−２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ
Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５：２３：１２９８−１３０７］。この同じアプローチをＭＰＳＩＩで用いて同様の有効性が可能であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＭＰＳＩＩにおける酵素発現の効率および交差補正を調べるために、ＭＰＳＩマウスにおける並行用量範囲の研究を実施した。ＭＰＳＩマウスは、ＩＤＳの代わりにα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）トランスジーンを用いることを除き、ＩＤＳｙ／−マウスのために用いられたものと同一のベクターで治療された。ＭＰＳＩＩ研究と同様に、ＭＰＳＩマウスは、２〜３ヶ月齢で、３ｘ１０８、３ｘ１０９、または３ｘ１０１０ＧＣ（群あたりｎ＝８）の用量を用いて治療され、脳酵素活性の測定のために治療の２１日後に犠牲にされ、組織学的分析のために治療の３ヶ月後に犠牲にされた。ＩＤＵＡの発現が、絶対的な酵素活性および野生型発現レベルに対する酵素活性の両方において、ＩＤＳと比較して幾分より効率的であるようにみえたが、ＩＤＳｙ／−マウスにおいて観察されたものと同様の用量応答が脳酵素発現において存在した（図７Ａ）。治療は、最低のベクター用量においてＭＰＳＩマウスにおいて控えめにより効率的であるようにみえたが、脳貯蔵病変の補正は、２つの疾患モデル間で同様であった（図７Ａ〜７Ｂ）。併せて、これらの結果は、ＭＰＳＩＩのためのＩＴ ＡＡＶ９介在遺伝子移入が、ＭＰＳＩにおいて観察されたものとほとんど同様の効率で脳貯蔵病変の補正を生じることを示唆し、またこのアプローチはマウスからスケールアップされた場合になお効果的であることを示唆している。しかし、ＭＰＳＩと比較して若干より高いベクター用量は、脳におけるより効率的でない酵素発現に打ち勝つためには、ＭＰＳＩＩにおいて必須であるかもしれない。
本研究では、ＭＰＳＩＩマウスにおけるヒトＩＤＳ遺伝子を有するＡＡＶ９ベクターのＩＴ送達は、ＣＮＳにおける治療的レベルの発現および脳貯蔵病変の分解をもたらした。機能的改善は、未治療対照と比較して治療されたマウスにおけるより大きな新規物体識別により、示された。神経認知欠損は、これまでＩＤＳｙ／−マウスにおいて十分に特徴付けられていない。これらの知見は、ＩＤＳｙ／−マウスが、オープンフィールドにおいて正常な探索活動を有し、ならびに野生型同腹仔と同様のＹメイズにおけるアームエントリを有することを実証している。これらの移動運動評価は、正常な探索を必要とする他の類の行動を考察する際に重要である。ＩＤＳｙ／−マウスは、対照と比較してＹメイズにおける同様の自発的変更により実証される、インタクトな短期作用記憶を有することが見出された。対照的に、Ｈｉｇｕｃｈｉら、［Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１２：１０７：１２２−１２８］は、３２週齢のＩＤＳｙ／−マウスにおける自発的変更の減少およびアームエントリの増大を報告した。異なるＹメイズ結果は、試験時の異なる年齢に起因し、ＭＰＳＩＩの進行性性質を強調し得る。本発明者らは、長期記憶の２つの形態に対するＩＤＳ欠損の影響を評価した。軽度の欠損は、ＩＤＳｙ／−マ
ウスにおけるコンテキスト恐怖条件付けにおいて同定された。ＩＤＳｙ／−マウスは、それらが嫌忌的刺激を受けたコンテキストを回想することができたが、それらは、野生型同腹仔と比較して有意に減少したフリーズ応答を示した。ＡＡＶ９のＩＴ送達を受けたＩＤＳｙ／−マウスは、注射されていないマウスと同様のフリーズ応答を示した。したがって、回復は検出されなかった。長期記憶欠損もまた、新規物体認識において見出された。ＮＯＲでは、ＩＤＳｙ／−マウスは、馴染みのある物体に対して新規物体への優先度を示さなかった。ベクター治療されたマウスは、未治療ＩＤＳｙ／−マウスにおいてみられたＮＯＲ欠損の回復を実証した。群あたり８匹の動物を伴って、研究は、行動学的エンドポイントの用量応答を評価するために十分には強力でなかったが、物体識別は、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった。２つの種類の長期記憶の回復に異なる影響を与えるＡＡＶ９のＩＴ送達の能力は、各タスクのために必要とされる異なるニューロン基質に起因し得る。コンテキスト恐怖条件付けは、嗅周野嗅内野（ｐｅｒｉｅｎｔｅｏｒｈｉｎａｌ）皮質を必要とするＮＯＲと逆で、海馬依存的タスクである［Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｐｏｓｔ−ｔｒａｉｎｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｍｏｒｙ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ＆ｍｅｍｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）２０１０；１７：１５５−１６０；Ａｂｅｌら、Ｃｅｌｌ １９９７；８８：６１５−６２６］。
ＭＰＳＩの大型動物モデルにおいて以前示されているように［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ
Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４：２２：２０１８−２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５：２３：１２９８−１３０７］、ＭＰＳＩＩおよびＭＰＳＩのマウスモデルにおけるＡＡＶ９送達の効率の比較は、酵素発現および組織補正が２つの疾患の間で同様であったことを示し、これは、ＭＰＳＩＩのためのＩＴ ＡＡＶ送達が、はるかに大きな脳サイズおよびＣＳＦ容量の文脈において広範な疾患補正をもたらすのに十分に効率的であるという証拠を提供した。興味深いことに、欠損酵素の発現は、ＭＰＳＩと比較してＭＰＳＩＩにおいて幾分より低い効率性であった。これは、発現構築物における制御要素は同一であるが、これらの特定のベクターの発現効率の単なる産物であった可能性があった。幾つかの研究は、ＩＤＳなどのスルファターゼの発現は、ＩＤＳの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ修飾因子、ＳＵＭＦ１の利用可能性により制限され得ることを示唆している［Ｆｒａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ、２００７：４０３：３０５−３１２を参照されたい。しかし、ＩＤＳおよびＳＵＭＦ１の同時発現を評価するパイロット実験は、より活性のあるＩＤＳ発現を実証しなかった（データは示されていない）。それにも関わらず、貯蔵病変の補正は、ＭＰＳＩマウスとほぼ同じくらいＭＰＳＩＩマウスにおいて効率的であり、これは、遺伝子移入が、ＭＰＳＩおよびＭＰＳＩＩ患者の両方について同様に効果的であるはずであることを示したが、後者の場合、控えめにより高いベクター用量が、最適な結果のために必須であり得る。
ＣＮＳ遺伝子移入に加えて、治療されたＭＰＳＩＩマウスでは有意な肝臓形質導入および末梢酵素発現が存在し、これは、ＭＰＳＩＩにおけるＩＴ ＡＡＶ９送達の起こり得る全身利点を示す。これは、様々な他の種におけるＡＡＶ送達の研究と一致する［Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４；２５：６１９−６３０；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ− Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１４；１；；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４；２２：２０１８−２０２７；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ２０１５；２３：１２９８−１３０７；Ｇｕｒｄａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１５；Ｈｉｇｕｃｈｉら、ｃｉｔｅｄ ａｂｏｖｅ；Ｈａｕｒｉｇｏｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２０１３：１２３：３２５４−３２７１；Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３：２０：４５０−４５９］。顕著にＩＴ ＡＡＶベクター送達後の肝臓形質導入は、種間で実質的に変動するので、ヒトが有意な末梢発現を示すかどうかはまだ明確ではない。
この研究は、ＩＴ ＡＡＶ９送達が脳への効果的なＩＤＳ遺伝子移入を到達し、ＭＰＳＩＩのＣＮＳ兆候を解決することを実証し、このアプローチを臨床へと進めることを支持する。
これらのデータは、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳがＭＰＳＩＩマウスにおける神経認知欠損を改善することができるという予備的な証拠を提供する。
実施例３：非ヒト霊長類研究
成体雄アカゲザルにおけるＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの安全性および効果を評価するために、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究を実施する。研究の目的は、髄腔内（ＩＴ）ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの局所的、急性、および慢性毒性を評価すること、およびベクターの体内分布を画定することである。総数２１匹の雄サルが、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ（５．６ｘ１０１１または１．８７５ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量）の２用量のうちの１つのＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳのＩＴ注射を用いて、またはビヒクル対照希釈剤を用いて、治療される。低用量は、ＭＰＳＩＩマウスにおけるＭＥＤよりもおおよそ１００倍多く（１．８７５ｘ１０９ＧＣ／ｇのＭＥＤ）、ＭＰＳＩＩマウスにおいて統計的に有意な組織学的改善および認知機能を反映すると考えられる神経行動学的変化をもたらす最低用量に対応する。より高い用量（おおよそ３００ＸＭＥＤ）は、ベクターが製剤化され得る最大濃度であり、ＣＳＦに安全に投与可能である注射容量（＜１０％ＣＳＦ容量）を維持するための要件により制限される。注射手順の間、動物は、全身麻酔下で維持される。脊椎ニードルは、後頭下空間内へ配置され、配置は、蛍光透視法により確認され、用量は、全容量１ｍＬで投与される。血清およびＣＳＦは、注射後の０日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、および３０日目、およびその後毎月、臨床的病理学評価について収集される。注射後の１４日目、９０日目、および１８０日目に、各用量群からの３匹の雄サル（１時点あたり総６匹）が、病理学および体内分布のために犠牲にされる。ビヒクル治療された動物は、対照として役立つ。すべての動物からの組織について、十分な組織病理学が実施され、ベクター体内分布の分析は、高用量コホートについて実施される。ＤＮＡ抽出および定量的ＰＣＲによるベクターゲノムの検出は、以前記載されたように実施される（Ｃｈｅｎら、２０１３、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ、２４（４）：１５４−１６０を参照されたい）。このアッセイは、ＤＮＡ１μｇあたり２０ベクターゲノムコピーより多い感受性を有し、スパイク対照は、個々の試料における反応効率を確認するために含まれる。体内分布、生化学、および免疫原性データは、１４日目、３ヶ月、および６ヶ月で収集される。
免疫抑制（ＭＭＦおよびシロリムス／ラパマイシン）と組み合わせた１．８ｘ１０１１または５．５ｘ１０１１ｒＡＡＶ９．ＣＢ８．ｈＩＤＳベクターを投与されたアカゲザルの研究では、以下が観察された。投与手順に関連したＡＥは存在せず、臨床的一般的観察、体重変化、器官重量、ＣＢＣ、血清化学、または凝固パラメータに対するベクターに関連する異常さも存在しなかった。ＩＳ手順は、幾つかの炎症パラメータの増大に伴う腸の徴候、およびベクター投与に関連しない貧血を引き起こした。ｈＩＤＳに対する液性免疫応答は、ＩＳにより予防され、他の動物における最小限の（バックグラウンドに近い）応答に対して、存在しないか、または軽減された。ＩＳ動物においてｈＩＤＳに対するＴ細
胞応答は存在せず、ＬＤ群のみにおいてＡＡＶ９に対して最小限〜中程度の応答であった。６０日目のＭＭＦの引き抜き後に、免疫応答のリバウンドは見られなかった。高用量および低用量群の両方は、最小限〜軽度の脊髄白質後索および坐骨神経の軸索障害を有した。白質後索および三叉神経節に突出する後根神経節における、単核性細胞湿潤を用いた最小限〜軽度のニューロン細胞体の変性。高いベクターコピー数の存在に関わらず、脳または脊髄内に炎症は見られなかった。高レベルのＡＡＶベクターゲノムは、脳、脊髄、および後根神経節にわたって検出された。有意なベクター体内分布は、末梢、特に、肝臓においても見出された。
実施例４：ｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳベクターの製造
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳは、（ｉ）ｈＩＤＳベクターゲノムプラスミドと、（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ２およびｃａｐ９野生型遺伝子を含有する、ｐＡＡＶ２９と称されるＡＡＶヘルパープラスミドと、（ｉｉｉ）ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）と称されるヘルパーアデノウイルスプラスミドとを用いて、ヒトＨＥＫ２９３ ＭＣＢ細胞のトリプルプラスミドトランスフェクションにより産生される。
プラスミドｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＧＢのクローニングは、上記の実施例１に記載されているとおりである。このプラスミドに由来するベクターゲノムは、ＡＡＶ２由来ＩＴＲに隣接するｈＩＤＳ発現カセットを伴う一本鎖ＤＮＡゲノムである。トランスジーンカセットからの発現はまた、ＣＢ７プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー（Ｃ４）およびニワトリベータアクチンプロモータの間のハイブリッドにより駆動され、一方で、このプロモータからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在により高められる。発現カセットのためのポリＡシグナルは、ウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。プラスミドは、コドン最適化およびｈＩＤＳ配列［配列番号８のｎｔ１１７７〜ｎｔ２８２９、および配列番号１１のｎｔ１９３７〜ｎｔ３５８９］の合成により構築され、得られた構築物は、次いで、プラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧ（ｐ１０４４）、ＣＢ７、ＣＩ、およびＲＢＧ発現要素を含有するＡＡＶ２ ＩＴＲ隣接の発現カセットをクローニングされて、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧを得た。
シスプラスミドｐＡＡＶ．ＣＢ７ＣＩｈＩＤＳ．ＲＧＢ．ＫａｎＲのクローニング：ベクターゲノムは、ＰａｃＩ制限酵素を用いてこのプラスミドから切り出され、カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＫＳＳに基づくプラスミド骨格（ｐ２０１７）にクローニングされた。最終的なベクターゲノムプラスミドは、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲである。
ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２：ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２は、４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、およびＡＡＶ９に由来する３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードする。キメラパッケージング構築物を作製するために、初めに、野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドｐ５Ｅ１８からのＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子が取り出され、肝臓ＤＮＡから増幅されたＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子のＰＣＲ断片と置換された。得られたプラスミドには、識別子ｐＡＡＶ２−９（ｐ０００８）が与えられた。発現を正常に駆動するＡＡＶ ｐ５プロモータは、ｒｅｐの５’末端およびｃａｐの３’末端からこの構築物中に移動される。この配置は、プロモータとｒｅｐ遺伝子との間の空間（すなわち、プラスミド骨格）をもたらし、ｒｅｐ発現を下方制御し、ベクター産生を支持する能力を増大するように役立つ。ｐ５Ｅ１８のプラスミド骨格は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ由来である。ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２は、４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ９に由来する３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質、およびカナマイシン耐性をコードする。
ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミドは、１５，７７０ｂｐの大きさである。プラスミドは、ＡＡＶ複製のために重要であるアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ（アデノウイルスＥ１機能は、２９３細胞により提供される）を含有するが、他のアデノウイルス複製または構造的遺伝子は含有しない。プラスミドは、アデノウイルス逆位末端配列などの複製のために重大なシス要素を含有しておらず、したがって、感染性のアデノウイルスが産生することは予想されない。それは、Ａｄ５（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド）のＥ１、Ｅ３欠失分子クローンに由来した。必須でないアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、３２Ｋｂ〜１２ｋｂのアデノウイルスＤＮＡの量を軽減するために、欠失は、Ａｄ５ ＤＮＡ中に導入された。最終的に、アンピシリン耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子により置換されて、ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）を得た。ＡＡＶベクター産生に必須であるＥ２、Ｅ４、およびＶＡＩアデノウイルス遺伝子の機能的要素は、このプラスミド中に依然としてある。アデノウイルスＥ１の必須遺伝子機能は、ＨＥＫ２９３細胞により供給される。ＤＮＡプラスミド配列決定は、Ｑｉａｇｅｎゲノムサービスにより実施され、参照配列ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）ｐ１７０７ＦＨ−Ｑの以下の重要な機能的要素と１００％の相同性を明らかにした。Ｅ４ ＯＲＦ６ ３６９２〜２８０８ｂｐ、Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質１１７８４〜１０１９４ｂｐ、ＶＡ ＲＮＡ領域１２４２６〜１３３７８ｂｐ。
製造プロセスを要約するフローダイアグラムは、図１０Ａ〜１０Ｂに提供される。
細胞播種：適任のヒト胚腎臓２９３細胞株を産生プロセスのために用いる。細胞は、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔ−フラスコおよびＣＳ−１０を用いて５ｘ１０９〜５ｘ１０１０細胞まで増殖され、これによりＢＤＳロットあたりのベクター産生のために最高５０個のＨＳ−３６を播種するために十分な細胞量が産生される。細胞は、１０％のガンマ照射したＵＳ−起源のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中で培養される。細胞は、足場依存的であり、細胞の解離は、ＴｒｙｐＬＥセレクト、動物製品不含の細胞解離用試薬を用いて成し遂げられる。細胞播種は、滅菌、単回使用の使い捨てバイオプロセス用バックおよびチューブセットを用いて成し遂げられる。細胞は、５％（±０．５％）のＣＯ２大気中、３７℃（±２℃）で維持される。細胞培養培地は、新鮮な血清不含ＤＭＥＭ培地と交換され、最適化されたＰＥＩに基づくトランスフェクションを用いて３つの産生用プラスミドでトランスフェクトされる。産生プロセスで使用されるすべてのプラスミドは、ｃＧＭＰ製造のうちの最も顕著な特徴、トレーサビリティ、文書管理、および材料分離を利用して、ＣＭＯ品質システムおよびインフラストラクチャーのコンテキストにおいて産生される。
十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション複合体は、最高５０個のＨＳ−３６（ＢＤＳバッチあたり）をトランスフェクトするためにＢＳＣ中で調製される。初めに、７．５ｍｇのｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムプラスミド、１５０ｍｇのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）、７５ｍｇのｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２ ＡＡＶヘルパープラスミド、およびＧＭＰグレードＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓトランスフェクションＳＡ）を含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物が、調製される。このプラスミド比は、小規模最適化研究においてＡＡＶ産生のために最適となるように決定された。よく混合した後、溶液を室温で２５分間、静置させておき、次いで、血清不含培地を加えて、反応をクエンチし、次いで、ＨＳ−３６に加える。トランスフェクション混合物は、ＨＳ−３６の３６層の間で一様にされ、細胞は、５％（±０．５％）ＣＯ２の大気中、３７℃（±２℃）で５日間インキュベートされる。
細胞培地回収：トランスフェクトされた細胞および培地は、ユニットからの培地を無菌
的に排出することにより、使い捨てバイオプロセスバッグを用いて各ＨＳ−３６から回収される。培地の回収後、約８０リットルの容量にＭｇＣｌ２を補足して、最終濃度２ｍＭ（ベンゾナーゼのための共同因子）とし、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｃａｔ＃：１．０１６７９７．０００１、Ｍｅｒｃｋ Ｇｒｏｕｐ）を加えて、最終濃度２５ユニット／ｍｌとした。産物（使い捨てバイオプロセスバッグ中）をインキュベータで３７℃で２時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果としての回収物中に存在する残留細胞およびプラスミドＤＮＡの酵素消化のために十分な時間を与える。この工程は、最終的なベクター中の残留ＤＮＡの量を最小限にするために、実施される。インキュベーション期間の後、ＮａＣｌを加えて、最終濃度５００ｍＭとし、濾過およびダウンストリームタンジェンシャルフロー濾過の間の産物の回収を補助する。
分類：蠕動ポンプにより駆動される滅菌、閉鎖チューブおよびバッグセットとして連続的に連結されたデプスフィルタカプセル（１．２μｍ／０．２２ｕｍ）を用いて、細胞および細胞破片を産物から取り除く。分類は、ダウンストリームフィルタおよびクロマトグラフィーカラムが汚損から保護されることを保証するものであり、生物汚染度減少濾過は、一連のフィルタの最後に、アップストリーム産生プロセスの間に潜在的に導入された任意の生物汚染が、ダウンストリーム精製の前に除去されることを確実にするものである。回収材料は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳカプセルフィルタ（１．２／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を通過する。
大規模タンジェンシャルフロー濾過：浄化された産物の容量減少（１０倍）は、カスタム製の滅菌、閉鎖バイオプロセシングチューブ、バッグおよびメンブレンセットを用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により成し遂げられる。ＴＦＦの原理は、圧力下で、溶液を適切な多孔性のメンブレン（１００ｋＤａ）に対して平行に流すことである。圧力差異は、メンブレン孔よりも大きな分子は保持しながら、より小さな分子をメンブレンに通し、かつ廃水流れへと効果的に駆り立てる。溶液を再循環させることにより、平行方向の流れは、メンブレン表面を洗い流し、メンブレン孔の汚損を防止する。適切なメンブレン孔サイズおよび表面領域を選択することにより、所望の分子を保持および濃縮しながら、液体試料の容量を急速に減少することができる。ＴＦＦ適用におけるダイアフィルトレーションは、液体がメンブレンを通って廃水流へと通過するのと同じ速度で、新鮮な緩衝液を再循環用試料に加えることを含む。ダイアフィルトレーションの容量増大に伴って、小分子の増大された量が、再循環試料から除去される。これは、清浄化された産物の控えめな精製をもたらすだけでなく、続くアフィニティカラムクロマトグラフィー工程と適合する緩衝液の交換を成し遂げる。したがって、本発明者らは、次いで、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、および４００ｍＭのＮａＣｌからなる４容量の緩衝液を用いてダイアフィルトレーションされる濃縮のために、１００ｋＤａのＰＥＳメンブレンを利用する。ダイアフィルトレーションされた産物は、一晩４℃で貯蔵され、次いで、任意の沈殿した材料を除去するために、さらに１．２μｍ／０．２２ｕｍのデプスフィルタカプセルを用いて清浄化される。
アフィニティクロマトグラフィー：ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用する。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕らえられる。適用後、カラムを洗浄して、さらなるフィード不純物を除去し、その後、低いｐＨ溶出工程（４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５）が続き、これは、１／１０の容量の中和緩衝液（ビストリスプロパン、２００ｍＭ、ｐＨ１０．２）中へ収集することにより即時に中和される。
アニオン交換クロマトグラフィー：エンプティＡＡＶ粒子を含むプロセス内不純物のさらなる減少を成し遂げるために、Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ２／９溶出プールは、５０倍に希釈され（２０ｍＭのビストリス−プロパン、０．００１％のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８、ｐＨ １０．２）、ＣＩＭｕｌｔｕｓ Ｑ ｍｏｎｏｌｉｔｈマトリックスへ結合可能なように、イオン強度を弱める（ＢＩＡ分離）。低塩ウォッシュ後、ベクター産物は、６０ＣＶのＮａＣｌ直線塩勾配（１０〜１８０ｍＭのＮａＣｌ）を用いて溶出される。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを伴わないカプシド粒子（エンプティ粒子）をベクターゲノムを含有する粒子（フル粒子）から効果的に分離し、フルカプシドに富む調製物をもたらす。フラクションは、１／１００容量の０．１％のプルロニックＦ６８および１／２７容量のビストリス、ｐＨ６．３を含有するチューブに収集されて、それぞれチューブへの非特異的結合と、高いＰｈへの曝露時間を最小限にする。適切なピークフラクションを収集し、ピーク面積を評価し、おおよそのベクター収率の決定についての以前のデータと比較する。
ＢＤＳを産生するための最終的な製剤化および滅菌濾過：１００ｋＤａのメンブレンを用いるプールされたＡＥＸフラクションに対してＴＦＦが使用され、最終的な製剤を得る。これは、４容量の製剤緩衝液（Ｅｌｌｉｏｔｓ Ｂ溶液、０．００１％のプルロニックＦ６８）を用いるダイアフィルトレーションにより成し遂げられ、濃縮されて、ＢＤＳを得、それにより、アニオン交換クロマトグラフィーからのピーク面積は、≧５ｘ１０１３ＧＣ／ｍｌの力価を達成するための濃度因子を推定するために以前のデータと比較される。試料は、ＢＤＳ試験（下記のセクションに記載される）のために除かれる。濾過された精製されたバルクは、滅菌ポリプロピレンチューブ中で貯蔵され、最終充填物を放出するまで隔離された場所で≦−６０℃で凍結される。予備的な安定性研究は、我々の提案した製剤緩衝液の凍結および解凍後にＤＰは活性を失っていないことを示す。−８０℃での長期貯蔵後の安定性を評価するために、さらなる研究を行う。
最終充填物：凍結されたＢＤＳは、解凍され、プールされ、最終的な製剤緩衝液を用いて標的力価まで希釈され、０．２２ｕｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して最終的に濾過され、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌの「使用準備済みの（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ）」（予め滅菌された）２ｍＬのガラスバイアルおよび１３ｍｍのストッパーへ充填され、バイアルあたり≧０．６ｍｌ〜≦２．０ｍＬの充填容量で密封された。個別にラベルされたバイアルは、以下の仕様に従ってラベルされる。ラベルされたバイアルは、≦−６０℃で貯蔵される。
ベクター（薬物製品）は、単回固定濃度でバイアルに入れられ、唯一の変数は、バイアルあたりの容量である。より低い用量濃度を成し遂げるために、薬物製品は、Ｅｌｌｉｏｔｓ Ｂ溶液、０．００１％のプルロニックＦ６８で希釈される。高用量ベクターは、希釈することなく直接用いられるが、低用量ベクターは、製剤緩衝液中で１：５希釈される必要があり、これは、投与時に薬剤師により実施される。
実施例５：ベクターの試験
血清型アイデンティティ、エンプティ粒子含有量、およびトランスジーン産物同一性を含む特徴付けアッセイが実施される。アッセイの記載は以下に示される。
Ａ．ベクターゲノムアイデンティティ：ＤＮＡ配列決定
ウイルスベクターゲノムＤＮＡを単離し、配列を、プライマーウォーキングを用いる２倍配列決定包括度により決定した。配列アライメントを実施し、期待される配列と比較する。Ｂ．ベクターカプシドアイデンティティ：ＶＰ３のＡＡＶカプシド質量分析
ベクターのＡＡＶ２／９血清型の確定は、質量分析（ＭＳ）によるＶＰ３カプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイにより成し遂げられる。方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出されたＶＰ３タンパク質バンドの複数酵素消化（トリプシン、キモトリプシン、およびエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ）、続いて、カプシドタンパク質配列に対するＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析でのＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳの特徴付けを含む。宿主タンパク質産物のサブトラクションを可能とし、質量分析からカプシドペプチド配列を導く、タンデム質量分析（ＭＳ）方法が、開発された。
Ｃ．ゲノムコピー（ＧＣ）力価
ｏｑＰＣＲに基づくゲノムコピー力価が、一定範囲の連続希釈にわたって決定され、同種プラスミド標準（ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲ）と比較される。ｏｑＰＣＲアッセイは、ＤＮａｓｅ ＩおよびプロテアーゼＫを用いる連続的消化、続いて、ｑＰＣＲ分析を利用して、カプシドに封入されたベクターゲノムコピーを測定することができる。ＤＮＡ検出は、ＲＢＧポリＡ領域を標的化する配列特異的プライマーをこの同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて用いて達成される。プラスミドＤＮＡ標準曲線との比較は、ＰＣＲ後のいずれの試料操作を必要することなく、力価決定を可能とする。多数の標準、確認用試料、および対照（バックグラウンドおよびＤＮＡ汚染についての）が、アッセイに導入された。アッセイは、感受性、検出限界、定性範囲、ならびにアッセイ内およびアッセイ間正確性を含むアッセイパラメータを構築および画定することにより、定性される。内部ＡＡＶ９参照ロットが構築され、定性研究を実施するために使用される。本研究者らの以前の経験では、本明細書に記載の最適化されたｑＰＣＲアッセイにより得られた力価は、一般に、前臨床的データを作成するのに使用された我々の標準的なｑＰＣＲ技法により成し遂げられたものよりも２．５倍高いことが示唆されていることに注目されたい。
Ｄ．エンプティ対フルの粒子比
薬物製品の全粒子含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定される。イオジキサノール勾配にて精製された参照ベクター調製は、様々な方法（分析用超遠心分離、電子顕微鏡法、および２６０／２８０ｎｍでの吸光度）により分析され、（フル）粒子を含有するゲノムを＞９５％含有する調製物を構築した。この参照材料は、周知のゲノムコピー数（故に拡張すると、粒子数）まで連続希釈され、各希釈液は、同様の連続希釈の薬物製品とともに、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上でランされる。参照材料および薬物製品ＶＰ３タンパク質バンドの両方のピーク面積容量は、デンシトメトリーにより測定され、参照材料の容量は、粒子数に対してプロットされる。薬物製品の総粒子濃度は、この曲線からの外挿により決定され、次いで、ゲノムコピー（ＧＣ）力価が除算されて、エンプティ粒子力価を得る。エンプティ対フル粒子比は、ＧＣ力価に対するエンプティ粒子力価の比である。
Ｅ．感染力価
感染ユニット（ＩＵ）アッセイを用いて、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２発現ＨｅＬａ細胞）におけるベクターの生産的取込みおよび複製を測定する。９６−ウェルエンドポイントフォーマットは、以前公開されたものと同様のものを利用した。簡潔に言うと、ＲＣ３２細胞は、ｒＡＡＶの各希釈において１２レプリケートを伴う、連続希釈のｒＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳ、および均一希釈のＡｄ５により同時感染される。感染の７２時間後、細胞を溶解し、ｑＰＣＲを実施して、インプットにわたってｒＡＡＶベクター増幅を検出する。エンドポイント希釈ＴＣＩＤ５０算出（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）は、ＩＵ／ｍｌとして表される複製的力価を測定するために実施される。「感染性」値は、細胞と接触することになる粒子、受容体結合、内部移行、核への輸送、およびゲノム複製に依存的であるので、それらは、アッセイ幾何学、ならびに使用される細胞株における適切な受容体の存在、および結合後経路により影響を受ける。受容体および結合後経路は、不死化細胞株において通常は維持されず、故に、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の
数の絶対的尺度ではない。しかし、カプシドに封入されたＧＣ対「感染ユニット」の比（ＧＣ／ＩＵ比として記載される）は、ロットからロットへの産物一貫性の尺度として使用されることができる。
ＧＣ／ＩＵ比は、産物一貫性の尺度である。ｏｑＰＣＲ力価（ＧＣ／ｍｌ）を感染室（ＩＵ／ｍｌ）で割って、算出されたＧＣ／ＩＵ比を得る。
Ｆ．複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）アッセイ
試料は、産生プロセス間で潜在的に生じ得る複製コンピテントＡＡＶ２／９（ｒｃＡＡＶ）の存在のために分析される。細胞に基づく増幅およびパッセージ、続いて、リアルタイムｑＰＣＲによるｒｃＡＡＶ ＤＮＡの検出（ｃａｐ ９標的）からなる３パッセージアッセイが、開発された。細胞に基づく構成成分は、試験試料および野生型ヒトアデノウイルス型５（Ａｄ５）の希釈を伴うＨＥＫ２９３細胞（Ｐ１）の単層を接種することからなる。１０１０ＧＣのベクター産物は、試験した産物の最大量である。アデノウイルスの存在に起因して、複製コンピテントＡＡＶは細胞培養にて増幅する。２日目の後、細胞可溶化物が産生され、Ａｄ５は熱不活性化される。次いで、清浄化された可溶化液を、第２ラウンドの細胞（Ｐ２）へ移して、感受性を高める（Ａｄ５の存在下で再び）。２日目の後、細胞可溶化物が産生され、Ａｄ５は熱不活性化される。次いで、清浄化された可溶化液を、第３ラウンドの細胞（Ｐ３）へ移して、感受性を最大限にする（Ａｄ５の存在下で再び）。２日目の後、細胞は溶解されて、ＤＮＡを放出し、次いで、これをｑＰＣＲに供して、ＡＡＶ９ ｃａｐ配列を検出する。Ａｄ５依存的様式でのＡＡＶ９ ｃａｐ配列の増幅は、ｒｃＡＡＶの存在を示す。ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶ２／９サロゲート陽性対照の使用により、アッセイの検出限界（ＬＯＤ）が測定可能となり（０．１、１、１０、および１００ＩＵ）、連続希釈のｒＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳベクター（１ｘ１０１０、１ｘ１０９、１ｘ１０８、１ｘ１０７ＧＣ）を用いて、試験試料中に存在するｒｃＡＡＶのおおよそのレベルが定量化されることができる。
Ｇ．インビトロ効力
ｑＰＣＲＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、インビトロバイオアッセイは、ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）細胞を細胞あたり既知の多様性のＧＣを用いて形質導入し、次いで、形質導入の７２時間後にＩＤＳ活性についての上清をアッセイすることにより、実施される。ＩＤＳ活性は、０．１ｍＬの水中に希釈された試料を０．１ｍＬの１００ｍｍｏｌ／ｌ ４ＭＵ−イズロン酸−２−サルフェートとともに３７℃で１〜３時間インキュベートすることにより、測定される。２ｍＬの２９０ｍｍｏｌ／ｌのグリシン、１８０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム、ｐＨ１０．９の添加により、反応を停止させ、遊離した４ＭＵは、蛍光を４ＭＵの標準的な希釈液と比較することにより、定量化される。より高い活性のある前臨床的および毒性ベクター調製物に対する比較により、産物活性の解釈が可能となる。
Ｈ．総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度決定、およびカプシドタンパク質比
ベクター試料は、初め、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質標準曲線に対する総タンパク質について定量化される。等価部分の試料とキット中で提供されるＭｉｃｒｏ−ＢＣＡ試薬とを混合することにより、決定がなされる。同じ手順は、ＢＳＡ標準の希釈にも適用される。混合物は６０℃でインキュベートされ、吸光度は５６２ｎｍで測定される。標準曲線は、４−パラメータフィットを用いて、既知濃度の標準的な吸光度から作成される。未知の試料は、４−パラメータ回帰に従って、定量化される。
ＡＡＶ純度の半定量的決定を提供するために、試料は、次いで、ゲノム力価について正
規化され、５ｘ１０９ＧＣが、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルにて分離される。ゲルは、次いで、ＳＹＰＲＯルビー色素を用いて染色される。任意の不純物バンドは、レーンあたり２５、５０、および１００ｎｇのタンパク質の同時に電気泳動されたＢＳＡ標準との比較により、デンシトメトリーにより定量化される。これらの量は、総ＡＡＶタンパク質試料の１％、２％、および４％を表す。３つのＡＡＶ特異的タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に加えて出現する染色されたバンドは、タンパク質不純物と考えられる。すべての不純物バンドは、参照タンパク質と比較され、不純物質量パーセントおよびおおよその分子量が報告される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルも用いられて、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質を定量化し、それらの比を決定する。
実施例６：ＭＰＳＩＩバイオマーカー
本研究では、ＭＰＳＩイヌからのＣＳＦ試料の代謝物プロファイリングが実施され、これは、ＣＳＦメタボロームにおける実質的な疾患に関連する変更を明らかにした。最も著しい差異は、正常な対照と比較されたスペルミンレベルにおいて３０倍を超える上昇であった。この知見は、ＭＰＳＩ患者試料およびＭＰＳＩのネコモデルにおいて確認され、ＭＰＳＩＩにおいても見出されることが期待される。スペルミンはＨＳに結合し、スペルミンの細胞取込みは、この相互作用に依存的である［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇら、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３８、３１７−３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈら、Ｔ．Ｈ．Ｖａｎ Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔ、Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉ−ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３２、７４９−７５６（２００８）、オンライン公開ＥｐｕｂＡｐｒ］。グリピカン−１などの細胞表面プロテオグリカンは、それらのＨＳ部分を通してスペルミンに結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、ＨＳ鎖の細胞内切断は、結合スペルミンを細胞へ放出する（Ｂｅｌｔｉｎｇら、Ｋ．Ｄｉｎｇ、Ｓら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６、４６７７９−４６７９１（２００１）、オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ １４）。故に、インタクトなＨＳリサイクルは、スペルミン取込みのために必須である。ＭＰＳＩでは、細胞外スペルミン蓄積が、不十分なＨＳリサイクルに起因するこの取込み機序の阻害を通して、またＭＰＳにおいて蓄積する細胞外ＧＡＧへのスペルミンの単結合を通して、生じることがあり、スペルミン結合の平衡を好ましい細胞外分布へと転じる。さらなる研究は、ＭＰＳＩ ＣＳＦにおけるスペルミン蓄積に対するこれらの機序の相対的貢献に対処する必要がある。
本発明者らは、スペルミン合成の阻害剤が、ＭＰＳニューロンにおいて過剰な神経突起成長を遮断し、神経突起成長が、患者ＣＳＦにおいて見出されたものと同様のスペルミン濃度によりＷＴニューロンにおいて誘導され得るということを見出した。ＭＰＳＩのイヌモデルにおける遺伝子療法は、スペルミン蓄積を逆転させ、ＧＡＰ４３の発現を正常化し、同じ経路がインビボで影響を受けたことを示唆している。本発明者らは、利用可能な阻害剤が血液脳関門を通過せず、出生時からの慢性直接ＣＮＳ投与が我々の動物モデルでは実行可能ではないために、インビボでのスペルミン合成阻害の影響を直接評価することができなかった。本発明者らのインビトロ知見は、ＭＰＳＩにおける異常な神経突起成長におけるスペルミンのための役割を支持するものであるが、スペルミン合成の阻害は、表現型を完全には逆転せず、正常なニューロンへのスペルミン添加は、ＭＰＳＩニューロンのレベルまで神経突起成長を増大させなかったことに留意することが重要である。スペルミン変調の効果は、比較的単期間の治療により制限されてもよい。スペルミン蓄積がＭＰＳ
Ｉにおける神経突起伸展成長に寄与する単一の調整因子ではないことも起こり得る。顕著には、ＨＳを通じる多くの神経栄養性因子結合は、受容体を修飾し、細胞外マトリックスにおけるＨＳとの相互作用は、神経突起成長に影響し得る［Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ、Ｄ．Ｐ．Ｗａｌｌ、Ｋ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ
ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６、４０−５１（２００６）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｆｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１）］。したがって、スペルミン蓄積は、ＭＰＳＩにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子のうちの１つであり得る。
スクリーニングした１５個のＭＰＳＩイヌＣＳＦ試料のうち、ただ１つのみが、スペルミン濃度の正常な範囲内に含まれた。２８日齢で、これは、研究に含まれた最も若い動物であった。この知見は、スペルミン蓄積が年齢依存的であり得ることを示す。さらなる研究は、ＭＰＳ患者において長期的にＣＳＦスペルミンレベルを評価する必要がある。ほとんどの患者が発達遅延の開始前に１〜２年の正常な発達を経験するため、スペルミンがＭＰＳ患者において年齢に従って増大するならば、これは、認知低下の動力学を説明することができる。
ニューロン成長を変更する代謝物の蓄積を誘引するためのＨＳ代謝障害の潜在性は、ＭＰＳＩにおける酵素欠損および異常な神経突起成長表現型との間の新規関連性を指摘することができ、これは、これらの障害に関連する認知機能不全を説明することができる。これらの知見はまた、ＣＳＦスペルミンが、ＭＰＳＩのための新規ＣＮＳ指向療法の薬力学を評価するための非侵襲性バイオマーカーとして有用であることを示す。
材料および方法：
実験設計：この研究は、初めに、健康な対照からの試料と比較してＭＰＳＩ患者ＣＳＦ試料において有意に異なるレベルで存在した代謝物を検出するように設計された。ＭＰＳＩＨを有する小児および健康な対照からのＣＳＦ試料の限られた入手可能性に起因して、初期スクリーンは、ヒト試料における候補バイオマーカーを実質的に評価することを目的として、より多数のものが入手可能であるＭＰＳＩイヌからのＣＳＦ試料を用いて実施された。個々の未治療ＭＰＳＩイヌからの総数１５個のＣＳＦ試料が、分析のために入手可能であり、さらなる１５個の試料が、健康な対照から得られた。予測的代謝物スクリーンにおけるＭＰＳＩイヌＣＳＦにおけるスペルミン増大を同定した後、スペルミンは、遺伝子療法で治療されたＭＰＳＩイヌおよびネコの以前の研究からのＣＳＦ試料ならびに患者試料において回顧的に測定された。これらの分析のために各群に含まれた対象の数は、試料入手可能性により制限され、統計的考察に基づいておらず、したがって、幾つかの場合では、数は、統計的比較のために不十分である。インビトロ神経突起成長の研究のために、各状態について定量された細胞の数は、細胞あたりの分枝長さ、神経突起数、または神経突起の数における２０％差異を検出するために状態あたり＞３０細胞が必要とされたということを示したパイロット実験に基づいた。細胞がプレーティングされ、指定の薬物で治療された後、ウェルは、コード化され、細胞画像の獲得、および神経突起長さおよび分岐化の手動定量化が、盲検レビュアにより実施された。同様の結果を伴う異なる基質［チャンバースライド（Ｓｉｇｍａ Ｓ６８１５）ではなくポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）コーティングされた組織培養プレート］を用いて、野生型およびＭＰＳマウスニューロンの比較が繰り返された。同様の結果を伴う両方の基質を用いて、スペルミン付加を伴うおよび伴わない野生型ニューロンの比較を４回実施した。
ＣＳＦ代謝物プロファイリング：ＣＳＦ代謝物プロファイリングを、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎにより実施した。
プロセシング時まで、試料を−８０℃で貯蔵した。ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ（登録商標）システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、試料を調製した。ＱＣ目的のための抽出プロセスにおける第１の工程の前にリカバリー標準を加えた。メタノールを用いて、２分間の激しい攪拌下、続いて、遠心分離により、タンパク質が沈殿した。得られた抽出物を５つのフラクションに分割した：陽性イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴う逆相（ＲＰ）ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析のための１つと、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴うＲＰ／ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析のための１つと、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴う親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）／ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析のための１つと、ＧＣ−ＭＳによる分析のための１つと、バックアップのために保存された１つの試料。有機溶媒を除去するために、試料は、ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）上に一時的に置かれた。ＬＣのために、試料は、分析用に調製する前に、一晩窒素下で貯蔵された。ＧＣのために、各試料は、分析用に調製する前に、真空下で一晩乾燥された。
プラットフォームのＬＣ／ＭＳ部分は、熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ−ＩＩ）ソースおよび３５，０００質量分解で操作されるＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析がインターフェース接続された、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解度／正確性質量分析計に基づいた。試料抽出物は次いで乾燥され、ＬＣ／ＭＳ方法の各々に適合する溶媒中で復元された。各復元用溶媒は、注射およびクロマトグラフィー一貫性を確実なものとするために、固定濃度の一連の標準を含有した。ＲＰクロマトグラフィーのために、１つのアリコートは、最適化された条件にて酸性陽性イオンを用いて分析され、他方は、塩基性陰イオン最適化条件を用いた。各方法は、別個の専用カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８−２．１ｘ１００ ｍｍ、１．７ μｍ）を利用した。酸性条件下で復元された抽出物は、０．１％のギ酸を含有する水およびメタノールを用いて勾配溶出された。塩基性抽出物は、同様に、メタノールおよび水を用いて溶出されたが、６．５ｍＭの重炭酸アンモニウムを伴った。第３のアリコートは、１０ｍＭのギ酸アンモニウムを伴う水およびアセトニトリルからなる勾配を用いるＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）からの溶出後の陰イオン化により分析された。ＭＳ分析は、ＭＳと動的排除を用いるデータ依存的ＭＳｎスキャンの間で変更された。スキャン範囲は、方法ごとに若干異なったが、８０〜１０００ｍ／ｚの範囲であった。
ＧＣ−ＭＳによる分析のために定められた試料を、真空下で最低１８時間乾燥し、その後、ビストリメチル−シリルトリフルオロアセトアミドを用いて乾燥窒素下で誘導体化した。誘導体化された試料は、キャリアガスとしてヘリウムを用いて、６０°〜３４０℃の温度で、１７．５分間、５％のジフェニル／９５％のジメチルポリシロキサン融合シリカカラム（２０ｍｘ０．１８ｍｍ ＩＤ、０．１８ｕｍのフィルム厚）上で分離された。試料は、電子衝撃イオン化（ＥＩ）を用い、かつユニット質量分解能で操作される、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ高速スキャンシングル四重極質量分析計上で分析された。スキャン範囲は、５０〜７５０ｍ／ｚであった。
幾つかの種類の対照は、実験試料と共同して分析され：各実験試料の小容量を採用することにより産生されるプールされたマトリックス試料は、データセットにわたって技術的レプリケートとして役立ち、抽出された水試料は、プロセスブランクとして役立ち、内因性化合物の測定に干渉しないように慎重に選択されたＱＣ標準のカクテルは、各分析試料にスパイクされ、器具性能をモニタリング可能とし、クロマトグラフィーアラインメントを補助する。器具変動性は、質量分析計に注入する前に各試料に加えられる標準について、中央値相対的標準偏差（ＲＳＤ）を算出することにより、決定される。全体的プロセス
変動性は、プールされたマトリックス試料の１００％に存在するすべての内因性代謝物（すなわち、非器具性標準）について、中央値ＲＳＤを算出することにより、決定される。実験試料は、注射間で等しく配置されたＱＣ試料を用いるプラットフォームランにわたって、無作為化された。
代謝物は、実験試料中のイオン特徴を化学的標準的エントリの参照ライブラリと自動化比較することにより、同定され、これは、保持時間、分子量（ｍ／ｚ）、好ましい付加物、およびソース内断片、ならびに関連するＭＳスペクトルを含み、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎで開発されたソフトウェアを用いる定量制御のために視覚的に精査することにより補助された。既知の化学的エントリの同定は、精製された標準のメタボロミクスライブラリーエントリとの比較に基づいた。ピークは、曲線下面積の測定を用いて定量された。各試料中の各代謝物についての生面積カウントは、各ランデイ（ｒｕｎ−ｄａｙ）についての中央値による器具インターデイ（ｉｎｔｅｒ−ｄａｙ）チューニング差異から得られたバリエーションについて補正するために正規化され、したがって、各ランについて中央値を１．０に設定した。これは、試料間のバリエーションを保存したが、広く異なる生ピーク面積の代謝物を同様の図画スケールで比較することを可能にした。欠測値は、正規化後の観察された最小値に起因した。
定量的ＭＳアッセイ：ＣＳＦ試料（５０μＬ）を、スペルミン−ｄ８内部標準（ＩｓｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。試料は、４倍過多のメタノールと混合してタンパクを除き、１２，０００ｘｇ、４℃で遠心分離した。上清を窒素流下で乾燥し、次いで、５０μＬの水中で再懸濁した。５μＬのアリコートをＬＣ−ＭＳ分析に供した。Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｃ１８カラム（３．５μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を装着したＷａｔｅｒｓ
ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＬＣ分離を実施した。流速は、０．１５ｍＬ／分であり、溶媒Ａは、０．１％のギ酸であり、溶媒Ｂは、９８／２のアセトニトリル／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）および０．１％のギ酸であった。溶出条件は以下の通りであった。０分にて２％のＢ、２分にて２％のＢ、５分にて６０％のＢ、１０分にて８０％のＢ、１１分にて９８％のＢ、１６分にて９８％のＢ、１７分にて２％のＢ、２２分にて２％のＢ、３５℃のカラム温度を伴う。Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、以下のパラメータを用いて、陽性イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析を行った：スプレー電圧４０００Ｖ、キャピラリー温度２７０℃、シース気体圧３５任意単位、イオンスイープ気体圧２任意単位、補助気体圧１０任意単位、蒸発器温度２００℃、チューブレンズオフセット５０、キャピラリーオフセット３５、およびスキマーオフセット０。以下の移行がモニターされた。スキャン幅０．００２ｍ／ｚ、およびスキャン時間０．１５ｓを用いる、２０３．１／１１２．１（スペルミン）、２１１．１／１２０．１（スペルミン−ｄ８）。
動物手順：すべての動物プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより認可された。ＣＳＦ代謝物スクリーニングのために、試料は、３〜２６ヶ月齢の正常なイヌ、および１〜１８ヶ月齢のＭＰＳＩイヌにおいて、後頭下穿刺により収集された。ＭＰＳＩイヌおよびネコにおける遺伝子移入研究を、以前に記載されているように実施した（２０、２２）。ＣＳＦ試料は、ベクター投与の６〜８ヶ月後に収集された。マウス皮質ニューロン実験のために、主要な皮質ニューロン培養は、Ｅ１８ ＩＤＵＡ−／−またはＩＤＵＡ＋／＋胚から調製された。
患者試料：インフォームドコンセントは、各対象の親または法的後見人から得られた。プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ
ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａにより認可された。ＣＳＦ
は、腰部穿刺により収集された。すべてのＭＰＳＩ患者は、ハンター症候群の診断を受けており、試料収集前に酵素補充療法または造血幹細胞移植を受けていなかった。ＭＰＳＩ患者は、６〜２６ヶ月齢であった。健康な対照は、３６および４８ヶ月齢であった。
統計的分析：ランダムフォレスト分析およびヒートマップ作成は、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０を用いて実施された［Ｒ．Ｇ．Ｋａｌｂ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０、３０６３−３０７１（１９９４）；Ｊ．Ｚｈｏｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４、５３１−５３９（１９９５）Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ、Ｄ．Ｐ．Ｗら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６、４０−５１（２００６）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｆｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１）。生ピークデータは、ログ変換され、正常な試料値の平均に対して正規化された。すべての他の統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて実施された。培養されたニューロン分枝の長さ、神経突起の数、および分岐を、ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により比較した。ＣＳＦスペルミンおよび皮質ＧＡＰ４３は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、続いて、Ｄｕｎｎ検定により比較された。
ＧＡＰ４３ウェスタン：Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒを３０Ｈｚで５分間使用して、前頭皮質の試料を、０．２％のトリトンＸ−１００中で均質化した。試料を、４℃での遠心分離により清澄化した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイにより上清中で測定された。試料は、ＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴うＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ緩衝液中で、７０℃で１時間インキュベートされ、ＭＯＰＳ緩衝液中のビストリス４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上で分離された。タンパク質は、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーされ、５％の無脂肪乾燥ミルク中で１時間ブロッキングされた。メンブレンは、５％の無脂肪乾燥ミルク中で１μｇ／ｍＬに希釈されたウサギポリクローナル抗−ＧＡＰ４３抗体（Ａｂｃａｍ）、続いて、５％の無脂肪乾燥ミルク中で１：１０，０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートしたポリクローナル抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプローブ化された。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、バンドは検出された。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、デンシトメトリーを実施した。
神経突起成長アッセイ：１８日目に、胚皮質ニューロンは、上記したように回収され、チャンバースライド（Ｓｉｇｍａ Ｓ６８１５）またはポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）コーティングされた組織培養プレート上に、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）により補足された血清不含神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）中、１００，０００細胞／ｍＬの濃度でプレーティングされた。プレーティングの２４時間後に（１日目）、デュプリケートでウェルに治療を適用した。定量化のための位相差画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉにおいて２０Ｘ、６００ｍｓの手動露光、および高位相での１．７０ｘのゲインを用いて撮影された。治療条件に対して盲検の個人が、１ウェルあたり１０〜２０枚の画像を獲得し、それらをコード化した。盲検レビュアにより、画像はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）にて８ビットフォーマットに変換され、ニューロンＪにトレースされた［Ｅ．Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇら、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒｉｔｅ
ｔｒａｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｅｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｐａｒｔ Ａ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ５８、１６７−１７６（２００４）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ａｐｒ（１０．１００２／ｃｙｔｏ．ａ．２００２２）］。幾つかの直径、神経突起の数、分岐点、および分枝長さは、手動でトレースされた。ニューロンＪにトレースされた画像は、画像サイズに基づく変換係数を用いてマイクロメータに変換され、
２５６０ｘ１９２０ピクセルの画像は、０．１７マイクロメータ／ピクセルの変換計数を用いてマイクロメータに変換された。
組織学：脳組織プロセシングおよびＬＩＭＰ２免疫蛍光を、以前に記載されているように実施した［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２、２０１８−２０２７（２０１４）、オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ（１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１３５）］。
ＲＴ−ＰＣＲ：３匹の正常なイヌおよび５匹のＭＰＳイヌからの前頭皮質の試料を、剖検時に、即時にドライアイスで凍結した。ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて抽出され、ＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２０分間室温で処理され、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元の指示に従って用いて精製した。精製されたＲＮＡ（５００ｎｇ）は、高容量ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてランダムヘキサマープライマーで逆転写された。アルギナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、スペルミンシンターゼ、スペルミジンシンターゼ、スペルミン−スペルミジンアセチルトランスフェラーゼ、およびグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼについての転写が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００を用いるＳｙｂｒ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲにより定量化された。
リアルタイムＰＣＲシステム。標準曲線が、すべての個別試料からなるプールされた標準の４倍希釈を用いて、各標的遺伝子について作成された。最も高い標準は、恣意的な転写数を割り当てられ、個別試料についてのＣｔ値は、標準曲線に基づいて転写数に変換された。値は、ＧＡＰＤＨ対照に対して表される。
統計的分析：ランダムフォレスト分析およびヒートマップ作成は、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ３．０を用いて実施された［Ｊ．Ｘｉａら、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ２．０−ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ
ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２０１２）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｍａｙ ２、２０１２（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ３７４）；Ｊ．Ｘｉａら、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７、Ｗ６５２−Ｗ６６０（２００９）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｊｕｌｙ １、２００９（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ３５６）．Ｊ．Ｘｉａら、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０−ｍａｋｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｍｏｒｅ ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２０１５）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ａｐｒｉｌ ２０、２０１５（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ３８０）］。代謝物スクリーンにおける検出不可な値は、データセットにおいて観察された最小値に起因した。生ピークデータは、正常な試料の値の平均値に対して正規化され、ログ変換された。すべての他の統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて実施された。培養されたニューロン分枝の長さ、神経突起の数、および分岐を、ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定．により比較した。ＣＳＦスペルミンおよび皮質ＧＡＰ４３は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、続いて、Ｄｕｎｎ検定により比較された。
結果
１．代謝物プロファイリングによる高められたＣＳＦスペルミンの同定
ＣＳＦ代謝物の初期スクリーンが、ＭＰＳＩのイヌモデルを用いて実施された。これらの動物は、ＩＤＵＡ遺伝子にスプライス部位変異を有し、ＭＰＳＩ患者のものと類似する
酵素発現の完全な喪失、ならびに臨床的および組織学的特徴の発達をもたらす［Ｋ．Ｐ．Ｍｅｎｏｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４、７６３−７６８（１９９２）、Ｒ．Ｓｈｕｌｌら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１４、４８７（１９８４）］。ＣＳＦ試料は、１５匹の正常なイヌおよび１５匹のＭＰＳＩイヌから収集された。ＣＳＦ試料は、ＬＣおよびＧＣ−ＭＳにより、代謝物の相対量について評価された。総数２８１個の代謝物が、質量分析によりＣＳＦ試料において積極的に同定されることができた。これらのうち、４７個（１７％）は、対照に対してＭＰＳＩイヌにおいて有意に高められており、８８個（３１％）は、対照に対して減少していた。群間で最も異なる５０個の代謝物のヒートマップが図１９Ａに示される。同定された代謝物プロファイリングは、ＭＰＳＩと正常なイヌとの間のポリアミン、スフィンゴ脂質、アセチル化アミノ酸、およびヌクレオチド代謝において差異を明示した。ランダムフォレストクラスター分析は、ＭＰＳＩと正常なイヌとの間の代謝物差異に対する最大の寄与因子としてポリアミンスペルミンを同定した（図２３）。平均して、スペルミンは、試料収集の時点で１ヶ月齢未満であった１匹のＭＰＳＩイヌを除いて、ＭＰＳＩイヌにおいて３０倍超高められていた。ＣＳＦ中のスペルミンを定量的に測定するために、安定なアイソトープ希釈（ＳＩＤ）−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイが開発された。ハンター症候群を有する６匹の子犬（６〜２６ヶ月齢）、および２匹の健康な対照（３６および４８ヶ月齢）から、試料がスクリーニングされた。健康な対照の両方は、アッセイの定量限界（１ｎｇ／ｍＬ）未満のＣＳＦスペルミンレベルを有したが、ＭＰＳＩ患者からのＣＳＦ試料は、定量限界を超える平均１０倍であった（図１９Ｂ）。ＭＰＳＩＨ患者におけるスペルミン上昇は、スペルミン結合および取込みにおけるＨＳの周知の役割に一致しているようであった［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２７８、４７１８１−４７１８９（２００３）；Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇら、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３８、３１７−３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３２、７４９−７５６（２００８））］；正常およびＭＰＳＩイヌ脳試料は、ポリアミン合成経路における転写制御された酵素について同様のｍＲＮＡ発現レベルを有したので、増大された合成は、ＣＳＦスペルミン上昇の原因とはならないようであった（図２４）。スペルミン上昇が、ヘパラン硫酸貯蔵疾患の一般的な特性であるか、またはＭＰＳＩに特異的であるかを決定するために、スペルミンは、ＭＰＳ ＶＩＩのイヌモデルからのＣＳＦ試料中で測定され、これは同様の上昇を示した（図２５）。
２．ＭＰＳに関連する異常な神経突起成長におけるスペルミンの役割
軸索損傷後、ニューロンは、ポリアミン合成を上方制御し、これが神経突起伸展成長を促進する［Ｄ．Ｃａｉら、Ｎｅｕｒｏｎ ３５、７１１−７１９（２００２）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ａｕｇ １５；Ｋ．Ｄｅｎｇら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２９、９５４５−９５５２（２００９）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｊｕｌ ２９；Ｙ．Ｇａｏら、Ｎｅｕｒｏｎ ４４、６０９−６２１（２００４）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｎｏｖ １８；Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２８、７４１−７４９（２００４）］。したがって、本発明者らは、ＭＰＳニューロンにおいて記載された成長表現型にわたって異常な神経突起中のスペルミンの役割を評価した［Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ、Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ８８、２０２−２１３（２０１０）］。ＭＰＳＩマウスからのＥ１８皮質ニューロンの培養は、培養の４日後に、コロニーからの野生型マウスに由来するニューロンよりも多くの神経突起の数、分岐化、および総分枝長さを示した（図２０Ａ〜２０Ｆ）。ＡＰＣＨＡ、スペルミン合成の阻害剤を用いるＭＰＳニューロンの治療は、有意に神経突起成長および分岐化を減少した。効果は、スペルミンを置換することにより逆転可能であった（図２０Ａ〜２０Ｆ）。同
じＡＰＣＨＡ濃度は、正常なニューロンの成長に影響を与えなかった（図２６）。インビボで同定されたものと同様の濃度で、スペルミンを野生型ニューロン培養に加えることにより、神経突起成長および分岐化における有意な増大をもたらした（図２０Ａ〜２０Ｆ）。
３．ＣＳＦスペルミンおよびＧＡＰ４３発現に対する遺伝子療法の影響
ＧＡＰ４３、神経突起成長の中心的調整因子は、インビトロおよびインビボの両方で、ＭＰＳＩＩＩマウスニューロンにより過剰発現されており、ニューロン培養において異常に活性化された同じ神経突起成長経路は、インビボにおいても活性がある。ＧＡＰ４３発現およびインビボでのスペルミン蓄積に対するＩＤＵＡ欠損を評価するために、本発明者らは、未治療ＭＰＳＩイヌおよびＣＮＳ指向遺伝子療法で治療されたものにおいてＣＳＦスペルミンおよび脳ＧＡＰ４３レベルを測定した。本発明者らは、以前、イヌＩＤＵＡ トランスジーンを有するアデノ随伴ウイルス血清型９ベクターの髄腔内注射を用いて治療された５匹のＭＰＳＩイヌについて記載した［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３、１２９８−１３０７（２０１５）、オンライン公開Ｅｐｕｂ Ａｕｇ］。ＭＰＳＩイヌは、正常なＩＤＵＡ酵素に対する抗体を産生することができ、したがって、２匹のイヌは、そのタンパク質に対する免疫耐性を誘導するために肝臓ＩＤＵＡ遺伝子移入を用いて新生児期に予め治療された。寛容化された両方のイヌは、ＡＡＶ９治療後に正常値を十分に上回る脳ＩＤＵＡ活性を示した。３匹の寛容化されていないイヌは、様々なレベルの発現を示し、１匹の動物は、正常なものよりも高いレベルに到達し、他の２匹は、正常に近い発現を示した（図２１Ａ）。ＣＳＦスペルミン減少は、脳ＩＤＵＡ活性に反比例し、最も低いＩＤＵＡ発現を伴う２匹のイヌにおいて未治療動物に対して３倍減少し、最も高い発現を伴う動物では２０倍超減少した（図２１Ａ、２１Ｂ〜２１Ｈ、および２１Ｋ）。ＧＡＰ４３は、ＭＰＳＩイヌの前頭皮質において上方制御され、発現は、すべてのベクター治療された動物において正常化された（図２１Ｉ〜２１Ｊ）。
本発明者らは、さらに、一定範囲のベクター用量を用いて治療されたＭＰＳＩイヌにおいて、ＣＳＦスペルミンレベルとＩＤＵＡ再構築との関係を評価した。新生児期肝臓遺伝子移入によりヒトＩＤＵＡに対して予め寛容化されたＭＰＳＩイヌは、ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターの髄腔内注射を３用量のうちの１つ（１０１０、１０１１、１０１２ＧＣ／ｋｇ、用量あたりｎ＝２）で用いて治療された［（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｎｅｏｎａｔａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＭＰＳ
Ｉ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２０１６．０６．００６］。ＣＳＦスペルミンは、注射の６ヶ月後に上昇した（図２２Ａ）。ＣＳＦスペルミンの減少は、用量依存的であり、中および高ベクター用量の動物は、正常な範囲に到達し、一方で、ＣＳＦスペルミンは、低用量動物では部分的に減少したのみであった。ＩＤＵＡ欠損とＣＳＦスペルミン蓄積との間の関連を独立的に確証するために、本発明者らは、ＭＰＳＩのネコモデルにおけるＣＳＦスペルミンレベルを評価した。本発明者らが以前に報告した遺伝子療法研究からのＣＳＦ試料を用いて、我々は、ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ未治療ＭＰＳＩネコが高いＣＳＦスペルミンを示したことを見出した（図２２Ｂ）［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｐ．Ｂｅｌｌ、Ｂ．Ｌ．Ｇｕｒｄａ、Ｑ．Ｗａｎｇ、Ｊ．Ｐ．Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ、Ｙ．Ｚｈｕ、Ｊ．Ｂａｇｅｌ、Ｐ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｔ．Ｓｉｋｏｒａ、Ｔ．Ｒｕａｎｅ、Ｐ．Ｗａｎｇ、Ｍ．Ｅ．Ｈａｓｋｉｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｆｅｌｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａ
ｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２、２０１８−２０２７（２０１４）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ（１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１３５）］。フェリンＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターの高用量の髄腔内投与は、ＣＳＦスペルミンレベルを正常化した（図２２Ｂ）。
Ｃ．議論
本研究では、本発明者らは、ＭＰＳＩイヌからのＣＳＦ試料の代謝物プロファイリングを実施し、これは、ＣＳＦメタボロームにおける本質的な疾患に関連する変更を明らかにした。最も著しい差異は、正常な対照と比較されたスペルミンレベルにおいて３０倍を超える上昇であった。この知見は、ＭＰＳＩ患者試料およびＭＰＳＩのネコモデルおよびＭＰＳ ＶＩＩのイヌモデルにおいて確認された。スペルミンは高い親和性を伴ってＨＳに直接結合し、スペルミンの細胞取込みは、この相互作用に依存的である［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ、Ｓ．ＰＥＲＳＳＯＮ、Ｌ．−Ａ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３８、３１７−３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３２、７４９−７５６（２００８）］。グリピカン−１などの細胞表面プロテオグリカンは、それらのＨＳ部分を通してスペルミンに結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、ＨＳ鎖の細胞内切断は、結合スペルミンを細胞へ放出する［Ｂｅｌｔｉｎｇら、上記引用；Ｋ．Ｄｉｎｇら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６、４６７７９−４６７９１（２００１）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ １４］。故に、インタクトなＨＳリサイクルは、スペルミン取込みのために必須である。ＩＤＵＡ欠損に起因する不十分なＨＳリサイクルは、このスペルミン取込み機序を阻害し、細胞外スペルミン蓄積を導くことができる。代替的には、細胞外ＧＡＧは、スペルミンを隔離し、好ましい細胞外分布へと平衡を転じ得る。この研究におけるＬＣ−ＭＳ試料調製のために利用されるメタノール除タンパク工程は、可溶性ＨＳも沈殿し、これは、ＣＳＦ中で検出されたスペルミンが非結合であり、したがって、ＧＡＧ結合ではなく取込み阻害が、細胞外スペルミン蓄積に関与していることを示唆する［Ｎ．Ｖｏｌｐｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ６８５、２７−３４（１９９６）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ １１］。機能的神経ネットワークの形成および維持は、神経突起成長およびシナプス形成の正確な制御に必要である。発達中、ＣＮＳ環境は、神経突起形成に対して益々阻害性となり、ミエリン関連タンパク質は、成人脳における神経突起成長を大いに遮断する。神経突起成長減少に向かうこの発達的転換は、ＧＡＰ４３発現における減少と並行して起こる［Ｓ．Ｍ．Ｄｅ ｌａ Ｍｏｎｔｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６、１６１−１６８（１９８９）；オンライン公開Ｅｐｕｂ４／１／］。持続的なＧＡＰ４３発現、およびＭＰＳニューロンにより示される誇張された神経突起伸展成長は、阻害および成長促進シグナルのこの正常なバランスを妨害し、異常な連結性および認知低下をもたらす。どのようにＨＳ貯蔵が神経突起成長におけるこの増大を導くかということは確立されていない。多数の研究が、神経突起伸展成長におけるポリアミンの関係を指摘しており、軸索損傷後、スペルミンおよびその前駆物質プトレシンおよびスペリミジンの合成のための律速酵素が高められ、ミエリンからの阻害性シグナルの存在下でさえ強化された神経突起伸展成長が可能となる［Ｃｉａ（２００２）、Ｄｅｎｇ（２００９）、Ｇａｏ（２００４）、すべて上記で引用されている］。さらに、プトレシンを用いるニューロンの治療は、ＣＳＦに直接注射される場合、神経突起成長を誘導し、これは、スペルミン合成の阻害剤により遮断される効果である（Ｄｅｎｇ（２００９）、上で引用した）。ポリアミンが神経突起成長に対してそれらの効果を発揮する機序は知られていない。１つの潜在的な標的は、ＮＭＤＡ受容体であり、その活性化は、スペルミン結合により増強される（Ｊ．Ｌｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｎ ８、３４３−
３５２（１９９２）；オンライン公開Ｅｐｕｂ２／／（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０８９６−６２７３（９２）９０３００−３））。ＮＭＤＡシグナリングは、神経突起伸展成長を誘導し、受容体のスペルミン感受性サブユニットは、発達中、高度に発現される［Ｄ．Ｇｅｏｒｇｉｅｖら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１４、２６０３−２６１７（２００８）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ａｕｇ １５（１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２００８．０６．００９）；Ｒ．Ｇ．Ｋａｌｂ、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０、３０６３−３０７１（１９９４）；Ｊ．Ｚｈｏｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４、５３１−５３９（１９９５）。顕著に、多くの神経栄養性因子は、ＨＳ修飾受容体を通じて結合し、細胞外マトリックス中のＨＳとの相互作用は、神経突起成長に影響を与えることができる（Ｄ．Ｖａｎ
Ｖａｃｔｏｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
１６、４０−５１（２００６）；オンライン公開Ｅｐｕｂ Ｆｅｂ］。したがって、スペルミン蓄積は、ＭＰＳＩにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子の１つであり得る。スクリーンされた１５個のＭＰＳＩイヌＣＳＦ試料のうち、１つのみが、スペルミン濃度の正常な範囲内に含まれた。２８日齢で、これは、研究に含まれた最も若い動物であった。この研究は、ハンター症候群を有する乳幼児では６ヶ月齢までにスペルミン濃度が既に高められていると実証しているが、この知見は、スペルミン蓄積が年齢依存的であり得ることを示す。さらなる研究は、ＭＰＳ患者において長期的にＣＳＦスペルミンレベルを評価する。ほとんどの患者が発達遅延の開始前に１〜２年の正常な発達を経験するため、スペルミンがＭＰＳ患者において年齢に従って増大するならば、これは、認知低下の動力学を説明する。ニューロン成長を変更する代謝物の蓄積を誘引するためのＨＳ代謝障害の潜在性は、ＭＰＳにおける酵素欠損および異常な神経突起成長表現型との間の新規関連性を指摘し、これは、これらの障害に関連する認知機能不全を説明することができる。さらなる研究は、ＭＰＳＩＩなどの他のＭＰＳにおけるスペルミン上昇を確認する。これらの知見はまた、ＣＳＦスペルミンが、ＭＰＳのための新規ＣＮＳ指向療法の薬力学を評価するための非侵襲性バイオマーカーとして有用であることを示す。ＣＮＳ指向療法のためのさらなる試験は、認知的エンドポイントとＣＳＦスペルミン変化との相関関係を評価する。
実施例７：ＣＴガイドＩＣＶ送達デバイス
Ａ．手順前スクリーニング評価
１．プロトコルビジット１：スクリーニング
主な調査者は、対象（または指定された介護者）がインフォームドコンセントに署名する際に十分に情報を得ることができるように、槽内（ＩＣ）手順に至るまでのスクリーニングプロセス、投与手順そのもの、およびすべての潜在的な安全性危険性を記載する。
ＩＣ手順のための対象適格性のそれらのスクリーニングアセスメントにおいて、以下のものが実施され、神経放射線科医／神経外科医／麻酔科標榜医に提供される：病歴、併用薬、身体検査、バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）、およびラボ検査結果。
２．インターバル：研究ビジット２に対するスクリーニング
適格性を吟味するために十分な時間を可能とするために、以下の手順が、第１のスクリーニングビジット〜研究ビジット２（０日目）前の最大１週間の間の任意の時点で実施される。
●ガドリニウムを伴うおよび伴わない、頭部／頸部磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）［注意：対象は、ガドリニウムを受けるために適切な候補である候補がある（すなわち、ｅＧＦＲ
＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）。］
●頭部／頸部ＭＲＩに加えて、調査者は、屈曲／延伸研究による首のさらなるいずれか
の評価のための必要性を決定する
●ＭＲＩプロトコルは、Ｔ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ、およびＣＩＮＥプロトコル画像を含む
●制度プロトコルに従う、頭部／頸部ＭＲＡ／ＭＲＶ（注意：●硬膜間／硬膜内処置の履歴を有する対象は、排除されてもよく、またはＣＳＦ流れの十分な評価、およびＣＳＦ空間内のコミュニケーションの起こり得る妨害または欠失の同定を可能とする、さらなる試験（例えば、放射性ヌクレオチドシステルノグラフィ）を必要としてもよい。
●神経放射線科医／神経外科医、対象の手順評価ミーティング：３部門からの代表者は、入手可能なすべての情報（スキャン、病歴、身体検査、ラボなど）に基づき、ＩＣ手順のための各対象の適格性を議論するために、電話会議（またはオンライン会議）をする。すべての試みは、ＩＣ手順を先に進めるか、または対象をスクリーンから排除するかについてのコンセンサスを成し遂げるためになされる必要がある（すなわち、各メンバーは、決断事項を受け入れるための準備がある必要がある）。
●ＭＰＳ対象の特別な生理的必要性を考慮した、気道、首（短くなった／太くなった）、および頭部運動範囲（首屈曲の程度）の詳細なアセスメントを用いる、−２８日目〜１日目の麻酔処置前評価。
３．１日目：コンピュータ断層撮影一式＆投与のためのベクター調製。ＩＣ手順の前に、ＣＴスイートは、以下の機器および医薬が存在することを確認する：
●成人腰部穿刺（ＬＰ）キット（協会によって供給される）
●ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージｘ３〜７インチの脊椎ニードル（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）
●（脊椎ニードルの導入のために）介入者の裁量で使用される、同軸導入用ニードル（例えば、１８Ｇ ｘ ３．５インチ）
●旋回式（スピン）雄型ルアーロックを伴う４方向小口径停止コック
●雌型ルアーロックアダプタを伴うＴ−コネクタ延長セット（チューブ）、おおよその長さ６．７インチ
●髄腔内投与のためのＯｍｎｉｐａｑｕｅ１８０（イオヘキソール）
●静脈内（ＩＶ）投与のためのヨウ素化コントラスト
●注射用の１％のリドカイン溶液（成人ＬＰキット中で供給されていない場合）
●充填済み１０ｃｃ通常食塩水（滅菌）フラッシュシリンジ
●放射線不透過性マーカー（複数可）
●手術準備用機器／カミソリ
●挿管された対象の正確な位置を可能とするための枕／支持
●気管内挿管用機器、全身麻酔機械、および機械式通風装置
●術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）機器（および必要とされる人員）
●ＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターを含有する１０ｃｃのシリンジ、別の薬務マニュアルに従って、調整され、ＣＴ／手術室（ＯＲ）スイートに輸送される
４．１日目：対象準備＆投与
●研究および手順のためのインフォームドコンセントを確認し、診療記録および／または研究ファイル内で文書化をする。制度上必要条件であるため、放射線科および麻酔科のスタッフからの手順についての別個の同意を得る。
●研究対象は、制度ガイドラインに従って、適切な病院治療室内に配置された静脈内アクセス（例えば、２つのＩＶアクセス部位）を有する。静脈内流体は、麻酔医の裁量で投与される。
●麻酔医の裁量および制度ガイドラインに従って、研究対象は、領域または手術／ＣＴ処置スイートを有する適切な患者治療室において、全身麻酔の投与とともに、気管内挿管を導入され、気管内挿管を受ける。
●腰部穿刺が実施され、初め、５ｃｃの脳脊髄液（ＣＳＦ）を除去し、引き続いて、大
槽の視覚化を補助するためにコントラスト（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ１８０）が髄腔内に注射される。適切な対象位置付け工作を実施して、コントラストの大槽への核酸を促進する。
●既にそうしていないならば、術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）機器が、対象に取り付けられる。
●対象は、うつ伏せまたは横向き臥位で、ＣＴスキャナ台上に配置される。
●適切であると考えられるならば、対象は、処置前評価の間安全であると判定される程度まで首を屈曲させる様式で、位置付けられ、位置付けられた後、通常の神経生理学的モニターシグナルが記録される。
●以下の研究スタッフおよび調査者（複数可）が、存在しているか、施設内に存在することが確認される：
○手順を実施する介入者／神経外科医
○麻酔科標榜医および呼吸器系技師（複数可）
○看護師および医師アシスタント
○ＣＴ（またはＯＲ）技師
○神経生理学の技師
○研究所コーディネーター
●頭蓋底下の対象の皮膚は、適切に剃られる。
●ＣＴスカウト画像が実施され、続いて、介入者が、標的位置をローカライズし、脈管構造を画像化することが必要と考える場合には、ＩＶコントラストを用いる手順前プラニングＣＴが実施される。
●標的部位（大槽）が同定され、ニードル軌道が計画されると、制度ガイドラインに従って滅菌技法を用いて、皮膚は準備され、布を掛けられる。
●介入者により指示される場合、放射線不透過性マーカーが、標的皮膚位置に配置される。
●マーカーされた皮膚は、１％のリドカインを用いて湿潤により麻酔をかけられる。
●２２Ｇまたは２５Ｇの脊椎ニードルは大槽に向かって前進されるが、同軸導入用ニードルを使用する選択肢もある。
●ニードル前進の後、協会の機器を用いて実行可能な最も薄いＣＴスライス厚さ（理想的には≦２．５ｍｍ）を用いて、ＣＴ画像が得られる。連続的ＣＴ画像は、ニードルおよび関連する軟組織（例えば、傍脊柱筋群、骨、脳幹、および脊髄）の十分な視覚化を可能にするのに可能な最も少ない放射線量を用いる必要がある。
●正確なニードル配置が、ニードルハブ中のＣＳＦの観察および大槽内のニードル先端の視覚化により、確認される。
●介入者は、ベクターを含有するシリンジが、滅菌野に近接しているが、滅菌野の外側に位置付けられていることを確認する。ベクターを取り扱う前またはそれを投与する前に、部門は、グローブ、マスク、および保護用メガネがあることを確認し、滅菌野の手順を補助するスタッフはそれらを装着する（滅菌野外の他のスタッフはこれらの手順を採用する必要はない）。
●短い（約６インチ）延長チューブは、挿入された脊椎ニードルに取り付けられ、これは次いで、４方向停止コックに取り付けられる。一旦、この機器が対象のＣＳＦで「セルフプライム」されると、１０ｃｃの充填済み通常の食塩水フラッシュシリンジが、４方向停止コックに取り付けられる。
●ベクターを含有するシリンジが介入者に提供され、４方向停止コック上のポートに取り付けられる。
●ベクターを含有するシリンジに対して停止コックポートが開放されると、注射中、プランジャーへ過剰な力を適用しないように気を付けながら、シリンジ内容物が、ゆっくりと注射される（おおよそ１〜２分間にわたって）。
●ＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡを含有するシリンジの内容物が注射されると、停止コックおよびニードルアセンブリが、取り付けられた充填済みシリンジを用いて１〜２ｃｃの通常食塩水をフラッシュできるように、停止コックが回される。
●用意ができたら、介入者は自分が対象から機器を取り出すことをスタッフに警告する。
●シリンジの動きにおいて、ニードル、延長チューブ、停止コック、およびシリンジは、ゆっくりと対象から取り出され、バイオハザード廃棄物入れまたは硬質容器（ニードルのため）へ廃棄するために手術トレイへ置かれる。
●調査者により指示されるように、ニードル挿入部位は、出血またはＣＳＦ漏出の徴候について調べられ、治療される。指示されるように、ガーゼ、手術用テープ、および／またはＴｅｇａｄｅｒｍ手当用品を用いて、部位は手当される。
●対象は、ＣＴスキャナから取り出され、ストレッチャー上に仰向けで配置される。
●麻酔を中止し、対象は、麻酔後ケアのための制度ガイドラインに従ってケアされる。神経生理学的モニターが研究対象から取り除かれることができる。
●対象が横たわっているストレッチャーの頭側は、回復中、若干上昇させる必要がある（約３０度）。
●制度ガイドラインに従って、対象は適切な麻酔後治療室に輸送される。
●対象が、十分に意識を回復し、安定な状態となった後、対象は、プロトコル指定の評価のために適切なフロア／ユニットに入院する。神経学的評価は、プロトコルに従って実施され、主要な調査者は、病院および研究スタッフとの共同で対象ケアを監督する。
実施例８：大型動物における髄腔内投与経路の評価
この研究の目的は、脳室内（ＩＣＶ）注射、および腰部穿刺による注射を含むＣＳＦへの投与のより慣用的な方法を評価することである。簡潔に言うと、この研究では、ＩＣＶおよびＩＣ ＡＡＶ投与がイヌにおいて比較された。ベクター投与は、非ヒト霊長類における腰部穿刺により評価され、一部の動物は、注射後にトレンデレンブルグ位置に配置され、その措置は、ベクターの頭蓋分布を促進することが示唆されている。イヌ研究では、ＩＣＶおよびＩＣベクター投与は、脳および脊髄にわたって同様に効率的な形質導入をもたらした。しかし、トランスジーン産物に対する重度のＴ細胞応答に明らかに起因して、ＩＣＶコホート内の動物は脳炎を発症した。ＩＣＶコホートにおいてのみのこのトランスジーン−特異的免疫応答の発生は、トランスジーン発現の部位における注射手順からの局所的炎症の存在に関連付けられるのではないかと考えられる。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究では、腰椎槽へのベクター投与後の形質導入効率は、非常に大量の注射容量（総ＣＳＦ容量のおおよそ４０％）を用いることによる我々の以前の研究と比較して改善された。しかし、このアプローチは、ＩＣ投与よりもなお効率的でない。注射後のトレンデレンブルグでの動物の配置は、さらなる利益を提供しなかった。しかし、大量の注射容量は、ベクターの頭蓋分布を改善し得ることが見出された。
髄腔内ＡＡＶ送達の効率を最大限にするために、ＣＳＦへのベクター投与の最適経路を決定することは重要である。本発明者らは、以前、後頭下穿刺による大槽（小脳延髄槽）へのベクター注射が非ヒト霊長類において効果的なベクター分布を成し遂げたが、一方で、腰部穿刺による注射は、脊髄への実質的により低い形質導入をもたらし、脳へは実質的に分布されず、投与経路の重要性を強調する報告した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。他者らは、一般的な臨床手順である側脳室へのベクター送達は、効果的なベクター分布をもたらすことを示唆している［Ｈａｕｒｉｇｏｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、Ａｕｇ ２０１３；１２３（８）：３２５４−３２７１］。腰部穿刺による送達は、注射後に動物をトレンデレンブルグ位に配置して、頭蓋内ベクター分布を促進することにより、改善されることができることも報告されている［Ｍｅｙｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ３１ ２０１４］。この研究では、本発明者らは、イヌにおいて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの脳室内および槽内投与
を比較した。我々は、脳室内送達がトランスジーン特異的免疫応答のさらなる危険性を有し得るが、両経路がＣＮＳにわたる効果的な分布を成し遂げることを見出した。我々は、ＮＨＰにおける腰部穿刺によるベクター送達、および注射後のトレンデレンブルグ位に動物を配置することの影響も評価した。注射後の位置付けによる明確な効果は存在しなかったが、我々は、大量の注射容量がベクターの頭蓋分布を改善し得ることを見出した。
Ａ．材料および方法：
１．ベクター産生：ＧＦＰベクターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーを伴うニワトリベータアクチンプロモータ、人工イントロン、強化された緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素、およびウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを有するＡＡＶ血清型９カプシドからなる。ＧＵＳＢベクターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーを伴うニワトリベータアクチンプロモータ、人工イントロン、イヌＧＵＳＢ ｃＤＮＡ、およびウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを有するＡＡＶ血清型９カプシドからなる。以前記載されているように、ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションにより産生され、イオジキサノール勾配にて精製される［Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ２０１０；２１（１０）：１２５９−１２７１］。
２．動物実験：すべてのイヌは、ガイドライン、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ＵＳＤＡ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈの下、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｒａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ＮＩＨ ＯＤ Ｐ４０−０１０９３９）で育てられた。
３．ＮＨＰ研究：この研究は、９〜１２歳の６匹のカニクイザルを含んだ。動物は、注射時に、４〜８ｋｇであった。注射前に、ベクター（２ｘ１０１３ＧＣ）を、５ｍＬのＯｍｎｉｐａｑｕｅ（イオヘキソール）１８０対照材料中で希釈した。腰部穿刺によるベクターの注射は、以前に記載されているように実施された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。髄腔内空間への正確な注射は、蛍光透視法により確認された。トレンデレンブルグ群の動物については、ベッドの頭側は、注射後即時に１０分間３０度低下された。安楽死および組織収集は、以前に記載されているように実施された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。
４．イヌ研究：この研究は、６匹の１歳のＭＰＳＩイヌ、および１匹の２ヶ月齢のＭＰＳ
ＶＩＩイヌを含んだ。ベースラインＭＲＩは、注射コーディネートを計画するためにすべてのＩＣＶ治療されたイヌについて実施された。槽内注射は、以前に記載されているように実施した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８−１３０７］。ＩＣＶ注射のために、イヌは、静脈内プロポフォールで麻酔され、気管内に挿管され、イソフルランを用いる麻酔下で維持され、定位固定フレームに配置された。皮膚は、滅菌的に準備され、注射部位にわたって切開がなされた。注射部位に単一の頭蓋穿孔をドリルで開け、そこを通して、２６ゲージのニードルを予め決めた深さまで前進させた。配置は、ＣＳＦリターンにより確認された。ベクター（１ｍＬ中１．８ｘ１０１３ＧＣ）は、１〜２分間かけてゆ
っくりと注入された。安楽死および組織収集は、以前に記載されているように実施された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８−１３０７］。
５．組織学：脳は、ＧＦＰ発現の評価のために処理された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。ＧＵＳＢ酵素染色およびＧＭ３染色は、以前に記載されているように実施された［Ｇｕｒｄａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ８ ２０１５．］。
６．ＥＬＩＳＰＯＴ：剖検時に、血液は、ヘパリン処理したチューブ中に、ベクター治療されたイヌから収集された。末梢血単核性細胞は、フィコール勾配遠心分離により単離された。ＡＡＶ９カプシドペプチドおよびＧＦＰペプチドに対するＴ細胞応答は、インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴにより評価された。ＡＡＶ９およびＧＦＰペプチドライブラリーが、１０アミノ酸の重複を用いて（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）１５−ｍｅｒｓとして合成された。ＡＡＶ９ペプチドライブラリーは、３つのプールへグループ分けされた。ペプチド１〜５０のプールＡ、ペプチド５１〜１００のプールＢ、およびペプチド１０１〜１４６のプールＣ。ＧＦＰペプチドライブラリーも、３つのプールへグループ分けされた：ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートおよびイオノマイシン塩（ＰＭＡ＋ＩＯＮ）は、陽性対照として用いられた。ＤＭＳＯは、陰性対照として用いられた。細胞は、ペプチドを用いて刺激され、インターフェロンガンマ分泌が記載されたように検出された。応答は、それが、百万リンパ球あたり５５超のスポット形成ユニット（ＳＦＵ）であり、かつＤＭＳＯ陰性対照値の少なくとも３倍である場合に、陽性であるとみなされた。
７．体内分布：剖検時に、体内分布のための組織は、即時にドライアイス上で凍結された。ＤＮＡ単離およびＴａｑＭａｎ ＰＣＲによるベクターゲノムの定量化が、記載されたように実施された［Ｗａｎｇら、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｏｖ
２０１１；２２（１１）：１３８９−１４０１］。
８．ＧＵＳＢ酵素アッセイ：ＧＵＳＢ活性は、記載されているようにＣＳＦにおいて測定された［Ｇｕｒｄａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ８ ２０１５］。
Ｂ．結果
１．イヌにおける脳室内および槽内ベクター送達の比較
リソソーム貯蔵疾患ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）のイヌモデルを用いる我々の以前の研究は、大槽へのＡＡＶ９注射が、全脳および脊髄を効果的に標的化可能であることを実証した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８−１３０７］。この研究では、我々は、成体ＭＰＳＩイヌの大槽または脳側室へ投与されたＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの分布を比較した。３匹のイヌは、ベクター（１．８ｘ１０１３ゲノムコピー）の大槽への単回１ｍＬ注射を用いて治療された。３匹のさらなるイヌは、同じベクターの脳側室への単回ベクター注射を受けた。ＩＣＶ注射により治療されたイヌのために、ベースラインＭＲＩは、注射のためのより大きな脳側室を選択し、標的コーディネートを画定するために、実施された。指定された脳室を正確に標的化するために定位固定フレームを用いて、注射が実施された。
ＩＣベクター注射で治療された３匹のイヌは、研究にわたって、健康であるように見えた。それらは、ベクター体内分布およびトランスジーン発現の評価のために、ベクター注射の２週間後に、安楽死させた。いずれのＩＣ治療イヌにおいても、全般的または顕微鏡的な脳障害は観察されなかった（図１２Ａ〜１２Ｆ）。定量的ＰＣＲによるベクターゲノムの測定は、脳および脊髄のすべての試料領域にわたるベクター堆積を明らかにした（図１３）。ベクターゲノムの分布と一致して、強固なトランスジーン発現が、大脳皮質のほとんどの領域、および脊髄にわたって検出可能であった（図１４Ａ〜１４Ｈ）。脊髄組織学は、胸部および腰部セグメントを好む形質導入の勾配を伴う、アルファ運動ニューロンの強力な形質導入について、明らかであった。
初めにＩＣＶ注射されたベクターを用いて治療された３匹のイヌは、手順後、健康であるようにみえた。しかし、１匹の動物（Ｉ−５６７）は、注射の１２日後に死亡が見出された。他の２匹の動物は、指定された１４日目の剖検時点まで生き抜いたが、１匹の動物（Ｉ−５６５）は、安楽死前に昏迷状態となり、他方（Ｉ−５６８）は、顔面筋の虚弱化を示し始めた。これらの臨床的知見は、有意な全般的な脳病変と相関した（図１２Ａ〜１２Ｆ）。すべての３匹の動物からの脳は、ニードル跡の周囲に変色を示し、死亡が見出された動物では関連する出血を伴った。組織学的評価は、注射部位の周囲の領域において重度のリンパ球性炎症を明らかにした。血管周囲リンパ球性湿潤はまた、各動物の脳にわたって観察された（図１２Ｇおよび１２Ｈ）。免疫学的毒性についてのこの証拠を考慮すると、ＡＡＶ９カプシドタンパク質およびＧＦＰトランスジーンの両方に対するＴ細胞応答が、剖検時にＩＣＶ治療されたイヌの１匹（Ｉ−５６５）から収集された末梢血試料において評価された。インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴは、カプシドペプチドへの応答の証拠はないが、ＧＦＰに対する強力なＴ細胞応答指向を示した（図１２Ｉ）。これは、観察された脳炎が、トランスジーン産物に対する細胞介在免疫応答により引き起こされたことを示唆している。
脊髄形質導入はＩＣコホートにおいて若干大きかったが、ＩＣＶ治療された動物におけるベクター分布は、ＩＣ治療された群において観察されたものと同様であった（図１３）。ＧＦＰ発現は、ＩＣＶ治療された動物において調べられたＣＮＳ領域にわたって、観察された（図１４Ａ〜１４Ｈ）。
２．ＮＨＰにおける腰部穿刺によるＡＡＶ９投与後のＣＮＳ形質導入に対するトレンデレンブルグ位の影響
本発明者らは、以前、ＮＨＰの大槽または腰椎槽へのＡＡＶ９注射を比較し、腰部経路は、脊髄の標的化のために１０倍効率的でなく、脳の標的化のために１００倍効果的でない［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。他の調査者は、その後、注射後に動物をトレンデレンブルグ位に配置することにより成し遂げられるベクターの頭蓋分布の改善を伴う、腰部穿刺によるＡＡＶ９投与を用いてより良好な形質導入を実証した［Ｍｙｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ３１ ２０１４］。このアプローチでは、ベクターは、過剰容量のコントラスト材料中に希釈されて、溶液の比重を増大し、トレンデレンブルグ位にある間に重力に駆動される分布を促進した。６匹の成体カニクイザルは、Ｌ３〜４の間の空間へのＧＦＰを発現するＡＡＶ９の単回注射（２ｘ１０１３ゲノムコピー）を用いて治療された。ベクターは、イオヘキソール１８０コントラスト材料中、最終容量５ｍＬに希釈された。４匹の動物を、注射後すぐに、１０分間、処置台の頭側を−３０°の角度で配置した。１０分後、ＣＳＦにおけるコントラスト分布を確証するために、蛍光画像を獲得した。顕著に、この大量の注射容量を用いると（動物の総ＣＳＦ容量のおおよそ
４０％）［Ｒｅｉｓｅｌｂａｃｈら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９６２；２６７（２５）：１２７３−１２７８］、コントラスト材料は、トレンデレンブルグ位に配置されていない動物においてさえ、全脊椎クモ膜下腔空間に沿って、大脳基底槽へと急速に分布した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。ＰＣＲによるベクターゲノム分布の分析（図１７）およびＧＦＰ発現（図１８Ａ〜１８Ｈ）は、脳および脊髄にわたっての形質導入を実証した。形質導入された細胞の数または分布に対する注射後位置の明らかな影響は存在しなかった。以前報告されたように、髄腔内ＡＡＶ投与後の末梢部へのベクター漏出および肝臓形質導入が存在した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１；Ｈａｕｒｉｇｏｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ａｕｇ ２０１３；１２３（８）：３２５４−３２７１］。肝臓形質導入の程度は、ＡＡＶ９に対する既存の中和抗体（ｎＡｂ）の存在に依存した。６匹の動物のうち４匹は、検出可能なベースラインＡＡＶ９ ｎＡｂｓを有さず（力価＜１：５）、２匹の動物（４０５１および０７−１１）は、１：４０の力価を伴う、ＡＡＶ９に対する検出可能な既存の抗体を有した。以前の結果と一致して、既存の抗体は、肝臓形質導入を遮断し、結果として脾臓への増大したベクター分布をもたらした［Ｗａｎｇら、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｏｖ ２０１１；２２（１１）：１３８９−１４０１が、ＣＮＳ形質導入に対しては影響を有さなかった；Ｈａｕｒｉｇｏｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ａｕｇ ２０１３；１２３（８）：３２５４−３２７１］。
Ｃ．議論
後頭下穿刺は、臨床的実施において一般的な手順ではないので、本発明者らは、脳側室および腰椎槽を含むＣＳＦアクセスというより慣用的な部位を評価した。ここで、本発明者らは、腰部領域からの頭蓋ベクター分布を改善するために、より高い密度を有するベクター溶液を利用する方法、および注射後にトレンデレンブルグ位を利用する方法を評価した。
イヌ研究では、ＩＣおよびＩＣＶベクター注射の両方は、同様に効果的なベクター分布をもたらしたが、脳炎は、ＩＣＶ群においてのみ生じた。ＧＦＰトランスジーンに対するＴ細胞応答は、ＩＣＶ治療されたイヌの１つにおいて、検出可能であったが、これは、これらの動物で観察されたリンパ球性脳炎が、トランスジーン特異的免疫応答に起因したことを示唆している。新規抗原に対するＴ細胞応答の誘導は、２つの要素−ナイーブＴ細胞によるタンパク質からのエピトープの認識と、Ｔ細胞の活性化を促進する炎症性「危険シグナル」とを必要とする。ＡＡＶは先天免疫系を活性化しないため、ＡＡＶは、トランスジーン産物に対する免疫を誘発することなく、外来性トランスジーンを発現することができると考えられ、それ故に、ナイーブリンパ球が新たに発現された抗原に出会った場合に、炎症性シグナルを回避し、免疫性ではなく耐性を促進することができる。外来性トランスジーン産物が発現されるのと同じ位置で生じる、脳実質の貫通の外傷により引き起こされる局所的炎症は、トランスジーン産物に対する免疫応答を誘導するのに必要とされる危険シグナルを提供してもよい。これは、ＩＣ注射によってではなく直接的脳注射により送達されたＡＡＶベクターから発現された酵素に対する細胞介在の免疫応答を発展させる、ＭＰＳＩイヌにおける以前の研究により支持される［Ｃｉｒｏｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．Ａｕｇ ２００６；６０（２）：２０４−２１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ ２０１５；２３（８）：１２９８−１３０７］。そのような免疫応答についての潜在性は、内在的にも産生されるタンパク質を発現するベクターの送達についてトランスジーン産物が外来として認識されるかどうかに依存し、注射により引き起こされる炎症性応答でさえ、自身のタンパク質に対する耐性を打ち破ることができないことがある。内因性タンパク質
に対するトランスジーン産物の類似性は、ＧＦＰに対して観察されたＴ細胞応答の種類の不在に関与する可能性があるので、ＭＰＳ ＶＩＩイヌにおけるＩＣＶベクター送達の研究における結果は、この概念を支持する。同じことが、トランスジーン産物に対して同様のタンパク質の産生を可能とするミスセンス変異を有する劣性疾患を有する患者についても当てはまることがある。したがって、免疫の危険性は、患者集団およびトランスジーン産物に応じて様々であり、幾つかの場合では、免疫抑制は、トランスジーンに対する破壊的Ｔ細胞応答を予防するために必要となり得る。現在の知見は、ＩＣＶ投与経路ではなくＩＣを用いることにより、有害な免疫応答が軽減される可能性があることを示唆している。
ＮＨＰにおける腰部穿刺によるＡＡＶ９投与の研究は、我々がこの投与経路を用いて以前観察したものよりも、ＣＮＳにわたってより大きな形質導入を示した。この違いは、過剰容量のコントラスト材料中にベクターを希釈するために必要であった、本研究における大量の注射容量に起因するようである。以前の研究は、そのような大容量の注射（ＣＳＦ容量のおおよそ４０％）が、注射された材料をサルの大脳基底槽へ直接、さらには室内ＣＳＦへ駆動することができることを示した［Ｒｅｉｓｅｌｂａｃｈ、上記で引用した］。このアプローチを再現するには、患者に慣用的に投与されない非常に大量の注射容量（＞６０ｍＬ）が必要になることを考慮すると、このアプローチをヒトに移行するための実行可能性は不明確である。さらに、この高容量アプローチを用いてさえ、腰部穿刺による注射は、ＩＣ送達を用いた以前の結果よりも効果的ではなかった。この以前の研究では、動物は、体重によって投与され、したがって、ただ１匹の動物が、本明細書で用いられたものと等価なＩＣベクター用量を受けた［Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ ２０１４；１］。その動物は、脳および脊髄において、平均して３倍高いベクター分布を有し、これは、腰椎槽へのさらに非常に大容量のベクター送達でさえ、ＩＣ送達よりも効果的でないことを示す。文献での報告と対照的に、本発明者らは、腰部ベクター注射後に動物をトレンデレンブルグ位に配置することに対してさらなる利点を見出さなかった［Ｍｅｙｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ ３１
２０１４］。
まとめると、これらの知見は、大槽レベルでのベクター投与を支持し、というのも、このアプローチは、腰部穿刺による投与よりも効果的なベクター分布を成し遂げ、ＩＣＶ投与よりもトランスジーン産物に対する免疫危険性が低いようであるからである。大槽へのベクター送達は、前臨床的研究において使用された後頭下穿刺アプローチを用いて臨床的に実施されることができる。追加的に、側室アプローチ（Ｃ１〜２穿刺）を用いる第１および第２頸椎の間のクモ膜下腔空間への注射は、大槽への注射部位の近位に投与されたベクター分布と同様のベクター分布を生じる可能性がある。Ｃ１〜２アプローチは、後頭下穿刺とは異なり、それがＣＳＦアクセスのために、特に髄腔内コントラスト投与のために広く臨床的に使用されるという、さらなる利点を有する。
実施例９：アカゲザルにおける髄腔内注射されたＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｓｅｒｈＩＤＳ．ＲＢＧの非臨床的薬理学的／毒物学的研究
アカゲザルにおける、ヒトＩＤＳをコードするベクター、ＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧの２つの用量の髄腔内投与の安全性を評価するために設計された研究が実施されて、ヒト投与のための最小有効用量（ＭＥＤ）を上回る十分な安全性マージンを得た。
対照品目は、群１に無作為化された一匹のマカクに後頭下穿刺により投与される。試験品目は、群２〜３に無作為化された６匹のアカゲザルに後頭下穿刺により投与される。群
２のサルは、高用量の５ｘ１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）（Ｎ＝３）で試験品目を受け、群３のサルは、１．７ｘ１０１３ＧＣ（Ｎ＝３）の低用量で投与された試験品目を受ける。一般的な安全性パネルの一部として、血液および脳脊髄液が収集される。
ベクター投与後９０±３日にてこれらの研究の生前フェーズが完了した後、サルは犠牲にされ、組織は、包括的な組織病理学的検査のために回収された。リンパ球は、肝臓、脾臓、および骨髄から回収されて、剖検時にこれらの器官における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在が調べられる。
Ｉ．実験設計
Ａ．材料
試験品目−ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳはまた、ＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧとしても知られており、ＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧ．ＫａｎＲとしても知られている。これらの命名は同義であり、互換的に使用されることができる。
試験品目は、５．７２ｘ１０１３ＧＣ／ｍｌの濃度を伴う単回ロットとして産生され、この濃度はドロップレットデジタル（ｄｄ）ＰＣＲを使用して測定される。ベクターは、産生後、注射日まで、≦−６０℃で貯蔵される。注射日に、ベクターは、対照品目を用いて希釈される。希釈されると、ベクターは、注射時まで、冷蔵庫または湿った氷上で２〜４℃で貯蔵される。ベクター調製は、注射日に実施される。
対照群動物は、対照品目Ｅｌｌｉｏｔ製剤緩衝液（ＥＦＢ）を投与され、試験品目（ＥＦＢ＋０．００１％のプルロニックＦ６８）は投与されない。対照品目は、産生後、注射日まで、室温で貯蔵される。
Ｂ．試験系
試験系選択についての根拠：この研究は、ＣＮＳ疾患のための遺伝子療法ベクターの髄腔内（ＩＴ）送達を含む。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＣＮＳのディメンションは、我々の臨床的標的集団の裁量の代表的モデルとして機能を果たす。この研究は、ＩＴ注射後のベクターの用量関連毒性についてのデータを提供する。
Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．（Ａｌｉｃｅ、ＴＸ）により供給された７匹の３〜１０ｋｇの体重を有する３〜７歳の雄アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）が使用される。
ＩＩ．一般的設計手順
７匹のアカゲザル（雄）を研究で用いる。動物を、表１に列挙されるように、３つの研究群に分ける。すべての７匹の動物は、後頭下穿刺によりＩＴ注射を受ける。
動物は麻酔され、大槽内への後頭下穿刺により試験品目を投与される。
麻酔されたサルは、処置室で準備され、蛍光透視スイートに移動され、撮影用の台上に側臥位で配置され、ＣＳＦ収集および大槽への投与のために頭部灌流された。注射部位は無菌で準備される。無菌技法を用いて、２１〜２７ゲージ、１〜１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦ流れが観察されるまで、後頭下空間へと前進させた。最大１．０ｍＬのＣＳＦを、投与前に、ベースライン分析のために収集する。横切られる解剖構造は、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜および環椎後頭筋膜を含む。ニードルは、血液の汚染および潜在的な脳幹損傷を回避するために、より広範囲の大槽の上部空隙へ指向される。ニードル穿刺の正確な配置は、透視装置（ＯＥＣ９８００ Ｃ−Ａｒｍ、ＧＥ）を用いる脊髄造影法により確認される。透視装置は、製造元の推奨条件に従って操作される。ＣＳＦ収集の後、ルアーアクセス延長カテーテルは、脊椎ニードルに連結されて、イオヘキサール（商標名：Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）コントラスト培地および試験または対照品の投与を促進する。１ｍＬのイオヘキソールが、カテーテルおよび脊椎ニードルを介して投与される。ニードル配置を確認した後、試験品目を含有するシリンジ（１ｍＬに等価な容量ならびにシリンジおよびリンカーのデッドスペース容量）は、可撓性リンカーに連結されて、２０〜６０秒間にわたってゆっくりと注射される。ニードルは除去され、直接的圧力が穿刺部位に適用される。注射機器中に残っている残留試験品目は、収集され、≦−６０℃で貯蔵される。
動物の大槽内へ首尾よく投与することができない場合には、Ｃ１〜Ｃ２の髄腔内空間（環椎−軸椎関節）への投与が、投与の代替的部位として使用され得る。投与手順は以下の通りである。動物は、側臥位で配置され、ＣＳＦ収集およびＣ１〜Ｃ２髄腔内空間への投与のために頭部灌流される。注射部位は無菌で準備される。無菌技法を用いて、２１〜２７ゲージ、１〜１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦ流れが観察されるまで、髄腔内空間へと前進させた。最大１．０ｍＬのＣＳＦを、投与前に、ベースライン分析のために収集する。横切られる解剖構造は、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜筋膜を含む。ニードルは、血液の汚染および脊髄頸部への潜在的な損傷を回避するために、Ｃ２脊椎上部から脊椎空間中へと挿入される。残りの手順は、大槽投与について以前に記載されたものと同様である。
動物は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳまたは対照品目のいずれかの髄腔内注射を受ける。投与の頻度は、表３に概説されている。高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳは、５ｘ１０１３ＧＣであり、低用量は、１．７ｘ１０１３ＧＣである。サルあたり注射される希釈されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳまたは対照品目の総容量は、１ｍＬである。
ＩＩＩ．結果
ＣＳＦにおける白血球細胞数として示されるように、ＣＳＦ髄液細胞増加が、高用量治療された群（群２）では３匹のうち２匹の動物で観察され、低用量治療された群（群３）では３匹のうち１匹の動物で観察された（図２８）。このような髄液細胞増加は、１匹の高用量治療された動物（ＲＡ２２０３）を除くすべての動物において９０日目に解決された。
加えて、脊髄後柱軸索障害が存在する（データは示されていない）。
ある実施形態では、低用量は、１．９ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳重量に対応し、高用量は、９．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳重量である。ある実施形態では、高用量は、５．６ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳重量に対応する。他の実施形態では、低および高用量は、１．３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量および６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量にそれぞれ対応する。ある実施形態では、投与された産物の総容量は、５ｍＬを超えない。
抗−ｈＩＤＳ抗体のＥＬＩＳＡアッセイは、上記した動物から収集された血清試料について実施された。６０日目に得られた結果は、図２９においてプロットされ、下記の表２に示される。ＣＳＦ試料は、抗−ｈＩＤＳ抗体のＥＬＩＳＡアッセイによる評価のために２０倍希釈される。結果は、表３に示される。血清およびＣＳＦの両方において、高用量のもの（群３）と比較して、減少した免疫原性が、低用量治療された群（群２）において観察された。ｈＩＤＳに対する免疫原性は、治療されていない対照では観察されなかった。
実施例１０：免疫抑制されたアカゲザルにおける髄腔内注射されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの非臨床的薬理学的／毒物学的研究
アカゲザルにおける、ヒトＩＤＳをコードするベクター、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳの２つの用量の髄腔内投与の安全性に対する化学的に誘導された免疫抑制（ＩＳ）の影響を評価するために設計された研究が、実施される。研究は、実施例９に記載されたものに下記の修正を加えたものである。
対照品目を投与された動物は、実施例９のものを繰り返す。試験品目は、群１〜２に無作為化された６匹のアカゲザルに後頭下穿刺により投与される。群１のサルは、高用量の５ｘ１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）（Ｎ＝３）で試験品目を受け、群２のサルは、１．７ｘ１０１３ＧＣ（Ｎ＝３）の低用量で投与された試験品目を受ける。一般的な安全性パネルの一部として、血液および脳脊髄液が収集される。群１および２からのサルは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳ投与の少なくとも２週間前に、および投与後の最大６０日目までに（６０日目を含む）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を受け、投与の少なくとも２週間前、および投与後の最大９０日目（９０日目を含む）（＋／−３日）までに、ラパマイシンを受ける。両方の免疫抑制薬についての血漿トラフレベルは、モニターされ、ミコフェノール酸（ＭＰＡ、ＭＭＦの活性代謝物）について２〜３．５ｍｇ／Ｌ、およびラパマイシンについて１０〜１５μｇ／Ｌの範囲を維持するように、用量調整される。
ベクター投与後９０±３日にてこれらの研究の生前フェーズが完了した後、サルは犠牲にされ、組織は、包括的な組織病理学的検査のために回収された。リンパ球は、血液、脾臓、および骨髄から回収されて、剖検時にこれらの組織における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在が調べられる。
Ａ．材料
試験品目、対照品目、それらの調製は、実施例９に記載されている。
Ｂ．試験系
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）を利用し、実施例９に記載されているように保持した。６匹の動物のコホート（６匹の雄）を研究のために用いる。動物を、最小ＩＤ〜最高ＩＤの１〜６の番号に割り当てる。ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇにより、番号１〜６の無作為リストを作成し、無作為化されたら、動物を以下のように割り当てる：群１は、３匹の動物に割り当てられ、群２は、３匹の動物に割りてられた。
Ｃ．一般的設計手順
試料サイズおよび群の命名：
６匹のアカゲザルを研究に用いる。表４に列挙されるように、動物を、２つの研究群に分ける。すべての６匹の動物は、後頭下穿刺によりＩＴ注射を受ける。
免疫抑制レジメンは、群１および２のすべての動物に投与される。動物の各群についての薬物組み合わせ、用量、および投与スケジュールを表５に要約する。免疫抑制に関連する日和見感染が存在する場合にはそれらを治療するために、動物は、全身性抗生剤および／または抗真菌剤を用いて治療されてもよい。
動物は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）およびラパマイシンの組み合わせ療法を用いて投与される。両方の免疫抑制薬は、麻酔下のサルまたは意識はあるが椅子に拘束されたサルに、経口胃フィードチューブまたは鼻腔胃フィードチューブを通して投与される。麻酔下の動物は、チューブからの胃内容物の吸引が可能であるために絶食されていない（正確な配置の確認）。免疫抑制レジメンは、試験品目の髄腔内投与の少なくとも２週間前に開始する。ＩＳ薬物の開始用量は、アカゲザルにおいて以前に記載された有効性に基づき、他の研究のためのＧＴＰで以前使用された用量に基づき、血漿トラフレベルモニタリングに基づいて調整される。
免疫抑制の第１日目の動物の体重を用いて、初期用量を計算する。次いで、動物は毎朝計量され、体重が＋／−１０％を超えて変化する場合には用量を再計算する。
トラフレベルは、初め週２回モニターされ、６０日目後（ラパマイシンのみが投与される）は週１回モニターされる。
ｃ．ＩＳ薬物
ラパマイシンは、髄腔内投与前の最低１４日、および研究の９０日目（９０日目を含む）（＋／−３日）まで、０．５〜４ｍｇ／ｋｇＰＯ、ＳＩＤの用量で投与される。開始用量は、１ｍｇ／ｋｇである。ラパマイシン用量は、研究期間中、可能な限り１０〜１５μｇ／Ｌに近い標的トラフレベルを維持するように算出される。標的トラフ薬物レベルが１週間以内に達成されないならば、用量は、０．２５〜２ｍｇ／ｋｇ用量間隔に用量設定される。安定化期間の後、トラフレベルが２つの連続する採血について低すぎる場合は、調整がなされる。それらが高すぎる場合は、即時の調整がなされる。
ＭＭＦは、髄腔内投与前の最低１４日間、および研究の６０日目（６０日目を含む）まで、５０ｍｇ／ｋｇＰＯ、ＢＩＤの開始用量で、投与される。次いで、トラフレベル結果を用いて、用量を調整して、５〜２５ｍｇ／ｋｇの用量間隔に用量設定する。ＭＰＡについてのトラフレベルは、可能な限り２〜３．５ｍｇ／Ｌに近づくように維持される。安定化期間の後、トラフレベルが２つの連続する採血について低すぎる場合は、調整がなされる。それらが高すぎる場合は、即時の調整がなされる。
ｄ．ＩＳ薬物の製剤
ＭＭＦは、２００ｍｇ／ｍＬの濃度で、商業的に入手可能な経口溶液を用いて試験系に経口投与される。
ラパマイシンは、以下の商業的に入手可能な製剤なうちの１つ以上を用いて、試験系に経口投与される：０．５ｍｇのコーティング錠剤、１ｍｇのコーティング錠剤、２ｍｇの
コーティング錠剤。
ピル製剤を投与する場合、錠剤は、以下のように調製される：
各ラパマイシンピルは、錠剤の外側コーティングを溶解させるために、室温水または温水（必要ならば温水を用いて溶解を加速させる）のいずれかの希釈剤中に置かれる。おおよそ１０ｍＬの水が使用される。ピルは、黄色コーティングの下側は白色である。
外側コーティングが溶解されると、各ピルを乳鉢と乳棒を用いて細かい粉末になるまで粉砕し、均一な溶液を作成する。錠剤（複数可）を溶解するために使用される希釈剤の総容量は、研究記録に記録される。
全混合物は、用量シリンジ中に引き込まれ、本実施例で以前記載されたように、ＯＧまたはＮＧチューブを通して投与される。
ＭＭＦおよび／またはラパマイシンの投与後、経口胃または鼻腔胃フィードチューブは、飲料水をフラッシュされる。フラッシュ容量は、研究記録に記録される。
以下の研究を実施して、ＭＰＳＩＩマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳの脳室内（ＩＣＶ）送達の有効性を評価し、最小有効用量を決定した。有効性は、ベクターに対する薬力学的応答の証拠（酵素的活性のあるｈＩＤＳタンパク質の産生）、およびＭＰＳＩＩ疾患（ＩＤＳ欠損）の行動学的および組織学的兆候に対する効果に基づいた。
この研究は、化学的に免疫抑制されたアカゲザルにおいて、画像ガイド下後頭下穿刺による投与後最高９０日間のヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードするベクターであるＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳの２用量レベルの安全性、体内分布、および薬理学を評価した。対照品目は、免疫抑制されていない一匹のマカクに後頭下穿刺により投与される。ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳは、群１〜２に無作為化された５匹のアカゲザルに後頭下穿刺により投与された。群１のサルは、高用量（ＨＤ）の５ｘ１０１３ゲノムコピー、ＧＣ（ｎ＝３）で試験品目を受け、群２のサルは、１．７ｘ１０１３ＧＣ（ｎ＝３）の低用量（ＬＤ）で投与された試験品目を受けた。血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）は、ベースライン、７、１４、２１、３０、４５、６０、および９０日目の一般的な安全性パネルの一部として収集された。トランスジーン産物ｈＩＤＳおよびＡＡＶ９カプシドに対する液性応答、ならびにｈＩ２Ｓ酵素活性は、同じ時点で、血清およびＣＳＦにおいて分析された。トランスジーン産物ｈＩ２ＳおよびＡＡＶ９カプシドに対するＴ細胞応答は、ベースライン、３０、６０、および９０日目に血液中で評価され、９０日目に脾臓および骨髄で評価された。ベクターゲノムは、ベースライン、７、１４、２１、３０、４５、６０、および９０日目に全血およびＣＳＦ中で定量化され、ベースライン、５、３０、および９０日目に尿および排泄物（排出）中で定量化された。ベクター投与後９０±３日にて研究の生前フェーズが完了した後、サルは犠牲にされ、組織は、さらなる評価のために回収された。ベクターゲノムの組織病理学的評価および体内分布は、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、および末梢器官からの組織の包括的リストにおいて実施された。
投与手順に関連したＡＥは存在せず、臨床的一般的観察、体重変化、器官重量、ＣＢＣ、血清化学、または凝固パラメータに対するＡＡＶ９．ＣＢ．ＨＩＤＳに関連する異常さも存在しなかった。ＩＳ手順は、幾つかの炎症パラメータの増大に伴う腸の徴候、およびＡＡＶ９．ＣＢ．ＨＩＤＳ投与に関連しない貧血を引き起こした。ＬＤ群からの１匹の動物（ＲＡ２２３３）のみが、剖検日に、リンパ球性ＣＳＦ髄液細胞増加（μＬあたり２３細胞）を有した。
ｈＩ２Ｓに対する液性免疫応答は、ＩＳにより効果的に予防され、他の動物における最小限の応答に対して、存在しないか、または軽減された。ＩＳ動物においてｈＩ２Ｓに対するＴ細胞応答は存在せず、ＬＤ群のみにおいてＡＡＶ９に対して最小限〜中程度の応答であった。６０日目のＭＭＦの引き抜き後に、免疫応答のリバウンドは見られなかった。
ベクター投与後に軽度のＡＡＶ９ Ｎａｂ応答が存在し、これは、ＨＤ動物においてよりもＬＤ動物においてより明らかであった。ＩＳは、ＬＤ動物のＡＡＶ９ Ｎａｂ応答に対する明確な効果は有さなかったが（ＩＳおよび非ＩＳ動物の両方において低い）、ＨＤ動物のＡＡＶ９ Ｎａｂ応答の調節において効果的であるようだった。
ＩＳは、ＡＡＶ９．ＣＢ．ＨＩＤＳで治療されたＨＤおよびＬＤ動物の両方においてＣＳＦ ＡＡＶ９ Ｎａｂ応答を完全に予防した。
治療に関連した知見は、高用量および低用量群の両方において同様に観察され、最小限〜軽度の脊髄白質後索および坐骨神経の軸索障害からなった。白質後索および三叉神経節に突出する後根神経節における、単核性細胞湿潤を用いた最小限〜軽度のニューロン細胞体の変性は、一般に研究＃２と同様であり、したがって、化学的に誘導された免疫抑制は、これらの知見に影響を与えなかった。
高いベクターコピー数の存在に関わらず、脳または脊髄内に炎症は見られなかったが、これは、高度に血管新生され、中枢神経系とは異なり保護的な血液脳関門を欠失している、後根神経節の解剖学的特異性を反映しているようだ［Ｓａｐｕｎａｒ Ｄら、Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ−ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｐａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２；５：３１−３８．ｄｏｉ：１０．２１４７／ＪＰＲ．Ｓ２６６０３．］。
高レベルのＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ９．ＣＢ．ＨＩＤＳで治療されたすべての動物の脳、脊髄、および後根神経節にわたって検出され、平均して全ＣＮＳおよび後根神経節試料にわたって低用量群では２ｘ１０５ＧＣ／μｇＤＮＡおよび高用量群では３．４ｘ１０５ＧＣ／μｇＤＮＡを産生した。有意なベクター体内分布はまた、末梢部、特に、肝臓において見出され、ＨＤ動物についてはＣＮＳよりも約１０高いレベルを有し、ＬＤ動物についてはＣＮＳと等価なレベルを有した。最も形質導入されなかった器官は、眼、腎臓、睾丸、および甲状腺であり、甲状腺での５４ＧＣ／μｇＤＮＡ〜腎臓での８，５４０ＧＣ／μｇＤＮＡの平均レベルを伴った。
１匹の動物（ＲＡ２２３３）は、既存のＡＡＶ９ ＮＡｂ（ベースライン力価１：４０）を有し、それは、肝臓、眼、心臓、肺、睾丸、および甲状腺の形質導入を完全に阻害した（ゲノムコピー非検出）が、ＣＮＳおよびＰＮＳベクター体内分布は、影響されなかった。ＣＮＳ、ＰＮＳ、および末梢器官におけるベクターゲノムコピーの存在に対応して、Ｉ２Ｓ活性は、血清中では１匹を除くすべての動物において、ＣＳＦ中ではすべての動物において、ベースラインを超えて急激に増大し、これは、ＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＩＤＳが、髄腔内治療された動物のＣＳＦおよび血清中の両方に存在する機能的Ｉ２Ｓ酵素を発現していることを示す。
ベクターＤＮＡは、ＡＡＶ９．ＣＢ．ＨＩＤＳ投与された動物から収集されたすべての血液試料中に存在し、７日目でピークとなる。ベクターＤＮＡのレベルは経時的に低下したが、研究．の試験品目投与後の最終時点である９０日目までに完全に陰性とはならなかった。
ベクターＤＮＡは、最も初期の時点を含めて、ＣＳＦ中よりも血液中により豊富にあり、これは、ＣＳＦから血液コンパートメントへの急激な移入を示す。
ベクターＤＮＡ排出は、ほとんどの場合胆汁クリアランスを通して生じるので、より高いゲノムコピー値が尿中よりも排泄物中で検出された。排出は、尿中（５日目まで）よりも排泄物中（３０〜９０日目まで）でより持続した。
実施例１１：ＭＰＳＩＩのマウスモデルにおける脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの有効性
Ｉ．概要
ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタンおよびヘパラン硫酸のリソソーム異化作用に関与する酵素イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の欠損により引き起こされる、Ｘ連鎖性遺伝疾患である。この欠損は、未分解ＧＡＧの細胞内蓄積に至り、結果的に進行性の重度の臨床的表現型をもたらす。遺伝子療法および体細胞療法を含む、疾患のための可能な治療的戦略を同定するために、多くの試みが、最近の２０〜３０年でなされてきた。研究は、ＭＰＳＩＩのマウスモデルにおいて、ヒトＩ２Ｓを発現するＡＡＶ９ベクターであるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの単回脳室内（ＩＣＶ）投与の短期間（２１日間）体内分布、発現、および活性を評価するために、実施された。ＭＰＳＩＩのマウスモデルにおいて、ＩＣＶ経路を通して単回用量として投与されるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの最小有効用量（ＭＥＤ）を決定するために、注射後（ｐｉ）３か月の観察期間を伴って、さらなる研究が設計され、実施された。研究はまた、幾つかの安全性エンドポイント（トランスジーンに対する液性免疫応答および脳組織病理学の評価）を含んだ。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧは、０日目に、３ｘ１０８ＧＣまたは３ｘ１０９ＧＣまたは３ｘ１０１０ＧＣの用量で（ベクターを滴定するｑＰＣＲにより決定された）、２〜３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｉ２Ｓ γ／−（ＭＰＳＩＩ）マウス（１６匹の雄／群）の脳室内に投与された。２１日目に、群３〜５からのマウス（表６）は、安楽死され、ＣＮＳ Ｉ２Ｓ活性、体内分布、および抗−ｈＩ２Ｓ免疫原性の評価のために剖検された。６０日目〜８９日目に、野生型マウスおよび未治療ＭＰＳＩＩマウスは、一連の神経行動学的アッセイ（オープンフィールド、Ｙメイズ、コンテキスト恐怖条件付け、および新規物体認識）において評価され、これらのエンドポイントでの効果および疾患状態を特徴付けた。これらの初期アッセイの結果に基づいて、残りの治療されたマウスが、長期記憶を評価した２つのアッセイ（コンテキスト恐怖条件付けおよび新規物体認識）において評価された。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧのＩＣＶ投与のおおよそ３ヶ月後、すべての残りのマウスは、安楽死され、剖検された。血清およびＣＳＦは、Ｉ２Ｓ活性について評価され、ならびに血清は、抗−Ｉ２Ｓ抗体について評価された。肝臓および心臓は、ＧＡＧ組織含有量について評価された。脳全体的リソソーム貯蔵（主要なＧＡＧ貯蔵および二次的ガングリオシド貯蔵の両方）は、ＬＩＭＰ２およびＧＭ３の免疫組織学的染色により評価された。組織ヘキソサミニダーゼレベルは、ＭＰＳＩＩマウスおよびＭＰＳＩＩ患者においてより高く、リソソームホメオスタシス崩壊のバイオマーカーとなり得ることが示された。故に、組織ヘキソサミニダーゼ酵素活性は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧ投与に二次的であるリソソーム機能のバイオマーカーとして測定された。有効性および安全性の両方を調査するために、脳の組織病理学が評価された。
Ｃ５７ＢＬ／６ Ｉ２Ｓ γ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスへの最高３ｘ１０１０ＧＣ（ｄｄＰＣＲ方法により５．２ｘ１０１０ＧＣ）でのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧのＩＣＶ投与は、十分寛容化されており、臨床的徴候または死亡を伴わず、ＣＮＳおよび末梢組織、特に肝臓への分布をもたらし、故に、注射されたウイルス粒子のＣＳＦから末梢血への部分的な再分布を実証した。
ベクター検出により証拠付けられるような脳におけるＩ２Ｓ遺伝子発現の証拠、ならびに注射後（ｐｉ）２１日目での脳における、および注射後３ヶ月でのＣＳＦにおけるＩ２Ｓ活性の用量依存性増大が存在し、最も高い用量（脳組織）では野生型に近接する酵素活性を伴い、中および高用量（ＣＳＦ）では野生型に相当するそれよりも高い酵素活性を伴った。すべての用量で注射後（ｐｉ）３ヶ月でのＣＮＳにおけるＬＩＭＰ２およびＧＭ３染色における減少により示されるように、リソソーム画分の用量依存的正常化が存在した。Ｈ＆Ｅ染色された脳セクションでは、ＭＰＳＩＩＣＮＳ表現型の指標である、両染性細胞巣材料のグリア空胞化およびニューロン蓄積の量および頻度における用量依存的減少も観察された。ＣＮＳリソソーム含有量における変化、およびＨ＆Ｅ染色されたセクションにおける疾患関連形態の改善に対応して、長期記憶（新規物体認識、ＮＯＲ）の１つの測定において改善が存在したが、他のコンテキスト恐怖条件付け（ＣＦＣ）では改善が存在しなかった。ＮＯＲの改善では明らかな用量応答はみられなかった。
血清Ｉ２Ｓ活性における用量依存性増大は、注射後（ｐｉ）３ヶ月で観察され、中および高用量において野生型に相当するか、またはそれよりも高い酵素活性を伴った。血清中のＩ２Ｓ活性の正常化を反映して、治療されたＭＰＳＩＩマウスは、肝臓および心臓におけるヘキソサミニダーゼ活性およびＧＡＧ含有量における用量依存的減少を有した。肝臓ヘキソサミニダーゼおよびＧＡＧレベルは、肝臓ではすべての用量レベルで正常化され、心臓では中および高用量で正常化された。高度に形質導入された肝臓（二倍体ゲノムあたり１〜１０ＧＣ）は、おそらく、血清中のＩ２Ｓの分泌のための貯蔵器官として作用し、より高い用量では、心臓のクロス補正を行う。
ＩＣＶ投与手順それ自体に関連する変化が一部のマウスで観察されたが、脳における試験品目に関連する毒性の証拠は存在しなかった。トランスジーンに対する液性免疫応答はごくわずかであり、一部の中および高用量動物においてのみ観察されたが、これらの動物の健康または脳組織病理学に影響は与えなかった。
結論付けると、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＩＤＳ．ｒＢＧは、すべての用量レベルでＭＰＳＩＩマウスにおいて十分に寛容化され、ＭＰＳＩＩのＣＮＳおよび末梢パラメータの両方における改善に関連したＩ２Ｓレベル（発現および酵素活性）の用量依存性増大をもたらした。投与された最も低用量の３ｘ１０８ＧＣ（５．２ｘ１０８ＧＣ ｄｄＰＣＲ法）は、この研究での最小有効用量であった。
ＩＩ．材料および方法
Ａ．ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧとして同定された試験品目は、透明、無色の液体であり、ｑＰＣＲにより測定された場合に１．１８ｘ１０１３ＧＣ／ｍＬの、ｄｄＰＣＲにより測定された場合に２．０５７ｘ１０１３ＧＶ／ｍＬの力価を伴う。エンドトキシンは、＜１．０ＥＵ／ｍＬである。純度は１００％である。試験品目は、≦−６０℃で貯蔵された。
Ｂ．用量製剤および分析
１．試験品目の調製：
試験品目は、滅菌リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を用いて、各用量群のために適切な濃度まで希釈された。希釈されたベクターは、湿った氷上で保管され、希釈の４時間後に動物へ注射された。
Ｃ．試験系
ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｉ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ表現型、Ｎ＝５６、雄）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｉ２Ｓγ／＋（野生型表現型、Ｎ
＝８、雄）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ストック番号０２４７４４）から元々得られたストックから、ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＴＲＬ）の動物施設において繁殖された。動物は、０日目（投与日）に２〜３ヶ月齢であった。
Ｄ．実験設計
１．研究Ｗ２３５６
０日目に、３〜５群からのすべての動物（１６匹の雄／群、Ｗ２３５６およびＷ２３０１研究を合わせて）に、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧをＩＣＶ投与した。２１日目に、マウス／３〜５群からの群（８匹の雄／群、Ｗ２３５６研究）を安楽死させ、剖検に供し、脳、心臓、肺、肝臓、および脾臓を収集し、脳Ｉ２Ｓ活性および組織ベクター体内分布の評価のために、ドライアイス上で軽く凍結した。
２．研究Ｗ２３０１
０日目に、３〜５群からのすべての動物（１６匹の雄／群）に、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧをＩＣＶ投与した。注射後（ｐｉ）２〜３ヶ月：群１および２からの動物（８匹のマウス／群）を、オープンフィールド活動、Ｙメイズ活動、コンテキスト恐怖条件付け、および新規物体認識を含む一連の神経行動学的アッセイにおいて評価し、これらのエンドポイントにおいて疾患状態（ＭＰＳＩＩ遺伝子型）の効果が存在するかを決定した。疾患の明らかな効果が観察される場合、８匹のマウス／群３〜５からの群もまたそのアッセイにおいて評価され、ベクターを用いた治療が応答に対して効果を有するかどうかを決定した。
群１〜５からの動物（神経行動学的アッセイにおいて評価されたのと同じ動物、８匹のマウス／群）は、深く麻酔をかけられ（ケタミン−キシラジン）、血清およびＣＳＦ Ｉ２Ｓ活性および血清抗−ｈＩ２Ｓ抗体の評価のために、ＣＳＦ（大槽穿刺）および血液（心臓穿刺）を収集した。次いで、マウスを安楽死させ、剖検に供し、試料を、脳組織病理学、脳リソソーム貯蔵（免疫組織化学および画像分析により評価される）、肝臓および心臓ヘキソサミニダーゼ活性、ならびに肝臓および心臓ＧＡＧ含有量（組織含有量により評価される）のために収集した。
３．試験品目の投与
ＩＣＶ経路は、最小限に侵襲的であり、マウスにおいて手術処置を必要としないので（首の皮膚および筋肉の切開が必須である大槽経路と比較して）、ＩＣＶ経路を選択した。マウス活動記録を含む幾つかの神経行動学的エンドポイントを含んだので、生存手術を含まない非侵襲的な注射は好ましいものであった。マウスおよび大型動物の両方において、脳脊髄液（ＩＣＶまたは大槽）へのＡＡＶ９の単回注射は、全ＣＮＳ内のニューロンを標的とすることが、本発明者らおよび他者らによって以前実証された（Ｄｉｒｒｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２５、１０９−１２０（２０１４）；Ｓｎｙｄｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２、１１２９−１１３５（２０１１）、Ｆｅｄｅｒｉｃｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９、８５２−８５９（２０１２）、Ｈａｕｒｉｇｏｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３、３２５４−３２７１（２０１３）、Ｂｕｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１、５２２−５２８（２０１４）、Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ：２２、２０１８−２０２７（２０１４）、およびＭｏｌ
Ｔｈｅｒ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １、１４０５１（２０１４）］。Ｈａｕｒｉｇｏｔらにより公開されたデータ（２０１３）は、別のリソソーム貯蔵疾患のコンテキストにおいてＩＣＶと大槽注射との比較を詳しく述べており、２つの投与経路が、ト
ランスジーン発現および体内分布の点で等価であることを実証している。
容量拘束（成体マウスにおけるＩＣＶ注射のために５μＬ）に起因して実行可能な最大用量は、マウスあたりおおよそ６ｘ１０１０ＧＣであった（ｑＰＣＲ滴定法）。他のＭＰＳの治療についてＧＴＰで得られた以前の結果に起因して、およびより大型な動物へのスケーラビリティに関する懸念に起因して、ベクターは、マウスあたり３ｘ１０１０、３ｘ１０９、または３ｘ１０８ＧＣ（ｑＰＣＲ滴定法）を注射するために希釈された。ｄｄＰＣＲ法に基づいて、実際の用量は、マウスあたり５．２ｘ１０１０、５．２ｘ１０９、および５．２ｘ１０８ＧＣであった。若年成体Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける０．４ｇの平均脳質量を考慮すると（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｏｕｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔａｆｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｓｅｃｏｎｄ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅａｒｌ Ｌ．Ｇｒｅｅｎ Ｅｄｉｔｏｒ）、これは、最大用量では脳質量１グラムあたり１．３１ｘ１０１１ＧＣに等価であり、最低用量では、脳質量１グラムあたり１．３１ｘ１０９ＧＣに等価である。
ベクターは、右脳側室へＩＣＶ投与された。イソフルランを用いてマウスを麻酔した。麻酔された各マウスは、後頭部の皮膚をたるませることによりしっかりと握られ、３ｍｍの深さまで挿入されるように調整された２６ゲージニードルを装着したＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、自由に前方および側方へ手を動かしながら、前項（ｂｒｅｇｍａ）に注射された。注射方法は、マウスにおいて色素または物質Ｐを右脳側室に注射することにより、以前確認されたものであった。成功したかどうかは、青色色素の視覚化として、または脳脊髄液への注射後のマウスの掻痒行動（物質Ｐ投与の後）により画定された。
Ｆ．手順、観察、および測定
動物は、病的状態／死亡について、毎日モニターされた。動物は、一般的な外観、毒性の徴候、行動における苦痛および変化について、毎日、ケージ横からの視覚的観察によりモニターされた。これらのデータは、この非ＧＬＰ研究に記録されなかった。
６０日目〜９０日目（ベクター投与の２〜３ヶ月後）に、研究Ｗ２３５６の群１および２からの８匹の動物は、行動学的および神経認知試験に供され、これらのエンドポイントにおける遺伝子型の効果を決定した。遺伝子型の効果が同定されたら、さらなる試験が、研究Ｗ２３５６群３〜５からの８匹の動物を用いてなされ、治療の効果があるかどうかを決定した。すべての行動手順は、遺伝子型および群に対して盲検の操作者により実施された。
一般的な運動（オープンフィールド活動）：
オープンフィールドにおける自発的活動が、光ビーム活動システム（ＰＡＳ）−オープンフィールド（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定された。このアセスメントでは、単一の１０分間トライアルの間、マウスは個別に、アリーナに配置された。一般的な運動および飼育活動を評価するために、平方向および垂直方向のビームブレイクが収集された。
ｂ）短期記憶（Ｙメイズ活性）：
Ｙメイズ自発的変更は、げっ歯類の新規環境を探索する意欲を測定するための行動学的試験である。試験は、互いに１２０°の角度で３本の白色不透明のプラスチックアームを有する、Ｙ形状のメイズで行われた。メイズの中心に導入された後、動物は、３本のアームを自由に探索することを許可される。げっ歯類は、典型的に、以前訪問したものへ戻るよりも、メイズの新規アームを探索することを好む。複数のアームエントリの経過にわたって、対象は、最近訪問したアームへ入る回数が減る傾向を示すはずである。変更のパーセンテージを算出するために、アームエントリの数および三つ組の数を記録する。エント
リは、アーム内に四肢のすべてが存在するものとして定義される。この試験は、マウスのトランスジェニック系統における認知欠損を定量し、新規化学物質の認知を認知に対するそれらの効果について評価するために、使用される。海馬、隔膜、前脳基底膜、および前頭前皮質を含む脳の多くの部分がこのタスクに関与している。この研究では、標準的なＹ形状メイズ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、８分間のトライアルの間のアームエントリの順番および数を記録した。自発的変更（ＳＡ）は、以前に入れたアームを即時に引き戻すことなく、メイズのすべての３本のアームへの連続的エントリとして、定義された。アームエントリの総数（ＡＥ）は、運動活動の尺度として収集された。自発的変更パーセントは、％ＳＡ＝（ＳＡ／（ＡＥ−２）＊１００）として算出された。
ｃ）長期記憶（コンテキスト恐怖条件付け）：
これらのタスクでは、動物は、条件付けされていない嫌忌的刺激（ＵＳ）、通常はフットショックを用いる時間的関連性のために、新規環境、またはトーンなどの感情的に中立の条件付け刺激（ＣＳ）を怖がるよう学習する。同じコンテキストまたは同じＣＳに曝露されたとき、条件付けされた動物は、フリーズ行動を示す（Ａｂｅｌら、Ｃｅｌｌ ８８：６１５−６２６．１９９７）。訓練日に、マウスに、独自の条件付けチャンバー（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ）を３００秒間探索させた。３００秒の期間のうち２４８〜２５０秒間、シグナルなしの１．５ｍＡの連続的なフットショックが加えられた。チャンバーにおいてさらなる３０秒後、マウスは、各自のホームケージへ戻された。２４時間後、訓練が行われるのと同じチャンバー内で、連続５分間、空間的コンテキストの回想が評価された。フリーズ行動をスコア付けするために使用されるソフトウェアを用いて、記憶が評価された（Ｆｒｅｅｚｅｓｃａｎ、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓ Ｉｎｃ）。訓練セッションの２．５分間の刺激前時期（フットショックの実施前）におけるフリーズパーセントが、チャンバーに再度曝露された際のフリーズパーセントと比較される。フリージングにおける増大は、フットショックの回想（すなわち、学習が存在したこと、および動物がチャンバーとフットショックを関連付けたこと）を示す。
ｄ）長期記憶（新規物体認識）：
新規物体認識（ＮＯＲ）タスクを用いて、ＣＮＳ障害のげっ歯類モデルにおける認知、特に、認知記憶を評価する。この試験は、げっ歯類が馴染みにある物体よりも新規物体を探索するのにより多くの時間を過ごす自発的傾向に基づく。新規物体を探索するという選択は、学習および認知記憶の使用を反映している。新規物体認識タスクは、一般に高さおよび容積が一致しているが、形状および外観が異なっている２つの異なる種類の物体を有するオープンフィールドアリーナにおいて実施される。慣らしの間、動物は、何もないアリーナを探索することを許可される。慣らしの２４時間後、動物は、等しい距離に配置された２つの同一物体を有する馴染みのあるアリーナに曝露される。翌日、長期認知記憶を試験するために、マウスは、馴染みのある物体および新規物体が存在するオープンフィールドを探索することを許可される。各物体を探索して過ごした時間と、識別指標パーセンテージとが記録される。この研究では、実験機器は、白色床上の灰色長方形アリーナ（６０ｃｍｘ５０ｃｍｘ２６ｃｍ）と、金属バー３．８ｘ３．８ｘ１５ｃｍおよび直径３．２ｃｍｘ長さ１５ｃｍのＰＶＣパイプである２つの独特の物体から構成された。５日間の慣らし期間の間、マウスは、１〜２分間／日ハンドリングされ、５分間／日、何もないアリーナを探索することが許可された。訓練期間の間、２つの同一の物体がアリーナ中に配置され、マウスは、１５分間、物体を探索することが許可された。回想期間では、マウスは、馴染みのある１つの物体と１つの新規物体とを有するアリーナに戻された。正常なマウスは、優先的に新規物体を探索する。すべてのセッションが記録され、物体を探索するのに過ごした時間が、オープンソースイメージ分析プログラム［ＰａｔｅｌらＦｒｏｎｔ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８：３４９（２０１４）］。
Ｉ．実験室的評価
１．血清およびＣＳＦ中のＩ２Ｓ活性
血清およびＣＳＦ Ｉ２Ｓ活性のための血液は、注射のおおよそ３ヶ月後の剖検時に収集された。血清は血液から分離され、血清およびＣＳＦはドライアイス上で凍結され、分析時まで−８０℃で貯蔵した。Ｉ２Ｓ活性は、１０μＬ試料を、０．１Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０１Ｍの酢酸鉛、ｐＨ５．０中に溶解した２０μＬの１．２５ｍＭの４−メチルウンベリフェリル（ＭＵ）−Ｌ−イドピラノシドウロン酸２−サルフェート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートすることにより、測定された。３７℃で２時間インキュベートした後、４５μＬのＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（０．４Ｍのリン酸ナトリウム、０．２Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）および５μＬの組換えヒトイズロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、０．５８ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）を反応混合液へ加え、一晩３７℃でインキュベートした。混合液をグリシン緩衝液、ｐＨ１０．９で希釈し、放出された４−ＭＵを蛍光（励起３６５ｎｍ、発光４５０ｎｍ）により定量化し、遊離４−ＭＵの標準希釈液と比較した。
２．血清抗−Ｉ２Ｓ抗体
血清抗−ｈＩ２Ｓ抗体の測定のための血液が、研究Ｗ２３５６（２１日目）および研究Ｗ２３０１の最終的な剖検エンドポイント（おおよそ３ヶ月）にて、心臓穿刺により収集された。血清は分離され、ドライアイス上で凍結され、分析時まで−８０℃で貯蔵した。ポリスチレンプレートは、ｐＨ５．８に滴定されたＰＢＳ中の組換えヒトＩ２Ｓ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）５μｇ／ｍＬを用いて一晩コーティングされた。プレートは洗浄され、中性ＰＢＳ中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１時間ブロッキングされた。次いで、プレートは、ＰＢＳ中の１：１０００に希釈された血清試料とともにインキュベートされた。結合された抗体は、２％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中の１：１０，０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗−マウス抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて検出された。アッセイは、テトラメチルベンジジン基質を用いて発展され、４５０ｎｍでの吸光度を測定する前に、２Ｎの硫酸を用いて停止された。力価は、恣意的に１：１０，０００の力価を割り当てた、陽性血清試料の連続希釈により作成された標準曲線から決定された。
以前記載されたように（Ｂｅｌｌら、２００６）、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキットを使用して、ＤＮＡを高用量群の組織から単離し、ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより定量した。総細胞ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて組織から抽出された。抽出されたＤＮＡ中のベクターゲノムの検出および定量化は、ｒＢＧポリＡ配列を標的とするプライマーおよびプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）により実施された。
フォワードプライマー：５Ｖ−ＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧ−３Ｖ、配列番号１６、
リバースプライマー：５Ｖ−ＣＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴ−３Ｖ、配列番号１７、
プローブ：６ＦＡＭ−ＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣ−ＭＧＢＮＦＱ、配列番号１８。
ＰＣＲ条件は、それぞれ、鋳型としての１００ｎｇの総細胞ＤＮＡ、３００ｎＭのプライマー、および２００ｎＭのプローブにて設定された。サイクルは、９５Ｃで１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルであった。１００ｎｇのＤＮＡあたりの１ｘ１０４ゲノムコピーの値は、１細胞あたり１ゲノムコピーを表すために算出された。
Ｈ＆Ｅ染色が、標準プロトコルに従って、注射後（ｐｉ）３ヶ月の剖検からのホルマリン固定パラフィン包埋頭側脳セクションについて実施された。脳のＨ＆Ｅセクションは、委員会認定の獣医病理学者により、毒性の証拠について評価され、ＭＰＳＩＩ表現型に関連する知見の範囲が、特徴付けられた。続いて、病理学者は、治療の知識がない状態で、スライドを再調査し、グリア細胞質空胞化、ニューロン細胞質膨張、および両染性細胞巣材料の蓄積を含むＭＰＳＩＩ表現型の組織学的兆候をスコア付けした。ＬＩＭＰ２およびＧＭ３についての細胞染色陽性の数が、熟練のＧＴＰ形態学コア人材により、Ｗ２３５６研究からの各動物からの２−４つの脳セクションにおいて定量化された。
ＧＭ３（凍結切片）：ＧＭ３免疫染色は、一次抗体としてモノクローナル抗体ＤＨ２（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、続いて、ビオチン化二次抗−マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて、記載されたように、３０μｍ厚の浮遊凍結セクションに対して実施され、検出は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いた。染色されたセクションをガラススライド上に移し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を用いてマウントした。
ＬＩＭＰ２（ホルマリン固定したセクション）：ホルマリン固定パラフィン包埋した脳組織からの６μｍのセクションについて、ＬＩＭＰ２免疫染色を実施した。セクションは、エタノールおよびキシレンシリーズによって、脱パラフィン包埋され、抗原賦活化のために１０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間、電子レンジ中で沸騰され、ＰＢＳ＋０．２％のトリトン中の１％のロバ血清を用いて１５分間ブロッキングされ、続いて、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次（１時間）および標識化二次（４５分間）抗体を用いて連続的インキュベーションされた。一次抗体は、ウサギ抗−ＬＩＭＰ２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、１：２００）であり、二次抗体は、ＦＩＴＣ−またはＴＲＩＴＣ−標識化ロバ抗−ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。
上記のように得られた組織試料（セクションｂ）は、組織溶解液（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、溶解用緩衝液（０．２％のトリトン−Ｘ１００、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ４．０）中で均質化した。試料は、凍結解凍し、遠心分離により清澄化した。タンパク質は、ＢＣＡアッセイにより定量化した。Ｉ２Ｓ活性は、蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イドピラノシドウロン酸２−サルフェート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて測定された。ヘキソサミニダーゼ活性およびＧＡＧ濃度は、記載されたように標準手順を用いて測定された（Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、２０１５）。
ＩＶ．コンピュータ化されたシステム
オープンフィールドについては、データはエクセルに入力され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。Ｙメイズについては、データはエクセルに入力され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。ＣＦＣについては、Ｆｒｅｅｚｅｓｃａｎ、ＣｌｅｖｅｒＳｙｓ Ｉｎｃが使用された。ＮＯＲについては、ＭＡＴＬＡＢ実装およびユーザガイド：ｗｗｗ．ｓｅａｓ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／〜ｍｏｌｎｅｕｒｏ／ａｕｔｏｔｙｐｉｎｇ．ｈｔｍｌが利用された。
Ｖ．統計的分析
治療されたマウスおよび未治療マウスにおける組織ＧＡＧ含有量、Ｈｅｘ活性、および脳貯蔵病変は、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて比較された。オープンフィールドおよびＹメイズデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて
分析された。二元ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの事後（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）分析を、恐怖条件付けデータに適用して、トライアルおよび遺伝子型効果を評価した。新規物体認識試験のために、各群についてｔ−検定を用いて、次いで、多重比較のためにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて、馴染みのある物体を探索する時間に対する新規物体を探索する時間を比較した。
ＶＩ．結果
死亡は全く観察されなかった。ベクターを用いた治療に関連したと考えられた臨床的観察は存在しなかった。
一般的な運動活動を評価するために、オープンフィールド試験が実施された。Ｉ２Ｓγ／−マウスは、野生型同腹仔と比較して、オープンフィールドアリーナにおいて正常な探索活動を示した（図９Ａ〜９Ｃ）。
オープンフィールドアリーナにおける野生型およびＩ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスパフォーマンス（水平方向の動き）の比較が実施された（図９Ａ）。１０分間トライアルの間の自発的活動は、水平方向の動きを捕らえるＸＹ−軸ビームブレイクに基づいて自動的に記録された。ＷＴとＭＰＳＩＩマウスとの間には、差異は見られなかった。
オープンフィールドアリーナにおける野生型およびＩ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスパフォーマンス（垂直方向の動きまたは後退）の比較が実施された（図９Ｂ）。１０分間トライアルの間の自発的活動は、マウスの後肢の後退を捕らえるＺ−軸ビームブレイクに基づいて自動的に記録された。ＷＴとＭＰＳＩＩマウスとの間には、差異は見られなかった。
オープンフィールドアリーナにおける野生型およびＩ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスパフォーマンス（中心の活動）の比較が実施された（図９Ｃ）。１０分間トライアルの間の自発的活動は、不安のマーカーとして、オープンアリーナで過ごした時間を捕らえる中心ビームブレイクに基づいて自動的に記録された。ＷＴとＭＰＳＩＩマウスとの間には、有意な差異は見られなかった。
短期記憶を評価するために、Ｙ−メイズ活性が分析された。８分間のＹメイズ試験セッションの間の野生型およびＩ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスの比較。ＷＴとＭＰＳＩＩマウスとの間には、アームエントリの総数に関して差異は見られなかった。Ｉ２Ｓγ／−マウスはまた、野生型同腹仔と比較して、Ｙメイズにおいて同様のアームエントリ数を有し、等価な自発的変更を有し、これは、疾患プロセスが短期記憶に影響しないことを示す（図９Ｄ）。
長期記憶を評価するために、コンテキスト恐怖条件付け（ＦＣ）が実施された。コンテキスト恐怖条件付けを用いる認知に対する治療効果の評価が、野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて試験された。フリーズパーセントが、ｙ軸にプロットされた（図６Ｂ）。学習前の（Ｐｒｅ）フリーズ行動は、各群について、条件付け（プローブ）後のフリーズ行動と比較される（図６Ｂ）。ＦＣアッセイでは、すべてのマウス（Ｉ２Ｓγ／−および野生型）は、学習が生じたことを実証する、試験の回想期の間のフリーズ時間パーセントにおいて増大を示したが、Ｉ２Ｓγ／−マウスは、野生型同腹仔に対して減少したフリージングを示した（データは示されていない）。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧで治療されたマウスでは、治療に関連する効果は、正常および未治療Ｉ２Ｓγ／−マウスの間の小さな差異に起因して評価することが困難だったが、治療された動物では、コンテキスト恐怖条件付けに応答しての明確な改善は存在しなかった（図６Ｂ）。
長期記憶をさらに評価するために、新規物体認識が実施された。新規物体認識を用いる認知に対する治療効果の評価が、野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて試験された。野生型、未治療、および治療されたＩ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスについて、新規物体を探索して過ごして時間、対、馴染みのある物体を探索して過ごした時間の比較が実施された。新規物体を探索して過ごす時間の増大（馴染みのある物体を記憶していることを示す）は、治療されたマウスのすべての群においてみられたが、中用量群においてのみ統計的に有意であった（図６Ｃ）。野生型マウスは、予想通り、新規物体に対する優先度を実証したが、Ｉ２Ｓγ／−は優先度を示さず、これは、馴染みのある物体の記憶の欠失（長期記憶障害）を示す。髄腔内ＡＡＶ９遺伝子療法は、Ｉ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスにおいて観察されたＮＯＲ欠損の改善をもたらしたが、明確な用量応答は伴わなかった。研究は、投与群の間の行動学的欠損の救済の相対的程度を比較するためには十分強力なものではなかったが、新規物体についての優先度は、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった（図６Ｃ）。
野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて、脳Ｉ２Ｓ活性（２１日目）における用量依存的増大が観察された（図２Ｂ）。高用量群のみが、この初期の時点で野生型と同様のレベルを有したが、これは、発現がその最大点までにまだ到達していないためと予想された。
野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて、Ｉ２Ｓ活性（９０日目）における用量依存的増大が、注射後（ｐｉ）３か月の剖検時に収集されたＣＳＦ中で観察された（図２Ａ）。本質的に、未治療Ｉ２Ｓγ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスでは、Ｉ２Ｓ活性は全く検出されなかった。
さらに、野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて、血清Ｉ２Ｓ活性（９０日目）における用量依存的増大が、注射後（ｐｉ）３か月の剖検時に検出された（図２Ｃ）。本質的に、未治療γ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスの血清中に、活性は本質的には全く検出されなかった。
注射後（ｐｉ）３ヶ月にて、ヘキソサミニダーゼ活性（９０日目）は、野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスの肝臓（図４Ｃ）および心臓（図４Ｄ）の両方において用量依存的様式で正常化された。二次的に増大された酵素活性のこの正常化は、リソソームホメオスタシスの回復を示した。
野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおける肝臓および心臓ＧＡＧ貯蔵が調査された。注射後（ｐｉ）３ヶ月にて、ＧＡＧの組織含有量が、心臓（図４Ｂ）および肝臓（図４Ａ）の両方で用量依存的に軽減され、これは、中および高用量レベルでの野生型組織含有量に匹敵した。肝臓は、すべての用量で補正され、心臓は、中および高用量のほとんどで部分的な改善を示した。
さらには、ヒトＩ２Ｓに対する抗体応答により表れる液性免疫原性は、ＩＣＶ ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧを用いて治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて評価された。ヒトＩ２Ｓに対する抗体は、２１日目および９０日目の両方において、中および高用量コホートにおいてのみ、何匹かの動物の血清中で検出された（図８）。両時点では、ほとんどの動物は、検出可能な液性免疫応答を有さなかった（対照と同様）。中用量の約３分の１の動物および動物群の約２０％は、バックグラウンドを上回る抗体レベルを有した。応答は、高用量群においてより明確ではなかった。図８は、両方の剖検エンドポイントデータをまとめて示す。
脳．において治療関連の組織病理学知見は存在しなかった。この研究において提示されるすべての顕微鏡的知見は、この種、年齢、および性別の動物についての正常なバックグラウンドであるか、疾患モデルに関連しているか、またはベクター投与手順に関連しているかを考慮された。
細胞質空胞化に基づくスコア付けシステムが構築され、治療または表現型の知識がない状態で、すべての試験動物の引き続く再評価のために使用された。核の常軌を逸したまたは末梢的な置換を伴う大きな透明の空胞により特徴付けられる、グリアのおける細胞質空胞化は、Ｉ２Ｓγ／−遺伝子型の特色のある特徴であった。評価された脳領域では、空胞化の量において領域により変化が見られた。両染性細胞巣材料のニューロン蓄積は、突出しておらず、未治療Ｉ２Ｓγ／−マウスにおいてのみ観察された。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ＲＢＧを用いた治療は、調べたすべての脳領域において、両染性細胞巣材料のグリア空胞化およびニューロン蓄積の量および頻度を軽減した。累積病理学的スコアは、グリアおよびニューロン病変における治療関連の改善を実証している（図２７）。
野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおけるＧＭ３およびＬＩＭＰ２の免疫組織化学的染色が、実施された。未治療Ｉ２Ｓ γ／− マウスの脳は、リソソームメンブレンタンパク質ＬＩＭＰ２の蓄積、およびＧＭ３を含むガングリオシドの二次貯蔵を含む、ニューロンにおけるリソソーム貯蔵の明確な組織学的証拠を示す（図５Ａ〜５Ｊ）。画像は、すべての用量でリソソーム貯蔵の減少があり、高用量群の動物では本質的にＷＴ対照と同様であったことを実証した（図５Ａ〜５Ｊ）。ＧＭ３−およびＬＩＭＰ２−陽性細胞における用量依存的減少の定量化は、野生型、未治療、および治療されたＭＰＳＩＩマウスにおいて実施された。すべての用量でリソソーム貯蔵の有意な減少があり、高用量群の動物では本質的にＷＴ対照と同様であった。治療されたマウスは、ＬＩＭＰ２およびＧＭ３染色の減少により証拠付けられるように、ニューロンの貯蔵病変における用量依存的減少を実証した（図５Ｋ〜５Ｌ）。
高用量群からのＭＰＳＩＩマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧの体内分布（２１日目）が分析された。体内分布データは、評価された末梢組織、特に、肝臓と同様に、脳組織が形質導入された（二倍体ゲノムあたり１〜１０ＧＣ）ことを実証した（図３）。肝臓およびＣＮＳにおける濃度は、１〜１０ＧＣ／二倍体ゲノムであり、肺における濃度は、０．１〜１ＧＣ／二倍体ゲノムであり、心臓および脾臓における濃度は、０．１ＧＣ／二倍体ゲノム未満であった。
ＶＩＩＩ．結論
Ｃ５７ＢＬ／６ Ｉ２Ｓ γ／−（ＭＰＳＩＩ）マウスへの最高３ｘ１０１０ＧＣ（５．２ｘ１０１０ＧＣ、ｄｄＰＣＲ方法）でのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＳ．ｒＢＧのＩＣＶ投与は、十分寛容化されており、臨床的徴候または死亡を伴わず、ＣＮＳおよび末梢組織、特に肝臓への分布をもたらし、注射されたウイルス粒子のＣＳＦから末梢血への部分的な再分布を示した。
ベクター検出により証拠付けられるような脳におけるＩ２Ｓ遺伝子発現の証拠、ならびに注射後（ｐｉ）２１日目での脳における、および注射後３ヶ月でのＣＳＦにおけるＩ２Ｓ活性の用量依存性増大が存在し、高用量（脳組織）では野生型に近接する酵素活性を伴い、中および高用量（ＣＳＦ）では野生型に相当するそれよりも高い酵素活性を伴った。すべての用量で注射後（ｐｉ）３ヶ月でのＣＮＳにおけるＬＩＭＰ２およびＧＭ３染色における減少により示されるように、リソソーム画分の用量依存的正常化が存在した。Ｈ＆Ｅ染色された脳セクションでは、ＭＰＳＩＩＣＮＳ表現型の指標である、両染性細胞巣材料のグリア空胞化およびニューロン蓄積の量および頻度における用量依存的減少も観察された。ＣＮＳリソソーム含有量における変化、およびＨ＆Ｅ染色されたセクションにおけ
る疾患関連形態の改善に対応して、長期記憶（新規物体認識）の１つの測定において改善が存在したが、長期記憶の他の測定、コンテキスト恐怖条件付けでは改善が存在しなかった。ＮＯＲの改善では明らかな用量応答はみられなかった。ＣＮＳ機能の他の試験、オープンフィールド試験およびＹメイズにおけるＭＰＳＩＩマウスのパフォーマンスは、野生型マウスのものに匹敵し、したがって、ベクターで治療されたマウスは、これらのアッセイで評価されなかった。
血清Ｉ２Ｓ活性における用量依存性増大は、注射後ｐｉ３ヶ月でも観察され、野生型に相当するか（低用量）、またはそれよりも高い酵素活性を伴った（中／高用量）。血清におけるＩ２Ｓ活性の正常化を反映して、ＭＰＳＩＩマウスは、肝臓および心臓におけるヘキソサミニダーゼ活性およびＧＡＧ含有量において用量依存的減少を有し、肝臓ヘキソサミニダーゼおよびＧＡＧレベルは、すべての用量レベルで正常化され、心臓ヘキソサミニダーゼおよびＧＡＧ活性は、それぞれ中用量および高用量で正常化された。高度に形質導入された肝臓（二倍体ゲノムあたり１〜１０ＧＣ）は、おそらく、血清中のＩ２Ｓの分泌のための貯蔵器官として作用し、より高い用量では、心臓のクロス補正を行う。
ＩＣＶ投与手順それ自体に関連する変化が一部のマウスで観察されたが、脳における試験品目に関連する毒性の証拠は存在しなかった。トランスジーンに対する液性免疫応答はごくわずかであり、一部の中および高用量動物においてのみ観察されたが、これらの動物の健康または脳組織病理学に影響は与えなかった。
結論付けると、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＩＤＳ．ｒＢＧは、すべての用量レベルでＭＰＳＩＩマウスにおいて十分に寛容化され、ＭＰＳＩＩのＣＮＳおよび末梢パラメータの両方における改善に関連したＩ２Ｓレベルの用量依存性増大をもたらした。
投与された最も低用量の３ｘ１０８ＧＣ（５．２ｘ１０８ＧＣ ｄｄＰＣＲ）は、この研究での最小有効用量であった。
実施例１２−ヒトへの遺伝子療法ベクターの送達
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＳ（ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ発現カセットを含有する組換えアデノ随伴ウイルス血清型９カプシド）。産物は、単回用量の槽内（ＩＣ）投与として送達される。２つの用量レベル、１．３×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／ｇ脳質量（用量１）、および６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（用量２）が評価され得る。投与された総用量は、研究対象の年齢に基づくそれらの推定脳サイズを説明するものである。投与される産物の総容積は、５ｍＬ未満であり得る。
主な目的：
●重度のＭＰＳＩＩを有するか、または有することが予想される小児対象に投与された単回槽内（ＩＣ）用量の後の２４週間にわたってＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の安全性および忍容性を評価すること。
二次的な目的：
●ＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の長期間の安全性および忍容性を評価すること。
●脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、および尿におけるバイオマーカーに対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を評価すること。
●認知、行動学的、および適応機能の神経発達学的パラメータに対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を評価すること。
●ＣＳＦ、血漿、および尿におけるベクター排出を評価すること。
探索的な目的：
●ＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の免疫原性を評価すること。
●ＣＮＳに対する物理的変化に対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を探索すること。
●疾患の全身兆候に対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を探索すること。
●聴力に対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を探索すること。
●ＩＶ ＥＲＴ（エラプラーゼ（登録商標））を一時的に中止している対象における血漿および尿中のバイオマーカーに対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を探索すること。
●生活の質および睡眠測定に対するＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の効果を探索すること。
これは、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品の、フェーズＩ／ＩＩ、ヒト初回、多施設、非盲検、シングルアーム用量漸増研究である。対照群は、含まれない。重度のＭＰＳＩＩを有するか、または有すると予想される、おおよそ６人の小児対象は、２用量コホート、１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（用量１）または６．５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（用量２）に登録することができ、ＩＣ注射により投与される単回用量のＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品を受けることになる。安全性は、治療後の最初の２４週間（主要な研究期間）の主要な焦点となり得る。主要な研究期間の完了後、対象は、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品を用いた治療の後の合計１０４週までの間、引き続き評価される（安全性および有効性）。研究の終了時に、対象は、長期間のフォローアップ研究に参加することを誘われる。
第１の３人の適格な対象は、用量１コホート（１．３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）に登録される。第１の対象にＡＡＶ９．ｈＩＤＳ試験製品を投与した後、安全性のために８週間の観察期間を設ける。
潜在的な対象は、研究．のための適格性を決定するために投与の最大３５日までにスクリーニングされる。適格性基準を満たすこれらの対象は、−２日目〜１日目の朝に入院し（施設実務に従って）、ベースライン評価が、投与前に実施される。対象は、１日目にＡＡＶ９．ｈＩＤＳの単回ＩＣ用量を受け、観察のために投与後およそ３０〜３６時間は病院に留まる。主要な研究期間（すなわち、２４週目まで）における引き続きの評価が、４週目までは毎週、ならびに８週目、１２週目、１６週目、２０週目、および２４週目に実施される。主要な研究期間の後、ビジットは、２８週目、３２週目、４０週目、４８週目、５２週目、５６週目、６４週目、７８週目、および１０４週目に実施される。１２週目、４０週目、および６４週目のビジットは、家庭健康指導看護師により実施されてもよい。２０週目および２８週目の評価は、電話連絡による、ＡＥおよび併用療法の評価に限定される。
すべての対象は、初めに、動物において実施された前臨床的安全性／毒物学的研究における潜在的な免疫原性の知見に基づく研究において免疫抑制（ＩＳ）を受け、それは、コルチコステロイド（１日目に１回、前用量のメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ静脈内［ＩＶ］と、２日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、徐々に量を減らし、１２週目までに中止する経口プレドニゾン）と、タクロリムス（２日目〜２４週目に経口により１日２回［ＢＩＤ］１ｍｇ、標的血液レベル４〜８ｎｇ／ｍＬを伴い、２４週目〜３２週目に８週間にわたって、徐々に量を減らす）と、シロリムス（−２日目に１ｍｇ／ｍ２の負荷用量、４時間毎に３用量、次いで、−１日目から、シロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日、ＢＩＤ用量で分割、４８週目まで標的血液レベル４〜８ｎｇ／ｍｌを伴う）と、を含む。神経学的評価およびタクロリムス／シロリムス血液レベルモニタリングが、実施される。
小児の発達初期に生じる比較的急速な脳成長のために、ＩＣ投与されるＲＧＸ−１２１の総用量は、異なる年齢層にわたって推定される脳質量に依存する。研究対象についての
年齢ごとに推定される脳質量は、公開されたデータに基づく（Ｄｅｋａｂａｎ Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９７８ Ｏｃｔ；４（４）：３４５−５６（１９７８）。
エンドポイント：
主要なエンドポイント：
●２４週目までの安全性：ＡＥおよび深刻な有害事象（ＳＡＥ）
二次エンドポイント：
●１０４週目までの安全性：ＡＥ報告、ラボ評価、バイタルサイン、ＥＣＧ、身体検査、および神経学的評価
●ＣＳＦ（ＧＡＧ、１２Ｓ活性）、血漿（ＧＡＳ、Ｉ２Ｓ活性）、および尿（ＧＡＧ）におけるバイオマーカー。
●認知、行動学的、および適応機能の神経発達学的パラメータ：
○乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＢＳＩＤ−ＩＩＩ）（Ｂａｙｌｅｙ ２００５）または小児用Ｋａｕｆｍａｎアセスメント群、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＫＡＢＣ−ＩＩ）（Ｋａｕｆｍａｎ ２００４）。
○Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動スケール、２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、包括的対談形態（ＶＡＢＳ−ＩＩ）（Ｓｐａｒｒｏｗら、２００５
ＡＡＶ９．ｈＩＤＳデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、ＣＳＦ、血漿、および尿におけるベクター濃度。
診査エンドポイント：
●免疫原性測定
○ＣＳＦおよび血清中の、ＡＡＶ９に対する中和抗体力価およびＩ２Ｓに対する結合抗体力価
○酵素結合免疫スポット（ＥＬＩスポット）アッセイ：ＡＡＶ９およびＩ２Ｓに対するＴ細胞応答
○フローサイトメトリー：ＡＡＶ−およびＩ２Ｓ−特異的調節Ｔ細胞
●脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により評価されたＣＮＳ構造異常さ
●腹部のＭＲＩおよび超音波により評価された肝臓および脾臓サイズ
●聴覚脳幹応答（ＡＢＲ）試験により測定された聴力変化
●ＩＶ ＥＲＴ（エラプラーゼ（登録商標））を一時的に中止している対象における、血漿および尿総ＧＡＧ、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸
●ＰｅｄｓＱＬ（バージョン４）
●睡眠スケールの全体的印象
おおよそ６人の対象が登録される。
●用量１コホートに３人の対象。
●用量２コホートに３人の対象。
●ＩＤＭＣは、さらなる対象を追加することを推奨してもよい。
研究の総期間は、２４週間の主要な安全性評価時点を伴って、投与後１０４週間となる。スクリーニングは最高３５日となり得る。
ある実施形態では、主要な組み入れ基準は：
●血漿、線維芽細胞、または白血球中で測定されるような酵素活性により確認される、ＭＰＳＩＩ診断の文書を有する。
●１８ヶ月齢以上の男性であり、以下の基準のうちの１つを満たす：
○スクリーニング時に６歳未満、かつ、神経認知スコア試験≦７７を有するが、スコアリング（ＢＳＩＤ−ＩＩＩもしくはＫＡＢＣ−ＩＩ）下限より上回る、または
○６歳未満であり、かつ、連続して＞１の標準偏差の低下を有する、
○神経認知試験（ＢＳＩＤ−ＩＩＩもしくはＫＡＢＣ−ＩＩ）、または
○スクリーニング時に４歳未満であり、以下の基準の両方を満たす：
■ＩＤＳの完全な欠失、またはＩＤＳ遺伝子の大きな（すなわち、スパニング≧１エクソン）欠失／転位、および
■同じＩＤＳ変異を有する重度のＭＰＳＩＩと診断された兄弟姉妹
ある実施形態では、主要な排除基準は以下を含む。
●ＩＣ注射についての禁忌を有する。
●ＩＳに対する禁忌を有する。
●脳室腹腔（ＶＰ）シャントを有する。
●造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けている。
●髄腔内（ＩＴ）投与によるイズルスルファーゼ［エラプラーゼ（登録商標）］を受けた。
●スクリーニング前３ヶ月以内である。
●任意の時点でＩＴイズルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））を受け、ＰＩの判断では、対象を危険な状況に置く可能性のある、ＩＴ投与に関連すると考えられる有意なＡＥを経験した。
●ＩＶイズルスルファーゼ［エラプラーゼ（登録商標）］を受け、ＩＶに関連すると推測されるアナフィキラシーを含む重大な過敏性反応を経験した。
●イズルスルファーゼ［エラプラーゼ（登録商標）］投与。（現在ＩＶイズルスルファーゼの投与を受けていて、投与中断または週１回とは異なる投与レジメンが必要な場合には、医療用モニタを用いた議論が必要とされる）
ある実施形態では、この研究に参加するために適格であるために、対象は、以下のすべての組み入れ基準を満たす必要がある。
１．対象の法的な後見人（複数可）が、研究の性質が説明された後、研究に関連する任意の手順を開始する前に、署名された書面のインフォームドコンセントを提出する意思があり、提出することが可能である。
２．１８ヶ月齢以上の男性である。
３．以下の基準の１つを満たす。
ａ．ＭＰＳＩＩの診断文書を有し、かつ、４ヶ月齢以上、５歳未満であり、かつ、＞５５および≦７７の神経認知試験スコアを有するか（ＢＳＩＤ−ＩＩＩもしくはＫＡＢＣ−ＩＩ）、または
ｂ．ＭＰＳＩＩの診断文書を有し、≧４ヶ月および＜５歳であり、かつ、連続した神経認知試験（ＢＳＩＤ−ＩＩＩもしくはＫＡＢＣ−ＩＩ）において≧１の標準偏差の低下を有し、＞５５の試験スコアを有するか、または
ｃ．対象と同じＩＤＳ変異を有し、かつ、遺伝学者の意見ではＭＰＳＩＩの重度の形態を遺伝した、重度のＭＰＳＩＩを有すると相関的に診断されている
４．補助の有無に関わらず、必要とされるプロトコル試験を完了するために、十分な聴力および視力を有し、試験日に妥当な場合には、補助器具を装着することに従う
以下の排除基準のいずれかを満たす対象は、研究に参加する適格性はない。
５．以下のいずれかを含むＩＣ注射についての禁忌を有する。
ａ．研究に参加する神経放射線科医／神経外科医のチーム（部門あたり１人）によるベースラインＭＲＩ試験のレビューにより、ＩＣ注射についての禁忌が示される。
ｂ．研究に参加する神経放射線科医／神経外科医のチームによる入手可能な情報のレビューに基づき、ＩＣ注射に対する禁忌を結果としてもたらす、以前の頭部／頸部手術の経歴。
ｃ．コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、コントラスト物質、または全身麻酔に対して任意の禁忌を有する。
ｄ．ＭＲＩまたはガドリニウムに対するいずれかの禁忌を有する。
６．＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の推定の糸球体濾過速度（ｅＧＦＲ）を有する、プレドニゾン、タクロリムス、またはシロリムスを用いた治療を禁忌とし得る任意の状態を有する。
７．ＭＰＳＩＩに起因しない任意の神経認知欠損、またはＰＩの意見では研究結果の解釈を混同する可能性のある神経精神医学的状態の診断を有する。
８．腰部穿刺に対していずれかの禁忌を有する。
９．室内シャントを有する。
１０．造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けている。
１１．ＡＡＶに基づく遺伝子療法製品を用いた前治療を受けた。
１２．髄腔内（ＩＴ）投与によるイズルスルファーゼ［エラプラーゼ（登録商標）］を受けた。
１３．イズルスルファーゼ［エラプラーゼ（登録商標）］ＩＶを受け、ＩＶイズルスルファーゼ投与に関連すると推測されるアナフィキラシーを含む重大な過敏性反応を経験した。現在ＩＶイズルスルファーゼの投与を受けていて、投与中断または週１回とは異なる投与レジメンが必要な場合には、神経認知欠損医療用モニタを用いた議論が必要とされる。
１４．どちらが長期であってもよいが、インフォームドコンセントフォームＩＣＦ）に署名する前の、１日目の３０日以内、または５半減期以内に、任意の調査製品を受けている。
１５．スクリーニングの前の少なくとも３ヶ月間で完全に寛解していない、リンパ腫の任意の病歴、または皮膚の扁平上皮細胞もしくは基底細胞癌腫以外の別の癌の病歴。
１６．マイクロリットル（μＬ）あたり＜１００，０００の血小板数を有する。
１７．対象が、Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群の以前に知られた病歴を有さず、総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、スクリーニング時にアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）＞３×ＵＬＮ、または総ビリルビン＞１．５×ＵＬＮを有する。
１８．最大限の医学的治療にも関わらず、制御されていない高血圧（収縮期血圧［ＢＰ］＞１８０ｍｍＨｇ、弛緩期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）
１９．ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくは肝炎ウイルス感染の病歴を有するか、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、もしくはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体についてのスクリーニング試験で陽性を有する。
２０．臨床部門の従業員、もしくは研究の実施に関与した任意の他の個人の一等親の家族であるか、または臨床部門の従業員もしくは研究の実施に関与した他の個人である。
２１．ＰＩの意見では対象の安全性を損なう可能性のある臨床的に有意なＥＣＧ異常値を有する。
２２．ＰＩの意見では対象の安全性、または研究参加の成功、または研究結果の解釈を損なう可能性のある、重大なまたは不安的な医学的または心理学的状態を有する。
２３．ＰＩの意見において対象を危険な状況へと置く可能性のある制御されていない発作を有する。
免疫抑制療法に関連する排除基準。
２４．タクロリムス、シロリムス、またはプレドニゾンに対する過敏反応の病歴を有する。
２５．主要な免疫欠損（例えば、一般的な不定の免疫欠損症候群）、脾摘出、または対象を易感染性とする任意の基底状態の病歴を有する。
２６．スクリーニングの少なくとも１２週間前に完全に解決されていない、帯状疱疹（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染を有する。
２７．少なくともビジット２の８週間前に解決されていない、入院または非経口抗感染薬を用いる治療を必要とする任意の感染を有する。
２８．ビジット２前の１０日以内に経口抗炎症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする
任意の活性のある感染を有する。
２９．スクリーニング中に、活動性結核（ＴＢ）、またはＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ−ＴＢゴールド試験で陽性の病歴を有する。
３０．ＩＣＦに署名する前の８週間以内に任意の生ワクチンを有する。
３１．ＩＣＦに署名する前の８週間以内に大手術を受けたか、または研究期間中に計画された大手術を受けた。
３２．登録の６ヶ月以内にアデノイド切除術または扁桃摘出術の必要性が予期される。
３３．＜１．３×１０３／μＬの絶対的好中球数を有する。
３４．免疫抑制療法に適切でないとＰＩが考える任意の状態またはラボ的異常値を有する。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別数字＜２２３＞の下でフリーテキストを含有する配列を提供する。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、ならびに２０１７年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５７３，８４１号、２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６２，１７９号、および２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，７６９号、ならびに本明細書とともに出願された配列表は、その個々の刊行物または特許出願が具体的および個別に参照により組み込まれることが指示されているかのように、参照によりそれらのすべてが、本明細書に組み込まれる。前述した本発明は、理解を明確にするという目的のための説明および例示のために、部分的に詳細に記載されてきたが、本発明の教示を照らし合わせて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修飾を本発明に加えることが可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。

Claims (27)

  1. ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）欠損を治療するための治療的レジメンであって、
    （ａ）複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液であって、
    （ａ）前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳの発現を導く調節配列の制御下にあるｈＩＤＳをコードする核酸配列を含むベクターゲノム（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）とを有し、
    （ｂ）生理学的に適合する水性緩衝液を含む髄腔内送達に適する製剤緩衝液、ならびに任意選択の界面活性剤、および賦形剤、の懸濁液と、
    （ｂ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第１の免疫抑制剤と、
    （ｃ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第２の免疫抑制剤と、を含む併用療法を含み、
    少なくとも１つの免疫抑制剤の投与が、前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳベクターの送達の前または送達と同日に開始され、
    前記免疫抑制剤のうちの少なくとも１つの投与が、ベクター投与後少なくとも８週間継続される、治療的レジメン。
  2. 前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳが、
    （ａ）配列番号３、
    （ｂ）配列番号１１、または
    （ｃ）配列番号１４から選択されるベクターゲノムを有する、請求項１に記載のレジメン。
  3. 患者が、初めに、ベクター送達前に静脈内ステロイドを事前投与される、請求項１または２に記載のレジメン。
  4. 前記患者が、ベクター送達後に経口ステロイドを投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のレジメン。
  5. 前記レジメンが、タクロリムス、もしくはシロリムス、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のマクロライドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレジメン。
  6. 第１の用量のマクロライドが、ベクターの投与前に送達される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のレジメン。
  7. 前記免疫抑制レジメンが、ＡＡＶ９．ｈＩＤＳの投与後４８週で中止される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のレジメン。
  8. 前記懸濁液が、６〜９のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレジメン。
  9. 前記懸濁液が、６．８〜７．８のｐＨを有する、請求項８に記載のレジメン。
  10. 前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳが、約１．３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内注射により投与可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のレジメン。
  11. 前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳが、約１．９ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内注射
    により投与可能である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレジメン。
  12. 前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳが、約６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内注射により投与可能である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレジメン。
  13. ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）の発現を導く調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを含む、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む懸濁液であって、約１．３ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳを含む懸濁液の使用。
  14. ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）の発現を導く調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを含む、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む懸濁液であって、約６．５ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／ｇ脳質量の用量のｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳを含む懸濁液の使用。
  15. 前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳが、
    （ａ）配列番号３、
    （ｂ）配列番号１１、または
    （ｃ）配列番号１４から選択されるベクターゲノムを有する、請求項１３または１４に記載の使用。
  16. ２つ以上の免疫抑制剤を含む併用治療レジメンにおける、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
  17. 前記２つ以上の免疫抑制剤が、
    コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第１の免疫抑制剤と、
    コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第２の免疫抑制剤と、を含む、請求項１６に記載の使用。
  18. 患者が、初めに、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ送達の前に静脈内ステロイドを事前投与される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の使用。
  19. 前記患者が、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ送達の後に経口ステロイドを投与される、請求項１８に記載の使用。
  20. 前記レジメンが、タクロリムス、もしくはシロリムス、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のマクロライドを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の使用。
  21. 前記ヒト患者が、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されている、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
  22. ＡＡＶ９カプシドと、ｈＩＤＳ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳ）の発現を導く調節配列の制御下にあるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを含む、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む水性懸濁液であって、１．３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量または約６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量でのそれらを必要とするヒトへの髄腔内注射のために製剤化される、懸濁液。
  23. （ｉ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第１の免疫抑制剤と、（ｉｉ）コルチコステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド、または細胞分裂阻害剤のうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも第２の免疫抑制剤と、を用いる併用療法であって、前記免疫抑制剤の投与が、前記ＡＡＶベクターの送達前または送達と同日に開始され、前記免疫抑制剤の少なくとも１つの投与が、ベクター投与後少なくとも８週間継続される、併用療法における使用のための、請求項２２に記載の懸濁液。
  24. 前記懸濁液が、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されているヒト患者に投与可能である、請求項２２または２３に記載の懸濁液。
  25. ＡＡＶ９カプシド内にパッケージされたヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする異種核酸を含む複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を約１．３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量または約６．５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内注射により用いてそれらを必要とする患者を治療する方法。
  26. 前記患者が、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）または重度のハンター症候群と診断されている、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＳが、
    （ａ）配列番号３、
    （ｂ）配列番号１１、または
    （ｃ）配列番号１４から選択されるベクターゲノムを有する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の懸濁液、または請求項２５もしくは２６に記載の方法。
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