BR112019015482A2 - Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose i (mps i) - Google Patents

Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose i (mps i) Download PDF

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Abstract

composições e métodos são descritos para entrega de uma a-l-iduronidase (idua) glicosada inteiramente humana (hugly) no líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central (snc) de um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose i (mps i).

Description

MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO HUMANO DIAGNOSTICADO COM
MUCOPOLISSACARIDOSE I (MPS I)
Referência cruzada a pedidos de patente correlates [0001] Este pedido de patente reivindica o beneficio de prioridade deste aos Pedidos de Patente U.S. Provisórios Nos 62/452 769, depositado em 31 de janeiro de 2017, 62/485 655, depositado em 14 de abril de 2017, 62/529 366, depositado em 06 de julho de 2017, 62/579 690, depositado em 31 de outubro de 2017, e 62/616 234, depositado em 11 de janeiro de 2018, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
Referência à listagem de sequências submetida eletronicamente [0002] Este pedido de patente incorpora por referência uma Listagem de Sequências submetida junto com este pedido de patente como arquivo de texto, intitulado Sequence_Listing_12656-106-228.txt, criado em 16 de janeiro de 2018 e com 80.541 bytes de tamanho.
1. INTRODUÇÃO [0003] Composições e métodos são descritos para entrega de uma α-L-iduronidase (IDUA) glicosilada inteiramente humana (HuGly) no liquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central (SNC) de um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I).
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2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0004] Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética recessiva rara com uma incidência estimada de 1 em 100.000 nascidos vivos (Moore D et al. , 2008, Orphanet Journal of Rare Diseases 3) . MPS I é causada por deficiência de α-1iduronidase (IDUA), uma enzima necessária para o catabolismo dos polissacarídeos complexos onipresentes heparan sulfato e dermatan sulfato nos lisossomos. Esses polissacarídeos, denominados glicosaminoglicanos (GAGs), se acumulam nos tecidos de pacientes com MPS I, resultando em lesões características de depósito e diversas sequelas da doença. Os pacientes podem exibir baixa estatura, deformidades ósseas e nas articulações, face com características grosseiras, hepatoesplenomegalia, doença valvular cardíaca, apneia obstrutiva do sono, infecções recorrentes nas vias aéreas superiores, comprometimento da audição, síndrome do túnel do carpo e comprometimento da visão decorrente da opacificação da córnea (Beck M, et al. , 2014, The natural história de MPS I: global perspectives from the MPS I Registry. Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10) :759-765) . Além disso, muitos pacientes desenvolvem sintomas relacionados ao depósito de GAG no sistema nervoso central, os quais pode incluir hidrocefalia, compressão da medula espinhal e, em alguns pacientes, comprometimento cognitivo.
[0005] Os pacientes com MPS I apresentam um espectro amplo de gravidade da doença e extensão do envolvimento do SNC. Essa variabilidade na gravidade correlaciona-se com expressão
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3/154 residual de IDUA; pacientes com duas mutações que resultam em ausência de expressão da enzima ativa — incluindo mutações nonsense, deleções e algumas mutações missense — tipicamente presentes com sintomas antes da idade de dois anos, e exibem universalmente declínio cognitivo grave depois de um período inicial de desenvolvimento normal (Terlato NJ & Cox GF, 2003, Genetics in Medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 5(4):286-294). Essa forma grave de MPS I é também denominada síndrome de Hurler (Η) . Pacientes com pelo menos uma mutação que resulta na produção de uma quantidade pequena de IDUA ativa exibem um fenótipo atenuado, chamado de síndrome de Hurler-Scheie (HS) ou síndrome de Scheie. Esses pacientes podem apresentar sintomas já no início da infância ou podem não ser identificados até que depois da primeira década de vida. Embora o início seja em geral mais tarde e a gravidade possa ser reduzida, os pacientes com a forma atenuada de MPS I podem experimentar as mesmas características somáticas que aquelas da síndrome de Hurler (Vijay S & Wraith JE, 2005, Acta Paediatrica 94(7) :872-877) . Pacientes com a forma atenuada de MPS I também apresentam altas taxas de complicações neurológicas, incluindo compressão da medula espinhal e hidrocefalia. O comprometimento cognitivo é relatado em aproximadamente 30% dos pacientes classificados como portadores da forma atenuada de MPS I (Beck M, et al. , 2014, Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10) :759-765) .
[0006] A terapia de reposição enzimática (TRE) [Aldurazyme® (laronidase)] foi aceita como o padrão de cuidados para sintomas sistêmicos de MPS I, porém não trata as manifestações
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4/154 no SNC (de Ru MH, et al., 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Wraith JE, et al., 2007, Pediatrics 120(1): E37E46) . O transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) não tem impacto sobre os sintomas neurocognitivos de MPS I, mas existem limitações importantes do procedimento. O TCTH para MPS I está associado com morbidade substancial e até 20% de mortalidade, e o tratamento é incompleto, pois os pacientes ainda enfrentarão declínio neurocognitivo até 1 ano depois do TCTH enquanto a expressão de IDUA estabiliza (Fonte: Ru MH, et al. , 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Fleming DR, et al., 1998, Pediatric transplantation 2 (4) :299-3 04; Boelens JJ, et al., 2007, Bone Marrow Transplantation 40(3) :225-233; Souillet G, et al., 2003, Bone Marrow Transplantation 31(12) :1105-1117; Whitley CB, et al., 1993, American Journal of Medical Genetics 46(2):209-218). Entre os pacientes com enxertia bem sucedida, a inteligência tipicamente permanece significativamente abaixo da normal.
3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0007] A invenção envolve a entrega de uma a-L-iduronidase glicosada inteiramente humana (HuGly) (HuGlyTDUA) ao líquido cefalorraquidiano (LCR) do sistema nervoso central de um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MBS I), incluindo, entre outros, pacientes diagnosticados com síndrome de Hurler, Hurler-Scheie ou de Scheie. Em uma modalidade preferida, o tratamento é realizado através da terapia gênica - p. ex., administrando um vetor viral ou outra construção de expressão do DNA que codifica a IDUA humana (hIDUA) , ou um derivado de hIDUA, para o LCR de um paciente
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5/154 (indivíduo humano) diagnosticado com MPS I, de modo gue é gerado um depósito permanente de células transduzidas que fornece continuamente o produto glicosilado inteiramente humano do transgene ao SNC. A HuGlylDUA secretada no LCR desde o depósito será absorvida por endocitose pelas células no SNC, resultando na correção cruzada do defeito enzimático nas células receptoras. Em uma modalidade alternativa, a HuGlylDUA pode ser produzida em cultura celular e administrada como uma terapia de reposição enzimática (TRE), p. ex., injetando a enzima. 0 entanto, a abordagem de terapia gênica oferece diversas vantagens em relação à TRE - a entrega sistêmica da enzima não resultará em tratamento do SNC porque a enzima não consegue atravessar a barreira hematoencefálica; e, diferentemente da abordagem de terapia gênica da invenção, para entrega direta da enzima no SNC, havería necessidade de injeções repetidas, as quais são não só penosas, mas também apresentam um risco de infeção.
[0008] A HuGlylDUA codificada pelo transgene pode incluir, entre outros, IDUA humana (hIDUA) , com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (conforme mostrada na Figura 1), e derivados da hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, p. ex., incluindo, entre outras, substituições de aminoácidos selecionados dentre os resíduos correspondentes não conservados em ortólogos de IDUA mostrados na Figura 2, com a ressalva de que tais mutações não incluem qualquer uma já identificada em fenótipos graves, graves-intermediários, intermediários ou atenuados de MPS I mostrados na Figura 3 (em Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, listagem na Tabela 1 de 57 mutações em pacientes com MPS I, cujo conteúdo
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6/154 é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência); ou relatados por Venturi et al. , 2002, Human Mutation #522 Online (Venturi 2002), ou Bertoia et al., 2011 Human Mutation
32:E2189-E2210 (Bertoia 2011), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[0009] Por exemplo, substituições de aminoácidos em uma determinada posição da hIDUA podem ser selecionadas a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes não conservados encontrados naquela posição nos ortólogos de IDUA representados na Figura 2 (mostrando o alinhamento de ortólogos conforme relatado em Malta et al., 2013, PNAS 110:14628, Figura S8, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência), com a ressalva de que tais substituições não incluam qualquer uma das mutações prejudiciais mostradas na Figura 3 ou relatadas em Venturi 2002 ou Bertoia 2011 supra. O produto transgênico resultante pode ser testado por meio de ensaios convencionais in vitro, em cultura celular ou animais de teste, visando assegurar que a mutação não afete a função da IDUA. As substituições, deleções ou adições preferidas de aminoácidos selecionadas devem ser aquelas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática, estabilidade ou meia-vida da IDUA, conforme testadas por ensaios convencionais in vitro, em cultura celular ou modelos animais para MPS I. Por exemplo, a atividade enzimática do produto transgênico pode ser avaliada por meio de um ensaio enzimático convencional com 4metilumbeliferil α-L-iduronida como o substrato (vide, p. ex., Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al. , 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; e Kakkis et al. , 1994,
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Prot Exp Purif 5: 225-232 para ensaios enzimáticos exemplares de IDUA que podem ser utilizados, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). A capacidade do produto transgênico para corrigir o fenótipo de MPS I pode ser avaliada em cultura celular; p. ex., transduzindo células de MPS I em cultura com um vetor viral ou outra construção de expressão do DNA codificante de hIDUA ou um derivado; adicionando a rHuGlylDUA ou um derivado a células de MPS I em cultura; ou cultivando concomitantemente células de MPS I com células hospedeiras humanas criadas para expressar e secretar rHuGlylDUA ou um derivado, e determinando a correção do defeito nas células cultivadas de MPS I, p. ex., pela atividade enzimática detectada de IDUA e/ou a redução no depósito de GAG nas células de MPS I em cultura (vide, p. ex., Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; e Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
[0010] Modelos animais para MPS I foram descritos para camundongos (vide, p. ex. , Clarke et al. , 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511), o gato doméstico de pelo curto (vide, p. ex., Haskins et al. , 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97), e diversas raças de cães (vide, p. ex., Menon et al., 1992, Genomics
14(3):763-768,- Shull et al. , 1982, Am J Pathol 109(2):244248). O modelo de MPS I no cão assemelha-se à síndrome de Hurler, a forma mais grave de MPS I, uma vez que a mutação na IDUA resulta em nenhuma proteína detectável. A alta homologia de genes entre proteínas IDUA (vide o alinhamento na Figura 2) significa que hIDUA é funcional em animais, e tratamentos abrangendo hIDUA podem ser testados nesses modelos animais.
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8/154 [0011] De preferência, o transgene de rHuGlylDUA deve ser controlado por elementos de controle da expressão que atuam em neurônios e/ou células gliais, p. ex. , o promotor CB7 (um promotor de β-actina de galinha e reforçador de CMV), e pode incluir outros elementos de controle da expressão que aumentam a expressão do transgene dirigida pelo vetor (p. ex., intron de β-actina de galinha e sinal poli A de e β-globina de coelho) . A construção do cDNA para o transgene de hIDUA deve incluir uma sequência de codificação para um peptídeo sinal que assegure o devido processamento concomitante e póstraducional (glicosilação e sulfatação proteica) pelas células transduzidas do SNC. Tais peptídeos sinais utilizados pelas células do SNC podem incluir, entre outros:
• Peptídeo sinal da glicoproteína da mielina de oligodendrócitos (hOMG):
MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (SEQ ID NO:2) • Peptídeo sinal do repressor celular dos genes 2 estimulados por EIA (hCREG2):
MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (SEQ ID NO:3) • Peptídeo sinal do domínio V-set e transmembrana contendo 2B (hVSTM2B):
MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA (SEQ ID NO:4) • Peptídeo sinal da protocaderina alfa-1 (hPCADHAl):
MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (SEQ ID NO:5)
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9/154 • Peptídeo sinal de FAM19A1 (TAFA1):
MAMVSAMSWVLYLWISACA (SEQ ID NO:6) • Peptídeo sinal de interleucina-2:
MYRMQLLSCIALILALVTNS (SEQ ID NO:14)
Os peptídeos sinais podem também ser referidos no presente documento como sequências líderes ou peptídeos líderes.
[0012] O vetor recombinante utilizado para entrega do transgene deve ter um tropismo para células no SNC, incluindo, entre outros, neurônios e/ou células gliais. Tais vetores podem incluir vetores recombinantes não replicantes do vírus adenoassociado (rAAV), sendo especialmente preferidos aqueles que carregam um capsídeo AAV9 ou AAVrhlO. Capsídeos AAV variantes podem ser utilizados, incluindo, entre outros aqueles descritos por Wilson na Patente U.S. N° 7 906 111, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência, sendo AAV/hu.31 e AAV/hu32 especialmente preferidos; bem como os capsídeos AAV variantes descritos por Chatterjee na Patente U.S. N° 8 628 966, Patente U.S. N° 8 927 514 e Smith et al., 2014, Mol Ther 22: 1625-1634, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. No entanto, outros vetores virais podem ser utilizados, incluindo, entre outros, vetores lentivirais, vetores de vírus Vaccíníum ou vetores de expressão não virais chamados de construções de DNA nu (DNA naked) (vide a Seção 5.2) .
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10/154 [0013] As composições farmacêuticas adequadas para administração ao LCR compreendem uma suspensão do vetor de rHuGlylDUA em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um tensoativo e excipientes opcionais. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intratecal. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracisternal (injeção na cisterna magna). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para injeção no espaço subaracnóideo através de punção Cl-2. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracerebroventricular. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas are adequadas para administração através de punção lombar.
[0014] Doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas ao LCR através de administração intratecal (ou seja, injeção no espaço subaracnóideo de modo que os vetores recombinantes se distribuam através do LCR e transduzam células no SNC). Isso pode ser alcançado de diversas maneiras - p. ex., por injeção intracraniana (cisternal ou ventricular) ou injeção na cisterna lombar. Por exemplo, a injeção intracisternal (IC) (na cisterna magna) pode ser realizada por punção suboccipital guiada por TC; ou a injeção no espaço subaracnóideo pode ser realizada através de punção Cl-2 guando viável para o paciente; ou a punção lombar (tipicamente procedimentos diagnósticos realizados visando coletar uma amostra de LCR) pode ser utilizada para obter acesso ao LCR. Alternativamente, a administração
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11/154 intracerebroventricular (ICV) (uma técnica mais invasiva utilizada para a introdução de fármacos anti-infecciosos ou antineoplásicos que não penetram a barreira hematoencefálica) pode ser utilizada para instilar os vetores recombinantes diretamente nos ventrículos do cérebro. Alternativamente, a administração intranasal pode ser utilizada para entrega do vetor recombinante no SNC. Devem ser utilizadas doses que mantenham uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/mL ou concentrações que variam de 9,25 a 277 pg/mL.
[0015] As concentrações no LCR podem ser monitoradas medindo diretamente a concentração de rHuGlylDUA no líquido LCR obtido de punções occipitais ou lombares, ou estimadas por extrapolação a partir de concentrações da rHuGlylDUA no soro do paciente. Em certas modalidades, 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlylDUA no soro é indicativo de 1 a 30 mg de rHuGlylDUA no LCR. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlylDUA no soro.
[0016] Nesse contexto, a IDUA humana é traduzida como um polipeptídeo de 653 aminoácidos e é N-glicosilada em seis sítios potenciais (N110, N190, N336, N372, N415 e N451) como representada na Figura 1. A sequência sinal é removida e o polipeptídeo é processado para a forma madura em lisossomos: um precursor intracelular de 75 kDa é cortado para 72 kDa em diversas horas e, no final, ao longo de 4 a 5 dias, é processado para uma forma intracelular de 66 kDa. Uma forma secretada de IDUA (76 kDa ou 82 kDa dependendo do ensaio
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12/154 utilizado) é rapidamente absorvida por endocitose pelas células via o receptor de manose-6-fosfato e igualmente processada para as formas intracelulares menores (vide, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; Clements et al. , 1989, Blochem J. 259: 199-208; Taylor et al., 1991, Biochem J. 274: 263-268; e Zhao et al. , 1997 J Biol Chem 272:22758-22765, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
[0017] A estrutura global de hIDUA consiste em três domínios: os resíduos 42-396 formam um domínio em forma de barril clássico (β/α) de triosefosfato isomerase (TIM) ; os resíduos 27-42 e 397-545 formam um domínio sanduíche β com um segmento hélice-alça-hélice curto (482-508); e os resíduos 546-642 formam um domínio semelhante à Ig. Os dois últimos domínios estão ligados através de uma ponte dissulfeto entre C541 e C577 . Os domínios sanduíche β e semelhante à Ig estão ligados à primeira, a sétima e a oitava hélice α do barril TIM . Um hairpin β (em forma de grampo de cabelo) (β12 — β13) está inserido entre a oitava fita β e a oitava hélice α do barril TIM, o qual inclui N372 N-glicosilado que é necessário para ligação do substrato e atividade enzimática (vide, Figura 1 e a estrutura cristalina descrita em Malta et al. , 2013, PNAS 110: 14628-14633, e Saito et al. , 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
[0018] A invenção baseia-se, em parte, nos seguintes princípios:
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13/154 (1) Os neurônios e células gliais no SNC são células secretoras que possuem o maquinário celular para o processamento pós-traducional de proteínas secretadas incluindo glicosilação e O-sulfatação de tirosina - processos robustos no SNC. Vide, p. ex. , Sleat et al. , 2005, Proteomics 5: 1520-1532, e Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98 que descreve o glicoproteoma de manose-6-fosfato (M6P) do cérebro humano e observa que o cérebro contém mais proteínas com um número muito maior de isoformas individuais e proteínas manose-6-fosforiladas do que encontradas em outros tecidos; e
Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 e Kanan & Al-
Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: : 126-131 que relatam a
produção de glicoproteínas tirosina- -sulfatadas secretadas por
células neuronals, cujos conteúdos sobre modificações pós-
traducionais efetuadas por células humanas do SNC são aqui
incorporados, em sua totalidade, por referência.
(ii) hIDUA possui seis sítios de glicosilação em asparagina (N) identificados na Figura 1 (N110FT; N190VS;
N336TT; N372NT; N415HT; N451RS) . A N-glicosilação de N372 é necessária para ligação ao substrato e atividade enzimática, e a manose-6-fosforilaçao é necessária para captação celular da enzima secretada e correção cruzada de células de MPS I. Os sítios de glicosilação N-ligada contêm porções de carboidratos complexos com alto teor de manose e manose-fosforilados (Figura 4), mas somente a forma secretada é captada pelas células (Myerowitz & Neufeld, 1981, supra). A abordagem da terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção contínua de uma glicoproteína IDUA de 7 6 - 82 kDa, conforme medida por eletroforese em gel de poliacrilamida (dependendo
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14/154 do ensaio utilizado), que é 2,6-sialilada e manose-6fosforilada. A IDUA glicosilada/fosforilada secretada deve ser absorvida e processada corretamente por células neurais e gliais não transduzidas no SNC.
(iii) 0 tráfego/captação celular e subcelular de proteínas lisossômicas é através de M6P. É possível medir o teor de M6P de uma proteína secretada, conforme realizado em Daniele 2002 (Bíochímíca et Bíophysíca Acta 1588(3):203-9) para a enzima iduronato-2-sulfatase. Na presença de M6P inibitório (p. ex. , 5 mM) , prevê-se que a captação do precursor da enzima gerado por células não neuronals ou não gliais, tais como as células renais criadas por engenharia genética de Daniele 2002, diminua para níveis próximos àquele das células controle, conforme mostrado em Daniele 2002. Enquanto na presença de M6P inibitório, prevê-se que a captação do precursor da enzima gerado por células do cérebro, como células neuronals e gliais, permaneça em um nível elevado, conforme mostrado em Daniele 2002, quando a captação foi quatro vezes maior do que nas células controle e comparável ao nível de atividade enzimática (ou captação) do precursor da enzima gerado por células renais geneticamente modificadas sem a presença de M6P inibitório. Esse ensaio permite predizer o teor de M6P em um precursor da enzima gerado por células do cérebro, e, em particular, comparar o teor de M6P em precursores da enzima gerados por tipos diferentes de células. A abordagem da terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção contínua de hIDUA que pode ser captada por células neuronals e gliais em nível elevado na presença de M6P inibitório em tal ensaio.
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15/154 (iv) Além dos sítios de glicosilação N-ligados, hIDUA contém um sítio de sulfatação de tirosina (Y) (ADTPIY296NDEADPLVGWS) próximo ao domínio que contém N372 necessário para ligação e atividade (vide, p. ex., Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. na p. 2154, cujo conteúdo sobre a análise de aminoácidos em volta dos resíduos de tirosina submetidos à sulfatação de tirosina da proteína é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. As regras podem ser resumidas como segue: resíduos Y com E ou D dentro de +5 a -5 posições de Y, e quando a posição -1 de Y é um aminoácido neutro ou ácido com carga - mas não um aminoácido básico, p. ex., R, K ou H que abole a sulfatação) . Embora sem pretender vincular-se a qualquer teoria, a sulfatação desse sítio na hIDUA pode ser crítica para atividade, pois mutações dentro da região de sulfatação de tirosina (p. ex., W306L) são conhecidas por sua associação com atividade enzimática diminuída e doença (vide, Malta et al., 2013, PNAS 110:14628 nas páginas 14632-14633).
(v) A glicosilação de hIDUA por células humanas do SNC resultará na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, a meia-vida e reduzir a agregação indesejada do produto transgênico. Significativamente, os glicanos que são adicionados à HuGlylDUA da invenção são N-glicanos biantenários do tipo complexos altamente processados que incluem ácido 2,6-siálico, incorporando Neu5Ac (NANA), mas não seu derivado hidroxilado, NeuGc (Ácido Nglicolilneuramínico, ou seja, NGNA ou Neu5Gc). Tais glicanos não estão presentes na laronidase que é produzida em células CHO que não dispõem da 2,6-sialiltransferase
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16/154 necessária para efetuar essa modificação pós-traducional, nem as células CHO produzem GlcNAc bissectado, embora adicionem Neu5Gc (NGNA) como ácido siálico não típico (e potencialmente imunogênico) a humanos em vez de Neu5Ac (NANA) . Vide, p. ex., Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 (Online inicialmente, pág. 1-13 em p. 5); e Hague et al., 1998 Electrophor 19:2612-2630 ([t]he CHO cell line is considered 'phenotypically restricted,' in terms of glycosylation, due to the lack of an a2,6-syalyl-transf erase) . Além do mais, as células CHO podem também produzir um glicano imunogênico, o antígeno α-Gal, que reage com anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos e, em concentrações elevadas, pode desencadear anafilaxia. Vide, p. ex., Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156. O padrão de glicosilação humana da
HuGlylDUA da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgênico e melhorar a eficácia.
(vi) Sulfatação de tirosina de hIDUA - um processo póstraducional robusto em células do SNC humano - deve resultar em processamento e atividade melhorados dos produtos transgênicos. A significância da sulfatação de tirosina de proteínas lisossômicas não foi elucidada; porém, em outras proteínas, demonstrou aumentar a avidez de interações proteína-proteína (anticorpos e receptores) e promover o processamento proteolítico (hormônio peptídico) (vide, Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; e Bundegaard et al. , 1995, The EMBO J 14: 3073-79) . O nível de expressão de tirosilproteína sulfotransferase (TPST1), responsável pela sulfatação da tirosina (que pode ocorrer como uma etapa final no processamento de IDUA), é aparentemente elevado (com base
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17/154 em mRNA) no cérebro (dados sobre a expressão do gene para TPST1 podem ser encontrados, por exemplo, no EMBL-EBI Expression Atlas, acessível em http://www.ebi.ac.uk/gxa/home). Tal modificação pós-traducional, no mínimo, está subrepresentada na laronidase - um produto de células CHO. Diferentemente das células do SNC humano, as células CHO não são secretoras e possuem capacidade limitada para sulfatação de tirosina pós-traducional (vide, p. ex., Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, esp. a discussão na página 1537) .
(vii) A imunogenicidade de um produto transgênico pode ser induzida por vários fatores, incluindo a condição imune do paciente, a estrutura e características do fármaco proteico infundido, a via de administração e a duração do tratamento. Impurezas relacionadas ao processo, como proteína da célula hospedeira (HOP), DNA da célula hospedeira e resíduos químicos, e impurezas relacionadas ao produto, como produtos de degradação e características estruturais da proteína, como glicosilação, oxidação e agregação (partículas subvisíveis), podem também aumentar a imunogenicidade por servirem como um adjuvante que intensifica a resposta imune. As quantidades de impurezas relacionadas ao processo e relacionadas ao produto podem ser afetadas pelo processo de fabricação: cultura celular, purificação, formulação, armazenamento e manuseio, os quais podem afetar produtos à base de IDUA fabricados comercialmente. Na terapia gênica, as proteínas são produzidas in vivo, de modo que não há impurezas relacionadas ao processo presentes e os produtos proteicos provavelmente não contêm impurezas relacionadas ao produto/produtos de degradação
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18/154 associados com as proteínas produzidas por tecnologias recombinantes, como agregação e oxidação das proteínas. A agregação, por exemplo, está associada com a produção e armazenamento de proteínas em decorrência da alta concentração proteica, a interação com a superfície do equipamento de fabricação e recipientes e o processo de purificação com certos sistemas tampão. Porém, essas condições que promovem a agregação não estão presentes quando um transgene é expresso in vivo. A oxidação, como a oxidação de metionina, triptofano e histidina, está também associada com a produção e armazenamento de proteínas e é causada, por exemplo, por condições de estresse na cultura celular, metal e contato com o ar, além de impurezas em tampões e excipientes. As proteínas expressas ín vivo podem também oxidar em uma condição estressante, porém os humanos, como muitos organismos, estão equipados com um sistema de defesa contra oxidação, que não só reduz o estresse da oxidação, mas pode também reparar e/ou reverter a oxidação. Assim, não é provável que proteínas produzidas ín vivo fiquem em forma oxidada. A agregação e a oxidação poderíam afetar a potência, PK (depuração) e podem aumentar preocupações sobre imunogenicidade. A abordagem da terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção contínua de hIDUA com imunogenicidade reduzida em comparação a produtos fabricados comercialmente.
[0019] Pelos motivos precedentes, a produção de HuGlylDUA deve resultar em uma molécula biomelhor para o tratamento de MPS I realizado por terapia gênica - p. ex., administrando um vetor viral ou outra construção de expressão do DNA codificante de HuGlylDUA ao LCR de um paciente (indivíduo
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19/154 humano) diagnosticado com uma doença do tipo MPS I (incluindo, entre outras, síndrome de Hurler, Hurler-Scheie ou Scheie) para criar um depósito permanente no SNC que forneça continuamente um produto transgênico sulfatado, manose-6fosforilado, glicosilado inteiramente humano, secretado pelas células transduzidas do SNC. 0 produto transgênico HuGlylDUA secretado desde o depósito no LCR será absorvido por endocitose pelas células no SNC, resultando na correção cruzada do defeito enzimático nas células receptoras de MRS I.
[0020] Não é essencial que toda molécula de hIDUA produzida quer pela abordagem de terapia gênica quer por terapia proteica seja inteiramente glicosilada e sulfatada. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve dispor de glicosilação (incluindo 2,6-sialilação e manose-6fosforilação) suficientes para demonstrar eficácia. O objetivo do tratamento com a terapia gênica da invenção é retardar ou sustar a progressão da doença. A eficácia pode ser monitorada medindo-se a função cognitiva (p. ex., prevenção ou diminuição do declínio neurocognitivo); reduções em biomarcadores da doença (como GAG) no LCR e/ou soro; e/ou aumento na atividade enzimática de IDUA no LCR e/ou soro. Os sinais de inflamação e outros eventos de segurança podem também ser monitorados.
[0021] Como tratamento alternativo ou adicional à terapia gênica, a glicoproteína rHuGlylDUA pode ser produzida em linhagens celulares humanas pela tecnologia do DNA recombinante e a glicoproteína pode ser administrada a pacientes diagnosticados com MPS I por via sistêmica e/ou no
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LCR para TRE) [sic] . As linhagens celulares humanas que podem ser utilizadas para tal produção da glicoproteína recombinante incluem, entre outras, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SHSY5y, hNSCll, ReNcell ATM, células 293 de rim embrionário humano (HEK293), HT-1080 de fibrossarcoma, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares da retina, PER.C6 ou RPE para citar algumas (vide, p. ex. , Dumont et al. , 2016, Critical Rev in Biotech 36(6) :1110-1122 Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives, cujo conteúdo sobre uma revisão das linhagens celulares humanas que poderíam ser utilizadas para a produção recombinante da glicoproteína rHuGlylDUA é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência a glicoproteína ). Para assegurar a glicosilação, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina completa, a linhagem celular utilizada para a produção pode ser aprimorada por engenharia das células hospedeiras para que expresse concomitantemente a-2,6sialiltransferase (ou ambas, a-2,3- e a-2,6sialiltransferases) e/ou as enzimas TPST-1 e TPST-2, responsáveis pela O-sulfatação de tirosina.
[0022] Embora a rHuGlylDUA entregue deva minimizar as reações imunes, a fonte potencial mais evidente de toxicidade relacionada à terapia gênica direcionada ao SNC é a imunidade gerada contra a proteína hIDUA expressa em indivíduos humanos com deficiência genética de IDUA e, portanto, potencialmente não tolerantes à proteína e/ou ao vetor utilizado para entrega do transgene.
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21/154 [0023] Assim, em uma modalidade preferida, é aconselhável tratar concomitantemente o paciente com terapia de supressão imune -- especialmente quando forem tratados pacientes portadores de formas graves da doença com níveis próximos ao zero de IDUA (p. ex., Hurler) . Podem ser empregadas terapias de supressão imune que envolvem um esquema com tacrolimo ou rapamicina (sirolimo), por exemplo, em combinação com ácido micofenólico ou em combinação com um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona, ou outros esquemas de supressão imune utilizados em procedimentos de transplante de tecidos. Tal tratamento de supressão imune pode ser administrado no decorrer da terapia gênica e, em certas modalidades, o pré-tratamento com terapia de supressão imune pode ser preferido. A terapia de supressão imune pode ser continuada subsequentemente ao tratamento com terapia gênica, com base no juízo do médico responsável pelo tratamento, e pode, posteriormente, ser retirada quando a tolerância imune tiver sido induzida; p. ex., depois de 180 dias.
[0024] Combinações da HuGlyTDUA entregue no LCR, acompanhada pela administração de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou depois do tratamento com terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS I que poderíam ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, entre outros, terapia de reposição enzimática com laronidase administrada por via sistêmica ou ao LCR; e/ou terapia de TCTH.
MODALIDADES ILUSTRATIVAS
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1. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de a-Liduronidase humana recombinante (IDUA), produzida por células neuronals humanas, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano.
2. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante, produzida por células gliais humanas, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano.
3. 0 método do parágrafo 1 ou 2, compreendendo ainda
administrar uma terapia de supressão imune ao referido
indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA
humana e continuar a terapia de supressão imune
posteriormente.
4. Um método para tratar um indivíduo humano
diagnosticado com MPS I, compreendendo:
liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana «2,6-sialilada.
5. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável.
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23/154
6. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
liberar no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
7. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana que contém sulfatação de tirosina.
8. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor
de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA
é «2, 6-sialilada quando da expressão, a partir do referido
vetor de expressão, em uma célula neuronal humana
imortalizada.
9. Um método para tratar um indivíduo humano
diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável quando da
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24/154 expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada.
10. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada.
11. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é tirosina-sulfatada quando da expressão, a partir do referido
vetor de expressão, em uma célula neuronal humana
imortalizada.
12 . Um método para tratar um indivíduo humano
diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS D ,
compreendendo:
administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado.
13. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
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25/154 administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável.
14. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antigeno a-Gal.
15. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina.
16.
método de qualquer um dos parágrafos 3 a 15 compreendendo ainda administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo, compreendendo administrar uma
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26/154 combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico, ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar posteriormente.
.
método do parágrafo 16 no qual a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias.
18. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 17 no qual a IDUA humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1.
19. O método do parágrafo 18 compreendendo ainda administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo, compreendendo administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana.
20 . 0 método do parágrafo 19 no qual a terapia de
supressão imune é retirada depois de 180 dias.
21. 0 método do parágrafo 12 no qual a produção da
referida IDUA contendo um glicano a.2, 6-sialilado é confirmada
transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular.
22. O método do parágrafo 13 no qual a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável é
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27/154 confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular.
23. 0 método do parágrafo 14 no qual a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular.
24. 0 método do parágrafo 15 no qual a produção da referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular.
25. 0 método de qualquer um dos parágrafos 21-24, no qual a produção é confirmada na presença e ausência de manose-6fosfato.
26. 0 método de qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-25, ou de qualquer um dos parágrafos 16-17 quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 815, em que o vetor de expressão ou vetor de expressão de nucleotídeo recombinante codifica um peptídeo sinal.
27. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente
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28/154 eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado;
em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado na referida cultura celular.
28. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável; em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável, na referida cultura celular.
29. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal; em que o referido
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29/154 vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável e/ou antígeno α-Gal, na referida cultura celular.
30. Um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo:
administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA que contém uma sulfatação de tirosina;
em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é tirosina-sulfatada na referida cultura celular.
31. O método de qualquer um dos parágrafos 27 a 30 compreendendo ainda administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo, compreendendo administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar posteriormente.
32. O método do parágrafo 31 no qual a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias.
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33. O método de qualquer um dos parágrafos 1-32, em que ο indivíduo humano tem menos de 3 anos de idade.
34. O método de qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-33, ou de qualquer um dos parágrafos 16-20 quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 815, em que o indivíduo humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou o vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado (por exemplo, administração IC (como por injeção suboccipital)) a uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral ou 5 χ 1010 GC/g de massa cerebral (por exemplo, em uma dose fixa única).
35. O método de qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-33, ou de qualquer um dos parágrafos 16-20 quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 815, em que o indivíduo humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou o vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado (por exemplo, Administração IC (como por injeção suboccipital)) a uma dose que variam de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral a 5 χ 1010 GC/g de massa cerebral (por exemplo, em uma dose fixa única).
. DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS [0025] FIGURA 1. A sequência de aminoácidos de IDUA humana. Seis sítios de glicosilação N-ligados (N) estão em negrito e sublinhados; um sítio de O-sulfatação de tirosina (Y) está em negrito e sublinhado, e a sequência completa do sítio de sulfatação (ADTPIYNDEADPLVGWS) está sombreada; e uma ligação dissulfeto (duas cisteínas como os resíduos; C) está em
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31/154 negrito e sublinhada. 0 N-terminal do produto recombinante secretado produzido em células CHO é A26, enquanto que o Nterminal da enzima intracelular nativa do fígado humano é E27 (vide, Kakkis et al. , 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232, na página 230).
[0026] FIGURA. 2. Alinhamento de múltiplas sequências de hIDUA com ortólogos conhecidos. As sequências foram alinhadas utilizando Clustal X ver.2 (Larkin MA, et al. , 2007, Clustal W e Clustal X versão 2.0. Bioinformatics 23(21):2947-2948). Os nomes das espécies e as identificações (IDs) da proteína foram como segue: humana (Homo sapiens; NP_000194.2 ) , cão (Canis familiaris; M81893.1), vaca (Bos taurus; XP_002688492.1), camundongo (Mus musculus; NP_032351.2), rato (Rattus norvegicus; NP_001165555.1), ornitorrinco (Ornithorhynchus anatinus; XP_001514102.2), galinha (Gallus gallus; NP_001026604.1), Xenopus (Xenopus laevis; NP_001087031.1), peixe-zebra (Danio rerio; XP_001923689.3) , ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus; XP_796813.3) ciona (Ciona intestinalis; XP_002120937.1) e mosca das frutas (Drosophila melanogaster; NP_609489.1) . O sítio de N-glicosilação na proteína humana (N110, N190, N336, N372, T374, N415, N451); os resíduos envolvidos na ligação ao substrato (R89, H91, N181, E182, H262, K264, E299, D349 e R363) e a interação com o Nglicano em N372 (P54, H58, W306, S307, Y355, R368 e Q370) estão indicados por sombreamento (Adaptado de: Malta et al., 2013, PNAS 110: 14628-14633; Supplementary Material, Fig. S8) .
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32/154 [0027]
FIGURA 3. mutações de MPS I, alterações estruturais em IDUA e fenótipos (Fonte: Saito et al. , Mol Genet Metab
111:107-112, Tabela 1).
[0028] FIGURA 4. Oligossacarídeos nos seis sítios de glicosilação da O-L-iduronidase humana recombinante secretada por células CHO. C, complexo; M, alto teor de manose; P, alto teor de manose, fosforilada. As letras maiusculas indicam que oligossacarídeos principais bem caracterizados, enquanto letras minúsculas indicam componentes menores ou não completamente caracterizados (Fonte: Zhao et al., 1997, J Biol Chem 272: 22758-22765).
[0029] FIGURA 5. Alinhamento de múltiplas sequências utilizando Clustal dos capsídeos AAV 1-9 (SEQ ID NOs: 1626). É possível efetuar substituições de aminoácidos (mostradas em negrito nas linhas inferiores) nos capsídeos AAV9 e AAV8 recrutando resíduos de aminoácidos na posição correspondente de outros capsídeos AAV alinhados. Regiões na sequência designadas por HVR = regiões hipervariáveis.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0030] A invenção envolve a entrega de uma (HuGly) a-Liduronidase (HuGlylDUA) humana inteiramente glicosada (HuGly) (HuGlylDUA) ao líquido cefalorraquidiano (LCR) do sistema nervoso central de um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), incluindo, entre outros, pacientes diagnosticados com síndrome de Hurler, Hurler-Scheie ou Scheie. Em uma modalidade preferida, o tratamento é realizado por terapia gênica - p. ex., administrando um vetor
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33/154 viral ou outra construção de expressão do DNA codificante de IDUA humana (hIDUA) , ou um derivado de hIDUA, ao LCR de um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com MPS I, de modo que seja gerado um depósito permanente de células transduzidas que fornece continuamente o produto transgênico humano inteiramente glicosilado ao SNC. A HuGlylDUA secretada a partir do depósito no LCR será absorvida por endocitose pelas células no SNC, resultando na correção cruzada do defeito enzimático nas células receptoras. Em uma modalidade alternativa, a HuGlylDUA pode ser produzida em cultura celular e administrada como uma terapia de reposição enzimática (TRE), p. ex., injetando a enzima. No entanto, a abordagem da terapia gênica oferece diversas vantagens em relação à TRE - a entrega sistêmica da enzima não resultará no tratamento do SNC, uma vez que a enzima não consegue cruzar a barreira hematoencefálica; e, diferentemente da abordagem da terapia gênica da invenção, a entrega direta da enzima ao SNC necessitaria de injeções repetidas que são não só incômodas, mas também apresentam um risco de infecção.
[0031] A HuGlylDUA codificada pelo transgene pode incluir, entre outras, IDUA humana (hIDUA) com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (conforme mostrada na Figura 1), e derivados de hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, p. ex., incluindo, entre outras, substituições de aminoácidos selecionados dentre os resíduos correspondentes não conservados em ortólogos de IDUA mostrados na Figura 2, com a ressalva de que tais mutações não incluem qualquer uma já identificada em fenótipos graves, graves-intermediários, intermediários ou atenuados de MPS I mostrados na Figura 3
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(from, Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, Tabela
1, listagem de 57 mutações na MPS I, cujo conteúdo é aqui
incorporado, em sua totalidade, por referência); ou relatados
por Venturi et al., 2002, Human Mutation #522 Online (v 'Venturi
2002), ou Bertoia et al. , 2011 Human Mutation 32:E2189-E2210 (Bertoia 2011), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[0032] Por exemplo, as substituições de aminoácidos em uma determinada posição da hIDUA podem ser selecionadas a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes não conservados encontrados naquela posição nos ortólogos de IDUA representados na Figura 2 (mostrando o alinhamento de ortólogos conforme relatado em Malta et al., 2013, PNAS 110:14628, Figura S8, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência), com a ressalva de que tais substituições não incluam qualquer uma das mutações prejudiciais mostradas na Figura 3 ou relatadas em Venturi 2002 ou Bertoia 2011 supra. O produto transgênico resultante pode ser testado por meio de ensaios convencionais in vitro, em cultura celular ou animais de teste, visando assegurar que a mutação não afete a função da IDUA. As substituições, deleções ou adições preferidas de aminoácidos selecionadas devem ser aquelas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática, estabilidade ou meia-vida da IDUA, conforme testadas por ensaios convencionais in vitro, em cultura celular ou modelos animais para MPS I. Por exemplo, a atividade enzimática do produto transgênico pode ser avaliada por meio de um ensaio enzimático convencional com 4metilumbeliferil α-L-iduronida como o substrato (vide, p. ex.,
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Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al., 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; e Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 para ensaios enzimáticos exemplares de IDUA que podem ser utilizados, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). A capacidade do produto transgênico para corrigir o fenótipo de MPS I pode ser avaliada em cultura celular; p. ex., transduzindo células de MPS I em cultura com um vetor viral ou outra construção de expressão do DNA codificante de hIDUA ou um derivado; adicionando a rHuGlylDUA ou um derivado a células de MPS I em cultura; ou cultivando concomitantemente células de MPS I com células hospedeiras humanas criadas para expressar e secretar rHuGlylDUA ou um derivado, e determinando a correção do defeito nas células cultivadas de MPS I, p. ex., pela atividade enzimática detectada de IDUA e/ou a redução no depósito de GAG nas células de MPS I em cultura (vide, p. ex., Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; e Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
[0033] Modelos animais para MPS I foram descritos para camundongos (vide, p. ex. , Clarke et al. , 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511), o gato doméstico de pelo curto (vide, p. ex., Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97) e diversas raças de cães (vide, p. ex., Menon et al., 1992, Genomics
14(3):763-768,- Shull et al. , 1982, Am J Pathol 109(2):244248). O modelo de MPS I no cão assemelha-se à síndrome de Hurler, a forma mais grave de MPS I, uma vez que a mutação na IDUA resulta em nenhuma proteína detectável. A alta homologia de genes entre proteínas IDUA (vide o alinhamento na Figura 2)
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36/154 significa que hIDUA é funcional em animais, e tratamentos abrangendo hIDUA podem ser testados nesses modelos animais.
[0034] De preferência, o transgene da rHuGlylDUA deve ser controlado por elementos de controle da expressão que atuam em neurônios e/ou células gliais, p. ex. , o promotor CB7 (um promotor de β-actina de galinha e reforçador de CMV), e pode incluir outros elementos de controle da expressão que aumentam a expressão do transgene dirigida pelo vetor (p. ex., intron de β-actina de galinha e sinal poli A de β-globina de coelho). A construção do cDNA para o transgene de huIDUA deve incluir uma sequência de codificação para um peptídeo sinal que assegure o devido processamento concomitante e pós-traducional (glicosilação e sulfatação proteica) pelas células transduzidas do SNC. Tais peptídeos sinais utilizados pelas células do SNC podem incluir, entre outros:
Peptídeo sinal da glicoproteína da mielina de oligodendrócitos (hOMG):
MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (SEQ ID NO:2)
Peptídeo sinal do repressor celular dos genes 2 estimulados por EIA (hCREG2):
MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (SEQ ID NO:3) • Peptídeo sinal do domínio V-set e transmembrana contendo 2B (hVSTM2B):
MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA (SEQ ID NO:4)
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37/154 • Peptídeo sinal da protocaderina alfa-1 (hPCADHAl):
MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (SEQ ID NO:5)
Peptídeo sinal de FAM19A1 (TAFA1):
MAMVSAMSWVLYLWISACA (SEQ ID NO:6)
Peptídeo sinal de interleucina-2:
MYRMQLLSCIALILALVTNS (SEQ ID NO:14)
Peptídeos sinais podem também ser referidos no presente documento como sequências líderes ou peptídeos líderes.
[0035] O vetor recombinante utilizado para entrega do transgene deve ter um tropismo para células no SNC, incluindo, entre outros, neurônios e/ou células gliais. Tais vetores podem incluir vetores recombinantes não replicantes do vírus adenoassociado (rAAV), sendo especialmente preferidos aqueles que carregam um capsídeo AAV9 ou AAVrhlO. Capsídeos AAV variantes podem ser utilizados, incluindo, entre outros, aqueles descritos por Wilson na Patente U.S. N° 7 906 111 cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência, sendo AAV/hu.31 e AAV/hu32 especialmente preferidos; bem como os capsídeos AAV variantes descritos por Chatterjee na Patente U.S. N° 8 628 966, Patente U.S. N° 8 927 514 e Smith et al., 2014, Mol Ther 22: 1625-1634, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. No entanto, outros vetores virais podem ser utilizados, incluindo, entre outros, vetores lentivirais, vetores de vírus Vaccíníum, ou vetores de expressão não virais
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38/154 chamados de construções de DNA nu (DNA naked) (vide a Seção
5.2) .
[0036] As composições farmacêuticas adequadas para administração ao LCR compreendem uma suspensão do vetor de rHuGlylDUA em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um tensoativo e excipientes opcionais. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracisternal (injeção na cisterna magna). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para injeção no espaço subaracnóideo através de punção Cl-2. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intratecal. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracerebroventricular. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas are adequadas para administração através de punção lombar.
[0037] Doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas ao LCR através de administração intratecal (ou seja, injeção no espaço subaracnóideo de modo que os vetores recombinantes se distribuam através do LCR e transduzam células no SNC). Isso pode ser realizado de diversas maneiras - p. ex., por injeção intracraniana (cisternal ou ventricular) ou injeção na cisterna lombar. Por exemplo, a injeção intracisternal (IC) (na cisterna magna) pode ser realizada por punção suboccipital guiada por TC; ou a injeção no espaço subaracnóideo pode ser realizada através de punção Cl-2 guando viável para o paciente; ou a punção lombar
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39/154 (tipicamente procedimentos diagnósticos realizados visando coletar uma amostra de LCR) pode ser utilizada para obter acesso ao LCR. Alternativamente, a administração intracerebroventricular (ICV) (uma técnica mais invasiva utilizada para a introdução de fármacos anti-infecciosos ou antineoplásicos que não penetram a barreira hematoencefálica) pode ser utilizada para instilar os vetores recombinantes diretamente nos ventrículos do cérebro. Alternativamente, pode-se utilizar a administração intranasal para a entrega do vetor recombinante ao SNC. Devem ser utilizadas doses que mantenham uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/mL ou concentrações que variam de 9,25 a 277 pg/mL.
[0038] As concentrações no LCR podem ser monitoradas medindo diretamente a concentração de rHuGlylDUA no líquido LCR obtido de punções occipitais ou lombares, ou estimadas por extrapolação a partir de concentrações da rHuGlylDUA no soro do paciente. Em certas modalidades, 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlylDUA no soro é indicativo de 1 a 30 mg de rHuGlylDUA no LCR. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlylDUA no soro.
[0039]
Nesse contexto, a IDUA humana é traduzida como um polipeptídeo de 653 aminoácidos e é N-glicosilada em seis sítios potenciais (N110, N190, N336, N372, N415 e N451) como representada na Figura 1. A sequência sinal é removida e o polipeptídeo é processado para a forma madura em lisossomos: um precursor intracelular de 75 kDa é cortado para 72 kDa em
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40/154 diversas horas e, no final, ao longo de 4 a 5 dias, é processado para uma forma intracelular de 66 kDa. Uma forma secretada de IDUA (76 kDa ou 82 kDa dependendo do ensaio utilizado) é rapidamente absorvida por endocitose pelas células via o receptor de manose-6-fosfato e igualmente processada para as formas intracelulares menores (vide, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048;
Clements et al. , 1989, Blochem J. 259: 199-208; Taylor et al., 1991, Biochem J. 274: 263-268; e Zhao et al., 1997 J Biol Chem 272:22758-22765 cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
[0040] A estrutura global de hIDUA consiste em três domínios: os resíduos 42-396 formam um domínio em forma de barril clássico (β/α) de triosefosfato isomerase (TIM) ; os resíduos 27-42 e 397-545 formam um domínio sanduíche β com um segmento hélice-alça-hélice curto (482-508); e os resíduos 546-642 formam um domínio semelhante à Ig. Os dois últimos domínios estão ligados através de uma ponte dissulfeto entre C541 e C577 . Os domínios sanduíche β e semelhante à Ig estão ligados à primeira, a sétima e a oitava hélice α do barril TIM . Um hairpin β (em forma de grampo de cabelo) (β12-β13) está inserido entre a oitava fita β e a oitava hélice α do barril TIM, o qual inclui N372 N-glicosilado que é necessário para ligação do substrato e atividade enzimática (vide, Figura 1 e a estrutura cristalina descrita em Malta et al. , 2013, PNAS 110: 14628-14633, e Saito et al. , 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112 cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
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41/154 [0041] A invenção baseia-se, em parte, nos seguintes princípios:
(i) Os neurônios e células gliais no SNC são células secretoras que possuem o maquinário celular para o processamento pós-traducional de proteínas secretadas incluindo glicosilação e O-sulfatação de tirosina - processos robustos no SNC. Vide, p. ex. , Sleat et al. , 2005, Proteomics 5: 1520-1532, e Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98 que descreve o glicoproteoma de manose-6-fosfato (M6P) do cérebro humano e observa que o cérebro contém mais proteínas com um número muito maior de isoformas individuais e proteínas manose-6-fosforiladas do que encontradas em outros tecidos; e
Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 e Kanan & Al-
Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: : 126-131 que relatam a
produção de glicoproteínas tirosina- -sulfatadas secretadas por
células neuronals, cujos conteúdos sobre modificações pós-
traducionais efetuadas por células humanas do SNC são aqui
incorporados, em sua totalidade, por referência.
(ii) hIDUA possui seis sítios de glicosilação em asparagina (N) identificados na Figura 1 (N110FT; N190VS;
N336TT; N372NT; N415HT; N451RS) . A N-glicosilação de N372 é necessária para ligação ao substrato e atividade enzimática, e a manose-6-fosforilaçao é necessária para captação celular da enzima secretada e correção cruzada de células de MPS I. Os sítios de glicosilação N-ligada contêm porções de carboidratos complexos com alto teor de manose e manose-fosforilados (Figura 4), mas somente a forma secretada é captada pelas células (Myerowitz & Neufeld, 1981, supra). A abordagem da
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42/154 terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção contínua de uma glicoproteína IDUA de 7 6 - 82 kDa, conforme medida por eletroforese em gel de poliacrilamida (dependendo do ensaio utilizado), que é 2,6-sialilada e manose-6fosforilada. A IDUA glicosilada/fosforilada secretada deve ser absorvida e processada corretamente por células neurais e gliais não transduzidas no SNC.
(iii) 0 tráfego/captação celular e subcelular de proteínas lisossômicas é através de M6P. É possível medir o teor de M6P de uma proteína secretada, conforme realizado em Daniele 2002 para a enzima iduronato-2-sulfatase. Na presença de M6P inibitório (p. ex., 5 mM) , prevê-se que a captação do precursor da enzima gerado por células não neuronals ou não gliais, tais como as células renais criadas por engenharia genética de Daniele 2002, diminua para níveis próximos àquele das células controle, conforme mostrado em Daniele 2002. Enquanto na presença de M6P inibitório, prevê-se que a captação do precursor da enzima gerado por células do cérebro, como células neuronals e gliais, permaneça em um nível elevado, conforme mostrado em Daniele 2002, quando a captação foi quatro vezes maior do que nas células controle e comparável ao nível de atividade enzimática (ou captação) do precursor da enzima gerado por células renais geneticamente modificadas sem a presença de M6P inibitório. Esse ensaio permite predizer o teor de M6P em um precursor da enzima gerado por células do cérebro, e, em particular, comparar o teor de M6P em precursores da enzima gerados por tipos diferentes de células. A abordagem da terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção contínua de hIDUA que pode
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43/154 ser captada por células neuronals e gliais em nível elevado na presença de M6P inibitório em tal ensaio.
(iv) Além dos sítios de glicosilação N-ligados, hIDUA contém um sítio de sulfatação de tirosina (Y) (ADTPIY296NDEADPLVGWS) próximo ao domínio que contém N372 necessário para ligação e atividade (vide, p. ex., Yang et al. , 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. Na página 2154, cujo conteúdo sobre a análise de aminoácidos em volta dos resíduos de tirosina submetidos à sulfatação de tirosina da proteína é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. As regras podem ser resumidas como segue: resíduos Y com E ou D dentro de +5 a -5 posições de Y, e quando a posição -1 de Y é um aminoácido neutro ou ácido com carga - mas não um aminoácido básico, p. ex., R, K ou H que abole a sulfatação) . Embora sem pretender vincular-se a qualquer teoria, a sulfatação desse sítio na hIDUA pode ser crítica para atividade, pois mutações dentro da região de sulfatação de tirosina (p. ex., W306L) são conhecidas por sua associação com atividade enzimática diminuída e doença (vide, Malta et al., 2013, PNAS 110:14628 nas páginas 14632-14633).
(v) A glicosilação de hIDUA por células humanas do SNC resultará na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, a meia-vida e reduzir a agregação indesejada do produto transgênico. Significativamente, os glicanos que são adicionados à HuGlylDUA da invenção são N-glicanos biantenários do tipo complexos altamente processados que incluem ácido 2,6-siálico, incorporando Neu5Ac (NANA), mas não seu derivado hidroxilado, NeuGc (Ácido N
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44/154 glicolilneuramínico, ou seja, NGNA ou Neu5Gc). Tais glicanos não estão presentes na laronidase que é produzida em células CHO que não dispõem da 2,6-sialiltransferase necessária para efetuar essa modificação pós-traducional, nem as células CHO produzem GlcNAc bissectado, embora adicionem Neu5Gc (NGNA) como ácido siálico não típico (e potencialmente imunogênico) a humanos em vez de Neu5Ac (NANA) . Vide, p. ex., Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 (Online inicialmente, pág. 1-13 em p. 5); e Hague et al., 1998 Electrophor 19:2612-2630 ([t]he CHO cell line is considered 'phenotypically restricted,' in terms of glycosylation, due to the lack of an a2,6-syalil-transf erase) . Além do mais, as células CHO podem também produzir um glicano imunogênico, o antígeno α-Gal , que reage com anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos e, em concentrações elevadas, pode desencadear anafilaxia. Vide, p. ex., Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156. O padrão de glicosilação humana da HuGlylDUA da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgênico e melhorar a eficácia.
(vi) A sulfatação de tirosina de hIDUA - um processo póstraducional robusto em células do SNC humano - deve resultar em processamento e atividade melhorados dos produtos transgênicos. A significância da sulfatação de tirosina de proteínas lisossômicas não foi elucidada; porém, em outras proteínas, demonstrou aumentar a avidez de interações proteína-proteína (anticorpos e receptores) e promover o processamento proteolítico (hormônio peptídico) (vide, Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; e Bundegaard et al. , 1995, The EMBO J 14: 3073-79) . O nível de expressão de
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45/154 tirosilproteina sulfotransferase (TPST1), responsável pela sulfatação da tirosina (que pode ocorrer como uma etapa final no processamento de IDUA), é aparentemente elevado (com base em mRNA) no cérebro (dados sobre a expressão do gene para TPST1 podem ser encontrados, por exemplo, no EMBL-EBI Expression Atlas, acessível em http://www.ebi.ac.uk/gxa/home). Tal modificação pós-traducional, no mínimo, está subrepresentada na laronidase - um produto de células CHO. Diferentemente das células do SNC humano, as células CHO não são secretoras e possuem capacidade limitada para sulfatação de tirosina pós-traducional (vide, p. ex., Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, esp. a discussão na página 1537) .
(vii) A imunogenicidade de um produto transgênico pode ser induzida por vários fatores, incluindo a condição imune do paciente, a estrutura e características do fármaco proteico infundido, a via de administração e a duração do tratamento. Impurezas relacionadas ao processo, como proteína da célula hospedeira (HCP), DNA da célula hospedeira e resíduos químicos, e impurezas relacionadas ao produto, como produtos de degradação e características estruturais da proteína, como glicosilação, oxidação e agregação (partículas subvisiveis), podem também aumentar a imunogenicidade por servirem como um adjuvante que intensifica a resposta imune. As quantidades de impurezas relacionadas ao processo e relacionadas ao produto podem ser afetadas pelo processo de fabricação: cultura celular, purificação, formulação, armazenamento e manuseio, os quais podem afetar produtos à base de IDUA fabricados comercialmente. Na terapia gênica, as proteínas são produzidas
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46/154 in vivo, de modo que não há impurezas relacionadas ao processo presentes e os produtos proteicos provavelmente não contêm impurezas relacionadas ao produto/produtos de degradação associados com as proteínas produzidas por tecnologias recombinantes, como agregação e oxidação das proteínas. A agregação, por exemplo, está associada com a produção e armazenamento de proteínas em decorrência da alta concentração proteica, a interação com a superfície do equipamento de fabricação e recipientes e o processo de purificação com certos sistemas tampão. Porém, essas condições que promovem a agregação não estão presentes quando um transgene é expresso in vivo. A oxidação, como a oxidação de metionina, triptofano e histidina, está também associada com a produção e armazenamento de proteínas e é causada, por exemplo, por condições de estresse na cultura celular, metal e contato com o ar, além de impurezas em tampões e excipientes. As proteínas expressas in vivo podem também oxidar em uma condição estressante, porém os humanos, como muitos organismos, estão equipados com um sistema de defesa contra oxidação, que não só reduz o estresse da oxidação, mas pode também reparar e/ou reverter a oxidação. Assim, não é provável que proteínas produzidas in vivo fiquem em forma oxidada. A agregação e a oxidação poderíam afetar a potência, PK (depuração) e podem aumentar preocupações sobre imunogenicidade. A abordagem da terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção contínua de uma hIDUA com imunogenicidade reduzida em comparação a produtos fabricados comercialmente.
[0042] Pelos motivos precedentes, a produção de HuGlylDUA deve resultar em uma molécula biomelhor para o tratamento de
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MPS I realizado por terapia gênica - p. ex., administrando um vetor viral ou outra construção de expressão do DNA codificante de HuGlylDUA ao LCR de um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma doença do tipo MPS I (incluindo, entre outros Hurler, Hurler-Scheie, ou Scheie) para criar um depósito permanente no SNC que forneça continuamente um produto transgênico sulfatado, manose-6-fosforilado, glicosilado inteiramente humano, secretado pelas células transduzidas do SNC. 0 produto transgênico HuGlylDUA secretado desde o depósito no LCR será absorvido por endocitose pelas células no SNC, resultando na correção cruzada do defeito enzimático nas células receptoras de MPS I.
[0043] Não é essencial que toda molécula de hIDUA produzida quer pela abordagem de terapia gênica quer por terapia proteica seja inteiramente glicosilada e sulfatada. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve dispor de glicosilação (incluindo 2,6-sialilação e manose-6fosforilação) suficientes para demonstrar eficácia. O objetivo do tratamento com a terapia gênica da invenção é retardar ou sustar a progressão da doença. A eficácia pode ser monitorada medindo-se a função cognitiva (p. ex., prevenção ou diminuição do declínio neurocognitivo); reduções em biomarcadores da doença (como GAG) no LCR e/ou soro; e/ou aumento na atividade enzimática de IDUA no LCR e/ou soro. Os sinais de inflamação e outros eventos de segurança podem também ser monitorados.
[0044] Como tratamento alternativo ou adicional à terapia gênica, a glicoproteína rHuGlylDUA pode ser produzida em linhagens celulares humanas pela tecnologia do DNA
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48/154 recombinante e a glicoproteína pode ser administrada a pacientes diagnosticados com MPS I por via sistêmica e/ou no LCR para TRE) [sic] . As linhagens celulares humanas que podem ser utilizadas para tal produção da glicoproteína recombinante incluem, entre outras, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SHSY5y, hNSCll, ReNcell ATM, células 293 de rim embrionário humano (HEK293), HT-1080 de fibrossarcoma, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares da retina, PER.C6 ou RPE para citar algumas (vide, p. ex. , Dumont et al. , 2016, Critical Rev in Biotech 36(6) :1110-1122 Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives, cujo conteúdo sobre uma revisão das linhagens celulares humanas que poderíam ser utilizadas para a produção recombinante da glicoproteína rHuGlylDUA é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência a glicoproteína ). Para assegurar a glicosilação, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina completa, a linhagem celular utilizada para a produção pode ser aprimorada por engenharia das células hospedeiras para que expresse concomitantemente a-2,6sialiltransferase (ou ambas, a-2,3- e a-2,6sialiltransferases) e/ou as enzimas TPST-1 e TPST-2, responsáveis pela O-sulfatação de tirosina.
[0045] Embora a rHuGlylDUA entregue deva minimizar as reações imunes, a fonte potencial mais evidente de toxicidade relacionada à terapia gênica direcionada ao SNC é a imunidade gerada contra a proteína hIDUA expressa em indivíduos humanos com deficiência genética de IDUA e, portanto, potencialmente não tolerantes à proteína e/ou ao vetor utilizado para entrega do transgene.
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49/154 [0046] Assim, em uma modalidade preferida, é aconselhável tratar concomitantemente o paciente com terapia de supressão imune -- especialmente quando forem tratados pacientes portadores de formas graves da doença com níveis próximos ao zero de IDUA (p. ex., Hurler) . Podem ser empregadas terapias de supressão imune que envolvem um esquema com tacrolimo ou rapamicina (sirolimo), por exemplo, em combinação com ácido micofenólico e/ou em combinação com corticosteroides como prednisolona e/ou metilprednisolona, ou outros esquemas de supressão imune utilizados em procedimentos de transplante de tecidos. Tal tratamento de supressão imune pode ser administrado no decorrer da terapia gênica e, em certas modalidades, o pré-tratamento com terapia de supressão imune pode ser preferido. A terapia de supressão imune pode ser continuada subsequentemente ao tratamento com terapia gênica, com base no juízo do médico responsável pelo tratamento, e pode, posteriormente, ser retirada quando a tolerância imune tiver sido induzida; p. ex., depois de 180 dias.
[0047] Em uma modalidade, a supressão imune compreende a administração de um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona e um esquema de tacrolimo e/ou sirolimo, opcionalmente administrado com MMF. Por exemplo, uma dose de um corticosteroide, como metilprednisolona, é injetada, seguida pela administração de um corticosteroide oral gue é gradualmente reduzido ao longo de 12 semanas e então descontinuado. Simultaneamente, tacrolimo e sirolimo podem ser administrados oralmente em combinação em uma dose baixa (p. ex. , mantendo a concentração sérica de 4 a 8 ng/mL) , ou isoladamente na dose indicada na rotulagem, ao longo de 24 a
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50/154 semanas. Tacrolimo ou sirolimo podem também ser administrados na dose indicada na rotulagem em combinação com MMF. Assim, o paciente recebe uma injeção inicial de um esteroide, que fica imediatamente disponível, e esse esteroide é então mantido por administração oral e gradualmente reduzido em 12 semanas. A supressão imune posterior até 48 semanas é mantida por tacrolimo e/ou sirolimo, opcionalmente, em combinação com MMF.
[0048] Combinações da HuGlylDUA liberada ao LCR, acompanhada pela administração de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou depois do tratamento com terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS I que poderíam ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, entre outros, terapia de reposição enzimática com laronidase administrada por via sistêmica ou ao LCR; e/ou terapia de TCTH.
[0049] Em certas modalidades, é descrito um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante, produzida por células neuronals humanas, no liquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano. Em certas modalidades, é descrito um método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante, produzida por células gliais humanas, no liquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano.
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51/154 [0050] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo: liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma a-Liduronidase (IDUA) humana «2,6-sialilada; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0051] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0052] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
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52/154 [0053] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: liberar, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana que contém sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0054] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é «2, 6-sialilada quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e
[0055] administrar uma terapia de supressão imune ao
referido indivíduo antes ou simultaneamente com a
administração do vetor de expressão e continuar a terapia de
supressão imune poster! ormente.
[0056] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma
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53/154 terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0057] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: etapa a) administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA humana é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em um humano ou em uma célula neuronal imortalizada; e etapa b) administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes e/ou simultaneamente com e/ou depois da administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0058] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é tirosina-sulfatada quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0059] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I,
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54/154 compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente
com a administração do vetor de expressão e continuar a
terapia de supressão imune posteriormente.
[0060] Em certas modalidades , são providos métodos para
tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I,
compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente
com a administração do vetor de expressão e continuar a
terapia de supressão imune posteriormente.
[0061] Em certas modalidades , são providos métodos para
tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I,
compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal; e
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55/154 administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0062] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
[0063] Em certas modalidades, a produção da referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular. Em certas modalidades, a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular. Em certas modalidades, a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular. Em certas modalidades, a produção da
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56/154 referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura celular. Em modalidades específicas, the IDUA transgene codifica um peptídeo sinal. Em certas modalidades, a linhagem de célula neuronal humana é HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSCll ou ReNcell UM.
[0064] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA contendo o referido glicano «2,6-sialilado na referida cultura celular. Em certas modalidades, as células neuronals
humanas são células HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-
SY5y, hNSCll ou ReNcell ATM.
[0065] Em certas modalidades, são providos métodos para
tratar um indivíduo humano diagnosticado com MRS I,
compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade
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57/154 terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotideo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável na referida cultura celular. Em certas modalidades, as células neuronals humanas são células HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSCll ou ReNcell UM.
[0066] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao liquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotideo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno α-Gal; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável e/ou antígeno α-Gal na referida cultura celular. Em certas modalidades, as células neuronals humanas
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58/154 são células HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSCll ou ReNcell ATM.
[0067] Em certas modalidades, são providos métodos para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA que contém uma sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é tirosina-sulfatada na referida cultura celular. Em certas modalidades, as células neuronals humanas são células HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSCll ou ReNcell ATM.
[0068] Em certas modalidades, a IDUA humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Em certas modalidades, a terapia de supressão imune compreende administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico ou (b) rapamicina e ácido micofenólico ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar posteriormente. Em certas modalidades, a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias.
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59/154 [0069] Em modalidades preferidas, a IDUA glicosilada não contém NeuGc detectável e/ou antigeno α-Gal. O texto NeuGc detectável e/ou antigeno α-Gal, neste relatório descritivo, significa porções detectáveis de NeuGc e/ou α-Gal por métodos de ensaio padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, NeuGc pode ser detectado por HPLC de acordo com Hara et al. , 1989, Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and NGlycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection, J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111119, cujo conteúdo sobre o método para detecção de NeuGc é aqui incorporado por referência. Alternativamente, NeuGc pode ser detectado por espectrometria de massa. O α-Gal pode ser detectado por meio de ELISA, vide, por exemplo, Galili et al., 1998, A sensitive assay for measuring alfa-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody, Transplantation. 65(8) :1129-32, ou por espectrometria de massa, vide, por exemplo, Ayoub et al., 2013, Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination de intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques, Landes Bioscience. 5(5): 699-710. Vide também as referências citadas em Platts-Mills et al., 2015, Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Al fa-gal, Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260.
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5.1 N-GLICOSILAÇÃO e SULFATAÇÃO DE TIROSINA
5.1.1. N-Glicosilação [0070] Os neurônios e as células gliais no SNC são células secretoras que possuem o maquinário celular para o processamento pós-traducional de proteínas secretadas incluindo glicosilação e O-sulfatação de tirosina. hIDUA possui seis sítios de glicosilação em asparagina (N) identificados na Figura 1 (N110FT; N190VS; N336TT; N372NT; N415HT; N451RS) . A N-glicosilação de N372 é necessária para ligação ao substrato e atividade enzimática, e a manose-6-fosforilaçao é necessária para captação celular da enzima secretada e correção cruzada de células de MPS I. Os sítios de glicosilação N-ligada contêm porções de carboidratos complexos com alto teor de manose e manose-fosforilados (Figura 4), mas somente a forma secretada é captada pelas células. A abordagem da terapia gênica aqui descrita deve resultar na secreção continua de uma glicoproteina IDUA que é 2,6-sialilada e manose-6-fosforilada. A IDUA glicosilada/fosforilada secretada deve ser absorvida e processada corretamente por células neurais e gliais não transduzidas no SNC.
[0071] A glicosilação de hIDUA por células humanas do SNC resultará na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, a meia-vida e reduzir a agregação indesejada do produto transgênico. Significativamente, os glicanos que são adicionados à HuGlylDUA da invenção são N-glicanos biantenários do tipo complexos altamente processados que incluem ácido 2,6-siálico, incorporando Neu5Ac (NANA), mas
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61/154 não seu derivado hidroxilado, NeuGc (Ácido Nglicolilneuraminico, ou seja, NGNA ou Neu5Gc). Tais glicanos não estão presentes na laronidase que é produzida em células CHO que não dispõem da 2,6-sialiltransferase necessária para efetuar essa modificação pós-traducional, nem as células CHO produzem GlcNAc bissectado, embora adicionem Neu5Gc (NGNA) como ácido siálico não típico (e potencialmente imunogênico) a humanos em vez de Neu5Ac (NANA) . Além do mais, as células CHO podem também produzir um glicano imunogênico, o antígeno α-Gal , que reage com anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos e, em concentrações elevadas, pode desencadear anafilaxia. Vide, p. ex., Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156. O padrão de glicosilação humana da HuGlyTDUA da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgênico e melhorar a eficácia.
[0072] Não é essencial que toda molécula produzida quer pela abordagem de terapia gênica quer por terapia proteica seja inteiramente glicosilada e sulfatada. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve ter glicosilação e sulfatação suficientes para demonstrar eficácia.
[0073] Em uma modalidade específica, a HuGlyTDUA utilizada de acordo com os métodos aqui descritos, quando expressa em um neurônio ou uma célula glial, in vivo ou in vitro, podería ser glicosilada em 100% de seus sítios de N-glicosilação. No entanto, o técnico no assunto apreciará que nem todo sítio de N-glicosilação de HuGlyTDUA precisa ser N-glicosilado para que os benefícios da glicosilação sejam atingidos. Em vez disso, os benefícios da glicosilação podem ser obtidos quando somente
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62/154 uma porcentagem dos sítios de N-glicosilação é glicosilada, e/ou quando somente uma porcentagem das moléculas expressas de IDUA é glicosilada. Desse modo, em certas modalidades, a HuGlylDUA utilizada de acordo com os métodos aqui descritos, quando expressa em um neurônio ou uma célula glial, in vivo ou in vitro, é glicosilada em 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90% ou 90% 100% de seus sítios disponíveis de N-glicosilação. Em certas modalidades, quando expressa em um neurônio ou uma célula glial, in vivo ou in vitro, 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90% ou 90% 100% das moléculas de HuGlylDUA utilizadas de acordo com os métodos aqui descritos são glicosiladas em pelo menos um de seus sítios disponíveis de N-glicosilação.
[0074] Em uma modalidade específica, pelo menos 10%, 20%
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação presentes na HuGlylDUA utilizada de acordo com os métodos aqui descritos são glicosilados em um resíduo de Asn (ou outro resíduo relevante) presente em um sítio de N-glicosilação, quando a HuGlylDUA é expressa em um neurônio ou uma célula glial, in vivo ou in vitro. Ou seja, pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação da HuGlylDUA resultante são glicosilados.
[0075] Em outra modalidade específica, pelo menos 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação presentes em uma molécula de HuGlylDUA, utilizada de acordo com os métodos aqui descritos,
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63/154 são glicosilados com um glicano idêntico anexado ligado ao resíduo de Asn (ou outro resíduo relevante) presente em um sítio de N-glicosilação, quando a HuGlylDUA é expressa em um neurônio ou uma célula glial, in vivo ou in vitro. Ou seja, pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação da HuGlylDUA resultante possuem um glicano idêntico anexado.
[0076] De modo importante, quando as proteínas IDUA utilizadas de acordo com os métodos aqui descritos são expressas em neurônios ou células gliais, a necessidade de produção in vitro em células hospedeiras procarióticas (p. ex., E. οοΐί} ou células hospedeiras eucarióticas (p. ex., CHO cells) é contornada. Em vez disso, como resultado dos métodos aqui descritos (p. ex., o uso de neurônios ou células gliais para expressar IDUA), os sítios de N-glicosilação das proteínas IDUA são vantajosamente adornados com glicanos relevantes e benéficos para o tratamento de humanos. Tal vantagem é inatingível quando células CHO ou E. coii são utilizadas na produção da proteína, uma vez que, p. ex., células CHO (1) não expressam 2,6 sialiltransferase e, assim, não conseguem adicionar o ácido 2,6 siálico durante a Nglicosilação e (2) conseguem adicionar Neu5Gc como ácido siálico em vez de Neu5Ac; e porque E. coii não contém naturalmente os componentes necessários para a N-glicosilação. Desse modo, em uma modalidade, uma proteína IDUA expressa em um neurônio ou uma célula glial, para dar origem a uma HuGlylDUA utilizada nos métodos de tratamento aqui descritos, é glicosilada da maneira em que uma proteína é N-glicosilada em neurônios ou células gliais humanas, mas não é glicosilada
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64/154 da maneira em que as proteínas são glicosiladas em células CHO. Em outra modalidade, uma proteína IDUA expressa em um neurônio ou uma célula glial, para dar origem a uma HuGlylDUA utilizada nos métodos de tratamento aqui descritos, é glicosilada da maneira em que uma proteína é N-glicosilada em um neurônio ou células gliais, em que tal glicosilação não é possível naturalmente utilizando uma célula hospedeira procariótica, p. ex., utilizando E. coli.
[0077] Ensaios para determinar o padrão de glicosilação de proteínas são conhecidos na técnica. Por exemplo, a hidrazinólise pode ser utilizada para analisar glicanos. Primeiramente, os polissacarídeos são liberados da sua proteína associada por incubação com hidrazina (o kit Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release, Oxfordshire, UK, pode ser utilizado). A hidrazina nucleofílica ataca a ligação glicosídica entre o polissacarídeo e a proteína transportadora e permite a liberação dos glicanos anexados. Grupos N-acetila são perdidos durante esse tratamento e precisam ser reconstituídos por re-N-acetilação. Os glicanos livres podem ser purificados em colunas de carbono e subsequentemente marcados na extremidade redutora com o fluoróforo 2-amino benzamida. Os polissacarídeos marcados podem ser separados em uma coluna GlycoSep-N (GL Sciences) de acordo com o protocolo de HPLC de Royle et al, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90. O cromatograma fluorescente resultante indica o comprimento do polissacarídeo e o número de unidades repetidas. Informações estruturais podem ser reunidas, coletando picos individuais e realizado, subsequentemente, uma análise por MS/MS. Assim, a composição do monossacarídeo e a sequência da unidade repetida
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65/154 podem ser confirmadas e, adicionalmente, a homogeneidade da composição do polissacarídeo pode ser identificada. Picos específicos de baixo peso molecular podem ser analisados por MALDI-MS/MS e o resultado utilizado para confirmar a sequência de glicano. Cada pico corresponde a um polímero constituído por certo número de unidades repetidas e fragmentos do mesmo. 0 cromatograma permite, assim, medir a distribuição do comprimento do polímero. 0 tempo de eluição é uma indicação para o comprimento do polímero, enquanto a intensidade de fluorescência correlaciona-se com a abundância molar para o respectivo polímero.
[0078] A homogeneidade dos padrões de glicanos associados com proteínas, no que diz respeito ao comprimento do glicano e números de glicano presentes em sítios de glicosilação, pode ser avaliada por meio de métodos conhecidos na técnica, p. ex., métodos que medem o comprimento de glicano e o raio hidrodinâmico. A HPLC de exclusão por tamanho permite medir o raio hidrodinâmico. Números mais altos de sítios de glicosilação em uma proteína levam à variação maior no raio hidrodinâmico em comparação a uma transportadora com menos sítios de glicosilação. No entanto, quando cadeias únicas de glicanos são analisadas, estas podem ser mais homogêneas devido ao comprimento mais controlado. O comprimento de glicano pode ser medido por hidrazinólise, SDS PAGE e eletroforese capilar em gel. Além disso, a homogeneidade pode também significar que certos padrões de utilização de sítios de glicosilação mudam para uma faixa mais ampla/mais estreita. Esses fatores podem ser medidos por LC-MS/MS de glicopeptídeos.
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66/154 [0079] A N-glicosilação confere inúmeros benefícios à HuGlylDUA utilizada nos métodos aqui descritos. Tais benefícios são inatingíveis pela produção de proteínas em E. coli, uma vez que E. coli não possui naturalmente os componentes necessários para N-glicosilação. Além disso, alguns benefícios são inatingíveis pela produção de proteínas em, p. ex. , células CHO, pois as células CHO não possuem os componentes necessários para a adição de certos glicanos (p. ex. , ácido 2,6 siálico) e porque as células CHO conseguem adicionar glicanos, p. ex., Neu5Gc não típicos de humanos, e o antígeno α-Gal que é imunogênico na maioria dos indivíduos e, em concentrações elevadas, pode desencadear anafilaxia. Assim, a expressão de IDUA em neurônio ou células gliais humanos resulta na produção de HuGlylDUA compreendendo glicano benéficos, os quais, do contrário, não estariam associados com a proteína se produzido em células CHO ou em E. coli.
5.1.2. Sulfatação de tirosina [0080] Além dos sítios de glicosilação N-ligados, hIDUA contém um sítio de sulfatação de tirosina (Y) (ADTPIY296NDEADPLVGWS) próximo ao domínio que contém N372 necessário para ligação e atividade (vide, p. ex., Yang et al. , 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. na página 2154, cujo conteúdo sobre a análise de aminoácidos em volta dos resíduos de tirosina submetidos à sulfatação de tirosina da proteína é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. As regras podem ser resumidas como segue: Resíduos Y com E ou D dentro de +5 a -5 posições de Y, e quando a posição -1 de Y é um aminoácido neutro ou ácido com carga - mas não um
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67/154 aminoácido básico, p. ex., R, K ou H que abole a sulfatação) . Embora sem pretender vincular-se a qualquer teoria, a sulfatação desse sitio na hIDUA pode ser crítica para atividade, pois mutações dentro da região de sulfatação de tirosina (p. ex., W306L) são conhecidas por sua associação com atividade enzimática diminuída e doença (vide, Malta et al., 2013, PNAS 110:14628 nas páginas 14632-14633).
[0081] De modo importante, proteínas tirosina-sulfatadas não podem ser produzidas em E. coli, o qual não possui naturalmente as enzimas necessárias para sulfatação de tirosina. Além disso, células CHO são deficientes para sulfatação de tirosina - elas não são células secretoras e dispõem de capacidade limitada para sulfatação pós-traducional de tirosina. Vide, p. ex., Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537. Vantajosamente, os métodos aqui providos exigem a expressão de IDUA, p. ex., HuGlylDUA, em neurônios ou células gliais, os quais são secretores e efetivamente possuem a capacidade para sulfatação de tirosina. Ensaios para detecção de sulfatação de tirosina são conhecidos na técnica. Vide, p. ex., Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164.
[0082] A sulfatação de tirosina de hIDUA - um processo póstraducional robusto em células do SNC humano - deve resultar em processamento e atividade melhorados dos produtos transgênicos. A significância da sulfatação de tirosina de proteínas lisossômicas não foi elucidada; porém, em outras proteínas, demonstrou aumentar a avidez de interações proteína-proteína (anticorpos e receptores) e promover o
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68/154 processamento proteolitico (hormônio peptídico) (vide, Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; e Bundegaard et al. , 1995, The EMBO J 14: 3073-79) . O nível de expressão de tirosilproteína sulfotransferase (TPST1), responsável pela sulfatação da tirosina (que pode ocorrer como uma etapa final no processamento de IDUA), é aparentemente elevado (com base em mRNA) no cérebro (dados sobre a expressão do gene para TPST1 podem ser encontrados, por exemplo, no EMBL-EBI Expression Atlas, acessível em http://www.ebi.ac.uk/gxa/home). Tal modificação pós-traducional, no mínimo, está subrepresentada na laronidase - um produto de células CHO.
5.2 CONSTRUÇÕES E FORMULAÇÕES [0083] A presente invenção prove, para uso nos métodos aqui descritos, vetores virais ou outras construções de expressão do DNA que codifica α-L-iduronidase (IDUA), p. ex., IDUA humana (hIDUA). Os vetores virais e outras construções de expressão do DNA aqui providos incluem qualquer método adequado para entrega de um transgene no líquido cefalorraquidiano (LCR). Os meios para entrega de um transgene incluem vetores virais, lipossomas, outros complexos contendo lipídios, outros complexos macromoleculares, mRNA sintético modificado, mRNA não modificado, pequenas moléculas, moléculas não biologicamente ativas (p. ex., partículas de ouro), moléculas polimerizadas (p. ex. , dendrímeros), DNA nu, plasmídeos, fagos, transposons, cosmídeos ou epissomos. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor direcionado, p. ex., um vetor direcionado para células neuronals.
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69/154 [0084]
Em alguns aspectos, a invenção prove um ácido nucleico para uso, em que o ácido nucleico codifica uma IDUA, p. ex., hIDUA, ligada operativamente a um promotor selecionado a partir do grupo constituído por: promotor do citomegalovírus (CMV), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de galinha, promotor CAG, promotor RPE65 e promotor de opsina.
[0085] Em certas modalidades, são providos vetores recombinantes que compreendem um ou mais ácidos nucleicos (p. ex., polinucleotídeos) . Os ácidos nucleicos podem compreender DNA, RNA ou uma combinação de DNA e RNA. Em certas modalidades, o DNA compreende uma ou mais das sequências selecionadas a partir do grupo constituído por sequências de promotores, a sequência do gene de interesse (o transgene, p. ex., IDUA), regiões não traduzidas e sequências de terminação. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um promotor ligado operacionalmente ao gene de interesse.
[0086] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos (p. ex., polinucleotídeos) e as sequências de ácidos nucleicos aqui revelados podem ter os códons otimizados, por exemplo, através de qualquer técnica de otimização de códons conhecida pelos entendidos no assunto (vide, p. ex., a revisão por Quax et al., 2015, Mol Cell 59:149-161).
5.2.1.
mRNA
Em certas modalidades os vetores aqui providos são mRNA modificado codificante para o gene de interesse (p. ex.,
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70/154 o transgene, por exemplo, IDUA). A síntese de mRNA modificado e não modificado para entrega de um transgene no LCR é ensinada, por exemplo, em Hocquemiller et al., 2016, Human
Gene Therapy 27(7) :478-496, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Em certas modalidades, é provido um mRNA modificado codificante para IDUA, p. ex. , hIDUA.
5.2.2. Vetores virais [0088] Os vetores virais incluem vetores à base de adenovirus, vírus adeno-associados (AAV, p. ex. , AAV9), lentivírus, adenovirus helper (auxiliar) dependente, vírus do herpes simples, poxvirus, vírus hemaglutinante do Japão (HVJ), alfavírus, vírus Vaccinia e retrovirus. Os vetores retrovirais incluem vetores à base do vírus da leucemia murina (MLV)- e vírus da imunodeficiência humana (HIV) . Os vetores à base de alfavírus incluem o vírus da floresta de Semliki (SFV) e o vírus Sindbis (SIN). Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais recombinantes. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são alterados de tal modo que são deficientes em replicação nos humanos. Em certas modalidades, os vetores virais são vetores híbridos, p. ex. , um vetor AAV colocado em um vetor adenoviral incapaz. Em certas modalidades, são providos vetores virais compreendendo um capsídeo viral de um primeiro vírus e proteínas do envelope viral de um segundo vírus. Em modalidades específicas, o segundo vírus é o vírus da estomatite vesicular (VSV). Em modalidades mais específicas, a proteína do envelope é a proteína G do VSV.
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71/154 [0089] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base do HIV. Em certas modalidades, os vetores à base do HIV aqui providos compreendem pelo menos dois polinucleotídeos, em que os genes gag e pol são do genoma de HIV e o gene env é de outro virus.
[0090] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base do vírus do herpes simples. Em certas modalidades, os vetores à base do vírus do herpes simples aqui providos são modificados de modo que não compreendam um ou mais genes imediatamente iniciais (IE), tornando-os não citotóxicos.
[0091] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base do MLV. Em certas modalidades, os vetores à base do MLV aqui providos compreendem até 8 kb de DNA heterólogo no lugar dos genes virais.
[0092] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base de lentivírus. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui providos são derivados de lentivírus humanos. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui providos são derivados de lentivírus não humanos. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui providos estão empacotados em um capsídeo lentiviral. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui providos compreendem um ou mais dos seguintes elementos: repetições terminais longas, um sítio de ligação do primer, um trato de polipurinas, sítios att e um sítio de encapsidação.
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72/154 [0093] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base de alfavírus. Em certas modalidades, os vetores alfavirais aqui providos são alfavírus recombinantes com replicação defeituosa. Em certas modalidades, replicons de alfavírus nos vetores alfavirais aqui providos são direcionados para tipos celulares específicos, exibindo um ligante heterólogo funcional na superfície de seus virions.
[0094] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base de AAV. Em modalidades preferidas, os vetores virais aqui providos são vetores virais à base de AAV9 ou AAVrhlO. Em certas modalidades, os vetores virais à base de AAV9 ou AAVrhlO aqui providos retêm tropismo para células do SNC. Foram identificados múltiplos sorotipos de AAV. Em certas modalidades, os vetores à base de AAV aqui providos compreendem componentes de um ou mais sorotipos de
AAV. Em certas modalidades, os vetores à base de AAV aqui providos compreendem componentes de um ou mais dentre AAV1,
AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrhlO ou AAV11. Em modalidades preferidas, os vetores à base de AAV aqui providos compreendem componentes de um ou mais dentre os sorotipos AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Vetores virais à base de AAV9 são utilizados nos métodos aqui descritos. Sequências de ácidos nucleicos de vetores virais à base de AAV e métodos para produzir AAV recombinante e capsídeos de AAV são ensinados, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 7 282
199 B2, Patente dos Estados Unidos N° 7 790 449 B2, Patente dos Estados Unidos N° 8 318 480 B2, Patente dos Estados Unidos N°
8,962,332 B2 e Pedido de Patente Internacional N°
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73/154
PCT/EP2014/076466, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Em um aspecto, são providos vetores virais à base de AAV (p. ex. , AAV9 ou AAVrhlO) que codificam um transgene (p. ex. , IDUA) . Em modalidades específicas, são providos vetores virais à base de AAV9 IDUA. Em modalidades mais específicas, são providos vetores virais à base de AAV9 que codificam hIDUA.
[0095] Em modalidades específicas, são providos vetores à base de AAV9 compreendendo um genoma artificial incluindo (i) um cassete de expressão contendo o transgene sob o controle de elementos reguladores e flanqueado por ITRs; e (ii) um capsídeo viral com a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV9 ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.9% idêntica à sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo AAV9 (SEQ ID NO: 26) enquanto retendo a função biológica do capsídeo AAV9. Em certas modalidades, o capsídeo AAV9 possui a sequência de SEQ ID NO: 26 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos e retendo a função biológica do capsídeo AAV9. A Figura 5 fornece um alinhamento comparativo das sequências de aminoácidos das proteínas do capsídeo de diferentes sorotipos de AAV com aminoácidos potenciais que podem ser substituídos em certas posições nas sequências alinhadas tendo por base a comparação as SUBs marcadas da linha. Desse modo, em
modalidades específicas, o vetor AAV9 compreende um caps ideo
AAV9 variante que possui 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos identificadas na
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74/154 linha de SUBS da Figura 5 que não estão presentes naquela posição na sequência nativa de AAV9.
[0096] Em certas modalidades, o AAV que é utilizado nos
métodos aqui descritos é Anc80 ou Anc80L65, conforme descrito
em Zinn et al. , 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068, cuj o
conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por
referência. Em certas modalidades, o AAV que é utilizado nos métodos aqui descritos compreende uma das seguintes inserções de aminoácidos: LGETTRP ou LALGETTRP, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos 9 193 956; 9 458 517; e 9 587 282 e Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2016/0376323, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Em certas modalidades, o AAV que é utilizado nos métodos aqui descritos é AAV.7m8, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos 9 193 956; 9 458 517; e 9 587 282 e Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2016/0376323, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Em certas modalidades, o AAV que é utilizado nos métodos aqui descritos é qualquer AAV revelado na Patente dos Estados Unidos N° 9 585 971, como AAV-PHP.B. Em certas modalidades, o AAV que é utilizado nos métodos aqui descritos é um AAV revelado em qualquer uma das patentes ou pedidos de patente a seguir, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência: Patentes dos Estados Unidos Nos 7 906 111; 8 52 4 446; 8 999 67 8; 8 62 8 966; 8 92 7 514; 8 734 809; 9 284 357; 9 409 953; 9 169 299; 9 193 956; 9 458 517; e 9 587282 e Publicações de Pedidos de Patente U.S. Nos
2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836;
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2016/0215024; 2017/0051257; e Pedidos de Patente Internacional Nos PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.
[0097] Em certas modalidades, um AAV fita simples (ssAAV) pode ser utilizado supra. Em certas modalidades, vetor autocomplementar, p. ex., scAAV, pode ser utilizado (vide, p. ex. , Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254; e Patente U.S. Nos 6 596 535; 7 125 717; e 7 456 683, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
[0098] Em certas modalidades, os vetores virais utilizados nos métodos aqui descritos são vetores virais à base de adenovirus. Pode-se utilizar um vetor de adenovirus recombinante para transferir a IDUA. O adenovirus recombinante pode ser um vetor de primeira geração, com uma deleção de El, com ou sem uma deleção de E3 e com o cassete de expressão inserido em qualquer uma das regiões deletadas. O adenovirus recombinante pode ser um vetor de segunda geração, contendo deleções totais ou parciais das regiões E2 e E4. Um adenovirus helper dependente retém somente as repetições terminais invertidas do adenovirus o sinal de empacotamento (phi). O transgene é inserido entre o sinal de empacotamento e a 3'ITR, com ou sem sequências stuffer para manter o genoma artificial próximo ao tamanho do tipo selvagem de aproximadamente 36 kb. Um protocolo exemplar para produção de vetores adenovirais pode ser encontrado em Alba et al., 2005, Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy, Gene Therapy
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12:S18-S27, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[0099] Em certas modalidades, os vetores virais utilizados nos métodos aqui descritos são vetores virais à base de lentivirus. Um vetor de lentivirus recombinante pode ser utilizado para transferir a IDUA. Quatro plasmideos são utilizados para produzir a construção: o plasmideo contendo a sequência de Gag/pol, plasmideos contendo a sequência de Rev, plasmideo contendo a proteína do envelope (ou seja, G de VSV) e o plasmideo Cis com os elementos de empacotamento e o gene de IDUA.
[00100] Para a produção do vetor lentiviral, os quatro plasmideos são cotransfectados em células (ou seja, células à base de HEK293), em que polietilenimina ou fosfato de cálcio pode ser utilizado como agentes de transfecção, entre outros, O lentivirus é então colhido no sobrenadante (lentivirus não precisam de brotamento das células para que sejam ativos, assim, nenhuma colhida de células precisa/deve ser realizada). O sobrenadante é filtrado (0,45 pm) e, a seguir, cloreto de magnésio e benzonase adicionados. Outros processos a jusante podem variar amplamente, sendo o uso TFF e cromatografia em coluna os mais compatíveis possíveis com as boas práticas de fabricação (BPF). Outros usam ultracentrifugação com/sem cromatografia em coluna. Protocolos exemplares para produção de vetores lentivirais podem ser encontrados em Lesch et al., 2011, Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors, Gene Therapy 18:531-538, e Ausubel et al., 2012, Production
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77/154 of CGMP-Grade Lentiviral Vectors, Bioprocess Int. 10(2) :3243, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00101] Em uma modalidade especifica, um vetor para uso nos métodos aqui descritos é aquele que codifica uma IDUA (p. ex., hIDUA) de tal modo que, quando da transdução de células no SNC ou em uma célula relevante (p. ex., um célula neuronal in vivo ou in vitro), uma variante glicosilada de IDUA é expressa pela célula transduzida. Em uma modalidade especifica, um vetor para uso nos métodos aqui descritos é aquele que codifica uma IDUA (p. ex. , hIDUA) de tal modo que, quando da transdução de uma célula no SNC ou uma célula relevante (p. ex., uma célula neuronal in vivo ou in vitro), uma variante sulfatada de IDUA é expressa pela célula.
5.2.3. Promotores e modificadores da expressão gênica [00102] Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem componentes que modulam a entrega ou a expressão de genes (p. ex., elementos de controle da expressão) . Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem componentes que modulam a expressão de genes. Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem componentes que influenciam a ligação ou o direcionamento para células. Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem componentes que influenciam a localização do polinucleotídeo (p. ex., o transgene) dentro da célula após a captação. Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem componentes que pode ser utilizados como marcadores
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78/154 detectáveis ou selecionáveis, p. ex., para detectar ou selecionar células que captaram o polinucleotídeo.
[00103] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um ou mais promotores. Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em modalidades alternativas, o promotor é um promotor induzível. O gene nativo de IDUA gene, tal qual a maioria dos genes housekeeping (constitutivos), utiliza primariamente um promotor rico em GC. Em uma modalidade preferida, são utilizados promotores constitutivos fortes que sustentam a expressão de hIDUA. Tais promotores incluem promotores sintéticos CAG que contêm: C - o elemento intensificador inicial do citomegalovírus (CMV); A - o promotor, bem como o primeiro exon e intron do gene beta-actina de galinha; e G o aceitador de splicing (processamento) do gene beta-globina de coelho (vide, Miyazaki et al. , 1989, Gene 79: 269-277; e Niwa et al., Gene 108: 193-199).
[00104] Em certas modalidades, o promotor é um promotor CB7 (vide Dinculescu et al., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência). Em algumas modalidades, o promotor CB7 inclui outros elementos de controle da expressão que aumentam a expressão do transgene dirigida pelo vetor. Em certas modalidades, os outros elementos de controle da expressão incluem o intron de β-actina de galinha e/ou o sinal poliA de β-globina de coelho. Em certas modalidades, o promotor compreende um TATA box. Em certas modalidades, o promotor compreende um ou mais elementos. Em certas modalidades, um ou mais elementos do promotor podem ser
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79/154 invertidos ou deslocados em relação uns a outros. Em certas modalidades, os elementos do promotor estão posicionados para que atuem cooperativamente. Em certas modalidades, os elementos do promotor estão posicionados para que atuem independentemente. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um ou mais promotores selecionados a partir do grupo constituído por o promotor do gene precoce imediato do CMV humano, o promotor precoce do SV40, a repetição longa terminal do vírus do sarcoma de Rous (RS) e o promotor de insulina do rato. Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem um ou mais promotores de repetições terminais longas (LTR) selecionadas a partir do grupo constituído por LTRs de AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1 e HIV-2. Em certas modalidades, os vetores aqui providos compreendem um ou mais promotores específicos de tecidos (p. ex., um promotor específico de células neuronals).
[00105] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um ou mais elementos reguladores além de um promotor. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um intensificador. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um repressor. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem um intron ou um intron quimérico. Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem uma sequência de poliadenilação.
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5.2.4. Peptídeos sinais [00106] Em certas modalidades, os vetores aqui providos
compreendem componentes que modulam a entrega de proteínas. Em
certas modalidades, os vetores virais aqui providos
compreendem um ou mais peptídeos sinais. Em certas
modalidades, os peptídeos sinais permitem que o produto
transgênico (p. ex., IDUA) alcance o devido empacotamento
(e.g. glicosilação) na célula. Em certas modalidades, os peptídeos sinais permitem que o produto transgênico (p. ex., IDUA) alcance a devida localização na célula. Em certas modalidades, os peptídeos sinais permitem que o produto transgênico (p. ex., IDUA) consiga secretar desde a célula. Os exemplos de peptídeos sinais a serem utilizados em conexão com os vetores e transgenes aqui providos podem ser encontrados na Tabela 1. Peptídeos sinais podem também ser referidos no presente documento como sequências líderes ou peptídeos líderes.
Tabela 1. Peptídeos sinais para uso com os vetores aqui providos
SEQ ID NO. Peptídeo sinal Sequência
2 Peptídeo sinal da glicoproteína da mielina de oligodendrócitos (hOMG) MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC
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SEQ ID NO. Peptídeo sinal Sequência
3 Peptídeo sinal do repressor celular dos genes 2 estimulados por EIA (hCREG2) MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG
4 Peptídeo sinal do domínio V-set e transmembrana contendo 2B (hVSTM2B) MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA
5 Peptídeo sinal da protocaderina alfa-1 (hPCADHAl) MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG
6 Peptídeo sinal de FAM19A1 (TAFA1) MAMVSAMSWVLYLWISACA
7 VEGF-A peptídeo sinal MNFLLSWVHW SLALLLYLHH AKWSQA
8 Peptídeo sinal da fibulina-1 MERAAPSRRV PLPLLLLGGL ALLAAGVDA
9 Peptídeo sinal da vitronectina MAPLRPLLIL ALLAWVALA
10 Peptídeo sinal do fator H do complemento MRLLAKIICLMLWAICVA
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SEQ TD NO. Peptídeo sinal Sequência
11 Peptídeo sinal da opticina MRLLAFLSLL ALVLQETGT
12 Peptídeo sinal da albumina MKWVTFISLLFLFSSAYS
13 Peptídeo sinal do quimiotripsinogênio MAFLWLLSCWALLGTTFG
14 Peptídeo sinal de interleucina-2 MYRMQLLSCIALILALVTNS
15 Peptídeo sinal do tripsinogênio-2 MNL L LIL T FVAAAVA
5.2.5. Regiões não traduzidas [00107] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem uma ou mais regiões não traduzidas (UTRs), p. ex. , 3' e/ou 5' UTRs. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para o nível desejado de expressão da proteína. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a meia-vida do mRNA do transgene. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para estabilidade do mRNA do transgene. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estrutura secundária do mRNA do transgene.
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5.2.6. Repetições terminais invertidas [00108] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem uma ou mais sequências de repetições terminais invertidas (ITR). As sequências de ITR podem ser utilizadas para empacotamento do cassete de expressão do gene recombinante no virion do vetor viral. Em certas modalidades, a ITR é de um AAV, p. ex. , AAV9 (vide, p. ex. , Yan et al., 2005, J. Virol., 79(1):364-379; Patente dos Estados Unidos N° 7 282 199 B2, Patente dos Estados Unidos N° 7 790 449 B2, Patente dos Estados Unidos N° 8 318 480 B2, Patente dos Estados Unidos N° 8 962 332 B2 e Pedido de Patente Internacional N° PCT/EP2014/076466, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
5.2.7. Transgenes [00109] Em certas modalidades, os vetores aqui providos codificam um transgene de IDUA. Em modalidades específicas, a IDUA é controlada por elementos adequados de controle da expressão para expressão em células neuronals: Em certas modalidades, o transgene de IDUA (p. ex., hIDUA) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o transgene de IDUA (p. ex. , hIDUA) compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO: 1.
[00110] A HuGlylDUA codificada pelo transgene pode incluir, entre outras, IDUA humana (hIDUA) , com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (conforme mostrada na Figura 1), e
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84/154 derivados da hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, p. ex., incluindo, entre outras, substituições de aminoácidos selecionados dentre os resíduos correspondentes não conservados em ortólogos de IDUA mostrados na Figura 2, com a ressalva de que tais mutações não incluem qualquer uma já identificada em fenótipos graves, graves-intermediários, intermediários ou atenuados de MPS I mostrados na Figura 3 (fonte: Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111:107-112,
Tabela 1, listagem de 57 mutações da MPS I, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência); ou relatadas por Venturi et al., 2002, Human Mutation #522 Online (Venturi 2002), ou Bertoia et al. , 2011 Human Mutation 32:E2189-E2210 (Bertoia 2011), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00111] Por exemplo, substituições de aminoácidos em uma determinada posição da hIDUA podem ser selecionadas a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes não conservados encontrados naquela posição nos ortólogos de IDUA representados na Figura 2 (mostrando o alinhamento de ortólogos conforme relatado em Malta et al., 2013, PNAS 110:14628, Figura S8, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência), com a ressalva de que tais substituições não incluam qualquer uma das mutações prejudiciais mostradas na Figura 3 ou relatadas em Venturi 2002 ou Bertoia 2011 supra. O produto transgênico resultante pode ser testado por meio de ensaios convencionais in vitro, em cultura celular ou animais de teste, visando assegurar que a mutação não afete a função da IDUA. Substituições, deleções ou adições preferidas de aminoácidos selecionadas devem ser
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85/154 aquelas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática, estabilidade ou meia-vida da IDUA, conforme testadas por ensaios convencionais in vitro, em cultura celular ou modelos animais para MPS I. Por exemplo, a atividade enzimática do produto transgênico pode ser avaliada por meio de um ensaio enzimático convencional com 4-metilumbeliferil a-L-iduronida como o substrato (vide, p. ex. , Hopwood et al. , 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al. , 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; e Kakkis et al. , 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 para ensaios enzimáticos exemplares de IDUA que podem ser utilizados, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência) . A capacidade do produto transgênico para corrigir o fenótipo de MPS I pode ser avaliada em cultura celular; p. ex., transduzindo células de MPS I em cultura com um vetor viral ou outra construção de expressão do DNA codificante de hIDUA ou um derivado; adicionando a rHuGlylDUA ou um derivado a células de MPS I em cultura; ou cultivando concomitantemente células de MPS I com células hospedeiras humanas criadas para expressar e secretar rHuGlylDUA ou um derivado, e determinando a correção do defeito nas células cultivadas de MPS I, p. ex., pela atividade enzimática detectada de IDUA e/ou a redução no depósito de GAG nas células de MPS I em cultura (vide, p. ex., Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; e Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência).
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5.2.8. Construções [00112] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem os elementos seguintes na ordem a seguir: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência de ligação (linker), c) uma sequência de promotor, d) uma segunda sequência de ligação, e) uma sequência de intron, f) uma terceira sequência de ligação, g) uma sequência codificante do transgene (p. ex. , IDUA), h) uma quarta sequência de ligação, i) uma sequência de poli A, j) uma quinta sequência de ligação e k) uma segunda sequência de ITR.
[00113] Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem os elementos seguintes na ordem a seguir: a) uma sequência de promotor e b) uma sequência codificante do transgene (p. ex., IDUA). Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem os elementos seguintes na
ordem a seguir: a) uma sequência de promotor, e b ) uma
sequência codificante do transgene (p. ex. , IDUA) , em gue o
transgene compreende um peptídeo sinal.
[00114] Em certas modalidades, os vetores virais aqui
providos compreendem os elementos seguintes na ordem a seguir: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência de ligação, c) uma sequência de promotor, d) uma segunda sequência de ligação, e) uma sequência de intron, f) uma terceira sequência de ligação, g) uma primeira sequência de UTR, h) uma sequência codificante do transgene (p. ex., IDUA), i) uma segunda sequência de UTR, j) uma quarta sequência de
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87/154 ligação,
k) uma segunda sequência de poli A, uma quinta sequencia de ligação e m) uma segunda sequência de ITR.
Em certas modalidades, os vetores virais aqui providos compreendem os elementos seguintes na ordem a seguir:
uma primeira sequência de ITR,
b) uma primeira sequência de ligação, uma sequência de promotor, d) uma segunda sequencia de ligação, uma sequência de intron, f) uma terceira sequência de ligação, uma primeira sequência de
UTR,
h) uma sequência codificante do transgene (p. ex. , IDUA), uma segunda sequência de UTR, uma quarta sequência de ligação, k) uma segunda sequência de poli A, uma quinta sequência de ligação e m) uma segunda sequência de
ITR, em que o transgene compreende um peptídeo sinal e em que o transgene codifica hIDUA.
5.2.9. Produção e testes de vetores [00116] Os vetores virais aqui providos podem ser produzidos utilizando células hospedeiras. Os vetores virais aqui providos podem ser produzidos utilizando células hospedeiras de mamíferos, por exemplo, células A549 , WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COSÍ, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, fibroblastos primários, hepatócitos e mioblastos. Os vetores virais aqui providos podem ser produzidos utilizando células hospedeiras de humanos, macacos, camundongos, ratos, coelhos ou hamsters.
[00117] As células hospedeiras são transformadas estavelmente com as sequências que codificam o transgene e elementos associados (ou seja, o genoma do vetor), e os meios para
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88/154 produzir vírus nas células hospedeiras, por exemplo, os genes para replicação e do capsídeo (p. ex., os genes rep e cap de AAV) . Para um método de produção de vetores de AAV recombinantes com capsídeos AAV8, vide a Seção IV da Descrição Detalhada da Patente U.S. N° 7 282 199 B2, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Os títulos de cópias do genoma dos referidos vetores podem ser determinados, por exemplo, por análise com TAQMAN®. Virions podem ser recuperados, por exemplo, por sedimentação com CsCÍ2.
[00118] Ensaios in vitro, p. ex., ensaios em cultura celular, podem ser utilizados para medir a expressão do transgene desde um vetor aqui descrito, indicando, assim, p. ex., a potência do vetor. Por exemplo, as linhagens das células HT-22, SK-NMC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSCll ou ReNcell ATM, ou outras linhagens celulares que são derivadas de células neuronals ou gliais ou de progenitoras de células neuronals ou gliais podem ser utilizadas para avaliar a expressão do transgene. Uma vez expresso, as características do produto expresso(ou seja, HuGlylDUA) podem ser determinadas, incluindo determinação dos padrões de glicosilação e sulfatação de tirosina associados com a HuGlylDUA.
5.2.10. Composições [00119] São descritas composições que compreende um vetor codificante de um transgene aqui descrito e um veículo adequado. Um veículo adequado (p. ex., para administração ao LCR e, por exemplo, a células neuronals) seria rapidamente selecionado pelo técnico no assunto.
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5.3 TERAPIA GÊNICA [00120] São descritos métodos para a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma construção transgênica a indivíduos humanos com MPS I. Mais particularmente, são descritos métodos para administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma construção transgênica a pacientes com MPS I, em particular, para administração ao LCR. Em modalidades específicas, tais métodos para administração ao LCR de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma construção transgênica podem ser utilizados para tratar pacientes com síndrome de Hurler ou síndrome de HurlerScheie.
5.3.1. Populações alvos de pacientes [00121] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I. Em modalidades específicas, os pacientes foram diagnosticados com síndrome de Hurler-Scheie. Em modalidades específicas, os pacientes foram diagnosticados com síndrome de Scheie. Em modalidades específicas, os pacientes foram diagnosticados com síndrome de Hurler.
[00122] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I grave. I Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I atenuada.
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90/154 [00123] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I que foram identificados como respondedores ao tratamento com IDUA, p. ex., hIDUA.
[00124] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes pediátricos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com menos de três anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com idades entre 2 e 4 anos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com idades entre 3 e 8 anos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com idades entre 8 e 16 anos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com idades entre 6 e 18 anos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 6 anos de idade ou mais. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com menos de 3 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses de idade. Em certas modalidades, doses
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91/154 terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 18 meses ou mais, mas menos de 3 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com mais de 10 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes adolescentes. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes adultos.
[00125] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I que foram identificados como respondedores ao tratamento com IDUA, p. ex. , hIDUA, injetada no LCR antes do tratamento com terapia gênica.
5.3.2. Dose modo de administração
[00126] Em certas modalidades, doses terapeuticamente
eficazes do vetor recombinante são administradas ao LCR
através de administração intratecal (ou seja, injeção no
espaço subaracnóideo de modo que os vetores recombinantes se distribuam através do LCR e transduzam células no SNC) . Isso pode ser alcançado de diversas maneiras - p. ex., por injeção intracraniana (cisternal ou ventricular) ou injeção na cisterna lombar. Em certas modalidades, a administração intratecal é realizada por injeção intracisternal (IC) (p. ex., na cisterna magna). Em modalidades específicas, a injeção intracisternal é realizada por punção suboccipital guiada por TC. Em modalidades específicas, a injeção intratecal é
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92/154 realizada por punção lombar. Em modalidades específicas, a injeção no espaço subaracnóideo é realizada por punção Cl-2 quando viável para o paciente. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao SNC através de administração intranasal. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao SNC através de injeção intraparenquimatosa. Em certas modalidades, a injeção intraparenquimatosa é direcionada para o corpo estriado. Em certas modalidades, a injeção intraparenquimatosa é direcionada para a substância branca. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao LCR por qualquer meio conhecido na técnica, por exemplo, por meios revelados em Hocquemiller et al., 2016, Human Gene Therapy 27(7) :478-496, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00127] O vetor recombinante deve ser administrado ao LCR a uma dose que mantenha uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25 a 277 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25, 16, 46, 92, 185 ou 277 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9, 25, 16, 46, 92, 185 ou 277 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém
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93/154 uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 16 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 4 6 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 92 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 185 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém uma concentração de rHuGlylDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 277 pg/mL.
[00128] Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,00 a 30,00 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,00; 1,74; 5,00; 10,00; 20,00 ou 30,00 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,00 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,74 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 5, 00 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 10,00 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante
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94/154 é administrado ao LCR a uma dose que mantém 20, 00 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 30,00 mg de rHuGlylDUA total no LCR.
[00129] Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,29 a 38,88 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,29; 2,25; 8,40; 12,96; 25,93 ou 38,88 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 1,29 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 2,25 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 8,40 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 12,96 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 25, 93 mg de rHuGlylDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 38,88 mg de rHuGlylDUA total no LCR.
[00130] Para administração intratecal, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas ao LCR em um volume de injeção de preferência até cerca de 20 mL. Um
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95/154 veículo adequado para injeção intratecal, como Solução de Elliotts B, deve ser utilizado como veículo para os vetores recombinantes. A solução de Elliots B (nome genérico: cloreto de sódio, bicarbonate de sódio, dextrose anidra, sulfato de magnésio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e fosfato de sódio) é uma solução isotônica, estéril, não pirogênica que não contém conservantes bacteriostáticos e que é utilizada como diluente para administração intratecal de quimioterápicos.
[00131] As concentrações no LCR podem ser monitoradas medindo diretamente a concentração de rHuGlylDUA no líquido LCR obtido de punções occipitais ou lombares, ou estimadas por extrapolação a partir de concentrações da rHuGlylDUA no soro do paciente. Em certas modalidades, 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlylDUA no soro é indicativo de 1 a 30 mg de rHuGlylDUA no LCR. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR a uma dose que mantém 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlylDUA no soro.
[00132] Em certas modalidades, as doses são medidas pelo número de cópias do genoma administradas ao LCR do paciente (p. ex., injetadas por punção suboccipital ou punção lombar) . Em certas modalidades, 1 x 1012 a 2 x 1014 cópias do genoma são administradas. Em certas modalidades, 5 x 1012 a 2 x 1014 cópias do genoma são administradas. Em modalidades específicas, 1 x 1013 a 1 x 1014 cópias do genoma são administradas. Em modalidades específicas, 1 x 1013 a 2 x 1013 cópias do genoma são administradas. Em modalidades específicas, 6 x 1013 a 8 x 1013 cópias do genoma são administradas.
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96/154 [00133] Em certas modalidades, uma dose fixa de 1 x 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose fixa de 5,6 x 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1 x 1012 a 5, 6 x 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1 x 1013 a 5, 6 x 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose fixa de 2,6 χ 1012 cópias do genoma é administrada a um paciente adulto. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1,3 χ 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente adulto. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1,4 x 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente adulto. Em certas modalidades, uma dose fixa de 7,0 χ 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente adulto. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1,4 χ 1013 a 7,0 χ 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente adulto. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1 χ 1012 a 5, 6 χ 1013 cópias do genoma é administrada a um paciente adulto.
[00134] Em certas modalidades, as doses são medidas pelo número de cópias do genoma administradas ao LCR do paciente (p. ex., injetadas por punção suboccipital ou punção lombar) por grama de massa cerebral. Em certas modalidades, 1 χ 109 a 2 χ 1010 cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 5 χ 109 a 2 χ 1010 cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 2 χ 109 cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 1 χ 1010 cópias do genoma por grama de massa cerebral são
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97/154 administradas. Em modalidades especificas, 9 x 109 a 1 x 1010 cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em modalidades especificas, 1 x 1010 a 1,5 x 1010 cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em modalidades especificas, 5 x 1010 a 6 x 1010 cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas.
[00135] Em uma modalidade, um AAV recombinante não replicante com capsideo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo forte.
[00136] O rAAV9.hIDUA pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) em uma dose fixa única que varia de 1,4 χ 1013 GC (1,1 χ 1010 GC/g de massa cerebral) a 7,0 χ 1013 GC (5,6 χ 1010 GC/g de massa cerebral) em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL, ou em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos. Caso o paciente tenha anticorpos neutralizantes contra AAV, podem ser utilizadas doses na faixa alta. O rAAV9.hIDUA pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) em uma dose fixa única que varia de 2,6 χ 1012 GC (2 χ 109 GC/g de massa cerebral) a 1,3 χ 1013 GC (1 χ 1010 GC/g de massa cerebral) em um volume de aproximadamente 5 a 2 0 mL, ou em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos. Quando o paciente tiver 4 meses ou mais, mas menos de 9 meses de idade, o rAAV9.hIDUA pode ser
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98/154 administrado IC (por injeção suboccipital) em uma dose fixa única que varia de 6,0 χ 1012 GC (1,0 χ 1010 GC/g de massa cerebral) a 3,0 χ 1013 GC (5 χ 1010 GC/g de massa cerebral) em um volume de aproximadamente 5 a 2 0 mL, ou em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos. Quando o paciente tiver 9 meses ou mais, mas menos de 18 meses de idade, o rAAV9.hIDUA pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) em uma dose fixa única que varia de 1,0 χ 1013 GC (1,0 χ 1010 GC/g de massa cerebral) a 5, 0 χ 1013 GC (5 χ 1010 GC/g de massa cerebral) em um volume de aproximadamente 5 a 2 0 mL, ou em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos. Quando o paciente tiver 18 meses ou mais, mas menos de 3 anos de idade, o rAAV9.hIDUA pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) em uma dose fixa única que varia de 1,1 χ 1013 GC (1,0 χ 1010 GC/g de massa cerebral) a 5,5 χ 1013 GC (5 χ 1010 GC/g de massa cerebral) em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL, ou em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos.
5.4 TERAPIAS COMBINADAS
5.4.1. Terapia concomitante com supressão imune [00137] Embora a rHuGlylDUA entregue deva minimizar as reações imunes, a fonte potencial mais evidente de toxicidade relacionada à terapia gênica direcionada ao SNC é a imunidade gerada contra a proteína hIDUA expressa em indivíduos humanos com deficiência genética de IDUA e, portanto, potencialmente não tolerantes à proteína e/ou ao vetor utilizado para libera o transgene. Assim, em uma modalidade preferida, é aconselhável tratar concomitantemente o paciente com terapia
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99/154 de supressão imune -- especialmente quando forem tratados pacientes portadores de formas graves da doença com níveis próximos ao zero de IDUA (p. ex. , pacientes com síndrome de Hurler). Podem ser empregadas terapias de supressão imune que envolvem um esquema com tacrolimo ou rapamicina (sirolimo) em combinação com ácido micofenólico, ou outros esquemas de supressão imune utilizados em procedimentos de transplante de tecidos. Tal tratamento de supressão imune pode ser administrado no decorrer da terapia gênica e, em certas modalidades, o pré-tratamento com terapia de supressão imune pode ser preferido. A terapia de supressão imune pode ser continuada subsequentemente ao tratamento com terapia gênica, com base no juízo do médico responsável pelo tratamento e, pode, posteriormente, ser retirada quando a tolerância imune tiver sido induzida; p. ex., depois de 180 dias.
[00138] Em certas modalidades, os métodos de tratamento aqui providos são administrados com um esquema de supressão imune compreendendo prednisolona, ácido micofenólico e tacrolimo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento aqui providos são administrados com um esquema de supressão imune compreendendo prednisolona, ácido micofenólico e rapamicina (sirolimo). Em certas modalidades, os métodos de tratamento aqui providos são administrados com um esquema de supressão imune que não compreende tacrolimo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento aqui providos são administrados com um esquema de supressão imune compreendendo um ou mais corticosteroides como metilprednisolona e/ou prednisolona, bem como tacrolimo e/ou sirolimo. Em certas modalidades, a terapia de supressão imune compreende administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido
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100/154 micofenólico ou (b) rapamicina e ácido micofenólico ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar posteriormente. Em certas modalidades, a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias. Em certas modalidades, a terapia de supressão imune é retirada depois de 30, 60, 90, 120, 150 ou 180 dias.
[00139] Em certas modalidades, tacrolimo é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 10 ng/mL. Em certas modalidades, tacrolimo é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 4 a 8 ng/mL. Em certas modalidades, especialmente quando o paciente tem menos de 3 anos de idade, tacrolimo é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 4 ng/mL. Em certas modalidades, MMF é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 pg/mL. Em certas modalidades, tacrolimo é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 10 ng/mL e MMF é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 pg/mL.
Em certas modalidades, a concentração sérica é alcançada por
titulação de tacrolimo e/ou MMF após medição dos níveis de
vale (trough) de tacrolimo e/ou MMF.
[00140] Em certas modalidades, metilprednisolona é
administrada a uma dose de 10 mg/kg via intravenosa uma vez. Em certas modalidades, prednisolona é administrada a uma dose de 0,5 mg/kg via oral, uma vez ao dia,. Em certas modalidades, prednisolona é gradualmente reduzida e então descontinuada. Em certas modalidades, tacrolimo é administrado a 1 mg por via oral, duas vezes ao dia, para manter um nível alvo no sangue
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101/154 de 4-8 ng/mL. Em certas modalidades, especialmente quando ο paciente tem menos de 3 anos de idade, tacrolimo é administrado 0,05 mg/kg por via oral, duas vezes ao dia, para manter um nível alvo no sangue de 2-4 ng/mL. Em certas modalidades, sirolimo é também administrado. O paciente pode ser pré-tratado com sirolimo, o qual é então mantido a um nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL durante o esquema. No entanto, em certas modalidades, quando o paciente tem menos de 3 anos de idade, o paciente é preferivelmente pré-tratado com sirolimo, o qual é então mantido em um nível alvo no sangue de 1-3 ng/mL durante o esquema. Em certas modalidades, metilprednisolona é administrada a uma dose de 10 mg/kg via intravenosa uma vez, prednisolona é administrada a uma dose de 0,5 mg/kg via oral, uma vez ao dia,, tacrolimo é administrado 0,2 mg/kg via oral uma vez al dia e sirolimo é administrado.
[00141] Em certas modalidades, rapamicina é administrada a uma dose de 2 ou 4 mg/kg via oral, uma vez ao dia, . Em certas modalidades, MMF é administrado a uma dose de 25 mg/kg via oral, duas vezes ao dia. Em certas modalidades, rapamicina é administrada a uma dose de 2 ou 4 mg/kg via oral, uma vez ao dia, e MMF é administrado a uma dose de 25 mg/kg via oral, duas vezes ao dia. Em certas modalidades, rapamicina é administrada a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 15 ng/mL. Em certas modalidades, MMF é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 pg/mL. Em certas modalidades, rapamicina é administrada a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 15 ng/mL e MMF é administrado a uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 pg/mL. Em certas modalidades, a concentração
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102/154 sérica é alcançada por titulação de rapamicina e/ou MMF após medição dos níveis de vale (trough) de rapamicina e/ou MMF.
5.4.2. Terapia concomitante com outros tratamentos, incluindo padrão de cuidados [00142] Combinações da administração de HuGlylDUA ao LCR acompanhada pela administração de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou depois do tratamento com terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS I que poderíam ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, entre outros, terapia de reposição enzimática (ERT) com laronidase administrada por via sistêmica ou ao LCR; e/ou terapia de TCTH. Em outra modalidade, a TRE pode ser administrada utilizando uma glicoproteína rHuGlylDUA produzida em linhagens celulares humanas pela tecnologia do DNA recombinante. As linhagens celulares humanas que podem ser utilizadas para tal produção da glicoproteína recombinante incluem, entre outras, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSCll, ReNcell ATM, células 293 de rim embrionário humano (HEK293), HT-1080 de fibrossarcoma, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares da retina, PER.06 ou RPE para citar algumas (vide, p. ex., Dumont et al. , 2016, Critical Rev in Biotech 36(6) :1110-1122 Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives, cujo conteúdo sobre uma revisão das linhagens celulares humanas que poderíam ser utilizadas para a produção recombinante da glicoproteína rHuGlylDUA é aqui incorporado, em sua totalidade, por
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103/154 referência a glicoproteina) . Para assegurar a glicosilação, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina completa, a linhagem celular utilizada para a produção pode ser aprimorada por engenharia das células hospedeiras para que expresse concomitantemente a-2,6-sialiltransferase (ou ambas, a-2,3- e a-2,6-sialiltransferases) e/ou as enzimas TPST-1 e TPST-2, responsáveis pela O-sulfatação de tirosina.
5.5 BIOMARCADORES/AMOSTRAGEM/MONITORAMENTO DA EFICÁCIA [00143] A eficácia pode ser monitorada medindo-se a função cognitiva (p. ex., prevenção ou diminuição do declínio neurocognitivo); reduções em biomarcadores da doença (como GAG) no LCR e/ou soro; e/ou aumento na atividade enzimática de IDUA no LCR e/ou soro. Os sinais de inflamação e outros eventos de segurança podem também ser monitorados.
5.5.1. Marcadores da doença [00144] Em certas modalidades, a eficácia do tratamento com o vetor recombinante é monitorada medindo-se o nível de um biomarcador da doença no paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido no LCR do paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido no soro do paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido na urina do paciente. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é GAG. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é a atividade enzimática de IDUA. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é inflamação. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é um evento de segurança.
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5.5.2. Testes para função neurocognitiva [00145] Em certas modalidades, a eficácia do tratamento com o vetor recombinante é monitorada medindo-se o nivel da função cognitiva no paciente. A função cognitiva pode ser medida por qualquer método conhecido pelo técnico no assunto. Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por intermédio de um instrumento validado para medir o coeficiente de inteligência (QI) . Em modalidades especificas, o QI é medido pela Escala Wechsler Abreviada de Inteligência, segunda edição (WASI-II) . Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por intermédio de um instrumento validado para medir a memória. Em modalidades especificas, a memória é medida pelo Teste de Aprendizagem Verbal de Hopkins (HVLT). Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por intermédio de um instrumento validado para medir a atenção. Em modalidades especificas, a atenção é medida pelo Teste de Variáveis de Atenção (TOVA). Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por intermédio de um instrumento validado para medir um ou mais dentre IQ, memória e atenção.
5.5.3. Alterações físicas [00146] Em certas modalidades, a eficácia do tratamento com o vetor recombinante é monitorada medindo-se características físicas associadas com deficiência do depósito lisossômico no paciente. Em certas modalidades, as características físicas são lesões de depósito. Em certas modalidades, a característica física é baixa estatura. Em certas modalidades, a característica física é face com características grosseiras.
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Em certas modalidades, a característica física é apneia obstrutiva do sono. Em certas modalidades, a característica física é comprometimento da audição. Em certas modalidades, a característica física é comprometimento da visão. Em modalidades específicas, o comprometimento visual deve-se à opacificação da córnea. Em certas modalidades, a característica física é hidrocefalia. Em certas modalidades, a característica física é compressão da medula espinhal. Em certas modalidades, a característica física é hepatosplenomegalia. Em certas modalidades, as características físicas são deformidades ósseas e articulares. Em certas modalidades, a característica física é doença cardíaca valvular. Em certas modalidades, as características físicas são infecções recorrentes nas vias aéreas superiores. Em certas modalidades, a característica física é síndrome do túnel do carpo. Em certas modalidades, a característica física é macroglossia (língua de tamanho aumentado). Em certas modalidades, a característica física é cordas vocais de tamanho aumentado e/ou alteração na voz. Tais características físicas podem ser medida por qualquer método conhecido pelo técnico no assunto.
TABELA DE SEQUÊNCIAS
SEQ ID NO: Descrição Sequência
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
1 Sequência de aminoácidos de IDUA humana MRPLRPRAAL LALLASLLAA PPVAPAEAPH LVHVDAARAL WPLRRFWRST GFCPPLPHSQ ADQYVLSWDQ QLNLAYVGAV PHRGIKQVRT HWLLELVTTR GSTGRGLSYN FTHLDGYLDL LRENQLLPGF ELMGSASGHF TDFEDKQQVF EWKDLVSSLA RRYIGRYGLA HVSKWNFETW NEPDHHDFDN VSMTMQGFLN YYDACSEGLR AASPALRLGG PGDSFHTPPR SPLSWGLLRH CHDGTNFFTG EAGVRLDYIS LHRKGARSSI SILEQEKVVA QQIRQLFPKF ADTPIYNDEA DPLVGWSLPQ PWRADVTYAA MVVKVIAQHQ NLLLANTTSA FPYALLSNDN AFLSYHPHPF AQRTLTARFQ VNNTRPPHVQ LLRKPVLTAM GLLALLDEEQ LWAEVSQAGT VLDSNHTVGV LASAHRPQGP ADAWRAAVLI YASDDTRAHP NRSVAVTLRL RGVPPGPGLV YVTRYLDNGL CSPDGEWRRL GRPVFPTAEQ FRRMRAAEDP VAAAPRPLPA GGRLTLRPAL RLPSLLLVHV CARPEKPPGQ VTRLRALPLT QGQLVLVWSD EHVGSKCLWT YEIQFSQDGK AYTPVSRKPS TFNLFVFSPD TGAVSGSYRV RALDYWARPG PFSDPVPYLE VPVPRGPPSP GNP
2 Peptideo sinal da glicoproteína da mielina de MEYQILKMSL CLFILLFLTP GILC
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
oligodendrócitos (hOMG)
3 Peptídeo sinal do repressor celular dos genes 2 estimulados por EIA (HCREG2) MSVRRGRRPA RPGTRLSWLL CCSALLSPAA G
4 Peptídeo sinal do domínio V-set e transmembrana contendo 2B (HVSTM2B) MEQRNRLGAL GYLPPLLLHA LLLFVADA
5 Peptídeo sinal da protocaderina alfa-1 (hPCADHAl) MVFSRRGGLG ARDLLLWLLL LAAWEVGSG
6 Peptídeo sinal de FAM19A1 (TAFA1) MAMVSAMSWV LYLWISACA
7 Peptídeo sinal de VEGF-A MNFLLSWVHW SLALLLYLHH AKWSQA
8 Peptídeo sinal de fibulina-1 MERAAPSRRV PLPLLLLGGL ALLAAGVDA
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
9 Peptídeo sinal de vitronectina MAPLRPLLIL ALLAWVALA
10 Peptídeo sinal do fator H do complemento MRLLAKIICL MLWAICVA
11 Peptídeo sinal de opticina MRLLAFLSLL ALVLQETGT
12 Peptídeo sinal de albumina MKWVTFISLL FLFSSAYS
13 Peptídeo sinal de quimiotripsinogênio MAFLWLLSCW ALLGTTFG
14 Peptídeo sinal de interleucina-2 MYRMQLLSCI ALILALVTNS
15 Peptídeo sinal de tripsinogênio-2 MNLLLILTFV AAAVA
16 AAV1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQ QKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDT SFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKR PVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSE SVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNE GADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTY
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109/154
SEQ ID NO: Descrição Sequência
NNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRF HCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEV TTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQ GCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCL EYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLD RLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSP AGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWT GASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGV ΜIEGKE SAGASNTAL DNVMIT DE E EIΚΆΤΝPVAT E R FGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDV YLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQIL IKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGL YTEPRPIGTRYLTRPL
17 AAV2 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAE RHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAA LEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDT SFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKR PVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDAD SVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNE GADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTY NNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFH CHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVT QNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQG CLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLE YFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDR
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110/154
SEQ ID NO: Descrição Sequência
LMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGAS DIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTG ATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVL IFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQY GSVSTNLQRGN RQAATADVNT Q GVL P GMVWQ D RDVY LQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILI KNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEW ELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVY SEPRPIGTRYLTRNL
18 AAV3-3 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGVPQPKANQ QHQDNRRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNEADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDT SFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEAAKTAPGKKG AVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSE SVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNE GADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTY NNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFH CHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVRGVT QNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQG CLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLE YFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDR LMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGP Q SMS L QARNWL PGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWT AASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGN LIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQ YGTVANNLQSSNTAPTTGTVNHQGALPGMVWQDRDV
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
YLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIM IKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGV YSEPRPIGTRYLTRNL
19 AAV4-4 MTDGYLPDWLEDNLSEGVREWWALQPGAPKPKANQQ H Q DNARGLVL PGYKYLGPGNGLDKGE PVNAADAAAL EHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTS FGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRP LIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKKLVFEDETGAGD GPPEGSTSGAMSDDSEMRAAAGGAAVEGGQGADGVG NASGDWHCDSTWSEGHVTTTSTRTWVLPTYNNHLYK RLGESLQSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ RLINNNWGMRPKAMRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVA NNLTSTVQIFADSSYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDV FMVPQYGYCGLVTGNTSQQQTDRNAFYCLEYFPSQM LRTGNNFEITYSFEKVPFHSMYAHSQSLDRLMNPLI DQYLWGLQSTTTGTTLNAGTATTNFTKLRPTNFSNF KKNWLPGPSIKQQGFSKTANQNYKIPATGSDSLIKY ETHSTLDGRWSALTPGPPMATAGPADSKFSNSQLIF AGPKQNGNTATVPGT LIFT S E E E LAATNAT DT DMWG NLPGGDQSNSNLPTVDRLTALGAVPGMVWQNRDIYY QGPIWAKIPHTDGHFHPSPLIGGFGLKHPPPQIFIK NTPVPANPATTFSSTPVNSFITQYSTGQVSVQIDWE IQKERSKRWNPEVQFTSNYGQQNSLLWAPDAAGKYT EPRAIGTRYLTHHL
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
20 AAV5 MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQ HQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAR EHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTS FGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRI DDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQI PAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASG DWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKS GSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQ RLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIA NNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQV FTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKML RTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVD QYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGP MGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQV PPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTA TYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSS TTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIP ETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNIT SFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWN PEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYL TRPL
21 AAV 6 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQ QKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDT S FGGNLGRAV FQAKKRVL E P FGLVE E GAKTAPGKKR PVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSE
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
SVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNE GADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTY NNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRF HCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEV TTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQ GCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCL EYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLD RLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSP AGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWT GASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGV ΜIFGKE SAGASNTAL DNVMIT DE E EIΚΆΤΝPVAT E R FGTVAVNL QSSSTDPATG DVHVMGAL PGMVWQ D RDV YLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIL IKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGL YTEPRPIGTRYLTRPL
22 AAV7 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQ QKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDT S FGGNLGRAV FQAKKRVL E PLGLVE E GAKTAPAKKR PVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDS ESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNN EGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSETAGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNR FHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLRFKLFNIQVKE VTTNDGVTTIANNLTSTIQVFSDSEYQLPYVLGSAH
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
QGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQSVGRSSFYC LEYFPSQMLRTGNNFEFSYSFEDVPFHSSYAHSQSL DRLMNPLIDQYLYYLARTQSNPGGTAGNRELQFYQG GPSTMAEQAKNWLPGPCFRQQRVSKTLDQNNNSNFA WTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSS GVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATE EYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRD VYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQI LIKNTPVPANPPEVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEI EWELQKENSKRWNPEIQYTSNFEKQTGVDFAVDSQG VYSEPRPIGTRYLTRNL
23 AAV 8 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQ QKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDT SFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKR PVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDS ESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNN EGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFN RFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVK EVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFY CLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQS LDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQG GPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFA WTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSN
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
GILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVAT EEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNR DVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQ ILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVE IEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTE GVYSEPRPIGTRYLTRNL
24 hu31 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAE RHKDDSRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDT SFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKR PVEQSPQEPDSSAGIGKSGSQPAKKKLNFGQTGDTE SVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNE GADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTY NNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNR FHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKE VTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAH EGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGGQAVGRSSFYC LEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSL DRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGP SNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSE FAWP GASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGS LIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATES Y GQVATNHQ SAQAQAQTGWVQNQGIL PGMVWQ DRDV YLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQIL IKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVSTEGV
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
YSEPRPIGTRYLTRNL
25 hu32 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAE RHKDDSRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDT SFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKR PVEQSPQEPDSSAGIGKSGSQPAKKKLNFGQTGDTE SVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNE GADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTY NNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNR FHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKE VTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAH EGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYC LEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSL DRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGP SNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSE FAWP GASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGS LIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATES Y GQVATNHQ SAQAQAQTGWVQNQGIL PGMVWQ DRDV YLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQIL IKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGV YSEPRPIGTRYLTRNL
26 AAV 9 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQ QHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAA LEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDT
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
SFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKR PVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTE SVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNE GADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTY NNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNR FHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKE VTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAH EGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYC LEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSL DRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGP SNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSE FAWP GASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGS LIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATES Y GQVATNHQ SAQAQAQTGWVQNQGIL PGMVWQ DRDV YLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQIL IKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGV YSEPRPIGTRYLTRNL
6. EXEMPLOS
6.1 EXEMPLO 1: cDNA de hIDUA [00147] É construído um vetor à base do cDNA de hIDUA que inclui um transgene compreendendo hIDUA (SEQ ID NO:1). O transgene também compreende ácidos nucleicos incluindo um peptídeo sinal escolhido dentre o grupo listado na Tabela 1. Opcionalmente, o vetor compreende adicionalmente um promotor.
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6.2 EXEMPLO 2: cDNAs substituídos de hIDUA [00148] É construído um vetor à base do cDNA de hIDUA que inclui um transgene compreendendo hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação à sequência de hIDUA de SEQ ID NO:1, p. ex. , incluindo, entre outras, substituições de aminoácidos selecionados dentre os resíduos correspondentes não conservados em ortólogos de IDUA mostrados na Figura 2, com a ressalva de que tais mutações não incluem qualquer uma já identificada em fenótipos graves, gravesintermediários, intermediários ou atenuados de MPS I mostrados na Figura 3 (fonte: Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, Tabela 1, listagem de 57 mutações da MPS I, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência); ou relatadas por Venturi et al. , 2002, Human
Mutation #522 Online (Venturi 2002), ou Bertoia et al., 2011 Human Mutation 32:E2189-E2210 (Bertoia 2011), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. O transgene também compreende ácidos nucleicos incluindo um peptídeo sinal escolhido dentro o grupo listado na Tabela 1. Opcionalmente, o vector compreende adicionalmente um promotor.
6.3 EXEMPLO 3: Tratamento de MPS I com hIDUA ou hIDUA substituída em modelos animais [00149] Um vetor à base do cDNA de hIDUA é considerado útil para o tratamento de MPS I quando expresso
Um modelo animal para MPS I, por exemplo, como um transgene.
um modelo animal descrito em Clarke et al.,
1997, Hum Mol Genet 6(4) :503-511
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119/154 (camundongos), Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13(11):129497 (o gato doméstico de pelo curto), Menon et al., 1992, Genomics 14(3):763-768 (cão) ou Shull et al., 1982, Am J Pathol 109(2):244-248 (cão), recebe um vetor recombinante que codifica hIDUA, via intratecal, a uma dose suficiente para entregar e manter uma concentração do produto transgênico a uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/mL no LCR do animal. Após o tratamento, o animal é avaliada quanto à melhora em sintomas compatíveis com a doença no modelo animal em particular.
6.4
EXEMPLO 4: Tratamento de MPS I com hIDUA ou hIDUA substituídas [00150] Um vetor à base do cDNA de hIDUA é considerado útil para o tratamento de MPS I quando expresso como um transgene. Um indivíduo que apresenta MPS I recebe um vetor à base de cDNA que codifica hIDUA, via intratecal, a uma dose suficiente para entregar e manter uma concentração do produto transgênico a uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/mL no LCR. Após o tratamento, o indivíduo é avaliado quanto melhora em sintomas de MPS I. Antes, concomitantemente ou depois da administração do vetor à base de cDNA que codifica hIDUA, o paciente é tratado com terapia de imunossupressão incluindo rapamicina, MMF e prednisolona.
6.5
EXEMPLO 5: Protocolo de tratamento clinico de MPS I [00151] O exemplo a seguir apresenta um protocolo que pode ser utilizado para tratar indivíduos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA visando tratar MPS I.
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120/154 [00152] População de pacientes. Os pacientes a serem tratados podem ser do sexo masculino ou feminino que tenham:
• diagnóstico de MPS I confirmado por atividade enzimática, conforme medida no plasma, fibroblastos ou leucócitos.
• déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS I, definido por qualquer um dos seguintes, se inexplicável por outros fatores neurológicos ou psiquiátricos:
o Pontuação >1 desvio padrão abaixo da média em testes de QI ou em 1 dominio da função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptual).
o Evidência histórica documentada (registros médicos) de declínio >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[00153] Os pacientes pode incluir aqueles que estão em um esquema estável de TRE (p. ex. , ALDURAZYME [laronidase] IV) . Pacientes do sexo feminino em idade fértil devem apresentar teste de gravidez negativo no soro no dia do tratamento. Indivíduos sexualmente ativos (do sexo masculino e do feminino) devem fazer uso de um método contraceptive de barreira clinicamente aceito (p. ex., preservativo, diafragma ou abstinência) até 24 semanas depois da administração do vetor. Pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir indivíduos com uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. As contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer uma das seguintes:
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História de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
Apresentar qualquer contraindicação para TC (ou contraste) ou para anestesia geral.
• Apresentar qualquer contraindicação para IRM (ou para gadolinio).
• Taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) <30 mL/min/1,7 3 m2.
[00154] Pacientes que receberam tratamento IT em qualquer momento e que sofreram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados IC.
[00155] Pacientes portadores de qualquer condição que o médico responsável pelo tratamento acredite que não seria adequada para terapia imunossupressora não devem receber o tratamento (p. ex., número absoluto de neutrófilos <1,3 χ 103/pL, número de plaquetas <100 χ 103/pL e hemoglobina <12 g/dL [sexo masculino] ou <10 g/dL [feminino]) . Um esquema alternativo de supressão imune deve ser utilizado em qualquer paciente que tenha qualquer história de reação de hipersensibilidade ao sirolimo, MMF ou à prednisolona.
[00156] Pacientes com história de linfoma ou de outro câncer, a não ser de carcinoma espinocelular ou basocelular da pele, não devem ser tratados a menos que em remissão completa por pelo menos 3 antes do tratamento.
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122/154 [0015'7] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartate aminotransferase (AST) >3 χ o limite superior da normalidade (LSN) ou bilirrubina total >1,5 χ LSN não devem ser tratados, a menos que tenha uma história previamente conhecida de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[00158] Pacientes com história de doença infecciosa ou abuso de substâncias podem não ser candidatos para o tratamento. Por exemplo, uma história de teste positivo para o vírus da imunodeficiência humana (HIV), história de hepatite B ou hepatite C ativa ou recorrente ou testes de rastreamento positivo para hepatite B, hepatite C ou HIV; história de abuso
de álcool ou de substâncias no período de 1 ano antes do
tratamento.
[00159] Em uma modalidade, os pacientes são pacientes
adultos. Em outra modalidade, os pacientes são pacientes
pediátricos.
[00160] Tratamentos administrados—Pré-tratamento com Terapia imunossupressora. Antes da terapia gênica, o paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para evitar respostas imunes contra o transgene e/ou o capsídeo de AAV. Tal terapia imunossupressora inclui prednisolona (60 mg, VO, lx/dia, Dias -2 a 8), MMF (1 g, VO, 2x/dia, Dias -2 a 60) e sirolimo (6 mg, VO, Dia -2, depois, 2 mg, lx/dia, do Dia -1 até a Semana 48) . A dose de sirolimo é ajustada para manter concentrações de vale no sangue total dentro de 16-24 ng/mL. Na maioria dos indivíduos, os ajustes de dose podem ser com base na equação:
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123/154 dose nova = dose atual * (concentração alvo/concentração atual) . Os indivíduos devem continuar na nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de ajustes adicionais da dose com monitoramento da concentração. Se houver desenvolvimento de neutropenia (número absoluto de neutrófilos <1.3 * 103/pL), a administração de MMF deve ser interrompida ou a dose reduzida.
[00161] Terapia gênica. Um AAV recombinante não replicante com capsídeo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo CAG forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução de Elliotts B para injeção intratecal.
[00162] O rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: uma dose baixa de 1,4 χ 1013 GC (1,1 x 1010 GC/g de massa cerebral) ou uma dose alta de 7,0 χ 1013 GC (5,6 x 1010 GC/g de massa cerebral) pode ser utilizada em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL. Caso o paciente tenha anticorpos neutralizantes contra AAV, a dose alta pode ser utilizada.
[00163] Para administração de rAAV9.IDUA, o indivíduo é posto sob anestesia geral. Uma punção lombar é realizada, em primeiro lugar para remover 5 cc de LCR e subsequentemente para injetar contraste IT para auxiliar a visualização da
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124/154 cisterna magna. TC (com contraste) é utilizada para guiar a inserção da agulha e a administração da dose selecionada de rAAV9.IDUA no espaço suboccipital.
6.6 EXEMPLO 6: Protocolo de tratamento clinico de MPS I [00164] O exemplo a seguir apresenta um protocolo que pode ser utilizado para tratar indivíduos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA visando tratar MPS I.
[00165] População de pacientes. Os pacientes a serem tratados podem ser do sexo masculino ou feminino com 6 anos de idade ou mais que tenham:
• diagnóstico de MPS I confirmado por atividade
enzimática, conforme medida no plasma, fibroblastos ou
leucócitos (inclui aqueles que podem ter recebido
anteriormente TCTH ou que tenham recebido anteriormente ou
estejam recebendo atualmente tratamento com laronidase).
• déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à
MPS I, definido por qualquer um dos seguintes, se inexplicável por outros fatores neurológicos ou psiquiátricos:
o Pontuação >1 desvio padrão abaixo da média em testes de QI ou em 1 domínio da função neuropsicológica (compreensão verbal, atenção ou raciocínio perceptual).
o Declínio >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[00166] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílios, para completar os testes
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125/154 requeridos pelo protocolo e estar dispostos a usar o auxilio, se aplicável, em dias de testes.
[00167] Pacientes do sexo feminino em idade fértil devem apresentar teste de gravidez negativo no soro no dia do tratamento. Todos os indivíduos sexualmente ativos deverão estar dispostos a usar um método contraceptive de barreira clinicamente aceito desde o dia da visita de seleção até 24 semanas depois da administração do vetor. Pacientes do sexo feminino sexualmente ativas deverão estar dispostas a fazer uso de um método eficaz de controle da natalidade desde o dia da visita de seleção até 12 semanas depois da última dose de sirolimo, o que for depois. Pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir indivíduos com uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. As contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer uma das seguintes:
História de cirurgia anterior na cabeça/pescoço, que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
Apresentar qualquer contraindicação para TC (ou contraste) ou para anestesia geral.
• Apresentar qualquer contraindicação para IRM (ou para gadolínio).
• Taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) <30 mL/min/1,7 3 m2.
[00168] Pacientes que receberam tratamento IT em qualquer momento e que sofreram uma reação adversa significativa
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126/154 considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados IC. Pacientes portadores de qualquer condição que o médico responsável pelo tratamento acredite que não seria adequada para terapia imunossupressora não devem receber o tratamento (p. ex., número absoluto de neutrófilos <1,3 χ 103/pL, número de plaquetas <100 χ 103/pL e hemoglobina <12 g/dL [sexo masculino] ou <10 g/dL [feminino]) . Um esquema alternativo de supressão imune deve ser utilizado em qualquer paciente que tenha qualquer história de reação de hipersensibilidade ao sirolimo, MMF ou à prednisolona.
[00169] Pacientes com história de linfoma ou de outro câncer, a não ser de carcinoma espinocelular ou basocelular da pele, não devem ser tratados a menos que em remissão completa por pelo menos 3 antes do tratamento.
[00170] Pacientes com hipertensão descontrolada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[00171] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 χ o limite superior da normalidade (LSN) ou bilirrubina total >1,5 χ LSN não devem ser tratados, a menos que tenha uma história previamente conhecida de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[00172] Pacientes com história de doença infecciosa ou abuso de substâncias podem não ser candidatos para o tratamento. Por exemplo, história de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou da hepatite B ou hepatite C, ou testes de
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127/154 rastreamento positivo para antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou anticorpo contra o core (núcleo) do virus da hepatite B ou anticorpos contra o virus da hepatite C ou HIV; história de abuso de álcool ou de substâncias no período de 1 antes da seleção.
[00173] Pacientes que receberam qualquer produto em investigação nos 30 dias ou 5 meias-vidas antes, o que for mais longo, não devem ser tratados exceto pacientes que recebem laronidase IT, a qual pode ser administrada em qualquer momento antes.
[00174] Pacientes que estão grávidas, com menos de seis semanas após o parto, amamentando na seleção ou planejando engravidar em qualquer momento até a Semana 52 não devem ser tratadas.
[00175] Pacientes com uma anormalidade clinicamente significativa no ECG que comprometería a segurança do indivíduo não devem ser tratados. Pacientes com uma condição médica ou psicológica grave ou instável que comprometería a segurança do indivíduo não devem ser tratados.
[00176] Tratamentos administrados—Pré-tratamento com Terapia imunossupressora. Antes da terapia gênica, o paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para evitar respostas imunes contra o transgene e/ou o capsídeo de AAV. Tal terapia imunossupressora inclui prednisolona (60 mg, VO, lx/dia, Dias -2 a 8), MMF (1 g, VO, 2x/dia, Dias -2 a 60) e sirolimo (6 mg, VO, Dia -2, depois, 2 mg, lx/dia, do Dia -1 até a Semana 48) . A dose de sirolimo é ajustada para manter concentrações de
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128/154 vale no sangue total dentro de 16-24 ng/mL. Na maioria dos indivíduos, os ajustes de dose podem ser com base na equação: dose nova = dose atual χ (concentração alvo/concentração atual) . Os indivíduos devem continuar na nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de ajustes adicionais da dose com monitoramento da concentração.
[00177] O princípio subjacente para o esquema de imunossupressão é administrar corticosteroides para suprimir completamente a imunidade - iniciando com metilprednisolona IV, como a dose de ataque, e seguindo com prednisolona oral que é reduzida gradualmente de modo que o paciente não esteja fora de esteroides na Semana 12. O tratamento com corticosteroide é suplementado por tacrolimo (durante 24 semanas) e/ou sirolimo (durante 12 semanas), e pode ser suplementado mais com MMF. Quando se usa tacrolimo e sirolimo, a dose de cada um deve ser uma dose baixa ajustada para manter um nível mínimo no sangue de 4-8 ng/mL. Se apenas um dos agentes for utilizado, a dose indicada na rotulagem (a dose mais alta) deve ser empregada; p. ex., tacrolimo a 0,15-0,20 mg/kg/dia, fornecido em duas doses divididas a cada 12 horas; e sirolimo a 1 mg/m2/dia; a dose de ataque deve ser 3 mg/m2. Se MMF for adicionado ao esquema, a dose de tacrolimo e/ou sirolimo pode ser mantida, pois os mecanismos de ação são diferentes.
[00178] Terapia gênica. Um AAV recombinante não replicante com capsídeo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC
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129/154 após administração IC. 0 genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo CAG forte. 0 vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução de Elliotts B para injeção intratecal.
[00179] O rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: a uma dose de 2 χ 109 GC/g de massa cerebral (2,6 x 1012 GC) ou uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral (1,3 χ 1013 GC) . A dose pode ser em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL.
[00180] Para administração de rAAV9.IDUA, o indivíduo é posto sob anestesia geral.
6.7 EXEMPLO 7: Protocolo de tratamento clinico de MPS I [00181] O exemplo a seguir apresenta um protocolo que pode ser utilizado para tratar indivíduos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA, visando tratar MPS I.
[00182] População de pacientes. Os pacientes a serem tratados podem ser do sexo masculino ou feminino que tenham:
diagnóstico de MPS
I confirmado por atividade enzimática conforme medida no plasma fibroblastos ou leucócitos aqueles que podem recebido anteriormente ou receberam atualmente tratamento com TCTH ou com laronidase).
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130/154 • déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS I, definido por qualquer um dos seguintes, se inexplicável por outros fatores neurológicos ou psiquiátricos:
o Pontuação >1 desvio padrão abaixo da média em testes de QI ou em 1 domínio da função neuropsicológica (compreensão verbal, atenção ou raciocínio perceptual).
o Declínio >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[00183] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílios, para completar os testes requeridos pelo protocolo e estar dispostos a usar o auxílio, se aplicável, em dias de testes.
[00184] Pacientes do sexo feminino em idade fértil devem apresentar teste de gravidez negativo no soro no dia do tratamento. Todos os indivíduos sexualmente ativos deverão estar dispostos a usar um método contraceptive de barreira clinicamente aceito desde o dia da visita de seleção até 24 semanas depois da administração do vetor. Pacientes do sexo feminino sexualmente ativas deverão estar dispostas a fazer uso de um método eficaz de controle da natalidade desde o dia da visita de seleção até 12 semanas depois da última dose de sirolimo, o que for depois. Pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) pode incluir indivíduos com uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. As contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer uma das seguintes:
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131/154
História de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
Apresentar qualquer contraindicação para TC (ou contraste) ou para anestesia geral.
• Apresentar qualquer contraindicação para IRM (ou para gadolínio).
• Taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) <30 mL/min/1,7 3 m2.
[00185] Pacientes que receberam tratamento IT em qualquer momento e que sofreram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados IC. Pacientes portadores de qualquer condição que o médico responsável pelo tratamento acredite que não seria adequada para terapia imunossupressora não devem receber o tratamento (p. ex., número absoluto de neutrófilos <1,3 χ 103/pL, número de plaquetas <100 χ 103/pL e hemoglobina <12 g/dL [sexo masculino] ou <10 g/dL [feminino]).
[00186] Um esquema alternativo de supressão imune deve ser utilizado em qualquer paciente que tenha qualquer história de reação de hipersensibilidade ao tacrolimo, sirolimo ou à prednisolona. Pacientes com história de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o indivíduo à infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção pelo vírus do herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha se resolvido completamente por pelo menos 12 semanas
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132/154 antes da seleção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parenterais que não tenha se resolvido pelo menos 8 semanas antes da segunda visita ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti-infecciosos orais (incluindo antivirals) nos dez dias antes da segunda visita ou com história de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon_TB Gold positivo durante a seleção ou (4) qualquer vacina viva nas 8 semanas anteriores à assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, ou (5) cirurgia de grande porte nas 8 semanas anteriores à assinatura do consentimento livre e esclarecido ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período do estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com número absoluto de neutrófilos <1,3 x 103/pL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[00187] Pacientes com história de linfoma ou de outro câncer, a não ser de carcinoma espinocelular ou basocelular da pele, não devem ser tratados a menos que em remissão completa por pelo menos 3 antes do tratamento.
[00188] Pacientes com hipertensão descontrolada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[00189] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 χ o limite superior da normalidade (LSN) ou bilirrubina total >1.5 χ LSN não devem ser tratados, a menos que tenha uma história previamente
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133/154 conhecida de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[00190] Pacientes com história de doença infecciosa ou abuso de substâncias podem não ser candidatos para o tratamento. Por exemplo, história de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou da hepatite B ou hepatite C, ou testes de rastreamento positivo para antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou anticorpo contra o core do vírus da hepatite B ou anticorpos contra o vírus da hepatite C ou HIV; história de abuso de álcool ou de substâncias no período de 1 ano antes do tratamento.
[00191] Em uma modalidade, os pacientes são pacientes adultos. Em outra modalidade, os pacientes são pacientes pediátricos.
[00192] Tratamentos administrados—Pré-tratamento com Terapia imunossupressora. Antes da terapia gênica, o paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para evitar respostas imunes contra o transgene e/ou o capsídeo de AAV. Tal terapia imunossupressora inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg via intravenosa [IV], uma vez no Dia 1 pré-dose, e prednisona oral iniciando a 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com redução gradual e descontinuação na Semana 12), tacrolimo (1 mg, duas vezes ao dia [2x/dia] por via oral [VO], Dia 2 à Semana 24 com nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL e redução ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32, e sirolimo (uma dose de ataque de 1 mg/m2 a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e, a seguir, a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/m2/dia dividido em duas doses
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134/154 ao dia com nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL até a Semana 48. Avaliações neurológicas e o monitoramento do nível de tacrolimo/sirolimo no sangue serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustados para manter os níveis no sangue na faixa planejada. Não está planejada terapia de imunossupressão depois da Semana 48. Na maioria dos indivíduos, os ajustes de dose podem ser com base na equação: dose nova = dose atual χ (concentração alvo/concentração atual) . Os indivíduos devem continuar na nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de ajustes adicionais da dose com monitoramento da concentração.
[00193] Terapia gênica. Um AAV recombinante não replicante com capsídeo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo CAG forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução de Elliotts B para injeção intratecal.
[00194] O rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: a uma dose de 2 χ 109 GC/g de massa cerebral (2,6 χ 1012 GC) ou uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral (1,3 χ 1013 GC) . A dose pode ser em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL.
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135/154 [00195] Para administração de rAAV9.IDUA, o indivíduo é posto sob anestesia geral.
6.8 EXEMPLO 8: Protocolo de tratamento clinico de MPS I [00196] O exemplo a seguir apresenta um protocolo que pode ser utilizado para tratar indivíduos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA, visando tratar MPS I.
[00197] População de pacientes. Os pacientes a serem tratados podem ser do sexo masculino ou feminino com 6 anos ou mais que tenham:
• diagnóstico de MPS I confirmado por atividade
enzimática, conforme medida no plasma, fibroblastos ou
leucócitos (inclui aqueles que podem ter recebido
anteriormente ou receberam atualmente tratamento com TCTH ou com laronidase).
• déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à
MPS I, definido por qualquer um dos seguintes, se inexplicável por outros fatores neurológicos ou psiquiátricos:
o Pontuação >1 desvio padrão abaixo da média em testes de QI ou em 1 domínio da função neuropsicológica (compreensão verbal, atenção ou raciocínio perceptual).
o Declínio >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[00198] OS pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílios, para completar os testes
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 211/244
136/154 requeridos pelo protocolo e estar dispostos a usar o auxílio, se aplicável, em dias de testes.
[00199] Pacientes do sexo feminino em idade fértil devem apresentar teste de gravidez negativo no soro no dia do tratamento. Todos os indivíduos sexualmente ativos deverão estar dispostos a usar um método contraceptive de barreira clinicamente aceito desde o dia da visita de seleção até 24 semanas depois da administração do vetor. Pacientes do sexo feminino sexualmente ativas deverão estar dispostas a fazer uso de um método eficaz de controle da natalidade desde o dia da visita de seleção até 12 semanas depois da última dose de sirolimo, o gue for depois. Pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) pode incluir indivíduos com uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. As contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer uma das seguintes:
História de cirurgia anterior na cabeça/pescoço, que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
Apresentar qualquer contraindicação para TC (ou contraste) ou para anestesia geral.
• Apresentar qualquer contraindicação para IRM (ou para gadolínio).
• Taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) <30 mL/min/1,7 3 m2.
[00200] Pacientes que receberam tratamento IT em qualquer momento e que sofreram uma reação adversa significativa
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 212/244
137/154 considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados IC. Pacientes portadores de qualquer condição que o médico responsável pelo tratamento acredite que não seria adequada para terapia imunossupressora não devem receber o tratamento (p. ex., número absoluto de neutrófilos <1,3 χ 103/pL, número de plaquetas <100 χ 103/pL e hemoglobina <12 g/dL [sexo masculino] ou <10 g/dL [feminino]).
[00201] Um esquema alternativo de supressão imune deve ser utilizado em qualquer paciente que tenha qualquer história de reação de hipersensibilidade ao tacrolimo, sirolimo ou à prednisolona. Pacientes com história de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o indivíduo à infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção pelo vírus do herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha se resolvido completamente por pelo menos 12 semanas antes da seleção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parenterais que não tenha se resolvido pelo menos 8 semanas antes da segunda visita ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti-infecciosos orais (incluindo antivirals) nos dez dias antes da segunda visita ou com história de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon_TB Gold positivo durante a seleção ou (4) qualquer vacina viva nas 8 semanas anteriores à assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido ou (5) cirurgia de grande porte nas 8 semanas anteriores à assinatura do consentimento livre e esclarecido ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período do estudo
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 213/244
138/154 não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com número absoluto de neutrófilos <1,3 x 103/pL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[00202] Pacientes com história de linfoma ou de outro câncer, a não ser de carcinoma espinocelular ou basocelular da pele, não devem ser tratados a menos que em remissão completa por pelo menos 3 antes do tratamento.
[00203] Pacientes com hipertensão descontrolada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[00204] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 χ o limite superior da normalidade (LSN) ou bilirrubina total >1,5 χ LSN não devem ser tratados, a menos que tenha uma história previamente conhecida de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[00205] Pacientes com história de doença infecciosa ou abuso de substâncias podem não ser candidatos para o tratamento. Por exemplo, história de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou da hepatite B ou hepatite C, ou testes de rastreamento positivo para antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou anticorpo contra o core do vírus da hepatite B anticorpos contra o vírus da hepatite C ou HIV; história de abuso de álcool ou de substâncias no período de 1 ano antes do tratamento.
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139/154 [00206] Tratamentos administrados—Pré-tratamento com Terapia imunossupressora. Antes da terapia gênica, o paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para evitar respostas imunes contra o transgene e/ou o capsídeo de AAV. Tal terapia imunossupressora inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg via intravenosa [IV], uma vez no Dia 1 pré-dose, e prednisona oral iniciando a 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com redução gradual e descontinuação na Semana 12), tacrolimo (1 mg, duas vezes ao dia [2x/dia] por via oral [VO], Dia 2 à Semana 24 com nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL e redução ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32, e sirolimo (uma dose de ataque de 1 mg/m2 a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e, a seguir, a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/m2/dia dividido em duas doses ao dia com nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL até a Semana 48. Avaliações neurológicas e o monitoramento do nível de tacrolimo/sirolimo no sangue serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustados para manter os níveis no sangue na faixa planejada. Não está planejada terapia de imunossupressão depois da Semana 48. Na maioria dos indivíduos, os ajustes de dose podem ser com base na equação: dose nova = dose atual * (concentração alvo/concentração atual) . Os indivíduos devem continuar na nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de ajustes adicionais da dose com monitoramento da concentração.
[00207] Terapia gênica. Um AAV recombinante não replicante com capsídeo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 215/244
140/154 expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo CAG forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução de Elliotts B para injeção intratecal.
[00208] O rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: a uma dose de 2 χ 109 GC/g de massa cerebral (2,6 χ 1012 GC) ou uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral (1,3 χ 1013 GC) . A dose pode ser em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL.
[00209] Para administração de rAAV9.IDUA, o indivíduo é posto sob anestesia geral.
6.9 EXEMPLO 9: Protocolo de tratamento clinico de MPS I [00210] O exemplo a seguir apresenta um protocolo que pode ser utilizado para tratar indivíduos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA, visando tratar MPS I.
[00211] População de pacientes. Os pacientes a serem tratados podem ser do sexo masculino ou feminino com 6 anos de idade ou do sexo masculino ou feminino com menos de 3 anos de idade que tenham:
diagnóstico de MPS
I confirmado por atividade enzimática conforme medida no plasma fibroblastos ou leucócitos aqueles que podem recebido anteriormente ou receberam atualmente tratamento com TCTH ou com laronidase).
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 216/244
141/154 • déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS I, definido por qualquer um dos seguintes, se inexplicável por outros fatores neurológicos ou psiquiátricos:
o Pontuação >1 desvio padrão abaixo da média em testes de QI ou em 1 domínio da função neuropsicológica (compreensão verbal, atenção ou raciocínio perceptual).
o Declínio >1 desvio padrão em testes sequenciais.
• pacientes com menos de 3 anos de idade portadores da forma grave de MPS I (síndrome de Hurler) confirmada por uma mais mutações conhecidas por levar à síndrome de Hurler com declínio neurocognitivo.
[00212] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílios, para completar os testes requeridos pelo protocolo e estar dispostos a usar o auxílio, se aplicável, em dias de testes.
[00213] Pacientes do sexo feminino em idade fértil devem apresentar teste de gravidez negativo no soro no dia do tratamento. Todos os indivíduos sexualmente ativos deverão estar dispostos a usar um método contraceptive de barreira clinicamente aceito desde o dia da visita de seleção até 24 semanas depois da administração do vetor. Pacientes do sexo feminino sexualmente ativas deverão estar dispostas a fazer uso de um método eficaz de controle da natalidade desde o dia da visita de seleção até 12 semanas depois da última dose de sirolimo, o que for depois. Pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) pode incluir indivíduos com
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 217/244
142/154 uma contraindicação para injeção
IC ou punção lombar.
As contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer uma das seguintes:
História de cirurgia anterior na cabeça/pescoço, que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
Apresentar qualquer contraindicação para TC (ou contraste) ou para anestesia geral.
• Apresentar qualquer contraindicação para IRM (ou para gadolínio).
• Taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) <30 mL/min/1,7 3 m2.
[00214] Pacientes que receberam tratamento IT em qualquer momento e que sofreram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados IC. Pacientes portadores de qualquer condição que o médico responsável pelo tratamento acredite que não seria adequada para terapia imunossupressora não devem receber o tratamento (p. ex., número absoluto de neutrófilos <1,3 χ 103/pL, número de plaquetas <100 χ 103/pL e hemoglobina <12 g/dL [sexo masculino] ou <10 g/dL [feminino]).
[00215] Um esquema alternativo de supressão imune deve ser utilizado em qualquer paciente, ou o paciente deve ser excluído, que tenha qualquer história de reação de hipersensibilidade ao tacrolimo, sirolimo ou à prednisolona. Pacientes com história de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 218/244
143/154 o indivíduo à infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção pelo vírus do herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha se resolvido completamente por pelo menos 12 semanas antes da seleção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parenterais que não tenha se resolvido pelo menos 8 semanas antes da segunda visita ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti-infecciosos orais (incluindo antivirals) nos dez dias antes da segunda visita ou com história de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon_TB Gold positivo durante a seleção ou (4) qualquer vacina viva nas 8 semanas anteriores à assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido ou (5) cirurgia de grande porte nas 8 semanas anteriores à assinatura do consentimento livre e esclarecido ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período do estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com número absoluto de neutrófilos <1,3 x 103/pL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[00216] Pacientes com história de linfoma ou de outro câncer, a não ser de carcinoma espinocelular ou basocelular da pele, não devem ser tratados a menos que em remissão completa por pelo menos 3 antes do tratamento.
[00217] Pacientes com hipertensão descontrolada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 219/244
144/154 [00218] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartate aminotransferase (AST) >3 χ o limite superior da normalidade (LSN) ou bilirrubina total >1.5 χ LSN não devem ser tratados, a menos que tenha uma história previamente conhecida de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[00219] Pacientes com história de doença infecciosa ou abuso de substâncias podem não ser candidatos para o tratamento. Por exemplo, uma história de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou da hepatite B ou hepatite C, ou testes de rastreamento positivo para antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou anticorpo contra o core do vírus da hepatite B, ou anticorpos contra o vírus da hepatite C ou HIV; história de abuso de álcool ou de substâncias no período de 1 ano antes do tratamento.
[00220] Tratamentos administrados—Pré-tratamento com Terapia imunossupressora. Antes da terapia gênica, o paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para evitar respostas imunes contra o transgene e/ou o capsídeo de AAV. Tal terapia imunossupressora, para pacientes com 6 anos de idade ou mais, inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg via intravenosa [IV], uma vez no Dia 1 pré-dose, e prednisona oral iniciando a 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com redução gradual e descontinuação na Semana 12), tacrolimo (1 mg, duas vezes ao dia [2x/dia] por via oral [VO], Dia 2 à Semana 24 com nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL e redução ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32, e sirolimo (uma dose de ataque de 1 mg/m2 a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e, a seguir, a partir
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145/154 do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/m2/dia dividido em duas doses ao dia com nível alvo no sangue de 4-8 ng/mL até a Semana 48. Tai terapia imunossupressora, para pacientes com menos de 3 anos de idade, inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg via intravenosa [IV], uma vez no Dia 1 pré-dose, e prednisona oral iniciando a 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com redução gradual e
descontinuação na Semana 12) , tacrolimo (0,05 mg/kg, duas
vezes ao dia [ 2x/dia] via oral [VO] , do Dia 2 à Semana 24 com
nível alvo no sangue de 2-4 n g/mL e redução ao longo de 8
semanas entre a Semana 24 e 32, e sirolimo ( uma dose de ataque
de 1 mg/m2 a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e, a seguir, a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/m2/dia dividido em duas doses ao dia com nivel alvo no sangue de 1-3 ng/mL até a Semana 48. Avaliações neurológicas e o monitoramento do nível de tacrolimo/sirolimo no sangue serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustados para manter os níveis no sangue na faixa planejada. Não está planejada terapia de imunossupressão depois da Semana 48. Na maioria dos indivíduos, os ajustes de dose podem ser com base na equação: dose nova = dose atual * (concentração alvo/concentração atual) . Os indivíduos devem continuar na nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de ajustes adicionais da dose com monitoramento da concentração.
[00221] Terapia gênica. Um AAV recombinante não replicante com capsídeo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais
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146/154 invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo CAG forte. The rAAV9.hIDUA vector é suspenso em solução de Elliotts B para injeção intratecal.
[00222] Para pacientes com 6 anos de idade ou mais, rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: a uma dose de 2 χ 109 GC/g de massa cerebral (2,6 χ 1012 GC) , ou uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral (1,3 χ 1013 GC) . A dose pode ser em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos .
[00223] Para pacientes com menos de 3 anos de idade, rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: a uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral (6,0 χ 1012 GC para pacientes com 4 meses ou mais, porém com menos de 9 meses de idade; 1,0 χ 1013 GC para pacientes com 9 meses ou mais, porém com menos de 18 meses de idade; 1,1 χ 1013 GC para pacientes com 18 meses ou mais, porém com menos de 3 anos de idade) ou uma dose de 5 χ 1010 GC/g de massa cerebral (3,0 χ 1013 GC para pacientes com 4 meses ou mais, porém com menos de 9 meses de idade; 5,0 χ 1013 GC para pacientes com 9 meses ou mais, porém com menos de 18 meses de idade; 5,5 χ 1013 GC para pacientes com 18 meses ou mais, porém com menos de 3 anos de idade) . A dose pode ser em um volume de aproximadamente 5 mL ou menos.
[00224] Para administração de rAAV9.IDUA, o indivíduo é posto sob anestesia geral.
6.10
EXEMPLO 10:
Protocolo de tratamento clinico de MPS I
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147/154 [00225] O exemplo a seguir apresenta um protocolo que pode ser utilizado para tratar indivíduos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA, visando tratar MPS I.
[00226] População de pacientes. Os pacientes a serem tratados podem ser do sexo masculino ou feminino com menos de 3 anos de idade que tenham:
• diagnóstico de MPS I grave-Hurler confirmado pela presença de sinais clínicos e sintomas compatíveis com MPS I-H e/ou homozigozidade ou heterozigosidade composta para mutações exclusivamente associadas com o fenótipo grave.
• Pontuação de quociente de inteligência (QI) h55 [00227] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílios, para completar os testes requeridos pelo protocolo e estar dispostos a usar o auxílio, se aplicável, em dias de testes.
[00228] Pacientes que podem ser excluídos do tratamento
intracisternal (IC) pode incluir indivíduos com uma
contraindicação para inj eção IC ou punção lombar. As
contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer
uma das seguintes:
• História de cirurgia anterior na cabeça/pescoço, que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
• Apresentar qualquer contraindicação para TC (ou contraste) ou para anestesia geral.
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148/154 • Apresentar qualquer contraindicação para IRM (ou para gadolínio).
• Taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) <30 mL/min/1,7 3 m2.
[00229] Pacientes que receberam tratamento IT em qualquer momento e que sofreram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados IC. Pacientes portadores de qualquer condição que o médico responsável pelo tratamento acredite que não seria adequada para terapia imunossupressora não devem receber o tratamento (p. ex., número absoluto de neutrófilos <1.3 χ 103/pL, número de plaquetas <100 χ 103/pL) e a hemoglobina será avaliada.
[00230] Um esquema alternativo de supressão imune deve ser utilizado em qualquer paciente, ou o paciente deve ser excluído, que tenha qualquer história de reação de hipersensibilidade ao tacrolimo, sirolimo, ou prednisolona. Pacientes com história de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o indivíduo à infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção pelo vírus do herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha se resolvido completamente por pelo menos 12 semanas antes da seleção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parenterais que não tenha se resolvido pelo menos 8 semanas
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149/154 antes da segunda visita ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti-infecciosos orais (incluindo antivirals) nos dez dias antes da segunda visita ou com história de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon_TB Gold positivo durante a seleção ou (4) qualquer vacina viva nas 8 semanas anteriores à assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, ou (5) cirurgia de grande porte nas 8 semanas anteriores à assinatura do consentimento livre e esclarecido ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período do estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com número absoluto de neutrófilos <1,3 x 103/pL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[00231] Pacientes com história de linfoma ou de outro câncer, a não ser de carcinoma espinocelular ou basocelular da pele, não devem ser tratados a menos que em remissão completa por pelo menos 3 antes do tratamento.
[00232] Pacientes com hipertensão descontrolada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[00233] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 χ o limite superior da normalidade (LSN) ou bilirrubina total >1,5 χ LSN não devem ser tratados, a menos que tenha uma história previamente conhecida de síndrome de Gilbert.
[00234] Pacientes com história de doença infecciosa ou abuso de substâncias podem não ser candidatos para o tratamento. Por exemplo, uma história de infecção pelo vírus da
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150/154 imunodeficiência humana (HIV) ou da hepatite B ou hepatite C, ou testes de rastreamento positivo para antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou anticorpo contra o core do vírus da hepatite B, anticorpos contra o vírus da hepatite C ou HIV; história de abuso de álcool ou de substâncias no período de 1 ano antes do tratamento.
[00235] Tratamentos administrados—Pré-tratamento com Terapia imunossupressora. Antes da terapia gênica, o paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para evitar respostas imunes contra o transgene e/ou o capsídeo de AAV. A administração de prednisona iniciará em 0,5 mg/kg/dia e será reduzida gradualmente até a visita da Semana 12. A dose de tacrolimo será ajustada para manter concentrações de vale no sangue total dentro de 2 a 4 ng/mL durante as primeiras 24 Semanas. Na semana 24, a dose será diminuída em aproximadamente 50%. Na Semana 28, a dose será diminuída ainda mais em aproximadamente 50%. Tacrolimo será descontinuado na Semana 32. A dose de sirolimo será ajustada para manter concentrações de vale no sangue total dentro de 1 a 3 ng/mL. Na maioria dos indivíduos, os ajustes de dose podem ser com base na equação: dose nova = dose atual χ (concentração alvo/concentração atual). Os indivíduos devem continuar na nova dose de manutenção por pelo menos 7 a 14 dias antes de ajustes adicionais da dose com monitoramento da concentração. Vide abaixo para mais detalhes.
[00236]
Cor ticosteroi des
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151/154 [0023'7] Na manhã da administração do vetor (Dia 1, pré-dose) , os pacientes receberão metilprednisolona, 10 mg/kg IV (no máximo, 500 mg) ao longo de pelo menos 30 minutos. A metilprednisolona deve ser administrada antes da punção lombar e da injeção IC do IP. A medicação prévia com acetaminofeno e um anti-histamínico é opcional o critério do investigador.
[00238] No Dia 2, será iniciada prednisona oral com o objetivo de descontinuar a prednisona na Semana 12. A dose de prednisona será como segue:
Dia 2 ao final da Semana 2: 0,5 mg/kg/dia
Semana 3 e 4: 0,35 mg/kg/dia
Semana 5-8: 0,2 mg/kg/dia
Semana 9-12: 0,1 mg/kg
Prednisona será descontinuada depois da Semana 12.
dose exata de prednisona pode ser ajustada para a dose mais alta seguinte clinicamente prática.
[00239]
Sirolimo [00240] dias antes da administração do vetor (Dia uma dose de ataque de sirolimo 1 mg/m2 a cada 4 horas doses serão administradas.
[00241] A partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/m2/dia dividido em duas doses ao dia com nível alvo no sangue de
1-3 ng/mL.
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152/154 [00242] Sirolimo será descontinuado depois da visita da
Semana 48.
[00243] Tacrolimo [00244] Tacrolimo será iniciado no Dia 2 (o dia após a administração do IP) a uma dose de 0,05 mg/kg, duas vezes ao dia, e ajustada para alcançar um nível no sangue de 2-4 ng/mL por 24 semana.
[00245] Com início na visita da Semana 24, tacrolimo ser reduzido ao longo de 8 semanas. Na Semana 24, a dose será diminuída em aproximadamente 50%. Na Semana 28, a dose será diminuída ainda mais em aproximadamente 50%. Tacrolimo será descontinuado na Semana 32.
[00246] Terapia gênica. Um AAV recombinante não replicante com capsídeo do sorotipo 9 contendo um cassete de expressão de hIDUA (rAAV9.hIDUA) é utilizado para o tratamento. O sorotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. A expressão desde o cassete é dirigida por um promotor constitutivo CAG forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução de Elliotts B para injeção intratecal.
[00247] O rAAV9.hIDUA é fornecido em dose única fixa por administração IC: a uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral (6,0 χ 1012 GC para pacientes com 4 meses ou mais, porém com menos de 9 meses de idade; 1 χ 1013 GC para pacientes com 9
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153/154 meses ou mais, porém com menos de 18 meses de idade; 1,1 χ 1013 GC para pacientes com 18 meses ou mais, porém com menos de 3 anos de idade) ou uma dose de 5 χ 1010 GC/g de massa cerebral (3 χ 1013 GC para pacientes com 4 meses ou mais, porém com menos de 9 meses de idade; 5 χ 1013 GC para pacientes com 9 meses ou mais, porém com menos de 18 meses de idade; 5,5 χ 1013 GC para pacientes com 18 meses ou mais, porém com menos de 3 anos de idade) . A dose pode ser em um volume de aproximadamente 5 a 20 mL.
[00248] Para administração de rAAV9.IDUA, o indivíduo é posto sob anestesia geral.
EQUIVALENTES [00249] Embora a invenção seja descrita detalhadamente com referência a modalidades específicas da mesma, ficará entendido que variações que sejam funcionalmente equivalentes são abrangidas pelo âmbito desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição precedente e dos desenhos anexos. Tais modificações se destinam a ser abrangidas pelo âmbito das reivindicações anexadas. Os técnicos no assunto reconhecerão, ou serão capazes de averiguar empregando não mais do que experimentação rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção ora descrita. Tais equivalentes destinam-se a ser abrangidos pelas reivindicações a seguir.
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154/154 [00250] Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patente mencionados são aqui incorporados por referência neste relatório descritivo na mesma medida que o seriam caso cada publicação, patente ou pedido de patente tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de α-L-iduronidase (IDUA) humana recombinante, produzida por células neuronals humanas, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano.
  2. 2. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, caracterizado pelo fato de que compreende liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante, produzida por células gliais humanas, no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
  4. 4. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com MPS I, caracterizado pelo fato de que compreende:
    liberar no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de a «2,6-sialilada IDUA humana; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
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    2/12
  5. 5. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
    liberar no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
  6. 6. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
    liberar no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
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    3/12 liberar no líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana que contém sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    8. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
    administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é «2,6-sialilada quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    9. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
    administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e
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    4/12 administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    10. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
    administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    11. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende:
    administrar ao cérebro do referido indivíduo humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é tirosina-sulfatada quando da expressão, a partir do referido vetor de expressão, em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do
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    5/12 vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    12 . Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    13. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do
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    6/12 vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    14 . Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno α-Gal; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    15. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do
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  7. 7/12 vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente.
    16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 15, caracterizado pelo fato de que a terapia de supressão imune compreende administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar posteriormente.
    17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias.
    18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a IDUA humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1.
    19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a terapia de supressão imune compreende administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido indivíduo antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana.
    20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias.
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  8. 8/12
    21. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a produção da referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotideo recombinante em cultura celular.
    22. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotideo recombinante em cultura celular.
    23. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno α-Gal é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotideo recombinante em cultura celular.
    24. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a produção da referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina é confirmada transduzindo uma linhagem de célula neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotideo recombinante em cultura celular.
    25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a produção é confirmada na presença e ausência de manose-6-fosfato.
    26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15 e 21 a 25 ou de qualquer uma das reivindicações 16 a 17
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  9. 9/12 quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão ou vetor de expressão de nucleotídeo recombinante codifica um peptídeo sinal.
    27 . Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano «2,6-sialilado; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente;
    em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA contendo o referido glicano «2,6sialilado na referida cultura celular.
    28 . Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente
    Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 73/244
  10. 10/12 eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente;
    em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável na referida cultura celular.
    29. Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente;
    em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta
    Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 74/244
  11. 11/12 na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável e/ou antígeno a-Gal na referida cultura celular.
    30 . Método para tratar um indivíduo humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), caracterizado pelo fato de que: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do
    referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a referida IDUA que contém uma sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de supressão imune ao referido indivíduo antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de supressão imune posteriormente;
    em que o referido vetor recombinante, quando utilizado para transduzir células neuronals humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é tirosina-sulfatada na referida cultura celular.
    31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a referida terapia de supressão imune compreende administrar uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido indivíduo
    Petição 870190071935, de 27/07/2019, pág. 75/244
  12. 12/12 antes ou concomitantemente com o tratamento com IDUA humana e continuar posteriormente.
    32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a terapia de supressão imune é retirada depois de 180 dias.
    33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-
    32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano tem menos de 3 anos de idade.
    34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15 e 21 a 33 ou de qualquer uma das reivindicações 16 a 20 quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou o vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado a uma dose de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral ou 5 χ 1010 GC/g de massa cerebral.
    35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15 e 21 a 33, ou de qualquer uma das reivindicações 16 a 20 quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou o vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado a uma dose que variam de 1 χ 1010 GC/g de massa cerebral a 5 χ 1010 GC/g de massa cerebral.
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