KR20190109506A

KR20190109506A - 완전히-인간 글리코실화된 인간 알파-l-이두로니다아제(idua)를 이용한 뮤코다당증 1형의 치료

Info

Publication number: KR20190109506A
Application number: KR1020197025133A
Authority: KR
Inventors: 스테판 유; 리키 로버트 레인하르트; 큐랜 매튜 심슨; 주춘 우
Original assignee: 리젠엑스바이오 인크.
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2019-09-25
Also published as: JP2020508289A; IL268076A; SG11201906452PA; BR112019015482A2; UY37587A; AU2018216807A1; IL268076B1; WO2018144441A1; US20190358303A1; EP3576768A4; CA3049915A1; US20240050537A1; MA47436A; EP3576768A1

Abstract

뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체의 중추신경계(CNS)의 뇌척수액에 완전히 인간 글리코실화된(HuGly) 알파-L-이두로니다아제(IDUA)를 전달하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다.

Description

완전히-인간 글리코실화된 인간 알파-L-이두로니다아제(IDUA)를 이용한 뮤코다당증 1형의 치료

관련 출원의 교차-참조

본 출원은 2017년 1월 31일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/452,769호, 2017년 4월 14일자로 출원된 제62/485,655호, 2017년 7월 6일자로 출원된 제62/529,366호, 2017년 10월 31일자로 출원된 제62/579,690호, 및 2018년 1월 11일자로 출원된 제62/616,234호의 우선권의 이익을 주장하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원은 2018년 1월 16일에 생성된 명칭이 "Sequence_Listing_12656-106-228.txt"이고 80,541 바이트의 크기를 갖는 텍스트(text) 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참고로 원용한다.

1. 서론

뮤코다당증 1형(mucopolysaccharidosis I, MPS I)으로 진단된 인간 대상체의 중추 신경계(central nervous system, CNS)의 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로의 완전히 인간-글리코실화된(HuGly) α-L-이두로니다아제(IDUA)의 전달을 위한 조성물 및 방법이 기재된다.

2. 발명의 배경

뮤코다당증 1형(MPS I)은 100,000명 출생 중 1명의 추정된 발생률을 갖는 드문 열성 유전병이다(Moore D et al., 2008, Orphanet Journal of Rare Diseases 3). MPS I은 아주 흔한 복합체 다당류 헤파란 설페이트 및 데르마탄 설페이트의 리포솜 이화작용을 위해 필요한 효소인 α-l-이두로니다아제(IDUA)의 결핍에 의해 유발된다. 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)으로 지칭되는 이들 다당류는 MPS I 환자의 조직에서 축적되어, 특유의 저장 병변 및 다양한 질환 후유증을 유발한다. 환자는 저신장, 뼈 및 관절 기형, 거친 얼굴 특징, 간비종대, 분문판 질환, 폐쇄 수면 무호흡, 재발성 상기도 감염, 청각 장애, 손목 터널 증후군, 및 각막 혼탁으로 인한 시각 장애를 나타낼 수 있다(Beck M, et al., 2014, The natural history of MPS I: global perspectives from the MPS I Registry. Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10):759-765). 또한, 많은 환자는 중추 신경계에서 GAG 저장과 관련된 증상이 발생하며, 이는 수두증, 척수 압박 및, 일부 환자에서, 인지 장애를 포함할 수 있다.

MPS I 환자는 광범위한 질환 중증도 및 CNS 병발의 정도에 걸쳐 있다. 중증도에서의 이 변이성은 잔여 IDUA 발현과 관련되어 있으며; 활성 효소 발현을 유발하지 않는 2개의 돌연변이 - 넌센스 돌연변이, 결실, 및 일부 미스센스 돌연변이를 포함함 - 를 갖는 환자는 통상적으로 2세 전에 증상을 나타내고, 일반적으로 정상 발달의 초기 기간 후에 중증 인지 감퇴를 나타낸다(Terlato NJ & Cox GF, 2003, Genetics in Medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 5(4):286-294). MPS I의 이 중증 형태는 또한 후를러(Hurler, H) 증후군으로서 지칭된다. 소량의 활성 IDUA의 생성을 유발하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 환자는 후를러-샤이에(Hurler-Scheie, HS) 증후군 또는 샤이에 증후군으로서 지칭되는 약화된 표현형을 나타낸다. 이들 환자는 소아기 초기에 증상을 나타낼 수 있거나 일생의 최초 10년 후까지 확인되지 않을 수 있다. 개시가 일반적으로 늦고 중증도가 감소될 수 있으나, MPS I의 약화된 형태를 갖는 환자는 후를러 증후군과 동일한 신체 특징 중 임의의 것을 겪을 수 있다(Vijay S & Wraith JE, 2005, Acta Paediatrica 94(7):872-877). 약화된 MPS I를 갖는 환자는 또한 척수 압박 및 수두증을 포함하여, 높은 비율의 신경학적 합병증을 겪는다. 인지 장애는 약화된 MPS I를 갖는 것으로 분류된 환자 중 대략 30%에서 보고된다(Beck M, et al., 2014, Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10):759-765).

효소 보충 요법(Enzyme replacement therapy, ERT)[Aldurazyme®(라로니다아제)]은 MPS I의 전신 증상에 대한 케어(care)의 표준으로서 수용되어 왔으나, CNS 징후를 치료하지는 않는다(de Ru MH, et al., 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Wraith JE, et al., 2007, Pediatrics 120(1): E37-E46). 조혈 줄기 세포 이식(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)은 MPS I의 신경인지 증후군에 영향을 주지만, 절차의 중요한 제한이 있다. MPS I을 위한 HSCT는 상당한 이환율 및 최대 20% 사망률과 연관되며, IDUA 발현이 안정화되는 한편 환자는 HSCT 후 최대 1년까지 신경인지 감퇴에 여전히 직면하므로 치료는 불완전하다(de Ru MH, et al., 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Fleming DR, et al., 1998, Pediatric transplantation 2(4):299-304; Boelens JJ, et al., 2007, Bone Marrow Transplantation 40(3):225-233; Souillet G, et al., 2003, Bone Marrow Transplantation 31(12):1105-1117; Whitley CB, et al., 1993, American Journal of Medical Genetics 46(2):209-218). 성공적으로 이식된 환자들 사이에서, 지능은 통상적으로 정상보다 상당히 낮다.

3. 발명의 요약

본 발명은, 비제한적으로, 후를러, 후를러-샤이에, 또는 샤이에 증후군으로 진단된 환자를 포함하여, 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체의 중추 신경계의 뇌척수액(CSF)으로의 완전히 인간-글리코실화된(HuGly) α-L-이두로니다아제(HuGlyIDUA)의 전달을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 치료는 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 인간 IDUA(hIDUA), 또는 hIDUA의 유도체를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체를 MPS I으로 진단된 환자(인간 대상체)의 CSF에 투여하여, 완전히 인간-글리코실화된 전이유전자(transgene) 생성물을 CNS에 계속적으로 공급하는 형질도입된 세포의 영구 데포(depot)가 생성됨으로써 달성된다. 데포로부터 CSF 내로 분비된 HuGlyIDUA는 CNS 내의 세포에 의해 흡수되어, 수용체 세포 내의 효소 결함의 "교차-교정"을 유발할 것이다. 대안적 실시양태에서, HuGlyIDUA는 세포 배양에서 생성되고 효소 보충 요법("ERT")으로서, 예를 들어, 효소를 주입함으로써 투여될 수 있다. 그러나, 유전자 요법 접근법은 ERT에 비해 몇몇 이점을 제공한다 - 효소의 전신 전달은 CNS 치료를 유발하지 않을 것이며, 이는 효소가 혈액 뇌 장벽을 넘지 못할 수 있고; 본 발명의 유전자 요법 접근법과 달리, CNS로의 효소의 직접 전달이 힘들뿐 아니라, 감염의 위험을 제기하는 반복 주입을 필요로 할 것이기 때문이다.

전이유전자에 의해 코딩된 HuGlyIDUA는, 비제한적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열(도 1에 나타낸 바와 같음)을 갖는 인간 IDUA(hIDUA), 및 예를 들어, 비제한적으로, 도 2에 나타낸 IDUA의 올소로그(ortholog)에서의 상응하는 비-보존 잔기로부터 선택된 아미노산 서열 치환을 포함하는 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가를 갖는 hIDUA의 유도체를 포함할 수 있되, 단 이러한 돌연변이는 도 3a 및 도 3b에 도시된(Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, 57 MPS I 돌연변이를 열거한 표 1로부터의 것, 이는 본원에 그 전체가 참고로 원용됨); 또는 Venturi et al., 2002, Human Mutation #522 Online ("Venturi 2002"), 또는 Bertola et al., 2011 Human Mutation 32:E2189-E2210 ("Bertola 2011")에 의해 보고된 중증, 중증-중간, 중간, 또는 약화된 MPS I 표현형에서 확인되었던 임의의 것을 포함하지 않으며, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 원용된다.

예를 들어, hIDUA의 특정 위치에서의 아미노산 치환은 도 2(그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Maita et al., 2013, PNAS 110:14628, Fig. S8에 보고된 바와 같은 올소로그의 정렬을 나타냄)에 도시된 IDUA 올소로그에서의 위치에서 발견되는 상응하는 비-보존 아미노산 잔기 중으로부터 선택될 수 있으며, 단 이러한 치환은 상기 도 3에 나타내거나 상기 Venturi 2002 또는 Bertola 2011에서 보고된 유해 돌연변이 중 임의의 것을 포함하지 않는다. 생성된 전이유전자 생성물은 세포 배양 또는 시험 동물에서 종래의 시험관내(in vitro) 어세이를 사용하여 시험되어, 돌연변이가 IDUA 기능을 방해하지 않는다는 것을 보장할 수 있다. 선택된 바람직한 아미노산 치환, 결실 또는 첨가는 MPS I에 대한 세포 배양 또는 동물 모델에서 종래의 시험관내 어세이에 의해 시험된 바와 같이, IDUA의 효소 활성, 안정성 또는 반감기를 유지하거나 증가시키는 것이어야 한다. 예를 들어, 전이유전자 생성물의 효소 활성은 기재로서 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로니드를 이용한 종래의 효소 어세이를 사용하여 평가될 수 있다(예를 들어, 사용될 수 있는 예시적 IDUA 효소 어세이에 대해 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al., 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; 및 Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 참고). MPS I 표현형을 교정하는 전이유전자 생성물의 능력은 세포 배양에서; 예를 들어, hIDUA 또는 유도체를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체로 배양에서 MPS I 세포를 형질도입하는 것에 의해; rHuGlyIDUA 또는 유도체를 배양 중 MPS I 세포에 첨가하는 것에 의해; 또는 MPS I 세포를 rHuGlyIDUA 또는 유도체를 발현 및 분비하도록 조작된 인간 숙주 세포와 공동-배양하는 것, 및 예를 들어, 배양 중 MPS I 세포에서 GAG 저장의 저하 및/또는 IDUA 효소 활성을 검출하는 것에 의해 MPS I 배양된 세포에서 결함의 교정을 결정하는 것에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; 및 Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379 참고).

MPS I에 대한 동물 모델은 마우스(예를 들어, Clarke et al., 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511 참고), 도메스틱 쇼트헤어(domestic shorthair) 고양이(예를 들어, Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97 참고), 및 몇몇 품종의 개(예를 들어, Menon et al., 1992, Genomics 14(3):763-768; Shull et al., 1982, Am J Pathol 109(2):244-248 참고)에 대해 기재되었다. 개에서의 MPS I 모델은 MPS I의 가장 중증 형태인 후를러 증후군과 유사하며, 이는 IDUA 돌연변이가 검출 가능한 단백질을 유발하지 않기 때문이다. IDUA 단백질 사이의 높은 유전자 상동성(도 2의 정렬 참고)은 hIDUA가 동물에서 기능적이고, hIDUA를 포함하는 치료가 이들 동물 모델에 대해 시험될 수 있다는 것을 의미한다.

바람직하게는, rHuGlyIDUA 전이유전자는 뉴런 및/또는 신경교세포에서 기능하는 발현 제어 요소, 예를 들어 CB7 프로모터(닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서)에 의해 제어되어야 하며, 벡터에 의해 구동되는 전이유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 닭 β-액틴 인트론 및 토끼 β-글로빈 poly A 신호)를 포함할 수 있다. hIDUA 전이유전자에 대한 cDNA 구조체는 형질도입된 CNS 세포에 의한 적절한 공동-번역 가공 및 번역후 가공(글리코실화 및 단백질 설페이트화)을 보장하는 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함해야 한다. CNS 세포에 의해 사용되는 이러한 신호 펩티드는 비제한적으로 다음을 포함할 수 있다:

● 올리고덴드로사이트-미엘린 당단백질(Oligodendrocyte-myelin glycoprotein)(hOMG) 신호 펩티드:

● E1A-자극 유전자의 세포성 억제자 2(Cellular repressor of E1A-stimulated genes 2)(hCREG2) 신호 펩티드:

● V-세트 및 막관통 도메인 함유 2B(V-set and transmembrane domain containing 2B)(hVSTM2B) 신호 펩티드:

● 프로토카드헤린 알파-1(Protocadherin alpha-1)(hPCADHA1) 신호 펩티드:

● FAM19A1(TAFA1) 신호 펩티드:

● 인터루킨-2 신호 펩티드:

신호 펩티드는 또한 본원에서 리더 서열 또는 리더 펩티드로서 지칭될 수 있다.

전이유전자의 전달을 위해 사용되는 재조합 벡터는, 제한적으로, 뉴런 및/또는 신경교세포를 포함하여, CNS 내의 세포에 대한 향성을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노-연합 바이러스 벡터(recombinant adeno-associated virus vector, "rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV9 또는 AAVrh10 캡시드를 보유한 것들이 바람직하다. 비제한적으로, 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제7,906,111호의 Wilson에 의해 기재된 것(AAV/hu.31 및 AAV/hu.32가 특히 바람직함)뿐 아니라; 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제8,628,966호, 미국 특허 제8,927,514호 및 Smith et al., 2014, Mol Ther 22: 1625-1634의 Chatterjee에 의해 기재된 AAV 변이체 캡시드를 포함하는 AAV 변이체 캡시드가 사용될 수 있다. 그러나, 비제한적으로, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드(naked) DNA" 구조체로서 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다(섹션 5.2 참고).

CSF로의 투여를 위해 적합한 약학 조성물은 생리학적 양립성 수성 완충제, 계면활성제 및 선택적 부형제를 포함하는 제형 완충제 내의 rHuGlyIDUA의 현탁액을 포함한다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 척수강 내(intrathecal) 투여를 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 수조 내(intracisternal) 투여(대수조 내로 주입)를 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 C1-2 천자를 통한 지주막하 공간 내로의 주입을 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 뇌실 내(intracerebroventricular) 투여를 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 요추 천자를 통한 투여를 위해 적합하다.

재조합 벡터의 치료적 유효 용량은 척수강 내 투여(즉, 재조합 벡터가 CSF를 통해 분산되고 CNS 내의 세포를 형질도입하도록 지주막하 공간 내로 주입)를 통해 CSF에 투여되어야 한다. 이는 다수의 방식으로 - 예를 들어, 두개 내(수조 또는 실(室)) 주입, 또는 요추 수조 내로의 주입에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 수조 내(IC) 주입(대수조 내로)은 CT-유도 후두하 천자에 의해 수행될 수 있거나; 지주막하 공간 내로의 주입은 환자에 대해 실현가능한 경우, C1-2 천자를 통해 수행될 수 있거나; 요추 천자(통상적으로 CSF의 샘플을 수집하기 위해 수행되는 진단 절차)가 사용되어 CSF에 접근할 수 있다. 대안적으로, 뇌실 내(ICV) 투여(혈액-뇌 장벽을 관통하지 않는 항감염성 또는 항암 약물의 도입을 위해 사용되는 더욱 침습성인 기술)가 사용되어, 재조합 벡터를 뇌의 뇌실 내로 직접 주입할 수 있다. 대안적으로, 비강 내 투여가 사용되어, 재조합 벡터를 CNS에 전달할 수 있다. rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 9.25μg/mL의 C_min 또는 9.25 내지 277μg/mL 범위의 농도로 유지하는 용량이 사용되어야 한다.

CSF 농도는 후두부 또는 요추 천자로부터 얻어진 CSF 액 내의 rHuGlyIDUA의 농도를 직접 측정함으로써 모니터링되거나, 환자의 혈청에서 검출된 rHuGlyIDUA의 농도로부터 외삽법에 의해 추정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 혈청에서 10ng/mL 내지 100ng/mL의 rHuGlyIDUA는 CSF에서 1 내지 30mg의 rHuGlyIDUA를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 혈청에서 10ng/mL 내지 100ng/mL의 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

배경으로서, 인간 IDUA는 653 아미노산 폴리펩티드로서 번역되고 도 1에 도시된 6개의 잠재 부위(N110, N190, N336, N372, N415 및 N451)에서 N-글리코실화된다. 신호 서열이 제거되고 폴리펩티드는 리소좀에서 성숙한 형태로 가공된다: 75 kDa 세포 내 전구체는 수시간 내에 72kDa으로 다듬어지고, 결국 4 내지 5 일에 걸쳐 66kDa 세포 내 형태로 가공된다. IDUA의 분비된 형태(사용된 어세이에 따라 76kDa 또는 82kDa)는 만노오스-6-포스페이트 수용체를 통해 세포에 의해 용이하게 흡수되며 소세포 내 형태로 유사하게 가공된다. (각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; Clements et al., 1989, Biochem J. 259: 199-208; Taylor et al., 1991, Biochem J. 274: 263-268; 및 Zhao et al., 1997 J Biol Chem 272:22758-22765 참고).

hIDUA의 전체 구조는 3개의 도메인으로 이루어진다: 잔기 42-396은 전통적인(β/α) 트리오세포스페이트 이소머라아제(triosephosphate isomerase, TIM) 배럴 도메인을 형성하고; 잔기 27-42 및 397-545는 짧은 나선고리나선구조(helix-loop-helix)(482-508)로 β-샌드위치 도메인을 형성하며; 잔기 546-642는 Ig-유사 도메인을 형성한다. 후자의 2개의 도메인은 C⁵⁴¹과 C⁵⁷⁷ 사이의 이황화물 다리를 통해 연결된다. β-샌드위치 및 Ig-유사 도메인은 TIM 배럴의 제1, 제7, 및 제8 α-나선에 부착된다. β-헤어핀(β12-β13)은 TIM 배럴의 제8 β-가닥과 제8 α-나선 사이에 삽입되고, 이는 기재 결합 및 효소 활성을 위해 필요한 N-글리코실화된 N³⁷²를 포함한다. (각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Maita et al., 2013, PNAS 110: 14628-14633, 및 Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112에 기재된 도 1 및 결정 구조를 참고).

본 발명은 부분적으로 다음 원리를 기본으로 한다:

(i) CNS 내의 뉴런 및 신경교세포는 CNS에서 견고한 가공인 분비된 단백질의 번역후 가공-글리코실화 및 티로신-O-설페이트화를 포함함 - 을 위한 세포 기구를 포함하는 분비성 세포다. 예를 들어, 인간 뇌 만노오스-6-포스페이트(M6P) 글리코프로테옴을 기재하고 뇌가 다른 조직에서 발견되는 것에 비해 더 많은 수의 개별 이소형 및 만노오스-6-포스포릴화된 단백질을 갖는 단백질을 더 많이 함유한다는 것을 언급하는 Sleat et al., 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 및 Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98; 및 뉴런 세포에 의해 분비된 티로신-설페이트화 당단백질의 생성을 보고하는 Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 인간 CNS 세포에 의해 이루어진 번역후 변형에 대한 참고로 원용된다.

(ii) hIDUA는 도 1에서 확인된 6 개의 아스파라긴("N") 글리코실화 부위를 갖는다(N¹¹⁰FT; N¹⁹⁰VS; N³³⁶TT; N³⁷²NT; N⁴¹⁵HT; N⁴⁵¹RS). N³⁷²의 N-글리코실화는 기재에 대한 결합 및 효소 활성을 위해 요구되고, 만노오스-6-포스포릴화는 분비된 효소의 세포 흡수 및 MPS I 세포의 교차-교정을 위해 요구된다. N-연결된 글리코실화 부위는 복합적이고, 고 만노오스 및 포스포릴화된 만노오스 탄수화물 모이어티(도 4)를 함유하지만, 분비된 형태만이 세포에 의해 흡수된다. (상기 Myerowitz & Neufeld, 1981). 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 2,6-시알산화되고 만노오스-6-포스포릴화된 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(사용된 어세이에 따름)에 의해 측정된 바와 같이 76 내지 82kDa의 IDUA 당단백질의 계속적인 분비를 유발해야 한다. 분비된 글리코실화/포스포릴화된 IDUA는 CNS에서 비형질도입된 뉴런 및 신경교세포에 의해 흡수되고 정확하게 가공되어야 한다.

(iii) 리소좀 단백질의 세포 및 세포 내 통행/흡수는 M6P를 통한다. 이두로네이트-2-설파타아제 효소에 대해 Daniele 2002 (Biochimica et Biophysica Acta 1588(3):203-9)에서 수행된 바와 같이, 분비된 단백질의 M6P 함량을 측정하는 것이 가능하다. 억제성 M6P(예를 들어, 5 mM)의 존재시, 비-뉴런 또는 비-신경교세포, 예컨대 Daniele 2002의 유전적으로 조작된 신장 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 Daniele 2002에 나타난 바와 같이 대조군 세포의 것에 근접한 수준까지 감소될 것으로 예측된다. 억제성 M6P의 존재시, 뇌 세포, 예컨대 뉴런 및 신경교세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 Daniele 2002에 나타난 바와 같이 높은 수준으로 유지될 것으로 예측되는 한편, 흡수는 대조군 세포에 비해 4 배 높았으며, 억제성 M6P의 존재 없이 유전적으로 조작된 신장 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 효소 활성(또는 흡수)의 수준과 비슷하였다. 이 어세이는 뇌 세포에 의해 생성된 효소 전구체에서 M6P의 함량을 예측하는 방식, 특히 상이한 유형의 세포에 의해 생성된 효소 전구체에서 M6P 함량을 비교하는 방식을 허용한다. 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 이러한 어세이에서 억제성 M6P의 존재시 높은 수준으로 뉴런 및 신경교세포 내로 흡수될 수 있는 hIDUA의 계속적인 분비를 유발해야 한다.

(iv) N-연결된 글리코실화 부위 이외에, hIDUA는 결합 및 활성을 위해 필요한 N³⁷²를 함유한 도메인에 인접한 티로신("Y") 설페이트화 부위(ADTPIY²⁹⁶NDEADPLVGWS)를 함유한다. (예를 들어, 단백질 티로신 설페이트화되는 티로신 잔기를 감싸는 아미노산의 분석에 대해 그 전체가 참고로 원용되는 Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. at p. 2154 참고. "규칙"은 다음과 같이 요약될 수 있음: Y의 +5 내지 -5 위치 내의 E 또는 D를 갖는 Y 잔기, Y의 위치 -1은 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만, 염기성 아미노산, 예를 들어 설페이트화를 폐지한 R, K, 또는 H가 아님). 임의의 이론에 구애됨 없이, hIDUA에서 이 부위의 설페이트화는 활성에 대해 중대할 수 있으며, 이는 티로신-설페이트화 영역(예를 들어, W306L) 내의 돌연변이가 감소된 효소 활성 및 질환과 연관된 것으로 알려져 있기 때문이다. (Maita et al., 2013, PNAS 110:14628 at pp. 14632-14633 참고).

(v) CNS의 인간 세포에 의한 hIDUA의 글리코실화는 전이유전자 생성물의 안정성, 반감기를 개선할 수 있고 원치 않는 응집을 감소시킬 수 있는 글리칸의 첨가를 유발할 것이다. 중요하게는, 본 발명의 HuGlyIDUA에 첨가되는 글리칸은 Neu5Ac("NANA")를 포함하지만 그의 수산화된 유도체인 NeuGc(N-글리콜릴뉴라민산, 즉 "NGNA" 또는 "Neu5Gc")는 그렇지 않은, 2,6-시알산을 포함하는 고도로 가공된 복합체-형 이중촉각(biantennary) N-글리칸이다. 이러한 글리칸은 이 번역후 변형을 제조하기 위해 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라아제를 갖지 않는 CHO 세포에서 제조되는 라로니다아제에 존재하지 않을 뿐 아니라, CHO 세포는 이등분 GlcNAc를 생성하지 않으나, 이들은 Neu5Ac(NANA) 대신에 인간에 대해 통상적이지 않은(또한 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로서 Neu5Gc(NGNA)를 첨가한다. 예를 들어, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 (Early Online pp. 1-13 at p. 5); 및 Hague et al., 1998 Electrophor 19:2612-2630 ("[t]he CHO cell line is considered 'phenotypically restricted,' in terms of glycosylation, due to the lack of an α2,6-sialyl-transferase")를 참고한다. 또한, CHO 세포는 대부분의 개체 내에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하는 α-Gal 항원인 면역원성 글리칸을 생성할 수도 있으며, 고농도에서 아나필락시스를 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156을 참고한다. 본 발명의 HuGlyIDUA의 인간 글리코실화 패턴은 전이유전자 생성물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

(vi) hIDUA의 티로신-설페이트화 - 인간 CNS 세포에서 견고한 번역후 가공 - 는 전이유전자 생성물의 가공 및 활성 개선을 유발해야 한다. 리소좀 단백질의 티로신-설페이트화의 중요성은 설명되지 않았으나; 다른 단백질에서 단백질-단백질 상호작용의 활성을 증가시키고(항체 및 수용체), 단백분해 가공을 촉진(펩티드 호르몬)하는 것으로 나타났다. (Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; 및 Bundegaard et al., 1995, The EMBO J 14: 3073-79 참고). 티로신-설페이트화(IDUA 가공에서 최종 단계로서 발생할 수 있음)를 담당하는 티로실단백질 설포트랜스퍼라아제(TPST1)는 뇌에서 분명히 높은 수준으로(mRNA를 기본으로 함) 발현된다(TPST1에 대한 유전자 발현 데이터는 예를 들어, EMBL-EBI Expression Atlas, accessible at http://www.ebi.ac.uk/gxa/home에서 찾아볼 수 있음). 이러한 번역후 변형은 기껏 라로니다아제 - CHO 세포 생성물 - 에서는 잘 나타나지 않는다. 인간 CNS 세포와 달리, CHO 세포는 분비성 세포가 아니며 번역후 티로신-설페이트화에 대해 제한된 능력을 갖는다. (예를 들어, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, esp. discussion at p. 1537 참고).

(vii) 전이유전자 생성물의 면역원성은 환자의 면역 상태, 주입된 단백질 약물의 구조 및 특징, 투여 경로, 및 치료의 기간을 포함한 다양한 인자에 의해 유도될 수 있다. 처치-관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA, 및 화학적 잔기, 및 생성물-관련 불순물, 예컨대 단백질 분해물 및 구조적 특징, 예컨대 글리코실화, 산화 및 응집(비가시성 입자)이 또한 면역 반응을 향상시키는 아쥬반트(adjuvant)로서 제공됨으로써 면역원성을 증가시킬 수 있다. 가공-관련 및 생성물-관련 불순물의 양은 제조 과정에 의해 영향을 받을 수 있다: 상업적으로 제조된 IDUA 제품에 영향을 줄 수 있는 세포 배양, 정제, 제형, 저장 및 조작. 유전자 요법에서, 단백질은 생체내(in vivo)에서 생성되어, 가공-관련 불순물은 존재하지 않으며 단백질 생성물은 재조합 기술에 의해 생성된 단백질과 연관된 생성물-관련 불순물/분해물, 예컨대 단백질 응집 및 단백질 산화를 함유하지 않을 수 있다. 응집은 예를 들어, 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호작용, 및 특정 완충제 시스템을 이용한 정제 과정으로 인해 단백질 생성 및 저장과 연관된다. 그러나, 응집을 촉진하는 이들 조건은 전이유전자가 생체내에서 발현되는 경우 나타나지 않는다. 산화, 예컨대 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘 산화는 또한 예를 들어, 스트레스 받은 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 및 완충제 및 부형제 내의 불순물에 의해 유발된 단백질 생성 및 저장과 연관된다. 생체내에서 발현된 단백질은 또한 스트레스 받은 조건에서 산화하지만, 인간은 많은 유기체와 마찬가지로 산화 스트레스를 감소시킬뿐 아니라, 산화를 수리하고/하거나 반전시킬 수도 있는 산화 방지 시스템을 갖추고 있다. 따라서, 생체내에서 생성된 단백질은 산화된 형태가 아닐 수 있다. 응집 및 산화 둘 다는 역가, PK(클리어란스(clearance))에 영향을 줄 수 있으며 면역원성 우려를 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 상업적으로 제조된 생성물과 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 hIDUA의 계속적인 분비를 유발해야 한다.

상술한 이유로, HuGlyIDUA의 생성은 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, HuGlyIDUA를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체를 MPS I 질환(비제한적으로, 후를러, 후를러-샤이에, 또는 샤이에)으로 진단된 환자(인간 대상체)의 CSF에 투여하여, 형질도입된 CNS 세포에 의해 분비된 완전히 인간-글리코실화, 만노오스-6-포스포릴화, 설페이트화된 전이유전자 생성물을 계속적으로 공급하는 CNS 내의 영구 데포를 생성함으로써 달성되는 MPS I의 치료를 위한 "바이오베터(biobetter)" 분자를 유발한다. 데포로부터 CSF 내로 분비된 HuGlyIDUA 전이유전자 생성물은 CNS에서 세포에 의해 흡수되어, MPS I 수용체 세포에서의 효소 결함의 "교차-교정"을 유발한다.

유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생성된 모든 hIDUA 분자가 완전히 글리코실화 및 설페이트화되는 것이 필수는 아니다. 오히려, 생성된 당단백질의 집단은 충분한 글리코실화(2,6-시알릴화 및 만노오스-6-포스포릴화를 포함함) 및 설페이트화를 가져 효능을 나타내야 한다. 본 발명의 유전자 요법 치료의 목표는 질환의 진행을 늦추거나 막는 것이다. 효능은 인지 기능(예를 들어, 신경인지 감퇴에서의 예방 또는 감소); CSF 및/또는 혈청에서 질환의 바이오마커(예컨대, GAG)에서의 감소; 및/또는 CSF 및/또는 혈청에서 IDUA 효소 활성에서의 증가를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 염증 및 다른 안전 사건의 징후가 또한 모니터링될 수 있다.

유전자 요법에 대한 대안적이거나, 추가적인 치료로서, rHuGlyIDUA 당단백질이 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생성될 수 있으며 당단백질은 MPS I으로 진단된 환자에게 ERT 동안 전신으로 및/또는 CSF 내로 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생성을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주는, 비제한적으로, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, 인간 배아 신장 293 세포(HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, 몇가지 예를 들면 PER.C6, 또는 RPE(예를 들어, rHuGlyIDUA 당단백질의 재조합 생성을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주의 검토에 대해 그 전체가 참고로 원용되는 Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives" 참고)를 포함한다. 완전히 글리코실화, 특히 시알릴화, 및 티로신-설페이트화를 보장하기 위해, 생성을 위해 사용되는 세포주는 티로신-O-설페이트화를 담당하는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제(또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 둘 다) 및/또는 TPST-1 및 TPST-2 효소를 공동-발현하도록 숙주 세포를 조작함으로써 향상될 수 있다.

rHuGlyIDUA의 전달은 면역 반응을 최소화해야 하는 한편, CNS-지시된 유전자 요법과 관련된 독성의 확실한 잠재적 공급원은 IDUA에 대해 유전적으로 결핍된 인간 대상체에서 발현된 hIDUA 단백질에 대해 면역력을 생성하여, 전이유전자를 전달하기 위해 사용되는 단백질 및/또는 벡터를 잠재적으로 용인하지 않는다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, -- 특히 0에 근접한 수준의 IDUA(예를 들어, 후를러)를 갖는 중증 질환이 있는 환자를 치료하는 경우, 면역 억제 요법으로 환자를 공동-치료하는 것이 권고된다. 예를 들어, 미코페놀산과 병용되거나 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론과 병용된 타크롤리무스 또는 라파마이신(시롤리무스)의 양생법, 또는 조직 이식 절차에서 사용되는 다른 면역 억제 양생법을 포함하는 면역 억제 요법이 사용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 요법의 과정 동안 투여될 수 있으며, 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법을 이용한 사전-치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단을 기반하여 유전자 요법 치료 후에 지속될 수 있으며, 그 후에 면역 내성이 유도되는 경우; 예를 들어 180일 후에 중단될 수 있다.

다른 이용 가능한 치료의 전달과 함께 CSF로의 HuGlyIDUA의 전달의 병용은 본 발명의 방법에 의해 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법과 병용될 수 있는 MPS I에 대해 이용 가능한 치료는, 비제한적으로, 전신으로 또는 CSF에 투여된 라로니다이제를 사용하는 효소 보충 요법; 및/또는 HSCT 요법을 포함한다.

예시적 실시양태

1. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제(IDUA)의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 것을 포함하는, 방법.

2. MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경교세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 것을 포함하는, 방법.

3. 단락 1 또는 2에 있어서, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 추가로 포함하는, 방법.

4. MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 α2,6-시알릴화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함하는, 방법.

5. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함하는, 방법.

6. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및

인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법.

7. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 티로신-설페이트화를 함유하는 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함하는, 방법.

8. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 α2,6-시알릴화되는 것을 포함하는, 방법.

9. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 것을 포함하는, 방법.

10. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 것을 포함하는, 방법.

11. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 티로신-설페이트화되는 것을 포함하는, 방법.

12. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하는, 방법.

13. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하는, 방법.

14. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하는, 방법.

15. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하는, 방법.

16. 단락 3 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, (b) 라파마이신 및 미코페놀산, 또는 (c) 타크롤리무스, 라파마이신 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론을 병용 투여하고, 그 후에 지속하는 것을 포함하는, 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.

17. 단락 16에 있어서, 면역 억제 요법이 180일 후에 중단되는, 방법.

18. 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 인간 IDUA가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

19. 단락 18에 있어서, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, (b) 라파마이신 및 미코페놀산, 또는 (c) 타크롤리무스, 라파마이신 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론을 병용 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.

20. 단락 19에 있어서, 면역 억제 요법이 180일 후에 중단되는, 방법.

21. 단락 12에 있어서, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.

22. 단락 13에 있어서, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.

23. 단락 14에 있어서, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.

24. 단락 15에 있어서, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.

25. 단락 21 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 생성이 만노오스-6-포스페이트의 존재 및 부재하에서 확인되는, 방법.

26. 단락 8 내지 15 및 21 내지 25 중 어느 하나, 또는 단락 8 내지 15 중 어느 하나를 직접적으로 또는 간접적으로 인용하는 경우 단락 16 또는 17에 있어서, 발현 벡터 또는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 신호 펩티드를 코딩하는, 방법.

27. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하되;

상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.

28. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하되; 상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.

29. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하되; 상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.

30. 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,

상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것을 포함하되;

상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 티로신-설페이트화된 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.

31. 단락 27 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, (b) 라파마이신 및 미코페놀산, 또는 (c) 타크롤리무스, 라파마이신 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론을 병용 투여하고, 그 후에 지속하는 것을 포함하는, 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.

32. 단락 31에 있어서, 면역 억제 요법이 180일 후에 중단되는, 방법.

33. 단락 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 3세 미만인, 방법.

34. 단락 8 내지 15 및 21 내지 33 중 어느 하나, 또는 단락 8 내지 15 중 어느 하나를 직접적으로 또는 간접적으로 인용하는 경우 단락 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 3세 미만이고, 발현 벡터 또는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 1×10¹⁰GC/g 뇌 질량 또는 5×10¹⁰GC/g 뇌 질량의 용량으로(예를 들어, 단일 플랫 용량으로서) 투여되는(예를 들어, IC 투여(예컨대, 후두부 주입에 의함)), 방법.

35. 단락 8 내지 15 및 21 내지 33 중 어느 하나, 또는 단락 8 내지 15 중 어느 하나를 직접적으로 또는 간접적으로 인용하는 경우 단락 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 3세 미만이고, 발현 벡터 또는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 1×10¹⁰GC/g 뇌 질량 내지 5×10¹⁰GC/g 뇌 질량 범위의 용량으로(예를 들어, 단일 플랫 용량으로서) 투여되는(예를 들어, IC 투여(예컨대, 후두부 주입에 의함)), 방법.

4. 도면의 간단한 설명
도 1. 인간 IDUA의 아미노산 서열. 6 개의 N-연결된 글리코실화 부위(N)는 볼드체 및 밑줄로 표시되고; 하나의 티로신-O-설페이트화 부위(Y)는 볼드체 및 밑줄로 표시되며, 완전 설페이트화 부위 서열(ADTPIYNDEADPLVGWS)은 음영처리되어 있고; 이황화물 결합(2 개의 시스테인 잔기; C)은 볼드체 및 밑줄로 표시된다. CHO 세포에서 제조된 분비된 재조합 생성물은 A²⁶인 반면에, 인간 간의 천연 세포내 효소의 N-말단은 E²⁷이다(Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232, at p. 230 참고).
도 2. 알려진 올소로그를 갖는 hIDUA의 다중 서열 정렬. 서열은 Clustal X ver.2(Larkin MA, et al., 2007, Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23(21):2947-2948)를 사용하여 정렬하였다. 종의 명칭 및 단백질 ID는 다음과 같다: 인간(호모 사피엔스(Homo sapiens); NP_000194.2), 개(카니스 파밀리아리스(Canis familiaris); M81893.1), 소(보스 타우루스(Bos Taurus); XP_002688492.1), 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus); NP_032351.2), 랫트(래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); NP_001165555.1), 오리너구리(오르니토린쿠스 아나티누스(Ornithorhynchus anatinus); XP_001514102.2), 닭(갈루스 갈루스(Gallus gallus); NP_001026604.1), 손톱개구리속(제노푸스 래비스(Xenopus laevis); NP_001087031.1), 제브라피쉬(다니오 레리오(Danio rerio); XP_001923689.3), 성게(스트롱길로센트로투스 푸르푸라투스(Strongylocentrotus purpuratus); XP_796813.3) 유령멍게(시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis); XP_002120937.1), 및 과실 파리(드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster); NP_609489.1). 인간 단백질에서의 N-글리코실화 부위(N110, N190, N336, N372, T374, N415, N451); 기재 결합(R89, H91, N181, E182, H262, K264, E299, D349, 및 R363) 및 N372에서 N-글리칸과의 상호작용(P54, H58, W306, S307, Y355, R368, 및 Q370)에 관련된 잔기는 음영처리에 의해 나타내었다. (Maita et al., 2013, PNAS 110: 14628-14633; Supplementary Material, 도 S8로부터 조정됨).
도 3a 및 도 3b. MPS I 돌연변이, IDUA 에서의 구조적 변화 및 표현형. (Saito et al., Mol Genet Metab 111:107-112, 표 1로부터의 것).
도 4. CHO 세포에 의해 분비된 재조합 인간 O-L-이두로니다아제의 6 개의 글리코실화 부위의 올리고당. C, 복합체; M, 고 만노오스; P, 포스포릴화된 고 만노오스. 대문자는 확인된, 주요 올리고당을 나타내는 반면, 소문자는 부수적이거나 불완전한 특징의 성분을 나타낸다. (Zhao et al., 1997, J Biol Chem 272: 22758-22765로부터의 것).
도 5a 내지 도 5e. AAV 캡시드 1-9의 Clustal 다중 서열 정렬(서열번호 16-26). 아미노산 치환(하부 열에서 볼드체로 나타냄)은 다른 정렬된 AAV 캡시드의 상응하는 위치로부터 아미노산 잔기를 "모집하는 것"에 의해 AAV9 및 AAV8 캡시드에 대해 이루어질 수 있다. "HVR"로 표기된 서열 영역 = 초가변 영역.

5. 발명의 상세한 설명

본 발명은, 비제한적으로, 후를러, 후를러-샤이에, 또는 샤이에 증후군으로 진단된 환자를 포함하여, 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체의 중추 신경계의 뇌척수액(CSF)으로의 완전히 인간-글리코실화된(HuGly) α-L-이두로니다아제(HuGlyIDUA)의 전달을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 치료는 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 인간 IDUA(hIDUA), 또는 hIDUA의 유도체를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체를 MPS I으로 진단된 환자(인간 대상체)의 CSF에 투여하여, 완전히 인간-글리코실화된 전이유전자 생성물을 CNS에 계속적으로 공급하는 형질도입된 세포의 영구 데포가 생성됨으로써 달성된다. 데포로부터 CSF 내로 분비된 HuGlyIDUA는 CNS 내의 세포에 의해 흡수되어, 수용체 세포 내의 효소 결함의 "교차-교정"을 유발할 것이다. 대안적 실시양태에서, HuGlyIDUA는 세포 배양에서 생성되고 효소 보충 요법("ERT")으로서, 예를 들어, 효소를 주입함으로써 투여될 수 있다. 그러나, 유전자 요법 접근법은 ERT에 비해 몇몇 이점을 제공한다 - 효소의 전신 전달은 CNS 치료를 유발하지 않을 것이며, 이는 효소가 혈액 뇌 장벽을 넘지 못할 수 있고; 본 발명의 유전자 요법 접근법과 달리, CNS로의 효소의 직접 전달이 힘들뿐 아니라, 감염의 위험을 제기하는 반복 주입을 필요로 할 것이기 때문이다.

예를 들어, hIDUA의 특정 위치에서의 아미노산 치환은 도 2(그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Maita et al., 2013, PNAS 110:14628, Fig. S8에 보고된 바와 같은 올소로그의 정렬을 나타냄)에 도시된 IDUA 올소로그에서의 위치에서 발견되는 상응하는 비-보존 아미노산 잔기 중으로부터 선택될 수 있으며, 단 이러한 치환은 상기 도 3a 및 도 3b에 나타내거나 상기 Venturi 2002 또는 Bertola 2011에서 보고된 유해 돌연변이 중 임의의 것을 포함하지 않는다. 생성된 전이유전자 생성물은 세포 배양 또는 시험 동물에서 종래의 시험관내 어세이를 사용하여 시험되어, 돌연변이가 IDUA 기능을 방해하지 않는다는 것을 보장할 수 있다. 선택된 바람직한 아미노산 치환, 결실 또는 첨가는 MPS I에 대한 세포 배양 또는 동물 모델에서 종래의 시험관내 어세이에 의해 시험된 바와 같이, IDUA의 효소 활성, 안정성 또는 반감기를 유지하거나 증가시키는 것이어야 한다. 예를 들어, 전이유전자 생성물의 효소 활성은 기재로서 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로니드를 이용한 종래의 효소 어세이를 사용하여 평가될 수 있다(예를 들어, 사용될 수 있는 예시적 IDUA 효소 어세이에 대해 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al., 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; 및 Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 참고). MPS I 표현형을 교정하는 전이유전자 생성물의 능력은 세포 배양에서; 예를 들어, hIDUA 또는 유도체를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체로 배양에서 MPS I 세포를 형질도입하는 것에 의해; rHuGlyIDUA 또는 유도체를 배양 중 MPS I 세포에 첨가하는 것에 의해; 또는 MPS I 세포를 rHuGlyIDUA 또는 유도체를 발현 및 분비하도록 조작된 인간 숙주 세포와 공동-배양하는 것, 및 예를 들어, 배양 중 MPS I 세포에서 GAG 저장의 저하 및/또는 IDUA 효소 활성을 검출하는 것에 의해 MPS I 배양된 세포에서 결함의 교정을 결정하는 것에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; 및 Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379 참고).

MPS I에 대한 동물 모델은 마우스(예를 들어, Clarke et al., 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511 참고), 도메스틱 쇼트헤어 고양이(예를 들어, Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97 참고), 및 몇몇 품종의 개(예를 들어, Menon et al., 1992, Genomics 14(3):763-768; Shull et al., 1982, Am J Pathol 109(2):244-248 참고)에 대해 기재되었다. 개에서의 MPS I 모델은 MPS I의 가장 중증 형태인 후를러 증후군과 유사하며, 이는 IDUA 돌연변이가 검출 가능한 단백질을 유발하지 않기 때문이다. IDUA 단백질 사이의 높은 유전자 상동성(도 2의 정렬 참고)은 hIDUA가 동물에서 기능적이고, hIDUA를 포함하는 치료가 이들 동물 모델에 대해 시험될 수 있다는 것을 의미한다.

바람직하게는, rHuGlyIDUA 전이유전자는 뉴런 및/또는 신경교세포에서 기능하는 발현 제어 요소, 예를 들어 CB7 프로모터(닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서)에 의해 제어되어야 하며, 벡터에 의해 구동되는 전이유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 닭 β-액틴 인트론 및 토끼 β-글로빈 poly A 신호)를 포함할 수 있다. huIDUA 전이유전자에 대한 cDNA 구조체는 형질도입된 CNS 세포에 의한 적절한 공동-번역 가공 및 번역후 가공(글리코실화 및 단백질 설페이트화)을 보장하는 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함해야 한다. CNS 세포에 의해 사용되는 이러한 신호 펩티드는 비제한적으로 다음을 포함할 수 있다:

● 올리고덴드로사이트-미엘린 당단백질(hOMG) 신호 펩티드:

● E1A-자극 유전자의 세포성 억제자 2(hCREG2) 신호 펩티드:

● V-세트 및 막관통 도메인 함유 2B(hVSTM2B) 신호 펩티드:

● 프로토카드헤린 알파-1(hPCADHA1) 신호 펩티드:

● FAM19A1(TAFA1) 신호 펩티드:

● 인터루킨-2 신호 펩티드:

전이유전자의 전달을 위해 사용되는 재조합 벡터는, 비제한적으로, 뉴런 및/또는 신경교세포를 포함하여, CNS 내의 세포에 대한 향성을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노-연합 바이러스 벡터("rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV9 또는 AAVrh10 캡시드를 보유한 것들이 바람직하다. 비제한적으로, 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제7,906,111호의 Wilson에 의해 기재된 것(AAV/hu.31 및 AAV/hu.32가 특히 바람직함)뿐 아니라; 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제8,628,966호, 미국 특허 제8,927,514호 및 Smith et al., 2014, Mol Ther 22: 1625-1634의 Chatterjee에 의해 기재된 AAV 변이체 캡시드를 포함하는 AAV 변이체 캡시드가 사용될 수 있다. 그러나, 비제한적으로, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드 DNA" 구조체로서 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다(섹션 5.2 참고).

CSF로의 투여를 위해 적합한 약학 조성물은 생리학적 양립성 수성 완충제, 계면활성제 및 선택적 부형제를 포함하는 제형 완충제 내의 rHuGlyIDUA의 현탁액을 포함한다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 수조 내 투여(대수조 내로 주입)를 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 C1-2 천자를 통한 지주막하 공간 내로의 주입을 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 척수강 내 투여를 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 뇌실 내 투여를 위해 적합하다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 요추 천자를 통한 투여를 위해 적합하다.

재조합 벡터의 치료적 유효 용량은 척수강 내 투여(즉, 재조합 벡터가 CSF를 통해 분산되고 CNS 내의 세포를 형질도입하도록 지주막하 공간 내로 주입)를 통해 CSF에 투여되어야 한다. 이는 다수의 방식으로 - 예를 들어, 두개 내(수조 또는 실) 주입, 또는 요추 수조 내로의 주입에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 수조 내(IC) 주입(대수조 내로)은 CT-유도 후두하 천자에 의해 수행될 수 있거나; 지주막하 공간 내로의 주입은 환자에 대해 실현가능한 경우, C1-2 천자를 통해 수행될 수 있거나; 요추 천자(통상적으로 CSF의 샘플을 수집하기 위해 수행되는 진단 절차)가 사용되어 CSF에 접근할 수 있다. 대안적으로, 뇌실 내(ICV) 투여(혈액-뇌 장벽을 관통하지 않는 항감염성 또는 항암 약물의 도입을 위해 사용되는 더욱 침습성인 기술)가 사용되어, 재조합 벡터를 뇌의 뇌실 내로 직접 주입할 수 있다. 대안적으로, 비강 내 투여가 사용되어, 재조합 벡터를 CNS에 투여할 수 있다. rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 9.25 ㎍/mL의 C_min 또는 9.25 내지 277 ㎍/mL 범위의 농도로 유지하는 용량이 사용되어야 한다.

CSF 농도는 후두부 또는 요추 천자로부터 얻어진 CSF 액 내의 rHuGlyIDUA의 농도를 직접 측정함으로써 모니터링되거나, 환자의 혈청에서 검출된 rHuGlyIDUA의 농도로부터 외삽법에 의해 추정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 혈청에서 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 rHuGlyIDUA는 CSF에서 1 내지 30 mg의 rHuGlyIDUA를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 혈청에서 10ng/mL 내지 100ng/mL의 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

배경으로서, 인간 IDUA는 653 아미노산 폴리펩티드로서 번역되고 도 1에 도시된 6 개의 잠재 부위(N110, N190, N336, N372, N415 및 N451)에서 N-글리코실화된다. 신호 서열이 제거되고 폴리펩티드는 리소좀에서 성숙한 형태로 가공된다: 75kDa 세포 내 전구체는 수시간 내에 72kDa으로 다듬어지고, 결국 4 내지 5일에 걸쳐 66kDa 세포 내 형태로 가공된다. IDUA의 분비된 형태(사용된 어세이에 따라 76kDa 또는 82kDa)는 만노오스-6-포스페이트 수용체를 통해 세포에 의해 용이하게 흡수되며 소세포 내 형태로 유사하게 가공된다. (각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; Clements et al., 1989, Biochem J. 259: 199-208; Taylor et al., 1991, Biochem J. 274: 263-268; 및 Zhao et al., 1997 J Biol Chem 272:22758-22765 참고).

hIDUA의 전체 구조는 3 개의 도메인으로 이루어진다: 잔기 42-396은 전통적인(β/α) 트리오세포스페이트 이소머라아제(TIM) 배럴 도메인을 형성하고; 잔기 27-42 및 397-545는 짧은 나선고리나선구조(482-508)로 β-샌드위치 도메인을 형성하며; 잔기 546-642는 Ig-유사 도메인을 형성한다. 후자의 2개의 도메인은 C⁵⁴¹과 C⁵⁷⁷ 사이의 이황화물 다리를 통해 연결된다. β-샌드위치 및 Ig-유사 도메인은 TIM 배럴의 제1, 제7, 및 제8 α-나선에 부착된다. β-헤어핀(β12-β13)은 TIM 배럴의 제8 β-가닥과 제8 α-나선 사이에 삽입되고, 이는 실질적 결합 및 효소 활성을 위해 필요한 N-글리코실화된 N³⁷²를 포함한다. (각각 본원에 참고로 원용되는 Maita et al., 2013, PNAS 110: 14628-14633, 및 Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112에 기재된 도 1 및 결정 구조를 참고).

본 발명은 부분적으로 다음 원리를 기본으로 한다:

(i) CNS 내의 뉴런 및 신경교세포는 CNS에서 견고한 가공인 분비된 단백질의 번역후 가공 - 글리코실화 및 티로신-O-설페이트화를 포함함 - 을 위한 세포 기구를 포함하는 분비성 세포다. 예를 들어, 인간 뇌 만노오스-6-포스페이트(M6P) 글리코프로테옴을 기재하고 뇌가 다른 조직에서 발견되는 것에 비해 더 많은 수의 개별 이소형 및 만노오스-6-포스포릴화된 단백질을 갖는 단백질을 더 많이 함유한다는 것을 언급하는 Sleat et al., 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 및 Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98; 및 뉴런 세포에 의해 분비된 티로신-설페이트화 당단백질의 생성을 보고하는 Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 인간 CNS 세포에 의해 이루어진 번역후 변형에 대한 참고로 원용된다.

(ii) hIDUA는 도 1에서 확인된 6개의 아스파라긴("N") 글리코실화 부위를 갖는다(N¹¹⁰FT; N¹⁹⁰VS; N³³⁶TT; N³⁷²NT; N⁴¹⁵HT; N⁴⁵¹RS). N³⁷²의 N-글리코실화는 기재에 대한 결합 및 효소 활성을 위해 요구되고, 만노오스-6-포스포릴화는 분비된 효소의 세포 흡수 및 MPS I 세포의 교차-교정을 위해 요구된다. N-연결된 글리코실화 부위는 복합적이고, 고 만노오스 및 포스포릴화된 만노오스 탄수화물 모이어티(도 4)를 함유하지만, 분비된 형태만이 세포에 의해 흡수된다. (상기 Myerowitz & Neufeld, 1981). 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 2,6-시알산화되고 만노오스-6-포스포릴화된 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(사용된 어세이에 따름)에 의해 측정된 바와 같이 76 - 82 kDa의 IDUA 당단백질의 계속적인 분비를 유발해야 한다. 분비된 글리코실화/포스포릴화된 IDUA는 CNS에서 비형질도입된 뉴런 및 신경교세포에 의해 흡수되고 정확하게 가공되어야 한다.

(iii) 리소좀 단백질의 세포 및 세포 내 통행/흡수는 M6P를 통한다. 이두로네이트-2-설파타아제 효소에 대해 Daniele 2002에서 수행된 바와 같이, 분비된 단백질의 M6P 함량을 측정하는 것이 가능하다. 억제성 M6P(예를 들어, 5 mM)의 존재시, 비-뉴런 또는 비-신경교세포, 예컨대 Daniele 2002의 유전적으로 조작된 신장 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 Daniele 2002에 나타난 바와 같이 대조군 세포의 것에 근접한 수준까지 감소될 것으로 예측된다. 억제성 M6P의 존재시, 뇌 세포, 예컨대 뉴런 및 신경교세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 Daniele 2002에 나타난 바와 같이 높은 수준으로 유지될 것으로 예측되는 한편, 흡수는 대조군 세포에 비해 4 배 높았으며, 억제성 M6P의 존재 없이 유전적으로 조작된 신장 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 효소 활성(또는 흡수)의 수준과 비슷하였다. 이 어세이는 뇌 세포에 의해 생성된 효소 전구체에서 M6P의 함량을 예측하는 방식, 특히 상이한 유형의 세포에 의해 생성된 효소 전구체에서 M6P 함량을 비교하는 방식을 허용한다. 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 이러한 어세이에서 억제성 M6P의 존재시 높은 수준으로 뉴런 및 신경교세포 내로 흡수될 수 있는 hIDUA의 계속적인 분비를 유발해야 한다.

(v) CNS의 인간 세포에 의한 hIDUA의 글리코실화는 전이유전자 생성물의 안정성, 반감기를 개선할 수 있고 원치 않는 응집을 감소시킬 수 있는 글리칸의 첨가를 유발할 것이다. 중요하게는, 본 발명의 HuGlyIDUA에 첨가되는 글리칸은 Neu5Ac("NANA")를 포함하지만 그의 수산화된 유도체인 NeuGc(N-글리콜릴뉴라민산, 즉 "NGNA" 또는 "Neu5Gc")는 그렇지 않은, 2,6-시알산을 포함하는 고도로 가공된 복합체-형 이중촉각 N-글리칸이다. 이러한 글리칸은 이 번역후 변형을 제조하기 위해 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라아제를 갖지 않는 CHO 세포에서 제조되는 라로니다아제에 존재하지 않을 뿐 아니라, CHO 세포는 이등분 GlcNAc를 생성하지 않으나, 이들은 Neu5Ac(NANA) 대신에 인간에 대해 통상적이지 않은(또한 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로서 Neu5Gc(NGNA)를 첨가한다. 예를 들어, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 (Early Online pp. 1-13 at p. 5); 및 Hague et al., 1998 Electrophor 19:2612-2630 ("[t]he CHO cell line is considered 'phenotypically restricted,' in terms of glycosylation, due to the lack of an α2,6-sialyl-transferase")를 참고한다. 또한, CHO 세포는 대부분의 개체 내에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하는 α-Gal 항원인 면역원성 글리칸을 생성할 수도 있으며, 고농도에서 아나필락시스를 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156을 참고한다. 본 발명의 HuGlyIDUA의 인간 글리코실화 패턴은 전이유전자 생성물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

(vii) 전이유전자 생성물의 면역원성은 환자의 면역 상태, 주입된 단백질 약물의 구조 및 특징, 투여 경로, 및 치료의 기간을 포함한 다양한 인자에 의해 유도될 수 있다. 처치-관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA, 및 화학적 잔기, 및 생성물-관련 불순물, 예컨대 단백질 분해물 및 구조적 특징, 예컨대 글리코실화, 산화 및 응집(비가시성 입자)이 또한 면역 반응을 향상시키는 아쥬반트로서 제공됨으로써 면역원성을 증가시킬 수 있다. 가공-관련 및 생성물-관련 불순물의 양은 제조 과정에 의해 영향을 받을 수 있다: 상업적으로 제조된 IDUA 제품에 영향을 줄 수 있는 세포 배양, 정제, 제형, 저장 및 조작. 유전자 요법에서, 단백질은 생체내에서 생성되어, 가공-관련 불순물은 존재하지 않으며 단백질 생성물은 재조합 기술에 의해 생성된 단백질과 연관된 생성물-관련 불순물/분해물, 예컨대 단백질 응집 및 단백질 산화를 함유하지 않을 수 있다. 응집은 예를 들어, 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호작용, 및 특정 완충제 시스템을 이용한 정제 과정으로 인해 단백질 생성 및 저장과 연관된다. 그러나, 응집을 촉진하는 이들 조건은 전이유전자가 생체내에서 발현되는 경우 나타나지 않는다. 산화, 예컨대 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘 산화는 또한 예를 들어, 스트레스 받은 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 및 완충제 및 부형제 내의 불순물에 의해 유발된 단백질 생성 및 저장과 연관된다. 생체내에서 발현된 단백질은 또한 스트레스 받은 조건에서 산화하지만, 인간은 많은 유기체와 마찬가지로 산화 스트레스를 감소시킬뿐 아니라, 산화를 수리하고/하거나 반전시킬 수도 있는 산화 방지 시스템을 갖추고 있다. 따라서, 생체내에서 생성된 단백질은 산화된 형태가 아닐 수 있다. 응집 및 산화 둘 다는 역가, PK(클리어란스)에 영향을 줄 수 있으며 면역원성 우려를 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 상업적으로 제조된 생성물과 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 hIDUA의 계속적인 분비를 유발해야 한다.

상술한 이유로, HuGlyIDUA의 생성은 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, HuGlyIDUA를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체를 MPS I 질환(비제한적으로, 후를러, 후를러-샤이에, 또는 샤이에)으로 진단된 환자(인간 대상체)의 CSF에 투여하여, 형질도입된 CNS 세포에 의해 분비된 완전히 인간-글리코실화, 만노오스-6-포스포릴화, 설페이트화된 전이유전자 생성물을 계속적으로 공급하는 CNS 내의 영구 데포를 생성함으로써 달성되는 MPS I의 치료를 위한 "바이오베터" 분자를 유발한다. 데포로부터 CSF 내로 분비된 HuGlyIDUA 전이유전자 생성물은 CNS에서 세포에 의해 흡수되어, MPS I 수용체 세포에서의 효소 결함의 "교차-교정"을 유발한다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, -- 특히 0에 근접한 수준의 IDUA(예를 들어, 후를러)를 갖는 중증 질환이 있는 환자를 치료하는 경우, 면역 억제 요법으로 환자를 공동-치료하는 것이 권고된다. 예를 들어, 미코페놀산과 병용되고/되거나 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론과 병용된 타크롤리무스 또는 라파마이신(시롤리무스)의 양생법, 또는 조직 이식 절차에서 사용되는 다른 면역 억제 양생법을 포함하는 면역 억제 요법이 사용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 요법의 과정 동안 투여될 수 있으며, 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법을 이용한 사전-치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단을 기반하여 유전자 요법 치료 후에 지속될 수 있으며, 그 후에 면역 내성이 유도되는 경우; 예를 들어 180일 후에 중단될 수 있다.

일 실시양태에서, 면역 억제는, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론의 투여 및 임의로 MMF와 함께 투여되는 타크롤리무스 및/또는 시롤리무스의 양생법을 포함한다. 예를 들어, 1회의 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론이 주입된 후, 12주의 과정에 걸쳐 서서히 점차 감소된 후 중단되는 경구 코르티코스테로이드의 투여가 이어진다. 동시에, 타크롤리무스 및 시롤리무스는 저용량으로 병용하여(예를 들어, 4 내지 8ng/mL 혈청 농도를 유지함), 또는 표지 용량으로 단독으로 24 내지 48주에 걸쳐 경구로 투여될 수 있다. 타크롤리무스 및 시롤리무스는 또한 MMF와 병용하여 표지 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 환자는 즉시 이용 가능한 스테로이드의 초기 주입을 투여받으며, 스테로이드는 그 다음에 경구 투여를 통해 유지되고 12주까지 점차 감소된다. 또한, 48주에 걸친 면역 억제는, 임의로 MMF와 병용된 타크롤리무스 및/또는 시롤리무스에 의해 유지된다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 것을 포함하는, 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경교세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 것을 포함하는, 방법을 기재한다.

특정 실시양태에서, 본원은 뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 α2,6-시알릴화된 인간 α-L-이두로니다아제(IDUA)의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 티로신-설페이트화를 함유하는 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 α2,6-시알릴화되는 것; 및

발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 단계 a) 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 인간 IDUA가 인간에서, 또는 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 것; 및 단계 b) 발현 벡터의 투여 이전에 및/또는 그와 동시에 및/또는 그 후에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 티로신-설페이트화되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생성은, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 실시양태에서, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생성은, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 실시양태에서, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생성은, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 실시양태에서, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA의 생성은, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 구체적 실시양태에서, IDUA 전이유전자는 신호 펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 인간 뉴런 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM이다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하되; 상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 상기 α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하되; 상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하되; 상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 실시양태에서, 본원은 MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 포함하되; 상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 티로신-설페이트화된 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 실시양태에서, 인간 IDUA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법은, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, 또는 (b) 라파마이신 및 미코페놀산을 병용 투여하고, 그 후에 지속하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법은 180일 후에 중단된다.

바람직한 실시양태에서, 글리코실화된 IDUA는 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal을 함유하지 않는다. 본원에 사용된 어구 "검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal"은 당업계 알려진 표준 어세이 방법에 의해 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 모이어티를 의미한다. 예를 들어, NeuGc는 NeuGc를 검출하는 방법에 대해 참고로 본원에 포함되는 Hara et al., 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection." J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111-119에 따른 HPLC에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, NeuGc는 질량 분석법에 의해 검출될 수 있다. α-Gal은 ELISA(예를 들어, Galili et al., 1998, "A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody." Transplantation. 65(8):1129-32 참고)를 사용하거나, 질량 분석법(예를 들어, Ayoub et al., 2013, "Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques." Landes Bioscience. 5(5): 699-710 참고)에 의해 검출될 수 있다. Platts-Mills et al., 2015, "Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal" Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260에 인용된 참고문헌을 또한 참고한다.

5.1 N-글리코실화 및 티로신 설페이트화

5.1.1. N-글리코실화

CNS 내의 뉴런 및 신경교세포는 분비된 단백질의 번역후 가공 - 글리코실화 및 티로신-O-설페이트화를 포함함 - 을 위한 세포 기구를 포함하는 분비성 세포다. hIDUA는 도 1에서 확인된 6 개의 아스파라긴("N") 글리코실화 부위를 갖는다(N¹¹⁰FT; N¹⁹⁰VS; N³³⁶TT; N³⁷²NT; N⁴¹⁵HT; N⁴⁵¹RS). N³⁷²의 N-글리코실화는 기재에 대한 결합 및 효소 활성을 위해 요구되고, 만노오스-6-포스포릴화는 분비된 효소의 세포 흡수 및 MPS I 세포의 교차-교정을 위해 요구된다. N-연결된 글리코실화 부위는 복합적이고, 고 만노오스 및 포스포릴화된 만노오스 탄수화물 모이어티(도 4)를 함유하지만, 분비된 형태만이 세포에 의해 흡수된다. 본원에 기재된 유전자 요법 접근법은 2,6-시알산화되고 만노오스-6-포스포릴화된 IDUA 당단백질의 계속적인 분비를 유발해야 한다. 분비된 글리코실화/포스포릴화된 IDUA는 CNS에서 비형질도입된 뉴런 및 신경교세포에 의해 흡수되고 정확하게 가공되어야 한다.

CNS의 인간 세포에 의한 hIDUA의 글리코실화는 전이유전자 생성물의 안정성, 반감기를 개선할 수 있고 원치 않는 응집을 감소시킬 수 있는 글리칸의 첨가를 유발할 것이다. 중요하게는, 본 발명의 HuGlyIDUA에 첨가되는 글리칸은 Neu5Ac("NANA")를 포함하지만 그의 수산화된 유도체인 NeuGc(N-글리콜릴뉴라민산, 즉 "NGNA" 또는 "Neu5Gc")는 그렇지 않은, 2,6-시알산을 포함하는 고도로 가공된 복합체-형 이중촉각 N-글리칸이다. 이러한 글리칸은 이 번역후 변형을 제조하기 위해 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라아제를 갖지 않는 CHO 세포에서 제조되는 라로니다아제에 존재하지 않을 뿐 아니라, CHO 세포는 이등분 GlcNAc를 생성하지 않으나, 이들은 Neu5Ac(NANA) 대신에 인간에 대해 통상적이지 않은(또한 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로서 Neu5Gc(NGNA)를 첨가한다. 또한, CHO 세포는 대부분의 개체 내에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하는 α-Gal 항원인 면역원성 글리칸을 생성할 수도 있으며, 고농도에서 아나필락시스를 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156을 참고한다. 본 발명의 HuGlyIDUA의 인간 글리코실화 패턴은 전이유전자 생성물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생성된 모든 분자가 완전히 글리코실화 및 설페이트화되는 것이 필수는 아니다. 오히려, 생성된 당단백질의 집단은 충분한 글리코실화 및 설페이트화를 가져 효능을 나타내야 한다.

구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyIDUA는 뉴런 또는 신경교세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현되는 경우, 이의 N-글리코실화 부위 중 100%에서 글리코실화될 수 있다. 그러나, 당업자는 얻어질 글리코실화의 이득을 위해 HuGlyIDUA의 모든 N-글리코실화 부위가 N-글리코실화될 필요는 없다는 것을 인식할 것이다. 오히려, 글리코실화의 이득은 N-글리코실화 부위의 일부만이 글리코실화되는 경우, 및/또는 발현된 IDUA 분자의 일부만이 글리코실화되는 경우 실현될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyIDUA는 뉴런 또는 신경교세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현되는 경우, 이의 이용 가능한 N-글리코실화 부위 중 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 100%에서 글리코실화된다. 특정 실시양태에서, 뉴런 또는 신경교세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현되는 경우, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyIDUA 분자 중 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 이의 이용 가능한 N-글리코실화 부위 중 적어도 하나에서 글리코실화된다.

구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyIDUA에 존재하는 N-글리코실화 부위 중 적어도 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 HuGlyIDUA가 뉴런 또는 신경교세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현되는 경우, N-글리코실화 부위에 존재하는 Asn 잔기(또는 다른 관련 잔기)에서 글리코실화된다. 즉, 생성된 HuGlyIDUA의 N-글리코실화 부위 중 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 글리코실화된다.

다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 HuGlyIDUA 분자에 존재하는 N-글리코실화 부위 중 적어도 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 HuGlyIDUA가 뉴런 또는 신경교세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현되는 경우, N-글리코실화 부위에 존재하는 Asn 잔기(또는 다른 관련 잔기)에 연결된 동일한 부착된 글리칸으로 글리코실화된다. 즉, 생성된 HuGlyIDUA의 N-글리코실화 부위 중 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 동일한 부착된 글리칸을 갖는다.

중요하게는, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 IDUA 단백질이 뉴런 또는 신경교세포에서 발현되는 경우, 원핵 숙주 세포(예를 들어, E. coli(대장균)) 또는 진핵 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서의 시험관내 생성에 대한 필요성은 회피된다. 대신에, 본원에 기재된 방법(IDUA를 발현할 뉴런 또는 신경교세포의 사용)의 결과로서, IDUA 단백질의 N-글리코실화 부위는 인간의 치료와 관련되고 이에 대해 유익한 글리칸으로 유리하게 장식된다. 이러한 이점은 CHO 세포 또는 E. coli가 단백질 생성에서 사용되는 경우 얻을 수 없으며, 이는 예를 들어, CHO 세포가 (1) 2,6 시알릴트랜스퍼라아제를 발현하지 않으므로, N-글리코실화 동안 2,6 시알산을 첨가할 수 없고 (2) Neu5Ac 대신 시알산으로서 Neu5Gc를 첨가할 수 있기 때문이며; E. coli가 N-글리코실화를 위해 필요한 성분을 천연적으로 함유할 수 없기 때문이다. 따라서, 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료의 방법에서 사용되는 HuGlyIDUA를 발생시키기 위해 뉴런 또는 신경교세포에서 발현되는 IDUA 단백질은 단백질이 인간 뉴런 또는 신경교세포에서 N-글리코실화되는 방식으로 글리코실화되지만, 단백질이 CHO 세포에서 글리코실화되는 방식으로는 글리코실화되지 않는다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료의 방법에서 사용되는 HuGlyIDUA를 발생시키기 위해 뉴런 또는 신경교세포에서 발현되는 IDUA 단백질은 단백질이 뉴런 또는 신경교세포에서 N-글리코실화되는 방식으로 글리코실화되며, 이러한 글리코실화는 원핵 숙주 세포를 사용하여, 예를 들어 E. coli를 사용하여 천연적으로 가능하지 않다.

단백질의 글리코실화 패턴을 결정하기 위한 어세이는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 하이드라진분해는 글리칸을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 첫번째로, 다당류는 이의 연관된 단백질로부터 하이드라진과의 항온처리에 의해 방출된다(Ludger Liberate 하이드라진분해 글리칸 방출 키트, Oxfordshire, UK가 사용될 수 있음). 친핵체 하이드라진은 다당류와 담체 단백질 사이의 글리코시드 결합을 공격하고 공격받은 글리칸의 방출을 허용한다. N-아세틸기는 이 치료 동안 소실되며 재-N-아세틸화에 의해 재구성되어야 한다. 유리 글리칸은 탄소 칼럼 상에서 정제되고, 이어서 형광단 2-아미노 벤즈아마이드로 환원 말단에서 표지될 수 있다. 표지된 다당류는 Royle et al, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90의 HPLC 프로토콜에 따라 GlycoSep-N 칼럼(GL Sciences) 상에서 분리될 수 있다. 생성된 형광 크로마토그램은 반복 단위의 다당류 길이 및 수를 나타낸다. 구조 정보는 개별 피크를 수집하고 이어서 MS/MS 분석을 수행함으로써 모을 수 있다. 이에 의해, 반복 단위의 단당류 조성 및 서열이 확인될 수 있으며, 추가적으로 다당류 조성의 균질성이 확인될 수 있다. 낮은 분자량의 특정 피크는 MALDI-MS/MS에 의해 분석될 수 있으며, 결과는 글리칸 서열을 확인하기 위해 사용된다. 각각의 피크는 특정 수의 반복 단위 및 이의 단편을 이루는 중합체에 상응한다. 따라서, 크로마토그램은 중합체 길이 분포의 측정을 허용한다. 용출 시간은 중합체 길이를 나타내는 한편, 형광 강도는 각각의 중합체에 대한 몰 풍부도와 연관성이 있다.

단백질과 연관된 글리칸 패턴의 균질성은 글리코실화 부위에 걸쳐 존재하는 글리칸 길이 및 글리칸의 수 둘 다와 관련되어 있기 때문에 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 글리칸 길이 및 유체역학적 반경을 측정하는 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 크기 배제-HPLC는 유체역학적 반경의 측정을 허용한다. 단백질에서 높은 수의 글리코실화 부위는 적은 글리코실화 부위를 갖는 담체와 비교하여 유체역학적 반경에서 더 큰 변화를 유발한다. 그러나, 단일 글리칸 쇄가 분석되는 경우, 이들은 더욱 제어된 길이로 인해 더욱 균질하다. 글리칸 길이는 하이드라진분해, SDS PAGE, 및 모세관 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 또한, 균질성은 특정 글리코실화 부위 사용 패턴이 넓은/좁은 범위로 변할 수 있다는 것을 의미할 수도 있다. 이들 인자는 글리코펩티드 LC-MS/MS에 의해 측정될 수 있다.

N-글리코실화는 본원에 기재된 방법에서 사용되는 HuGlyIDUA에 많은 이득을 부여한다. 이러한 이득은 E. coli에서 단백질의 생성에 의해 얻을 수 없으며, 이는 E. coli가 N-글리코실화를 위해 필요한 성분을 천연적으로 포함하지 않기 때문이다. 또한, 일부 이득은 예를 들어, CHO 세포에서 단백질 생성을 통해 얻을 수 없으며, 이는 CHO 세포가 특정 글리칸(예를 들어, 2,6 시알산)의 첨가를 위해 필요한 성분이 결여되어 있기 때문이고, CHO 세포가 글리칸, 예를 들어 인간에 대해 통상적이지 않은 Neu5Gc, 및 대부분의 개체에서 면역원성이고 고농도에서 아나필락시스를 촉발시킬 수 있는 α-Gal 항원을 첨가할 수 있기 때문이다. 따라서, 인간 뉴런 또는 신경교세포에서 IDUA의 발현은 유익한 글리칸을 포함하는 HuGlyIDUA의 생성을 유발하며, 그렇지 않으면 CHO 세포 또는 E. coli에서 생성되는 경우, 단백질과 연관되지 않을 것이다.

5.1.2. 티로신 설페이트화

N-연결된 글리코실화 부위 이외에, hIDUA는 결합 및 활성을 위해 필요한 N³⁷²를 함유한 도메인에 인접한 티로신("Y") 설페이트화 부위(ADTPIY²⁹⁶NDEADPLVGWS)를 함유한다. (예를 들어, 단백질 티로신 설페이트화되는 티로신 잔기를 감싸는 아미노산의 분석에 대해 그 전체가 참고로 원용되는 Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. at p. 2154 참고. "규칙"은 다음과 같이 요약될 수 있음: Y의 +5 내지 -5 위치 내의 E 또는 D를 갖는 Y 잔기, Y의 위치 -1은 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만, 염기성 아미노산, 예를 들어 설페이트화를 폐지한 R, K, 또는 H가 아님). 임의의 이론에 구애됨 없이, hIDUA에서 이 부위의 설페이트화는 활성에 대해 중대할 수 있으며, 이는 티로신-설페이트화 영역(예를 들어, W306L) 내의 돌연변이가 감소된 효소 활성 및 질환과 연관된 것으로 알려져 있기 때문이다. (Maita et al., 2013, PNAS 110:14628 at pp. 14632-14633 참고).

중요하게는, 티로신-설페이트화된 단백질은 티로신-설페이트화를 위해 필요한 효소를 천연적으로 포함하지 않는 E. coli에서 생성될 수 없다. 또한, CHO 세포는 티로신 설페이트화가 결핍되어 있다 - 이들은 분비성 세포가 아니며 번역후 티로신-설페이트화에 대해 제한된 능력을 갖는다. 예를 들어, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537을 참고한다. 유리하게는, 본원에 제공된 방법은 뉴런 또는 신경교세포에서 IDUA, 예를 들어 HuGlyIDUA의 발현을 필요로 하며, 이는 분비성이고 티로신 설페이트화에 대한 능력을 갖는다. 티로신 설페이트화를 검출하기 위한 어세이는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164를 참고한다.

hIDUA의 티로신-설페이트화 - 인간 CNS 세포에서 견고한 번역후 가공 - 는 전이유전자 생성물의 가공 및 활성 개선을 유발해야 한다. 리소좀 단백질의 티로신-설페이트화의 중요성은 설명되지 않았으나; 다른 단백질에서 단백질-단백질 상호작용의 활성을 증가시키고(항체 및 수용체), 단백분해 가공을 촉진(펩티드 호르몬)하는 것으로 나타났다. (Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; 및 Bundegaard et al., 1995, The EMBO J 14: 3073-79 참고). 티로신-설페이트화(IDUA 가공에서 최종 단계로서 발생할 수 있음)를 담당하는 티로실단백질 설포트랜스퍼라아제(TPST1)는 뇌에서 분명히 높은 수준으로(mRNA를 기본으로 함) 발현된다(TPST1에 대한 유전자 발현 데이터는 예를 들어, EMBL-EBI Expression Atlas, accessible at http://www.ebi.ac.uk/gxa/home에서 찾아볼 수 있음). 이러한 번역후 변형은 기껏 라로니다아제 - CHO 세포 생성물 - 에서는 잘 나타나지 않는다.

5.2 구조체 및 제형

본원에 제공된 방법은 α-L-이두로니다아제(IDUA), 예를 들어 인간 IDUA(hIDUA)를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 구조체를 사용한다. 본원에 제공된 바이러스 벡터 및 다른 DNA 발현 구조체는 뇌척수액(CSF)으로의 전이유전자의 전달을 위한 임의의 적합한 방법을 포함한다. 전이유전자의 전달의 수단은 바이러스 벡터, 리포솜, 다른 지질-함유 복합체, 다른 거대분자 복합체, 합성 변형 mRNA, 비변형 mRNA, 소분자, 비-생물학적 활성 분자(예를 들어, 금 입자), 중합된 분자(예를 들어, 덴드리머), 네이키드 DNA, 플라스미드, 파지, 전이인자, 코스미드, 또는 에피솜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 표적화된 벡터, 예를 들어 뉴런 세포에 표적화된 벡터이다.

일부 양태에서, 본 발명은 사용을 위한 핵산을 제공하되, 핵산은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동 가능하게 연결된 IDUA, 예를 들어 hIDUA를 코딩한다: 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터.

특정 실시양태에서, 본원은 하나 이상의 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA 및 RNA의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA는 프로모터 서열, 관심 유전자(전이유전자, 예를 들어 IDUA)의 서열, 비번역 영역, 및 종결 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 관심 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 및 핵산 서열은 예를 들어, 당업자에게 알려진 임의의 코돈-최적화 기술을 통해 코돈-최적화될 수 있다(예를 들어, Quax et al., 2015, Mol Cell 59:149-161에 의해 검토됨).

5.2.1. mRNA

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 관심 유전자(예를 들어, 전이유전자, 예를 들어 IDUA)를 코딩하는 변형 mRNA이다. CSF로의 전이유전자의 전달을 위한 변형 및 비변형 mRNA의 합성은 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Hocquemiller et al., 2016, Human Gene Therapy 27(7):478-496에 교시되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원은 IDUA, 예를 들어 hIDUA를 코딩하는 변형 mRNA를 제공한다.

5.2.2. 바이러스 벡터

바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스(AAV, 예를 들어 AAV9), 렌티바이러스, 헬퍼(helper)-의존성 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 폭스바이러스, 일본 헤마글루티닌 바이러스(hemagglutinin virus of Japan, HVJ), 알파바이러스, 백시니아바이러스, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MLV)- 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-계 벡터를 포함한다. 알파바이러스 벡터는 셈리키 삼림열 바이러스 (SFV) 및 신드비스(sindbis) 바이러스(SIN)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 이들이 인간에서 복제-결핍성이도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하이브리드 벡터, 예를 들어, "무력한(helpless)" 아데노바이러스 벡터내에 위치된 AAV 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원은 제1 바이러스로부터의 바이러스 캡시드 및 제2 바이러스로부터의 바이러스 외피 단백질을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 제2 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitus virus, VSV)이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 외피 단백질은 VSV-G 단백질이다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 HIV계 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 HIV-계 벡터는 적어도 2 개의 폴리뉴클레오티드를 포함하되, gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터의 것이고 env 유전자는 다른 바이러스로부터의 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 단순 포진 바이러스-계 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 단순 포진 바이러스-계 벡터는 이들이 하나 이상의 즉시 초기(immediate early, IE) 유전자를 포함하지 않아, 이들이 비-세포독성이 되도록 변형된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 MLV계 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 MLV-계 벡터는 바이러스 유전자 대신 최대 8 kb의 이종성 DNA를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 렌티바이러스-계 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 인간 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 비-인간 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 캡시드 내로 패키징된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 포함한다: 긴 말단 반복부, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린 트랙트(tract), att 부위, 및 이입(encapsidation) 부위.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 알파바이러스-계 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 알파바이러스 벡터는 재조합, 복제-결함 알파바이러스이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 알파바이러스 벡터 내의 알파바이러스 레플리콘(replicon)은 이들의 비리온 표면 상에 기능성 이종성 리간드를 디스플레이함으로써 특정 세포 유형에 표적화된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 AAV계 바이러스 벡터이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 AAV9 또는 AAVrh10계 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, AAV9 또는 AAVrh10계 바이러스 벡터는 CNS 세포에 대한 향성을 보유한다. 다수의 AAV 혈청형이 확인되었다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 AAV-계 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 AAV계 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, 또는 AAV11 중 하나 이상으로부터의 성분을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 AAV계 벡터는 AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAV11 혈청형 중 하나 이상으로부터의 성분을 포함한다. AAV9-계 바이러스 벡터가 본원에 기재된 방법에서 사용된다. AAV계 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제7,282,199 B2호, 미국 특허 제7,790,449 B2호, 미국 특허 제8,318,480 B2호, 미국 특허 제8,962,332 B2호 및 국제 특허 출원 PCT/EP2014/076466호에 교시된다. 일 양태에서, 본원은 전이유전자(예를 들어, IDUA)를 코딩하는 AAV(예를 들어, AAV9 또는 AAVrh10)-계 바이러스 벡터를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 IDUA를 코딩하는 AAV9-계 바이러스 벡터를 제공한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 본원은 hIDUA를 코딩하는 AAV9-계 바이러스 벡터를 제공한다.

특별한 실시양태에서, (i) 조절 요소의 제어 하에서 ITR의 측면에 있는 전이유전자를 함유하는 발현 카세트; 및 (ii) AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 갖거나 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열(서열번호 26)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 한편, AAV9 캡시드의 생물학적 기능을 보유하는 바이러스 캡시드를 포함하는 인공 게놈을 포함하는 AAV9 벡터가 제공된다. 특정 실시양태에서, 코딩된 AAV9 캡시드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 26의 서열을 갖고 AAV9 캡시드의 생물학적 기능을 보유한다. 도 5a 내지 도 5e는 SUBS로 표지된 열에서의 비교를 기본으로 하여 정렬된 서열에서의 특정 위치에서 치환될 수 있는 잠재적 아미노산과 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교 정렬을 제공한다. 따라서, 구체적 실시양태에서, AAV9 벡터는 천연 AAV9 서열에서 그 위치에 존재하지 않는 도 5a 내지 도 5e의 SUBS 열에서 확인된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 갖는 AAV9 캡시드 변이체를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 AAV는 그 전체가 참고로 원용되는 Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068에 기재된 바와 같은 Anc80 또는 Anc80L65이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 AAV는 다음의 아미노산 삽입 중 하나를 포함한다: 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 및 미국 특허 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 LGETTRP 또는 LALGETTRP. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 AAV는 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제9,193,956호; 제9,458,517호; 및 제9,587,282호 및 미국 특허 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 AAV.7m8이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 AAV는 미국 특허 제9,585,971호에 개시된 임의의 AAV, 예컨대 AAV-PHP.B이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 AAV는 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 다음 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV이다: 미국 특허 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; US 9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 미국 특허 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 PCT/US2015/034799호; PCT/EP2015/053335호.

특정 실시양태에서, 단일-가닥 AAV(ssAAV)가 상기한 대로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 자기-상보성 벡터, 예를 들어 scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254; 및 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호 참고).

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 바이러스 벡터는 아데노바이러스계 바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스 벡터가 IDUA에서 전달하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E1 결실을 가지며, E3 결실이 있거나 없으며, 발현 카세트가 결실된 영역 내로 삽입된, 제1 세대 벡터일 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E2 및 E4 영역의 전체 또는 부분 결실을 함유하는 제2 세대 벡터일 수 있다. 헬퍼-의존성 아데노바이러스는 아데노바이러스 역위 말단 반복부 및 패키징 신호(phi)만을 보유한다. 전이유전자는 인공 게놈을 대략 36 kb의 야생형 크기에 가깝게 유지하기 위한 스터퍼 서열(stuffer sequence)이 있거나 없이, 패키징 신호와 3'ITR 사이에 삽입된다. 아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 예시적인 프로토콜은 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27에서 찾아볼 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 바이러스 벡터는 렌티바이러스계 바이러스 벡터이다. 재조합 렌티바이러스 벡터가 IDUA에서 전달하기 위해 사용될 수 있다. 구조체를 제조하기 위해 4개의 플라스미드가 사용된다: Gag/pol 서열 함유 플라스미드, Rev 서열 함유 플라스미드, 외피 단백질 함유 플라스미드(즉, VSV-G), 및 패키징 요소 및 IDUA 유전자를 가진 Cis 플라스미드.

렌티바이러스 벡터 생성을 위해, 4개의 플라스미드는 세포(즉, HEK293계 세포) 내로 공동-형질감염되며, 이에 의해 폴리에틸렌이민 또는 칼슘 포스페이트가 다른 것 중에서도 형질감염제로 사용될 수 있다. 그 다음에, 렌티바이러스가 상청액에서 수집된다(렌티바이러스는 활성되기 위하여 세포로부터 빠져나가야하며, 세포 수집이 필요하거나/수행되지 않음). 상청액이 여과되고(0.45μm), 그 다음에 마그네슘 클로라이드 및 벤조나제가 첨가된다. 추가의 다운스트림 과정(downstream process)은 가장 GMP 양립성인 TFF 및 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 광범위하게 달라질 수 있다. 다른 것은 컬럼 크로마토그래피가 있거나 없이 초원심분리를 이용한다. 렌티바이러스 벡터의 생성을 위한 예시적인 프로토콜은 Lesch et al., 2011, "Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors," Gene Therapy 18:531-538, 및 Ausubel et al., 2012, "Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors," Bioprocess Int. 10(2):32-43에서 찾아볼 수 있으며, 둘 다 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.

구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 벡터는 CNS, 또는 관련 세포(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 뉴런 세포)에서 세포의 형질도입시, IDUA의 글리코실화된 변이체가 형질도입된 세포에 의해 발현되도록, IDUA(예를 들어, hIDUA)를 코딩하는 것이다. 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 벡터는 CNS, 또는 관련 세포(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 뉴런 세포)에서 세포의 형질도입시, IDUA의 설페이트화된 변이체가 세포에 의해 발현되도록, IDUA(예를 들어, hIDUA)를 코딩하는 것이다.

5.2.3 프로모터 및 유전자 발현의 변형제

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 유전자 전달 또는 유전자 발현을 조절하는 성분(예를 들어, "발현 제어 요소")을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원 제공된 벡터는 유전자 발현을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 주는 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 흡수 후 세포 내에서 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 전이유전자)의 국소화에 영향을 주는 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 흡수한 세포를 검출하거나 선택하기 위해, 검출가능하거나 선택가능한 마커로서 사용될 수 있는 성분을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 대안적 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 대부분의 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)와 마찬가지로, 천연 IDUA 유전자는 GC-풍부 프로모터를 주로 사용한다. 바람직한 실시양태에서, hIDUA의 지속적인 발현을 제공하는 강한 구성적 프로모터가 사용된다. 이러한 프로모터는 다음을 함유하는 "CAG" 합성 프로모터를 포함한다: "C" - 거대세포바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소; "A" - 프로모터뿐 아니라 닭 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 인트론; 및 "G" - 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체(Miyazaki et al., 1989, Gene 79: 269-277; 및 Niwa et al., Gene 108: 193-199 참고).

특정 실시양태에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다(그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Dinculescu et al., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663 참고). 일부 실시양태에서, CB7 프로모터는 벡터에 의해 구동되는 전이유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 다른 발현 제어 요소는 닭 β-액틴 인트론 및/또는 토끼 β-글로빈 polA 신호를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 TATA 박스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 하나 이상의 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 프로모터 요소는 서로에 대하여 역위되거나 이동될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로모터의 요소는 협조적으로 기능하도록 위치된다. 특정 실시양태에서, 프로모터의 요소는 독립적으로 기능하도록 위치된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간 CMV 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RS) 긴 말단 반복부, 및 랫트 인슐린 프로모터로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1, 및 HIV-2 LTR로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터(예를 들어, 뉴런 세포-특이적 프로모터)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 프로모터 이외에 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인핸서를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 억제자(repressor)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인트론 또는 키메라 인트론을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.

5.2.4 신호 펩티드

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 단백질 전달을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 신호 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 전이유전자 생성물(예를 들어, IDUA)이 세포에서 적절한 패키징(예를 들어, 글리코실화)을 이루도록 한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 전이유전자 생성물(예를 들어, IDUA)이 세포에서 적절한 국소화를 이루도록 한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 전이유전자 생성물(예를 들어, IDUA)이 세포로부터 분비되도록 한다. 본원에 제공된 벡터 및 전이유전자와 관련하여 사용될 신호 펩티드의 예는 표 1에서 찾아볼 수 있다. 신호 펩티드는 또한 본원에서 리더 서열 또는 리더 펩티드로서 지칭될 수 있다.

5.2.5. 비번역 영역

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 비번역 영역(UTR), 예를 들어, 3' 및/또는 5' UTR을 포함한다. 특정 실시양태에서, UTR은 단백질 발현의 소망하는 수준을 위해 최적화된다. 특정 실시양태에서, UTR은 전이유전자의 mRNA 반감기를 위해 최적화된다. 특정 실시양태에서, UTR은 전이유전자의 mRNA의 안정성을 위해 최적화된다. 특정 실시양태에서, UTR은 전이유전자의 mRNA의 이차 구조를 위해 최적화된다.

5.2.6. 역위 말단 반복부

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 역위 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다. ITR 서열은 바이러스 벡터의 비리온 내로 재조합 유전자 발현 카세트를 패키징하기 위해 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, ITR은 AAV, 예를 들어, AAV9로부터의 것이다(예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Yan et al., 2005, J. Virol., 79(1):364-379; 미국 특허 제7,282,199 B2호, 미국 특허 제7,790,449 B2호, 미국 특허 제8,318,480 B2호, 미국 특허 제8,962,332 B2호 및 국제 특허 출원 PCT/EP2014/076466호 참고).

5.2.7. 전이유전자

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 IDUA 전이유전자를 코딩한다. 구체적 실시양태에서, IDUA는 뉴런 세포에서의 발현을 위해 적절한 발현 제어 요소에 의해 제어된다: 특정 실시양태에서, IDUA(예를 들어, hIDUA) 전이유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IDUA(예를 들어, hIDUA) 전이유전자는 서열번호 1에 기재된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

5.2.8. 구조체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 순서대로 하기 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 전이 유전자(예컨대, IDUA)를 코딩하는 서열, h) 제4 링커 서열, i) 폴리 A 서열, j) 제5 링커 서열, 및 k) 제2 ITR 서열.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 순서대로 하기 요소를 포함한다: a) 프로모터 서열, 및 b) 전이 유전자(예컨대, IDUA)를 코딩하는 서열. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 순서대로 하기 요소를 포함한다: a) 프로모터 서열, 및 b) 전이 유전자(예컨대, IDUA)를 코딩하는 서열을 포함하되, 전이 유전자는 신호 펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 순서대로 하기 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 전이 유전자(예컨대, IDUA)를 코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하기 순서대로 하기 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 전이 유전자(예컨대, IDUA)를 코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열을 포함하되, 전이 유전자는 신호 펩티드를 포함하고, 전이 유전자는 hIDUA를 코딩한다.

5.2.9. 벡터의 제조 및 테스트

본원에 제공된 바이러스 벡터는 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 제공된 바이러스 벡터는 포유류 숙주 세포, 예컨대, A549 , WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 일차 섬유아세포, 간세포 및 근아세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터로부터의 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다.

숙주 세포는 전이 유전자 및 연관 요소를 코딩하는 서열(즉, 벡터 게놈), 및 숙주 세포에서 바이러스를 생성시키는 수단, 예를 들어, 복제 및 캡시드 유전자(예컨대, AAV의 rep 및 cap 유전자)로 안정적으로 형질전환된다. AAV8 캡시드를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 생성하는 방법에 대해서는, 미국특허 제7,282,199 B2호의 상세한 설명의 IV 섹션을 참조할 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 원용된다. 상기 벡터의 게놈 복사체(copy) 역가는 예를 들어, TAQMAN^® 분석에 의해 확인될 수 있다. 비리온온 예를 들어, CsCl₂ 침강에 의해 회수될 수 있다.

시험관 내 분석, 예컨대, 세포 배양 분석은 본원에 기술된 벡터로부터의 전이 유전자 발현을 측정하는데 사용되어, 예컨대, 벡터의 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포주; 또는 뉴런 세포 또는 신경교세포, 또는 뉴런 세포 또는 신경교세포의 전구 세포로부터 유래된 다른 세포주는 전이 유전자 발현을 평가하는데 사용될 수 있다. 일단 발현되면, HuGlyIDUA와 연관된 글리코실화 및 티로신 설페이트화 패턴의 확인을 포함한 발현된 생성물(즉, HuGlyIDUA)의 특성을 확인할 수 있다.

5.2.10. 조성물

본원에 기술된 전이 유전자 및 적절한 담체를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물을 기술한다. (예컨대, CSF 및 예를 들어, 뉴런 세포에 투여하기 위한) 적절한 담체는 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.

5.3 유전자 요법

MPS Ⅰ을 앓는 인간 대상체에 전이 유전자 구조체의 치료적 유효량을 투여하기 위한 방법이 기술되어 있다. 특히, MPS I을 앓는 환자에게 전이 유전자 구조체의 치료적 유효량을 투여하기 위한 특히, CSF에 투여하기 위한 방법이 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, 전이 유전자 구조체의 치료적 유효량을 CSF에 투여하기 위한 이러한 방법은 후를러 증후군 또는 후를러-샤이에 증후군을 앓는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

5.3.1. 목표 환자 집단

특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 MPS Ⅰ로 진단된 환자에 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 후를러-샤이에 증후군으로 진단되었다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 샤이에 증후군으로 진단되었다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 후를러 증후군으로 진단되었다.

특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 중증 MPS Ⅰ로 진단된 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 약화된 MPS Ⅰ로 진단된 환자에 투여된다.

특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 IDUA, 예컨대, hIDUA를 이용한 치료에 반응하는 것으로 확인된, MPS I으로 진단된 환자에 투여된다.

특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 소아 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 3세 미만인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 2 내지 4세인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 3 내지 8세인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 8 내지 16세인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 6 내지 18세인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 6세 이상인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 3세 미만인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 4개월 이상 9개월 미만인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 9개월 이상 18개월 미만인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 18개월 이상 3세 미만인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 10세 초과인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 청소년 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 성인 환자에 투여된다.

특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 유전자 요법으로 치료하기 전 CSF 내에 주입되는 IDUA, 예컨대, hIDUA를 이용한 치료에 반응하는 것으로 확인된, MPS I으로 진단된 환자에 투여된다.

5.3.2. 투여량 및 투여의 모드(mode)

특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량은 척수강 내 투여(즉, 재조합 벡터가 CSF를 통해 분산되고 CNS 내의 세포를 형질도입하도록 지주막하 공간 내로 주입)를 통해 CSF에 투여된다. 이는 다수의 방식으로 - 예를 들어, 두개 내(수조 또는 실) 주입 또는 요추 수조 내로의 주입에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 척수강 내 투여는 수조 내(IC) 주입을 통해(예컨대, 대수조 내로) 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 수조 내 주입은 CT-유도 후두하 천자에 의해 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 척수강 내 주입은 요추 천자에 의해 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 지주막하 공간 내로의 주입은 환자에 대해 실현가능한 경우, C1-2 천자를 통해 수행된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 비강 내 투여를 통해 CNS에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량이 뇌실질 내 주입을 통해 CNS에 투여된다. 특정 실시양태에서, 뇌실질 내 주입은 선조체(striatum)를 목표로 한다. 특정 실시양태에서, 뇌실질 내 주입은 백질을 목표로 한다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효 용량은 당업계에 공지된 임의의 수단, 예를 들어, Hocquemiller et al., 2016, Human Gene Therapy 27(7):478-496에 개시된 임의의 수단에 의해 CSF에 투여되며, 상기 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.

재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 9.25 내지 277μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여되어야 한다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 9.25, 16, 46, 92, 185 또는 277μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 9.25, 16, 46, 92, 185 또는 277μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 9.25μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 16μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 46μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 92μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 적어도 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 185μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 벡터는 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 적어도 277μg/mL의 C_min으로 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.00 내지 30.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.00, 1.74, 5.00, 10.00, 20.00 또는 30.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.74mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 5.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 10.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 20.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 30.00mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.29 내지 38.88mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.29, 2.25, 8.40, 12.96, 25.93 또는 38.88mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.29mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 2.25mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 8.40mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 12.96mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 25.93mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 실시양태에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 38.88mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

척수강 내 투여를 위한 재조합 벡터의 치료적 유효 용량은 주입 부피, 바람직하게는 약 20mL 이하로 CSF에 투여되어야 한다. 척수강 내 주입에 적절한 담체, 예컨대, Elliotts B 용액이 재조합 벡터의 비히클로서 사용되어야 한다. Elliots B 용액(성분명: 소듐 클로라이드, 소듐 비카보네이트, 무수 덱스트로스, 마그네슘 설페이트, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 및 소듐 포스페이트)은 정균 보존제를 함유하지 않는 무균의 비발열성 등장액이고, 화학요법의 척수강 내 투여를 위한 희석액으로서 사용된다.

특정 실시양태에서, 투여량은 환자의 CSF에 투여된(예컨대, 후두하 천자 또는 요추 천자를 통해 주입된) 게놈 복사체 갯수에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 1x10¹² 내지 2x10¹⁴개의 게놈 복사체가 투여된다. 특정 실시양태에서, 5x10¹² 내지 2x10¹⁴개의 게놈 복사체가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 1x10¹³ 내지 1x10¹⁴개의 게놈 복사체가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 1x10¹³ 내지 2x10¹³개의 게놈 복사체가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 6x10¹³ 내지 8x10¹³개의 게놈 복사체가 투여된다.

특정 실시양태에서, 1x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 소아 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 5.6×10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 소아 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1x10¹² 내지 5.6x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 소아 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1x10¹³ 내지 5.6x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 소아 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 2.6×10¹²개의 게놈 복사체의 편평 용량이 성인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1.3x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 성인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1.4x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 성인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 7.0x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 성인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1.4x10¹³ 내지 7.0x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 성인 환자에 투여된다. 특정 실시양태에서, 1x10¹² 내지 5.6x10¹³개의 게놈 복사체의 편평 용량이 성인 환자에 투여된다.

특정 실시양태에서, 투여량은 뇌 질량 1그램 당 환자의 CSF에 투여된(예컨대, 후두하 천자 또는 요추 천자를 통해 주입된) 게놈 복사체 갯수에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 1x10⁹ 내지 2x10¹⁰개의 게놈 복사체가 투여된다. 특정 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 5x10⁹ 내지 2x10¹⁰개의 게놈 복사체가 투여된다. 특정 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 2×10⁹개의 게놈 복사체가 투여된다. 특정 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 1×10¹⁰개의 게놈 복사체가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 9x10⁹내지 1x10¹⁰개의 게놈 복사체가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 1x10¹⁰ 내지 1.5x10¹⁰개의 게놈 복사체가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 뇌 질량 1그램 당 5x10¹⁰ 내지 6x10¹⁰개의 게놈 복사체가 투여된다.

hIDUA 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9 캡시드의 비-복제 재조합 AAV(rAAV9.hIDUA)가 치료에 사용된다. AAV9 혈청형은 IC 투여 후 CNS에서 hIDUA 단백질의 효율적인 발현을 가능하게 한다. 벡터 게놈은 AAV2-역 말단 반복서열(ITR)로부터 측면에 배치된 hIDUA 발현 카세트를 함유한다. 카세트로부터의 발현은 강력한 구성적 프로모터에 의해 유도된다.

rAAV9.hIDUA는 약 5 내지 20ml의 부피 또는 약 5ml 이하의 부피 내의 1.4×10¹³GC(1.1×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 내지 7.0×10¹³GC(5.6×10¹⁰GC/g뇌 질량) 범위의 단일 편평 용량으로서 IC로(후두하 주입에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 AAV에 대한 중화 항체를 갖는 경우, 높은 범위의 용량을 사용할 수 있다. rAAV9.hIDUA는 약 5 내지 20ml의 부피, 또는 약 5ml 이하의 부피 내의 2.6×10¹²GC(2×10⁹GC/g 뇌 질량) 내지 1.3×10¹³GC(1×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 편평 용량으로서 IC로(후두하 주입에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 4개월 이상 9개월 미만인 경우, rAAV9.hIDUA는 약 5 내지 20ml의 부피, 또는 약 5ml 이하의 부피 내의 6.0×10¹²GC(1.0×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 내지 3.0×10¹³GC(5×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 편평 용량으로서 IC로(후두하 주입에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 9개월 이상 18개월 미만인 경우, rAAV9.hIDUA는 약 5 내지 20ml의 부피, 또는 약 5ml 이하의 부피 내의 1.0×10¹³GC(1.0×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 내지 5.0×10¹³GC(5×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 편평 용량으로서 IC로(후두하 주입에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 18개월 이상 3세 미만인 경우, rAAV9.hIDUA는 약 5 내지 20ml의 부피, 또는 약 5ml 이하의 부피 내의 1.1×10¹³GC(1.0×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 내지 5.5×10¹³GC(5×10¹⁰GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 편평 용량으로서 IC로(후두하 주입에 의해) 투여될 수 있다.

5.4 병용 요법

5.4.1. 면역 억제제를 이용한 공동-요법

rHuGlyIDUA의 전달은 면역 반응을 최소화해야 하는 한편, CNS-지시된 유전자 요법과 관련된 독성의 확실한 잠재적 공급원은 IDUA에 대해 유전적으로 결핍된 인간 대상체에서 발현된 hIDUA 단백질에 대해 면역력을 생성하여, 전이유전자를 전달하기 위해 사용되는 단백질 및/또는 벡터를 잠재적으로 용인하지 않는다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, -- 특히 0에 근접한 수준의 IDUA를 갖는 중증 질환 환자(예컨대, 후를러 증후군 환자)를 치료하는 경우, 면역 억제 요법으로 환자를 공동-치료하는 것이 권고된다. 미코페놀산과 병용된 타크롤리무스 또는 라파마이신(시롤리무스)의 양생법, 또는 조직 이식 과정에서 사용되는 다른 면역 억제 양생법을 포함한 면역 억제 요법이 이용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 요법의 과정 동안에 투여될 수 있고, 특정 실시양태에서는 면역 억제 요법을 이용한 사전-치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단을 기반하여 유전자 요법 치료 후에 지속될 수 있으며, 면역 내성이 유도되는 경우 이후에, 예컨대, 180일 후에 중단될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 프레드니솔론, 미코페놀산 및 타크롤리무스를 포함하는 면역 억제 양생법으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 프레드니솔론, 미코페놀산 및 라파마이신(시롤리무스)을 포함하는 면역 억제 양생법으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 타크롤리무스를 포함하지 않는 면역 억제 양생법으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 하나 이상의 코르티코스테로이드, 예컨대, 메틸프레드니솔론 및/또는 프레드니솔론 뿐만 아니라 타크롤리무스 및/또는 시롤리무스를 포함하는 면역 억제 양생법으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법은 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, 또는 (b) 라파마이신 및 미코페놀산을 병용하여 투여하고, 그 후에 지속하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법은 180일 후에 중단된다. 특정 실시양태에서, 면역 억제 요법은 30, 60, 90, 120, 150 또는 180일 후에 중단된다.

특정 실시양태에서, 타크롤리무스는 5 내지 10ng/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 타크롤리무스는 4 내지 8ng/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 특히 환자가 3세 미만인 경우, 타크롤리무스는 2 내지 4ng/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, MMF는 2 내지 3.5μg/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 타크롤리무스는 5 내지 10ng/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여되고, MMF는 2 내지 3.5μg/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 혈청 농도는 타크롤리무스 및/또는 MMF의 최저 수준의 측정 후에 타크롤리무스 및/또는 MMF의 적정에 의해 달성된다.

특정 실시양태에서, 메틸프레드니솔론은 1회 정맥 내로 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 프레드니솔론은 매일 1회 경구로 0.5mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 프레드니솔론은 점차 감소된 후 중단된다. 특정 실시양태에서, 타크롤리무스는 4 내지 8ng/ml의 목표 혈중 수준을 유지하기 위해 매일 2회 경구로 1mg이 투여된다. 특정 실시양태에서, 특히 환자가 3세 미만인 경우, 타크롤리무스는 2 내지 4ng/ml의 목표 혈중 수준을 유지하기 위해 매일 2회 경구로 0.05mg/kg이 투여된다. 특정 실시양태에서, 시롤리무스도 또한 투여된다. 환자에는 시롤리무스가 사전-투여되어, 이 후 양생법 동안에 4 내지 8ng/ml의 목표 혈중 농도를 유지할 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 환자가 3세 미만인 경우, 환자에는 바람직하게는 시롤리무스가 사전-투여되어, 이 후 양생법 동안에 1 내지 3ng/ml의 목표 혈중 농도를 유지할 수 있다. 특정 실시양태에서, 메틸프레드니솔론은 1회 정맥 내로 10mg/kg의 용량으로 투여되고, 프레드니솔론은 매일 1회 경구로 0.5mg/kg의 용량으로 투여되고, 타크롤리무스는 매일 1회 경구로 0.2mg/kg이 투여되고, 시롤리무스가 투여된다.

특정 실시양태에서, 라파마이신은 매일 1회 경구로 2 또는 4mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, MMF는 매일 2회 경구로 25mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 라파마이신은 매일 1회 경구로 2 또는 4mg/kg의 용량으로 투여되고, MMF는 매일 2회 경구로 25mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 라파마이신은 5 내지 15ng/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, MMF는 2 내지 3.5μg/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 라파마이신은 5 내지 15ng/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여되고, MMF는 2 내지 3.5μg/mL의 혈청 농도를 유발하는 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 혈청 농도는 라파마이신 및/또는 MMF의 최저 수준의 측정 후에 라파마이신 및/또는 MMF의 적정에 의해 달성된다.

5.4.2. 주의 기준을 포함한, 다른 치료를 이용한 공동-요법

다른 이용 가능한 치료의 투여를 수반하는 CSF에 HuGlyIDUA의 병용 투여가 본 발명의 방법에 포함된다. 추가적인 치료는 유전자 요법 치료 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법과 병용될 수 있는 MPS I에 대한 이용 가능한 치료는 전신적으로 또는 CSF에 투여된 라로니다아제를 사용하는 효소 대체 요법(ERT) 및/또는 HSCT 요법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, ERT는 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생성된 rHuGlyIDUA 당단백질을 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생성에 사용될 수 있는 인간 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, 인간 배아 신장 293 세포(HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막세포주, 예를 들어, PER.C6, 또는 RPE(Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives"를 참조할 수 있으며, 이는 rHuGlyIDUA 당단백질의 재조합체 생성을 위해 사용될 수 있는 인간 세포주의 검토를 위하여 이의 전체가 참고로 원용된다)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 완전히 글리코실화, 특히 시알릴화 및 티로신-설페이트화를 확실히 하기 위해, 생성에 사용된 세포주는 숙주 세포를 조작함으로써 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제(또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제) 및/또는 티로신-O-설페이트화에 관여하는 TPST-1 및 TPST-2 효소의 공동 발현을 증진시킬 수 있다.

5.5 효능의 바이오마커/샘플링/모니터링

효능은 인지 기능(예컨대, 신경인지 감퇴의 예방 또는 감소); CSF 및/또는 혈청에서의 질환의 바이오마커(예컨대, GAG)의 저하; 및/또는 CSF 및/또는 혈청에서의 IDUA 효소 활성의 증가를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 염증 및 다른 안전 사건의 징후가 또한 모니터링될 수 있다.

5.5.1. 질환 마커

특정 실시양태에서, 재조합 벡터를 이용한 치료의 효능은 환자의 질환 바이오마커의 수준을 측정함으로써 모니터링된다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커의 수준은 환자의 CSF에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커의 수준은 환자의 혈청에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커의 수준은 환자의 소변에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커는 GAG이다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커는 IDUA 효소 활성이다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커는 염증이다. 특정 실시양태에서, 질환 바이오마커는 안전 사건이다.

5.5.2. 신경인지 기능의 테스트

특정 실시양태에서, 재조합 벡터를 이용한 치료의 효능은 환자의 인지 기능의 수준을 측정함으로써 모니터링된다. 인지 기능은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인지 기능은 지능 지수(IQ)를 측정하기 위한 검증된 도구를 통해 측정된다. 특정 실시양태에서, IQ는 Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence, Second Edition(WASI-II)에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 인지 기능은 기억력을 측정하기 위한 검증된 도구를 통해 측정된다. 특정 실시양태에서, 기억력은 Hopkins Verbal Learning Test(HVLT)에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 인지 기능은 주의력을 측정하기 위한 검증된 도구를 통해 측정된다. 특정 실시양태에서, 주의력은 Test Of Variables of Attention (TOVA)에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 인지 기능은 IQ, 기억력 및 주의력 중 하나 이상을 측정하기 위한 검증된 도구를 통해 측정된다.

5.5.3. 신체적 변화

특정 실시양태에서, 재조합 벡터를 이용한 치료의 효능은 환자의 리소좀 저장 결핍과 연관된 신체적 특성을 측정함으로써 모니터링된다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 저장 병변이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 저신장증이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 거친 얼굴 특징이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 폐쇄성 수면 무호흡증이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 청각 장애이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 시각 장애이다. 특정 실시양태에서, 시각 장애는 각막 혼탁(corneal clouding)에 기인한다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 뇌수종이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 척수 압박이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 간비종대증이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 뼈 및 관절 기형이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 심장 판막 질환이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 재발성 상부 호흡기 감염이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 손목터널증후군이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 대설증(확대된 혀)이다. 특정 실시양태에서, 신체적 특성은 확대된 성대 및/또는 음성의 변화이다. 이러한 신체적 특성은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.

서열 표

6. 실시예

6.1 실시예 1: hIDUA cDNA

hIDUA(서열번호 1)를 포함하는 전이 유전자를 포함하는 hIDUA cDNA-기반 벡터를 구축한다. 전이 유전자는 또한 표 1에 열거된 군으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 임의로, 벡터는 추가로 프로모터를 포함한다.

6.2 실시예 2: 치환된 hIDUA cDNA

서열번호 1의 hIDUA 서열과 비교하여, 예컨대, 비제한적으로, 도 2에 나타낸 IDUA의 올소로그에서의 상응하는 비-보존 잔기들로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 hIDUA를 포함하는 전이 유전자를 포함하는 hIDUA cDNA-기반 벡터를 구축하되, 단, 이러한 돌연변이는 도 3a 및 도 3b에 도시된(Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, 57 MPS I 돌연변이를 열거한 표 1로부터의 것, 이는 본원에 그 전체가 참고로 원용됨); 또는 Venturi et al., 2002, Human Mutation #522 Online ("Venturi 2002"), 또는 Bertola et al., 2011 Human Mutation 32:E2189-E2210 ("Bertola 2011")에 의해 보고된 중증, 중증-중간, 중간, 또는 약화된 MPS I 표현형에서 확인되었던 임의의 것을 포함하지 않으며, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 원용된다. 전이 유전자는 또한 표 1에 열거된 군으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 임의로, 벡터는 추가로 프로모터를 포함한다.

6.3 실시예 3: hIDUA 또는 치환된 hIDUA를 갖는 동물 모델에서의 MPS I의 치료

hIDUA cDNA-기반 벡터는 전이 유전자로서 발현되는 경우 MPS I의 치료에 유용한 것으로 간주된다. MPS I의 동물 모델, 예컨대, Clarke et al., 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511 (마우스), Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97 (도메스틱 쇼트헤어 고양이), Menon et al., 1992, Genomics 14(3):763-768 (개), 또는 Shull et al., 1982, Am J Pathol 109(2):244-248 (개)에 기술된 동물 모델은, 동물의 CSF에 전이 유전자 생성물의 농도를 9.25μg/mL 이상의 C_min로 유지 및 전달하기에 충분한 용량으로 척수강 내로 hIDUA를 코딩하는 재조합 벡터가 투여된다. 치료 후, 동물은 특정 동물 모델의 질병과 일치하는 증상의 개선에 대해 평가된다.

6.4 실시예 4: hIDUA 또는 치환된 hIDUA를 사용한 MPS I의 치료

hIDUA cDNA-기반 벡터는 전이 유전자로서 발현되는 경우 MPS I의 치료에 유용하다고 간주된다. MPS I을 나타내는 대상체는, CSF에 전이 유전자 생성물의 농도를 9.25μg/mL 이상의 C_min로 유지 및 전달하기에 충분한 용량으로 척수강 내로 hIDUA를 코딩하는 cDNA-기반 벡터가 투여된다. 치료 후, 대상체는 MPS I의 증상의 개선에 대해 평가된다. hIDUA를 코딩하는 cDNA-기반 벡터의 투여 전, 그와 동시에, 또는 그 후에, 환자는 라파마이신, MMF 및 프레드니솔론을 포함하는 면역 억제 요법이 투여된다.

6.5 실시예 5: MPS I 치료의 임상 프로토콜

다음의 실시예는 MPS Ⅰ의 치료를 위해 rAAV9.hIDUA 벡터로 인간 대상체를 치료하는데 사용될 수 있는 프로토콜을 제시한다.

환자 집단. 치료를 받는 환자는 다음을 갖는 남성 또는 여성을 포함할 수 있다:

● 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성에 의해 확인된 MPS I의 진단.

● 임의의 다른 신경학적 또는 정신의학적 요인들에 의해 설명될 수 없다면, 다음 중 하나로 정의된 MPS I으로 인한 초기-단계의 신경인지 부족(neurocognitive deficit):

○ IQ 테스트 또는 신경심리학적 기능의 1 영역(언어 이해력, 기억력, 주의력 또는 지각 추론력)에서 평균 아래의

1 표준 편차의 점수.

○ 순차적 테스트에서 >1 표준 편차의 감소의 문서화된 병력적 증거(의료 기록).

환자는 ERT의 안정한 양생법(예컨대, ALDURAZYME [라로니다아제] IV)을 받은 사람들을 포함할 수 있다. 잠재적인 가임기 여성은 치료 당일에 혈청 임신 테스트에서 음성이어야 한다. 성적 활동을 하는 대상체(여성 및 남성 둘 다)는 벡터 투여 후 24주까지 의학적으로 허용되는 장벽 피임법(예컨대, 콘돔, 다이어프램(diaphragm) 또는 금욕)을 사용해야 한다. 수조 내(IC) 치료에서 제외될 수 있는 환자에는 IC 주입 또는 요추 천자에 대한 금기 사항이 있는 대상체를 포함할 수 있다. IC 주입에 대한 금기 사항은 다음 중 하나를 포함할 수 있다:

● 이전의 두경부 수술의 병력, 이는 IC 주입에 대한 금기 사항을 유발한다.

● CT(또는 조영(contrast)) 또는 전신 마취에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● MRI(또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● 추정 사구체 여과율(eGFR)<30mL/분/1.73m²을 갖는다.

임의의 시간에 IT 치료를 받은 적이 있고 IT 투여와 관련하여 고려되는 유의한 이상 반응을 경험한 환자는 IC로 치료받아서는 안된다.

치료 의사가 면역 억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 병태(예컨대, 절대 호중구 갯수<1.3x10³/μL, 혈소판 갯수<100x10³/μL, 및 헤모글로빈<12g/dL[남성] 또는 <10g/dL[여성])를 갖는 환자는 치료받아서는 안된다. 대안의 면역 억제 양생법은 시롤리무스, MMF 또는 프레드니솔론에 대한 과민 반응의 임의의 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다.

피부의 편평 세포 또는 기저 세포 암종 이외의 림프종 또는 다른 암의 병력이 있는 환자는 치료 전 적어도 3개월 동안 완전 완화가 아니면 치료받아서는 안된다.

알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST)>3x정상 상한치(ULN), 또는 총 빌리루빈>1.5xULN인 환자는, 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력 및 총 빌리루빈의 <35%이 컨쥬게이트된(conjugated) 빌리루빈을 나타내는 분획화된 빌리루빈을 갖지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

감염성 질환 또는 약물 남용의 병력이 있는 환자는 치료를 위한 후보자가 아닐 수도 있다. 예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)-양성 테스트의 병력, 활동성 또는 재발성 B형 간염 또는 C형 간염의 병력, 또는 B형 간염, C형 간염 또는 HIV에 대한 양성 스크리닝 테스트; 치료 전 1년 이내에 알콜이나 약물 남용의 병력.

일 실시양태에서, 환자는 성인 환자이다. 다른 실시양태에서, 환자는 소아 환자이다.

투여되는 치료 - 면역 억제 요법으로 사전-치료.

유전자 요법에 앞서, 환자는 전이 유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역 억제 요법으로 치료받아야 한다. 이러한 면역 억제 요법은 프레드니솔론(-2 내지 8일차에 1일 1회, 경구투여, 60mg), MMF(-2 내지 60일차에 1일 2회, 경구투여, 1g) 및 시롤리무스(-2일차에 경구투여, 6mg, 이후에, -1일차부터 48주차까지 1일 1회, 2mg)을 포함한다. 시롤리무스의 용량 조절은 16 내지 24ng/mL 이내의 전혈 최저농도를 유지하도록 이루어진다. 대부분의 대상체들에서 용량 조절은 새로운 용량 = 현재 용량×(목표 농도/현재 농도)의 공식을 기반으로 할 수 있다. 대상체는 농도 모니터링과 함께 추가 투여량 조절 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량이 계속 사용되어야 한다. 호중구 감소증(절대 호중구 갯수<1.3×10³/μL)이 발생하면, MMF 투여를 중단하거나 용량을 저하시켜야 한다.

유전자 요법. hIDUA 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9 캡시드의 비-복제 재조합 AAV(rAAV9.hIDUA)가 치료에 사용된다. AAV9 혈청형은 IC 투여 후 CNS에서 hIDUA 단백질의 효율적인 발현을 가능하게 한다. 벡터 게놈은 AAV2-역 말단 반복서열(ITR)로부터 측면에 배치된 hIDUA 발현 카세트를 함유한다. 카세트로부터의 발현은 강력한 구성적 CAG 프로모터에 의해 유도된다. rAAV9.hIDUA 벡터는 척수강 내 주입을 위해 Elliotts B 용액에 현탁된다.

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 편평 용량으로 투여된다: 1.4×10¹³GC(1.1×10¹⁰GC/g 뇌질량)의 저용량 또는 7.0×10¹³GC(5.6×10¹⁰GC/g 뇌질량)의 고용량 둘 중 하나가 약 5 내지 20ml의 부피로 사용될 수 있다. 환자가 AAV에 중화 항체를 가지고 있는 경우, 고용량이 사용될 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체를 전신 마취하에 둔다. 요추 천자는 CSF 5cc를 먼저 제거한 다음 대수조의 시각화를 돕기 위해 조영 IT를 주입하도록 수행된다. (조영과 함께) CT를 이용하여, 바늘 삽입 및 rAAV9.IDUA의 선택된 용량의 투여를 후두하 공간으로 이끈다.

6.6 실시예 6: MPS I 치료의 임상 프로토콜

환자 집단. 치료를 받는 환자는 다음을 갖는 6세 이상의 남성 또는 여성을 포함할 수 있다:

● 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성에 의해 확인된 MPS I의 진단(여기에는 이전에 HSCT를 받은 적이 있을 수 있거나 라로니다아제 치료를 이전에 받은 적이 있거나 현재 받고 있는 사람들이 포함된다).

● 임의의 다른 신경학적 또는 정신의학적 요인들에 의해 설명될 수 없다면, 다음 중 하나로 정의된 MPS I으로 인한 초기-단계의 신경인지 부족:

○ IQ 테스트 또는 신경심리학적 기능의 1 영역(언어 이해력, 주의력 또는 지각 추론력)에서 평균 아래의

1 표준 편차의 점수.

○ 순차적 테스트에서 >1 표준 편차의 감소.

환자들은 필요한 프로토콜 테스트를 완료하고 해당되는 경우 테스트 당일에 보조기구를 착용하는 것을 기꺼이 준수할 수 있도록, 보조기구의 유무에 상관없이 청각 및 시각적 능력을 충분히 갖춰야 한다.

잠재적인 가임기 여성은 치료 당일에 혈청 임신 테스트에서 음성이어야 한다. 모든 성적 활동을 하는 대상체는 검진 방문으로부터 벡터 투여 후 24주까지 의학적으로 허용되는 장벽 피임법을 기꺼이 사용해야만 한다. 성적 활동을 하는 여성은 검진 방문으로부터 나중의 시롤리무스의 마지막 투여 후 12주까지 효과적인 피임법을 기꺼이 사용해야만 한다. 수조 내(IC) 치료에서 제외될 수 있는 환자에는 IC 주입 또는 요추 천자에 대한 금기 사항이 있는 대상체를 포함할 수 있다. IC 주입에 대한 금기 사항은 다음 중 하나를 포함할 수 있다:

● CT(또는 조영) 또는 전신 마취에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● MRI(또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● 추정 사구체 여과율(eGFR)<30mL/분/1.73m²을 갖는다.

임의의 시간에 IT 치료를 받은 적이 있고 IT 투여와 관련하여 고려되는 유의한 이상 반응을 경험한 환자는 IC로 치료받아서는 안된다. 치료 의사가 면역 억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 병태(예컨대, 절대 호중구 갯수<1.3x10³/μL, 혈소판 갯수<100x10³/μL, 및 헤모글로빈<12g/dL[남성] 또는 <10g/dL[여성])를 갖는 환자는 치료받아서는 안된다. 대안의 면역 억제 양생법은 시롤리무스, MMF 또는 프레드니솔론에 대한 과민 반응의 임의의 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다.

피부의 편평 세포 또는 기저 세포 암종 이외의 림프종 또는 다른 암의 병력이 있는 환자는 치료 전 3개월 이상 동안 완전 완화가 아니면 치료받아서는 안된다.

최대의 의학적 치료에도 불구하고 제어되지 않는 고혈압(수축기 BP>180mmHg, 이완기 BP>100mmHg)이 있는 환자는 치료받아서는 안된다.

알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST)>3x정상 상한치(ULN), 또는 총 빌리루빈>1.5xULN인 환자는, 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력 및 총 빌리루빈의 <35%이 컨쥬게이트된 빌리루빈을 나타내는 분획화된 빌리루빈을 갖지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

감염성 질환 또는 약물 남용의 병력이 있는 환자는 치료를 위한 후보자가 아닐 수도 있다. 예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염의 병력, 또는 B형 간염 표면 항원, B형 간염 코어 항체, C형 간염 항체 또는 HIV 항체에 대한 양성 스크리닝 테스트; 스크리닝 전 1년 이내에 알콜이나 약물 남용의 병력.

30일 또는 5회 반감기 중 더 긴 기간 이내에 임의의 임상시험용 제품을 투여받은 적이 있는 환자는, 그 이전에 임의의 시간에 투여될 수 있는 IT 라로니다아제가 투여된 환자를 제외하고 치료받아서는 안된다.

임신 중이거나, 산후 6주 미만이거나, 스크리닝시에 모유수유를 하거나, 52주차까지 임의의 시간에 임신을 계획하는 환자는 치료받아서는 안된다.

대상체의 안전을 해칠 수 있는 임상적으로 유의한 ECG 이상이 있는 환자는 치료받아서는 안된다. 대상체의 안전을 해칠 수 있는 심각하거나 불안정한 의학적 또는 심리학적 병태가 있는 환자는 치료받아서는 안된다.

투여되는 치료 - 면역 억제 요법으로 사전-치료.

유전자 요법에 앞서, 환자는 전이 유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역 억제 요법으로 치료받아야 한다. 이러한 면역 억제 요법은 프레드니솔론(-2 내지 8일차에 1일 1회, 경구투여, 60mg), MMF(-2 내지 60일차에 1일 2회, 경구투여, 1g) 및 시롤리무스(-2일차에, 경구투여, 6mg, 이후에 -1일차부터 48주차까지 1일 1회, 2mg)을 포함한다. 시롤리무스의 용량 조절은 16 내지 24ng/mL 이내의 전혈 최저농도를 유지하도록 이루어진다. 대부분의 대상체들에서 용량 조절은 새로운 용량 = 현재 용량×(목표 농도/현재 농도)의 공식을 기반으로 할 수 있다. 대상체는 농도 모니터링과 함께 추가 투여량 조절 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량이 계속되어야 한다.

면역 억제 양생법의 근본적인 원리는 면역성을 완전히 억제하기 위해 코르티코스테로이드를 투여하는 것으로, IV 메틸프레드니솔론으로 시작하여 용량을 적재하고, 이후에 경구 프레드니솔론이 점차 감소되어 환자가 12주차까지 스테로이드를 벗어나게 한다. 코르티코스테로이드 치료는 타크롤리무스(24주 동안) 및/또는 시롤리무스(12주 동안)에 의해 보충되고, MMF로 추가 보충될 수 있다. 타크롤리무스 및 시롤리무스를 둘 다를 사용하는 경우, 각각의 용량은 4 내지 8ng/ml의 혈중 최저 수준을 유지하도록 조절된 저용량이어야 한다. 오직 한 가지 약물만 사용되는 경우, 표지 용량(고용량)을 사용해야 한다; 예컨대, 12시간 마다 2개의 분할 용량으로 주어진 0.15 내지 0.20mg/kg/일의 타크롤리무스; 및 1mg/m²/일의 시롤리무스; 적재 용량은 3mg/m²이어야 한다. MMF가 양생법에 첨가되면, 작용 메커니즘이 상이하기 때문에 타크롤리무스 및/또는 시롤리무스의 용량이 유지될 수 있다.

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 편평 용량으로 투여된다: 2×10⁹GC/g 뇌질량의 용량(2.6×10¹²GC) 또는 1×10¹⁰GC/g 뇌질량의 용량(1.3×10¹³GC) 둘 중 하나. 용량은 약 5 내지 20ml의 부피일 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체를 전신 마취하에 둔다.

6.7 실시예 7: MPS I 치료의 임상 프로토콜

● 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성에 의해 확인된 MPS I의 진단(여기에는 이전이나 현재 HSCT 또는 라로니다아제 치료를 받은 적이 있을 수 있는 사람들이 포함된다).

1 표준 편차의 점수.

○ 순차적 테스트에서 >1 표준 편차의 감소.

● MRI(또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● 추정 사구체 여과율(eGFR)<30mL/분/1.73m²을 갖는다.

임의의 시간에 IT 치료를 받은 적이 있고 IT 투여와 관련하여 고려되는 유의한 이상 반응을 경험한 환자는 IC로 치료받아서는 안된다. 치료 의사가 면역 억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 병태(예컨대, 절대 호중구 갯수<1.3x10³/μL, 혈소판 갯수<100x10³/μL, 및 헤모글로빈<12g/dL[남성] 또는 <10g/dL[여성])를 갖는 환자는 치료받아서는 안된다.

대안의 면역 억제 양생법은 타크롤리무스, 시롤리무스 또는 프레드니솔론에 대한 과민 반응의 임의의 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다. 일차 면역결핍증, 비장절제술 또는 감염의 대상체가 되기 쉬운 임의의 근본적인 병태의 병력이 있는 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. 검진 전 12주 이상 동안 완전히 해결되지 않은 대상포진, 사이토메갈로바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus(EBV)) 감염이 있는 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. (1) 2차 방문 전 8주 이상 해결되지 않은 부모의 항-감염제로 치료 또는 입원치료가 필요한 임의의 감염이 있거나, (2) 2차 방문 전 10일 이내에 경구 항-감염제(항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활동성 감염 또는 활동성 결핵의 병력이 있거나, (3) 검진 동안에 퀀티페론-TB 골드(Quantiferon_TB Gold) 테스트에서 양성이거나, (4) 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 임의의 생백신을 투여받았거나, (5) 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 주요 수술이 있거나, (6) 연구 기간 동안에 주요 수술이 계획된 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. 절대 호중구 갯수가 <1.3x10³/μL인 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다.

감염성 질환 또는 약물 남용의 병력이 있는 환자는 치료를 위한 후보자가 아닐 수도 있다. 예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염의 병력, 또는 B형 간염 표면 항원, B형 간염 코어 항체, C형 간염 항체 또는 HIV 항체에 대한 양성 스크리닝 테스트; 치료 전 1년 이내에 알콜이나 약물 남용의 병력.

투여되는 치료 - 면역 억제 요법으로 사전-치료.

유전자 요법에 앞서, 환자는 전이 유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역 억제 요법으로 치료받아야 한다. 이러한 면역 억제 요법은 코르티코스테로이드(메틸프레드니솔론 1일차에 1회, 정맥 내[IV], 10mg/kg 사전투여(predose), 2일차에 경구 프레드니솔론 0.5mg/kg/일로 시작하여 점차 감소되어, 12주차까지 중단), 타크롤리무스(2일차 내지 24주차에 4 내지 8ng/mL의 목표 혈중 수준으로 경구[PO]로, 매일 2회[BID], 1mg, 및 24주차 내지 32주차의 8주동안 줄임), 및 시롤리무스(-2일차에 1mg/m²의 적재 용량으로 4시간 마다 3회 용량, 이후에 -1일차 내지 48주차의 4 내지 8ng/mL의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 시롤리무스 0.5mg/m²/일 분할 투여)를 포함한다. 신경학적 평가 및 타크롤리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링이 실시될 것이다. 시롤리무스와 타크롤리무스의 용량은 목표 범위의 혈중 수준을 유지하도록 조절될 것이다. 48주 이후에는 면역 억제 요법이 계획되지 않는다. 대부분의 대상체들에서 용량 조절은 새로운 용량 = 현재 용량×(목표 농도/현재 농도)의 공식을 기반으로 할 수 있다. 대상체는 농도 모니터링과 함께 추가 투여량 조절 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량이 계속되어야 한다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체를 전신 마취하에 둔다.

6.8 실시예 8: MPS I 치료의 임상 프로토콜

● 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성에 의해 확인된 MPS I의 진단(여기에는 이전이나 현재 HSCT 또는 라로니다아제 치료를 받은 적이 있을 수도 있는 사람들이 포함된다).

1 표준 편차의 점수.

○ 순차적 테스트에서 >1 표준 편차의 감소.

● MRI(또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● 추정 사구체 여과율(eGFR)<30mL/분/1.73m²을 갖는다.

대안의 면역 억제 양생법은 타크롤리무스, 시롤리무스 또는 프레드니솔론에 대한 과민 반응의 임의의 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다. 일차 면역결핍증, 비장절제술 또는 감염의 대상체가 되기 쉬운 임의의 근본적인 병태의 병력이 있는 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. 검진 전 12주 이상 동안 완전히 해결되지 않은 대상포진, 사이토메갈로바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스 감염이 있는 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. (1) 2차 방문 전 8주 이상 해결되지 않은 부모의 항-감염제로 치료 또는 입원치료가 필요한 임의의 감염이 있거나, (2) 2차 방문 전 10일 이내에 경구 항-감염제(항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활동성 감염 또는 활동성 결핵의 병력이 있거나, (3) 검진 동안에 퀀티페론-TB 골드(Quantiferon_TB Gold) 테스트에서 양성이거나, (4) 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 임의의 생백신을 투여받았거나, (5) 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 주요 수술이 있거나, (6) 연구 기간 동안에 주요 수술이 계획된 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. 절대 호중구 갯수가 <1.3x10³/μL인 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다.

투여되는 치료 - 면역 억제 요법으로 사전-치료.

유전자 요법에 앞서, 환자는 전이 유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역 억제 요법으로 치료받아야 한다. 이러한 면역 억제 요법은 코르티코스테로이드(메틸프레드니솔론 1일차에 1회, 정맥 내[IV], 10mg/kg 사전투여, 2일차에 경구 프레드니솔론 0.5mg/kg/일로 시작하여 점차 감소되어, 12주차까지 중단), 타크롤리무스(2일차 내지 24주차에 4 내지 8ng/mL의 목표 혈중 수준으로 경구[PO], 매일 2회[BID], 1mg, 및 24주차 내지 32주차의 8주동안 줄임), 및 시롤리무스(-2일차에 1mg/m²의 적재 용량으로 4시간 마다 3회 용량, 이후에 -1일차부터 48주차까지 4 내지 8ng/mL의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 시롤리무스 0.5mg/m²/일 분할 투여)를 포함한다. 신경학적 평가 및 타크롤리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링이 실시될 것이다. 시롤리무스와 타크롤리무스의 용량은 목표 범위의 혈중 수준을 유지하도록 조절될 것이다. 48주 이후에는 면역 억제 요법이 계획되지 않는다. 대부분의 대상체들에서 용량 조절은 새로운 용량 = 현재 용량×(목표 농도/현재 농도)의 공식을 기반으로 할 수 있다. 대상체는 농도 모니터링과 함께 추가 투여량 조절 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량이 계속되어야 한다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체를 전신 마취하에 둔다.

6.9 실시예 9: MPS I 치료의 임상 프로토콜

환자 집단. 치료를 받는 환자는 다음을 갖는 6세 이상의 남성 또는 여성, 및 3세 미만의 남성 또는 여성을 포함할 수 있다:

1 표준 편차의 점수.

○ 순차적 테스트에서 >1 표준 편차의 감소.

● 3세 미만 환자는 신경인지 감퇴와 함께 후를러 증후군을 초래하는 것으로 알려진 돌연변이(들)에 의해 확인된 중증 형태의 MPS I(후를러 증후군)를 갖는다.

● MRI(또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● 추정 사구체 여과율(eGFR)<30mL/분/1.73m²을 갖는다.

대안의 면역 억제 양생법은 타크롤리무스, 시롤리무스 또는 프레드니솔론에 대한 과민 반응의 임의의 병력이 있는 임의의 환자, 또는 제외되어야 하는 환자에게 사용되어야 한다. 일차 면역결핍증, 비장절제술 또는 감염의 대상체가 되기 쉬운 임의의 근본적인 병태의 병력이 있는 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. 검진 전 12주 이상 동안 완전히 해결되지 않은 대상포진, 사이토메갈로바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스 감염이 있는 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. (1) 2차 방문 전 8주 이상 해결되지 않은 부모의 항-감염제로 치료 또는 입원치료가 필요한 임의의 감염이 있거나, (2) 2차 방문 전 10일 이내에 경구 항-감염제(항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활동성 감염 또는 활동성 결핵의 병력이 있거나, (3) 검진 동안에 퀀티페론-TB 골드(Quantiferon_TB Gold) 테스트에서 양성이거나, (4) 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 임의의 생백신을 투여받았거나, (5) 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 주요 수술이 있거나, (6) 연구 기간 동안에 주요 수술이 계획된 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다. 절대 호중구 갯수가 <1.3x10³/μL인 환자는 면역 억제 요법으로 치료받아서는 안된다.

알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST)>3x정상 상한치(ULN), 또는 총 빌리루빈>1.5xULN인 환자는, 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력 및 총 빌리루빈의 35% 미만이 컨쥬게이트된 빌리루빈을 나타내는 분획화된 빌리루빈을 갖지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

투여되는 치료 - 면역 억제 요법으로 사전-치료.

유전자 요법에 앞서, 환자는 전이 유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역 억제 요법으로 치료받아야 한다. 6세 이상인 환자의 경우 이러한 면역 억제 요법은 코르티코스테로이드(메틸프레드니솔론 1일차에 1회, 정맥 내[IV], 10mg/kg 사전투여, 2일차에 경구 프레드니솔론 0.5mg/kg/일로 시작하여 점차 감소되어, 12주차까지 중단), 타크롤리무스(2일차 내지 24주차에 4 내지 8ng/mL의 목표 혈중 수준으로 경구[PO], 매일 2회[BID], 1mg, 및 24주차 내지 32주차의 8주동안 줄임), 및 시롤리무스(-2일차에 1mg/m²의 적재 용량으로 4시간 마다 3회 용량, 이후에 -1일차부터 48주차까지 4 내지 8ng/mL의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 시롤리무스 0.5mg/m²/일 분할 투여)를 포함한다. 3세 미만인 환자의 경우 이러한 면역 억제 요법은 코르티코스테로이드(메틸프레드니솔론 1일차에 1회, 정맥 내[IV], 10mg/kg 사전투여, 2일차에 경구 프레드니솔론 0.5mg/kg/일로 시작하여 점차 감소되어, 12주차까지 중단), 타크롤리무스(2일차 내지 24주차에 2 내지 4ng/mL의 목표 혈중 수준으로 경구[PO], 매일 2회[BID], 0.05mg, 및 24주차 내지 32주차의 8주동안 줄임), 및 시롤리무스(-2일차에 1mg/m²의 적재 용량으로 4시간 마다 3회 용량, 이후에 -1일차부터 48주차까지 1 내지 3ng/mL의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 시롤리무스 0.5mg/m²/일 분할 투여)를 포함한다. 신경학적 평가 및 타크롤리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링이 실시될 것이다. 시롤리무스와 타크롤리무스의 용량은 목표 범위의 혈중 수준을 유지하도록 조절될 것이다. 48주 이후에는 면역 억제 요법이 계획되지 않는다. 대부분의 대상체들에서 용량 조절은 새로운 용량 = 현재 용량×(목표 농도/현재 농도)의 공식을 기반으로 할 수 있다. 대상체는 농도 모니터링과 함께 추가 투여량 조절 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량이 계속되어야 한다.

6세 이상인 환자의 경우, rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 편평 용량으로 투여된다: 2×10⁹GC/g 뇌질량의 용량(2.6×10¹²GC) 또는 1×10¹⁰GC/g 뇌질량의 용량(1.3×10¹³GC) 둘 중 하나. 용량은 약 5ml 이하의 부피일 수 있다.

3세 미만인 환자의 경우, rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 편평 용량으로 투여된다: 1×10¹⁰GC/g 뇌질량의 용량(4개월 이상 9개월 미만 환자의 경우 6.0×10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만인 경우 1.0×10¹³GC; 18개월 이상 3세 미만인 경우 1.1×10¹³GC) 또는 5×10¹⁰GC/g 뇌질량의 용량(4개월 이상 9개월 미만인 경우 3.0×10¹³GC; 9개월 이상 18개월 미만인 경우 5.0×10¹³GC; 18개월 이상 3세 미만인 경우 5.5×10¹³GC) 둘 중 하나. 용량은 약 5ml 이하의 부피일 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체를 전신 마취하에 둔다.

6.10 실시예 10: MPS I 치료의 임상 프로토콜

환자 집단. 치료를 받는 환자는 다음을 갖는 3세 미만의 남성 또는 여성을 포함할 수 있다:

● MPS I-H와 양립 가능한 임상 증상 및 징후의 존재, 및/또는 중증 표현형과 독점적으로 연관된 돌연변이에 대한 동형 접합성 또는 복합 이형 접합성으로 확인된 중증 MPS I-후를러의 진단

● 지능 지수(IQ) 점수

55

수조 내(IC) 치료에서 제외될 수 있는 환자에는 IC 주입 또는 요추 천자에 대한 금기 사항이 있는 대상체를 포함할 수 있다. IC 주입에 대한 금기 사항은 다음 중 하나를 포함할 수 있다:

● MRI(또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항을 갖는다.

● 추정 사구체 여과율(eGFR)<30mL/분/1.73m²을 갖는다.

임의의 시간에 IT 치료를 받은 적이 있고 IT 투여와 관련하여 고려되는 유의한 이상 반응을 경험한 환자는 IC로 치료받아서는 안된다. 치료 의사가 면역 억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 병태(예컨대, 절대 호중구 갯수<1.3x10³/μL 및 혈소판 갯수<100x10³/μL)를 갖는 환자는 치료받아서는 안되며, 헤모글로빈은 평가될 것이다.

알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST)>3x정상 상한치(ULN), 또는 총 빌리루빈>1.5xULN인 환자는, 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력이 있지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

투여되는 치료 - 면역 억제 요법으로 사전-치료.

유전자 요법에 앞서, 환자는 전이 유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역 억제 요법으로 치료받아야 한다. 프레드니솔론 투여는 0.5mg/kg/일로 시작하여 12주차까지 점차 감소될 것이다. 타크롤리무스 용량 조절은 제1 24주차동안 2 내지 4ng/mL 이내로 전혈 최저농도를 유지하도록 이루어진다. 24주차에 용량은 대략 50%까지 감소할 것이다. 28주차에 용량은 추가로 대략 50%까지 감소할 것이다. 타크롤리무스는 32주차에 중단될 것이다. 시롤리무스 용량 조절은 1 내지 3ng/mL 이내로 전혈 최저농도를 유지하도록 이루어진다. 대부분의 대상체들에서 용량 조절은 새로운 용량 = 현재 용량×(목표 농도/현재 농도)의 공식을 기반으로 할 수 있다. 대상체는 농도 모니터링과 함께 추가 투여량 조절 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량이 계속되어야 한다.

코르티코스테로이드

벡터 투여날(1일차 사전투여)의 아침에, 환자는 30분 이상 동안 메틸프레드니솔론 10mg/kg IV(최대 500mg)를 투여받을 것이다. IP의 요추 천자 및 IC 주입 전에 메틸프레드니솔론이 투여되어야 한다. 아세트아미노펜과 항히스타민제의 예비투약은 조사자의 재량에 따라 선택적이다.

2일차에, 경구 프레드니손은 12주차까지 프레드니손을 중단하는 것을 목표로 하여 시작될 것이다. 프레드니솔론의 투여는 아래와 같을 것이다:

2일차 내지 2주차 말: 0.5 mg/kg/일

3주차 및 4주차: 0.35 mg/kg/일

5 내지 8주차: 0.2 mg/kg/일

9 내지 12주차: 0.1 mg/kg

프레드니손은 12주차 후에 중단될 것이다. 프레드니손의 정확한 용량은 그 다음으로 더 높은 임상적 실제 용량으로 조절될 수 있다.

시롤리무스

벡터 투여 전 2일(-2일차): 시롤리무스 1mg/m²의 적재 용량으로 4시간 마다 3회 용량이 투여될 것이다.

-1일차부터: 1 내지 3ng/mL의 목표 혈중 수준으로 하루에 2회로 시롤리무스 0.5mg/m²/일 분할 투여

시롤리무스는 48주차 방문 후에 중단될 것이다.

타크롤리무스

타크롤리무스는 2일차(IP 투여 다음날)에 매일 2회 0.05mg/kg의 용량으로 시작되고, 24주차 동안 2 내지 4ng/mL의 혈중 수준을 달성하기 위해 조절될 것이다.

24주차 방문에서부터, 타크롤리무스는 8주 동안 줄여질 것이다. 24주차에 용량은 대략 50%까지 감소할 것이다. 28주차에 용량은 추가로 대략 50%까지 감소할 것이다. 타크롤리무스는 32주차에 중단될 것이다.

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 편평 용량으로 투여된다: 1×10¹⁰GC/g 뇌질량의 용량(4개월 이상 9개월 미만 환자의 경우 6.0×10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만인 경우 1.0×10¹³GC; 18개월 이상 3세 미만인 경우 1.1×10¹³GC) 또는 5×10¹⁰GC/g 뇌질량의 용량(4개월 이상 9개월 미만인 경우 3.0×10¹³GC; 9개월 이상 18개월 미만인 경우 5.0×10¹³GC; 18개월 이상 3세 미만인 경우 5.5×10¹³GC) 둘 중 하나. 용량은 약 5 내지 20ml의 부피일 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체를 전신 마취하에 둔다.

등가물

본 발명은 이의 특정 실시양태를 참고하여 상세하게 기술되었지만, 기능적으로 균등한 변형은 본 발명의 범주 내에 있다는 것이 이해될 것이다. 사실상, 본원에 도시되고 기술된 것 외에도, 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식할 수 있거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 그 전체가 본원에 참고로 원용되도록 지시된 것과 같이, 동일한 범위로 본 명세서에 참고로 원용된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO INC. <120> TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSIS I WITH FULLY-HUMAN GLYCOSYLATED HUMAN alpha-L-IDURONIDASE (IDUA) <130> 12656-106-228 <140> TBA <141> On even date wherewith <150> 62/452,769 <151> 2017-01-31 <150> 62/485,655 <151> 2017-04-14 <150> 62/529,366 <151> 2017-07-06 <150> 62/579,690 <151> 2017-10-31 <150> 62/616,234 <151> 2018-01-11 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 653 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IDS <400> 1 Met Arg Pro Leu Arg Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu Val 20 25 30 His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg 35 40 45 Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr 50 55 60 Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val 65 70 75 80 Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His Trp Leu Leu Glu Leu 85 90 95 Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr 100 105 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Gln Thr Gln Val Val Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asn Pro Pro Glu Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Phe Glu Lys Gln Thr Gly Val Asp Phe Ala Val Asp Ser Gln Gly 705 710 715 720 Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn 725 730 735 Leu <210> 23 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV8 <400> 23 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly 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Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Gly Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp 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Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly 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710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims

뮤코다당증 1형(mucopolysaccharidosis I, MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제(IDUA)의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 것을 포함하는, 방법.
MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경교세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 것을 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
MPS I으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 α2,6-시알릴화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및
인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및
인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및
인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에, 티로신-설페이트화를 함유하는 인간 IDUA의 치료적 유효량을 전달하는 것; 및
인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 α2,6-시알릴화되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌에 인간 IDUA를 코딩하는 발현 벡터를 투여하되, 상기 IDUA가 인간, 불멸성 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 티로신-설페이트화되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포(depot)가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하는, 방법.
제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 억제 요법이, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, (b) 라파마이신 및 미코페놀산, 또는 (c) 타크롤리무스, 라파마이신 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론을 병용 투여하고, 그 후에 지속하는 것을 포함하는, 방법.
제16항에 있어서,
면역 억제 요법이 180일 후에 중단되는, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 IDUA가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서,
면역 억제 요법이, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, (b) 라파마이신 및 미코페놀산, 또는 (c) 타크롤리무스, 라파마이신 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론을 병용 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제19항에 있어서,
면역 억제 요법이 180일 후에 중단되는, 방법.
제12항에 있어서,
α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.
제13항에 있어서,
검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.
제14항에 있어서,
검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.
제15항에 있어서,
티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA의 생성이, 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인되는, 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
생성이 만노오스-6-포스페이트의 존재 및 부재하에서 확인되는, 방법.
제8항 내지 제15항 및 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항, 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항을 직접적으로 또는 간접적으로 인용하는 경우 제16항 또는 제17항에 있어서, 발현 벡터 또는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 신호 펩티드를 코딩하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하되;
상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 상기 α2,6-시알릴화 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하되;
상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하되;
상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.
뮤코다당증 1형(MPS I)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 인간 IDUA를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 투여하여, 티로신-설페이트화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되는 것; 및
발현 벡터의 투여 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 지속하는 것
을 포함하되;
상기 재조합 벡터가, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 티로신-설페이트화된 상기 IDUA의 생성을 유발하는, 방법.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 억제 요법이, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에 (a) 타크롤리무스 및 미코페놀산, (b) 라파마이신 및 미코페놀산, 또는 (c) 타크롤리무스, 라파마이신 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론을 병용 투여하고, 그 후에 지속하는 것을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서,
면역 억제 요법이 180일 후에 중단되는, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 대상체가 3세 미만인, 방법.
제8항 내지 제15항 및 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항, 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항을 직접적으로 또는 간접적으로 인용하는 경우 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 대상체가 3세 미만이고, 발현 벡터 또는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 1×10¹⁰GC/g 뇌 질량 또는 5×10¹⁰GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여되는, 방법.
제8항 내지 제15항 및 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항, 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항을 직접적으로 또는 간접적으로 인용하는 경우 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 대상체가 3세 미만이고, 발현 벡터 또는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 1×10¹⁰GC/g 뇌 질량 내지 5×10¹⁰GC/g 뇌 질량 범위의 용량으로 투여되는, 방법.