DE69928563T2 - Abgeben von neurotropischen Wirkstoffen an das Zentralnervensystem - Google Patents

Abgeben von neurotropischen Wirkstoffen an das Zentralnervensystem Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, in der Herstellung eines Medikaments zum Abgeben eines neurotropischen Wirkstoffs an das Zentralnervensystem über die Nasenhöhle verwendet zu werden. Ein solches Medikament kann bei der Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems und/oder des Hirns nützlich sein.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Zentralnervensystem (ZNS) schließt mehrere Gewebe und Organe, wie das Hirn, das Stammhirn und das Rückenmark, ein. Jedes dieser Organe und Gewebe ist aus einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen und subzellulären Strukturen, z.B. Neuronen, Gliazellen, Dendriten, Axonen, Myelin und verschiedenen Membranen, aufgebaut. Das ZNS ist von der äußeren Welt durch mehrere Membranen abgetrennt, die diese Organe, Gewebe, Zellen und Strukturen sowohl abfedern bzw. polstern (cushion) als auch schützen. Z.B. die Membranen, die die Blut-Hirn-Schranke bilden, schützen das Hirn vor bestimmten Inhaltsstoffen des Blutes. Die Blut-Liquor-Schranke schützt das ZNS vor vielen Chemikalien und Mikroben.
  • Der Zugang für manche Substanzen in das ZNS wird durch spezialisierte aktive Transportsysteme oder durch passive Diffusion durch die schützende Membran in das ZNS bereitgestellt. Die gegenwärtigen Verfahren zum Abgeben gewünschter therapeutischer Wirkstoffe an das ZNS sind typischerweise invasiv. Z.B. kann eine in den Schädel implantierte Pumpe (eine intracerebroventrikuläre Pumpe) effizient eine Vielzahl von nützlichen Substanzen an das Hirn abgeben. Jedoch erfordert das Implantieren einer solchen Pumpe Hirnchirurgie, die eine Vielzahl von ernsten Komplikationen nach sich ziehen kann. Bestimmte Substanzen (z.B. epidurale Schmerzmittel) können direkt durch die schützende Membran in das ZNS injiziert werden. Eine solche Injektion ist jedoch für die meisten Medikationen nicht praktikabel. Bessere Verfahren zum Verabreichen der gewünschten Wirkstoffe an das ZNS, das Hirn und/oder das Rückenmark werden benötigt.
  • WO 91/07947 offenbart ein Verfahren zum Transportieren von therapeutischen neurologischen und/oder diagnostisch-neurologischen Mitteln an das Hirn über den Riechnerv und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung und Diagnose von Hirnstörungen nützlich ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines neurotropischen Wirkstoffs oder einer biologisch aktiven Variante davon bei der Herstellung eines Medikaments zum Abgeben einer therapeutisch wirksamen Menge des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon an das Zentralnervensystem eines Säugers über eine Nasenhöhle, wobei das Medikament eine Einzeldosis von 0,1 nmol bis 1000 nmol des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon umfasst, wobei eine Verabreichung des Medikaments an die Nasenhöhle des Säugers für einen Transport des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon an das Zentralnervensystem des Säugers in einer Menge sorgt, die eine schützende oder therapeutische Wirkung auf eine Zelle des Zentralnervensystems liefert, wobei der neurotropische Wirkstoff aus der Gruppe, bestehend aus insulinartigem Wachstumsfaktor (IGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), ausgewählt ist und die biologische Variante davon wenigstens 70% Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz für den neurotropischen Wirkstoff hat und wobei die biologisch aktive Variante von IGF eine biologisch aktive Variante des insulinartigen Wachstumsfaktors I (IGF-I) ist.
  • Die vorliegende Erfindung kann bei der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des neurotropischen Wirkstoffs an die Nasenhöhle der Person, vorzugsweise an das obere Drittel der Nasenhöhle, verwendet werden. Der neurotropische Wirkstoff kann dann durch die Mucosa oder das Epithel absorbiert werden und zu dem Zentralnervensystem des Säugers transportiert werden, vorzugsweise ohne die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die therapeutische Dosis des neurotropischen Wirkstoffs in einer Weise verabreicht werden, dass der neurotropische Wirkstoff durch das Gewebe absorbiert wird und über einen neuralen Weg (neural pathway) in einer wirksamen Menge in das Zentralnervensystem des Säugers transportiert wird, um eine schützende oder therapeutische Wirkung auf eine Zelle des Zentralnervensystems zu liefern.
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um für eine Verabreichung auf diesen Wegen unter Verwendung einer Zusammensetzung zu sorgen, die einen Träger einschließt, der eine Absorption des neurotropischen Wirkstoffs, einen Transport des neurotropischen Wirkstoffs über einen neuralen Weg (neural pathway) und/oder den Transport des neurotropischen Wirkstoffs zum Zentralnervensystem, zum Hirn und/oder Rückenmark ermöglicht. Bevorzugte Zusammensetzungen schließen eine oder mehrere eines löslichkeitsverbessernden Zusatzstoffs, eines hydrophilen Zusatzstoffs, eines absorptionsfördernden Zusatzstoffs, eines kationischen Tensids, eines viskositätserhöhenden Zusatzstoffs, einer Matrix oder Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, eines Lipid-basierten Trägers, vorzugsweise einer mizellären oder liposomalen Zusammensetzung, eines Doppelschicht-destabilisierenden Zusatzstoffes oder eines fusogenen (fusogenic) Zusatzstoffs ein.
  • Neurotropische Wirkstoffe, die in der Erfindung verwendet werden können, sind der Fibroblastenwachstumsfaktor, insbesondere der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), der insulinartige Wachstumsfaktor, insbesondere der insulinartige Wachstumsfaktor I (IGF-I), und der Nervenwachstumsfaktor (NGF).
  • Kurze Beschreibung der Figur
  • 1 veranschaulicht ein lineares Verhältnis zwischen der NGF-Konzentration in dem Bulbus olfactorius und den über nasale Verabreichung gegebenen Dosen.
  • 2 veranschaulicht ein lineares Verhältnis zwischen der NGF-Konzentration in der Dura-Membran (dura membrane) des Bulbus olfactorius und den über nasale Verabreichung gegebenen Dosen.
  • 3 veranschaulicht ein lineares Verhältnis zwischen der NGF-Konzentration im Riechepithel und den über nasale Verabreichung gegebenen Dosen.
  • 4 veranschaulicht ein lineares Verhältnis zwischen der NGF-Konzentration im Halsrückenmark und den über nasale Verabreichung gegebenen Dosen.
  • 5 veranschaulicht ein lineares Verhältnis zwischen der NGF-Konzentration in den tiefen Halslymphknoten und den über nasale Verabreichung gegebenen Dosen.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Verabreichungswege
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um den Wirkstoff an Gewebe, das durch Trigeminusnerven und Riechnerven innerviert ist, und in der Nasenhöhle und/oder den Nebenhöhlen zu verabreichen. Solche Nervensysteme können eine direkte Verbindung zwischen der äußeren Umgebung und dem Hirn bereitstellen und somit eine vorteilhafte Abgabe eines neurotropischen Wirkstoffs an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark bereitstellen.
  • Der Riechnerv
  • Die Erfindung kann zur Verabreichung eines Wirkstoffs an Gewebe, das durch Riechnerven innerviert ist, und in der Nasenhöhle verwendet werden. Vorzugsweise wird der Wirkstoff an die Area olfactoria bzw. den Bereich des Geruchssinns (olfactory area) im oberen Drittel der Nasenhöhle, und insbesondere an das Riechepithel, abgegeben.
  • Fasern des Riechnervs sind amyeline Axone der Geruchsrezeptorzellen, die im oberen Drittel der Nasenschleimhaut lokalisiert sind. Die Geruchsrezeptorzellen sind bipolare Neuronen mit Schwellungen, die von Haar-ähnlichen Cilia bedeckt sind, welche in die Nasenhöhle ragen. Am anderen Ende sammeln sich die Axone aus diesen Zellen in Aggregaten und treten am Nasendach (roof of the nose) in die Schädelhöhle ein. Umgeben von einem dünnen Schlauch aus weicher Hirnhaut (pia), durchqueren die Riechnerven den Subarachnoidraum, der den Liquor (CSF) enthält, und treten in die unteren Seiten der Bulbi olfactori ein. Sobald der Wirkstoff in die Nasenhöhle abgegeben ist, kann der Wirkstoff einen Transport durch die Nasenschleimhaut und in den Bulbus olfactorius, und damit verbundene Bereiche des Gehirns, wie der Formatio hippocampi, den Amygdalen, dem Nucleus basali Meynert, dem Locus ceruleus, dem Stammhirn und dergleichen, erfahren.
  • Der Trigeminusnerv
  • Die Erfindung kann auch zur Verabreichung eines Wirkstoffs an Gewebe, das durch den Trigeminus innerviert wird, und in der Nasenhöhle verwendet werden. Innerhalb der Nasenhöhle innerviert der Trigeminus hauptsächlich die unteren Zweidrittel der Nasenschleimhaut. Der Trigeminus hat drei Hauptäste, den Augennerv, den Maxillarnerv und den Mandibularnerv. Die Erfindung kann verwendet werden, um den Wirkstoff an das Gewebe innerhalb der Nasenhöhle, das von einem oder mehreren dieser Äste innerviert ist, zu verabreichen.
  • Der Augennerv und seine Äste
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um den Wirkstoff an das Gewebe innerhalb der Nasenhöhle und/oder der Nebenhöhlen, das durch den Augennervast des Trigeminus innerviert ist, zu verabreichen. Der Augennerv hat drei Äste, die als der Nasen-Augennerv, der Stirnnerv und der Tränennerv bzw. Nervus lacrimalis bekannt sind. Der Nervus ethmoidalus anterior, ein Ast des Nasen-Augennervs, innerviert, zwischen anderen Geweben, auch die Siebbeinhöhle und Bereiche der unteren Zweidrittel der Nasenschleimhaut, einschließlich des vorderen Teils der Nasenscheidewand und der seitlichen Wand der Nasenhöhle. Vorzugsweise kann die Erfindung verwendet werden, um den Wirkstoff an das Gewebe, das durch den Nervus ethmoidalus anterior innerviert wird, zu verabreichen.
  • Der Maxillarnerv und seine Äste
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um den Wirkstoff an das Gewebe innerhalb der Nasenhöhle und/oder der Nebenhöhlen, das durch den Maxillarnerv des Trigeminus innerviert wird, zu verabreichen. Der Maxillarnerv hat mehrere Äste, die die Nasenhöhle und die Nebenhöhlen innervieren, einschließlich des Nervus palatinus, des Nervus palatinus major, der hinteren Nervi alveolaris superiores, des mittleren Nervus alveolaris superior und des inneren Nervus alveolaris superior. Die Kieferhöhle wird durch die hinteren, mittleren und vorderen Nervi alveolaris superiores innerviert. Die Schleimhaut der Nasenscheidewand ist hauptsächlich mit dem Nervus palatinus versehen, und die seitliche Wand der Nasenhöhle ist mit dem Nervus palatinus major versehen. Vorzugsweise kann die Erfindung verwendet werden, um den Wirkstoff an das Gewebe, das durch den Nervus palatinus und/oder den Nervus palatinus major innerviert ist, zu verabreichen.
  • Neurotropische Wirkstoffe für die Abgabe an das Zentralnervensystem
  • Eine Vielzahl von verschiedenen neurotropischen Wirkstoffen kann an das ZNS unter Verwendung der Erfindung verabreicht werden. Im Allgemeinen kann die Erfindung verwendet werden, um einen neurotropischen Wirkstoff zu verabreichen, der zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit oder Störung, die das ZNS, das Hirn und/oder das Rückenmark beeinflusst, eingesetzt werden kann, der das Wachstum, die Regeneration oder das Überleben einer Zelle oder eines Gewebes im ZNS, Hirn und/oder Rückenmark fördern kann, oder dergleichen. Wie hierin verwendet, bezieht sich "neurotropischer Wirkstoff' auf Proteine, wie Wachstumsfaktoren, Neurotrophine, neurotrophe Faktoren und dergleichen, die diese Wirksamkeit bzw. Aktivitäten haben.
  • Insbesondere schließt der neurotropische Wirkstoff den Nervenwachstumsfaktor (NGF), die Neurotrophine 3, 4 und/oder 5 (NT-3, NT-4 und/oder NT-5), den vom Hirn stammenden neurotropen Faktor (brain-derived neurotrophic factor) (BDNF), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs, z.B. den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor), Insulin, insulinartige Wachstums faktoren (IGFs, z.B. IGF-I und/oder IGF-II), den ziliarneurotropen Faktor (ciliary neurotrophic factor) (CNTF), den Glia-abgeleiteten neurotropen Faktor (glia-derived neurotrophic factor) (GDNF), Glia-abgeleitetes Nexin (glia-derived nexin), den Aktivitäts-abhängigen neurotropen Faktor und Kombinationen davon ein.
  • Bestimmte neurotropische Wirkstoffe werden nicht oder nur schlecht über die Blut-Hirn-Schranke transportiert. Für solche Wirkstoffe wird eine wirksame Menge des neurotropischen Wirkstoffs nicht leicht, und möglicherweise niemals, die Blut-Hirn-Schranke überschreiten. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um solche neurotropischen Wirkstoffe effektiv an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark abzugeben.
  • Die Verabreichung von neurotropischen Wirkstoffen unter Verwendung der Erfindung kann den neurotropischen Wirkstoff effektiver an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark abgeben, die Menge des neurotropischen Wirkstoffs, die außerhalb des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks verabreicht wird, verringern und vorzugsweise die unerwünschten systemischen Wirkungen des neurotropischen Wirkstoffs verringern. Eine effektivere oder effiziente Abgabe des neurotropischen Wirkstoffs an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark kann die Gesamtdosis des verabreichten neurotropischen Wirkstoffs verringern. Alternativ kann eine solche effektive Abgabe des neurotropischen Wirkstoffs die Menge des neurotropischen Wirkstoffs, die unerwünschte Ziele innerhalb der Person, aber außerhalb des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks, erreicht, verringern. Diese effektivere Abgabe resultiert in einer geringeren Menge eines solchen neurotropischen Wirkstoffs an Orten innerhalb der Person, an denen er unerwünschte Wirkungen haben kann.
  • IGF-I
  • Der Begriff "IGF-I", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den insulinartigen Wachstumsfaktor I (IGF-I), ein einkettiges Peptid mit 70 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 7.600 Dalton. Der insulinartige Wachstumsfaktor I stimuliert die Mitose und Wachstumsprozesse, die mit der Zellentwicklung verbunden sind.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Erhöhen der IGF-I-Menge bis zu einem therapeutisch wirksamen Level über eine Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, einschließlich einer therapeutisch wirksamen Dosis, erreicht. Das IGF-I, das verabreicht werden soll, kann von jeder Tierspezies, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Nager, Vogel, Hund, Rind, Schwein, Pferd, und vorzugsweise Mensch, stammen. Vorzugsweise stammt das IGF-I von einer Säugerspezies, und stärker bevorzugt von einem Säuger derselben Spezies wie der Säuger, der sich der Behandlung unterzieht.
  • Biologisch aktive Varianten von IGF-I sind auch durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. Solche Varianten sollten die IGF-I-Wirksamkeiten bzw. -Aktivitäten beibehalten, insbesondere die Fähigkeit, an IGF-I-Rezeptorstellen zu binden. Die IGF-I-Wirksamkeit bzw. -Aktivität kann unter Verwendung von Standard-IGF-I-Bioassays gemessen werden. Maßgebliche Assays schließen die bekannten Radiorezeptor-Assays unter Verwendung von Plazentamembranen (siehe z.B. US-Patent Nr. 5 324 639, Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39:973–976; und Marshall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39:283–292) ein, einen Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls misst, den Einbau von Tritiummarkiertem Thymidin in einer Dosis-abhängigen Weise in die DNA von BALB/c 3T3-Fibroblasten zu verstärken (siehe z.B. Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262:5616–5621). Vorzugsweise hat die Variante mindestens die gleiche Aktivität wie das native Molekül.
  • Geeignete biologisch aktive Varianten können IGF-I-Fragmente, Analoga und Derivate sein. Mit "IGF-I-Fragment" ist ein Protein gemeint, das nur aus einem Teil der intakten IGF-I-Sequenz und -Struktur besteht, und es kann eine C-terminale Deletion oder N-terminale Deletion von IGF-I sein. Mit "Analogon" ist ein Analogon entweder von IGF-I oder einem IGF-I-Fragment gemeint, die eine native IGF-I-Sequenz und -Struktur mit einer oder mehreren Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen einschließen. Peptide mit einem oder mehreren Peptoiden (Peptidomimetika) (peptide mimics) werden ebenfalls durch den Begriff Analogon umfasst (siehe z.B. internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/04282). Mit "Derivat" ist jegliche geeignete Modifikation von IGF-I, IGF-I-Fragmenten oder ihrer entsprechenden Analoga gemeint, wie Glykosylierung, Phosphorylierung oder eine andere Hinzufügung fremder Gruppierungen, solange die IGF-I-Wirksamkeit bzw. -Aktivität erhalten bleibt. Verfahren zum Herstellen von IGF-I-Fragmenten, -Analoga und -Derivaten sind im Stand der Technik verfügbar. Siehe dazu allgemein die US-Patente mit den Nummern 4 738 921, 5 158 875 und 5 077 276; die internationalen Veröffentlichungen mit den Nummern WO 85/00831, WO 92/04363, WO 87/01038 und WO 89/05822; und die europäischen Patente mit den Nummern EP 135094 , EP 123228 und EP 128733 .
  • IGF-I-Varianten werden mindestens 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 85%, noch stärker bevorzugt 90 bis 95% oder mehr, und am stärksten bevorzugt 98% oder mehr, Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz des Referenz-IGF-I-Moleküls haben. Eine Variante kann sich z.B. durch so wenige wie 1 bis 10 Aminosäurereste, wie 6–10, so weinige wie 5, so wenige wie 4, 3, 2 oder sogar 1 Aminosäurerest unterscheiden.
  • Mit "Sequenz-Identität" ist gemeint, dass die gleichen Aminosäurereste in der Sequenz der Variante und einer Vergleichssequenz gefunden werden, wenn ein spezifisches zusammenhängendes Segment der Aminosäuresequenz der Variante vergleichend angeordnet und mit der Aminosäuresequenz der Vergleichssequenz verglichen wird. Verfahren zur vergleichenden Anordnung von Sequenzen und zur Bestimmung der Identität zwischen Sequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe z.B. Ausubel et al., Hrsg. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York); und das ALIGN-Programm (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Eine Anzahl von Algorithmen sind für das vergleichende Anordnen von Sequenzen und das Bestimmen der Sequenz-Identität verfügbar und schließen z.B. den Homologie-Anordnungs-Algorithmus (homology alignment algorithm) von Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443; den lokalen Homologie-Algorithmus (local homology algorithm) von Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; das Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren (search for similarity method) von Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444; den Smith-Waterman-Algorithmus (Meth. Mol. Biol. 70:173–187 (1997); und BLASTP-, BLASTN- und BLASTX-Algorithmus (siehe Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410) ein.
  • Computerisierte Programme, die diese Algorithmen verwenden, sind ebenfalls verfügbar und schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA, die in dem Genetics Computing Group (GCG)-Paket, Version 8, Madison, Wisconsin, USA, erhältlich sind; und CLUSTAL in dem PC/Gene-Programm von Intelligenetics, Mountain View, Californien. Vorzugsweise wird die Sequenz-Identität unter Verwendung der durch das Programm bestimmten voreingestellten Parameter bestimmt.
  • Hinsichtlich der optimalen vergleichenden Anordnung zweier Aminosäuresequenzen kann das zusammenhängende Segment der Aminosäuresequenz der Variante zusätzliche Aminosäurereste oder deletierte Aminosäurereste hinsichtlich der Vergleichs-Aminosäuresequenz haben. Das zusammenhängende Segment, das für den Vergleich mit der Vergleichs-Aminosäuresequenz verwendet wird, wird mindestens 20 zusammenhängende Aminosäurereste einschließen und kann 30, 40, 50 oder mehr Aminosäurereste sein. Korrekturen für eine erhöhte Sequenz-Identität, die mit dem Einschluss von Lücken (gaps) in die Aminosäuresequenz der Variante verbunden sind, können durch Festsetzen von Lückenstrafen (gap penalties) gemacht werden.
  • Wenn der Prozentsatz der Amionsäuresequenz-Identität betrachtet wird, können sich manche Aminosäurerest-Positionen als ein Ergebnis von konservativen Aminosäure-Substitutionen unterscheiden, die die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinflussen. In diesen Fällen kann die prozentuale Sequenz-Identität nach oben angepasst werden, um die Ähnlichkeit bei den konservativ substituierten Aminosäuren zu berücksichtigen. Solche Anpassungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe z.B. Meyers & Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11–17.
  • Der Stand der Technik stellt eine wesentliche Anleitung bezüglich der Herstellung und Verwendung solcher IGF-I-Varianten bereit, wie weiter unten diskutiert wird. Ein Fragment von IGF-I wird allgemein mindestens etwa 10 zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls in ganzer Länge einschließen, vorzugsweise etwa 15–25 zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls in ganzer Länge, und am stärksten bevorzugt etwa 20–50 oder mehr zusammenhängende Aminosäurereste des IGF-I in ganzer Länge.
  • Mehrere IGF-I-Analoga und -Fragmente sind in dem Stand der Technik bekannt und schließen diejenigen ein, die z.B. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4904–4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987) 398–404; J. Biol. Chem. 263 (1988) 6233–6239; Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 766–771; Fosbert et al. (1990) Biochem. J. 271:357–363; den US-Patenten mit den Nummern 4 876 242 und 5 077 276; und den internationalen Veröffentlichungen mit den Nummern WO 87/01038 und WO 89/05822 beschrieben sind. Repräsentative Analoga schließen eines mit einer Deletion von Glu-3 des reifen Moleküls, Analoga, die um bis zu 5 Aminosäuren am End-Terminus verkürzt sind, ein Analogon mit einer Verkürzung um die ersten 3 N-terminalen Aminosäuren (bezeichnet als des(1-3)-IGF-I, des-IGF-I, tIGF-I oder Hirn-IGF) und ein Analogon, das die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette von Humaninsulin anstelle der ersten 16 Aminosäuren von Human-IGF-I einschließt, ein.
  • Das in der vorliegenden Erfindung verwendete IGF-I kann in seinen im Wesentlichen aufgereinigten, nativen, rekombinant hergestellten oder chemisch synthetisierten Formen vorliegen. IGF-I kann aus Serum oder Plasma isoliert und aufgereinigt werden (siehe Phillips (1980) New Eng. J. Med. 302: 371–380, und das europäische Patent Nr. EP 123 228 ). IGF-I kann auch chemisch mittels des Festphasenverfahrens synthetisiert werden (siehe Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216–2220).
  • Gentechnologie mittels rekombinanter DNA-Techniken kann der effizienteste Weg zum Herstellen von IGF-I sein. Die Human-DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, ist bekannt und kann in Wirtszellen zur Expression eingeführt werden. IGF-I kann durch rekombinante DNA-Techniken in E. coli-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen hergestellt werden. Ausgeschiedenes IGF-I kann hergestellt werden, indem eine Signalsequenz an die DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, angefügt wird. Zusätzlich kann die DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, verändert werden, um IGF-I-Fragmente, -Analoga oder -Derivate herzustellen. Solche rekombinante DNA-Techniken sind im Stand der Technik allgemein verfügbar. Siehe z.B. die internationale Veröffentlichung mit der Nr. WO 96/07424, in der rekombinantes Human-IGF-I-Protein in Hefe produziert wird. IGF-I kann auch rekombinant in dem Hefestamm Pichia pastoris hergestellt werden und im Wesentlichen wie in den US-Patenten mit den Nummern 5 324 639, 5 324 660 und 5 650 496 und der internationalen Veröffentlichung mit der Nr. WO 96/40776 beschrieben, aufgereinigt werden.
  • FGF
  • Mit dem Begriff "FGF", wie er hierin verwendet wird, ist ein Fibroblastenwachstumsfaktor-Protein gemeint, wie FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-8, FGF-9 oder FGF-98, oder ein biologisch aktives Fragment oder Mutein davon. Typischerweise ist das FGF Human (h)-FGF-1, Rinder (b)-FGF-1, hFGF-2, bFGF-2, hFGF-4 oder hFGF-5. In einer alternativen Ausführungsform ist der aktive Wirkstoff in der Einzeldosis hFGF-6, hFGF-8, hFGF-9 oder hFGF-98. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Erhöhen der Menge von FGF bis zu einem therapeutisch wirksamen Level über Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Dosis einschließt, erreicht. Das FGF, das verabreicht werden soll, kann von jeglicher Tierspezies stammen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Nager, Vogel, Hund, Rind, Schwein, Pferd, und vorzugsweise Mensch. Vorzugs weise stammt das FGF von einer Säugerspezies, und stärker bevorzugt stammt es von einem Säuger derselben Spezies wie der Säuger, der sich der Behandlung unterzieht.
  • Die Aminosäuresequenzen und das Verfahren zur Herstellung vieler der FGFs, die in einer Einzeldosis oder pharmazeutischen Zusammensetzung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eingesetzt werden, sind im Stand der Technik gut bekannt. Insbesondere Literaturverweise, die die Aminosäuresequenz und die rekombinante Expression von FGF 1-9 und FGF-98 offenbaren, werden nachfolgend unten diskutiert.
  • FGF-1:
  • Die Aminosäuresequenz von hFGF-1 und ein Verfahren zu seiner rekombinanten Expression werden in dem US-Patent Nr. 5 604 293 (Fiddes) mit dem Titel "Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor", erteilt am 18. Februar 1997, offenbart. Siehe 2d des '293-Patents. Die Aminosäuresequenz von bFGF-1 ist in dem US-Patent 5 604 293 (Fiddes) in 1b offenbart, wie auch ein Verfahren zu seiner Expression. Die reifen Formen von sowohl hFGF-1 als auch bFGF-1 haben 140 Aminosäurereste. bFGF-1 unterscheidet sich von hFGF-1 an 19 Restpositionen: 5 Pro statt Leu, 21 His statt Tyr, 31 Tyr statt Val, 35 Arg statt Lys, 40 Gin statt Gly, 45 Gin statt Phe, 47 Ser statt Cys, 51 Tyr statt Ile, 54 Tyr statt Val, 64 Tyr statt Phe, 80 Asn statt Asp, 106 Asn statt His, 109 Tyr statt Val, 116 Ser statt Arg, 117 Cys statt Ser, 119 Arg statt Leu, 120 Gly statt Glu, 125 Tyr statt Phe und 137 Tyr statt Val. In den meisten Fällen sind die Unterschiede konserviert. Weiterhin tauschen die Unterschiede in den Positionen der Reste 116 und 119 lediglich die Position des Arg aus.
  • FGF-2:
  • Die Aminosäuresequenz von Human-FGF-2 (hFGF-2) und Verfahren zu seiner rekombinanten Expression werden in dem US-Patent 5 439 818 (Fiddes) mit dem Titel "DNA Encoding Human Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor", erteilt am 8. August 1995 (siehe 4 darin), offenbart. Die Aminosäuresequenz von Rinder-FGF-2 (bFGF-2) und verschiedene Verfahren zu seiner rekombinanten Expression werden in dem US-Patent 5 155 214 mit dem Titel "Basic Fibroblast Growth Factor", erteilt am 13. Oktober 1992, offenbart. Wenn die 146-Rest-Formen von hFGF-2 und bFGF-2 verglichen werden, sind ihre Aminosäuresequenzen nahezu identisch mit nur zwei Resten, die sich unterscheiden. Insbesondere im Übergang von hFGF-2 zu bFGF-2 treten die einzigen Unterschiede an den Positionen der Reste 112(Thr zu Ser) und 128(Ser zu Pro) auf.
  • FGF-3:
  • FGF-3 wurde zuerst als ein Expressionsprodukt eines Mäuse-int-2-Brusttumors (mouse int-2 mammary tumor) identifiziert, und seine Aminosäuresequenz ist in Dickson et al., "Potential Oncogene Product Related to Growth Factors", Nature 326:833 (30. April 1987), offenbart. FGF-3, der 243 Reste hat, wenn das N-terminale Met ausgeschlossen wird, ist wesentlich länger als sowohl FGF-2 (human und Rind) als auch FGF-2 (human und Rind). Ein Vergleich der Aminosäurereste für mFGF-3 im Vergleich zu bFGF-1 und bFGF-2 wird in einer überlappenden Weise in Dickson et al. (1987) vorgestellt. Wenn die Aminosäuresequenz von mFGF-3 mit bFGF-1 und bFGF-2 verglichen wird, hat FGF-3 5 Orte, die Resteinfügungen bezüglich sowohl FGF-1 als auch FGF-2 enthalten. Die bedeutendste dieser Einfü gungen ist eine 12- und eine 14-Resteinfügung bezüglich FGF-2 bzw. FGF-1, beginnend an der Position von Rest 135 von FGF-3. Unter Berücksichtigung der Einfügungen offenbart Dickson, dass der mFGF-3 53 Restidentitäten bezüglich FGF-1 und 69 Restidentitäten bezüglich FGF-2 hat. Zusätzlich enthält FGF-3 eine hydrophobe N-terminale Verlängerung von 10 Resten bezüglich des N-Terminus der Signalsequenz von sowohl FGF-1 als auch FGF-2. Bezüglich des C-Terminus von bFGF-1 und bFGF-2 enthält mFGF-3 eine Verlängerung um näherungsweise 60 Reste. Es ist unwahrscheinlich, dass die C-terminale Verlängerung von mFGF-3 für die Aktivität bzw. Wirksamkeit erforderlich ist. Wahrscheinlicher ist sie ein Vermittler (moderator) der Aktivität bzw. Wirksamkeit, indem sie die Rezeptorspezifität auf das FGF überträgt.
  • FGF-4:
  • Die Aminosäuresequenz für das hst-Protein, nun als hFGF-4 bekannt, wurde zuerst durch Yoshida et al., "Genomic Sequence of hst, a Transforming Gene Enclosing a Protein Homologous to Fibroblast Growth Factors and the int-2 Enclosed Protein", PHAS USA, 84:7305–7309 (Okt. 1987), in 3 offenbart. Einschließlich seiner Leitsequenz hat hFGF-4 206 Aminosäurereste. Wenn die Aminosäuresequenzen von hFGF-4, hFGF-1, hFGF-2 und mFGF-3 verglichen werden, haben die Reste 72–204 von hFGF-4 43% Homologie mit hFGF-2; die Reste 79–204 haben 38% Homologie mit hFGF-1; und die Reste 72–174 haben 40% Homologie mit mFGF-3. Ein Vergleich dieser vier Sequenzen in einer überlappenden Form ist in Yoshida (1987) in 3 gezeigt. Weiterhin sind die Cys an den Positionen der Reste 88 und 155 von hFGF-4 hochkonserviert unter hFGF-1, hFGF-2, mFGF-3 und hFGF-4 und werden in einem homologen Bereich gefunden.
  • Die beiden mutmaßlichen Zellbindungsstellen von hFGF-2 treten an den Positionen der Reste 36–39 und 77–81 davon auf. Siehe Yoshida (1987) bei 3. Zwei mutmaßliche Heparin-Bindungsstellen von hFGF-2 treten an den Positionen der Reste 18–22 und 107–111 davon auf. Siehe Yoshida (1987) bei 3. Angesichts der wesentlichen Ähnlichkeit zwischen den Aminosäuresequenzen für Human- und Rinder-FGF-2 würden wir die Zellbindungsstelle für bFGF-2 ebenfalls an den Positionen der Reste 36–39 und 77–81 davon und die Heparin-Bindungsstellen an den Positionen der Reste 18-22 und 107–111 davon erwarten. In Bezug auf hFGF-1 treten die mutmaßlichen Zellbindungsstellen bei den Resten 27–30 und 69–72 auf und die mutmaßlichen Heparin-Bindungsstellen treten bei den Resten 9–13 und 98–102 auf. Insofern als reifes bFGF-1 die identischen Aminosäuren bei den Positionen der Reste 9–13, 27–30, 69–72 und 98–102 hat, wie reifes hFGF-2, würde erwartet werden, dass bFGF-1 die gleichen Zell- und Heparin-Bindungsstellen wie hFGF-1 hat.
  • FGF-5:
  • Die cDNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für hFGF-5 werden in Zhan et al., "The Human FGF-5 Oncogene Encodes a Novel Protein Related to Fibroblast Growth Factors", Molec. And Cell. Biol., 8(8):3487–3495 (Aug. 1988), in 1 offenbart. Zhan offenbart auch ein Verfahren zum Klonieren von hFGF-5. Ein anderes hFGF-5 hat eine Aminosäuresequenz, die sich von der Sequenz von Zhan an der Position des Rests 236 (mit einem Lys anstelle des Asn von Zhan) und an der Position des Rests 243 (mit einem Pro anstelle des Ser von Zhan) unterscheidet. Beide Aminosäuresequenzen für hFGF-5 haben 266 Aminosäurereste, die eine Leitsequenz von 67 Resten stromaufwärts von dem ersten Rest des reifen FGF-2 und eine Endsequenz einschließen, die sich über 47 Reste nach dem C-Terminus von hFGF-2 erstreckt. Ein Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen von hFGF-1, hFGF-2, mFGF-3, hFGF-4 und FGF-5 wird in 2 von Zhan (1988) dargestellt. In 2 von Zhan werden hFGF-1, hFGF-2, mFGRF-3 und hFGF-4 als ein aFGF (d.h. saures FGF), bFGF (d.h. basisches FGF), int-2 bzw. hstKS3, d.h., mit ihren Originalnamen, identifiziert. In dem oben zitierten Vergleich zeigten zwei Blöcke von FGF-5-Aminosäureresten (90–180 und 187–207) eine wesentliche Homologie mit FGF 1–4, d.h., 50,4% mit FGF-4, 47,5% mit FGF-3, 43,4% mit FGF-2 und 40,2% mit hFGF-1. Siehe Zhan (1988) bei 2. Die US-Patente 5 155 217 (Goldfarb) und 5 238 916 (Goldfarb), die der Zhan-Publikation entsprechen, bezeichnen das FGF-5 von Zhan als FGF-3. Jedoch kam der Stand der Technik (wie durch Coulier im Text unten bewiesen) dazu, das hFGF von Zhan (und der Goldfarb-Patente) als FGF-5 und nicht als FGF-3 zu erkennen. Die zwei Goldfarb-Patente enthalten die gleiche Aminosäuresequenz für hFGF-5, wie sie oben durch Zhan gezeigt wurde.
  • FGF-6:
  • Die cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz für hFGF-6 werden in Coulier et al., "Putative Structure of the FGF-6 Gene Product and Role of the Signal Peptide", Oncogene 6:1437–1444 (1991), in 2 offenbart. Coulier offenbart auch ein Verfahren zum Klonieren von FGF-6. hFGF-6 ist einer der größten der FGFs mit 208 Aminosäureresten. Wenn die Aminosäuresequenzen von Human-FGF-1, -FGF-2, -FGF-3, -FGF-4, -FGF-5, -FGF-6 und -FGF-7 verglichen werden, gibt es starke Ähnlichkeiten in den C-terminalen Zweidritteln der Moleküle (entsprechend z.B. den Resten 78–208 von hFGF-6). Insbesondere 23 Reste von FGF-6, einschließlich der zwei Cysteine an den Positionen der Reste 90–157 von hFGF-6, waren identisch zwischen den sieben Mitgliedern der Familie. Diese Zahl erhöht sich auf 33 Reste, wenn die konservierten Aminosäurereste betrachtet werden. Die Gesamtähnlichkeiten zwischen diesen sieben Human-FGFs reichen von 32% bis 70% an identischen Resten und 48% bis 79% an konservierten Resten für die C-terminalen Zweidrittel der Moleküle. Die Sequenzvergleiche von hFGF-1 bis hFGF-5 und hFGF-7, bezüglich hFGF-6, sind hierin in der FGF-Tabelle gezeigt.
  • FGF-TABELLE Aminosäuresequenz-Vergleich von hFGF-6 mit anderen hFGFs
    Figure 00110001
    • * Die Zahl und die Prozentsätze der identischen oder konservierten Reste wurden für die C-terminalen Zweidrittel des hFGF-6-Moleküls (Reste 78–208) berechnet.
    • ** Die konservierten Reste sind gemäß der Struktur-Gen-Matrix (structure-genetic matrix) von Feng et al., J. Mol. Evol., 21:112–125 (1985), definiert.
  • Bezugnehmend auf die FGF-Tabelle, hat FGF-6 die höchste Übereinstimmung (91 identische Reste/103 konservierte Reste) mit FGF-4. Dies beläuft sich auf 70% identische und 79% konservierte Reste. hFGF-6 unterscheidet sich am stärksten von hFGF-3, hFGF-2, hFGF-7 und hFGF-1 mit 42, 42, 36 bzw. 32 identischen Resten.
  • Ein übereinandergelegter Vergleich der Aminosäuresequenzen der FGFs 1–7 ist in 3 des einbezogenen Coulier (1991) gezeigt. Die 3 von Coulier zeigt, dass es, wenn die C-terminalen Zweidrittel der FGF-Moleküle vergleichend angeordnet werden, 23 Positionen von Resten gibt, in denen die Reste von allen sieben FGF-Mitgliedern identisch sind. Es gibt auch zehn Positionen von Resten, in denen die Reste von allen sieben FGF-Mitgliedern konserviert sind. Coulier (1991) in 3. In Kombination bilden diese identischen und konservierten Reste etwa 6 Orte von drei bis fünf Resten auf den terminalen Zweidritteln jedes der FGFs 1–7, wobei drei bis fünf Reste in allen sieben Spezies von Human-FGF (d.h., hFGF 1–7) zusammen gruppiert sind.
  • FGF-7:
  • Die Aminosäuresequenz von hFGF-7 ist im Stand der Technik gut bekannt und in Miyamoto et al., "Molecular Cloning of a Novel Cytokine cDNA Encoding the Ninth Member of the Fibroblast Growth Factor Family, Which has a Unique Secretion Property", Mol. And Cell. Biol. 13(7):4251–4259 (1993), in 2 offenbart. In Miyamoto wurde der hFGF-7 mit seinem älteren Namen "KGF" bezeichnet. FGF-7 hat 191 Aminosäuresequenzen von hFGF-106 und hFGF-9 zeigt, dass die Carboxy-terminalen Zweidrittel des FGF-7 eine vergleichbare Homologie mit den distalen Zweidritteln der anderen Mitglieder der Gruppe haben. Siehe Miyamoto (1993) auf Seite 4254 (2).
  • FGF-8:
  • Die cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz von mFGRF-8 ist im Stand der Technik gut bekannt und in Tanaka et al., "Cloning and Characterization of an Androgen-Induced Growth Factor Essential for the Growth of Mouse Mammary Carcinoma Cells", PNAS USA, 89:8928–8932 (1992), in 2 offenbart. Tanaka offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem FGF-8. Der mFGF-8 von Tanaka hat 215 Aminosäurereste. MacArthur et al., "FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development", Development. 1212:3603–3613 (1995), offenbart, dass der FGF-8 8 verschiedene Isoformen hat, die sich an dem reifen N-Terminus unterscheiden, die aber über den C-terminalen Bereich identisch sind. Die 8 Isoformen entstehen, weil FGF-8 6 Exons hat, von denen die ersten vier (die dem ersten Exon der meisten anderen FGF-Gene entsprechen) zu alternativem Spleißen führen.
  • FGF-9:
  • Die cDNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Human- und Maus-FGF-9 sind im Stand der Technik bekannt, und Verfahren und ihre rekombinante Expres sion werden in Santos-Ocamp et al., "Expression and Biological Activity of Mouse Fibroblast Growth Factor", J. Biol. Chem., 271(3):1726–1731 (1996), offenbart. Sowohl die Human- als auch die Maus-FGF-9-Moleküle haben 208 Aminosäurereste und Sequenzen, die sich nur durch zwei Reste unterscheiden. Insbesondere hat hFGF-9 Ser und Asn bei den Resten 9 bzw. 34. FGF-9 hat eine vollständige Erhaltung der konservierten Aminosäuren, die die FGF-Familie definieren. Santos-Ocamp (1996) auf Seite 1726. Die halb-maximale Aktivierung von FGF-9 wird bei 185 ng/ml Heparin gesehen, wohingegen die halb-maximale Aktivierung von FGF-1 bei 670 ng/ml Heparin gesehen wird. Santos-Ocamp (1996) auf Seite 1730. Wenn sie mit FGF-1 verglichen werden, erfordern sowohl FGF-1, sowohl FGF-2 als auch FGF-9 niedrigere Heparin-Konzentrationen für die optimale Aktivität bzw. Wirksamkeit.
  • FGF-98:
  • Die cDNA und die Aminosäuresequenz von hFGF-98 und ein Verfahren für seine rekombinante Expression werden in der vorläufigen Patentanmeldung mit der Eingangsnummer 60/083 553 offenbart, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin eingeschlossen ist. hFGF-98, der auch als hFGF-18 bekannt ist, hat 207 Aminosäurereste. Somit sind sich hFGF-6 (207 Reste), hFGF-9 (208 Reste) und hFGF-98 (207 Reste) in der Größe ähnlich.
  • bFGF-2 und andere FGFs können wie in dem US-Patent 5 155 214 ("das '214-Patent") beschrieben hergestellt werden. Der rekombinante bFGF-2 und andere FGFs können bis zu pharmazeutischer Qualität (98% oder größere Reinheit) unter Verwendung der Techniken, die im Detail in dem US-Patent 4 956 455 (das '455-Patent) mit dem Titel "Bovine Fibroblast Growth Factor", erteilt am 09/11/90, beschrieben sind, aufgereinigt werden.
  • Biologisch aktive Varianten von FGF werden auch durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. Solche Varianten sollten die FGF-Aktivitäten bzw. -Wirksamkeiten beibehalten, insbesondere die Fähigkeit, an FGF-Rezeptorstellen zu binden. Die FGF-Aktivität bzw. -Wirksamkeit kann unter Verwendung von Standard-FGF-Bioassays gemessen werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Repräsentative Assays schließen die bekannten Radiorezeptor-Assays unter Verwendung von Membranen ein, einen Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls misst, den Einbau von Tritium-markiertem Thymidin in einer Dosisabhängigen Weise in die DNA von Zellen und dergleichen zu verstärken. Vorzugsweise hat die Variante mindestens die gleiche Aktivität bzw. Wirksamkeit wie das native Molekül.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen FGFs schließt der neurotropische Wirkstoff auch ein aktives Fragment von irgendeinem der oben beschriebenen FGFs ein. In seiner einfachsten Form wird das aktive Fragment durch die Entfernung des N-terminalen Methionins hergestellt unter Verwendung gut bekannter Techniken für die Entfernung von N-terminalem Met, wie eine Behandlung mit einer Methionin-Aminopeptidase. Eine zweite wünschenswerte Verkürzung schließt einen FGF ohne seine Leitsequenz ein. Die Fachleute auf dem Gebiet erkennen die Leitsequenz als eine Reihe von hydrophoben Resten bei dem N-Terminus eines Proteins, die seinen Durchgang durch eine Zellmembran ermöglichen, die aber nicht für die Aktivität bzw. Wirksamkeit erforderlich sind und die bei dem reifen Protein nicht gefunden werden.
  • Bevorzugte Verkürzungen der FGFs werden bezüglich des reifen hFGF-2 (oder des analogen bFGF-2) mit 146 Resten bestimmt. Als eine allgemeine Regel wird die Aminosäuresequenz eines FGF mit FGF-2 vergleichend angeordnet, um eine maximale Homologie zu erhalten. Teile des FGF, die sich über den entsprechenden N-Terminus des vergleichend angeordneten FGF-2 erstrecken, sind allgemein für die Deletion ohne nachteilige Wirkung geeignet. In gleicher Weise sind die Teile des FGF, die sich über den C-Terminus des vergleichend angeordneten FGF-2 erstrecken, ebenfalls in der Lage, ohne nachteilige Wirkung deletiert zu werden.
  • Fragmente von FGF, die kleiner sind als jene Beschriebenen, können auch in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, solange sie die Zell-bindenden Teile von FGF und mindestens ein Heparin-bindendes Segment beibehalten. In dem Fall des reifen FGF-2 mit den Resten 1–146 treten die zwei mutmaßlichen Zellbindungsstellen an den Positionen der Reste 36–39 und 77–81 davon auf. Siehe Yoshida et al., "Genomic Sequence of hst, a Transforming Gene Encoding Protein", PNAS USA, 84:7305–7309 (Okt. 1987), in 3. Die zwei mutmaßlichen Heparin-Bindungsstellen von hFGF-2 treten bei den Positionen der Reste 18–22 und 107–11 davon auf. Siehe Yoshida (1987) in 3. Demgemäß umfassen die aktiven Fragmente eines FGF typischerweise jene terminal verkürzten Fragmente eines FGF, die, wenn sie mit reifem FGF-2 (mit den Resten 1–146) vergleichend angeordnet werden, um die Homologie zu maximieren, mindestens die Reste haben, die den Resten in den Positionen 30–110 von FGF-2 entsprechen, noch typischer mindestens die Reste, die den Resten 18–146 von FGF-2 entsprechen.
  • Geeignete biologisch aktive Varianten können FGF-Analoga oder -Derivate sein. Mit "Analogon" ist ein Analogon von entweder FGF oder ein FGF-Fragment gemeint, das eine native FGF-Sequenz und -Struktur mit einer oder mehreren Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen einschließt. Analoga mit einer oder mehreren Peptoid-Sequenzen (Peptidomimetika-Sequenzen) (peptide mimic sequences) sind ebenfalls eingeschlossen (siehe z.B. internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/04282). Mit "Derivat" ist jegliche geeignete Modifikation von FGF, FGF-Fragmenten oder ihrer entsprechenden Analoga, wie Glykosylierung, Phosphorylierung oder eine andere Hinzufügung von fremden Gruppierungen, gemeint, solange die FGF-Aktivität bzw. -Wirksamkeit erhalten bleibt. Verfahren zum Herstellen von FGF-Fragmenten, -Analoga und -Derivaten sind im Stand der Technik verfügbar.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen FGFs kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch ein aktives Mutein oder eine Variante davon einsetzen. Mit dem Begriff "aktives Mutein", wie er in Verbindung mit einem FGF verwendet wird, ist eine mutierte Form des natürlich auftretenden FGFs gemeint. FGF-Muteine oder Varianten werden mindestens 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 85%, noch stärker bevorzugt 90–95% oder mehr, und am stärksten bevorzugt 98% oder mehr, Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz des Vergleichs-FGF-Moleküls haben. Ein Mutein oder eine Variante kann sich z.B. durch so wenige wie 1 bis 10 Aminosäurereste, wie 6 bis 10, so wenige wie 5, so wenige wie 4, 3, 2 oder sogar 1 Aminosäurerest, unterscheiden.
  • Die Sequenz-Identität kann wie hierin oben beschrieben bestimmt werden. Für FGF setzt ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der Sequenz-Identität den Smith-Waterman-Homologie-Suche-Algorithmus (Smith-Waterman homology search algorithm) (Meth. Mol. Biol. 70:173–187 (1997)) ein, wie er in dem MSPRCH-Programm (Oxford Molecular) implementiert ist, unter Verwendung einer Affine-Lücken-Suche (affine gap search) mit den folgenden Suchparametern: Lückenöffnungsstrafe (gap open penalty) von 12 und Lückenerweiterungsstrafe (gap extension penalty) von 1. Vorzugsweise sind die Mutationen in "konservative Aminosäure-Substitutionen" unter Verwendung von L-Amionsäuren, wobei eine Aminosäure durch eine andere biologisch ähnliche Amiosäure ersetzt wird. Wie zuvor angemerkt, sind konservative Aminosäure-Substitutionen diejenigen, die die allgemeine Ladung, Hydrophobie, Hydropholie und/oder das sterische Volumen der Aminosäure, die ersetzt wird, erhalten. Beispiele von konservativen Substitutionen sind diejenigen zwischen den folgenden Gruppen: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr und Phe/Trp/Tyr. In dem Fall von FGF-2 schließt ein Beispiel einer solchen konservativen Aminosäure-Substitution die Substitution von Serin für eines oder beide Cysteine bei den Positionen der Reste ein, die nicht an der Disulfid-Bildung beteiligt sind, wie die Reste 87 und 92 in dem reifen FGF-2 (mit den Resten 1–146).
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken eine oder mehrere Punktmutationen in die DNA einführen, die für irgendeines der FGFs codiert, um eine Expression eines FGF-Polypeptid-Muteins (oder Fragment-Muteins) mit angiogener Aktivität bzw. Wirksamkeit zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Um ein biologisch aktives Mutein eines FGFs herzustellen, verwendet man Standardtechniken für die ortsgerichtete Mutagenese, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, und/oder in Gilman et al., Gene, 8:81 (1979), oder Roberts et al., Nature, 328:731 (1987), gelehrt werden, um eine oder mehrere Mutationen in die cDNA einzuführen, die den FGF codiert.
  • NGF
  • Der Begriff "NGF", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Nervenwachstumsfaktor (NGF). NGF wurde ursprünglich als ein Komplex mit dem Molekulargewicht 130 kDa und einem Sedimentationskoeffizienten von 7S isoliert. Dieser 7S-Komplex schloss drei Typen von Untereinheiten ein, wobei die "β"-Untereinheit die gesamten biologischen Aktivitäten bzw. Wirksamkeiten von NGF trägt. Der Begriff β-NGF kann verwendet werden, wenn NGF gemeint ist, und der Begriff NGF bezieht sich typischerweise auf β-NGF. NGF ist ein Dimer aus zwei identischen Peptidketten, wobei jede 118 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von etwa 26,5 kDa hat. Der Nervenwachstumsfaktor stimuliert die Mitose und Wachstumsprozesse, die mit der Zell-, insbesondere der Nervenzell-, Entwicklung verbunden sind.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Erhöhen der Menge von NGF bis zu einem therapeutisch wirksamen Level über Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Dosis einschließt, erreicht. Der NGF, der verabreicht werden soll, kann von jeglicher Tierspezies stammen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Nager, Vogel, Hund, Rind, Schwein, Pferd, und vorzugsweise Mensch. Vorzugsweise stammt der NGF von einer Säugerspezies, und stärker bevorzugt stammt er von einem Säuger derselben Spezies wie der Säuger, der sich der Behandlung unterzieht.
  • Biologisch aktive Varianten von NGF können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Varianten sollten die NGF-Aktivitäten bzw. -Wirksamkeiten beibehalten, insbesondere die Fähigkeit, an NGF-Rezeptorstellen zu binden. Die NGF-Aktivität bzw. -Wirksamkeit kann unter Verwendung von Standard-NGF-Bioassays gemessen werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Repräsentative Assays schließen die bekannten Radiorezeptor-Assays unter Verwendung von Membranen ein, ein Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls misst, den Einbau von Tritium-markiertem Thymidin in einer Dosis-abhängigen Weise in die DNA von Zellen und dergleichen zu verstärken. Die biologischen Aktivitäten bzw. Wirksamkeiten von NGF schließen das Erhöhen der Level von Cholinacetyltransferase ein. Vorzugsweise hat die Variante mindestens die gleiche Aktivität bzw. Wirksamkeit wie das native Molekül.
  • Geeignete biologisch aktive Varianten können NGF-Fragmente, -Analoga und -Derivate sein. Mit "NGF-Fragment" ist ein Protein gemeint, das nur aus einem Teil der intakten NGF-Sequenz und -Struktur besteht, und es kann eine C-terminale Deletion oder eine N-terminale Deletion von NGF sein. Mit "Analogon" ist ein Analogon von entweder NGF oder eines NGF-Fragments gemeint, das eine native NGF-Sequenz und -Struktur mit einer oder mehreren Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen einschließt. Analoga mit einer oder mehreren Peptoid-Sequenzen (Peptidomimetika-Sequenzen) (peptide mimic sequences) sind ebenfalls eingeschlossen (siehe z.B. die internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/04282). Mit "Derivat" ist jegliche geeignete Modifikation von NGF, NGF-Fragmenten oder ihren entsprechenden Analoga, wie Glykosylierung, Phosphorylierung oder eine andere Hinzufügung einer fremden Gruppierung, gemeint, solange die NGF-Aktivität bzw. -Wirksamkeit erhalten bleibt. Verfahren zum Herstellen von NGF-Fragmenten, -Analoga und -Derivaten sind im Stand der Technik verfügbar.
  • NGF-Varianten werden mindestens 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 85%, noch stärker bevorzugt 90–95% oder mehr, und am stärksten bevorzugt 98% oder mehr, Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz des Vergleichs-NGF-Moleküls haben. Eine Variante kann sich z.B. durch so wenige wie 1 bis 10 Aminosäurereste, wie 6 bis 10, so wenige wie 5, so wenige wie 4, 3, 2 oder sogar 1 Aminosäurerest, unterscheiden. Die Sequenz- Identität und die vergleichende Anordnung können wie hierin oben beschrieben bestimmt werden.
  • Der Stand der Technik stellt eine wesentliche Anleitung bezüglich der Herstellung und Verwendung von NGF-Varianten bereit. Ein Fragment von NGF wird allgemein mindestens etwa 10 zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls in der Gesamtlänge, vorzugsweise etwa 15–25 zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls in der Gesamtlänge, und am stärksten bevorzugt etwa 20–50 oder mehr zusammenhängende Aminosäurereste von NGF in seiner Gesamtlänge einschließen.
  • Das in der vorliegenden Erfindung verwendete NGF kann in seinen im Wesentlichen aufgereinigten, nativen, rekombinant hergestellten oder chemisch synthetisierten Formen vorliegen. NGF kann aus Serum, Plasma oder anderen Geweben durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, isoliert und aufgereinigt werden. NGF kann auch durch das Festphasenverfahren chemisch synthetisiert werden (siehe Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2216–2220).
  • Gentechnologie mittels rekombinanter DNA-Techniken kann der effizienteste Weg des Herstellens von NGF sein. Die Human-DNA-Sequenz, die für NGF codiert, ist bekannt und kann in Wirtszellen für die Expression eingeführt werden. NGF kann mittels rekombinanter DNA-Techniken in E. coli-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen produziert werden. Ausgeschiedenes NGF kann hergestellt werden, indem eine Signalsequenz an die DNA-Sequenz, die für NGF codiert, angefügt wird. Zusätzlich kann die DNA-Sequenz, die für NGF codiert, verändert werden, um NGF-Fragmente, -Analoga oder -Derivate herzustellen. Solche rekombinante DNA-Techniken sind im Stand der Technik allgemein verfügbar. Siehe z.B. die internationale Veröffentlichung mit der Nr. WO 96/07424.
  • Pharmazeutische Zusammensetzung
  • Zunahmen in der Menge des neurotropischen Mittels in dem ZNS, Hirn und/oder Rückenmark bis zu einem therapeutisch wirksamen Level können über die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Dosis dieses Wirkstoffs enthält, erhalten werden. Mit "therapeutisch wirksamer Dosis" ist eine Dosis des neurotropischen Wirkstoffs gemeint, die das gewünschte Ziel des Erhöhens der Menge dieses Wirkstoffs in einem relevanten Teil des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks bis zu einem therapeutisch wirksamen Level erreicht, was eine gewünschte biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit des Wirkstoffs ermöglicht. Die gewünschten biologischen Aktivitäten bzw. Wirksamkeiten schließen eine Zunahme der Protein-Phosphorylierung, insbesondere des IGF-I-Rezeptors, als Reaktion auf IGF-I und eine Erhöhung der Acetylcholinacetyltransferase als Antwort auf NGF ein.
  • Die Erfindung ist insbesondere auf die Verwendung in der Herstellung eines Medikaments oder einer Zusammensetzung gerichtet, die für die Abgabe eines neurotropischen Wirkstoffs an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark bei Verabreichung an die Nasenhöhle eingesetzt werden können. Die Zusammensetzung kann z.B. jeglichen pharmazeutisch annehmbaren Zu satzstoff, Träger oder Adjuvans einschließen, der zur Verabreichung eines neurotropischen Wirkstoffs durch die Mucosa oder das Epithel der Nasenhöhle geeignet ist. Vorzugsweise kann die pharmazeutische Zusammensetzung in der Diagnose, Verhütung oder Behandlung einer Krankheit oder Störung oder Verletzung des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks eingesetzt werden. Vorzugsweise schließt die Zusammensetzung einen neurotropischen Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger, Zusatzstoff und/oder Adjuvans ein, der den Transfer des neurotropischen Wirkstoffs innerhalb oder durch die Mucosa oder das Epithel der Nasenhöhle oder entlang oder durch ein neurales System fördern kann. Alternativ kann der neurotropische Wirkstoff mit Substanzen kombiniert werden, die das Transportieren des neurotropischen Wirkstoffs an die Stellen der Nervenzellschädigung unterstützen können. Die Zusammensetzung kann eine oder mehrere neurotropische Wirkstoffe einschließen.
  • Die Zusammensetzung enthält typischerweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, der mit dem neurotropischen Wirkstoff und anderen Komponenten in der pharmazeutischen Zusammensetzung vermischt ist. Mit "pharmazeutisch annehmbarer Träger" ist ein Träger gemeint, der konventionell im Stand der Technik verwendet wird, um die Lagerung, Verabreichung und/oder die heilende Wirkung des neurotropischen Wirkstoffs zu ermöglichen. Ein Träger kann auch jegliche unerwünschte Nebenwirkungen des neurotropischen Wirkstoffs verringern. Ein geeigneter Träger sollte stabil sein, d.h., nicht fähig, mit anderen Inhaltsstoffen in der Formulierung zu reagieren. Er sollte keine signifikanten örtlichen oder systemischen nachteiligen Wirkungen bei den Empfängern bei den Dosierungen und Konzentrationen, die zur Behandlung eingesetzt werden, hervorrufen. Solche Träger sind allgemein im Stand der Technik bekannt.
  • Geeignete Träger für diese Erfindung schließen jene ein, die als große, stabile Makromoleküle verwendet werden, wie Albumin, Gelatine, Collagen, Polysaccharid, Monosaccharide, Polyvinylpyrrolidon, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyaminosäuren, gebundene Öle, Ethyloleat, Liposome, Glucose, Saccharose, Lactose, Mannose, Dextrose, Dextran, Cellulose, Mannit, Sorbit und Polyethylenglykol (PEG).
  • Wasser, Salzlösung, wässrige Dextrose und Glykole sind bevorzugte flüssige Träger, insbesondere (wenn isotonisch) für Lösungen. Der Träger kann aus verschiedenen Ölen, einschließlich derjenigen von Mineralöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, z.B. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen, ausgewählt werden. Geeignete pharmazeutische Exzipientien schließen Stärke, Cellulose, Talk, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silicagel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerin, Propylenglykol, Wasser und Ethanol ein. Die Zusammensetzungen können konventionellen pharmazeutischen Hilfsmitteln unterzogen werden, wie Sterilisierung, und sie können konventionelle pharmazeutische Zusätze enthalten, wie Konservierungsstoffe, Stabilisierungsmittel, Netzmittel oder emulgierende Mittel, Salze zum Anpassen des osmotischen Drucks und Puffer.
  • Andere annehmbare Komponenten in der Zusammensetzung schließen Puffer, die die Isotonie (isotonicity) verbessern, wie Wasser, Salzlösung, Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure, und andere organische Säuren oder deren Salze ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Typischerweise schließt der pharmazeutisch annehmbare Träger auch einen oder mehrere Stabilisatoren, Reduktionsmittel, Antioxidantien und/oder antioxidative Chelatbildner ein. Die Verwendung von Puffern, Stabilisatoren, Reduktionsmitteln, Antioxidantien und Chelatbildnern in der Herstellung von Protein-basierten Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutischen Zusammensetzungen, ist im Stand der Technik gut bekannt. Siehe Wang et al., "Review of Excipients and pHs for Parenteral Products Used in the United States'; J. Parent. Drug Assn., 34(6):452–462 (1980); Wang et al., "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", J. Parent. Sci. and Tech., 42:54–526 (Supplement 1988); Lachman et al., "Antioxidants and Chelating Agents as Stabilizers in Liquid Dosage Forms – Part 1", Drug and Cosmetic Industry, 102(1):36–38, 40 und 146–148 (1968); Akers, M.J., "Antioxidants in Pharmaceutical Products", J. Parent. Sci. and Tech., 36(5):222–228 (1988); und Methods in Enzymology, Bd. XXV, Colowick und Kaplan Hrsg., "Reduction of Disulfide Bonds in Proteins with Dithiothreitol", von Konigsberg, Seiten 185–188.
  • Geeignete Puffer schließen Acetat, Adipat, Benzoat, Citrat, Lactat, Maleat, Phosphat, Tartrat, Borat, Tri(hydroxymethylaminomethan), Succinat, Glycin, Histidin, die Salze verschiedener Aminosäuren oder dergleichen, oder Kombinationen davon ein. Siehe Wang (1980) auf Seite 455. Geeignete Salze und isotonisch machende Mittel (isotonicifiers) schließen Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Saccharose, Trehalose oder dergleichen ein. Wenn der Träger eine Flüssigkeit ist, wird es bevorzugt, dass der Träger hypotonisch oder isotonisch mit oralen, konjunktivalen oder dermalen Flüssigkeiten ist und einen pH innerhalb des Bereichs von 4,5–8,5 hat. Wenn der Träger pulverförmig ist, ist es bevorzugt, dass der Träger ebenfalls innerhalb eines annehmbaren nicht-toxischen pH-Bereichs ist.
  • Geeignete Reduktionsmittel, die die Reduktion von reduzierten Cysteinen aufrecht erhalten, schließen Dithiothreitol (DTT, auch bekannt als Cleland's Reagens) oder Dithioerythrol von 0,01% bis 0,1% G/G, Acetylcystein oder Cystein von 0,1% bis 0,5% (pH 2–3) und Thioglycerol von 0,1% bis 0,5% (pH 3,5–7,0) und Glutathion ein. Siehe Akers (1988) auf den Seiten 225 bis 226. Geeignete Antioxidantien schließen Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfat, Natriumdisulfit, Natriumthiosulfat, Natriumformaldehydsulfoxylat und Ascorbinsäure ein. Siehe Akers (1988) auf den Seiten 225. Geeignete Chelatbildner, die mit Spurenmetallen Chelatkomplexe bilden, um die Spurenmetall-katalysierte Oxidation von reduzierten Cysteinen zu verhindern, schließen Citrat, Tartrat, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als ihre Dinatrium-, Tetranatrium- und Calciumdinatrium-Salze und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) ein. Siehe z.B. Wang (1980) auf den Seiten 457–458 und 460–461; und Akers (1988) auf den Seiten 224–227.
  • Die Zusammensetzung kann ein oder mehrere Konservierungsstoffe, wie Phenol, Cresol, Paraaminobenzoesäure, BDSA, Sorbitrat, Chlorhexidin, Benzalkoniumchlorid oder dergleichen, einschließen. Geeignete Stabilisatoren schließen Kohlenhydrate, wie Trelose oder Glycerin, ein. Die Zusammensetzung kann einen Stabilisator, wie einen oder mehrere von mikrokristalliner Cellulose, Magnesiumstearat, Mannit oder Saccharose, um z.B. die physikalische Form der Zusammensetzung zu stabilisieren, und einen oder mehrere von Glycin, Arginin, hydrolysiertem Collagen oder Protease-Inhibitoren, um z.B. die chemische Struktur der Zusammensetzung zu stabilisieren, einschließen. Geeignete suspendierende Mittel schließen Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hyaluronsäure, Alginat, Chonodroitinsulfat, Dextran, Maltodextrin, Dextransulfat oder dergleichen ein. Die Zusammensetzung kann einen Emulgator, wie Polysorbat 20, Polysorbat 80, Pluronic, Triolein, Sojabohnenöl, Lecithine, Squalen und Squalane, Sorbitantrioleat oder dergleichen, einschließen. Die Zusammensetzung kann ein antimikrobielles Mittel, wie Phenylethylalkohol, Phenol, Cresol, Benzalkoniumchlorid, Phenoxyethanol, Chlorhexidin, Thimerosol oder dergleichen, einschließen. Geeignete Verdickungsmittel schließen natürliche Polysaccharide, wie Mannane, Arabinane, Alginat, Hyaluronsäure, Dextrose oder dergleichen, und synthetische, wie PEG-Hydrogele mit niedrigem Molekulargewicht, und die zuvor genannten Suspensionsmittel ein.
  • Die Zusammensetzung kann ein Adjuvans, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, BDSA, Cholat, Deoxycholat, Polysorbat 20 und 80, Fusidinsäure (fusidic acid), und in dem Fall von DNA-Abgabe vorzugsweise ein kationisches Lipid einschließen. Geeignete Zucker schließen Glycerin, Threose, Glucose, Galactose und Mannit, Sorbit ein. Ein geeignetes Protein ist Human-Serumalbumin.
  • Bevorzugte Zusammensetzungen schließen einen oder mehrere eines Löslichkeitsverbessernden Zusatzes, vorzugsweise ein Cyclodextrin; eines hydrophilen Zusatzes, vorzugsweise ein Mono- oder Oligosaccharid; eines Absorptions-fördernden Zusatzes, vorzugsweise ein Cholat, ein Deoxycholat, eine Fusidinsäure (fusidic acid), oder ein Chitosan; eines kationischen Tensids, vorzugsweise ein Cetyltrimethylammoniumbromid; eines Viskositäts-verstärkenden Zusatzes, vorzugsweise um die Verweildauer der Zusammensetzung an dem Verabreichungsort zu fördern, vorzugsweise eine Carboxymethylcellulose, ein Maltodextrin, eine Alginsäure, eine Hyaluronsäure oder ein Chondroitinsulfat; oder eine Matrix mit verzögerter Freisetzung, vorzugsweise ein Polyanhydrid, ein Polyorthoester, ein Hydrogel, ein partikuläres Depotsystem mit langsamer Freisetzung (particulate slow release depo system), vorzugsweise ein Polylactid-co-glykolid (PLG), ein Depotschaum (depo foam), eine Stärkemikrosphere oder ein von Cellulose abgeleitetes bukkales System (cellulose derived buccal system), eines Lipid-basierten Trägers, vorzugsweise eine Emulsion, ein Liposom, ein Niosom oder eine Mizelle, ein. Die Zusammensetzung kann einen Doppelschicht-destabilisierenden Zusatz, vorzugsweise ein Phosphatidylethanolamin; einen fusogenen (fusogenic) Zusatz, vorzugsweise ein Cholesterin-Hemisuccinat, einschließen.
  • Diese Liste von Trägern und Zusätzen ist keineswegs vollständig, und ein Fachmann auf diesem Gebiet kann Exzipientien aus der GRAS (allgemein als sicher angesehenen)-Liste von Chemikalien, die in den pharmazeutischen Zubereitungen erlaubt sind, und jenen, die derzeit in topischen und parenteralen Formulierungen erlaubt sind, auswählen.
  • Für die Aufgaben dieser Erfindung kann die pharmazeutische Zusammensetzung einschließlich des neurotropischen Wirkstoffs in einer Einzeldosis und in einer Form, wie eine Lösung, Suspension oder Emulsion, formuliert werden. Der neurotropische Wirkstoff kann an die Nasenhöhle als ein Pulver, ein Granulat, eine Lösung, eine Creme, ein Spray (z.B. ein Aerosol), ein Gel, eine Salbe, eine Infusion, eine Injektion, ein Tropfen oder eine Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, wie eine Polymerscheibe, verabreicht werden. Andere Formen von Zusammensetzungen zur Verabreichung schließen eine Suspension von Teilchen, wie eine Emulsion, ein Liposom, eine Einlage, die den neurotropischen Wirkstoff langsam freisetzt, und dergleichen ein. Die Pulver- oder Granulatformen der pharmazeutischen Zusammensetzung können mit einer Lösung und mit einem verdünnenden, dispergierenden oder oberflächenaktiven neurotropischen Wirkstoff kombiniert werden. Zusätzliche bevorzugte Zusammensetzungen zur Verabreichung schließen ein bioadhäsives Mittel, um den neurotropischen Wirkstoff an dem Verabreichungsort zu halten, ein Spray, eine Tinktur oder einen Tupfer ein, die auf die Mucosa oder das Epithel appliziert werden. Die Zusammensetzung kann auch in der Form eines lyophilisierten Pulvers sein, das vor der Verabreichung in eine Lösung, Suspension oder Emulsion umgewandelt werden kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung mit dem neurotropischen Wirkstoff wird vorzugsweise durch Membranfiltration sterilisiert und wird in Einzeldosen- oder Mehrfachdosen-Behältern gelagert, wie versiegelte Fläschchen oder Ampullen.
  • Das Verfahren zum Formulieren einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist allgemein im Stand der Technik bekannt. Eine gründliche Diskussion der Formulierung und Auswahl von pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Stabilisatoren und Isoosmolyten (isomolytes) kann in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Aufl.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) gefunden werden.
  • Der neurotropische Wirkstoff der vorliegenden Erfindung kann auch in einer Form mit verzögerter Freisetzung formuliert werden, um das Vorhandensein des pharmazeutisch aktiven neurotropischen Wirkstoffs in dem behandelten Säuger zu verlängern, allgemein für länger als einen Tag. Viele Verfahren zur Herstellung einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung sind im Stand der Technik bekannt und werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Aufl.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) offenbart.
  • Allgemein kann der neurotropische Wirkstoff in semipermeable Matrizes von festen hydrophoben Polymeren eingeschlossen werden. Die Matrizes können als Filme oder Mikrokapseln ausgeformt sein. Beispiele solcher Matrizes schließen Polyester, Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547–556), Polylactide (US-Patent Nr. 3 773 919 und EP 58 481 ), Polylactat-Polyglykolat (PLGA), wie Polylactid-co-glykolid (siehe z.B. die US-Patente mit den Nummern 4 767 628 und 5 654 008), Hydrogele (siehe z.B. Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167–277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98–105), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat (z.B. Ethylenvinylacetat-Scheiben und Polyethylen-co-vinylacetat)), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie die Lupron DepotTM Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133 988 ), Hyaluronsäuregele (siehe z.B. US-Patent 4 636 542) und Alginsäure-Suspensionen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Geeignete Mikrokapseln können auch Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln und Polymethylmethacrylat-Mikrokapseln, hergestellt durch Coazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation, einschließen. Siehe die ebenfalls anhängige Anmeldung mit dem Titel "Method for Producing Sustained-release Formulations", US-Patentanmeldung Eingangsnr. 09/187 780, eingereicht am 6. November 1998, worin ein neurotropischer Wirkstoff in PLGA-Mikrospheren eingekapselt ist. Zusätzlich können Mikroemulsionen oder kolloidale Wirkstoff-Abgabesysteme, wie Liposome und Albumin-Mikrospheren, verwendet werden. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Aufl.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Andere Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung setzen ein bioadhäsives Mittel ein, um den neurotropischen Wirkstoff an dem Verabreichungsort zu halten.
  • Unter den optionalen Substanzen, die mit dem neurotropischen Wirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden können, gibt es lipophile Substanzen, die die Absorption des neurotropischen Wirkstoffs durch die Mucosa oder das Epithel der Nasenhöhle zu den geschädigten Nervenzellen in dem ZNS verstärken können. Der neurotropische Wirkstoff kann mit einem lipophilen Adjuvans allein oder in Kombination mit einem Träger gemischt werden oder mit einem oder mehreren Typen von Mizell- oder Liposom-Substanzen kombiniert werden. Unter den bevorzugten lipophilen Substanzen sind kationische Liposome, einschließlich eines oder mehrerer von Phosphatidylcholin, Lipofectin, DOTAP oder dergleichen. Diese Liposomen können andere lipophile Substanzen einschließen, wie Ganglioside und Phosphatidylserin (PS). Auch bevorzugt sind mizellare Zusätze, wie GM-1-Ganglioside und Phosphatidylserin (PS), die entweder alleine oder in Kombination mit dem neurotropischen Wirkstoff kombiniert werden können. Ein GM-1-Gangliosid kann von 1–10 Molprozent in jeglichen liposomalen Zusammensetzungen oder in höheren Mengen in mizellaren Strukturen eingeschlossen sein. Proteinwirkstoffe können entweder in partikulären Strukturen verkapselt sein oder als Teil des hydrophoben Teils der Struktur, abhängig von der Hydrophobie des Proteinwirkstoffs, eingebaut sein. Eine bevorzugte liposomale Formulierung setzt Depofoam ein. Ein neurotropischer Wirkstoff kann in multivesikulären Liposomen verkapselt sein, wie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit dem Titel "High and Low Load Formulations of IGF-1 in Multivesicular Liposomes", US-Patentanmeldung Eingangs-Nr. 08/925 531, eingereicht am 8. September 1997, offenbart.
  • Wenn der neurotropische Wirkstoff ein FGF ist und der pharmazeutisch annehmbare Träger ein flüssiger Träger ist, kann eine typische pharmazeutische Zusammensetzung etwa 50 bis etwa 10.000 ng/ml, typischerweise etwa 50 bis 1500 ng/ml, eines FGF oder eines aktiven Fragments oder Muteins davon, 10 mM Thioglycerin, 135 mM NaCl, 10 mM Natriumcitrat und 1 mM EDTA, pH 5, einschließen. Ein geeignetes Verdünnungs- oder Spülungsmittel für die oben beschriebene Zusammensetzung ist ein beliebiger der oben beschriebenen Träger. Typischerweise ist das Verdünnungsmittel die Trägerlösung selbst, die in diesem Beispiel 10 mM Thioglycerin, 135 mM NaCl, 10 mM Natriumcitrat und 1 mM EDTA, pH 5, einschließt.
  • Wenn sie in einer flüssigen Form bereitgestellt wird, kann eine solche FGF-Zusammensetzung, oder eine Zusammensetzung eines anderen neurotropischen Wirkstoffs oder eine Einzeldosis unstabil werden, wenn sie für ausgedehnte Zeitdauern gelagert wird. Um die Stabilität und die Lagerfähigkeit zu maximieren, sollten die pharmazeutischen Zusammensetzungen und die Einzeldosis-Zusammensetzungen gefroren bei –60°C gelagert werden. Wenn sie aufgetaut ist, kann die Lösung für 6 Monate bei gekühlten Bedingungen stabil sein. Ein typisches Fläschchen der pharmazeutischen Zusammensetzung würde etwa 1,0 bis 100 ml (typischer etwa 1,0 bis 25 ml, am typischsten etwa 1,0 bis 10 ml) des oben beschriebenen pharmazeutisch annehmbaren Trägers enthalten, wobei darin von etwa 5 ng bis etwa 10.000 ng FGF, oder ein anderer neurotropischer Wirkstoff oder ein aktives Fragment oder Mutein davon, enthalten ist.
  • Wenn der neurotropische Wirkstoff IGF-I oder ein anderer neurotropischer Wirkstoff ist, kann die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine solubilisierende Verbindung einschließen. Für IGF-I schließt ein bevorzugtes solubilisierendes Mittel eine Guanidiniumgruppe ein, und diese ist in der Lage, die Löslichkeit eines neurotropischen Wirkstoffs, wie IGF-I, zu verbessern. Beispiele solcher solubilisierenden Verbindungen schließen die Aminosäure Arginin sowie Aminosäure-Analoga von Arginin ein, die die Fähigkeit, die Löslichkeit eines neurotropischen Wirkstoffs bei pH 5,5 oder größer zu verbessern, erhalten. Solche Analoga schließen ohne Einschränkung, Dipeptide und Tripeptide ein, die Arginin enthalten. Mit "Verbessern der Löslichkeit" eines neurotropischen Wirkstoffs ist gemeint, dass die Menge des neurotropischen Wirkstoffs, die in einer Lösung bei pH 5,5 oder größer in Gegenwart einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung gelöst werden kann, erhöht wird, verglichen mit der Menge des neurotropischen Wirkstoffs, die bei pH 5,5 oder größer in einer Lösung mit den gleichen Komponenten gelöst werden kann, der aber die Guanidinium-enthaltende Verbindung fehlt. Die Fähigkeit einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung, die Löslichkeit eines neurotropischen Wirkstoffs zu erhöhen, kann unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmt werden. Im Allgemeinen wird die Konzentration der solubilisierenden Verbindung, die in der Zusammensetzung vorhanden ist, etwa 10 mM bis etwa 1 M, und z.B. in dem Fall der Verbindung Arginin in einem Konzentrationsbereich von etwa 20 mM bis etwa 200 mM sein, wie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit dem Titel "Com positions Providing for Increased IGF-I Solubility", US-Patentanmeldung Eingangsnr. 09/188 051, eingereicht am 6. November 1998, offenbart.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Zusammensetzung schließt eine wirksame Menge von NGF mit einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Träger ein, der eine angemessene Menge von Mizellen, eingeschlossen von GM-1-Gangliosid, enthält. Von GM-1 wird angenommen, dass es synergistisch mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) wirkt, um Neuronen zu schützen und die Nervenregeneration und -reparatur zu fördern. Eine andere bevorzugte Ausführungsform schließt ein Antisense-Oligonucleotid zur Behandlung von Hirntumoren ein. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung schließt die Kombination einer wirksamen Menge des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF) oder des insulinartigen Wachstumsfaktors-I (IGF-I) mit Polyethylen-co-vinylacetat) ein, um für die kontrollierte Abgabe des neurotropischen Wirkstoffs, z.B. bei der Behandlung eines Schlaganfalls, zu sorgen.
  • Verabreichen des neurotropischen Wirkstoffs
  • Der neurotropische Wirkstoff wird typischerweise in einer Dosis verabreicht, die ausreichend ist, um einen therapeutisch wirksamen Level in dem Teil des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks bereitzustellen, der von dem Wirkstoff profitieren kann. Ein neurotropischer Wirkstoff weist allgemein eine biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit bei einer Konzentration in oder um ein Gewebe herum von etwa 10–12 M bis etwa 10–9 M, vorzugsweise etwa 10–11 M bis etwa 10–9 M, vorzugsweise etwa 10–10 M, auf. Wenige der am meisten potenten neurotropischen Wirkstoffe (z.B. der aktivitätsabhängige neurotropische Faktor, ADNF) weisen ihre biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit in einem so niedrigen Bereich wie etwa 10–15 M auf. Bevorzugte neurotropische Wirkstoffe, wie NGF, IGF-I und bFGF, weisen biologische Wirkungen in den relevanten Geweben des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks bei Konzentrationen von etwa 10–11 M bis etwa 10–9 M auf.
  • Diese Konzentrationen des neurotropischen Wirkstoffs können in den relevanten Geweben des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks einer Ratte nach nasaler Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis von etwa 0,1 nM bis etwa 10 nM erreicht werden. Z.B. kann NGF in relevanten Konzentrationen in dem Ratten-ZNS, -Hirn und/oder -Rückenmark nach Verabreichung von etwa 0,5 nM bis etwa 10 nM dieses Wirkstoffs gefunden werden und, davon wird ausgegangen, bei niedrigeren Konzentrationen. IGF-I und bFGF können in relevanten Konzentrationen in dem Ratten-ZNS, -Hirn und/oder -Rückenmark nach Verabreichung von etwa 1 nM bis etwa 10 nM dieses Wirkstoffs gefunden werden und, davon wird ausgegangen, bei niedrigeren Konzentrationen. In manchen Regimen schließen therapeutisch wirksame Dosen zur Verabreichung eines neurotropischen Wirkstoffs an eine Ratte etwa 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 nmol ein. Diese Dosen hängen von Faktoren, einschließlich der Effizienz, mit der der Wirkstoff von der Nasenhöhle zum Hirn transportiert wird, ab. Eine größere Gesamtdosis kann durch Mehrfachverabreichungen des Wirkstoffs abgegeben werden.
  • Basierend auf Überlegungen, die die relative Größe und Masse von Teilen der Ratten- und menschlichen Hirne einschließen, die vorteilhafte Ziele für die Abgabe eines neurotropischen Wirkstoffs sind, können therapeutisch wirksame Dosen für Menschen des neurotropischen Wirkstoffs von etwa 1 nmol bis etwa 1000 nmol reichen. Insbesondere können NGF, bFGF und IGF-I an einen Menschen in einer therapeutisch wirksamen Dosis von etwa 1 nmol bis etwa 1000 nmol verabreicht werden. In manchen Regimen schließen therapeutisch wirksame Dosen zur Verabreichung eines neurotropischen Wirkstoffs an einen Menschen etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 nmol ein. Diese Dosen hängen von Faktoren ab, die die Wirksamkeit, mit der der Wirkstoff von der Nasenhöhle zum Hirn transportiert wird, einschließen. Eine größere Gesamtdosis kann durch Mehrfachverabreichungen des Wirkstoffs abgegeben werden.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Einzeldosis des neurotropischen Wirkstoffs kann z.B. in der Form einer Lösung, Suspension, Emulsion oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung sein. Vorzugsweise reicht das Gesamtvolumen einer Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung von etwa 10 μl bis etwa 0,2 ml, vorzugsweise von etwa 50 μl bis etwa 200 μl. Es ist offensichtlich, dass das geeignete Volumen mit Faktoren, wie der Größe der Nasenhöhle, an die der Wirkstoff verabreicht wird, und der Löslichkeit der Komponenten in der Zusammensetzung, variieren kann.
  • Eine solche therapeutisch wirksame Dosis kann den neurotropischen Wirkstoff an einen Teil des ZNS, Hirns oder Rückenmarks abgeben, der zum Behandeln einer Krankheit, Störung oder Verletzung dieser Gewebe relevant ist. Z.B. kann es zum Behandeln der Alzheimer'schen Krankheit vorteilhaft sein, einen neurotropischen Wirkstoff an die Bulbi olfactori, die Formatio hippocami und/oder den frontalen Cortex abzugeben. In ähnlicher Weise kann es zum Behandeln der Parkinsonschen Krankheit vorteilhaft sein, einen neurotropischen Wirkstoff an das Mittelhirn, einschließlich der Substantia nigra und des Locus ceruleus, und/oder das Stammhirn abzugeben. Bewegungsstörungen, die als Ataxien bekannt sind, können von einer Behandlung, die auf das Kleinhirn gerichtet ist, profitieren. Ein Schlaganfall oder eine Verletzung können die meisten Teile des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks beeinflussen. Die Erfindung kann verwendet werden, um therapeutisch wirksame Mengen eines neurotropischen Wirkstoffs an die Teile des Hirns und des ZNS, einschließlich der Bulbi olfactori, der Formatio hippocampi, des frontalen Cortex, des Mittelhirns, des Stammhirns und des Rückenmarks, abzugeben, wobei diese Teile für mehrere Krankheiten und Störungen des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks relevant sind.
  • Es wird erkannt, dass die Gesamtmenge des neurotropischen Wirkstoffs, die als eine Einzeldosis an ein spezielles Gewebe verabreicht wird, von dem Typ der verabreichten pharmazeutischen Zusammensetzung abhängen wird, d.h., ob die Zusammensetzung in der Form z.B. einer Lösung, einer Suspension, einer Emulsion oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung vorliegt. Z.B., wo die pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge des neurotropischen Wirkstoffs enthält, eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung ist, wird der neurotropische Wirkstoff in einer höheren Konzentration verabreicht.
  • Es sollte für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass Variationen hinsichtlich der therapeutisch wirksamen Dosis und der Verabreichungshäufigkeit des neurotropischen Wirkstoffs in dieser Ausführungsform der Erfindung annehmbar sind. Die Menge des verabreichten neurotropischen Wirkstoffs wird umgekehrt mit der Verabreichungshäufigkeit korrelieren. Daher wird eine Zunahme der Konzentration des neurotropischen Wirkstoffs in einer einzeln verabreichten Dosis oder eine Zunahme der mittleren Verweildauer in dem Fall einer Form mit verzögerter Freisetzung des neurotropischen Mittels allgemein mit einer Abnahme der Verabreichungshäufigkeit gekoppelt sein.
  • Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bewusst, dass die tatsächliche Dosis des neurologischen Wirkstoffs von einer Vielzahl von Faktoren abhängen wird, die spezifisch für die Person sein können, die das Dosieren durchlebt. Diese Faktoren sollten in die Betrachtung einbezogen werden, wenn die therapeutisch wirksame Dosis des neurotropischen Wirkstoffs und die Verabreichungshäufigkeit festgelegt werden. Z.B. kann die wirksame Dosis von der Spezies, dem Alter, dem Gewicht oder dem allgemeinen Gesundheitszustand der Person, der Schwere der Krankheit oder Störung, der Größe und dem Ort des Teils des Hirns, in dem eine wirksame Menge an Wirkstoff erreicht werden muss, der Häufigkeit und Dauer des Dosierens, dem Typ der verabreichten Formulierung, den Merkmalen, wie Lipophilie, des Wirkstoffs und der Zusammensetzung, der Beschaffenheit des Wirkstoffs und seiner Rezepturen, falls vorhanden, und dergleichen abhängen. Allgemein ist eine höhere Dosierung bevorzugt, wenn die Krankheit oder Störung ernster ist. Es wird angenommen, dass die Geschwindigkeit bzw. Rate des Transports durch ein Neuron unabhängig von Spezies und Wirkstoff sein kann.
  • Ein geringfügiges Maß des Experimentierens kann benötigt werden, um die wirksamste Dosis und Häufigkeit der Dosisverabreichung zu bestimmen, wobei dies gut innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns auf dem Gebiet liegt, sobald er von der vorliegenden Offenbarung Kenntnis hat.
  • Intermittierendes Dosieren
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die pharmazeutische Zusammensetzung, die die therapeutisch wirksame Dosis des neurotropischen Wirkstoffs umfasst, intermittierend verabreicht. Mit "intermittierender Verabreichung" ist eine Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des neurotropischen Wirkstoffs gemeint, gefolgt von einer Zeitdauer der Unterbrechung, der dann eine weitere Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis folgt, usw. Die Verabreichung der therapeutisch wirksamen Dosis kann in einer kontinuierlichen Weise, wie z.B. mit einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung, erreicht werden, oder sie kann gemäß einem gewünschten täglichen Dosierungsregimes, wie z.B. mit einer, zwei, drei oder mehr Verabreichungen pro Tag, erreicht werden. Mit "Zeitdauer der Unterbrechung" ist ein Unterbrechen der kontinuierlichen Verabreichung mit verzögerter Freisetzung oder täglichen Verabreichung des neurotropischen Wirkstoffs gemeint. Die Zeitdauer der Unterbrechung kann länger oder kürzer als die Dauer der kontinuierlichen Verabreichung mit verzögerter Freisetzung oder täglichen Verabreichung sein. Während der Zeitdauer der Unterbrechung ist der Level des neurotropischen Wirkstoffs in dem relevanten Gewebe wesentlich unterhalb des maximalen Levels, der während der Behandlung erreicht wird. Die bevorzugte Länge der Unterbrechungsdauer hängt von der Konzentration der wirksamen Dosis und der Form des verwendeten neurotropischen Wirkstoffs ab. Die Unterbrechungsdauer kann mindestens 2 Tage sein, sie ist vorzugsweise mindestens 4 Tage, sie ist stärker bevorzugt mindestens 1 Woche, und überschreitet im Allgemeinen eine Dauer von 4 Wochen nicht. Wenn eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung verwendet wird, muss die Unterbrechungsdauer verlängert werden, um die größere Verweilzeit des neurotropischen Wirkstoffs an der Verletzungsstelle zu berücksichtigen. Alternativ kann die Verabreichungshäufigkeit der wirksamen Dosis der Formulierung mit verzögerter Freisetzung demgemäß verringert werden. Ein intermittierender Verabreichungszeitplan des neurotropischen Wirkstoffs kann bis zur gewünschten therapeutischen Wirkung fortgesetzt werden, und schließlich wird die Behandlung der Krankheit oder Störung erreicht.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist die intermittierende Verabreichung der therapeutisch wirksamen Dosis des neurotropischen Wirkstoffs zyklisch. Mit "zyklisch" ist eine intermittierende Verabreichung gemeint, die durch Unterbrechungen in der Verabreichung begleitet wird, mit Zyklen, die von etwa 1 Monat bis zu etwa 2, 3, 4, 5 oder 6 Monaten reichen, stärker bevorzugt etwa 3 Monate bis etwa 6 Monate. Z.B. könnte der Verabreichungszeitplan eine intermittierende Verabreichung der wirksamen Dosis des neurotropischen Wirkstoffs sein, in der eine einzelne Kurzzeitdosis einmal pro Woche für 4 Wochen gegeben wird, gefolgt von einer Unterbrechung in der intermittierenden Verabreichung für eine Dauer von 3 Monaten, gefolgt von intermittierender Verabreichung, von Verabreichung einer einzelnen Kurzzeitdosis, einmal pro Woche für 4 Wochen gegeben, gefolgt von einer Unterbrechung in der intermittierenden Verabreichung für eine Dauer von 3 Monaten, usw. Als ein anderes Beispiel kann eine einzelne Kurzzeitdosis einmal pro Woche für 2 Wochen gegeben werden, gefolgt von einer Unterbrechung in der intermittierenden Verabreichung für eine Dauer von 1 Monat, gefolgt von einer einzelnen Kurzzeitdosis, einmal pro Woche für 2 Wochen gegeben, gefolgt von einer Unterbrechung in der intermittierenden Verabreichung für eine Dauer von einem Monat, usw. Ein zyklischer intermittierender Verabreichungszeitplan des neurotropischen Wirkstoffs an eine Person kann bis zu der gewünschten therapeutischen Wirkung fortgesetzt werden, und schließlich wird die Behandlung der Störung oder Krankheit erreicht.
  • Neuronaler Transport
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einer Weise ein, so dass der neurotropische Wirkstoff in das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark entlang eines neuralen Weges (neural pathway) transportiert wird. Ein neuraler Weg (neural pathway) schließt den Transport innerhalb oder entlang eines Neurons, durch oder mittels der Lymphgefäße, die bei einem Neuron verlaufen, durch oder mittels eines perivaskulären Raums eines Blutgefäßes, das bei einem Neuron oder neuralen Weg (neural pathway) verläuft, durch oder mittels einer Adventitia eines Blutgefäßes, die bei einem Neuron oder neuralen Weg (neural pathway) verläuft, oder durch ein hämangiolymphatisches (hemangiolymphatic) System ein. Die Erfindung bevorzugt den Transport eines neurotropischen Wirkstoffs mittels eines neuralen Wegs (neural pathway) eher als durch das Kreislaufsystem, so dass die neurotropischen Wirkstoffe, die nicht oder nur schlecht die Blut-Hirn-Schranke aus dem Blutstrom in das Hirn überschreiten können, an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark abgegeben werden können. Der neurotropische Wirkstoff kann, einmal nach der Blut-Hirn-Schranke und in dem ZNS angekommen, dann an verschiedene Gebiete des Hirns oder Rückenmarks durch Lymphgefäße, durch einen perivaskulären Raum oder Transport durch oder entlang von Neuronen abgegeben werden. In einer Ausführungsform sammelt sich der neurotropische Wirkstoff vorzugsweise in Gebieten mit der größten Rezeptor- oder Bindungsstellendichte für diesen neurotropischen Wirkstoff.
  • Die Verwendung eines neuralen Wegs (neural pathway), um einen neurotropischen Wirkstoff in das Hirn, Rückenmark oder andere Komponenten des Zentralnervensystems zu transportieren, umgeht das durch die Blut-Hirn-Schranke dargestellte Hindernis, so dass Medikationen, wie der Nervenwachstumsfaktor (NGF), ein Protein, das normalerweise diese Schranke nicht überschreiten kann, direkt an das Hirn, Kleinhirn, Stammhirn oder das Rückenmark abgegeben werden können. Obwohl der verabreichte neurotropische Wirkstoff in den Blutstrom sowie den neuralen Weg (neural pathway) absorbiert werden kann, bietet der neurotropische Wirkstoff vorzugsweise systemisch minimale Wirkungen. Zusätzlich kann die Erfindung für die Abgabe eines konzentrierteren Levels des neurotropischen Wirkstoffs an Nervenzellen sorgen, da der neurotropische Wirkstoff nicht in den im Blutstrom vorhandenen Flüssigkeiten verdünnt wird. Die Erfindung stellt als solche ein verbessertes Verfahren zum Abgeben eines neurotropischen Mittels an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark bereit. Zusätzlich kann die Abgabe eines therapeutischen neurotropischen Wirkstoffs an das ZNS mittels seines neuralen Wegs (neural pathway) die systemische Abgabe und unerwünschte systemische Nebenwirkungen verringern. Dies kann aufrechterhalten werden, unabhängig davon, ob der neurotropische Wirkstoff die Blut-Hirn-Schranke überschreitet.
  • Der Riechnerv-Weg (olfactory neural pathway)
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einer Weise ein, dass der neurotropische Wirk stoff in ZNS, Hirn und/oder Rückenmark entlang eines Riechnerv-Wegs (olfactory neural pathway) transportiert wird. Typischerweise schließt eine solche Ausführungsform das Verabreichen des neurotropischen Wirkstoffs an Gewebe ein, das durch den Riechnerv innerviert ist und in der Nasenhöhle ist. Der Riechnerv-Weg (olfactory neural pathway) innerviert hauptsächlich das Riech-Epithel in dem oberen Drittel der Nasenhöhle, wie oben beschrieben. Die Applikation des neurotropischen Wirkstoffs auf ein Gewebe, das durch den Riechnerv innerviert ist, kann den neurotropischen Wirkstoff an geschädigte Neuronen oder Zellen des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks abgeben. Riech-Neuronen innervieren dieses Gewebe und können eine direkte Verbindung zu dem ZNS, Hirn und/oder Rückenmark aufgrund, so wird angenommen, ihrer Rolle beim Riechen bereitstellen.
  • Die Abgabe durch den Riechnerv-Weg (olfactory neural pathway) kann Lymphgefäße einsetzen, die sich mit dem Riechnerv zu der Gehirnbrücke und anderen Hirnbereichen erstrecken (travel), und von dort in durale Lymphgefäße, die mit Teilen des ZNS, wie dem Rückenmark, verbunden sind. Der Transport entlang des Riechnervs kann auch neurotropische Wirkstoffe an einen Bulbus olfactorius abgeben. Ein perivaskulärer Weg und/oder ein hämangiolymphatischer Weg (hemangiolymphatic), wie Lymphgefäße, die innerhalb der Adventitia der Hirnblutgefäße verlaufen, können einen zusätzlichen Mechanismus für den Transport der therapeutischen neurotropischen Wirkstoffe zum Rückenmark aus dem Gewebe, das durch den Riechnerv innerviert ist, bereitstellen.
  • Ein neurotropischer Wirkstoff kann z.B. durch das Riech-Epithel an den Riechnerv verabreicht werden. Eine solche Verabreichung kann einen extrazellulären oder intrazellulären (z.B. transneuronalen), antegraden und retrograden Transport des neurotropischen Wirkstoffs, der durch die Riechnerven eintritt, an das Hirn und seine Hirnhäute, an das Stammhirn oder das Rückenmark einsetzen. Sobald der neurotropische Wirkstoff in oder auf das Gewebe, das durch den Riechnerv innerviert ist, verteilt ist, kann der neurotropische Wirkstoff durch das Gewebe transportiert werden und sich entlang der Riech-Neuronen in Gebiete des ZNS, einschließlich des Stammhirns, Kleinhirns, Rückenmarks, Bulbus olfactorius und corticaler und subcorticaler Strukturen, fortbewegen.
  • Die Abgabe durch den Riechnerv-Weg (olfactory neural pathway) kann die Bewegung eines neurotropischen Wirkstoffs in oder über die Mucosa oder das Epithel in den Riechnerv oder in ein Lymphgefäß, einen perivaskulären Raum eines Blutgefäßes, eine Adventitia eines Blutgefäßes oder ein Lymphgefäß eines Blutgefäßes (blood vessel lymphatic), das sich mit dem Riechnerv zu der Gehirnbrücke erstreckt (travels), und von dort in die Hirnhautlymphgefäße, die mit Teilen des ZNS, wie dem Rückenmark, verbunden sind, einsetzen. Lymphgefäße von Blutgefäßen (blood vessel lymphatics) schließen Lymphgefäße ein, die sich um die Blutgefäße herum auf der Außenseite der Blutgefäße befinden. Dies wird auch als das hämangiolymphatische System (hemangiolymphatic system) bezeichnet. Die Einführung eines neurotropischen Wirkstoffs in die Lymphgefäße der Blutgefäße führt nicht notwendigerweise den neurotropischen Wirkstoff in das Blut ein.
  • Der Trigeminusnerv-Weg (trigeminal neural pathway)
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einer Weise ein, in der der neurotropische Wirkstoff in das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark entlang eines Trigeminusnerv-Wegs (trigeminal neural pathway) transportiert wird. Typischerweise schließt eine solche Ausführungsform das Verabreichen des neurotropischen Wirkstoffs an einen Teil der Nasenhöhle ein, der durch den Trigeminus innerviert ist, wie oben beschrieben. Die Applikation des neurotropischen Wirkstoffs an ein Gewebe, das durch den Trigeminus innerviert ist, kann den neurotropischen Wirkstoff an geschädigte Neuronen oder Zellen des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks abgeben. Trigeminus-Neuronen innervieren die Nasenhöhle und können eine direkte Verbindung zu dem ZNS, Hirn und/oder Rückenmark aufgrund, so wird angenommen, ihrer Rolle in dem allgemeinen chemischen Sinn (common chemical sense), einschließlich der mechanischen Sinnesempfindung, der Wärmesinnesempfindung und der Nocizeption (z.B. der Erkennung scharfer Gewürze und gesundheitsschädlicher Chemikalien), bereitstellen.
  • Die Abgabe durch den Trigeminusnerv-Weg (trigeminal neural pathway) kann Lymphgefäße einsetzen, die sich mit dem Trigeminus zu der Gehirnbrücke und anderen Hirnbereichen erstrecken (travel), und von dort in die duralen Lymphgefäße, die mit Teilen des ZNS, wie dem Rückenmark, verbunden sind. Der Transport entlang des Trigeminus kann neurotropische Wirkstoffe auch an einen Bulbus olfactorius abgeben. Ein perivaskulärer Weg und/oder ein hämangiolymphatischer Weg (hemangiolymphatic), wie Lymphgefäße, die innerhalb der Adventitia der Hirnblutgefäße verlaufen, kann einen zusätzlichen Transportmechanismus der therapeutischen neurotropischen Wirkstoffe zu dem Rückenmark aus Gewebe, das durch den Trigeminus innerviert ist, bereitstellen.
  • Der Trigeminus schließt Axone mit großem Durchmesser, die die mechanische Sinnesempfindung vermitteln, z.B. Berührung, und Axone mit kleinem Durchmesser, die die Schmerz- und Wärmesinnesempfindung vermitteln, ein, wobei beide seiner Zellkörper in dem semilunaren (oder Trigeminus-) Ganglion oder dem mesencephalen Trigeminuskern in dem Mittelhirn lokalisiert sind. Bestimmte Teile des Trigeminus erstrecken sich in die Nasenhöhle. Einzelne Fasern des Trigeminus sammeln sich in einem großen Bündel, setzen sich unterhalb des Hirns fort und treten in die ventrale Seite der Gehirnbrücke ein. Ein neurotropischer Wirkstoff kann an den Trigeminus z.B. durch die Mucosa und/oder das Epithel der Nasenhöhle verabreicht werden. Eine solche Verabreichung kann einen extrazellulären oder intrazellulären (z.B. transneuronalen), antegraden und retrograden Transport des neurotropischen Wirkstoffs einsetzen, der durch den Trigeminus in das Hirn und seine Hirnhäute, das Stammhirn oder das Rückenmark eintritt. Sobald der neurotropische Wirkstoff in oder auf das Gewebe, das durch den Trigeminus innerviert ist, verteilt ist, kann der neurotropische Wirkstoff durch das Gewebe transportiert werden und sich entlang der Trigeminus-Neuronen in Bereiche des ZNS, einschließlich des Stammhirns, Kleinhirns, Rückenmarks, Bulbus olfactorius und corticaler und subcortialer Strukturen, bewegen.
  • Die Abgabe durch den Trigeminusnerv-Weg (trigeminal neural pathway) kann die Bewegung eines neurotropischen Wirkstoffs über die Nasenschleimhaut oder das -epithel in den Trigeminusnerv oder in ein Lymphgefäß, einen perivaskulären Raum eines Blutgefäßes, eine Adventitia eines Blutgefäßes oder ein Lymphgefäß eines Blutgefäßes (blood vessel lymphatic), das sich mit dem Trigeminus zu der Gehirnbrücke erstreckt, und von dort in Hirnhautlymphgefäße, die mit Teilen des ZNS, wie dem Rückenmark, verbunden sind, einsetzen. Lymphgefäße eines Blutgefäßes (blood vessel lymphatics) schließen Lymphgefäße ein, die sich um die Blutgefäße herum auf der Außenseite der Blutgefäße befinden. Dies wird auch das hämangiolymphatisches (hemangiolymphatic) System bezeichnet. Die Einführung eines neurotropischen Wirkstoffs in die Lymphgefäße eines Blutgefäßes (blood vessel lymphatics) führt nicht notwendigerweise den neurotropischen Wirkstoff in das Blut ein.
  • Neurale Wege (neural pathways) und nasale Verabreichung
  • In einer Ausführungsform kann die Erfindung verwendet werden, um die Abgabe mittels eines neuralen Wegs (neural pathway), z.B. eines Trigeminus- oder Riechnerv-Wegs (trigeminal or olfactory neural pathway), nach Verabreichung an die Nasenhöhle bereitzustellen. Bei der Verabreichung an die Nasenhöhle kann die Abgabe über den Trigeminusnerv-Weg (trigeminal neural pathway) die Bewegung eines neurotropischen Wirkstoffs durch die Nasenschleimhaut und/oder das -epithel einsetzen, um einen Trigeminus- oder einen perivaskulären und/oder lymphatischen Kanal zu erreichen, der sich mit dem Nerv fortsetzt. Bei der Verabreichung an die Nasenhöhle kann die Abgabe über den Riechnerv-Weg die Bewegung eines neurotropischen Wirkstoffes durch die Nasenschleimhaut und/oder das -epithel einsetzen, um den Riechnerv- oder einen perivaskulären und/oder lymphatischen Kanal zu erreichen, der sich mit dem Nerv fortsetzt.
  • Z.B. kann der neurotropische Wirkstoff in einer Weise in die Nasenhöhle verabreicht werden, die einen extrazellulären oder intrazellulären (z.B. transneuronalen), antegraden und retrograden Transport in und entlang der Trigeminus- und/oder Riechnerven einsetzt, um das Hirn, das Stammhirn oder das Rückenmark zu erreichen. Sobald der neurotropische Wirkstoff in oder auf die Nasenschleimhaut und/oder das -epithel, die durch den Trigeminus- und/oder Riechnerv innerviert sind, verteilt ist, kann der neurotropische Wirkstoff durch die Nasenschleimhaut und/oder das -epithel transportiert werden und sich entlang der Trigeminus- und/oder Riech-Neuronen in Bereiche des ZNS, einschließlich des Stammhirns, Kleinhirns, Rückenmarks, Bulbus olfactorius und corticaler und subcorticaler Strukturen, bewegen (travel). Alternativ kann die Verabreichung an die Nasenhöhle in einer Abgabe des neurotropischen Wirkstoffs in einen perivaskulären Raum eines Blutgefäßes oder eines Lymphgefäßes resultieren, das sich mit dem Trigeminus- und/oder Riechnerv zu der Gehirnbrücke, dem Bulbus olfac torius und anderen Hirnbereichen erstreckt (travels), und von dort in die Hirnhautlymphgefäße, die mit Teilen des ZNS, wie dem Rückenmark, verbunden sind. Ein Transport entlang des Trigeminus- und/oder Riechnervs kann auch Wirkstoffe, die an die Nasenhöhle verabreicht wurden, an den Bulbus olfactorius, das Mittelhirn, das Zwischenhirn, die Medulla und das Kleinhirn abgeben. Ein Wirkstoff, der an die Nasenhöhle verabreicht wurde, kann in die ventrale Dura des Hirns eintreten und sich in Lymphgefäßen innerhalb der Dura bewegen (travel).
  • Zusätzlich kann die Erfindung in einer Weise ausgeführt werden, die einen perivaskulären Weg und/oder einen hämangiolymphatischen (hemangiolymphatic) Weg, wie ein Lymphgefäß, das innerhalb der Adventitia eines Hirnblutgefäßes verläuft, einsetzt, um einen zusätzlichen Mechanismus zum Transport eines neurotropischen Wirkstoffs von der Nasenschleimhaut und/oder dem -epithel zum Rückenmark bereitzustellen. Ein neurotropischer Wirkstoff, der mittels des hämangiolymphatischen (hemangiolymphatic) Weges transportiert wird, tritt nicht notwendigerweise in den Kreislauf ein. Die Lymphgefäße der Blutgefäße (blood vessel lymphatics), die mit dem Gefäßkranz der Hirnbasis (circle of Willis) verbunden sind, sowie Blutgefäße, die dem Trigeminus und/oder Riechnerv folgen, können auch an dem Transport des neurotropischen Wirkstoffs beteiligt sein.
  • Die Verabreichung an die Nasenhöhle unter Anwendung eines neuralen Wegs (neural pathway) kann einen neurotropischen Wirkstoff an das Stammhirn, Kleinhirn, Rückenmark und corticale und subcorticale Strukturen abgeben. Der neurotropische Wirkstoff allein kann diese Bewegung in das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark ermöglichen. Alternativ können der Träger oder andere Übertragungs-fördernde Faktoren den Transport des neurotropischen Wirkstoffs in den und entlang des Trigeminusnervs- und/oder Riechnerv-Weges unterstützen. Die Verabreichung eines therapeutischen neurotropischen Wirkstoffs kann die Blut-Hirn-Schranke durch ein Transportsystem von der Nasenschleimhaut und/oder dem -epithel zu dem Hirn und dem Rückenmark überbrücken bzw. umgehen.
  • Störungen des Zentralnervensystems
  • Das vorliegende Verfahren kann eingesetzt werden, um neurotropische Wirkstoffe an das Hirn zur Diagnose, Behandlung oder Vorbeugung von Störungen oder Krankheiten des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks abzugeben. Diese Störungen können neurologische oder psychiatrische Störungen sein. Die Störungen oder Krankheiten schließen Hirnkrankheiten, wie Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson'sche Krankheit, Lewy-Körper-Demenz, Multiple Sklerose, Epilepsie, cerebelläre Ataxie, progressive supranucleäre Lähmung, amyotrophe Lateralsklerose, Affektstörungen, Angststörungen, obsessiv-kompulsive Störungen, Persönlichkeitsstörungen, Aufmerksamkeitsschwäche-Störung, Aufmerksamkeits- und Hyperaktivitätsstörung, Tourette-Syndrom, Tay-Sachs-Syndrom, Nieman-Pick'sche Krankheit und andere Lipidspeicher- und genetische Hirnkrankheiten und/oder Schizophrenie, ein. Die Erfindung kann auch bei Personen angewendet werden, die an oder am Risiko für Nervenschädigung durch cerebrovaskuläre Störungen, wie Schlaganfall in dem Gehirn oder Rückenmark, durch ZNS-Infektionen, ein schließlich Meningitis und HIV, durch Tumoren des Hirns und Rückenmarks oder durch eine Prionen-Krankheit, leiden. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um neurotropische Wirkstoffe abzugeben, um ZNS-Störungen entgegenzuwirken, die aus gewöhnlichem Altern (z.B. Anosmie oder Verlust der allgemeinen chemischen Sinne (general chemical sense)), einer Hirnverletzung oder Rückenmarksverletzung resultieren.
  • Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um neurotropische Wirkstoffe an das Hirn zur Diagnose, Behandlung oder Vorbeugung von neurodegenerativen Störungen abzugeben. Die nasale Verabreichung eines neurotropischen Wirkstoffs an periphere Nervenzellen der Riechnerv- und/oder Trigeminusnerv-Wege, die die Nasenhöhle innervieren, vorgegebener Eintrittsweg für verursachende Mittel von Hirnkrankheiten, kann helfen, gegen eine Krankheit in diesen Nervenzellen zu schützen und verletzte Nervenzellen zu regenerieren und dadurch der nachfolgenden Ausbreitung der Krankheit in die anfälligen Bereiche des ZNS, Hirns und/oder Rückenmarks zuvorzukommen.
  • Die Applikation eines neurotropischen Wirkstoffs an die Nasenhöhle kann auch helfen, die Ausbreitung bestimmter ZNS-, Hirn- und/oder Rückenmarksstörungen zu verhindern, indem periphere Zellen und Neuronen, die durch Neurotoxine und andere Insulte verletzt sind, direkt behandelt werden. Eine prophylaktische Behandlung dieser abseits gelegenen Nervenzellen hilft den Zugang von Krankheits-verursachenden Mitteln in das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark auszuschließen. Dieses Behandlungsverfahren ist besonders günstig in den Fällen der Alzheimer'schen Krankheit, wo vermutet wird, dass ein Umwelt-bedingter Faktor eines der auslösenden Mittel der Krankheit ist. Die Applikation eines neurotropischen Wirkstoffs an die Sinnesneuronen behandelt oder verhindert auch teilweise den Verlust des Geruchssinns oder des allgemeinen chemischen Sinnes (general chemical sense), der mit neurodegenerativen Krankheiten und gewöhnlichem Altern verbunden sein kann.
  • Die Erfindung kann auch zur Vorbeugung von Hirnstörungen verwendet werden, insbesondere in Fällen, wo der verursachende Faktor durch die Riech-Neuronen in das Hirn eintritt. Es ist bevorzugt, dass prophylaktische Behandlungen eingesetzt werden, wo Hinweise eine neuronale Degeneration in den Riech-Neuronen, wie in dem Fall der Alzheimer'schen Krankheit und anderer verwandter Hirnstörungen, anzeigen. Eine prophylaktische Behandlung einer Hirnerkrankung kann die direkte oder indirekte Applikation eines neurotropischen Wirkstoffs an das Riech- oder Nasenepithel beinhalten. Solche Faktoren können in die peripheren Riechnervenzellen absorbiert werden, um diese Neuronen vor Schädigung durch Neurotoxine und andere Insulte zu schützen, und dadurch die Ausbreitung eines Krankheits-verursachenden Mittels in andere Bereiche des Riechnerv-Wegs (olfactory neural pathway) zu verhindern und den Verlust des Geruchssinns, der mit neurodegenerativen Erkrankungen und Altern verbunden sein kann, zu behandeln oder zu verhindern.
  • Die Behandlung von Anosmie ist eine andere, sehr wichtige mögliche Verwendung für das intranasale Geruchssinn-Verfahren (intranasal olfactory method) der Abgabe. Mehr als 75% der Individuen über 80 erleiden einen kompletten oder teilweisen Verlust ihres Geruchssinns. Viele jüngere Individuen, einschließlich derjenigen mit Alzheimer'scher Krankheit und Parkinson'scher Krankheit, erfahren ebenfalls Verluste in der Geruchswahrnehmung. Der Geruch ist für unsere Geschmackswahrnehmung entscheidend und hat somit signifikante Wirkungen auf die Ernährung.
  • Die Behandlung der Parkinsonschen Krankheit kann auch eine wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung sein, da der Trigeminusnerv-Weg neurotropische Wirkstoffe von der Nasenhöhle zur Gehirnbrücke in dem Stammhirn liefern kann. Das prinzipielle therapeutische Ziel für die Parkinson'sche Krankheit in dem Hirn ist die Substantia nigra, die sich vorwärts über die dorsale Oberfläche des Basis-Pedunculus (basis peduncle) von der rostralen Grenze der Gehirnbrücke zu dem Nucleus subthalamicus erstreckt. Andere therapeutische Zielbereiche sind der Locus ceruleus, der in der rostralen Gehirnbrückenregion lokalisiert ist, und der ventrale Tegmentumbereich, der dorsomedial zu der Substantia nigra lokalisiert ist.
  • Eine "wirksame Menge" des neurotropischen Wirkstoffs ist eine Menge, die ausreichend ist, um die Symptome und/oder zugrunde liegende Ursachen einer beliebigen der obigen Störungen oder Krankheiten zu verhindern, behandeln, verringern und/oder verbessern. In einigen Fällen ist eine "wirksame Menge" ausreichend, um die Symptome jener Krankheiten zu beseitigen und vielleicht die Krankheit selbst zu überwinden. In dem Kontext der vorliegenden Erfindung beziehen sich die Begriffe "behandeln" und "Therapie" und dergleichen darauf, eine bestehende Krankheit zu lindern, ihr Fortschreiten zu verlangsamen, auf ihre Prophylaxe, Abschwächung oder Heilung. Verhindern, wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Aussetzen, Verzögern, Verlangsamen, Hemmen oder anderweitiges Stoppen, Verringern oder Verbessern des Ausbruchs von solchen Hirnkrankheiten oder -störungen. Es ist bevorzugt, dass eine ausreichend große Menge des neurotropischen Wirkstoffs in nicht-toxischen Leveln appliziert wird, um eine wirksamen Level von Aktivität bzw. Wirksamkeit innerhalb des neuralen Systems gegen die Krankheit bereitzustellen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann bei jedem beliebigen Säuger verwendet werden. Beispielhaft genannte Säuger schließen Ratten, Katzen, Hunde, Pferde, Kühe, Schafe, Schweine, und stärker bevorzugt Menschen, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Erzeugnisse und Verfahren zur Herstellung
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um ein Erzeugnis bereitzustellen, das einen neurotropischen Wirkstoff zur Verabreichung an das ZNS, Hirn und/oder Rückenmark bereitstellt. Das Erzeugnis kann ein Fläschchen oder einen anderen Behälter einschließen, der eine Zusammensetzung, die für das Vorliegen der Verfahren geeignet ist, zusammen mit einem beliebigen Träger, entweder in getrockneter oder flüssiger Form, enthält. Das Erzeugnis schließt weiterhin Anweisungen zur Ausführung des Verfahrens der Erfindung in der Form eines Etiketts auf dem Behälter und/oder in der Form einer Beilage, die in ein Behältnis eingeschlossen ist, in das der Behälter gepackt ist, ein. Die Anweisungen können auch auf das Be hältnis aufgedruckt sein, in das das Fläschchen gepackt ist. Die Anweisungen enthalten Informationen, wie eine ausreichende Dosierungs- und Verabreichungsinformation, um es der Person oder einem Anwender auf dem Gebiet zu ermöglichen, den neurotropischen Wirkstoff zu verabreichen. Es wird erwartet, dass ein Anwender in dem Gebiet einen beliebigen Arzt, eine Krankenschwester, einen Techniker, einen Ehepartner oder einen anderen Pflegegebenden umfasst, der den neurotropischen Wirkstoff verabreichen könnte. Der neurotropische Wirkstoff kann auch durch die Person selbst verabreicht werden.
  • Gemäß der Erfindung kann ein neurotropischer Wirkstoff zur Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Medikaments mit neurotropischem Wirkstoff verwendet werden, die/das für nasale Verabreichung geeignet ist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung oder eines Medikaments mit neurotropischem Wirkstoff, die/das für nasale Verabreichung geeignet ist. Z.B. kann eine flüssige oder feste Zusammensetzung unter Verwendung konventioneller Techniken auf mehreren Wegen hergestellt werden. Eine flüssige Zusammensetzung kann durch Auflösen eines neurotropischen Wirkstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, bei einem angemessenen pH, einschließlich Puffern oder anderer Exzipientien, hergestellt werden, z.B. um eine hierin oben beschriebene Lösung zu bilden.
  • Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden. Diese Beispiele sind als Vertreter spezifischer Ausführungsformen der Erfindung gedacht und nicht dazu gedacht, den Rahmen der Erfindung einzuschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel I – Intranasale Verabreichung von IGF-I an das Hirn
  • Einleitung
  • Das intranasale Verabreichen des insulinartigen Wachstumsfaktors-I (IGF-I) ist ein wirksames Mittel zum Abgeben dieses neurotropischen Wirkstoffs an das Hirn eines Tieres.
  • Materialien und Methoden
  • Intranasale Abgabe an das Hirn: Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200–310 Gramm, wurden intraperitoneal mit Pentobarbital (40 mg/kg) anästhesiert. Die Arzneistoffabgabe an das Hirn wurde nach intranasaler Verabreichung von 7,4 nmol von 125I-IGF-I in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, bewertet. Die Ratten wurden auf ihre Rücken gelegt, und es wurden ihnen ~25 Mikroliter 125I-IGF-I an jedes Nasenloch über 10–22 Minuten verabreicht, wobei das Tropfen alle 2–3 Minuten zwischen den linken und den rechten Nasenlöchern abgewechselt wurde. Die Ratten wurden nachfolgend einer Perfusionsfixierung innerhalb der Minuten, die der Beendigung der 125I-IGF-I-Verabreichung folgten, unterzogen. Die Perfusionsfixierung wurde mit 50–100 ml physiologischer Salzlösung, gefolgt von 500 ml des Fixierungsmittels, das 1,25% Glutaraldehyd und 1% Paraformaldehyd in 0,1 M Sorenson's Phosphatpuffer, pH 7,4, enthielt, vor der Rückenmarkssektion und der 125I-Messung durch gamma-Zählung (gamma counting) durchgeführt. Die sezierten Bereiche schlossen die Bulbi olfactori, die Medulla, die Gehirnbrücke und das Kleinhirn ein.
  • Ergebnisse
  • Ein rasches Auftreten der Radiomarkierung in dem Hirn wurde mit den höchsten gesehenen Konzentrationen in den Bulbi olfactori (3,0 ± 0,47 nM), der Medulla (0,62 ± 0,16 nM), der Gehirnbrücke (0,31 ± 0,07 nM) und dem Kleinhirn (0,30 ± 0,10 nM) beobachtet.
  • Schlussfolgerungen
  • Diese Ergebnisse zeigen den direkten Transport von IGF-I entlang eines oder mehrerer neuraler Wege (neural pathways) in das Hirn an. Die hohen IGF-I-Level in den Bulbi olfactori und dem Kleinhirn, Geweben, die mit die höchsten Mengen an IGF-I-mRNA und -Rezeptoren in dem Hirn enthalten, zeigen an, dass IGF-I rasch aus der nasalen Submucosa mit bevorzugter Akkumulation in Geweben mit den höchsten Rezeptorleveln transportiert wird. IGF-I-Level, die so niedrig wie 10–100 pM sind, zeigen neuroprotektive Wirkungen, die anzeigen, dass das vorliegende Verfahren effizient schützende IGF-I-Level an das Hirn liefert.
  • Beispiel 2 – Intranasale Verabreichung von IGF-I an das Rückenmark
  • Einleitung
  • Es wurde gezeigt, dass die intranasale Verabreichung von Proteintherapeutika, wie dem insulinartigen Wachstumsfaktor-I (IGF-I), bei der Abgabe neurotropischer Wirkstoffe an das Hirn effektiv ist. Die intanasale Verabreichung umgeht die Blut-Hirn-Schranke, die andernfalls peripher verabreichtes IGF-I behindert. Zusätzlich kann IGF-I auch durch intranasale Abgabe an das Rückenmark abgegeben werden.
  • Materialien und Methoden
  • Intranasale Abgabe an das Rückenmark: Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200–310 Gramm, wurden intraperitoneal mit Pentobarbital (40 mg/kg) anästhesiert. Die Arzneistoffabgabe an das Rückenmark wurde nach intranasaler Verabreichung von 7,4–8,2 nmol von 125I-IGF-I in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, bewertet. Die Ratten wurden auf ihre Rücken gelegt, und es wurden ihnen ~25 Mikroliter 125I-IGF-I an jedes Nasenloch über 15–20 Minuten verabreicht, wobei das Tropfen alle 2–3 Minuten zwischen den linken und den rechten Nasenlöchern abgewechselt wurde. Die Ratten wurden nachfolgend einer Perfusionsfixierung innerhalb der Minuten, die der Beendigung der 125I-IGF-I-Verabreichung folgten, unterzogen. Die Perfusionsfixierung wurde mit 50–100 ml physiologischer Salzlösung, gefolgt von 500 ml des Fixierungsmittels, das 1,25% Glutaraldehyd und 1% Paraformaldehyd in 0,1 M Sorenson's Phosphatpuffer, pH 7,4, enthielt, vor der Rückenmarkssektion und der 125I-Messung durch gamma-Zählung (gamma counting) durchgeführt. Die sezierten Bereiche schlossen die Hals-, Thorax- und lumbosakralen Segmente des Rückenmarks ein.
  • Intravenöse Abgabe an das Rückenmark: Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200–310 Gramm, wurden intraperitoneal mit Pentobarbital (40 mg/kg) anästhesiert. Die Arzneistoffabgabe an das Rückenmark wurde nach intravenöser Verabreichung von 15 pmol von 125I-IGF-I in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, bewertet, um die Penetration von 125I-IGF-I in das Rückenmark aus dem vaskulären System zu bewerten. Diese Dosis, die in einem Gesamtblut gehalt von 125I-IGF-I resultierte, der mit dem oben mittels intranasaler Abgabe erhaltenen vergleichbar war, wurde durch Analyse der Fläche unter der Blutkonzentration gegen Zeit-Kurve, wie von Frey et al., Drug Delivery 4:87–92 (1997), beschrieben, bestimmt. Die Ratten wurden auf ihre Rücken gelegt, und es wurden ihnen 500 Mikroliter 125I-IGF-I über 1 Minute über eine 24-Gauge-Kanüle, die in die Femoralvene eingesetzt war, verabreicht. Die Ratten wurden nachfolgend einer Perfusionsfixierung 20 Minuten nach Beendigung der 125I-IGF-I-Verabreichung unterzogen. Die Perfusionsfixierung wurde mit 50–100 ml physiologischer Salzlösung, gefolgt von 500 ml des Fixierungsmittels, das 1,25% Glutaraldehyd und 1% Paraformaldehyd in 0,1 M Sorenson's Phosphatpuffer, pH 7,4, enthielt, vor der Rückenmarkssektion und der 125I-Messung durch gamma-Zählung (gamma counting) durchgeführt. Die sezierten Bereiche schlossen die Hals-, Thorax- und lumbosakralen Segmente des Rückenmarks ein.
  • Intranasale Abgabe an den Liquor (Cerebrospinal Fluid) (CSF): Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200–310 Gramm, wurden intraperitoneal mit Pentobarbital (40 mg/kg) anästhesiert. Die Arzneistoffabgabe an die CSF wurde nach intranasaler Verabreichung von 12,4–12,8 nmol von 125I-IGF-I in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, bestimmt, um den Transportmechanismus festzustellen. Die Ratten wurden auf ihre Rücken gelegt, und es wurden ihnen ~25 Mikroliter 125I-IGF-I an jedes Nasenloch über 15–25 Minuten verabreicht, wobei das Tropfen alle 2–3 Minuten zwischen den linken und den rechten Nasenlöchern abgewechselt wurde. Bei zwei Minuten oder 17 Minuten nach Beendigung der intranasalen Verabreichung wurden die Ratten einer Zisternenpunktur unterzogen, und 70–100 Mikroliter CSF wurden aufgesaugt. 125I-IGF-I wurde dann in der CSF mittels gamma-Zählung (gamma counting) gemessen.
  • Ergebnisse
  • Ratten, denen 125I-IGF-I durch intranasale Verabreichung gegeben wurde, zeigten einen signifikanten Transport der Markierung in das Rückenmark (siehe Tabelle 1). Die 125I-IGF-I-Konzentrationen waren in der Halsregion (näherungsweise 4 nM) am höchsten und wiesen caudal einen abnehmenden Gradienten mit einer Konzentration in dem Thoraxband von etwa 0,7 nM auf. Tabelle 2 zeigt einen Kontrollversuch, in dem 125I-IGF-I intravenös gegeben wurde, wobei sehr niedrige Markierungskonzentrationen das Rückenmark erreichten (um 2–3 Größenordnungen geringere Konzentrationen als diejenige, die auf eine intranasale Verabreichung einer Dosis, die ähnliche Blutlevel ergibt, folgend beobachtet wurde). Eine CSF-Analyse, die auf eine intranasale Verabreichung folgte, konnte keine nachweisbare Markierung in der CSF zeigen (siehe Tabelle 3).
  • Tabelle 1 Abgabe von 125I-IGF-I an das Rückenmark, auf intranasale Verabreichung folgend (Statistische Analyse für das Rückenmark (aufgelistete Werte sind 125I-IGF-I-Konzentrationen))
    Figure 00380001
  • Tabelle 2 Intravenöse Verabreichung von 125I-IGF-I
    Figure 00380002
  • Tabelle 3 Liquor (cerebrospinal fluid)-Level, auf intranasale Verabreichung von 125I-IGF-I folgend
    Figure 00380003
    • ND – nicht detektiert
  • Schlussfolgerungen
  • IGF-I wird mittels intranasaler Verabreichung an das Rückenmark abgegeben. Dies zeigt die Nützlichkeit einer nicht-invasiven intranasalen Verabreichung zum Abgeben therapeutischer neurotropischer Wirkstoffe an das Rückenmark an. Die intranasale Verabreichung von IGF-I resultierte nicht in einer Abgabe an den Liquor, was ein Transportsystem von der nasalen Mucosa an das Hirn und Rückenmark ohne den Liquor andeutet. Dies deutet darauf hin, dass Lymphgefäße sowie vielleicht hämangiolymphatische (hemangiolymphatic) Wege, Lymphge fäße, die innerhalb der Adventitia der Hirnblutgefäße verlaufen, der wahrscheinlichste Transportmechanismus des IGF-I von der nasalen Submucosa an das Rückenmark sind.
  • Beispiel 3 – Intransale Verabreichung von IGF-I über den Trigeminus
  • Einleitung
  • Die intranasale Verabreichung von insulinartigem Wachstumsfaktor-I (IGF-I) kann diesen neurotropischen Wirkstoff an das Hirn oder Rückenmark über den Trigeminus eines Tieres abgeben.
  • Materialien und Methoden
  • Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200–310 Gramm, wurden intraperitoneal mit Pentobarbital (40 mg/kg) anästhesiert. Die Arzneistoffabgabe an das Hirn und Rückenmark entlang des Trigeminus wurde nach intranasaler Verabreichung von 7,4–8,2 nmol von 125I-IGF-I in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, bestimmt. Die Ratten wurden auf ihre Rücken gelegt, und es wurden ihnen ~25 Mikroliter 125I-IGF-I an jedes Nasenloch über 15–25 Minuten verabreicht, wobei das Tropfen alle 2–3 Minuten zwischen den linken und den rechten Nasenlöchern abgewechselt wurde. Die Ratten wurden nachfolgend einer Perfusionsfixierung innerhalb der Minuten, die der Beendigung der 125I-IGF-I-Verabreichung folgten, unterzogen. Die Perfusionsfixierung wurde mit 50–100 ml physiologischer Salzlösung, gefolgt von 500 ml des Fixierungsmittels, das 1,25% Glutaraldehyd und 1% Paraformaldehyd in 0,1 M Sorenson's Phosphatpuffer, pH 7,4, enthielt, vor der Sektion und der 125I-Messung mittels gamma-Zählung (gamma counting) durchgeführt. Die sezierten Bereiche schlossen den Trigeminus, ausgewählte Hirnbereiche und Rückenmark ein.
  • Ergebnisse
  • Radioaktiv markiertes IGF war in dem Hirn, Stammhirn, Rückenmark und entlang des Trigeminus lokalisiert. Signifikante Mengen an radioaktiv markiertem IGF-I wurden in dem Trigeminus zweier Ratten beobachtet, die IGF-I intranasal erhielten. Der Anteil des Nervs, der der Nasenhöhle am nächsten ist, wies die höchsten Konzentrationen (103–461 nM) auf, wobei andere Teile des Nervs, die näher an dem Austrittspunkt des Nervs aus der ventralen Gehirnbrücke liegen, signifikante, aber geringere IGF-I-Konzentrationen (29–186 nM) aufwiesen.
  • Die Ergebnisse aus den Studien, die gemäß der Beispiele 1–3 durchgeführt wurden, sind in Tabelle 4 unten zusammengestellt. Diese Ergebnisse zeigen IGF-I-Konzentrationen in verschiedenen ZNS-Geweben.
  • Schlussfolgerungen
  • Diese Ergebnisse zeigen den direkten Transport von IGF-I entlang des Trigeminusnerv-Wegs (trigeminal neural pathway) auf.
  • Tabelle 4 – Radioaktiv-Marker-Konzentration (nM) in verschiedenen Hirnregionen und im Blut, auf intranasale Verabreichung von 125I-IGF-I folgend.
    Figure 00400001
    • Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler angegeben; Trigeminusnerv-Dora – Mittelwert aus zwei Messungen. an = 7; bn = 6; cn = 5; dn =4; en = 3; fn = 2
  • Beispiel 4 – Biologische Wirkungen von IGF-I im ZNS nach intranasaler Verabreichung
  • Einleitung
  • Die biologischen Wirkungen von IGF-I wurden nach intranasaler Verabreichung überwacht, um zu zeigen, dass dieser Weg biologisch bedeutsame Level von IGF-I im ZNS erreicht.
  • Materialien und Methoden
  • IGF-I wurde, wie in den Beispielen 1–3 oben beschrieben, allgemein und in Dosen von 7,4 nmol und 74 nmol verabreicht. Nachdem die Ratten getötet worden waren, wurden die Gewebe des ZNS entfernt, fixiert und mittels immunohistochemischer Methoden analysiert. Die Immunohistochemie wurde mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt. Die relevanten Gewebeteile wurden mit einem Antikörper inkubiert, der Proteine mit phosphorylierten Tyrosinresten erkennt, worauf Färben mit DAB folgte. Anderes ZNS-Gewebe wurde perfundiert, gefroren und für die Durchführung einer Gelelektrophorese und eines Western-Blots, wiederum durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, extrahiert.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Bei beiden Dosen erhöhte die Verabreichung von IGF-I die Protein-Tyrosin-Phosphorylierung im ZNS und erhöhte die Phosphorylierung des IGF-I-Rezeptors im ZNS.
  • Die IGF-I-Verabreichung erhöhte die Protein-Tyrosin-Phosphorylierung in dem Bulbus olfactorius, dem Kleinhirn und dem oberen Halsrückenmark. Im Bulbus olfactorius war die Phosphorylierung in der glomerulären Schicht und in den Mitralzellkörpern (mitral cell bodies) klar offensichtlich. Im Kleinhirn war die Phosphorylierung in der Molekularschicht und in der Purkunje-Zellschicht (purkunje cell) klar offensichtlich. Im Rückenmark war die Phosphorylierung in dem oberflächlichen Cornus posterius/spinalen Vten Nucleus klar offensichtlich. Die IGF-I-Verabreichung resultierte in einer Phosphorylierung der β-Untereinheit des IGF-I-Rezeptors und des Proteins p130cas.
  • Die Beobachtung dieser relevanten biologischen Wirkungen von IGF-I im ZNS zeigt an, dass die nasale Verabreichung therapeutisch wirksame Mengen dieses neurotropischen Wirkstoffs an das ZNS abgibt.
  • Beispiel 5 – Intranasale Verabreichung von NGF an das Zentralnervensystem (Hirn und Rückenmark)
  • Einleitung
  • Die intranasale Verabreichung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) ist ein effektives Mittel zum Abgeben dieses neurotropischen Wirkstoffs an das Hirn und Rückenmark eines Tieres.
  • Materialien und Methoden
  • Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200–310 Gramm, wurden intraperitoneal mit Urethan (1,1 g/kg) anästhesiert, in eine Rückenlage gebracht, und dann wurden ihnen näherungsweise entweder 0,4 oder 4 nmol von 125I-markiertem Maus-NGF über eine Dauer von 30 Minuten, im Wesentlichen, wie zuvor von Frey et al. [1997, Drug Delivery 4:87–92] beschrieben, gegeben. Der 125I-NGF wurde als Nasentropfen, 50 μl pro Nasenloch, verabreicht. Eine Gefäßperfusion mit physiologischer Salzlösung und Aldehyd-Fixierungsmittel wurde kurz nach Beendigung der 125I-NGF-Verabreichung eingeleitet. Ausgewählte Hirn-, Rückenmark- und periphere Gewebe wurden dann auf NGF-Aufnahme hin mittels gamma-Zählung (gamma counting) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Ein rasches Auftreten der radioaktiven Markierung im Hirn und Rückenmark wurde beobachtet. Die 125I-NGF-Konzentration war in der Halsregion des Rückenmarks höher als in der Thoraxregion und in der Thoraxregion höher als in den Lumbal- oder Sakralregionen (Tabelle 4). Die im Rückenmark gefundene Konzentration war abhängig von der Dosis.
  • Tabelle 5. 125I-NGF-Konzentration (pM) in dem Rückenmark, auf Geruchssinn-Verabreichung (olfactory administration) folgend
    Figure 00420001
  • Hohe 125I-NGF-Konzentrationen wurden in der Dura gefunden, die jedes der Folgenden umgibt: die Bulbi olfactori, die dorsalen und ventralen Regionen des Hirns, den Trigeminusnerv und das Rückenmark (Tabellen 5 und 6). Die tiefen Halslymphknoten enthielten sehr hohe 125I-NGF-Konzentrationen, wie es auch die gemeinsame Kopfarterie tat.
  • Der Trigeminusnerv selbst enthielt auch hohe 125I-NGF-Konzentrationen (Tabelle 6).
  • Schlussfolgerungen
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die intranasale Verabreichung ein wirksames Verfahren zum Abgeben von NGF an das Hirn, den Trigeminus und das Rückenmark ist. Während frühere Studien eine Abgabe an den Bulbus olfactorius und andere Regionen des Hirns klar gezeigt hatten, ist dies die erste Demonstration einer nicht-invasiven Abgabe von NGF an das Rückenmark. Dies ist wichtig, da NGF die Blut-Hirn-Schranke nicht überschreiten kann und somit bisher nicht nicht-invasiv an das Rückenmark abgegeben wurde.
  • Es wurde gezeigt, dass sich 125I-NGF, auf intranasale Verabreichung folgend, in dem Trigeminus und in der Dura, die den Trigeminus umgibt, sowie in den tiefen Halslymphknoten befindet. Dies deutet darauf hin, dass sich intranasal verabreichter NGF von der Nasenhöhle über die Nasenschleimhaut in die Dura-Lymphgefäße, die sich entlang des Trigeminus erstrecken (travel), und dann in die Dura-Lymphgefäße, die das Rückenmark umgeben, bewegt. Diese Abgabe an das Rückenmark kann entlang des Trigeminusnerv-Weges (trigeminal neural pathway) auftreten. Die Beobachtung der radioaktiven Markierung in der gemeinsamen Kopfarterie und dem Gefäßkranz der Hirnbasis (circle of Willis) deutet darauf hin, dass der Transport in gewissem Ausmaß auch durch hämangiolymphatische (hemangiolymphatic) Wege auftreten kann.
  • Figure 00430001
  • Beispiel 6 – Dosis-Reaktion für intranasale Verabreichung von NGF an das Hirn
  • Einleitung
  • Mehrere verschiedene NGF-Dosen wurden intranasal verabreicht, um die Wirkung der Dosis auf die im Hirn erreichten NGF-Level zu bestimmen.
  • Material und Methoden
  • Diese Versuche wurden allgemein durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Dosis des markierten NGF reichte von 2,4 bis 38 nmol.
  • Ergebnisse
  • Die NGF-Level in verschiedenen Hirngeweben bei Dosen zwischen 2,4–38 nmol sind in den 1–5 veranschaulicht.
  • Diskussion
  • Eine lineare Beziehung wurde zwischen den NGF-Konzentrationen und den über nasale Verabreichung gegebenen Dosen in den folgenden Hirnregionen gefunden: Bulbus olfactorius und seine Dura-Membran (1 und 2), Riechepithel (3), Halsrückenmark (4) und tiefe Halslymphknoten (5), innerhalb des Dosisbereichs von 2,4–38 nmol. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die NGF-Konzentration im Bulbus olfactorius gut mit den NGF-Leveln sowohl im Riechepithel als auch in der Bulbus olfactorius-Dura korrelierte. Die lineare Dosis-Konzentrations-Beziehung, die in dieser Studie beobachtet wurde, bedeutet nicht notwendigerweise, dass der Rezeptor-vermittelte, saturierende Prozess nicht an dem NGF-Transport beteiligt ist. Die getestete NGF-Dosis kann nicht hoch genug gewesen sein, um die NGF-Rezeptoren im Hirn zu sättigen.
  • Beispiel 7 – Intranasale Verabreichung von FGF an das Zentralnervensystem (Hirn und Rückenmark)
  • Einleitung
  • Die intranasale Verabreichung des Fibroblastenwachstumsfaktors (FGF) ist ein effektives Mittel zum Abgeben dieses neurotropischen Wirkstoffs an das Hirn und das Rückenmark eines Tieres.
  • Materialien und Methoden
  • Der basische FGF (bFGF) wurde durch hierin oben beschriebene Verfahren erhalten. Der 125I-bFGF wurde allgemein intranasal an Ratten verabreicht, wie in den vorigen Beispielen für IGF und NGF beschrieben. Nach der Tötung wurde das Rattenhirn zum Bestimmen der FGF-Menge in verschiedenen Hirnsektionen sowohl durch Zählen von markiertem FGF als auch durch Phosphor-Szintigraphie bzw. -Scanning (Phosphor-Scanning) unter Verwendung eines Packard Cyclone Phosphor Scanner präpariert. Das Scanning wurde an einer sagittalen Sektion durch den lateralen 1 mm des Hirns durchgeführt. Zusätzlich wurden bestimmte Teile des ZNS abgetrennt, und die FGF-Konzentration wurde in diesen abgetrennten Teilen bestimmt.
  • Ergebnisse
  • Das Scanning zeigte an, dass wesentliche bFGF-Level an den Bulbus olfactorius, das Kleinhirn und den frontalen Cortex abgegeben wurden. Das Scanning zeigte auch wenig bFGF in der Riechbahn und dem ventralen Bereich des Hirns an.
  • Die in den abgetrennten Teilen des ZNS beobachteten FGF-Konzentrationen waren: 1200 pM im Bulbus olfactorius, 1600 pM im oberen Halsrückenmark. Zusätzlich wurden etwa 200 bis etwa 700 pM bFGF in anderen Regionen des Hirns beobachtet. bFGF-Konzentrationen von etwa 2000 bis etwa 6000 pM wurden im Trigeminus beobachtet.
  • Schlussfolgerungen
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die intranasale Verabreichung ein effektives Verfahren zum Abgeben von FGF an das Hirn, den Trigeminus und das Rückenmark ist. Die abgegebenen Konzentrationen sind höher als jene, die für eine biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit von FGF als notwendig erachtet werden (10–100 pM). Die hohe FGF-Konzentration im Trigeminus deutet darauf hin, dass dieser Wirkstoff durch einen Transport entlang eines Trigeminusnerv-Weges geliefert wird.
  • Es sollte angemerkt werden, dass die Singularformen "ein/eine/eines" ("a", "an") und "der/die/das" ("the"), wie sie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, die Plural-Wortinhalte einschließen, soweit der Inhalt nicht eindeutig etwas anderes vorgibt. Somit schließt z.B. eine Bezugnahme auf eine Zusammensetzung, die "eine Verbindung" enthält, eine Mischung von zwei oder mehr Verbindungen ein. Es sollte auch angemerkt werden, dass der Begriff "oder" allgemein in seinem Sinn eingesetzt wird, einschließlich "und/oder", soweit der Inhalt nicht eindeutig etwas anderes vorgibt.
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen in dieser Beschreibung sind Beispiele für das Maß der gewöhnlichen Kenntnis im Stand der Technik, zu dem diese Erfindung gehört. Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Techniken beschrieben.

Claims (27)

  1. Verwendung eines neurotropischen Wirkstoffs oder einer biologisch aktiven Variante davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon über die Nasenhöhle an das Zentralnervensystem eines Säugers, wobei das Medikament einer Einzeldosis von 0,1 nmol bis 1000 nmol des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon umfasst, wobei eine Verabreichung des Medikaments an die Nasenhöhle des Säugers für einen Transport des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon an das Zentralnervensystem in einer Menge sorgt, die eine schützende oder therapeutische Wirkung auf eine Zelle des Zentralnervensystems liefert, wobei der neurotropische Wirkstoff aus der Gruppe, bestehend aus insulinartigem Wachstumsfaktor (IGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), ausgewählt ist und die biologisch aktive Variante davon wenigstens 70% Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz für den neurotropischen Wirkstoff hat und wobei die biologisch aktive Variante von IGF eine biologisch aktive Variante von insulinartigem Wachstumsfaktor I (IGF-I) ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine Verabreichung des Medikaments an die Nasenhöhle in einer therapeutisch wirksamen Menge von 10–11 M bis etwa 10–9 M des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon in einem Teil des Zentralnervensystems resultiert.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Verabreichung des Medikaments an die Nasenhöhle für einen Transport des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon an mit dem Zentralnervensystem verbundene Lymphgefäße sorgt.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Verabreichung des Medikaments an die Nasenhöhle für einen Transport des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon zum Bulbus olfactorius, zur Formatio hippocampi, zum frontalen Cortex, zum Mittelhirn, zum Stammhirn, zum Rückenmark oder einer Kombination davon sorgt.
  5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament eine Flüssigkeit, ein Pulver, ein Spray, ein Gel, eine Salbe, eine Infusion oder eine Kombination davon umfasst.
  6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament eine Substanz umfasst, die Affinität für eine Rezeptorstelle an einem Neuron hat.
  7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, eine lipophile Mizelle, ein Liposom oder eine Kombination davon umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die lipophile Mizelle oder das Liposom ein Gangliosid, ein Phosphatidylcholin, ein Phosphatidylserin, Lipofectin, DOTAP oder eine Kombination davon umfasst.
  9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament ein Polymer zur kontrollierten Freisetzung umfasst.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Polymer Poly(ethylen-co-vinylacetat) umfasst.
  11. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verabreichung Anwenden des Medikaments auf ein oberes Drittel der Nasenhöhle umfasst.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Verabreichung Anwenden des Medikaments auf einen Bereich des Geruchssinns im oberen Drittel der Nasenhöhle umfasst.
  13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Verabreichung Anwenden des Medikaments auf ein Nasendach umfasst.
  14. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Säuger ein Mensch ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Medikament etwa 1 nmol bis etwa 1000 nmol des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon umfasst.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament etwa 1 nmol bis etwa 300 nmol des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon umfasst.
  17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament etwa 300 nmol bis etwa 700 nmol des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon umfasst.
  18. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament etwa 700 nmol bis etwa 1000 nmol des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon umfasst.
  19. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der insulinartige Wachstumsfaktor insulinartiger Wachstumsfaktor-I (IGF-I) ist.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei der IGF-I humaner IGF-I ist, und die biologisch aktive Variante davon wenigstens 70% Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz für humanen IGF-I hat.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der FGF basischer FGF (FGF-2) ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der FGF-2 humaner FGF-2 ist, und die biologisch aktive Variante davon wenigstens 70% Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz für humanen FGF-2 hat.
  23. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der NGF humaner NGF ist, und die biologisch aktive Variante davon wenigstens 70% Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz für humanen NGF hat.
  24. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei der neurotropische Wirkstoff oder die Variante davon rekombinant produziert ist.
  25. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Verabreichung des Medikaments an die Nasenhöhle für einen Transport des neurotropischen Wirkstoffs oder der Variante davon an das Zentralnervensystem des Säugers in einer Menge sorgt, die für eine Behandlung eines neurologischen Krankheitsbilds, einer Störung des Zentralnervensystems, einer psychiatrischen Störung oder einer Kombination davon wirksam ist.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Krankheitsbild oder die Störung eine neurodegenerative Störung, eine Affektstörung, eine Nervenschädigung durch eine cerebrovaskuläre Störung, eine ZNS-Infektion oder eine Kombination davon umfasst.
  27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Krankheitsbild oder die Störung Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson-Krankheit, Lewy-Körper-Demenz, multiple Sklerose, cerebrale Ataxie, progressive supranukleäre Lähmung, amyotrophe Lateralsklerose, Affektstörungen, Angststörungen, Schizophrenie, Hirnschlag, Schlaganfall im Rückenmark, Meningitis, HIV-Infektion des Zentralnervensystems, einen Tumor im Gehirn, einen Tumor im Rückenmark, eine Prionenkrankheit, Anosmie, Hirnverletzung, Rückenmarksverletzung oder eine Kombination davon umfasst.
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