ES2258601T3 - Un metodo para la identificacion de las secuencias desconocidas del virus adeno-asociado (vaa) y un kit para el metodo. - Google Patents

Un metodo para la identificacion de las secuencias desconocidas del virus adeno-asociado (vaa) y un kit para el metodo.

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ES2258601T3
ES2258601T3 ES02257826T ES02257826T ES2258601T3 ES 2258601 T3 ES2258601 T3 ES 2258601T3 ES 02257826 T ES02257826 T ES 02257826T ES 02257826 T ES02257826 T ES 02257826T ES 2258601 T3 ES2258601 T3 ES 2258601T3
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Guangping Gao
James M. Wilson
Maricio Alvira
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University of Pennsylvania Penn
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Abstract

Un método de identificar secuencias desconocidas de virus adeno-asociados (VAA) en sospecha que contiene VAA de una infección latente, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) someter la muestra que contiene el ADN a amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un primer grupo de iniciadores que amplifican específicamente una primera región del VAA que comprende al menos 250 pb de las secuencias de ácido nucleico de la cápside del VAA, dicha primera región teniendo una secuencia variable flanqueada al menos por 18 pares de bases de una secuencia altamente conservada en su extremo 5¿ y al menos 18 pares de bases de una secuencia altamente conservada en su extremo 3¿, dichos pares de bases estando altamente conservados con relación a un alineamiento de al menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6; (b) opcionalmente someter al ADN a una amplificación adicional utilizando un segundo grupo de iniciadores que amplifican específicamente una segunda regiónque comprende a la primera región de secuencias de VAA y secuencias que están 5¿ de la primera región, de tal manera que se obtienen secuencias de extensión 5¿ que se fijan al extremo 5¿ de las secuencias del VAA amplificadas por los iniciadores para la primera región; (c) opcionalmente someter al ADN a una amplificación adicional utilizando un tercer grupo de iniciadores que amplifican específicamente una tercera región que comprende a la primera región de secuencias de VAA y secuencias que están 3¿ de la primera región, de tal manera que se obtienen secuencias de extensión 3¿ que se fijan al extremo 3¿ de las secuencias del VAA amplificadas por los iniciadores para la primera región, cada una de dichas segunda y tercera regiones estando predeterminadas con base en el alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de la menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6, y cada una de dicha regiones comprendiendo secuencias de ácido nucleico que están altamente conservadas al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 5¿, opcionalmente secuencias variables en la mitad, y secuencias que están altamente conservadas al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 3¿ de las secuencias de la región, con relación a las secuencias de al menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6; y cada uno de los grupos de iniciadores consiste de un iniciador 5¿ y un iniciador 3¿; la presencia de las secuencias amplificadas indicando la presencia de un VAA en la muestra, y una comparación de diferencias entre las secuencias amplificadas y las secuencias de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6 indicando la presencia de un VAA desconocido.

Description

Un método para la identificación de las secuencias desconocidas del virus adeno-asociado (VAA) y un kit para el método.
Antecedentes de la invención
El virus adeno-asociado (VAA), un miembro de la familia del Parvovirus, es un pequeño virus icosahédrico, no envuelto con genomas de ADN lineal de una sola cadena, de 4,7 kilobases (kb) hasta 6 kb. VAA está asignado al género Dependovirus, ya que el virus fue descubierto como un contaminante en patrones purificados de adenovirus. El ciclo de vida del VAA incluye una fase latente en la cual los genomas del VAA, después de la infección, son sitios específicamente integrados dentro de los cromosomas huésped, y una fase infecciosa en la cual, después de la infección ya sea por adenovirus o herpes simple, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empacados dentro de virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, un amplio rango de infectividad del huésped, incluidas las células que no se dividen, y la integración cromosomal potencial específica para el sitio hacen de VAA una atractiva herramienta para la transferencia génica.
Recientes estudios sugieren que los vectores VAA pueden ser el vehículo preferido para terapia génica. Hasta la fecha, han existido 6 diferentes serotipos de VAA aislados de primates humanos o no humanos (NHP) y bien caracterizados. Entre ellos, el serotipo humano 2 es el primer VAA que fue desarrollado como un vector de transferencia génica; ha sido ampliamente utilizado para eficientes experimentos de transferencia génica en diferentes tejidos objetivo y modelos animales. Los vectores de terapia génica basados en virus adeno-asociados tipo 1 también han sido revelados (Xiao y colaboradores, J. Virology; Mayo 1999; páginas 3994-4008). Los ensayos clínicos de la aplicación experimental de vectores basados en AAV2 en algunos modelos de enfermedades humanas están en progreso, e incluyen enfermedades tales como la fibrosis cística y la hemofilia B.
Se conoce un método PCR general adecuado para detectar tipos de virus de papiloma humano en tumores cutáneos y en piel normal (Forslund y colaboradores, J. of General Virology: 1990 80: páginas 2437-2443).
Lo que es deseable son construcciones basadas en VAA para inserción de genes.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un nuevo método de identificación de secuencias desconocidas de VAA de los ADN celulares de diferentes tejidos de primates humanos y no humanos (PHN) utilizando análisis bioinformáticos, amplificación génica basada en PCR y tecnología de clonación, basados en la naturaleza de la latencia y la integración los VAA en ausencia de co-infección por el virus auxiliar, estando definido el método en lo sucesivo en la reivindicación 1.
En otro aspecto la invención proporciona un kit para ser utilizado con el método de la invención, estando el kit definido en lo sucesivo como en la reivindicación 23.
Descripción detallada de la invención
En la presente invención, los inventores han encontrado un método que toma ventaja de la capacidad del virus adeno-asociado (VAA) de penetrar el núcleo, y, en ausencia de una co-infección por un virus auxiliar, para integrarse dentro del ADN celular y establecer una infección latente. Este método utiliza una estrategia de detección basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), identificación de secuencias de VAA a partir de los ADN de tejidos originados en primates humanos y no humanos, así como a partir de otras fuentes.
Las secuencias de ácido nucleico pueden identificarse de acuerdo con el método de la invención. Uno de tales virus adeno-asociados es del serotipo, denominado de ahora en adelante serotipo 7 (VAA7). Otros nuevos serotipos de virus adeno-asociados identificados por medio del método incluyen VAA10, VAA11, y VAA12.
Entre los fragmentos particularmente deseables de VAA que pueden ser identificados están las proteínas de la cápsula, incluidas las regiones hipervariables vp1, vp2, vp3, las proteínas rep, incluidas la rep 78, la rep 68, la rep 52, y la rep 40, y las secuencias que codifican a estas proteínas. Cada uno de estos fragmentos puede ser utilizado fácilmente en una variedad de sistemas de vectores y células huésped. Tales fragmentos pueden ser utilizados solos, en combinación con otras secuencias o fragmentos de VAA, o en combinación con elementos de otras secuencias virales o no virales de VAA. En una modalidad particularmente deseable, un vector contiene las secuencias rep y/o las secuencias de la cápsula.
Como se describe aquí, los alineamientos se llevan acabo utilizando cualquiera entre una variedad de Programas de Alineación de Secuencia Múltiple públicos o comercialmente disponibles, tales como "Clustal W", accesible a través de Servidores de la Red en Internet. Alternativamente, también se utilizan los servicios del Vector NTI. También existen un número de algoritmos conocidos en el estado del arte que pueden utilizarse para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos, incluidos aquellos contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse utilizando Fasta, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor traslapo entre la pregunta y las secuencias de búsqueda. Por ejemplo, puede determinarse el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de ácido nucleico utilizando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de marcación) como lo provee GCG Versión 6.1. Existen programas disponibles similares para secuencias de aminoácidos, por ejemplo, el programa "Clustal X". Generalmente, cualquiera de estos programas es utilizado en los ajustes por defecto, aunque alguien entrenado en la técnica puede alterar estos ajustes según se requiera. Alternativamente, alguien entrenado en la técnica puede utilizar otro algoritmo o programa de computador que provea al menos el nivel de identidad o alineación que aquel proporcionado por los algoritmos y programas referenciados.
El término "homología sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico, o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean óptimamente con las inserciones o supresiones con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos aproximadamente al menos en 95 a 99% de las secuencias alineadas. Preferiblemente, la homología es sobre la secuencia completa, o un marco de lectura abierto de la misma, u otro fragmento adecuado que tiene al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ejemplos de fragmentos adecuados son descritos aquí.
El termino "homología sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a aminoácidos o fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinean óptimamente con las inserciones o supresiones con otro ácido nucleico, existe identidad de secuencia de aminoácidos aproximadamente al menos en 95 a 99% de las secuencias alineadas. Preferiblemente, la homología es sobre la secuencia completa, o una proteína de la misma, por ejemplo, una proteína de la cápsula, una proteína rep, o un fragmento de la misma que tiene al menos 8 aminoácidos, o más deseablemente, al menos 15 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de los fragmentos adecuados son descritos aquí.
Por el término "altamente conservado" se quiere decir al menos 80% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, y más preferiblemente, por encima de 97% de identidad. La identidad la determina fácilmente alguien entrenado en la técnica recurriendo a algoritmos y a programas de computador conocidos por el.
El término "porcentaje de identidad de secuencia" o "idéntico" en el contexto de las secuencias de ácido nucleico se refiere a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de la secuencia puede ser deseablemente sobre la longitud total del genoma, la longitud total de la secuencia de codificación del gen, o un fragmento aproximadamente de al menos 500 a 5000 nucleótidos. Sin embargo, la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo alrededor al menos de nueve nucleótidos, usualmente al menos alrededor de 20 a 24 nucleótidos, al menos alrededor de 28 a 32 nucleótidos, al menos alrededor de 36 o más nucleótidos, pude también ser deseable. En forma similar, el "porcentaje de identidad de secuencia" pude determinarse fácilmente para las secuencias de aminoácidos, sobre la longitud total de una proteína, o un fragmento de la misma. Convenientemente, un fragmento es de al menos alrededor de 8 aminoácidos de longitud, y pude ser hasta alrededor de 700 aminoácidos. Ejemplos de fragmentos adecuados son descritos aquí.
Las secuencias de VAA y los fragmentos de los mismos son útiles en la producción de VAAr, y son útiles también como vectores de inserción antisentido, vectores para terapia génica, o vectores para vacunas.
Como se describe aquí, los vectores que contienen a las proteínas de la cápside del VAA son particularmente muy adecuados para ser utilizados en aplicaciones en las cuales los anticuerpos de neutralización disminuyen la efectividad de otros vectores basados en el serotipo del VAA, así como de otros vectores virales. Los vectores del VAAr son particularmente convenientes en la nueva administración de VAAr y en la terapia génica de repetición.
Como se la utiliza a lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones, los términos que "comprende" y que "incluye" y sus variantes es porque incluyen a otros componentes, elementos, enteros, etapas y similares. En forma inversa, el término que "consiste" y sus variantes es exclusivo de otros componentes, elementos, enteros, etapas y similares.
I. Métodos de la invención A. Detección de Secuencias a través de Clonación Molecular
En un aspecto, la invención provee un método para identificar secuencias objetivo de ácido nucleico (desconocidas) en una muestra. Este método es particularmente adecuado para detección de secuencias virales que se encuentran integradas dentro del cromosoma de una célula, por ejemplo, virus adeno-asociados (VAA) y retrovirus, entre otros.
Como se lo utiliza aquí, una muestra es cualquier fuente que contiene ácidos nucleicos, por ejemplo tejido, cultivo de tejido, células, cultivos de células y fluidos biológicos que incluyen, sin limitación, orina y sangre. Estas secuencias de ácido nucleico pueden ser ADN o ARN de plásmidos, ADN o ARN naturales de cualquier fuente, incluidas bacterias, levaduras, virus y organismos superiores tales como plantas o animales. El ADN o ARN se extrae de la muestra por medio de una variedad de técnicas conocidas por aquellos entrenados en la técnica, tales como aquellas descritas por Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory). El origen de la muestra y el método por medio del cual se obtienen para la aplicación del método de la invención no son una limitación para la presente invención. Opcionalmente, el método de la invención puede realizarse directamente sobre la fuente de ADN, o sobre ácidos nucleicos obtenidos (por ejemplo, extraídos) a partir de una fuente.
El método de la invención involucra someter una muestra que contiene ADN a amplificación a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un primer grupo iniciador específico para una primera región de secuencias de ácido nucleico de doble cadena, obteniendo así secuencias amplificadas.
Como se lo utiliza aquí, cada una de las "regiones" es predeterminada con base en la alineación de las secuencias de ácido nucleico de al menos dos serotipos (por ejemplo, VAA) o cepas (por ejemplo, lentivirus), y en donde cada una de dichas regiones se compone de secuencias que tienen un extremo 5' que está altamente conservado, una mitad que es variable, y un extremo 3' que está altamente conservado, cada una de ellas estando conservadas o siendo relativamente variables para las secuencias al menos de VAA1-VAA6. Los extremos 5' y 3' están altamente conservados por más de 18 pb, más de 25 pb, más de 30 pb, o más de 50 pb en el extremo 5'. Con respecto a la región variable, no existe requerimiento por las secuencias conservadas, estas secuencias pueden estar relativamente conservadas, o pueden tener menos de 90, 80 ó 70% de identidad entre los serotipos o cepas alineadas.
Cada una de las regiones puede abarcar alrededor desde 100 pb hasta 10 bares de kilobases de longitud siempre que la primera región sea al menos de 250 pb de longitud. Sin embargo, es particularmente deseable que una de las regiones sea una "región de firma", esto es, una región que sea suficientemente única para identificar positivamente la secuencia amplificada como siendo de la fuente objetivo. Por ejemplo, en una modalidad, la primera región es aproximadamente de 250 pb de longitud, y es suficientemente única entre las secuencias conocidas del VAA, que identifica positivamente a la región amplificada como siendo originalmente del VAA. Además, las secuencias variables dentro de ésta región son suficientemente únicas de tal manera que pueden ser utilizadas para identificar al serotipo del cual se originan las secuencias amplificadas. Una vez amplificadas (y por lo tanto detectadas), las secuencias pueden identificarse llevando a cabo una digestión convencional de restricción y una comparación con los patrones de digestión de restricción para ésta región en cualquiera entre VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 o VAA6, o aquella de VAA7, VAA10, VAA11, VAA12, o cualquiera de los otros serotipos nuevos identificados por la invención, que son predeterminados y suministrados por la presente invención.
Dada la guía proporcionada aquí, alguien entrenado en la técnica puede identificar fácilmente tales regiones entre otros virus integrados para permitir una detección e identificación fácil de estas secuencias. Después, puede diseñarse un grupo óptimo de iniciadores genéricos localizados dentro de los extremos altamente conservados y probados para una amplificación eficiente de la región seleccionada de las muestras. Este aspecto de la invención se adapta fácilmente a un kit de diagnóstico para detectar la presencia de la secuencia objetivo (por ejemplo, VAA) y para identificar al serotipo del VAA, utilizando estándares que incluyen a los patrones de restricción para los serotipos del VAA descritos aquí o aislados utilizando las técnicas descritas aquí. Por ejemplo, la identificación rápida o la obtención del serotipo molecular de los productos por PCR puede lograrse por medio de la digestión de los productos obtenidos por PCR y comparando los patrones de restricción.
Así, en una modalidad, la "región de firma" para un VAA abarca aproximadamente desde 2800 pb hasta aproximadamente 3200 pb del VAA1 [SEQ ID NO. 6], y los correspondientes pares de bases en VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6. Más deseablemente, la región es aproximadamente de 250 pb, localizada dentro de las pb 2886 hasta aproximadamente 3143 pb de VAA1 [SEQ ID NO: 6], y los correspondientes pares de bases en VAA2 
\hbox{[SEQ ID NO: 7],}
VAA3 [SEQ ID NO: 8], y en otros serotipos de VAA. Para permitir la detección rápida del VAA en la muestra, se utilizan los iniciadores que amplifican específicamente ésta región de firma. Sin embargo, la presente invención no está limitada a las secuencias exactas identificadas aquí para la región de firma del VAA, ya que alguien entrenado la técnica puede fácilmente alterar ésta región para abarcar fragmento más corto, o un fragmento más largo de ésta región de firma.
Los iniciadores PCR se generan utilizando técnicas conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Cada uno de los grupos de iniciadores PCR se compone de un iniciador 5' y de un iniciador 3'. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, citado aquí. El término "iniciador" se refiere a un oligonucleótido que actúa como punto de iniciación de síntesis cuando se lo coloca bajo condiciones en cuya síntesis se induce un producto de extensión del iniciador que es complementario a una cadena de ácidos nucleicos. El iniciador es preferiblemente de cadena sencilla. Sin embargo, si se utiliza un iniciador de cadena doble, se lo trata para separar sus cadenas antes de utilizarlo para preparar productos de extensión. Los iniciadores pueden ser aproximadamente de 15 a 25 o más nucleótidos, y preferiblemente al menos de 18 nucleótidos. Sin embargo, para ciertas aplicaciones se utilizan nucleótidos más cortos, por ejemplo de 7 a 15 nucleótidos.
Los iniciadores se seleccionan para ser suficientemente complementarios con las diferentes cadenas de cada secuencia específica que va a ser amplificada para hibridar con sus respectivas cadenas. Por lo tanto, la secuencia del iniciador necesita no reflejar la secuencia exacta de la región que está siendo amplificada. Por ejemplo, un fragmento no complementario de nucleótido puede estar unido al extremo 5' del iniciador, con la secuencia restante del iniciador siendo completamente complementaria a la cadena. Alternativamente, las bases no complementarias o las secuencias más largas pueden ser esparcidas dentro del iniciador, siempre que la secuencia del iniciador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena que va a ser amplificada para hibridarse con ella y formar un molde para síntesis del producto de extensión del otro iniciador.
Los iniciadores para PCR para la región de firma se basan en las secuencias altamente conservadas de dos o más secuencias alineadas (por ejemplo, dos o más serotipos del VAA). Los iniciadores pueden acomodar una identidad menos exacta entre los dos o más serotipos alineados del VAA en el extremo 5' o en la mitad. Sin embargo, las secuencias en el extremo 3' de los iniciadores corresponden a una región de dos o más serotipos alineados del VAA en la cual existe identidad exacta al menos sobre cinco, preferiblemente, al menos sobre nueve pares de bases, y más preferiblemente, al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 3' de los iniciadores. Así, el extremo 3' de los iniciadores se compone de secuencias con 100% de identidad con las secuencias alineadas al menos sobre cinco nucleótidos. Sin embargo, se puede utilizar opcionalmente uno, dos o más nucleótidos degenerados en el extremo 3' del iniciador.
Por ejemplo, el grupo iniciador para la región de firma del VAA fue diseñado con base en una única región dentro de la cápside del VAA, como sigue. El iniciador 5' se basó en 2867-2891 nt de VAA2 [SEQ ID NO: 7], 5'-GG
TAATTCCTCCGGAAATTGGCATT-3'. El iniciador 3' fue diseñado con base en los 3096- 3122 nt del VAA2 [SEQ ID NO: 7], 5'-GACTCATCAACAACAACTGGGGATTC-3'. Sin embargo, alguien entrenado en la técnica puede diseñar fácilmente el grupo iniciador con base en las regiones correspondientes de VAA1, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, o con base en la información proporcionada aquí, VAA7, VAA10, VAA11, VAA12, u otros nuevos VAA. Además, pueden diseñarse fácilmente sin embargo otros grupos de iniciadores para amplificar ésta región de firma, utilizando técnicas conocidas por aquellos entrenados en la técnica.
B. Aislamiento de Secuencias Objetivo
Como se describe aquí, la presente invención utiliza un primer grupo iniciador que amplifica específicamente a la región de firma de la secuencia objetivo, por ejemplo, un serotipo del VAA, con el propósito de permitir la detección del objetivo. En una situación en la cual se desean secuencias adicionales, por ejemplo, si se identifica una nuevo serotipo del VAA, puede extenderse la región de firma. Así, la invención puede utilizar además uno o más grupos adicionales de iniciadores.
Convenientemente, estos grupos de iniciadores están diseñados para incluir o bien al iniciador 5' o al iniciador 3' del primer grupo iniciador, y un segundo iniciador único para el grupo iniciador, de tal manera que el grupo iniciador amplifica una región 5' ó 3' para la región de firma que se fija ya sea al extremo 5' o al extremo 3' de la región de firma. Por ejemplo, un primer grupo iniciador está compuesto de un iniciador 5', P1 y de un iniciador 3' P2 para amplificar la región de firma. Con el propósito de extender la región de firma sobre su extremo 3', se prepara un segundo grupo iniciador con el iniciador P1 y un iniciador 3' P4, que amplifica la región de firma y a las secuencias contiguas secuencia abajo de la región de firma. Con el propósito de extender la región de firma sobre su extremo 5', se prepara un tercer grupo iniciador compuesto de un iniciador 5', P5, y un iniciador P2, de tal manera que la región de firma las y las secuencias contiguas secuencia arriba de la región de firma se amplifiquen. Estas etapas de extensión se repiten (o se llevan a cabo al mismo tiempo), como se necesite o se desee. Después de eso, los productos resultantes de estas etapas de amplificación se fusionan utilizando etapas convencionales para producir una secuencia aislada de la longitud deseada.
El segundo y tercer grupos de iniciadores se diseña, como con el grupo iniciado para la región de firma, para amplificar una región que tiene secuencias altamente conservadas entre las secuencias alineadas. La referencia que se hace aquí del término "segundo" o "tercer" grupo de iniciadores es únicamente para discusión, sin considerar el orden en el cual éstos iniciadores se añaden a la mezcla de reacción, o la utilizada para amplificación. La región amplificada por el segundo grupo iniciador se selecciona de tal manera que por amplificación se fija por su extremo 5' al extremo 3' de la región de firma. En forma similar, la región amplificada por el tercer grupo iniciador se selecciona de tal manera que por amplificación se fije a su extremo 3' y se fije al extremo 5' de la región de firma. Pueden diseñarse grupos adicionales de iniciadores de tal manera que las regiones que ellos amplifican se fijen una ya sea al extremo 5' o al extremo 3' de los productos de extensión formados por el segundo o por el tercer grupo de iniciadores, o por posteriores grupos de iniciadores.
Por ejemplo, donde VAA es la secuencia objetivo, se utiliza un primer grupo de iniciadores (P1 y P2) para amplificar la región de firma de la muestra. En una modalidad deseada, la región de firma se localiza dentro de la cápside del VAA. Se utiliza un segundo grupo de iniciadores (P1 y P4) para extender el extremo 3' de la región de firma hasta una ubicación en la secuencia del VAA aquí está justamente antes del ITR 3' del VAA, esto es, proveyendo un producto de extensión que contiene al extremo 3' completa de la cápside del VAA cuando se utiliza la región de firma como un ancla. En una modalidad, el iniciador P4 corresponde a 4435 hasta 4462 nt del VAA2 [SEQ ID NO: 7], y las secuencias correspondientes en los otros serotipos del VAA. Esto resulta en la amplificación de una región aproximadamente de 1,6 kb, que contiene la región de firma de 0,25 kb. Se utiliza un tercer grupo de iniciadores (P3 y P2) para extender el extremo 5' de la región de firma hasta una ubicación en las secuencias del VAA que está en el extremo 3' de los genes rep, esto es, proveyendo un producto de extensión que contiene al extremo 5' de la cápside del VAA cuando se utiliza la región de firma como un ancla. En una modalidad, el iniciador P3 corresponde a 1384 hasta 1409 nt del VAA2 [SEQ ID NO: 7], y las secuencias correspondientes en los otros serotipos del VAA. Esto resulta en una amplificación de una región aproximadamente de 1,7 kb, que contiene a la región de firma de 0,25 kb. Opcionalmente, se utiliza una cuarto grupo de iniciadores para extender más al producto de extensión que contiene al extremo 5' completo de la cápside del VAA para incluir también a las secuencias rep. En una modalidad, el iniciador designado como P5 corresponde a 108 hasta 133 nt del VAA2 [SEQ ID NO: 7], y las secuencias correspondientes en los otros serotipos del VAA y se utiliza junto con el iniciador P2.
Después de completar el número deseado de etapas de extensión, se fusionan los diferentes productos de extensión, haciendo uso de la región de firma como un ancla o marcador, para construir una secuencia intacta. En el ejemplo suministrado aquí, se obtienen las secuencias del VAA que contienen, como mínimo, un gen de la cápsula del VAA. Pueden obtenerse las secuencias más grandes, dependiendo del número de las etapas de extensión ejecutadas.
Convenientemente, los productos de extensión se ensamblan dentro de una secuencia intacta del VAA utilizando métodos conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Por ejemplo, los productos de extensión pueden dirigirse con DraIII, que escinde en el sitio DraIII localizado dentro de la región de firma, para proveer fragmentos de restricción que se ligan nuevamente para proveer productos que contienen (como mínimo) un gen intacto de la cápsula del VAA. Sin embargo, pueden utilizarse otras técnicas adecuadas para el montaje de los productos de extensión dentro de una secuencia intacta. Ver, generalmente, a Sambrook y colaboradores, citado aquí.
Como alternativa para las múltiples etapas de extensión descritas anteriormente, otra modalidad de la invención proporciona una amplificación directa de un fragmento de 3,1 kb que permite el aislamiento de secuencias completas de la cápsula. Para amplificar directamente un fragmento completo la cápsula de 3,1 kb a partir de tejido de PHN y los ADN sanguíneos, se identificaron otras dos regiones altamente conservadas en genomas de VAA para el uso en la amplificación por PCR de fragmentos grandes. Se utiliza un iniciador dentro de una región conservada ubicada en la mitad del gen rep (AV1ns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt de la SEQ ID NO: 6) en combinación con el iniciador 3' ubicado en otra región conservada secuencia abajo del gen de la cápsula (AV2cas: 5' CGCAGA
GACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID NO: 7) para la amplificación de las secuencias del VAA que incluye a la cápsula completa del VAA. Típicamente, después de la amplificación, los productos se clonan y se realiza un análisis de secuencia con una precisión de \geq 99,9%. Utilizando este método, los inventores han aislado al menos 50 clones de la cápside que han sido caracterizados secuencialmente. Entre ellos, 37 clones se derivaron de los tejidos de macaco Rhesus (rh.1 - rh.37), 6 clones de macacos cinomólogos (cy.1 - cy.6), 2 clones de mandriles (bb.1 y bb.2) y 5 clones de chimpancés (ch.1 - ch.5). Estos clones se identifican en otra parte de las especificaciones, junto con las especies de animales a partir de los cuales fueron identificados y los tejidos en ese animal en los cuales se habían localizado estas nuevas secuencias.
II. Kit de diagnóstico
En otro aspecto, la invención provee un kit de diagnóstico como el definido en la reivindicación 23 más adelante para detentar la presencia de un virus adeno-asociado (VAA) desconocido en una muestra. Tal kit puede contener un primer grupo de iniciadores PCR 5' y 3' específicos para una región de firma de la secuencia de ácido nucleico del VAA. Alternativamente, o adicionalmente, tal kit puede contener un primer grupo de iniciadores PCR 5' y 3' específicos para el fragmento de 3,1 kb que incluye la secuencia de ácido nucleico de la cápside completa del VAA identificada aquí (por ejemplo, los iniciadores AV1ns y AV2cas). Opcionalmente, un kit de la invención puede contener además dos o más grupos adicionales de iniciadores 5' y 3', como se describe aquí, y/o sondas PCR. Estos iniciadores y sondas se utilizan de acuerdo a la presente invención para amplificar las regiones de firma de cada serotipo del VAA, por ejemplo utilizando PCR cuantitativo.
Tal kit puede contener además una o más enzimas de restricción, estándares para serotipos del VAA que proveen sus "análisis de digestiones por enzimas de restricción designa", y/o otros medios para determinar el serotipo del VAA detectado.
Además, los kits de la invención pueden incluir, instrucciones, un control negativo y/o positivo, contenedores, diluyentes y amortiguadores para la muestra, cartas indicadoras para las comparaciones de firma, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, aplicadores o contenedores, y recipientes para la preparación de la muestra, así como cualquier reactivo deseado, incluidos medios, reactivos de lavado y reactivos de concentración. Tal es reactivos pueden seleccionarse fácilmente entre los reactivos descritos aquí, y entre los reactivos de concentración convencionales. En una modalidad deseable, el reactivo de lavado es una solución salina isotónica que ha sido amortiguada hasta pH fisiológico, tal como solución salina amortiguada de fosfato (PBS); el reactivo de elusión es PBS que contiene NaCl 0,4 M, y los reactivos de concentración y dispositivos. Por ejemplo, alguien entrenado en la técnica reconocerá que pueden ser útiles reactivos tales como polietilén glicol (PEG), o NH_{4}SO_{4}, o dispositivos tales como filtros. Por ejemplo, un dispositivo filtrante con una membrana 100 K concentraría al VAAr.
Los kits suministrados por la presente invención, son útiles para llevar a cabo los métodos descritos aquí, y para el estudio de biodistribución, epidemiología, modo de transmisión de nuevos serotipos del VAA en humanos y en los PHN.
Así, los métodos y kits de la invención permiten la identificación de secuencias objetivo del VAA, particularmente las secuencias integradas del VAA.
En un ejemplo notable, el método de la invención facilitó el análisis de las secuencias del VAA clonadas por los inventores, lo cual reveló heterogeneidad de las secuencias provirales entre los fragmentos clonados de diferentes animales, todos los cuales fueron distintos de los seis serotipos conocidos del VAA, con la mayoría de las variaciones localizadas para las regiones hipervariables de la proteína de la cápside. Se observó una sorprendente divergencia de las secuencias del VAA en clones aislados a partir de las fuentes sencillas de tejido, tal como el nodo linfático, de un mono rhesus individual. Esta heterogeneidad se explica mejor por medio de la evolución aparente de la secuencia del VAA dentro de animales individuales, debido en parte, a una recombinación homóloga extensa entre un número limitado de virus parenterales coinfectados. Estos estudios sugieren la evolución de la secuencia de virus ampliamente diseminados durante el curso de una infección natural por el VAA que presumiblemente conduce a la formación de multitudes de cuasiespecies que difieren de los virus en una forma que antiguamente se pensaba que estaba restringida a virus de ARN.
Se proveen las secuencias de diferentes serotipos nuevos del VAA identificadas por medio del método de la invención y la caracterización de estos serotipos.
III. Nuevos serotipos del VAA A. Secuencias de Ácido Nucleico
Se proveen las secuencias de ácido nucleico de nuevos serotipos del VAA identificadas por medio de los métodos de la invención. Ver, las SEQ ID NOS: 1, 9 - 59, y 117 - 120. Ver también el listado de secuencia.
Para el nuevo serotipo VAA7, se suministran las secuencias completas, incluidos los ITR 5' del VAA, la cápside, rep, y los ITR 3' del VAA en una SEQ ID NO: 1.
Para otros serotipos nuevos del VAA, se provee el fragmento aproximadamente de 3,1 kb aislados de acuerdo al método de la invención. Este fragmento contiene secuencias que codifican a la proteína completa de la cápside, y todo o parte de las secuencias que codifican a la proteína rep. Estas secuencias incluyen a los clones identificados más adelante.
Para aún otros serotipos nuevos del VAA, se provee la región de firma que codifica a la proteína de la cápside. Por ejemplo, las secuencias d ácido nucleico del VAA10 incluyen a aquellas ilustradas en la SEQ ID NO: 117, que abarca 255 bases. Las secuencias de ácido nucleico del VAA11 incluyen a las secuencias de ADN ilustradas en la SEQ ID NO: 118 que abarca 258 bases. Las secuencias de ácido nucleico del VAA12 incluyen a las secuencias de ADN ilustradas en la SEQ ID NO: 119, que consiste de 255 bases. Utilizando la metodología descrita anteriormente, pueden además identificarse fácilmente las secuencias VAA10, VAA11 y VAA12 y utilizarse para una variedad de propósitos, incluidos aquellos descritos para VAA7 y los otros nuevos serotipos incluso.
Las nuevas secuencias de PHN identificadas por la invención incluyen a aquellas suministradas a continuación en la Tabla I, que se identifican por medio de un número de clon:
TABLA I
Secuencia de la Número de Clon Fuente
Cápsula del VAA
Especie Tejido SEQ ID NO (ADN)
Rh.1 Clon 9 (VAA9) Rhesus Corazón 5
Rh.2 Clon 43.1 Rhesus MLN 39
Rh.3 Clon 43.5 Rhesus MLN 40
Rh.4 Clon 43.12 Rhesus MLN 41
Rh.5 Clon 43.20 Rhesus MLN 42
Rh.6 Clon 43.21 Rhesus MLN 43
Rh.7 Clon 43.23 Rhesus MLN 44
Rh.8 Clon 43.25 Rhesus MLN 45
Rh.9 Clon 44.1 Rhesus Hígado 46
Rh.10 Clon 44.2 Rhesus Hígado 59
Rh.11 Clon 44.5 Rhesus Hígado 47
Rh.12 Clon 42.1B Rhesus MLN 30
Rh.13 Clon 42.2 Rhesus MLN 9
TABLA I (continuación)
Secuencia de la Número de Clon Fuente
Cápsula del VAA
Especie Tejido SEQ ID NO (ADN)
Rh.14 Clon 42.3A Rhesus MLN 32
Rh.15 Clon 42.3B Rhesus MLN 36
Rh.16 Clon 42.4 Rhesus MLN 33
Rh.17 Clon 42.5A Rhesus MLN 34
Rh.18 Clon 42.5B Rhesus MLN 29
Rh.19 Clon 42.6B Rhesus MLN 38
Rh.20 Clon 42.8 Rhesus MLN 27
Rh.21 Clon 42.10 Rhesus MLN 35
Rh.22 Clon 42.11 Rhesus MLN 37
Rh.23 Clon 42.12 Rhesus MLN 58
Rh.24 Clon 42.13 Rhesus MLN 31
Rh.25 Clon 42.15 Rhesus MLN 28
Rh.26 Clon 223.2 Rhesus Hígado 49
Rh.27 Clon 223.4 Rhesus Hígado 50
Rh.28 Clon 223.5 Rhesus Hígado 51
Rh.29 Clon 223.6 Rhesus Hígado 52
Rh.30 Clon 223.7 Rhesus Hígado 53
Rh.31 Clon 223.10 Rhesus Hígado 48
Rh.32 Clon C1 Rhesus Bazo, Duodeno, 19
Riñón e Hígado
Rh.33 Clon C3 Rhesus 20
Rh.34 Clon C5 Rhesus 21
Rh.35 Clon F1 Rhesus Hígado 22
Rh.36 Clon F3 Rhesus 23
Rh.37 Clon F5 Rhesus 24
Cy.1 Clon 1.3 Cyno Sangre 14
Cy.2 Clon 13.3B Cyno Sangre 15
Cy.3 Clon 24.1 Cyno Sangre 16
Cy.4 Clon 27.3 Cyno Sangre 17
Cy.5 Clon 7.2 Cyno Sangre 18
TABLA I (continuación)
Secuencia de la Número de Clon Fuente
Cápsula del VAA
Especie Tejido SEQ ID NO (ADN)
Cy.6 Clon 16.3 Cyno Sangre 10
bb.1 Clon 29.3 Mandril Sangre 11
bb.2 Clon 29.5 Mandril Sangre 13
Ch.1 Clon A3.3 Chimpancé Sangre 57
Ch.2 Clon A3.4 Chimpancé Sangre 54
Ch.3 Clon A3.5 Chimpancé Sangre 55
Ch.4 Clon A3.7 Chimpancé Sangre 56
Un nuevo clon de PHN fue elaborado empalmando fragmentos de cápsides de 2 adenovirus de chimpancé centro de una construcción rep de VAA2. Este nuevo clon, A3.1, es también llamado Ch.5 [SEQ ID NO: 20]. Adicionalmente, la presente invención incluye dos secuencias del VAA humano, llamadas H6 [SEQ ID NO: 25] y H2 [SEQ ID
NO: 26].
Las secuencias de ácido nucleico del VAA abarcan además a la cadena que es complementaria de las cadenas suministradas en las secuencias proporcionadas en el Listado de Secuencia [SEQ ID NOS: 1, 9 - 59, 117 - 120], en las secuencias de ácido nucleico, así como las secuencias de ADNc y ARN que corresponden a las secuencias suministradas en el Listado de Secuencia [SEQ ID NOS: 1, 9 - 59, 117 - 120], y sus cadenas complementarias. También están incluidas en las secuencias de ácido nucleico las variantes naturales y las modificaciones por ingeniería genética de las secuencias del Listado de Secuencia [SEQ ID NOS: 1, 9 - 59, 117 - 120], y sus cadenas complementarias. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcas que son conocidas en el arte, mutilación, y sustitución de uno o más de los nucleótidos de ocurrencia natural con un nucleótido degenerado.
Además, están incluidas las secuencias de ácido nucleico que son mayores al 85%, preferiblemente aproximadamente al menos 90%, más preferiblemente aproximadamente al menos 95%, y lo más preferible aproximadamente al menos de 98 a 99% de identidad u homología con las secuencias de la invención, incluido el Listado de Secuencia [SEQ ID NOS: 1, 9 - 59, 117 - 120]. Estos términos son como se los define aquí.
También están incluidos los fragmentos de las nuevas secuencias del VAA identificados por medio del método descrito aquí. Los fragmentos adecuados son de al menos 15 nucleótidos de longitud, y abarcan fragmentos funcionales, esto es, fragmentos que son de interés biológico. En una modalidad, estos fragmentos son fragmentos de las nuevas secuencias del Listado de Secuencia [SEQ ID NOS: 1, 9 - 59, 117 - 120], sus cadenas complementarias, ARN y ADNc complementarios de ellos.
Se proveen ejemplos de fragmentos adecuados con respecto a la ubicación de estos fragmentos sobre VAA1, VAA2, o VAA7. Sin embargo, utilizando la alineación suministrada aquí (obtenida utilizando el programa Clustal W de configuración por defecto), o técnicas similares para generar una alineación con otros serotipos nuevos de la invención, alguien entrenado en la técnica puede identificar fácilmente al nucleótido preciso de los codones de inicio y detención para los fragmentos deseados.
Ejemplos de fragmentos adecuados incluyen a las secuencias que codifican a las tres proteínas variables (pv) de la cápside del VAA que son variantes alternativas de empalme pv1 [por ejemplo, nt 825 a 3049 del VAA7, SEQ ID
NO: 1]; pv2 [por ejemplo, nt 1234 - 3049 del VAA7, SEQ ID NO: 1]; pv3 [por ejemplo, nt 1434 - 3049 del VAA7, SEQ ID NO: 1]. Es notable que VAA7 tenga un codón de inicio GTG inusual. Con la excepción de unos pocos genes constitutivos, tal como un codón de inicio que no ha sido previamente reportado en los virus de ADN. Se ha creído que los codones de inicio para pv1, pv2 y pv3 para otros serotipos del VAA son tales que ellos permitan al mecanismo celular de las células huésped en las cuales ellos residen para producir pv1, pv2 y pv3 en una proporción de 10%:10%:80%, respectivamente, 9 un ensamblaje eficiente del virión. Sin embargo, se ha encontrado que el virión VAA7 se ensambla eficientemente aún con este raro codón de inicio GTG. Así, los inventores anticipan que esto es deseable para alterar al codón de inicio del pv3 de otros serotipos del VAA para que contengan éste raro codón de inicio del GTG, con el propósito de mejorar la eficiencia del empaquetamiento, para alterar la estructura del virión y/o para alterar la ubicación de los epítopos (por ejemplo, epítopos para neutralización de los anticuerpos) de otros serotipos del VAA. Los codones de inicio pueden alterarse utilizando técnicas convencionales que incluyen, por ejemplo, mutagénesis
dirigida al sitio. Los viriones alterados del VAA pueden ser de cualquier serotipo seleccionado, compuesto de un pv3, y/o opcionalmente, pv1 y/o pv2 que tengan codones de inicio alterados para GTG.
Otros fragmentos adecuados del VAA, incluyen a un fragmento que contiene al codón de inicio para la proteína de la cápside del VAA [por ejemplo, nt 468 a 3090 de VAA7, SEQ ID NO: 1, nt 725 a 3090 del VAA7, SEQ ID NO: 1, y las regiones correspondientes de los otros serotipos del VAA]. Aún otros fragmentos de VAA7 y los otros serotipos nuevos del VAA identificados utilizando los métodos descritos aquí, incluyen a aquellos que codifican a las proteínas rep, incluido rep 78 [por ejemplo, codón de iniciación 334 para VAA7), rep 69 [codón de iniciación nt 334 para VAA7], rep 52 [codón de iniciación 1006 para VAA7], y rep 40 [codón de iniciación 1006 para AVV]. Otros fragmentos de interés pueden incluir a las repeticiones terminales invertidas ITR del VAA5, [nt 1 a 107 para VAA7]; las ITR del VAA3 [nt 4704 a 4721 para VAA7], secuencias P19. Las secuencias P40 del VAA, el sitio de enlazamiento rep, y el sitio terminal determinado (STD). Aún otros fragmentos adecuados serán fácilmente evidentes para aquellos entrenados en la técnica.
Además de las secuencias de ácido nucleico suministradas en las figuras y en el Listado de Secuencia, existen moléculas y secuencias de ácido nucleico que se diseñan para expresar a las secuencias de aminoácidos, las proteínas y los péptidos de los serotipos del VAA de la invención. Estas incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican a las siguientes secuencias nuevas de aminoácidos del VAA: C1 [SEQ ID NO: 60], C2 [SEQ ID NO: 61], C5 [SEQ ID NO: 62], A3-3 [SEQ ID NO: 66], A3-7 [SEQ ID NO: 67], A3-4 [SEQ ID NO: 68], A3-5 [SEQ ID NO: 69],
3.3b [SEQ ID NO: 62], 223.4 [SEQ ID NO: 73], 223-5 [SEQ ID NO: 74], 223-10 [SEQ ID NO: 75], 223-2 [SEQ ID NO: 76], 223-7 [SEQ ID NO: 77], 223-6 [SEQ ID NO: 78], 44-1 [SEQ ID NO: 79], 44-5 [SEQ ID NO: 80], 44-2 [SEQ ID NO: 81], 42-15 [SEQ ID NO: 84], 42-8 [SEQ ID NO: 85], 42-13 [SEQ ID NO: 86], 42-3A [SEQ ID NO: 87], 42-4 [SEQ ID NO: 88], 42-5A [SEQ ID NO: 89], 42-1B [SEQ ID NO: 90], 42-5B [SEQ ID NO: 91], 43-1 [SEQ ID NO: 92], 43-12 [SEQ ID NO: 93], 43-5 [SEQ ID NO: 94], 43-21 [SEQ ID NO: 96], 43-25 [SEQ ID NO: 97], 43-20 [SEQ ID NO: 99], 24.1 [SEQ ID NO: 101], 42.2 [SEQ ID NO: 102], 7.2 [SEQ ID NO: 103], 27.3 [SEQ ID NO: 104], 16.3 [SEQ ID NO: 105], 42.10 [SEQ ID NO: 106], 42-38 [SEQ ID NO: 107], 42-11 [SEQ ID NO: 108],
F1 [SEQ ID NO: 109], F5 [SEQ ID NO: 110], F3 [SEQ ID NO: 111], 42-6B [SEQ ID NO: 112], y/o 42-12 [SEQ ID NO: 113], y los serotipos artificiales del VAA generados utilizando estas secuencias y/o los fragmentos únicos de los mismos.
Como se utiliza aquí, los serotipos del VAA incluyen, sin limitación, un VAA con una proteína de la cápside de ocurrencia no natural. Tal cápside artificial puede ser generada por medio de cualquier técnica adecuada, utilizando una nueva secuencia del VAA (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside de pv1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse a partir de otro serotipo del VAA (conocido o desconocido), porciones no contiguas del mismo serotipo del VAA, de una fuente viral no del VAA, o de una fuente no viral. Un serotipo artificial del VAA puede ser, sin limitación, una cápside quimérica del VAA, una cápside recombinante del VAA, o una cápside "humanizada" del VAA.
B. Secuencias de Aminoácidos del VAA, Proteínas y Péptidos
La invención provee proteínas y fragmentos de éstos que son codificados por las secuencias de ácido nucleico de los serotipos nuevos del VAA identificados aquí, incluyendo, por ejemplo, VAA7 [nt 825 a 3049 del VAA7, SEQ ID NO: 1] los otros serotipos nuevos suministrados aquí. Así, las proteínas de la cápside de los serotipos nuevos de la invención, que incluyen: H6 [SEQ ID NO: 25], H2 [SEQ ID NO: 26], 42-2 [SEQ ID NO: 9], 42-8 [SEQ ID NO: 27], 42-15 [SEQ ID NO: 28], 42-5b [SEQ ID NO: 29], 42-1b [SEQ ID NO: 30]; 42-13 [SEQ ID NO: 31], 42-3a [SEQ ID NO: 32], 42-4 [SEQ ID NO: 33], 42-5a [SEQ ID NO: 34], 42-10 [SEQ ID NO: 35], 42-3b [SEQ ID NO: 36], 42-11 [SEQ ID NO: 37], 42-6b [SEQ ID NO: 38], 43-1 [SEQ ID NO: 39], 43-5 [SEQ ID NO: 40], 43-12 [SEQ ID NO: 41], 43-20 [SEQ ID NO: 42], 43-21 [SEQ ID NO: 43], 43-23 [SEQ ID NO: 44], 43-25 [SEQ ID NO: 45], 44.1 [SEQ ID NO: 47], 44.5 [SEQ ID NO: 47], 223.10 [SEQ ID NO: 48], 223.2 [SEQ ID NO: 49], 223.4 [SEQ ID NO: 50], 223.5 [SEQ ID NO: 51], 223.6 [SEQ ID NO: 52], 223.7 [SEQ ID NO: 53], A3.4 [SEQ ID NO: 54], A3.5 [SEQ ID NO: 55], A3.7 [SEQ ID NO: 56], A3.3 [SEQ ID NO: 57], 42.12 [SEQ ID NO: 58], y 44.2 [SEQ ID NO: 59], pueden generarse fácilmente utilizando técnicas convencionales a partir de los marcos de lectura abierta suministrados por los clones anteriormente enlistados.
Las secuencias, proteínas, y fragmentos pueden producirse por medio de cualquiera de los medios adecuados, que incluyen producción recombinante, síntesis química, u otros medios de síntesis. Tales métodos de producción son conocidos por aquellos entrenados en la técnica.
IV. Producción de VAAr con nuevas cápsides del VAA
Los serotipos nuevos, de tipo silvestre del VAA pueden identificarse por medio de la invención, cuyas secuencias de los serotipos de tipo silvestre del VAA están libres de ADN y/o de material celular con estos virus asociados de forma natural. En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas que utilizan las nuevas secuencias del VAA de la invención, incluidos los fragmentos de las mismas, para la producción de moléculas útiles en la inserción de un gen heterólogo o de otras secuencias de ácido nucleico para una célula objetivo.
Los siguientes ejemplos ilustran diferentes aspectos y modalidades de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
amplificación por PCR, clonación y caracterización de nuevas secuencias del VAA
Los tejidos de los primates no humanos fueron protegidos por las secuencias del VAA utilizando un método PCR basado en nucleótidos para las regiones altamente conservadas de los VAA conocidos. Se seleccionó un estiramiento de la secuencia del VAA que se extiende desde 2886 hasta 3143 pb del VAA1 [SEQ ID NO: 6] como un amplicón por PCR en el cual una región hipervariable de la proteína de la cápside (Cap) que es única para cada serotipo conocido del VAA, que es llamada aquí una "región de firma," está flanqueada por secuencias conservadas. En análisis posteriores, se mostró que esta región de firma estaba localizada entre los residuos conservados que se abarcan la región 
\hbox{hipervariable 3.}
Un examen inicial de la sangre periférica de un cierto número de especies de primates no humanos reveló VAA detectable en un subconjunto de animales de especies tales como los macacos rhesus, los macacos cinomólogos, los chimpancés y los babuinos. Sin embargo, no se detectaron secuencias del VAA en algunas otras especies analizadas, incluidos los machacaos japoneses, los macacos cola de cerdo y los monos ardilla. Se llevó a cabo un análisis más exhaustivo de la distribución del vector en tejidos de monos rhesus de la Universidad de Pensilvania y en las colonias de Tulane recuperadas en la necropsia. Esto reveló una secuencia del VAA en una gran variedad de tejidos.
A. Amplificación de una región de firma del VAA
Se alinearon una con la otra las secuencias de ADN de VAA1-6 y los VAA aislados de Ganso y de pato utilizando "Clustal W" en configuraciones por defecto. Se compararon las similitudes de secuencia entre los VAA. En la línea de estudio, los inventores identificaron una región de 257 pb que abarca desde 2886 pb hasta 3143 pb de VAA 1 [SEQ ID NO: 6], y a la región correspondiente en los genomas de VAA 2-6. Se localizó esta región con el gen de la cápside del VAA y tiene en el medio secuencias altamente conservadas en ambos extremos 5' y 3' y es una secuencia relativamente variable en el medio. Además, esta región contiene un sitio para la enzima de restricción DraIII (CACCACGTC, SEQ ID NO: 15). Los inventores han encontrado que esta región sirve como firma específica para cada tipo conocido de ADN del VAA. En otras palabras, después de las reacciones PCR, de digestión con endonucleasas que son específicas para cada uno de los serotipos conocidos y del análisis por electroforesis sobre gel, estas regiones pueden ser utilizadas para identificar definitivamente al ADN amplificado como siendo del serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, o de otro serotipo.
Los iniciadores fueron diseñados, validados y se optimizaron las condiciones PCR con controles de ADN de los VAA1, 2 y 5. Los iniciadores se basaron en las secuencias del iniciador VAA2: 5', 1S: pb 2867-2891 de VAA2 (SEQ ID NO: 7) y del iniciador 3', 18as, pb 3095-3121 del VAA2 (SEQ ID NO:7).
Los ADN celulares de diferentes tejidos incluidos sangre, cerebro, hígado, pulmón, testículo, etc. de diferentes monos rhesus fueron estudiados utilizando la estrategia descrita anteriormente. Los resultados revelaron que los ADN de los diferentes tejidos de estos monos dieron origen a fuertes amplificaciones por PCR. Otros análisis de restricción de los productos PCR indicaron que ellos fueron amplificados a partir de secuencias del VAA diferentes de cualquiera de las secuencias publicadas del VAA.
Los productos PCR (alrededor de 255 pb en tamaño) de los AND de una variedad de tejidos de monos han sido clonados y secuenciados. Estudios bioinformáticos de estas nuevas secuencias del VAA indican que ellas son nuevas secuencias del VAA del gen de la cápside y distintas entre sí. Se llevaron a cabo múltiples análisis de alineación de secuencia utilizando el programa Clustal W (1.81). El porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones de firma de los genomas de VAA 1-7 y VAA 10-12 se suministra a continuación.
TABLA 1 Secuencias para Análisis
Secuencia # Serotipo del VAA Tamaño (pb)
1 VAA1 258
2 VAA2 255
3 VAA3 255
4 VAA4 246
TABLA 1 (continuación)
Secuencia # Serotipo del VAA Tamaño (pb)
5 VAA5 258
6 VAA6 258
7 VAA7 258
10 VAA10 255
11 VAA11 258
12 VAA12 255 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Alineación por Pares (Porcentaje de Identidad)
VAA2 VAA3 VAA4 VAA5 VAA6 VAA7 VAA10 VAA11 VAA12
VAA1 90 90 81 76 97 91 93 94 93
VAA2 93 79 78 90 90 93 93 92
VAA3 80 76 90 92 92 92 92
VAA4 76 81 84 82 81 79
VAA5 75 78 79 79 76
VAA6 91 92 94 94
VAA7 94 92 92
VAA10 95 93
VAA11 94
Se aislaron y se secuenciaron por encima de 300 clones que contienen nuevas secuencias del serotipo del VAA que abarcan a la región seleccionada de 257 pb. Los análisis bioinformáticos de estos 300+ clones sugieren que esta región de 257 pb es crítica, sirviendo como un buen marcador de región o de secuencia de firma para aislamiento rápido e identificación de un nuevo serotipo del VAA.
B. Uso de la región de firma para amplificación por PCR
Se utilizó la región de firma de 257 pb como un ancla PCR para extender las amplificaciones por PCR hasta 5' del genoma para cubrir la región de unión de los genes rep y cap (1398 pb - 3143 pb, SEQ ID NO: 6) y 3' del genoma para obtener la secuencia génica de la cápsula completa (2866 pb - 4600 pb, SEQ ID NO: 6). Las aplicaciones por PCR fueron llevadas a cabo utilizando las condiciones estándar, incluidas la desnaturalización a 95ºC durante 0,5-1 minuto, recociendo a 60-65ºC durante 0,5-1 minuto y una extensión a 72ºC durante 1 minuto por kb con un número total de ciclos de amplificación en el rango de 28 a 42.
Utilizando las secuencias alineadas como se describe en "A", se identificaron otras dos regiones relativamente conservadas en la secuencia localizada en el extremo 3' de los genes rep y 5' para la región de 257 pb, y secuencia abajo del fragmento de 257 pb pero antes de las ITR 3' del VAA. Se diseñaron dos grupos de nuevos iniciadores y condiciones PCR optimizadas para la recuperación de la cápside completa y una parte de las secuencias rep de los nuevos serotipos del VAA. Más específicamente, para la amplificación 5', el iniciador 5', AV1Ns, fue GCTGCGT
CAACTGGACCAATGAGAAC 'nt 1398 - 1423 del VAA1, SEQ ID NO: 6] y el iniciador 3' fue 18as, identificado más arriba. Para la amplificación 3', el iniciador 5' fue 1s, identificado anteriormente, y el iniciador 3' fue AV2Las, TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG [nt 4435 - 4462 de VAA2, SEQ ID NO: 7].
En estas amplificaciones por PCR, la región de 257 pb fue utilizada como un ancla PCR y marcador de región para generar el traslapo de los fragmentos para construir un gen completo de la cápside por fusión en el sitio DraIII en la región de firma seguido por la amplificación de los fragmentos de extensión 5' y 3' obtenidos como se describió aquí. Más particularmente, para generar al gen intacto de la cápsula del VAA, las secuencias de los tres productos de amplificación (a) de la región de firma; (b) las secuencias de la extensión 5'; y (c) las secuencias de la extensión 3' fueron clonadas dentro de una columna vertebral del plásmido pCR4-Topo [Invitrogen] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después, se digirieron los plásmidos con DraIII ni se recombinaron para formar un gen intacto de la cápsula.
En esta línea de trabajo, aproximadamente 80% de las secuencias de la cápside del VAA7 y del VAA8 fueron aisladas y analizadas. Otro serotipo nuevo, VAA9, también fue descubierto a partir del Mono #2.
Utilizando las condiciones PCR descritas anteriormente, la porción restante de la secuencia del gen rep para VAA7 se aisla y se clona utilizando los iniciadores que amplifican de 108 pb hasta 1461 pb del genoma del VAA (calculado con base en la numeración de VAA2, SEQ ID NO: 7). Este clon se secuencia para la construcción de un genoma completo del VAA7 sin las ITR.
C. Amplificación Directa del Fragmento de Cápsula de 3,1 kb
Para amplificar directamente fragmento completo de cápsula de 3,1 kb a partir de tejido de PHN y de los ADN de la sangre, se identificaron otras dos regiones altamente conservadas en los genomas del VAA para usarlas en amplificación PCR de fragmentos grandes. Se seleccionó un iniciador dentro de una región conservada localizada en la mitad del gen rep (AV1ns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt 1398-1423 de la SEQ ID
NO: 6) en combinación con el iniciador 3' localizado en otra región conservada secuencia abajo del gen Cap (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID NO: 7) para la amplificación de los fragmentos completos de la cápsula. Los productos PCR fueron clonados con Topo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen) y los análisis de secuencia fueron realizados por Quiagengenomics, Seatle, WA) con una precisión \geq99,9%. Un total de 50 clones de cápside fueron aislados y caracterizados. Entre ellos, 37 clones se derivaron de los tejidos del macaco Rhesus (rh.1 - rh.37), seis clones de los macacos cinomólogos (cy.1 - cy.6), 2 clones de los Mandriles (bb.1 y bb.2) y 5 clones de los Chimpancés (ch.1 - ch.5).
Para descartar la posibilidad de que la diversidad de la secuencia dentro de la nueva familia del VAA una no fuera un artefacto del PCR, tal como el acoplamiento del gen mediado por PCR por la extensión del traslapo entre dirigentes moldes parciales de ADN con secuencias homólogas, o el resultado del proceso de recombinación en bacterias, se realizaron una serie de experimentos bajo idénticas condiciones para la amplificación de VP1 utilizando los ADN celulares totales. Primero, los plásmidos intactos VAA7 y VAA8 fueron mezclados en una relación molar igual seguido de una serie de diluciones. Las mezclas diluidas serialmente fueron utilizadas como moldes para amplificación por PCR de los fragmentos VP1 de 3,1 kb utilizando iniciadores universales e idénticas condiciones PCR a aquellas que fueron utilizadas para las amplificaciones del ADN para ver si se generaron productos híbridos por PCR. La mezcla fue transformada dentro de bacterias y los transformantes fueron aislados para buscar la posibilidad de clones híbridos derivados del proceso de recombinación en células bacterianas. En un experimento diferente, se restringió a los plásmidos VAA7 y VAA8 con Msp I, Ava I y Hael, todos los cuales cortan ambos genomas múltiples veces en diferentes posiciones, mezclando las digestiones en diferentes combinaciones y utilizándolas para amplificación por PCR de los fragmentos VP1 bajo las mismas condiciones para probar si cualquiera de los productos PCR podría ser generado a través del traslapo de la extensión de la secuencia de las secuencias parciales del VAA. En otro experimento, se diluyó serialmente una mezcla de un fragmento 5' VP1 de VAA7 de 1,5 kb purificado sobre gel y un fragmento 3' VP1 de VAA8 de 1,7 kb con traslapo en la región de firma, y se la utilizó para amplificación por PCR en presencia y en ausencia de 200 ng de ADN celular extraído de una línea celular de mono que estaba libre de secuencias del VAA por medio de análisis TaqMan. Ninguno de estos experimentos demostró una producción eficiente de traslapo de secuencia mediado por PCR bajo las condiciones de amplificación Cap del ADN genómico (datos no mostrados). Como confirmación adicional, se diseñaron 3 pares de iniciadores, que fueron ubicados en diferentes HVR, y fueron específicos para secuencia de las variantes del clon 42s del macaco Rhesus F953, en diferentes combinaciones para amplificar los fragmentos más cortos del ADN del nodo linfático mesentérico (NLM) de F953, a partir del cual se aislaron los clones 42s. Todas las variaciones de la secuencia identificadas en los clones Cap completos, fueron encontradas en estos fragmentos cortos (datos no mostrados).
Ejemplo 2
Los Virus Adeno-Asociados Sufren una Evolución Sustancial en los Primates Durante Infecciones Naturales
El análisis de secuencia de los aislados seleccionados del VAA reveló una divergencia en todo el genoma que está más concentrado en las regiones hipervariables de las proteínas de la cápside. Los datos epidemiológicos indican que todos serotipos conocidos son endémicos para los primates, aunque el aislamiento de aislados clínicos ha sido restringido a VAA2 y VAA3 a partir de frotis anales y de garganta de infantes humanos y a VAA5 a partir de una verruga condilomatosa humana. No se han asociado secuelas clínicas conocidas con una infección por VAA.
En un intento por comprender mejor la biología del VAA, se utilizaron primates no humanos como modelos para caracterizar las secuelas de las infecciones naturales. Se muestrearon los tejidos de primates no humanos para las secuencias del VAA utilizando el método PCR de la invención con base en oligonucleótidos para las regiones altamente conservadas de los VAA conocidos (ver Ejemplo 1). Se seleccionó un estiramiento de la secuencia del VAA que abarca desde 2886 hasta 3143 pb de VAA1 [SEQ ID NO: 6] como un amplicón PCR cuyas secuencias conservadas están flanqueadas por una región hipervariable que es única para cada serotipo conocidos del VAA, llamado aquí una "región de firma".
Un estudio inicial de la sangre periférica de un cierto número de especies de primates no humanas que incluye monos rhesus, monos cinomólogos, chimpancés, y mandiles reveló VAA detectable en un subconjunto de animales de todas las especies. Un análisis más exhaustivo de la distribución del vector fue conducida en tejidos de monos rhesus de la Universidad de Pensilvania y de las colonias de Tulane, recuperados en la necropsia. Esto reveló una secuencia de VAA en toda una amplia gama de tejidos.
Las secuencias amplificadas de firma fueron subclonadas en plásmidos y los transformantes individuales fueron sometidos a análisis de secuencia. Esto reveló una variación sustancial en la secuencia de nucleótidos de los clones derivados de diferentes animales. La variación en la secuencia de firma también fue observada en clones obtenidos en animales individuales. Los tejidos recolectados de dos animales en los cuales se identificaron secuencias únicas de firma (esto es, colon de 98E044 y corazón de 98E056) se caracterizaron además por expandir la secuencia amplificada por PCR utilizando oligonucleótidos para las secuencias altamente conservadas. Esta forma, se reconstruyeron estructuras provirales completas para los genomas virales de ambos tejidos como se describe aquí. Estos provirus difieren de los otros VAA conocidos con la divergencia más grande de secuencia observada en regiones del gen Cap.
Se realizaron experimentos adicionales para confirmar que las secuencias residentes del VAA en tejido de primate no humano representa genomas provirales de virus infecciosos que pueden ser rescatados y forman viriones. El ADN genómico de tejido de hígado del animal 98E056, a partir del cual se detectó la secuencia de firma del VAA8, fue digerido con una endonucleasa que no tiene un sitio dentro de la secuencia del VAA, y transfectado en células 293 con un plásmidos que contiene un genoma suprimido E1 del serotipo 5 de adenovirus humano como fuente de funciones auxiliares. El lisado resultante fue pasado una vez sobre células 293 y se recuperó el lisado y se lo analizó por la presencia de proteínas Cap del VAA utilizando un anticuerpo policlonal de reacción general con las proteínas Cap, y por la presencia y abundancia de secuencias de ADN a partir del provirus del VAA amplificado por PCR, a partir del cual se derivó VAA8. La transfección de endonucleasa restringió al ADN de corazón y el plásmido auxiliar del adenovirus produjo una gran cantidad del virus VAA8 como se demostró por la detección de proteínas Cap por medio del análisis Western blot, y de la presencia de 10^{4} genomas del vector VAA8 por célula 293. Los lisados se generaron a partir de una preparación a gran escala, y se purificó al VAA por medio de sedimentación con cesio. La preparación purificada demostró estructuras icosahédricas de 26 nm que parecían idénticas a aquellas del serotipo 2 del VAA. La transfección sólo con el auxiliar de adenovirus no produjo proteínas o genomas del VAA, descartando la contaminación como una fuente del VAA rescatado.
Para caracterizar más la variación de la secuencia de firma del VAA dentro del animal y entre animales, se sometieron los tejidos seleccionados a un PCR extendido para amplificar los marcos completos de lectura abierta de Cap.
Los fragmentos resultantes fueron clonados en plásmidos bacteriales y se aislaron los transformantes individuales y se los secuenció completamente. Este análisis involucró nodos linfáticos mesentéricos de tres monos rhesus (Tulane/V223 - 6 clones; Tulane/T612 - 7 clones; Tulane/F953 - 14 clones), hígado de dos monos rhesus (Tulane/V251 - 3 clones; Penn/00E033 - 3 clones), bazo de un mono rhesus (Penn/97E043 - 3 clones), corazón de un mono rhesus (IHGT/98E046 - 1 clon) y sangre periférica de un chimpancé (New Iberia/X133 - 5 clones), seis macacos cinomólogos (Charles River/A1378, A3099, A3388, A3442, A2821, A3242 - 6 clones en total) y un Mandril (SFRB/8644 - 2 clones). De los 50 clones que por secuenciados a partir de 15 diferentes animales, 30 fueron considerados no redundantes con base en el hallazgo de al menos 7 diferencias en los aminoácidos entre sí. Los clones no redundantes VP1 se enumeran secuencialmente en la medida en que se aislan, con un prefijo que indica la especie de primate no humano a partir del cual se derivan. La relación estructural entre estos 30 clones no redundantes y los 8 serotipos del VAA previamente descritos, fue determinada utilizando el programa Splits Tree [Huson, D. H. SplitsTree: analyzing and visualizing evolutionary data. Bioinformatics 14, 68-73 (1998)] con la implementación del método de descomposición del empalme. El análisis describe homeoplásia entre un grupo de secuencias en una red tipo árbol en vez de un árbol que se bifurca. La ventaja es que permite la detección de agrupamientos que son el resultado de convergencia y para exhibir las relaciones filogenéticas aún cuando están distorsionadas por eventos paralelos. Se requerirá de una investigación filogenética extensiva con el propósito de dilucidar la evolución del VAA, mientras que la intención aquí es solamente la de agrupar a los diferentes clones por sus similitudes de secuencia.
Para confirmar que las nuevas secuencias VP1 se derivaron de genomas virales infecciosos, se restringió al ADN celular de tejidos con alta abundancia de ADN viral, con una endonucleasa que no debe escindir dentro del VAA y transfectar en células 293, seguido por la infección con adenovirus. Esto resulta en el rescate y amplificación de genomas del VAA a partir del ADN de tejidos de dos diferentes animales (datos no mostrados).
Las secuencias VP1 de los nuevos VAA se caracterizaron además con respecto a la naturaleza y localización de la variación de secuencia de aminoácidos. Todos los 30 clones VP1 que se mostró que diferían entre sí en más del 1% de la secuencia de aminoácidos, fueron alineados y marcados por las variaciones en cada residuo. Un algoritmo desarrollado para determinar las áreas divergentes de la secuencia produjo 12 regiones hipervaribles (RHV) de las cuales 5 traslapan o son parte de las 4 regiones variables previamente descritas [Kotin, citado anteriormente; Rutledge, citado anteriormente]. Los picos próximos triples contienen la mayoría de la variabilidad (HVR5-10). En forma muy interesante, los bucles localizados en el eje de pliegue 2 y en el eje de pliegue 5 muestran también una intensa variación. Los HVR 1 y 2 se presentan en la porción N-terminal de las proteína de la cápside que no está resulta en la estructura de rayos X, sugiriendo que el N-terminal de la proteína VP1 está expuesto sobre la superficie del virión.
Se utilizó PCR en tiempo real para cuantificar las secuencias del VAA de los tejidos de 21 monos rhesus utilizando iniciadores y sondas para regiones altamente conservadas de Rep (un grupo) y Cap (dos grupos) de los VAA conocidos. Cada punto de datos representa análisis de ADN de tejido de un animal individual. Esto confirmó la amplia distribución de secuencias del VAA, aunque la distribución cuantitativa difirió entre los animales individuales. La fuente de animales y la historia previa o los tratamientos no pareció que influenciaran la distribución de las secuencias del VAA en los macacos rhesus. Los tres grupos diferentes de iniciadores y de sondas utilizados para cuantificar al VAA, produjeron resultados consistentes. Los niveles más altos de VAA se encontraron constantemente en los modos linfáticos mesentéricos en un promedio de 0,01 copias por genoma diploide para 13 animales que fueron positivos. El hígado y el bazo también contenían gran abundancia de ADN viral. Hubieron ejemplos de VAA muy alto, tal como en el corazón de macacos rhesus 98E056, en el bazo de macacos rhesus 97E043 y en el hígado de macacos rhesus RQ4407, lo cual demostró 1.5, 3 y 20 copias de secuencia del VAA por genoma diploide, respectivamente. Se observaron niveles relativamente bajos de ADN viral en células mononucleares de sangre periférica, sugiriendo que los datos en el tejido no son debidos a componentes residentes en la sangre (datos no mostrados). Debe observarse que este método no necesariamente capturaría a todos los VAA residentes de los primates no humanos ya que la detección requiere de alta homología para ambos oligonucleótidos y la sonda PCR en tiempo real. Los tejidos de los animales con gran abundancia de ADN del VAA fueron analizados adicionalmente por el estado molecular del ADN, por medio de técnicas de hibridación de ADN, y su distribución celular, por medio de hibridación in situ.
La clase de variación de la secuencia revelada en los fragmentos provirales del VAA aislados de diferentes animales y dentro de los tejidos de los mismos animales, es una reminiscencia de la evolución que se presenta por muchos virus de ARN durante pandemias o incluso dentro de la infección de un individuo. En algunas situaciones, se ha reemplazado la noción de un virus de tipo silvestre por la existencia de una multitud de cuasiespecies que evolucionaron como resultado de replicaciones y mutaciones rápidas en presencia de una presión selectiva. Un ejemplo es la infección por HIV, que evoluciona en respuesta a una presión inmunológica y farmacológica. Varios mecanismos contribuyen a la alta velocidad de las mutaciones en los virus de ARN, incluyendo baja fidelidad y la carencia de prueba de la capacidad lectura de la transcriptasa inversa y de la recombinación homóloga y no homologa.
Se ilustró en este estudio la evidencia de la formación de cuasiespecies del VAA por medio de secuenciación sistemática de múltiples fragmentos provirales clonados. En realidad, no podrían encontrarse secuencias idénticas dentro de ninguno de los clones extendidos aislados entre o dentro de animales. Un importante mecanismo para esta evolución de secuencia parece ser una alta velocidad de recombinación homóloga entre un número más limitado de virus parenterales. El resultado neto es el cambio extensivo de regiones hipervaribles de la proteína Cap que conducen a una disposición de quimeras que podrían tener diferente tropismo y especificaciones serológicas (esto es, la capacidad para evadir respuestas inmunológicas especialmente mientras se relaciona con anticuerpos de neutralización). Los mecanismos por medio los cuales podría ocurrir la recombinación homóloga no son claros. Una posibilidad es que las cadenas + y - de diferentes genomas del VAA de cadena sencilla se fijen por calor durante la replicación como ha sido descrito durante la gran multiplicidad de infecciones con VAA recombinantes. No es claro si otros mecanismos contribuyen a la evolución de las secuencias en infecciones por VAA. La velocidad total de las mutaciones que ocurren durante la replicación del VAA parece ser relativamente baja y los datos no sugieren altas frecuencias de errores en la replicación. Sin embargo, se han descrito reordenamientos sustanciales del genoma del VAA durante la infección lítica conduciendo a la formación de partículas que interfieren en forma defectuosa. Independientemente del mecanismo que conduce a la divergencia de secuencia, con pocas excepciones, las estructuras vp1 de las cuasiespecies permanecieron intactas sin desplazamientos del marco o mutaciones sin sentido sugiriendo que la selección competitiva de los virus con el perfil más favorable de adaptabilidad contribuye a las dinámicas de población.
Esos estudios tienen implicaciones en diferentes áreas de la biología y la medicina. El concepto de evolución rápida del virus, que antiguamente se pensaba que era una propiedad restringida a los virus de ARN, debe ser considerada en los virus de ADN, que clásicamente se han caracterizado por ensayos serológicos. Será importante en términos de parvovirus para desarrollar un nuevo método para describir aislados de virus que capturan la complejidad de su estructura y biología, tal como con el VIH, que se categorizan como familias generales de estructura y función similar llamadas Clades. Una estrategia alternativa es la de continuar categorizando aislados con respecto a la especificidad serológica y desarrollar criterios para describir variantes con grupos serológicos.
Ejemplo 3
Vectorología de genomas recombinantes del VAA equipados con las ITR del VAA2 utilizando plásmidos quiméricos que contienen genes rep VAA2 y nuevos cap del VAA para estudios serológicos y de transferencia génica en diferentes modelos de animales
Las construcciones de empaquetamiento quimérico se generan por fusión de rep VAA2 con secuencias cap de serotipos nuevos de VAA. Las construcciones de empaquetamiento quimérico son usadas, inicialmente, para pseudotipaje de genomas recombinantes del VAA que transportan a las ITR del VAA2 por medio de transfección triple en células 293 utilizando al plásmido auxiliar Ad5. Estos vectores de pseudotipaje son utilizados para evaluar el rendimiento en los estudios serológicos basados en transducción y evalúan la eficiencia de la transferencia génica de los nuevos serotipos del VAA en diferentes modelos de animales incluidos los PHN y roedores, antes de aislar a los virus infecciosos e intactos de estos nuevos serotipos.
A. pVAA2PFV
El plásmido del VAA2 que contiene a las ITR del VAA2 y a la proteína fluorescente verde expresada bajo el control de un promotor constitutivo. Este plásmido contiene los siguientes elementos: a las ITR del VAA2, un promotor CMV, y las secuencias de codificación de la PFV.
B. Clonación del plásmido trans
Para construir al plásmido quimérico trans para la producción de vectores recombinantes pseutipados del VAA7, se digirió parcialmente al plásmido p5E18 (Xiao y colaboradores, 1999, J. Virol 73: 3994-4003) con Xho I para linearizar al plásmido en el sitio Xho I en la posición de 3169 pb solamente. Los extremos del corte con Xho I fueron rellenados y ligados nuevamente. Este plásmido modificado p5E18 fue restringido con Xba I y Xho I en una digestión completa para remover la secuencia del gen cap del VAA2 y reemplazarlo con un fragmento Spe I/Xho I de 2267 pb que contiene al gen cap del VAA7 que fue aislado del plásmido pCRAAV7 6-5+15-4.
El plásmido resultante contiene las secuencias rep del VAA2 para Rep78/68 bajo el control del promotor P5 del VAA2, y las secuencias rep del VAA2 para Rep52/40 bajo el control del promotor P19 del VAA2. Las secuencias de la cápside del VAA7 están bajo el control del promotor P40 del VAA2, que se localiza dentro de las secuencias Rep. Este plásmido contiene además un espaciador 5' del rep ORF.
C. Producción de VAAr Pseudotipado
Las partículas VAAr (vector del VAA2 en la cápside del VAA7) se generan utilizando un método libre de adenovirus. En resumen, el plásmido cis (el plásmido pVAA2.1 lacZ que contiene las ITR del VAA2), y el plásmido trans pCRAAV7 6-5+15-4 (que contiene la rep del VAA2 y la cap del VAA7) y un plásmido auxiliar, respectivamente, fueron simultáneamente cotransfectados dentro de células 293 en una proporción 1:1:2 por medio de precipitación con fosfato de calcio.
Para la construcción de los plásmidos auxiliares pAd, se adquirió al plásmido pBG 10 de Microbix (Canadá). Se suprimió un fragmento RsrII que contenía L2 y L3 de pBHG10, resultando en el primer plásmido auxiliar, pAd\DeltaF13. El plásmido Ad\DeltaF1 fue construido por medio de la clonación del fragmento Asp700/SaII con una supresión PmeI/SgfI, aislamiento de pBHG10, dentro de Bluescript. MLP, L2, L2 y L3 fueron suprimidos en el pAd\DeltaF1. Las supresiones adicionales de un fragmento Nrul de 2,3 kb y, posteriormente, de un fragmento RsrII/NruI de 0,5 kb, generó a los plásmidos auxiliares pAd\DeltaF5 y pAd\DeltaF6, respectivamente. El plásmido auxiliar, llamado p\DeltaF6, provee las funciones auxiliares esenciales de E2a y E4 ORF6 no provistas por la célula auxiliar que expresa a E1, pero está suprimido de las proteínas de la cápside adenoviral y de las regiones funcionales E1).
Típicamente, se transfectaron 50 \mug de ADN (cis:trans:auxiliar) sobre una placa para cultivo de tejidos de 150 mm. Se recolectaron las células 293 72 horas después de la transfección, se sonicaron y se las trató con desoxicolato de sodio al 0,5% (37ºC durante 10 min). Los lisados celulares fueron sometidos entonces a dos vueltas de un gradiente de CsCl. Se recolectaron las fracciones de los picos que contenían al vector VAAr, se las reunió y se las dializó contra PBS.
Ejemplo 4
Creación de clones infecciosos que transportan nuevos serotipos intactos del VAA para el estudio de virología básica en líneas celulares derivadas de humanos y PHN, y la evaluación de patogénesis de nuevos serotipos del VAA en PHN y en otros modelos de animales
Para lograr este objetivo, se emplea el sistema del genoma caminante para obtener las secuencias terminales 5' y 3' (las ITR) y la construcción completa de clones que contienen los genomas intactos del serotipo nuevo del VAA.
En resumen, utilizando Universal Genome Walker Kit comercialmente disponible [Clontech], los AND genómicos de tejidos de mono o de líneas celulares que se identifican como positivas por la presencia de la secuencia del VAA7 se digieren con Dra I, EcoR V, Pvu II y Stu I endonucleasas y se ligan al Genome Walker Adaptor para generar 4 Genome Walker Libraries individuales (GWL). Utilizando los ADN de los GWL como moldes, VAA7 y las secuencias genómicas adyacentes serán amplificadas por PCR por el iniciador adaptador 1 (API, suministrado con el kit) y un iniciador 1 específico para VAA7, seguido por un PCR anidado utilizando al iniciador adaptador 2 (AP2) y otro iniciador 2 específico para VAA7, ambos internos al primer grupo de iniciadores. Los principales productos PCR a partir del PCR anidado se clonan y se caracterizan por medio de análisis de secuenciación.
En este experimento, se utilizan los iniciadores que cubren a los 257 pb u otros fragmentos de firma de un genoma genérico del VAA para amplificación PCR de los ADN celulares extraídos de las líneas celulares derivadas de Humano y de PHN para identificar y caracterizar las secuencias latentes del VAA. Los genomas latentes identificados del VAA se rescatan de las líneas celulares positivas utilizando auxiliares adenovirus de diferentes especies y cepas.
Para aislar los clones infecciosos del VAA de las líneas celulares derivadas de PHN, se obtiene una línea celular deseada a partir de ATCC y muestreados por PCR para identificar al amplicón de 257 pb, esto es, la región de firma de la invención. El producto PCR de 257 pb se clona y se serotipea por medio del análisis de secuencia. Para estas líneas celulares que contienen la secuencia del VAA7, las células se infectan con SV-15, un adenovirus de simio adquirido a ATCC, Ad5 humano o transfectado con construcciones de plásmido que alojan a los genes Ad humanos que son responsables por las funciones auxiliares del VAA. 48 horas después de la infección o la transfección, se recogen las células y se prepara el ADN de Hirt para la clonación del genoma del VAA7 siguiendo a Xiao y colaboradores, 1999, J. Virol, 73:3994-4003.
Ejemplo 5
Producción de Vectores del VAA
Se empleó una estrategia de pseudotipaje similar a aquella del Ejemplo 3 para VAA1/7 para producir vectores del VAA2 empacados con proteínas de la cápside del VAA1, VAA5 y VAA8. En resuman, los genomas recombinantes del VAA equipados con las ITR del VAA2 fueron empacados por medio de transfección triple de células 293 con plásmidos cis, plásmido auxiliar de adenovirus y una construcción quimérica de empaquetamiento donde el gen rep del VAA2 se fusiona con genes cap de los nuevos serotipos del VAA. Para crear las construcciones quiméricas de empaquetamiento, el sitio Xho I del plásmido p5E18 en 3169 pb sufrió ablación y el plásmido modificado se restringieron con Xba I y Xho I en una digestión completa para remover al gen cap del VAA2 y reemplazarlo con un fragmento de Spe I/Xho I de 2267 pb que contiene al gen cap del VAA8 [Xiao, W., y colaboradores, (1999) J Virol 73, 3994-4003]. Se utilizó una estrategia de clonación similar para la creación de plásmidos quiméricos de empaquetamiento del VAA2/1 y del VAA2/5. Todos los vectores recombinantes se purificaron por medio del método de sedimentación estándar con CsCl_{2} excepto para VAA2/2, que fue purificado por medio de una etapa única de cromatografía en heparina.
Se determinaron las concentraciones de las copias genómicas (CG) de los vectores del VAA por medio del análisis con TaqMan utilizando sondas e iniciadores dirigidos a la región poli A SV40 como de describió previamente [Gao, G., y colaboradores, (2000) Hum Gene Ther 11, 2079-91].
Se construyeron los vectores para cada serotipo para un cierto número de estudios in vitro e in vivo. Se incorporaron ocho diferentes casetes del transgén en los vectores y se produjeron los viriones recombinantes para cada serotipo. La recuperación del virus, con base en las copias genómicas, se resume en la Tabla 4 más adelante. Los rendimientos de vector fueron altos para cada serotipo con diferencias no consistentes entre los serotipos. Los datos presentados en la tabla son rendimientos promedio de copias genómicas con una desviación estándar x 10^{13} de lotes de producción múltiple de transfecciones de 50 placas (150 mm).
TABLA 4 Producción de Vectores Recombinantes
VAA2/1 VAA2/2 VAA2/5 VAA2/7 VAA2/8
CMV LacZ 7,30 \pm 4,33 (n=9) 4,49 \pm 2,89 (n=6) 5,19 \pm 5,19 (n=8) 3,42 (n=1) 0,87 (n=1)
CMV EGFP 6,43 \pm 2,42 (n=2) 3,39 \pm 2,42 (n=2) 5,55 \pm 6,49 (n=4) 2,98 \pm 2,66 (n=2) 3,74 \pm 3,88 (n=2)
TBG LacZ 4,18 (n=1) 0,23 (n=1) 0,704 \pm 0,43 (n=2) 2,16 (n=1) 0,532 (n=1)
Alb A1AT 4,67 \pm 0,75 (n=2) 4,77 (n=1) 4,09 (n=1) 5,04 (n=1) 2,02 (n=1)
CB A1AT 0,567 (n=1) 0,438 (n=1) 2,82 (n=1) 2,78 (n=1) 0,816 \pm 0,679 (n=2)
TBG rhCG 8,51 \pm 6,65 (n=6) 3,47 \pm 2,09 (n=5) 5,26 \pm 3,85 (n=4) 6,52 \pm 3,08 (n=4) 1,83 \pm 0,98 (n=5)
TBG cFIX 1,24 \pm 1,29 (n=3) 0,63 \pm 0,394 (n=6) 3,74 \pm 2,48 (n=7) 4,05 (n=1) 15,8 \pm 15,0 (n=5)
Ejemplo 6
Análisis Serológico de Vectores de Pseudotipaje
Se inyectaron en forma intramuscular ratones C57BL/6 con vectores de diferentes serotipos de vectores AAVCBA1AT (5 x 10^{11} CG) y se recolectaron muestras de suero 34 días después. Para probar la actividad neutralizante y de neutralización cruzada de sueros para cada serotipo del VAA, los sueros fueron analizados en un ensayo de neutralización de anticuerpo basado en transducción [Gao, G. P., y colaboradores, (1996) J Virol 70, 8934-43]. Más específicamente, se determine la presencia de anticuerpos de neutralización por medio de la evolución de la capacidad del suero para inhibir la transducción de células 84-31 por medio de virus reporteros (AAVCMVEGFP) de diferentes serotipos. Específicamente, el virus reportero AAVCMVEGFP de cada serotipo [en una multiplicidad de infección (MDI) que condujo a una transducción del 90% de células indicadoras] fue incubado previamente con suero inactivado por calor de animales que recibieron diferentes serotipos del VAA o de ratones naïve. Después de 1 hora de incubación a 37ºC, se añadieron los virus a células 84-31 en placas de 96 pozos durante 48 ó 72 horas, dependiendo del serotipo del virus. La expresión de GFP fue medida por medio de Fluorolmagin (Molecular Dynamics) y cuantificada por medio del Image Quant Software. Las concentraciones de anticuerpo de neutralización fueron reportadas como la dilución más alta en suero que inhibió la transducción a menos del 50%.
La disponibilidad de los vectores de expresión GFP simplificaron el desarrollo de un ensayo para anticuerpos de neutralización que se basó en la inhibición de la transducción en una línea celular permisiva (esto es, células 293 que expresan establemente a E4 a partir de Ad5). Los sueros para seleccionar a los serotipos del VAA se generaron por medio de inyección intramuscular de los virus recombinantes. La neutralización de la transducción del VAA por medio de diluciones 1:20 y 1:80 de antisueros fueron evaluadas (Ver Tabla 5 más abajo). Los antisueros para la transducción neutralizada de VAA1, VAA2, VAA5 y VAA8 del serotipo para el cual se generó el antisuero (VAA5 y VAA8 para un grado menor que VAA1 y VAA2) pero no para el otro serotipo (esto es, no hubo evidencia de neutralización cruzada sugiriendo que VAA 8 es un serotipo realmente único).
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TABLA 5 Análisis Serológico de Nuevos Serotipos del VAA
% de Infección sobre células 84-31 con el virus AAVCMVEGFP
VAA2/1 VAA2/2 VAA2/5 VAA2/7 VAA2/8
Dilución del Dilución del Dilución del Dilución del Dilución del
suero: suero: suero: suero: suero:
Sueros Vector de 1/20 1/80 1/20 1/80 1/20 1/80 1/20 1/80 1/20 1/80
Inmunización
Grupo 1 VAA2/1 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
Grupo 2 VAA2/2 100 100 0 0 100 100 100 100 100 100
Grupo 3 VAA2/5 100 100 100 100 16,5 16,5 100 100 100 100
Grupo 4 VAA2/7 100 100 100 100 100 100 61,5 100 100 100
Grupo 5 VAA2/8 100 100 100 100 100 100 100 100 26,3 60 
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Los sueros humanos de 52 individuos normales fueron muestreados para neutralización contra serotipos seleccionados. No se encontró una muestra de suero para neutralizar al VAA2/7 y al VAA2/8 mientras que los vectores VAA2/2 y VAA2/1 fueron neutralizados en 20% y 10% de sueros, respectivamente. Una fracción reunida de IgG humano representando una colección de 60.000 muestras individuales no neutralizó al VAA2/7 ni al VAA2/8, mientras que los vectores VAA2/2 y VAA2/1 fueron neutralizados a concentraciones de suero iguales a 1/1280 y 1/640, respectivamente.
Ejemplo 7
Evaluación in vivo de Diferentes Serotipos de Vectores VAA
En este estudio, 7 genomas recombinantes del VAA, AAV2CBhAlAT, AAV2AlbhAlAt, AAV2CMVrhCG,
AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ y AAV2TBGLacZ fueron empaquetados con proteínas de la cápside de diferentes serotipos. En todas las 7 construcciones, los casetes de minigen fueron flanquedos con las ITR del VAA2. Los ADNc de \alpha-antitripsina humana (AlAT) [Xiao, W., y colaboradores, (1999) J Virol 73, 3994-4003] la \beta-subunidad de la hormona coriogonadotrópica de mono rhesus (CG) [Zoltick, P. W. & Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2, 657-9] el factor IX canino [Wang, L., y colaboradores, (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 11563-6] y los genes de la \beta-glactosidasa bacteriana (esto es, Lac Z) fueron utilizados como genes reporteros. Para la transferencia génica dirigida al hígado, se utilizaron o bien al promotor génico de albúmina de ratón (Alb) [Xiao, W. (1999), citado anteriormente] o al promotor génico de la globulina para el enlazamiento de la hormona tiroidea humana (TBG) [Wang (1997), citado anteriormente] para conducir la expresión específica al hígado de los genes reporteros. En los experimentos de transferencia génica dirigida a los músculos, se emplearon ya sea el promotor temprano del citomegalovirus (CMV) o el promotor \beta-actina de gallina con el mejorador CMV (CB) para dirigir la expresión de los
reporteros.
Para la transferencia génica dirigida a los músculos, los vectores fueron inyectados en el tibial anterior derecho de ratones C57BL/6 o NCR desnudos de 4-6 semanas de edad (Taconic, Germantown, NY). En los estudios de transferencia génica dirigidos al hígado, los vectores fueron infundidos intraportalmente en ratones C57BL/6 o NCR desnudos de 7-9 semanas de edad (Taconic, Germantown, NY). Se recolectaron intraorbitalmente las muestras de suero en diferentes momentos después de la administración del vector. Se recolectaron tejidos de hígado y de músculo en diferentes momentos para crioseccionamiento y tinción histoquímica Xgal de los animales que recibieron a los vectores lacZ. Para el experimento con una nueva administración, los ratones C56BL/6 recibieron inicialmente en forma intramuscular a los vectores VAA2/1, 2/2, 2/5, 2/7 y 2/8CBAlAT y seguido de la expresión génica A1AT para 7 semanas. Los animales fueron tratados entonces con VAA2/8TBGcFIX intraportalmente y estudiados por la expresión
génica cFIX.
Los ensayos basados en ELISA se realizaron para cuantificar los niveles en suero de las proteínas hA1AT, rhCG y cFIX como se describió previamente [Gao, G. P., y colaboradores, (1996) J Virol 70, 8934-43; Zoltick, P. W. & Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2, 657-9; Wang, L., y colaboradores, Proc Natl Acad Sci, Estados Unidos 94, 11563-6]. Los experimentos se completaron cuando los animales fueron sacrificados para recolectar los tejidos de hígado y de músculo para la extracción de ADN y el análisis cuantitativo de las copias genómicas de los vectores presentes en los tejidos objetivo por medio de TaqMan utilizando el mismo grupo de iniciadores y de sonda que en la titulación de las preparaciones de los vectores [Zhang, Y., y colaboradores, (2001) Mol Ther 3, 697-707].
Se evaluó el desempeño de los vectores con base en los nuevos serotipos en modelos de murino de la transferencia génica dirigida al músculo y al hígado y se la comparó con los vectores basados en los serotipos conocidos del VAA1, VAA2 y VAA5. Fueron utilizados vectores que expresan proteínas secretadas (alfa-antitripsina (A1AT) y gonadotropina coriónica (GC)) para las eficiencias cuantitativas de transducción relativa entre diferentes serotipos por medio del análisis ELISA de los sueros. La distribución celular de la transducción dentro del órgano objetivo fue evaluada utilizando los vectores de expresión lacZ e histoquímica X-gal.
Se analizó el desempeño de los vectores del VAA en músculo esqueletal seguido de inyección directa en los músculos tibiales anteriores. Los vectores contenían el mismo genoma basado en VAA2 con el gen temprano inmediato de CMV o un promotor mejorado de \beta-actina de CMV conduciendo la expresión del transgén. Estudios previos indicaron que los ratones competentes inmunes C57BL/6 causan respuestas humorales limitadas para la proteína A1AT humana cuando es expresada a partir de los vectores del VAA [Xiao, W., y colaboradores, (1999) J Virol 73, 3994-4003].
En cada cepa, el vector VAA2/1 produjo los niveles más altos de A I AT y el vector VAA2/2 los más bajos, con los vectores VAA2/7 y VAA2/8 mostrando niveles intermedios de expresión. Los niveles del pico de GC 28 días después de la inyección de los ratones NCR un/un mostraron los niveles más altos a partir de VAA2/7 y los más bajos a partir de VAA2/2 con VAA2/8 y VAA2/1 en la mitad. La inyección de los vectores VAA2/1 y VAA2/7 lacZ produjo expresión génica en los sitios de la inyección en todas las fibras musculares sustancialmente con menos fibras positivas lacZ observadas con los vectores VAA2/2 y VAA 2/8. Estos datos indican que la eficiencia de transducción con vectores VAA2/7 en músculo esqueletal es similar a aquella obtenida con VAA2/1, que es la más eficiente en el músculo esqueletal de los serotipos anteriormente descritos [Xiao, W. (1999), citado anteriormente; Chao, H., y colaboradores, (2001) Mol Ther 4, 217-22; Chao, H., y colaboradores, (2000) Mol Ther 2, 619-23].
Se utilizaron modelos similares de murino para evaluar la transferencia génica dirigida al hígado. Se hicieron infusiones con dosis idénticas del vector con base en las copias genómicas dentro de las venas portas de los ratones que fueron analizados posteriormente para expresión del transgén. Cada vector contenía un genoma basado un genoma basado en VAA2 utilizando los promotores específicos para el hígado previamente descritos (esto es, globulina para enlazamiento a la hormona tiroidea a la albúmina) para conducir la expresión del transgén. Más particularmente, se utilizaron los casetes de los minigenes CMVCG y TBGCG para la transferencia génica dirigida al hígado y al músculo, respectivamente. Los niveles de rhCG fueron definidos como unidades relativas (RUs x 10^{3}). Los datos fueron de la evaluación de las muestras de suero recolectadas el día 28, después de la administración del vector (4 animales por grupo). Como se muestra en la Tabla 3, el impacto de las proteínas de la cápside sobre la eficiencia de la transducción de los vectores A1AT en ratones nu/nu y C57BL/6 y de los vectores GC en ratones C57BL/6 fue consistente
(Ver la Tabla 6).
TABLA 6 Expresión de la unidad \beta de la Gonadotropina Coriónica de Mono Rhesus (rhGC)
Vector Músculo Hígado
VAA2/1 4,5 \pm 2,1 1,6 \pm 1,0
VAA2 0,5 \pm 0,1 0,7 \pm 0,3
VAA2/5 ND* 4,8 \pm 0,8
VAA2/7 14,2 \pm 2,4 8,2 \pm 4,3
VAA2/8 4,0 \pm 0,7 76,0 \pm 22,8
* No determinado en este experimento.
En todos los casos, los vectores VAA2/8 produjeron los niveles más altos de expresión transgénica en el rango de 16 a 110 más altos que aquellos obtenidos con los vectores VAA2/2; la expresión de los vectores VAA2/5 y VAA2/7 fue intermedia con VAA2/7 más alta que VAA2/5. El análisis de secciones de hígado teñido con X-Gal de animales que recibieron a los correspondientes vectores lacZ, mostraron una correlación entre el número de células transducidas y los niveles totales de expresión transgénica. Los ADN extraídos de hígados de ratones C57BL/6 que recibieron a los vectores A1AT fueron analizados por la abundancia del ADN del vector utilizando tecnología PCR en tiempo real.
La cantidad de ADN del vector encontrado en el hígado 56 días después de la inyección, fue correlacionada con los niveles de expresión transgénica (Ver la Tabla 7). Para este experimento, se utilizaron un grupo de sondas e iniciadores para dirigir la región poli A SV40 del genoma del vector para PCR con TaqMan. Los valores mostrados son la media de tres animales individuales con desviaciones estándar. Los animales fueron sacrificados el día 56 para recoger los tejidos de hígado para la extracción del ADN. Estos estudios indican que VAA8 es el vector más eficiente para la transferencia génica dirigida al hígado, debido a los mayores números de hepatocitos transducidos.
TABLA 7 Análisis por PCR en Tiempo Real de la Abundancia de Vectores VAA en Hígado de Ratón nu/un Luego de la Inyección de 1 x 10^{11} Copias Genómicas del Vector
Vectores VAA/Dosis Copias Genómicas por Célula
VAA2/1AlbA1AT 0,6 \pm 0,36
VAA2AlbA1AT 0,003 \pm 0,001
VAA2/5AlbA1AT 0,83 \pm 0,64
VAA2/7AlbA1AT 2,2 \pm 1,7
VAA2/8AlbA1AT 18 \pm 11
Los datos serológicos descritos anteriormente sugieren que el vector VAA2/8 no debe ser neutralizado in vivo después de la inmunización con los otros serotipos. Los ratones C57BL/6 recibieron inyecciones intraportales del vector VAA2/8 que expresan al factor IX canino (10^{11} copias genómicas) 56 días después de que recibieron inyecciones intramusculares de vectores A1AT de diferentes serotipos. Se obtuvieron altos niveles de expresión del factor IX 14 días después de la infusión del VAA2/8 en animales naïve (17\pm2 \mug/ml, n=4) que no fueron significativamente diferentes a aquellos que fueron observados en animales inmunizados con VAA2/1 (31\pm23 \mug/ml, n=4), VAA2/2 (16 \mug/ml, n=2), y VAA2/7(12 \mug/ml, n=2). Esto contrasta con lo que se observó en animales inmunizados VAA2/8 a los cuales se les dio una infusión con el vector del factor IX del VAA2/8 en los cuales no se observó en forma detectable al factor IX (< 0.1 \mug/ml, n=4).
Los oligonucleótidos para las regiones conservadas del gen de remate amplificaron secuencias de monos rhesus que representaron a los VAA únicos. Se encontraron secuencias de firma de remate idénticas en tejidos múltiples de monos rhesus derivados al menos de dos colonias diferentes. Los marcos de lectura abierta completos de remate y rep fueron aislados y secuenciados a partir de fuentes únicas. Solamente fueron necesarios los marcos de lectura abierta de remate de los nuevos VAA para evaluar su potencial como vectores ya que los vectores con las cápsides del VAA7 o del VAA8 se generaron utilizando las ITR y rep a partir de VAA2. Esto simplificó también la comparación de diferentes vectores ya que el genoma del vector real es idéntico entre diferentes serotipos de vector. En realidad, los rendimientos de vectores recombinantes generados utilizando esta aproximación no difirieron entre los serotipos.
Los vectores basados en VAA7 y VAA8 parecen ser inmunológicamente distintos (esto es, no son neutralizados por los anticuerpos generados contra otros serotipos). Además, los sueros de humanos no neutralizan la transducción por medio de los vectores VAA7 y VAA8, lo cual es una ventaja sustancial sobre los VAA derivados de humano actualmente bajo desarrollo por lo cual una proporción significativa de la población humana tiene inmunidad preexistente que es neutralizada [Chirmule, N., y colaboradores, (1999) Gene Ther 6, 1574-83].
El tropismo de cada Nuevo vector es favorable par alas aplicaciones in vivo. Los vectores VAA2/7 parecen transducir el músculo esqueletal tan eficientemente como VAA2/1, que es el serotipo que confiere el nivel más alto de transducción en el músculo esqueletal de los VAA de primate ensayados hasta la fecha [Xiao, W., citado anteriormente; Chou (2001), citado anteriormente, y Chou (2000), citad anteriormente]. En forma muy importante, VAA2/8 provee una ventaja adicional sobre los otros serotipos en términos de eficiencia de transferencia del gen al hígado que hasta ahora había sido relativamente desilusionante en términos del número de hepatocitos transducidos en forma estable. VAA2/8 logró consistentemente una mejora entre 10 y 100 veces en la eficiencia de transferencia génica comparado con los otros vectores. El fundamento para una eficiencia mejorada del VAA2/8 no es claro, aunque presumiblemente es debido a la incorporación a través de un receptor diferente que es más activo sobre la superficie basolateral de los hepatocitos. Esta eficiencia mejorada será muy útil en el desarrollo de la transferencia génica dirigida al hígado donde el número de células transducidas es crítico, tal como en los desordenes del ciclo de la urea y la hipercolesterolemia familiar.
Por lo tanto, la presente invención provee una nueva aproximación para el aislamiento de los nuevos VAA con base en la recuperación por PCR de las secuencias genómicas. Las secuencias amplificadas fueron incorporadas fácilmente dentro de los vectores y ensayadas en animales. La carencia de una inmunidad preexistente para VAA7 y el tropismo favorable de los vectores por el músculo indica que VAA7 es adecuado para el uso como un vector en terapia génica humana y en otras aplicaciones in vivo. En forma similar, la carencia de una inmunidad preexistente para los serotipos del VAA de la invención, y sus tropismos, los hace útiles en la liberación de moléculas terapéuticas y de otras moléculas útiles.
Ejemplo 9
Estudios de Tropismo en los Tejidos
En el diseño de un esquema de muestreo funcional de alto rendimiento para nuevas construcciones del VAA, se seleccionó un promotor altamente activo y específico no tisular, el promotor CB (promotor mejorado de CMV de \beta-actina de gallina) para conducir a un gen reportero fácilmente detectable y cuantificable, el gen de la \alpha anti-tripsina humana. Por lo tanto, solo se necesita elaborar un solo vector para cada nuevo clon del VAA para los estudios de transferencia génica dirigidos a 3 diferentes tejidos, de hígado, de pulmón y de músculo para proteger de tropismo tisular a una construcción particular del VAA. La siguiente tabla resume los datos generados a partir de 4 vectores nuevos del VAA en los estudios de tropismo tisular (AAVCBA1AT), a partir de los cuales se encontró que un nuevo clon en la cápside del VAA, 44.2, era un vehículo de transferencia génica muy potente en los 3 tejidos con una gran primacía particularmente en el tejido pulmonar. La Tabla 8 reporta los datos obtenidos (en \mug de A1AT/mL en suero) en el día 14 del estudio.
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TABLA 8
Vector Tejido Objetivo
Pulmón Hígado Músculo
VAA2/1 ND ND 45 \pm 11
VAA2/5 0,6 \pm 0,2 ND ND
VAA2/8 ND 84 \pm 30 ND
VAA2/rh.2 (43.1) 14 \pm 7 25 \pm 7,4 35 \pm 14
VAA2/rh.10 (44.2) 23 \pm 6 53 \pm 19 46 \pm 11
VAA2/rh.13 (42.2) 3,5 \pm 2 2 \pm 0,8 3.5 \pm 1,7
VAA2/rh.21 (42.10) 3,1 \pm 2 2 \pm 1,4 4.3 \pm 2 
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Se realizaron entonces otro par de experimentos para confirmar el tropismo superior de VAA 44,2 en tejido pulmonar. Primero, los minigenes CC10hA1AT transportados por el vector VAA para expresión pulmonar específica que experimentaron pseudotipaje con las cápsides de los nuevos VAA, fueron suministrados a animales inmunodeficientes (NCR desnudos) en volúmenes iguales (50 \mul de cada una de las preparaciones originales sin dilución) a través de inyecciones intratraqueales como se muestra en la siguiente tabla. En la Tabla 9, 50 \mul de cada una de las preparaciones originales por ratón, NCR Desnudos, límite de detección \geq0,0033 \mug/ml, Día 28.
TABLA 9
Vector CG Total en 50 \mug de A1AT/ml con \mug de A1AT/ml con Transferencia Génica
\mul de vector 50 \mul de vector 1x10^{11} de vector Relativa \; comparada
con rh.10 (clon 44.2)
2/1 3x10^{12} 2,6 \pm 0,5 0,09 \pm 0,02 2,2
2/2 5,5x10^{11} <0,03 <0,005 <0,1
2/5 3,6x10^{12} 0,65 \pm 0,16 0,02 \pm 0,004 0,5
2/7 4,2x10^{12} 1 \pm 0,53 0,02 \pm 0,01 0,5
2/8 7,5x10^{11} 0,9 \pm 0,7 0,12 \pm 0,09 2,9
2/ch.5(A.3.1) 9x10^{12} 1 \pm 0,7 0,01 \pm 0,008 0,24
2/rh.8(43.25) 4,6x10^{12} 26 \pm 21 0,56 \pm 0,46 13,7
2/rh.10(44.2) 2,8x10^{12} 115 \pm 38 4,1 \pm 1,4 100
2/rh.13(42.2) 6x10^{12} 7,3 \pm 0,8 0,12 \pm 0,01 2,9
2/rh.21(42.10) 2,4x10^{12} 9 \pm 0,9 0,38 \pm 0,04 9,3
2/rh.22(42.11) 2,6x10^{12} 6 \pm 0,4 0,23 \pm 0,02 5,6
2/rh.24(42.13) 1,1x10^{11} 0,4 \pm 0,3 0,4 \pm 0,3 1
Los vectores fueron administrados también a animales inmunocompetentes (C57BL/6) en copias genómicas iguales (1x10^{11} CG) como se muestra en la Tabla 10. (1x10^{11} CG por animal, C57BL/6, día 14, límite de detección \geq0,033 \mug/ml).
TABLA 10
Vector \mug de A1AT/ml con 1x10^{11} de vector Transferencia Génica Relativa
comparada con rh.10 (clon 44.2)
2/1 0,076 \pm 0,0031 2,6
2/2 0,1 \pm 0,09 3,4
2/5 0,084 \pm 0,033 2,9
2/7 0,33 \pm 0,01 11
2/8 1,92 \pm 1,3 2,9
2/ch.5(A.3.1) 0,048 \pm 0,004 1,6
2/rh.8(43.25) 1,7 \pm 0,7 58
2/rh.10(44.2) 2,93 \pm 1,7 100
2/rh.13(42.2) 0,45 \pm 0,15 15
2/rh.21(42.10) 0,86 \pm 0,32 29
2/rh.22(42.11) 0,38 \pm 0,18 13
2/rh.24(42.13) 0,3 \pm 0,19 10
Los datos de ambos experimentos confirmaron el tropismo magnífico del clon 44.2 en la transferencia génica dirigida al pulmón.
Interesantemente, el rendimiento del clon 44.2 en la transferencia génica dirigida al hígado y al músculo fue también sobresaliente, cercano a aquel del mejor transductor del hígado, VAA8 y el mejor transductor del músculo VAA1, sugiriendo que este nuevo VAA tiene algún significado biológico intrigante.
Para estudiar las propiedades serológicas de aquellos nuevos VAA, los vectores pseudotipados AAVGFR fueron creados por inmunización de conejos y transducción in vitro de células 84-31 en presencia y en ausencia de antisuero contra cápsides diferentes. Los datos se resumen a continuación:
TABLA 11a Ensayo NAB cruzado en células 84-31 y coinfección por adenovirus (Adv). Infección en células 84-31 (coinfectadas con Adv) con
Suero de conejo inmunizado con: 10^{9} CG 10^{9} CG 10^{9} CG 10^{9} CG
rh.13 rh.21 rh.22 rh.24
VAA2/42.2 VAA2/42.10 VAA2/42.1 VAA2/42.13
VAA2/1 1/20 1/20 1/20 NoNAB
VAA2/2 1/640 1/1280 1/5120 NoNAB
VAA2/5 NoNAB 1/40 1/160 NoNAB
VAA2/7 1/81920 1/81920 1/40960 1/640
VAA2/8 1/640 1/640 1/320 1/5120
ch.5 VAA2/A3 1/20 1/160 1/640 1/640
rh.8 VAA2/43.25 1/20 1/20 1/20 1/320
rh.10 VAA2/44.2 NoNAB NoNAB NoNAB 1/5120
rh.13 VAA2/42.2 1/5120 1/5120 1/5120 NoNAB
rh.21 VAA2/42.10 1/5120 1/10240 1/5120 1/20
rh.22 VAA2/42.11 1/20480 1/20480 1/40960 NoNAB
rh.24 VAA2/42.13 NoNAB 1/20 1/20 1/5120
TABLA 11b Ensayo NAB cruzado en células 84-31 y coinfección por Adv. Infección en células 84-31 (coinfectadas con Adv) con
Suero de conejo inmunizado con: 10^{9} CG 10^{10} CG 10^{10} CG 10^{9} CG 10^{9} CG
rh.12 ch.5 rh.8 rh.10 rh.20
VAA2/42.1B VAA2/A3 VAA2/43.25 VAA2/44.2 VAA2/42.8.2
VAA2/1 NoNAB 1/20480 NoNAB 1/80 ND
VAA2/2 1/20 NoNAB NoNAB NoNAB ND
VAA2/5 NoNAB 1/320 NoNAB NoNAB ND
VAA2/7 1/2560 1/640 1/160 1/81920 ND
VAA2/8 1/10240 1/2560 1/2560 1/81920 ND
TABLA 11b (continuación)
Suero de conejo inmunizado con: 10^{9} CG 10^{10} CG 10^{10} CG 10^{9} CG 10^{9} CG
rh.12 ch.5 rh.8 rh.10 rh.20
VAA2/42.1B VAA2/A3 VAA2/43.25 VAA2/44.2 VAA2/42.8.2
ch.5 VAA2/A3 1/1280 1/10240 ND 1/5120 1/320
rh.8 VAA2/43.25 1/1280 ND 1/20400 1/5120 1/2560
rh.10 VAA2/44.2 1/5120 ND ND 1/5120 1/5120
rh.13 VAA2/42.2 1/20 ND ND NoNAB 1/320
rh.21 VAA2/42.10 1/20 ND ND 1/40 1/80
rh.22 VAA2/42.11 NoNAB ND ND ND NoNAB
rh.24 VAA2/42.13 1/5120 ND ND ND 1/2560 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 12
Concentración de sueros de conejo Concentración después de Cebado
Vector Concentración d21
ch.5 VAA2/A3 1/10.240 1/40.960
rh.8 VAA2/43.25 1/20.400 1/163.840
rh.10 VAA2/44.2 1/10.240 1/527.680
rh.13 VAA2/42.2 1/5.120 1/20.960
rh.21 VAA2/42.10 1/20.400 1/81.920
rh.22 VAA2/42.11 1/40.960 ND
rh.24 VAA2/42.13 1/5.120 ND 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 13a Infección en células 84-31 (coinfectadas con Adv) con GFP
10^{9} CG/pozo 10^{9} CG/pozo 10^{9} CG/pozo 10^{9} CG/pozo 10^{9} CG/pozo 10^{9} CG/pozo
ch.5
VAA2/1 VAA2/2 VAA2/5 VAA2/7 VAA2/8 VAA2/A3
128 >200 95 56 13 1
#GFU/campo 83 >200 65 54 11 1
TABLA 13b Infección en células 84-31 (coinfectadas con Adv) con GFP
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Modelo de ratón de Hipercolesterolemia Familiar
El experimento siguiente demuestra que la construcción del VAA2/7 de la invención libera al receptor LDL y expresa al receptor LDL en una cantidad suficiente para reducir los niveles de colesterol en plasma y de triglicéridos en modelos animales de hipercolesterolemia familiar.
A. Construcción del Vector
Los vectores del VAA empaquetados con las proteínas de la cápside de VAA7 o VAA8 fueron construidos utilizando una estrategia de pseudotipaje [Hildinger M, y colaboradores, J. Virol 2001; 75:6199-6203]. Los genomas recombinantes del VAA con las repeticiones terminales invertidas VAA2 (ITR) fueron empaquetados por medio de transfección triple de células 293 con el plásmido cis, con el plásmido auxiliar del adenovirus y una construcción quimérica de empaquetamiento, una fusión de la cápside de los serotipos nuevos del VAA con el gen rep del VAA2. El plásmido de empaquetamiento quimérico fue construido como se describió previamente [Hildinger y colaboradores, citado anteriormente]. Los vectores recombinantes fueron purificados por medio del método estándar de sedimentación con CsCl_{2}. Para determinar el rendimiento con TaqMan (Applied Biosystems) el análisis se realizó utilizando sondas e iniciadores dirigidos a la región poli (A) SV40 poli(A) de los vectores [Gao GP, y colaboradores, Hum Gene Ther. 2000 Oct 10; 11(15):2079-91]. Los vectores resultantes expresan al transgén bajo el control del promotor génico de la globulina de enlazamiento a la hormona tiroidea humana (TBG).
B. Animales
Los ratones deficientes en el receptor LDL sobre el medio C57Bl/6, fueron adquiridos a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, Estados Unidos) y mantenidos como una colonia de crianza. A los ratones se les permitió libre acceso al agua y obtuvieron una Dieta Western alta en grasa (alto % de colesterol) empezando tres semanas antes de la inyección del vector. En el día 7 así como en el día 0, se obtuvo sangre por medio de sangrado retroorbital y se evaluó el perfil lipídico. Los ratones fueron divididos en forma aleatoria en siete grupos. El vector fue inyectado por medio de una inyección como se describió previamente ([Chen SJ y colaboradores, Mol Therapy 2000; 2(3), 256-261]. En resumen, los ratones fueron anestesiados con quetamina y xilazina. Se llevó a cabo una laparotomía y se expuso la vena porta. Utilizando una aguja de 30g se inyectó directamente la dosis apropiada del vector diluido en 100 \mul de PBS en la vena porta. Se aplicó presión en el sitio de la inyección para asegurar una detención del sangrado. La herida en la piel fue cerrada y cubierta y se les hizo un seguimiento cuidadoso a los ratones durante el siguiente día. Se realizaron sangrados semanalmente empezando en el día 14 después de haber trasferido directamente el gen al hígado para medir los lípidos en sangre. Se sacrificaron dos animales de cada grupo al mismo tiempo en la semana 6 y en la semana 12 después de la inyección del vector para examinar el tamaño de la placa aterosclerótica así como la expresión del receptor. Los demás ratones fueron sacrificados en la semana 20 para medir la placa y determinar la
expresión del transgén.
TABLA 14
Vector Dosis n
Grupo 1 VAA2/7-TBG-hLDLr 1X10^{12} cg 12
Grupo 2 VAA2/7-TBG-hLDLr 3X10^{11} cg 12
Grupo 3 VAA2/7-TBG-hLDLr 1X10^{11} cg 12
Grupo 4 VAA2/8-TBG-hLDLr 1X10^{12} cg 12
TABLA 14 (continuación)
Vector Dosis n
Grupo 5 VAA2/8-TBG-hLDLr 3X10^{11} cg 12
Grupo 6 VAA2/8-TBG-hLDLr 1X10^{11} cg 12
Grupo 7 VAA2/7-TBG-LacZ 1X10^{11} cg 16
C. Lipoproteína en suero y análisis de la función del hígado
Las muestras de sangre fueron tenidas a partir del plexo retroorbital después de un periodo de ayuno de 6 horas. Se separó del suero de plasma por centrifugación. La cantidad de lipoproteínas en plasma y de transaminasas del hígado en suero, fue detectada utilizando un analizador automatizado de química clínica (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassermann).
D. Detección de expresión transgénica
La expresión del receptor LDL fue evaluada por medio de tinción de inmunofluorescencia y transferencias de Western. Para las transferencias de Western, el tejido del hígado congelado fueron organizado con amortiguador de lisis (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 130 mM, Tritón al 1% X 100, inhibidor completo de proteinasa, libre de EDTA, Roche, Mannheim, Alemania). La concentración de proteína fue determinada utilizando el Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL). Se disolvieron nuevamente 40 \mug de proteína sobre 4-15% de Tris-HCl Ready Gels (Biorad, Hércules, CA) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). Para generar anticuerpos del receptor Anti-hLDL, se inyectó un conejo en forma intravenosa con una preparación de AdhLDLr (1x10^{13} CG). Cuatro semanas después se obtuvo el suero de conejo y se utilizó para las transferencias de Western. Se utilizó una dilución 1:100 del suero como anticuerpo primario seguido por una IgG anti-conejo conjugada con HRP y detección por quimiluminiscencia ECL (ECL Western Blot Detection Kit, Amersham, Arlington Heights, IL).
E. Inmunocitoquímica
Para la determinación de la expresión del receptor de LDL en secciones de hígado congelado, se realizaron análisis de inmunohistoquímica. 10 \mum de secciones de criostato fueron o bien fijadas en acetona durante 5 minutos, o desfijadas. El bloqueo se logró después de un período de incubación de 1 hora con 10% de suero de cabra. Las secciones fueron incubadas entonces por una hora con el anticuerpo primario a temperatura ambiente. Se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo LDL antihumano (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA), diluido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron lavadas con PBS, e incubadas con IgG anticonejo de cabra en fluoresceína diluida 1:100 (Sigma, St Louis, MO). Los espécimenes fueron examinados finalmente bajo un microscopio de fluorescencia Nikon Microphot-FXA. En todos los casos, cada incubación fue seguida por un riguroso lavado con PBS. Los controles negativos consistieron de una preincubación con PBS, omisión del anticuerpo primario, y sustitución del anticuerpo primario por un anticuerpo de control no inmune apareado con un isotipo. Los tres tipos de controles mencionados anteriormente fueron preparados para cada experimento el mismo día.
F. Eficiencia de la transferencia génica
El tejido de hígado se obtuvo después de sacrificar a los ratones en los momentos designados. El tejido fue congelado por choque en nitrógeno líquido y almacenado a -80ºC hasta procesamiento adicional. Se extrajo el AND del tejido de hígado utilizando un QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Alemania) de acuerdo al protocolo de los fabricantes. Se evaluaron las copias del genoma de los vectores del VAA en el tejido de hígado utilizando análisis Taqman, usando sondas e iniciadores contra la cola de Poli(A) SV40 como se describió anteriormente.
G. Medición de la placa ateriosclerótica
Para la cuantificación de las placas aterioscleróticas en la aorta de ratón, éstos fueron anestesiados (10% de quetamina y xilazina, ip), se les abrió el pecho y el sistema arterial fue prefundido con solución salina amortiguada con fosfato enfriada con hielo a través del ventrículo izquierdo. La aorta fue cuidadosamente raspada, cortada a lo largo de la línea media ventral desde el arco aórtico hacia abajo hasta las arterias femorales y fijada en formalina. Las placas ateroscleróticas ricas en lípido fueron teñidas con Sudan IV (Sigma, Alemania) y la aorta fue consumida en forma extendida sobre una superficie de cera negra. La imagen fue capturada con una cámara de vídeo a color DXC-960 MD de Sony. El área de la placa así como la superficie aórtica completa fueron determinadas utilizando Phase 3 Imaging Systems (Media Cybernetics).
\newpage
H. Aclaramiento de LDL con I^{125}
Se analizaron dos animales por cada grupo experimental. Un bolo de LDL marcado con I^{125} (generosamente suministrado por Dan Rader, U. de Pensilvania) fue infusionado lentamente a través de la vena de la cola durante un período de 30 segundos (recuento de 1.000.000 de [I^{125}]-LDL diluido en 100 \mul de PBS estéril/animal). A los 3min, 30 min, 1.5hr, 3hr, 6hr después de la inyección, se obtuvo una muestra de sangre a través del plexo retro-orbital. Se separó el plasma de la sangre entera y se hizo un recuento a 10 \mul de plasma en el contador gama. Finalmente, se calculó la velocidad catabólica fraccional a partir de los datos de aclaramiento de lipoproteína.
I. Evaluación de la acumulación de Lípido en el Hígado
Se realizó la coloración por el método de Pearse de las secciones de hígado congelado para determinar la acumulación de lípido. Las secciones congeladas de hígado fueron enjuagadas brevemente en agua destilada, seguido de incubación durante 2 minutos en propilénglicol absoluto. Las secciones fueron coloreadas entonces en una solución de acuerdo al método de Pearse (0.5% en propilénglicol) durante 16 horas seguido por una coloración opuesta con una solución de hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y montándolas en una solución calentada de gelatina de glicerina.
Para la cuantificación del colesterol en hígado y del contenido de triglicéridos en secciones de hígado, éstas se homogenizaron y se incubaron en cloroformo/metanol (2:1) durante la noche. Después de añadir H_{2}SO_{4} al 0,05% y de centrifugación durante 10 minutes, se recolectó la capa inferior de cada muestra, dividida en dos alícuotas y se la secó bajo atmósfera de nitrógeno. Para la medición del colesterol, se disolvieron los lípidos secos de la primera alícuota en 1% de Tritón X-100 en cloroformo. Una vez disueltos, se secó la solución bajo atmósfera de nitrógeno. Después de disolver los lípidos en ddH_{2}O e incubar durante 30 minutos a 37ºC, se midió la concentración de colesterol total usando un Kit de Colesterol Total (Wako Diagnostics). Para la segunda alícuota, se disolvieron los lípidos secos en KOH alcohólico y se incubaron a 60ºC durante 30 minutos. Luego se añadió MgCl_{2} 1 M, seguido de incubación sobre hielo durante 10 minutos y centrifugación a 14.000 rpm durante 30 minutos. The supernatant was finally evaluated for triglycerides (Wako Diagnostics).
Todos los vectores de pseudotipaje en una cápside de VAA2/8 o del VAA2/7 disminuyeron el colesterol total, LDL y triglicéridos comparado con el control. Estos vectores de prueba también corrigieron el fenotipo de la hipercolesterolemia en una forma dependiente de la dosis. Se observó una reducción en el área de las placas para los ratones del VAA2/8 y VAA2/7 en los ratones tratados en el primer ensayo (2 mese), y se observó el efecto para persistir durante la duración del experimento (6 meses).
Ejemplo 10
Expresión del Factor Funcional IX y Corrección de la Hemofilia A. Ratones Genéticamente Deficientes
La expresión del factor canino funcional IX (FIX) fue evaluada en ratones con hemofilia B. Se construyeron vectores con cápsides de VAA1, VAA2, VAA5, VAA7 o VAA8 para liberar ITR 5' de VAA2 - promotor específico de hígado [LSP] - FIX canino - elemento pos-regulador de la hepatitis de marmota (WPRE) - ITR 3' de VAA2. Se construyeron los vectores como se describe en Wang y colaboradores, 2000, Molecular Therapy 2: 154-158), utilizando las cápsides apropiadas.
Los ratones genéticamente deficientes fueron generados como se describe en Wang y colaboradores, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94: 11563-11566. Este modelo imita muy cercanamente a los fenotipos de hemofilia B en humanos.
Los vectores de serotipos diferentes (VAA1, VAA2, VAA5, VAA7 y VAA8) fueron suministrados como una inyección intraportal sencilla dentro del hígado de adultos hemofílicos de los ratones C57Bl/6 ratones en una dosis de 1x10^{11} CG/ratón para los cinco serotipos diferentes, y un grupo recibió un vector VAA8 en una dosis menor, 1x10^{10} CG/ratón. El grupo de control fue inyectado con 1 x 10^{11} CG del VAA2/8 TBG LacZ3. Cada grupo contiene 5-10 ratones machos y ratones hembra. Los ratones fueron sangrados cada dos semanas después de la administración del vector.
1. ELISA
La concentración de FIX canino en el plasma de ratón fue determinada por medio de un ensayo de ELISA específico para el factor IX canino, realizado esencialmente como lo describen Axelrod y colaboradores, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87:5173-5177 con modificaciones. El factor IX anticanino de oveja (Enzyme Research Laboratories) fue utilizado como anticuerpo primario y el factor IX anticanino de conejo (Enzyme Research Laboratories) fue utilizado como anticuerpo secundario. Iniciando dos semanas después de la inyección, los mayores niveles de cFIX en plasma fueron detectados apara todos los vectores del ensayo. Los mayores niveles fueron mantenidos a niveles terapéuticos a todo lo largo del experimento, esto es, hasta las 12 semanas. Los niveles terapéuticos se considera que son 5% de los niveles normales, esto es, aproximadamente 250 ng/mL.
Los mayores niveles de expresión fueron observados para las construcciones VAA2/8 (a 10^{11}) y VAA2/7, con niveles sostenidos de superfisiología de los niveles de cFIX (diez veces mayores que el nivel normal). Los niveles de expresión para VAA2/8 (10^{11}) fueron aproximadamente 10 veces mayores que aquellos observados para VAA2/2 y VAA2/8 (10^{10}). Los niveles de expresión más bajos, aunque aún están por encima del rango terapéutico, fueron observados para VAA2/5.
2. Ensayo del tiempo de Tromboplastina Parcialmente Activada In Vitro (aPTT)
La actividad funcional del factor IX en plasma, de los ratones FIX genéticamente deficientes fue determinada por medio de un ensayo del tiempo de tromboplastina parcialmente activada in vitro (aPTT). Las muestras de sangre fueron recolectadas del plexo retroorbital en un volumen de 1/10 del amortiguador de citrato. El ensayo aPTT fue realizado como lo describen Wang y colaboradores, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94: 11563-11566.
Las veces que se presentó coagulación por aPTT en las muestras de plasma de todos los ratones inyectados con el vector, estuvo dentro del rango normal (aproximadamente 60 segundos) cuando se midió dos semanas después de la inyección, y las veces en se presentó coagulación sostenida en el rango normal o más corto a todo lo largo del período del estudio (12 semanas).
Los tiempos más bajos de coagulación sostenida fueron observados en los animales que recibieron VAA2/8 (10^{11}) y VAA2/7. En la semana 12, VAA2/2 también indujo tiempos de coagulación similares a aquellos para VAA2/8 y VAA2/7. Sin embargo, este tiempo más corto de coagulación no fue observado para VAA2/2 hasta la semana 12, mientras que los tiempos más cortos de coagulación (en el rango de 25 - 40 segundos) fueron observados para VAA2/8 y VAA2/7 comenzando en la segunda semana.
La coloración por inmunohistoquímica sobre los tejidos de hígado recolectados de algunos de los ratones tratados está siendo realizada actualmente. Aproximadamente 70-80% de hepatocitos se colorean en forma positiva para FIX canino en el ratón inyectado con el vector VAA2/8.cFIX.
B. Hemofilia B en Perros
Los perros que tienen una mutación puntual en el dominio catalítico del gen F.IX, que, con base en los estudios de modelación, parece suministrar la proteína inestable, sufren de hemofilia B [Evans y colaboradores, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 86:10095-10099). Una colonia de tales perros se ha mantenido por más de dos décadas en la Universidad de Carolina del Norte, en Chapel Hill. Los parámetros homeostáticos de estos perros están bien descritos e incluyen la ausencia en el plasma del antígeno F. IX, 60 minutos por encima de los tiempos de coagulación en sangre entera, mientras que en perros normales es de 6-8 minutes, y un tiempo prolongado de tromboplastina parcialmente activada de 50-80 segundos, mientras que en los perros normales es de 13-28 segundos. Estos perros experimentan hemorragias espontáneas recurrentes. Típicamente, los episodios de sangrado significativo son manejados exitosamente por medio de una infusión única intravenosa de 10 ml/kg de plasma canino normal; ocasionalmente, se requieren infusiones repetidas para controlar el sangrado.
Cuatro perros son tratados intraportalmente con VAA.cFIX de acuerdo con el programa de más siguiente. Un primer perro recibe una inyección única con VAA2/2.cFIX a una dosis de 3.7x10^{11} copias genómicas (CG)/kg. Un segundo pero recibe una primera inyección de VAA2/2.cFIX (2.8x10^{11} CG/kg), seguido por una segunda inyección con VAA2/7.cFIX (2.3x10^{13} CG/kg) en el día 1180. Un tercer perro recibe una inyección única con VAA2/2.cFIX en una dosis de 4.6x10^{12} CG/kg. El cuarto perro recibe una inyección con VAA2/2.cFIX (2.8x10^{12} CG/kg) y una inyección en el día 99.5 con VAA2/7.cFIX (5x10^{12} CG/kg).
El abdomen de los perros hemofílicos es abierto quirúrgicamente en forma aséptica bajo anestesia general y se administra una infusión única del vector dentro de la vena porta. Los animales son protegidos de la hemorragia en el período preoperatorio por medio de administración intravenosa de plasma canino normal. El pero es sedado, intubado para inducir anestesia general, y el abdomen rasurado y preparado. Después de abrir el abdomen, el bazo es movido dentro del campo operatorio. Se localiza la vena esplénica y se coloca una sutura en forma suelta, próxima a una incisión distal pequeña en la vena. Se inserta rápidamente una aguja en la vena, luego se afloja la sutura y se inserta una cánula 5 F hasta una ubicación intravenosa cercana a la vena porta insertada en una ubicación intravenosa cercana a la bifurcación de la vena porta. Después de asegurada la hemostasis y de que el balón del catéter es inflado, se infusionan aproximadamente 5.0 ml del vector diluido en PBS dentro de la vena porta por un intervalo de 5 minutos. La infusión del vector es seguida por una infusión de 5,0 ml de solución salina. Se desinfla luego el balón, se remueve la cánula y se asegura la hemostasis venosa. El bazo es luego remplazado, se cauterizan los vasos sangrantes y se cierra la incisión de la operación. Se desentuba al animal habiendo tolerado bien el procedimiento quirúrgico. Las muestras de sangre se analizan como se describe. [Wang y colaboradores, 2000, Molecular Therapy 2: 154-158]
Se anticipan los resultados que muestran una corrección o corrección parcial para VAA2/7.
<110> Los Depositarios de la Universidad de Pensilvania
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<120> Un método para Detectar y/o Identificar Secuencia de Virus Adeno-Asociados (VAA) y el Aislamiento de Nuevas Secuencias Identificados Así.
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<130> UPN-02735ff
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<150> US 60/350.607
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<151> 2001-11-13
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<150> US 60/341.117
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<151> 2001-12-17
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/377.066
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<151> 2002-05-01
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<150> US 60/386.675
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<151> 2002-06-05
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<160> 120
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 4721
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<212> ADN
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<213> serotipo 7 del virus adeno-asociado
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<400> 1
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2
3
4 
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<210> 2
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<211> 737
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<212> PRT
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<213> Proteína de la cápside del serotipo 7 del virus adeno-asociado
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<400> 2
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5
6
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<210> 3
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<211> 623
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<212> PRT
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<213> proteína rep serotipo 7 del virus adeno-asociado
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<400> 3
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8
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<210> 4
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<211> 4393
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<212> ADN
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<213> serotipo 8 del virus adeno-asociado
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 4385
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<212> ADN
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<213> serotipo 9 del virus adeno-asociado
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<400> 5
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14
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<210> 6
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<211> 4718
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<212> ADN
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<213> serotipo 1 del virus adeno-asociado
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<400> 6
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17
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<210> 7
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<211> 4675
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<212> ADN
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<213> serotipo 2 del virus adeno-asociado
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<400> 7
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20
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<210> 8
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<211> 4720
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<212> ADN
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<213> serotipo 3 del virus adeno-asociado
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<400> 8
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23
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<210> 9
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<211> 3098
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<212> ADN
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<213> nuevo serotipo del VAA, clon 42.2
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<400> 9
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27
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<210> 10
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<211> 3098
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<212> ADN
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<213> nuevo serotipo del VAA, clon 16,3
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 3121
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<212> ADN
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<213> nuevo serotipo del VAA, clon 29.3
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<400> 11
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32
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<210> 12
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<211> 3121
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<212> ADN
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<213> nuevo serotipo del VAA, clon 29,4
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<400> 12
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35
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<210> 13
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<211> 3121
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<212> ADN
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<213> nuevo serotipo del VAA, clon 29,5
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<400> 13
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37
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<210> 14
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<211> 3131
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<212> ADN
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<213> nuevo serotipo del VAA, clon 1-3
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 3127
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<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon 13-3b
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 3106
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<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon 24-1
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 3102
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<212> ADN
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<213> serotipo nuevo, clon 27-3
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<400> 17
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48
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<210> 18
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<211> 3106
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<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon 7-2
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 3105
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<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon C1
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 3105
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<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon C3
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<400> 20
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61
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<220>
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<221> miso_feature
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<222> (1302)..(1302)
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<223> puede ser a, c, g o t
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<212> ADN
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<212> ADN
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144
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon 42,12
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146
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> serotipo nuevo AAV, clon 44,2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
149
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
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151
152
153
154 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 733
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon CZVP 1
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 733
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon C5VP 1 @2
\vskip1.000000\baselineskip
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159
160
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 734
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon AAV4VP1
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163
164
165
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167
168
169
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<210> 65
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<211> 736
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon AAV6VP1
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173
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<212> PRT
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<211> 735
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<212> PRT
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179
180
181
182 
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<212> PRT
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186
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188
189 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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190
191
192
193 
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194
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196
197 
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198
199
200
201 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
202
203
204 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 223, 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
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205
206
207
208 
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<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 223,10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (434)..(434)
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<223> puede hacer cualquier aminoácido
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<400> 75
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209
210
211
212 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
213
214
215 
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<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon
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216
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219 
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 223,6
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220
221
222 
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224
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226
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 44,5
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<400> 80
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228
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 738
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 44,2
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
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232
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<211> 738
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<212> PRT
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236
237
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239 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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240
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,15
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
244
245
246
247 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 738
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,8
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
248
249
250
251 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
252
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<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 733
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,3A
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
256
257
258
259 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<400> 88
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260
261
262
263 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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264
265
266 
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\hskip1,5cm267 
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\vskip0.400000\baselineskip
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271
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
274
275
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
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288 
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289
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\vskip0.400000\baselineskip
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292
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 43,20
\newpage
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<400> 99
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295
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297 
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<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 736
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon AAV9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
298
299
300 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 24,1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
301
302
303
304 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,2REAL
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
306
307
308 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 7,2VP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
309
310
311
312 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 27,3VP1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 104
313
314
315
316 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 6,3VP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
317
318
319
320 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
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321
322
323
324 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 107
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<211> 728
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,3B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
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325
326
327
328 
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<210> 108
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<211> 728
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
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329
330
331
332 
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<210> 109
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<211> 729
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<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon F1VP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
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333
334
335
336 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon F5VP1@3
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 110
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337
338
339
340 
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<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon F3VP1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
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341
342
343
344 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 112
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<211> 735
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,6B
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
345
346
347
348 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 685
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon 42,12
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
349
350
351
352 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína de la cápside del serotipo AAV, clon AAV5CAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
353
354
355
356 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> ADN
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<213> sitio de la enzima de restricción Drall
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caccacgtg 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AV2cas
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgcagagacc aaagttcaac tgaaacga 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> serotipo 10 del virus adeno-asociado
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
357 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> serotipo 11 del adeno-asociado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
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358 
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<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> serotipo 12 del virus adeno-asociado
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
359 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> serotipo del virus adeno-asociado, clon A3,1vp1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
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360
361 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (31)

  1. Un método de identificar secuencias desconocidas de virus adeno-asociados (VAA) en sospecha que contiene VAA de una infección latente, dicho método comprendiendo las etapas de:
    (a)
    someter la muestra que contiene el ADN a amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un primer grupo de iniciadores que amplifican específicamente una primera región del VAA que comprende al menos 250 pb de las secuencias de ácido nucleico de la cápside del VAA, dicha primera región teniendo una secuencia variable flanqueada al menos por 18 pares de bases de una secuencia altamente conservada en su extremo 5' y al menos 18 pares de bases de una secuencia altamente conservada en su extremo 3', dichos pares de bases estando altamente conservados con relación a un alineamiento de al menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6;
    (b)
    opcionalmente someter al ADN a una amplificación adicional utilizando un segundo grupo de iniciadores que amplifican específicamente una segunda región que comprende a la primera región de secuencias de VAA y secuencias que están 5' de la primera región, de tal manera que se obtienen secuencias de extensión 5' que se fijan al extremo 5' de las secuencias del VAA amplificadas por los iniciadores para la primera región;
    (c)
    opcionalmente someter al ADN a una amplificación adicional utilizando un tercer grupo de iniciadores que amplifican específicamente una tercera región que comprende a la primera región de secuencias de VAA y secuencias que están 3' de la primera región, de tal manera que se obtienen secuencias de extensión 3' que se fijan al extremo 3' de las secuencias del VAA amplificadas por los iniciadores para la primera región,
    cada una de dichas segunda y tercera regiones estando predeterminadas con base en el alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de la menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6, y cada una de dicha regiones comprendiendo secuencias de ácido nucleico que están altamente conservadas al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 5', opcionalmente secuencias variables en la mitad, y secuencias que están altamente conservadas al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 3' de las secuencias de la región, con relación a las secuencias de al menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6; y
    cada uno de los grupos de iniciadores consiste de un iniciador 5' y un iniciador 3';
    la presencia de las secuencias amplificadas indicando la presencia de un VAA en la muestra, y
    una comparación de diferencias entre las secuencias amplificadas y las secuencias de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6 indicando la presencia de un VAA desconocido.
  2. 2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la comparación comprende la etapa de comparar los patrones de la enzima de restricción para las secuencias amplificadas con los patrones de la enzima de restricción de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6.
  3. 3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 o a la reivindicación 2, en donde la etapa (a) amplifica al gen completo de la cápside.
  4. 4. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las secuencias amplificadas comprenden al gen de la cápside del VAA y al gen rep del VAA.
  5. 5. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ADN ha sido extraído de células, cultivos celulares, tejidos, cultivo de tejidos o fluidos biológicos.
  6. 6. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la primera región está altamente conservada sobre aproximadamente al menos 25 pares de bases en el extremo 5' de la región, el extremo 3' de la región o ambos.
  7. 7. Un método de acuerdo a la reivindicación 6, en donde la primera región está altamente conservada sobre aproximadamente al menos 30 pares de bases en el extremo 5' de la región, el extremo 3' de la región o ambos.
  8. 8. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las secuencias altamente conservadas de la primera región tienen al menos una identidad del 80% entre los VAA alineados en el extremo 5' de la región, el extremo 3' de la región o ambos.
  9. 9. Un método de acuerdo a la reivindicación 8, en donde las secuencias altamente conservadas de la primera región tienen al menos una identidad del 90% entre los VAA alineados en el extremo 5' de la región, el extremo 3' de la región o ambos.
    \newpage
  10. 10. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las secuencias variables en la mitad de la primera región tienen menos del 70% de identidad entre los VAA alineados.
  11. 11. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la primera región abarca aproximadamente entre 2800 y aproximadamente 3200 pb de VAA1, SEQ ID NO: 6, y los correspondientes pares de bases en los otros VAA.
  12. 12. Un método de acuerdo a la reivindicación 11, en donde la primera región de 257 pb abarca desde 2886 hasta aproximadamente 3143 de VAA1, SEQ ID NO: 6, y los correspondientes pares de bases en los otros VAA.
  13. 13. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los iniciadores eje AV1ns, tienen la secuencia de nucleótidos 1398 a 1423 de la SEQ ID NO: 6 y AV2cas, tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7.
  14. 14. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 o a la reivindicación 2, en donde el primer grupo de iniciadores permite el aislamiento de las secuencias completa de la cápside del virus adeno-asociado a partir de una muestra,
    el primer grupo de iniciadores comprendiendo un iniciador 5' dirigido a una región localizada en la mitad de un gen rep del VAA, basado en una región conservada predeterminada, y un iniciador 3' dirigido a una región secuencia abajo de un gen cap del VAA, basado en una región conservada predeterminada del VAA.
  15. 15. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la muestra comprende un VAA integrado dentro del cromosoma.
  16. 16. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra comprende tejido humano.
  17. 17. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la muestra contiene secuencias provirales del VAA.
  18. 18. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la primera región es una región de firma.
  19. 19. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde los pares de bases de las secuencias altamente conservadas están altamente conservadas con relación a un alineamiento de los VAA 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y los VAA aislados de gansos y patos.
  20. 20. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la secuencia variable es una secuencia hipervariable.
  21. 21. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la primera región comprende hasta 10 kilopares de bases de longitud.
  22. 22. Un método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde la primera región comprende un fragmento de 3-1 kilopares de bases que comprende la secuencia cap de longitud completa.
  23. 23. Un kit para detectar la presencia de un virus adeno-asociado desconocido (VAA) en una muestra de ADN celular que se sospecha que contiene una infección latente del VAA, dicho kit comprendiendo:
    (a)
    Un primer grupo de iniciadores que específicamente amplifica una primera región que comprende 250 pb de secuencias de ácido nucleico de la cápside del VAA, dicha primera región teniendo al menos 18 pares de bases de una secuencia altamente conservada en su extremo 5', una secuencia variable, y al menos 18 pares de bases de una secuencia altamente conservada en su extremo 3', dichos pares de bases estando altamente conservados con relación a un alineamiento de al menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6;
    (b)
    opcionalmente un segundo grupo de iniciadores específicos para una segunda región de las secuencias de ácido nucleico del VAA que comprende a la primera región de secuencias de VAA y se obtienen secuencias que están 5' de la primera región, de tal manera que las secuencias de extensión 5' del VAA que se fijan al extremo 5' de las secuencias del VAA amplificadas por los iniciadores para la primera región;
    (c)
    opcionalmente un tercer grupo de iniciadores que específicamente amplifican una tercera región que comprende a la primera región de secuencias de VAA y secuencias que están 3' de la primera región, de tal manera que se obtienen las secuencias de extensión 3' del VAA que se fijan al extremo 3' de las secuencias del VAA amplificadas por los iniciadores para la primera región,
    cada una de dichas segunda y tercera regiones estando predeterminadas con base en el alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de la menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6, y cada una de dicha regiones comprendiendo secuencias de ácido nucleico que están altamente conservadas al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 5', opcionalmente secuencias variables en la mitad, y secuencias que están altamente conservadas al menos sobre 18 pares de bases en el extremo 3' de las secuencias de la región, con relación a las secuencias de al menos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6;
    cada uno de los grupos de iniciadores consistiendo de un iniciador 5' y un iniciador 3', cada uno de dichos iniciadores comprendiendo al menos 15 nucleótidos complementarios a su respectiva secuencia altamente conservada y teniendo identidad exacta con su respectiva secuencia altamente conservada sobre al menos 5 pares de bases en su extremo 3'.
  24. 24. Un kit de acuerdo a la reivindicación 23, en donde el iniciador 5' y/o el iniciador 3' comprende al menos 18nucleótidos.
  25. 25. Un kit de acuerdo a la reivindicación 24, en donde el iniciador 5' y/o el iniciador 3' comprende 25 nucleótidos.
  26. 26. Un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde el iniciador 5' y/o el iniciador 3' comprende al menos 9 pares de bases de identidad exacta con su extremo 3'.
  27. 27. Un kit de acuerdo a la reivindicación 26, en donde el iniciador 5' y/o el iniciador 3' comprende al menos 18 pares de bases de identidad exacta con su extremo 3'.
  28. 28. Un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en donde el primer grupo de iniciadores permite el aislamiento de las secuencias completas de la cápside del virus adeno-asociado de una muestra,
    El primer grupo de iniciadores comprende un iniciador 5' dirigido a una región localizada en la mitad de un gen rep del VAA, basado en una región predeterminada conservada del VAA, y un iniciador 3' dirigido a una región secuencia debajo de un gen cap del VAA, basado en una región predeterminada conservada del VAA.
  29. 29. Un kit de acuerdo a la reivindicación 23, en donde el iniciador 5' tiene una secuencia que comprende GCTGCG
    TCAACTGGACCAATGAGAAC, que corresponde de nt 1398 a 1423 de la SEQ ID NO: 6.
  30. 30. Un kit de acuerdo a la reivindicación 23, en donde el iniciador 3' tiene una secuencia que comprende CGCA
    GAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA, que corresponde a los nucleótidos complementarios a 4462-4435 de la SEQ ID NO: 7.
  31. 31. Un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en donde la muestra comprende al VAA integrado dentro del cromosoma.
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