KR20230083287A

KR20230083287A - Cln2 질환의 안구 징후에 대한 유전자 요법

Info

Publication number: KR20230083287A
Application number: KR1020237012074A
Authority: KR
Inventors: 크리스티나 마리아 온스만; 스티븐 조셉 파콜라; 쉐리 반 에버렌; 파울로 팔라벨라; 알렉산더 마스톤 베일리; 니콜라스 알렉산더 피어스 사샤 버스; 귀 혜 김
Original assignee: 리젠엑스바이오 인크.
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2021-10-06
Publication date: 2023-06-09
Also published as: IL301643A; JP2023544803A; CA3197342A1; US20230364206A1; EP4225926A1; AU2021358781A1; AU2021358781A9; WO2022076582A1

Abstract

예를 들어, 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터와 같은 재조합 바이러스 벡터를 수반하는, 눈의 병리를 치료하기 위해 인간 대상체의 눈에서 망막/유리체액으로 치료 생성물 (예컨대 치료 단백질 (예를 들어, 항체), 치료 RNA (예를 들어, shRNA, siRNA, 및 miRNA), 치료 압타머)을 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기술된다.

Description

CLN2 질환의 안구 징후에 대한 유전자 요법

우선권

본 출원은 2020년 10월 7일에 출원된 미국 일련 번호 63/088,911 및 2021년 2월 5일에 출원된 미국 일련 번호 63/146,134에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록 참조

본 출원은 2021년 9월 30일에 생성되고, 42,746 바이트의 크기를 갖는 "12656-144-228_서열_Listing.txt"라는 제목의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.

1. 발명의 배경

신경원성 세로이드 리포푸신증 (neuronal ceroid lipofuscinose; NCL)은 희귀하고 유전성인 신경퇴행성 장애의 그룹이다. 이는 환자에서 보이는 세로이드 및 리포푸신과 유사한 자가 형광성 지방색소의 축적을 갖는 가장 흔한 신경유전학적 저장 질환으로 간주된다. NCL은 비정상적으로 증가된 근긴장 또는 경련, 실명 또는 시력 문제, 치매, 근육 조정의 결핍, 지적 장애, 운동 장애, 발작 및 불안정한 보행을 포함하는, 다양하지만 진행성인 증상과 관련된다. 이 질환의 빈도는 12,500명당 대략 1명이다. NCL에는 다음의 세 가지 주요 유형이 있다: 성인형 (쿠프스병 또는 파리병); 청소년 및 후기 영아형 (빌쇼스키-얀스키병). 신경원성 세로이드 리포푸신증 (NCL)은 원래 발병 연령 및 임상적 증상 (본 명세서에 언급된 바와 같음)에 의해 정의되었다. 그러나 이는 이전에 임상적 표현형에 의해 제안되었던 것보다 다른 유전적 변이에 대해 훨씬 더 많이 중복되는 증거를 제공한 새로운 분자 발견을 기반으로 재분류되었다.

NCL과 관련하여 적어도 20개의 유전자가 확인되었다. CLN2 돌연변이가 있는 NCL 환자는 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1)이라고 불리는 펩스타틴-둔감성 리소좀 펩티다제가 결핍되어 있다. TPP1은 폴리펩티드의 N-말단으로부터 트리펩티드를 제거한다. CLN2 유전자의 13개의 엑손 모두에서 돌연변이가 보고되었다. 일부 돌연변이는 더 오래 진행된다. 발병은 일반적으로 후기 유아기에 발생하지만, 발병 후에 대해 기술된다. 58개 초과의 돌연변이가 CLN2에 기술되어 있다.

바텐병의 한 형태인 CLN2 질환은 희귀한 리소좀 저장 장애 (LSD)로, 출생 100,000명당 0.07 내지 0.51명의 추정 발생률을 나타낸다 (문헌 [Augestad et al., 2006; Claussen et al., 1992; Mole et al., 2013; National Batten Disease Registry; Poupetova et al., 2010; Santorelli et al., 2013; Teixeira et al., 2003]). CLN2 질환은 11q15 염색체 상에 위치하며 가용성 리소좀 효소 트리펩티딜-펩티다제-1 (TPP1)을 인코딩하는 CLN2 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 치명적인 상염색체 열성 신경퇴행성 LSD이다. CLN2 유전자의 돌연변이와 그에 따른 TPP1 효소 활성의 결핍은 저장 물질의 리소좀 축적 및 뇌와 망막의 신경퇴행을 초래한다 (Liu et al., 1998; Wlodawer et al., 2003). CLN2 질환은 일반적으로 재발성 발작 (간질) 및 운동 협응의 어려움 (운동실조)을 포함하는 초기 특징을 갖는 2세 내지 4세 연령의 조기 발병을 특징으로 한다. 질환은 또한 이전에 습득한 기술의 상실 (발달적 퇴행)을 초래한다. 간질은 종종 의학적 치료에 불응성이며, 정신운동 기능의 일반적인 쇠퇴는 중간 유년기의 조기 사망 (문헌 [Nickel M et al., 2016; Worgall et al., 2007]) 전 세 번째 생일과 다섯 번째 생일 사이에서 빠르고 균일하다 (문헌 [Schulz et al., 2013]).

고전적인 신경원성 세로이드 리포푸신증 2형 (CLN2) 질환과 관련된 망막 변성은 중심 황반에서 과녁 패턴으로 시작하여 말기 질환에서 말초 망막으로 확장되는 양측성, 진행성, 대칭적 쇠퇴로 나타난다 (문헌 [Orlin et al, 2013 PLoS One. 2013 Aug 28;8(8):e73128]). 망막 변성은 중요한 2년의 기간 동안 광간섭 단층활영 (OCT)에서 중심 망막 두께 (CRT)의 급격한 상실을 특징으로 한다 (문헌 [Kovacs et al, 2020; Ophthalmol Retina. 2020;4(7):728-36]). 그러나, 시력 상실이 지연되는 덜 일반적이고 약화된 표현형이 청소년기까지 나타날 수 있다 (문헌 [Kohlschutter et al, 2019]).

재조합 TPP1 (Brineura® 셀리포나아제 알파, BioMarin Pharmaceuticals)을 사용한 효소 대체 요법 (ERT)이 최근 CLN2 질환의 치료를 위해 미국 (US) 및 유럽 연합 (EU)에서 승인되었으며, 영구적으로 이식된 장치를 통해 측뇌실로 2주에 한 번의 주입으로 투여된다. Brineura®의 임상적 이점은 FDA에 의해 운동 기능의 안정화로 제한되도록 지정되었지만, 유럽 의약국 (EMA)은 언어 능력에도 긍정적인 영향이 있다고 결정하였다 (Brineura®, FDA 요약 승인 기준; Brineura® 유럽 공공 평가 보고서 [EPAR]; 문헌 [Schulz et al., 2016]). Brineura®는 포트를 뇌에 직접 이식하기 위한 전문 지식을 필요로 하며, 뇌실내(ICV) 투여에 대해 잘 알고 있는 훈련된 전문가에 의해 의료 환경에서 2주마다 4시간씩 주입하는 동안 투여되어야 한다. 각각 7시간 및 11.5일로 추정되는 Brineura®의 짧은 CSF 및 리소좀 반감기로 인해 부분적으로 반복 주입이 필요하다 (Brineura®, EPAR). 따라서, ERT의 반복 투여와 관련된 높은 환자 부담 및 이환율 없이 CLN2 질환이 있는 환자의 중추 신경계 (CNS)에서 오래 지속되고 장기적인 TPP1 효소 활성을 제공할 수 있는 새로운 요법에 대한 충족되지 않은 상당한 필요성이 남아있다. 따라서, CLN2 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 TPP1을 전달하고 발현하는데 유용한 조성물이 필요하다. 개 TPP1 (rAAV2.caTPP1)을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)의 1회 투여는 주로 뇌실막 세포에서 TPP1의 높은 발현과 효소의 뇌척수액으로의 분비로 인한 임상적 이점으로 이어지는 것으로 나타났다. 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Katz et al, Sci Transl Med. 2015 Nov 11; 7(313): 313ra180; 및 KATZ, et al, Gene therapy 2017 Feb 24(4): 215-223]을 참조한다. 그러나 AAV2는 뇌 실질을 투과하지 않으며 뉴런을 표적으로 하지 않기 때문에, 신규한 신경친화성 AAV로 달성될 수 있는 것과 비교하여 예상되는 이점을 제한한다.

후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증 (CLN2) 질환에서 CLN2 유전자의 돌연변이는 TPP1 효소 활성의 결핍으로 이어져 중추신경계와 망막 내에서 심각한 신경퇴행을 초래한다. 광범위한 수의 눈 질환과 눈에 병리학적 징후가 있는 질환은 유전적 개변 또는 단백질 조절장애로 추적될 수 있다 (문헌 [Stone et al., 2017, Ophthalmology 124(9): 1314-1331]). 유전체학 및 단백질체학의 최근 발전은 질환 메커니즘 및/또는 그러한 안구 질환 또는 징후의 기저가 되는 유전적 기초에 대한 이해에 큰 영향을 미쳤다. 유전자 요법은 소정의 눈 질환을 치료하는 데 이용되었다 (예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/027650 (국제 공개 번호 WO 2017/181021 A1) 참조).

현재 CLN2 질환의 안구 징후를 치료하기 위해 승인된 요법이 없으며 시력 상실은 충족되지 않은 중요한 수요를 나타낸다. 임의의 이용 가능한 치료 옵션이 없기 때문에 CLN2 질환이 있는 모든 아동은 시력 상실 및 실명 진행과 관련된 황반 변성을 경험할 것이다 (문헌 [Kovacs et al, 2020; Williams et al, 2017; Nickel et al, 2018]). CLN2 질환의 치료를 위한 ERT 출시 이전과 이후 주요 연구 기관은 CLN2 집단에서 시력 상실로 이어지는 망막 변성의 과정을 이해하기 위해 자연사 데이터를 수집해왔다. 1) ERT는 CLN2 질환과 관련된 망막 변성의 궤적을 변경하지 않고, 2) 망막 변성의 발병은 양측성이며, 양쪽 눈이 동시에 동일한 정도로 영향을 받고, 그리고 3) 망막 변성은 시간 경과 따라 눈 사이에서 대칭적으로 진행되는 것으로 밝혀졌다.

2. 발명의 요약

일 양태에서, 필요로 하는 대상체에서 CLN2 바텐병과 관련된 안구 징후를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 rAAV는 AAV9이고, 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR); (b) 프로모터; (c) 인간 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1) 단백질을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 AAV 5' ITR 및/또는 AAV3' ITR은 AAV2로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, (c)의 코딩 서열은 서열번호: 2의 천연 인간 코딩 서열과 적어도 70% 동일한 코돈 최적화된 인간 CLN2이다. 일부 실시형태에서, (c)의 코딩 서열은 서열번호: 3이다.

일부 실시형태에서, 상기 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 프로모터는 CBA 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 인핸서 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터이다.

일부 실시형태에서, 상기 벡터 게놈은 폴리A를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리A는 합성 폴리A이거나 소 성장 호르몬 (bGH), 인간 성장 호르몬 (hGH), SV40, 토끼 β-글로빈 (RGB), 또는 변형된 RGB (mRGB)로부터 유래한다.

일부 실시형태에서, 상기 벡터 게놈은 인트론을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 인트론은 CBA, 인간 베타 글로빈, IVS2, SV40, bGH, 알파-글로불린, 베타-글로불린, 콜라겐, 오브알부민, 또는 p53으로부터 유래한다.

일부 실시형태에서, 상기 벡터 게놈은 인핸서를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 인핸서는 CMV 인핸서, RSV 인핸서, APB 인핸서, ABPS 인핸서, 알파 mic/bik 인핸서, TTR 인핸서, en34, ApoE이다.

일부 실시형태에서, 상기 벡터 게놈은 크기가 약 3 킬로베이스 내지 약 5.5 킬로베이스이다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터 게놈은 크기가 약 4 킬로베이스이다.

일부 실시형태에서, 상기 rAAV의 눈 당 2×10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 rAAV의 눈 당 6×10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다.

일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 중심 망막 두께 (CRT)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 동공측정법에 의해 측정된 바와 같이 동공 광 반사에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 황반 두께/부피에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 외부 핵층 (ONL) 두께에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 전체 망막 두께에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 내부 핵층에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 광수용체 (PR)와 망막 색소 상피 (RPE)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 외부 세그먼트와 RPE (OS+RPE)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 타원체 구역 (EZ)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는다.

일부 실시형태에서, 상기 대상체는 치료 기준과 비교 가능한 임상 진행과 비교하여 망막 퇴행의 발병이 지연된다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 치료 기준과 비교 가능한 임상 진행과 비교하여 시력 상실의 발병이 지연된다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 rAAV를 투여한 후 3개월 이내에 상기 대상체의 눈의 유리체액(vitreous humour) 및/또는 안방수(aqueous humour)에서 검출 가능한 TPP1 발현 수준을 초래한다. 일부 실시형태에서, 유리체액 및/또는 안방수에서의 TPP1 발현 수준은 상기 rAAV의 투여 전에 검출할 수 없다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체의 혈청에서 TPP1의 발현 수준은 검출할 수 없는 상태로 유지된다.

일부 실시형태에서, 상기 대상체는 뇌실내 Brineura^® 효소 대체 요법을 동시에 받고 있다.

일부 실시형태에서, 상기 대상체는 인간이다.

3. 도면의 간단한 설명
도 1a는 AAV.CB7.CI.hTPP1co.RBG 벡터 게놈의 도식적 표현이다. ITR은 AAV2 역 말단 반복부를 나타낸다. CB7은 거대세포바이러스 인핸서를 갖는 닭 베타 액틴 프로모터를 나타낸다. RBG 폴리A는 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호를 나타낸다.
도 1b는 AAV.hTPP1co 벡터의 생산 플라스미드의 맵을 제공한다.
도 1c는 AAV 시스 플라스미드 작제물의 맵을 제공한다. ITR: 역 말단 반복부; CMV IE 프로모터: 거대세포바이러스 즉시-초기 프로모터; CB 프로모터: 닭 β-액틴 프로모터 닭 β-액틴 인트론; hCLN2: 인간 CLN2 cDNA; 토끼 글로빈 폴리 A: 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호; Kan-r: 카나마이신 저항성 유전자.
도 1d는 AAV 트랜스 패키징 플라스미드 작제물의 맵을 제공한다.
도 1e는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드의 맵을 제공한다.
도 2는 CLN2 CRS-MX 스코어링 흐름도를 제공한다.
도 3은 2세 내지 <3세 대상체에 대한 CLN2 CRS-LX 스코어링 흐름도를 제공한다.
도 4a 및 4b는 작제물 I의 망막하 주사 후 시노몰구스 원숭이의 안방수 및 유리체액 모두에서의 TPP1 농도를 도시한다. 용량은 GC/눈이고; 데이터는 평균 +/- SEM으로 표시된다.
도 5는 작제물 I의 망막하 주사 후 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 TPP1 농도를 도시한다. 용량은 GC/눈이고; 데이터는 평균 +/- SEM으로 표시된다.
도 6a 및 6b는 시노몰구스 원숭이에게 작제물 I를 망막하 주사한 후 눈에서 검출된 벡터 DNA를 도시한다. 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다.
도 7a 및 7b는 망막하 주사로 4주 (도 7a) 및 13주 (도 7b) 후 작제물 I 벡터 DNA의 말초 생체분포를 도시한다. 정량 한계 미만 (BLQ): 50 카피/μg DNA. 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다.
도 8은 작제물 I 투여 후 시노몰구스 원숭이 망막에서 TPP1에 대한 면역형광 염색을 도시한다. TPP1에 대한 면역형광 염색; 망막 세포층을 보여주는 Nissl 대조염색 스트립.
도 9. TPP1 면역반응성의 임계값 이미지 분석. 표시된 데이터는 비히클 주사된 동물과 비교되며, 1×10¹² GC/눈의 망막하 용량은 상당히 더 큰 TPP1 면역염색 영역을 초래하여 (** p=0.0013 대 비히클, 편도 ANOVA, 사후 Bonferroni), 이러한 더 높은 용량에서 더 높은 수준의 형질도입을 나타낸다.
도 10: RGX-381을 사용한 CLN2 환자 RPE의 형질도입. CLN2 RPE는 대조군 RPE와 비교하여 TPP1 발현이 없음을 도시한다. 세 가지 상이한 용량으로 형질도입된 CLN2 RPE는 용량 의존적 방식으로 치료 21일 후에 TPP1을 발현한다.
도 11: 망막 오르가노이드 특성화. 망막 오르가노이드는 분화 80일 및 200일에 특성화되었다. TPP1 및 리커버린은 200일차에 발현되었으나 80일차에는 발현되지 않았다 (도 11a). SCMAS 축적은 TPP1의 부재 하에 CLN2 RO의 200일차에 검출된다 (도 11b).
도 12: RGX-381을 사용한 RO의 처리. 88일차 RO는 RGX-381로 처리되어, 미처리군 CLN2 RO에서 검출된 SCMAS 축적을 방지하였다. MOI3: 감염 방식은 3E+06 GC/세포였다.

4. 발명의 상세한 설명

바텐병의 치료, 특히 바텐병과 관련된 안구 징후의 치료를 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 바텐병과 관련된 안구 징후는 시력 상실, 망막 위축 및/또는 망막 변성을 포함하지만 이제 제한되지 않는다. 이러한 조성물은 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 포함하고, 상기 rAAV는 AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 상기 벡터 게놈은 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 또한, 섹션 4.1.8에 기술된 바와 같이 현탁 세포 배양을 사용하여 본 명세서에 기술된 rAAV를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 또한, 재조합 AAV를 포함하는 조성물, 예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 조성물이 본 명세서에 제공된다. 또한, 본 명세서, 예를 들어, 섹션 4.3에 기술된 바와 같이 TPP1을 인코딩하는 벡터 (예컨대, rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 것을 포함하는, CLN2 유전자의 결함에 의해 유발된 바텐병의 안구 징후를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

4.1 작제물 및 제형

치료 생성물 (예를 들어, TPP1)를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된 방법에 사용된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 표적화된 벡터, 예를 들어, 망막 색소 상피 세포를 표적으로 하는 벡터이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 사용을 위한 핵산을 제공하며, 여기서 상기 핵산은 본 명세서에 기술된 프로모터 또는 인핸서-프로모터에 작동가능하게 연결된 치료 생성물을 인코딩한다.

소정의 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 재조합 벡터가 본 명세서에 제공된다. 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 조합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, DNA는 프로모터 서열, 관심 있는 치료 생성물을 인코딩하는 서열, 비번역 영역, 및 종결 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 관심 있는 치료 생성물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 및 핵산 서열은 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 코돈-최적화 기술을 통해 코돈-최적화될 수 있다 (예를 들어, [Quax et al., 2015, Mol Cell 59:149-161]의 리뷰 참조).

4.1.1 재조합 바이러스 벡터

재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV2tYF, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAVrh10), 렌티바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 일본 헤마글루티닌 바이러스 (HVJ), 알파바이러스, 백시니아 바이러스, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)- 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-기반 벡터를 포함한다. 알파바이러스 벡터는 셈리키 삼림열 바이러스 (semliki forest virus; SFV) 및 신드비스 바이러스 (SIN)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 바이러스 벡터는 인간에서 복제 결핍이 되도록 변경된다. 소정의 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 하이브리드 벡터, 예를 들어, "무력한 (helpless)" 아데노바이러스 벡터에 배치된 AAV 벡터이다. 소정의 실시형태에서, 제1 바이러스부터의 바이러스 캡시드 및 제2 바이러스로부터의 바이러스 외피 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 제2 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)이다. 더 구체적인 실시형태에서, 외피 단백질은 VSV-G 단백질이다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 바이러스 벡터는 AAV 기반 바이러스 벡터이다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 바이러스 벡터는 AAV9-기반 바이러스 벡터이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV9-기반 바이러스 벡터는 망막 세포에 대한 지향성을 유지한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV-기반 벡터는 AAV rep 유전자 (복제에 필요함) 및/또는 AAV cap 유전자 (캡시드 단백질의 합성에 필요함)를 인코딩한다. 다수의 AAV 혈청형이 확인되었다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV-기반 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 구성성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV2tYF, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAVrh10 중 하나 이상으로부터의 캡시드 구성성분을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV 기반 벡터는 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAVrh10 혈청형 중 하나 이상으로부터의 구성성분을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 조절 요소의 제어 하에 있고 ITR이 측면에 있는 치료 생성물의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 바이러스 게놈, 및 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 갖거나 AAV9 캡시드의 생물학적 기능을 유지하면서 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열 (서열번호: 9)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 바이러스 캡시드를 포함하는 AAV9 벡터가 제공된다. 소정의 실시형태에서, 인코딩된 AAV9 캡시드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 아미노산 치환을 갖고 AAV9 캡시드의 생물학적 기능을 유지하는 서열번호 9의 서열을 갖는다.

AAV9-기반 바이러스 벡터는 본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서 사용된다. AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466에 교시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일 양태에서, 치료 생성물을 인코딩하는 AAV (예를 들어, AAV9)-기반 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다.

소정의 실시형태에서, 단일-가닥 AAV (ssAAV)는 상기와 같이 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 자가-상보성 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254]; 및 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683 참조, 이들 각각은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함됨).

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스는 E1 결실이 있고, E3 결실이 있거나 없이, 그리고 어느 하나의 결실된 영역 안으로 삽입된 발현 카세트가 있는 1세대 벡터일 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E2 및 E4 영역의 전체 또는 부분 결실을 함유하는 2세대 벡터일 수 있다. 헬퍼-의존성 아데노바이러스는 아데노바이러스 역 말단 반복부 및 패키징 신호 (phi) 만을 보유한다. 치료 생성물은 패키징 신호와 3'ITR 사이에 삽입되며, 게놈을 대략 36 kb의 야생형 크기에 가깝게 유지하기 위해 스터퍼 서열을 갖거나 갖지 않는다. 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌 [Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27]에서 찾을 수 있다.

4.1.2 유전자 발현의 프로모터 및 변형자

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 치료 생성물의 전달 또는 발현을 조절하는 구성성분 (예를 들어, "발현 제어 요소")을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 치료 생성물의 발현을 조절하는 구성성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 구성성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 흡수 후 세포 내에서 치료 생성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 국소화에 영향을 미치는 구성성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는, 예를 들어, 치료 생성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 흡수한 세포를 검출하거나 선택하기 위해 검출 가능하거나 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있는 구성성분을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 치료 효능을 위해 원하는 대로 치료 생성물의 발현을 턴 온 및 턴 오프할 수 있도록 바람직할 수 있다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 저산소증-유도된 프로모터 및 약물 유도성 프로모터, 예컨대 라파마이신 및 관련 제제에 의해 유도된 프로모터를 포함한다. 저산소증-유도성 프로모터는 HIF 결합 부위를 갖는 프로모터를 포함하며, 예를 들어, 각각이 저산소증-유도성 프로모터의 교시를 위해 참조로 포함된 문헌 [Schodel, et al., 2011, Blood 117(23):e207-e217 및 Kenneth and Rocha, 2008, Biochem J. 414:19-29]을 참조한다. 또한, 작제물에 사용될 수 있는 저산소증-유도성 프로모터는 에리트로포이에틴 프로모터 및 N-WASP 프로모터를 포함한다 (에리트로포이에틴 프로모터의 개시내용에 대해서는 문헌 [Tsuchiya, 1993, J. Biochem. 113:395] 및 N-WASP 프로모터의 개시내용에 대해서는 문헌 [Salvi, 2017, Biochemistry and Biophysics Reports 9:13-21]을 참조하며, 이 둘 모두는 저산소증-유도된 프로모터의 교시를 위해 참조로 포함됨). 대안적으로, 재조합 벡터는 약물 유도성 프로모터, 예를 들어, 라파마이신 및 관련된 유사체의 투여에 의해 유도 가능한 프로모터를 함유할 수 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO94/18317, WO 96/20951, WO 96/41865, WO 99/10508, WO 99/10510, WO 99/36553, 및 WO 99/41258, 및 미국 특허 번호 US 7,067,526 (라파마이신 유사체 개시)를 참조하며, 이들은 약물 유도성 프로모터의 그 개시내용에 대해 본 명세서에 참조로 포함됨). 유도성 프로모터는 또한 엑디손 프로모터, 에스트로센-반응성 프로모터, 및 테트라사이클린-반응성 프로모터, 또는 이종이량체 억제 스위치를 포함하는 공지된 프로모터로부터 선택될 수 있다. 문헌 [Sochor et al, An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications. Scientific Reports, 2015 Nov 24;5:17105] 및 문헌 [Daber R, Lewis M., A novel molecular switch. J Mol Biol. 2009 Aug 28;391(4):661-70, Epub 2009 Jun 21]을 참조하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.

소정의 실시형태에서 프로모터는 저산소증-유도성 프로모터이다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 저산소증-유도성 인자 (HIF) 결합 부위를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 HIF-1α 결합 부위를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 HIF-2α 결합 부위를 포함한다. 소정의 실시형태에서, HIF 결합 부위는 RCGTG 모티프를 포함한다. HIF 결합 부위의 위치 및 서열에 관한 세부사항은, 예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌 [Schodel, et al., Blood, 2011, 117(23):e207-e217]을 참조한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 HIF 전사 인자 이외의 저산소증 유도된 전사 인자에 대한 결합 부위를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 저산소증에서 우선적으로 번역되는 하나 이상의 IRES 부위를 포함한다. 저산소증-유도성 유전자 발현 및 이와 관련된 인자에 관한 교시에 대해서는, 예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌 [Kenneth and Rocha, Biochem J., 2008, 414:19-29]을 참조한다.

또 다른 실시형태에서, 프로모터는 세포-특이적이다. 용어 "세포-특이적"은 재조합 벡터에 대해 선택된 특정 프로모터가 특정 세포 또는 조직 유형에서 최적화된 TPP1 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있음을 의미한다.

또 다른 실시형태에서, 프로모터는 유비쿼터스 또는 구성적 프로모터이다.

소정의 실시형태에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다 (그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함된 문헌 [Dinculescu et al., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663] 참조). 소정의 실시형태에서, CB7 프로모터는 벡터에 의해 구동된 치료 생성물의 발현을 증진하는 다른 발현 제어 요소, 예를 들어, (1) CAG 프로모터; (2) CBA 프로모터; (3) CMV 프로모터; (4) 1.7-kb 레드 원추체 옵신 프로모터 (PR1.7 프로모터); (5) 로돕신 키나아제 (GRK1) 광수용체-특이적 인핸서-프로모터 (문헌 [Young et al., 2003, Retinal Cell Biology; 44:4076-4085]); (6) 인간 원추체 어레스틴 프로모터인 hCARp 프로모터; (7) 로돕신 키나아제 프로모터인 hRKp; (8) 원추체 광수용체 특이적 인간 어레스틴 3 (ARR3) 프로모터; (9) 로돕신 프로모터; 및 (10) U6 프로모터 (특히 치료 생성물이 shRNA 또는 siRNA와 같은 작은 RNA인 경우)를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 프로모터는 3396 내지 4061번 nt의 서열번호: 5에 나타낸 서열과 같은 거대세포바이러스 (CMV) 인핸서 요소를 갖는 하이브리드 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다. 다른 적합한 프로모터는 인간 β-액틴 프로모터, 인간 신장 인자-1α 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터, 유인원 바이러스 40 프로모터, 및 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Damdindorj et al, (August 2014) A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors. PLoS ONE 9(8): e106472]을 참조한다. 또 다른 적합한 프로모터는 바이러스 프로모터, 구성적 프로모터, 조절 가능한 프로모터를 포함한다 (예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/04943 참조). 대안적으로, 생리학적 신호에 반응성인 프로모터는 본 명세서에 기술된 바와 같은 발현 카세트, rAAV 게놈, 벡터, 플라스미드 및 바이러스에 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 AAV 벡터의 크기 제한으로 인해 1000 bp 미만의 작은 크기이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 400 bp 미만이다. 다른 프로모터는 당업자에 의해 선택될 수 있다.

추가 실시형태에서, 프로모터는 SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 파지 람다 (phage lambda; PL) 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스; HSV) 프로모터, 테트라사이클린-제어 트랜스-활성자-반응성 프로모터 (tetracycline-controlled trans-activator-responsive promoter; tet) 시스템, 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, 예컨대 RSV LTR, MoMLV LTR, BIV LTR 또는 HIV LTR, 몰로니 뮤린 육종 바이러스의 U3 영역 프로모터, 그랜자임 A 프로모터, 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(들), CD34 프로모터, CD8 프로모터, 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터, B19 파보바이러스 프로모터, PGK 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 열 충격 단백질 (HSP) 프로모터, 예컨대 HSP65 및 HSP70 프로모터, 면역글로불린 프로모터, MMTV 프로모터, 라우스 육종바이러스 (RSV) 프로모터, lac 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, MND 프로모터, 또는 MNC 프로모터로부터 선택된다. 이들의 프로모터 서열은 당업자에게 공지되어 있거나 문헌 또는 데이터베이스, 예를 들어, GenBank, PubMed 등에서와 같이 공개적으로 이용 가능하다.

소정의 실시형태에서, 다른 발현 제어 요소는 닭 β-액틴 인트론 및/또는 토끼 β-글로빈 polA 신호를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 TATA 박스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 하나 이상의 요소를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터 요소는 서로에 대해 반전되거나 이동될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 프로모터의 요소는 협력하여 기능하도록 위치된다. 소정의 실시형태에서, 프로모터의 요소는 독립적으로 기능하도록 위치된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 인간 CMV 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RS) 긴 말단 반복부, 및 랫트 인슐린 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1, 및 HIV-2 LTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터 (예를 들어, 망막 색소 상피 세포-특이적 프로모터)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 RPE65 프로모터를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 VMD2 프로모터를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 프로모터 이외의 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 인핸서를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 리프레서 (repressor)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 인트론 또는 키메라 인트론을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.

4.1.3 신호 펩티드

치료 생성물이 치료 단백질인 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 단백질 전달을 조절하는 구성성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 하나 이상의 신호 펩티드를 포함한다. 신호 펩티드는 또한 본 명세서에서 "리더 서열" 또는 "리더 펩티드"로 지칭될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 신호 펩티드는 치료 생성물이 세포에서 적절한 패키징 (예를 들어, 글리코실화)을 달성하도록 한다. 소정의 실시형태에서, 신호 펩티드는 치료 생성물이 세포에서 적절한 국소화를 달성하도록 한다. 소정의 실시형태에서, 신호 펩티드는 치료 생성물이 세포로부터 분비를 달성하도록 한다. 본 명세서에 제공된 재조합 벡터 및 치료 생성물과 관련하여 사용되는 신호 펩티드의 예는 표 1에서 찾아볼 수 있다.

[표 1]

본 명세서에 제공된 벡터와 함께 사용하기 위한 신호 펩티드

4.1.4 비번역된 영역

치료 생성물이 치료 단백질인 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 하나 이상의 비번역된 영역 (UTR), 예를 들어, 3' 및/또는 5' UTR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, UTR은 원하는 수준의 단백질 발현에 대해 최적화된다. 소정의 실시형태에서, UTR은 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA의 반감기에 대해 최적화된다. 소정의 실시형태에서, UTR은 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA의 안정성에 대해 최적화된다. 소정의 실시형태에서, UTR은 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA의 2차 구조에 대해 최적화된다.

4.1. 5 역 말단 반복부

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 바이러스 벡터는 하나 이상의 역 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. ITR 서열은 재조합 바이러스 벡터의 비리온 내로 재조합 치료 생성물 발현 카세트를 패키징하기 위해 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, ITR은 AAV, 예를 들어, AAV8 또는 AAV2로부터 유래한다 (예를 들어, 문헌 [Yan et al., 2005, J. Virol., 79(1):364-379]; 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466을 참조하며, 이들 각각은 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함됨).

4.1.6 치료 생성물

또 다른 양태에서, 치료 생성물을 대상체에게 전달하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 치료 생성물은 TPP1이다. 일부 실시형태에서, 환자는 시력 상실, 망막 위축 및/또는 망막 변성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 바텐병과 관련된 안구 징후를 경험하고 있다. 특정 실시형태에서, TPP1 치료 생성물의 유효량을 대상체에게 전달하는 방법에 본 명세서에 제공되며, 여기서 대상체는 바텐병과 관련된 안구 징후를 경험한다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 치료 생성물은 트리펩티딜-펩티다제 1 (TPP1)이다. CLN2로도 알려진 TPP1 유전자는 트리펩티딜-펩티다제 I 활성을 갖는 리소좀 세린 프로테아제인 트리펩티딜-펩티다제 1을 인코딩한다. 또한 리소좀 단백분해효소에 의해 생성된 분해 생성물로부터 트리펩티드를 생성하고 비치환된 N-말단을 갖는 기질을 필요로하는 비-특이적 리소좀 펩티다제로 작용하는 것으로 생각된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "TPP1", "CLN2", 및 "트리펩티딜-펩티다제 1"은 코딩 서열을 지칭할 때 상호교환적으로 사용된다. 인간 트리펩티딜-펩티다제 1을 인코딩하는 천연 핵산 서열은 NCBI 참조 서열 NM_000391.3에 보고되어 있으며, 여기에서 서열번호: 2로 재현된다. 인간 트리펩티딜-펩티다제 1의 2개의 이소형은 UniProtKB/Swiss-Prot Accessions O14773-1 및 O14773-2로 보고되었다 (여기서 서열번호: 1 및 4로 재현됨). CLN2 유전자의 돌연변이는 후기-영아기 NCL (LINCL) 질환과 관련이 있다.

소정의 실시형태에서, 인간 (h) TPP1-인코딩 최적화된 cDNA는 최적의 코돈 사용을 위해 맞춤 설계되고 합성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 서열번호: 3으로 재현되는 hTPP1co cDNA는 이어서 CB7 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV) 즉시 초기 인핸서 (C4)와 닭 베타 액틴 프로모터 사이의 하이브리드에 의해 구동되는 이식유전자 발현 카세트에 배치될 수 있으며, 이 프로모터로부터의 전사는 닭 베타 액틴 인트론 (CI)의 존재에 의해 증진된다 (도 1a 및 도 1b). 소정의 실시형태에서, 발현 카세트에 대한 폴리A 신호는 토끼 베타-글로빈 (RBG) 폴리A이다.

일 양태에서, 인간 (h) TPP1를 인코딩하는 코돈 최적화되고 조작된 핵산 서열이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 천연 TPP1 서열 (서열번호: 2)과 비교하여 번역을 최대화하도록 설계된 조작된 인간 (h) TPP1 cDNA가 (서열번호: 3으로서) 본 명세서에 제공된다. 바람직하게는, 코돈 최적화된 TPP1 코딩 서열은 전장 천연 TPP1 코딩 서열 (서열번호: 2)과 약 80% 미만의 동일성, 바람직하게는 약 75% 이하의 동일성을 갖는다. 일 실시형태에서, 코돈 최적화된 TPP1 코딩 서열은 서열번호: 2의 천연 TPP1 코딩 서열과 약 74% 동일성을 갖는다. 일 실시형태에서, 코돈 최적화된 TPP1 코딩 서열은 AAV-매개성 전달 (예를 들어, rAAV) 후 천연 TPP1와 비교하여 개선된 번역률을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 코돈 최적화된 TPP1 코딩 서열은 서열번호: 2의 전장 천연 TPP1 코딩 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% 미만의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% 이상의 동일성을 공유하는 서열이다. 일 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 다른 실시형태에서, 상이한 TPP1 코딩 서열이 선택된다.

서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전체 길이에 걸쳐있을 수 있고, 유전자 코딩 서열의 전체 길이 또는 적어도 약 500 내지 5000개의 뉴클레오티드의 단편이 바람직하다. 그러나, 더 작은 단편들, 예를 들어, 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 20 내지 24개의 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32개의 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오티드 사이의 동일성이 또한 바람직할 수 있다.

퍼센트 동일성은 단백질, 폴리펩티드, 약 32개의 아미노산, 약 330개의 아미노산, 또는 이의 펩티드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열의 전체 길이에 걸쳐 아미노산 서열에 대해 쉽게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개의 아미노산 길이일 수 있고, 최대 약 700개의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열 간의 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 지칭할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 다수의 핵산 서열 또는 단백질 (아미노산) 서열을 지칭하며, 종종 참조 서열과 비교하여 누락되거나 추가된 염기 또는 아미노산에 대한 수정을 함유한다.

동일성은 서열의 정렬을 준비하고, 당업계에 공지되거나 상업적으로 이용 가능한 다양한 알고리즘 및/또는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 [예를 들어, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; 예를 들어, Needleman-Wunsch 알고리즘, Smith-Waterman 알고리즘을 사용하여] 결정될 수 있다. 정렬은 임의의 다양한 공개적으로 또는 상업적으로 이용 가능한 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 수행된다 서열 정렬 프로그램, 예를 들어, "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램이 아미노산 서열에 이용 가능하다. 일반적으로, 임의의 이들 프로그램은 디폴트 설정에서 사용되지만, 당업자의 필요에 따라 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 같은 적어도 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)]을 참조한다.

핵산 서열에 대한 다중 서열 정렬 프로그램이 또한 이용 가능하다. 이러한 프로그램의 예는 "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP", 및 "MEME"를 포함하며, 이들은 인터넷의 웹 서버를 통해 엑세스할 수 있다. 이러한 프로그램에 대한 다른 공급원은 당업자에게 공지되어 있다. 대안적으로, 벡터 NTI 유틸리티 또한 사용된다. 또한, 상기 기술된 프로그램에 함유된 것을 포함하여 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 알고리즘이 있다. 다른 예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 Fasta™을 사용하여 비교될 수 있다. Fasta™은 질의 및 검색 서열 사이에서 가장 많이 중첩되는 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 퍼센트 서열 동일성은 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 GCG 버전 6.1에 제공된 디폴트 매개변수 (단어 크기 6 및 점수 행렬에 대한 NOPAM 인자)를 갖는 Fasta™을 사용하여 결정될 수 있다.

코돈-최적화된 코딩 영역은 다양한 다른 방법에 의해 설계될 수 있다. 이러한 최적화는 온라인으로 이용 가능한 방법 (예를 들어, GeneArt), 공개된 방법, 또는 코돈 최적화 서비스, 예를 들어, DNA2.0 (Menlo Park, CA)을 제공하는 회사를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 코돈 최적화 방법은 예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 국제 특허 공개 번호 WO 2015/012924에 기술되어 있다. 또한, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2014/0032186 및 미국 특허 공개 번호 2006/0136184를 참조한다. 적절하게는, 생성물에 대한 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 전체 길이가 변형된다. 그러나, 일부 실시형태에서, ORF의 단편만이 변경될 수 있다. 이러한 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 주어진 폴리펩티드 서열에 대한 빈도를 적용하고 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 코딩 영역의 핵산 단편을 생산할 수 있다.

코돈에 대한 실제 변화를 수행하거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 설계된 코돈-최적화된 코딩 영역을 합성하기 위한 다수의 옵션이 이용 가능하다. 이러한 변형 또는 합성은 당업자에게 잘 알려진 표준 및 일상적인 분자 생물학적 조작을 사용하여 수행될 수 있다. 한 접근법에서, 각각 80 내지 90개의 뉴클레오티드의 길이이며 원하는 서열의 길이에 걸쳐져 있는 일련의 상보적 올리고뉴클레오티드 쌍이 표준 방법에 의해 합성된다. 이러한 올리고뉴클레오티드 쌍은 어닐링 시 응집성 말단을 함유하는 80 내지 90개의 염기 쌍의 이중 가닥 단편을 형성하도록 합성되며, 예를 들어, 쌍에 있는 각 올리고뉴클레오티드는 쌍에 있는 다른 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 넘어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 염기를 확장하도록 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 각 쌍의 단일-가닥 말단은 또 다른 올리고뉴클레오티드 쌍의 단일-가닥 말단과 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드 쌍을 어닐링한 후, 대략 5 내지 6개의 이러한 이중-가닥 단편을 응집성 단일 가닥 말단을 통해 함께 어닐링한 다음, 함께 결찰하고, 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어, Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif에서 이용 가능한 TOPO® 벡터로 클로닝된다. 그런 다음, 작제물은 표준 방법에 의해 시퀀싱된다. 함께 결찰된 80 내지 90개의 염기 쌍 단편의 5 내지 6개의 단편, 즉 약 500개의 염기 쌍의 단편으로 이루어진 이들 작제물 중 일부가 원하는 서열 전체가 일련의 플라스미드 작제물로 표현되도록 제조된다. 그런 다음, 이러한 플라스미드의 삽입물은 적절한 제한 효소로 절단되고, 함께 결찰되어 최종 작제물을 형성한다. 그런 다음, 최종 작제물은 표준 박테리아 클로닝 벡터에 클로닝되고, 시퀀싱된다. 추가적인 방법은 당업자에게 즉시 명백할 것이다. 또한, 유전자 합성은 쉽게 상업적으로 이용 가능하다.

일 실시형태에서, TPP1을 인코딩하는 핵산 서열은 이에 공유 결합된 태그 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 태그 폴리펩티드는 제한 없이 myc 태그 폴리펩티드, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그 폴리펩티드, 녹색 형광 단백질 태그 폴리펩티드, myc-피루베이트 키나아제 태그 폴리펩티드, His6 태그 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 태그 폴리펩티드, 플래그 태그 폴리펩티드, 및 말토스 결합 단백질 태그 폴리펩티드를 포함하는 공지된 "에피토프 태그"로부터 선택될 수 있다.

또 다른 양태에서, TPP1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 제공된다. 일 실시형태에서, 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 인간 TPP1을 인코딩하는 서열번호: 3이다.

일부 실시형태에서, TPP1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 인코딩하는 단백질의 전사를 유도, 억제 또는 그렇지 않으면 제어하는 조절 서열 (제한 없이 개시 서열, 인핸서 서열, 및 프로모터 서열을 포함)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, TPP1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2020/102369에 기술된 뉴클레오티드 서열이다.

4.1.7 작제물

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 다음의 순서로 다음의 요소를 포함한다: a) 구성적 또는 저산소증-유도성 프로모터 서열, 및 b) 치료 생성물을 인코딩하는 서열. 소정의 실시형태에서, 치료 생성물을 인코딩하는 서열은 IRES 요소에 의해 분리된 다중 ORF를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 치료 생성물을 인코딩하는 서열은 F/F2A 서열에 의해 분리된 1개의 ORF에 다중 서브유닛을 포함한다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 다음의 순서로 다음의 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 구성적 또는 저산소증-유도성 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 치료 생성물을 인코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열.

소정의 실시형태에서, AAV.hTPP1co 벡터 (AAV.CB7.CI.hTPP1co.RBG)의 6841개의 bp 생산 플라스미드는 AAV2 유래된 ITR이 측면에 있을 뿐만 아니라 선별 마커로서 암피실린에 저항성을 갖는 본 명세서에 기술된 hTPP1co 발현 카세트로 구축될 수 있다 (도 1b). 소정의 실시형태에서, 카나마이신에 저항성이 있는 유사한 AAV.hTPP1co 생산 플라스미드 또한 구축될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 두 플라스미드로부터 유래되는 벡터는 본 명세서에 기술된 hTPP1co 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 유래된 ITR을 갖는 단일-가닥 DNA 게놈일 수 있다.

소정의 실시형태에서, AAV.hTPP1co 벡터는 삼중 형질감염에 의해 제조되고 0.001% 플루로닉 F68 (PF68)을 함유하는 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 부형제로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mizukami, Hiroaki, et al., A Protocol for AAV vector production and purification, Diss. Di-vision of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998]을 참조한다. 소정의 실시형태에서, 생산된 벡터의 게놈 역가는 액적 디지털 PCR (ddPCR)을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14]를 참조한다. 때때로 본 명세서에서 AAV9.CB7.hCLN2로 지칭되는 예시적인 AAV.hTPP1co 벡터가 본 명세서에 기술된다.

일부 실시형태에서, 재조합 벡터는 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2020/102369에 기술된 재조합 벡터이다.

본 명세서에서 사용되는 "발현 카세트"는 TPP1 단백질, 프로모터에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭하며, 이에 대한 다른 조절 서열을 포함할 수 있고, 이 카세트는 바이러스 벡터 (예를 들어, 바이러스 입자)의 캡시드로 패키징될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 이러한 발현 카세트는 바이러스 게놈의 패키징 신호가 측면에 있는 본 명세서에 기술된 CLN2 서열 및 본 명세서에 기술된 것과 같은 다른 발현 제어 서열을 함유한다. 예를 들어, AAV 바이러스 벡터의 경우, 패키징 신호는 5' 역 말단 반복부 (ITR) 및 3' ITR이다. AAV 캡시드로 패키징될 때, 발현 카세트와 함께 ITR은 "재조합 AAV (rAAV) 게놈" 또는 "벡터 게놈"으로 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 TPP1 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 카세트는 숙주 세포에서 TPP1을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열의 발현을 지시하는 발현 제어 서열과 작동 가능하게 관련된 코돈 최적화된 CLN2를 제공한다.

또 다른 실시형태에서, AAV 벡터에서 사용하기 위한 발현 카세트가 제공된다. 이 실시형태에서, AAV 발현 카세트는 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 5' 및 3' ITR은 TPP1을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열, 선택적으로 숙주 세포에서 TPP1을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열의 발현을 지시하는 추가적인 서열의 측면에 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, AAV 발현 카세트는 5' 말단에 5' AAV 역 말단 반복부 서열 (ITR)이 측면에 있고, 3' 말단에 3' AAV ITR이 측면에 있는 상기 기술한 바와 같은 발현 카세트를 기술하기 위한 것이다. 따라서, 이러한 rAAV 게놈은 발현 카세트를 AAV 바이러스 입자, 즉, AAV 5' 및 3' ITR로 패키징하는데 필요한 최소한의 서열을 함유한다. AAV ITR은 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 AAV의 ITR 서열로부터 얻어질 수 있다. 이러한 ITR은 생성된 재조합 AAV에 이용되는 캡시드와 동일한 AAV 기원 또는 (AAV 슈도형을 생산하기 위한) 상이한 AAV 기원일 수 있다. 일 실시형태에서, AAV2로부터의 ITR 서열이 사용된다. 그러나, 다른 AAV 공급원으로부터의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래되고 AAV 캡시드는 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 경우, 생성된 벡터는 슈도형이라 할 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터 게놈은 AAV 5' ITR, TPP1 코딩 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이러한 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다. D-서열 및 말단 분해능 부위 (trs)가 결실된

ITR이라고 하는 5' ITR의 짧아진 버전이 기술되어 있다. 다른 실시형태에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다. 그런 다음, 각각의 rAAV 게놈은 생산 플라스미드에 도입될 수 있다.

일 양태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 이러한 벡터는 다양한 기원의 플라스미드일 수 있으며, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이 재조합 복제 결합 바이러스의 생성을 위한 소정의 실시형태에서 유용하다.

일 실시형태에서, 벡터는 예를 들어, 마이셀, 리포솜, 양이온성 지질 - 핵산 조성물, 폴리-글리칸 조성물 및 다른 중합체, 지질 및/또는 콜레스테롤-기반 - 핵산 접합체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 작제물을 포함하는 다양한 조성물 및 나노 입자와 결합된, 이들의 기술된 발현 카세트, 예를 들어, "네이키드 DNA", "네이키드 플라스미드 DNA", RNA, 및 mRNA를 포함하는 비-바이러스 플라스미드이다. 예를 들어, 문헌 [X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; web publication: March 21, 2011]; WO2013/182683, WO 2010/053572 및 WO 2012/170930을 참조하며, 이들 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다. 이러한 비-바이러스 TPP1 벡터는 본 명세서에 기술된 경로에 의해 투여될 수 있다. 바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터는 유전자 전달 및 유전자 요법 적용에 사용하기 위해 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에 기술된 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 외인성 또는 이종성 CLN2 핵산 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 발현 카세트는 약물 전달 또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 사용되는 플라스미드 상에서 조작될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 바람직하게는 복제 결합성이며, 뇌 세포를 표적하는 하는 것들 중에서 선택된다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스; 헤르페스 바이러스; 렌티바이러스; 레트로바이러스; 파보바이러스 등을 포함하지만 이제 제한되지 않는 유전자 요법에 적합한 임의의 바이러스를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제-결함성일 수 있다. "복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 있는 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 외피에 패키징된 합성 또는 재조합 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 또한 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제-결핍성이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력을 유지한다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하지는 않지만 (게놈은 "무기력"하게 조작될 수 있음 - 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호 옆에 있는 관심 있는 이식유전자만을 함유), 이들 유전자는 생산 중에 공급될 수 있다. 따라서, 이는 복제에 필요한 바이러스 효소가 존재하는 경우를 제외하고는 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 발생할 수 없기 때문에 유전자 요법에 사용하기에 안전한 것으로 간주된다.

또 다른 실시형태에서, 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터가 제공된다. rAAV는 AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함한다.

벡터 게놈은 일 실시형태에서 다음을 포함한다: (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR. 또 다른 실시형태에서, 벡터 게놈은 본 명세서에 기술된 발현 카세트이다. 일 실시형태에서, CLN2 서열은 전장 TPP1 단백질을 인코딩한다. 일 실시형태에서, TPP1 서열은 서열번호: 1의 단백질 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호: 3 또는 이의 변이체이다.

ITR 또는 다른 AAV 구성성분은 AAV로부터 당업자에게 이용 가능한 기법을 사용하여 쉽게 단리 또는 조작될 수 있다. 이러한 AAV는 학술적, 상업적 또는 공개적 공급원 (예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, VA)으로부터 단리, 조작 또는 얻어질 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은 문헌 또는 예를 들어, GenBank, PubMed 등과 같은 데이터베이스에서 이용 가능한 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적합한 수단을 통해 조작될 수 있다. AAV 바이러스는 종래의 분자 생물학 기법에 의해 조작될 수 있으므로, 이러한 입자를 핵산 서열의 세포 특이적 전달, 면역원성의 최소화, 안정성 및 입자 수명의 조정, 효율적인 분해, 핵으로의 정확한 전달 등을 위해 최적화될 수 있다.

AAV의 단편은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 쉽게 이용될 수 있다. 바람직한 AAV 단편 중에는 vp1, vp2, vp3 및 초가변 영역을 포함하는 cap 단백질, rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40을 포함하는 rep 단백질, 및 이러한 단백질을 인코딩하는 서열이 있다. 이러한 단편은 단독으로, 다른 AAV 혈청형 서열 또는 단편과 조합하거나 또는 다른 AAV 또는 비-AAV 바이러스 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 인공 AAV 혈청형은 비-자연 발생적 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 인공 캡시드는 또 다른 AAV 혈청형 (공지 또는 신규), 동일한 AAV 혈청형의 비-연속 부분, 비-AAV 바이러스 공급원, 또는 비-바이러스 공급원으로부터 얻어질 수 있는 이종성 서열과 조합된 본 발명의 신규 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하여 임의의 적합한 기법에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 제한 없이 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있다. 일 실시형태에서, 벡터는 AAV9 cap 및/또는 rep 서열을 함유한다. 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,906,111를 참조한다.

일 실시형태에서, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 특징으로 하는 AAV9 캡시드를 갖는 AAV 벡터가 본 명세서에 제공되며, 여기서 핵산은 필요로 하는 환자에서 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 고전적인 후기 영아형 신경원성 세로이드 리포푸신증 2 (CLN2) 유전자를 인코딩한다.

본 명세서에서 사용되는 "AAV9 캡시드"는 전형적으로 대안적 스플라이스 변이체로 발현되어 서열번호: 6의 상이한 길이의 단백질을 생성하는 약 60개의 가변 단백질 (vp)의 어셈블리인 DNAse-저항성 입자를 특징으로 한다. 또한, 본 명세서에 참조로 포함되는 Genbank 등록 번호 AAS99264.1를 참조한다. 또한, US7906111 및 WO 2005/033321을 참조한다. 본 명세서에서 사용되는 "AAV9 변이체"는 예를 들어, WO2016/049230, US 8,927,514, US 2015/0344911, 및 US 8,734,809에 기술된 것들을 포함한다. 아미노산 서열은 서열번호: 6에서 재현되고, 코딩 서열은 서열번호: 7에서 재현된다. 일 실시형태에서, AAV9 캡시드는 서열번호: 7에 의해 인코딩된 캡시드, 또는 그것과 적어도 약 90%, 95%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.

가장 큰 단백질인 vp1은 일반적으로 서열번호: 6의 아미노산 서열의 전체 길이이다 (서열번호: 6의 1번 내지 736번 aa). 소정의 실시형태에서, AAV9 vp2 단백질은 서열번호: 6의 138 내지 736번 아미노산 서열을 갖는다. 소정의 실시형태에서, AAV9 vp3은 서열번호: 6의 203 내지 736번 아미노산 서열을 갖는다. 소정의 실시형태에서, vp 1, 2 또는 3 단백질은 절단 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산)을 가질 수 있다. AAV9 캡시드는 약 60개의 vp 단백질로 구성되며, 여기서 vp1, vp2 및 vp3은 조립된 캡시드 내에서 약 1개의 vp, 약 1개의 vp2, 약 10 내지 20개의 vp3 단백질의 비로 존재한다. 이러한 비는 사용되는 생산 시스템에 따라 달라질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조작된 AAV9 캡시드는 vp2의 부재 하에 생성될 수 있다.

DNA (게놈 또는 cDNA), 또는 RNA (예를 들어, mRNA)를 포함하는 이러한 AAV9 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열을 설계하는 것은 당업계의 기술 내에 있다. 소정의 실시형태에서, AAV9 vp1 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 7에 제공된다. 다른 실시형태에서, AAV9 캡시드를 발현하기 위해 서열번호: 7과 70% 내지 99.9% 동일성의 핵산 서열이 선택될 수 있다. 소정의 다른 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호: 7과 적어도 약 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 동일, 또는 적어도 99% 내지 99.9% 동일하다.

AAV의 그룹과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "계통군 (clade)"은 AAV vp1 아미노산 서열의 정렬에 기초하여, 적어도 75% (적어도 1000개의 복제물의)의 부트스트랩 값 및 0.05 이하의 포아송 (Poisson) 보정 거리 측정에 의해 이웃-연결 알고리즘 (Neighbor-Joining algorithm)을 사용하여 결정된 바와 같이 서로 계통발생적으로 관련된 AAV의 그룹을 지칭한다. 이웃-연결 알고리즘은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics,Oxford University Press, New York (2000)]을 참조한다. 이러한 알고리즘을 실행하는데 이용 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 예를 들어, MEGA v2.1 프로그램은 변형된 Nei-Gojobori 방법을 실행한다. 이러한 기법 및 컴퓨터 프로그램, 및 AAV vp1 캡시드 단백질의 서열을 사용하여, 당업자는 선택된 AAV가 다른 계통군에서 본 명세서에서 확인된 계통군 중 하나에 포함되는지 또는 이들 계통군의 바깥에 있는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 계통군 A, B, C, D, E 및 F를 확인하고 신규한 AAV의 핵산 서열, GenBank 등록 번호 AY530553 내지 AY530629를 제공하는 문헌 [G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10): 6381-6388]을 참조한다. 또한, WO 2005/033321을 참조한다. AAV9는 계통군 F 내에 있는 것을 추가 특징으로 한다. 다른 계통군 F AAV는 AAVhu31 및 AAVhu32를 포함한다.

AAV와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 변이체는 아미노산 또는 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것들을 포함하는 공지된 AAV 서열로부터 유래하는 임의의 AAV 서열을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 임의의 기술되거나 공지된 AAV 캡시드 서열로부터 최대 약 10%의 변이를 포함할 수 있는 변이체를 포함한다. 즉, AAV 캡시드는 본 명세서에 제공되고/되거나 당업계에 공지된 AAV 캡시드에 대해 약 90%의 동일성 내지 약 99.9%의 동일성, 약 95% 내지 약 99%의 동일성 또는 약 97% 내지 약 98%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV9 캡시드와 적어도 95%의 동일성을 공유한다. AAV 캡시드의 퍼센트 동일성을 결정할 때, 임의의 가변 단백질 (예를 들어, vp1, vp2, 또는 vp3)에 대해 비교될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 캡시드는 vp1, vp2 또는 vp3에 대해 AAV9와 적어도 95%의 동일성을 공유한다.

본 명세서에서 사용되는 "인공 AAV"는 제한 없이 비-자연 발생적 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 의미한다. 이러한 인공 캡시드는 다른 선택된 AAV, 동일한 AAV의 비-연속 부분, 비-AAV 바이러스 공급원 또는 비-바이러스 공급원으로부터 얻어질 수 있는 이종성 서열과 조합하여 선택된 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하여 임의의 적합한 기법에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV는 제한 없이 슈도형 AAV, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있다. 하나의 AAV의 캡시드가 이종성 캡시드 단백질로 대체된 슈도형 벡터가 본 발명에 유용하다. 실시형태에서, AAV2/9 및 AAV2/rh.10은 예시적인 슈도형 벡터이다.

또 다른 실시형태에서, 자가-상보성 AAV가 사용된다. "자가-상보성 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 코딩 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 발현 카세트를 갖는 플라스미드 또는 벡터를 지칭한다. 감염 시, 두 번째 가닥의 세포 매개성 합성을 기다리는 대신, scAAV의 2개의 상보성 반쪽은 즉각적인 복제 및 전사를 위해 준비된 하나의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 단위를 형성하기 위해 결합할 것이다. 예를 들어, 문헌 [D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254]을 참조한다. 자가-상보성 AAV는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.

또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 것들을 포함하는 발현 카세트가 재조합 AAV 게놈을 생성하는 데 이용된다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 발현 카세트는 바이러스 벡터를 생성하고/하거나 숙주 세포, 예를 들어, DNA, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜 등으로 전달하는 데 유용한 적합한 유전적 요소 (벡터)로 조작되며, 이는 그 위에 운반된 CLN2 서열을 전달한다. 선택된 벡터는 형질감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA-코팅된 펠릿, 바이러그 감염 및 원형질체 융합을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 이러한 작제물을 제조하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작에 숙련된 자들에게 공지되어 있으며, 유전 공학, 재조합 공합 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY]을 참조한다.

발현 카세트 또는 rAAV 게놈 또는 생산 플라스미드를 비리온으로 패키징하기 위해, ITR은 발현 카세트와 동일한 작제물에서 시스로 (in cis) 필요한 유일한 AAV 구성성분이다. 일 실시형태에서, 복제 (rep) 및/또는 캡시드 (cap)를 위한 코딩 서열은 AAV 게놈으로부터 제거되고, AAV 벡터를 생성하기 위해 트랜스로 (in trans) 또는 패키징 세포주에 의해 공급된다.

대상체에게 전달하기에 적합한 AAV 바이러스 벡터를 생성하고 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7790449; 미국 특허 번호 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 US 7588772 B2를 참조한다. 한 시스템에서, 생산자 세포주는 ITR이 측면에 있는 이식유전자를 인코딩하는 작제물과 rep 및 cap를 인코딩하는 작제물(들)로 일시적으로 형질감염된다. 두 번째 시스템에서, rep 및 cap를 안정적으로 공급하는 패키징 세포주는 ITR이 측면에 있는 이식유전자를 인코딩하는 작제물로 일시적으로 형질감염된다. 특정 실시형태에서, 생산자 세포주 또는 패키징 세포주는 본 명세서에 기술된 AAV 바이러스 벡터가 현탁 배양에서 생산자 세포주 또는 패키징 세포주를 성장시킴으로써 제조될 수 있도록 하는 현탁 세포주이다. 각각의 이러한 시스템에서, AAV 비리온은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스로의 감염에 대한 반응으로 생성되며, 오염된 바이러스로부터 rAAV를 분리할 필요가 있다. 최근에는, AAV를 복구하기 위해 헬퍼 바이러스로의 감염이 필요하지 않은 시스템이 개발되었다 - 필요한 헬퍼 기능 (즉, 아데노바이러스 E1, E2a, VA, 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52, 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 중합효소)은 또한 시스템에 의해 트랜스로 공급된다. 이러한 새로운 시스템에서, 헬퍼 기능은 필요한 헬퍼 기능을 인코딩하는 작제물로 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 공급될 수 있거나, 세포는 헬퍼 기능을 인코딩하는 유전자를 안정적으로 함유하도록 조작될 수 있으며, 그 발현은 전사 또는 전사 후 수준에서 제어될 수 있다.

또 다른 시스템에서, ITR 및 rep/cap 유전자가 측면에 있는 발현 카세트는 바큘로바이러스-기반 벡터로 감염시킴으로써 곤충 세포로 도입된다. 이러한 생산 시스템에 대한 리뷰는, 일반적으로, 예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Zhang et al., 2009, " Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929]을 참조한다. 이러한 및 다른 AAV 생산 시스템을 제조 및 사용하는 방법은 또한 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 다음의 미국 특허에 기술되어 있다: 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 제6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; 및 7,439,065. 일반적으로, 예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Grieger & Samulski, 2005, " Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med. 10:717-733]; 및 하기에 인용된 참조문헌을 참조한다.

일 양태에서, rAAV를 생산할 수 있는 현탁 세포주를 현탁 배양에서 성장시키는 것을 포함하는, 본 명세서에 기술된 rAAV를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

소정의 실시형태에서, 현탁 세포주는 무혈청 및 동물 구성성분이 없는 배양 배지를 사용하여 세포를 현탁 배양에 적응시킴으로써 부착성 세포주로부터 유래한다. 특정 실시형태에서, 현탁 세포주는 HEK293 현탁 세포주이다.

본 발명의 임의의 실시형태를 구축하기 위해 사용되는 방법은 핵산 조작의 숙련자에게 공지되어 있으며, 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Green and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)]을 참조한다. 유사하게는, rAAV 비리온을 생성하는 방법이 잘 알려져 있으며, 적합한 방법의 선택은 본 발명을 제한하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532] 및 미국 특허 번호 5,478,745를 참조한다.

"플라스미드"는 일반적으로 당업자에게 친숙한 표준 명명 규칙에 따라 대문자 및/또는 숫자가 선행 및/또는 후행하는 소문자 p로 본 명세서에서 지정된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라스미드 및 다른 클로닝 및 발현 벡터가 잘 알려져 있으며, 당업자가 쉽게 이용 가능하다. 더욱이, 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 임의의 수의 다른 플라스미드를 쉽게 구축할 수 있다. 본 발명에서 이러한 플라스미드뿐만 아니라 다른 벡터의 특성, 구성 및 사용은 본 개시내용으로부터 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.

일 실시형태에서, 생산 플라스미드는 본 명세서에 기술되거나 또는 본 명세서에 참조로 포함되는 WO2012/158757에 기술된 것과 같은 것이다. rAAV 벡터를 생산하는 데 사용하기 위한 다양한 플라스미드가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 유용하다. 생산 플라스미드는 AAV cap 및/또는 rep 단백질을 발현하는 숙주 세포에서 배양된다. 숙주 세포에서, 각 rAAV 게놈은 구제되고, 감염성 바이러스 입자를 형성하기 위해 캡시드 단백질 또는 외피 단백질로 패키징된다.

일 양태에서, 상기 기술된 발현 카세트를 포함하는 생산 플라스미드가 제공된다. 일 실시형태에서, 생산 플라스미드는 도 1b에 도시되어 있다. 이 플라스미드는 rAAV-인간 코돈 최적화된 TPP1 벡터의 생성을 위한 예에 사용된다. 이러한 플라스미드는 5' AAV ITR 서열; 선택된 프로모터; 폴리A 서열; 및 3' ITR을 함유하는 것이며; 추가적으로, 이는 또한 닭 베타-액틴 인트론과 같은 인트론 서열을 함유한다. 예시적인 개략도가 도 1a에 도시되어 있다. 추가 실시형태에서, 인트론 서열은 약 3 킬로베이스 (kb) 내지 약 6 kb, 약 4.7 kb 내지 약 6 kb, 약 3 kb 내지 약 5.5kb, 또는 약 4.7 kb 내지 5.5 kb의 크기로 rAAV 벡터 게놈을 유지한다. TPP1 인코딩 서열을 포함하는 생산 플라스미드의 예는 서열번호: 5에서 찾을 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생산 플라스미드는 최적화된 벡터 플라스미드 생산 효율로 변형된다. 이러한 변형은 다른 중성 서열의 첨가, 또는 벡터 플라스미드의 슈퍼코일의 수준을 조절하기 위한 람다 스터퍼 서열의 포함을 포함한다. 이러한 변형은 본 명세서에서 상정된다. 다른 실시형태에서, 종결자 및 다른 서열이 플라스미드에 포함된다.

소정의 실시형태에서, rAAV 발현 카세트, 벡터 (예컨대 rAAV 벡터), 바이러스 (예컨대 rAAV), 및/또는 생산 플라스미드는 AAV 역 말단 반복부 서열, TPP1을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열, 및 숙주 세포에서 인코딩된 단백질의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, rAAV 발현 카세트, 바이러스, 벡터 (예컨대 rAAV 벡터), 및/또는 생산 플라스미드는 인트론, 코작 (Kozak) 서열, 폴리A, 전사 후 조절 요소 등 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 전사 후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 (Woodchuck Hepatitis 바이러스; WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)이다.

발현 카세트, 벡터 및 플라스미드는 본 명세서에 기술된 바와 같이 예를 들어, 코돈 최적화를 포함하는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 특정 종에 대해 최적화될 수 있는 다른 구성성분을 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 발현 카세트, 벡터, 플라스미드 및 바이러스는 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; TATA 서열; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열 (즉, 코작 공통 서열); 인트론; 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 함유한다. 발현 카세트 또는 벡터는 본 명세서에 기술된 임의의 요소가 없거나 임의의 요소 중 하나 이상을 함유할 수 있다.

적합한 폴리A 서열의 예는 예를 들어, 합성 폴리A를 포함하거나 소 성장 호르몬 (bGH), 인간 성장 호르몬 (hGH), SV40, 토끼 β-글로빈 (RGB), 또는 변형된 RGB (mRGB)로부터 유래한다. 추가 실시형태에서, 폴리 A는 서열번호: 5의 33번 내지 159번 nt의 핵산 서열을 갖는다.

적합한 인핸서의 예는 예를 들어, 다른 것들 중에서 CMV 인핸서, RSV 인핸서, 알파 태아단백질 인핸서, TTR 최소화 프로모터/인핸서, LSP (TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서), APB 인핸서, ABPS 인핸서, 알파 mic/bik 인핸서, TTR 인핸서, en34, ApoE를 포함한다.

일 실시형태에서, 코작 서열은 올바른 개시 코돈으로부터의 변역을 증진시키기 위해 TPP1 코딩 서열의 상류에 포함된다. 또 다른 실시형태에서, CBA 엑손 1 및 인트론은 발현 카세트에 포함된다. 일 실시형태에서, TPP1 코딩 서열은 하이브리드 닭 β 액틴 (CBA) 프로모터의 제어 하에 배치된다. 이 프로모터는 거대세포바이러스 (CMV) 즉시 초기 인핸서, 근위 닭 β 액틴 프로모터, 및 인트론 1 서열 측면에 있는 CBA 엑손 1로 구성된다.

또 다른 실시형태에서, 인트론은 CBA, 인간 베타 글로빈, IVS2, SV40, bGH, 알파-글로불린, 베타-글로불린, 콜라겐, 오브알부민, p53, 또는 이들의 단편으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 발현 카세트, 벡터, 플라스미드 및 바이러스는 5' ITR, 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터, CMV 인핸서, CBA 엑손 1 및 인트론, 인간 코돈 최적화된 CLN2 서열, 토끼 글로빈 폴리 A 및 3' ITR을 함유한다. 추가 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호: 8의 1번 내지 4020번 nt를 포함한다. 또 다른 추가 실시형태에서, 5' ITR은 서열번호: 5의 3199번 nt 내지 3328번 nt로부터의 핵산 서열을 가지며, 3'ITR은 서열번호: 5의 248번 nt 내지 377번 nt로부터의 핵산 서열을 갖는다. 추가 실시형태에서, 생산 플라스미드는 서열번호: 5의 서열을 가지며, 또한 도 1c 내지 1e에 도시되어 있다.

4.1.8 벡터의 제조 및 시험

본 명세서에 제공된 재조합 벡터 (예를 들어, 재조합 바이러스 벡터)는 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 1차 섬유아세포, 간세포, 및 근아세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 제공된 재조합 벡터는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터로부터의 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 용어 "숙주 세포"는 바텐병에 대해 생체내에서 치료되는 대상체의 뇌 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 숙주 세포는 뇌실 시스템의 상피 내층인 뇌실막을 포함하는 CNS의 상피 세포를 포함한다. 다른 숙주 세포는 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포를 포함한다.

재조합 바이러스 벡터의 경우, 숙주 세포는 치료 생성물 및 관련된 요소 (즉, 벡터 게놈)를 인코딩하는 서열, 및 숙주 세포에서 바이러스를 생산하는 수단, 예를 들어, 복제 및 캡시드 유전자 (예를 들어, AAV의 rep 및 cap 유전자)로 안정적으로 형질전환된다. AAV8 캡시드로 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법에 대해서는, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,282,199 B2의 상세한 설명의 섹션 IV를 참조한다. 상기 벡터의 게놈 카피 역가는 예를 들어, TAQMAN® 분석에 의해 결정될 수 있다. 비리온은 예를 들어, CsCl₂ 침강에 의해 회수될 수 있다.

시험관내 검정, 예를 들어, 세포 배양 검정을 사용하여 본 명세서에 기술된 벡터로부터 치료 생성물 발현을 측정할 수 있으며, 따라서, 예를 들어, 벡터의 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 망막 세포로부터 유래된 세포주인, PER.C6® 세포주(Lonza), 또는 망막 색소 상피 세포, 예를 들어, 망막 색소 상피 세포주 hTERT RPE-1(ATCC®로부터 이용가능)을 사용하여 치료 생성물 발현을 평가할 수 있다. 일단 발현되면, 번역-후 변형 패턴의 결정을 포함하여 발현된 치료 생성물의 특성이 결정될 수 있다. 또한, 세포-발현된 치료 생성물의 번역-후 변형으로 인한 이점은 당업계에 공지된 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

4.2 조성물

본 명세서에 기술된 치료 생성물 및 적합한 담체를 인코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 조성물이 기술되어 있다. 적합한 담체 (예를 들어, 맥락막상, 망막하, 공막옆, 유리체내, 결막하, 및/또는 망막내 투여용)는 당업자에 의해 용이하게 선택될 것이다.

본 개시내용은 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV), 제1인산칼륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨 무수화물, 수크로스, 및 계면활성제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV), 이온성 염 부형제 또는 완충제, 수크로스, 및 폴록사머 188을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이온성 염 부형제 또는 완충제는 제1인산칼륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨 무수화물, 인산나트륨 6수화물, 제1인산나트륨 1수화물, 트로메타민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염 (트리스-HCl), 아미노산, 히스티딘, 히스티딘 염산염 (히스티딘-HCl), 숙신산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 및 (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) (HEPES), 황산나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘 6수화물, 황산칼슘, 염화칼륨, 염화칼슘, 구연산칼슘로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 구성성분일 수 있다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 60 mM 내지 115 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 60 mM 내지 100 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 65 mM 내지 95 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 70 mM 내지 90 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 75 mM 내지 85 mM의 이온 강도를 갖는다

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 30 mM 내지 100 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 35 mM 내지 95 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 40 mM 내지 90 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 45 mM 내지 85 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 50 mM 내지 80 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 55 mM 내지 75 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 60 mM 내지 70 mM의 이온 강도를 갖는다

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 60 mM 내지 115 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 60 mM 내지 100 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 65 mM 내지 95 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 70 mM 내지 90 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 75 mM 내지 85 mM의 이온 강도를 갖는다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 30 mM 내지 100 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 35 mM 내지 95 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 40 mM 내지 90 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 45 mM 내지 85 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 50 mM 내지 80 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 55 mM 내지 75 mM의 이온 강도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 60 mM 내지 70 mM의 이온 강도를 갖는다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.2 g/L의 농도로 염화칼륨을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.2 g/L의 농도로 제1인산칼륨을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 5.84 g/L의 농도로 염화나트륨을 포함하고, 그리고

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1.15 g/L의 농도로 제2인산나트륨 무수화물을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 3% (중량/부피, 30 g/L) 내지 18% (중량/부피, 180 g/L)의 농도로 수크로스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 4% (중량/부피, 40 g/L)의 농도로 수크로스를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.001% (중량/부피, 0.01 g/L)의 농도로 폴록사머 188을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.0005% (중량/부피, 0.005 g/L) 내지 0.05% (중량/부피, 0.5 g/L)의 농도로 폴록사머 188을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.001% (중량/부피, 0.01 g/L)의 농도로 폴록사머 188을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV), 이온성 염 부형제 또는 완충제, 수크로스, 및 계면활성제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이온성 염 부형제 또는 완충제는 제1인산칼륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨 무수화물, 인산나트륨 6수화물, 제1인산나트륨 1수화물, 트로메타민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염산염 (트리스-HCl), 아미노산, 히스티딘, 히스티딘 염산염 (히스티딘-HCl), 숙신산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 및 (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) (HEPES), 황산나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘 6수화물, 황산칼슘, 염화칼륨, 염화칼슘, 구연산칼슘으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 구성성분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 구성성분일 수 있다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.0005% (중량/부피, 0.05 g/L) 내지 0.05% (중량/부피, 0.5 g/L)의 농도로 폴리소르베이트 20을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.0005% (중량/부피, 0.05 g/L) 내지 0.05% (중량/부피, 0.5 g/L)의 농도로 폴리소르베이트 80을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 약 7.4이다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 약 6.0 내지 9.0이다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 7.4이다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 6.0 내지 9.0이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 ± 10% 이내를 의미한다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 소수성으로 코팅된 유리 바이알에 들어 있다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 사이클로 올레핀 중합체 (Cyclo Olefin Polymer; COP) 바이알에 들어 있다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 Daikyo Crystal Zenith® (CZ) 바이알에 들어 있다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 TopLyo 코팅된 바이알에 들어 있다.

소정의 실시형태에서, (a) 재조합 AAV, (b) 0.2 g/L 농도의 염화칼륨, (c) 0.2 g/L 농도의 제1인산칼륨, (d) 5.84 g/L 농도의 염화나트륨, (e) 1.15 g/L 농도의 제2인산나트륨 무수화물, (f) 4% 중량/부피 (40 g/L) 농도의 수크로스, (g) 0.001% 중량/부피 (0.01 g/L) 농도의 폴록사머 188, 및 (h) 물로 이루어진 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시되어 있으며, 여기서 재조합 AAV는 AAV9이다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물의 벡터 게놈 농도 (VGC)는 약 3 × 10⁹ GC/mL, 약 1 × 10¹⁰ GC/mL, 약 1.2 × 10¹⁰ GC/mL, 약 1.6 × 10¹⁰ GC/mL, 약 4 × 10¹⁰ GC/mL, 약 6 × 10¹⁰ GC/mL, 약 1 × 10¹¹ GC/mL, 약 2 × 10¹¹ GC/mL, 약 2.4 × 10¹¹ GC/mL, 약 2.5 × 10¹¹ GC/mL, 약 3 × 10¹¹ GC/mL, 약 6.2 × 10¹¹ GC/mL, 약 1 × 10¹² GC/mL, 약 3 × 10¹² GC/mL, 약 2 × 10¹³ GC/mL 또는 약 3 × 10¹³ GC/mL이다.

소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV), 제1인산칼륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨 무수화물, 수크로스, 및 폴록사머 188을 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형을 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 AAV9로부터의 구성성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV는 AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 이식유전자를 전달하기 위해 사용되는 AAV는 인간 망막 세포 또는 광수용체 세포에 대해 지향성을 가져야 한다. 이러한 AAV는 비-복제 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함할 수 있으며, 특히 AAV9 캡시드를 보유하는 것이 바람직하다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터 또는 DNA 발현 작제물은 작제물 I이며, 여기서 작제물 I는 다음의 구성성분: AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 (a) 관심 있는 이식유전자를 인코딩하는 AAV 캡시드 패키징 벡터, (b) 염화칼륨 0.2 g/L 농도의 염화칼륨, (c) 0.2 g/L 농도의 제1인산칼륨, (d) 5.84 g/L 농도의 염화나트륨, (e) 1.15 g/L 농도의 제2인산나트륨 무수화물, (f) 4% 중량/부피 (40 g/L) 농도의 수크로스, (g) 0.001% 중량/부피 (0.01 g/L) 농도의 폴록사머 188, 및 (h) 물로 구성되며, 여기서 관심 있는 이식유전자는 관심 RNA 또는 관심 단백질, 예를 들어, 인간 TPP1을 인코딩한다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결된 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 액체 조성물로부터의 동결건조된 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 재구성된 동결건조된 제형이다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1% 및 약 7%의 잔류 수분 함량을 포함하는 동결건조된 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 2% 및 약 6%의 잔류 수분 함량을 포함하는 동결건조된 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 3% 및 약 4%의 잔류 수분 함량을 포함하는 동결건조된 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 5%의 잔류 수분 함량을 포함하는 동결건조된 조성물이다.

소정의 양태에서, 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 1개, 2개 이상의 투여 경로에 의한 투여에 적합하다 (예를 들어, 맥락막상 및 망막하 투여에 적합함).

제공된 방법은 이식유전자를 인코딩하는 재조합 AAV를 포함하는 약제학적 조성물의 생산에 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1) 단백질을 인코딩하는 rAAV 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, TPP1을 인코딩하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, CLN2를 인코딩하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다.

소정의 양태에서, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 주사, 맥락막상 주사 (예를 들어, 미세바늘이 있는 마이크로주사기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 통함), 유리체내 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후방 극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 및/또는 후방 공막옆 저장 절차 (예를 들어, 팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 의해 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본 명세서에 개시된다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 약제학적 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 주사, 맥락막상 주사 (예를 들어, 미세바늘이 있는 마이크로주사기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 통함), 유리체내 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후방 극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 및/또는 후방 공막옆 저장 절차 (예를 들어, 팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 적합하다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 주사, 맥락막상 주사 (예를 들어, 미세바늘이 있는 마이크로주사기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 통함), 유리체내 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후방 극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 및/또는 후방 공막옆 저장 절차 (예를 들어, 팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 적합한 바람직한 점도를 갖는다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 주사, 맥락막상 주사 (예를 들어, 미세바늘이 있는 마이크로주사기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 통함), 유리체내 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후방 극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 및/또는 후방 공막옆 저장 절차 (팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 적합한 바람직한 밀도를 갖는다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 주사, 맥락막상 주사 (예를 들어, 미세바늘이 있는 마이크로주사기와 같은 맥락막상 약물 전달 장치를 통함), 유리체내 접근법을 통한 망막하 주사 (외과적 절차), 맥락막상 공간을 통한 망막하 투여 (예를 들어, 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후방 극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치를 통한 외과적 절차), 및/또는 후방 공막옆 저장 절차 (예를 들어, 팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치를 통함)에 적합한 바람직한 오스몰 농도를 갖는다. 특정 실시형태에서, 망막하 투여를 위한 바람직한 오스몰 농도는 160 430 mOsm/kg H2O이다. 다른 특정 실시형태에서, 맥락막상 투여의 바람직한 오스몰 농도는 600 mOsm/kg H2O 미만이다.

소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 500 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 130 내지 470 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 160 내지 430 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 200 내지 400 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 240 내지 340 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 280 내지 300 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 295 내지 395 mOsm/kg H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 600 mOsm/kg H2O 미만의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 200 mOsm/L 내지 660 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 200 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 250 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 300 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 350 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 400 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 450 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 500 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 550 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 600 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 650 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 660 mOsm/L의 오스몰 농도를 갖는다.

이식유전자를 전달하기 위해 사용되는 재조합 벡터는 인간 망막 세포 또는 광수용체 세포에 대해 지향성을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 ("rAAV")를 포함할 수 있지만, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드 DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 유전자 요법 작제물은 제형 완충액에 AAV 벡터 활성 성분의 동결된 멸균 단일 사용 용액으로서 공급된다. 특정 실시형태에서, 망막하 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 수성 완충액, 계면활성제 및 임의의 부형제를 포함하는 제형 완충액에 재조합 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 실시형태에서, 작제물은 둘베코 (Dulbecco) 인산염 완충 식염수 및 0.001% 폴록사머 188, pH = 7.4에서 제형화된다.

4.3 유전자 요법

일 양태에서, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 망막하로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV는 맥락막상으로 투여된다.

일 양태에서, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체에게 망막하로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함하고, 여기서 상기 방법은 상기 인간 환자의 눈에 유리체절제술을 수행하는 것을 포함하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 상기 인간 대상체의 눈의 맥락막상 공간을 통해 재조합 바이러스 벡터 치료 생성물을 상기 인간 대상체의 눈의 망막하 공간에 투여하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 작은 바늘이 망막하 공간으로 주입되는 후방 극을 향해 맥락막상 공간을 통해 삽입 및 터널링될 수 있는 카테터를 포함하는 망막하 약물 전달 장치의 사용에 의한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 맥락막상 공간을 통해 망막하 약물 전달 장치의 카테터를 삽입 및 터널링하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체에게 망막하로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함하고, 여기서 상기 방법은 상기 인간 환자의 눈에 유리체절제술을 수행하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 유리체절제술은 부분 유리체절제술이다.

또 다른 양태에서, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체에게 맥락막상으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 맥락막상 공간으로 주사하는 것이다. 소정의 실시형태에서, 맥락막상 약물 전달 장치는 마이크로주사기다.

또 다른 양태에서 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체의 공막의 외부 표면에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치의 사용에 의한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 캐뉼러의 팁을 공막 표면에 직접 인접하여 삽입 및 유지하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체에게 유리체내로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 유리체내 약물 전달 장치를 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 유리체강 내로 주사하는 것이다. 소정의 실시형태에서, 유리체내 약물 전달 장치는 마이크로주사기다.

또 다른 양태에서, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 이를 필요로하는 대상체의 눈의 유리체강에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 유리체내 약물 전달 장치를 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 유리체강 내로 주사하는 것이다. 소정의 실시형태에서, 유리체내 약물 전달 장치는 마이크로주사기다.

일 양태에서, rAAV를 치료를 필요로 하는 인간 대상체의 눈의 망막하 공간으로 투여하는 것을 포함하는, CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하기 위한 유리체절제술을 수반하는 망막하 투여 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 인간 환자의 눈에 유리체절제술을 수행하는 것을 포함하고, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 유리체절제술은 부분 유리체절제술이다.

일 양태에서, rAAV를 치료를 필요로 하는 인간 대상체의 눈 뒤쪽에 위치한 시신경 원반, 중심와 및 황반 주위의 망막하 공간에 투여하는 것을 포함하는, CLN2 바텐병의 안구 징후를 치료 및/또는 예방하기 위한 망막하 투여 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 인간 환자의 눈에 유리체절제술을 수행하는 것을 포함하지 않으며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 주사 단계는 유리체내 주사에 의한다. 소정의 실시형태에서, 유리체내 투여 방법은 눈 전체에 걸쳐 치료 생성물의 균일한 발현을 초래한다 (예를 들어, 주사 부위에서의 발현 수준은 눈의 다른 영역에서의 발현 수준과 비교하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 미만으로 다양함). 소정의 실시형태에서, 유리체내 주사는 날카로운 바늘을 눈의 상측 또는 하측을 통해 공막 내로 삽입하고, 날카로운 바늘을 유리체를 통해 끝까지 통과시켜 반대측의 망막하 공간에 재조합 바이러스 벡터를 주사하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 바늘은 2시 또는 10시 위치에 삽입된다. 소정의 실시형태에서, 유리체내 주사는 공막 내로 투관침을 삽입하고, 투관침을 통해 그리고 유리체를 통해 캐뉼러를 삽입하여 재조합 바이러스 벡터를 반대측의 망막하 공간에 주사하는 것을 포함한다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 투여 단계는 rAAV의 치료적 유효량를 상기 인간 대상체의 막막에 전달한다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, rAAV 게놈 (예를 들어, TPP1)에 의해 인코딩된 단백질의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 인간 망막 세포에 의해 생산된다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, rAAV 게놈 (예를 들어, TPP1)에 의해 인코딩된 단백질의 치료적 유효량은 상기 인간 대상체의 바깥 경계 막에서 인간 광수용체 세포, 수평 세포, 양극성 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포, 및/또는 망막 색소 상피 세포에 의해 생산된다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 인간 광수용체 세포는 원추 세포 및/또는 간상 세포이다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 망막 신경절 세포는 소형 세포, 파라솔 세포, 이중층 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및/또는 뮐러 신경교이다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 rAAV 벡터 (예를 들어, rAAV8, rAAV2, rAAV9, 또는 rAAV5 벡터)이다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 rAAV9 벡터이다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 눈으로의 전달은 눈의 망막, 맥락막 및/또는 유리체액으로의 전달을 포함한다. 눈의 병리를 갖는 인간 대상체에게 재조합 벡터 (즉, 재조합 바이러스 벡터 또는 DNA 발현 작제물)의 치료적 유효량을 투여하는 방법이 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 벡터는 작제물 I이며, 여기서 작제물 I는 다음의 구성성분: AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 (a) AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 TPP1을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' ITR는 AAV2로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 제한 없이 시력 상실, 망막 위축 및 망막 변성을 포함하는 바텐병의 안구 징후의 치료를 위한 것이다.

특히, 다음 접근법들 중 하나를 통해 재조합 벡터 (즉, 재조합 바이러스 벡터 또는 DNA 발현 작제물)의 치료적 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 방법이 기술되어 있다: (1) 유리체절제술이 없이 망막하 투여 (예를 들어, 맥락막상 공간을 통한 또는 말초 주사를 통한 망막하 공간으로의 투여), (2) 맥락막상 투여, (3) 공막의 외부 공간으로의 투여 (즉, 공막옆 투여); (4) 유리체절제술을 동반한 망막하 투여; (5) 유리체내 투여, 및 (6) 결막하 투여.

소정의 실시형태에서, 망막하 또는 맥락막상 공간으로의 전달은 국제 공개 번호 WO 2016/042162, WO 2017/046358, WO 2017/158365, 및 WO 2017/158366에 기술되고 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하여 수행될 수 있으며, 그 각각은 그 전체내용이 참조로 포함된다.

4.3.1 표적 환자 집단

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 바텐병과 관련된 안구 징후를 갖는 환자에게 투여하기 위한 것이다. 바텐병과 관련된 안구 징후는 진행성 시력 상실, 망막 위축 및/또는 망막 변성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 인간 대상체는 ≤20/20 및 ≥20/400인 BCVA를 갖는다. 또 다른 특정 실시형태에서, 인간 대상체는 ≤20/63 및 ≥20/400인 BCVA를 갖는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 이중대립유전자 CLN2 돌연변이를 갖는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 감소된 백혈구 TPP1 활성을 갖는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 CLN2 질환 (예를 들어, 발달 지연, 발달 쇠퇴, 발작, 시력 상실, 또는 다른 징후 증상)과 일치하는 임상 징후 또는 증상을 갖고/갖거나 대상체는 CLN2 진단이 확인된 형제자매가 있다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 뇌실내 Brineura 효소 대체 요법을 받았거나 받고 있는 중이다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 한쪽 또는 양쪽 눈에서 약 210　μm 이하의 CRT를 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체는 한쪽 또는 양쪽 눈에서 약 140　μm 이상의 CRT를 갖는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 형재자매의 CLN2 질환의 가족력으로 인해 무증상환자에서 CLN2 질환이 진단된 경우, 영향을 받는 형제자매의 시력 상실의 발병이 생후 84개월 전후에 발생한다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 한쪽 또는 양쪽 눈에서 약 140　μm 이하의 CRT 및 5 이상의 웰 코넬 안과 중증도 점수 (Weill Cornell Ophthalmic Severity Score)를 갖는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 상당한 수정체 또는 각막 혼탁, 녹내장, 약시 및/또는 육안적 망막 해부학적 이상을 갖지 않는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 오른쪽 및 왼쪽 눈 사이의 스크리닝 CRT 측정에서 10　μm 이상의 차이를 갖지 않는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 이전에 등급 3 또는 4의 과민 반응, 예를 들어, 정맥내 치료를 필요로 하는 기관지 경련 및 저혈압, 심장 기능 장애, 뇌실내 Brineura 주입에 대한 아나필락시스를 갖지 않는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 다음 범위의 굴절 이상 (근시 ≥ -2.00, 원시 ≥ +4.00, 난시 ≥ +1.50) 또는 상당한 부동시를 갖지 않는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 이전에 임의의 종류의 안내 주사, 예를 들어, 오프-라벨 유리체내 Brineura를 받지 않았다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 예를 들어, 작제물 I 치료를 시작하기 전 6개월 이내에 안구 수술을 받지 않았다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 이전에 골수 이식을 받지 않았다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 작제물 I 치료를 시작하기 전 30일 이내에 다음의 약물을 사용하지 않았다: 젬피브로질, 미코페놀레이트, 프레드니손 또는 NCL (천식 징후는 포함하지 않음) 치료의 의도된 목적을 위한 다른 스테로이드, 플루피르틴.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 전식 면역억제에 대한 금기사항이 없다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 또 다른 CLN 유전자에 돌연변이를 갖지 않는다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체는 안내 수술 (예를 들어, 중증 응고병증)에 대한 금기사항이 없다.

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 여성이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 남성이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 아동이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1세, 1.5세, 2세, 2.5세, 3세, 3.5세, 4세, 4.5세, 또는 5세 연령이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1.5개월 미만, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1세, 1.5세, 2세, 2.5세, 3세, 3.5세, 4세, 4.5세, 또는 5세 미만 연령이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1 내지 2개월, 2 내지 3개월, 3 내지 4개월, 4 내지 5개월, 5 내지 6개월, 6 내지 7개월, 7 내지 8개월, 8 내지 9개월, 9 내지 10개월, 10 내지 11개월, 11개월 내지 1세, 1 내지 1.5세, 1.5 내지 2세, 2 내지 2.5세, 2.5 내지 3세, 3 내지 3.5세, 3.5 내지 4세, 4 내지 4.5세, 또는 4.5 내지 5세 연령이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 6개월 내지 5세 연령이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 18세 연령 초과의 인간 성인이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 18세 연령 미만의 인간 아동이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 생후 84개월 미만의 인간 아동이다.

4.3.2 투여량 및 투여 방식

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효량은 투여 방법에 의존하여 50 내지 100 μl 또는 100 내지 500 μl, 바람직하게는 100 내지 300 μl, 그리고 가장 바람직하게는, 250 μl의 범위인 부피로 (1) 유리체절제술 없이 망막하 공간 (예를 들어, 맥락막상 공간을 통해 또는 말초 주사를 통해), (2) 맥락막상 공간, (3) 공막의 외부 공간 (즉, 공막옆 투여), (4) 유리체절제술을 통해 망막하 공간, 또는 (5) 유리체강으로 투여된다. 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효량은 100 μl 이하의 부피, 예를 들어, 50 내지 100 μl의 부피로 맥락막상으로 투여된다. 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효량은 500 μl 이하의 부피, 예를 들어, 10 내지 20 μl, 20 내지 50 μl, 50 내지 100 μl, 100 내지 200 μl, 200 내지 300 μl, 300 내지 400 μl, 또는 400 내지 500 μl의 부피로 (예를 들어, 후방 공막옆 저장 절차에 의해) 공막의 외부 표면에 투여된다. 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효량은 50-100 μl 또는 100-500 μl, 바람직하게는 100-300 μl, 그리고 가장 바람직하게는, 200 μl의 부피로 말초 주사를 통해 망막하 공간으로 투여된다.

특정 실시형태에서, 재조합 벡터의 치료적 유효량은 200 μL의 부피로 망막하로 투여된다.

소정의 실시형태에서, 눈 투여를 위해 본 명세서에 기술된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 마이크로 부피 주사기 전달 시스템이 본 명세서에 기술되어 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906에 기술된 바와 같이, 높은 힘 전달과 개선된 정밀성을 제공하는 가스-동력 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 수압 드라이브와, 가스-동력 모듈과, 유체 전달을 차례로 제어하기 위한 낮은-힘 활성화 레버를 포함할 수 있다.

소정의 실시형태에서, 마이크로 부피 주사기에 사용될 수 있는 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 용량 안내가 있는 마이크로 부피 주사기이고, 예를 들어, 맥락막상 바늘 (예를 들어, Clearside® 바늘), 망막하 바늘, 유리체내 바늘, 공막옆 바늘, 결막하 바늘, 및/또는 망막내 바늘과 함께 사용될 수 있다. 마이크로 부피 주사기 사용의 이점은 (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀한 주입 유량 제어 및 용량 안내로 인함), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 조작; (c) 10 μL 증분 투여량으로 공압 드라이브; (d) 유리체절제술 기계와 분리됨; (e) 400 μL 실린지 용량; (f) 디지털 방식으로 안내된 전달; (g) 디지털 방식으로 기록된 전달; 및 (h) 불가지론적 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘은 망막하 전달에 사용될 수 있는 반면, Clearside® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터는 망막하 전달에 사용될 수 있음)을 포함한다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터는 맥락막상으로 (예를 들어, 맥락막상 주사에 의해) 투여된다. 특정 실시형태에서, 맥락막상 투여 (예를 들어, 맥락막상 공간 안으로의 주사)는 맥락막상 약물 전달 장치를 사용하여 수행된다. 맥락막상 약물 전달 장치는 눈의 맥락막상 공간에 약물의 투여를 수반하는 맥락막상 투여 절차에 종종 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23; Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87; Baldassarre et al., 2017]을 참조하며; 그 각각은 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함됨). 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 맥락막상 공간에 재조합 벡터를 침착시키기 위해 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Clearside® Biomedical, Inc.에 의해 제조된 맥락막상 약물 전달 장치 및 MedOne 맥락막상 카테터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23] 참조). 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 눈 투여를 위해 본 명세서에 기술된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 마이크로 부피 주사기 전달 시스템을 포함한다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906에 기술된 바와 같이, 높은 힘 전달과 개선된 정밀성을 제공하는 가스-동력 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 수압 드라이브와, 가스-동력 모듈과, 유체 전달을 차례로 제어하기 위한 낮은-힘 활성화 레버를 포함할 수 있다. 현재 맥락막상 공간 (SCS) 전달에 이용 가능한 기법이 존재한다. 전임상적으로, SC 주사는 공막 플랩 기술, 카테터 및 표준 피하 주사 바늘뿐만 아니라 미세바늘을 사용하여 달성되었다. 속이 빈 750 um-길이의 미세바늘 (Clearside Biomedical, Inc.)을 파스 (pars)에 삽입할 수 있으며, 임상 시험에서 가능성을 보여주었다. 힘-감지 기술로 설계된 미세바늘은 Chitnis 등이 기술한 바와 같이 SC 주사에 활용될 수 있다. (문헌 [Chitnis, G.D., et al. A resistance-sensing mechanical injector for the precise delivery of liquids to target tissue. Nat Biomed Eng 3, 621-631 (2019)]. https://doi.org/10.1038/s41551-019-0350-2). Oxular Limited는 맥락막상 공간에서 조명 캐뉼러를 전진시키는 전달 시스템 (Oxulumis)을 개발하고 있다. 궤도 장치 (자이로스코프)는 유연한 캐뉼러로 맥락막상 공간의 캐뉼레이션을 가능하게 하는 특수-설계된 시스템이다. 캐뉼러 내부의 미세바늘은 망막하 공간으로 전진하여 표적 용량 전달을 가능하게 한다. SCS에 대한 Ab interno 액세스는 또한 최소-침습적 녹내장 수술 (MIGS) 장치 역할을 하는 마이크로-스텐트를 사용하여 달성될 수 있다. 예는 CyPass® Micro-Stent (Alcon, Fort Worth, Texas, US) 및 iStent® (Glaukos)을 포함하는데, 이는 여과 수포를 형성하지 않고 안방수를 배출하기 위해 전방에서 SCS로 도관을 제공하도록 외과적으로 이식된다. 맥락막상 전달을 위해 고려되는 다른 장치는 영국 특허 공개 번호 GB 2531910A 및 미국 특허 번호 10,912,883 B2에 기술된 것을 포함한다.

마이크로 부피 주사기는 용량 안내가 있는 마이크로 부피 주사기이고, 예를 들어, 맥락막상 바늘 (예를 들어, Clearside® 바늘) 또는 망막하 바늘과 함께 사용될 수 있다. 마이크로 부피 주사기 사용의 이점은 (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀한 주입 유량 제어 및 용량 안내로 인함), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 조작; (c) 10 μL 증분 투여량으로 공압 드라이브; (d) 유리체절제술 기계와 분리됨; (e) 400 μL 실린지 용량; (f) 디지털 방식으로 안내된 전달; (g) 디지털 방식으로 기록된 전달; 및 (h) 불가지론적 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘은 망막하 전달에 사용될 수 있는 반면, Clearside® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터는 맥락막상 전달에 사용될 수 있음)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 맥락막상 약물 전달 장치는 Visionisti OY에 의해 제조된 어댑터 (및 바람직하게는 바늘 가이드)가 있는 정상 길이의 피하 바늘을 포함하는 도구이며, 이 어댑터는 어댑터로부터 노출되는 바늘 팁의 길이를 조절함으로써 맥락막상 바늘로 정상 길이의 피하 바늘을 전환한다 (예를 들어, 미국 디자인 특허 번호 D878,575; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2016/083669 참조). 특정 실시형태에서, 맥락막상 약물 전달 장치는 1 밀리미터 30 게이지 바늘이 있는 실린지이다. 이 장치를 사용하여 주사하는 동안, 바늘이 공막의 기저부를 관통하고 약물을 함유한 액체가 맥락막상 공간으로 들어가 맥락막상 공간의 확장을 초래한다. 결과적으로, 주사하는 동안 촉각 및 시각적 피드백이 있다. 주사에 이어서 유체는 후방으로 흐르고 맥락막과 망막에서 주로 흡수된다. 그 결과 모든 망막 세포층과 맥락막 세포로부터 치료 생성물이 생산된다.　이 유형의 장치 및 절차를 사용하면 합병증의 위험이 낮은 사무실-내 절차를 빠르고 쉽게 수행할 수 있다. 맥락막상 공간 안으로 최대 100 μl의 부피를 주사할 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터는 유리체절제술을 통해 망막하로 투여된다. 유리체절제술을 통한 망막하 투여는 숙련된 망막 외과의가 수행하는 외과적 절차로 이는 국소 마취하에 대상체의 유리체절제술 및 망막 안으로 유전자 요법의 망막하 주사를 수반한다 (예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Campochiaro et al., 2017, Hum Gen Ther 28(1):99-111] 참조).

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 재조합 벡터는 유리체절제술 없이 망막하로 투여된다.

본 명세서에 기술된 방법의 소정의 실시형태에서, 유리체절제술이 없는 망막하 투여는 망막하 약물 전달 장치의 사용에 의해 맥락막상 공간을 통해 수행된다. 특정 실시형태에서, 망막하 약물 전달 장치는 망막하 공간으로 약물을 전달하기 위해 외과적 절차 동안 눈의 뒤쪽 주위로 맥락막상 공간을 통해 삽입되고 터널링되는 카테터이다. 이 절차는 유리체가 손상되지 않은 상태로 유지되게 하고 따라서 합병증 위험이 더 적고 (유전자 치료 이탈 위험 및, 망막 박리와 황반 구멍과 같은 합병증의 위험이 적음), 유리체절제술 없이 생성된 수포가 더 널리 퍼질 수 있어 더 작은 부피로 변환되는 망막의 더 많은 표면적을 허용할 수 있다. 이 절차에 따른 백내장 유발 위험이 최소화되어 이는 젊은 환자에게 바람직하다. 더욱이, 이 절차는 표준 유리체내 접근법보다 더 안전하게 중심와 아래 수포를 전달할 수 있으며, 이는 형질도입을 위한 표적 세포가 황반에 있는 중심 시력에 영향을 미치는 유전성 망막 질환이 있는 환자에게 바람직하다. 이 절차는 또한 다른 전달 경로 (예컨대 맥락막상 및 유리체내)에 영향을 미칠 수 있는 전신 순환에 존재하는 AAV에 대한 중화 항체 (Nab)가 있는 환자에게 유리하다. 추가적으로, 이 방법은 표준 유리체내 접근법보다 망막절개 부위 밖으로 덜 나가는 수포를 생성하는 것으로 나타났다. 원래는 Janssen Pharmaceuticals, Inc.에 의하였고 현재는 Orbit Biomedical Inc.에 의해 제조된 망막하 약물 전달 장치가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 맥락막상 공간을 통한 세포의 망막하 전달: Janssen Trial. In: Schwartz et al. (eds) Cellular Therapies for Retinal 질환, Springer, Cham; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040635 A1 참조).

또 다른 특정 실시형태에서, 유리체절제술이 없는 망막하 투여는 망막 안으로의 말초 주사를 통해 수행된다 (즉, 눈의 뒤쪽에 위치한 시신경 원반, 중심와 및 황반 주위). 이는 유리체내 주사로 달성될 수 있다.

일 실시형태에서, 바늘이 반대쪽의 망막에 주사하기 위해 유리체를 통해 완전히 통과하도록 날카로운 바늘이 눈의 위쪽 또는 아래쪽 (예를 들어, 2시 또는 10시 위치)을 통해 공막 안으로 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 투관침은 망막하 캐뉼러가 눈 안으로 삽입될 수 있도록 공막 안으로 삽입된다. 캐뉼러는 투관침을 통해 그리고 유리체를 통해 원하는 주사 부위에 삽입된다. 어느 하나의 실시형태에서, 재조합 벡터는 망막하 공간에 주사되어 눈의 반대쪽 내부 표면에 재조합 벡터를 함유하는 수포를 형성한다. 성공적인 주사는 돔 형상의 망막 박리/망막 수포의 출현으로 확인된다.

자체-조명 렌즈는 유리체내 투여를 위한 광원으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Chalam et al., 2004, Ophthalmic Surgery and Lasers 35: 76-77] 참조). 대안적으로, 원하는 경우 광 (또는 주입)을 위해 하나 이상의 투관침(들)을 배치할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 광섬유 샹들리에가 망막하 주사를 시각화하기 위해 투관침을 통해 이용될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 망막하 또는 맥락막상 공간으로의 전달은 국제 공개 번호 WO 2016/042162, WO 2017/046358, WO 2017/158365, 및 WO 2017/158366에 기술되고 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하여 수행될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체내용이 참조로 포함된다.

재조합 벡터를 투여하기 위해 1회, 2회 또는 그 이상의 말초 주사가 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 재조합 벡터를 함유하는 1개, 2개 또는 그 이상의 수포가 시신경 원반, 중심와 및 황반 주변의 망막하 공간에서 만들어질 수 있다. 놀랍게도, 재조합 벡터의 투여는 말초 주사된 수포에 한정되지만, 이 접근법을 사용할 때 망막 전반에 걸쳐서 치료 생성물의 발현이 검출될 수 있다.

특정 실시형태에서, 유리체내 투여는 눈 투여를 위해 본 명세서에 기술된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 마이크로 부피 주사기 전달 시스템을 포함하는 유리체내 약물 전달 장치로 수행된다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215), 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906에 기술된 바와 같이 높은 힘 전달과 개선된 정밀성을 제공하는 가드-동력 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 수압 드라이브와, 가스-동력 모듈과, 유체 전달을 차례로 제어하기 위한 낮은-힘 활성화 레버를 포함할 수 있다. 마이크로 부피 주사기는 용량 안내가 있는 마이크로 부피 주사기이고, 예를 들어, 유리체내 바늘과 함께 사용될 수 있다. 마이크로 부피 주사기 사용의 이점은 (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀한 주입 유량 제어 및 용량 안내로 인함), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 조작; (c) 10 μL 증분 투여량으로 공압 드라이브; (d) 유리체절제술 기계와 분리됨; (e) 400 μL 실린지 용량; (f) 디지털 방식으로 안내된 전달; (g) 디지털 방식으로 기록된 전달; 및 (h) 불가지론적 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘은 망막하 전달에 사용될 수 있는 반면, Clearside® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터는 망막하 전달에 사용될 수 있음)을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 말초 주사는 눈 전체에 걸쳐 치료 생성물의 균일한 발현을 초래한다(예를 들어, 주사 부위에서 발현 수준은 눈의 다른 영역에서의 발현 수준과 비교하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 미만으로 다양함). 눈 전체에 걸쳐 치료 생성물의 발현은 이러한 목적을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 눈 또는 망막의 전체 마운트 면역형광 염색에 의해, 또는 동결된 안구 절편에 대한 면역형광 염색에 의해 측정될 수 있다.

유리체내 주사가 망막하 공간 대신 유리체에서 재조합 벡터의 상실을 초래하는 경우에, 유리체 안으로 주사된 재조합 벡터를 제거하기 위해 임의의 유리체절제술을 수행할 수 있다. 그런 다음 유리체절제술을 통한 망막하 주사를 수행하여 250 μl의 재조합 벡터를 망막하 공간 안으로 전달할 수 있다. 대안적으로, 주사된 재조합 벡터의 일부가 유리체 안으로 침착되고 유리체로부터 재조합 벡터를 제거하기 위해 유리체절제술이 수행되지 않는 경우, 고정된 (예를 들어, 공유 결합된) 항-AAV 항체 (예를 들어, 항 AAV9 항체)와 정렬된 카테터를 유리체 안으로 삽입하여 유리체로부터 과잉 재조합 벡터를 포획하고 제거할 수 있다.

특정 실시형태에서, 망막하 투여는 눈 투여를 위해 본 명세서에 기술된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 마이크로 부피 주사기 전달 시스템을 포함하는 망막하 약물 전달 장치로 수행된다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906에 기술된 바와 같이 높은 힘 전달과 개선된 정밀성을 제공하는 가드-동력 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 수압 드라이브와, 가스-동력 모듈과, 유체 전달을 차례로 제어하기 위한 낮은-힘 활성화 레버를 포함할 수 있다. 마이크로 부피 주사기는 용량 안내가 있는 마이크로 부피 주사기이고, 예를 들어, 망막하 바늘과 함께 사용될 수 있다. 마이크로 부피 주사기 사용의 이점은 (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀한 주입 유량 제어 및 용량 안내로 인함), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 조작; (c) 10 μL 증분 투여량으로 공압 드라이브; (d) 유리체절제술 기계와 분리됨; (e) 400 μL 실린지 용량; (f) 디지털 방식으로 안내된 전달; (g) 디지털 방식으로 기록된 전달; 및 (h) 불가지론적 팁 (예를 들어, MedOne 38g 바늘 및 Dorc 41g 바늘은 망막하 전달에 사용될 수 있는 반면, Clearside® 바늘 및 Visionisti OY 어댑터는 맥락막상 전달에 사용될 수 있음)을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 재조합 벡터는 공막의 외부 표면에 투여된다 (예를 들어, 캐뉼러의 팁이 공막 표면에 직접 인접하여 삽입되고 유지될 수 있는, 캐뉼러를 포함하는 공막옆 약물 전달 장치의 사용에 의함). 특정 실시형태에서, 공막의 외부 표면으로의 투여는 후방 공막옆 저장 절차를 사용하여 수행되며, 이는 뭉툭한 팁의 구부러진 캐뉼러 안으로 약물을 끌어들인 다음 안구에 구멍을 뚫지 않고 공막의 외부 표면과 직접 접촉하여 전달하는 것을 수반한다. 특히, 노출된 공막에 대한 작은 절개의 생성에 이어서, 캐뉼러 팁이 삽입된다. 캐뉼러 샤프트의 구부러진 부분이 삽입되어 캐뉼러 팁이 공막 표면에 직접 부착되도록 유지한다. 캐뉼러의 완전한 삽입 후, 멸균 면봉으로 캐뉼러 샤프트의 상단과 측면을 따라 부드러운 압력을 유지하면서 약물을 천천히 주사한다. 이 전달 방법은 일반적으로 치료제를 눈 안으로 직접적으로 주사하는 것과 관련된 부작용인 안내 감염 및 망막 박리의 위험을 피한다.

특정 실시형태에서, 공막옆 투여는 눈 투여를 위해 본 명세서에 기술된 임의의 투여 경로에 사용될 수 있는 Altaviz에 의해 제조된 마이크로 부피 주사기 전달 시스템을 포함하는 공막옆 약물 전달 장치로 수행된다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/177215, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906 참조). 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0175825 및 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0167906에 기술된 바와 같이 높은 힘 전달과 개선된 정밀성을 제공하는 가스-동력 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로 부피 주사기 전달 시스템은 일관된 용량 비율을 제공하기 위한 수압 드라이브와, 가스-동력 모듈과, 유체 전달을 차례로 제어하기 위한 낮은-힘 활성화 레버를 포함할 수 있다. 마이크로 부피 주사기는 용량 안내가 있는 마이크로 부피 주사기이고, 예를 들어, 공막옆 바늘과 함께 사용될 수 있다. 마이크로 부피 주사기 사용의 이점은 (a) 보다 제어된 전달 (예를 들어, 정밀한 주입 유량 제어 및 용량 안내로 인함), (b) 단일 외과의사, 한 손, 한 손가락 조작; (c) 10 μL 증분 투여량으로 공압 드라이브; (d) 유리체절제술 기계와 분리됨; (e) 400 μL 실린지 용량; (f) 디지털 방식으로 안내된 전달; (g) 디지털 방식으로 기록된 전달; 및 (h) 불가지론적 팁을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 체온보다 차가운 용액을 투여한 후 안구 표면의 열적 프로필의 변화를 검출하여, 예를 들어, SCS 내에서의 용액의 확산을 시각화하고 투여가 성공적으로 완료되었는지 여부를 잠재적으로 결정할 수 있는 안구 표면의 열적 프로필의 변화를 검출할 수 있다. 이는 소정의 실시형태에서 투여되는 재조합 벡터를 함유하는 제형이 투여 전에 초기에 동결되고 실온 (68-72 ℉)이 되고, 단기간 (예를 들어, 적어도 30분) 동안 해동되기 때문이고, 따라서 제형은 주사 시 인간 눈 (약 92 ℉) 보다 차갑다 (그리고 때로는 실온보다 더 차가움). 약품은 전형적으로 해동 후 4시간 이내에 사용되며, 용액의 가장 따뜻한 온도는 실온이다. 바람직한 실시형태에서, 절차는 적외선 비디오로 비디오화된다.

적외선 열화상 카메라는 온도의 작은 변화를 검출할 수 있다. 이들은 렌즈를 통해 적외선 에너지를 포착하고 에너지를 전자 신호로 변환한다. 적외선은 에너지를 열화상으로 변환하는 적외선 센서 어레이에 집중된다. 적외선 열화상 카메라는 본 명세서에 기술된 임의의 투여 경로, 예를 들어, 맥락막상 투여, 망막하 투여, 결막하 투여, 유리체내 투여, 또는 맥락막상 공간 안으로 느린 주입 카테터를 사용하는 투여를 포함하는 눈으로의 임의의 투여 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T530 적외선 열화상 카메라이다. FLIR T530 적외선 열화상 카메라는 ±3.6 ℉의 정확도로 미세한 온도 차이를 포착할 수 있다. 카메라는 76,800 픽셀의 적외선 해상도를 갖는다. 카메라는 또한 더 작은 시야를 포착하는 24° 렌즈를 이용한다. 높은 적외선 해상도와 조합된 더 작은 시야는 작업자가 이미징하는 것에 대한 보다 상세한 열적 프로필에 기여한다. 그러나, 다른 적외선 해상도 및/또는 다른 정도의 렌즈를 사용하여 약간의 온도 변화를 포착하는 다른 능력과 정확도를 가진 다른 적외선 카메라를 사용할 수 있다.

특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T420 적외선 열화상 카메라이다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIR T440 적외선 열화상 카메라이다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라는 Fluke Ti400 적외선 열화상 카메라이다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라는 FLIRE60 적외선 열화상 카메라이다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라의 적외선 해상도는 75,000 픽셀 이상이다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라의 열적 민감도는 30℃에서 0.05℃이거나 그보다 적다. 특정 실시형태에서, 적외선 열화상 카메라의 시야 (FOV)는 25°×25°이거나 그보다 낮다.

소정의 실시형태에서, 철 필터를 적외선 열화상 카메라와 함께 사용하여 안구 표면의 열적 프로필의 변화를 검출한다. 바람직한 실시형태에서, 철 필터의 사용은 의사-색상 이미지를 생성할 수 있으며, 여기서 가장 따뜻하거나 높은 온도 부분은 흰색으로 착색되고 중간 온도는 빨간색과 노란색으로, 가장 차갑거나 낮은 온도 부분은 검은색으로 착색된다. 소정의 실시형태에서, 다른 유형의 필터가 또한 열적 프로필의 의사-색상 이미지를 생성하는 데 사용될 수 있다.

각 투여 방법에 대한 열적 프로필은 상이할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 성공적인 맥락막상 주사는 (a) 어두운 색상의 느리고 넓은 방사상 확산, (b) 시작 시 매우 어두운 색상, 및 (c) 더 밝은 색상으로 주사액의 점진적 변화, 즉, 더 밝은 색상으로 표시되는 온도 구배를 특징으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 성공적이지 못한 맥락막상 주사는 (a) 어두운 색상의 확산 없음, 및 (b) 어떠한 분포도 없이 주사 부위에 국한된 색상의 미미한 변화를 특징으로 할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 작은 국소적 온도 강하는 안구 조직 (고온)과 접촉하는 캐뉼러 (저온)로 인해 발생한다. 일 실시형태에서, 성공적인 유리체내 주사는 (a) 어두운 색상의 확산 없음, (b) 주사 부위에 국소화된 매우 어두운 색상으로의 초기 변화, 및 (c) 어두운 색상으로 눈 전체의 점진적이고 균일한 변화를 특징으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 외안 유출은 (a) 눈의 외부 표면의 외부에서 빠르게 흐르는 스트림, (b) 시작 시 매우 어두운 색상, 및 (c) 밝은 색상으로의 빠른 변화를 특징으로 할 수 있다.

치료 생성물이 연속적으로 생산되기 때문에 (구성적 프로모터의 제어 하에 또는 저산소증-유도성 프로모터를 사용하는 경우 저산소 조건에 의해 유도됨), 더 낮은 농도의 유지가 효과적일 수 있다. 유리체액 농도는 유리체액 또는 앞방에서 수집한 유체의 환자 샘플에서 직접 측정하거나 치료 생성물의 환자의 혈청 농도를 측정하여 추정 및/또는 모니터링할 수 있다 - 치료 생성물에 대한 전신 노출 대 유리체 노출의 비는 약 1:90,000이다. (예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Xu L, et al., 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624]의 p. 1621 및 p. 1623에서의 표 5에서 보고된 라니비주맙의 유리체액 및 혈청 농도 참조).

소정의 실시형태에서, 투여량은 ml 당 게놈 카피 또는 화자의 눈에 투여된 (예를 들어, 맥락막상, 망막하, 유리체내, 공막옆, 결막하, 및/또는 망막내로 투여된) 게놈 카피의 수에 의해 측정된다. 소정의 실시형태에서, ml 당 1 x 10⁹ 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹⁵ 게놈 카피가 투여된다. 특정 실시형태에서, ml 당 1 x 10⁹ 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 1 x 10¹⁰ 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹¹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹⁰ 내지 5 x 10¹¹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 1 x 10¹¹ 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹² 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 1 x 10¹² 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹³ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 1 x 10¹³ 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹⁴ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 1 x 10¹⁴ 게놈 카피 내지 ml 당 1 x 10¹⁵ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10⁹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10¹¹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10¹² 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10¹³ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10¹⁴ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ml 당 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피가 투여된다. 소정의 실시형태에서, 1 x 10⁹ 내지 1 x 10¹⁵ 게놈 카피가 투여된다. 특정 실시형태에서, 1 x 10⁹ 내지 1 x 10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹⁰ 내지 1 x 10¹¹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹⁰ 내지 5 x 10¹¹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹¹ 내지 1 x 10¹² 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹² 내지 1 x 10¹³ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹³ 내지 1 x 10¹⁴ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹³ 내지 1 x 10¹⁴ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 1 x 10¹⁴ 내지 1 x 10¹⁵ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10⁹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10¹¹ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10¹² 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10¹³ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10¹⁴ 게놈 카피가 투여된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피가 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 3.0 × 10¹³ 게놈 카피가 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 최대 3.0 × 10¹³ 게놈 카피가 투여된다.

소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2.0 × 10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 6.0 × 10¹⁰ 게놈 카피가 투여된다.

소정의 실시형태에서, 눈당 약 1.0 x 10¹⁰ 내지 2.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2.0 x 10¹⁰ 내지 3.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 3.0 x 10¹⁰ 내지 4.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 4.0 x 10¹⁰ 내지 5.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 5.0 x 10¹⁰ 내지 6.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 6.0 x 10¹⁰ 내지 7.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 7.0 x 10¹⁰ 내지 8.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 8.0 x 10¹⁰ 내지 9.0 x 10¹⁰게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 9.0 x 10¹⁰ 내지 1.0 x 10¹¹게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다 사. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 1.0 x 10¹¹ 내지 2.0 x 10¹¹게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다.

소정의 특정 실시형태에서, 눈 당 약 2.0 x 10¹⁰ 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 소정의 특정 실시형태에서, 눈 당 약 6.0 x 10¹⁰ 게놈 카피가 망막하 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 망막하의 주사 부피는 200 μL이다.

소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2 × 10¹⁰ 내지 3 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 3 × 10¹⁰ 내지 4 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 4 × 10¹⁰ 내지 5 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 5 × 10¹⁰ 내지 6 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 6 × 10¹⁰ 내지 7 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 7 × 10¹⁰ 내지 8 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 8 × 10¹⁰ 내지 9 × 10¹⁰게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 9 × 10¹⁰ 내지 1 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 1 × 10¹¹ 내지 2 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2 × 10¹¹ 내지 3 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 3 × 10¹¹ 내지 4 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 4 × 10¹¹ 내지 5 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 5 × 10¹¹ 내지 6 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 6 × 10¹¹ 내지 7 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 7 × 10¹¹ 내지 8 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 8 × 10¹¹ 내지 9 × 10¹¹게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 9 × 10¹¹ 내지 1 × 10¹²게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다.

소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2 × 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 3 × 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 4 × 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 5 x 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 6 x 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 7 x 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 8 x 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 9 x 10¹⁰ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 1 x 10¹¹ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 1.5 x 10¹¹ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2 x 10¹¹ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 2.5 x 10¹¹ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 눈 당 약 3 x 10¹¹ 게놈 카피가 맥락막상 주사에 의해 투여된다.

소정의 실시형태에서, 단일 맥락막상 주사가 투여된다. 소정의 실시형태에서, 이중 맥락막상 주사가 투여된다. 소정의 실시형태에서, 맥락막상 주사의 주사 부피는 100 μl이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 약"은 주어진 값 또는 범위의 ± 10% 이내를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "약"은 언급된 정확한 숫자를 포함한다.

4.3.3 효능의 샘플링 및 모니터링

소정의 실시형태에서, 인간 대상체가 CNS 및 눈 둘 모두에서 질환 징후를 갖는 경우 (예를 들어, 인간 대상체가 바텐병을 갖는 경우), 본 명세서에 제공된 방법은 본 명세서에 기술된 재조합 벡터 (즉, 재조합 바이러스 벡터 또는 DNA 발현 작제물)를 중추신경계 (CNS) 전달 경로 및 안구 전달 경로 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 안구 전달 경로) 둘 모두를 통해 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 안구 전달 경로는 다음 중 하나로부터 선택된다: (1) 유리체절제술 없이 망막하 투여 (예를 들어, 맥락막상 공간을 통해 또는 말초 주사를 통해 망막하 공간으로 투여), (2) 맥락막상 투여, (3) 투여 공막의 외부 공간 (즉, 공막옆 투여); (4) 유리체절제술을 동반한 망막하 투여; (5) 유리체내 투여, 및 (6) 유리체내 투여. 소정의 실시형태에서, CNS 전달 경로는 다음 중 하나로부터 선택된다: 뇌실내 (ICV) 전달, 수조내 (IC) 전달, 또는 척추강내 (IT-L) 전달.

시각 결함에 대한 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 BCVA (최상-교정 시력), 안압, 세극등 생체현미경, 및/또는 간접 검안경에 의해 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 시각 결함에 대한 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 본 명세서에 기술된 방법에 의해 치료되는 인간 환자의 눈이 치료 후 (예를 들어, 치료 후 46 내지 50주 또는 98 내지 102주) 43글자 초과의 BCVA를 달성하는지 여부에 의해 측정될 수 있다. 43글자의 BCVA는 20/160 대략적 스넬렌 등가물 (Snellen equivalent)에 해당한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 치료되는 인간 환자의 눈은 치료 후 (예를 들어, 치료 후 46 내지 50주 또는 98 내지 102주) 43글자 초과의 BCVA를 달성한다.

특정 실시형태에서, 시각 결함에 대한 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 본 명세서에 기술된 방법에 의해 치료되는 인간 환자의 눈이 치료 후 (예를 들어, 치료 후 46 내지 50주 또는 98 내지 102주) 84글자 초과의 BCVA를 달성하는지 여부에 의해 측정될 수 있다. 84글자의 BCVA는 20/20 대략적 스넬렌 등가물에 해당한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 치료되는 인간 환자의 눈은 치료-후 (예를 들어, 치료 후 46 내지 50주 또는 98 내지 102주) 84글자 초과의 BCVA를 달성한다.

눈/망막에 물리적 변화에 대한 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 SD-OCT (SD-광간섭 단층촬영)에 의해 측정될 수 있다.

효능은 망막전위도 (ERG)에 의해 측정된 바와 같이 모니터링될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 시력 상실, 감염, 염증 및 망막 박리를 포함한 기타 안전 사건의 징후를 측정함에 의해 모니터링될 수 있다.

망막 두께는 본 명세서에 제공된 방법의 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 망막의 두께는 임상 판독으로서 사용될 수 있으며, 여기서 망막 두께의 감소가 크거나 망막이 두꺼워지기 전의 기간이 길수록 치료가 더 효과적이다. 망막 기능은 예를 들어, ERG에 의해 결정될 수 있다. ERG는 눈의 광 민감성 세포 (간상체 및 원추체)와 이들의 연결 신경절 세포, 특히 플래시 자극에 대한 그 반응을 시험하는, 인간에 사용하도록 FDA의 승인된 망막 기능의 비-침습적 전기생리학적 검사이다. 망막 두께는 예를 들어, SD-OCT에 의해 결정될 수 있다. SD-OCT는 관심 있는 물체에서 반사되는 후방 산란광의 에코 시간 지연과 크기를 결정하기 위해 저-간섭 간섭계를 사용하는 3차원 이미징 기술이다. OCT는 3 내지 15 μm 축 해상도로 조직 샘플 (예를 들어, 망막)의 층을 스캔하는 데 사용될 수 있고, SD-OCT는 이전 형태의 기술보다 축 해상도와 스캔 속도를 향상시킨다 (문헌 [Schuman, 2008, Trans. Am. Opthamol. Soc. 106:426-458]).

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 Rasch-스코어링 버전인, 국립 안과 연구소 시각 기능 설문지 (NEI-VFQ-28-R) (복합 점수; 활동 제한 영역 점수; 및 사회-정서적 기능 영역 점수)에서의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 국립 안과 연구소 시각 기능 설문지 25-항목 버전 (NEI-VFQ-25) (복합 점수 및 정신 건강 하위척도 점수)에서의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 황반 질환 치료 만족도 설문지 (MacTSQ) (복합 점수; 안전성, 효능 및 불편 영역 점수; 및 정보 제공과 편의 영역 점수)에서의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법의 효능은 약 4주, 12주, 6개월, 12개월, 24개월, 36개월 또는 기타 원하는 시점에서의 시력의 개선에 의해 반영된다. 특정 실시형태에서, 시력의 개선은 BCVA의 증가, 예를 들어, 1글자, 2글자, 3글자, 4글자, 5글자, 6글자, 7글자, 8글자, 9글자, 10글자, 11글자 또는 12글자 또는 그 이상에 의한 증가를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 시력의 개선은 기준선으로부터 시력에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상의 증가를 특징으로 한다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법의 효능은 약 4주, 12주, 6개월, 12개월, 24개월, 36개월, 또는 기타 원하는 시점에서 중심 망막 두께 (CRT) 또는 외부 핵층 두께 (OLN)의 감소, 예를 들어, 기준선으로부터 중심 망막 두께의 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상 감소에 의해 반영된다.

특정 실시형태에서, 치료 후 눈에 염증이 없거나 치료 후 눈에 염증이 거의 없다 (예를 들어, 염증의 수준에서 기준선으로부터 10%, 5%, 2%, 1% 이하로 증가).

시각 결함에 대한 본 명세서에 제공된 방법의 효과는 시운동성 안진검사(OKN)에 의해 측정될 수 있다.

이론에 얽매이지 않고, 이 시력 스크리닝은 OKN 비자발적 반사의 원리를 사용하여 환자의 눈이 움직이는 표적을 따를 수 있는지 여부를 객관적으로 평가한다. OKN을 사용하면 시험자와 환자 사이에 구두 의사 소통이 필요하지 않는다. 따라서, OKN은 언어-전 및/또는 비-언어 환자의 시력을 측정하는 데 사용할 수 있다. 소정의 실시형태에서, OKN은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1세, 1.5세, 2세, 2.5세, 3세, 3.5세, 4세, 4.5세, 또는 5세 연령인 환자의 시력을 측정하는 데 사용된다. 소정의 실시형태에서, iPad는 환자가 iPad 상에서 움직임을 보고 있을 때 OKN 반사의 검출을 통해 시력을 측정하는 데 사용된다.

이론에 얽매이지 않고, 이 시력 스크리닝은 OKN 비자발적 반사의 원리를 사용하여 환자의 눈이 움직이는 표적을 따를 수 있는지 여부를 객관적으로 평가한다. OKN을 사용하면 시험자와 환자 사이에 구두 의사 소통이 필요하지 않는다. 따라서, OKN은 언어-전 및/또는 비-언어 환자의 시력을 측정하는 데 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, OKN은 1.5개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1세, 1.5세, 2세, 2.5세, 3세, 3.5세, 4세, 4.5세, 또는 5세 연령 미만인 환자의 시력을 측정하는 데 사용된다. 또 다른 특정 실시형태에서, OKN은 1 내지 2개월, 2 내지 3개월, 3 내지 4개월, 4 내지 5개월, 5 내지 6개월, 6 내지 7개월, 7 내지 8개월, 8 내지 9개월, 9 내지 10개월, 10 내지 11개월, 11개월 내지 1세, 1 내지 1.5세, 1.5 내지 2세, 2 내지 2.5세, 2.5 내지 3세, 3 내지 3.5세, 3.5 내지 4세, 4 내지 4.5세, 또는 4.5 내지 5세 연령인 환자의 시력을 측정하는 데 사용된다. 또 다른 특정 실시형태에서, OKN은 6개월 내지 5세 연령인 환자의 시력을 측정하는 데 사용된다. 소정의 실시형태에서, iPad는 환자가 iPad 상에서 움직임을 보고 있을 때 OKN 반사의 검출을 통해 시력을 측정하는 데 사용된다.

소정의 실시형태에서, 환자가 트리펩티딜-펩티다제 1(TPP1)을 인코딩하는 AAV, 바람직하게는 AAV9로 치료되기 전에 OKN을 측정함으로써 베튼- CLN2-관련 시력 상실을 나타내는 환자에서 시력이 평가된다. 구체적으로, 베튼-CLN2-관련 시력 상실을 나타내는 환자는 상기 기술된 연령 및/또는 연령 범위 내에 있다. 소정의 실시형태에서, 환자가 트리펩티딜-펩티다제 1을 인코딩하는 AAV, 바람직하게는 AAV9로 치료되기 전에 OKN을 측정함으로써 베튼-CLN2-관련 시력 상실을 나타내는 최대 5세 연령의 환자에서 시력이 평가된다. 소정의 실시형태에서, OKN에 기반한 시력 평가는 AAV 유전자 요법으로 치료 후 시력이 감소하지 않는 것으로 결정한다. 소정의 실시형태에서, OKN에 기반한 시력 평가는 AAV 유전자 요법으로 치료 후 환자의 시력이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%까지 개선되는 것으로 결정한다. 소정의 실시형태에서, OKN에 기반한 시력 평가는 AAV 유전자 요법으로 치료 후 환자에서 시력이 더 악화되지 않는 것으로 결정한다.

소정의 실시형태에서, 환자가 TPP1을 인코딩하는 AAV, 바람직하게는 AAV9로 치료되기 전에 OKN을 측정함으로써 베튼-CLN2-관련 시력 상실을 나타내는 환자에서 시력이 평가된다. 구체적으로, 베튼-CLN2-관련 시력 상실을 나타내는 환자는 상기 기술된 연령, 및/또는 연령 범위 내에 있다. 소정의 실시형태에서, 환자가 트리펩티딜-펩티다제 1을 인코딩하는 AAV, 바람직하게는 AAV9로 치료되기 전에 OKN을 측정함으로써 베튼-CLN2-관련 시력 상실을 나타내는 최대 5세 연령의 환자에서 시력이 평가된다. 소정의 실시형태에서, OKN에 기반한 시력 평가는 AAV 유전자 요법으로 치료 후 시력이 감소하지 않는 것으로 결정한다. 소정의 실시형태에서, OKN에 기반한 시력 평가는 AAV 유전자 요법으로 치료 후 환자의 시력이 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 100%까지 개선되는 것으로 결정한다. 소정의 실시형태에서, OKN에 기반한 시력 평가는 AAV 유전자 요법으로 치료 후 환자에서 시력이 더 악화되지 않는 것으로 결정한다.

인간 환자가 아동인 경우, 시각 기능은 시운동성 안진검사 (OKN)-기반 접근법 또는 변형된 OKN-기반 접근법을 사용하여 평가될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 시간 경과에 따른 동공측정법에 의해 측정된 바와 같이 동공 광 반사의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 기준선으로부터의 동공 광 반사 변화에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 시간 경과에 따른 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 황반 두께 및/또는 부피의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 기준선으로부터의 황반 두께 및/또는 부피의 변화에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 망막 변성의 가속화된 쇠퇴 단계 (예를 들어, 210 μm CRT에 도달)까지의 시간 변화, 예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 망막 변성의 가속화된 쇠퇴 단계까지의 시간 변화, 또는 CRT에서 30 μm 상실 또는 약 110 μm 미만의 CRT 상실까지의 시간 변화, 예를 들어, 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 CRT에서 30 μm 상실 또는 약 110 μm 미만의 CRT 상실까지의 시간 변화에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 시간 경과에 따른 SD-OCT 해부학적 마커, 예를 들어, 중심와 주위 타원체 구역, ELM, RNFL, 전체 망막 두께, 내부 핵층, 외부 핵층 (ONL), 광수용체 (PR) + 망막 세포 상피 망막 세포 상피 (RPE), 외부 분절 + RPE (OS+RPE), 및/또는 타원체 구역 (EZ)에서의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 SD-OCT 해부학적 마커, 예를 들어, 중심와 주위 타원체 구역, ELM, RNFL 전체 망막 두께, 내부 핵층, 외부 핵층 (ONL), 광수용체 (PR) + 망막 세포 상피 (RPE), 외부 분절 + RPE (OS+RPE), 및/또는 타원체 구역 (EZ)에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 시간 경과에 따른 변형된 WCBS에 의해 측정된 바와 같이 시간 경과에 따른 안저 사진의 안저 모양의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 변형된 WCBS에 의해 측정된 바와 같이 시간 경과에 따른 안저 사진의 안저 모양에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 시간 경과에 따른 PedEyeQ를 사용하여 평가된 시간 경과에 따른 간병인-보고 시각적 결과에서의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 변형된 WCBS에 측정된 바와 같이 시간 경과에 따른 PedEyeQ를 사용하여 평가된 시간 경과에 따른 간병인-보고 시각적 결과에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 시간 경과에 따른 VABs III 및 MSEL-시각적 수용을 사용하여 평가된 시간 경과에 따른 인지 능력에 기초한 적응 행동에서의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 시간 경과에 따른 VABs III 및 MSEL-시각적 수용을 사용하여 평가된 시간 경과에 따른 인지 능력에 기초한 적응 행동에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법의 효과는 또한 시간 경과에 따른 치료된 눈 및 대조군 눈을 사용한 함부르크 척도 운동 기능 점수에서의 변화, 예를 들어, 기준선으로부터 약 1 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 8 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 14, 12 내지 16, 16 내지 18, 18 내지 20, 20 내지 22, 22 내지 24개월 또는 약 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월에서 변형된 WCBS에 의해 측정된 바와 같이 시간 경과에 따른 치료된 눈 및 대조군 눈을 사용한 함부르크 척도 운동 기능 점수에서 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정될 수 있다.

또 다른 양태에서, 벡터 쉐딩은 예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 눈물, 혈청 또는 소변과 같은 생물학적 유체에서 벡터 DNA를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터의 투여 후 임의의 시점에서 생물학적 유체 (예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 어떠한 벡터 유전자 카피도 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 1000개 미만, 500개 미만, 100개 미만, 50개 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL이 임의의 투여 시점에서 생물학적 유체 (예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능하다. 특정 실시형태에서, 210개의 벡터 유전자 카피/5 μL 또는 그 이하가 혈청에서 검출 가능하다. 일부 실시형태에서, 투여 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주 또는 14주까지 1000개 미만, 500개 미만, 100개 미만, 50개 미만 또는 10개 미만의 벡터 유전자 카피/5 μL가 생물학적 유체 (예를 들어, 눈물, 혈청 또는 소변)에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출 가능하다. 특정 실시형태에서, 벡터 유전자 카피가 벡터의 투여 후 14주까지 혈청에서 검출 가능하다.

또 다른 양태에서, 이식유전자 (예를 들어, 작제물 I에 의해 인코딩된 이식유전자, 또는 TPP1)의 발현 수준은 작제물 I가 투여된 대상체의 CSF 및/또는 혈청에서 이식유전자 생성물을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 이식유전자 생성물 (예를 들어, TPP1)의 발현 수준은 또한 작제물 I가 투여된 대상체의 눈 (예를 들어, 안방수 및/또는 유리체액)에서 모니터링될 수 있다. 이식유전자 발현은 제한 없이 웨스턴 블롯팅, Meso Scale Discovery (MSD) 플랫폼을 사용하여 구현된 전기화학발광 (ECL) 면역검정, 및 ELISA을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적합한 검정에 의해 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 눈에서 TPP1의 발현 수준은 눈의 상이한 영역 사이에서 다를 수 있으며, 예를 들어, 높은 수준의 벡터 DNA가 수포 영역 (측두엽, 주사로 인함)의 망막과 맥락막/RPE 뿐만 아니라 상위, 하위 및 비강 사분면에서 검출될 수 있는 반면, 낮은 수준의 벡터 DNA는 시신경, 시신경교차 및 후두엽에서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 rAAV (예를 들어, 작제물 I)는 시각 경로를 따라 제한된 전방 지향성을 입증한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 rAAV (예를 들어, 작제물 I)를 대상체에게 투여하면 rAAV를 대상체에게 투여한지 약 3개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 12개월, 약 15개월, 약 18개월, 약 21개월, 또는 약 24개월 이내에 대상체의 눈의 유리체액 및/또는 안방수에서 검출 가능한 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 검출 가능한) TPP1 발현 수준이 발생하며, 여기서 유리체액 및/또는 안방수에서의 TPP1 발현 수준은 rAAV의 투여 전에 검출할 수 없었다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 rAAV (예를 들어, 작제물 I)를 대상체에게 투여하면 rAAV를 대상체에게 투여한지 약 3개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 12개월, 약 15개월, 약 18개월, 약 21개월, 또는 약 24개월 이내에 대상체의 눈의 유리체액 및/또는 안방수에서 검출 가능한 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 검출 가능한) TPP1 발현 수준이 발생하여, 여기서 유리체액 및/또는 안방수에서의 TPP1 발현 수준은 rAAV의 투여 전에 검출할 수 없었고, 대상체의 혈청에서의 TPP1 발현 수준은 검출 불가능 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 검출 불가능)하게 남아있다. 일부 실시형태에서, TPP1은 면역형광 검정을 사용하거나 검출 가능하거나 검출 불가능하다. 일부 실시형태에서, TPP1은 면역염색 검정을 사용하여 검출 가능하거나 검출 불가능하다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 rAAV (예를 들어, 작제물 I)를 대상체에게 투여하면, rAAV의 투여 전의 TPP1 발현 수준과 비교하여 rAAV를 대상체에게 투여한지 약 3개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 12개월, 약 15개월, 약 18개월, 약 21개월, 또는 약 24개월 이내에 대상체의 눈의 유리체액 및/또는 안방수에서 TPP1 발현 수준의 증가 (예를 들어, 약 100배 내지 약 500배, 약 500배 내지 약 1000배, 약 1000배 내지 약 1500배, 약 1500배 내지 약 2000배, 약 2000배 내지 약 2500배, 약 2500배 내지 약 3000배, 약 3000배 내지 약 4000배, 약 4000배 내지 약 5000배, 약 5000배 내지 약 10,000배, 약 10,000배 내지 약 15,000배, 약 15,000배 내지 약 20,000배, 또는 약 20,000배 이상의 증가)가 발생한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 rAAV (예를 들어, 작제물 I)를 대상체에게 투여하면 rAAV의 투여 전 TPP1 발현 수준과 비교하여 rAAV를 대상체에게 투여한지 약 3개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 12개월, 약 15개월, 약 18개월, 약 21개월, 또는 약 24개월 이내에 대상체의 눈의 유리체액 및/또는 안방수에서 TPP1 발현 수준의 증가 (예를 들어, 약 100배 내지 약 500배, 약 500배 내지 약 1000배, 약 1000배 내지 약 1500배, 약 1500배 내지 약 2000배, 약 2000배 내지 약 2500배, 약 2500배 내지 약 3000배, 약 3000배 내지 약 4000배, 약 4000배 내지 약 5000배, 약 5000배 내지 약 10,000배, 약 10,000배 내지 약 15,000배, 약 15,000배 내지 약 20,000배, 또는 약 20,000배 이상의 증가)가 발생하며, 여기서 대상체의 혈청에서의 TPP1 발현 수준은 투여 전 TPP1 발현 수준과 비교하여 거의 일정하게 유지된다 (예를 들어, 약 10% 이내로 유지됨). 일부 실시형태에서, TPP1은 면역형광 검정을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, TPP1은 면역염색 검정을 사용하여 검출 가능하거나 검출 불가능하다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 rAAV (예를 들어, 작제물 I)를 대상체에게 투여하면 대상체의 망막에서 TPP1 발현, 예를 들어, 망막 색소 상피 및/또는 광수용체 외부 분절, 또는 이의 비율에서의 발현, 또는 망막의 전체 깊이에 걸친 발현이 발생한다. 일부 실시형태에서, TPP1 발현은 뉴런에 한정될 수 있다.

이식유전자 생성물 수준은 치료된 눈의 전방으로부터의 유리체액 및/또는 안방수의 환자 샘플에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 유리체액 농도는 이식유전자 생성물의 환자의 혈청 농도를 측정하여 추정 및/또는 모니터링될 수 있다 - 이식유전자 생성물에 대한 전신 노출 대 유리체 노출의 비율은 약 1:90,000이다. (예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Xu L, et al., 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624]의 p. 1621 및 p. 1623의 표 5에서 보고된 라니비주맙의 유리체액 및 혈청 농도 참조).

작제물 I에 대한 면역원성이 평가될 수 있고, 항-이식유전자 생성물 항체 (방수, 혈청, 및 CSF), 항-AAV9 항체 (혈청, CSF), 및 AAV9에 대한 대한 T-세포 반응성 및 효소-연결 면역스폿 (ELISPOT; 전혈)을 통한 작제물 I 이식유전자 생성물로서 평가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 소아 환자에게 CLN2 CRS-MX를 투여함으로써 질환 진행을 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 성인 환자에게 CLN2 CRS-MX를 투여함으로써 질환 진행을 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필요로 하는 대상체에서 CLN2 바텐병과 관련된 안구 징후를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 rAAV는 AAV9이고, 상기 벡터 게놈은

AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR);

프로모터;

인간 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1) 단백질을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및

AAV 3' ITR을 포함하고,

상기 방법은 벡터의 투여 동안 및/또는 후에 상기 환자의 CLN2 CRS-MX 등급의 변화 또는 그의 결핍을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이들의 CLN2 CRS-MX 등급에서 +1점, +2점, +3점, +4점, +5점, 또는 +6점의 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 1년 이상, 또는 2년 이상의 기간에 걸쳐 대상체의 CLN2 CRS-MX 등급의 느린 감소 및/또는 유지에 의해 결정되는, 대상체에서 CLN2 바텐병과 관련된 안구 징후의 진행을 늦추거나 정지시킨다.

일부 실시형태에서, 소아 환자에게 CLN2 CRS-LX를 투여함으로써 질환 진행을 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필요로 하는 대상체에서 CLN2 바텐병과 관련된 안구 징후를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 rAAV는 AAV9이고, 상기 벡터 게놈은

AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR);

프로모터;

AAV 3' ITR을 포함하고,

상기 방법은 벡터의 투여 동안 및/또는 후에 상기 환자의 CLN2 CRS-LX 등급의 변화 또는 그의 결핍을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이들의 CLN2 CRS-LX 등급에서 +1점, +2점, +3점, +4점, +5점, 또는 +6점의 기준선으로부터의 변화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 1년 이상, 또는 2년 이상의 기간에 걸쳐 대상체의 CLN2 CRS-LX 등급의 느린 감소 및/또는 유지에 의해 결정되는, 대상체에서 CLN2 바텐병과 관련된 안구 징후의 진행을 늦추거나 정지시킨다.

4.4 본 명세서에 기술된 치료 방법에 사용되는 치료 시스템, 장치 또는 장비

본 명세서에 기술된 치료 방법에 사용되는 치료 시스템, 장치 및 장비가 또한 본 명세서에 제공되며, 이는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 병, 튜브, 광원, 마이크로주사기 및 발 페달. 소정의 실시형태에서, 광원은 자체-조명 콘택트 렌즈이며, 이는 눈의 뒤쪽에 벡터를 침착시키고, 특히 시신경 원반, 중심와 및/또는 황반을 손상시키는 것을 피하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Chalam et al., 2004, Ophthalmic surgery and lasers. 35. 76-77] 참조). 소정의 실시형태에서, 자체-조명 콘택트 렌즈는 망막하 주사를 시각화하기 위해 말초 주사 동안 이용된다 (예를 들어, 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Chalam et al., 2004, Ophthalmic surgery and lasers. 35. 76-77] 참조). 소정의 실시형태에서, 망막하 주사를 시각화하기 위해 광섬유 샹들리에가 제2 투관침을 통해 이용된다.

4.5 병용 요법

본 명세서에 제공된 방법은 하나 이상의 추가 요법과 조합될 수 있다.

추가 요법은 유전자 요법 치료 전, 동시 또는 이후에 시행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 요법은 재조합 TPP1 (예를 들어, Brineura® 셀리포나아제 알파)을 사용한 효소 대체 요법 (ERT)이다.

5. 서열

6. 실시예

본 섹션 (즉, 섹션 6)의 예는 제한이 아닌 설명을 위해 제공된다.

6.1 실시예 1: 인간 대상체를 치료하고 작제물 I로 치료 효능을 평가하기 위한 프로토콜

본 실시예는 작제물 I 치료의 효능을 평가할 수 있도록 인간 대상체를 치료하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다. 작제물 I는 약 또는 적어도 약 2×10¹⁰ GC/눈 또는 약 또는 적어도 약 6×10¹⁰ GC/눈의 용량으로 투여될 수 있다. 작제물 I는 약 1×10¹¹ GC/mL 내지 약 3.0×10¹¹ GC/mL의 농도로 200 μL의 부피로 망막하 투여될 수 있다.

6.1.1 환자 집단

본 실시예에 기술된 방법에 따라 치료받은 환자는 이중대립유전자 CLN2 돌연변이를 보유하고 백혈구 TPP1 활성이 감소하였다. 환자는 또한 CLN2 질환과 일치하는 임상적 징후 또는 증상 (예를 들어, 발달 지연, 발달 쇠퇴, 발작, 시력 상실, 또는 기타 징후 증상)을 나타내거나 CLN2 진단이 확인된 형재자매가 있다.

환자는 뇌실내 Brineura 효소 대체 요법을 받고 있다. 환자는 추가로 양쪽 눈의 기준선에서 ≤ 210　μm인 CRT 및 기준선에서 ≥ 140　μm인 CRT를 가지며, 최대 생후 84개월이다. 대안적으로, 환자는 증상이 없을 수 있으며, 양쪽 눈의 기준선에서 >210　μm인 CRT를 가지며, 생후 12개월에서 48개월 사이이다. 형제자매의 CLN2 질환의 가족력으로 인해 무증상 환자에서 CLN2 질환이 진단된 경우, 영향을 받는 형제자매의 시력 상실의 발병은 생후 84개월 이하에서 발생해야 한다. 환자는 또한 양쪽 눈의 기준선에서 <140　μm인 CRT를 가질 수 있으며, <5의 웰 코넬 안과 중증도 점수를 가질 수 있다 (연령 제한 없음).

환자는 OKN-기반 VA 테스트로 측정 가능한 시력 (VA)을 갖는다.

환자는 작제물 I 치료와 동시에 프레드니솔론 (7일 동안 (즉,　-3일부터 4일까지) 1　mg/kg/일, 40　mg/일의 최대 용량)을 투여받을 수 있다. 7일 후 (수술 전 3일, 수술 당일, 수술 후 3일), 환자는 추가 10일 동안 (즉, 5일부터 14일까지) 0.5　mg/kg/일의 감소된 용량과 20　mg/일의 최대 용량을 투여받을 수 있다.

환자는 CLN2 바텐병의 치료를 위해 2주마다 뇌실내 Brineura 효소 대체 요법을 받을 수 있다.

6.1.2 효능 종점

효능에 대한 1차 종점은 360일차에 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같은 CRT의 기준선으로부터의 변화이다. 다른 효능 종점은 다음을 포함한다:

혈청 및 소변에서 PCR에 의해 검출된 AAV9,

360일차 (또는 그 이상)에 OKN에 의해 측정된 바와 같은 VA의 기준선으로부터의 변화,

360일차 (또는 그 이상)에 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같은 중앙 1mm에서 ONL 두께의 기준선으로부터의 변화,

360일차에 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같은 시간 경과에 따른 망막층의 측정치 및 외관의 기준선으로부터의 변화,

360일차에 시간 경과에 따라 동공측정법에 의해 측정된 바와 같은 동공 광 반사의 기준선으로부터의 변화,

360일차에 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같은 황반 두께/부피의 기준선으로부터의 변화,

210　μm CRT에 도달하는 것으로 정의되는 망막 변성의 가속 감소 단계까지의 시간, CRT≤210　μm에서 30　μm 상실까지의 시간,

360일차에 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같은 CRT의 기준선으로부터의 변화,

SD-OCT 해부학적 마커, 예를 들어, 중심와 주위 타원체 구역, ELM, RNFL의 기준선으로부터의 변화,

변형된 WCBS에 의해 측정된 바와 같은 시간 경과에 따른 안저 사진의 안저 모양의 기준선으로부터의 변화,

360일차에 FAF의 기준선으로부터의 변화, CRT≤110　μm로 정의되는 말기 질환까지의 시간,

PedEyeQ를 사용하여 평가된 바와 같은 시간 경과에 따른 간병인이 보고한 시각적 결과의 기준선으로부터의 변화,

VABs III 및 MSEL-시각적 수용을 사용하여 평가된 바와 같은 시간 경과에 따른 인지 능력에 기반한 적응 행동의 기준선으로부터의 변화,

처리군 눈과 대조군 눈을 사용하여 함부르크 척도 운동 기능 점수의 기준선으로부터의 변화,

처리군 눈과 대조군 눈을 사용하여 변형된 함부르크 척도 운동 기능 점수의 기준선으로부터의 변화.

6.1.3 약력학 종점

방수, 혈청 및 CSF에서 TPP1의 수준이 또한 평가된다. AAV9 농도는 CSF에서 측정된다. AAV9에 대한 항체는 혈청 및 CSF에서 측정될 수 있고, 작제물 I (TPP1)의 이식유전자 생성물에 대한 항체는 혈청, CSF 및 안방수에서 측정될 수 있다. AAV9 및 작제물 I TP에 대한 T 세포 반응성은 전혈과 함께 ELISPOT를 사용하여 PBMC에서 테스트된다.

6.1.4 효능 평가

작제물 I를 사용한 치료의 효능을 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, Heidelberg Spectralis 모듈 이미징 시스템을 사용하여 스펙터럼 영역-광간섭 단층촬영 (SD-OCT) (양측 황반 및 시신경 원반)을 사용하여 망막 이미징을 시행할 수 있다.

처리군 눈 및 대조군 눈의 축 길이는 A-스캔 초음파촬영을 사용하여 수행할 수 있다. 시운동성 안진검사 테스트 (OKN 테스트)를 사용한 시력 검사를 시행할 수 있다.

플렉스 모듈 (Flex Module)이 있는 Heidelberg Spectralis OCT 기기를 사용하여 연구 눈의 안저 자가형광을 수행할 수 있다.

플렉스 모듈 (Flex Module)이 있는 Heidelberg Spectralis OCT 기기를 사용하여 연구 눈의 다색 안저 이미징을 수행할 수 있다.

동공측정법을 사용한 동공 광 반사를 시행할 수 있다.

PedEyeQ는 최대 17세 연령의 아동에 대한 아동의 눈-관련 삶의 질 및 기능적 시각에 대한 아동의 눈 상태의 영향을 평가하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Hatt et al, 2019, Am J Ophthalmol. 200:201-17]). PedEyeQ는 아동, 대리인 및 부모를 위한 여러가지 버전이 있으며, 0 내지 4세 및 5 내지 11세 연령 그룹에 맞게 조정될 수 있다. 각 연령대별 대리 질문은 3개의 공통 영역 (기능적 시각, 눈/시력 장애, 사회화)과 5세 이상 연령의 환자만을 대상으로 하는 2개의 영역 (좌절/걱정, 눈 관리)으로 구성되어 있다. 각 영역은 5 내지 10개의 항목으로 구성된다. 간병인은 각각 2, 1 또는 0의 점수에 해당하는 "전혀 없음", "가끔 있음" 또는 "항상 있음"의 각 항목에 대한 응답을 선택할 수 있다. 각 영역은 해당 영역에 대해 완료된 항복의 평균 Rasch 보정 값으로 독립적으로 점수를 매길 수 있다. 영역 점수는 0에서 100까지의 척도로 변환될 수 있다. 여기서 0은 최악으로 간주되고, 100은 삶의 질 또는 기능적 시각의 최상의 척도로 간주된다.

바이랜드 적응 행동 척도 (VABS)-III (문헌 [Sparrow et al, 2016, Vineland Adaptive Behavior Scales. 3rd ed. Bloomington, MN: Pearson])은 유아기부터 90세 연령까지 개인의 신경 인지에 기반한 적응 행동을 평가하는 데 사용될 수 있다. 의사소통, 일상 생활 기술, 사회화, 및 운동 기술의 4가지 영역은 <7세 연령의 아동에게 적합하므로 평가될 수 있다. 각 영역의 항목은 개인이 각 적응 기술/행동을 나타내는 빈도를 기준으로 2에서 0까지 점수가 매겨지며, 2는 거의 항상 있음에 해당하고 0은 전혀 없음에 해당한다. 개별 항목을 합산한 다음 평균 100, 및 표준 편차 15의 표준 연령 일치 종형 곡선과 비교할 복합 점수로 계산된다. 아동의 점수가 도달한 백분위수에 따라 전반적인 적응 행동 능력은 낮음, 적당히 낮음, 적절함, 적당히 높음 또는 높음으로 기록될 수 있다.

멀렌 조기 학습 척도 (MSEL)는 인지 발달의 척도로서 일반적으로 사용되는 표준화된 평가이다 (Mullen, 1995, Scales of Early Learning (AGS ed.). Circle Pines, MN: American Guidance Service Inc.). MSEL은 (a) 대근육 운동, (b) 소근육 운동, (c) 시각적 수용 (또는 비-언어 문제 해결), (d) 수용 언어, 및 (e) 표현 언어 기술을 측정하는 5개의 하위 척도로 구성된다. 각 하위척도를 표준화하여 표준 점수, 백분위수, 및 연령에 상응하는 점수를 계산할 수 있다.

MSEL은 시각 처리 및 문제 해결 (즉, MSEL-시각적 수용)에 대한 치료의 잠재적 효과를 측정하기 위한 임상 결과 평가로서 본 연구에서 사용하도록 조정되었다. 표준 시각적 수용 하위척도에 추가하여, 시각적 수용 영역의 변형된 버전 (처음 7개 항목)을 평가할 수 있다. 예를 들어 삼각형에 고정 및 추적, 움직이는 과녁을 180도 추적, 떨어뜨린 숟가락 찾기 등이 있다.

CLN2 임상 평가 척도 (CRS)는 시간 경과에 따라 개인의 운동 기능, 언어, 발작 및 시력의 변화를 평가하기 위해 CLN2 질병에 특화되어 개발되었다. 원래의 12점 함부르크 척도 (문헌 [Steinfeld et al, 2002, Am J Med Genet. 112(4):347-54])는 환자를 후향적으로 뿐만 아니라 전향적으로 평가하기 위해 개발되었다. 이것은 가장 큰 종적 자연사 데이터 수집에 사용되었다 (문헌 [Nickel et al, 2018, Lancet Child Adolesc Health. 2(8):582-590. doi: 10.1016/S2352-4642(18)30179-2. Epub 2018 Jul 2]). 2018년에 척도의 운동 및 언어 영역에 대한 업데이트가 공개되어 (문헌 [Wyrwich et al, 2018, J Inborn Errors Metab Screen. 6:1-7]), 운동 및 언어 점수에 대한 척도 문구가 임상 시험에서 전향적 데이터 수집에 사용하기 위하여 더 자세한 정의를 제공한다. 운동 및 언어 영역은 조합된 0- 내지 6-점 점수를 형성한다. 각 영역의 최고 점수는 정상 또는 최대 능력에 해당하는 3점이며, 0점은 해당 영역에 남은 능력이 없음을 나타낸다. 이러한 척도는 이전에 Brineura의 임상 효능을 평가하는 데 사용되는 6-점 운동-언어 척도와 같이 임상 연구에서 사용되었다 (문헌 [Schulz et al, 2018, N Engl J Med. 378(20):1898-1907]). 운동 기능 척도는 원래 함부르크 척도 및 2018 수정 버전을 모두 사용하여 평가될 수 있다. 환자는 OD (오른쪽 눈) 점수 및 OS (왼쪽 눈) 점수가 기록되도록 각 눈이 가려진 상태에서 한 번씩 각 테스트를 두 번 수행할 수 있다. 2개의 척도에 대해 총 4개의 점수를 기록할 수 있다.

6.1.5 안정성 평가

작제물 I의 투여의 안정성은 예를 들어, 안과 검사, 신체 검사 바이탈 징후 평가 또는 임상 안정성 실험실 평가 (예를 들어, 혈청 화학, 혈액학적 측정 및 소변검사 포함)에 의해 평가될 수 있다.

6.1.6 벡터 쉐딩

벡터 이식유전자는 쉐딩 (표적 세포를 감염시키지 않고 배설물 또는 체액을 통해 신체에서 제거된 벡터의 방출), 동원 (표적 세포 밖으로 이식유전자 복제 및 전달), 또는 생식선 전염 (정액을 통해 자손에게 유전적으로 전염)으로부터 의도하지 않은 수용자에게 퍼질 가능성이 있다. 벡터 쉐딩은 예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 눈물, 혈청 또는 소변과 같은 생물학적 유체에서 벡터 DNA를 측정함으로써 결정될 수 있다.

혈액 (혈청), 소변, 및 눈물의 샘플링은 AAV9 벡터 농도의 측정을 위해 작제물 I 환자에 대해 수행될 수 있다.

이러한 생물학적 유체에서 수집된 쉐딩 데이터는 표적 환자 집단에서 작제물 I의 쉐딩 프로필을 제공할 수 있고, 미처리된 개인에 대한 전파 가능성을 추정하는 데 사용될 수 있다. 쉐딩은 정량적 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 측정될 수 있다.

6.2 실시예 2: 시노몰구스 원숭이에게 작제물 I의 망막하 주사는 눈에서 초생리학적 수준의 TPP1을 유도한다

후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증 (CLN2) 질환에서, CLN2 유전자의 돌연변이는 결핍된 TPP1 효소 활성을 초래하여, 중추 신경계 및 망막 내에서 심각한 신경퇴행을 초래한다. 현재 CLN2 질환의 안구 징후를 치료하기 위해 승인된 요법이 없으며, 시력 상실은 중요한 미충족 수요를 나타낸다. 본 연구의 목적은 망막하 주사에 의해 작제물 I를 투여하고 CLN2 질환의 안구 징후를 예방하기 위해 충분한 수준의 TPP1 효소를 생산하는 것이었다. CLN2 질환의 뮤린 모델이 명백한 망막 병리를 나타내지 않기 때문에, 작제물 I의 약력학, 생체분포, 면역원성 및 독성을 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 시노몰구스 원숭이 그룹 (4-5/그룹)에 망막하 주사 (100 μL)에 의해 >1×10¹⁰ GC/눈의 용량으로 작제물 I를 투여하고, 혈청, 안방수 및 유리체액에서 이식유전자 발현 (TPP1 농도)을 관찰하였으며, 최대 13주 동안 생체분포를 평가하였다. TPP1 농도의 증가는 안방수 및 유리체액에서 관찰되었지만 혈청에서는 관찰되지 않았다. 이식유전자 발현은 3개월 동안 지속되었지만, 혈청 항-TPP1 항체의 발달로 일부 눈에서 TPP1 농도가 부분적으로 감소하였다. 눈에서 높은 수준의 벡터 DNA가 망막과 맥락막/RPE에서 수포 영역 (측두엽)과 비-수포 영역 (상위, 하위, 비강 사분면) 둘 모두에서 관찰되었다. 벡터 DNA는 또한 시신경, 시신경교차 및 후두엽에서 낮은 수준으로 존재하지만, 다른 뇌 영역에는 존재하지 않아 전방 지형성임을 암시한다. 면역염색은 TPP1 단백질이 광수용체 내에서 주로 망막의 광범위한 영역에 존재하지만 다른 세포층에서는 덜 존재한다는 것을 보여주었다. 1×10¹⁰ GC/눈에서, TPP1 농도는 미처리된 동물보다 150-(방수) 및 200배 (유리체) 더 컸다. 이는 작제물 I의 망막하 주사가 CLN2 환자에서 보이는 망막 변성을 약화시키기에 충분한 수준의 TPP1을 제공할 수 있음을 입증한다.

6.3 실시예 3: 시노몰구스 원숭이에게 작제물 I의 망막하 주사는 눈에서 초생리학적 수준의 TPP1을 유도한다

본 연구의 목적은 인간 CLN2 (hCLN2) 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9의 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV9)인 작제물 I의 망막하 주사 후 시노몰구스 원숭이의 망막에서 인간 TPP1의 수준을 평가하는 것이었다.

6.3.1 방법

어린 시노몰구스 원숭이 그룹(n=5/그룹; ~2-3세)은 0 (비히클) 또는 >1×10¹⁰ GC/눈의 용량으로 양쪽 눈 안에 작제물 I의 단일 망막하 주사 (100 μL)를 투여하였다. 투여 후 4 (2/그룹)주차 또는 13 (3/그룹)주차에 동물을 안락사시켰다. 본 연구에서 안방수, 유리체액 (말단 샘플) 및 혈청 내 TPP1 농도, 혈청 내 면역원성 (항-AAV9 중화 항체 [NAbs] 및 항-TPP1 항체), 생체분포 (벡터 DNA) 및 TPP1 면역 염색의 평가가 포함되었다.

Meso Scale Discovery (MSD) 플랫폼을 사용하여 구현된 전기화학발광 (ECL) 면역검정에 의해 TPP1 농도를 결정하였다.

6.3.2 결과

작제물 I-치료된 동물 일부는 작제물 I의 투여 후 약력학 또는 생체분포에 주목할 만한 효과가 없는 투여 전에 Nab에 대해 양성이었다.

건강한 시노몰구스 원숭이의 눈 안에 작제물 I의 망막하 주사는 연구 과정에 걸쳐 안방수에서 TPP1 농도의 증가뿐만 아니라 3개월 후 유리체액 (말단 샘플 단독)에서 TPP1의 농도의 증가를 유도하였다 (도 4a 및 4b). 이는 혈청에 반영되지 않았으며, 연구 전반에 걸쳐 대조군 동물과 유사하게 유지되었다 (도 5). 작제물 I-처리된 동물의 말단 샘플은 일부 동물에서 수성 TPP1 농도의 감소를 야기할 수 있는 항-TPP1 항체의 증가된 발생률을 보여주었다.

높은 수준의 벡터 DNA가 망막 및 맥락막/RPE에서 수포 영역 (측두엽) 뿐만 아니라 상위, 하위 및 비강 사분면에서 검출되었다 (도 6a 및 6b).

벡터 DNA는 ≥1×10¹¹GC/눈에서 시신경, 시신경교차 및 후두엽에서 낮은 수준으로 검출되었으며, 이는 시각 경로를 따라 제한된 전방 지향성임을 암시한다 (도 7a 및 7b).

TPP1 면역반응성은 망막의 광범위한 영역 내에서 관찰되었다. >1×10¹⁰ GC/눈에서, 강한 TPP1 면역반응성이 망막 색소 상피, 광수용체 외부 분절의 비율 및 수평 또는 무축삭 세포의 간헐적인 표지 (1×10¹¹ GC/눈에서 더 분명함)에 존재하였다. 1×10¹² GC/눈에서 현저한 대조로, 망막의 전체 깊이에 걸쳐 강한 TPP1 면역반응성이 관찰되었다 (도 8). 1×10¹² GC/눈에서, TPP1 면역염색은 망막 신경절 세포 및 광수용체 세포의 비율이 다른 두 용량 중 어느 것보다 훨씬 높은 비율을 포함하여 존재하는 모든 유형의 뉴런을 표지하는 것으로 나타났다. 용량에 관계없이, 망막 내 TPP1 면역반응성은 뮬러 아교세포의 명백한 염색 없이, 심지어 망막하 벡터 침착물이 배치된 곳에 인접하여도 뉴런에 한정되는 것으로 나타났다.

TPP1 염색된 망막의 % 면적은 비히클 처리된 동물에 존재하는 것보다 작제물 I-치료된 동물에서 더 컸다 (도 9).

6.3.3 결론:

1×10¹⁰ GC/눈의 용량은 미처리된 시노몰구스 원숭이에서의 TPP1의 농도보다 약 170배 (방수) 및 200배 (유리체) 더 큰 TPP1 농도를 유도하였다.

면역염색은 1×10¹⁰ GC/눈에서 수평 또는 무축삭 세포로 추정되는 경우에만 간헐적인 표지와 함께 망막 색소 상피 내에서 그리고 광수용체의 외부 분절의 비율에서 강렬한 TPP1 면역반응성을 나타내었다.

시노몰구스 원숭이에서 생성된 데이터는 작제물 I의 망막하 주사가 CLN2 환자에서 보이는 망막 변성을 약화시키기에 충분한 수준의 TPP1을 제공할 수 있음을 입증한다.

6.4 실시예 4: 시노몰구스 원숭이에게 작제물 I의 망막하 주사는 유리한 안전 수준을 유도한다

본 연구의 목적은 시노몰구스 원숭이에서 3개월 독성 연구에 의해 인간 CLN2 (hCLN2) 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9의 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV9)인 작제물 I의 안정성을 평가하는 것이었다. 독성 연구를 위한 표준 종점 외에도, 본 연구는 눈의 생리학적 변화에 대한 평가를 포함하였다. 청소년 독성, 생식 독성, 및 유전 독성 또한 CLN2 질환이 있는 아동의 높은 미충족 임상 수요를 고려하여 논의되었다.

6.4.1 방법

시노몰구스 원숭이 그룹에 1 × 10¹⁰ 내지 1 × 10¹³ GC/눈 범위의 용량으로 망막하 주사에 의해 작제물 I를 투여하였다. 혈청, 안방수 및 유리체액 내 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1) 농도 및 생체분포를 평가하여 이식유전자 발현을 확인하였다. 연구의 눈은 직접 및 간접 검안경, OCT, 망막전위도, 안저 사진, 및 조직병리학에 의해 검사되었다. 효과는 최대 3개월 동안 평가되었다. 2 내지 3세 연령의 어린 시노몰구스 원숭이를 연구에 포함시켰다.

6.4.2 결과

시노몰구스 원숭이에게 작제물 I의 망막하 주사는 TPP1 생체분포의 상승되고 지속된 수준을 입증하였고 이는 본 연구에서 정상적인 이식유전자 발현을 나타낸다.

결과는 1 × 10¹⁰ GC/눈의 용량이 본 연구에 대한 무-관찰-부작용 수준 (no-observed-adverse-effect level; NOAEL)임을 시사한다. 부작용 또는 소견에는 안구 염증, OCT 및 안저 사진 소견, 및 시각 기능 저하가 포함되었다.

수컷 및/또는 암컷 시노몰구스 원숭이에게 1 × 10¹⁰, 1 × 10¹¹, 1 × 10¹², 또는 1 × 10¹³ GC/눈의 작제물 I의 망막하 투여는 ≥1 × 10¹¹ GC/눈 용량에서 유해한 소견과 관련되었다. 1 × 10¹¹ 또는 1 × 10¹² GC/눈의 용량에서, 수성 세포, 유리체 혼탁 또는 유리체 세포에서 관찰된 안구 염증은 최고 용량에서 관찰된 것보다 중증도가 낮았다. 또한, 저용량 (예를 들어 1 × 10¹¹ 또는 1 × 10¹² GC/눈)에서 관찰된 안구 염증은 전신 및/또는 국소 항염증 요법에 잘 반응하였다.

1 × 10¹⁰ GC/눈에서 관찰되는 간헐적인 유리체 세포 염증은 부작용으로 간주되지 않는다. 1 × 10¹⁰ GC/눈에서, 간헐적인 유리체 세포 염증은 22일차까지 심각성이 감소하였지만 일부 눈에서는 3개월 동안 지속되었다. 한 마리의 동물은 중증의 수성 세포, 중등도의 발적 및 중등도의 유리체 혼탁과 함께 보다 중증의 염증을 나타내었다. 그러나, 이것은 15일차에 한쪽 눈에서만 관찰되었고, 국소 항-염증 요법을 시행하였다. 1 × 10¹⁰ GC/눈 용량에서 안구 색상 안저 사진, ERG, 또는 시각 유발 전위에 대한 벡터-관련 효과는 관찰되지 않았으므로, 현미경 평가에 대한 연구가 종료될 때 한쪽 눈에서 최소한의 단핵 세포 침윤물이 관찰되었음에도 불구하고 유리체 세포 염증이 시각 기능에 미치는 영향과 상관관계가 없음을 입증하였다. 이는 1 × 10¹⁰ GC/눈에서 간헐적인 유리체 세포 염증이 시각 기능에 영향을 미치지 않을 수 있으며 경미한 수준 내에서 조절될 수 있음을 시사한다.

3개월 독성 연구 동안 시노몰구스 원숭이에서 신경행동, 호흡기 또는 현미경적 (심혈관) 변화가 관찰되지 않았다.

1 × 10¹⁰ GC/눈 용량에서 생식계에 대한 효과를 시사하는 발견은 없었다. 벡터 DNA는 1 × 10¹⁰ GC/눈의 용량까지 모든 동물의 고환 또는 난소에서 검출되지 않았다. 대조적으로, 벡터 DNA는 동일한 용량 하에서 29일 및 92일차에 안구 조직에서 주로 검출되었다. 이러한 구분은 검출 불가능한 벡터 DNA 수준으로 인해 1 × 10¹⁰ GC/눈이 생식계에 안전할 수 있음을 뒷받침한다.

≥1 × 10¹¹ GC/눈 용량에서 매우 낮은 카피 수의 벡터 DNA의 존재는 생식계에 대한 영향을 암시하지 않았다. 1 × 10¹¹ GC/눈을 망막하로 투여한 남성과 1.0 × 10¹² GC/눈을 망막하로 투여한 남성에서, 벡터 DNA는 92일차에 각각 340 및 109 카피/μg DNA로 매우 낮은 수준으로 고환에서 검출되었다. 1 × 10¹² GC/눈이 맥락막상 공간 (SCS)으로 투여된 한 여성에서, 344 카피/μg DNA가 29일차에 난소에서 검출되었다. 고환과 난소에서 미세한 변화는 관찰되지 않았다. 생식계에 그러한 변화가 없다는 것은 연구에서 가장 높은 용량까지 ≥1 × 10¹¹ GC/눈 용량에서도 매우 낮은 DNA 카피가 부작용으로 간주되지 않을 수 있음을 시사한다.

작제물 I는 유전독성에 대한 위험이 낮을 수 있다. 이용 가능한 과학 문헌 및 임상 데이터는 AAV 벡터의 통합이 관찰되지 않았다고 보고하였다 (문헌 [Wang et al., Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery, Nature Reviews Drug Discovery, 2019, 18: 358-378]). 야생형 AAV의 통합 기구 없이, 작제물 I는 형질도입된 세포에서 복제될 수 없다. 최근 승인된 AAV9인 onasemnogene abeparvovec-xioi (ZOLGENSMA USPI, 2019)는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)가 삽입 돌연변이 유발 위험이 낮다는 것을 뒷받침한다.

작제물 I를 사용한 면역독성 연구는 면역 반응에 의해 평가될 수 있다. 이 연구에서, 체액 반응은 AAV9 캡시드에 대한 항체, 및 이식유전자 생성물에 대한 항체, 즉 시노몰구스 원숭이의 항-TPP1 항체를 검출하여 모니터링되었다.

작제물 I의 청소년 독성은 2세 내지 3세 연령의 시노몰구스 원숭이에서 평가될 수 있다. 유럽 의약청 지침에 따르면, 이 연령 범위는 사춘기 전 원숭이를 포함할 가능성이 높으므로 평가에 임신 연령을 포함한다 (EMEA/CHMP/SWP/169215/2005).

6.4.3 결론

1 × 10¹⁰ GC/눈의 용량 수준은 본 실시예에서 시노몰구스 원숭이에게 작제물 I의 망막하 투여에 대한 NOAEL이었다. 임상 연구에서, 2 × 10¹⁰ GC/눈의 시작 용량 수준이 NOAEL로서 수행될 수 있다. 1 × 10¹¹ 또는 1 × 10¹² GC/눈의 용량에서 관찰된 안구 염증은 전신 및/또는 국소 항-염증 요법에 잘 반응하였다.

시노몰구스 원숭이에서 3개월 독성 연구로부터 생성된 데이터는 작제물 I의 망막하 투여가 유리한 안정성 프로필을 제공할 수 있음을 입증한다. 작제물 I의 SR 또는 SCS 투여 후 신경행동, 호흡기 또는 현미경적 변화는 기술되지 않았다. 특정 청소년 독성, 생식 독성 또는 유전독성은 관찰되지 않았다.

6.5 실시예 5: CLN2 질환의 레티나 -온-칩 ( 레티나 -온-칩) 모델에서 작제물 I의 평가

본 연구의 목적은 레티나-온-칩 (RoC) 모델에서 hiPSC RPE와 인간 유도 만능 줄기 세포주 (hiPSC) 망막 오가노이드 (RO)를 조합함으로써 CLN2 질환에서 인간 망막의 생리학적으로 관련된 3차원 시험관내 모델을 개발하는 것이었다. 이 새로운 미세생리학적 플랫폼은 증진된 내부 및 외부 분절 형성 및 보존, RPE와 광수용체간의 직접적인 상호작용, 정밀하게 제어 가능한 맥관 구조와 같은 관류를 가능하게 한다. 동물 모델에서는 가능하지 않거나 CLN2 아동에서 이해되지 않는 질환 표현형을 특성화할 뿐만 아니라, 이 모델은 작제물 I에 대한 작용 메커니즘 및 잠재적 이점에 대한 지원을 제공한다.

6.5.1 방법

CLN2 질환으로 사망하기 전에 아동으로부터 수집된 피부 섬유아세포는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Achberger et al. eLife 2019, 8, e46188]에 기술된 바와 같이 인간 유도 만능 줄기 세포주로 재프로그래밍되었고 RPE 및 망막 오가노이드 (RO)로 분화되었다.

6.5.2 결과

대조군 RPE와 달리, CLN2 RPE는 TPP1을 발현하지 않는다. TPP1 발현의 회복은 작제물 I로의 형질도입 21일 후 CLN2 RPE에서 나타났다 (도 10).

RPE를 단리한 후, RO를 더 성숙시켰다. 광수용체 마커인 리커버린은 분화 200일차에 양성이었고, 80일차에는 없었다. 대조군 계통에서 TPP1 발현은 200일차에 주로 광수용체 영역에서 RO에서만 검출되었으며, 이는 TPP1 발현의 공간적 및 시간적 특이성을 시사한다. 흥미롭게도, CLN2에서 확인된 축적된 기질 중 하나인 ATP 합성효소 서브유닛 C (SCMAS)는 대조군 RO에서 TPP1 발현이 검출되는 광수용체 영역에서 200일차에만 CLN2 RO에 존재하였다 (도 11).

SCMAS 축적의 검출 전 88일 차에 작제물 I를 사용한 CLN2 RO의 처리는 미처리된 CLN2 RO와 대조적으로 SCMAS 축적 방지와 함께 TPP1 발현을 나타냈고, 이는 조기 개입이 RO에서 저장 물질 축적을 늦추거나 방지할 수 있음을 시사한다 (도 12).

6.5.3 결론

작제물 I를 사용한 인간 CLN2 RPE에서 생성된 데이터는 인간 CLN2 RPE 및 RO에 TPP1이 결여되어 있고 작제물 I를 사용한 치료가 치료 후 TPP1의 발현을 회복할 수 있음을 보여준다. 또한, CLN2 RO를 치료하지 않고 방치하면, CLN2 질환의 특징인 SCMAS가 축적되는데, 이는 작제물 I로 전처리하여 예방할 수 있다. 이 데이터는 작제물 I를 사용한 RO (광수용체 포함)의 형질도입이 CLN2 변성과 관련된 리소좀 저장 물질의 축적을 방지함을 보여준다.

6.6 실시예 6: CLN2 질환의 레티나 -온-칩 모델에서 작제물 I의 평가를 위한 프로토콜

본 연구의 목적은 레티나-온-칩 모델을 사용하여 인간 대상체에서 CLN2의 안구 징후를 치료하는 데 있어서 인간 CLN2 (hCLN2) 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9의 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV9)인 작제물 I의 효능을 평가하는 것이다.

6.6.1 망막 오가노이드 ( RO )에 대한 환자 및 대조군 iPSC의 분화

4개의 인간 유도 만능 줄기 세포주 (iPSC, 2명의 CLN2 환자) 및 2개의 대조군 세포주는 각각 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Zhong et al. Nat. Commun . 2013, 5, 4047] 및 [Achberger et al. eLife 2019, 8, e46188]에 기술된 망막 분화 프로토콜에 따라 해동되고 망막 오가노이드 (RO)로 분화될 것이다. RO는 최소 3 내지 6개월 동안 배양될 것이다. 분화된 RO에서 착색된 RPE 세포 덩어리는 수동 해부에 의해 얻어질 것이다. 이러한 RPE 세포는 점착하여 해리되고 배양될 것이다. 이용 가능한 모든 계통의 RPE 세포는 사용 시점까지 배양 또는 동결될 것이다.

6.6.2 작제물 I를 사용한 망막 오가노이드의 처리

섹션 6.6.1에서 생성된 이용 가능한 계통의 80일차 RO는 내부 품질 기준 (예를 들어 분절 형성, 상피 스트라이에이션 (epithelial striation), 큰 괴사 영역의 부재)에 따라 선택될 것이다.

선택된 오가노이드는 예를 들어 96 웰 형식이며 작제물 I에 적용될 것이다. 이를 위해, 이용 가능한 환자 계통에 세 가지 상이한 농도가 적용될 것이다. 더욱이, 텅 빈 AAV의 한 농도를 한 환자 계통에 적용하여 TPP1 유전자 발현 효과의 특이성을 평가할 것이다. 세포에 대한 요법의 효과는 작제물 I의 초기 첨가 후 5주차에 모니터링될 것이다. 종점 방법은 qPCR을 통한 RNA 분석 (조건 당 4개의 생물학적 복제) 및 면역세포화학을 통한 단백질 분석 (조건 당 10개의 샘플)을 포함할 것이다. RO는 상이한 망막 세포 유형 마커, 리소좀 마커 (예를 들어 LAMP1 또는 LAMP2), TPP1 발현 및 미토콘드리아 ATP 합성효소 서브유닛 C (SCMAS)에 대해 염색될 것이다.

전술한 절차는 120일차에 RO로 반복될 것이다.

6.6.3 작제물 I를 사용한 레티나 -온-칩의 치료

레티나-온-칩 (RoC) 실험의 경우, 80일 및 120일차의 RO는 섹션 6.6.2에 적용된 동일한 기준에 따라 선택될 것이다. 섹션 6.6.1에서 생산된 이용 가능한 계통의 RPE는 내부 품질 기준 (계대, 배양 시간, 색소 침착, 육각형 세포 모양 및 일반적인 외관)에 따라 선택될 것이다. 세 가지 상이한 농도의 작제물 I 뿐만 아니라 비히클 제어가 이용 가능한 환자 계통에 적용될 것이다. RoC에 대한 요법의 효과는 작제물 I의 초기 첨가 후 5주 차에 모니터링될 것이다. 종점 방법은 qPCR을 통한 RNA 분석과 냉동절편을 통한 단백질 분석 및 면역세포화학 (조건 당 8개의 샘플)을 포함할 것이다. RoC는 다양한 망막 세포 유형 마커, 리소좀 마커 (예를 들어 LAMP1 또는 LAMP2), TPP1 발현 및 SCMAS에 대해 염색될 것이다.

6.7. 실시예 7: 작제물 I를 사용한 인간 RPE 오가노이드의 처리를 위한 프로토콜 및 SCMAS 축적 조사

본 연구의 목적은 작제물 I로 인간 RPE 오가노이드를 처리하고 RPE 오가노이드 및 망막 오가노이드에서 유세포 분석, 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 고해상도 공초점 현매경 검사를 통해 SCMAS 축적을 조사하는 것이다.

6.7.1 망막 오가노이드 ( RO )로 환자 및 대조군 iPSC의 분화

4개의 인간 iPSC 계통, 2개의 환자 계통 및 2개의 대조군 계통이 해동되고 섹션 6.6.1에서와 같이 망막 오가노이드 (RO)로 분화될 것이다. 분화된 RO에서, 착색된 RPE 색소 덩어리는 수동 해부에 의해 수확될 것이다. 이러한 RPE 세포는 현탁액에서 배양되어 RPE 오가노이드를 형성할 것이다.

6.7.2 TPP1 유전자 요법을 사용한 망막 색소 상피 세포 오가노이드 ( RPEorg )의 처리

우리의 데이터에 따르면, 제한된 기간 동안 단층에서 배양되는 부착성 RPE 세포는 ATP-C 침착물과 같은 질환 표현형을 재현하는 정확한 모델을 나타내지 않는다. 한편, RPEorg는 3D 구조와 장기 배양으로 인해, TPP1 돌연변이 효과와 ATP-C 축적을 연구하는 견고한 모델로 나타났으며, 따라서 RPE 세포에서 TPP1 유전자 치료 효과를 평가할 수 있는 흥미로운 플랫폼을 나타낸다. 이를 위해, 섹션 6.7.1에서 생산된 이용 가능한 계통의 >150일차 (표현형 개시)에서 RPEorg는 내부 품질 기준 (예를 들어 균일한 색소침착, 비-RPE 영역 부재)에 따라 선택될 것이다. 선택된 RPEorg는 예를 들어 96 웰 형식으로 구성되고 작제물 I를 사용한 처리에 적용될 것이다. 세포에 대한 요법의 효과는 작제물 I의 초기 첨가 후 5주차에 모니터링될 것이다. 종점 방법은 qPCR을 통한 RNA 분석 (조건 당 4개의 생물학적 복제) 및 면역세포화학을 통한 단백질 분석 (조건 당 10개의 샘플)을 포함할 것이다. RO는 TPP1 발현, SCMAS 및 리소좀 마커 (예를 들어 LAMP1 또는 LAMP2)에 대해 염색될 것이다.

6.7.3 RPEorg에 대한 TPP1 돌연변이 및 TPP1 유전자 요법 효과 분석

2개의 대조군 계통, 2개의 환자 계통 및 >150일 차에 TPP1 유전자 요법 (예를 들어 작제물 I)의 한 농도로 처리된 2개의 환자 계통에서 RPEorg는 AAV 처리 후 5주차에 선택되고, 해리되고, 단일 세포 RNA 시퀀싱 (sc-RNAseq)을 거칠 것이다. sc-RNAseq 평가는 SCMAS 축적을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자 발현에 대한 TPP1 돌연변이의 영향을 결정할 것이다. 마지막으로, 분석은 RPE 세포 신호전달, 생존 및 세포사멸에 대한 TPP1 유전자 요법 (예를 들어 작제물 I)의 결과를 확인할 것이다.

6.7.4 RO에 대한 TPP1 돌연변이 및 TPP1 유전자 요법 효과의 세포 유형 특이적 분석

2개의 대조군 계통, 2개의 환자 계통 및 120일 차에 TPP1 유전자 요법 (예를 들어 작제물 I)의 한 농도로 처리된 2개의 환자 계통에서 RO는 AAV 치료 후 5주차에 선택되고, 해리되고, 단일 세포 RNA 시퀀싱 (sc-RNAseq)을 거칠 것이다. 분석은 TPP1을 발현하는 망막 세포 유형 (대조군 계통에서) 및 TPP1 유전자 요법에 의해 보다 효율적으로 감염된 세포 유형 (환자 계통에서)을 평가할 것이다. 더욱이, sc-RNAseq 평가는 SCMAS 축적을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자 발현에 대한 TPP1 돌연변이의 영향을 결정할 것이다. 마지막으로, 분석은 세포 신호전달, 생존 및 세포사멸에 대한 TPP1 유전자 요법의 결과를 확인할 것이다.

6.7.5 SCMAS 축적 조사

SCMAS 침착물에 의해 영향을 받는 망막 세포 유형을 확인하고 TPP1 발현/부재와 SCMAS 사이의 상관관계를 강조하기 위해, RO는 SCMAS, TPP1 및 각 망막 세포 유형에 대한 하나의 특정 항체 (간상체, 원추체, 뮐러 아교세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 양극성 세포)로 염색한 후 유세포 분석 (FC)에 의해 분석될 것이다.

이를 위해, 이들 항체의 FC 검출을 위한 프로토콜이 먼저 확립될 것이다. 그 후, 2개의 대조군 계통, 2개의 환자 계통 및 120일 차에 TPP1 유전자 요법 (예를 들어 작제물 I)의 한 농도로 치료된 2개의 환자 계통에서 3 내지 5개의 RO는 AAV 치료 후 5주 차에 선택되고, 해리되고, ATP-C, TPP1 및 각 망막 세포 유형에 대한 하나의 특이적 항체로 염색한 후 유세포 분석을 받을 것이다.

마지막으로, SCMAS 축적을 나타내는 망막 세포 유형은 고해상도 공초점 현미경에 의해 추가로 분석될 것이다. 이를 위해, >155일 차에 2개의 대조군 계통 및 2개의 환자 계통에서 3 내지 5개의 RO는 SCMAS 및 개별 마커 또는 SCMAS 침착물 형태 및 세포 국소화의 평가를 위한 망막 하위유형에 대해 염색된다.

6.8 실시예 8: 확장된 CLN2 임상 등급 척도 운동 ( CLN2 CRS- MX )은 보행 기능에 대한 평가를 향상시킨다 .

후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증 2 (CLN2) 질환에서, 질환의 급속한 진행은 원래 함부르크 CLN2 척도를 사용하여 정량화되었다. 함부르크 운동 영역은 이후 CLN2 임상 등급 척도 모터 (CLN2 CRS-M)에 적용되었으며, 셀리포나아제 알파 뇌실내 효소 대체 요법 (ERT)에 대한 치료 반응과 비교하여 자연 질환 과정에서 운동 기능의 상실을 정량화하는 데 사용되었다. CLN2 질환 손상은 운동 실조, 저긴장성, 과다긴장성, 및 쇠약을 포함한다. 그러나, 아동의 경우, ERT에 대해 진화하는 표현형은 아동의 질환 진행이 더 느리기 때문에 인지하기가 어렵다.

본 연구의 목적은 보행 능력에 대한 CLN2 질환 손상의 영향을 평가하기 위해 CLN2-CRS-MX라고 하는 더 광범위하고 더 세분화된 측정을 제공하는 것이었다.

6.8.1 방법

항목의 도출은 관심 있는 주요 CLN2 질환 개념의 식별을 기반으로 하였다.

주요 개념은 대상 문헌 검토, 임상 전문가 인터뷰, 2명의 가상 간병인 포커스 그룹 및 6명의 CLN2 임상 전문가와 1년 동안 진행되는 격주 회의에서 확인되었다.

임상의 인터뷰 및 간병인 포커스 그룹은 특히 운동 기능과 관련된 CLN2의 주요 증상 및 영향, ERT-치료된 환자 및 ERT-나이브 환자에서의 질환 진행의 차이, 및 CLN2 CRS에서 운동 기능 평가의 세분성을 개선하여 임상 시험에서 치료 이점을 평가하는 데 더 유용하게 만드는 방법에 대해 논의하였다.

반복적인 개발 프로세스에는 파일럿 적용 및 수많은 항목 개정이 포함되었다. 추적 매트릭스는 모든 스캐일 반복과 변경의 근거를 문서화하는 데 사용되었다.

임상의 사이에서 평가자 간 신뢰도, 즉 동의 수준은 4명의 평가자에 대한 동의율로 계산되었다.

평가는 1차 임상의에 의해 관리되고 점수가 매겨졌으며, 또한 관찰자 임상의에 의해 독립적으로 점수가 매겨졌다.

각각의 평가는 2명의 추가 임상의에 의해 독립적으로 녹화되고 점수가 매겨졌다.

생후 20개월 내지 16세 연령 (평균 7.8세)의 30명의 환자를 각각 CLN2 CRS-MX 척도에 대해 4명의 임상의가 점수를 매겼다. 상기 환자들 모두 현재 ERT를 받고 있다.

6.8.2 결과

이 연구는 CLN2 CRS-MX 척도의 상세한 관리, 스코어링 및 교육 매뉴얼을 개발하였다.

이 연구는 증상 진행을 결정하기 위한 전형적인 보행 작업을 개발하였다. 일반적으로 임상의와 간병인은 보행에 해로운 영향을 미치는 증상의 현저한 진행으로 CLN2 질환을 특징지었다. 근 긴장 저하, 극도의 과다긴장성 및 운동 실조는 일반적으로 운동 기능에 영향을 미치는 증상으로 보고되었다. 증상이 악화되면, 환자가 더 이상 걸을 수 없을 때까지 균형을 잡기 위해 손, 두 손 또는 몸통을 잡는 것과 같은 도움의 필요성이 증가하는 것으로 보고되었다. 이 연구에서, 임상의는 보행 거리를 연장하고 안전하게 정지할 수 있는 능력을 고려하고, 방향 변경을 평가하고 보행하는 데 필요한 보조 수준을 측정하는 보행 작업으로 원래 CLN2 CRS-M에 대한 10단계 보행 작업의 확장을 지원하였다.

표 2는 원래 CLN2 CRS-M에 대한 평가 기준 및 비교의 개요를 제공한다. 도 2는 이동성 등급을 결정하기 위한 CLN2 CRS-MX 스코어링 흐름도를 개략적으로 나타낸다.

[표 2]

CLN2 CRS-M 및 CLN2 CRS-MX 평가 기준.

평가자 간 합의에서, CLN2 CRS-MX에 대한 임상의 사이의 합의 수준은 1.0이었고, 이는 완전/완벽한 합의를 나타낸다 (문헌 [Landis, JR, Koch, GG. An application of hierarchical kappa-type statistics in the assessment of majority agreement among multiple observers, Biometrics, 1977. Level of agreement range 0.81-0.99] 참조).

6.8.3 결론

CLN2 CRS-MX는 보행 능력에 대한 CLN2 질환의 영향을 측정할 때 더 많은 세분성, 개선된 항목 관련성을 제공하고, 반응 옵션의 수를 증가시켰다.

이 척도는 CLN2가 있는 아동을 위해 설계되었지만 유사한 질환 손상을 나타내는 다른 신경근 또는 신경퇴행성 장애와 관련이 있을 수 있다.

6.9 실시예 9: 확장된 CLN2 임상 등급 척도 언어 ( CLN2 CRS- LX )는 언어 기능에 대한 평가를 향상시킨다

ERT에 대한 치료 반응과 비교하여 자연 CLN2 질환 과정에서 언어 기능의 상실은 CLN2 임상 등급 척도 언어 (CLN2 CRS-L)를 사용하여 정량화되었다. 그러나, ERT 치료에서 아동의 질환 진행 및 표현형 진화는 더 느리고 인지하기 어렵다. 본 연구의 목적은 CLN2 CRS-LX라고 하는 더 광범위하고 세분화된 측정을 제공하여 표현 언어 및 비-언어 의사소통 능력의 변화를 포착하는 것이었다.

6.9.1 방법

주요 CLN2 질환 개념은 대상 문헌 검토 [자료에 명시되지 않음], 임상 전문가 인터뷰, 2명의 가상 간병인 포커스 그룹 및 6명의 CLN2 임상 전문가와 1년 동안 진행되는 격주 회의에서 확인되었다.

임상의 인터뷰 및 간병인 포서스 그룹은 특히 언어 기능과 관련된 CLN2의 주요 증상 및 영향, ERT-치료된 환자 및 ERT-나이브 환자에서의 질환 진행의 차이, 및 CLN2 CRS에서 언어 기능 평가의 세분성을 개선하여 임상 시험에서 치료 이점을 평가하는 데 더 유용하게 만드는 방법에 대해 논의하였다.

생후 20개월 내지 16세 연령 (평균 7.8세)의 30명의 환자를 각각 CLN2 CRS-MX에 대해 4명의 임상의가 점수를 매겼다. 상기 환자들 모두 현재 ERT를 받고 있다.

6.9.2 결과

이 연구는 CLN2 CRS-LX의 상세한 관리, 스코어링 및 교육 매뉴얼을 개발하였다. 상기 매뉴얼은 표현 언어 및 비-언어 의사소통 역량을 결정하기 위한 프롬프트 사용에 대한 특정 지침을 함유한다.

CLN2 CRS-LX는 옹알이, 어휘 및 문구 개발, 이해 불가능한 발성 및 제스처를 포함한 욕구와 요구를 전달하는 아동의 표현 언어 능력을 측정하였다. 일반적으로, 임상의와 간병인은 CLN2가 있는 아동이 일상 생활에 영향을 미치는 진보적 언어 상실을 경험한다고 보고하였다. 그들은 2세에서 3.5세 범위의 연령대에서 20 내지 100개의 단어의 최고 단어 수를 보고했으며, CLN2가 있는 아동은 단일 및 이중 단어 구, 이해 불가능한 발성 및 제스처를 포함한 다양한 의사소통 전략을 사용했다고 보고하였다. 이 연구에서, 임상의는 연령별로 기능적 기대치를 차별화하고 더 많은 응답 옵션을 포함하고 어휘 및 문구 개발, 발성 및 제스처를 고려하는 언어에 대한 확장된 CLN2 CRS의 개발을 지원하였다.

평가 기준의 개요 및 원래 CLN2 CRS-L과의 비교는 표 3 및 4에 제공되어 있다. 각 CLN2 CRS-LX 연령 카테고리 (1 내지 <2세, 2 내지 <3세 및 ≥3세)에 대한 스코어링 흐름도가 개발되었다. 도 3은 예로서 2 내지 <3세 흐름도를 도시한다.

[표 3]

CLN2 CRS-L 평가 기준.

[표 4]

CLN2 CRS-LX 평가 기준

평가자 간 합의에서, CLN2 CRS-LX에 대한 임상의 사이의 합의 수준은 0.933이었고, 이는 거의 완벽한 합의를 나타낸다 (문헌 [Landis, JR, Koch, GG. An application of hierarchical kappa-type statistics in the assessment of majority agreement among multiple observers, Biometrics, 1977. Level of agreement range 0.81-0.99] 참조).

6.9.3 결론

CLN2 CRS-LX는 표현 언어 및 비-언어 의사소통 능력에 대한 CLN2 질환의 영향의 측정에서 더 많은 세분성, 항목 관련성을 개선했으며 응답 옵션 수를 증가시켰다.

이 척도는 CLN2가 있는 어린이를 위해 특별히 설계되었지만, 유사한 질환 장애가 있는 다른 신경근육 또는 신경퇴행성 장애와 관련이 있을 수 있다.

등가물

비록 발명이 그 특정 실시형태를 참조하여 상세하게 기술되어 있지만, 기능적으로 동등한 변형이 본 발명의 범주 내에 있다는 것을 이해할 것이다. 실제로, 본 명세서에 도시되고 기술된 것에 부가하여 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부한 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 당업자는 본 명세서에 기술된 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 일상적인 실험 이하를 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 포괄되도록 의도된다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO INC. <120> GENE THERAPY FOR OCULAR MANIFESTATIONS OF CLN2 DISEASE <130> 12656-144-228 <140> TBA <141> <150> US 63/088,911 <151> 2020-10-07 <150> US 63/146,134 <151> 2021-02-05 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 563 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Leu Gln Ala Cys Leu Leu Gly Leu Phe Ala Leu Ile Leu Ser 1 5 10 15 Gly Lys Cys Ser Tyr Ser Pro Glu Pro Asp Gln Arg Arg Thr Leu Pro 20 25 30 Pro Gly Trp Val Ser Leu Gly Arg Ala Asp Pro Glu Glu Glu Leu Ser 35 40 45 Leu Thr Phe Ala Leu Arg Gln Gln Asn Val Glu Arg Leu Ser Glu Leu 50 55 60 Val Gln Ala Val Ser Asp Pro Ser Ser Pro Gln Tyr Gly Lys Tyr Leu 65 70 75 80 Thr Leu Glu Asn Val Ala Asp Leu Val Arg Pro Ser Pro Leu Thr Leu 85 90 95 His Thr Val Gln Lys Trp Leu Leu Ala Ala Gly Ala Gln Lys Cys His 100 105 110 Ser Val Ile Thr Gln Asp Phe Leu Thr Cys Trp Leu Ser Ile Arg Gln 115 120 125 Ala Glu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Glu Phe His His Tyr Val Gly Gly 130 135 140 Pro Thr Glu Thr His Val Val Arg Ser Pro His Pro Tyr Gln Leu Pro 145 150 155 160 Gln Ala Leu Ala Pro His Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Arg Phe 165 170 175 Pro Pro Thr Ser Ser Leu Arg Gln Arg Pro Glu Pro Gln Val Thr Gly 180 185 190 Thr Val Gly Leu His Leu Gly Val Thr Pro Ser Val Ile Arg Lys Arg 195 200 205 Tyr Asn Leu Thr Ser Gln Asp Val Gly Ser Gly Thr Ser Asn Asn Ser 210 215 220 Gln Ala Cys Ala Gln Phe Leu Glu Gln Tyr Phe His Asp Ser Asp Leu 225 230 235 240 Ala Gln Phe Met Arg Leu Phe Gly Gly Asn Phe Ala His Gln Ala Ser 245 250 255 Val Ala Arg Val Val Gly Gln Gln Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile Glu 260 265 270 Ala Ser Leu Asp Val Gln Tyr Leu Met Ser Ala Gly Ala Asn Ile Ser 275 280 285 Thr Trp Val Tyr Ser Ser Pro Gly Arg His Glu Gly Gln Glu Pro Phe 290 295 300 Leu Gln Trp Leu Met Leu Leu Ser Asn Glu Ser Ala Leu Pro His Val 305 310 315 320 His Thr Val Ser Tyr Gly Asp Asp Glu Asp Ser Leu Ser Ser Ala Tyr 325 330 335 Ile Gln Arg Val Asn Thr Glu Leu Met Lys Ala Ala Ala Arg Gly Leu 340 345 350 Thr Leu Leu Phe Ala Ser Gly Asp Ser Gly Ala Gly Cys Trp Ser Val 355 360 365 Ser Gly Arg His Gln Phe Arg Pro Thr Phe Pro Ala Ser Ser Pro Tyr 370 375 380 Val Thr Thr Val Gly Gly Thr Ser Phe Gln Glu Pro Phe Leu Ile Thr 385 390 395 400 Asn Glu Ile Val Asp Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe 405 410 415 Pro Arg Pro Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Val Thr Lys Phe Leu Ser Ser 420 425 430 Ser Pro His Leu Pro Pro Ser Ser Tyr Phe Asn Ala Ser Gly Arg Ala 435 440 445 Tyr Pro Asp Val Ala Ala Leu Ser Asp Gly Tyr Trp Val Val Ser Asn 450 455 460 Arg Val Pro Ile Pro Trp Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser Thr Pro Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Ile Leu Ser Leu Ile Asn Glu His Arg Ile Leu Ser Gly 485 490 495 Arg Pro Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Arg Leu Tyr Gln Gln His Gly 500 505 510 Ala Gly Leu Phe Asp Val Thr Arg Gly Cys His Glu Ser Cys Leu Asp 515 520 525 Glu Glu Val Glu Gly Gln Gly Phe Cys Ser Gly Pro Gly Trp Asp Pro 530 535 540 Val Thr Gly Trp Gly Thr Pro Asn Phe Pro Ala Leu Leu Lys Thr Leu 545 550 555 560 Leu Asn Pro <210> 2 <211> 1693 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggactcc aagcctgcct cctagggctc tttgccctca tcctctctgg caaatgcagt 60 tacagcccgg agcccgacca gcggaggacg ctgcccccag gctgggtgtc cctgggccgt 120 gcggaccctg aggaagagct gagtctcacc tttgccctga gacagcagaa tgtggaaaga 180 ctctcggagc tggtgcaggc tgtgtcggat cccagctctc ctcaatacgg aaaatacctg 240 accctagaga atgtggctga tctggtgagg ccatccccac tgaccctcca cacggtgcaa 300 aaatggctct tggcagccgg agcccagaag tgccattctg tgatcacaca ggactttctg 360 acttgctggc tgagcatccg acaagcagag ctgctgctcc ctggggctga gtttcatcac 420 tatgtgggag gacctacgga aacccatgtt gtaaggtccc cacatcccta ccagcttcca 480 caggccttgg ccccccatgt ggactttgtg gggggactgc accgttttcc cccaacatca 540 tccctgaggc aacgtcctga gccgcaggtg acagggactg taggcctgca tctgggggta 600 accccctctg tgatccgtaa gcgatacaac ttgacctcac aagacgtggg ctctggcacc 660 agcaataaca gccaagcctg tgcccagttc ctggagcagt atttccatga ctcagacctg 720 gctcagttca tgcgcctctt cggtggcaac tttgcacatc aggcatcagt agcccgtgtg 780 gttggacaac agggccgggg ccgggccggg attgaggcca gtctagatgt gcagtacctg 840 atgagtgctg gtgccaacat ctccacctgg gtctacagta gccctggccg gcatgaggga 900 caggagccct tcctgcagtg gctcatgctg ctcagtaatg agtcagccct gccacatgtg 960 catactgtga gctatggaga tgatgaggac tccctcagca gcgcctacat ccagcgggtc 1020 aacactgagc tcatgaaggc tgccgctcgg ggtctcaccc tgctcttcgc ctcaggtgac 1080 agtggggccg ggtgttggtc tgtctctgga agacaccagt tccgccctac cttccctgcc 1140 tccagcccct atgtcaccac agtgggaggc acatccttcc aggaaccttt cctcatcaca 1200 aatgaaattg ttgactatat cagtggtggt ggcttcagca atgtgttccc acggccttca 1260 taccaggagg aagctgtaac gaagttcctg agctctagcc cccacctgcc accatccagt 1320 tacttcaatg ccagtggccg tgcctaccca gatgtggctg cactttctga tggctactgg 1380 gtggtcagca acagagtgcc cattccatgg gtgtccggaa cctcggcctc tactccagtg 1440 tttgggggga tcctatcctt gatcaatgag cacaggatcc ttagtggccg cccccctctt 1500 ggctttctca acccaaggct ctaccagcag catggggcag gactctttga tgtaacccgt 1560 ggctgccatg agtcctgtct ggatgaagag gtagagggcc agggtttctg ctctggtcct 1620 ggctgggatc ctgtaacagg ctggggaaca cccaacttcc cagctttgct 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agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100 tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160 tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211 <210> 8 <211> 4020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 8 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180 atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840 aaagcgaagc gcgcggcggg cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc 900 tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 960 agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt 1020 gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg 1080 gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc 1140 gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt 1200 gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg 1260 aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg 1320 gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg 1380 ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg 1440 caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg 1500 cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt 1560 ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg 1620 aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc 1680 ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc 1740 cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg 1800 gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat 1860 gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat 1920 tttggcaaag aattcacgcg tgccaccatg ggactgcagg cctgtctgct gggactgttc 1980 gccctgatcc tgagcggcaa gtgcagctac agccccgagc ccgaccagag aagaacactg 2040 cctccaggct gggtgtccct gggcagagct gaccctgaag aggaactgag cctgaccttc 2100 gccctgcggc agcagaacgt ggaaagactg agcgagctgg tgcaggccgt gtccgatcct 2160 agcagccctc agtacggcaa gtacctgacc ctggaaaacg tggccgacct cgtgcggcct 2220 agccctctga cactgcacac cgtgcagaag tggctgctgg ctgccggcgc tcagaaatgc 2280 cactccgtga tcacccagga ctttctgacc tgttggctga gcatccggca ggccgaactg 2340 ctgctgcctg gggccgagtt tcaccactat gtgggcggac ccaccgagac acatgtcgtg 2400 cgcagcccac acccttacca gctgccacag gctctggccc ctcacgtgga ctttgtggga 2460 ggcctgcaca gattcccccc aaccagcagc ctgagacaga ggcctgagcc acaagtgacc 2520 ggcacagtgg gcctgcatct gggcgtgaca cctagcgtga tccggaagcg gtacaacctg 2580 accagccagg atgtgggcag cggcaccagc aacaatagcc aggcctgcgc ccagttcctg 2640 gaacagtact tccacgacag cgatctggcc cagttcatgc ggctgttcgg cggcaacttc 2700 gcacatcagg ctagcgtggc cagagtcgtg ggccagcagg gaagaggcag agccggaatt 2760 gaggcctccc tggacgtgca gtacctgatg agcgctggcg ccaacatcag cacctgggtg 2820 tacagcagcc ccggcagaca cgagggccag gaaccttttc tgcagtggct gatgctgctg 2880 agcaacgaga gcgccctgcc tcatgtgcac acagtgtcct acggcgacga cgaggacagc 2940 ctgagcagcg cctacatcca gagagtgaac accgagctga tgaaggccgc tgccagggga 3000 ctgaccctgc tgtttgcctc tggcgatagc ggagccggct gttggagtgt gtcaggccgg 3060 caccagttca gacccacctt tcctgccagc tccccctacg tgacaaccgt gggcggcacc 3120 tcctttcagg aacccttcct gatcaccaac gagatcgtgg actacatcag cggcggaggc 3180 ttcagcaacg tgttccccag acccagctac caggaagagg ccgtgaccaa gttcctgtcc 3240 tccagccctc atctgccccc cagctcctac ttcaacgcca gcggcagagc ctacccagat 3300 gtggccgctc tgtccgacgg ctactgggtg gtgtccaaca gagtgcccat cccttgggtg 3360 tccggcacaa gcgccagcac ccctgtgttt ggcggcatcc tgtccctgat caacgagcac 3420 agaatcctgt ccggcagacc ccccctgggc ttcctgaacc ctagactgta ccagcagcac 3480 ggcgctggcc tgttcgatgt gaccagaggc tgccacgaga gctgcctgga cgaggaagtg 3540 gaaggccagg gcttctgttc tggccctggc tgggatcctg tgaccggatg gggcacccct 3600 aacttccccg ccctgctgaa aacactgctg aacccctgat gactcgagga cggggtgaac 3660 tacgcctgag gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 3720 cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 3780 aattttttgt gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat 3840 acccattacc ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct 3900 agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 3960 aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 4020 <210> 9 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus 9 <400> 9 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims

치료를 필요로 하는 대상체에서 CLN2 바텐병과 관련된 안구 징후를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 상기 rAAV는 AAV9이고, 상기 벡터 게놈은
a. AAV 5' 역 말단 반복부 (ITR);
b. 프로모터;
c. 인간 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1) 단백질을 인코딩하는 CLN2 코딩 서열; 및
d. AAV 3' ITR
을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 AAV 5' ITR 및/또는 AAV3' ITR은 AAV2로부터 유래하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)의 코딩 서열은 서열번호: 2의 천연 인간 코딩 서열과 적어도 70% 동일한 코돈 최적화된 인간 CLN2인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)의 코딩 서열은 서열번호: 3인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CBA 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 인핸서 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 폴리A를 추가로 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 폴리A는 합성 폴리A이거나, 소 성장 호르몬 (bGH), 인간 성장 호르몬 (hGH), SV40, 토끼 β-글로빈 (RGB), 또는 변형된 RGB (mRGB)로부터 유래하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 인트론은 CBA, 인간 베타 글로빈, IVS2, SV40, bGH, 알파-글로불린, 베타-글로불린, 콜라겐, 오브알부민, 또는 p53으로부터 유래하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서를 추가로 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 인핸서는 CMV 인핸서, RSV 인핸서, APB 인핸서, ABPS 인핸서, 알파 mic/bik 인핸서, TTR 인핸서, en34, ApoE인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 크기가 약 3 킬로베이스 내지 약 5.5 킬로베이스인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 크기가 약 4 킬로베이스인, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 눈 당 2Х10¹⁰ 게놈 카피가 투여되는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 눈 당 6Х10¹⁰ 게놈 카피가 투여되는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 중앙 망막 두께 (CRT)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 외부 핵층 (ONL) 두께에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 동공측정법에 의해 측정된 바와 같이 동공 광 반사에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 황반 두께/부피에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 전체 망막 두께에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 망막 신경 섬유층에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 내부 핵층에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 광수용체 (PR)와 망막 색소 상피 (RPE)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 외부 세그먼트와 RPE (OS+RPE)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SD-OCT에 의해 측정된 바와 같이 타원체 구역 (EZ)에서 기준선으로부터의 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 치료 기준과 비교 가능한 임상 진행과 비교하여 망막 퇴행의 발병이 지연되는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 치료 기준과 비교 가능한 임상 진행과 비교하여 시력 상실의 발병이 지연되는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 rAAV를 투여한 후 3개월 이내에 상기 대상체의 눈의 유리체액(vitreous humour) 및/또는 안방수(aqueous humour)에서 검출 가능한 TPP1 발현 수준을 초래하는, 방법.
제29항에 있어서, 유리체액 및/또는 안방수에서의 TPP1 발현 수준은 상기 rAAV의 투여 전에 검출할 수 없는, 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 대상체의 혈청에서의 TPP1의 발현 수준은 검출할 수 없는 상태로 유지되는, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 뇌실내 Brineura^® 효소 대체 요법을 동시에 받고 있는, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.