NO20140988L - Adeno-assosierte virus (AAV) capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, vertscelle samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning - Google Patents

Adeno-assosierte virus (AAV) capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, vertscelle samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning

Info

Publication number
NO20140988L
NO20140988L NO20140988A NO20140988A NO20140988L NO 20140988 L NO20140988 L NO 20140988L NO 20140988 A NO20140988 A NO 20140988A NO 20140988 A NO20140988 A NO 20140988A NO 20140988 L NO20140988 L NO 20140988L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
aav
seq
sequences
aav2
sequence
Prior art date
Application number
NO20140988A
Other languages
English (en)
Other versions
NO336801B1 (no
Inventor
Guangping Gao
Mauricio Alvira
James Wilson
Original Assignee
Univ Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27502639&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO20140988(L) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20140988L publication Critical patent/NO20140988L/no
Application filed by Univ Pennsylvania filed Critical Univ Pennsylvania
Publication of NO336801B1 publication Critical patent/NO336801B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/14162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/90—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates avian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN
Adeno-assosiert virus (AAV), et medlem av Parvovirusfamilien, er en liten, ikke-innpakket, ikosaedrisk virus med enkelttrådede lineære DNA genomer på 4,7 kilobaser (kb) til 6 kb. AAV er tilskrevet genusen Dependovirus fordi virusen ble oppdaget som en kontaminant i rensede adenovirusforråd. AAV livscyklusen inkluderer en latent fase med hvilken AAV genomer, etter infeksjon, blir setespesifikt integrert i vertskromoso-mer, og en infektiøs fase der, etter enten adenovirus- eller herpes simplex virus infeksjon, de integrerte genomer deretter reddes, replikeres og pakkes i infektiøse vimser. Egenskapene når det gjelder ikke-patogenisitet, bredt verksspektrum når det gjelder infektivitet inkluderer ikke-delende celler, og potensiell, setespesifikk kromosomal integrering, gjør AAV til et attraktivt verktøy for overføring av gener.
Nylige studier antyder at AAV vektorer kan være den foretrukne vehikel for genterapi. Til i dag er det isolert 6 forskjellige serotyper av AAVer fra humane eller ikke-humane primater (NHP) og disse er godtkarakterisert. Blant disse er human serotype 2 den førs-te AAV som ble utviklet som en genoverføringsvektor; den er senere utstrakt brukt for effektive genoverføringsforsøk i forskjellige målvev og dyremodeller. Kliniske prøver av forsøksapplikasjon av AAV2 baserte vektorer mot visse humansykdomsmodeller er i forløp og inkluderer sykdommer som systisk fibrose og hemofili B.
Ønsket er å tilveiebringe AAV-baserte konstrukter for genavlevering.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
I ett aspekt angår foreliggende oppfinnelse en ny metode for å detektere og å identifisere AAV sekvenser fra cellulære DNA'er av forskjellige human- og ikke-human primat (NHP) vev ved bruk av bioinformatikkanalyser, PCR basert genforsterkning og klo-ningsteknologi, basert på arten av latens og integrering av AAVer i fravær av hjelpevi-ruskoinfeksjon.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for isolering av nye detekterte AAV sekvenser ved bruk av den ovenfor beskrevne metode ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen omfatter videre metoder for generering av vektorer basert på disse nye AAV serotyper for serologi og genoverføringsstudier kun basert på tilgjenge-lighet av capsidgensekvenser og strukturen for rep/cap genskjøter.
I nok et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ny fremgangsmåte for å gjen-nomføre studier i forbindelse med serologj, epidemiologi, biofordeling og transmi-sjonsmåte ved bruk av reagenser ifølge oppfinnelsen som inkluderer generiske sett av primere/prober og kvantitativ real tids PCR.
I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å isolere komplette og infektiøse genomer av nyere AAV serotyper fra cellulær DNA og forskjellige opprinnelser ved bruk av RACE og andre molekylære teknikker.
I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å komme frem til nye serotyper av AAV genomer fra human- og NHP cellelinjer ved bruk av adenovirushjelpere av forskjellige opprinnelser.
I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen nye AAV serotyper, vektorer inneholdende disse og metoder for bruk av disse.
Disse og andre aspekter ifølge oppfinnelsen vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelse.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figurene IA til 1AAAR tilveiebringer en innretning av nukleinsyresekvensen som koder minst cap proteinene for AAV serotypene. Full-lengdesekvensene inkludert ITR'-ene, rep området og capsid området tilveiebringes for nye AAV serotyper 7 [SEQ ID nr. 1], og for tidligere publiserte AAV1 [SEQ IN Nr. 6], AAV2 [SEQ ID nr. 7]; og AAV3 [SEQ ID nr. 8]. Nye AAV serotyper AAV8 [SEQ ID nr. 4] og AAV9 [SEQ ID nr. 5] er gjenstand for samtidig inngitte søknader. De andre nye kloner ifølge oppfinnelsen som tilveiebringes i denne innretning inkluderer: 42-2 [SEQ ID nr. 9], 42-8 [SEQ ID
nr. 27], 42-15 [SEQ ID nr. 28], 42-5b [SEQ ID nr. 29], 42-lb [SEQ ID nr. 30]; 42-13 [SEQ ID nr. 31], 42-3a [SEQ ID nr. 32], 42-4 [SEQ ID nr. 33], 42-5a [SEQ ID nr. 34], 42-10 [SEQ ID nr. 35], 42-3b [SEQ ID nr. 36], 42-11 [SEQ ID nr. 37], 42-6b [SEQ ID nr. 38], 43-1 [SEQ ID nr. 39], 43-5 [SEQ ID nr. 40], 43-12 [SEQ ID nr. 41], 43-20 [SEQ ID nr. 42], 43-21 [SEQ ID nr. 43], 43-23 [SEQ ID nr. 44], 43-25 [SEQ ID nr. 45], 44.1 [SEQ ID nr. 47], 44.5 [SEQ ID nr. 47], 223.10 [SEQ ID nr. 48], 223.2 [SEQ ID nr. 49], 223.4 [SEQ ID nr. 50], 223.5 [SEQ ID nr.51], 223.6 [SEQ ID nr. 52], 223.7 [SEQ ID nr. 53], A3.4 [SEQ ID nr. 54], A3.5 [SEQ ID nr. 55], A3.7 [SEQ ID nr. 56],
A3.3 [SEQ ID nr. 57], 42.12 [SEQ ID nr. 58], 44.2 [SEQ ID nr. 59]. Nukleotidsekven-sene av signaturområdene av AAV10 [SEQ ID nr. 117], AAV11 [SEQ ID nr. 118] og AAV12 [SEQ ID nr. 119] er tilveiebragt i denne figur. Kritiske landemerker i strukture-ne av AAV genomene vises. Gap påvises ved punkter. 3' ITR'en av AAV1 [SEQ ID nr. 6] vises i den samme konfigurasjon som i de publiserte sekvenser. TRS representerer termaloppløsningssetet. Merk at AAV7 er den eneste AAV som er rapportert som bru-ker GTG som initieringskodon for VP3.
Figurene 2A til 2F er innretninger av aminosyresekvensene av proteinene av vpl capsid proteinene av tidligere publiserte AAV serotyper 1 [SEQ ID nr. 64], AAV2 [SEQ ID nr. 70], AAV3 [SEQ ID nr. 71], AAV4 [SEQ ID nr. 63], AAV5 [SEQ ID nr. 114] og
AAV6 [SEQ ID nr. 65] og nye AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen, inkludert: Cl [SEQ ID nr. 60], C2 [SEQ ID nr. 61], C5 [SEQ ID nr. 62], A3-3 [SEQ ID nr. 66], A3-7 [SEQ ID nr. 67], A3-4 [SEQ ID nr. 68], A3-5 [SEQ ID nr. 69], 3.3b [SEQ ID nr. 62], 223.4 [SEQ ID nr. 73], 223-5 [SEQ ID nr. 74], 223-10 [SEQ ID nr. 75], 223-2 [SEQ ID nr. 76], 223-7 [SEQ ID nr. 77], 223-6 [SEQ ID nr. 78], 44-1 [SEQ ID nr. 79], 44-5 [SEQ ID nr. 80], 44-2 [SEQ ID nr. 81], 42-15 [SEQ ID nr. 84], 42-8 [SEQ ID nr. 85], 42-13 [SEQ ID nr. 86], 42-3A [SEQ ID nr. 87], 42-4 [SEQ ID nr. 88], 42-5A [SEQ ID nr. 89], 42-1B [SEQ ID nr. 90], 42-5B [SEQ ID nr. 91], 43-1 [SEQ ID nr. 92], 43-12 [SEQ ID nr. 93], 43-5 [SEQ ID nr. 94], 43-21 [SEQ ID nr. 96], 43-25 [SEQ ID nr. 97], 43-20 [SEQ ID nr. 99], 24.1 [SEQ ID nr. 101], 42.2 [SEQ ID nr. 102], 7.2 [SEQ ID nr. 103], 27.3 [SEQ ID nr. 104], 16.3 [SEQ ID nr. 105], 42.10 [SEQ ID nr. 106], 42-3B [SEQ ID nr. 107], 42-11 [SEQ ID nr. 108], Fl [SEQ ID nr. 109], 5F [SEQ ID nr. 110], F3 [SEQ ID nr. 111], 42-6B [SEQ ID nr. 112], 42-12 [SEQ ID nr. 113].
Nye serotyper AAV8 [SEQ ID nr. 95] og AAV9 [SEQ ID nr. 100] er gjenstand for samtidig inngitte søknader.
Figurene 3A til 3C gir aminosyresekvensen av AAV7 rep proteinene [SEQ ID nr. 3].
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Ifølge oppfinnelsen har foreliggende oppfinnere funnet en metode som trekker fordel av evnen hos adenoassosiert virus (AAV) å penetrere nukleus og, i fravær av en hjelpevi-rusko-infeksjon, å integrere inn i cellulær DNA og etablere en latent infeksjon. Denne metode benytter en polymerasekjedereaksjon (PCR)-basert strategi for detektering, identifisering og/eller isolering av sekvenser av AAVer fra DNA'er fra vev av human og ikke-human primatopprinnelse så vel som for andre kilder. Fortrinnsvis er denne metode også egnet for detektering, identifisering og/eller isolering av andre integrerte, virale og ikke-virale sekvenser, som beskrevet nedenfor.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre nukleinsyresekvenser som er identifisert i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte. En slik adenoassosiert virus er av en ny serotype, her kalt serotype 7 (AAV7). Andre, nye adenoassosierte virus serotyper som her tilveiebringes inkluderer også AAV 10, AAV11 og AAV12. Ytterligere andre AAV serotyper som er identifisert ifølge oppfinnelsens metoder tilveiebringes i foreliggende beskrivelse, det vises til figurene og sekvenslistingen som er en del av beskrivelsen.
Det tilveiebringes videre fragmenter av disse AAV sekvenser. Blant spesielt ønskede AAV fragmenter er cap proteinene inkludert vi, vp2, vp3, de hypervariable områder, rep proteinene inkludert rep 78, rep 68, rep 52 og rep 40, og sekvensene som koder disse proteiner. Hvert av disse fragmenter kan lett benyttes i forskjellige vektorsystemer og vertsceller. Slike fragmenter kan benyttes alene, i kombinasjon med andre AAV sekvenser eller -fragmenter, eller i kombinasjon med elementer fra andre AAV- eller ik-ke-AAV virale sekvenser. I en spesielt ønskelig utførelsesform inneholder en vektor AAV cap- og/eller rep sekvensene ifølge oppfinnelsen.
Som beskrevet her blir innretning gjennomført ved bruk av en hvilken som helst av et antall ålment eller kommersielt tilgjengelige "Multiple Sequence Alignment Programs" som "Clustal W", tilgjengelig via Web Servere på internet. Alternativt blir vektor NTI utiliteter også benyttet. Det finnes også et antall algoritmer som er velkjente i teknikken som kan benyttes for å måle nukleotidsekvensidentitet inkludert de som inneholdes i programmene som beskrevet ovenfor. Som et annet eksempel kan polynukleotidsekven-ser sammenlignes ved bruk av Fasta, et program i GCG Versjon 6.1. Fasta tilveiebringer innretninger og prosent sekvensidentitet for områdene med best overlapping mellom spørsmåls- og svarsekvensene. For eksempel kan prosent sekvensidentitet mellom nukleinsyresekvenser bestemmes ved bruk av Fasta med dens default parametre (en ordstør-relse på 6 og NOPAM faktoren for bedømmelsesmatrisen) slik den tilveiebringes i GCG Versjon 6.1, hvortil det vises når det gjelder detaljer. Tilsvarende programmer er tilgjengelige for aminosyresekvenser, for eksempel "Clustal X" programmet. Generelt kan et hvilket som helst av disse programmer være brukbare som default settinger selv om fagmannen på området kan endre disse etter behov. Alternativt kan fagmannen på området benytte andre algoritme- eller maskinprogrammer som gir minst det identitets-eller innretningsnivå som tilveiebringes av nevnte algoritmer og programmer. Uttrykket "vesentlig homologi" eller "vesentlig likhet" indikerer at, under henvisning til en nukleinsyre eller et fragment derav, og ved optimal innretning med egnede nukleotid-innskudd eller delesjoner med andre nukleinsyrer (eller dens kompiementærtråd), er det nukleotidsekvensidentitet i minst rundt 95 til 99 % av de innrettede sekvenser. Fortrinnsvis er homologien over full-lengde sekvens, eller en åpen leseramme derav, eller et annet egnet fragment som er minst 15 nukleotider i lengde. Eksempler på egnede fragmenter er beskrevet her.
Uttrykket "vesentlig homologi" eller "vesentlig likhet" indikerer at, under henvisning til aminosyrer eller fragmenter derav og når det er optimalt innrettet med egnede aminosy-reinnskudd eller delesjoner med andre aminosyrer, er det aminosyresekvensidentitet på minst rundt 95 til 99 % av de innrettede sekvenser. Fortrinnsvis er homologien over full-lengde sekvenser eller et protein derav, for eksempel et cap protein, et rep protein eller et fragment derav med minst 8 aminosyrer eller helst minst 15 aminosyrer i lengde. Eksempler på egnede fragmenter er beskrevet her.
Med uttrykket "meget bevart" eller lignende menes minst 80 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet og aller helst mer enn 97 % identitet. Identitet bestemmes lett av fagmannen på området ved å benytte algoritmer og dataprogrammer som kjent av fagmannen.
Utrykket "prosent sekvensidentitet" eller "identisk" i konteksten nukleinsyresekvenser henviser til rester i de to sekvenser som er de samme når de innrettes for maksimal overensstemmelse. Lengden av sekvensidentitetsammenligningen kan være over hele lengden av genomet, hele lengden av en genkodende sekvens, eller et fragment på minst 500 til 5000 nukleotider, hvis ønskelig. Imidlertid kan identitet blant mindre fragmenter, for eksempel minst rundt 9 nukleotider, vanligvis minst rundt 20 til 24 nukleotider, minst rundt 28 til 32 nukleotider eller minst rundt 36 eller flere nukleotider, også være ønskelig. På samme måte kan "prosent sekvensidentitet" lett bestemmes for aminosyresekvenser over hele lengden av et protein, eller et fragment derav. Hensiktsmessig er et fragment minst 8 aminosyrer i lengde og kan være opp til 700 aminosyrer. Eksempler på egnede fragmenter er beskrevet her.
AAV sekvensene og fragmentene derav er brukbare ved fremstilling av rAAV og er også brukbare som antisense avleveringsvektorer, genterapivektorer eller vaksinevekto-rer. Oppfinnelsen tilveiebringer videre nukleinsyremolekyler, genavleveringsvektorer og vertsceller som inneholder AAV sekvensene ifølge oppfinnelsen.
Som beskrevet her er vektorene ifølge oppfinnelsen inneholdende AAV capsid proteinene ifølge oppfinnelsen spesielt godt egnet for anvendelse ved applikasjon der de nøyt-raliserende antistoffer reduserer effektivitetene av andre AAVserotyp baserte vektorer, så vel som andre virale vektorer. rAAV vektorene ifølge oppfinnelsen er spesielt fordel-aktige ved rAAV readministrering og repeat genterapi.
Disse og andre utførelsesformer og fordeler ifølge oppfinnelsen beskrives i større detalj nedenfor.
Som benyttet i beskrivelsen og krav er uttrykkene "omfattende" og "inkludert" og deres varianter, inkluderende når det gjelder andre komponenter, elementer, integere, trinn og lignende. Omvendt er uttrykket "bestående av" og varianter derav ekskluderende for andre komponenter, elementer, integere, trinn og lignende.
I. Metoder ifølge oppfinnelsen
A. Detektering av sekvenser via molekylær kloning
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å detektere og/eller identifisere store nukleinsyresekvenser i en prøve. Denne prøve er spesielt velegnet for detektering av virale sekvenser som er integrert i en celles kromosom, for eksempel adenoassosierte vimser (AAV) og retrovimser, blant andre. Beskrivelsen henviser til AAV som er ek-semplifisert her. Basert på denne informasjon vil fagmannen imidlertid lett kunne gjen-nomføre metodene ifølge oppfinnelsen på retro vimser [for eksempel felin leukemi vi-ms (FeLV), HTLVI og HTLVUI], og lentivirinae [for eksempel human immunodefekt vims (FflV), simian immunodefekt vims (SIV), felin immunodefekt vims (FIV), ekvin infektiøs anemi vims, og spumavirinal)], blant andre. Videre kan metoden ifølge oppfinnelsen også benyttes for detektering av andre virale og ikke-virale sekvenser, uansett om de er integrert eller ikke-integrert i genomet av vertscellen.
Som benyttet her er en prøve en hvilken som helst kilde inneholdende nukleinsyrer, for eksempel vev, vevkultur, celler, cellekultur og biologiske fluider inkludert, uten begrensning, urin og blod. Disse nukleinsyresekvenser kan være DNA eller RNA fra plasmider, naturlig DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde inkludert bakterier, gjær, vimser og høyere organismer som planter eller dyr. DNA eller RNA ekstraheres fra prøver ved et antall teknikker som er velkjente for fagmannen og som de som er beskrevet av Sambrook i "Molecular Cloning: A Laboratoray Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory). Opprinnelsen for prøven og den metode med hvilken nuk-leinsyrene oppnås for gjennomføring av metoden ifølge oppfinnelsen er ingen begrensning for denne. Eventuelt kan oppfinnelsens metoder gjennomføres direkte på kilden for DNA, eller på oppnådde nukleinsyrer (som for eksempel er ekstrahert) fra en kilde.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen involverer å underkaste en prøve inneholdende DNA en forsterkning via polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av et første sett primere som er spesifikke for et første område av dobbeltstrengede nukleinsyresekvenser for derved å oppnå forsterkede sekvenser. Som benytter her er hvert av "områdene" bestemt på forhånd basert på innretningen av nukleinsyresekvensen av minst to serotyper (for eksempel AAV) eller stammer (for eksempel lentiviruser) og der hvert av områdene består av sekvenser med en 5' ende som er meget konservert, en midtre som fortrinnsvis men ikke nødvendigvis er variabel, og en 3' ende som er sterkt konservert idet hver av disse er konservert eller variable relativt sekvensene av de minst to innrettede AAV serotyper. Fortrinnsvis er 5'- og/eller 3'-enden sterkt konservert i forhold til minst 9 og aller helst minst 18 basepar (bp). Imidlertid kan en eller begge av sekvensene ved 5'- eller 3'-enden være konservert over mer enn 18 bp, mer enn 25 bp, mer enn 30 bp eller mer enn 50 bp ved 5'-enden. Med henblikk på det variable området er det intet krav for konserverte sekvenser, disse sekvenser kan være relativt konservert eller kan ha mindre enn 90, 80 eller 70 % identitet blant de innrettede serotyper eller stammer.
Hvert av områdene kan spenne over 100 bp til rundt 10 kilobase par i lengde. Imidlertid er det spesielt ønskelig at et av områdene er et "signaturområde", det vil si et område som er tilstrekkelig unikt til positivt å identifisere den forsterkede sekvens som en fra målkilden. I en utførelsesform har for eksempel det første området en lengde på rundt 250 bp og er tilstrekkelig unikt blant kjente AAV sekvenser til at det positivt identifise-rer det forsterkede området til å være av AAV opprinnelse. Videre er de variable sekvenser innen området tilstrekkelig unike til at de kan benyttes til å identifisere serotypen hvorfra den forsterkede sekvens stammer. Når de først er forsterket (og derved detektert) kan sekvensene identifiseres ved å gjennomføre konvensjonell restriksjonsdi-gestering og sammenligning med restriksjonsregj streite mønstere for dette området i en hvilken som helst av AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, eller AAV6, eller den til AAV7, AAV10, AAV11, AAV12 eller en hvilken som helst annen ny serotype som er identifisert ifølge oppfinnelsen, som er bestemt på forhånd og tilveiebragt ved oppfinnelsen.
Gitt de rettledninger som finnes her kan fagmannen på området lett identifisere slike områder blant andre, integrerte vimser for å tillate lett detektering og identifisering av disse sekvenser. Deretter kan et optimalt sett av generiske primere lokalisert i de sterkt konserverte ender konstmeres og testes for effektiv forsterkning av de valgte områder fra prøvene. Dette aspekt ved oppfinnelsen kan lett tilpasses et diagnostisk sett for detektering av nærværet av målsekvensen (for eksempel AAV) og for å identifisere AAV serotypen, ved bmk av standarder som inkluderer restriksjonsmønstrene for AAV serotypene som beskrives her eller som isoleres ved bmk av de her beskrevne teknikker. For eksempel kan hurtig identifisering eller molekylær serotyping av PCR produkter gjen-nomføres ved digestering av PCR produktene og sammenligning av restriksjonsmøns-tre.
I en utførelsesform spenner således "signaturområdet" for AAV mndt bp 2800 til mndt 3200 av AAV1 [SEQ ID nr. 6] og tilsvarende basepar i AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 og AAV6. Mer ønskelig er området cirka 250 bp, lokalisert innen bp 2886 til mndt 3143 bp av AAV1 [SEQ ID nr. 6] og tilsvarende basepar i AAV2 [SEQ ID nr. 7], AAV3 [SEQ ID nr. 8] og andre AAV serotyper, det henvises til figur 1. For å tillate hurtig detektering av AAV i prøven benyttes det primere som spesielt forsterker dette signaturområdet. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til de nøyaktige sekvenser som er identifisert her for AAV signaturområdet da fagmannen lett kan endre området til å omfatte et kortere fragment eller større fragmenter av dette signaturområdet.
PCR primerne genereres ved bmk av teknikker som er velkjente for fagmannen. Hvert av PCR primersettene består av en 5' primer og en 3' primer, se for eksempel Sambrook et al supra. Uttrykket "primer" henviser til et nukleotid som virker som et initierings-punkt for syntesen ved anbringelse under betingelser hvori synteser av et primerforleng-elsesprodukt som er komplementært til nukleinsyretråden, induseres. Primeren er fortrinnsvis enkelttrådet. Hvis imidlertid en dobbelttrådet primer benyttes behandles denne for å separere trådene før de benyttes for å fremstille forlengelsesproduktene. Primerne kan være mndt 15 til 25 eller flere nukleotider og er fortrinnsvis minst 18 nukleotider. For enkelte anvendelser benyttes det imidlertid kortere nukleotider, for eksempel 7 til 15 nukleotider.
Primerne velges for å være tilstrekkelig komplementære til de forskjellige tråder av hver spesifikke sekvens som skal forsterkes for å hybridere med deres respektive tråder. Primersekvensen behøver derfor ikke å reflektere den nøyaktige sekvens av området som forsterkes. For eksempel kan et ikke-komplementært nukleotidfragment festes til 5'- enden av primeren mens resten av primersekvensen er fullstendig komplementær til tråden. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller lengre sekvenser intersperseres inn i primeren forutsatt at primersekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen i tråden som skal forsterkes til å hybridere med denne og danne et templat for syntese av forlengelsesproduktet av den andre primer.
PCR primerne for signaturområdet ifølge oppfinnelsen er basert på de sterkt konserverte sekvenser av to eller flere innrettede sekvenser (for eksempel to eller flere AAV serotyper). Primerne kan stemme overens med mindre enn nøyaktig identitet blant to eller flere innrettede AAV serotyper ved 5'-enden eller i midten. Imidlertid tilsvarer sekvens ved 3'-enden av primerne et område av to eller flere innrettede AAV serotyper hvori det er eksakt identitet over minst fem og fortrinnsvis over minst ni basepar, aller helst over minst 18 basepar ved 3'-enden av primerne. Således består 3'-enden av primerne av sekvenser med 100 % identitet til de innrettede sekvenser over minst fem nukleotider. Imidlertid kan man eventuelt benytte en, to eller flere degeneratnukleotider ved 3'-enden av primeren.
For eksempel ble primersettet for signaturområdet av AAV konstruert basert på et unikt område innen AAV capsidet som følger. 5' primerenden var basert på nt 2867-2891 av AAV2 [SEQ ID nr. 7], 5'-GGTAATTCCTCCGGAAATTGGCATT3'. Se figur 1. 3' primerenden ble konstruert basert på nt 3096-3122 av AAV2 [SEQ ID nr. 7], 5'-GACTCATCAAC AACAACTGGGGATTC-3'. Imidlertid kan fagmannen lett konstruere primersettet basert på de tilsvarende områder av AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, eller basert på den formasjon som er gitt der, AAV7, AAAV10, AAV11, AAV12, eller en annen ny AAV ifølge oppfinnelsen. I tillegg kan ytterligere andre primersett lett konstrueres for å forsterke dette signaturområdet ved bruk av teknikker som er velkjente for fagmannen.
B. Isolering av mål sekvenser
Som beskrevet her tilveiebringer oppfinnelsen et første primersett som spesifikt forsterker signaturområdet av målsekvensen, for eksempel en AAV serotype, for å tillate detektering av målet. I en situasjon hvori ytterligere sekvenser er ønsket, hvis for eksempel en ny AAV serotype er identifisert, kan signaturområdet forlenges. Således kan oppfinnelsen videre benytte ett eller flere ytterligere primersett.
Hensiktsmessig er disse primersett konstruert til å inkludere enten 5'- eller 3'-primeren av det første primersettet og en andre primer som er unik for primersettet slik at primersettet forsterker et område 5' eller 3' til signaturområdet som annellerer enten til 5'-enden eller 3'-enden av signaturområdet. For eksempel består et første primersett av en 5' primer, Pl og en 3' primer P2 for å forsterke signaturområdet. For å forlenge signaturområdet ved dettes 3'-ende består et andre primersett av primer Pl og en 3' primer P4 som forsterker signaturområdet og nabosekvenser nedstrøms signaturområdet. For å forlenge signaturområdet ved dettes 5'-ende består et tredje primersett av en 5' primer, P5, og primeren 2 slik at signaturområdet og nabosekvenser oppstrøms signaturområdet forsterkes. Disse forlengelsestrinn gjentas (eller gjennomføres samtidig) etter behov eller ønske. Deretter blir produktene som stammer fra disse forsterkningstrinn fusert ved bruk av konvensjonelle trinn for å gi en isolert sekvens med ønsket lengde.
Det andre og tredje primersett konstrueres som med primersettet for signaturområdet for å forsterke et område med sterk konservert sekvenser blant de innrettede sekvenser.
Referanser hertil uttrykket "andre" eller "tredje" primersett er kun for diskusjon og uten hensyn til den rekkefølge med hvilken disse primere settes til reaksjonsblåndingen, eller benyttes for forsterkning. Området som forsterkes ved det andre primersett velges slik at ved forsterkning annellerer det ved sin 5'-ende til 3'-enden av signaturområdet. På tilsvarende måte blir området som forsterkes av det tredje primersett valgt slik at ved forsterkning annellerer det ved sin 3'-ende til 5'-enden av signaturområdet. Ytterligere primersett kan konstrueres slik at områdene som de forsterker annellerer til enten 5'-enden eller 3'-enden av forlengelsesproduktene som dannes av det andre eller tredje primersett, eller av etterfølgende primersett.
Der for eksempel AAV er målsekvensen blir et første sett av primere (Pl og P2) benyttet for å forsterke signaturområdet fra prøven. I en ønsket utførelsesform er dette signaturområdet lokalisert inne i AAV capsidet. Et andre sett primere (Pl og P4) benyttes for å forlenge 3'-enden av signaturområdet til en lokasjon i AAV sekvensen som er akkurat foran AAV 3' ITR, det vil si som gir et forlengelsesprodukt inneholdende hele 3'-enden av AAV capsidet når man benytter signaturområdet som anker. I en utførelsesform tilsvarer P4 primeren nt 4435 til 4462 av AAV2 [SEQ ID nr. 7], og tilsvarende sekvenser i de andre AAV serotyper. Dette resulterer i forsterkning av et område på rundt 1,6 kb som inneholder 0,25 kb signaturområde. Et tredje sett primere (P3 og P2) benyttes for å forlenge 5'-enden av signaturområdet til en lokasjon i AAV sekvensene som er i 3'-enden av rep genene, det vil si som gir et forlengelsesprodukt inneholdende hele 5'-enden av AAV capsidet når man benytter signaturområdet som anker. I en utførelses- form tilsvarer P3 primeren nt 1384 til 1409 av AAV2 [SEQ ID nr. 7] og tilsvarende sekvenser i andre AAV serotyper. Dette resulterer i forsterkning av et område på rundt 1,7 kb som inneholder 0,25 kb signaturområde. Eventuelt blir et fjerde sett av primere benyttet for ytterligere å forlenge forlengelsesproduktet inneholdende hele 5'-enden av AAV capsidet til også å inkluder rep sekvensene. I en utførelsesform tilsvarer P5 nt 108 til 133 av AAV2 [SEQ ID nr. 7] og tilsvarende sekvenser i de andre AAV serotyper og benyttes i forbindelse med P2 primeren.
Etter fullføring av det ønskede antall forlengelsestrinn blir de forskjellige forlengelses-produkter fusert idet man gjør bruk av signaturområdet som anker eller markør for å konstruere en intakt sekvens. I det her gitte eksempel oppnås det AAV sekvenser som som et minimum inneholder et intakt AAV cap gen. Større sekvenser kan oppnås, avhengig av antall forlengelsestrinn som gjennomføres.
Hensiktsmessig blir forlengelsesproduktene satt sammen til en intakt AAV sekvens ved bruk av metoder som er velkjente for fagmannen. For eksempel kan forlengelsesproduktene digesteres med DraUI som spalter ved DraUI setet lokalisert i signaturområdet, for å gi restriksjonsfragmenter som re-ligeres for å gi produkter som (som et minimum) inneholder et intakt AAV cap gen. Imidlertid kan andre egnede teknikker for å sette sammen forlengelsesproduktene til en intakt sekvens, benyttes. Det vises her generelt til Sambrook et al. supra.
Som et alternativ til de multiple forlengelsestrinn som er beskrevet ovenfor gir en annen utførelsesform av oppfinnelsen direkteforsterkning av et 3,1 kb fragment som tillater isolering av full-lengde sekvenser. For direkte å forsterke et 3,1 kb full-lengde cap fragment fra NHP vev- og -blod DNAer ble to andre sterkt konserverte områder identifisert i AAV genomer for bruk ved PCR forsterkning av store fragmenter. En primer innen et konservert område lokalisert i midten av rep genet benyttes (AVlns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt av SEQ ID nr. 6) i kombinasjon med 3' primeren lokalisert i et annet konservert område nedstrøms cap genet (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID nr. 7) for forsterkning av AAV sekvenser inkludert den angjeldende full-lengde AAV cap. Etter forsterkning blir produktene typisk klonet og sekvensanalyse gjennomført med en nøyaktighet på >99,9 %. Ved bruk av denne metode har foreliggende oppfinnere isolert minst 50 capsid kloner som deretter erkarakterisert. Blant disse ble 37 kloner avledet fra Rhesus macaque vev (rh.l - rh.37), 6 kloner fra cynomologe macaquer (cy.l - cy.6), 2 kloner fra bavianer (bb.l og bb.2) og 5 kloner fra sjimpanser (ch.l - ch.5). Disse kloner er identifisert annensteds i beskrivelsen sammen med dyrespesiene hvorfra de ble identifisert og ve-vene i det dyr der disse nye sekvenser ble lokalisert.
C. Alternativ metode for isolering av ny AAV
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en alternativ metode for å isolere nye AAV fra en celle. Denne metode involverer infeksjon av cellen med en vektor som tilveiebringer hjelperfunksjoner til den angjeldende AAV; isolering av infektiøse kloner inneholdende AAV; sekvensering av den isolerte AAV; og sammenligning av sekvensen av den isolerte AAV med kjente AAV serotyper hvorved forskjeller i sekvensene av de isolerte AAV- og kjente AAV serotyper indikerer nærværet av en ny AAV.
I en utførelsesform tilveiebringer vektoren som tilveiebringer hjelperfunksjonen essensielle adenovirusfunksjoner inkludert for eksempel Ela, Elb, E2a, E40RF6.1 en utfø-relsesform tilveiebringes disse hjelperfunksjoner av en adenovirus. Adenovirusen kan være en vill-type adenovirus og kan være av human eller ikke-human opprinnelse, fortrinnsvis av ikke-human primat (NHP) opprinnelse. DNA sekvensene av et antall ade-novirustyper er tilgjengelige fra Genbank inkludert type Ad5 [Genbank Aksess nr. M73260]. Adenovirussekvensene kan oppnås fra en hvilken som helst kjent adenovirus serotype som serotypene 2, 3, 4, 7, 12 og 40, og inkluderer videre en hvilken som helst av de til nu identifiserte humane typer, se for eksempel Horwitz supra. Tilsvarende adenoviruser som er kjente for å infisere ikke-humane dyr, for eksempel sjimpanser, kan også benyttes i vektorkonstruktene ifølge oppfinnelsen, se for eksempel US 6 083 716.1 tillegg til vill-type adenoviruser kan rekombinante vimser eller ikke-virale vektorer (for eksempel plasmider, episomer og så videre) som bærer de nødvendige hjelperfunksjoner, benyttes. Slike rekombinante vimser er velkjente i teknikken og kan fremstilles i henhold til offentliggjorte teknikker, se for eksempel US 5 871 982 og 6 251 677 som beskriver en hybrid Ad/AAV vims. Valget av adenovirus type er ikke ansett som begrensende for oppfinnelsen. Et antall adenovims stammer er tilgjengelige fra "American Type Culture Collection", Manassas, Virginia eller tilgjengelige på forespørsel fra et antall kommersielle og institusjonelle kilder. Videre er sekvensene for mange slike stammer tilgjengelige fra et antall databaser inkludert for eksempel PubMed og GenBank.
I et annet alternativ kan infektiøs AAV isoleres ved bmk av genom vandreteknologi (Siebert et al., 1995, "Nucleic Acid Research", 23:1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, "J. Biol. Chem." 261: 6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo, Alto, CA). Genomvandring er spesielt godt egnet for identifisering og isolering av sekvenser ved siden av de nye sekvenser som identifiseres ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte. For eksempel kan denne teknikk være brukbar for å isolere invertert terminal repeat (ITR'er) av den nye AAV serotype, basert på de nye AAV capsid- og/eller -rep sekvenser som er identifisert ved bruk av oppfinnelsens metoder. Denne teknikk er også brukbar for å isolere sekvenser ved siden av andre AAV- og ikke-AAV sekvenser som er identifisert og isolert ifølge oppfinnelsen, se eksemplene 3 og 4.
Metodene ifølge oppfinnelsen kan lett benyttes for et antall epidemiologiske studier, studier av biofordeling, overvåking av genterapi via AAV vektorer og vektorer avledet fra andre integrerte vimser. Således er metodene vel egnet for anvendelse i på forhånd pakkede sett for bruk av leger, forskere og epidemiologer.
n. Diagnosesett
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et diagnosesett for detektering av nærværet av en kjent eller ukjent adenoassosiert vims (AAV) i en prøve. Et slikt sett kan inneholde et første sett av 5'- og 3' PCR primere som er spesifikke for signaturområdet av AAV nukleinsyresekvensen. Alternativt eller i tillegg kan et slikt sett inneholde et første sett av 5'- og 3' PCR primere spesifikke for 3,1 kb fragmentet som inkluderer full-lengde AAV capsid nukleinsyresekvensen som er identifisert her (for eksempel AVlns- og AV2cas primerne). Eventuelt kan et sett ifølge oppfinnelsen videre inneholde to eller flere ytterligere sett av 5'- og 3' primere som beskrevet her, og/eller PCR prober. Disse primere og prober benyttes ifølge oppfinnelsen for å forsterke signaturområder av hver AAV serotype, for eksempel ved bmk av kvantitativ PCR.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre et sett som er brukbart for å identifisere en AAV serotype som er detektert i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte og/eller for å skille ny AAV fra kjent AAV. Et slikt sett kan videre inkludere ett eller flere restriksjonsen-zymer, standarder for AAV serotyper som tilveiebringer deres "signatur restriksjons enzym digesteringsanalyser" og/eller andre midler for å bestemme serotypen av den detekterte AAV.
I tillegg kan sett ifølge oppfinnelsen inkludere instmksjoner, en negativ og/eller positiv kontroll, beholdere, diluenter og buffere for prøven, indikatorkart for signatursammen-ligninger, engangshansker, dekontamineringsinstruksjoner, applikatorstifter eller beholdere, og prøvepreparatorlokk, så vel som hvilke som helst ønskede reagenser inkludert media, vaskereagenser og konsentrasjonsreagenser. Slike reagenser kan lett velges blant de som er beskrevet her og blant konvensjonelle konsentrasjonsreagenser. I en ønsket utførelsesform er vaskereagensen en isotonisk saltoppløsning som er bufret til fysiologisk pH-verdi, for eksempel fosfatbufret saltoppløsning (PBS), elueringsreagensen er PBS inneholdende 0,4 M NaCl og konsentrasjonsreagensen og innretninger. For eksempel vil fagmannen på området erkjenne at reagenser som polyetylenglykol (PEG) eller NH4SO4kan være brukbare, eller at innretninger som filterinnretninger, for eksempel en filterinnretning med en 100 K membran, vil konsentrere rAAV.
Settene som tilveiebringes ifølge oppfinnelsen er brukbare for å gjennomføre metodene som beskrevet her og for studering av biofordeling, epidemiologi, transmisjonsmodus for nye AAV serotyper i mennesker og NHP'er.
Således tillater metoden og settene ifølge oppfinnelsen detektering, identifisering og isolering av virale målsekvenser og særlig integrerte virale sekvenser. Metodene og settene er spesielt egnet for bruk ved detektering, identifisering og isolering av AAV sekvenser og som kan inkludere nye AAV serotyper.
I et spesielt eksempel lettet metoden ifølge oppfinnelsen analysen av AAV sekvenser som var klonet av oppfinnerne og som avdekket heterogenitet av provirale sekvenser mellom klonede fragmenter fra forskjellige dyr, alle distinkte fra de kjente seks AAV serotyper, med hovedandelen av variasjonen lokalisert til hypervariable områder av capsidproteinet. Overraskende divergens fra AAV sekvenser ble notert i kloner som var isolert fra enkle vevkilder som lymfeknuten, fra en individuell rhesus ape. Denne heterogenitet forklares best ved den åpenbare evolusjon av AAV sekvensen i det individuelle dyr som delvis skyldes ekstensiv, homolog rekombinering mellom et begrenset antall ko-infiserende parenterale vimser. Disse studier antyder sekvensevaluering av utstrakt disseminert vims under forløpet av en naturlig AAV infeksjon som antagelig fører til dannelse av svermer av kvasispesier som skiller seg fra hverandre i mønstere av capsid hypervariable områder. Dette er det første eksempel på hurtig molekular utvikling av en DNA vims på en måte som tidligere var antatt å være begrenset til RNA vimser.
Det tilveiebringes sekvenser av flere nye AAV serotyper som er identifisert ved metoden ifølge oppfinnelsen samt karakteriseringen av disse serotyper.
Ul. Nye AAV serotyper
A. Nukleinsyresekvenser
Nukleinsyresekvenser av nye AAV serotyper som var identifisert ved oppfinnelsens metode tilveiebringes her, se SEQ ID nr. 1, 9 - 59 samt 117 - 120 hvortil det vises. Det skal også vises til figur 1 og sekvenslistene.
For den nye serotype AAV7 tilveiebringes full-lengde sekvensene inkludert AAV5' ITR'ene, capsid, rep og AAV3' ITR'ene i SEQ ID nr. 1.
For andre nye AAV serotyper ifølge oppfinnelsen tilveiebringes det omtrent 3,1 kb store fragment som var isolert ifølge oppfinnelsens metode. Dette fragment inneholder sekvenser som koder full-lengde capsid protein eller hele eller en del av sekvensene som koder rep proteinet. Disse sekvenser inkluderer klonene som er identifisert nedenfor.
For ytterligere andre AAV serotyper tilveiebringes det signaturområdet som koder capsid proteinet. For eksempel inkluderer AAV10 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen de som er illustrert i figur 1 [se SEQ ID nr. 117 som spenner over 255 baser].
AAVl 1 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen inkluderer de DNA sekvenser som er illustrert i figur 1 [se SEQ ID nr. 118 som spenner over 258 baser]. AAV 12 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen inkluderer de DNA sekvenser som er illustrert i figur 1 [se SEQ ID nr. 19 som består av 258 baser]. Ved bruk av metodologien som beskrevet ovenfor kan videre AAV10-, AAVl 1- og AAV12-sekvensen lett identifiseres og anvendes for et antall formål inkludert det som er beskrevet for AAV7 og andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen.
Figur 1 tilveiebringer de ikke-human primat (NHP) AAV nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen i en innretning med alle tidligere publiserte AAV serotyper, AAVl [SEQ ID nr. 6], AAV2 [SEQ ID nr. 7] og AAV3 [SEQ ID nr. 8]. Disse nye NHP sekvenser inkluderer de som er gitt i den følgende tabell 1 og som er identifisert ved klon nr.:
En ny NHP klon ble tildannet ved å spleise capsidfragmenter fra to sjimpanseadenovi-rus til et AAV2 rep konstrukt. Den nye klon, A3,l, er også kalt Ch.5 [SEQ ID nr. 20]. I tillegg inkluderer oppfinnelsen to human AAV sekvenser kalt H6 [SEQ ID nr. 25] og H2 [SEQ ID nr. 26].
AAV nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen omfatter videre tråden som er komplementær til de tråder som tilveiebringes i sekvensen som gitt i figur 1 og i sekvenslistene [SEQ ID nr. 1,9- 59, 117 - 120], nukleinsyresekvenser så vel som RNA- og cDNA-sekvenser tilsvarende sekvensene som er gitt i figur 1 og sekvenslisten [SEQ ID nr. 1, 9 - 59, 117-120], og deres komplementære tråder. Videre inkludert i nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen er naturlige varianter og konstruerte modifikasjoner av sekvensene ifølge figur 1 og sekvenslistene [SEQ ID nr. 1,9- 59, 117-120] og deres komplementære tråder. Slike modifikasjoner inkluderer for eksempel merkelapper som er velkjente i teknikken, metylering, og substituering av en eller flere av de naturlig forekommende nukleotider med et degenerat nukleotid.
Videre inkludert i oppfinnelsen er nukleinsyresekvenser som er mer enn 85 %, fortrinnsvis minst rundt 90 % og aller helst minst rundt 95 %, spesielt minst rundt 98 til 99 % identiske eller homologe med sekvensene ifølge oppfinnelsen inkludert figur 1 og sekvenslisten [SEQ ID nr. 1, 9 - 59, 117-120]. Disse termer er som definert her.
Også inkludert i oppfinnelsen er fragmenter av de nye AAV sekvenser identifisert ved de her beskrevne metoder. Egnede fragmenter er minst 15 nukleotider lange og omfatter funksjonelle fragmenter, det vil si fragmenter som er av biologisk interesse. I en utførel-sesform er disse fragmenter slike av de nye sekvenser med figur 1 og sekvenslistene [SEQ ID nr. 1, 9 - 59, 117-120], deres komplementære tråder, cDNA og RNA som er komplementære dertil.
Eksempler på egnede fragmenter tilveiebringes med henblikk på lokasjonen av disse fragmenter på AAVl, AAV2 eller AAV7. Imidlertid kan fagmannen ved bruk av inn-retningene som her er gitt (oppnådd ved bruk av Clustal W programmet ved default innstilling), eller tilsvarende teknikker for å generere en innretning med andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen, lett identifisere de nøyaktige nukleotid start- og stopp-codoner for ønskede fragmenter.
Eksempler på egnede fragmenter inkluderer sekvensene som koder de tre variable proteiner (vp) av AAV capsidet som er alternative spleisevarianter: vpl [for eksempel nt 825 til 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1]; vp2 [for eksempel nt 1234 - 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1]; og vp3 [for eksempel nt 1434 - 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1]. Det er verdt å merke seg at AAV7 har en uvanlig GTG startcodon. Bortsett fra noen få hus-holdningsgener er en slik startcodon tidligere ikke rapportert i DNA vimser. Startcodonene for vpl, vp2 og vp3 for andre AAV serotyper er antatt å være slik at de tillater den cellulære mekanisme i vertscellen hvori de residerer å produser vpl, vp2 og vp3 i et forhold på henholdsvis 10 %: 10 %:80 %, for å tillate effektiv sammensetning av virionet. Imidlertid er AAV7 virionet funnet å sette seg sammen effektivt selv med denne sjeldne GTG startcodon. Således antar oppfinnerne at det er ønskelig å endre startcodonen for vp3 for andre AAV serotyper til å inneholde denne sjeldne GTG startcodon for å forbedre pakkingseffektiviteten, for å endre virionstrukturen og/eller for å endre lokasjonen av epitoper (for eksempel nøytraliserende antistoffepitoper) av andre AAV serotyper. Startcodonene kan endres ved bmk av konvensjonelle teknikker inkludert for eksempel seterettet mutagenese. Således omfatter foreliggende oppfinnelse endrede AAV virioner av en hvilken som helst valgt serotype, bestående av en vp3, og/eller eventuelt vpl og/eller vp2 med startcodoner endret til GTG.
Andre egnede fragmenter av AAV inkludert et fragment inneholdende startcodonen for AAV capsidproteinet [for eksempel nt 468 til 3090 av AAV7, SEQ ID nr. 1, nt 725 til
3090 av AAV7, SEQ ID nr. 1 og tilsvarende regioner av andre AAV serotyper]. Ytterligere andre fragmenter av AAV7 og de andre nye AAV serotyper som er identifisert ved bruk av de her beskrevne metoder inkluderer de som koder rep proteinene, inkludert rep 78 [for eksempel initialcodon 334 av figur 1 for AAV7], rep 68 [initialcodon nt 334 av
figur 1 for AAV7], rep 52 [initialcodon 1006 av figur 1 for AAV7] og rep 40 [initalco-don 1006 av figur 1 for AAV7]. Andre fragmenter av interesse kan inkludere de AAV5' inverterte terminalrepeat ITR'er [nt 1 til 107 av figur 1 for AAV7]; AAV3' ITR'er [nt 4704 til 4721 av figur 1 for AAV7], P19 sekvenser, AAV P40 sekvenser, rep bindings-sete og terminal resolutt sete (TRS). Ytterligere andre egnede fragmenter vil lett fremgå for fagmannen. De egnede områder i andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen kan lett bestemmes under henvisning til figur 1 eller ved å benytte konvensjonelle innretnings-teknikker med de sekvenser som her tilveiebringes.
I tillegg til å inkludere nukleinsyresekvensene som gis i figurene og sekvenslisten inkluderer oppfinnelsen nukleinsyremolekyler og sekvenser som er designert til å uttrykke aminosyresekvensene, proteinene og peptidene av AAV serotypene ifølge oppfinnelsen. Således inkluderer oppfinnelsen nukleinsyresekvenser som koder de følgende nye AAV aminosyresekvenser: Cl [SEQ ID nr. 60], C2 [SEQ ID nr. 61], C5 [SEQ ID nr. 62], A3-3 [SEQ ID nr. 66], A3-7 [SEQ ID nr. 67], A3-4 [SEQ ID nr. 68], A3-5 [SEQ ID nr. 69], 3.3b [SEQ ID nr. 62], 223.4 [SEQ ID nr. 73], 223-5 [SEQ ID nr. 74], 223-10 [SEQ ID nr. 75], 223-2 [SEQ ID nr. 76], 223-7 [SEQ ID nr. 77], 223-6 [SEQ ID nr. 78], 44-1 [SEQ ID nr. 79], 44-5 [SEQ ID nr. 80], 44-2 [SEQ ID nr. 81], 42-15 [SEQ ID nr. 84], 42-8 [SEQ ID nr. 85], 42-13 [SEQ ID nr. 86], 42-3A [SEQ ID nr. 87], 42-4 [SEQ ID nr. 88], 42-5A [SEQ ID nr. 89], 42-1B [SEQ ID nr. 90], 42-5B [SEQ ID nr. 91], 43-1 [SEQ ID nr. 92], 43-12 [SEQ ID nr. 93], 43-5 [SEQ ID nr. 94], 43-21 [SEQ ID nr. 96], 43-25 [SEQ ID nr. 97], 43-20 [SEQ ID nr. 99], 24,1 [SEQ ID nr. 101], 42,2 [SEQ ID nr. 102], 7,2 [SEQ ID nr. 103], 27,3 [SEQ ID nr. 104], 16,3 [SEQ ID nr. 105], 42,10 [SEQ ID nr. 106], 42-3B [SEQ ID nr. 107], 42-11 [SEQ ID nr. 108], Fl [SEQ ID nr. 109], F5 [SEQ ID nr. 110], F3 [SEQ ID nr. 111], 42-6B [SEQ ID nr. 112] og/eller 42-12 [SEQ ID nr. 113] og kunstige AAV serotyper som genereres ved bruk av disse sekvenser og/eller unike fragmenter derav.
Som benyttet her inkluderer kunstige AAV serotyper uten begrensning AAV med et ikke-naturlig forekommende capsid protein. Et slikt kunstig capsid kan generere ved en hvilken som helst egnet teknikk ved bruk av en ny AAV sekvens ifølge oppfinnelsen (for eksempel et fragment av et vpl capsid protein) i kombinasjon med heterologe sekvenser som kan oppnås fra en annen AAV serotype (kjent eller ny), ikke-kontigøse deler av den samme AAV serotype, fra en ikke-AAV viral kilde, eller fra en ikke-viral kilde. En kunstig AAV serotype kan uten begrensning være et kimerisk AAV capsid, et rekombinant AAV capsid eller et "humanisert" AAV capsid.
B. AAV aminosyresekvenser, proteiner og peptider
Oppfinnelsen tilveiebringer proteiner og fragmenter derav som kodes av nukleinsyresekvensen av de her identifiserte nye AAV serotyper inkludert for eksempel AAV7 [nt 825 til 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1], de andre nye serotyper som beskrevet her. Således kan capsidproteinene av de nye serotyper ifølge oppfinnelsen, inkludert: H6 [SEQ ID nr. 25], H2 [SEQ ID nr. 26], 42-2 [SEQ ID nr. 9], 42-8 [SEQ ID nr. 27], 42-15 [SEQ ID nr. 28], 42-5b [SEQ ID nr. 29], 42-lb [SEQ ID nr. 30], 42-13 [SEQ ID nr. 31], 42-3a [SEQ ID nr. 32], 42-4 [SEQ ID nr. 33], 42-5a [SEQ ID nr. 34], 42-10 [SEQ ID nr. 35], 42-3b [SEQ ID nr. 36], 42-11 [SEQ ID nr. 37], 42-6b [SEQ ID nr. 38], 43-1 [SEQ ID nr. 39], 43-5 [SEQ ID nr. 40], 43-12 [SEQ ID nr. 41], 43-20 [SEQ ID nr. 42], 43-21 [SEQ ID nr. 43], 43-23 [SEQ ID nr. 44], 43-25 [SEQ ID nr. 45], 44.1 [SEQ ID nr. 47], 44.5 [SEQ ID nr. 47], 223.10 [SEQ ID nr. 48], 223.2 [SEQ ID nr. 49], 223.4 [SEQ ID nr. 50], 223.5 [SEQ ID nr. 51], 223.6 [SEQ ID nr. 52], 223.7 [SEQ ID nr. 53], A3.4 [SEQ ID nr. 54], A3.5 [SEQ ID nr. 55], A3.7 [SEQ ID nr. 56], A3.3 [SEQ ID nr. 57], 42.12 [SEQ ID nr. 58] og 44.2 [SEQ ID nr. 59], lett genereres ved bruk av konvensjonelle teknikker fra de åpne leserammer som tilveiebringes for de ovenfor anførte kloner.
Oppfinnelsen omfatter videre AAV serotyper som er generert ved bruk av sekvenser av de nye AAV serotyper ifølge oppfinnelsen og som er generert ved bruk av syntetiske, rekombinante eller andre teknikker som velkjente for fagmannen. Oppfinnelsen er ikke begrenset til nye AAV aminosyresekvenser, peptider og proteiner som er uttrykt fra de nye AAV nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen og omfatter aminosyresekvenser, peptider og proteiner som er generert ved andre metoder som kjent i teknikken, inkludert for eksempel ved kjemisk syntese, eller ved andre syntetiske teknikker, eller ved andre metoder. For eksempel kan sekvensene av en hvilken som helst av Cl [SEQ ID nr. 60], C2 [SEQ ID nr. 61], C5 [SEQ Id nr. 62], A3-3 [SEQ ID nr. 66], A3-7 [SEQ ID nr. 67], A3-4 [SEQ ID nr. 68], A3-5 [SEQ ID nr. 69], 3.3b [SEQ ID nr. 62], 223.4 [SEQ ID nr.73], 223-5 [SEQ ID nr. 74], 223-10 [SEQ ID nr. 75], 223-2 [SEQ ID nr. 76], 223-7 [SEQ ID nr. 77], 223-6 [SEQ ID nr. 78], 44-1 [SEQ ID nr. 79], 44-5 [SEQ ID nr. 80], 44-2 [SEQ ID nr. 81], 42-15 [SEQ ID nr. 84], 42-8 [SEQ ID nr. 85], 42-13 [SEQ ID nr. 86], 42-3A [SEQ ID nr. 87], 42-4 [SEQ ID nr. 88], 42-5A [SEQ ID nr. 89], 42-1B [SEQ ID nr. 90], 42-5B [SEQ ID nr. 91], 43-1 [SEQ ID nr. 92], 43-12 [SEQ ID nr. 93], 43-5 [SEQ ID nr. 94], 43-21 [SEQ ID nr. 96], 43-25 [SEQ ID nr. 97], 43-20 [SEQ ID nr. 99], 24.1 [SEQ ID nr. 101], 42.2 [SEQ ID nr. 102], 7.2 [SEQ ID nr. 103], 27.3 [SEQ ID nr. 104], 16.3 [SEQ ID nr. 105], 42.10 [SEQ ID nr. 106], 42-3B [SEQ ID nr. 107], 42-11 [SEQ ID nr. 108], Fl [SEQ ID nr. 109], F5 [SEQ ID nr. 110], F3 [SEQ ID nr. 111], 42-6B [SEQ ID nr. 112], og/eller 42-12 [SEQ ID nr. 113] lett genereres ved bruk av et antall teknikker.
Egnede produksjonsteknikker er velkjente for fagfolk på området, se for eksempel Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativt kan peptider også syntetiseres ved den godt kjente fastfasepeptidsyntesemetode (Merrifield, "J. Am. Chem. Soc", 85:2149 (1962); Stewart og Young, "Solid PhasePeptide Synthesis" (Freeman, San Francisco, 1969),s. 27-62). Disse og andre egnede produksjonsmetoder ligger innenfor fagmannens kunn-skapsområde og er ingen begrensning av oppfinnelsen.
Spesielt ønskelige proteiner inkluderer AAV capsidproteinene som kodes av nukleotid-sekvensene som identifisert ovenfor. Sekvensene av mange av capsidproteinene ifølge oppfinnelsen er tilveiebragt i en innretning i figur 12 og/eller i sekvenslistene, SEQ ID nr. 2 og 60 til 115 hvortil det vises når det gjelder detaljer. AAV capsidet består av tre proteiner, vpl, vp2 og vp3, som er alternative spleisevarianter. Full-lengde sekvensen som tilveiebringes i disse figurer er den til vpl. Basert på nummereringen av AAV7 capsidet [SEQ ID nr. 2] spenner sekvensene av vp2 over aminosyre 138 - 737 av AAV7 og sekvensene av vp3 spenner over aminosyrene 203 - 737 av AAV7. Med denne informasjon kan fagmannen lett bestemme lokasjonen for vp2- og vp3-proteinene for de andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen.
Andre ønskelige proteiner og fragmenter av capsidproteinet inkluderer de konstante og variable områder, lokalisert mellom hypervariable områder (HPV) og sekvensene av HPV områdene selv. En algoritme utviklet for å bestemme arealer med sekvensdivergens i AAV2 har gitt 12 hypervariable områder (HVR) av hvilke 5 overlapper eller er del av de fire tidligere beskrevne variable områder, se Chiorini et al, "J. Virol", 73:1309-19 (1999), Rutledge et al, "J. Virol.", 72:309-319. Ved bruk av denne algoritme og/eller innretningsteknikkene som beskrevet her bestemmes HVR av de nye AAV serotyper. Med henblikk på numre av AAV2 vpl [SEQ ID nr. 70], er for eksempel HVR lokalisert som følger: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262-264, HVR4, aa 381-383, HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; ogHVR12, aa 705-719. Ved bruk av en innretning fremstilt i henhold til konvensjonelle metoder og de nye sekvenser som er gitt her, se for eksempel figur 2, kan man lett bestemme lokasjonen av denne HVR i de nye AAV serotyper ifølge oppfinnelsen. Ved bruk for eksempel av figur 2 kan man lett bestemme at for AAV7 [SEQ ID nr. 2] er HVRl lokalisert ved aa 146 - 152; er HVR2 lokalisert ved 182-187; er HVR3 lokalisert ved 263-266, er HVR4 lokalisert ved aa 383-385, er HVR5 lokalisert ved aa 451-475; er HVR6 lokalisert ved aa 491-496, er HVR7 lokalisert ved aa 501-505; er HVR8 lokalisert ved aa 513-521; er HVR9 lokalisert ved 533-554; er HVR10 lokalisert ved aa 583-596; er HVRl 1 lokalisert ved aa 660-669, er HVR12 lokalisert ved 707-721. Ved bruk av den her gitte informasjon kan HVR'ene for de andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen lett bestemmes.
I tillegg er, i capsidet, aminosyreidentitetskassettene identifisert. Disse kassetter er av spesiell interesse da de er brukbare ved konstruering av kunstige serotyper, for eksempel ved å erstatte en HVRl kassett av en valgt serotype med en HVRl kassett av en annen serotype. Visse av disse identitetskassetter er angitt i figur 2, se figur 2, som tilveiebringer Clustal X innretningen som har en lineal vist under sekvensen og som star-ter ved 1 for posisjonen for den første rest. Linjen over lineal en benyttes for å markere sterkt konserverte posisjoner. Tegnene (<*>, :,.) benyttes. "<*>" antyder posisjoner som har en enkelt, helt konservert rest.":" antyder at en "sterk" gruppe er helt bevart."." indikerer at en "svakere" gruppe er fullt konservert. Dette er alle positivt bedømmende grupper som opptrer i Gonnet Pam250 matrisen. De sterke grupper er definert som en sterk bedømmelse >0,5 og de svake grupper er definert som svak bedømmelse <0,5.
I tillegg inkluderer eksempler på andre egnede fragmenter av AAV capsider, med henblikk på nummerering av AAV2 [SEQ ID nr. 70], aa 24 - 42, aa 25- 28; aa 81 - 85; Aal33-165; aa 134 - 165; aa 137-143; aa 154-156; aa 194-208; aa 261-274; aa 262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581-601; aa 660-671; aa 709-723. Ytterligere andre ønskelige fragmenter inkluderer for eksempel, i AAV7, aminosyrene 1 til 184 av SEQ ID nr. 2, aminosyrene 199 til 259; aminosyrene 274 til 446; aminosyrene 603 til 659; aminosyrene 670 til 706; aminosyrene 724 til 736; aa 185 til 198; aa 260 til 273; aa 447 til 477; aa 495 til 602; aa 660 til 669; og aa 707 til 723. Ytterligere andre ønskelige områder, basert på nummereringen av AAV7 [SEQ ID nr. 2] er valgt fra gruppen bestående av aa 185 til 198; aa 260 til 273; aa 447 til 477; aa 495 til 602; aa 660 til 669; og aa 707 til 723. Ved bruk av innretningen som tilveiebragt her, oppnådd ved bruk av Clustal X programmet ved default innstillinger, eller ved bruk av andre kommersielt eller ålment tilgjengelige innretningsprogrammer ved default innstillinger, kan fagmannen lett bestemme tilsvarende fragmenter av de nye AAV capsider ifølge oppfinnelsen.
Andre ønskelige proteiner er AAV rep proteinene [aa 1 til623 av SEQ ID nr. 3 for AAV7] og funksjonelle fragmenter derav inkludert for eksempel aa 1 til 171, aa 172 til 372, aa 373 til 444, aa 445 til 623 av SEQ ID nr. 3, blant andre. Hensiktsmessig er disse fragmenter minst 8 aminosyrer lange, se figur 3. Sammenlignbare områder kan identifiseres i proteinene av andre nye AAVer ifølge oppfinnelsen ved bruk av de her beskrevne teknikker og de som er kjente i teknikken. I tillegg kan fragmenter av andre ønskede lengder lett benyttes. Slike fragmenter kan produseres rekombinant eller ved andre egnede midler, for eksempel kjemisk syntese.
Sekvensene, proteinene og fragmentene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på en hvilken som helst egnet måte inkludert rekombinantproduksjon, kjemisk syntese eller andre syntetiske midler. Slike produksjonsmetoder ligger innenfor fagmannens kunnskapsom-råde og er ingen begrensning av oppfinnelsen.
IV. Produksjon av rAAV med nye AAV capsider
Oppfinnelsen omfatter nye, vill-type AAV serotyper som er identifisert ifølge oppfinnelsen, der sekvensene av disse vill-type AAV serotyper er frie for DNA og/eller cellu-lært materiale som disse vimser er forbundet med i naturen. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen molekyler som benytter de nye AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen, inkludert fragmenter derav, for fremstilling av molekyler som er bmkbare ved avlevering av et heterologt gen eller andre nukleinsyresekvenser til en målcelle.
Molekylene ifølge oppfinnelsen som inneholder sekvenser av en ny AAV serotype iføl-ge oppfinnelsen inkluderer et hvilket som helst genetisk element (vektor) som kan avgis til en vertscelle, for eksempel naken DNA, et plasmid, en fag, en transposon, et cosmid, et episom, et protein i en ikke-viral avleveringsbærer (for eksempel en lipidbasert bærer), en vims og så videre som overfører sekvensen som bæres derpå. Den valgte vektor kan avleveres ved hjelp av en hvilken som helst egnet metode inkludert transfeksjon, elektroporering, liposomavlevering, membranfusjonsteknikker, høyhastighets DNA-belagte pellets, viralinfeksjon og protoplastfusjon. Metodene som benyttes for å konstruere enhver utførelsesform av oppfinnelsen er velkjente for fagmannen på nukleinsy-remanipulering og inkluderer genetisk konstruksjon, rekombinant konstruksjon og syn-teseteknikker, se for eksempel Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
I en utførelsesform inneholder vektorene ifølge oppfinnelsens sekvenser som koder et nytt AAV capsid ifølge oppfinnelsen (for eksempel AAV7 capsid, AAV 44-2 (rh.10), et AAV10 capsid, et AAVl 1 capsid, et AAV12 capsid), eller et fragment av et eller flere av disse AAV capsider. Alternativt kan vektorene selv inneholde capsidproteinet eller et fragment derav.
Eventuelt kan vektorene ifølge oppfinnelsen inneholde sekvenser som koder AAV rep proteiner. Slike rep sekvenser kan være fra den samme AAV serotype som tilveiebringer cap sekvensen. Alternativt tilveiebringer oppfinnelsen vektorer hvor rep sekvensen er fra en AAV serotype som skiller seg fra den som tilveiebringer cap sekvensene. I en utførelsesform blir rep- og cap-sekvensene uttrykt fra separate kilder (for eksempel separate vektorer, eller en vertscelle og en vektor). I en annen utførelsesform blir disse rep sekvenser uttrykt fra den samme kilde som cap sekvensene. I denne utførelsesform kan rep sekvensene fuseres i rammen til cap sekvensene av en forskjellig AAV serotype for å danne en kimer AAV vektor. Eventuelt kan vektorene ifølge oppfinnelsen videre inneholder et minigen omfattende et valgt transgen som er flankert av AAV5' ITR og
AAV3' ITR.
Således inneholder i en utførelsesform de her beskrevne vektorer nukleinsyresekvenser som koder et intakt AAV capsid som kan være fra en enkelt AAV serotype (for eksempel AAV7 eller en annen ny AVV). Alternativt inneholder disse vektorer sekvenser som koder kunstige capsider som inneholder ett eller fleres fragmenter av AAV7 (eller en annen ny AAV capsid) fusert til heterologe AAV- eller ikke-AAV capsidproteiner eller fragmenter derav. Disse kunstige capsidproteiner er valgt blant ikke-kontigøse deler av AAV7 (eller en annen ny AAV) capsid eller fra capsider av andre AAV serotyper. For eksempel kan det være ønskelig å modifisere de kodende områder av en eller flere av AAV vpl, for eksempel i ett eller flere av de hypervariable områder (det vil si HPV1-12), eller vp2 og/eller vp3.1 et annet eksempel kan det være ønskelig å endre startcodonen for vp3 proteinet til GTG. Disse modifikasjoner kan skje for å øke ekspresjon, utbytte og/eller forbedre rensing i de valgte ekspresjonssystemer, eller for et annet ønsket formål (for eksempel for å endre tropismen eller endre nøytraliseringsantistoffepito-pene).
Vektorene som beskrives her, for eksempel et plasmid, er brukbare for et antall formål men er spesielt godt egnet for bruk ved produksjon av en rAAV inneholdende et capsid omfattende AAV sekvenser eller et fragment derav. Disse vektorer, inkludert rAAV, deres elementer, konstruksjon og anvendelse er beskrevet i detalj her.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å generere en rekombinant, adenoassosiert virus (AAV) med et AAV serotype 7 (eller et annet nytt AAV) capsid, eller en del derav. En slik metode involverer dyrking av en vertscelle som inneholder en nukleinsyresekvens som koder et adenoassosiert virus (AAV) serotype 7 (eller et annen nytt AAV) capsid protein eller et fragment derav, som definert her; et funksjonelt rep gen; et minigen bestående minimum av AAV inverterte terminal repeater (ITR'er) og et transgen; og tilstrekkelig med hjelperfunksjoner til å tillate pakking av minigenet inn i AAV7 (eller et annet nytt AAV) capsid protein.
Komponentene som kreves for dyrking i vertscellen for pakking av et AAV minigen i et AAV capsid kan tilveiebringes i vertscellen in trans. Alternativt kan hvilke som helst en eller flere av de krevede komponenter (for eksempel minigen, rep sekvenser, cap sekvenser, og/eller hjelperfunksjoner) tilveiebringes av en stabil vertscelle som er konstruert til å inneholde en eller flere av de nødvendige komponenter ved bruk av i og for seg kjente metoder for fagmannen. Helst vil en slik stabil vertscelle inneholde den eller de krevede komponenter under kontroll av en induserbar promoter. Imidlertid kan den eller de krevede komponenter være under kontroll av en konstitutiv promoter. Eksempler på egnede induserbare og konstitutive promotere gis her i diskusjonen av regulatoriske elementer som er egnet for bruk med transgenet. I nok et alternativ kan en valgt, stabil vertscelle inneholde en eller flere valgte komponenter under kontroll av en konstitutiv promoter og en eller flere andre valgte komponenter under kontroll av en eller flere induserbare promotere. For eksempel kan en stabil vertscelle genereres avledet fra 293 celler (som inneholder El hjelperfunksjoner under kontroll av en konstitutiv promoter), men som inneholder rep- og/eller cap proteinene under kontroll av induserbare promotere. Ytterligere andre stabile vertsceller kan genereres av fagmannen på området.
Minigenet, rep sekvensene, cap sekvensene og hjelperfunksj onene som er nødvendige for å produsere oppfinnelsens rAAV kan avleveres til den pakkende vertscelle i form av et hvilket som helst genetisk element som overfører sekvensene som bæres derpå. Det valgte, genetiske element kan avleveres ved en hvilken som helst egnet metode inkludert de som er beskrevet her. Metodene som benyttes for å konstruere en hvilken som helst utførelsesform av oppfinnelsen er velkjente for fagmannen på området nukleinsy-remanipulering og inkluderer genetisk konstruksjon, rekombinant konstruksjon og syntetiske teknikker, se for eksempel Sambrook et al. i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. På tilsvarende måte er metoder for generering av rAAV virioner velkjent og valget av en egnet metode er ingen begrensning for oppfinnelsen, se for eksempel K. Fisher et al. i "J. Virol.", 70:520-532 (1993) samt US 5 478 745.
A. Minigen
Minigenet består minimum av et transgen og dettes regulatoriske sekvenser, og 5'- og 3' AAV inverterte terminal repeater (ITR'er). Det er dette minigen som pakkes inn i et capsidprotein og avgis til en valgt vertscelle.
1. Transgen
Transgenet er en nukleinsyresekvens, heterolog til vektorsekvensene som flankerer transgenet, som koder et polypeptid, et protein eller et annet produkt av interesse. Den nukleinsyrekodende sekvens er operativt forbundet med regulatoriske komponenter på en måte som tillater transgen transkripsjon, translasjon og/eller ekspresjon i en vertscelle.
Sammensetningen av transgensekvensen vil avhenge av den anvendelse den resulterende vektor vil brukes for. For eksempel inkluderer en type transgensekvens en rapportør-sekvens som ved ekspresjon produserer et detekterbart signal. Slike rapportørsekvenser inkluderer uten begrensning DNA sekvenser som koder fJ-laktamase, P-galaktosidase
(LacZ), alkalisk fosfatase, tymidinkinase, grønt fluorescent protein (GFP), kloramfeni-kol acetyltransferase (CAT), luciferase, membranbundne proteiner inkludert for eksempel CD2, CD4, CD8, influensa hemagglutininproteinet, og andre som er velkjente i teknikken, til hvilke det foreligger høyaffinitetsantistoff rettet mot det eller kan produseres ved konvensjonelle midler, og fusjonsproteiner omfattende et membranbundet protein
som på egnet måte er fusert til et anti-gen tag domene fra blant annet hemagglutinin eller Mye.
Disse kodende sekvenser, assosiert med regulatoriske elementer som driver deres ekspresjon, gir signaler som er detekterbare ved konvensjonelle midler inkludert enzyma-tiske, radiografiske, kolorimetriske, fluoressens- eller andre spektrografiske analyser, fluorescentaktiverende cellesorteringsanalyser og immunologiske analyser, inkludert enzymlinket immunoabsorbentanalyse (ELISA), radioimmunoanalyse (RIA) og im-munohistokjemi. Der for eksempel markørsekvensen er LacZ genet blir nærværet av vektoren som bærer signalet detektert ved analyser på P-galaktosidaseaktivitet. Der transgenet er grønt fluorescent protein eller luciferase kan vektoren som bærer signalet måles visuelt ved farve- eller lysproduksjon i et luminometer.
Imidlertid er transgenet helst en ikke-markør sekvens som koder et produkt som er brukbart i biologi og medisin som proteiner, peptider, RNA, enzymer, eller katalytiske RNA'er. Øskede RNA molekyler inkluderer tRNA, dsRNA, ribosomal RNA, katalytiske RNA'er og antisense RNA'er. Et eksempel på en brukbar RNA sekvens er en sekvens som sletter ekspresjon av en innsiktet nukleinsyresekvens i det behandlede dyr.
Transgenet kan benyttes for å korrigere eller forbedre gendefekt og som kan inkludere defekter der normale gener uttrykkes i mindre enn normale nivåer eller defekter der det funksjonelle genprodukt ikke uttrykkes. En foretrukken type transgensekvenser koder et terapeutisk protein eller et polypeptid som uttrykkes i en vertscelle. Oppfinnelsen inkluderer videre bruken av multiple transgener, for eksempel for å korrigere eller forbedre en gendefekt forårsaket av et multisubenhetprotein. I visse situasjoner kan et forskjellig transgen benyttes for å kode hver subenhet av et protein, eller for å kode forskjellige peptider eller proteiner. Dette er ønskelig når størrelsen av det DNA som koder protein-subenheten er stor, for eksempel for et immunoglobulin, den plateavledede vekstfaktor, eller et dystrofint protein. For at cellen skal produsere multisubenhetproteinet blir cellen fisert med den rekombinante virus inneholdende hver av de forskjellige subenheter. Alternativt kan forskjellige subenheter av et protein kodes av det samme transgen. I dette tilfelle inkluderer et enkelt transgen det DNA som koder hver av subenhetene med DNA for hver subenhet separert av et indre ribozym inngangssete (IRES). Det er ønskelig når størrelsen for det DNA som koder hver av subenhetene er liten, for eksempel at den totale størrelse for det DNA som koder subenhetene og IRES er mindre enn fem kilobaser. Som et alternativ til en IRES kan det angjeldende DNA være separert av sekvenser som koder et 2A peptid, som er selvspaltende i et post-translasjonelt evenement, se for eksempel M L. Donnelly et al. i "J. Gen. Virol.", 78(Pt 1): 13-21 (Jan 1997); S Furier et al. i "Gene Ther.", 8(ll):864-873 (Juni 2001); H Klump et al. i "Gene Ther.", 8(10:811-817 (Mai 2001). Dette 2A peptid er signifikant mindre enn en IRES, noe som gjør det velegnet for bruk når rommet er en begrensende faktor. Imidlertid kan det valgte transgen kode et hvilket som helst, biologisk aktivt produkt eller et annet produkt, for eksempel et produkt som er ønskelig for studier.
Egnede transgener kan lett velges av fagmannen på området. Valget av transgen er ikke ansett som en begrensende faktor for oppfinnelsen.
2. Regulatoriske elementer
I tillegg til hovedelementene som er identifisert ovenfor for minigenet inkluderer vektoren også nødvendige, konvensjonelle kontrollelementer som operativt er forbundet til transgenet på en måte som tillater dets transkripsjon, translasjon og/eller ekspresjon i en celle som er transfektert med plasmidvektoren eller infisert med virusen som produseres ifølge oppfinnelsen. Som benyttet her inkluderer "operativt forbundne" sekvenser både ekspresjonskontrollsekvenser som er tilstøtende genet av interesse og ekspresjonskontrollsekvenser som virker in trans eller i en avstand for å kontrollere genet av interesse.
Ekspresjonskontroll sekvenser inkluderer egnede transkripsjonsinitierings-, -terminerings-, promoter- og enhancersekvenser; effektive RNA prosesseringssignaler som spleise- og polyadenylerings (poly A) signaler, sekvenser som stabiliserer cyto-plasmiske mRNA; sekvenser som forbedrer translasjonseffektiviteten (det vil si Kozak konsensus sekvens); sekvenser som forbedrer proteinstabiliteten; og, hvis ønskelig, sekvenser som forbedrer sekresjonen av det kodede produkt. Et stort antall ekspresjonskontroll sekvenser, inkludert promotere som er native, konstitutive, induserbare og/eller vevspesifikke, er velkjente i teknikken og kan benyttes.
Eksempler på konstitutive promotere inkluderer, uten begrensning, den retrovirale Rous sarkoma virus (RSV) LTR promoter (eventuelt med RSV enhanceren), cytomegalovirus (CMV) promoteren (eventuelt med CMV enhanceren), [se for eksempel Boshart et al. i "Cell", 41:521-530 (1985)], SV40 promoteren, dihydrofolatreduktasepromoteren, p-aktivpromoteren, fosfoglycerol kinase (PGK) promoteren, og EF la promoteren [Invitrogen].
Induserbare promotere tillater regulering av genekspresjon og kan reguleres ved eksogent tilførte forbindelser, miljøfaktorer som temperatur, eller nærværet av en spesifikk fysiologisk tilstand, for eksempel akuttfase, en spesiell differensieringstilstand for cellen, eller kun i replikerende celler. Induserbare promotere og induserbare systemer er tilgjengelige fra et antall kommersielle kilder inkludert, uten begrensning, Invitrogen, Clontech og Ariad. Mange andre systemer er beskrevet og kan lett velges av fagmannen. Eksempler på induserbare promotere som reguleres av eksogent tilførte promotere inkluderer den sinkinduserbare saue metallotionin (MT) promoter, den deksametason (Dex)-induserbare musebrysttumorvirus (MMTV) promoter, T7 polymerase promoter system [WO 98/10088]; ekdyson insektpromoteren [No et al. "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 93:3346-3351 (1996)], det tetracyklinrepresserbare system [Gossen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 89:5547-5551] (1992)], det tetracyklininduserbare system [Gossen et al. "Science", 268:1766-1769 (1995), se også Harvey et al. "Curr. Opin. Chem. Biol.", 2:512-518 (1998)], det RU486-induserbare system [Wang et al., "Nat. Biotech.", 15:239-243 (1997) og Wang et al., "Gene Ther.", 4:432-441 (1997)] og det rapamycin-induserbare system [Magari et al., "J. Clin. Invest", 100:2865-2872 (1997)]. Ytterligere andre typer av induserbare promotere som kan være brukbare i denne kontekst er de som reguleres av en spesifikk, fysiologisk tilstand, for eksempel temperatur, akuttfase, en spesiell differensieringstilstand hos cellen eller kun i replikerende celler.
I en annen utførelsesformer vil man benytte den native promoter for transgenet. Den native promoter kan være foretrukket når det er ønskelig at ekspresjonen av transgen
etterligner den native ekspresjon. Den native promoter kan benyttes når ekspresjonen av transgenet må reguleres temporært eller utviklingsmessig, eller i en vevspesifikk modus, eller som respons på spesifikke transkripsjonelle stimuli. I en ytterligere utførelsesform kan andre native ekspresjonskontrollelementer som enhancerelementer, polyadenyle-ringsseter eller Kozak konsensus sekvenser også benyttes for å etterligne den native ekspresjon.
En annen utførelsesform av transgenet inkluderer et transgen som operativt er forbundet med en vevspesfikk promoter. Hvis det for eksempel er ønskelig med ekspresjon i ge-lettmuskelen bør det benyttes en promoter som er aktiv i muskler. Disse inkluderer promotere fra gener som koder skjelett P-aktin, myosin lettkjedet 2A, dystofin, muskel - kreatin kinase, så vel som syntetiske muskelpromotere som aktiverer høyere enn naturlig forekommende promotere, (se Li et al. i "Nat. Biotech.", 17:241-245 (1999)). Eksempler på promotere som er vevspesifikke er kjente for leveren (albumin, Miyatake et al. i "J. Virol.", 71:5124-32 (1997); hepatitt B virus kjernepromoter, Sandig et al. i "Ge-ne Ther.", 3:1002-9 (1996); a-fetoprotein (AFP); Arbuthnot et al. i "Hum. Gene Ther.", 7:1503-14 (1996)), benosteokalcin (Stein et al. i "Mol. Biol. Rep." 24:185-96 (1997)), bensialoprotein (Chen et al. i "J. Bone Miner. Res.", 11:654-64 (1996)), lymfocytter (CD2, Hansal et al. i "J. Immunol.", 161:1063-8 (1998), immunoglobulin tungkjede; T celle receptor a kjede), neuronal som neuron-spesifikk enolase (NSE) promoter (Ander- sen et al. i "Cell. Mol. Neurobiol.", 13:503-15 (1993)), neurofilament lett-kjede gen (Piccioli et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 88:5611-5 (1991)) og det neuro-spesifikke vgf gen (Piccioli et al. i "Neuron", 15:373-84 (1995)), blant andre.
Eventuelt kan plasmider som bærer terapeutisk brukbare transgener også inkludere valgbare markører eller rapportørgener kan inkludere sekvenser som koder geneticin-, hygromicin- eller purimycinresistens, blant andre. Slike valgbare rapportører eller mar-kørgener (fortrinnsvis lokalisert utenfor det virale genom som skal tilveiebringes via oppfinnelsens metode) kan benyttes for å signalisere nærværet av plasmidene i bakterieceller, som ampicillinresistens. Andre komponenter av plasmidet kan inkludere en replikasjonsopprinnelse. Valget av disse og andre promotere og vektorelementer er konvensjonelle og mange slike sekvenser er tilgjengelige, se for eksempel Sambrook et al. og de deri angitte referanser.
Kombinasjonen av transgenet, promoter/enhancer, og 5'- og 3' ITR'ene angis som et "minigen" for hensiktsmessighetens skyld i foreliggende beskrivelse. Tilveiebragt sammen med læren ifølge oppfinnelsen vil konstruksjonen av et slikt minigen lett kunne foretas ved å ty til konvensjonelle teknikker.
3. Avlevering av minigenet til en pakkende vertscelle
Minigenet kan bæres på en hvilken som helst egnet vektor, for eksempel et plasmid, som avgis til en vertscelle. Plasmider som er brukbare ifølge oppfinnelsen kan konstrueres slik at de er egnet for replikasjon og eventuelt integrasjon i prokaryotiske celler, pattedyrceller eller begge deler. Disse plasmider (eller andre vektorer som bærer de 5' AAV ITR-heterolog molekyl-3' ITR) inneholder sekvenser som tillater replikasjon av minigenet i eukaryoter og/eller prokaryoter og seleksjonsmarkører for disse systemer. Valgbare markører eller rapportørgener kan inkludere sekvenser som koder genetisin-, hygromicin- eller purimycinresistens, blant andre. Plasmidene kan også inneholde visse valgbare rapportører eller markørgener som kan benyttes for å signalisere nærværet av vektoren i bakterieceller, som ampicillinresistens. Andre komponenter av plasmidet kan inkludere en replikasjonsopprinnelse og et amplikon, for eksempel det amplikonsystem som benytter Epstein Barr virus nukleær antigenet. Dette amplikon system, eller andre tilsvarende amplikon komponenter, tillater høy kopi episomal replikasjon i cellene. Fortrinnsvis blir molekylet som bærer minigenet transfektert inn i cellen der det kan eksistere transient. Alternativt kan minigenet (som bærer den angjeldende 5' AAV ITR-heterologmolekyl-3' ITR) stabilt være integrert i genomet av vertscellen, enten kromo-somalt eller som et episom. I visse utførelsesformer kan minigenet være til stede i mul tiple kopier, eventuelt i hode-mot-hode-, hode-mot-hale- eller hale-mot-hale kontakta-merer. Egnede transfeksjonsteknikker er velkjente og kan lett benyttes for å avgi minigenet til vertscellen.
Ved avlevering av vektoren omfattende minigenet ved transfeksjon blir generelt vektoren avgitt i en mengde fra rundt 5 ug til rundt 100 ug DNA og fortrinnsvis rundt 10 til rundt 50 ug DNA til rundt 1 x IO<4>celler til rundt 1 x IO13 celler og fortrinnsvis rundt 10<5>celler. Imidlertid kan de relative mengder av vektor DNA i forhold til vertsceller justeres, tatt i betraktning faktorer som valgt vektor, avleveringsmetode og de valgte vertsceller.
B. Rep- og Cap sekvenser
I tillegg til minigenet inneholder vertscellen de sekvenser som driver ekspresjonen av det nye AAV capsid protein (for eksempel AAV7- eller annet nytt AAV capsid eller et kunstig capsid protein omfattende et fragment av ett eller flere av disse capsider) i vertscellen og rep sekvenser av den samme serotype som serotypen av de AAV ITRer som ble funnet i minigenet. AAV cap- og -rep sekvensene kan uavhengig oppnås fra en AAV kilde som beskrevet ovenfor og kan innføres i vertscellen på en hvilken som helst kjent måte for fagmannen som beskrevet ovenfor. I tillegg og ved pseudotyping av et nytt AAV capsid ifølge oppfinnelsen kan sekvensene som koder hvert av de essensielle rep proteiner suppleres med den samme AAV serotype, eller sekvensene som koder rep proteinene kan suppleres med forskjellige AAV serotyper (for eksempel AAVl, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 eller en av de nye serotyper som er identifisert her). For eksempel kan rep78/68 sekvensene være fra AAV2 mens rep52/40 sekvensene kan være fra AAVl.
I en utførelsesform inneholder vertscellen stabilt capsidprotein under kontroll av en egnet promoter, for eksempel de som er beskrevet ovenfor. Aller helst og i denne utførel-sesform uttrykkes capsidproteinet under kontroll av en induserbar promoter. I en annen utførelsesform bringes capsidproteinet til veie til vertscellen in trans. Avgitt til vertscellen in trans kan capsidproteinet avgis via et plasmid som inneholder se sekvenser som er nødvendige for å styre ekspresjonen av det valgte capsidprotein i vertscellen. Helst bærer plasmidet som bærer capsidproteinet, når det avgis til vertscellen in trans, også andre sekvenser som er nødvendige for pakking av den angjeldende rAAV, for eksempel rep sekvensene.
I en annen utførelsesform inneholder vertscellen stabilt rep sekvensene under kontroll av en egnet promoter som de som er beskrevet ovenfor. Helst blir de essensielle rep proteiner, i denne utførelsesform, uttrykt under kontroll av en induserbar promoter. I en annen utførelsesform tilveiebringes rep proteinene til vertscellene in trans. Avgitt til vertscellen in trans kan rep proteinene avlevers via et plasmid som inneholder de sekvenser som er nødvendige for å styre ekspresjonen av de valgte rep proteiner i vertscellen. Aller helst bærer plasmidet som bærer capsidet, når det avgis til vertscellen in trans, også andre sekvenser som er nødvendige for å pakke den angjeldende rAAV, for eksempel rep- og cap sekvensene.
I en utførelsesform kan således rep- og cap-sekvensene transfekteres inn i vertscellen på et enkelt nukleinsyremolekyl og eksistere stabilt i cellen som et episom. I en annen utfø-relsesform blir rep- og cap sekvensene stabilt integrert inn i genomet av cellen. En annen utførelsesform har rep- og trans sekvensene transient uttrykt i vertscellen. For eksempel omfatter et brukbart nukleinsyremolekyl for slik transfeksjon, fra 5' til 3', en promoter, en eventuell spacer anordnet mellom promoteren og startsetet for rep gen sekvensen, en AAV rep gen sekvens, og en AAV cap gen sekvens.
Eventuelt kan rep- og/eller cap sekvensene tilveiebringes på en vektor som inneholder andre DNA sekvenser som skal innføres i vertscellen. For eksempel kan vektoren inneholde rAAV konstruktet omfattende minigenet. Vektoren kan omfatte ett eller flere gener som koder hjelperfunksjonene, for eksempel de adenovirale proteiner El, E2a, og E40RF6, og genet for VAI RNA.
Fortrinnsvis kan promoteren som brukes i dette konstrukt være en hvilken som helst av de konstitutive, induserbare eller native promotere som er velkjente for fagmannen på området eller som diskutert ovenfor. I en utførelsesform benyttes en AAV P5 promoter sekvens. Valget av AAVen for å tilveiebringe en hvilken som helst av disse sekvenser er ikke en begrensning for oppfinnelsen.
I en annen foretrukken utførelsesform er promoteren for rep en induserbar promoter som diskutert ovenfor i forbindelse med de transgenregulatoriske elementer. En foretrukken promoter for repekspresjon er T7 promoteren. Vektoren omfattende rep genet som reguleres av T7 promoteren og cap genet transfekteres eller transformeres inn i en celle som enten konstitutivt eller induserbart uttrykker T7 polymerasen, se WO 98/10088, publisert 12. mars 1998.
Spaceren er et eventuelt element i konstruksjonen av vektoren. Spaceren er en DNA sekvens som er anbragt mellom promoteren og rep genet ATG startsete. Spaceren kan ha en hvilken som helst ønsket konstruksjon, det vil si at den kan være en vilkårlig sekvens av nukleotider eller kan eventuelt kode et genprodukt, for eksempel et markørgen. Spaceren kan inneholde gener som typisk inkorporerer start/stopp- og polyA seter. Spaceren kan være en ikke-kodende DNA sekvens fra en prokaryot eller en eukaryot, en repetitiv ikke-kodende sekvens, en kodende sekvens uten transkripsjonene kontroller eller en kodende sekvens med transkripsjonene kontroller. To eksempelkilder for spa-cersekvensen er a fag stigesekvens eller gjærstigesekvensen, som er kommersielt tilgjengelige, for eksempel blant annet fra Gibco eller Invitrogen. Spaceren kan være av en hvilken som helst størrelse tilstrekkelig til å redusere ekspresjonen av rep78- og rep68 genproduktene og etterlate rep52-, rep40- og cap gen produktene uttrykt i normale nivåer. Lengden av spaceren kan derfor ligge fra rundt 10 bp til rundt 10,0 kbp, fortrinnsvis i ormådet rundt lOObp til rundt 8,0 kbp. For å redusere muligheten for rekom-binasjon har spaceren fortrinnsvis en lengde kortere enn 2 kbp, imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset av dette.
Selv o molekylet eller molekylene som tilveiebringer rep og cap kan eksistere i vertscellen transient (det vil si ved transfeksjon), er det foretrukket at en eller begge av rep- og cap proteinene og promoteren eller promoterne som kontrollerer deres ekspresjon, stabilt uttrykkes i vertscellen, for eksempel som et episom eller ved integrering i kromo-somet av vertscellen. Metodene som benyttes for å konstruere utførelsesformer av oppfinnelsen er konvensjonelle genetiske konstruksjons- eller rekombinante konstruksjons-teknikker som de som er beskrevet i referansene ovenfor. Mens foreliggende beskrivelse gir illustrerende eksempler på de spesifikke konstrukter vil fagmannen ved bruk av den her gitte informasjon kunne velge å konstruere hvilke som helst andre egnede konstrukter ved bruk av et utvalg av spacere, P5 promotere og andre elementer, inkludert minst ett translasjonelt start- og stoppsignal, og den eventuelle addisjon av polyadenylerings-seter.
I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan rep- eller cap proteinet tilveiebringes stabilt av en vertscelle.
C. Hjelperfunksjoner
Den pakkende vertscelle krever også hjelperfunksjoner for å pakke oppfinnelsens rAAV. Disse funksjoner kan eventuelt leveres av en herpesvirus. Helst blir de nødven-dige hjelperfunksjoner alle tilveiebragt fra en human eller ikke-human primatadenovi- ruskilde som de som er beskrevet ovenfor og/eller som er tilgjengelige fra et antall kilder inkludert "American Type Culture Collection" (ATCC), Manassas, VA (US). I en i dag foretrukken utførelsesform tilveiebringes vertscellen med og/eller inneholder et Ela genprodukt, et Elb genprodukt, et E2a genprodukt og/eller et E4 ORF6 genprodukt. Vertscellen kan inneholde andre adenovirale gener som VAI RNA men disse gener er ikke nødvendige. I en foretrukken utførelsesform er ingen andre adenovirusgener eller
-genfunksj oner til stede i vertscellen.
Med "adenoviral DNA som uttrykker Ela genproduktet" menes en hvilken som helst adenovirussekvens som koder Ela eller en hvilken som helst funksjonell Ela del. Adenoviral DNA som uttrykker E2a genprodukt og adenoviral DNA som uttrykker E4 ORF6 genprodukt defineres på tilsvarende måte. Også inkludert er hvilke som helst alleler eller andre modifikasjoner av det adenovirale gen eller funksjonelle deler derav. Slike modifikasjoner kan med hensikt innføres ved å ty til konvensjonelle genetiske konstruksjons- eller mutagene teknikker for å øke den adenovirale funksjon på en eller annen måte så vel som naturlig forekommende allelvarianter derav. Slike modifikasjoner og metoder for å manipulere DNA for å oppå disse adenovirusgenfunksjoner er velkjente for fagmannen.
Adenovirus Ela-, -Elb-, -E2a- og/eller E40RF6 genprodukt, såvel som hvilke som helst andre ønskede hjelperfunksjoner, kan tilveiebringes på en hvilken som helst måte som tillater deres ekspresjon i en celle. Hver av sekvensene som koder disse produkter kan være på en separat vektor, eller et eller flere gener kan være på samme vektor. Vektoren kan være en hvilken som helst vektor som er kjent i teknikken eller beskrevet her inkludert plasmider, kosmider og vimser. Innføring i vertscellen av vektoren kan oppnås på en hvilken som helst kjent måte i teknikken eller som beskrevet ovenfor, inkludert transfeksjon, infeksjon, elektroporasjon, liposomavlevering, membranfusjonsteknikker, høyhastighets DNA-belagte pellets, viralinfeksjon og protoplastfusjon blant andre. Ett eller flere av de adenovirale gener kan stabilt være integrert i genomet av vertscellen, stabilt uttrykkes som episomer eller uttrykkes transient. Genproduktene kan alle uttrykkes transient, på et episom eller integreres stabilt, eller noen av genproduktene kan uttrykkes stabilt mens andre uttrykkes transient. Videre kan promoterne for hvert av de adenovirale gener velges uavhengig fra en konstitutiv promoter, en induserbar promoter eller en nativ adenoviral promoter. Disse promotere kan reguleres via en spesifikk, fysiologisk tilstand hos organismen eller cellen (for eksempel ved differensieringstilstan-der eller i replikerende eller hvilende celler) eller ved eksogent tilsatte faktorer, som eksempler.
D. Vertsceller og pakkende cellelinjer
Vertscellen kan per se være valgt fra en hvilken som helst biologisk organisme inkludert prokaryotiske (for eksempel bakterielle) celler, og eukaryotiske celler inkludert insekt-, gjær- og pattedyrceller. Spesielt ønskelige vertsceller er valgt blant hvilke som helst pattedyrceller inkludert, uten begrensning, celler som A549-, WEFfl-, 3T3-, 10T1/2-, BHK-, MDCK-, COS 1-, COS 7-, BSC 1-, BSC 40-, BMT 10-, VERO-, WI38- HeLa-eller 293 celler (som uttrykker funksjonell adenoviral El), Saos-, C2C12- eller L-celler, HT1080-, HepG2- og primær fibroblast-, hepatocyt- og myoblastceller avledet fra pattedyr inkludert mennesker, aper, mus, rotter, kaniner og hamstere. Valget av en patte-dyrspesie for å tilveiebringe cellene er ingen begrensning av oppfinnelsen og heller ikke er typen pattedyrceller det, for eksempel fibroblast-, hepatocyt-, tumorceller og så videre. De mest ønskede celler bærer ingen adenovirusgener andre enn El, E2a og/eller E4 ORF6; heller ikke inneholder de noen andre virusgener som kunne resultere i homolog rekombinering av en kontaminerende virus under produksjonen av rAAV; og den er i stand til infeksjon eller transfeksjon av DNA og ekspresjon av den transfekterte DNA. I en foretrukken utførelsesform er vertscellen en som har rep og cap stabilt transfektert i cellen.
En vertscelle som er brukbar ifølge oppfinnelsen er en vertscelle som stabilt er transformert med sekvensene som koder rep og cap og som er transfektert med den angjeldende adenovirus El-, -E2a- og -E40RF6 DNA og et konstrukt som bærer minigenet som beskrevet ovenfor. Stabile rep- og/eller cap uttrykkende cellelinjer som B-50
(PCT/US98)19463) og de som er beskrevet i US 5 658 785, kan også benyttes på tilsvarende måte. Andre ønskelige vertsceller inneholder den minimale adenovirale DNA som er tilstrekkelig til å uttrykke E4 ORF6. Ytterligere andre cellelinjer kan konstrueres ved bruk av de nye AAV rep- og/eller nye AAV cap sekvenser ifølge oppfinnelsen.
Fremstillingen av en vertscelle ifølge oppfinnelsen involverer teknikker som sammensetning av valgte DNA sekvenser. Denne sammensetning kan gjennomføres ved å benytte konvensjonelle teknikker. Slike teknikker inkluderer cDNA- og genomiske kloner, noe som er velkjent for fagmannen og beskrevet av Sambrook et al. supra, ved bruk av overlappende oligonukleotidsekvenser av adenovirusen og AAV genomene, kombinert med polymerasekjedereaksjon, syntetiske metoder og hvilke som helst andre egnede metoder som gir de ønskede nukleotidsekvenser.
Innføring av molekylene (som plasmider eller vimser) i vertscellen kan også gjennom-føres ved bmk av teknikker som er kjente for fagmannen og som diskutert i foreliggende beskrivelse. I en foretrukken utførelsesform benyttes det standard transfeksjonsteknikker, for eksempel CaPC^transfeksjon eller elektroporering, og/eller infeksjon ved hybrid adenovims/AAV vektorer inn i cellelinjene som den humane embryoniske nyrecellelinje HEK 293 (en human nyrecellelinje inneholdende funksjonelle adenovims El gener som gir transvirkende El proteiner).
Disse nye AAV-baserte vektorer som genereres av fagmannen på området er fordelakti-ge for genavlevering til valgte vertsceller og genterapipasienter fordi ingen nøytralise-rende antistoffer til AAV7 er funnet i den humane populasjon. Videre viser tidlige studier ingen nøytraliserende antistoffer i cyno ape- eller sjimpansepopulasjoner og mindre enn 15 % kryss-reaktivitet av AAV7 i rhesus aper, spesiene hvorfra serotypen ble isolert. Fagmannen på området kan lett fremstille andre rAAV virale vektorer inneholdende AAV7 capsidproteinene som tilveiebringes der ved bmk av et antall teknikker som er velkjente for fagmannen. Man kan ganske enkelt fremstille ytterligere andre rAAV virale vektorer inneholdende AAV7 sekvensene og AAV capsidene av en annen serotype. Tilsvarende fordeler oppnås ved vektorene som er basert på andre nye AAVer ifølge oppfinnelsen.
Således vil fagmannen på området lett forstå at AAV7 sekvensene ifølge oppfinnelsen lett kan tilpasses for bruk i disse og andre virale vektorsystemer for in vitro-, ex vivo-eller in vivo-genavlevering. Tilsvarende kan fagmannen på området lett velge andre fragmenter av det nye AAV genom ifølge oppfinnelsen for bruk i et antall rAAV- og ikke-rAAV vektorsystemer. Slike vektorsystemer kan blant andre for eksempel inkludere lentiviruser, retrovimser, poxvimser, vaksinevimser og adenovirale systemer. Valg blant disse vektorsystemer er ingen begrensning for oppfinnelsen.
Således tilveiebringer oppfinnelsen videre vektorer generert ved bmk av nukleinsyren og aminosyresekvensen av den nye AAV ifølge oppfinnelsen. Slike vektorer er brukbare for et antall formål, inkludert for avlevering av terapeutiske molekyler og for bmk i vaksineregimer. Særlig ønskelige for avlevering av terapeutiske molekyler er rekombinant AAV holdige capsider av de nye AAVer ifølge oppfinnelsen. Disse eller andre vek-torkonstrukter inneholdende nye AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen kan benyttes i vaksineregimer, for eksempel for samtidig avlevering av et cytokin, eller for avlevering av immunogenet per se.
V. Rekombinante vimser og anvendelse derav.
Ved bmk av de her beskrevne teknikker kan fagmannen på området generere en rAAV med et capsid av en ny serotype ifølge oppfinnelsen, eller et nytt capsid inneholdende ett eller flere fragmenter av en AAV serotype identifisert ved oppfinnelsens metode. I en utførelsesform kan det benyttes et full-lengde capsid fra en enkelt serotype, for eksempel AAV7 [SEQ ID nr. 2]. I en annen utførelsesform kan et full-lengde capsid genereres inneholdende ett eller flere fragmenter av en ny serotype ifølge oppfinnelsen, fusert i ramme med sekvenser fra en annen, valgt AAV serotype. For eksempel kan en rAAV inneholde en eller flere av de nye hypervariabelområdesekvenser av en AAV serotype ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan de unike AAV serotyper ifølge oppfinnelsen benyttes i konstrukter inneholdende andre virale eller ikke-virale sekvenser.
Det vil lett fremgå for fagmannen at i en utførelsesform vil visse serotyper ifølge oppfinnelsen være spesielt egnet for visse anvendelser. For eksempel er vektorer basert på AAV7 capsider ifølge oppfinnelsen spesielt godt egnet for anvendelse i muskler mens vektorer basert på rh.10 (44-2) capsider ifølge oppfinnelsen er spesielt godt egnet for bmk i lungen. Bruken av slike vektorer er ikke begrenset og fagmannen kan benytte disse vektorer for avlevering til andre celletyper, vev eller organer. Videre kan vektorer basert på andre capsider ifølge oppfinnelsen benyttes for avlevering til disse eller andre celler, vev eller organer.
A. Avlevering av et transgen
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for avlevering av et transgen til en vert som involverer transfektering eller infisering av en valgt vertscelle med en vektor generert med sekvensene av oppfinnelsens AAV. Metoder for avlevering er velkjente for fagmannen på området og er ingen begrensning av oppfinnelsen.
I en ønsket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for AAV-mediert avlevering av et transgen til en vert. Metoden involverer transfektering eller infisering av en valgt vertscelle med en rekombinant viral vektor inneholdende et valgt transgen under kontroll av sekvenser som styrer ekspresjonen derav og AAV capsid proteinene.
Eventuelt kan en prøve fra verten først analyseres på nærvære av antistoffer mot en valgt AAV serotype. Et antall analyseformater for detektering av nøytraliserende anti stoffer er velkjente for fagmannen. Valget av en slik analyse er ingen begrensning av oppfinnelsen, se for eksempel Fisher et al. i "Nature Med.", 3(3):306-312 (Mars, 1997) samt W.C. Manning et al. i "Human Gene Therapy", 9:477-485 (Mars 1, 1998). Resultatene av denne analyse kan benyttes for å bestemme hvorvidt AAV vektorholdige capsidproteiner av en spesiell serotype er foretrukket for avlevering, for eksempel ved fravær av nøytraliserende antistoffer som er spesifikke for denne capsid serotype.
I ett aspekt ved denne metode kan avleveringen av en vektor med et valgt AAV capsidprotein gå foran eller følge etter avlevering av et gen via en vektor med et forskjellig serotype AAV capsidprotein. Tilsvarende kan avleveringen av vektor med andre nye AAV capsidproteiner ifølge oppfinnelsen gå foran eller følge etter avlevering av et gen via en vektor med et forskjellig serotype AAV capsidprotein. Således kan genavlevering via rAAV vektorer benyttes for gjentatt genavlevering til en valgt vertscelle. Ønskelig bærer senere administrerte rAAV vektorer det samme transgen som den første rAAV vektor mens de etterfølgende administrerte vektorer inneholder capsidproteiner av serotyper som er forskjellige fra den første vektor. Hvis for eksempel en første vektor har AAV7 capsidproteiner [SEQ ID nr. 2] kan senere administrerte vektorer ha capsidproteiner som er valgt blant andre serotyper inkludert AAVl, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV6, AAV10, AAVl 1, og AAV 12, eller et hvilket som helst av de andre nye AAV capsider som er identifisert her, uten begrensning inkludert: A3.1, H2, H6, Cl, C2, C5, A3-3, A3-7, A3-4, A3-5, 3.3b, 223.4, 223-5, 223-10, 223-2, 223-7, 223-6, 44-1, 44.5, 44_2, 42-15, 42-8, 42-13, 42-3A, 42-4, 42-5A, 42-1B, 42-5B, 43-1, 43-12, 43-5, 43-21, 43-25, 43-20, 24.1, 42.2., 7.2., 27.3, 16.3, 42.10. 42-3B, 42-11, Fl, F5, F3, 42-6B, og eller 42-12.
De ovenfor beskrevne, rekombinante vektorer kan avleveres til vertsceller i henhold til publiserte metoder. Den angjeldende rAAV, fortrinnsvis suspendert i en fysiologisk akseptabel bærer, kan administreres til en human eller ikke-human pattedyrpasient. Egnede bærere kan lett velges av fagmannen på området i lys av den indikasjon for hvilken overføringsvirusen bestemmes. For eksempel inkluderer en egnet bærer saltoppløsning som kan formuleres med et antall bufferoppløsninger (for eksempel fosfatbufret saltopp-løsning). Andre eksempler på bærere er sterile saltoppløsninger, laktose, sukrose, kal-siumfosfat, gelatin, dekstran, agar, pektin, jordnøtt- eller sesamolje, samt vann. Valget av bærer er ingen begrensning for oppfinnelsen.
Eentuelt kan preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg til rAAV og en eller flere bærere inneholde andre konvensjonelle, farmasøytiske bestanddeler som preserveringsmidler eller kjemiske stabilisatorer. Egnede eksempler på preserveringsmidler er klorbutanol, kaliumsorbat, sorbinsyre, svoveldioksyd, propylgallat, parabener, etylvanillin, glycerin, fenol og paraklorfenol. Egnede kjemiske stabilisatorer er gelatin og albumin.
De virale vektorer administreres i mengder tilstrekkelig til å transfektere cellen og å tilveiebringe tilstrekkelige nivåer av genoverføring og ekspresjon for derved å tilveiebringe en terapeutisk fordel uten urimelige negative effekter, eller med medisinsk akseptable fysiologiske effekter, som kan bestemmes av fagmannen på området. Konvensjonelle og farmasøytisk akseptable administeringsveier er, uten begrensning, å rette avleveringen til det valgte organ (for eksempel intraportal avlevering til leveren), oral, inhalering (inkludert intranasal og intratrakeal avlevering), intraokkulær, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intradermal og andre parenterale administreringsveier. Admi-nistreringsveiene kan hvis ønskelig kombineres.
Doser av den virale vektor vil primært avhenge av faktorer som den tilstand hos indivi-det som skal behandles, vider alder, vekt og helse og kan således variere blant forskjellige pasienter. For eksempel ligger en terapeutisk effektiv, human dose av den virale vektor generelt i området fra rundt 1 ml til rundt 100 ml oppløsning inneholdende kon-sentrasjoner fra rundt 1 x IO<9>til 1 x IO<16>genomer virus vektor. En foretrukken human-dosering kan være fra rundt 1 x IO<13>til 1 x IO<16>AAV genomer. Doseringen vil justeres for å balansere den terapeutiske fordel mot eventuelle bivirkninger og slike doseringer kan variere avhengig av den terapeutiske anvendelse for hvilken den rekombinante vektor benyttes. Ekspresjonsnivåene for transgenet kan overvåkes for å bestemme frekven-sen av dosering som resulterer i virale vektorer, fortrinnsvis AAV vektorer inneholdende minigenet. Eventuelt kan doseringsregimer tilsvarende det som er beskrevet for terapeutiske formål benyttes for immunisering ved bruk av oppfinnelsens preparater.
Eksempler på terapeutiske produkter og immunogene produkter for avlevering via AAV-holdige vektorer ifølge oppfinnelsen skal beskrives nedenfor. Disse vektorer kan benyttes ved et antall terapeutiske eller vaksineformål som beskrevet her. I tillegg kan disse vektorer avleveres i kombinasjon med en eller flere andre vektorer eller aktive bestanddeler i et ønsket terapeutisk og/eller vaksineregjme.
B. Terapeutiske transgener
Brukbare, terapeutiske produkter som kodes av transgenet inkluderer hormoner og vekst- og differensieringsfaktorer inkludert, uten begrensning, insulin, glukagon, vekst-hormon (GH), paratyoridhormon (PTH), vektshormonfrigivende faktor (GRF), follikel- stimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), humankorionisk gonadotropin (hCG), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), angiopoietiner, angiostatin, granau-locyttkolonistimulerende faktor (GCSF), erytropoietin (EPO), bindevevsvektfaktor (CTGF), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), sur fibroblast vekstfaktor (aFGF), epi-dermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor a (TGFa), plateavledet vekstfaktor (PDGF), insulin vekstfaktorene I og II (IGF-I og IGF-II), en hvilken som helst fra den transformerende vekstfaktor P superfamilie inkludert TGF P, aktiviner, inhibiner, eller et hvilket som helst av de benmorfogeniske proteiner (BMP) BMPs 1-15, en hvilken som helst fra heregluin/neuregulin/ARIA/nydifferenseieringsfaktor (NDF) familien av vekstsfaktorer, nervevekstfaktor (NGF), hjerne-avledet neurotropisk faktor (BDNF), neurotrofiner NT-3 og NT-4/5, ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), glialcelleavledet neurotrofisk faktor (GDNF), neurturin, agrin, et hvilket som helst fra familien av sema-foriner/kollapsiner, netrin-1 og netrin-2, hepatocyt vekstfaktor (HGF), efriner, noggjn, sonisk hedgehod- og tyrosinhydroksylase.
Andre, brukbare transgene produkter inkluderer proteiner som regulerer immunsystemet inkludert, uten begrensning, cytokiner og lymfokiner som trombopoietin (TPO), inter-leukiner (IL) IL-1 til og med IL-25 (inkludert IL-2, IL-4, IL-12, og IL-18), monocytt kjemoattraktantprotein, leukemiinhibitorisk faktor, granulocytt-makrofagkolonistimu-lerende faktor, Fas ligand, tumor nekrosefaktor a og -P, interferoner a, p og y, stamcel-lefaktor, flk-2/flt3 ligand. Genprodukter som produseres av immunsystemet er også brukbare ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer, uten begrensning, immunoglobuliner IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, kimeriske immunoglobuliner, humaniserte antistoffer, en-keltkjedeantistoffer,T-celle receptorer, kimeriske T-celle receptorer, enkeltkjede T-celle receptorer, klasse I- og klasse IIMHC molekyler, så vel som konstruerte immunoglobuliner og MHC molekyler. Brukbare genprodukter inkluderer også komplementregulato-riske proteiner som komplettmentregulatoriske proteiner, membran kofaktor protein (MCP), nedbrytningsaksellererende faktor (DAF), CR1, CF2 og CD59.
Ytterligere andre brukbare genprodukter inkluderer en hvilken som helst av receptorene for hormonene, vekstfaktorene, cytokinene, lymfokinene, de regulatoriske proteiner og immunsystemproteinene. Oppfinnelsen omfatter receptorer for kolesterolregulering inkludert lavdensitets lipoprotein (LDL) receptoren, høydensitets lipoprotein (HDL), meget lav densitets lipoprotein (VLDL) receptoren samt oppfanger (scavenger) receptoren. Oppfinnelsen omfatter også genprodukter som medlemmer av steroidhormon receptor superfamilien inkludert glukokortikoidreceptorer og østrogenreceptorer, vitamin D receptorer og andre nukleære receptorer. I tillegg inkluderer brukbare genprodukter tran- skripsjonsfaktorer som jun, fos, max, mad, serumresponsfaktor (SRF), aP-1, AP2, myb, Myod og myogenin, ETS-boksholdige proteiner, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-boksbindende proteiner, interferonreguleringsfaktor (TRF-1), Wilms tumor protein, ETS-bindingsprotein, STAT, GATA-boksbindingsproteiner, for eksempel GATA-3, og gaffelfamilien av vingede heliksproteiner.
Andre brukbare genprodukter inkluderer carbamoylsyntase I, ornitin transkarbamylase, argjnosuccinatsyntease, arginosuccinatlyase, arginase, fumarylacetacetathydrolase, fenylalaninhydroksylase, a-1 antitrypsin, glukose-6-fosfatase, porfobilinogen deamina-se, faktor VJJI, faktor IX, cystation P-syntase, forgrenetkjede ketosyre dekarboksylase, albumin, isovaleryl-coA dehydrogenase, propionyl CoA karboksylase, metylmalonyl CoA mustase, glutaryl CoA dehydrogenase, insulin, P-glukosidase, pyruvatkarboksylat, hepatisk fosforylase, fosforylasekinase, glycin dekarboksylase, H-protein, T-protein, en cystisk fibrose transmembranregulator (CFTR) sekvens og en en dystrofin cDNA sekvens. Ytterligere andre brukbare genprodukter inkluderer enzymer som de som kan være brukbare ved enzymerstatningsterapi som er brukbar ved et antall tilstander som skyldes defekt enzymaktivitet. For eksempel kan enzymer som inneholder mannose-6-fosfat benyttes i terapier for lysosomal lagringssykdommer (for eksempel et egnet gen inkludert det som koder P-glukoronidase (GUSB)).
Andre brukbare genprodukter inkluderer ikke-naturlig forekommende polypeptider som kimeriske eller hybride polypeptider med en ikke-naturlig forekommende aminosyresekvens inneholdende innskudd, delesjoner eller aminosyresubstitusjoner. For eksempel kan enkeltkjedekonstruerte immunoglobuliner være brukbare hos visse immunokom-promitterte pasienter. Andre typer ikke-naturlig forekommende gensekvenser inkluderer antisense molekyler og katalytiske nukleinsyrer som ribozymer, som kan benyttes for å redusere overekspresjon av et mål.
Reduksjon og/eller modulering av ekspresjonen av et gen er spesielt ønskelig for behandling av hyperproliferative tilstander som karakteriseres ved hyperprolifererende celler, som cancere og psoriasis. Målpolypeptider inkluderer de polypeptider som produseres utelukkende eller ved høyere nivåer i hyperproliferative celler sammenlignet med normale celler. Målantigener inkluderer polypeptider som kodes av onkogener som myb, mye, fyn, og translokasjonsgenet bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk og EGRF. I tillegg til onkogenprodukter som målantigener inkluderer målpolypeptidet for anticancerbe-handling og protektive regimer variable områder av antistoffer lavet av B-celle lymfo mer og variable områder av T-celle receptorer av T-celle lymfomer som, ved enkelt utførelsesformer, også benyttes som målantigener for autoimmunsykdom. Andre tumor-assosierte polypeptider kan benyttes som målpolypeptider, for eksempel polypeptider som finnes ved høyere nivåer i tumorceller inkludert det polypeptid som gjengkjennes av monoklonalt antistoff 17-1A og folatbindingspolypeptider.
Andre egnede, terapeutiske polypeptider og proteiner inkluderer de som kan være brukbare for behandling av individer som lider av autoimmune sykdommer og lidelser ved å tilveiebringe en bredt basert, protektiv immunrespons mot mål som er assosiert med autoimmunitet inkludert cellereceptorer og celler som produserer "selv"-styrte antistoffer. T-celle medierte autoimmunsykdommer inkluderer rheumatoid artritt (RA), multippel sklerose (MS), Sjøgrens syndrom, sarkoidose, insulinavhengig diabetes mellitus (JDDM), autoimmun tyroiditt, reaktiv artritt, anyloserende spondylitt, skleroderma, po-lymyositt, dermatomyositt, psoriasis, vaskulitt, Wegeners granulomatose, Chrons sykdom og ulcerativ kolitt. Hver av disse sykdommer karakteriseres ved T-celle receptorer (TCRer) som binder til endogene antigener og initierer den inflammatoriske kaskade som assosieres med autoimmune sykdommer.
C. Immunogene transgener
Alternativt, eller i tillegg, kan vektorene ifølge oppfinnelsen inneholde AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen og et transgen som koder et peptid, polypeptid eller protein som induserer en immunrespons mot et valgt immunogen. For eksempel kan immunogenene være valgt fra et antall virale familier. Eksempler på ønskede virale familier mot hvilken en immunrespons ville være ønskelig inkluderer pikornavirusfamilien som inkluderer genera rhinoviruser, som er ansvarlige for en 50 % av tilfellene av vanlig forkjølelse; genera enteroviruser som inkluderer polioviruser, coxsackieviruser, echoviruser og human enteroviruser som hepatitt A virus; og genera aptoviruser som er ansvarlige for munn- og klovsyke, primært hos ikke-humane dyr. Innen picornavirusfamilien av vimser inkluderer målantigener VP1, VP2, VP3, VP4 og VPG. En annen viral familie inkluderer calcivirusfamilien som omfatter Norwalkgruppen av vimser som er et viktig kausativt middel for epidemisk gastroenteritt. En ytterligere viral familie som er ønskelig for bmk i innsikting av antigener for å indusere immunresponser hos mennesker og ikke-humane dyr er togavirusfamilien som inkluderer genera a-virus som inkluderer Sindbis vimser, RossRiver vimser og venezuelansk, øst- og vest-ekvin encefalitt, og mbivims inkludert Rubella vims. Flaviviridaefamilien inkluderer dengue-, gulfeber-, japansk encefalitt-, St. Louis encefalitt- og flottbåret encefalitt vimser. Andre målantigener kan genereres fra hepatitis C- eller coronavirusfamilien som inkluderer et antall ikke-humane vimser som infektiøs bronkitt vims (fjærfe), porcin transmitterbar gastroenterisk vims (svin), porcin hemagglutinerende encfalomyelitt vims (svin), felin infektiøss pritonitt vims (katter), felin enterisk koronavims (katter), canine koronavims (hunder), og humanrespiratoriske koronavimser som kan forårsake vanlig forkjølelse og/eller ikke-A, B eller C hepatitt. Innen koronavirusfamilien inkluderer målantigenene El (også kalt M eller matriksprotein), E2 (også kalt S- eller Spike protein), E3 (også kalt HE eller hemagglutin-elterose), glykoprotein (ikke til stede i alle koronavimser), eller N (nukleocapsid). Ytterligere andre antigener kan innsiktes mot rhabdovirusfamilien som inkluderer genera vesikulovirus (for eksempel Vesicular Stomatit vims) og den generelle lyssavims (for eksempel rabies). Innen rhabdovirusfamilien kan egnede antigener avledes fra G-proteinet eller N-proteinet. Familien filoviridae som inkluderer he-moragjsk febervirus som Marburg- og Ebolavims kan være en egnet kilde for antigener. Paramyksovirusfamilien inkluderer parainfluensa vims type 1, parainfluensa vims type 3, bovin parainfluensa vims type 3, mbulavims (kusmavims, parainfluensa vims type 2, parainfluensa vims type 4, Newcastle sykdom vims (kyllinger), kvegpest, morbillivirus, som inkluderer meslinger og kanindistemper, og pneumovims som inkluderer respiratorisk syncytisk vims. Influensavirus er klassifisert innen familien orotomyksoviurs og er en egnet kilde for antigen (for eksempel HA proteinet, NI proteinet). Bunyavirusfami-lien inkluderer genera bunyavims (Californai encefalitt, La Crosose), flebovirus (Rift Valley Feber), hantavims (puremala er en hemahagin feber vims), nairovims (Nairobi sauesykdom) og forskjellige ikketilskreve bungavimser. Arenavirusfamiline tilveiebringer en kilde for antigener mot LCM- og Lassa feber vims. Reovirusfamilien inkluderer genera reovims, rotavims (som forårsaker akutt gastroenteritt hos barn), orbivim-ser og kultiviruser (Colorado Flott feber, Lebombo (mennesker), ekvin encefalose, blå-tunge).
Retrovirusfamilien inkluder subfamilien onkorivirinal som omfatter slike human- og veterinærsykdommer som felinleukemivirus, HTLVI og HTLVTI, lentivirinal (som inkluderer human immunodefektiv vims (HIV), simian immunodefekt vims (SIV), felin immunodefekt vims (FIV), ekvin efektiøs anemi vims og spumavirinal). Mellom HIV og SIV er mange egnede antigener beskrevet og kan lett velges. Eksempler på egnede HIV- og SIV antigener inkluderer uten begrensning gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat og Rev proteinene så vel som forskjellige fragmenter derav. I tillegg er et antall modifikasjoner til disse antigener beskrevet. Egnede antigener for dette formål er velkjente for fagmanne. For eksempel kan man velge en sekvens som koder gag, pol, Vif og Vpr, Env, Tat og Rev, blant andre proteiner, se for eksempel det modifiserte gag protein som er beskrevet i US 5 972 596. Se videre de HIV- og SIV proteiner som er beskrevet av D.H. Barouch et al. i "J: Virol.", 75(5):2462-2467 (Mars 20001), samt av R.R. Amara et al. i "Science", 292:69-74 (6 April 2002). Disse proteiner eller subenheter derav kan avleveres alene, eller i kombinasjon via separate vektorer eller fra en enkelt vektor.
Papovavirusfamilien inkluderer subfamilien polyomaviruser (BKU- og JCU vimser) og subfamilien papillomaviruser (assosiert med cancere og malignant progresjon av papill-oma). Adenovirusfamilien inkluderer vimser ((EX, AD7, ARD, O.B.) som forårsaker respiratorisk sykdom og/eller enteritt. Parvovimsfamilien inkluderer felin parvovims (felinenteritt); felin panleukopeniavims, canine parvovims og porcine parvovims. Her-pesvimsfamilien inkluderer sub-familien alfaherpesvirinae, som omfatter genera sim-plexvims (HSVL HSVIT), varicellovims (pseudorabies, varicella zoster) og sub-familien betaherpesvirinae, som inkluderer genera cytomegalovirus (HCMV, muromegalovims) og sub-familien gammeherpesvirinae som inkluderer genera lymfokryptovirus, EBV (Burkitts lymfom), infektiør rhinotrakeitt, Mareks sykdomsvims og rhadinovims. Poxvirusfamilien inkluderer sub-familien kordopoxvirinae som omfatter genera orto-poxvims (Variola (småkopper) og vaksinia (kukopper)), parapoxvims, avipoxvims, capripoxvims, leporipoxvims, suipoxvims og sub-familien entomopoxvirinae. Hepad-nvavimsfamilien inkluderer hepatitt B vimsen. En ikke-klassifisert vims som kan være en egnet kilde for antigener er Hepatitis delta vimsen. Ytterligere andre virale kilder kan inkludere avi an infektiøs bursal sykdoms vims og porcin respiratorisk og reproduktiv syndromvirus. Alfavirusfamilien inkluderer ekvin arteritis vims og forskjellige Encefa-litis vimser.
Foreliggende oppfinnelse kan også omfatte immunogener som er bmkbare for å immun-iser et menneske eller ikke-humant dyr mot andre patogener inkludert bakteria, fungj, parasittiske mikroorganismer eller multicellulære parasitter som infiserer humane og ikke-humane vertebrater, eller danner en cancercelle eller tumorcelle. Eksempler på bakterielle patogener inkluderer patogenisk gram-positive kokki inkludert pneumo-kokki; stafylokokki; og streptokokki. Patogeniske, gram-negative kokki inkluderer me-ningokokkus; gonokokkus. Patogeniske, enteriske gram-negative bacilli inkluderer en-terobacteriaceae; psudomonas, acinetobacteia og eikenella; melioidosis, salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. Ducreyi (som forårsaker chancroid); bmcella; Franisealla tularensis (som forårsaker tularemia); yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis og spirillum; Gram-positive bacilli inkluderer listeria monocytogeners; erypsipelotrhrix rhusopathiae; Corynebacterium diphteria (difteri), kloera; B. Anthracis (anthrax); donovanosis (granuloma inguinale); og bartonellose. Sykdommer forårsaket av patogeniske, anaerobe bakterier inkluderer tetanus; botulisme; andre clostridia; tu- berkulose; leprosi; og andre mykobakteria. Patogeniske, spiroketale sykdommer inkluderer syfilis; treponematoser; yaws, pinta og endemisk syfilis; og leptospirose. Andre infeksjoner forårsaket av høyere patogenbakteria og patogeniske fungi inkluderer akti-nomykose, nokardiose; kryptokokkose, blastomykose, hi stopl asmose og kokki di omyko-se; candidiase, aspergillose, og mukormykose; sportotrikose; parakokkidiodomykose, petriellidiose, torulopsose, mycetoma og kromomykose; og dermatofytose. Ricketsielle infeksjoner inkluder Tyfusfeber, Rocky Mountain flekkfeber, Q feber og Rickettsial-opox. Eksempler på mykoplasma og klamydiale infeksjoner inkluderer: mycoplasma pneumoniae; lympfogranuloma venereum, psittakose; og perinatal klamydiale infeksjoner. Patogeniske eukaryoter omfatter patogeniske protozoaner og helminter og infeksjoner fra disse inkluderer: amebiaser, malaria, leishamiase; trypanosomiase; toxoplasmo-se; Pneumocystis carinii; Trikaner, Toxoplasmo gondii; babesiose; giardiase; trikinose; filariase; schistosomiase; nematoder; trematoder eller "flukes"; og cestose (bendelorm) infeksjoner.
Mange av disse organismer og/eller toksiner som produsere av disse er identifisert av "Centers for Disease Control" [(CDC), Department of Health and Human Services, USA], som midler som har potensiale for bruk ved biologiske angrep. For eksempel inkluderer noen av disse biologiske midler Bacillus anthracis (antrax), Clostridium bo-tulinum og dettes toksin (botulisme), Yersinia pestis (pest) vari ola major (småkopper), Francisella tularensis (tularemi), og viral hemoragisk feber, alt i dag klassifisert som Kategori A midler; Coxiella burnetti (Q feber); Brucella species (brucellose), Burkhol-deria matlei (snive), Ricinus communis og dettes toksin (ricintoksin), Clostridium per-jringens og dettes toksin (e-toksin ), Stahylococcus spesier og deres toksiner (enterotok-sin B), alt i dag klassifisert som Kategori B midler; og Nipan virus og hantaviruser som i dag er klassifisert som Kategori C midler. I tillegg kan andre organismer som er klassifisert slik eller forskjellig, identifiseres og/eller benyttes for et slikt formål i fremtiden. Det vil være lett å forstå at de virale vektorer og andre konstrukter som beskrevet her er brukbare for å avlevere antigener fra disse organismer, vimser og deres toksiner eller andre biprodukter, som vil forhindre og/eller behandle infeksjon eller andre ugunstige reaksjoner med disse biologiske midler.
Administrering av vektorene ifølge oppfinnelsen for å avlevere immunogener mot det variable området av T-cellen utløser en immunrespons inkludert CTL'er for å eliminere disse T-celler. Ved rheumatoid artritt (RA) er diverse spesifikke, variable områder av T-celle receptorer (TCRer) som er involvert i sykdommen,karakterisert. Disse TCRer inkluderer V-3, V-14, V-17 og Va-17. Således vil avlevering av en nukleinsyresekvens som koder minst ett av disse polypeptider utløse en immunrespons som vil ta sikte på T-celler involvert ved RA. Ved multippel sklerose (MS) er flere spesifikke, variable områder av TCRer som er involvert i sykdommen,karakterisert. Disse TCRer inkluderer V-7 og Va-10. Således vil avlevering av en nukleinsyresekvens som koder minst ett av disse polypeptider elicitere en immunrespons som vil ta sikte på T-celler involvert i MS. Ved skleroderma er detkarakterisertflere spesifikke, variable områder av TCRer som er involvert i sykdommen. Disse TCRer inkluderer V-6, V8, V-14 og Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 og Va-12. Således vil avlevering av et nukleinsyremolekyl som koder minst ett av disse polypeptider utløse en immunrespons som vil ta sikte på T-celler involvert i skleroderma.
Eventuelt kan vektorer inneholdende AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen avleveres ved bruk av et prime-boost regime. En antall slike regimer er beskrevet i teknikken og kan lett velges, se for eksempel TO 00/11140, publisert 2. mars 2000, hvortil det vises når det gjelder detaljer.
Slike prime-boost regimer involverer karakteristisk administrering av en DNA (for eksempel plasmid) basert vektor for å prime immunsystemet til andre, booster, administrering med et tradisjonelt antigen som et protein eller en rekombinant virus som bærer sekvensene som koder et slikt antigen. I en slik utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for priming og boosting av en immunrespons mot et valgt anti-gen ved avlevering av en plasmid DNA vektor som bærer nevnte antigen, fulgt av boosting, for eksempel med en vektor inneholdende AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen.
I en utførelsesform involverer prime-boost regimet ekspresjonene av multiproteiner fra prime- og/eller boost bærerer, se for eksempel R.R. Amara i "Science", 292:69-74 (6 april 2001) som beskriver et multiproteinregime for ekspresjon av proteinsubenheter som kan brukes for generering av en immunrespons mot HIV og SIV. For eksempel kan en DNA prime avlevere Gag, Pol, Vif, VPX og Vpr og Env, Tat, og Rev fra et enkelt transkript. Alternativt avgis SIV Gag, Pol og HIV-1 Env.
Imidlertid er prime-boost regimene ikke begrenset til immunisering for HIV eller for avlevering av disse antigener. For eksempel kan priming involvere avlevering med en første chimp vektor ifølge oppfinnelsen fulgt av boosting med en andre chimp vektor, eller med et preparat inneholdende antigenet per se i protein form. I ett eksempel kan prime-boost regimet tilveiebringe en protektiv immunrespons mot virusen, bakterien eller en annen organisme hvorfra antigenet avleveres. I en annen ønsket utførelsesform tilveiebringer prime-boost regimet en terapeutisk effekt som kan måles ved bruk av konvensjonelle analyser for detektering av nærvær av tilstanden for hvilken terapien administreres.
Primingvaksinen kan administreres på forskjellige seter i kroppen i en doseavhengig modus som avhenger av antigenet mot hvilket den ønskede immunrespons innsiktes. Oppfinnelsen er ikke begrenset til mengden injeksjonsseter eller til farmasøytisk bærer. Tvert imot inkluderer primingstrinn behandlingsregimer som inkluderer en enkelt dose eller dosering som administreres per time, per dag, per uke, per måned eller per år. Som et eksempel kan pattedyr motta en eller to priminginjeksjoner inneholdende mellom 10 ug og 50 ug plasmid i bærer. En ønsket primingmengde eller dosering for priming DNA vaksinepreparater ligger mellom rundt 1 ug og 10.000 ug av DNA vaksinen. Dose-ringene kan variere fra 1 ug til 1.000 ug DNA per kg individ kroppsvekt. Mengden eller injeksjonssetet velges fortrinnsvis basert på identitet og tilstand hos det pattedyr som behandles.
Doseringsenheten for DNA vaksinen som er egnet for avlevering av antigenet til patte-dyret, beskrives her. DNA vaksinen fremstilles for administrering med suspendering eller oppløsning i en farmasøytisk eller fysiologisk akseptabel bærer som isotonisk salt-oppløsning, isotoniske salter i oppløsning eller andre formuleringer som vil være åpenbare for fagmannen på området. Den egnede bærer vil være åpenbar for fagmannen og vil avhenge for det meste av administreirngsveien. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et pattedyr i henhold til de ovenfor beskrevne veier i form av en formu-lering med opprettholdt frigivning ved bruk av en bionedbrytbar biokompatibel poly-mer, eller ved avlevering på setet ved bruk av miceller, geler og liposomer.
Eventuelt kan primingtrinnet ifølge oppfinnelsen også inkludere, sammen med administreringen av priming DNA vaksinepreparatet, en egnet mengde av en adjuvant som definert her.
Fortrinnsvis blir et boostingpreparat administrert rundt 2 til rundt 27 uker etter administrering av priming DNA vaksinen til mammalindividet. Administreringen av boostingpreparatet gjennomføres ved bruk av en effektiv mengde av et boostingvaksinepreparat inneholdende eller i stand til å avgi det samme antigen som administrert av priming DNA vaksinen. Boostingpreparatet kan bestå av en rekombinant, viral vektor avledet fra den samme virale kilde eller fra en annen kilde. Alternativt kan "boostingpreparatet" være et preparat inneholdende det samme antigen som kodet i priming DNA vaksinen men i form av et protein eller peptid, hvilket preparat induserer en immunrespons hos verten. I en annen utførelsesform inkluderer boostingvaksinepreparatet et preparat inneholdende en DNA sekvens som koder antigenet under kontroll av en regulatorisk sekvens som styrer dens ekspresjon i en pattedyrcelle, for eksempel vektorer som velkjente bakterielle eller virale vektorer. De primære krav for boostingvaksinepreparatet er at antigenet av vaksinepreparatet er det samme antigen, eller et kryssreaktivt antigen, som kodet av DNA vaksinen.
Fortrinnsvis er vektorene ifølge oppfinnelsen også velegnet for bruk i regimer som benytter ikke-AAV vektorer så vel som proteiner, peptider og/eller andre biologisk brukbare terapeutiske eller immunogeniske forbindelser. Disse regimer er spesielt velegnet for genavlevering for terapeutiske formål og for immunisering, inkludert indusering av protektiv immunitet. Slike anvendelser vil lett være åpenbare for fagmannen.
Videre tilveiebringer en vektor ifølge oppfinnelsen en effektiv genoverføringstranspor-tør som kan avlevere et valgt transgen til en valgt vertscelle in vivo eller ex vivo også der organismen har nøytraliserende antistoffer mot en eller flere AAV serotyper. I en utførelsesform blir vektoren (for eksempel en rAAV) og cellene blandet ex vivo; de infi-serte celler dyrkes ved bruk av konvensjonelle metoder; og de transduserte celler reinfu-seres i pasienten. Videre kan vektorene ifølge oppfinnelsen også benyttes for fremstilling av et ønsket genprodukt in vitro. For in vitro produksjon kan et ønsket produkt (for eksempel et protein) oppnås fra en ønsket kultur etter transfeksjon av vertsceller med en rAAV inneholdende molekylet som koder det ønskede produkt og dyrking av cellekul-turen under betingelser som tillater ekspresjon. Det uttrykte produkt kan så renses og isoleres etter ønske. Egnede teknikker for transfeksjon, celledyrking, rensing og isolasjon er velkjent for fagmannen.
De følgende eksempler skal illustrere forskjellige aspekter og utførelsesformer av oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1:
PCR forsterkning, kloning og karakterisering av nye AAV sekvenser.
Vev fra ikke-humane primater avsøkes på AAV sekvenser ved bruk av en PCR metode basert på oligonukleotider til sterkt konserverte områder av kjente AAVer. En strekning av AAV sekvens som spennes over 2886 til 3143 bp av AAVl [SEQ ID nr. 6] ble valgt som en PCR amplikon der et hypervariabelt område av capsidproteinet (Cap) som er unikt for hver kjente AAV serotype, og som her angis som et "signaturområde", er flankert av konserverte sekvenser. I senere analyser ble dette signaturområdet vist å være lokalisert mellom konserverte rester som spente over hypervariabelt område 3.
En første undersøkelse av perifert blod fra et antall ikke-human primat spesier avdekket detekterbar AAV i et subsett av dyr fra spesier som rhesus macaquer, cynomologe macaquer, sjimpanser og bavianer. Imidlertid var det ingen AAV sekvens detektert i noen av de andre testede spesier inkludert japanske macaquer, grisehalemacaquer og ekorna-per. En mer utstrakt analyse av vektorfordelingen ble gjennomført i vev av Rhesusaper ved University of Pennsylvania and Tulane-kolonier gjenvunnet ved nekropsi. Dette avdekket AAV sekvens gjennom et vidt mønster av vev.
A. Forsterkning av et AA V signaturområde
DNA sekvenser av AAVl-6 og AAVer isolert fra gjess og ender ble innrettet ved siden av hverandre ved bruk av "Clustal W" ved default innstilling. Innretningen for AAVl-6 og inkludering av informasjon for den nye AAV7 er gitt i figur 1. Sekvenslikheter blant AAVene ble sammenlignet.
Ved denne studie ble et 257 bp område som spente over 2886 bp til 3143 bp av AAVl [SEQ ID nr. 6], og det tilsvarende område i genomene av AAV 2-6 genomene [se figur 1] identifisert av oppfinnerne. Dette område er lokalisert ved AAV capsid genet og har sterkt konserverte sekvenser både ved 5'- og 3' endene og har en relativt variabel sekvens i midten. I tillegg inneholder dette området et DralU restriksjons enzymsete (CACCACGTC, SEQ ID nr. 15). Oppfinnerne har funnet at dette området tjener som spesifikk signatur for hver kjente type av AAV DNA. Ved med andre ord å følge PCR reaksjoner, digestering med endonukleaser som er spesifikke for hver kjente serotype, og gel elektroforeseanalyse kan dette området benyttes for definitivt å identifisere forsterkede DNA til å være fra serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, eller en annen serotype.
Primerne ble designert, validert og PCR betingelsene optimalisert med AAVl, 2 og 5 DNA kontroller. Primerne var basert på sekvensene av AAV2: 5'primeren, IS: bp 2867-2891 av AAV2 (SEQ ID nr. 7) og 3' primeren, 18as, bp 3095-3121 av AAV2 (SEQ ID nr. 7).
Cellulære DNA er fra forskjellige vev inkludert blod, hjerne, lever, lunge, testis og så videre fra forskjellige rhesusaper ble studert ved bruk av strategien som beskrevet ovenfor. Resultatene viste at DNAer fra forskjellige vev av disse aper gav grunn til sterke PCR forsterkninger. Ytterligere restriksjonsanalyser av PCR produkter indikerte at de ble forsterket fra AAV sekvenser som var forskjellige fra alle publiserte AAV sekvenser.
PCR produkter (med størrelse rundt 255 bp) fra DNAer fra en varietet av apevev er klonet og sekvensert. Bioinformasjonsstudier over disse nye AAV sekvenser antydet at de er nye AAV sekvenser av capsid gen og distinkte fra hverandre. Figur 1 inkluderer innretningen av de nye AAV signaturområder for AAV 10-12 [SEQ ID nr. 117, 118 henholdsvis 119]. Multippelsekvensinnretninganalyse ble gjennomført ved bruk av Clustal W (1.81) programmet. Prosentandelen sekvensidentitet mellom signaturområdene for AAV 1-7- og AAV 10-12 genomene er gitt nedenfor.
Over 300 kloner inneholdende nye AAV serotypesekvenser som spenner over det valgte 257 bp område ble isolert og sekvensert. Bioinformatikkanalyse av disse 300+ kloner antydet at dette 257 bp området er kritisk med henblikk på å tjene som en god land mar-kør eller signatursekvens for hurtig isolering og identifisering av en ny AAV serotype.
B. Bruk av signaturområde for PCR forsterkning
257 bp signaturområdet ble benyttet som et PCR anker for å forlenge PCR forsterk-ningene til 5' av genomet for å dekke skjøteområdet for rep- og cap genene (1398 bp - 3143 bp, SEQ ID nr. 6) og 3' av genomet for å oppnå hele cap gen sekvensen (2866 bp - 4600 bp, SEQ ID nr. 6). PCR forsterkninger ble gjennomført ved å benytte standardbe-tingelsene inkludert denaturering ved 95 °C i 0,5-1 minutt, annellering ved 60-65 °C i 0,5-1 minutt og forlengelse ved 72 °C i 1 minutt per kb med et totalt antall forsterk-ningscykler fra 28 til 42.
Ved bruk av de innrettede sekvenser som beskrevet under punkt "A" ble to andre relativt konserverte områder identifisert i sekvensen lokalisert i 3' enden av rep gener og 5' til 257 bp området og i sekvensen nedstrøms 57 bp fragmentet men før AAV 3 ITR. To sett av nye primere ble designet og PCR betingelsene optimalisert for gjenvinning av totalt capsid eller en del av rep sekvensene av nye AAV serotyper. Mer spesifikt var for 5' forsterkningen, 5' primeren, AVINs, GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC [nt 1398-1423 av AVI, SEQ ID nr. 6] og 3' primeren var 18as, identifisert ovenfor. For 3' forsterkning var 5' primeren ls, identifisert ovenfor, og 3' primeren var Av2Las, TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG [nt 4435-4462 av AAV2, SEQ ID nr. 7].
Ved disse PCR forsterkninger ble 257 bp området benyttet som et PCR anker og land-markør for å generere overlappingsfragmenter for å konstruere et komplett capsid gen
ved fusjon ved DRAin setet i signaturområdet fulgt av forsterkning av 5'- og 3' forleng-elsesfragmentene, oppnådd som beskrevet her. Mer spesielt ble, for å generere det intakte AAV 7 cap gen, de tre forsterkningsprodukter (a) sekvensene av signaturområdet; (b) sekvensene av 5' forlengelsen; og (c) sekvensene av 3' forlengelsen, klonet inn i et
pCR4-Topo [Invitrogen] plasmidskjelett i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble plasmidene digestert med Drain og rekombinert for å danne et intakt cap gen.
Ved denne arbeidsvei ble rundt 80 % av capsid sekvensene av AAV7 og AAV8 isolert og analysert. En annen ny serotype, AAV9, ble også oppdaget fra ape nr. 2.
Ved bruk av PCR betingelsene som beskrevet ovenfor isoleres den gjenværende del av rep gen sekvensen for AAV7 og klones så ved bruk av primere som forsterker 108 bp til 1461 bp av AAV genomet (beregnet ved bruk av nummereringen av AAV2, SEQ ID nr. 7). Denne klon sekvenseres for konstruksjon av et fullstendig AAV7 genom uten ITRer.
C. Direkteforsterkning av 3,1 kb Cap fragmentet
For direkte å forsterke et 3,1 kb full-lengde Cap fragment fra NHP vev- og -blod DNAer ble to andre sterkt konserverte områder identifisert i AAV genomer for bruk ved PCR forsterkning av store fragmenter. En primer i et konservert område lokalisert i midten av rep genet ble valgt (AVlns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt 1398-1423 av SEQ ID nr. 6) i kombinasjon med 3' primeren lokalisert i et annet konservert område nedstrøms cap genet (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID nr. 7) for forsterkning av full-lengde cap fragmenter. PCR produktene var Topo-klonet i henhold til produsentens retningslinjer (Invitrogen) og sekvensanalysen ble gjennomført med Qiagengenomics (Qiagengenomics, Seattle, WA) med en nøyaktighet på >99,9 %. Til sammen 50 capsid kloner ble isolert ogkarakterisert. Blant disse var 37 kloner avledet fra Rhesus macaque vev (rh.l - rh.37), 6 kloner fra cynomologe macaquer (cy.l - cy.6), 2 kloner fra bavianer (bb.l og bb.2) og 5 kloner fra sjimpanser (ch.l - ch.5).
For å utelukke muligheten for at sekvensdiversiteten i den nye AAV familie ikke var et resultat av PCR, som PCR-mediert genspleising ved overlapsforlengelse mellom forskjellige partial DNA templater med homologe sekvenser, eller resultatet av rekombinasjonsprosesser i bakterier, ble en serie forsøk gjennomført under identiske betingelser for VPl forsterkning ved bruk av total cellulære DNAer. Først ble intakte AAV7- og AAV8 plasmider blandet i et likt molforhold fulgt av seriefortynninger. De seriefortyn-nede blandinger ble benyttet som templater for PCR forsterkning av 3,1 kb VP1 fragmenter ved bruk av universalprimere og identiske PCR betingelser til det som ble benyttet for DNA forsterkning for å se hvorvidt det ble generert noen hybrid PCR produkter. Blandingen ble transformert inn i bakterier og isolerte transformanter for å se etter hybridkloner som eventuelt kunne oppstå fra rekombinasjonsprosesser i bakterieceller. I et annet forsøk ble AAV7- og AAV8 plasmider restriksjonsbehandlet med Msp I, Ava I og Hael, der alle kuttet begge genomer flere ganger ved forskjellige posisjoner, blandet så digestsjonene i forskjelligge rekombinasjoner og benyttet disse for PCR forsterkning av VP1 fragmenter under de samme betingelser for å teste hvorvidt PCR produkter kunne genereres ved overlapsekvensforlengelse av partielle AAV sekvenser. I et annet for-søk ble en blanding av gelrenset 5' l,5kb AAV7 VP1 fragment og 3' 1,7 kb AAV8 VP1 fragment med overlap i signaturområdet, seriefortynnet og benyttet for PCR forsterkning i nærvær og fravær av 200 ng cellulær DNA, ekstrahert fra en apecellelinje som var fri for AAV sekvenser ved TaqMan analyse. Ingen av disse forsøkene viste effektiv PCR mediert overlapsekvensproduksjon under betingelsen for den genomiske DNA cap forsterkning (data ikke vist). Som en ytterligere bekreftelse ble det designert 3 par primere som var lokalisert i forskjellige HVR'er, og var sekvenser spesifikke til variantene av klon 42s fra Rhesus macaque F953, i forskjellige kombinasjoner, for å forsterke kortere fragmenter fra mesenterisk lymfeknute (MLN) DNA fra F953 hvorfra klonet 42s ble isolert. Alle sekvensvariasjoner som var identifisert i full-lengde cap kloner ble funnet i disse korte fragmenter (data ikke vist).
Eksempel 2: Adeno-assosierte vimser undergår substansiell utvikling i primater under naturlige infeksjoner.
Sekvensanalyse av valgte AAV isolater viste divergens gjennom genomet som er mest
konsentrert i hypervariable områder av capsid proteinene. Epidemiologiske data antyder at alle kjent serotyper er endemiske til primater selv om isolasjon av kliniske isolater er begrenset til AAV2 og AAV3 fra anal- og strupeutskrap av humanbarn og AAV5 fra en human condylomatøs vorte. Ingen kjente kliniske sekveller er assosiert med AAV infeksjon.
I et forsøk på bedre å forstå biologien for AAV ble ikke-humane primater benyttet som modeller for å karakterisere sekvellene for naturlige infeksjoner. Vev fra ikke-humane primater ble avsøkt på AAV sekvenser ved bmk av PCR metoden ifølge oppfinnelsen basert på oligonukleotidet til høyt konserverte områder av kjente AAVer (se eksempel 1). Et strekk av AAV sekvens over 2886 til 3143 bp av AAVl [SEQ ID nr. 6] ble valgt som en PCR amplikon hvori konserverte sekvenser er flankert av et hypervariabelt område som er unikt for hver kjente AAV serotype, her angitt som et "signaturområde".
En første undersøkelse av perfert blod fra et antall ikke-humane primatspesier inkludert Rhesusaper, cynomologe aper, sjimpanser og bavianer, viste detekterbar AAV i et subsett av dyr fra alle spesier. En mer utstrakt analyse av vektorfordelingen ble gjennomført i vev av Rhesusaper fra University of Pennsylvania and Tulane-kolonier, gjenvunnet ved nekropsi. Dette viste ata AAV sekvenser gjennom et vidt mønster av vev.
Den forsterkede signatursekvens ble subklonet inn i plasmider og individuelle transformanter ble underkaste sekvensanalyse. Dette viste substansiell variasjon i nukleotid-sekvensen for kloner avledet fra forskjellige dyr. Variasjon i signatursekvensen ble også notert i kloner oppnådd innen individuelle dyr. Vev som var hentet fra to dyr hvori unike signatursekvenser var identifisert (det vil si kolon fra 98E044 og hjerte fra 98E056) ble ytterligerekarakterisert vedå utvide sekvensen forsterket ved PCR ved bruk av oligonukleotider til høyt konserverte sekvenser. På denne måte ble komplette, provirale strukturer rekonstruert for virale genomer fra begge vev som beskrevet her. Disse provi-ruser skiller seg fra de kjente AAVer med den største sekvensdivergens som ble notert i områdene av Cap genet.
Ytterligere forsøk ble gjennomført for å bekrefte at AAV sekvensene som er resistente til ikke-humant privatvev representerte proviralgenomer av infektiøse vimser som er i stand til å kunne hentes og danne virioner. Genomisk DNA fra levervev av dyr 98E056 hvorfra AAV8 signatursekvensen var bestemt, ble digestert med en endonuklease som ikke har et sete innen AAV sekvensen og transfektert inn i 293 celler med et plasmid inneholdende et El deletert genom av human adenovims serotype 5 som en kilde for hjelperfunksjoner. Det resulterende lysat ble bragt på 293 celler en gang og lysatet gjenvunnet og analysert på nærværet av AAV cap proteiner ved bmk av et bredt reagerende, polyklonalt antistoff mot cap proteiner og nærværet og rikeligheten av DNA sekvenser fra den PCR forsterkede AAV provirus hvorfra AAV8 var avledet. Transfeksjon av endonuklease restriksjonsbehandlet hjerte DNA og adenovims hjelperplasmidet gav høye mengder AAV8 vims som påvist ved detektering av cap proteiner ved Western blot analyse og nærværet av IO<4>AAV8 vektorgenomer per 293 celler. Lysater ble generert fra en storskalapreparering og AAV ble renset ved cesiumsedimentering. Det rensede preparat viste 26 nm ikosoedrisk struktur som virket identisk med de til AAV serotype 2. Transfeksjon med adenovirushjelperen alene gav ikke AAV proteiner eller -genomer, noe som utelukker kontaminering som en kilde for gjenvunnet AAV.
For ytterligere å karakterisere inter- og intra dyrevariasjonen av AAV signatursekvensen ble valgte vev underkastet ustrakt PCR for å forsterke hele Cap åpne leserammer.
De resulterende fragmenter ble klonet inn i bakterielle plasmider og individuelle transformanter ble isolert og sekvensielt fullstendig. Denne analyse involverte mesenteriske lymfeknuter fra tre rhesus aper (Tulane/V223 - 6 kloner; tulane/T612 - 7 kloner; Tula-ne/F953 - 14 kloner), lever fra to rhesuaper (Tulane/V251 - 3 kloner; Penn/00E033 - 3 kloner), milt fra en rhesusape (Penn/97E043 - 3 kloner), hjerte fra en rhesusape (JHGT/98E046- 1 klon) og perifert blod fra en sjimpanse (New Iberia/XI33 - 5 kloner), seks cynomologe macaquer (Charles River/A1378, A3099, A3388, A3442, A2821, A3442 - til sammen 6 kloner) og en bavian (SFRB/8644 - 2 kloner). Av de 50 kloner som ble sekvensielt fra 15 forskjellige dyr ble 30 ansett som ikke-rikelige basert på funn av minst 7 aminosyredifferanser fra hverandre. De ikke-redundante VPl kloner ble nummerert sekvensielt etter hvert som de ble isolert med en prefiks som antyder spesiene av den ikke-humane primat hvorfra de ble hentet. Den strukturelle sammenheng mellom disse 30 ikke-redundante kloner og de tidligere beskrevne 8 AAV serotyper ble bestemt ved bruk av SplitsTree programmet [D.H. Huson i "SplitsTree: analyzing and visualizing evolutionary data." " Bioinformatics" 14, 68-73 (1998)] med implementering av metoden med splittdekomponering. Analysen angir homoplasi mellom et sett av frekvenser i et tre-lignende nettverk heller enn et tre som deler seg i to. Fordelen er å mu-liggjøre detektering av grupperinger som er resultatet av konvergens og å vise fylogene-tiske sammenhenger selv når de er forstyrret av parallelle evenementer. Ekstensiv fylo-genetisk forskning vil være nødvendig for å elucidere AAV utvikling, intensjonen her er kun å grupper forskjellige kloner hva angår deres sekvenslikhet.
For å bekrefte at de nye VPl sekvenser var avledet fra infektiøse, virale genomer, ble cellulær DNA fra vev med høy rikelighet av viral DNA behandlet med en endonuklease som ikke skulle spalte i AAV og så transfektert inn i 293 celler, fulgt av infeksjon med adenovirus. Dette resulterte i "rescue" og forsterkning av AAV genomer fra DNA fra vev fra to forskjellige dyr (data ikke vist).
VPl sekvenser av de nye AAVer ble ytterligerekarakterisertmed henblikk på arten og lokasjonen av aminosekvensvariasjonen. Alle 30 VPl kloner som ble påvist å skille seg fra hverandre med mer enn 1 % aminosyresekvens ble innrettet og bedømt på variasjon i hver rest. En algoritme som var utviklet for å bestemme arealer av sekvensdivergens gav 12 hypervariable områder (HVR) hvorav 5 overlappet eller er en del av de 4 tidligere beskrevne, variable områder [Kotin, supra; Rutledge, supra]. De tre-ganger-proksimale topper inneholder mesteparten av variabiliteten (HVR5-10). Interessant er at løkkene som var lokalisert ved 2- og 5 ganger aksen også viste intens variasjon. HVRene 1 og 2 opptrer i den N-terminale del av capsid proteinet som ikke er oppløst i røntgenstrukturen og antyder at N-terminus av VPl proteinet er eksponert på overflaten av virionet.
Sann-tid PCR ble benyttet for å kvantifisere AAV sekvenser fra vev av 21 rhesusaper ved bruk av primere og prober på høyt konserverte områder av Rep (ett sett) og Cap (to sett) av kjente AAVer. Hvert datapunkt representerer analyse fra vev DNA fra et indi-viduelt dyr. Dette bekreftet den vide fordeling av AAV sekvenser selv om den kvantita-tive fordeling var forskjellig dyrene seg imellom. Kilden for dyr og tidligere historie eller behandling syntes ikke å påvirke fordelingen av AAV sekvenser i rhesus macaquer. Tre forskjellige sett av primere og prober ble benyttet for å kvantifisere AAV og gav konsistente resultater. De høyeste nivåer av AAV ble funnet konsistente i mesenteriske lymfeknuter ved et middel på 0,01 kopier per diploidgenom for 13 dyr som var positive. Lever og milt inneholdt også høy rikelighet av virus DNA. Det var eksempler på meget høy AAV som i hjerte av rhesus macaquen 98E056, milten av rhesus macaquen 97E043 og lever fra rhesus macaquen RQ4407, som viste 1,5, 3 henholdsvis 20 kopier av AAV sekvens per diploid genom. Relativt høye nivåer av virus DNA ble notert i perifere mononukleære blodceller, noe som antyder at data i vev ikke skyldes residente blodkomponenter (data ikke vist). Det skal påpekes at denne metode ikke nød-vendigvis vil fange opp alle AAVer som er residente til de ikke-humane primater fordi detekteringen krever høy homologi både hva angår oligonukleotidene og sann-tid PCR proben. Vev fra dyr med høy rikelighet av AAV DNA ble analysert videre på moleky-lærtilstand av den angjeldende DNA ved DNA hybridiseringsteknikker, og dens cellulære fordeling, ved in situ hybridisering.
Type sekvensvariasjon som ble avdekket i AAV provirale fragmenter som var isolert fra forskjellige dyr og innen vev fra samme dyr, er reminiscent fra utviklingen som inntrer for mange RNA vimser under pandemi eller sogar innen infeksjonen av et individ. I noen situasjoner er nosjonen av en vill-type vims erstattet med eksistensen av svermer av kvasi spesier som utvikler seg som et resultat av hurtig replikering og mutasjoner i nærvær av selektivt trykk. Ett eksempel er infeksjon ved HIV som utvikles i respons på immunologisk og farmakologisk trykk. Flere mekanismer bidrar til den høye grad av mutasjoner i RNA vimser inkludert lav fidelitet og mangel på sikker avlesningskapasitet av reverstranskriptase og ikke-homolog og homolog rekombinering.
Bevis på dannelse av kvasispesier av AAV ble illustrert i denne studie ved den systema-tiske sekvensering av multippelklonede provirale fragmenter. Således kunne identiske sekvenser ikke finnes innen noen forlengede kloner isolert mellom eller innen dyrene. En viktig mekanisme for denne utvikling av sekvens synes å være den høye grad av homolog rekombinering mellom et mer begrenset antall parenterale vimser. Nettoresul-tatet er en utstrakt bytting av hypervariable områder av cap protein som fører til et mønster av kimerer som kan ha forskjellig tropisme og serologiske spesifisiteter (for eksempel evnen til å slippe unna immunologiske responser, spesielt når det angår nøyt-raliserende antistoffer). Mekanismer ved hvilke homolog rekombinering kan inntre er uklar. En mulighet er at + - og -trådene av forskjellige enkelttrådede AAV genomer annellerer under replikering slik det er beskrevet under høy multiplisitet av infeksjoner med AAV rekombinanter. Det er uklart om andre mekanismer bidrar til sekvensutvik-ling i AAV infeksjoner. Den totale grad av mutasjon som inntrer under AAV replikering synes å være relativt lav og data antyder ikke høye frekvenser av replikasjonsfeil. Imidlertid er vesentlige omarrangeringer av AAV genom beskrevet under lytisk infeksjon som fører til dannelsen av defektive, interfererende partikler. Uansett de mekanismer som fører til sevkvensdivergens forble, med få unntak, vpl strukturen av kvasispe-siene intakt uten rammeskifte eller ikke-sense mutasjon, noe som antyder at kompetitiv seleksjon av vims med den gunstigste tilpasningsprofil bidrar til populasjonsdynamik-ken.
Disse studier har implikasjoner på flere områder av biologi og medisin. Konseptet med
hurtig vimsutvikling, tidligere antatt å være en egenskap begrenset til RNA vimser, bør tas i betraktning i DNA vimser som klassisk har værtkarakterisert vedserologiske analyser. Det vil være viktig uttrykt ved parvoviruser å utvikle en ny metode for å beskrive virusisolater som fanger inn kompleksiteten av deres struktur og biologi som ved HIV, som er kategorisert som generelle familier av lik struktur og funksjon kalt Clades. En alternativ strategi er å fortsette å kategorisere isolater med henblikk på serologisk spesi-fisitet og å utvikle kriterier for å beskrive varianter innen serologiske grupper.
Eksempel 3: Vektorologj for rekombinante AAV genomer utstyrt med AAV2 ITR er ved bmk av kimere plasmider inneholdende AAV2 rep- og nye AAV cap gener for serologisk og genoverføringsstudier i forskjellige dyremodeller.
Kimeriske pakningskonstrukter genereres ved å fusere AAV2 rep med cap sekvenser av nye AAV serotyper. Disse kimere pakkingskonstrukter benyttes i utgangspunktet for pseudotyping av rekombinante AAV genomer som bærer AAV2 ITR'er ved trippeltransfeksjon i 293 celler ved bruk av Ad5 hjelperplasmid. Disse pseudotyper vektorer benyttes for å evaluere ytelsen i transduksjonsbaserte, serologiske studier og evaluerer genoverføringseffektiviteten av nye AAV serotyper i forskjellige dyremodeller inkludert NHP og gnagere, før intakte og infektiøse vimser av disse nye serotyper isoleres.
A. pAAV2GFP
AAV2 plasmidet som inneholder AAV2 ITR'ene og grønt fluorescent protein uttrykt under kontroll av en konstitutiv promoter. Dette plasmid inneholder de følgende elementer: AAV2 ITR'ene, en CMV promoter, og GFP kodingssekvensen.
B. Kloning av trans plasmid
For å konstmere det kimeriske transplasmid for produksjon av rekombinante, pseudotypede AAV7 vektorer, ble p5E18 plasmidet (Xiao et al., 1999, "J. Virol." 73:3994-4003) partielt digestert med Xho I for å linealisere plasmid ved Xho I setet kun i posisjon 3169. De Xho I kuttede ender ble så fylt inn og ligert tilbake. Dette modifiserte p5E18 plasmid ble behandlet med Xba I og Xho I i en fullstendig digestering for å fjerne AAV2 cap gen sekvensen og erstattet med et 2267 bp Spe I/Xho fragment inneholdende AAV7 cap genet som var isolert fra pCRAAV7 6-5+15-4 plasmid.
Det resulterende plasmid inneholder AAV2 rep sekvensene for Rep78/68 under kontroll av AV2 P5 promoteren og AAV2 rep sekvensene for Rep52/40 under kontroll av AAV2 P19 promoteren. AAV7 capsid sekvensene er under kontroll av AAV2 P40 promoteren dette plasmid inneholder videre en spacer 5' av rep ORF.
C. Fremstilling av pseudotypet rAA V
rAAV partiklene (AAV2 vektor i AAV7 capsid) genereres under en adenovirusfri metode. Kort sagt ble cis plasmidet (pAAV2.1 lacZ plasmid inneholdende AAV2 ITR'ene) og trans plasmidet pCRAAV7 6-5+15-4 (inneholdende AAV2 rep og AAV7 cap) og henholdsvis et hjelperplasmid, samtidig kotransfektert inn i 293 celler i et forhold på 1:1:2 ved kalsiumfosfatprecipitering.
For konstmksjon av pAd hjelperplasmidene ble pBGlO plasmid ervervet fra Microbix (Canada). Et RsII fragment inneholdende L2 og L13 ble deletert fra pBHGlO, noe som gav det første hjelperplasmid, pAdAF13. Plasmid AdA Fl ble konstruert ved å klone Asp700/Sall fragment med en Pmel/Sgfl delesjon, isolering fra pBHGlO inni Bluescriptet. MLPL, L2 og L3, ble deletert i pAdAFl. Videre delesjoner av et 2,3 kb Nrul fragment og deretter et 0,5 kb RsrH/NruI fragment genererte hjelperplasmider pADAF5 henholdsvis pADAF6. Hjelperplasmidet, kalt pAF6, gav de vesentlige hjelperfunksjoner av E2a og E4 ORF6 som ikke ble tilveiebragt av den El-uttrykkende hjel-percelle, men er deletert fra adenovirale capsid proteiner og funksjonelle El områder.
Karakeristisk ble 50 ug DNA (cis:trans:hjelper) transfektert på en 150 mm vevkulturs-kål. 293 cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon, sonikert og behandlet med 0,5 % natriumdeoksykolat (37 °C i 10 minutter). Cellelysater ble så underkastet to run-der av en CsCl gradient. Toppfraksjoner inneholdende rAAV vektor ble samlet, slått sammen og dialysert mot PBS.
Eksempel 4: Dannelse av infektiøse kloner som bærer intakte, nye AAV serotyper for studie av prinsipiell virologi i human- og NHP avledede cellelinjer og bedømmelse av patogenese av nye AAV serotyper i NHP- og andre dyremodeller.
For å oppnå dette formål ble genom vandrer systemet benyttet for å oppnå 5'- og 3- terminal sekvenser (ITR'er) og fullstendig konstruksjon av kloner inneholdende intakte, nye AAV serotype genomer.
Ved bruk av et kommersielt tilgjengelig "Universal Genome Walker Kit" [Clontech] ble kort sagt genomiske DNA'er fra apevev eller cellelinjer som er identifisert som positive for nærvær av AAV7 sekvensen, digestert med Dra I-, EcoR V-, Pvu II- og Stu I-endonuklease og ligert til "Genome Walker Adaptor" for å generere 4 individuelle "Genome Walker Libraries" (GWL'er). Ved bruk av DNA'er fra GWL'ene som templater blir AAV7 og nabogenomiske sekvenser PCR-forsterket av adaptorprimer 1 (API, tilvei ebragt i settet) og en AAV7 spesifikk primer 1, fulgt av en nestet PCR ved bruk av adaptor primer 2 (AP2) og en ytterligere AAV7 spesifikk primer 2, begge interne i det første sett av primere. Hoved PCR produktene fra den "nestede" PCR klones og karakteriseres ved sekvensanalyse.
I dette forsøk ble primere som dekker de 257 bp eller andre signaturfragmenter av et generisk AAV genom benyttet for PCR forsterkning av cellulære DNA'er ekstrahert fra Human- og NHP avledede cellelinjer for å identifisere og karakterisere de latente AAV sekvenser. De identifiserte, latente AAV genomer gjenvinnes fra de positive cellelinjer ved bruk av adenovirushjelpere av forskjellige spesier og stammer.
For å isolere infektiøse AAV kloner fra NHP avledede cellelinjer oppnås en ønsket cellelinje fra ATCC og avsøkes ved PCR for å identifisere 257 bp amplikonet, det vil si oppfinnelsens signaturområde. Dette 257 bp PCR produkt klones og serotypes ved se-kvenseringsanalyse. For disse cellelinjer inneholdende AAV7 sekvensen blir cellene infisert med SV-15, en simian adenovirus ervervet fra ATCC, human Ad5 eller transfektert med plasmidkonstrukt som huser de humane Ad gener som er ansvarlige for AAV hjelperfunksjonene. 48 timer etter infeksjon eller transfeksjon blir cellene høstet og Hirt DNA preparert for kloning av AAV7 genom i henhold til Xiao et al., 1999, "J. Virol.", 73:3994-4003.
Eksempel 5: Fremstilling av AAV vektorer
En pseudotypingsstrategj tilsvarende den i eksempel 3 for AAV 1/7 ble benyttet for å
produsere AAV2 vektorer pakket med AAVl-, AAV5- og AAV8 capsid proteiner. Kort sagt blir rekombinante AAV genomer utstyrt med AAV2 ITRer pakket ved trippeltransfeksjon av 293 celler med cis-plasmid, adenovirushjelperplasmid og et kimerisk pakke-konstrukt der AAV2 rep genet er fusert med cap gener av nye AAV serotyper. For å skape de kimeriske pakningskonstrukter ble Xho I setet av p5E18 plasmid ablatert ved 3169 bp og det modfiserte plasmid ble behandlet med Xba I og Xho I i en fullstendig digestering for å fjerne AAV2 cap genet og erstatte dette med et 2267 bp Spe I/Xho I fragment inneholdende AAV8 cap genet [Xiao, W., et al., (1999) "J Virol" 73, 3994-4003]. En tilsvarende kloningsstrategj ble benyttet for å skape kimere pakningsplasmi-der av AAV2/1 og AAV2/5. Alle rekombinante vektorer ble renset ved standard CsCb sedimenteringsmetoden bortsett fra AAV2/2 som ble renset ved en enkelttrinns hepa-rinkromatografi.
Genomkopi (GC) titere av AAV vektorer ble bestemt ved TaqMan analyse ved bruk av prober og primere som siktes på SV40 poly A området som beskrevet tidligere [Gao, G, et al., (2000) "Hum Gene Ther" 11, 2079-91].
Vektorer ble konstruert for hver serotype for et antall av in vitro- og in vivo studier. Åtte forskjellige transgene kassetter ble innarbeidet i vektorene og rekombinante virioner ble fremstilt for hver serotype. Gjenvinningen av virus, basert på genomkopi er, er oppsummert i tabell 4. Utbyttene av vektor var høy for hver serotype uten noen konsistente forskjeller mellom serotypene. Data som er vist i tabellen er midlere genomkopiutbytter med standardavvik x IO<13>av multiple produksjonsloter på 50 plate (150 mm) transfek-sjoner.
Eksempel 6: Serologiske analyser av pseudotypede vektorer
C57BL/6 mus ble injisert med vektorer av forskjellige serotyper av AAVCBA1AT vektorer intramuskulært (5 x 10<11>) og serumprøver ble samlet 34 dager senere. For å teste nøytraliserings- og kryssnøytraliseringsaktiviteten for sera mot hver serotype av AAV, ble sera analysert i en transduksjonsbasert, nøytraliserende antistoffanalyse [Gao,G.P., et al., (1996) "J Virol", 70, 8934-43]. Mer spesielt ble nærvær av nøytraliserende antistoffer bestemt ved å bedømme evnen hos serum til å inhibere transduksjon av 84-31 celler med rapportørviruser (AAVCMVEGFP) av forskjellige serotyper. Spesifikt ble rapportørvirusen AAVCMVEGFP av hver serotype [ved infeksjonsmultiplisitet (MOI) som ledet til transduksjon av 90 % av indikatorcellene] forinkubert med varmeinaktivert serum fra dyr som hadde mottatt forskjellige serotyper av AAV fra naive mus. Etter 1 times inhibering ved 37 °C ble virusene satt til 84-31 cellene i 96 brønners plater i 48 eller 72 timer, avhengig av virus serotypen. Ekspresjonen av GFP ble målt ved Fluor-olmagjn (Molecular Dynamics) og kvantifisert ved "Image Quant Software". Nøytrali-serende antistofftitere ble rapportert som den høyeste serumfortynning som inhiberte transduksjon til mindre enn 50 %.
Tilgjengeligheten av GFP uttrykkende vektorer forenklet utviklingen av en analyse for nøytralisering av antistoffer som var basert på inhibering av transduksjon i en tillatende cellelinje (det vil 293 celler som stabilt uttrykker E4 fra Ad5). Sera til utvalgte AAV serotyper ble generert ved intramuskulær injeksjon av de rekombinante vimser. Nøytra-lisering av AAV transduksjonen ved 1:20- og 1:80 fortynninger av antisera ble evaluert (se tabell 5). Antisera til AAVl, AAV2, AAV5 og AAV8 nøytraliserte transduksjon av serotyper hvortil antiserumet ble generert (AAV5 og AAV8 i mindre grad enn AAVl og AAV2) men ikke til den andre serotype (det vil si at det ikke var noe bevis på noen kryssnøytralisering som antyder at AAV8 er en virkelig unik serotype).
Humansera fra 52 normale individer ble avsøkt på nøytralisering mot valgte serotyper. Ingen serumprøve ble funnet å nøytralisere AAV2/7 og AAV2/8 mens AAV2/2- og AAV2/1 vektorer ble nøytralisert i 20 % henholdsvis 10 % semm. En fraksjon av hu-mansammenslått IgG som representerer en samling av 60 000 individuelle prøver nøyt-raliserte ikke AAV2/7 og AAV2/8 mens AAV2/2- og AAV2/1 vektorene ble nøytrali-sert ved semmtitere lik 1:1280 henholdsvis 1:640.
Eksempel 7: In vivo evaluering av forskjellige serotyper av AAV vektorer
I denne studie ble 7 rekombinante AAV genomer, AAV2CBhAl AT, AAV2AlbhA1 AT, AAV2CMVrhCG, AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ og AAV2TBGLacZ pakket med capsid proteiner av forskjellige serotyper. I alle syv konstrukter var minigenkassetten flankert med AAV2 ITR'er. cDNAer av human a-antitrypsin- (AlAT) [Xiao, W., et al., (1999) "J Virol" 73, 3994-4003], P-subenheten av rhesusape koriogonadotropisk hormon- (CG) [Zoltick, P.W. & Wilson, J.M. (2000) " Mol Ther" 2,657-9], canine faktor IX- [Wang, L., et ala., (1997) " Proe Nati Acad Sei USA " 94, 11563-6] og bakteriell P-galaktosidase (det vil si Lac Z) gener ble benyttet som rapportørgener. For leverrettet genoverføring ble enten musealbumingenpromoter (Alb) [Xiao, W. (1999), supra] eller humantyroidhormonbindingsglobulingenpromoter (TBG) [Wang (1977), supra] benyttet for å drive leverspesifikk ekspresjon av rappor-tørgener. I muskelrettet genoverføringsforsøk ble enten den tidlige cytomegalovirus-promoter (CMV) eller kylling P-aktinpromoter med CMV enhancer (CB) benyttet for å styre ekspresjonen av rapportører.
For muskelrettet genoverføring ble vektorer injisert i den høyre tibialis anterior på 4-6 uker gamle nakne NCR- eller C57BL/6 mus (Taconic, Germantown, NY). I lever-rettet genoverføirngsstudier ble vektorer infusert intraportalt i 7-9 uker gamle nakne NCR-eller C57BL/6 mus (Taconic, Germantown, NY). Serumprøver ble samlet intraorbitalt på forskjellige tidspunkter etter vektoradministreringen. Muskel- og/eller levervev ble høstet på forskjellige tidspunkter for cryosnitt og Xgal histokjemisk farving fra dyr som fikk lacZ vektorene. For re-administreirngsforsøket fikk C56BL/6 mus først AAV2/1-, - 2/2-, -2/5-, -2/7- og -2/8CBA1 AT vektorer intramuskulært og fulgt for Al AT genekspresjon i 7 uker. Dyrene ble så behandlet med AAV"(8TBGcFDC intraportalt og studert for cFJX genekspresjon.
ELISA baserte analyser ble gjennomført for å kvantifisere serumnivåene av hAl AT-, rhCG- og cFIX proteiner som beskrevet tidligere [Gao, G.P., et al, (1996) " J Virol" 70, 8934-43; Zoltick, P.W. & Wilson, J.M. (2000) " Mol Ther" 2, 657-9; Wang, L., et al., " Proe Nati Acad Sei USA "94, 11563-6]. Forsøkene ble fullført når dyrene ble avlivet for høsting av muskel- og levervev for DNA ekstrahering og kvantitativ analyse av genomkopier av vektorer til stede i målvevet ved TaqMan ved bruk av det samme sett av primere og prober som ved titrering av vektorpreparatene [Zhang, Y., et al., (2001) " Mol Ther" 3, 697-707].
Ytelsen for vektorer basert på de nye serotyper ble bedømt i murinmodeller av muskel-og leverrettet genoverføring og sammenlignet med vektorer basert på de kjente serotyper AAVl, AAV2 og AAV5. Vektorer som uttrykker utskilte proteiner (a-antitrypsin (Al AT) og chorionisk gonadotropin (CG)) ble benyttet for å kvantifisere relative trans-duksjonseffektiviteter mellom forskjellige serotyper ved hjelp av ELISA analyse av sera. Cellulærfordelingen av transduksjon innen mål organet ble bedømt ved bruk av lacZ uttrykkende vektorer og Z-gal histokjemi.
Ytelsen for AAV vektorer i skjelettmuskelen ble analysert etter direkteinjeksjon i tibialis anterior musklene. Vektorer inneholdt det samme AAV2 baserte genom med det umiddelbart tidlige gen av CMV eller en CMV enhanced P-actin promoter, som driver ekspresjonen av transgenet. Tidlige studier indikerte at immunkompetente C57BL/6 mus utløste begrensede humorale responser til human Al AT proteinet når det ble uttrykt fra AAV vektorer [Xiao, W. Et al., (1999) " J Virol" 73, 3994-4003].
I hver stamme produserte AAV2/1 vektorer de høyeste nivåer av Al AT og AAV2/2 vektoren de laveste mens AAV2/7- og AAV2/8 vektorene viste mellomliggende nivåer for ekspresjonen. Toppnivåer av CG 28 dager etter injeksjonen av nu/nu NCR mus viste de høye nivåer fra AAV2/7 og de laveste fra AAV2/2 mens AAV2/8 og AAV2/1 lå mellom disse. Injeksjon av AAV2/1- og AAV2/7 lacZ vektorer gav genekspresjon ved injeksjonssetene i alle muskelfibrene med vesentlig færre lacZ positive fibre observert med AAV2/2- og AAV2/8 vektorer. Disse data antyder at transduksjonseffektiviteten med AAV2/7 vektorer i skjelettmuskelen er tilsvarende det som oppnås med AAV2/1 som er den mest effektive i skjelettmuskler av de tidligere beskrevne serotyper [Xiao, W. (1999), sitert ovenfor, Chao, H., et al., (2001), " Mol Ther" 4, 217-22; Chao, H., et al., (2000) " Mol Ther" 2, 619-23].
Tilsvarende murinmodeller ble benyttet for å evaluere leverrettet genoverføring. Identiske doser av vektorer basert på genomkopier ble infusert i portalvenene av mus som ble analysert deretter på ekspresjon av transgenet. Hver vektor inneholdt et AAV2 basert genom ved bruk av tidligere beskrevne, leverspesifikke promotere (det vil si albumin- eller tyroidhormonbindingsglobulin) for å drive ekspresjonen av transgenet. Mer spesielt ble CMVCG- og TBGCG minigen kassetter benyttet for muskel- henholdsvis leverberettet genoverføring. Nivåer av rhCG ble definert som relative enheter (Rus x IO<3>). Data er angitt fra analysering av serumprøver samlet dag 28 etter vektoradministrering (4 dyr per gruppe). Som vist i tabell 3 var virkningen av capsid proteiner på effektiviteten av transduksjon av Al AT vektorer i nu/nu- og C57BL/6 mus og CG vektorer i C57BL/6 mus konsistent (se tabell 6).
I alle tilfeller gav AAV2/8 vektorer de høyeste nivåer av transgen ekspresjon som lå fra 16 til 110 større enn det som ble oppnådd med AAV2/2 vektorer; ekspresjonen fra AAV2/5- og AAV2/7 vektorer lå mellom med AAV2/7 høyere enn AAV2/5. Analyser av X-Gal farvede leversnitt fra dyr som mottok de tilsvarende lacZ vektorer viste en korrelasjon mellom antallet transduserte celler og de totale nivåer av transgen ekspresjon. DNA'er som var ekstrahert fra levere fra C57BL/6 mus som fikk Al AT vektorene ble analysert på forekomsten av vektor DNA ved bruk av sann-tid PCR teknologi.
Mengden vektor DNA som ble funnet i leveren 56 dager etter injeksjon korrelerte med nivåene av transgen ekspresjonen (se tabell 7). For dette forsøk ble et sett av probe og primere innsiktet på SV40 polyA området av vektorgenomet benyttet for TaqMan PCR. De viste verdier er gjennomsnittet av tre individuelle dyr med standardavvik. Dyrene ble avlivet dag 56 for å høste levervev for DNA ekstrahering. Disse studier antyder at AAV8 er den mest effektive vektor for leverrettet genoverføring på grunn av øket antall transduserte hepatocyter.
De serologiske data som er beskrevet ovenfor antyder at AAV2/8 vektorer ikke skulle
nøytraliseres in vivo etter immunisering med de andre serotyper. C57BL/6 mus som fikk intraportale injeksjoner av AAV2/8 vektorer uttrykker canine faktor JX (IO<11>genomkopi er) 56 dager etter at de fikk intramuskulære injeksjoner av Al AT vektorer fra forskjellige serotyper. Høye nivåer av faktor JX ekspresjon ble oppnådd 14 dager etter infusjon av AAV2/8 i naive dyr (17±2 ug/ml, n=4), noe som ikke var signifikant forskjellig fra det som ble observert hos dyr som var immunisert med AAV2/1 (31±23 ug/ml, n=4), AAV2/2 (16 ug/ml, n=2) og AAV2/7 (12 ug/ml, n=2). Dette står i motsetning til det som ble observert i AAV2/8 immuniserte dyr som var infusert med AAV2/8 faktor JX vektor der ingen detekterbar faktor JX ble observert (<0,1 ug/ml, n=4).
Oligonukleotider til konserverte områder av cap genet forsterket sekvenser fra rhesusaper som representerte unike AAVer. Identiske cap signatursekvenser ble funnet i mange vev fra rhesusaper som stammet fra minst to forskjellige kolonier. Full-lengde rep- og cap åpen leserammer ble isolert og sekvensert fra enkelte kilder. Kun de cap åpne leserammer av de nye AAVer var nødvendige for å evaluere deres potensiale som vektorer fordi vektorer med AAV7- eller AAV8 capsidene ble generert ved bruk av ITR'ene og rep fra AAV2. Dette forenklet også sammenligningen mellom forskjellige vektorer fordi det aktuelle vektorgenom er identisk mellom forskjellige vektor serotyper. Således var utbyttene av rekombinante vektorer som var generert ved bruk av denne vei ikke vesentlig forskjellig mellom serotypene.
Vektorer basert på AAV7 og AAV8 syntes å være immunologisk distinkte (det vil si at de ikke ble nøytralisert av antistoffer generert mot andre serotyper). Videre nøytraliserte ikke sera fra mennesker transduksjon med AAV7- og AAV8 vektorer, noe som er en vesentlig fordel i forhold til de humanavledede AAVer som i dag er under utvikling for hvilke en signifikant andel av den humane populasjon har pre-eksisterende immunitet som er nøytraliserende [Chirmule, N., et al., (1999) " Gene Ther" 6, 1574-83].
Tropismen for hver ny vektor er gunstig for in vivo anvendelser. AAV2/7 vektorene synes å transdusere skjelettmuskelen like effektivt som AAV2/1 som er den serotype som gir det høyeste nivå av transduksjon i skjelettmuskelen hos primat AAVer testet til i dag [Xioa., W., supra; Chou (2001), supra og Chou (2000) supra]. Viktig er at AAV2/8 gir en vesentlig fordel i forhold til de andre serotyper uttrykt ved effektivitet ved genoverføring til leveren som inntil nu har vært relativt skuffende uttrykt ved antallet hepatocyter som stabilt ble transdusert. AAV2/8 oppnådde konsistent en 10 til 100- gangers forbedring i genoverføringseffektiviteten sammenlignet med de andre vektorer. Basis for den forbedrede effektivitet for AAV2/8 er uklar selv om det muligens skyldes opptaket via en annen receptor som er mer aktiv i den basolaterale overflate av hepatocytene. Denne forbedre effektivitet vil være heller brukbar ved utvikling av leverrettet genoverføring der antallet transduserte celler er kritisk, for eksempel slik tilfellet er når det gjelder urea cyklus lidelser og arvelig hyperkolesterolemi.
Således tilveiebringer oppfinnelsen en ny tilnærmelse for isolering av nye AAVer basert på PCR gjenvinning av genomiske sekvenser. De forsterkede sekvenser ble lett innarbeidet i vektorer og testet i dyr. Mangelen på for-eksisterende immunitet til AAV7 og den gunstige tropisme hos vektorene for muskelen antyder at AAV7 er egnet for anvendelse som vektor i humangenterapi og andre in vivo anvendelser. Tilsvarende gjør mangelen på for-eksisterende immunitet mot AAV serotypene ifølge oppfinnelsen, og deres tropismer, dem også brukbare for avlevering av terapeutiske molekyler og andre brukbare molekyler.
Eksempel 9 - Vevtropismestudier
Ved konstruksjonen av et høyytelsesfunksjonelt screeningskjema for nye AAV konstrukter ble en ikke-vev spesifikk og meget aktiv promoter, CB promoteren (CMV enhanced kylling p actin promoter) valgt for å drive et lett detekterbart og kvantifiser-bart rapportørgen, human a anti-trypsin genet. Således behøver man kun å lave en vektor for hver nye AAV klon for genoverføringsstudiet som tar sikte på 3 forskjellige vev, lever, lunge og muskel, for avsøking for vevtropisme for et spesielt AAV konstrukt. Tabell 8 oppsummerer data som er generert fra 4 nye AAV vektorer i vevtropismestudi-ene (AAVCBA1 AT), hvorfra en ny AAV capsid klon, 44.2, ble funnet å være en meget potent genoverføringsbærer i alle 3 vev med stor avstand når det gjelder særlig lungevev. Tabell 8 rapporterer data oppnådd (i ug Al AT/ml serum) på studiens dag 14.
Et par andre forsøk ble så gjennomført for å bekrefte den overlegne tropisme for AAV 44,2 i lungevev. Først ble AAV vektorbåret CClOhalAT minigen for lungespesifikk ekspresjon pseudotypet med capsider av nye AAVer gitt til immundefekte dyr (nakne NCR) i et likt volum (50 ul hver av de opprinnelige preparater uten fortynning) via intratrakeale injeksjoner som gitt i tabell 9.1 tabell 9 vises 50 ul av hvert opprinnelige preparat per mus, NCR nakne, med detekteringsgrense >0,033 ug/ml, dag 28.
Vektorene ble også administrert til immunkompetente dyr (C57BL/6) i like genomkopier (1 x 10<11>) som vist i tabell 10. (1 x 10<11>GC per dyr, C57BL/6, dag 14, detekteringsgrense >0,033 ug/ml)
Data fra begge forsøk bekreftet den overlegne tropisme for klon 44,2 i lungerettet gen-overføring.
Interessant er at ytelsen for klon 44,2 i lever- og muskelrettet genoverføring også var fremragende, nær den til den beste levertransducer, AAV8, og den beste muskeltransdu-cer AAVl, noe som antyder at denne nye AAV har en viss spesiell biologisk signifi-kans.
For å studere serologiske egenskaper for disse nye AAVer ble pseudotypede AAVGFP vektorer skapt for immunisering av kaniner og in vitro transduksjon av 84-31 celler i nærvær og fravær av antisera mot de forskjellige capsider. Data er oppsummert nedenfor:
Eksempel 10 - Musemodell for arvelig hyperkolesterolemi
De følgende forsøk viser at AAV2/7 konstruktet ifølge oppfinnelsen avgir LDL receptoren og uttrykker LDL receptoren i en mengde tilstrekkelig til å redusere nivåene for plasmakolesterol og triglycerider i dyremodeller av arvelig hyperkolesterolemi.
A. Vektorkonstruksjon
AAV vektorer, pakket med AAV7- eller AAV8 capsid proteiner ble konstruert ved bruk av en pseudotypingsstrategi [Hildinger, M et al., " J. Virol" 2001; 75:6199-6203]. Rekombinante AAV genomer med AAV2 inverterte terminalrepeatere (ITR) ble pakket ved trippeltransfeksjon av 293 celler med cis-plasmidet, adenovirushjelperplasmidet og et kimerisk pakkingskonstrukt, en fusjon av capsidene av de nye AAV serotyper med rep genet av AAV2. Det kimeriske pakkingsplasmid ble konstruert som beskrevet tidligere [Hildinger et al, supra]. De rekombinante vektorer ble renset ved standard CsCb sedimenteringsmetoden. For å bestemme utbyttet ble TaqMan (Applied Biosystems) analyse gjennomført ved bruk av prober og primere som sikter på SV40 poly(A) området av vektorene [Gao GP, et al. " Hum Gene Ther." 2000 Okt 10, 11(15):2079-91]. De resulterende vektorer uttrykker trans genet under kontroll av den humane tyroid-hormonbindingsglobulingenpromoter (TBG).
B. Dyr
LDL receptordefekte mus med C57B1/6 bakgrunn ble ervervet fra Jackson Laboratory (Bar Harbour, ME, USA) og holdt som en formeringskoloni. Musene ble gitt ubegrenset tilgang til vann og fikk en Western Diet med høyt fettinnhold (høy % kolesterol) med start tre uker før vektorinjeksjon. På dag -7 så vel som dag 0 ble blod oppnådd via retroorbitale tappinger og lipidprofilen ble bedømt. Musene ble vilkårlig inndelt i syv grupper. Vektoren ble injisert via en intraportalinjeksjon som beskrevet tidligere ([Chen SJ et al., " Mol Therapy" 2000; 2(3), 256-261]. Kort sagt ble musene anestetisert med ketamin og xylazin. En laparotomy ble gjennomført og portalvenen eksponert. Ved bruk av en 30g nål ble den egnede dose av vektor, fortynnet i lOOul PBS, injisert direkte i portalvenen. Trykk ble lagt på injeksjonssetet for å sikre blødningsstoff. Huden rundt ble lukket og drapert og musene omhyggelig overvåket den følgende dag. Ukentlige tappinger ble gjennomført med start dag 14 etter leverrettet genoverføring for å måle blodlipidene. To dyr i hver gruppe ble avlivet på tidspunktene 6 uker og 12 uker etter vektorinjeksjon for å undersøke aterosklerotisk plakkstørrelse så vel som receptoreks-presjon. De gjenværende mus ble avlivet i uke 20 for plakkmåling og bestemmelse av trans gen ekspresjon.
C. Serum lipoprotein- og leverfunksjonsanalyse
Blodprøver ble oppnådd fra den retroorbitale pleksus etter en 6 timers fasteperiode. Serum ble separert fra plasma ved sentrifugering. Mengden plasmalipoproteiner og lever-transaminaser i serum ble detektert ved bruk av en automatisert, klinisk kjemianalysør (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassemann).
D. Detektering av transgenekspresjon
LDL receptor ekspresjon ble evaluert ved immunofluoressensfarving og Western Blot. For Western Blot ble frossent levervev homogenisert med lyseringsbuffer (20 mM Tris, pH7,4, 130mMNacl, 1 % triton X 100, proteinaseinhibitor (komplett, EDTA-fri, Roche Mannheim, Tyskland). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av "Micro BCA Protein Assay Reagent Kit" (Pierce, Rockford, IL). 40 ug protein ble oppløst i 4-15 % Tris-HCl "Ready Gels" (Biorad, Hercules, CA) og overført til en nitrocellulosemembran (InVitrogen). For å generere Anti-hLDL receptorantistoffer ble en kanin injisert intra-venøst med et AdhLDLr prep (lxlO<13>GC). Fire uker senere ble kaninserum oppnådd og benyttet for Western Blot. En 1:100 fortynning av serum ble benyttet som et primærantistoff fulgt av et HRP-konjugert anti-kanin IgG og ECL kjemiluminescent detektering ("ECL Western Blot Detection Kit", Amersham, Arlington Heights, IL).
E. Immunocytokjemi
For bestemmelse av LDL receptorekspresjonen i frosne leversnitt ble det gjennomført immunohistokjemianalyser. 10 um kryostatsnitt ble enten fiksert i aceton i 5 minutter eller ikke fiksert. Blokkering ble oppnådd via en 1 times inkuberingsperiode med 10 % gjeteserum. Snitt ble så inkubert i en time med det primære antistoff ved romtemperatur. Et kaninpolyklonalt antistoff anti-human LDL (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) ble benyttet fortynnet i henhold til produsentens instruksjoner. Snittene ble vasket med PBS og inkubert med 1:100 fortynnet fluorescein gjeteantikanin IgG (Sigma, St Louis, MO). Prøver ble til slutt undersøkt under fluoressensmikroskop Nikon Microphot-FXA. I alle tilfelle ble hver inkubering fulgt av utstrakt vasking med PBS. Negative kontroller bestod av forinkubering med PBS, utelatelse av det primære antistoff og erstatning av det primære antistoff med et isotypetilpasset ikke-immunt kon-trollantistoff. De tre typer kontroller som nevnt ovenfor ble gjennomført for hvert forsøk den samme dag.
F. Genoverføringseffektivitet
Levervev ble oppnådd etter avlivning av musene på de angitte tidspunkter. Vevet ble sjokkfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C inntil ytterligere prosessering. DNA ble ekstrahert fra levervevet ved bruk av et "QIAamp DNA Mini Kit" (QIAGEN Gmbh, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Genomkopi er av AAV vektorer i levervevet ble evaluert ved bruk av Taqman analyse ved bruk av prober og primere mot SV40 poly(A) halen som beskrevet ovenfor.
G. Aterosklerotisk plakkmåling
For kvantifisering av tilstedeværende aterosklerotisk plakk i museaorta ble musene anestetisert (10 % ketamin og xylazin, ip), brystet åpnet og arteriesystemet perfusert med iskold fosfatbufret saltoppløsning gjennom den venstre ventrikkel. Aorta ble så forsiktig hentet ut, skåret ned langs den ventrale midtlinje fra aortabuen ned til femoral- arteriene og fiksert i formalin. De lipidrike, aterosklerotiske plakk ble farvet med Sudan IV (Sigma, Tyskland) og aorta satt opp flatt på en sort voksoverflate. Bildet ble tatt med et Sony DXC-960 MD farvevideokamera. Området for plakk så vel som den fullstendi-ge aortaoverflate ble bestemt ved bruk av "Phase 3 Imaging Systems (Media Cyberne-tics).
H. Klaring av I125 LDL
To dyr per forsøksgruppe ble testet. En bolus av I<125->merket LDL (velvillig tilveiebragt av Dan Rader, U Penn) ble infusert langsomt gjennom halevenen i løpet av et tidsrom på 30 sekunder (1 000 000 tellinger [1<125>]-LDL fortynnet i 100 ul steril PBS/dyr. På tidspunktene 3 minutter, 30 minutter, 1,5 time, 3 timer og 6 timer etter injeksjon ble en blodprøve oppnådd via den retroorbitale pleksus. Plasma ble separert fra fullblodet og 10 ul plasma tellet i y-telleren. Til slutt ble andelen katabolsk grad beregnet fra de oppnådde lipoproteinklaringsdata.
I. Evaluering av leverlipidakkumulering
Oljerød farving av frosne leversnitt ble gjennomført for å bestemme lipidakkumulering. De frosne leversnitt ble kort skyllet i destillert vann fulgt av en 2 minutters inkuberingsperiode i absolutt propylenglykol. Snittene ble så farvet i oljerød oppløsning (0,5 % i propylenglykol) i 16 timer fulgt av en motfarving med Mayers hematoxylin-oppløsning i 30 sekunder og anbringelse i oppvarmet glyceringeleoppløsning.
For kvantifisering av leverkolesterol- og -triglyceridnivå ble leversnitt homogenisert og inkubert i kloroform:metanol 2:1 over natten. Etter tilsetning av 0,05 % H2SO4og sentrifugering i 10 minutter ble det nedre sjikt av hver prøve samlet, delt i to alikvoter og tørket under nitrogen. For kolesterolmålingen ble de tørkede lipider fra den første alikvot oppløst i 1 % Triton X-100 i kloroform. Når det var oppløst ble oppløsningen så tørket under nitrogen. Etter oppløsning av lipidene i ddH20 og inkubering i 30 minutter ved 37 °C ble den totale kolesterolkonsentrasjon målt ved bruk av et "Total Cholesterol Kit" (Wako Diagnostics). For den andre alikvot ble de tørkede lipider oppløst i alkoho-lisk KOH og inkubert ved 60 °C i 30 minutter. Deretter ble IM MgC12 tilsatt, fulgt av inkubering på is i 10 minutter og sentrifugering ved 14 000 omdreininger per minutt i 30 minutter. Supernatanten ble til slutt evaluert på triglycerider (Wako Diagnostics).
Alle av vektorene som var pseudotypet i et AAV2/8- eller AAV2/7 capsid reduserte totalkolesterol, LDL, og triglycerider, sammenlignet med kontrollen. Disse testvektorer korrigerte også fenotypen av kolesterolemi på dosisavhengjg måte. En reduksjon av plakkarealet for AAV2/8- og AAV2/7 mus ble observert i behandlede mus ved den førs-te test (2 måneder) og effekten ble observert å vare over hele forsøket (6 måneder).
Eksempel 10 - Funksjonell faktor IX ekspresjon og korreksjon av hemofili
A. Knock- out mus
Funksjonell caninefaktor IX (FIX) ekspresjon ble bedømt i hemofilia B mus. Vektorer med capsidene av AAVl, AAV2, AAV5, AAV7 eller AAV8 ble konstruert for å avlevere AAV2 5' ITR- lever-spesifikk promoter [LSP] - canine FIX - "woodchuck" hepatitt postregulatorisk element (WPRE) - AAV2 3' ITR. Vektorene ble konstruert som beskrevet hos Wang et al, 2000 " Molecular Therapy" 2: 154-158 ved bruk av de egnede capsider.
Knock-out mus ble generert som beskrevet hos Wang et al, 1997 " Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 94: 11563-11566. Denne modell etterlignet nært fenotypene av hemofili B hos mennesker.
Vektorer av forskjellige serotyper (AAVl, AAV2, AAV5, AAV7 og AAV8) ble avle-vert som en enkelt intraportal injeksjon i leveren til voksne hemofiliske C57B1/6 mus i en dose på lx 1011 GC/mus for de fem forskjellige serotyper og en gruppe fikk en AAV8 vektor ved en lavere dose, lxlO<10>GC/mus. Kontrollgruppen ble injisert med lxlO<11>GC av AAV2/8 TBG LacZ3. Hver gruppe inneholdt 5-10 hann- og hunnmus. Musene ble tappet hver annen uke etter vektoradministrering.
1. ELISA
Canine FIX konsentrasjonen i museplasma ble bestemt ved en ELISA analyse spesifikk for canine faktor JX, gjennomført i det vesentlige som beskrevet av Axelrod et al, 1990 " Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 87:5173-5177 med modifikasjoner. Saue anticaninefaktor IX (Enzyme Research Laboratories) ble benyttet som primærantistoff og kanin anti-canine faktor JX (Enzyme Research Laboratories) ble benyttet som sekundært antistoff. Med start to uker etter injeksjon ble økede plasmanivåer av cFJX bestemt for alle testvektorer. De økede nivåer ble holdt ved terapeutiske nivåer gjennom hele forsøkets lengde, det vil si til 12 uker. Terapeutiske nivåer anses å være 5 % av normale nivåer, det vil si rundt 250 ng/ml.
De høyeste nivåer av ekspresjon ble observert for AAV2/8- (ved 10<11>) og AAV2/7 konstruktene som opprettholdt superfysiologjske nivåer av cFJX (ti ganger høyere enn normalnivået). Ekspresjonsnivåene for AAV2/8 (IO<11>) var omtrent 10 ganger høyere enn den dose som ble observert for AAV2/2 og AAV2/8 (10<10>). De laveste ekspresjons-nivåer ble observert for AAV2/5 selv om dette fremdeles var over det terapeutiske området.
2. In vitro aktivertpartialtromboplastintid ( aPTT) analyse
Funksjonell faktor IV aktivitet i plasma hos FDC knock-out mus ble bestemt ved en in vitro aktivert partialtromboplastintid (aPTT) analyse. Museblodprøver ble samlet fra den retroorbitale pleksus i 1/10 volum citratbuffer. aPPT analysen ble gjennomført som beskrevet av Wang et al, 1977 i " Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 94:11563-11566.
Klumpingstidene ved aPTT på plasmaprøver for alle vektorinjiserte mus lå innen det normale området (cirka 60 sekunder), målt to uker etter injeksjon, og opprettholdt klumpingstider i det normale eller kortere enn normale området gjennom studieperioden (12 uker).
De laveste klumpingstider som ble opprettholdt ble observert i dyrene som fikk AAV2/8 (10<11>) og AAV2/7. Etter 12 uker induserte AAV2/2 også klumpingstider tilsvarende de for AAV2/8 og AAV2/7. Imidlertid ble de laveste klumpingstider ikke observert for AAV2/2 inntil uke 12 mens reduserte klumpingstider (i området 25 - 40 sekunder) ble observert for AAV2/8 og AAV2/7 med begynnelse i uke to.
Immunohistokjemifarving av levervevene høstet fra noen av de behandlede mus er for tiden under gjennomføring. Cirka 70-80 % av hepatocytene er farvet positive for canine FDC i mus injisert med AAV2/8.cFDC vektor.
B. Hemofili B hunder
Hunder som har en punktmutasjon i det katalytiske domenet av F.DC genet som, basert på modellstudier, synes å gjøre proteinet ustabilt, lider av hemofili B (Evans et al, 1989 i " Proe. Nati. Acad. Sei. "USA, 86:10095-10099). En koloni av slike hunder er holdt i mer enn to tiår ved University of North Carolina, Chapel Hill. De homeostatiske parametre for disse hunder er godt beskrevet og inkluderer fraværet av plasma F.DC antigen, fullblod klumpingstider på over 60 minutter mens normale hunder er 6-8 minutter, og forlenget aktivert partialtromboplastintid på 50-80 sekunder mens normale hunder har 13-28 sekunder. Disse hunder erfarer rekurrent spontanhemoragi. Karakteristisk ble signifikante blødningsepisoder med hell ordnet ved enkel intravenøs infusjon av 10 ml/kg normal canine plasma; leilighetsvis krever gjentatte infusjoner for å kontrollere blødningen.
Fire hunder injiseres intraportalt med AAV.cFIX i henhold til planen nedenfor. En førte hund mottar en enkelt injeksjon med AAV2/2.cFIX i en dose på 3,7xlO<n>genomkopier (GC)/kg. En andre hund mottar en første injeksjon på AAV2/2.cFIX (2,8xlOnGC/kg) fulgt av en andre injeksjon med AAV2/7.cFIX (2,3xl0<13>GC/kg) på dag 1180. En tredje hund mottar en enkelt injeksjon med AAV2/2.cFIX i en dose på 4,6xl0<12>GC/kg. Den fjerde hund mottar en injeksjon med AAV2/2.cFIX (2,8x10<12>GC/kg) og en injeksjon på dag 995 med AAV2/7.cFK (5xl012GC/kg).
Abdomen av hemofilihunder åpnes aseptisk og kirurgisk under generell anestesi og en enkelt infusjon av vektor administreres inn i portalvenen. Dyrene beskyttes mot hemo-ragj i den perioperative periode ved intravenøs administrering av normal canine plasma. Hundene sederes, intuberes for å indusere generell anestesi og abdomen barberes og prepareres. Etter at abdomen er åpnet flyttes milten til operasjonsfeltet. Miltvenen loka-liseres og en sutur plasseres løst proksimalt til et lite, distalt innsnitt i venen. En nål inn-føres hurtig i venen og deretter blir suturen løsnet og en 5 F kanyle anbragt til en intra-venøs lokasjon nær portalvenen og ført til en intravenøs lokasjon nær portalvenebifur-kasjonen. Etter at hemostase er sikret og kateterballongen blåst opp blir cirka 5,0 ml vektor fortynnet i PBS infusert i portalvenen i løpet av et intervall på 5 minutter. Vek-torinfusjonen følges av en 5,0 ml infusjon av saltoppløsning. Ballongen blir så avlastet, callula fjernet og den venøse hemostase sikret. Milten blir så bragt tilbake, blødende kar kauterisert og operasjonssåret lukket. Dyret ekstuberes og har tålt den kirurgiske prose-dyre godt. Blodprøvene analyseres som beskrevet [Wang et al, 2000 i " Molecular Therapy" 2: 154-158].
Resultater som viser korreksjon eller partialkorreksjon er antisipert for AAV2/7.
Alle publikasjoner som er nevnt i beskrivelsen skal anses som en del av denne. Mens oppfinnelsen er beskrevet under henvisning til spesielt foretrukne utførelsesformer skal det være klart at modifikasjoner kan foretas uten å gå utenfor oppfinnelsens ramme. Slike modifikasjoner er ment å ligge innenfor kravenes ramme.

Claims (15)

1. Adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at det omfatter et AAV capsid som har en aminosyresekvens AAV7, aminosyrer 1 til 737 fra SEQ ID NO:2 eller en sekvens som er minst 95% identisk dermed og et minigen som har AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et heterologt gen operativt koblet til regulatoriske sekvenser som dirigerer dets ekspresjon i en vertscelle.
2. AAV i følge krav 1, karakterisert ved at ITRene er fra AAV2
3. Isolert capsidprotein, karakterisert ved et AAV7 protein valgt fra gruppen bestående av: vp2 capsidprotein, aminosyrer 138 til 737 fra SEQ ID NO:2; og vp3 capsidprotein, aminosyrer 203 til 737 fra SEQ ID NO:2.
4. Adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at det omfatter minst et AAV7 vp3 som har aminosyresekvensen fra 203 til 737 fra SEQ ID NO:2 eller en sekvens som er minst 95% identisk dertil og et minigen som har AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et heterologt gen operativt koblet til regulatoriske sekvenser som dirigerer dets ekspresjon i en vertscelle.
5. Isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl karakterisert v e d at det koder for et protein i følge krav 3.
6. Isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl som koder for et nytt adenoassosiert virus (AAV) 7 capsidprotein, karakterisert ved at det har en aminosyresekvens 1 til 737 fra SEQ ID NO:2.
7. Isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl som koder for et fragment fra et adeno-assosiert virus 7 capsidprotein, karakterisert ved at nevnte nukleinsyresekvens er valgt fra gruppen bestående av: vpl, nukleotidene 2222 til 4435 fra SEQ ID NO:l; vp2, nukleotider 2633 til 4435 fra SEQ ID NO:l; og vp3, nukleotider 2831 til 4435 fra SEQ ID NO:l.
8. Molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 5 til 7, karakterisert ved at nevnte molekyl er et plasmid.
9. Molekyl i følge et hvilket som helse av kravene 5 til 7, karakterisert ved at nevnte molekyl ytterligere omfatter et funksjonelt AAV rep gen.
10. Fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at den omfatter et AAV serotype capsid som omfatter trinnene å dyrke en vertcelle som inneholder: a) et molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 5 til 7 som koder for et adenoassosiert viruscapsid; b) et funksjonelt rep gen; c) et minigen som omfatter AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et transgen; og d) tilstrekkelige hjelperfunksjoner som tillater pakking av minigenet inn i AAV capsidproteinet.
11. In vitro vertcelle, karakterisert ved at den er transfektert med et adenoassosiert virus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 2 eller et molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 5 til 9.
12. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter AAV i følge krav 1 eller 4, og en fysiologisk kompatibel bærer.
13. Sammensetning karakterisert ved at den omfatter et molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 6 til 9, og en fysiologisk kompatibel bærer.
14. Isolert eller syntetisk adenoassosiert (AAV) 7 rep protein eller et fragment derav, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av aminosyrer 1 til 623, aminosyrer 1 til 171, aminosyrer 172 til 372 og aminosyrer 445 til 623 fra SEQ ID NO:3.
15. Isolert eller syntetisk nukleinsyre molekyl, karakterisert ved a t det koder for en adenoassosiert virus (AAV) serotype 7 aminosyresekvens i følge krav 14.
NO20140988A 2001-11-13 2014-08-14 Adeno-assosierte virus (AAV) capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, vertscelle samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning NO336801B1 (no)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35060701P 2001-11-13 2001-11-13
US34111701P 2001-12-17 2001-12-17
US37706602P 2002-05-01 2002-05-01
US38667502P 2002-06-05 2002-06-05
PCT/US2002/033629 WO2003042397A2 (en) 2001-11-13 2002-11-12 A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20140988L true NO20140988L (no) 2004-07-14
NO336801B1 NO336801B1 (no) 2015-11-02

Family

ID=27502639

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20042183A NO334379B1 (no) 2001-11-13 2004-05-26 Fremgangsmåte for detektering av adenoassosiert virus (AAV) i en prøve, samt kit for detektering av et ukjent AAV i en prøve
NO20131359A NO336468B1 (no) 2001-11-13 2013-10-14 Adeno-assosierte virus (AAV8) capsidprotein, vertcelle og vektor inneholdende dette samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning
NO20140988A NO336801B1 (no) 2001-11-13 2014-08-14 Adeno-assosierte virus (AAV) capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, vertscelle samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning
NO20150196A NO338362B1 (no) 2001-11-13 2015-02-10 Adeno-assosierte virus (AAV), fremgangsmåte for fremstilling derav, isolert capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, molekyl, vertscelle samt sammensetning.

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20042183A NO334379B1 (no) 2001-11-13 2004-05-26 Fremgangsmåte for detektering av adenoassosiert virus (AAV) i en prøve, samt kit for detektering av et ukjent AAV i en prøve
NO20131359A NO336468B1 (no) 2001-11-13 2013-10-14 Adeno-assosierte virus (AAV8) capsidprotein, vertcelle og vektor inneholdende dette samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20150196A NO338362B1 (no) 2001-11-13 2015-02-10 Adeno-assosierte virus (AAV), fremgangsmåte for fremstilling derav, isolert capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, molekyl, vertscelle samt sammensetning.

Country Status (23)

Country Link
US (15) US20030138772A1 (no)
EP (4) EP2341068B1 (no)
JP (6) JP3958191B2 (no)
KR (2) KR101015854B1 (no)
CN (6) CN103589692B (no)
AT (2) ATE520707T1 (no)
AU (1) AU2002361573B2 (no)
BR (3) BRPI0214119B8 (no)
CA (8) CA2864537C (no)
DE (1) DE60209193T2 (no)
DK (1) DK1310571T3 (no)
ES (3) ES2439515T3 (no)
HK (2) HK1056198A1 (no)
HU (2) HU230406B1 (no)
IL (11) IL270065B2 (no)
MX (3) MX346493B (no)
NO (4) NO334379B1 (no)
NZ (7) NZ564506A (no)
PH (2) PH12014501487A1 (no)
PL (4) PL220644B1 (no)
SG (5) SG10201506627PA (no)
WO (1) WO2003042397A2 (no)
ZA (1) ZA200403360B (no)

Families Citing this family (514)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
AU762220B2 (en) 1998-05-28 2003-06-19 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The AAV5 vector and uses thereof
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20040121309A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
BRPI0214119B8 (pt) 2001-11-13 2021-05-25 Univ Pennsylvania vírus adenoassociado recombinante, método de geração do referido vírus e composição compreendendo o referido vírus
EP2573170B1 (en) * 2001-12-17 2017-12-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
PT1453547T (pt) 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
WO2003093460A1 (en) 2002-04-29 2003-11-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular dna of tissues
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
AU2003265855A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 University Of Florida Modified aav
JP2006516193A (ja) 2002-12-06 2006-06-29 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
WO2005017101A2 (en) 2003-05-19 2005-02-24 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof
DK2657248T3 (en) 2003-06-19 2017-06-26 Genzyme Corp AAV virions with reduced immunoreactivity and applications thereof
US9233131B2 (en) * 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
NZ545656A (en) * 2003-09-01 2009-02-28 Amc Amsterdam AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
AU2010201278B2 (en) * 2003-09-01 2012-11-15 Academisch Medisch Centrum AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8394945B2 (en) 2003-09-11 2013-03-12 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
PT3211085T (pt) 2003-09-30 2021-06-17 Univ Pennsylvania Clados de vírus adeno-associados (aav), sequências, vetores que as contêm, e suas utilizações
AU2011250849B2 (en) * 2003-09-30 2013-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2005056807A2 (en) 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
WO2006033672A2 (en) 2004-04-28 2006-03-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
CA2563538C (en) * 2004-04-28 2013-12-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
CA2567839C (en) 2004-05-24 2011-06-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006073496A2 (en) * 2004-07-30 2006-07-13 Targeted Genetics Corporation Recombinant aav based vaccine methods
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
MX2007003922A (es) * 2004-10-05 2007-06-07 Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa Nuevas propenonas ciclicas y aciclicas para tratar trastornos del sistema nervioso central.
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
CA2600184A1 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
CN101203613B (zh) * 2005-04-07 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
WO2006119432A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
CA2616281C (en) 2005-07-21 2014-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of mitochondrial dna variants
EP1957678B1 (en) * 2005-11-28 2012-06-13 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
CN101528916B (zh) 2006-04-28 2013-09-04 宾夕法尼亚大学托管会 规模可调的aav生产方法
ES2398593T3 (es) * 2006-07-25 2013-03-20 Celladon Corporation Infusión coronaria epicárdica anterógrada prolongada de vectores víricos adeno-asociados que comprenden SERCA2a para la terapia génica
EP2064332B1 (en) 2006-09-14 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2008104002A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
LT2191001T (lt) 2007-04-09 2016-10-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Raav vektoriaus kompozicijos, turinčios tirozin-modifikuotų kapsidės baltymų ir jų panaudojimo būdai
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
ES2538468T3 (es) 2008-05-20 2015-06-22 Eos Neuroscience, Inc. Vectores para la administración de proteínas sensibles a la luz y métodos para su utilización
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
US8148163B2 (en) 2008-09-16 2012-04-03 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
PL2425000T3 (pl) 2009-04-30 2019-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje do kierowania komórek przewodzących do dróg oddechowych zawierające konstrukty wirusów związanych z adenowirusami
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
WO2010143761A1 (ko) * 2009-06-12 2010-12-16 (주)바이오니아 미지시료 내 감염성 미생물을 신속하게 검출하는 방법
EP2454000A4 (en) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
US20120244127A1 (en) 2009-10-01 2012-09-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV Vectors Expressing SEC10 for Treating Kidney Damage
EP2488656B1 (en) 2009-10-15 2015-06-03 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
CN102869779A (zh) 2010-03-29 2013-01-09 宾夕法尼亚大学托管会 药理学诱导的转基因消融系统
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
EP3444346B1 (en) 2010-04-23 2022-07-27 University of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
WO2011133890A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
US9309534B2 (en) 2010-07-12 2016-04-12 Universidad Autonoma De Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
EP2699688A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
EP3318634A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating diseases involving dominant-negative or gain of function mutations
SG194583A1 (en) 2011-04-22 2013-12-30 Univ California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US9169299B2 (en) * 2011-08-24 2015-10-27 The Board Of Trustees Of The Leleand Stanford Junior University AAV capsid proteins for nucleic acid transfer
US20130136729A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-30 University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors
CN104520428B (zh) * 2012-02-17 2018-09-21 费城儿童医院 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法
WO2013130393A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 Cornell University Aav-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation
WO2013154744A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Cornell University Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
ES2741502T3 (es) 2013-02-08 2020-02-11 Univ Pennsylvania Cápside de AAV8 modificada para la transferencia génica para terapias de retina
DK2956477T4 (da) 2013-02-15 2024-04-15 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
US8957044B2 (en) 2013-03-01 2015-02-17 Wake Forest University Health Sciences Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM)
ES2805355T3 (es) 2013-03-15 2021-02-11 Univ Pennsylvania Composiciones para tratar MPSI
WO2015012924A2 (en) 2013-04-29 2015-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof
JP6600624B2 (ja) 2013-05-31 2019-10-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
WO2015013313A2 (en) 2013-07-22 2015-01-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
SI3099333T1 (sl) 2014-01-31 2021-04-30 Temple University of the Commonwealth System of Higher Education 1938 Liacouras Walk BAG3 kot tarča za terapijo srčne odpovedi
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015127128A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Massachusetts Recombinant aavs having useful transcytosis properties
SI3116900T1 (sl) 2014-03-09 2021-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sestavki uporabni pri zdravljenju pomanjkanja ornitin transkarbamilaze(OTC)
CN106414474B (zh) 2014-03-17 2021-01-15 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于视锥细胞中增强的基因表达的组合物和方法
WO2015143078A1 (en) 2014-03-18 2015-09-24 University Of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
HUE046454T2 (hu) 2014-03-21 2020-03-30 Genzyme Corp Retinitis pigmentosa génterápia
EP2933335A1 (en) 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
EP3134522B1 (en) 2014-04-25 2021-10-06 University of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
EP3134115A4 (en) 2014-04-25 2017-10-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
WO2015164778A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennysylvania Ldlr variants and their use in compositions for reducing cholesterol levels
SG11201609207SA (en) 2014-05-13 2016-12-29 Univ Pennsylvania Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof
US10689653B2 (en) 2014-06-03 2020-06-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
AU2015283850B2 (en) 2014-07-03 2020-06-04 Board Of Regents, University Of Texas System GLS1 inhibitors for treating disease
EP4012035A1 (en) 2014-09-16 2022-06-15 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
CA2961523A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
EP3200830B1 (en) 2014-10-03 2020-09-09 University of Massachusetts High efficiency library-identified aav vectors
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
CN107073051B (zh) 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
CN112553229A (zh) 2014-11-05 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
DK3218386T3 (da) 2014-11-14 2021-06-07 Voyager Therapeutics Inc Modulatorisk polynukleotid
KR102599909B1 (ko) 2014-11-14 2023-11-09 보이저 테라퓨틱스, 인크. 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
CA2974235A1 (en) 2015-01-07 2016-07-14 Universitat Autonoma De Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
US20180021364A1 (en) 2015-01-16 2018-01-25 Voyager Therapeutics, Inc. Central nervous system targeting polynucleotides
CA2974378A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 Genzyme Corporation Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles
WO2016126857A1 (en) * 2015-02-03 2016-08-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
US10676726B2 (en) 2015-02-09 2020-06-09 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
PT3256594T (pt) 2015-02-10 2022-01-18 Genzyme Corp Entrega intensificada de partículas virais ao corpo estriado e córtex
WO2016130589A2 (en) 2015-02-10 2016-08-18 Genzyme Corporation VARIANT RNAi
US10584321B2 (en) 2015-02-13 2020-03-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
WO2016141078A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Avalanche Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
US20180042991A1 (en) 2015-03-10 2018-02-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Recombinant glut1 adeno-associated viral vector constructs and related methods for restoring glut1 expression
JP6836999B2 (ja) 2015-03-24 2021-03-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
EP3285788A4 (en) 2015-04-23 2018-12-05 University of Massachusetts Modulation of aav vector transgene expression
WO2016172008A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 University Of Massachusetts Modified aav constructions and uses thereof
US20180110877A1 (en) 2015-04-27 2018-04-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania DUAL AAV VECTOR SYSTEM FOR CRISPR/Cas9 MEDIATED CORRECTION OF HUMAN DISEASE
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
CA2985081A1 (en) 2015-05-13 2016-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
RU2021132397A (ru) 2015-05-16 2022-02-24 Джензим Корпорейшн Генное редактирование глубоких интронных мутаций
MX2018000307A (es) 2015-06-23 2018-05-02 Childrens Hospital Philadelphia Factor ix modificado, y composiciones, metodos y usos para la transferencia de genes a celulas, organos y tejidos.
US10676735B2 (en) 2015-07-22 2020-06-09 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
KR20180038558A (ko) 2015-08-25 2018-04-16 듀크 유니버시티 Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 이용하는 게놈 조작에서 특이성을 개선하는 조성물 및 방법
KR20180057636A (ko) 2015-08-31 2018-05-30 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 반려 동물 치료용 aav-epo
KR20180055872A (ko) 2015-09-24 2018-05-25 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 보체 매개 질환 치료용 조성물 및 방법
EP3831842A1 (en) 2015-09-28 2021-06-09 The University of North Carolina at Chapel Hill Methods and compositions for antibody-evading virus vectors
US11273227B2 (en) 2015-10-09 2022-03-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful in treating Stargardt's disease and other ocular disorders
US11970710B2 (en) 2015-10-13 2024-04-30 Duke University Genome engineering with Type I CRISPR systems in eukaryotic cells
EP3364997B1 (en) 2015-10-22 2024-01-17 University of Massachusetts Aspartoacylase gene therapy in the treatment of canavan disease
WO2017070516A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
JP2019501115A (ja) 2015-10-28 2019-01-17 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクターのくも膜下腔内投与
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
CA3001941A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Nbe-Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
EP3384035A4 (en) 2015-12-02 2019-08-07 Voyager Therapeutics, Inc. ASSAYS FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES OF VAA
FR3044926B1 (fr) 2015-12-09 2020-01-31 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
US11015173B2 (en) 2015-12-11 2021-05-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAV1
ES2918998T3 (es) 2015-12-11 2022-07-21 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAVrh10
EP3387138B1 (en) 2015-12-11 2022-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav9
BR112018011687A2 (pt) 2015-12-11 2018-12-04 Univ Pennsylvania terapia de gene para tratar hipercolesterolemia familiar
WO2017100676A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav8
AU2016370487C1 (en) 2015-12-14 2022-03-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for ocular disorders
CA3007330A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition for treatment of crigler-najjar syndrome
KR20180098294A (ko) 2015-12-15 2018-09-03 젠자임 코포레이션 뮤코지질증 ii형을 치료하기 위한 아데노-관련 바이러스 벡터
BR112018014615A2 (pt) 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
US11753461B2 (en) 2016-02-01 2023-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor VIII genes
CA3011939A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
US10973929B2 (en) 2016-02-03 2021-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type I
EP4094780A3 (en) 2016-02-12 2023-02-08 University of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
WO2017151717A1 (en) * 2016-03-01 2017-09-08 French Brent A Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells
WO2017176929A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 University Of Massachusetts Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
EP3443001A4 (en) 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
US11413356B2 (en) 2016-04-15 2022-08-16 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
IL298604A (en) 2016-04-15 2023-01-01 Univ Pennsylvania Novel aav8 mutant capsids and preparations containing them
AU2017248731A1 (en) 2016-04-15 2018-10-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
SG10201912761UA (en) 2016-04-15 2020-02-27 The Trustees Of The Univ Of Pennsyvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
US11191847B2 (en) 2016-04-15 2021-12-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating hemophilia B
SG11201808422QA (en) 2016-04-15 2018-10-30 Univ Pennsylvania Gene therapy for treating hemophilia a
US11401527B2 (en) 2016-04-17 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
GB201608046D0 (en) * 2016-05-09 2016-06-22 Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Treatment of complement-mediated disorders
ES2941502T3 (es) 2016-05-13 2023-05-23 4D Molecular Therapeutics Inc Variantes de cápsides de virus adenoasociado y procedimientos de utilización de las mismas
AU2017267665C1 (en) 2016-05-18 2023-10-05 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
CA3024449A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
US11158076B2 (en) 2016-06-08 2021-10-26 Sony Corporation Imaging control device and method, and vehicle
US11882815B2 (en) 2016-06-15 2024-01-30 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
CA3029864A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 University Of Massachusetts Aav2-mediated gene delivery of sfasl as a neuroprotective therapy in glaucoma
AU2017292010B2 (en) 2016-07-08 2023-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treatment of disorders and diseases involving RDH12
US11883470B2 (en) 2016-07-25 2024-01-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof
JP6994018B2 (ja) 2016-07-26 2022-01-14 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 新規アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質
JP7071332B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
MX2019001938A (es) 2016-08-15 2019-07-04 Genzyme Corp Metodos para detectar aav.
AU2017321488B2 (en) 2016-08-30 2022-10-20 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
EP3518985A4 (en) * 2016-09-29 2020-08-05 University of Florida Research Foundation, Incorporated AAVRH.10 VARIANTS WITH HOST ANTIBODY EXHAUST CAPACITIES AND MODIFIED TISSUE TARGETING PROPERTIES
US11578340B2 (en) 2016-10-13 2023-02-14 University Of Massachusetts AAV capsid designs
US11192925B2 (en) 2016-10-19 2021-12-07 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
WO2018100054A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of retinal degenerative diseases
US11584931B2 (en) 2016-12-14 2023-02-21 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (DIP)
US11382941B2 (en) * 2016-12-30 2022-07-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating Phenylketonuria
EP3571298A4 (en) 2017-01-20 2020-10-21 University of Pittsburgh - of The Commonwealth System of Higher Education TREATMENT FOR CRAB'S LATERAL CORD BLOOD TRANSPLANTATION (UCBT) AND INCREASED GALACTOCEREBROSIDASE (GALC) EXPRESSION
US11554147B2 (en) 2017-02-20 2023-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating familial hypercholesterolemia
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
SG10201913833PA (en) 2017-02-28 2020-03-30 Univ Pennsylvania Influenza vaccines based on aav vectors
CA3053399A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel adeno-associated virus (aav) clade f vector and uses therefor
CA3054136A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for ocular disorders
EP3589311A1 (en) 2017-03-02 2020-01-08 Genethon Method for removing anti-aav antibodies from a blood-derived composition
EP3606544A4 (en) 2017-04-05 2021-04-07 University of Massachusetts MINI-GENE THERAPY
EP3610016A1 (en) 2017-04-10 2020-02-19 Genethon Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies
KR20190139951A (ko) 2017-04-14 2019-12-18 리젠엑스바이오 인크. 인간 뉴런 또는 신경교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 이두로네이트-2 설파타제(ids)를 이용한 뮤코다당증 ii형의 치료
US11879133B2 (en) 2017-04-24 2024-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for ocular disorders
AU2018261003A1 (en) 2017-05-05 2019-11-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's Disease
US11603542B2 (en) 2017-05-05 2023-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CA3059213A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
SG11201910015SA (en) 2017-05-11 2019-11-28 Univ Pennsylvania Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
JP2020519294A (ja) 2017-05-12 2020-07-02 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ ウイルスベクター産生
CN108103058A (zh) * 2017-05-12 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种i型糖尿病的基因治疗药物
CA3098592A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating peroxisomal disorders
JP2020522269A (ja) 2017-06-06 2020-07-30 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ レット症候群におけるｍｅｃｐ２の安全な発現のための自己調節ａａｖベクター
JP2020527335A (ja) 2017-06-14 2020-09-10 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 眼疾患のための遺伝子療法
US10721272B2 (en) 2017-06-15 2020-07-21 Palo Alto Networks, Inc. Mobile equipment identity and/or IOT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US10693918B2 (en) 2017-06-15 2020-06-23 Palo Alto Networks, Inc. Radio access technology based security in service provider networks
US10708306B2 (en) 2017-06-15 2020-07-07 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US10812532B2 (en) 2017-06-15 2020-10-20 Palo Alto Networks, Inc. Security for cellular internet of things in mobile networks
US11050789B2 (en) 2017-06-15 2021-06-29 Palo Alto Networks, Inc. Location based security in service provider networks
JP2020525010A (ja) * 2017-06-22 2020-08-27 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 制御性免疫細胞を産生するための方法及びその使用
US11890329B2 (en) 2017-07-06 2024-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type I
CA3069045A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Genethon Novel polynucleotides encoding a human fkrp protein
AU2018302016A1 (en) 2017-07-17 2020-02-06 The Regents Of The University Of California Trajectory array guide system
CA3071978A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
SG11202000846WA (en) 2017-08-07 2020-02-27 Nbe Therapeutics Ag Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
CN110709511A (zh) * 2017-08-28 2020-01-17 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒衣壳变体及其使用方法
SG11202002276VA (en) 2017-09-20 2020-04-29 4D Molecular Therapeutics Inc Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
BR112020005569A2 (pt) 2017-09-22 2020-10-06 Genzyme Corporation rna de interferência (rnai) variante
SG11202002457RA (en) 2017-09-22 2020-04-29 Univ Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
CA3075643A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 University Of Massachusetts Sod1 dual expression vectors and uses thereof
EP3692151A4 (en) * 2017-10-03 2021-07-14 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS
TWI804518B (zh) 2017-10-16 2023-06-11 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CA3079565A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
RU2020112558A (ru) 2017-10-18 2021-11-18 Боард Оф Регентс, Зе Юниверсити Оф Тексас Систем Терапия на основе ингибитора глутаминазы
BR112020007405A2 (pt) 2017-10-18 2020-12-08 Regenxbio Inc. Produtos terapêuticos de anticorpo pós-translacionalmente modificados totalmente humanos
EP4272728A2 (en) 2017-11-27 2023-11-08 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
US11723989B2 (en) 2017-11-30 2023-08-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for mucopolysaccharidosis IIIB
AU2018375164A1 (en) 2017-11-30 2020-06-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for Mucopolysaccharidosis IIIA
JP2021506861A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 アコーオス インコーポレイテッド 内耳への治療用抗体のａａｖ媒介送達
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
JP7244547B2 (ja) 2018-02-19 2023-03-22 ホモロジー・メディシンズ・インコーポレイテッド Ｆ８遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用の方法
EP3762500A1 (en) 2018-03-06 2021-01-13 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
JP2021519065A (ja) 2018-03-23 2021-08-10 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 骨障害を処置するための遺伝子治療法
JP7406677B2 (ja) 2018-04-03 2023-12-28 ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド 抗体を回避するウイルスベクター
CA3098448A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 University Of Massachusetts Aav capsids identified by in vivo library selection
WO2019212921A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant aav production
EP3788165A1 (en) 2018-04-29 2021-03-10 REGENXBIO Inc. Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
WO2019217582A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
US11739345B2 (en) 2018-05-09 2023-08-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
CA3099306A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
US20210230632A1 (en) 2018-05-15 2021-07-29 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2019222441A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
EP3793615A2 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution of aav to improve tropism for cns
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
EP3807404A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
JP7385603B2 (ja) 2018-06-14 2023-11-22 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 組換えａａｖ生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー
CN112567035A (zh) 2018-07-02 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
MX2021000810A (es) 2018-07-24 2021-04-28 Voyager Therapeutics Inc Sistemas y metodos para producir formulaciones de terapia genetica.
US20210292790A1 (en) * 2018-07-30 2021-09-23 Gene Therapy Research Institution Co., Ltd. Method for enhancing gene expression using aav vector
KR20210062627A (ko) 2018-08-03 2021-05-31 젠자임 코포레이션 알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi
KR20210043580A (ko) 2018-08-10 2021-04-21 리젠엑스바이오 인크. 재조합 aav 생산을 위한 규모 조정 가능한 방법
JP7450945B2 (ja) 2018-08-30 2024-03-18 テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド ミオカルディンおよびａｓｃｌ１を用いた心細胞リプログラミング
US20210403923A1 (en) 2018-09-28 2021-12-30 President And Fellows Of Harvard College Mutant reverse tetracycline transactivators for expression of genes
WO2020069373A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
US20210395776A1 (en) 2018-09-28 2021-12-23 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
AU2019351815A1 (en) 2018-10-01 2021-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful for treating GM1 gangliosidosis
TW202035689A (zh) 2018-10-04 2020-10-01 美商航海家醫療公司 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法
SG11202103425YA (en) 2018-10-05 2021-05-28 Voyager Therapeutics Inc Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
US20210371470A1 (en) 2018-10-12 2021-12-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
JP2022504740A (ja) 2018-10-12 2022-01-13 ジェンザイム・コーポレーション 肝臓に向けられた遺伝子補充療法によって重度のｐｋｕを処置するための改善されたヒトｐａｈの生成
WO2020081490A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Voyager Therapeutics, Inc. EXPRESSION VECTORS FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF rAAV IN THE BACULOVIRUS/Sf9 SYSTEM
KR20210075994A (ko) 2018-10-15 2021-06-23 리젠엑스바이오 인크. 복제 결함 바이러스 벡터 및 바이러스의 감염성을 측정하는 방법
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
JP2022513376A (ja) 2018-10-22 2022-02-07 ユニバーシティ オブ ロチェスター レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集
EP3870600A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3650956A1 (fr) 2018-11-07 2020-05-13 Tissot S.A. Procede de diffusion d'un signal acoustique
MX2021005720A (es) 2018-11-16 2021-07-21 Astellas Pharma Inc Metodo para tratar la distrofia muscular mediante el direccionamiento del gen de utrofina.
US20220054656A1 (en) * 2018-11-16 2022-02-24 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus for treating pompe disease
US20220033824A1 (en) 2018-11-29 2022-02-03 University Of Massachusetts Modulation of sptlc1 via recombinant adeno-associated vectors
US20220089670A1 (en) 2018-12-28 2022-03-24 University Of Rochester Gene Therapy for BEST1 Dominant Mutations
SG11202106855YA (en) 2019-01-04 2021-07-29 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Gene therapy constructs for treating wilson disease
JP7416451B2 (ja) 2019-01-14 2024-01-17 ユニバーシティ オブ ロチェスター ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによる標的化された核内ＲＮＡ切断及びポリアデニル化
JP2022522995A (ja) 2019-01-18 2022-04-21 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖ粒子を生成するための方法及びシステム
EP3917566A4 (en) 2019-01-31 2022-10-26 Oregon Health & Science University METHODS OF USING DIRECTED, TRANSCRIPTION-DEPENDENT EVOLUTION OF AAV CAPSIDS
CA3131023A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Michael R. Volkert Oxr1 gene therapy
JP2022523766A (ja) 2019-02-22 2022-04-26 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス
BR112021016501A2 (pt) 2019-02-25 2021-10-26 Novartis Ag Composições e métodos para tratar distrofia cristalina de bietti
EP3931335A2 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
AU2020229772A1 (en) 2019-02-26 2021-08-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of krabbe disease
CA3131919A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
JP2022526526A (ja) 2019-03-25 2022-05-25 ジェネトン オーバーラップａａｖベクターを使用する大きいサイズのクアシジストロフィンの産生
KR20220004987A (ko) 2019-04-03 2022-01-12 리젠엑스바이오 인크. 눈 병리에 대한 유전자 요법
TW202102526A (zh) 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
PL3953483T3 (pl) 2019-04-11 2024-04-22 Regenxbio Inc. Sposoby chromatografii wykluczania do charakteryzowania kompozycji rekombinowanych wirusów towarzyszących adenowirusom
WO2020215010A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2020214929A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Regenxbio Inc. Adeno-associated virus vector formulations and methods
AU2020262416A1 (en) 2019-04-24 2021-12-16 Regenxbio Inc. Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
KR20220004695A (ko) * 2019-04-29 2022-01-11 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 신규 aav 캡시드 및 이를 포함하는 조성물
TW202106879A (zh) 2019-04-29 2021-02-16 美商航海家醫療公司 於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法
WO2020227515A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
JP2022533438A (ja) * 2019-05-24 2022-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 改変ウイルス粒子およびその使用
SG11202111427RA (en) 2019-05-28 2021-11-29 Astellas Pharma Inc Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene
EP3987024A4 (en) 2019-06-20 2023-11-01 University Of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED GENE EDITING
AU2020298575A1 (en) 2019-07-02 2022-02-24 M6P Therapeutics (Switzerland) GmbH Vector compositions and methods of using same for treatment of lysosomal storage disorders
US20220251567A1 (en) 2019-07-10 2022-08-11 Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
WO2021007515A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
CN114729331A (zh) 2019-07-11 2022-07-08 法国国家科学研究中心 化学修饰的腺相关病毒
US10557149B1 (en) * 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10653731B1 (en) * 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
US20220267773A1 (en) 2019-07-23 2022-08-25 University Of Rochester Targeted RNA cleavage with CRISPR-Cas
JP2022544004A (ja) 2019-07-26 2022-10-17 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
WO2021021674A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Akouos, Inc. Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
JP2022546236A (ja) * 2019-08-14 2022-11-04 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． 遺伝子治療のためのａａｖカプシドバリアント
BR112022003811A2 (pt) 2019-08-26 2022-11-16 Regenxbio Inc Tratamento de retinopatia diabética com fab anti vegf totalmente humano modificado pós tradução
EP4022070A1 (en) 2019-08-26 2022-07-06 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CA3152288A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive dna
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
US20220340643A1 (en) 2019-09-13 2022-10-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
WO2021053124A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Genethon Gene therapy expression system alleviating cardiac toxicity of fkrp
US11834659B2 (en) 2019-09-26 2023-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Trans-activated functional RNA by strand displacement and uses thereof
US11492622B2 (en) 2019-09-26 2022-11-08 Massachusetts Institute Of Technology MicroRNA-based logic gates and uses thereof
US20220347298A1 (en) 2019-10-04 2022-11-03 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods for improved therapeutic use of recombinant aav
CA3156984A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Regenxbio Inc. Adeno-associated virus vector pharmaceutical composition and methods
US20230121437A1 (en) 2019-10-15 2023-04-20 University Of Massachusetts Rna editor-enhanced rna trans-splicing
EP4045664A1 (en) * 2019-10-16 2022-08-24 Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. A novel aav variant
MX2022004352A (es) 2019-10-17 2022-07-19 Stridebio Inc Vectores virales adenoasociados para el tratamiento de la enfermedad de niemann-pick tipo c.
CN114829391A (zh) 2019-11-14 2022-07-29 生物马林药物股份有限公司 用肝特异性基因疗法载体治疗遗传性血管性水肿
EP4061943A1 (en) 2019-11-19 2022-09-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
US20230270886A1 (en) 2019-11-28 2023-08-31 Regenxbio Inc. Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof
IL293684A (en) 2019-12-10 2022-08-01 Takeda Pharmaceuticals Co Adeno-related virus vectors for the treatment of Hunter disease
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
AU2021211416A1 (en) 2020-01-22 2022-08-11 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis I with fully-human glycosylated human alpha-L-iduronidase (IDUA)
JP2023512242A (ja) 2020-01-29 2023-03-24 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド ヒト神経細胞またはヒトグリア細胞が産生した組換えヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ｉｄｓ）によるムコ多糖症ｉｉの治療
TW202136516A (zh) 2020-01-29 2021-10-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 Ｉｖａ型黏多醣病之治療
EP4096707A1 (en) 2020-01-30 2022-12-07 Umoja Biopharma, Inc. Bispecific transduction enhancer
KR20220145838A (ko) 2020-02-02 2022-10-31 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Gm1 강글리오사이드증을 치료하는 데 유용한 조성물
JP2023514149A (ja) 2020-02-07 2023-04-05 ユニバーシティ オブ ロチェスター リボザイムにより媒介されるｒｎａアセンブリ及び発現
JP2023513211A (ja) 2020-02-07 2023-03-30 ユニバーシティ オブ ロチェスター タンパク質合成を増強するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３による標的ＲＮＡ翻訳
AU2021218703A1 (en) 2020-02-14 2022-07-28 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating CDKL5 deficiency disorder
BR112022017551A2 (pt) 2020-03-02 2022-11-16 Tenaya Therapeutics Inc Controle de vetor genético por micrornas expressos por cardiomiócito
EP4127169A1 (en) 2020-03-27 2023-02-08 University of Rochester Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13
WO2021195525A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 University Of Rochester Crispr-cas13 crrna arrays
WO2021191424A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 UCB Biopharma SRL Autonomous knob domain peptides
KR20230113689A (ko) 2020-03-31 2023-08-01 유니버시티 오브 매사추세츠 Aav 캡시드 변이체 및 그의 용도
EP4127189A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
AR122409A1 (es) 2020-04-03 2022-09-07 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas
JP2023520927A (ja) 2020-04-10 2023-05-22 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー タンパク質凝集障害の処置のための組成物および方法
AU2021257848A1 (en) 2020-04-15 2022-12-01 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
CN115836129A (zh) 2020-04-28 2023-03-21 索拉生物科学有限公司 用于治疗tdp-43蛋白病的组合物和方法
CA3177924A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of krabbe disease
CA3177407A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 James M. Wilson Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
BR112022022906A2 (pt) 2020-05-13 2023-01-17 Akouos Inc Composições e métodos para tratar perda auditiva associada a slc26a4
WO2021231538A2 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
CA3183251A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of synucleinopathies
KR20230025000A (ko) 2020-06-17 2023-02-21 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 유전자 요법 환자의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2021255245A2 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Genethon Gene therapy expression system allowing an adequate expression in the muscles and in the heart of sgcg
CN116194587A (zh) 2020-07-10 2023-05-30 吉尼松公司 一种新的肌肉特异性启动子
JP2023540429A (ja) 2020-07-10 2023-09-25 アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） てんかんを治療するための方法及び組成物
US20230270884A1 (en) 2020-07-13 2023-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful for treatment of charcot-marie-tooth disease
US20230348871A1 (en) 2020-07-15 2023-11-02 University Of Rochester Targeted RNA cleavage with dCas13-RNase Fusion Proteins
WO2022017630A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Ucl Business Ltd GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF
WO2022026410A2 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
CN117120619A (zh) 2020-07-27 2023-11-24 沃雅戈治疗公司 用于治疗与葡萄糖神经酰胺酶β缺陷相关的神经病症的组合物和方法
EP4192514A1 (en) 2020-08-06 2023-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
CN116209430A (zh) 2020-08-07 2023-06-02 阿米库斯治疗学公司 囊泡靶向蛋白及其用途
AU2021320902A1 (en) 2020-08-07 2023-04-06 Spacecraft Seven, Llc Plakophilin-2 (PKP2) gene therapy using AAV vector
CN114075610B (zh) * 2020-08-11 2023-11-17 北京荷塘生华医疗科技有限公司 检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用
KR20230051208A (ko) 2020-08-14 2023-04-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 신규 aav 캡시드 및 이를 함유하는 조성물
GB202013194D0 (en) 2020-08-24 2020-10-07 Combigene Ab Gene therapy for lipodystrophy
AU2021332235A1 (en) 2020-08-24 2023-03-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Viral vectors encoding GLP-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases
EP4204014A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 The Trustees of The University of Pennsylvania Recombinant adeno-associated virus for treatment of grn-associated adult-onset neurodegeneration
WO2022056000A1 (en) 2020-09-09 2022-03-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy
CN116323641A (zh) 2020-09-10 2023-06-23 路德维希-马克西米利安慕尼黑大学 工程化的aav载体
EP4213890A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
WO2022060916A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
WO2022061002A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency
US11401531B2 (en) 2020-09-24 2022-08-02 University Of Massachusetts AAV vectors encoding NF1 and uses thereof
CA3193866A1 (en) 2020-10-01 2022-04-07 Sirkka R.M. Kyostio-Moore Human pah expression cassette for treatment of pku by liver-directed gene replacement therapy
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
AU2021358781A1 (en) 2020-10-07 2023-05-18 Regenxbio Inc. Gene therapy for ocular manifestations of cln2 disease
WO2022076591A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation
CA3193697A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Joseph Bruder Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
KR20230106598A (ko) 2020-10-07 2023-07-13 리젠엑스바이오 인크. 겔 제형과 같은 맥락막위 투여용 제형
US20240024508A1 (en) 2020-10-07 2024-01-25 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as high viscosity formulations
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
EP4225906A1 (en) 2020-10-09 2023-08-16 The Trustees of The University of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
AU2021359874A1 (en) 2020-10-18 2023-05-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
US20230391864A1 (en) 2020-10-28 2023-12-07 Regenxbio, Inc. Vectorized anti-tnf-alpha antibodies for ocular indications
WO2022094078A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of rett syndrome
WO2022094255A2 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
CA3196964A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Xu Wang Vectorized tnf-alpha antagonists for ocular indications
US20230414648A1 (en) 2020-11-06 2023-12-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of DM1 with SLUCAS9 and SACAS9
CN112322791B (zh) * 2020-11-27 2023-10-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
JP2023551533A (ja) 2020-12-01 2023-12-08 アコーオス インコーポレイテッド 前庭神経鞘腫関連症状を治療するための抗ｖｅｇｆ抗体構築物及び関連する方法
JP2023551903A (ja) 2020-12-01 2023-12-13 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組織特異的標的化モチーフを有する新規組成物及びそれを含有する組成物
CA3200192A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Justin PERCIVAL Compositions and uses thereof for treatment of angelman syndrome
IL303614A (en) 2020-12-16 2023-08-01 Regenxbio Inc A method for producing an ADNO-linked recombinant virus particle
WO2022147087A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Regenxbio Inc. Tau-specific antibody gene therapy compositions, methods and uses thereof
EP4271419A1 (en) 2020-12-29 2023-11-08 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss
US20240084329A1 (en) 2021-01-21 2024-03-14 Regenxbio Inc. Improved production of recombinant polypeptides and viruses
WO2022164935A1 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Umoja Biopharma, Inc. Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor
AU2022214429A1 (en) 2021-02-01 2023-09-14 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
KR20230145386A (ko) 2021-02-10 2023-10-17 리젠엑스바이오 인크. 재조합 인간 이두로네이트-2-설파타아제(ids)를 사용한 점액다당류증 ii의 치료
GB202101958D0 (en) 2021-02-12 2021-03-31 Ucl Business Ltd Gene therapy for dopamine transporter deficiency syndrome
TW202302848A (zh) 2021-02-26 2023-01-16 美商維泰克斯製藥公司 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
WO2022182959A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
IL305440A (en) 2021-02-26 2023-10-01 Takeda Pharmaceuticals Co Preparation and methods for treating Fabry disease
TW202246516A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN117460832A (zh) 2021-03-22 2024-01-26 建新公司 空aav衣壳和完整aav衣壳的尺寸排阻色谱分析
WO2022204476A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
CA3215141A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 James M. Wilson Compositions useful for treating spinal and bulbar muscular atrophy (sbma)
AR125406A1 (es) 2021-04-23 2023-07-12 Univ Pennsylvania Nuevas composiciones con motivos selectivos para el cerebro y composiciones que las contienen
AU2022261125A1 (en) 2021-04-23 2023-11-23 University Of Rochester Genome editing by directed non-homologous dna insertion using a retroviral integrase-cas fusion protein and methods of treatment
BR112023021999A2 (pt) 2021-04-26 2023-12-26 Regenxbio Inc Administração de terapia gênica de microdistrofina para tratamento de distrofinopatias
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
EP4334454A2 (en) 2021-05-04 2024-03-13 RegenxBio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
EP4337267A1 (en) 2021-05-11 2024-03-20 RegenxBio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
CA3223292A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Laura Van Lieshout Adeno-associated virus packaging systems
EP4363437A1 (en) 2021-07-01 2024-05-08 Amicus Therapeutics, Inc. Neurotensin variants and tagged proteins comprising neurotensin or sortilin propeptide
CA3225985A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
AR126407A1 (es) 2021-07-08 2023-10-11 Tenaya Therapeutics Inc Casetes de expresión optimizada para genoterapia
WO2023004331A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
AU2022318664A1 (en) 2021-07-30 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
AU2022325232A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
WO2023019227A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
WO2023039444A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
CA3233097A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Katherine Diane GRIBBLE Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
TW202332472A (zh) 2021-10-01 2023-08-16 美商拜奧馬林製藥公司 利用ａａｖ基因療法載體進行之遺傳性血管水腫治療及治療性調配物
TW202325845A (zh) 2021-10-02 2023-07-01 賓州大學委員會 新穎aav衣殼及含其之組成物
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2023060272A2 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023060269A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
WO2023060248A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers
WO2023060221A2 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of proteopathies
AU2022371442A1 (en) 2021-10-21 2024-04-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hypoimmune cells
WO2023077092A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
WO2023087019A2 (en) 2021-11-15 2023-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
WO2023102442A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Jaguar Gene Therapy, Llc Gene therapy methods for treatment of diabetes
WO2023102517A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
WO2023111348A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Centre National De La Recherche Scientifique Peptides and methods for use in treating pain
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023133593A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav5 capsid variants
WO2023133584A1 (en) 2022-01-10 2023-07-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of metachromatic leukodystrophy
AR128239A1 (es) 2022-01-10 2024-04-10 Univ Pennsylvania Composiciones y métodos útiles para el tratamiento de trastornos mediados por c9orf72
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
WO2023147304A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150142A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Akouos, Inc. Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
WO2023154693A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023156530A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Lysogene Gene therapy for neurodegenerative diseases
TW202345911A (zh) 2022-03-08 2023-12-01 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之部分外顯子44、50及53之精確切除
WO2023172926A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023173123A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
TW202346590A (zh) 2022-03-13 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 經修飾之肌肉特異性啟動子
WO2023178220A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2023183623A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
WO2023187728A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy for diseases with cns manifestations
TW202404651A (zh) 2022-04-06 2024-02-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物
WO2023196851A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 President And Fellows Of Harvard College Reversing aging of the central nervous system
WO2023196862A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Genzyme Corporation Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy
WO2023196893A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating her2 positive metastatic breast cancer and other cancers
WO2023196873A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regenxbio Inc. Pharmaceutical composition comprising a recombinant adeno-associated virus vector with an expression cassette encoding a transgene forsuprachoidal administration
WO2023196892A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Passive immunization with anti- aav neutralizing antibodies to prevent off-target transduction of intrathecally delivered aav vectors
TW202345913A (zh) 2022-04-06 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物
WO2023201207A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2023198652A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Centre National De La Recherche Scientifique Chemically-modified adeno-associated viruses
US20230346977A1 (en) 2022-04-13 2023-11-02 Universitat Autònoma De Barcelona Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023201308A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Gene therapy for treating an ocular disease
TW202405173A (zh) 2022-04-18 2024-02-01 美商維泰克斯製藥公司 用於增強aav療法及降低aav向肝臟之趨性的組合物及方法
WO2023215807A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Regenxbio Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α INHIBITORS FOR OCULAR INDICATIONS
TW202400803A (zh) 2022-05-03 2024-01-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 載體化抗補體抗體與補體劑及其投與
WO2023214346A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
WO2023227731A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Tafalgie Therapeutics Peptides and methods for use in treating pain
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
WO2024006770A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Astellas Gene Therapies, Inc. Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophies
WO2024006741A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024007020A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods
WO2024011112A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024020352A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
CN115354049A (zh) * 2022-07-29 2022-11-18 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用
WO2024044725A2 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
WO2024042485A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Composition for use in the treatment of fabry disease
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2024064863A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of arrhythmogenic cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
WO2024064856A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
WO2024073669A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases with recombinant viral vectors encoding anti-vegf fab
WO2024081746A2 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
CN116622908B (zh) * 2023-04-13 2024-02-06 武汉珈创生物技术股份有限公司 快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8929110D0 (en) * 1989-12-22 1990-02-28 3I Res Expl Ltd Polypeptides and dna encoding therefor
US5449616A (en) 1990-05-23 1995-09-12 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid encoding dystrophin-associated protein
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2046745A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Isaac Neuman Article including a container containing at least one precious stone
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
CA2230758A1 (en) * 1995-09-08 1997-03-13 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
EP0870044B1 (en) * 1995-12-01 2004-04-14 Crucell Holland B.V. Regulated protein expression in stably transfected mammalian cells
US20020037867A1 (en) * 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
IL128780A0 (en) 1996-09-06 2000-01-31 Univ Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
EP1696036B1 (en) 1996-09-06 2010-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania Use of recombinant adeno-associated virus in the manufacture of a medicament for gene therapy via muscle cells
EP0950111A1 (en) * 1996-09-06 1999-10-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US20030215422A1 (en) * 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
AU5070298A (en) * 1996-12-05 1998-06-29 Introgene B.V. Genetic modification of primate hemopoietic repopulating stem cells
US6039942A (en) * 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
AU9774998A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
CA2304168A1 (en) * 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
WO1999014354A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
PT1064393E (pt) 1998-03-20 2005-04-29 Univ Pennsylvania Composicoes e metodos para a producao de virus adeno-associados recombinantes sem auxiliar
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
AU762220B2 (en) 1998-05-28 2003-06-19 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The AAV5 vector and uses thereof
US6210663B1 (en) 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
EP1127150B1 (en) * 1998-11-05 2007-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6759237B1 (en) * 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6387368B1 (en) * 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
JP4693244B2 (ja) * 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
EP1183380A1 (en) 1999-06-02 2002-03-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
CA2382483A1 (en) * 1999-08-20 2001-03-01 Johns Hopkins University School Of Medicine Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
US6365394B1 (en) * 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
JP2003523320A (ja) 1999-09-29 2003-08-05 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ウイルスベクターの迅速なｐｅｇ改変方法、高められた遺伝子形質導入のための組成物、高められた物理的安定性を伴う組成物、およびそのための用途
US6821512B1 (en) 1999-12-03 2004-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
JP2003523180A (ja) 1999-12-03 2003-08-05 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 多重のパッケージングシグナルを用いる組み換えアデノウイルスのパッケージングおよび収量を増加するための組成物および方法
US20020045264A1 (en) * 2000-03-14 2002-04-18 During Matthew J. Production of chimeric capsid vectors
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US6468524B1 (en) * 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
US7056502B2 (en) * 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
WO2002018659A2 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 Haplogen, Llc Method for determining alleles
US7749492B2 (en) 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20020159978A1 (en) * 2001-02-06 2002-10-31 James Allen Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions
BRPI0214119B8 (pt) 2001-11-13 2021-05-25 Univ Pennsylvania vírus adenoassociado recombinante, método de geração do referido vírus e composição compreendendo o referido vírus
PT1453547T (pt) * 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
EP2573170B1 (en) 2001-12-17 2017-12-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
AU2002367943A1 (en) 2001-12-18 2003-12-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Improved reagents and methods for producing parvoviruses
WO2003088899A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-30 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (aav) vectors, compositions of chimeric aav vectors, and methods of use thereof
WO2003093460A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular dna of tissues
DK2657248T3 (en) 2003-06-19 2017-06-26 Genzyme Corp AAV virions with reduced immunoreactivity and applications thereof
PT3211085T (pt) * 2003-09-30 2021-06-17 Univ Pennsylvania Clados de vírus adeno-associados (aav), sequências, vetores que as contêm, e suas utilizações
WO2006039218A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Perfusion circuit and use therein in targeted delivery of macromolecules
CN101203613B (zh) 2005-04-07 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
US7788045B2 (en) 2005-09-01 2010-08-31 Meditasks, Llc Systems and method for homeostatic blood states
CN101528916B (zh) 2006-04-28 2013-09-04 宾夕法尼亚大学托管会 规模可调的aav生产方法
JP2009102988A (ja) 2007-10-19 2009-05-14 Toyota Motor Corp 内燃機関の燃料噴射装置
WO2009114702A2 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Humanzyme Limited Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems
US20090280103A1 (en) 2008-04-04 2009-11-12 Martin Flueck Regulation of muscle repair
WO2010065630A2 (en) 2008-12-03 2010-06-10 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
WO2011133890A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
CN103648328B (zh) 2011-07-15 2016-01-06 阿尔弗雷德·凯驰两合公司 旋转刷和带旋转刷的清扫机
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
CN104520428B (zh) 2012-02-17 2018-09-21 费城儿童医院 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法
EP3470523A1 (en) 2012-05-09 2019-04-17 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
US9819463B2 (en) 2016-02-18 2017-11-14 Huawei Technologies Co., Ltd. Method and apparatus for transmitting data in a wireless communication system
CA3053399A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel adeno-associated virus (aav) clade f vector and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003042397A2 (en) 2003-05-22
CA3159060C (en) 2023-05-16
PH12014501487B1 (en) 2015-12-07
PL222683B1 (pl) 2016-08-31
US8524446B2 (en) 2013-09-03
IL193525A (en) 2014-08-31
JP3958191B2 (ja) 2007-08-15
NO20150196L (no) 2004-07-14
IL270065B1 (en) 2023-06-01
US10041090B2 (en) 2018-08-07
EP1310571B1 (en) 2006-02-15
HU230406B1 (hu) 2016-04-28
DE60209193T2 (de) 2006-09-28
PH12016502583A1 (en) 2017-10-18
BR122016004944B1 (pt) 2016-11-22
IL234063A0 (en) 2014-09-30
NO338362B1 (no) 2016-08-15
US20030138772A1 (en) 2003-07-24
US10508286B2 (en) 2019-12-17
US9790472B2 (en) 2017-10-17
US20200087684A1 (en) 2020-03-19
US20110151434A1 (en) 2011-06-23
JP2003235562A (ja) 2003-08-26
CA2915124A1 (en) 2003-05-22
CA2864537C (en) 2016-11-29
CA2864537A1 (en) 2003-05-22
CN102181480A (zh) 2011-09-14
US20110263027A1 (en) 2011-10-27
NO334379B1 (no) 2014-02-24
IL258545B (en) 2019-11-28
EP2341068A1 (en) 2011-07-06
NZ564506A (en) 2009-09-25
BR0214119A (pt) 2005-06-28
JP2016136953A (ja) 2016-08-04
NZ600121A (en) 2013-12-20
DK1310571T3 (da) 2006-06-19
JP2014239680A (ja) 2014-12-25
SG168422A1 (en) 2011-02-28
HK1068925A1 (en) 2005-05-06
US20160097040A1 (en) 2016-04-07
JP4677187B2 (ja) 2011-04-27
CA2465868A1 (en) 2003-05-22
EP2338900B1 (en) 2014-01-01
EP1456419A4 (en) 2005-11-09
CN103555677B (zh) 2018-01-30
CN103589692A (zh) 2014-02-19
CN105671005A (zh) 2016-06-15
US11041171B2 (en) 2021-06-22
NO336468B1 (no) 2015-08-31
EP1310571A2 (en) 2003-05-14
JP5669795B2 (ja) 2015-02-18
ES2455126T3 (es) 2014-04-14
CN103555676A (zh) 2014-02-05
JP2013013414A (ja) 2013-01-24
KR101014207B1 (ko) 2011-02-14
IL248724B (en) 2018-04-30
NO20131359L (no) 2004-07-14
NZ578982A (en) 2011-03-31
EP1456419A2 (en) 2004-09-15
CA2406745C (en) 2006-01-10
US20130045186A1 (en) 2013-02-21
CA2915124C (en) 2018-08-14
CA2945734C (en) 2020-02-25
SG157224A1 (en) 2009-12-29
HUP0600229A2 (en) 2006-06-28
US20200131534A1 (en) 2020-04-30
US10526617B2 (en) 2020-01-07
NZ591012A (en) 2012-06-29
MX359371B (es) 2018-09-25
DE60209193D1 (de) 2006-04-20
IL270065B2 (en) 2023-10-01
US11034976B2 (en) 2021-06-15
NZ548094A (en) 2008-07-31
CA2406745A1 (en) 2003-05-13
IL233391A (en) 2016-12-29
CA2756866C (en) 2017-06-06
NO336801B1 (no) 2015-11-02
PL373864A1 (en) 2005-09-19
CN103555676B (zh) 2016-08-31
ATE317916T1 (de) 2006-03-15
CN103555677A (zh) 2014-02-05
ZA200403360B (en) 2005-04-26
US8906675B2 (en) 2014-12-09
KR20050058234A (ko) 2005-06-16
JP2009195237A (ja) 2009-09-03
US20220213501A1 (en) 2022-07-07
CA3159060A1 (en) 2003-05-22
JP5140627B2 (ja) 2013-02-06
NZ618298A (en) 2015-04-24
IL213810A0 (en) 2011-07-31
ES2258601T3 (es) 2006-09-01
KR101015854B1 (ko) 2011-02-23
WO2003042397A3 (en) 2004-02-05
PL404537A1 (pl) 2014-02-17
ES2439515T3 (es) 2014-01-23
NO20042183L (no) 2004-07-14
US11377669B2 (en) 2022-07-05
HU229379B1 (en) 2013-11-28
PL217623B1 (pl) 2014-08-29
IL221602A (en) 2015-09-24
US11499167B2 (en) 2022-11-15
IL213810A (en) 2014-08-31
HK1056198A1 (en) 2004-02-06
PL397823A1 (pl) 2012-07-16
IL227866A (en) 2015-11-30
CA2465868C (en) 2017-02-28
IL270065A (no) 2019-12-31
IL161827A (en) 2009-11-18
CA2756866A1 (en) 2003-05-22
CA2945734A1 (en) 2003-05-22
CA3066428C (en) 2022-05-24
EP2338900A1 (en) 2011-06-29
EP2341068B1 (en) 2013-09-25
ATE520707T1 (de) 2011-09-15
JP2005525086A (ja) 2005-08-25
US20180030479A1 (en) 2018-02-01
IL248724A0 (en) 2017-01-31
EP1310571A3 (en) 2003-08-13
PL409838A1 (pl) 2015-07-20
SG10201506627PA (en) 2015-10-29
US20170240921A1 (en) 2017-08-24
US20190024117A1 (en) 2019-01-24
CN103555678B (zh) 2018-02-09
EP1456419B1 (en) 2011-08-17
IL227866A0 (en) 2013-09-30
JP6212142B2 (ja) 2017-10-11
PL220644B1 (pl) 2015-11-30
MXPA04004600A (es) 2004-08-13
IL233391A0 (en) 2014-08-31
US20220025401A1 (en) 2022-01-27
IL234063A (en) 2017-06-29
PH12014501487A1 (en) 2015-12-07
CA3066428A1 (en) 2003-05-22
US20200080109A1 (en) 2020-03-12
IL161827A0 (en) 2005-11-20
US20210285012A1 (en) 2021-09-16
PL221877B1 (pl) 2016-06-30
NZ532635A (en) 2007-05-31
US20170298388A1 (en) 2017-10-19
US11034977B2 (en) 2021-06-15
CN102181480B (zh) 2016-01-27
US10544432B2 (en) 2020-01-28
BR122016004944B8 (pt) 2021-07-27
BRPI0214119B1 (pt) 2016-09-27
SG10202108118RA (en) 2021-08-30
MX346493B (es) 2017-03-21
IL221602A0 (en) 2012-10-31
JP5969547B2 (ja) 2016-08-17
AU2002361573B2 (en) 2008-06-12
CN103589692B (zh) 2018-07-24
SG10201912509RA (en) 2020-02-27
IL258545A (en) 2018-06-28
CN105671005B (zh) 2020-09-15
BR122016004546B1 (pt) 2016-11-29
KR20100029134A (ko) 2010-03-15
HUP0600229A3 (en) 2010-01-28
IL193525A0 (en) 2009-02-11
BRPI0214119B8 (pt) 2021-05-25
CN103555678A (zh) 2014-02-05
US10308958B2 (en) 2019-06-04
BR122016004546B8 (pt) 2021-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11377669B2 (en) Method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2013202568B2 (en) Adeno-associated virus rh.8 (AAVrh.8) sequences and recombinant AAVs comprising same
AU2011250837B2 (en) A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2008202344B2 (en) A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired