ES2805355T3 - Composiciones para tratar MPSI - Google Patents

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Abstract

Un vector que lleva un casete de expresión que comprende un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos aproximadamente el 80 % idéntica a SEQ ID NO: 1 que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional en células humanas, en donde dicho casete de expresión comprende además secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión de la alfa-L-iduronidasa humana en células humanas, comprendiendo dichas secuencias de control reguladoras un promotor específico del hígado.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para tratar MPSI
Antecedentes de la invención
Las mucopolisacaridosis son un grupo de trastornos hereditarios causados por la falta de enzimas lisosómicas específicas implicadas en la degradación de los glucosaminoglucanos (GAG), también llamados mucopolisacáridos. La acumulación de GAG parcialmente degradado provoca interferencia con la función celular, tisular y orgánica. A lo largo del tiempo, el GAG se acumula dentro de las células, la sangre y el tejido conectivo, dando como resultado un aumento del daño celular y orgánico. El más grave de los trastornos de mucopolisacaridosis (MPS), MPS I, está provocado por una deficiencia de la enzima a-L-iduronidasa (IDUA). Esto da lugar a tres síndromes clínicos que en orden de gravedad son los síndromes de Hurler, Hurler-Scheie y Scheie. Cada uno se hereda de forma autosómica recesiva y el grado de deficiencia enzimática está directamente relacionado con la gravedad del fenotipo clínico.
Se ha informado que el gen IDUA proporciona instrucciones para producir una enzima llamada alfa-L-iduronidasa, que es esencial para la descomposición de grandes moléculas de azúcar llamadas glucosaminoglucanos (GAG). Específicamente, se informa que la alfa-L-iduronidasa retira el sulfato de una molécula conocida como ácido alfa-L-idurónico sulfatado, que está presente en dos GAG llamados heparán sulfato y dermatán sulfato. La alfa-L-iduronidasa se encuentra en los lisosomas, compartimentos dentro de las células que digieren y reciclan diferentes tipos de moléculas. Se han encontrado más de 100 mutaciones en el gen IDUA que producen mucopolisacaridosis tipo I (MPS I). Las mutaciones que cambian un bloque de construcción de ADN (nucleótido) son las más comunes. Las mutaciones que hacen que la MPS I reduzca o elimine por completo la función de la alfa-L-iduronidasa.
Con respecto a los síndromes clínicos, la normativa actual de atención para el síndrome de Hurler es el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), tales como el trasplante de médula ósea (BMT) o los trasplantes de sangre del cordón umbilical (UCBT). El procedimiento se realiza lo antes posible y antes de los dos años de edad, para impactar tanto en aspectos somáticos como del SNC de la enfermedad. Sin embargo, HSCT para MPS I permanece asociado con una cantidad significativa de morbilidad y una tasa de mortalidad del 20 %. Si el trasplante no es una opción, entonces puede iniciarse la terapia de reemplazo enzimático (ERT) que requiere una infusión semanal de enzima para la vida del paciente. La ERT no afecta la progresión de la enfermedad del SNC, pero mejora parcialmente las manifestaciones somáticas. La organomegalia mejora significativamente aunque aspectos de la enfermedad en el sistema esquelético, ojo y corazón solo se mejoran parcialmente. Los pacientes pueden requerir cirugía para estabilizar la cadera y la rodilla y para tratar el síndrome del túnel carpiano y las contracciones de los dedos. La enfermedad cardíaca se trata médicamente, aunque finalmente puede requerirse cirugía.
La ERT para MPS I proporciona una enzima exógena para su absorción en los lisosomas y un catabolismo aumentado de GAG. Aunque las enzimas lisosómicas funcionan internamente, los receptores de manosa-6-fosfato de la superficie celular son capaces de unirse, internalizar y administrar estas enzimas a los lisosomas. IDUA recombinante (Aldurazyme®, BioMarin) está aprobado por la FDA para pacientes con formas Hurler y Hurler-Scheie de MPS I y para pacientes con la forma Scheie que tienen síntomas moderados a graves y se demostró que mejora la función pulmonar y la capacidad para caminar. También se ha observado que la ERT reduce la hepatomegalia en pacientes con MPS I, así como los niveles de GAG urinario. Sin embargo, ya que la enzima intravenosa no atraviesa fácilmente el cerebro, la ERT actualmente no aborda los síntomas neurológicos experimentados por algunos pacientes con MPS I.
Las complicaciones de la ERT giran en torno a la respuesta inmunitaria a la enzima recombinante, que puede variar de anafilaxia leve a completa, así como complicaciones del acceso periférico de por vida tales como infecciones locales y sistémicas. Hasta el 91 % de los pacientes que reciben Aldurazyme desarrollan anticuerpos contra la enzima, aunque no está claro cuánto afecta a la efectividad. Adicionalmente, la ERT requiere infusiones intravenosas (i.v.) semanales, administradas durante un período de 3-8 horas en un entorno hospitalario, que impacta significativamente en la calidad de vida del paciente y, a un alto coste, es una tensión importante en los sistemas de reembolso de atención médica.
A la luz de estas limitaciones, un tratamiento que pueda corregir más eficazmente la morbilidad asociada a MPS I sigue siendo una necesidad médica insatisfecha.
Hartung et al (''Correction of metabolic, craniofacial, and neurologic abnormalities in MPS I mice treated at birth with adeno-associated virus vector transducing the human a-L-iduronidase gene", Molecular Therapy, vol. 9, N.° 6, 1 de junio de 2004, páginas 866-875) describieron modelos murinos de enfermedades de almacenamiento lisosómico que brindan la oportunidad de evaluar el potencial de la terapia génica para prevenir las manifestaciones sistémicas de la enfermedad. Los autores concluyeron que la transducción mediada por AAV del gen IDUA en ratones recién nacidos Idua-/- es suficiente para tener un impacto curativo importante en varios de los parámetros más importantes de la enfermedad.
Cardone et al ("Correction of Hunter syndrome in the MPSII mouse model by AAV2/8-mediated gene delivery", Human Molecular Genetics, vol. 15, N.° 7, 1 de enero de 2006) describió un diseño para un enfoque in vivo de terapia génica para el tratamiento de un ratón adulto con deficiencia de iduronato-2-sulfatasa. Los autores sugirieron en sus descubrimientos que este enfoque de transferencia génica tiene potencial para el tratamiento sistémico de pacientes con síndrome de Hunter.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un casete de expresión que comprende un gen de alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos aproximadamente el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 1 que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional en células humanas, en donde dicho casete de expresión comprende además secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión de la alfa-L-iduronidasa humana en células humanas, comprendiendo dichas secuencias de control reguladoras un promotor específico del hígado.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que contiene el casete de expresión. En una realización, el casete de expresión se encuentra en un plásmido cis. En otra realización, el casete de expresión se encuentra en pENN.TBG.hIDUA.nRBG.
En otro aspecto más, la invención proporciona una partícula recombinante de virus adenoasociados (rAAV) que tiene una cápside de AAV y que contiene una repetición terminal invertida izquierda (ITR), un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del mismo y una ITR derecha de AAV, en donde dicho gen hIDUA tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 (FIGURA 1) o una secuencia al menos aproximadamente el 95 % idéntica a la misma que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional. En una realización, el gen hIDUA funcional se expresa bajo el control de un promotor específico del hígado. Dicho promotor puede ser un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG).
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso en la partícula vírica recombinante adenoasociada AAV2/8.TBG.hIDUA.co.
En un otro aspecto más, la invención proporciona una composición para usar en el tratamiento de mucopolisacaridosis tipo I (MPS I) que comprende el rAAV que comprende el casete de expresión descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Aún otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la Descripción detallada de la invención.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A-1D proporcionan la secuencia del plásmido pENN.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB [SEQ ID NO: 3] descrito en el presente documento, que incluye la secuencia de ácido nucleico del gen IDUA humano funcional. El gen del IDUA funcional ubicado en la posición 1251-3213 de la FIG1 y su secuencia enzimática codificada también se proporcionan en la SEQ ID NO: 1 y 2. La secuencia se anota más para identificar las secuencias de los potenciadores alfa mic/bik, el intrón 1, la globulina de conejo poli A, los ITR, el origen de la replicación.
La Figura 2 proporciona el mapa circular de pENN.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB.
Descripción detallada de la invención
Las composiciones descritas en el presente documento proporcionan un casete de expresión que lleva un gen IDUA humano que expresa una cantidad terapéuticamente eficaz de enzima alfa-L-iduronidasa humana funcional en un sujeto humano.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de la composición que administra y expresa en las células diana una cantidad de enzima suficiente para mejorar o tratar los síntomas de Hurler, los síndromes de Hurler-Scheie y/o Scheie y/o MPS I. El "tratamiento" puede incluir el empeoramiento de los síntomas de uno de los síndromes (o MPS I) y posiblemente la reversión de uno o más de los síntomas de los mismos.
Como se usa en el presente documento, una "alfa-L-iduronidasa humana funcional" se refiere a una enzima alfa-L-iduronidasa humana que funciona normalmente en humanos sin MPS1 o un síndrome asociado tales como los síndromes de Hurler, de Hurler-Scheie y/o de Scheie. Contrariamente, una variante de la enzima alfa-L-iduronidasa humana que provoca MPS1 o uno de estos síndromes se considera no funcional. En una realización, una alfa-1-iduronidasa humana funcional tiene la secuencia de aminoácidos de una alfa-L-iduronidasa humana de tipo silvestre descrita por Bremer et al., Mol. Genet. Metab. 104 (3): 289-294 (2011), secuencia de referencia NCBI NP_000194.2, reproducida en SEQ ID NO: 2 (653 aminoácidos). Sin embargo, se han descrito diversos polimorfismos funcionales (variantes) naturales de esta secuencia y pueden incluirse dentro del alcance de esta invención. Estas variantes incluyen, con referencia a la SEQ ID NO: 2, una glucosilación ligada a N en la posición 110 [Chen et al, J Proteome Res., 8:651-661 (2009)], un cambio de H a Q en la posición de aminoácido 33 [SEQ ID NO: 7, VAR_003350; Scott, HS, et al, Proc Natl Acad. Sci, 88:9695-9699 (1991); Scott, HS, et al, Genomics, 12:1311-1313 (1992); Scott h S, et al, Hum Genet, 90:327-327 (1992); Bertola F., et al, Hum Mutat, 32: E2189-E2210 (2011)], una reducción de H a Q en la posición de aminoácido 82 [SEQ ID NO: 8, VAR_020976; Scott, HS, Hum Genet, antes citada], un cambio de R a Q en la posición 105 [SEQ ID NO: 9, VAR_003356; Scott, Hum Genet, anteriormente citada; Bertola et al, antes citada], un cambio de G a R en la posición 116 [SEQ ID NO: 12, VAR_003367], un cambio de V a A en la posición 279 [SeQ ID NO: 11, VAR 003359], un cambio de L a R en la posición 346 [SEQ ID NO: 12, VAR_017436, Teng, YN, et al, Clin. Genet, 57: 131-136 (2000)], un cambio de A a T en la posición 361 [SEQ ID NO: 13, VAR_003364; Scott, HS, et al, Hum Mol Genet, 2: 1471-1473 (1993); Yogalingam et al, Hum Mutat, 24: 199-207 (2004); Bertola, et al, antes citada], un cambio de H a N en la posición 449 [SEQ ID NO: 14, VAR_066228, Bertola et al, antes citada], un cambio de V a I en la posición 454 [SEQ ID NO: 15, VAR_003372; Yogalingam et al, anteriormente citada; Bertola, et al, antes citada], un cambio de A a T en la posición 591 [SEQ ID NO: 16, VAR_0066231, Bertola et al, citado anteriormente] y un cambio de A a T en la posición 622 [SEQ ID NO: 17, Scott et al, Genomics, anteriormente citada]. Véase, por ejemplo, UniProtKB/Swiss-Prot; www.uniprot.org/uniprot/P35475. En otra realización, una alfa-L-iduronidasa humana funcional puede incluir una secuencia de aminoácidos sintética en la que todos o una parte de los primeros 26 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que corresponden al péptido líder (señal), se reemplazan por un péptido líder heterólogo. Este péptido líder, que es responsable de transportar la enzima fuera de la célula a través de su ruta secretora hacia la circulación, puede sustituirse con otro péptido líder adecuado, por ejemplo, tales como los péptidos líderes de interleucina-2 (IL-2) u oncostatina. Los péptidos líderes adecuados son preferentemente, aunque no necesariamente de origen humano. Los péptidos líderes adecuados pueden elegirse de http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htm, o pueden determinarse usando una diversidad de programas computacionales para determinar el péptido líder (señal) en una proteína seleccionada. Aunque no limitado, tales secuencias pueden tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 28 aminoácidos de longitud, o pueden ser más grandes o más pequeños según se requiera. Además, se ha descrito al menos un ensayo in vitro siendo útil para evaluar la actividad enzimática de una enzima IDUA [véase, por ejemplo, Kakkis et al, Mol Genet Metabol, marzo de 2001; 72(3): 199-208].
Adecuadamente, la composición y el método descritos en el presente documento no requieren inyecciones a largo plazo, semanalmente repetidas de una dosis terapéutica. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el método descrito en el presente documento es útil para corregir el fenotipo del sistema nervioso central además de los síntomas somáticos asociados a los trastornos de MPSI.
Casete de expresión
El casete de expresión se compone de, como mínimo, un gen y sus secuencias reguladoras. Cuando el casete está diseñado para expresarse a partir de un virus adenoasociado recombinante, el casete de expresión contiene además repeticiones terminales invertidas (ITR) de 5' y 3' AAV. Estas ITR pueden ser de longitud completa o una o ambas ITR pueden estar truncadas. Por ejemplo, puede usarse una ITR 5' truncada que contiene una deleción de la secuencia D y una eliminación del sitio de resolución terminal (trs), por ejemplo, para un AAV auto-complementario. En una realización, el rAAV está pseudotipado, es decir, la cápside de AAV proviene de una fuente AAV diferente a al AAV que proporciona las ITR. En una realización, se usan las ITR del serotipo 2 del AAV. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otras fuentes adecuadas.
Como se describe en el presente documento, a los pacientes que padecen una de las afecciones descritas en el presente documento se administra un casete de expresión que lleva un gen funcional de alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de una enzima funcional de alfa-L-iduronidasa humana en las células.
El casete de expresión contiene un gen hIDUA caracterizado por tener la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Esta secuencia, desarrollada por los inventores, tiene una identidad de aproximadamente el 83 % con la secuencia de genes publicada de Genbank NP000194.2 que codifica la SEQ ID NO: 2. En otra realización, el casete de expresión contiene un gen hIDUA caracterizado por tener la secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 80 % a la SEQ ID NO: 1 y codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional. En otra realización, la secuencia tiene al menos aproximadamente el 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o al menos aproximadamente el 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional. En una realización, la secuencia es al menos aproximadamente el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, al menos aproximadamente el 97 % idéntica a SEQ ID NO: 1 o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional. En una realización, esto abarca el gen hIDUA de longitud completa, incluyendo las secuencias del péptido líder de la alfa-L-iduronidasa humana (es decir, que codifica de aproximadamente el aminoácido 26 o aproximadamente el aminoácido 27, a aproximadamente el aminoácido 653 de SEQ ID NO: 2), que corresponde de aproximadamente 1 a aproximadamente 78 de SEQ ID NO: 1. En otra realización, el gen hIDUA codifica una enzima alfa-L-iduronidasa humana sintética funcional que es un péptido sintético que comprende una secuencia líder heteróloga fusionada a la porción secretada de una enzima alfa-L-iduronidasa funcional, es decir, los aminoácidos aproximadamente 27 a aproximadamente 653 de la SEQ ID NO: 2 o una de las variantes funcionales de la misma que se identifican en el presente documento.
La identidad o similitud con respecto a una secuencia se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, el mismo resto) o similares (es decir, resto de aminoácido del mismo grupo en función de las propiedades comunes de la cadena lateral, véase a continuación) con las regiones de péptidos y polipéptidos proporcionadas en el presente documento, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El porcentaje (%) de identidad es una medida de la relación entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos, según se determina al comparar sus secuencias de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. En general, Las dos secuencias a comparar están alineadas para dar una correlación máxima entre las secuencias. Se examina la alineación de las dos secuencias y se determina el número de posiciones que dan una correspondencia exacta de aminoácidos o nucleótidos entre las dos secuencias, dividido por la longitud total de la alineación y multiplicado por 100 para dar una cifra de % de identidad. Esta cifra de % de identidad puede determinarse a lo largo de la longitud completa de las secuencias a comparar, que es particularmente adecuado para secuencias de la misma longitud o muy similar y que son altamente homólogas o de longitudes definidas más cortas, que es más adecuado para secuencias de longitud desigual o que tienen un menor nivel de homología. Hay una serie de algoritmos y programas de ordenador basados en ellos, que están disponibles para usarse en la bibliografía y/o están disponibles públicamente o en el mercado para realizar alineaciones y porcentajes de identidad. La selección del algoritmo o programa no es una limitación de la presente invención.
Algunos ejemplos de programas de alineación adecuados que incluyen, por ejemplo, el software CLUSTALW bajo Unix y luego importado al programa Bioedit (Hall, T. A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98); el paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, versión 9.1 (Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984, disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wis., EE.UU.). Los programas BESTFIT y GAP, pueden usarse para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad entre dos secuencias polipeptídicas.
Otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias incluyen, por ejemplo, la familia BLAST de programas disponibles en el National Center for Biotechnology Information (NCB), Bethesda, Md., EE.UU. y accesible a través de la página de inicio del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov), el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4; y FASTA (Pearson W. R. y Lipman D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988, disponible como parte del paquete de análisis de secuencia de Wisconsin). Software SeqWeb (una interfaz basada en web para el paquete GCG Wisconsin: programa de hueco).
Como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las frases "que comprende" y "que incluye" son inclusivas de otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares. Contrariamente, la frase "que consiste" y sus variantes son exclusivas de otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares. El término "aproximadamente" abarca una variación dentro de e incluyendo ± 10 %, a menos que se especifique de otro modo.
En una realización, el casete de expresión está diseñado para la expresión dirigida al hígado humano. Por lo tanto, un promotor específico del hígado es particularmente adecuado para el casete de expresión. En una realización, se selecciona el promotor de globulina de unión a tiroxina. En una realización, el promotor TBG tiene la secuencia de nucleótidos 442 a 901 de la FIGURA 1. Como alternativa, puede seleccionarse otro promotor específico del hígado. Los ejemplos de promotores que son específicos de tejido son bien conocidos para el hígado y otros tejidos (albúmina, Miyatake et al., (1997) J. Virol., 71:5124-32; promotor central del virus de la hepatitis B, Sandig et al., (1996) Gene Ther., 3:1002-9; alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., (1996) Hum. Gene Ther., 7:1503-14), osteocalcina ósea (Stein et al., (1997) Mol. Biol. Rep., 24:185-96); sialoproteína ósea (Chen et al., (1996) J. Bone Miner. Res., 11:654-64), linfocitos (CD2, Hansal et al., (1998) J. Immunol., 161:1063-8; cadena pesada de inmunoglobulina; cadena del receptor de células T), neuronal tal como el promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., (1993) Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5) y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., (1995) Neuron, 15:373-84), entre otros. Pueden seleccionarse otros promotores (no específicos del hígado), pero los casetes de expresión que contienen los mismos pueden no tener todas las ventajas de aquellos con TBG u otro promotor específico del hígado. Como alternativa, puede seleccionarse un promotor regulable. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/126808B2.
En una realización, el casete de expresión comprende uno o más potenciadores de expresión. En una realización, el casete de expresión contiene dos o más potenciadores de expresión. Estos potenciadores pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por ejemplo, un potenciador puede incluir un potenciador Alfa mic/bik. Este potenciador puede estar presente en dos copias que se encuentran adyacentes entre sí. Como alternativa, las copias dobles del potenciador pueden estar separadas por una o más secuencias. En otra realización más, el casete de expresión contiene además un intrón, por ejemplo, el intrón Promega. Otros intrones adecuados incluyen aquellos conocidas en la técnica, por ejemplo, tales como se describen en el documento WO 2011/126808.
Además, se proporciona un casete de expresión de la invención con una señal de poliadenilación adecuada. En una realización, la secuencia poli A es una poli A de globulina de conejo. En una realización, la secuencia poli A se caracteriza por la de los nt 3261 -3387 de la FIGURA 1. Como alternativa, otra poliA, por ejemplo, una secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (hGH), una poliA de SV40 o una poliA sintética. Aún otros elementos reguladores convencionales pueden ser adicionales u opcionalmente incluidos en un casete de expresión.
En una realización, el casete de expresión está diseñado por ingeniería en un vector adecuado, por ejemplo, un vector plasmídico que usa técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Opcionalmente, una composición de la invención puede contener un primer casete de expresión que comprende el gen IDUA humano modificado y un segundo casete de expresión que comprende un gen diferente. En otra realización más, el IDUA humano funcional puede expresarse a partir de más de un casete de expresión, que puede estar ubicado en múltiples vectores, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2011/126808.
En una realización, el casete de expresión se transporta por el pENN.TBG.hIDUA.nRBG, cuyo plásmido se usa para generar un virus recombinante adenoasociado que lleva el casete de expresión.
Producción de partículas víricas AAV
En una realización, la invención proporciona una partícula de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) que tiene una cápside de AAV y que contiene empaquetada en la misma una repetición terminal invertida 5' (ITR), un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del mismo y una ITR 3' de AAV, en donde dicho gen hIDUA tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 (FIGURA 1) o una secuencia al menos aproximadamente el 95 % idéntica a la misma que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional. Un rAAV particularmente deseable es AAV2/8.TBG.hIDUA.co.
Se conocen métodos para preparar vectores basados en AAV. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Publicada de EE.UU. N.° 2007/0036760 (15 de febrero de 2007). El uso de cápsides de AAV de AAV8 es particularmente adecuado para las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Las secuencias de AAV8 y los métodos para generar vectores basados en la cápside de AAV8 se describen en la Patente de EE.UU. 7.282.199 B2, US 7.790.449 y US 8.318.480. También son adecuadas para su uso en la invención las cápsides de AAV9. Las secuencias de AAV9 y los métodos para generar vectores basados en la cápside de AAV9 se describen en la Patente de EE.UU. 7.906.111. Sin embargo, pueden seleccionarse o generarse otras cápsides de AAV para su uso en la invención. Las secuencias de varios de tales AAV se proporcionan en la Patente de EE.UU. 7.282.199 B2 citada anteriormente, US 7.790.449, US 8.318.480 y la patente de EE.UU. 7.906.111 y/o están disponibles en GenBank. Las secuencias de cualquiera de las cápsides de AAV pueden generarse fácilmente de forma sintética o usando una diversidad de técnicas de biología molecular e ingeniería genética. Las técnicas de producción adecuadas son bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Como alternativa, los oligonucleótidos que codifican péptidos (por ejemplo, CDR) o los péptidos mismos pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, por los conocidos métodos de síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, (1962) J. Am. Chem. Soc., 85:2149; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62). Véase, también, D M McCarty et al, "Selfcomplementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (Agosto de 2001), Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254. Los AAV autocomplementarios se describen en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 6.596.535; 7.125.717; y 7.456.683. Estos y otros métodos de producción adecuados están dentro del conocimiento de aquellos expertos en la materia y no son una limitación de la presente invención.
El virus recombinante adenoasociado (AAV) descrito en el presente documento puede generarse usando técnicas conocidas. Tal método implica cultivar una célula hospedadora que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAV; un gen rep funcional; un casete de expresión compuesto por, como mínimo, repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén; y suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del casete de expresión en la proteína de la cápside del AAV.
Los componentes requeridos para cultivarse en la célula hospedadora para empaquetar un casete de expresión de AAV en una cápside de AAV pueden proporcionarse a la célula hospedadora en trans. Como alternativa, uno cualquiera o más de los componentes requeridos (por ejemplo, casete de expresión, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden proporcionarse mediante una célula hospedadora estable que se ha diseñado por ingeniería para contener uno o más de los componentes requeridos usando métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. Lo más adecuadamente, una célula hospedadora estable tal contendrá el componente o componentes requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el componente o componentes requeridos pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados, en el análisis de elementos reguladores adecuados para su uso con el transgén. En otra alternativa más, una célula hospedadora estable seleccionada puede contener componente o componentes seleccionados bajo el control de un promotor constitutivo y otros componente o componentes seleccionados bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, puede generarse una célula hospedadora estable que deriva de 293 células (que contienen funciones E1 auxiliares bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contiene las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Un experto en la materia puede generar incluso otras células hospedadoras estables.
El casete de expresión, secuencias rep, secuencias cap y las funciones auxiliares requeridas para producir el rAAV de la invención pueden administrarse a la célula hospedadora de empaquetamiento en forma de cualquier elemento genético que transfiera las secuencias transportadas sobre el mismo. El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo aquellos descritos en el presente documento. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por aquellos expertos en la manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De forma similar, son bien conocidos los métodos para generar viriones de rAAV y la selección de un método adecuado no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532 y la Patente de EE.UU. N.25.478.745.
A menos que se especifique otra cosa, las ITR de AAV y otros componentes de AAV seleccionados descritos en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente de entre cualquier AAV. Estas ITR u otros componentes de AAV pueden aislarse fácilmente usando técnicas disponibles para aquellos expertos en la materia a partir de una secuencia de AAV. Dicho AAV puede aislarse u obtenerse de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Como alternativa, las secuencias de AAV pueden obtenerse a través de medios sintéticos u otros adecuados por referencia a secuencias publicadas tales como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed® o similares.
A. El casete de expresión
El casete de expresión es como se define en el presente documento. Además, el casete de expresión y/o un vector como se describe en el presente documento puede contener secuencias transgénicas o reguladoras adicionales. El casete de expresión se empaqueta en una proteína de la cápside y se administra a una célula hospedadora seleccionada.
1. El transgén
La invención puede incluir el uso de múltiples transgenes. Los transgenes adecuados pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la materia. La selección del transgén no se considera ser una limitación de esta invención.
2. Elementos reguladores
Además de los elementos principales identificados anteriormente para el casete de expresión, el vector también incluye elementos de control convencionales que están unidos operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, su traducción y/o su expresión en una célula transfectada con el vector o infectada con el virus producido por la invención. Como se usa en el presente documento, las secuencias "unidas operativamente" incluyen las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, de terminación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento del ARN eficientes tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNM citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína; y cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción del producto codificado. Una gran cantidad de secuencias de control de expresión, incluyendo los promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido, se conocen en la técnica y pueden utilizarse.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retrovírico (opcionalmente con el potenciador del RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador del CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al, (1985) Cell, 41:521 -530], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y pueden regularse mediante compuestos suministrados de forma exógena, factores ambientales tales como temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación concreto de la célula o únicamente en células en replicación. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y un experto en la materia puede seleccionarlos fácilmente. Algunos ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos suministrados de forma exógena, incluyen, el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa T7 [Publicación de Patente Internacional N.° WO 98/10088]; el promotor de ecdisona de insectos [No et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al, (1995) Science, 268:1766-1769, véase también Harvey et al, (1998) Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518], el sistema inducible por RU486 [Wang et al, (1997) Nat. Biotech., 15:239-243 y Wang et al, (1997) Gene Ther., 4:432-441] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al, (1997) J. Clin. Invest., 100:2865-2872], incluyendo, por ejemplo, el sistema Argent™ que está disponible de Ariad. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación concreto de la célula o únicamente en células en replicación.
Otra realización del transgén incluye un gen operativamente unido a un promotor específico de tejido. Por ejemplo, si se desea la expresión en el músculo esquelético, debería usarse un promotor activo en el músculo. Estos incluyen los promotores de genes que codifican la p-actina esquelética, la cadena ligera de miosina 2A, la distrofina, la desmina, MHC, la creatina quinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades superiores a los promotores naturales (véase Li et al., (1999) Nat. Biotech., 17:241-245). Los ejemplos de promotores que son específicos de tejido conocidos para el SNC/neuronas incluyen, por ejemplo, el promotor de la enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., (1993) Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611 -5) y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., (1995) Neuron, 15:373-84), entre otros. En otra realización, se usará el promotor nativo para el transgén. Puede preferirse el promotor nativo cuando se desea que la expresión del transgén imite la expresión nativa. El promotor nativo puede usarse cuando la expresión del transgén debe regularse temporal o evolutivamente, o de una manera específica de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, otros elementos de control de la expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak también pueden usarse para imitar la expresión nativa.
La combinación del transgén, promotor/potenciador e ITR AAV 5' y 3' se denominan un casete de expresión para facilitar su referencia en el presente documento. Proporcionado con las enseñanzas de esta invención, el diseño de un casete de expresión tal puede realizarse recurriendo a técnicas convencionales.
3. Administración del casete de expresión a una célula hospedadora de empaquetamiento AAV
El casete de expresión puede transportarse en cualquier vector adecuado, por ejemplo, un plásmido, que se administra a una célula hospedadora. Los plásmidos útiles en esta invención pueden diseñarse por ingeniería de modo que sean adecuados para la replicación y, opcionalmente, integración en células procariotas, células de mamífero o ambas. Estos plásmidos (u otros vectores que llevan el casete de expresión) contienen secuencias que permiten la replicación del casete de expresión en eucariotas y/o procariotas y marcadores de selección para estos sistemas. Los marcadores seleccionables o genes indicadores pueden incluir secuencias que codifican resistencia a kanamicina, geneticina, higromicina o purimicina, entre otros. Los plásmidos también pueden contener ciertos genes indicadores o marcadores seleccionables que pueden usarse para señalar la presencia del vector en células bacterianas, tales como la resistencia a ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tales como el sistema de amplicón que emplea el antígeno nuclear del virus Epstein Barr. Este sistema de amplicón u otros componentes similares de amplicón permiten una alta replicación episómica de copias en las células. Preferentemente, la molécula que lleva el casete de expresión se transfecta en la célula, donde puede existir de forma transitoria. Como alternativa, el casete de expresión puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula hospedadora, ya sea cromosómicamente o como un episoma. En determinadas realizaciones, el casete de expresión puede estar presente en múltiples copias, opcionalmente en concatámeros cabeza a cabeza, cabeza a cola o cola a cola. Se conocen técnicas de transfección adecuadas y pueden utilizarse fácilmente para administrar el casete de expresión a la célula hospedadora.
Generalmente, cuando se administra el vector que comprende el casete de expresión por transfección, el vector se administra en una cantidad de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 100 pg de ADN, de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 50 pg de ADN a aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, o aproximadamente 1 x 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN del vector a las células hospedadoras pueden ajustarse, teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de administración y las células hospedadoras seleccionadas.
B. Empaquetamiento de células hospedadoras
Además del casete de expresión, la célula hospedadora contiene las secuencias que dirigen la expresión de una proteína de la cápside del AAV de la invención en la célula hospedadora y las secuencias rep de la misma fuente que la fuente de las iTr del AAV encontradas en el casete de expresión o de una fuente de complementación cruzada. La célula hospedadora de empaquetamiento también requiere funciones auxiliares para empaquetar el rAAV de la invención. Dichas funciones auxiliares son bien conocidas en la técnica y no se duplicarán en el presente documento. De forma similar, se conocen métodos para producir vectores adecuados que tienen cápsides de AAV. [Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Publicada de EE.UU. N.° US 2007/0036760].
La construcción de un rAAV que codifica un casete de expresión descrito en el mismo presente documento puede suspenderse en un vehículo fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto. En una realización, el vehículo es solución salina estéril sola u, opcionalmente, con cualquiera de una serie de soluciones tamponantes (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros vehículos ejemplares incluyen lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de sésamo y agua. La selección del vehículo no es una limitación de la presente invención.
Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además de los rAAV y el vehículo o vehículos, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizantes químicos. En una realización, la administración es a través de administración intravenosa. Sin embargo, aún pueden seleccionarse otras vías de administración. Como alternativa o adicionalmente, las vías de administración pueden combinarse, si se desea.
En una realización, la invención incluye una composición liofilizada que contiene un rAAV como se describe en el presente documento o una mezcla de rAAV, en forma liofilizada. Opcionalmente, uno o más estabilizantes o conservantes están presentes en esta composición. Adecuadamente, para su uso, una composición liofilizada se reconstituye con un diluyente adecuado, por ejemplo, solución salina estéril o una solución salina tamponada.
Las dosificaciones del vector vírico dependerán principalmente de factores tales como la afección a tratar, la edad, el peso y la salud del paciente y, por lo tanto, pueden variar entre los pacientes. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz del vector vírico generalmente está en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 100 ml, o aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml, o aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml, o aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml, de solución que contiene concentraciones de aproximadamente 3 x 109 a 3 x 1013 genomas de vector vírico (partículas)/ml de agente de suspensión acuoso. Otra dosis ejemplar es de aproximadamente 3 x 109 a 3 x 1013 genomas de AAV por 1 kg. Un volumen adecuado es de aproximadamente 1 ml. En otra realización, una dosis terapéuticamente eficaz de la construcción rAAV está en el intervalo de aproximadamente 0,001 ng a aproximadamente 1000 mg/70 kg animal, que puede administrarse en una dosis única o en una serie de dos o más dosis. Pueden determinarse otras dosificaciones adecuadas. La dosificación se ajustará para equilibrar el beneficio terapéutico frente a cualquier efecto secundario y tales dosificaciones pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la que se emplea el vector recombinante.
USO MÉDICO
Las composiciones de la presente invención evitan complicaciones de la terapia de reemplazo enzimático relacionadas con la respuesta inmunitaria a la enzima recombinante que puede variar de anafilaxia leve a completa, así como complicaciones del acceso periférico de por vida, tales como infecciones locales y sistémicas. Además, en contraste con ERT, la composición de la invención no requiere inyecciones a largo plazo, semanalmente repetidas. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el método terapéutico dirigido al hígado descrito en el presente documento es útil para corregir el fenotipo del sistema nervioso central asociado a trastornos de MPSI al proporcionar transferencia génica eficiente, a largo plazo brindada por los vectores con alta eficiencia de transducción, podría proporcionar niveles continuos elevados de IDUA circulante, que proporciona aprovechamiento terapéutico a través de la barrera hematoencefálica. Además, La transferencia de genes hepáticos de AAV puede proporcionar tolerancia activa y prevenir la formación de anticuerpos contra la enzima.
Se proporciona un casete de expresión de hIDUA modificado para su uso en el tratamiento de mucopolisacaridosis de tipo I que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un casete de expresión de hIDUA modificado como se describe en el presente documento. También se describe un método para tratar y/o mejorar los síntomas de síndromes de Hurler, de Hurler-Scheie y de Scheie.
En una realización, el rAAV se administra por vía intravenosa.
En otra realización, el rAAV se administra en una cantidad de aproximadamente 3 x 109 a aproximadamente 3 x 1012 se administra al sujeto. Aunque se prevé que una sola administración de rAAV sea eficaz, dado que el hígado es un órgano regenerativo, la administración puede repetirse (por ejemplo, trimestralmente, bianualmente, anualmente, o según sea de otra manera necesario. Opcionalmente, puede administrarse una dosis inicial de una cantidad terapéuticamente eficaz en sesiones de infusión divididas, teniendo en cuenta la edad y la capacidad del sujeto para tolerar infusiones. Sin embargo, no se requieren inyecciones semanales repetidas de una dosis terapéutica completa, proporcionando una ventaja al paciente en términos de comodidad y resultado terapéutico.
Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos y no son una limitación de la invención descrita en el presente documento.
Ejemplo 1 - Producción de transgén y vector
Se sintetizó una secuencia de nucleótidos modificada que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional. La secuencia resultante es particularmente adecuada para la expresión humana y tiene menos de aproximadamente el 90 % de identidad con el gen IDUA humano funcional (hIDUA; Genbank NP000194.2). El transgén resultante se insertó después en un plásmido que contiene los elementos cis necesarios para el empaquetamiento en un vector AAV disponible de UPenn Vector Core usando sitios MluI y SalI de ingeniería genética. La expresión génica se dirigió por la globulina de unión a tiroides humana (TBG, Hayashi Y, Mori Y, Janssen OE, et al. Human thyroxine-binding globulin gene: complete sequence and transcriptional regulation. Mol Endocrinol 1993; 7: 1049-1060]. El plásmido resultante, mostrado en la Figura 2, pENN.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB contiene el gen hIDUA modificado bajo el control de secuencias de control de la expresión, incluyendo el promotor TBG específico del hígado. El plásmido contiene además la ITR 5' AAV2, repeticiones en tándem de los potenciadores alfa mic/bic, el promotor TBG, una secuencia de intrones de Promega, el gen IDUA humano modificado de SEQ ID NO: 1, una poli A de globulina de conejo y una ITR AAV2 -3'.
Las preparaciones de vectores a gran escala se realizaron esencialmente como describen Lock et al. [Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther 21(10): 1259­ 1271. (2010)]. Las transfecciones basadas en PEI se realizaron en pilas de células de 10 capas que contenían el 75 % de monocapas confluentes de células HEK293. Se clarificaron 10 l de medio de cultivo de materia prima de las pilas de células y luego se concentraron por filtración de flujo tangencial. La materia prima clarificada concentrada se purificó sobre gradientes de yodixanol (Optiprep; Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Todas las fracciones directamente debajo de una banda de proteína contaminante visible se recogieron y agruparon. Las fracciones agrupadas se diafiltraron contra PBS/NaCl 35 mM y
concentrado utilizando concentradores de giro Amicon Ultra 15 (Millipore). Se añadió glicerol al producto concentrado diafiltrado hasta un 5 % final y la preparación se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 0C. Los vectores resultantes se denominan en el presente documento AAV8.TBG.hIDUA o AAV2/8.TBG.hIDUA. En determinadas ubicaciones, las partículas de AAV recombinantes se denominan AAV8.TBG.hIDUAco o AAV2/8.TBG.hIDUAco. El plásmido contiene además la ITR 5' AAV2, repeticiones en tándem de los potenciadores alfa mic/bic, el promotor TBG, una secuencia de intrones de Promega, el gen IDUA humano modificado de SEQ ID NO: 1, una poli A de globulina de conejo y una ITR AAV2 - 3'.
Ejemplo 2 -
A. Ensayos basados en células
Las células HEK 293 se mantuvieron en medio de crecimiento que contenía Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco®, Life Technologies™) con suero bovino fetal al 5 % (FBS; XXX), 1 % de penicilina/estreptomicina (p/s; Life Technologies ™). Las transfecciones de ADN plasmídico se llevaron a cabo usando Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™, Life Technologies™) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células se colocaron en placas a una densidad de 5x10A5 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en medio de transfección (DMEM 5 % de FBS, sin p/s) y se dejó adherir durante la noche a 37 0C en 5 % de CO2. Al día siguiente, las células se verificaron para una confluencia del 90-95 % y los medios se renovaron. El ADN plasmídico y Lipofectamine™ 2000 se diluyeron con medio de suero reducido Opti-MEM I ® (sin suero) para una relación final de 1:2,5 (ADN: Lipofectamine™ 2000). La solución de transfección Lipofectamine™ 2000 se incubó durante cinco minutos a 22 0C antes de mezclarla con la solución de ADN. Esta mezcla final de transfección que contiene la solución de ADN: Lipofectamine™ 2000 se incubó más durante 20 minutos (22 0C) antes de la adición a los pocillos que contenían células y medios. Las células simuladas no recibieron ADN plasmídico y se utilizó un plásmido que codifica para eGFP como control de transfección. Se transfectaron tres pocillos para cada construcción probada. Las células se incubaron a 37 0C en 5 % de CO2; los medios fueron reemplazados por medios de crecimiento cuatro horas después. El contenido de cada pocillo se cosechó 72 horas más tarde y se recogió a 4000 rpm durante 15 minutos a 4 0C. Las células se resuspendieron en 100 pl/pocillo de tampón de lisis (0,2 % Triton X-100, 0,9 % NaCl, pH 4,0) y se congelaron/descongelaron tres veces con agitación vorticial. Además, los lisados se trataron con benzonasa durante 30 minutos a 37 0C antes de la congelación/descongelación final. Los restos celulares se sedimentaron a 10000 pm (4 0C) durante 10 minutos y los lisados celulares clarificados finales se colocaron en hielo y se analizaron inmediatamente para determinar la actividad enzimática.
B. Lisis de tejidos y extracción de proteínas
Los tejidos congelados se semi-descongelaron en una caja sobre una cama de hielo seco y se cortaron pequeños trozos de tejido húmedo (~20 mg, ~10 mg de bazo) en una pequeña placa de Petri. Los tejidos pre-procesados se sumergieron en un Eppendorf de 2 ml con 1 ml de tampón de lisis (0,2 % Triton X-100, 0,9 % NaCl, pH 4,0) y una perla de acero de 5 mm. Las muestras se homogeneizaron en un tisularizador a 30 Hz durante 2 minutos. Las muestras homogeneizadas se centrifugaron brevemente a 6000 rpm durante 30 segundos y se retiraron las perlas de acero de 5 mm. Los lisados tisulares se interrumpieron aún más sometiendo a ultrasonidos usando un microhorn de 1-1/16" de diámetro y se congelaron durante la noche a -80° C. Las muestras procesadas se descongelaron al día siguiente a 22 0C y se clarificaron por centrifugación (10 000 rpm/10 minutos/4 0C). Las capas de lípidos flotantes del cerebro u otros tejidos grasos, se aspiraron antes del ensayo. Las muestras se almacenaron en hielo húmedo y se ensayaron inmediatamente para determinar la actividad enzimática.
C. Estimación de proteínas
La proteína total se estimó utilizando el ensayo de Bradford basado en Coomassie (Thermo Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se configuró una curva patrón usando albúmina de suero bovino (BSA) para generar un intervalo de trabajo de 1-25 pg/ml y un blanco que representa el tampón de dilución de proteína sin BSA. Las muestras se diluyeron dos veces de 1/300 -1/1200 y se mezclaron en una proporción 1:1 de proteína diluida: Reactivo Bradford en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se permitió que las muestras se equilibraran a 22 °C durante 15 minutos y se recogieron los valores de absorbancia en un lector de placas a la longitud de onda sugerida de 595 nm. Los valores brutos se convirtieron en concentraciones de pg/ml utilizando la curva patrón con corrección del blanco. Las cantidades de microgramos después se convirtieron y se informaron en miligramos.
D. Ensayos de actividad enzimática
La actividad de la enzima IDUA se ensayó usando ácido 4-metillumbeliferil alfa-L-idopranosidurónico, Sal de ciclohexilamonio (4-MU-Ido; Toronto Research Chemicals, Inc.) como sustrato de acuerdo con métodos publicados previamente [Kakkis et al, Mol Genet Metab, marzo de 2001; 72(3): 199-208]. En resumen, 5-15 pl de lisados, o suero, se llevaron hasta 100 pl con agua doblemente destilada (ddH2O) y 100 pl de sustrato 4-MU-Ido 100 pM, diluido con tampón de reacción (acetato sódico 0,1 M, pH 3,5, NaCl 0,15 M, 0,05 % de Triton X-100) se combinó en una cubeta de metilacrilato (Thermo Scientific). Las reacciones se incubaron durante 1-3 horas en un baño de agua a 37 0C y terminaron con la adición de un tampón de parada 1x (glicina 290 mM, carbonato sódico 180 mM, pH 10,5). Los productos se leyeron en un QuantiFluor™-ST (Promega) a través del canal UV (Ex 365 nm, Em 440 - 470 nm). Los valores de fluorescencia en bruto se registraron y se convirtieron a nmol/ml/h usando una curva patrón de cantidades conocidas de 4-Metilmbeliferona (M-5410; Biosynth®). Los lisados de células y tejidos se normalizaron a valores de proteína estimados (nmol/mg/h; véase la sección de métodos titulada "estimación de proteínas").
E. Extracción de ADN y análisis de copia genómica
Se usó PCR Taqman para determinar la carga de ADN del vector en células diploides. Para la detección y cuantificación de genomas de vectores por PCR en tiempo real, el ADN celular total se extrajo de los tejidos usando un Mini Kit de ADN QIAamp (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Los conjuntos de cebadores y sondas se diseñaron para dirigirse a la región nRBG poliA del vector, usando las siguientes secuencias; directa: GCCAAAAATTATGGGGACAT, inversa: ATTCCAACACACTATTGCAATG, sonda: 6FAM-ATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCT-TAMRA. Las curvas patrón para la cuantificación del genoma del vector se establecieron con los plásmidos cis usados para la producción del vector correspondiente. La PCR se realizó con una mezcla maestra universal de PCR TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con 200 ng de ADN celular total como molde, cebadores 300 nM y sondas 200 nM cada uno. Los ciclos fueron durante 2 min a 50 0C, 10 min a 95 0C, 40 ciclos de 15 s a 95 0C y 1 min a 60 0C.
F. Inmunotransferencia
La inmunotransferencia se realizó de acuerdo con métodos convencionales. En resumen, se usó el sistema de gel NuPAGE (Life Technologies), geles bis-tris 4-12 %. La transferencia fue después de 30 minutos a 20V a una membrana de PVDF. El bloque fue 10 % de NFDM en T-PBS (durante la noche). El MAb primario fue IDUA anti­ humano de ratón 1:300 (1,5 horas); 1 % de NFDM en T-PBS. Secundario: Conejo anti-ratón unido a HRP 1:3000 (1 h); 1 % de NFDM en la detección de T-PBS fue por el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Dura (Thermo Scientific), 30 segundos de exposición en película de rayos X.
Ejemplo 3 - Estudios in vivo en ratones y perros
Pueden encontrarse deficiencias de IDUA en perros, permitiendo el estudio de la enfermedad y las terapias en un animal grande. Los perros MPS I portan una mutación recesiva (nula) en el gen IDUA, en donde una mutación G>A en el sitio de corte y empalme del donador del intrón 1 crea un codón de terminación prematuro en la unión exón-intrón [Menon, K.P., P.T. Tieu y E.F. Neufeld, Architecture of the canine IDUA gene and mutation underlying canine mucopolysaccharidosis I. Genomics, 1992. 14(3): p. 763-8.]. El curso de la enfermedad en el perro es análogo al síndrome de Hurler-Scheie; las manifestaciones de la enfermedad incluyen enfermedad esquelética significativa, incluyendo deformidad en el pecho.
El análisis de GAG en orina es un marcador bioquímico usado para determinar la efectividad de los tratamientos para MPS I en el entorno clínico.
La acumulación de glucosaminoglucanos (GAG) se evaluó en los órganos principales mediante tinción con azul de Alcian (pH 1) de secciones de parafina. La acumulación de GAG sin procesar dentro de las células se visualiza particularmente bien en secciones delgadas de 1 pm de tejidos embebidos en plástico teñidos con azul de toluidina. Secciones delgadas (1 pm) de tejidos embebidos en epon, teñido con azul de toluidina. Esto muestra células que contienen material de almacenamiento ("células espumosas, de esponja").
La inmunohistoquímica se realizó con anticuerpo contra gangliósido GM3 en el cerebro. Muestra almacenamiento anormal de GM3 en neuronas. La corteza se evaluó en perros y la corteza e hipotálamo en ratones. La expresión de IDUA humana en el hígado se evaluó por inmunofluorescencia.
A. Estudios con ratones
Se preparó hIDUA modificado con AAV8.TBG como se describe en el Ejemplo 1. Los ratones (aproximadamente 3 meses) se inyectaron por vía intravenosa a dosis de aproximadamente 1 x1011 GC, 3 x 1010 GC, 3 x 109 GC, 1 x109 GC y se evaluaron ~ 2 semanas después de la inyección.
Los resultados mostraron una ausencia disminuida o completa de tinción de GAG en los animales a los que se les administró 1 x 1011, 3 x 1010 y 3 x 109. En estos animales, se observó una disminución o ausencia total de lesiones de almacenamiento en secciones delgadas.
En los animales dosificados a 1 x 109, el almacenamiento de GAG se ve más o menos como en ratones no tratados y las lesiones de almacenamiento se ven más o menos como en ratones no tratados
Para almacenamiento de GM3, solo se evaluaron los animales dosificados en 1 x 1011 GC y 3 x 1010 GC, y se observó una mejora muy débil en el almacenamiento de GM3 en las neuronas.
Se observó una fuerte expresión (100 % de hepatocitos) de IDUA en animales dosificados a 1 x 1011 GC. Esto cae con dosis más bajas, con muy pocos hepatocitos positivos visibles a 1 x 109 GC.
B. Estudios caninos
Se preparó hIDUA modificado con AAV8.TBG como se describe en el Ejemplo 1. Los perros (de aproximadamente 8 meses de edad) fueron inyectados por vía intravenosa a una dosis de 1 x1011 GC y evaluados después de cuatro meses después de la inyección (es decir, 1 año de edad).
Este estudio muestra la reversión de las lesiones de almacenamiento. Más particularmente, el aclaramiento prácticamente completo del almacenamiento de GAG en todos los órganos principales se observa mediante la tinción de azul Alcian. No se observan lesiones de almacenamiento en secciones delgadas de corazón, riñón o hígado. Se observa una reducción o eliminación completa de la acumulación de GM3 en las neuronas. La expresión de IDUA en el hígado se observa por inmunofluorescencia en > 95 % de los hepatocitos.
Ejemplo 4 - Tratamiento de Hurler-Scheie con AAV2/8.TBG.hIDUA
La transferencia de genes mediada por AAV8 de IDUA se evaluará en pacientes con Hurler-Scheie. Los sujetos recibirían una única infusión de vector en una vena periférica que, según los datos preclínicos, debería conducir a una producción estable de la enzima a niveles cercanos a los obtenidos en sujetos normales. El ensayo puede implicar diferentes dosis de vector, por ejemplo, 3x1011 GC/kg; 1x1012 GC/kg; 3x1012 GC/kg y por favor añadir el intervalo de dosis. La evaluación más no invasiva de la efectividad es el nivel de GAG en orina que están elevados en la enfermedad y parcialmente corregidos después de la ERT. El injerto transgénico y su nivel de expresión se determinarán midiendo IDUA en suero. Los GAG en orina también se medirán antes y después de la terapia génica. (Texto independiente de listado de secuencias)
La siguiente información se proporciona para secuencias que contienen texto independiente de secuencias con el identificador numérico <223>.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un vector que lleva un casete de expresión que comprende un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos aproximadamente el 80 % idéntica a SEQ ID NO: 1 que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional en células humanas, en donde dicho casete de expresión comprende además secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión de la alfa-L-iduronidasa humana en células humanas, comprendiendo dichas secuencias de control reguladoras un promotor específico del hígado.
2. El vector de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen hIDUA modificado es al menos aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 1.
3. El vector de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la alfa-L-iduronidasa humana funcional se selecciona del grupo que consiste en:
(a) de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente 653 de SEQ ID NO: 2;
(b) una enzima humana sintética que comprende una secuencia líder heteróloga fusionada a aproximadamente los ácidos 27 a aproximadamente 653 de SEQ ID NO: 2;
(c) una variante de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene una o más de las modificaciones que comprenden: una reducción H en la posición de aminoácido 82; un cambio de R a Q en la posición 105; un cambio de G a R en la posición 116; un cambio de V a A en la posición 279; un cambio de L a R en la posición 346; un cambio de A a T en la posición 361; un cambio de H a N en la posición 449; un cambio de V a I en la posición 454; un cambio de A a T en la posición 591; y un cambio de A a T en la posición 622.
4. El vector de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el casete de expresión comprende además un poli A seleccionado de poli A de globulina de conejo.
5. El vector de acuerdo con la reivindicación 1 que es el plásmido pENN.TBG.hIDUA.nRBG.
6. Una partícula de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que tiene una cápside de AAV y que contiene empaquetada en la misma una repetición terminal invertida 5' (ITR), un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) bajo el control de secuencias reguladoras que controlan la expresión del mismo y una ITR 3' de AAV, en donde dicho gen hIDUA tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia al menos aproximadamente el 95 % idéntica a la misma que codifica una alfa-L-iduronidasa humana funcional.
7. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el gen hIDUA modificado se expresa bajo el control de un promotor específico del hígado
8. El vector de acuerdo con la reivindicación 1 o el rAAV de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el promotor es un promotor TBG.
9. El vector de acuerdo con la reivindicación 1 o el rAAV de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el vector comprende además uno o más potenciadores, opcionalmente en donde los potenciadores son iguales o diferentes.
10. El vector de acuerdo con la reivindicación 9 o el rAAV de acuerdo con la reivindicación 9, en donde los potenciadores se seleccionan del grupo que consiste en un intrón, un potenciador de CMV y un potenciador de Alfa mic/bik, opcionalmente en donde más de una copia de un potenciador seleccionado está presente en el vector, opcionalmente además en donde la más de una copia del potenciador se encuentra en tándem.
11. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV seleccionada de AAV8 y AAV9.
12. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el rAAV está pseudotipado, opcionalmente en donde los ITR son de un AAV2.
13. Una partícula vírica adenoasociada recombinante AAV2/8.TBG.hIDUA.co.
14. Una composición para su uso en el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo I (MPS I) que comprende una cantidad eficaz de la composición que comprende el rAAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho rAAV se administra por vía intravenosa o en donde el rAAV se administra al sujeto en una cantidad de aproximadamente 3 x 109 a aproximadamente 3 x 1012.
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