CN108601771B

CN108601771B - 使用基因疗法以推迟疾病发生和发展同时提供认知保护来治疗神经变性疾病的方法

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Publication number: CN108601771B
Application number: CN201680075712.7A
Authority: CN
Inventors: B.L.戴维森; Y.H.陈; L.特塞多尔
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2036-10-24
Also published as: KR20180067684A; CA3002654A1; BR112018008069A2; CN116650668A; AU2016341428B2; EP3364970A1; JP2022123145A; SG11201803218PA; US20180236105A1; JP7190352B2; EP3364970B1; AU2016341428A1; JP2018535955A; EP3364970A4; WO2017070678A1; CN108601771A

Abstract

本公开提供治疗哺乳动物中的溶酶体贮积病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的中枢神经系统直接施用编码多肽的AAV颗粒结合施用至少两种免疫抑制剂。AAV颗粒可通过直接注射到脑、脊髓、脑脊液或其一部分中来递送。

Description

使用基因疗法以推迟疾病发生和发展同时提供认知保护来治疗神经变性疾病的方法

相关申请

本专利申请要求2015年10月23日提交的美国专利申请号62/245,824的权益，该申请明确地以引用方式整体并入本文。

引言

基因转移现已被广泛接受为在细胞和分子水平下分析生物事件和疾病过程的有力手段。近年来，基因疗法在治疗遗传性(例如，ADA缺乏症)或获得性(例如，癌症或感染性疾病)人类疾病中的应用已受到广泛关注。

传统上，将基因疗法定义为治疗性基因被导入哺乳动物细胞中以纠正先天性基因错误的方法。虽然超过4500种人类疾病目前被分类为遗传性的，但这些疾病中仅有相对较少数已鉴别出人类基因组中的特定突变。直到最近，这些罕见的遗传性疾病才显现出基因疗法研究的排他靶标。因此，迄今为止，大多数NIH批准的基因疗法方案是涉及将缺陷基因的功能性拷贝导入具有已知的先天性基因错误的个体的体细胞中。直到近年来，研究人员和临床医师才开始认识到，大部分人类癌症、某些形式的心血管疾病及许多变性疾病也具有重要的遗传成分，并且出于设计新型基因疗法的目的，应被视为“遗传性病症”。因此，基因疗法近年来在广义上被定义为经由向患病生物体中导入新的遗传信息而对疾病表型的纠正。

在体内基因疗法中，转移基因被原位导入受体生物体的细胞中，原位即在受体内。在若干动物模型中考察体内基因疗法。若干最新出版物报道了直接基因原位转移到器官和组织如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统及肺中的可行性。还报道了DNA直接注射到骨骼肌、心肌中及DNA-脂质复合体注射到血管系统中产生表达水平可检测的体内插入的基因产物。

中枢神经系统疾病(例如脑遗传性疾病)的治疗仍是一个难处理的问题。其实例为溶酶体贮积病和阿尔茨海默氏病。总体上，溶酶体贮积病(LSD)的发病率在全世界10,000个新生儿中有1例，并且在65％的病例中，存在明显的中枢神经系统(CNS)参与。这些病症中缺乏的蛋白质当静脉内递送时不能通过血脑屏障，或当直接递送到脑中时，不能广泛分布。因此，需要开发用于CNS缺陷的疗法。

概述

本发明提供治疗患有溶酶体贮积病(LSD)的哺乳动物的方法。在一个实施方案中，方法包括：

(a)向哺乳动物的脑或脊柱施用多个AAV颗粒，所述AAV颗粒(i)包含AAV衣壳蛋白和插在一对AAV反向末端重复(ITR)之间的核酸，所述核酸编码具有溶酶体水解酶活性的多肽，及(ii)能够转导所述哺乳动物的细胞并提供所述多肽的表达；以及

(b)向所述哺乳动物施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂。在一个具体方面，在施用AAV颗粒之前，向哺乳动物施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂。

在具体实施方案中，所述多肽具有三肽基-肽酶1(TPP1)活性。在具体方面，所述多肽包括TPP1、其酶原或其酶促活性变体。

在进一步具体的实施方案中，第一免疫抑制剂是在施用AAV颗粒之前施用，且第二免疫抑制剂是在施用所述AAV颗粒之前、与之同时或之后施用。

在具体方面，在施用所述AAV颗粒之前至少约两周施用所述第一免疫抑制剂，且在施用所述AAV颗粒之前约两周或之后40天内施用所述第二免疫抑制剂。

在具体方面，第一免疫抑制剂包括环孢菌素。在具体方面，第二免疫抑制剂包括麦考酚酯或其衍生物(例如，吗替麦考酚酯(MMF))。

在某些实施方案中，第一免疫抑制剂(例如，环孢菌素)是以约5-20mg/kg的剂量每天施用两次持续至少3个月。

在某些实施方案中，第一免疫抑制剂(例如，环孢菌素)的剂量在施用AAV颗粒之后1-2个月是减少的。

在某些实施方案中，第二免疫抑制剂(例如麦考酚酯或其衍生物)是以每天约5-20mg/kg的剂量施用。

在另外的具体实施方案中，在哺乳动物的脑脊液中的三肽基-肽酶1(TPP1)活性在至少5pmol TPP1/mg蛋白质的水平下可检测持续超过350天。

在另外的实施方案中，由所述AAV颗粒转导构成哺乳动物的脑脊液(CSF)的细胞(例如室管膜细胞)。在具体方面，用AAV颗粒转导的细胞(例如，室管膜细胞)表达并分泌多肽到所述哺乳动物的CSF中。

在进一步的实施方案中，AAV颗粒的施用包括向所述哺乳动物的小脑延髓池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间和/或室管膜的施用。

在更进一步实施方案中，AAV颗粒的施用包括向所述哺乳动物的脑脊液(CSF)的施用。

在仍另外的实施方案中，AAV颗粒的施用包括将所述哺乳动物的室管膜细胞与AAV颗粒接触。

在某些方面，AAV颗粒的施用包括将所述哺乳动物的软膜细胞、内皮细胞或脑膜细胞与所述AAV颗粒接触。

在某些实施方案中，AAV颗粒的施用包括将AAV颗粒注射到所述哺乳动物的脑或脊髓的组织或体液中。

在某些实施方案中，AAV颗粒的施用包括将AAV颗粒注射到所述哺乳动物的脑脊液中。

在某些实施方案中，哺乳动物为非啮齿类哺乳动物。在具体方面，非啮齿类哺乳动物为灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。在具体方面，非啮齿类哺乳动物为人类(例如儿童，例如，约1至约4岁)。

在某些实施方案中，所述LSD为婴儿或婴儿晚期蜡样脂褐质沉积症(LINCL)、神经元病性戈谢病、少年型巴藤病(Juvenile Batten)、法布里病(Fabry)、MLD、圣菲利波症(Sanfilippo)A型、亨特病(Hunter)、克腊比病(Krabbe)、莫尔基奥氏病(Morquio)、庞佩氏病(Pompe)、尼曼-匹克病(Niemann-Pick)C型、泰-萨病(Tay-Sachs)、贺勒氏症(Hurler)(MPS-I H)、圣菲利波症B型、马-拉病(Maroteaux-Lamy)、尼曼-匹克病A型、胱氨酸贮积症、贺勒-施艾氏症(Hurler-Scheie)(MPS-I H/S)、斯赖综合征(Sly Syndrome)(MPS VII)、施艾氏症(Scheie)(MPS-I S)、婴儿巴藤病(Infantile Batten)、GM1神经节苷脂沉积症、粘脂病II型/III型或桑霍夫氏病(Sandhoff disease)。

在具体实施方案中，与LSD有关的症状被推迟、减少、减轻或改善。在某些方面，症状是以下一种或多种：本体感受反应、眼球震颤、胁迫、瞳孔对光反射、小脑共济失调及意向性震颤。

在具体实施方案中，与在不先前施用第一免疫抑制剂的情况下施用第二免疫抑制剂相比，与LSD有关的症状的发作在例如施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时推迟了5-10、10-25、25-50或50-100天。

在具体实施方案中，与在不先前施用第一免疫抑制剂的情况下施用第二免疫抑制剂相比，与LSD有关的认知功能损失的发作在施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时推迟了5-10、10-25、25-50或50-100天。

在某些实施方案中，与在不先前施用第一免疫抑制剂的情况下施用第二免疫抑制剂相比，患有LSD的哺乳动物的寿命在施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时延长了例如5-10、10-25、25-50或50-100天。

在某些实施方案中，AAV颗粒是以约1×108至约1×1015vg/kg的剂量施用。

在某些实施方案中，在施用AAV颗粒之后至少30、60、90、120或更多天都未在哺乳动物的CSF中检测到中和抗体(例如，针对具有溶酶体水解酶活性的AAV载体颗粒或多肽)。在具体方面，在施用所述AAV颗粒之后至少250天未在所述哺乳动物的CSF中检测到中和抗体(例如，针对具有溶酶体水解酶活性的AAV载体颗粒或多肽)。

在某些实施方案中，多肽是在所述哺乳动物的脾脏或心脏中表达。

在某些实施方案中，多肽是在所述哺乳动物的小脑中表达。

在某些实施方案中，AAV颗粒为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10及AAV-2i8颗粒。

在某些实施方案中，AAV ITR中的一个或多个为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10及AAV-2i8 ITR。

本发明还提供AAV载体和AAV载体颗粒。在一个实施方案中，AAV载体包含AAV ITR序列、编码具有溶酶体水解酶活性(例如TPP1)的多肽的核酸、及表达控制元件，所述表达控制元件驱动编码具有溶酶体水解酶活性(例如TPP1)的多肽的核酸的表达。

在一个实施方案中，AAV颗粒包括本文所述的AAV载体。

在某些实施方案中，AAV载体或AAV颗粒包含AAV ITR序列，如一个或多个AAV2ITR。

在某些实施方案中，AAV载体或AAV具有编码哺乳动物TPP1的核酸。在某些方面，所述核酸编码人TPP1。在某些方面，所述核酸编码与SEQ ID NO:5中所示的人TPP1具有80％或更多同一性的蛋白质。在某些方面，所述核酸编码如SEQ ID NO:5中所示的人TPP1。

在某些实施方案中，表达控制元件包括CMV增强子。

在某些实施方案中，表达控制元件包括β肌动蛋白启动子。在具体方面，表达控制元件包括鸡β肌动蛋白启动子。

在某些实施方案中，表达控制元件包括CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子。

在某些实施方案中，表达控制元件包括与SEQ ID NO:9具有80％或更多同一性的序列。在具体方面，表达控制元件包括SEQ ID NO:9。

在某些实施方案中，AAV颗粒具有衣壳序列，所述衣壳序列包含与以下序列具有90％或更多同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8VP1、VP2和/或VP3序列。

在某些实施方案中，AAV颗粒具有VP1衣壳序列，所述衣壳序列与AAV2 VP1衣壳序列具有80％或更多同一性或与AAV2具有80％或更多同一性，其中所述衣壳序列在位置444、500和/或730处具有被不是酪氨酸的氨基酸取代的酪氨酸。在具体方面，衣壳序列与AAV2VP1衣壳序列具有80％或更多同一性，其中所述衣壳序列在位置444、500和/或730处具有被苯丙氨酸取代的酪氨酸。在更具体的方面，衣壳序列包含AAV2 VP1衣壳序列，其中在位置444、500和/或730处的酪氨酸已被苯丙氨酸取代。

在某些实施方案中，AAV颗粒具有选自以下中的任一个的VP2或VP3衣壳序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型。

附图简述

图1A-C共同示出了AAV2(SEQ ID NO:1；AVV2capPro)的VP1与AAV4(SEQ ID NO:2；AVV4capPro)的VP1的比对。

图2A-G共同示出了基于来自AAV2(NCBI登录号NC_001401)和AAV4(NCBI登录号NC_001829)的序列，AAV2(SEQ ID NO:3；AVV2capNuc)与AAV4(SEQ ID NO:4；AVV4capNuc1)核苷酸(即，编码VP1、VP2及VP3的ORF)的比对。

图3示出了人TPP1氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。

图4A-C共同示出了人TPP1核酸序列(SEQ ID NO:6)。

图5示出了恒河猴TPP1氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。

图6示出了食蟹猴TPP1氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。

图7A-7F示出了在CSF中的TPP1和TPP1中和抗体(NAb)。通过活性测定(图7A、7C和7E)测量升高的TPP1水平，并且通过将缺乏TPP1的小鼠胚胎成纤维细胞暴露于纯化的TPP1与在治疗之前或之后收集的狗CSF的混合物来测量NAb水平，相对于未治疗的狗CSF(图7B、7D和7F)。在给予免疫抑制治疗的狗中测量TPP1活性和NAb水平：在第44天，相对于载体输注(图7A和7B)；在第33天，相对于载体输注(图7C和7D)且在第-5天，相对于载体输注(图7E和7F；DC019显示出0.3pmol/mg蛋白质，其为正常的100％)。

图8A-8G示出了在缺乏TPP1的狗中AAV2.caTPP1治疗对临床症状的发作的影响：(图8A)与未治疗的狗相比，后肢中的受损本体感受反应的发作在治疗的狗中平均推迟了4.5个月；(图8B)在5只治疗的狗的3只中未出现病理性眼球震颤；(图8C)与未治疗的狗相比，胁迫反应缺陷的发作在治疗的狗中被推迟；(图8D)与未治疗的狗相比，瞳孔对光反射异常在治疗的狗中平均推后了3.1个月出现；(图8E)与未治疗的狗相比，在治疗的狗中在5.4个月后检测到小脑共济失调；(图8F)与未治疗的狗相比，前肢中的受损本体感受反应的发作在治疗的狗中被推迟；(图8G)治疗的狗比未治疗的狗推后4.1个月开始显现出意向性震颤。*p<0.05，**p<0.01，使用非参数的Mann-Whitney检验。

图9示出了AAV2.caTPP1治疗对认知缺陷的发作的影响。AAV.caTPP1治疗的狗从4个月(注射后1个月)起一直优于未治疗的狗。

图10A-10B示出了在实验终点处脑实质中的TPP1活性水平：(图10A)在室管膜中的TPP1活性水平；(图10B)在室周或脑膜区域中的TPP1活性水平。TPP1水平是相对于正常狗中所见的。

图11A-11C示出了在AAV.caTPP1输注的狗中caTPP1的生物分布：(图11A)在治疗的(右)和未治疗的(中)缺乏TPP1的狗中对于犬TPP1的免疫组织化学染色。示出了在前脑中的隔膜(Spt)和尾状核(Caud)、在第三脑室水平下的下丘脑(HT)及在第四脑室附近的前庭区(VA)中的TPP1免疫阳性细胞。比例尺＝100μm。示出了I.侧脑室(第一和第二排图)、III.脑室(第三排图)及IV脑室(第四排图)的横截面积；(图11B)在中央管和沿着脊髓的神经元附近的TPP1免疫阳性细胞；颈3(C3)、胸5(T5)及腰7(L7)。比例尺＝400μm；(图11C)在治疗的(右)和未治疗的(中)缺乏TPP1的狗中对于犬TPP1的免疫组织化学染色。横截面积示于图的左侧。示出了从尾端皮质区到喙端皮质区的TPP1免疫阳性细胞TPP1免疫阳性细胞。比例尺＝100μm。

图12示出了AAV.caTPP1治疗对星形胶质细胞活化的影响。与未治疗的缺乏TPP1的狗相比，通过对神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫反应性所测量的神经胶质星形细胞增生在治疗的狗中是减少的。mCx＝运动皮质；cgCx＝扣带皮质。比例尺＝1mm。

图13A-13B示出了：(图13A)与未治疗的缺乏TPP1的狗相比，在AAV2.caTPP1治疗的狗中自动荧光储存和对于ATP合酶亚基C积聚的免疫标记的水平降低。比例尺分别＝25μm和100μm；(图13B)在丘脑(Th)、小脑(CB)及枕叶皮质(occCx)中通过蛋白质印迹定量的p62和SCMAS。将正常狗(黑色柱)和AAV.caTPP1治疗狗(空心柱)的结果针对未治疗狗中的p62和SCMAS水平进行归一化。根据相对于载体输注的MMF治疗天数对AAV.caTPP1分组。

图14示出了在外周器官中的TPP1水平。在未治疗的(-)、AAV.caTPP1治疗的(+)及正常狗(+/+)的所示外周组织的匀化样品中通过TPP1活性测定测量TPP1水平。与未治疗的缺乏TPP1的狗相比，在AAV.caTPP1治疗的脾脏和心脏样品中检测到TPP1的活性增加。*p<0.05，使用非参数的Kruskal-Wallis检验。

图15示出了在正常狗的CSF中的TPP1水平。通过正常犬CSF中的TPP1活性水平来测量TPP1水平。

图16示出了AAV.caTPP1治疗对寿命的影响。未治疗的TPP1无效狗(黑线)和在注射后33天(虚线)或注射前5天(虚线)用MMF治疗的AAV.caTPP1注射动物的存活期图。

发明详述

本文提供了治疗哺乳动物的溶酶体贮积病(LSD)的方法。在某些实施方案中，需要本文所述的治疗的哺乳动物为患有或疑似患有LSD的哺乳动物。在某些实施方案中，本文所述的方法或组合物是用于治疗、预防或推迟LSD的一种或多种症状的发作。

LSD的非限制性实例包括婴儿脂褐质沉积症或婴儿晚期神经元蜡样脂褐质沉积症(LINCL)、戈谢病、少年型巴藤病、法布里病、MLD、圣菲利波症A型、婴儿晚期巴藤病、亨特病、克腊比病、莫尔基奥氏病、庞佩氏病、尼曼-匹克病C型、泰-萨病、贺勒氏症(MPS-I H)、圣菲利波症B型、马-拉病、尼曼-匹克病A型、胱氨酸贮积症、贺勒-施艾氏症(MPS-I H/S)、斯赖综合征(MPS VII)、施艾氏症(MPS-I S)、婴儿巴藤病、GM1神经节苷脂沉积症、粘脂病II型/III型或桑霍夫氏病。

LSD常常是由编码三肽基肽酶-1(TPP1)酶的基因中的遗传异常(例如突变、缺失、插入)引起，由此导致TPP1酶活性的缺乏。在人类中，TPP1是由CLN2基因编码，有时称为TPP1基因。例如，婴儿晚期神经元蜡样脂褐质沉积症(LINCL)是一种儿童期神经变性疾病，最经常是由TPP1活性缺乏引起，这归因于CLN2中的突变。发育正常直至2-4岁，之后表现为运动和智力衰退、癫痫发作及视觉缺陷。死亡一般发生在生命的第一个十年内。大多数LINCL病例是由于CLN2中的突变，其诱导可溶性溶酶体酶三肽基肽酶-1(TPP1)的缺乏。TPP1被合成为甘露糖-6-磷酸酶原并且类似于其它可溶性溶酶体水解酶，该酶原基本上靶向溶酶体但也可经由分泌途径从细胞中释放。因而，可发生通过相同或相邻细胞的细胞摄取以及后续的溶酶体递送及酶原被活化为活性形式。

在某些实施方案中，本文提供了通过向中枢神经系统的组织或体液直接施用AAV颗粒来治疗患有或疑似患有LSD的哺乳动物的方法，所述AAV颗粒指导具有TPP1活性的多肽(在本文中称为AAV-TPP1颗粒)的表达。在某些实施方案中，AAV-TPP1颗粒与一种或多种免疫抑制剂一起施用。本文公开了显示在溶酶体贮积病的动物模型中AAV直接递送至脑和/或脊髓的功效的数据。

任何合适的哺乳动物都可通过本文所述的方法或组合物来治疗。哺乳动物的非限制性实例包括人类、非人类灵长类动物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家畜(例如狗和猫)、农场动物(例如马、奶牛、山羊、绵羊、猪)以及实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物为人类。在某些实施方案中，哺乳动物为非啮齿类哺乳动物(例如人类、猪、山羊、绵羊、马、狗等)。在某些实施方案中，非啮齿类哺乳动物为人类。哺乳动物可为任何年龄或处在任何一个发育阶段(例如，成人、少年、儿童、婴儿或哺乳动物子宫内)。哺乳动物可为雄性或雌性。在某些实施方案中，哺乳动物可为动物疾病模型，例如用于研究LSD的动物模型。

通过本文所述的方法或组合物治疗的受试者包括成人(18岁以上)和儿童(小于18岁)。儿童也包括婴儿。儿童的年龄范围在小于2岁或2-4、4-6、6-18、8-10、10-12、12-15及15-18岁范围内。婴儿年龄通常在1-12个月的范围内。

腺相关病毒(AAV)为细小病毒科的小型非致病性病毒。AAV不同于此家族的其它成员之处是在于其依靠辅助病毒来复制。AAV基因组已显示稳定地整合到宿主细胞基因组中；具有宽的宿主范围；在体外和体内转导分裂和非分裂细胞两者并且保持高水平的转导基因表达。AAV病毒颗粒是热稳定的、耐溶剂的、耐清洁剂的、耐pH和温度变化的，并且可在CsCl梯度上或通过其它方式浓缩。AAV基因组包含正义或负义的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。在辅助病毒不存在下，AAV可以基因座特异性方式整合到例如染色体19的q臂中。AAV的大约5kb基因组是由一节+或-极性的单链DNA组成。基因组的末端是短的反向末端重复，其可折叠成发夹结构并用作病毒DNA复制的起点。

迄今为止，众多血清学不同的AAV已被鉴别，且超过一打已由人或灵长类动物中分离。大多数天然AAV的基因组常含有两个开放阅读框(ORF)，有时称为左ORF和右ORF。左ORF经常编码非结构性Rep蛋白、Rep 40、Rep 52、Rep 68及Rep 78，除产生单链子代基因组之外，其还参与了复制和转录的调控。Rep蛋白中的两个与AAV基因组优先整合到人类染色体19的q臂的一个区域中有关。已显示Rep68/78具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。一些Rep蛋白具有核定位信号以及若干潜在的磷酸化位点。在某些实施方案中，AAV(例如rAAV)的基因组编码一些或所有Rep蛋白。在某些实施方案中，AAV(例如rAAV)的基因组不编码Rep蛋白。在某些实施方案中，Rep蛋白中的一种或多种可在转运中被递送且因此不包括在包含编码多肽的核酸的AAV颗粒中。

AAV基因组的末端包含短的反向末端重复(ITR)，其具有折叠成T形发夹结构从而用作病毒DNA复制的起点的潜能。因此，AAV的基因组包含一个或多个(例如一对)ITR序列，该序列侧接其单链病毒DNA基因组。ITR序列各自常常包含约145个碱基。已描述了在ITR区域内的两个元件，它们被认为对ITR功能很重要，即GAGC重复基序和末端分解位点(trs)。已显示当ITR呈线性或发夹构象时重复基序结合Rep。此结合被认为是将用于裂解的Rep68/78置于以位点和链特异性方式出现的trs处。除它们在复制中的作用之外，这两个元件似乎也是病毒整合的关键。包含在染色体19内的整合基因座是具有相邻trs的Rep结合位点。这些元件已显示出功能性并且为基因座特异性整合所必需。在某些实施方案中，AAV(例如rAAV)包含两个ITR。在某些实施方案中，AAV(例如rAAV)包含一对ITR。在某些实施方案中，AAV(例如rAAV)包含一对ITR，其侧接(即，在各5′和3′端处)至少编码具有TPP1酶活性的多肽的多核苷酸。

AAV病毒粒子(颗粒)是直径为大约25nm的无包膜二十面体颗粒。AAV颗粒包含具有二十面体对称性的衣壳，其是由三个相关衣壳蛋白构成，即VP1、VP2和VP3，它们一起互相作用以形成衣壳。右ORF经常编码衣壳蛋白VP1、VP2及VP3。这些蛋白质通常分别以1:1:10的比率存在，但可呈变化的比率，并且全部来源于右ORF。衣壳蛋白由于利用替代剪接和不寻常的起始密码子而彼此不同。缺失分析显示由替代剪接的信息翻译而来的VP1的移除或变更造成感染性颗粒的产生减少。VP3编码区内的突变使得无法产生任何单链子代DNA或感染性颗粒。AAV颗粒为包含AAV衣壳的病毒颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒的基因组编码VP1、VP2及VP3多肽中的一个、两个或全部。

术语“载体”是指小型载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)或可通过插入或并入核酸来操纵的其它媒介物。这种载体可用于遗传操纵(即“克隆载体”)，以便将多核苷酸引入/转移到细胞中并在细胞中转录或翻译插入的多核苷酸。

“表达载体”是含有具有在宿主细胞中表达所需的必要调控区的基因或核酸序列的专用载体。载体核酸序列通常含有至少一个复制起点以供在细胞中增殖以及任选另外的元件，如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、ITR、多腺苷酸化信号。

病毒载体来源于或基于构成病毒基因组的一个或多个核酸元件。具体的病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体。还提供了包含编码TPP1多肽的核酸序列、变体或子序列(例如，具有TPP1酶活性的多肽片段)的载体。

术语“重组”作为载体的修饰语，如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如AAV)载体，以及序列的修饰语，如重组多核苷酸和多肽，意指以通常自然界中不存在的方式被操纵(即工程化)的组合物。重组载体(如AAV载体)的一个具体实例将为以下：通常不存在于野生型病毒(例如AAV)基因组中的多核苷酸被插入病毒基因组内。重组多核苷酸的一个实例将为以下：编码TPP1多肽的核酸(例如基因)被克隆到载体中，有或没有其基因通常关联在病毒(例如AAV)基因组内的5′、3′和/或内含子区域。尽管术语“重组”在本文中并不总是关于载体(如病毒和AAV载体)以及序列(如多核苷酸)使用，但包括多核苷酸的重组形式明确地包括在内，虽然存在任何这种遗漏。

重组病毒“载体”或“AAV载体”来源于病毒(如AAV)的野生型基因组，通过使用分子方法以从病毒(例如AAV)中除去野生型基因组，并用非天然核酸(如编码TPP1的核酸序列)替代。通常，对于AAV，AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”病毒载体(例如AAV)不同于病毒(例如AAV)基因组，因为所有或一部分病毒基因组已被关于病毒(例如AAV)基因组核酸(如编码TPP1的核酸序列)的非天然序列替代。因此，非天然序列的并入将病毒载体(例如AAV)定义为“重组”载体，在AAV的情况下，其可被称为“rAAV载体”。

AAV载体(例如，rAAV载体)可被包装并且在本文中称为“AAV颗粒”，以用于细胞后续的离体、体外或体内感染(转导)。当重组AAV载体被包裹或包装到AAV颗粒中时，所述颗粒也可被称为“rAAV颗粒”。在某些实施方案中，AAV颗粒为rAAV颗粒。AAV颗粒通常包含AAV载体或其一部分。AAV颗粒可为一个或多个AAV颗粒(例如，多个AAV颗粒)。AAV颗粒通常包含包裹或包装AAV载体基因组的蛋白质(例如，衣壳蛋白)。

任何合适的AAV颗粒(例如rAAV颗粒)都可用于本文的方法或组合物。AAV颗粒和/或其中所包含的基因组可来源于AAV的任何合适的血清型或菌株。AAV颗粒和/或其中所包含的基因组可来源于AAV的两个或更多个血清型或菌株。因此，AAV可包含AAV的任何血清型或菌株的蛋白质和/或核酸或其部分，其中AAV颗粒适用于感染和/或转导哺乳动物细胞。AAV血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10或AAV-2i8。在某些实施方案中，多个AAV颗粒包含相同菌株或血清型(或亚组或变体)的颗粒或来源于它们的颗粒。在某些实施方案中，多个AAV颗粒包含两种或更多种不同AAV颗粒(例如，不同血清型和/或菌株)的混合物。

在某些实施方案中，AAV颗粒不是AAV4颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒在抗原性或免疫上不同于AAV4。可通过标准方法确定差异。例如，ELISA和蛋白质印迹可用于确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫上不同于AAV4。此外，在某些实施方案中，AAV2病毒颗粒保留不同于AAV4的组织向性。

在某些实施方案中，基于第一血清型基因组的rAAV载体与包装载体的衣壳蛋白中的一种或多种的血清型相同。在某些实施方案中，重组AAV载体基因组可基于AAV(例如AAV2)血清型基因组，其不同于包装载体的AAV衣壳蛋白中的一种或多种的血清型。例如，AAV载体基因组可包含源自AAV2的核酸(例如ITR)，而三种衣壳蛋白中的至少一种或更多种来源于AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8血清型或其变体。

包含指导多肽表达的多核苷酸的重组AAV载体可使用本领域中已知的合适的重组技术生成(例如，参见Sambrook等人,1989)。重组AAV载体通常被包装到有转导能力的AAV颗粒中并使用AAV病毒包装系统来增殖。有转导能力的AAV颗粒能够结合至并进入哺乳动物细胞中且随后将核酸货物(例如异源基因)递送到细胞核中。因此，有转导能力的完整AAV颗粒被配置来转导哺乳动物细胞。AAV颗粒被配置来转导通常没有复制能力的哺乳动物细胞，并且需要另外的蛋白质机构以进行自我复制。因此，将配置来转导哺乳动物细胞的AAV颗粒工程化以结合并进入哺乳动物细胞并且将核酸递送到细胞中，其中供递送的核酸经常位于AAV基因组中的一对AAV ITR之间。

在某些实施方案中，用于产生有转导能力的AAV颗粒的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞，它们可被或已被用作异源AAV载体的受体。来自稳定的人细胞系293(容易例如以登记号ATCC CRL1573获自美国典型培养物保藏中心)的细胞可在本公开的实践中使用。在某些实施方案中，将修饰过的人胚肾细胞系(例如，HEK293)用于生成重组AAV颗粒，所述细胞系是用腺病毒型-5DNA片段转化并表达腺病毒E1a和E1b基因。修饰过的HEK293细胞系容易被转染，并提供用于产生rAAV颗粒的特别方便的平台。生成能够转导哺乳动物细胞的高滴度AAV颗粒的方法是本领域中已知的。例如，AAV颗粒可如Wright,2008和Wright,2009中所述而制得。

在某些实施方案中，AAV辅助功能通过在转染AAV表达载体之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞被导入宿主细胞中。AAV辅助构建体因此有时用于至少提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达以补充生产性AAV转导所必需的失去的AAV功能。AAV辅助构建体经常缺少AAV ITR并且不能自我复制和包装。这些构建体可呈质粒、噬菌体、转位子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，如常用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其编码Rep和Cap表达产物。编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体是已知的。

在某些实施方案中，本文中的方法包括AAV2颗粒的使用。在一个具体方面，AAV2颗粒为重组AAV2颗粒。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含AAV2衣壳。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含一种或多种衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，这些蛋白与天然或野生型AAV2颗粒的相应衣壳蛋白至少60％、65％、70％、75％或更多同一，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等、高达100％同一。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，这些蛋白与天然或野生型AAV2颗粒的相应衣壳蛋白至少75％或更多同一，例如80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等、高达100％同一。在某些实施方案中，AAV2颗粒为天然或野生型AAV2颗粒的变体。在一些方面，AAV2变体的一种或多种衣壳蛋白与天然或野生型AAV2颗粒的衣壳蛋白相比具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20个或更多个氨基酸取代。

在某些实施方案中，AAV2颗粒(例如，AAV2颗粒的衣壳)包含VP1多肽，所述多肽与中SEQ ID NO:1所示的蛋白质具有至少60％、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含VP1多肽，该多肽与具有如图1和2中的AAV2 VP1衣壳蛋白的氨基酸序列的多肽约63％或更多同一(例如63％同一性)。AAV2衣壳序列与AAV4衣壳序列为约60％同源。在某些实施方案中，AAV2 VP1衣壳蛋白具有与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少65％同源的序列。在某些实施方案中，AAV2VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，AAV颗粒包含一个或两个ITR(例如，一对ITR)，该ITR与天然或野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10或AAV-2i8的相应ITR至少75％或更多同一，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等、高达100％同一，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能(例如形成发夹的能力，这允许DNA复制；AAV DNA整合到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要的话)。在其它实施方案中，AAV2颗粒包含一个或两个ITR(例如，一对ITR)，该ITR与天然或野生型AAV2颗粒的相应ITR至少75％或更多同一，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等、高达100％同一，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能(例如形成发夹的能力，这允许DNA复制；AAVDNA整合到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要的话)。

AAV2颗粒可包含具有任何合适数目的“GAGC”重复的ITR。在某些实施方案中，AAV2颗粒的ITR包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个“GAGC”重复。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含具有三个“GAGC”重复的ITR。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含具有少于四个“GAGC”重复的ITR。在某些实施方案中，AAV2颗粒包含具有多于四个“GAGC”重复的ITR。在某些实施方案中，AAV2颗粒的ITR包含Rep结合位点，其中在头两个“GAGC”重复中的第四个核苷酸为C而非T。

任何合适长度的DNA都可并入到AAV2颗粒中。用于AAV载体中的合适的DNA分子可为约5千碱基(kb)、小于约5kb、小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb、小于约3kb、或小于约2.5kb。

TPP1为由CLN2基因(TPP1基因)编码的溶酶体丝氨酸蛋白酶。人类TPP1的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:5。人类TPP1的核酸序列表示为SEQ ID NO:6。人类TPP1包含三肽基-肽酶I活性(TPP1酶活性)。TPP1活性包含非特异性溶酶体肽酶活性，由此从由溶酶体蛋白酶产生的分解产物生成三肽。底物特异性研究表明TPP1主要裂解来自肽和蛋白质中未被取代的氨基末端的三肽。内源性表达的TPP1被合成为无催化活性的酶。在靶向溶酶体中之后，因为酸性环境，所以TPP1自身催化加工成为成熟活性的酶。TPP1的活性可使用已知方法在体外测量和/或定量。参见，例如Junaid等人,1999。

具有TPP1活性的多肽是指哺乳动物的TPP1蛋白或其一部分，它们展现SEQ ID NO:5的人TPP1的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％肽酶活性，如使用合适的肽底物所测定，例如，通过Junaid等人,1999的方法或另一种相当方法所测定。在某些实施方案中，具有TPP1活性的多肽是指哺乳动物的TPP1蛋白或其子序列或变体，它们展现SEQ ID NO:5的人TPP1的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％肽酶活性。

具有TPP1活性的多肽可包含截短的、突变的、嵌合的或修饰形式的TPP1多肽，这些多肽保留至少部分TPP1活性。具有TPP1活性的多肽可包含TPP1蛋白或其一部分，它们是获自任何合适的生物体(例如，来自哺乳动物、人、非人哺乳动物，例如，来自狗、猪、奶牛等)。在某些实施方案中，具有TPP1活性的多肽与SEQ ID NO:5中所示的TPP1蛋白具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性。

在某些实施方案中，AAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和编码具有TPP1活性的多肽的核酸。在某些实施方案中，AAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和指导具有TPP1活性的多肽的表达和/或分泌的核酸。

在某些实施方案中，AAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和编码TPP1多肽或其酶活性部分的核酸。在某些实施方案中，AAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和指导TPP1多肽或其酶活性部分的表达和/或分泌的核酸。在某些实施方案中，施用的核酸编码TPP1，即与野生型TPP1、和/或TPP1的变体、突变体或片段具有基本同一性的TPP1。在某些实施方案中，TPP1多肽与SEQ IDNO:5中所示的蛋白质具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性。在其它实施方案中，TPP1多肽与SEQ ID NO:7或8中所示的蛋白质具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性。

在某些实施方案中，AAV颗粒包含与SEQ ID NO:6中所示的核酸具有至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性的核酸。在某些实施方案中，编码TPP1活性或编码或指导TPP1多肽的表达的核酸为与SEQ ID NO:6中所示的核酸具有至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性的核酸。

人TPP1氨基酸序列描绘于图3(SEQ ID NO:5)中，人TPP1核酸序列描绘于图4A-6C(SEQ ID NO:6)中。图5描绘了恒河猴TPP1氨基酸序列(SEQ ID NO:7)，而图6描绘了食蟹猴TPP1氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。

在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用或递送AAV-TPP1颗粒并向哺乳动物施用一种或多种免疫抑制剂。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用或递送AAV-TPP1颗粒并向哺乳动物施用2、3、4种或更多种免疫抑制剂。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用或递送AAV-TPP1颗粒并向哺乳动物施用两种免疫抑制剂。在一个代表性实施方案中，治疗哺乳动物的方法包括向哺乳动物施用或递送AAV-TPP1颗粒并向哺乳动物施用第一和第二免疫抑制剂。

当施用两种或更多种免疫抑制剂时，每种免疫抑制剂是独特和/或不同的(例如，每种试剂在结构和/或作用机制方面是不同的)。“试剂”是指活性药物成分。在某些实施方案中，免疫抑制剂为抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂为麦考酚酯或其衍生物。所述麦考酚酯衍生物的一个实例为吗替麦考酚酯(MMF)。在某些实施方案中，免疫抑制剂为环孢菌素或其衍生物。在某些实施方案中，第一免疫抑制剂包括环孢菌素且第二免疫抑制剂包括麦考酚酯或其衍生物(例如MMF)。在某些实施方案中，第一免疫抑制剂包括环孢菌素且第二免疫抑制剂包括MMF。

在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前、期间和/或之后施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒的同时施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之后施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之后约1至约60分钟、之后约1至约24小时、之后约1至约100天、之后约1至约12个月、或之后约1至约5年施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前约1至约60分钟、之前约1至约24小时、之前约1至约100天、或之前约1至约3个月施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10天施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前、期间和/或之后以预定的时间间隔(例如，每天一次、每天两次、每天三次、每隔一天、每周、每两周、每两月、其组合等等)施用。

在某些实施方案中，在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前至少约1至约7天、或之前约1、约2、约3、约4或约5周向哺乳动物施用第一免疫抑制剂，且在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前约1至约7天、之前约1、约2、约3、约4或约5周、期间和/或之后约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约350、约400或约500天内施用第二免疫抑制剂。在某些实施方案中，在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前至少约1至约7天、或之前约1、约2、约3、约4或约5周向哺乳动物施用环孢菌素，且在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前约1至约7天、之前约1、约2、约3、约4或约5周、期间和/或之后约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约350、约400或约500天内施用麦考酚酯或其衍生物(例如，MMF)。在某些实施方案中，在施用AAV-TPP1颗粒之前约1至约7天、或之前约1、约2、约3、约4或约5周并且在治疗之后每隔一定时间施用环孢菌素，且在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之前约1至约7天、之前约1、约2、约3、约4或约5周、期间和/或之后约10至约40天内施用麦考酚酯或其衍生物(例如，MMF)一次。

免疫抑制剂可以任何合适的剂量施用。在某些实施方案中，环孢菌素是以约1至约50mg/kg、约1至约20mg/kg、或约5至约10mg/kg的剂量，在每天一次、两次或三次至每隔一天一次的频率下施用。在某些实施方案中，环孢菌素是以约10mg/kg每天两次施用。在某些实施方案中，环孢菌素是以约10mg/kg每天两次施用持续至少约1、约2、约3、约4或约5个月。在某些实施方案中，在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之后约1至约2个月，环孢菌素的剂量逐渐减少至小于约5mg/kg或小于约2mg/kg的剂量。

在某些实施方案中，麦考酚酯或其衍生物(例如，MMF)是以约1至约100mg/kg、约1至约50mg/kg、约1至约25mg/kg、或约5至约20mg/kg的剂量，在每天一次、两次或三次至每隔一天一次的频率下施用。在某些实施方案中，麦考酚酯或其衍生物(例如，MMF)是以约10至约20mg/kg每天一次施用。在某些实施方案中，在向哺乳动物施用AAV-TPP1颗粒之后约1至约2个月，麦考酚酯或其衍生物(例如，MMF)的剂量减少至小于约5mg/kg或小于约2mg/kg的剂量。

免疫抑制剂可在适于特定的施用途径的任何合适的制剂中配制。免疫抑制剂的各种药学上可接受的制剂可商购获得且可易于由执业医生获得。

免疫抑制剂可通过任何合适的途径施用。在某些实施方案中，免疫抑制剂是经口施用。在某些实施方案中，麦考酚酯或其衍生物，如吗替麦考酚酯(MMF)，是经口施用。在某些实施方案中，环孢菌素是经口施用。免疫抑制剂也可胃肠外(例如，肌内、静脉内、皮下)施用，或通过注射到脑、脊髓或其一部分中(例如，注射到CSF中)来施用。

在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统施用一个或多个(例如多个)AAV-TPP1颗粒。在某些实施方案中，中枢神经系统包括脑、脊髓及脑脊液(CSF)。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物的脑或脊髓或CSF施用一个或多个AAV-TPP1颗粒。在某些实施方案中，向脑或脊髓的一部分施用AAV-TPP1颗粒。在某些实施方案中，向哺乳动物的小脑延髓池和/或哺乳动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间和/或室管膜施用包含AAV-TPP1颗粒和免疫抑制剂的组合物。例如，AAV-TPP1颗粒可直接递送至小脑延髓池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间或室管膜。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物的室管膜施用一个或多个AAV-TPP1颗粒。

在某些实施方案中，例如，通过将一个或多个细胞与AAV-TPP1颗粒接触向哺乳动物中接触CSF的所述细胞施用AAV-TPP1颗粒。接触CSF的细胞的非限制性实例包括室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞和/或脑膜细胞。在某些实施方案中，向室管膜细胞施用AAV-TPP1颗粒。在某些实施方案中，例如通过将室管膜细胞与AAV-TPP1颗粒接触，将AAV-TPP1颗粒递送至室管膜细胞。

在某些实施方案中，AAV-TPP1颗粒被局部递送。“局部递送”是指将活性剂直接递送到哺乳动物内的靶位点(例如，直接递送至组织或体液)。例如，试剂可通过直接注射到器官、组织或指定的解剖位置中来局部递送。在某些实施方案中，一个或多个AAV-TPP1颗粒是通过直接注射到脑、脊髓或其组织或体液(例如CSF，如室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞和/或脑膜细胞)中来递送或施用。例如，AAV-TPP1颗粒可经由直接注射被直接递送到CSF、小脑延髓池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间和/或室管膜。在某些实施方案中，将AAV-TPP1颗粒通过直接注射到脑或脊髓的组织或体液中与脑或脊髓的组织、体液或细胞接触。在某些实施方案中，AAV-TPP1颗粒没有通过例如静脉内、皮下或肌内注射或通过静脉内输注来全身递送。在某些实施方案中，AAV-TPP1颗粒是通过立体定位注射递送到脑或脊髓的组织或体液。

在某些实施方案中，一个或多个AAV-TPP1颗粒是通过将AAV-TPP1颗粒直接注射到脑、脊髓或其组织或体液(例如，CSF，如室管膜)中来递送或施用。在一个具体方面，AAV-TPP1颗粒转导室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞和/或脑膜细胞。

如本领域技术人员在考虑到本文的教导(如本文所提供的剂量范围)时所显而易见，可凭经验确定AAV-TPP1颗粒的有效量。在治疗过程中可以一个剂量、连续或间断地施用。施用的有效剂量可由本领域技术人员确定并可根据AAV血清型、病毒滴度以及被治疗的哺乳动物的体重、状况及物种而变化。可以用治疗医师选择的剂量水平、靶标及时机来完成单次或多次施用。

在某些实施方案中，施用多个AAV-TPP1颗粒。如本文所用，多个AAV颗粒是指约1×10⁵至约1×10¹⁸个颗粒。

在某些实施方案中，AAV-TPP1颗粒是以如下剂量施用：在约1至约5ml中约1×10⁵至约1×10¹⁶vg/ml的剂量；约1至约3ml的1×10⁷至约1×10¹⁴vg/ml的剂量；或约1至约2ml的1×10⁸至约1×10¹³vg/ml的剂量。在某些实施方案中，AAV-TPP1颗粒是以约1×10⁸至约1×10¹⁵vg/kg所治疗的哺乳动物体重的剂量施用。例如，AAV-TPP1颗粒可以如下剂量施用：约1×10⁸vg/kg、约5×10⁸vg/kg、约1×10⁹vg/kg、约5×10⁹vg/kg、约1×10¹⁰vg/kg、约5×10¹⁰vg/kg、约1×10¹¹vg/kg、约5×10¹¹vg/kg、约1×10¹²vg/kg、约5×10¹²vg/kg、约1×10¹³vg/kg、约5×10¹³vg/kg、约1×10¹⁴vg/kg、约5×10¹⁴vg/kg或约1×10¹⁵vg/kg所治疗的哺乳动物体重。

AAV-TPP1颗粒的施用可以一个或多个剂量进行。例如，可根据需要施用多剂量以保持足够的酶活性。

适于注射或输注AAV-TPP1颗粒的药物形式可包括无菌水溶液或分散体，它们适用于无菌可注射或可输注溶液或分散体的临时制备，任选地包裹在脂质体中。在所有情况下，最终形式在制造、使用和储存的条件下，应为灭菌流体并且是稳定的。液体载体或媒介物可为溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适的混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体、在分散体的情况下通过维持所需粒度或通过利用表面活性剂来保持。等渗剂，例如糖、缓冲液或盐(例如氯化钠)可包括在内。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

AAV-TPP1颗粒的溶液或混悬液可任选地包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、人工CSF、固定油类、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)、甘油或其它合成溶剂；抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸等；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡萄糖。

AAV-TPP1颗粒和组合物可以便于剂量的施用和均一性的剂量单位形式配制。如本文所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为用于有待治疗的个体的整体剂量；各单位含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物联合所要药物载体。剂量单位形式取决于产生所需效果所必需的AAV-TPP1颗粒的量。所必需的量可以单剂量配制，或可以多个剂量单位来配制。剂量可调整至合适的AAV-TPP1颗粒浓度，任选地与抗炎剂组合，并包装以供使用。

在一个实施方案中，药物组合物将含有足够量的遗传物质来提供治疗有效量，即其量足以减轻或缓解所讨论的疾病状态的症状或其量足以带来所需的益处。药物组合物通常含有药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括任何其本身对接受所述组合物的个体不产生有害抗体的药用试剂，并且施用时没有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、Tween80、以及液体，如水、盐水、甘油及乙醇。药学上可接受的盐也可包括在内，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。这类媒介物中还可能存在辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。药学上可接受的赋形剂的全面论述可获自Remington’s Pharmaceutical Sciences,1991。

含有AAV-TPP1颗粒的制剂将在媒介物中含有有效量的rAAV颗粒，该有效量容易由本领域技术人员确定。AAV-TPP1颗粒通常可在约1％至约95％(w/w)的组合物的范围内，或甚至更高(如果合适的话)。有待施用的量取决于以下因素：如哺乳动物的年龄、体重和身体状况或考虑接受治疗的人受试者。本领域的普通技术人员可通过建立剂量反应曲线的常规试验来确定有效剂量。

在某些实施方案中，方法包括向如本文所述的哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)施用多个AAV-TPP1颗粒，任选地连同第一和第二免疫抑制剂一起，其中LSD的一种或多种症状的发作时间被推迟。术语“发作时间”是指在首次施用AAV-TPP1颗粒之后首次观察或检测到LSD症状的时间点。其发作可被推迟的LSD的非限制性症状包括本体感受反应、眼球震颤、胁迫、瞳孔对光反射、小脑共济失调及意向性震颤。症状(例如，神经功能障碍的体征)的发作时间可通过标准临床神经病学检查(例如，参见Lorenz等人,2011在主观上确定。

与LSD有关的症状的发作时间的推迟可通过将用AAV-TPP1颗粒、第一和第二免疫抑制剂(例如环孢菌素和MMF)治疗的哺乳动物的症状发作时间与用AAV-TPP1颗粒和麦考酚酯(例如，在第一免疫抑制剂如环孢菌素不存在下)治疗的一种或多种哺乳动物相比较来确定。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分施用多个AAV-TPP1颗粒及第一和第二免疫抑制剂，其中LSD的一种或多种症状的发作时间与用AAV-TPP1颗粒和麦考酚酯(例如，在如环孢菌素的第一免疫抑制剂不存在下)治疗的一种或多种哺乳动物相比推迟了至少约5至约10、约10至约25、约25至约50、或约50至约100天。

在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分施用多个AAV-TPP1颗粒及第一和第二免疫抑制剂，其中认知功能损失的发作时间与用AAV-TPP1颗粒和麦考酚酯(例如，在如环孢菌素的第一免疫抑制剂不存在下)治疗的一种或多种哺乳动物相比推迟了至少约5至约10、约10至约25、约25至约50、或约50至约100天。认知功能损失的发作时间可由Tmaze(Sanders等人,2011)确定。在某些实施方案中，本文中的方法包括向哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分施用多个AAV-TPP1颗粒及第一和第二免疫抑制剂，其中哺乳动物的寿命与用AAV-TPP1颗粒和麦考酚酯(例如，在如环孢菌素的第一免疫抑制剂不存在下)治疗的一种或多种哺乳动物相比延长了至少约5至约10、约10至约25、约25至约50、或约50至约100天。

在某些实施方案中方法包括向哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分施用多个AAV-TPP1颗粒及第一和第二免疫抑制剂，其中在哺乳动物的CSF中没有检测到中和抗体的存在持续AAV-TPP1颗粒施用之后至少约10至至少约300天。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分施用多个AAV-TPP1颗粒及第一和第二免疫抑制剂，其中在哺乳动物的CSF中没有检测到中和抗体持续AAV-TPP1颗粒施用之后至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天、至少约60天、至少约70天、至少约80天、至少约90天、至少约100天、至少约150天、至少约200天、至少约250天或至少约300天。

在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物的脑或脊髓或其部分施用多个AAV颗粒，其中所述AAV颗粒被配置来转导哺乳动物的细胞并指导哺乳动物中具有TPP1活性的多肽的表达，其中所述多肽在一种或多种外周器官(例如，在脾脏和/或心脏中)表达和/或检测。

在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物的脑或脊髓或其部分施用多个AAV颗粒，其中所述AAV颗粒被配置来转导哺乳动物的细胞并指导哺乳动物中具有TPP1活性的多肽的表达，其中所述多肽在中枢神经组织(例如，脑，例如小脑)中表达和/或检测。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用以指代所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其聚合物。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA及抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微小RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸可包括天然存在的、合成的、及有意修饰或更改的多核苷酸(例如，变体核酸)。多核苷酸可为单链、双链、或三链的、线性或环状的，并且可具有任何合适的长度。在讨论多核苷酸时，具体的多核苷酸的序列或结构可根据在5′至3′方向上提供序列的惯例在本文中描述。

编码多肽的核酸经常包含编码多肽的开放阅读框。除非另外指出，特定的核酸序列还包含简并密码子取代。

核酸可包含一个或多个与开放阅读框可操作地连接的调控元件，其中所述一个或多个调控元件被配置来指导在哺乳动物细胞中由开放阅读框编码的多肽的转录和翻译。调控元件的非限制性实例包括转录起始序列(例如启动子、增强子、TATA盒等)、翻译起始序列、mRNA稳定性序列、poly A序列、分泌序列等等。调控元件可从任何合适生物体的基因组处获得。有用的调控元件的非限制性实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子区(CMVIE)；劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成启动子、杂合启动子等等。另外，在本文中也可使用来源于非病毒基因(如鼠科金属硫蛋白基因)的序列。示例性组成型启动子包括编码某些组成型或“管家”功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子及本领域技术人员已知的其它组成型启动子。另外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型地发挥作用。其中尤其包括：SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼氏白血病毒及其它逆转录病毒的长末端重复(LTR)；及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。因此，以上参照的组成型启动子中的任一个可用于控制异源基因插入物的转录。

在诱导型启动子的控制下的基因仅仅表达或在诱导剂(例如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子存在时极大地增加)存在下以更大程度表达。诱导型启动子包括反应元件(RE)，该元件当它们的诱导因子结合时刺激转录。例如，存在用于血清因子、甾体激素、视黄酸及环AMP的RE。含有特定RE的启动子可被选出以获得可诱导的反应，且在一些情况下，RE本身可连接到不同启动子上，由此向重组基因赋予可诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型对比诱导型；强对比弱)，有可能控制多肽在遗传修饰的细胞中的存在和表达水平。如果编码多肽的基因在诱导型启动子的控制下，那么多肽原位递送是通过将遗传修饰的细胞原位暴露于允许多肽转录的条件下而触发，例如，通过控制所述因子转录的诱导型启动子的特定诱导物的腹膜内注射来完成。例如，在金属硫蛋白启动子的控制下通过遗传修饰的细胞对由基因编码的多肽的原位表达是通过将遗传修饰的细胞与含有适当(即诱导)金属离子的溶液原位接触来增强。

当一条核酸与另一条核酸序列处于功能关系中时，该核酸即为“可操作地连接”。编码多肽的核酸或指导TPP1多肽(例如，具有TPP1活性的多肽)表达的核酸可包含诱导型启动子或组织特异性启动子以用于控制所编码多肽的转录。

在某些实施方案中，CNS特异性或诱导型启动子、增强子等被用于本文所述的方法中。CNS特异性启动子的非限制性实例包括从来自髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)及神经元特异性烯醇酶(NSE)的基因中分离的那些。诱导型启动子的非限制性实例包括用于蜕皮激素、四环素、低氧及IFN的DNA反应元件。

可以靶向多肽以便递送到胞外、胞内或膜位置处。从细胞中分泌的基因产物通常具有分泌“信号”，以用于从细胞中分泌到胞外环境。表达载体也可被构建以包括分泌“信号”。基因产物也可保留在细胞内。以类似的方式，基因产物可包括“保持”信号序列或表达载体可被构建以包括“保留”信号序列，以用于将多肽锚定在细胞质膜内。例如，膜蛋白具有疏水性跨膜区，由此将蛋白质保持在膜中。

如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变型意指偏离参照序列的核酸、多肽或其子序列。修饰的及变体序列因此与参照序列相比可具有基本上相同、更多或更少的表达、活性或功能，但至少保留参照序列的部分活性或功能。特定类型的变体为突变蛋白，其指的是在TPP1中由具有突变(例如，错义或无义突变)的基因编码的蛋白质。

“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已被遗传更改的修饰过的序列。所述序列可被遗传修饰，而不更改所编码的蛋白质序列。或者，所述序列可被遗传修饰以编码变体蛋白，例如，变体TPP1蛋白。核酸或多核苷酸变体也可指的是已被密码子修饰以编码仍保留与参照序列(如野生型蛋白质序列)的至少部分序列同一性的蛋白质并且还被密码子修饰以编码变体蛋白的组合序列。例如，这样一种核酸变体的一些密码子将被改变，而不会更改由此编码的TPP1蛋白的氨基酸，并且核酸变体的一些密码子将被改变，这又会改变由此编码的TPP1蛋白的氨基酸。

如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且包括全长蛋白质及其片段。因此，“蛋白质”与“多肽”在本文中经常可互换使用。由本文所公开的“核酸”或“多核苷酸”序列编码的“多肽”包括部分或全长天然TPP1序列，连同天然存在的野生型和功能性多态蛋白、其功能性子序列(片段)以及其修饰形式或序列变体，只要所述多肽保留一定程度的TPP1酶活性。因此，在本发明方法中，这种由核酸序列编码的多肽可以但不要求与内源性蛋白质TPP1蛋白相同，该TPP1蛋白是有缺陷的或其表达不足或在被治疗的哺乳动物中是缺乏的。

多肽中的氨基酸变化可通过改变相应核酸序列的密码子来完成。这种多肽可基于用其它氨基酸取代多肽结构中的某些氨基酸以改变或改善生物活性来获得。例如，经由替代氨基酸的取代，可给予多肽以小的构象改变以便提高活性。或者，在某些多肽中的氨基酸取代可用于提供残基，随后这些残基可连接至其它分子以得到肽-分子缀合物，该缀合物保留足以适用于其它目的的起始多肽的性质。

在赋予多肽以相互作用的生物功能时，可使用氨基酸的亲水性指数，其中发现某些氨基酸可取代其它具有相似亲水性指数的氨基酸，而仍保留相似的生物活性。或者，可基于亲水性进行相似氨基酸的取代，尤其是当将产生的多肽中所需的生物功能用于免疫实施方案中时。“蛋白质”的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性相关。因此，注意到可基于分配到每个氨基酸的亲水性来进行取代。

在应用将数值赋予每一氨基酸的亲水性指数或亲水指数的过程中，进行这些数值±2时的氨基酸取代，其中典型的是±1，且在±0.5以内是最典型的取代。

修饰的非限制性实例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如，约1至约3、约3至约5、约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约100、约100至约150、约150至约200、约200至约250、约250至约500、约500至约750、约750至约1000或更多个核苷酸或残基)。核酸修饰的一个非限制性实例为密码子优化。

氨基酸修饰的一个实例为保守氨基酸取代或缺失。在具体实施方案中，修饰或变体序列(例如TPP1)保留未修饰的序列(例如野生型TPP1)的功能或活性的至少一部分。

“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。在大多数生物体中脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与了DNA内所含的信息向蛋白质中的转移。所公开的核苷酸序列的片段和变体及由此编码的蛋白质或部分长度蛋白质也包括在本发明中。“片段”或“部分”意指全长或小于全长的编码多肽或蛋白质的核苷酸序列或多肽或蛋白质的氨基酸序列。在某些实施方案中，片段或部分是生物功能性的(即，保留5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％野生型TPP1的酶活性)。

分子的“变体”是基本上类似于天然分子序列的序列。对于核苷酸序列，变体包括以下那些序列：因为遗传密码的简并性，故而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列。天然存在的等位基因变体(如这些)可通过使用分子生物学技术，例如像聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴别。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，如例如通过使用定点诱变生成的编码天然蛋白质的那些以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些。通常，本发明的核苷酸序列变体将与天然(内源性)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，通常至少80％，例如81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％序列同一性。在某些实施方案中，变体是生物功能性的(即，保留5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％野生型TPP1的酶活性)。

具体核酸序列的“保守修饰的变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸序列。因为遗传密码的简并性，所以很多功能相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA及AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸用密码子表示的每个位置处，密码子可被更改为在未更改所编码的蛋白质的情况下所述的任何相应的密码子。这种核酸变异是“沉默变异”，它是一种“保守修饰的变异”。除非其中另有说明，编码多肽的本文所述的每个核酸序列还描述每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，在核酸中的每个密码子(除ATG之外，其是通常用于甲硫氨酸的唯一密码子)可通过标准技术被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”都隐含在每个描述的序列中。

术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含使用采用标准参数描述的比对程序中的一种与参照序列相比具有以下序列同一性的序列：至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％。本领域技术人员将认识到，这些值可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框位置等而适当调整以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性通常意指至少70％、至少80％、90％、或甚至至少95％的序列同一性。

在肽的上下文中，术语“基本同一性”是指肽包含在一个指定的比较窗口上与参照序列具有以下序列同一性的序列：至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至95％、96％、97％、98％或99％。表示两条肽序列基本上相同的指示是，一条肽与针对第二条肽的抗体具有免疫反应性。因此，例如，当两条肽区别仅在于保守取代时，某肽与第二条肽基本相同。

AAV“基因组”是指最终被包装或包裹以形成AAV颗粒的重组核酸序列。AAV颗粒常常包含AAV基因组。在重组质粒用于构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包括“质粒”中不对应于重组质粒的载体基因组序列的部分。重组质粒的此非载体基因组部分被称为“质粒主链”，其对于质粒的克隆和扩增(即增殖和重组病毒产生所需的过程)很重要，但本身不被包装或包裹到病毒(例如AAV)颗粒中。因此，载体“基因组”是指由病毒(例如AAV)包装或包裹的核酸。

“转基因”在本文中宜指的是意图或已被导入细胞或生物体中的核酸。转基因包括任何核酸，如编码多肽或蛋白质(例如TPP1)的基因。

在具有转基因的细胞中，转基因经常经由载体被导入/转移，如AAV颗粒。转基因通过AAV颗粒向细胞中的导入常被称为细胞的“转导”。术语“转导”是指分子如核酸经由载体(例如，AAV颗粒)向细胞或宿主生物体中的导入。转基因可被或不被整合到转导细胞的基因组核酸中。如果导入的核酸被整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，那么所导入的核酸可稳定地维持在那个细胞或生物体中并由受体细胞或生物体的后代细胞或生物体进一步继承或遗传。最终，导入的核酸可存在于受体细胞或宿主生物体的额外染色体中，或仅瞬时存在。“转导细胞”是转基因已经由转导被导入其中的细胞。因此，“转导”细胞是核酸已被导入其中的细胞或其子代。可使转导细胞增殖并表达导入的蛋白质，或转录核酸。对于基因疗法使用和方法，转导细胞可在哺乳动物中。

如本文所用，术语“血清型”是一种用于指代以下的区别：具有在血清上不同于其它AAV血清型的衣壳的AAV。血清学区别性是基于针对一种AAV的抗体与另一种AAV相比之间的交叉反应性的缺乏来确定。这种交叉反应性差异通常归因于衣壳蛋白序列/抗原决定簇中的差异(例如，归因于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。尽管存在包括衣壳变体的AAV变体在血清上与参照AAV或其它AAV血清型相同的可能性，但它们与参照或其它AAV血清型相比仍相差至少一个核苷酸或氨基酸残基。

在各种示例性实施方案中，与参照血清型有关的AAV颗粒或其载体基因组具有包含或由与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8颗粒的多核苷酸、多肽或子序列至少60％或更多(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)同一的序列组成的多核苷酸、多肽或其子序列。在具体实施方案中，与参照血清型有关的AAV颗粒或其载体基因组具有包含或由与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8血清型的衣壳或ITR序列至少60％或更多(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)同一的序列组成的衣壳或ITR序列。

本文所用的术语“约”是指在参考值的10％(加或减)内的值。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”指的是治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目标是预防或减轻不希望有的生理变化或病症，如癌症的发展或扩散。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状况、延迟或减缓疾病发展、改善或缓和疾病状态、以及(部分或全部)缓解，无论是可检测的抑或不可检测的。“治疗”也可意指与未接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。那些需要治疗的包括那些已经患有病状或病症的以及那些倾向于患上病状或病症的或者那些其中这些病状或病症将被预防的。

除非在本文中另作说明或与本文的内容明显矛盾，在描述本发明的上下文中所使用的术语“一”和“所述”以及类似的指代词应理解为包括单数和复数。因此，举例来说，提及“载体”包括多个这种载体，且提及“病毒”或“颗粒”包括多个这种病毒粒子/颗粒。

除非另作说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被视为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非在本文中另有说明，本文所述的数值范围仅仅用作分别指代该范围内的每个单独的值的简化方法，并且每个单独的值与它在本文中被单独引述一样引用到说明书中。

所有申请、公布、专利及本文引用的其它参考文献(GenBank引文和ATCC引文)都以引用的方式整体并入。当发生冲突时，以本说明书(包括定义)为准。

除非在本文中另作说明或另外与本文的内容明显矛盾，本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行。本文所提供的任何及所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅仅意在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围施加限制，除非另外声明。说明书中任何语言均不应解释为将任何未要求保护的元素作为实施本发明的必要元素。

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本发明，但在本文中描述合适的方法和材料。

本文所公开的所有特征可以任何组合形式组合。说明书中公开的每个特征可由实现相同、等同或相似目的的替代特征所代替。因此，除非另外明确说明，所公开的特征是等同或相似特征的一般系列的一个实例。

除非在上下文中另外明确指出，所有数值或数值范围包括在所述范围内的整数及在范围内的值或整数的分数。因此，为了说明，提及80％或更多同一性包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。

用大于(超过)或小于提及整数包括分别大于或小于参考数值的任何数值。因此，举例来说，提及小于100包括99、98、97等，一直低至数值一(1)；且小于10包括9、8、7等，一直低至数值一(1)。

除非在上下文中另外明确指出，如本文所用的所有数值或范围包括在所述范围内的值和整数的分数以及在所述范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数值范围如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。提及1-50的范围因此包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直至并且包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。

提及一系列的范围包括将在该系列内的不同范围的边界值组合的范围。因此，为了说明，提及例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000的一系列范围包括10-50、50-100、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000等的范围。

通常使用肯定的语言来描述众多的实施方案和方面，由此在本文中公开本发明。本发明还特别包括其中完全或部分排除了特定主题(如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序)的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中通常不是按照本发明不包括什么来表述，但本发明中未被明确排除的方面仍在本文中公开。

本发明的实施方案在本文中有描述。本领域普通技术人员一旦阅读以上描述将对那些实施方案的变型显而易见。本发明者预期，熟练技术人员视情况而定采用所述变型，并且本发明者意图用本文具体描述以外的方式实施本发明。因此，只要法律容许，本发明包括此处所附的权利要求所述主题的所有改动和等价物。此外，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾，本发明包括要素以其所有可能变型的任何组合。因此，以下实施例旨在说明而不是限制要求保护的发明的范围。

本发明现将通过以下非限制性实施例来说明。

实施例1：在婴儿晚期形式的巴藤病的犬模型中脑室衬覆细胞的AAV介导的转导延迟神经变性疾病的发作和进展。

在LINCL狗模型中评价经由AAV载体递送至脑室系统(例如室管膜)的衬覆上皮的CLN2基因的治疗效果。用CLN2基因中的缺陷对LINCL狗进行工程化，该缺陷造成TPP1酶缺乏症。LINCL狗在出生时是正常的，但在约7个月时发展神经病学体征，在～5-6个月时出现可测试的认知缺陷，在10-11个月时癫痫发作，以及进行性视力损失。LINCL狗中的CLN2基因突变致使TPP1蛋白无功能，并且检测不到TPP1蛋白。随着疾病进展，脑组织缩小，造成脑中的脑室空间扩大。神经病学症状包括平衡和运动功能的下降、视力损失、震颤。在本发明之前，用表达溶酶体水解酶的rAAV转导室管膜细胞以逆转大型动物模型中的表型的有效性是未知的。

对室管膜细胞(其能够直接进入CSF)的转导进行研究以确认其是否在单次单侧输注表达犬形式的TPP1(caTPP1)的rAAV之后提供TPP1在LINCL狗模型中的长期和广泛生物分布。室管膜构成衬覆脑室系统和脊髓中央管的单层上皮。室管膜细胞是多纤毛的和有丝分裂后的，并且它们对旁分泌信号的定向CSF流动和移动、代谢物和毒素流入和流出脑是必不可少的。更具体地，用表达犬TPP1的rAAV2(rAAV.caTPP1)转导室管膜细胞并且评价穿过脑和在CNS外的TPP1酶活性以及临床益处。

表达TPP1的重组腺相关病毒(rAAV)的一次施用介导基因向室管膜细胞中的转移，从而提供重组TPP1在CSF中的组成型、高水平表达，由此产生显著的临床益处。具体说来，rAAVca.TPP1治疗的患病狗展现(1)临床体征发作的延迟；(2)疾病进展的延迟；(3)对认知下降的保护；及(4)寿命的延长。通过免疫染色和酶测定，重组蛋白明显遍及脑中。另外，存在对疾病的神经病理学特征的修正。在天然存在的犬疾病模型中的这些研究显示靶向脑室衬覆细胞的存活力以完成重组蛋白的稳定分泌，由此实现广泛的CNS分布和治疗益处。

材料和方法

AAV载体产生：使用标准三重转染方法生成在CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子的控制下表达犬TPP1的重组AAV2载体并且通过CsCl梯度离心(Wright,2008；Wright,2009)进行纯化。在凝胶电泳(SDS-PAGE)和PCR(Wright,2008；Wright,2009)之后通过银染色来定量滴度。

CAG启动子(SEQ ID NO:9)：

动物：长毛迷你腊肠犬繁殖并饲养于Missouri大学的由Office of AnimalResources(OAR)监督的机构中。TPP1无效的动物产生于杂合育种(Awano,2006)。通过PCR对所有小狗进行基因分型。除由OAR提供的标准护理之外，在整个研究期间每天对狗进行社会化训练。涉及狗的所有程序都是由University of Missouri Animal Care and UseCommittee综述并经其批准，并且关于实验动物的护理和使用，这些程序符合NationalInstitutes of Health Guide。使用配备有26号12cm针的Brainsight^TM神经导航系统，经25分钟进行脑室内输注。从基因疗法载体施用之前一至两周开始，在此项研究中向所有狗经口施用10mg/kg环孢菌素，每天两次。在2个月之后剂量逐渐减至每天一次，这在研究期间一直持续。制定了吗替麦考酚酯(MMF)的10-20mg/kg口服日剂量，如结果中所示，并且视耐受性而定在2至几个月之后逐渐减少。

组织样品TPP1酶活性分析：经由先前描述的方法(Chang等人,2008；Tian等人,2006)的修改版本测定TPP1活性。将样品在300μl冰冷的匀浆缓冲液(在具有完全蛋白酶抑制剂混合物的生理盐水中的0.1％Triton X-100，Roche,Mannheim,Germany)中匀化。通过在4℃×15分钟下以21×10³rcf离心来除去不溶性物质，并且通过DC蛋白质分析(Biorad,Hercules,CA)定量蛋白质。将上清液(10μl)置于含有以下各物的96孔黑壁板的各孔中：90μl的100mM柠檬酸钠缓冲液、150mM NaCl、及0.1％Triton X-100(pH 4.0)和酶底物(250μmol/l Ala-Ala-Phe 7-酰胺基-4-甲基香豆素，在柠檬酸钠缓冲液中，pH 4.0)。使用460-nm发射过滤器在37℃下在Safire 2微板读数器(Tecan.,Mannedorf,Switzerland)上读取板。将纯化的重组TPP1用作标准(P.Lobel,State University of New Jersey)。

脑脊液TPP1酶活性测定：在4℃下，以21×10³rcf使用Amicon Ultra-0.5离心过滤机(Ultracel-10K.Millipore Corporation)5分钟将样品浓缩3.5倍。将组织样品中的活化TPP1定量。

caTPP1中和抗体测定：为了评价CSF中的中和Ab(Nab)，使用Cln2-/-小鼠胚胎成纤维细胞。在测定之前十六小时，在前一天将1.0×10⁵个细胞/孔铺于24孔板上，并且将狗CSF在56℃下热灭活30分钟，1:10稀释，然后在37℃下用1.75nM的TPP1预温育1小时。将混合物在37℃下施用于细胞持续三小时，之后将细胞用37℃HBSS(Ca²⁺和Mg²⁺)洗涤，然后在100μl的冰冷匀浆缓冲液(即在具有完全蛋白酶抑制剂混合物的生理盐水中的0.1％TritonX-100)(Roche,Mannheim,Germany)中匀化。通过在4℃下以21×10³rcf离心10分钟除去不溶性物质并且如上所述检测TPP1活性。结果计算为从载体施用之前收集的CSF处获得的活性的百分比。

脑组织过程和组织学：将安乐死之后不久获得的脑切片在4℃下固定于4％多聚甲醛中24小时。将切片(40μm)在冷冻切片机上切割并漂浮在低温防护剂溶液(30％乙二醇、15％蔗糖、0.05％叠氮化钠，在Tris缓冲盐水中)中以便于在-20℃下储存。使用以下各物完成免疫组织化学：小鼠抗TPP1(Abcam；1:500)、小鼠抗GFAP(Sigma-Aldrich，1:500)、兔抗SCMAS(由E.F.Neufeld.惠赠,University ofCalifornia,Los Angeles,CA.；1:500)。将所有抗体在具有2％牛血清白蛋白、0.1％NaN₃及0.05％Tween 20的Tris-缓冲盐水中稀释。所用的二级抗体是生物素化的山羊抗小鼠(Jackson,Immuno Research,West Grove,PA；1:200)。将载玻片用Vectstain抗生物素蛋白和生物素化辣根过氧化酶大分子复合物(ABC)溶液(Vector Laboratories)温育，然后用3,3'-二氨基联苯胺过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich)显影。使用配备有DFC450 Leica彩色照相机的DM6000B Leica显微镜观察切片并拍照。

蛋白质印迹分析：通过BCA分析(Pierce,Rockford)来测定蛋白质浓度并且将50μg样品施加于12％SDS-PAGE，然后转移到0.2μm Immobilon PVDF膜(Millipore,Billerica)上。第一抗体是：兔抗p62(Cell Signaling；1:1000)、兔抗SCMAS(由E.F.Neufeld惠赠；1:3000)。二级抗体是HRP-山羊抗兔IgG(Jackson Laboratories；1:40000)。使用ECL Plus蛋白质印迹检测系统(GE Healthcare,Pittsburg)显色印迹。使用VersaDoc^TM成像系统(Biorad)进行蛋白质定量。将条带密度针对通过丽春红S染色评价的总蛋白负荷来归一化。

脑自身荧光：在安装到用Vectashield盖片的载玻片上的40μm自由漂浮切片上评价自身荧光储存物质。采用配备有复消色差透镜×40放大率透镜(N.A.0.85)、激发带通470(+20)：发射带通525(+25)nm滤光器及OrcaFlash4.0单色相机(Hamamatsu)的DM6000BLeica显微镜，在落射荧光下观察载玻片并拍照。暴露-匹配数字图像是取自治疗的和未治疗的脑的可比区域。图像经伪彩色至绿色作为滤光器发射波长。

统计分析：将GraphPad Prism 6软件(GraphPad Software,La JollaCalifornia,USA)用于统计分析。通过非参数检验分析数据。当仅比较两个组时进行Mann-Whitney检验，或者在三个或更多组的情况下，进行Kruskal-Wallis检验。

认知测试：如先前所描述(Sanders等人,2011)，通过评价狗对倒序学习任务的表现进行认知测试。狗各自开始测试方案的训练前期，然后从4月龄开始，以月间隔进行狗对倒序学习任务的表现。测试继续直到由于疾病相关的残疾，狗不能完成测试为止。将数据记录为每只狗在达到预定表现标准之前的测试阶段期间制造的错误的数量。

神经病学检查概要：狗经历临床评估，这些评估包括每周的身体和神经病学检查。在首个剂量之前连同身体检查一起记录所有狗的体重以建立基线值且此后每周进行记录。在整个研究过程中每周进行神经病学检查。通过标准化的临床神经病学检查(Lorenz等人,2011)主观上监测神经功能障碍的体征。神经病学检查的组成部分包括心理状态、姿势和步态的观察；颅神经的测试；姿势反应(本体感受位置、跳跃、独轮车、触觉放置及后体位伸肌推进)的评价；脊髓反射(肌伸张和屈肌)；以及感官测试。步态评价被评定为正常或异常的，在异常时存在共济失调(一般本体感受的、小脑的、前庭的)及下肢轻瘫和四肢轻瘫。姿势反应、脊髓反射、脑神经测试及感觉被评定如完整的、降低的或不存在的。还就异常活动和癫痫发作活性对狗进行评价。记录以下神经缺陷发作时的年龄：胁迫反应缺陷(单侧和双侧的)、视觉追踪、意向性震颤、头部震颤、肌肉阵挛性抽搐、共济失调以及骨盆和上肢的本体感受位置。

出于人道的原因，通过使用定义晚期疾病的统一标准来实施安乐死。晚期疾病标准是由以下组成：认识损失、严重的心理状态异常、视觉追踪损失、药物难治性肌阵挛性抽搐及癫痫发作活性，以及在无明显协助下不能进食。存活时间被定义为从出生到处死的时间，不考虑得出安乐死决定的临床体征。

结果

在犬CSF中的TPP1表达：TPP1无效的腊肠犬疾病模型在CLN2中具有移码突变(Awano等人,2006)，在血液中没有可检测的TPP1活性，并且具有重现了人TPP缺乏症的进行性神经变性症状(Sanders等人,2011；Katz等人2008)。

为了确定室管膜转导是否足以实现重组TPP1表达在脑中的广泛递送，需要一种载体，所述载体当递送时将特异性地且以合理的效率感染室管膜。在小鼠中，AAV4之所以独特是因为纹状体内或脑室内注射引起稳健的室管膜转导(Davidson等人,2000)。相反，在AAV4递送之后的犬脑中没有观察到室管膜转导。对表达报道基因的AAV1、2、6、8及9血清型进行另外筛选并发现AAV2是最佳的；2E12载体基因组的脑室内注射引起衬覆侧脑室的室管膜的几乎完全转导、以及在第3和第4脑室中室管膜的另外转导。

对在两只CLN2-/-狗中单侧注射rAAV.caTPP1(DC013、DC014)到CSF中之后早期的TPP1酶活性水平进行定量(表1；所有狗在治疗之前都以环孢菌素开始)。

表1：药物和载体治疗

早在注射后5天，CSF中便存在TTP1酶活性的显著提高；高达杂合对照狗CSF中所测水平的20倍(图7A；图15)。然而，重组TPP1活性在两个月之后降至背景水平(图7A)。因为这些狗是TPP1无效的，所以测试以确定此下降是否与中和抗体(NAb)的上升同时发生。将纯化的TTP1酶原用从rAAV.caTPP1治疗的CLN2-/-狗处收集的CSF或血清的连续稀释液温育，然后将混合物施于Cln2-/-小鼠胚胎成纤维细胞。发现在Cln2-/-细胞裂解物中的TPP1活性当将重组蛋白用注射后一个月收集的rAAV.caTPP1治疗的狗的CSF温育时降低(图7B)。来自这些动物的血清显示出相似的结果。

为了试图抑制中和免疫应答，除环孢菌素治疗之外还制定了MMF治疗。从第44天开始向两只狗(DC013和DC014)施用MMF，且在第33天施用另2只(DC015和DC016)。在载体施用后第44天MMF的引入不会造成TPP1活性的恢复(图7A)。然而，在载体施用后第33天开始MMF治疗将造成CSF TPP1活性的提高和抗TPP1 Ab滴度的降低(图7C和7D)。然后，在rAAV.caTPP1递送之前5天用MMF治疗CLN2-/-狗(DC018)。在此动物中，TPP1活性是稳健和持续的，并且不出现抗TPP1抗体(图7E和7F)。鉴于转基因表达的稳定性及神经病学症状的总体改善，在开始MMF疗法之后第5天用rAAV.caTPP1治疗另外2只狗(DC019和DC020)。

TPP1的CSF水平升高与临床症状和认知缺陷的改善有关。

未治疗的CLN2-/-狗早在5月龄时便显示出临床体征的发作且通常到38-45周时需要无痛处死(Katz等人,2014)。在未治疗的CLN2-/-狗中最早的临床体征之一是后肢的本体感受反应受损(平均发作年龄＝6个月；范围在4.6-8个月；n＝8；图8A)及后肢无力。在用rAAV.caTPP1基因疗法时，这些临床表型平均推迟了4.5个月(图8A)。在三只狗中，从未出现异常的眼球震颤(在未治疗的狗中的平均发作年龄＝7.7个月，范围在4.6-10.9，n＝7；治疗的狗为13.4个月，范围在12.6-14.3，n＝2)(图8B)，也未出现胁迫反应缺陷(在未治疗的狗中的平均发作年龄＝6.5个月，范围在4.8-8,3，n＝6；治疗的狗为10个月，范围在9.9-10.2，n＝2)(图8C)。瞳孔对光反射(PLR)异常在3只治疗的狗中被推迟，且在2只治疗的狗中从未检测到(在未治疗的狗中的平均发作年龄为8.5个月，范围在6.7-9.6个月，n＝8；治疗的狗为11.6个月，范围在10.6-13.7，n＝3)(图8D)。通常在后肢本体感受缺陷之后不久发作的小脑共济失调从未治疗的狗中平均年龄6.4个月(范围在5.9-9.4个月，n＝8)推迟到治疗的狗中的12.7个月(范围在12-13.8个月，n＝4)并且从未在1只治疗动物中出现(图8E)。上肢功能障碍也推迟了5至5.5个月，并且从未在1只治疗动物中出现(图8F)。

神经解剖局部异常的发作与未治疗的狗相比在治疗的狗之间是变化的。在未治疗的狗中的最早异常是一般本体感受性共济失调，但在治疗的狗中是视觉缺陷。这可能反映了分泌到CSF中的重组蛋白的视网膜渗透的缺乏。尽管如此，仍存在参与PLR的重要途径的明显节约，其是由视网膜引发(图8C和8D)。总之，存在运动异常发作的明显推迟，最惊人的实例是意向震颤发作的推迟或不存在(图8G)，异常的眼球震颤和小脑共济失调表明小脑前庭系统的节约。

除神经病学体征之外，CLN2-/-狗还具有认知下降，这可通过T迷宫(Sanders等人,2011)来量化。招募四只动物，在此测定中从4月龄开始，2只治疗且2只未治疗。类似于较早期的研究(Sanders等人,2011)，未治疗的CLN2-/-动物在T-迷宫中犯了更多错误，并且到6月龄时变得无法完成任务(图9)。然而，接受rAAV.caTPP1的狗类似于正常的狗继续探索迷宫，只要它们的运动能力容许(图9)。一只治疗的动物在19月龄时类似于正常狗以极少的错误继续完成任务，并且与其所处环境、照料者及群体中的其它狗保持高度交互。寿命的延长(图16；在未治疗的狗中无痛处死的平均年龄是10.4个月，相比之下rAAV2.caTPP1治疗的狗中是16.4个月(动态；一只狗在过去的22个月保持存活；表1)、临床症状的推迟(图8)及认知能力的保留(图9)与向来自同一群体的狗的鞘内或脑室空间中每两周输注重组TPP1所注意到的改善相比有明显延长(Katz等人，2014)。

重组TPP1广泛地分布于脑实质中。

到目前为止，数据支持以下假说：rAAV.caTPP1基因向室管膜中的转移提供对于临床益处来说足够的脑中的TPP1活性。预期CSF中的重组TPP1经由侧面孔隙从脑室流出到蛛网膜下腔中且最终沿着血管周间隙弥漫到下层实质。在啮齿类动物中，这造成了疾病相关读出结果的改善(Chang等人,2008；Liu等人,2005)。然而，此较早研究是在啮齿动物中完成并且不知道在较大的脑中TPP1渗透是否将有广泛递送局部差异或摄取是否将针对某些细胞类型。

在以下时间下采集的组织中发现TPP1活性从喙端到尾端脑区域都有显著提高：注射后第60天(2个月；DC013和DC014)、第300天(10个月；DC015和DC016)、第444天(～16个月；DC018)及第545天(～19个月；DC017)。DC019保持认知完好(～22个月；第631天)。在侧脑室近端的区域中，TPP1活性比正常增加2和4.5倍(图10A)。在由尾状核、丘脑和髓质处采集的样品中观察到与正常相比超过8倍的增加(图10B)。还在枕叶皮质中检测到TPP1活性，表明其可到达蛛网膜下腔并穿透大脑皮质(图10B)。

为了进一步检查脑中的TPP1分布，对犬TPP1执行免疫组织化学。与无效动物相反，发现稳健的酶染色遍及脑中(图11)。TPP1明显存在于衬覆整个脑室系统的室管膜细胞中以及包围以下的区域中：侧脑室(例如，隔膜和尾端；图11A)、第3脑室(例如下丘脑；图11A)、第4脑室(例如喙端髓质；图11A)及脊髓的中央管(图11B)。还发现TPP1阳性细胞沿着rAAV.caTPP1注射动物的大脑皮质和小脑皮质存在(图11C)。发现了免疫阳性细胞的喙端-尾端梯度。TPP1阳性细胞在型态上等同于锥体细胞，其中在胞体和主要树突内有点状免疫反应性。在前额皮质中，大多数TPP1阳性细胞位于V层中(图11C)。更尾端地，TPP1免疫阳性细胞见于所有皮质层中(图11C)。在梨状皮质中，胞内免疫反应性存在于胞体及多个细胞过程中(图11C)。在小脑皮质中，浦肯野神经元及分子层内的其它细胞显示最稳健的TPP1染色(图11C)。这些结果一起证实了从室管膜分泌的酶可到达蛛网膜下腔，并且内化穿过多个脑区域中的血管周间隙。

rAAV2.caTPP1转导之后星形胶质细胞活化和储存负荷的减少。

已在TPP-1缺乏症的啮齿类模型中和患者脑中了进行性星形胶质细胞活化。此活化的特征是在星形胶质细胞过程中GFAP免疫染色强度的增加。强烈的GFAP染色见于未治疗的TPP1无效的狗中(图12)。用rAAV.caTPP1进行的室管膜细胞转导造成GFAP免疫反应性的显著降低，甚至在晚期疾病时(图12)。在AAV.caTPP1注射动物中的隔膜、尾状核、运动皮质(mCx)及扣带回(cgCx)显示通过IHC的弱GFAP染色，以及与未治疗的TPP1缺乏的狗(图12)中的那些区域相比较少的免疫反应性过程。总体而言，数据表明TPP1在这些动物中的存在减少进行性星形细胞增生。

自身荧光积聚是NCL的标志，并且明显遍及患病的脑中。AAV2.caTPP1显著减少X、Y及Z区域中的自身荧光储存(图13A)。这伴随有ATP合酶亚基C积聚(SCMAS)的可测量的减少，如通过免疫组织化学(图13A)和蛋白质印迹(图13B)所评价。还评价了p62水平，近来有报道称其在TPP1无效小鼠中升高(Micsenyi等人,2013)。相对于未治疗的动物中所见，AAV2.caTPP1显著地降低p62储存负荷(图13B)。

外周器官中的重组TPP1

虽然在CLN2中具有突变的儿童中最相关的症状是神经系统来源的，但TPP1是普遍表达的酶(Kida等人,2001)。在室管膜转导之后在CSF中表达的TPP1可提供CNS之外的酶来源，因为CSF中的蛋白质可穿过蛛网膜颗粒到达外周血管系统。为了确定在治疗的狗中在CNS外的分布，通过酶活性测定来定量未治疗的和AAV.caTPP1治疗的狗的肝脏、脾脏、肾脏及心脏中的重组TPP1。与对照相比，显著升高的TPP1活性见于AAV.caTPP1治疗的狗的脾脏和心脏中(图14)。虽然总活性水平升高，但可获得的心脏样品的免疫组织化学显示在一些成肌细胞中的斑状、稳健染色，且在脾脏中的染色更为均匀。在肾脏中没有显著增加，且在肝脏中的TPP1活性也无显著升高，这归因于在无效的未治疗的狗中增强的背景酶活性，可能是由于肝脏中的另一种水解酶能够裂解本测定中使用的底物(图15)。心脏中TPP1活性的归一化与儿童的临床表现有关，因为心肌病已有报道并且在另一种NCL中可促进疾病进展(Ostergaard等人,2011)。在AAV.caTPP1治疗的狗的心脏中的酶活性比未治疗的无效动物大一个数量级，且在脾脏中高2倍(图14)。这些结果支持CSF驻留酶在室管膜转导之后可向外周器官提供TPP1的来源。

讨论

针对由TPP1缺乏所致的LINCL的基因疗法的安全性研究已在患者中有报道，采用重组AAV2的12个注射液到脑实质中(Worgall等人,2008)。使用相似递送方法的第二临床研究已用经由实质内注射递送的AAV血清型rh10开始进行(ClinicalTrials.gov标识:NCT01161576)。在两个试验中，病毒被限制在脑实质。

为了探究重组蛋白向脑中的递送及或许更宽的分布是否可经由CSF实现，评估在单次脑室内注射或脑室内与脑池的组合注射之后的室管膜转导。此外，与实质相反，这些方法不需要重大的神经外科手术，手术需要长期镇静，这是对患有神经变性疾病的儿童的一个重要考虑因素。在狗中，此方法造成重组TPP1的广泛分布，其中在疾病发作、疾病进展上有显著延迟，并且有对认知下降的保护。此疗法还产生神经病学改善并延长寿命，并且改善生活质量。

惊人的观察结果是临床体征首次出现的顺序上的差异。未治疗的TPP1缺乏的狗首次展示本体感受位置和共济失调的缺陷，伴有后肢无力。它们还显示出极早的认知损伤，通过在T-迷宫中的不良表现所反映。在患有TPP1缺乏症的儿童中的最早症状是相似的。患病儿童通常展示早期语言缺陷及在发育里程碑中的延迟或已获得的里程碑的损失、以及共济失调和本体感受缺陷。在AAV2.caTPP1治疗的动物中，共济失调、本体感受缺陷及认知的特征在发作上显著延迟，且在一些治疗的动物中，共济失调、本体感受缺陷及认知损失从未出现。反而，在AAV2.caTPP1治疗的动物中最早的临床体征是视力异常。尽管如此，治疗的狗显示由接收视网膜输入的重要途径中的缺陷所引起的临床体征的延迟，并且组织和酶测定结果显示在这些区域及正常视觉所必需的其它区域中存在的广泛水平的TPP1。因此，经由眼球内注射对视网膜的定向矫正可能保留这些受试者的视力。

在组织学上，检测到许多区域中储存负荷和神经胶质活化的减少，但关于减少程度，结果是可变的。具有最深远的临床益处的TPP1缺乏的狗具有降低水平的残余储存。在9-11月龄处死的未治疗的狗类似于TPP1无效小鼠在所有脑区域中都具有广泛的储存和神经胶质活化(Sleat等人,2004)。在13-17月龄(在基因转移之后10-14个月)采集的治疗动物的组织在SCMAS、自身荧光包含物、p62水平及神经胶质活化上显示广泛的减少。鉴于以下事实对这些数据感兴趣：在一些动物中，存在针对重组蛋白的明显抗TPP1应答。

在本文的研究中，早期抗TPP1应答在没有用MMF预治疗的狗中最稳健。在AAV递送之时或之前引入药物可减轻、抑制或显著延迟抗TPP1免疫应答。在此相同的狗疾病模型中，针对重组人TPP1的免疫应答也诱导稳健的抗TPP1应答，重组人TPP1是被输注到腰蛛网膜下腔或侧脑室中(Vuillemenot等人,2015)。在用弹丸输注时注意到过敏反应，其在减慢、连续输注方案时能被更好地控制或者不发生。至今，一直没有关于影响用重组蛋白每两周治疗的儿童的抗TPP1应答的报道。这是否反映了儿童与TPP1缺乏的狗之间在CSF中针对重组蛋白的免疫应答之间的差异也是未知的。在因危急生命的溶酶体贮积病而接受酶疗法的儿童中针对新抗原的免疫应答可如在治疗患有庞佩氏病的患者中所报道受到控制(Messenger等人,2012)。如果NAb在AAV.TPP1递送之后在TPP1缺乏的儿童中限制功效，那么可使用本文所开发的方法。最终，虽然在此施用的剂量产生临床功效，但这并不是最低有效剂量，且因此较低剂量可能产生稳健性较低的免疫应答。由于载体狗不展现症状，所以在整个生命期间连续表达50％的正常TPP1水平似乎也是足够的。

尽管受到治疗，但对基因疗法反应良好的狗最终还是死于疾病。虽然数据表明酶从CSF到达外周(在心脏和脾脏中的水平升高)，但该水平不足以挽救全身表现，其可在狗由于改善神经病学功能而活得更久而出现。尽管如此，本文所公开的方法从几个观点来看比当前方法有前景，它是一种用于患有TPP1缺乏症和ERT的儿童的基因疗法试验。一个优点是在于，此方法不需要为了载体输注而在镇静下(装置植入)的大量时间，或为了多基因疗法输注的重病特别护理。最终，此方法可减小患者的风险是因为其将避免对终生酶输注的需要，否则将需要长期反复进入脑中。

所有公布、专利以及专利申请都以引用的方式并入本文。尽管在前面的说明书中已结合某些实施方案描述了本发明并为了说明目的阐述了许多细节，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明包括另外的实施方案，而且本文描述的某些细节可以有相当大的改变，只要不脱离本发明的基本原理。

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Claims

1.(a)多个AAV颗粒和(b)第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂在制备用于治疗患有溶酶体贮积病(LSD)的哺乳动物的药物中的用途，

所述AAV颗粒(i)包含AAV衣壳蛋白和插在一对AAV反向末端重复(ITR)之间的核酸，所述核酸编码多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的三肽基-肽酶1(TPP1)多肽或其酶原，及(ii)能够转导所述哺乳动物的细胞并提供所述多肽的表达；以及

其中在施用所述AAV颗粒之前向所述哺乳动物施用所述第一免疫抑制剂和所述第二免疫抑制剂中的至少一者，其中所述第一免疫抑制剂是环孢菌素，其中所述第二免疫抑制剂是吗替麦考酚酯(MMF)，并且其中所述哺乳动物中的中和抗体应答通过施用所述第一免疫抑制剂和所述第二免疫抑制剂而降低。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述第一免疫抑制剂是在施用所述AAV颗粒之前施用且所述第二免疫抑制剂是在施用所述AAV颗粒之前、与之同时或之后施用。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中在所述哺乳动物的脑脊液中的三肽基-肽酶1(TPP1)活性在至少5pmol TPP1/mg蛋白质的水平下可检测持续超过350天。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中通过所述AAV颗粒转导构成所述哺乳动物的脑脊液(CSF)的细胞。

5.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中(i)在施用所述AAV颗粒之前至少两周施用所述第一免疫抑制剂，及(ii)在施用所述AAV颗粒之前两周或之后40天内施用所述第二免疫抑制剂。

6.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒的施用包括向所述哺乳动物的小脑延髓池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间或室管膜的施用。

7.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒的施用包括向所述哺乳动物的脑脊液(CSF)的施用。

8.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒的施用包括将所述哺乳动物的室管膜细胞与所述AAV颗粒接触。

9.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中用所述AAV颗粒转导的细胞表达并分泌所述多肽到所述哺乳动物的CSF中。

10.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒的施用包括将所述哺乳动物的软膜细胞、内皮细胞或脑膜细胞与所述AAV颗粒接触。

11.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是非啮齿类哺乳动物。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述非啮齿类哺乳动物为灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。

13.根据权利要求11所述的用途，其中所述非啮齿类哺乳动物为人类。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述人类为儿童。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述儿童为1岁至4岁。

16.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述LSD为婴儿或婴儿晚期蜡样脂褐质沉积症(LINCL)、神经元病性戈谢病、少年型巴藤病、法布里病、MLD、圣菲利波症A型、亨特病、克腊比病、莫尔基奥氏病、庞佩氏病、尼曼-匹克病C型、泰-萨病、贺勒氏症(MPS-IH)、圣菲利波症B型、马-拉病、尼曼-匹克病A型、胱氨酸贮积症、贺勒-施艾氏症(MPS-I H/S)、斯赖综合征(MPS VII)、施艾氏症(MPS-I S)、婴儿巴藤病、GM1神经节苷脂沉积症、粘脂病II型/III型或桑霍夫氏病。

17.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒的施用包括将所述AAV颗粒注射到所述哺乳动物的脑或脊髓的组织或体液中。

18.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒转导所述哺乳动物的室管膜细胞。

19.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中与在不先前施用所述第一免疫抑制剂的情况下施用所述第二免疫抑制剂相比，与所述LSD有关的症状的发作在施用所述第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时推迟了5-10、10-25、25-50或50-100天。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述症状选自由以下组成的组：本体感受反应、眼球震颤、胁迫、瞳孔对光反射、小脑共济失调及意向性震颤。

21.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中与在不先前施用所述第一免疫抑制剂的情况下施用所述第二免疫抑制剂相比，与所述LSD有关的认知功能损失的发作在施用所述第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时推迟了5-10、10-25、25-50或50-100天。

22.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中与在不先前施用所述第一免疫抑制剂的情况下施用所述第二免疫抑制剂相比，患有所述LSD的哺乳动物的寿命在施用所述第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时延长了5-10、10-25、25-50或50-100天。

23.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述环孢菌素是以5-20mg/kg的剂量每天施用两次持续至少3个月。

24.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中施用的所述环孢菌素的剂量在施用所述AAV颗粒之后1-2个月是减少的。

25.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述MMF是以每天5-20mg/kg的剂量施用。

26.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒是以1×10⁸至1×10¹⁵vg/kg的剂量施用。

27.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中在施用所述AAV颗粒之后至少30、60、90、120或更多天都未在所述哺乳动物的CSF中检测到中和抗体。

28.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中在所述AAV颗粒的所述施用之后至少250天未在所述哺乳动物的CSF中检测到中和抗体。

29.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述多肽在所述哺乳动物的脾脏或心脏中表达。

30.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述多肽在所述哺乳动物的小脑中表达。

31.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述AAV颗粒选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10及AAV-2i8颗粒。

32.根据权利要求1-2、12-15中任一项所述的用途，其中所述ITR中的一个或多个选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10及AAV-2i8 ITR。

33.一种AAV颗粒，其包含AAV载体和AAV衣壳序列，所述AAV载体包含AAV ITR序列、编码与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的三肽基-肽酶1(TPP1)多肽或其酶原的核酸、驱动编码TPP1的核酸的表达的表达控制元件，其中所述衣壳序列包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8VP1、VP2和/或VP3序列任一者的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其中所述表达控制元件包括CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子，所述AAV颗粒用于根据权利要求1-32中任一项的用途。

34.根据权利要求33用于所述用途的AAV颗粒，其中所述表达控制元件包括SEQ ID NO:9。

35.一种AAV颗粒，其包含AAV载体和AAV衣壳序列，所述AAV载体包含AAV ITR序列、编码与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的三肽基-肽酶1(TPP1)多肽或其酶原的核酸、驱动编码TPP1的核酸的表达的表达控制元件，其中所述衣壳序列包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8VP1、VP2和/或VP3序列任一者的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其中所述表达控制元件包括SEQ ID NO:9，所述AAV颗粒用于根据权利要求1-32中任一项的用途。

36.根据权利要求33-35中任一项用于所述用途的AAV颗粒，其中所述AAV ITR序列包含一个或多个AAV2 ITR。

37.根据权利要求33-35中任一项用于所述用途的AAV颗粒，其中所述核酸编码如SEQID NO:5中所示的人TPP1。

38.根据权利要求35用于所述用途的AAV颗粒，其中所述表达控制元件包括CMV增强子。

39.根据权利要求35用于所述用途的AAV颗粒，其中所述表达控制元件包括β肌动蛋白启动子。

40.根据权利要求35用于所述用途的AAV颗粒，其中所述表达控制元件包括鸡β肌动蛋白启动子。

41.一种AAV颗粒，其包含AAV载体和AAV衣壳序列，所述AAV载体包含AAV ITR序列、编码与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的三肽基-肽酶1(TPP1)多肽或其酶原的核酸、驱动编码TPP1的核酸的表达的表达控制元件，其中所述衣壳序列包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 VP1、VP2和/或VP3序列具有80％或更多同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其中所述衣壳序列包含在位置444、500和/或730处具有被苯丙氨酸取代的酪氨酸的AAV2 VP1衣壳序列，其中所述表达控制元件包括CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子，所述AAV颗粒用于根据权利要求1-32中任一项的用途。

42.根据权利要求41用于所述用途的AAV颗粒，其中所述表达控制元件包括SEQ ID NO:9。

43.一种AAV颗粒，其包含AAV载体和AAV衣壳序列，所述AAV载体包含AAV ITR序列、编码与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的三肽基-肽酶1(TPP1)多肽或其酶原的核酸、驱动编码TPP1的核酸的表达的表达控制元件，其中所述衣壳序列包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 VP1、VP2和/或VP3序列具有80％或更多同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其中所述衣壳序列包含在位置444、500和/或730处具有被苯丙氨酸取代的酪氨酸的AAV2 VP1衣壳序列，其中所述表达控制元件包括SEQ ID NO:9，所述AAV颗粒用于根据权利要求1-32中任一项的用途。