CN107922932A - 用于酶置换疗法的改造酶 - Google Patents

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Abstract

一种改造酶，包含与人类β‑葡萄糖醛酸苷酶的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，其中与所述人类β‑葡萄糖醛酸苷酶相比，所述改造酶显示出更高量的α‑己醛糖酸盐水解酶活性。

Description

用于酶置换疗法的改造酶
相关申请案的交互引用文献
本申请案主张于2015年8月6日申请的美国临时申请案申请号62/201,889的优先权，其内容通过引用的方式整体并入本文。
背景技术
溶酶体贮积症(lysosomal storage disorders，LSDs)包括超过50种不同的疾病，具有广泛的临床表现型，以及在活产新生儿中总发生率为1/7000。不同的溶酶体贮积症(LSDs)由不同溶酶体酶的遗传缺陷所引起，导致未经处理的糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAG)的累积与渐近性组织损伤。酶置换疗法(enzyme replacementtherapy，ERT)为许多溶酶体贮积症提供了有效的治疗，并且被美国食品及药物管理局批准用于治疗第I型、第II型、第IV型黏多糖症(mucopolysaccharidosis，MPS)、第I型高歇氏病(Gaucher disease)，以及法布里氏病(Fabry disease)。酶置换疗法(ERT)包括静脉注射治疗性酶以补充缺乏或缺陷的酶，进而清除累积的代谢物。
施用重组酶可以在缺乏或具有截短型内生性酶的患者体内诱导免疫反应。事实上，在酶置换疗法(ERT)患者的血清中发现抗治疗性酶的抗体，其频率范围为：高歇氏病为15％、法布里氏病为55-80％、第I型黏多糖症为91％、第IV型黏多糖症为97％，以及庞贝氏症(Pompe disease)为100％。越来越多的证据表明，患者体内的抗体反应会阻碍酶置换疗法(ERT)的功效。例如，在庞贝氏病中，蛋白质含量、抗体反应，以及治疗结果之间存在明确的关系。在完全不具有酸性α-葡萄糖苷酶的患者体内发现具有抗该酶的高抗体力价，而且在酶置换疗法(ERT)期间显现出对酶吸收和活性的抑制现象。其他研究也显示在法布里病和庞贝氏症患者中有类似的结果。在第I型黏多糖症的动物模型中，亦有报告指出抗α-L-己醛糖酸盐水解酶的特异性抗体会降低酶置换疗法(ERT)的治疗功效。经由以免疫抑制药物治疗患者所诱导出的免疫耐受性，显示可增加该患者的组织酶含量以及降低GAG的含量。在第I型黏多糖症的患者体内因为抗体介导的酶吸收的抑制现象，也与较差的生物标记反应强烈相关，这可能暗示在临床结果中的重要角色。危及生命的过敏反应也发生在接受重组人类α-己醛糖酸盐水解酶(英文药名为laronidase)的患者中。这些研究凸显了在酶置换疗法(ERT)临床使用中保持对重组酶的最小免疫反应的重要性。
溶酶体贮积症(LSDs)通常在个体患者中是异质性的，因此难以达成通用的去免疫化方法，例如去除治疗性蛋白质的免疫原性的抗原决定位。克服针对重组酶的抗体反应的现行方法主要集中于诱导免疫耐受性。然而，因为该方法通常结合高剂量的免疫抑制药物，所以这可能对患者是有害的。而且感染及恶性肿瘤风险的增加也是令人担心的。
发明内容
于一方面，本文描述一种改造酶，其包括与一人类β-葡萄糖醛酸苷酶的氨基酸序列至少80％相同的一氨基酸序列，其中与所述人类β-葡萄糖醛酸苷酶相较，所述改造酶显现出一较高量的α-己醛糖酸盐水解酶酶活性。
在一具体实施例中，人类β-葡萄糖醛酸苷酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述改造酶可以在如SEQ ID NO:2所示的序列中对应于残基T204、Q279、K438、N484、N502、S503、Y504、S506、Y508、H509、G542、T545、L565、W587、F592、T594、E595、P598、R600、G603、N604、K606或P636的至少一个残基处具有取代。例如，所述改造酶可以具有残基S484、D502、A503、G506、A509、D542、A545、Y592、V595、S604，及/或F606。在另一个实例中，所述改造酶具有残基H279、C484、K502、Y503、G504、G506、P509、A545、A565、L594、Q595、A604，及/或F606。或者，所述改造酶可具有残基D484、K502、Y503、G506、D508、P509、A545、Y592、L594、G595、D598、T604、F606，及/或S636。所述改造酶可用于治疗患有与缺陷酶相关的疾病的受试者，例如患有黏多糖症的受试者。
于另一方面，本文描述了发展用于在具有与缺陷酶相关的疾病的受试者中治疗该疾病的候选酶置换疗法。该方法包括选择模板酶，其中所述模板酶对该受试者而言是内源性及/或非免疫原性的，且在该受试者体内正常地表达，并且改造该模板酶以获得一改造酶，其中，与模板酶的活性相较，所述改造酶显现出增加的目标酶活性，所述目标酶活性是所述缺陷酶的野生型对应物的酶活性；其中所述改造酶为用于治疗该疾病的候选酶置换疗法。
在附图及以下的描述中阐述了一个或多个具体实施例的细节。具体实施例的其他特征、目的和优点将从描述及附图中，以及从权利要求书范围中变得明显。
附图说明
图1为用于酶置换疗法的“隐形匿踪”酶的概念的图式。野生型α-己醛糖酸盐水解酶(IDUA)可在黏多糖症(MPS)第I型患者体内产生特异性抗体，其可抑制治疗效果，甚至引起危及生命的过敏反应。改变其活性位点以显示α-己醛糖酸盐水解酶酶活性的β-葡萄糖醛酸苷酶(Beta-glucuronidase，βG)变体，可表达为正常的免疫耐受自身蛋白，因此能够预防及/或最小化抗体反应，从而保持治疗活性及减少副作用。人类免疫球蛋白G(150kDa)、α-己醛糖酸盐水解酶(83kDa)，以及β-葡萄糖醛酸苷酶(78kDa)的大小未按比例绘制。
图2为可裂解的表面系链酶多用途筛选系统(enzyme cleavable surfacetethered all-purpose screening system，ECSTASY)的应用说明。(1)将β-葡萄糖醛酸苷酶变体的库克隆到反转录病毒载体中，其编码一信号肽、一HA卷标、一6x His卷标、一酶变体、一myc标签，以及人类DAF的C-端37个氨基酸。(2)通过在低感染复数的条件下对HEK293细胞进行反转录病毒转导作用，以产生表达一种GPI锚定的β-葡萄糖醛酸苷酶变体的库细胞。(3、4)以抗β-葡萄糖醛酸苷酶-FITC共轭物对细胞进行免疫荧光染色，以鉴定在其表面上表达β-葡萄糖醛酸苷酶的细胞。进行荧光活化细胞的区分，即以低免疫荧光染色判断，以快速去除表达折迭错误或不稳定的酶变体的细胞。(5)将阳性细胞单独区分至96孔微量盘中，使其生长至完全长满。(6)通过PI-PLC裂解作用自细胞释放表面系链的酶变体。(7)含有可溶性酶变体的上清液以ELISA测量酶浓度，并以荧光测定法测量酶活性。(8)通过DNA改组或位点饱和突变诱发作用，使获选的具有较高活性的突变体可作为新一代库的模板。
图3为显示人类β-葡萄糖醛酸苷酶对α-己醛糖酸盐水解酶基质MUI展现可测量活性的一系列图组。重组人类β-葡萄糖醛酸苷酶是从人类α-己醛糖酸盐水解酶缺陷型细胞(34/2000，衍生自第I型黏多糖贮积症患者)中纯化，并与250μMα-己醛糖酸盐水解酶基质4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)在0.2M甲酸盐缓冲液，pH 3.5，在37℃下作用1或17小时。(A)在355nm的激发波长以及460nm的发射波长下检测荧光。MUI水解为4-甲基伞形酮(4-MU)的作用也通过在以20％甲醇(pH 4)平衡的LiChroprep RP18(40-63μm)管柱上的固相提取/高效液相色层分析法检测。以二次蒸馏水配置的25％甲醇(pH 4)洗提单独的MUI(B)以及与人类β-葡萄糖醛酸苷酶作用的MUI(C)。以二次蒸馏水配置的25％甲醇(pH 4)洗提未与α-己醛糖酸盐水解酶作用(D)或与α-己醛糖酸盐水解酶作用(E)的市售MUI(未纯化的)。
图4为合成库的构建示意图。全长的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体库是由5个DNA片段(F0-F4)组合而成，各片段之间有18个核苷酸重迭。F0片段含有一个Apa I克隆位点以及一个沉默突变以去除一个独特的Bgl II酶切位点。通过引物组合，随后并以PCR扩增构建F2及F3片段，这二个片段在第19个位置上含有可变氨基酸。F4片段含有Sal I克隆位点。将所有的片段以等摩尔比混合并以PCR扩增以获得全长人类β-葡萄糖醛酸苷酶库。库连接后，以Bgl II限制酶解作用去除野生型DNA。
图5为显示以ECSTASY筛选人类β-葡萄糖醛酸苷酶合成库的筛选实例的一系列图组。图5中的A.将293和293/L1细胞以7G8-FITC染色，并在流式细胞仪上分析表面人类β-葡萄糖醛酸苷酶的表达(虚线，16％)。将表达出人类β-葡萄糖醛酸苷酶表达量最高的细胞(实线，6.8％)，以单细胞分选至96孔微量盘中，以用于随后的筛选。图5中的B.以PI-PLC从各个293/L1克隆株酶切出GPI锚定的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体。在pH 3.5环境下，测量上清液中4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐水解苷(MUI)的水解。蛋白质含量通过三明治ELISA进行定量。野生型与β-葡萄糖醛酸苷酶变体分别以实心及空心的圆形来表示。图5中的C.每个β-葡萄糖醛酸苷酶变体的特异性活性以每毫微克(ng)蛋白的相对荧光单位(relativefluorescence unit，RFU)表示。
图6为显示表达出α-己醛糖酸盐水解酶酶活性的β-葡萄糖醛酸苷酶变体特性分析的图式。将重组野生型和β-葡萄糖醛酸苷酶变体在pH 3.5的环境下与4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)作用，并检测相对荧光。
图7为显示表达出α-己醛糖酸盐水解酶酶活性的β-葡萄糖醛酸苷酶变体特性分析的一图组。将人类α-己醛糖酸盐水解酶缺陷型细胞(34/2000，衍生自第I型黏多糖贮积症患者)与Na2 35SO4一起作用，以放射性标记糖胺聚糖。然后以5μg/ml重组酶处理细胞72小时。图7中的A.与未处理的细胞相比，细胞裂解物的减少的放射性以平均值±SD表示(白色柱状图)。图7中的B.与未处理的细胞相比，上清液的增加的放射性以平均值±SD表示(黑色柱状图)。
图8为显示表达出α-己醛糖酸盐水解酶酶活性的β-葡萄糖醛酸苷酶变体特性分析的图式。以5μg/ml重组酶处理人类α-己醛糖酸盐水解酶缺陷细胞72小时，并以Lysotracker-Red DND-99染剂染色溶酶体。每个细胞的溶酶体荧光以平均值±SEM表示。通过双尾t检验并显示与未处理细胞比较的统计上显著差异。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；n.s.：无显著差异(n＝3)。
图9为显示人类β-葡萄糖醛酸苷酶转基因小鼠的建立的一组数据。图9中的A.显示用于产生表达人类β-葡萄糖醛酸苷酶的转基因小鼠的pCAG-hβG质粒的图式。图9中的B.通过基因组PCR(230bp)进行新生小鼠的基因分型。PC：正对照组。NC：负对照组。C.从小鼠尾部萃取的总蛋白，在10％SDS-PAGE上进行电泳，并以抗人类β-葡萄糖醛酸苷酶(抗-hβG)抗体以及抗β-肌动蛋白抗体进行免疫墨点分析。
图10为显示转殖人类β-葡萄糖醛酸苷酶的转基因小鼠中，改造β-葡萄糖醛酸苷酶免疫原性评估的一系列图组。图10中的A、B，及C.每组三只转殖人类β-葡萄糖醛酸苷酶的转基因小鼠，每三周以静脉注射分别注射50μg小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶、50μg人类α-己醛糖酸盐水解酶，或50μg人类β-葡萄糖醛酸苷酶。以ELISA测定每周血清样品中抗各自蛋白质的抗体。图10中的D.每组三只转殖人类β-葡萄糖醛酸苷酶的转基因小鼠，每三周以静脉注射50μg所指示的重组蛋白，共注射4次。将血清样品稀释1000倍，并以ELISA测量抗体反应。注射人类α-己醛糖酸盐水解酶的小鼠与注射其它蛋白质的小鼠中的抗体反应之间显现出显著差异。**，p<0.001。
具体实施方式
本文描述了可用于酶置换疗法的改造酶以及发展酶置换疗法的方法。
模板酶的酶活性或特异性被发现可以在该模板酶的结构或序列没有显著改变的情况下，至少部分地转换为另一种酶的酶活性或特异性。
因此，本文描述了从人类β-葡萄糖醛酸苷酶模板(例如野生型β-葡萄糖醛酸苷酶)产生的改造酶，其展现出比所述人类β-葡萄糖醛酸苷酶模板较高量的α-己醛糖酸盐水解酶酶活性。所述改造酶与所述β-葡萄糖醛酸苷酶模板具有高氨基酸序列一致性(例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％)，但与人类α-己醛糖酸盐水解酶具有非常低的序列一致性。
以下提供了人类β-葡萄糖醛酸苷酶与人类α-己醛糖酸盐水解酶的示例性核酸及氨基酸序列。
人类β-葡萄糖醛酸苷酶核酸序列(SEQ ID NO:1)：
ATGGCCCGGGGGTCGGCGGTTGCCTGGGCGGCGCTCGGGCCGTTGTTGTGGGGCTGCGCGCTGGGGCTGCAGGGCGGGATGCTGTACCCCCAGGAGAGCCCGTCGCGGGAGTGCAAGGAGCTGGACGGCCTCTGGAGCTTCCGCGCCGACTTCTCTGACAACCGACGCCGGGGCTTCGAGGAGCAGTGGTACCGGCGGCCGCTGTGGGAGTCAGGCCCCACCGTGGACATGCCAGTTCCCTCCAGCTTCAATGACATCAGCCAGGACTGGCGTCTGCGGCATTTTGTCGGCTGGGTGTGGTACGAACGGGAGGTGATCCTGCCGGAGCGATGGACCCAGGACCTGCGCACAAGAGTGGTGCTGAGGATTGGCAGTGCCCATTCCTATGCCATCGTGTGGGTGAATGGGGTCGACACGCTAGAGCATGAGGGGGGCTACCTCCCCTTCGAGGCCGACATCAGCAACCTGGTCCAGGTGGGGCCCCTGCCCTCCCGGCTCCGAATCACTATCGCCATCAACAACACACTCACCCCCACCACCCTGCCACCAGGGACCATCCAATACCTGACTGACACCTCCAAGTATCCCAAGGGTTACTTTGTCCAGAACACATATTTTGACTTTTTCAACTACGCTGGACTGCAGCGGTCTGTACTTCTGTACACGACACCCACCACCTACATCGATGACATCACCGTCACCACCAGCGTGGAGCAAGACAGTGGGCTGGTGAATTACCAGATCTCTGTCAAGGGCAGTAACCTGTTCAAGTTGGAAGTGCGTCTTTTGGATGCAGAAAACAAAGTCGTGGCGAATGGGACTGGGACCCAGGGCCAACTTAAGGTGCCAGGTGTCAGCCTCTGGTGGCCGTACCTGATGCACGAACGCCCTGCCTATCTGTATTCATTGGAGGTGCAGCTGACTGCACAGACGTCACTGGGGCCTGTGTCTGACTTCTACACACTCCCTGTGGGGATCCGCACTGTGGCTGTCACCAAGAGCCAGTTCCTCATCAATGGGAAACCTTTCTATTTCCACGGTGTCAACAAGCATGAGGATGCGGACATCCGAGGGAAGGGCTTCGACTGGCCGCTGCTGGTGAAGGACTTCAACCTGCTTCGCTGGCTTGGTGCCAACGCTTTCCGTACCAGCCACTACCCCTATGCAGAGGAAGTGATGCAGATGTGTGACCGCTATGGGATTGTGGTCATCGATGAGTGTCCCGGCGTGGGCCTGGCGCTGCCGCAGTTCTTCAACAACGTTTCTCTGCATCACCACATGCAGGTGATGGAAGAAGTGGTGCGTAGGGACAAGAACCACCCCGCGGTCGTGATGTGGTCTGTGGCCAACGAGCCTGCGTCCCACCTAGAATCTGCTGGCTACTACTTGAAGATGGTGATCGCTCACACCAAATCCTTGGACCCCTCCCGGCCTGTGACCTTTGTGAGCAACTCTAACTATGCAGCAGACAAGGGGGCTCCGTATGTGGATGTGATCTGTTTGAACAGCTACTACTCTTGGTATCACGACTACGGGCACCTGGAGTTGATTCAGCTGCAGCTGGCCACCCAGTTTGAGAACTGGTATAAGAAGTATCAGAAGCCCATTATTCAGAGCGAGTATGGAGCAGAAACGATTGCAGGGTTTCACCAGGATCCACCTCTGATGTTCACTGAAGAGTACCAGAAAAGTCTGCTAGAGCAGTACCATCTGGGTCTGGATCAAAAACGCAGAAAATACGTGGTTGGAGAGCTCATTTGGAATTTTGCCGATTTCATGACTGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGGGGAATAAAAAGGGGATCTTCACTCGGCAGAGACAACCAAAAAGTGCAGCGTTCCTTTTGCGAGAGAGATACTGGAAGATTGCCAATGAAACCAGGTATCCCCACTCAGTAGCCAAGTCACAATGTTTGGAAAACAGCCTGTTTACTTGA
人类β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
MARGSAVAWAALGPLLWGCALGLQGGMLYPQESPSRECKELDGLWSFRADFSDNRRRGFEEQWYRRPLWESGPTVDMPVPSSFNDISQDWRLRHFVGWVWYEREVILPERWTQDLRTRVVLRIGSAHSYAIVWVNGVDTLEHEGGYLPFEADISNLVQVGPLPSRLRITIAINNTLTPTTLPPGTIQYLTDTSKYPKGYFVQNTYFDFFNYAGLQRSVLLYTTPTTYIDDITVTTSVEQDSGLVNYQISVKGSNLFKLEVRLLDAENKVVANGTGTQGQLKVPGVSLWWPYLMHERPAYLYSLEVQLTAQTSLGPVSDFYTLPVGIRTVAVTKSQFLINGKPFYFHGVNKHEDADIRGKGFDWPLLVKDFNLLRWLGANAFRTSHYPYAEEVMQMCDRYGIVVIDECPGVGLALPQFFNNVSLHHHMQVMEEVVRRDKNHPAVVMWSVANEPASHLESAGYYLKMVIAHTKSLDPSRPVTFVSNSNYAADKGAPYVDVICLNSYYSWYHDYGHLELIQLQLATQFENWYKKYQKPIIQSEYGAETIAGFHQDPPLMFTEEYQKSLLEQYHLGLDQKRRKYVVGELIWNFADFMTEQSPTRVLGNKKGIFTRQRQPKSAAFLLRERYWKIANETRYPHSVAKSQCLENSLFT
人类α-己醛糖酸盐水解酶核酸序列(SEQ ID NO:3)
ATGCGTCCCCTGCGCCCCCGCGCCGCGCTGCTGGCGCTCCTGGCCTCGCTCCTGGCCGCGCCCCCGGTGGCCCCGGCCGAGGCCCCGCACCTGGTGCATGTGGACGCGGCCCGCGCGCTGTGGCCCCTGCGGCGCTTCTGGAGGAGCACAGGCTTCTGCCCCCCGCTGCCACACAGCCAGGCTGACCAGTACGTCCTCAGCTGGGACCAGCAGCTCAACCTCGCCTATGTGGGCGCCGTCCCTCACCGCGGCATCAAGCAGGTCCGGACCCACTGGCTGCTGGAGCTTGTCACCACCAGGGGGTCCACTGGACGGGGCCTGAGCTACAACTTCACCCACCTGGACGGGTACCTGGACCTTCTCAGGGAGAACCAGCTCCTCCCAGGGTTTGAGCTGATGGGCAGCGCCTCGGGCCACTTCACTGACTTTGAGGACAAGCAGCAGGTGTTTGAGTGGAAGGACTTGGTCTCCAGCCTGGCCAGGAGATACATCGGTAGGTACGGACTGGCGCATGTTTCCAAGTGGAACTTCGAGACGTGGAATGAGCCAGACCACCACGACTTTGACAACGTCTCCATGACCATGCAAGGCTTCCTGAACTACTACGATGCCTGCTCGGAGGGTCTGCGCGCCGCCAGCCCCGCCCTGCGGCTGGGAGGCCCCGGCGACTCCTTCCACACCCCACCGCGATCCCCGCTGAGCTGGGGCCTCCTGCGCCACTGCCACGACGGTACCAACTTCTTCACTGGGGAGGCGGGCGTGCGGCTGGACTACATCTCCCTCCACAGGAAGGGTGCGCGCAGCTCCATCTCCATCCTGGAGCAGGAGAAGGTCGTCGCGCAGCAGATCCGGCAGCTCTTCCCCAAGTTCGCGGACACCCCCATTTACAACGACGAGGCGGACCCGCTGGTGGGCTGGTCCCTGCCACAGCCGTGGAGGGCGGACGTGACCTACGCGGCCATGGTGGTGAAGGTCATCGCGCAGCATCAGAACCTGCTACTGGCCAACACCACCTCCGCCTTCCCCTACGCGCTCCTGAGCAACGACAATGCCTTCCTGAGCTACCACCCGCACCCCTTCGCGCAGCGCACGCTCACCGCGCGCTTCCAGGTCAACAACACCCGCCCGCCGCACGTGCAGCTGTTGCGCAAGCCGGTGCTCACGGCCATGGGGCTGCTGGCGCTGCTGGATGAGGAGCAGCTCTGGGCCGAAGTGTCGCAGGCCGGGACCGTCCTGGACAGCAACCACACGGTGGGCGTCCTGGCCAGCGCCCACCGCCCCCAGGGCCCGGCCGACGCCTGGCGCGCCGCGGTGCTGATCTACGCGAGCGACGACACCCGCGCCCACCCCAACCGCAGCGTCGCGGTGACCCTGCGGCTGCGCGGGGTGCCCCCCGGCCCGGGCCTGGTCTACGTCACGCGCTACCTGGACAACGGGCTCTGCAGCCCCGACGGCGAGTGGCGGCGCCTGGGCCGGCCCGTCTTCCCCACGGCAGAGCAGTTCCGGCGCATGCGCGCGGCTGAGGACCCGGTGGCCGCGGCGCCCCGCCCCTTACCCGCCGGCGGCCGCCTGACCCTGCGCCCCGCGCTGCGGCTGCCGTCGCTTTTGCTGGTGCACGTGTGTGCGCGCCCCGAGAAGCCGCCCGGGCAGGTCACGCGGCTCCGCGCCCTGCCCCTGACCCAAGGGCAGCTGGTTCTGGTCTGGTCGGATGAACACGTGGGCTCCAAGTGCCTGTGGACATACGAGATCCAGTTCTCTCAGGACGGTAAGGCGTACACCCCGGTCAGCAGGAAGCCATCGACCTTCAACCTCTTTGTGTTCAGCCCAGACACAGGTGCTGTCTCTGGCTCCTACCGAGTTCGAGCCCTGGACTACTGGGCCCGACCAGGCCCCTTCTCGGACCCTGTGCCGTACCTGGAGGTCCCTGTGCCAAGAGGGCCCCCATCCCCGGGCAATCCATGA
人类α-己醛糖酸盐水解酶氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
MRPLRPRAALLALLASLLAAPPVAPAEAPHLVHVDAARALWPLRRFWRSTGFCPPLPHSQADQYVLSWDQQLNLAYVGAVPHRGIKQVRTHWLLELVTTRGSTGRGLSYNFTHLDGYLDLLRENQLLPGFELMGSASGHFTDFEDKQQVFEWKDLVSSLARRYIGRYGLAHVSKWNFETWNEPDHHDFDNVSMTMQGFLNYYDACSEGLRAASPALRLGGPGDSFHTPPRSPLSWGLLRHCHDGTNFFTGEAGVRLDYISLHRKGARSSISILEQEKVVAQQIRQLFPKFADTPIYNDEADPLVGWSLPQPWRADVTYAAMVVKVIAQHQNLLLANTTSAFPYALLSNDNAFLSYHPHPFAQRTLTARFQVNNTRPPHVQLLRKPVLTAMGLLALLDEEQLWAEVSQAGTVLDSNHTVGVLASAHRPQGPADAWRAAVLIYASDDTRAHPNRSVAVTLRLRGVPPGPGLVYVTRYLDNGLCSPDGEWRRLGRPVFPTAEQFRRMRAAEDPVAAAPRPLPAGGRLTLRPALRLPSLLLVHVCARPEKPPGQVTRLRALPLTQGQLVLVWSDEHVGSKCLWTYEIQFSQDGKAYTPVSRKPSTFNLFVFSPDTGAVSGSYRVRALDYWARPGPFSDPVPYLEVPVPRGPPSPGNP
所述改造酶可以具有与如SEQ ID NO:2所示的序列至少80％相同的氨基酸序列，并且在对应于在如SEQ ID NO:2所示的序列(例如，通过序列比对确定)中由位置204、279、438、484、502、503、504、506、508、509、542、545、565、587、592、594、595、598、600、603、604、606以及636组成的位置群组的一个或多个位置包括氨基酸取代。例如，所述改造酶可以在一个或多个上述的23个位置具有相应的野生型残基(如SEQ ID NO:2中所示)，或任何其它氨基酸(例如A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V或其类似物)。
在一具体实施例中，所述改造酶具有与如SEQ ID NO:2所示的序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
在一具体实施例中，所述改造酶具有一氨基酸序列，其中，与SEQ ID NO:2的序列相比，相应的位置204为T或K；位置279为Q或H；位置438为K或M；位置484为S、D、H、R或C；位置502为N、D或K；位置503为A、D、Y、P或V；位置504为Y、G或C；位置506为S或G；位置508为Y或D；位置509为H、A或P；位置542为G或D；位置545为T或A；位置565为L或A；位置587为W或T；位置592为F或Y；位置594为T或L；位置595为L、V、Q或G；位置598为P或D；位置600为R或A；位置603为G或E；位置604为Y、S、A或T；位置606为Q、F或L；并且位置636为P或S。在一具体实施例中，根据表1或表2(参见下文)进行所述改造酶氨基酸的氨基酸残基的取代作用。
例如，与如SEQ ID NO:2所示的序列相比，所述改造酶可以具有以下改变的/取代的残基：S484、D502、A503、G506、A509、D542、A545、Y592、V595、S604，及/或F606。另一个示例性改造酶具有以下改变的残基：H279、C484、K502、Y503、G504、G506、P509、A545、A565、L594、Q595、A604及/或F606。另一种改造酶可具有以下改变的残基：D484、K502、Y503、G506、D508、P509、A545、Y592、L594、G595、D598、T604、F606及/或S636。
在野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶(例如，SEQ ID NO:2)中的某些残基可以是改变其酶活性的特定目标，例如N484、N502、S503、S506、H509、F592、E595、N604和K606。因此，在一具体实施例中，改造酶可包括在该9个氨基酸位置中的一个或多个的氨基酸取代。另一方面，某些野生型残基，例如，S447、G542、L565、W587、R600、G603和P636可能是较佳的。因此，所述改造酶可保留这七个野生型残基(如SEQ ID NO:2所示)中的一个或多个。因此，在一具体实施例中，改造酶在对应于如SEQ ID NO:2所示的序列的残基S447、G542、L565、W587、R600、G603及/或P636的残基处不具有取代。
在一具体实施例中，本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码如本文所述的改造酶。
在另一具体实施例中，本发明提供了表达载体，其包含编码如本文所述的改造酶的多核苷酸。
本领域已知的方法，例如重组技术，可用于产生本文所述的改造酶。
改造酶可以作为酶置换疗法，以治疗具有与缺陷性α-己醛糖酸盐水解酶相关的疾病(即黏多糖贮积病)的受试者。由于改造酶将以正常的、非免疫原性的内源性酶呈现于受试者的免疫系统，所以其不会在受试者体内诱导不想要的免疫反应。
涉及施用编码所述改造酶的核酸分子的基因治疗也可用于治疗受试者的黏多糖贮积病。
本文还描述了发展或鉴定候选酶置换疗法的方法，所述候选酶置换疗法用于在具有与缺陷酶相关的疾病的受试者中治疗该疾病，例如，溶酶体贮积症，如MPS第I型、MPS第II型、MPS第IV型、第I型高歇氏病、庞贝氏症，以及法布里氏病。该缺陷可以是起因于突变的酶(例如，截短的酶)或低于正常量的野生型酶。
在该方法中，改变一正常内源性酶(即模板酶)的酶活性及/或特异性，以补偿所述缺陷酶的酶活性及/或特异性。由于修饰的酶将表达为正常的内源性蛋白，所以所述修饰的酶在受试者中将不会引起免疫反应。
合适的模板酶应该是对具有缺陷酶的受试者而言是内源性的，且在所述具有缺陷酶的受试者体内为正常地表达的模板酶。模板酶和缺陷酶的野生型对应物可以在一个或多个方面相似，例如，催化机制、催化结构域结构、组织表达概况、大小，以及细胞定位方面。
然后，改变所选择的模板酶，以便至少部分地将其酶活性或特异性转换成缺陷酶的正常对应物的酶活性或特异性。这种改变包括氨基酸取代、缺失和插入。该改变不应使所述模板酶以外源蛋白呈现于受试者的免疫系统。换句话说，所述修饰的酶应当仍然与模板酶具有高的序列一致性(例如，至少80％、85％、90％、95％或99％的一致性)。改变可以是合理设计的、随机的或其组合。
例如，可以基于模板酶和缺陷酶的正常对应物的结构(例如，整个酶的结构和活性位点的结构)设计改造酶。本领域可用的各种技术和软件可用于比较两种酶的序列及结构，以鉴定用于改变的潜在残基。已知或预测与一基质相互作用的残基可以是用于改变的特定目标。可以产生在各变体中一个或多个所鉴定的残基处具有取代的变体库，以用于筛选。还可以进行筛选随机产生的模板酶变体的库，以鉴定表达出所需活性及/或特异性的变体。
可以进一步测试候选酶置换疗法(例如，在动物模型中)以确定其是否诱导出不想要的免疫反应。在一具体实施例中，选择不会诱导免疫反应的候选酶，或是选择与由缺陷酶诱导的免疫反应相较，诱导较低量免疫反应的候选酶，以用于酶置换疗法。
该方法可以应用于野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶模板(例如，SEQ ID NO:2)，以产生表达出α-己醛糖酸盐水解酶酶活性的改造酶。可以改变人类β-葡萄糖醛酸苷酶的催化结构域内的残基。如上所述，在如SEQ ID NO:2所示的序列中位置204、279、438、484、502、503、504、506、508、509、542、545、565、587、592、594、595、598、600、603、604、606和636，各自是改变的目标。本文所述的每种特定改造酶可以进一步改变(例如，添加取代的残基或不同的取代残基)以发展更多改造酶。
筛选方法可以使用本领域已知的技术或系统进行。一个示例性的技术为可裂解的表面系链酶多用途筛选系统(ECSTASY)。参见Chen,C.P.,等人，Protein Eng Des Sel，2012年。25(7)：p.367-75；以及亦可参见图2。
“受试者”是指人类及非人类的动物。非人类动物的实例包括所有脊椎动物，例如，哺乳类动物，例如非人类灵长类动物(特别是较高级的灵长类动物)、狗、囓齿动物(例如，小鼠或大鼠)、天竺鼠、猫，以及非哺乳类动物，例如鸟类、两栖动物等。在优选的具体实施例中，该受试者为人类。在另一具体实施例中，该受试者为适合作为疾病模型的实验动物或动物。
本文所用，术语“治疗”是指将包括一种或多种活性剂的组合物应用或施用于患有疾病、疾病的症状，或对疾病有倾向的患者，其目的为治疗、治愈、缓解、纾解、改变、补救、改善、促进或影响该疾病、该疾病的症状、或对疾病的倾向。如本文所用，“有效量”是指给予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量，包括单独或与一种或多种其它活性剂的组合。如本发明所属技术领域中具有通常知识者所认识到的，有效量的变化取决于施用途径、赋形剂的使用，以及与其它活性剂的共同使用。
以下的具体示例将被解释为仅仅是说明性的，而且不以任何方式限制本公开的其余部分。无需进一步详细描述，相信本发明所属技术领域技术人员可以基于本文的描述最大程度地利用本公开内容。本文引用的所有出版物通过引用方式整体并入本文。
实施例
以下所描述为另一种策略，其中改变正常内源性酶的酶特异性，以补偿缺陷酶以帮助减轻抗体反应。请参见图1。因为修饰的酶将整体以正常的内源蛋白出现，所以该酶在LSD患者体内的免疫原性较低。
我们采用人类β-葡萄糖醛酸苷酶作为模板以生成α-己醛糖酸盐水解酶的类似物。β-葡萄糖醛酸苷酶的表达在MPS第I型的患者中是正常的，因此重组β-葡萄糖醛酸苷酶应当可被良好地耐受，且为非免疫原性的。β-葡萄糖醛酸苷酶与α-己醛糖酸盐水解酶在它们的催化结构域中共有类似的TIM(β/α)8-桶状结构，并且属于糖苷水解酶(GH-A)的相同群体。它们也具有类似的催化机制，其通过一对谷氨酸残基来水解基质，该残基是为保守取向的β-葡萄糖醛酸苷酶的E451和E540，以及α-己醛糖酸盐水解酶的E182和E299。此外，与α-己醛糖酸盐水解酶一样，β-葡萄糖醛酸苷酶可经由存在于缺陷细胞表面上的甘露糖-6-磷酸受体，以通过受体调节的胞吞作用定位到溶酶体。由于这些相似性，选择β-葡萄糖醛酸苷酶作为特异性转换的候选物。
我们构建了一个β-葡萄糖醛酸苷酶库，并使用以前在我们实验室开发的可裂解的表面系链酶多用途筛选系统(ECSTASY)以筛选其α-己醛糖酸盐水解酶的活性。参见图2以及Chen,C.P.,等人，Protein Eng Des Sel，2012年，25(7)：p.367-75。该β-葡萄糖醛酸苷酶库通过与来自人类衰变加速因子(decay accelerating factor，DAF)的C端GPI-锚定信号序列融合而表达于表面。参见Caras,I.W.，等人，Science，1987年，238(4831)：p.1280-3。以高通量荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting，FACS)筛选膜结合的β-葡萄糖醛酸苷酶库细胞，接着以磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶切，以便于在确定的条件下筛选α-己醛糖酸盐水解酶活性。筛选后，研究在α-己醛糖酸盐水解酶缺陷细胞中的β-葡萄糖醛酸苷酶变体的体外功效。
我们成功地分离展现显著的α-己醛糖酸盐水解酶活性以及表达出对MPS第I型细胞的表型功效的β-葡萄糖醛酸苷酶变体。结果显示，正常表达的内源性人类酶的特异性可以转移，以补偿另一缺陷酶。
野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶显示可侦测到的α-己醛糖酸盐水解酶活性
由于人类β-葡萄糖醛酸苷酶和α-己醛糖酸盐水解酶之间的相似性，我们试图确定人类β-葡萄糖醛酸苷酶是否显示内源性α-己醛糖酸盐水解酶活性。
我们从源自MPS第I型患者的人类α-己醛糖酸盐水解酶缺陷纤维母细胞中，表达和纯化重组人类β-葡萄糖醛酸苷酶，以消除重组β-葡萄糖醛酸苷酶与内源性α-己醛糖酸盐水解酶可能的污染。通过硫酸铵沉淀和Ni2+-次氮基三乙酸亲和色层分析法纯化带有多组氨酸(6x His)标签的重组β-葡萄糖醛酸苷酶。
体外测定显示，人类β-葡萄糖醛酸苷酶显现出抗α-己醛糖酸盐水解酶基质，即4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)，可测量的活性，对应于野生型人类α-己醛糖酸盐水解酶的约0.002％的活性。MUI的水解与人类β-葡萄糖醛酸苷酶的含量及作用时间成比例。参见图3，A部分。HPLC也证实了这种活性，其显示MUI的水解和产物4-甲基伞形酮4-MU的增加。参见图3，B及C部分。注意，市售MUI含有0.1-2％的4-甲基伞形酮基β-D-葡糖酸苷(MUG)的污染，如所提供的数据表以及HPLC分析所指出所示。参见图3，D及E部分。因此，在测定之前先将市售MUI以在“材料及方法”所述的方式纯化，以避免得到由MUG水解而来的讯号。
对显示升高的α-己醛糖酸盐水解酶活性的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体的鉴定
我们以ECSTASY方法筛选具有较高α-己醛糖酸盐水解酶活性的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体，以用于克隆。参见图2。简而言之，通过结构分析及文献回顾而设计出具有19个残基突变的人类β-葡萄糖醛酸苷酶库，其总多样性为3×109。参见表1。
表1.具有高α-己醛糖酸盐水解酶活性的β-葡萄糖醛酸苷酶变体的氨基酸频率(n＝9)
底线标示的位置是由不同预测方法所辨识出的推定热点。
*：未预期的突变
通过引物组合以及随后以PCR扩增(参见图4)，在人类β-葡萄糖醛酸苷酶基因的19个位置上引入突变，产生1.2×107个细菌菌落。以0.1的感染复数(MOI)对293细胞株以库DNA进行逆转录病毒转导，以确保每个细胞中仅有单一β-葡萄糖醛酸苷酶变体基因，结果产生3×106个稳定的克隆株(293/L1细胞)。
为了除去不能正确折迭或在细胞表面上表达的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体，我们首先以会结合人类β-葡萄糖醛酸苷酶的单克隆抗体7G8-FITC对活的293/L1细胞进行染色，并收集在其表面上展现出相对高量的人类β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白的细胞。流式细胞仪分析结果显示，16％的293/L1细胞在其表面上表达GPI锚定的人类β-葡萄糖醛酸苷酶(虚线框，参见图5，A部分)。将显现出最高表达量的人类β-葡萄糖醛酸苷酶的细胞，以单细胞方式分选至96孔微量盘(群体的6.8％，实线框，图5，A部分)中，并允许增殖至接近细胞长满的程度。接着以PI-PLC处理每个克隆株以切除GPI锚，并以如“材料及方法”中所述方法测定每种可溶性β-葡萄糖醛酸苷酶变体的浓度及活性。例如，几个96孔微量盘的筛选结果中，发现三株β-葡萄糖醛酸苷酶变体，其展现出比野生型β-葡萄糖醛酸苷酶显著更高的α-己醛糖酸盐水解酶活性。参见图5，B及C部分。总结，我们筛选了50个具有分选的293/L1库细胞的96孔盘，并鉴定出1.3％(73/4800)的β-葡萄糖醛酸苷酶变体，与野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相较，具有提高的α-己醛糖酸盐水解酶活性。
展现α-己醛糖酸盐水解酶活性的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体的特性描述
随机选择表达出高的α-己醛糖酸盐水解酶活性的几株人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体，并将其克隆到哺乳动物表达载体中，以从BALB/3T3纤维母细胞以及34/2000细胞(源自一位MPS第I型患者的人类α-己醛糖酸盐水解酶缺陷型纤维母细胞)产生更大量的重组可溶性β-葡萄糖醛酸苷酶。与野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相较，所有可溶性人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体展现出增强的α-己醛糖酸盐水解酶活性，并分析其序列。参见表1。
所选择的克隆株的氨基酸序列示于表2中。进一步针对三株β-葡萄糖醛酸苷酶变体，102H1、101C7和70H1进行特性描述。重组人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体显示出与野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶类似的分子量，如通过以抗-6x His标签抗体进行免疫墨点分析法所测定的。与野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶相较，β-葡萄糖醛酸苷酶变体还显示出对MUI的活性的增加。参见图6。
表2.高α-己醛糖酸盐水解酶活性变体的氨基酸序列
测量和分析人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体对MUI的动力学性质。参见表3。人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体102H1、101C7和70H1对MUI的基质亲和力KM分别为36.9±3.2、28.2±2.4和24.5±1.6μM。与野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶相较，这些变体分别显示对MUI增加19、25和29倍的亲和力。人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体102H1、101C7和70H1的酶变率kcat为0.0099±0.0009、0.013±0.0011和0.0039±0.0003，这对应于与野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相较，分别为11、14和4倍的改善。与野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相较，三株β-葡萄糖醛酸苷酶变体的总体α-己醛糖酸盐水解酶活性从100增加到290倍。参见表4。酶特异性从β-葡萄糖醛酸苷酶转变为α-己醛糖酸盐水解酶的范围从7900倍至24500倍。β-葡萄糖醛酸苷酶变体表达出低但显著的α-己醛糖酸盐水解酶活性，其范围为野生型α-己醛糖酸盐水解酶的0.3-0.9％。
表3.在pH 3.5下水解4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)的野生型α-己醛糖酸盐水解酶(IDUA)、β-葡萄糖醛酸苷酶(βG)，以及β-葡萄糖醛酸苷酶变体的动力学参数
KM(μM) kcat(s-1) kcat/KM(s-1M-1)
IDUA 203±21 10.2±0.4 50100±3100
野生型βG 705±7.0 0.0009±0.0002 1.22±0.35
102H1 36.9±3.2 0.0099±0.0009 270±24
101C7 28.2±2.4 0.013±0.0011 470±40
70H1 24.5±1.6 0.0039±0.0003 160±11
结果以三重复测定的平均值±标准偏差表示。
表4.野生型和β-葡萄糖醛酸苷酶(βG)变体的相对酶活性和特异性变化
以4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)及4-甲基伞形酮基β-D-葡糖酸苷(MUG)分别测定α-己醛糖酸盐水解酶(IDUA)和β-葡萄糖醛酸苷酶(βG)活性。相对于野生型α-己醛糖酸盐水解酶与β-葡萄糖醛酸苷酶，相对酶活性以kcat/KM的倍数增加表示。与野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相较，特异性偏移以IDUA活性相对于βG活性的倍数变化表示。
为了解决重组人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体是否可以改变MPS第I型细胞的表型，通过35SO4并入试验来测量细胞GAG的累积。在将细胞暴露于5μg/ml重组酶72小时之前，将MPS第I型细胞与Na2 35SO4一起作用以放射性标记GAG。然后收集细胞裂解物和培养基，并测量35S的放射性。与未处理的细胞相较，以野生型α-己醛糖酸盐水解酶或β-葡萄糖醛酸苷酶变体102H1和70H1处理的细胞，在细胞裂解物中表达出显著降低的放射性。参见图7，A部分。与使用野生型β-葡萄糖醛酸苷酶处理的细胞相比，使用野生型α-己醛糖酸盐水解酶和三株β-葡萄糖醛酸苷酶变体处理的MPS第I型细胞的培养基显现出显著增加的放射性(参见图7，B部分)，表明细胞GAG产物增强的消化和排泄。总之，与未处理的细胞以及使用野生型β-葡萄糖醛酸苷酶处理的细胞相较，以β-葡萄糖醛酸苷酶变体102H1和70H1处理的细胞显现出显著降低的细胞GAG和增加的GAG排泄。以β-葡萄糖醛酸苷酶变体101C7处理的细胞展现出细胞GAG不具统计上显著性的降低，但显著增加GAG排泄。尽管β-葡萄糖醛酸苷酶变体不如野生型α-己醛糖酸盐水解酶那样有效，但这些结果表明MPS第I型细胞中贮存的GAG的部分校正。
我们还采用定性溶酶体染色方法来显现MPS第I型细胞的表型变化。将MPS第I型细胞与5μg/ml重组酶一起作用72小时，然后以Lysotracker-red DND-99染料(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，美国)染色以显现溶酶体(数据未显示)。将溶酶体荧光定量为每个细胞的平均荧光强度。在未处理的MPS第I型细胞中观察到高度溶酶体染色。正如所预期的，以野生型β-葡萄糖醛酸苷酶处理细胞并不影响溶酶体荧光。相较之下，与未处理的MPS第I型细胞相较，以α-己醛糖酸盐水解酶或β-葡萄糖醛酸苷酶变体(102H1、101C7和70H1)处理的细胞显现出的溶酶体染色显著减少(参见图8)，表示在缺陷细胞中至少有一部分正常化溶酶体。总之，这些结果显示β-葡萄糖醛酸苷酶变体显现出对MPS第I型细胞表型的校正具有有益效果。
与MPS第I型患者中的α-己醛糖酸盐水解酶相较，β-葡萄糖醛酸苷酶变体被预期显现出降低的免疫原性，因为只有几个氨基酸从野生型β-葡萄糖醛酸苷酶序列改变。例如，所选的β-葡萄糖醛酸苷酶变体102H1、101C7和70H1具有11、13和13个氨基酸变化，其对应于总氨基酸的1.7、2和2％。此外，这些突变大多被埋在内部活性位点中，且可能无法与抗体接触。
人类β-葡萄糖醛酸苷酶转基因小鼠中人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体的免疫原性
针对研究β-葡萄糖醛酸苷酶变体的免疫原性，合适的动物模型如人类β-葡萄糖醛酸苷酶转基因小鼠是非常有用的。人类β-葡萄糖醛酸苷酶转基因小鼠可以模拟MPS第I型患者，其表达正常人类β-葡萄糖醛酸苷酶，但不表达人类α-己醛糖酸盐水解酶。这些小鼠可用于研究人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体的免疫原性以及测试是否诱导针对内源性人类β-葡萄糖醛酸苷酶引发的宿主自体免疫反应。因此，我们生产了表达人类β-葡萄糖醛酸苷酶的转基因小鼠。参见图9。
为了确定转基因小鼠中人类β-葡萄糖醛酸苷酶是否具耐受性，将50μg重组蛋白(即人类β-葡萄糖醛酸苷酶、小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶、人类α-己醛糖酸盐水解酶、人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体101C7，以及人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体70H1)每三周以静脉注射到转基因小鼠中，共注射4次。并以ELISA测定抗施用的蛋白质的血清抗体。
正如所预期的，小鼠耐受重复注射小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶(参见图10，A部分)，但小鼠体内发展出抗人类α-己醛糖酸盐水解酶的抗体(参见图10，B部分)。相较之下，小鼠不产生抗人类β-葡萄糖醛酸苷酶的抗体(参见图10，C部分)，表示人类β-葡萄糖醛酸苷酶显示为自身的抗原。二个显示α-己醛糖酸盐水解酶活性的人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体(101C7和70H1)在转基因小鼠中，显现出比野生型α-己醛糖酸盐水解酶显著更低的免疫原性(参见图10，D部分)，表示“隐形匿踪”的方法可有助于降低酶置换疗法的免疫原性。
总结，转基因小鼠表达人类β-葡萄糖醛酸苷酶，并且对施用的野生型人类β-葡萄糖醛酸苷酶具有良好的耐受性。该动物模型容易仿真表达正常β-葡萄糖醛酸苷酶而不表达α-己醛糖酸盐水解酶的MPS第I型患者。
材料及方法
试剂及抗体
磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)、Lysotracker-Red DND-99染料，以及Hoechst 33342核染料是来自Invitrogen公司(Carlsbad，加州，美国)。4-甲基伞形酮基β-D-葡糖酸苷(MUG)是来自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，密苏里州，美国)。4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)来自USB公司(Cleveland，俄亥俄州，美国)。在以20％甲醇(pH 4)平衡的LiChroprep RP18(40-63μm)管柱，通过固相萃取/高效液相色层法除去市售MUI中的微量MUG污染物(～2％)。以二次蒸馏水配置的25％甲醇(pH4)洗提MUI，并在旋转蒸发器中浓缩。如所述，以FITC或生物素直接标记小鼠抗人类β-葡萄糖醛酸苷酶单克隆抗体(mAb)7G8。链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)来自Jackson ImmunoResearch公司(West Grove，宾州，美国)。
细胞培养
GP293V细胞(源自人类胚胎肾293细胞)由位于华盛顿州西雅图的华盛顿大学的Andre Lieber博士慷慨提供。34/2000细胞(来源于MPS第I型患者的人类α-己醛糖酸盐水解酶缺陷型纤维母细胞)是来自意大利热那亚的G.Gaslini研究所的Mirella Filocamo博士慷慨的赠与。BALB/3T3纤维母细胞和HEK293细胞获自ATCC(Manassas，弗吉尼亚州，美国)。细胞在添加有10％胎牛血清、2.98g/L HEPES、2g/L NaHCO3、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco基本必需培养基(DMEM)中培养。
人类β-葡萄糖醛酸苷酶和α-己醛糖酸盐水解酶的结构分析
人类β-葡萄糖醛酸苷酶、人类α-己醛糖酸盐水解酶，以及解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)β-木糖苷酶的蛋白质结构比对显示它们具有保守的催化性谷氨酸残基。由解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)β-木糖苷酶(PDB ID:1Y24)和解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)β-木糖苷酶(PDB ID:1PX8)衍生出的人类β-葡萄糖醛酸苷酶(PDB ID:1BHG)、人类α-己醛糖酸盐水解酶同源模型的立体结构也被用于分析中。催化TIM(β/α)8-桶状区域被迭加并分别通过PyMOL与OPAAS分析。虽然人类β-葡萄糖醛酸苷酶和α-己醛糖酸盐水解酶的整个蛋白质结构彼此不是非常相似，这些蛋白质具有共同的TIM(β/α)8-桶状结构以及保守的谷氨酸残基在其催化位点中。选择预测会接触基质的残基进行突变。
合成库构建
设计了具有19个残基的突变的人类β-葡萄糖醛酸苷酶库，其总多样性为3×109。β-葡萄糖醛酸苷酶催化结构域中的15个残基(S447、N484、N502、S503、Y504、Y508、H509、G542、W587、F592、T594、E595、R600、N604和K606)被鉴定为包围该活性位点，其中能容纳基质。先前的研究还报告了与酶活性和特异性相关的几种β-葡萄糖醛酸苷酶残基(N484、S503、S506、H509、T545、L565、E595、P598、N604和K606)。总共19个氨基酸残基被突变。参见表1。通过结构分析和文献回顾，辨识出的六个划底线的残基(N484、S503、H509、E595、N604和K606)被认为是热点。这六个热点突变为可变氨基酸以增加库的多样性。例如，我们在S503使用简并引物将丝氨酸突变为具有侧链的带正电荷(组氨酸)、带负电荷(天门冬氨酸)、芳香族(酪氨酸和苯丙氨酸)、疏水性(丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸)、特殊构象(脯氨酸)的氨基酸。将其他残基突变为从结构比较或在先前研究中鉴定的相应氨基酸(表1)。使用引物组合产生人类β-葡萄糖醛酸苷酶库(见图4)。简言之，将全长β-葡萄糖醛酸苷酶序列分成五个彼此之间具有18个重迭核苷酸的片段(F0-4)。F0片段含有Apa I克隆位点以及沉默突变(核苷酸G741A)以去除人类β-葡萄糖醛酸苷酶基因中的独特Bgl II切割位点，以在库构建后除去野生型DNA的污染。野生型片段F1仅用作F0和F2片段之间的桥梁。通过引物组合，随后通过PCR扩增构建了在19个位置含有可变氨基酸的F2和F3片段。野生型F4片段含有Sal I克隆位点。所有片段以相同的摩尔比混合，并通过PCR扩增以获得全长β-葡萄糖醛酸苷酶库，其用Apa I和Sal I消化并连接到pLNCX-hβG-DAF中的相同位点，以附加编码GPI锚定到酶变体C端的序列。通过Bgl II消化DNA库以除去任何野生型DNA的污染，然后通过电穿孔转型至DH5α胜任细胞中。在15-cm含卡本西林(carbenicillin)的LB琼脂培养基上，于37℃下进行筛选转型的细菌16小时。从单一菌落中纯化质粒DNA并测序以确定所选残基的突变率。所有预期的突变存在于合成库中。收集来自多个培养基的菌落并在含有卡本西林的LB培养基中增殖。当OD600为0.5时，通过加入氯霉素将质粒增殖至终浓度170μg/ml。整夜培养后，使用Beckman Optima L-90K超速离心机(Beckman Coulter公司，Fullerton，加州，美国)，在4℃下，使用Ti 70.1转子以60,000rpm在CsCl-溴化乙锭密度梯度中离心24小时以纯化质粒DNA。
稳定库细胞的产生
为了产生稳定的细胞库，将库质粒DNA与pVSV-G(Clontech公司，Mountain View，加州，美国)共转染到GP293V细胞中以产生重组逆转录病毒颗粒。转染后两天，将培养基过滤，与8μg/ml聚凝胺混合，并与293细胞以0.1的感染复数培养。在含有0.5mg/ml G418(Calbiochem公司，San Diego，加州，美国)的培养基中选择稳定的细胞株。得到的合成库细胞称为293/L1细胞。
流式细胞仪分析和库细胞筛选
使用会结合人类β-葡萄糖醛酸苷酶的7G8-FITC染色293/L1细胞，并以FACScaliber流式细胞仪(BD Biosciences公司，Franklin Lakes，纽泽西州，美国)测量活细胞的免疫荧光来测定人类β-葡萄糖醛酸苷酶表面的表达。通常，将2×107个细胞清洗后悬浮于1ml含有0.5％BSA以及20μg/ml 7G8-FITC的HBSS培养液(5.4mM KCl、0.3mM Na2HPO4、0.4mM KH2PO4、4.2mM NaHCO3、1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2、0.6mM MgSO4、137mM NaCl、5.6mMD-葡萄糖，pH 7.4)，在4℃下培养30分钟。以含有0.5％BSA的冰冷HBSS培养液清洗细胞，并悬浮于含有5μg/ml碘化丙啶的0.5％BSA/HBSS培养液中。在FACSAria细胞分选仪(BDBiosciences公司，Franklin Lakes，纽泽西州，美国)上分选细胞。在488/515nm(FL1)的激发/发射波长下检测到7G8-FITC免疫荧光之前，框选出死细胞(碘化丙啶阳性，高FL3荧光者)。将表达表面人类β-葡萄糖醛酸苷酶的单细胞分选到含有添加有10％牛血清的Dulbecco基本必需培养基的96孔微量盘中。
表面酶释放以及酶活性筛选
将96孔微量盘中的293/L1细胞以PBS洗涤一次，并与100μl含有50mU/mL磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)的PBS在37℃下培养1小时，以从该细胞表面切下GPI锚定的β-葡萄糖醛酸苷酶变体。将20μl裂解酶样品与80μl的50μM4-甲基伞形酮α-L-己醛糖酸盐(MUI)在0.2M甲酸盐缓冲液(pH3.5)中，于37℃下混合17小时来测定释放的β-葡萄糖醛酸苷酶的α-己醛糖酸盐水解酶活性。通过加入100μl中止缓冲液(1M甘氨酸，0.5M碳酸氢钠，pH 10.7)中止反应，并在激发波长355nm和发射波长460nm下测量盘孔中的4-甲基伞形酮(4-MU)荧光。为了减少大规模MUI测定和三明治ELISA分析期间，以手动移转液体造成的体积转移的系统误差，使用自动液体处理系统MicroLab MPH-96(Hamilton Robotics，Reno，内华达州，美国)。通过用限定浓度的酶水解连续稀释的基质(400μM)来测定针对MUI的动力学参数。在各个时间点中止反应并测量荧光。通过与4-MU标准曲线比较，将获得的荧光转化为产物浓度。使用Lineweaver-Burk图测定KM和kcat。
三明治酶联结免疫吸附分析法(ELISA)
通过三明治ELISA测量以PI-PLC切割来自分选的单一株293-L1细胞的表面酶产生的可溶性β-葡萄糖醛酸苷酶的浓度。将稀释于50μl涂覆缓冲液(50mM Na2CO3、50mM NaHCO3，pH 8)中的0.1μg单克隆抗体7G8在96孔微量盘的每个孔中，于室温下作用1小时。将微量盘以PBS洗涤3次，然后在室温下以含有2.5％脱脂奶粉的PBS进行阻隔作用1小时。将微量盘以PBS洗涤3次，并将以PBS稀释至50μl的20μl人类β-葡萄糖醛酸苷酶变体样品在室温下转移至每个孔中静置1小时。将微量盘以含有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次，然后在室温下加入在含有2.5％脱脂奶粉的50μl PBS中的20ng 7G8-生物素和50ng链霉亲和素-HRP，并静置1小时。在每个步骤后，将微量盘以含有0.05％Tween 20的PBS清洗3次。在室温下添加150μl新鲜制备的2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)ABTS基质，静置30分钟并在405nm波长处测量每个孔的吸亮度。
溶酶体染色和图像的获得
采用溶酶体染色法观察MPS第I型细胞中的酶效应。简言之，将MPS第I型细胞接种在96孔微量盘中，并与5.0μg/ml重组酶共同培养72小时。以PBS清洗细胞，并以含有100nMLysotracker-red DND-99染料和1μg/mL Hoechst 33342的100μl培养基在37℃下染色30分钟。以PBS清洗细胞两次，并补充200μl不含酚红的DMEM培养液，并在ImageXpress Micro XLHigh-Content Screening System(高内涵筛选生物影像系统)(Molecular Devices公司，加州，美国)上进行实时成像。使用TRITC(Em＝545±20、Ex＝593±20nm)和DAPI(Ex＝350±50、Em＝455±50nm)过滤器分别观察Lysotracker和Hoechst染色。通过MetaXpress HighContent Image Acquisition&Analysis Software(高内涵图像采集和分析软件)(Molecular Devices公司，加州，美国)记录和分析每孔9个图像位点。
统计分析
使用双尾学生t检验，通过Graphpad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.公司，San Diego，加州，美国)计算野生型和β-葡萄糖醛酸苷酶变体之间的显著差异。在P值小于0.05时，认为数据具有显著性。
其他具体实施例
在本说明书中揭露的所有特征可以任何组合方式来组合。本说明书中揭露的每个特征可以由具有相同、等同或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅仅是等同或类似特征的一般系列的示例。
由以上描述，本发明所属技术领域技术人员可以容易地确定所描述的具体实施例的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对具体实施例进行各种改变和修改以适应各种用途和条件。因此，其他具体实施例也在权利要求书范围内。
序列表
<110> 中央研究院
<120> 用于酶置换疗法的改造酶
<130> GCI18TW0289
<150> US 62/201,889
<151> 2015-08-06
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1956
<212> DNA
<213> 人类β-葡萄糖醛酸苷酶
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1956)
<400> 1
atg gcc cgg ggg tcg gcg gtt gcc tgg gcg gcg ctc ggg ccg ttg ttg 48
Met Ala Arg Gly Ser Ala Val Ala Trp Ala Ala Leu Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
tgg ggc tgc gcg ctg ggg ctg cag ggc ggg atg ctg tac ccc cag gag 96
Trp Gly Cys Ala Leu Gly Leu Gln Gly Gly Met Leu Tyr Pro Gln Glu
20 25 30
agc ccg tcg cgg gag tgc aag gag ctg gac ggc ctc tgg agc ttc cgc 144
Ser Pro Ser Arg Glu Cys Lys Glu Leu Asp Gly Leu Trp Ser Phe Arg
35 40 45
gcc gac ttc tct gac aac cga cgc cgg ggc ttc gag gag cag tgg tac 192
Ala Asp Phe Ser Asp Asn Arg Arg Arg Gly Phe Glu Glu Gln Trp Tyr
50 55 60
cgg cgg ccg ctg tgg gag tca ggc ccc acc gtg gac atg cca gtt ccc 240
Arg Arg Pro Leu Trp Glu Ser Gly Pro Thr Val Asp Met Pro Val Pro
65 70 75 80
tcc agc ttc aat gac atc agc cag gac tgg cgt ctg cgg cat ttt gtc 288
Ser Ser Phe Asn Asp Ile Ser Gln Asp Trp Arg Leu Arg His Phe Val
85 90 95
ggc tgg gtg tgg tac gaa cgg gag gtg atc ctg ccg gag cga tgg acc 336
Gly Trp Val Trp Tyr Glu Arg Glu Val Ile Leu Pro Glu Arg Trp Thr
100 105 110
cag gac ctg cgc aca aga gtg gtg ctg agg att ggc agt gcc cat tcc 384
Gln Asp Leu Arg Thr Arg Val Val Leu Arg Ile Gly Ser Ala His Ser
115 120 125
tat gcc atc gtg tgg gtg aat ggg gtc gac acg cta gag cat gag ggg 432
Tyr Ala Ile Val Trp Val Asn Gly Val Asp Thr Leu Glu His Glu Gly
130 135 140
ggc tac ctc ccc ttc gag gcc gac atc agc aac ctg gtc cag gtg ggg 480
Gly Tyr Leu Pro Phe Glu Ala Asp Ile Ser Asn Leu Val Gln Val Gly
145 150 155 160
ccc ctg ccc tcc cgg ctc cga atc act atc gcc atc aac aac aca ctc 528
Pro Leu Pro Ser Arg Leu Arg Ile Thr Ile Ala Ile Asn Asn Thr Leu
165 170 175
acc ccc acc acc ctg cca cca ggg acc atc caa tac ctg act gac acc 576
Thr Pro Thr Thr Leu Pro Pro Gly Thr Ile Gln Tyr Leu Thr Asp Thr
180 185 190
tcc aag tat ccc aag ggt tac ttt gtc cag aac aca tat ttt gac ttt 624
Ser Lys Tyr Pro Lys Gly Tyr Phe Val Gln Asn Thr Tyr Phe Asp Phe
195 200 205
ttc aac tac gct gga ctg cag cgg tct gta ctt ctg tac acg aca ccc 672
Phe Asn Tyr Ala Gly Leu Gln Arg Ser Val Leu Leu Tyr Thr Thr Pro
210 215 220
acc acc tac atc gat gac atc acc gtc acc acc agc gtg gag caa gac 720
Thr Thr Tyr Ile Asp Asp Ile Thr Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Asp
225 230 235 240
agt ggg ctg gtg aat tac cag atc tct gtc aag ggc agt aac ctg ttc 768
Ser Gly Leu Val Asn Tyr Gln Ile Ser Val Lys Gly Ser Asn Leu Phe
245 250 255
aag ttg gaa gtg cgt ctt ttg gat gca gaa aac aaa gtc gtg gcg aat 816
Lys Leu Glu Val Arg Leu Leu Asp Ala Glu Asn Lys Val Val Ala Asn
260 265 270
ggg act ggg acc cag ggc caa ctt aag gtg cca ggt gtc agc ctc tgg 864
Gly Thr Gly Thr Gln Gly Gln Leu Lys Val Pro Gly Val Ser Leu Trp
275 280 285
tgg ccg tac ctg atg cac gaa cgc cct gcc tat ctg tat tca ttg gag 912
Trp Pro Tyr Leu Met His Glu Arg Pro Ala Tyr Leu Tyr Ser Leu Glu
290 295 300
gtg cag ctg act gca cag acg tca ctg ggg cct gtg tct gac ttc tac 960
Val Gln Leu Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Pro Val Ser Asp Phe Tyr
305 310 315 320
aca ctc cct gtg ggg atc cgc act gtg gct gtc acc aag agc cag ttc 1008
Thr Leu Pro Val Gly Ile Arg Thr Val Ala Val Thr Lys Ser Gln Phe
325 330 335
ctc atc aat ggg aaa cct ttc tat ttc cac ggt gtc aac aag cat gag 1056
Leu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Tyr Phe His Gly Val Asn Lys His Glu
340 345 350
gat gcg gac atc cga ggg aag ggc ttc gac tgg ccg ctg ctg gtg aag 1104
Asp Ala Asp Ile Arg Gly Lys Gly Phe Asp Trp Pro Leu Leu Val Lys
355 360 365
gac ttc aac ctg ctt cgc tgg ctt ggt gcc aac gct ttc cgt acc agc 1152
Asp Phe Asn Leu Leu Arg Trp Leu Gly Ala Asn Ala Phe Arg Thr Ser
370 375 380
cac tac ccc tat gca gag gaa gtg atg cag atg tgt gac cgc tat ggg 1200
His Tyr Pro Tyr Ala Glu Glu Val Met Gln Met Cys Asp Arg Tyr Gly
385 390 395 400
att gtg gtc atc gat gag tgt ccc ggc gtg ggc ctg gcg ctg ccg cag 1248
Ile Val Val Ile Asp Glu Cys Pro Gly Val Gly Leu Ala Leu Pro Gln
405 410 415
ttc ttc aac aac gtt tct ctg cat cac cac atg cag gtg atg gaa gaa 1296
Phe Phe Asn Asn Val Ser Leu His His His Met Gln Val Met Glu Glu
420 425 430
gtg gtg cgt agg gac aag aac cac ccc gcg gtc gtg atg tgg tct gtg 1344
Val Val Arg Arg Asp Lys Asn His Pro Ala Val Val Met Trp Ser Val
435 440 445
gcc aac gag cct gcg tcc cac cta gaa tct gct ggc tac tac ttg aag 1392
Ala Asn Glu Pro Ala Ser His Leu Glu Ser Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys
450 455 460
atg gtg atc gct cac acc aaa tcc ttg gac ccc tcc cgg cct gtg acc 1440
Met Val Ile Ala His Thr Lys Ser Leu Asp Pro Ser Arg Pro Val Thr
465 470 475 480
ttt gtg agc aac tct aac tat gca gca gac aag ggg gct ccg tat gtg 1488
Phe Val Ser Asn Ser Asn Tyr Ala Ala Asp Lys Gly Ala Pro Tyr Val
485 490 495
gat gtg atc tgt ttg aac agc tac tac tct tgg tat cac gac tac ggg 1536
Asp Val Ile Cys Leu Asn Ser Tyr Tyr Ser Trp Tyr His Asp Tyr Gly
500 505 510
cac ctg gag ttg att cag ctg cag ctg gcc acc cag ttt gag aac tgg 1584
His Leu Glu Leu Ile Gln Leu Gln Leu Ala Thr Gln Phe Glu Asn Trp
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tat aag aag tat cag aag ccc att att cag agc gag tat gga gca gaa 1632
Tyr Lys Lys Tyr Gln Lys Pro Ile Ile Gln Ser Glu Tyr Gly Ala Glu
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acg att gca ggg ttt cac cag gat cca cct ctg atg ttc act gaa gag 1680
Thr Ile Ala Gly Phe His Gln Asp Pro Pro Leu Met Phe Thr Glu Glu
545 550 555 560
tac cag aaa agt ctg cta gag cag tac cat ctg ggt ctg gat caa aaa 1728
Tyr Gln Lys Ser Leu Leu Glu Gln Tyr His Leu Gly Leu Asp Gln Lys
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cgc aga aaa tac gtg gtt gga gag ctc att tgg aat ttt gcc gat ttc 1776
Arg Arg Lys Tyr Val Val Gly Glu Leu Ile Trp Asn Phe Ala Asp Phe
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atg act gaa cag tca ccg acg aga gtg ctg ggg aat aaa aag ggg atc 1824
Met Thr Glu Gln Ser Pro Thr Arg Val Leu Gly Asn Lys Lys Gly Ile
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ttc act cgg cag aga caa cca aaa agt gca gcg ttc ctt ttg cga gag 1872
Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Arg Glu
610 615 620
aga tac tgg aag att gcc aat gaa acc agg tat ccc cac tca gta gcc 1920
Arg Tyr Trp Lys Ile Ala Asn Glu Thr Arg Tyr Pro His Ser Val Ala
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aag tca caa tgt ttg gaa aac agc ctg ttt act tga 1956
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<211> 651
<212> PRT
<213> 人类β-葡萄糖醛酸苷酶
<400> 2
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100 105 110
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580 585 590
Met Thr Glu Gln Ser Pro Thr Arg Val Leu Gly Asn Lys Lys Gly Ile
595 600 605
Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Arg Glu
610 615 620
Arg Tyr Trp Lys Ile Ala Asn Glu Thr Arg Tyr Pro His Ser Val Ala
625 630 635 640
Lys Ser Gln Cys Leu Glu Asn Ser Leu Phe Thr
645 650
<210> 3
<211> 1962
<212> DNA
<213> 人类α-己醛糖酸盐水解酶
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1962)
<400> 3
atg cgt ccc ctg cgc ccc cgc gcc gcg ctg ctg gcg ctc ctg gcc tcg 48
Met Arg Pro Leu Arg Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
ctc ctg gcc gcg ccc ccg gtg gcc ccg gcc gag gcc ccg cac ctg gtg 96
Leu Leu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu Val
20 25 30
cat gtg gac gcg gcc cgc gcg ctg tgg ccc ctg cgg cgc ttc tgg agg 144
His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg
35 40 45
agc aca ggc ttc tgc ccc ccg ctg cca cac agc cag gct gac cag tac 192
Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr
50 55 60
gtc ctc agc tgg gac cag cag ctc aac ctc gcc tat gtg ggc gcc gtc 240
Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val
65 70 75 80
cct cac cgc ggc atc aag cag gtc cgg acc cac tgg ctg ctg gag ctt 288
Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His Trp Leu Leu Glu Leu
85 90 95
gtc acc acc agg ggg tcc act gga cgg ggc ctg agc tac aac ttc acc 336
Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr
100 105 110
cac ctg gac ggg tac ctg gac ctt ctc agg gag aac cag ctc ctc cca 384
His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Glu Asn Gln Leu Leu Pro
115 120 125
ggg ttt gag ctg atg ggc agc gcc tcg ggc cac ttc act gac ttt gag 432
Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser Gly His Phe Thr Asp Phe Glu
130 135 140
gac aag cag cag gtg ttt gag tgg aag gac ttg gtc tcc agc ctg gcc 480
Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys Asp Leu Val Ser Ser Leu Ala
145 150 155 160
agg aga tac atc ggt agg tac gga ctg gcg cat gtt tcc aag tgg aac 528
Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu Ala His Val Ser Lys Trp Asn
165 170 175
ttc gag acg tgg aat gag cca gac cac cac gac ttt gac aac gtc tcc 576
Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His His Asp Phe Asp Asn Val Ser
180 185 190
atg acc atg caa ggc ttc ctg aac tac tac gat gcc tgc tcg gag ggt 624
Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Asp Ala Cys Ser Glu Gly
195 200 205
ctg cgc gcc gcc agc ccc gcc ctg cgg ctg gga ggc ccc ggc gac tcc 672
Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg Leu Gly Gly Pro Gly Asp Ser
210 215 220
ttc cac acc cca ccg cga tcc ccg ctg agc tgg ggc ctc ctg cgc cac 720
Phe His Thr Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ser Trp Gly Leu Leu Arg His
225 230 235 240
tgc cac gac ggt acc aac ttc ttc act ggg gag gcg ggc gtg cgg ctg 768
Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr Gly Glu Ala Gly Val Arg Leu
245 250 255
gac tac atc tcc ctc cac agg aag ggt gcg cgc agc tcc atc tcc atc 816
Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ile
260 265 270
ctg gag cag gag aag gtc gtc gcg cag cag atc cgg cag ctc ttc ccc 864
Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile Arg Gln Leu Phe Pro
275 280 285
aag ttc gcg gac acc ccc att tac aac gac gag gcg gac ccg ctg gtg 912
Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu Ala Asp Pro Leu Val
290 295 300
ggc tgg tcc ctg cca cag ccg tgg agg gcg gac gtg acc tac gcg gcc 960
Gly Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg Ala Asp Val Thr Tyr Ala Ala
305 310 315 320
atg gtg gtg aag gtc atc gcg cag cat cag aac ctg cta ctg gcc aac 1008
Met Val Val Lys Val Ile Ala Gln His Gln Asn Leu Leu Leu Ala Asn
325 330 335
acc acc tcc gcc ttc ccc tac gcg ctc ctg agc aac gac aat gcc ttc 1056
Thr Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Asp Asn Ala Phe
340 345 350
ctg agc tac cac ccg cac ccc ttc gcg cag cgc acg ctc acc gcg cgc 1104
Leu Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala Gln Arg Thr Leu Thr Ala Arg
355 360 365
ttc cag gtc aac aac acc cgc ccg ccg cac gtg cag ctg ttg cgc aag 1152
Phe Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Val Gln Leu Leu Arg Lys
370 375 380
ccg gtg ctc acg gcc atg ggg ctg ctg gcg ctg ctg gat gag gag cag 1200
Pro Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu Ala Leu Leu Asp Glu Glu Gln
385 390 395 400
ctc tgg gcc gaa gtg tcg cag gcc ggg acc gtc ctg gac agc aac cac 1248
Leu Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val Leu Asp Ser Asn His
405 410 415
acg gtg ggc gtc ctg gcc agc gcc cac cgc ccc cag ggc ccg gcc gac 1296
Thr Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro Gln Gly Pro Ala Asp
420 425 430
gcc tgg cgc gcc gcg gtg ctg atc tac gcg agc gac gac acc cgc gcc 1344
Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser Asp Asp Thr Arg Ala
435 440 445
cac ccc aac cgc agc gtc gcg gtg acc ctg cgg ctg cgc ggg gtg ccc 1392
His Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg Leu Arg Gly Val Pro
450 455 460
ccc ggc ccg ggc ctg gtc tac gtc acg cgc tac ctg gac aac ggg ctc 1440
Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr Leu Asp Asn Gly Leu
465 470 475 480
tgc agc ccc gac ggc gag tgg cgg cgc ctg ggc cgg ccc gtc ttc ccc 1488
Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly Arg Pro Val Phe Pro
485 490 495
acg gca gag cag ttc cgg cgc atg cgc gcg gct gag gac ccg gtg gcc 1536
Thr Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala Glu Asp Pro Val Ala
500 505 510
gcg gcg ccc cgc ccc tta ccc gcc ggc ggc cgc ctg acc ctg cgc ccc 1584
Ala Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg Leu Thr Leu Arg Pro
515 520 525
gcg ctg cgg ctg ccg tcg ctt ttg ctg gtg cac gtg tgt gcg cgc ccc 1632
Ala Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His Val Cys Ala Arg Pro
530 535 540
gag aag ccg ccc ggg cag gtc acg cgg ctc cgc gcc ctg ccc ctg acc 1680
Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg Ala Leu Pro Leu Thr
545 550 555 560
caa ggg cag ctg gtt ctg gtc tgg tcg gat gaa cac gtg ggc tcc aag 1728
Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu His Val Gly Ser Lys
565 570 575
tgc ctg tgg aca tac gag atc cag ttc tct cag gac ggt aag gcg tac 1776
Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln Asp Gly Lys Ala Tyr
580 585 590
acc ccg gtc agc agg aag cca tcg acc ttc aac ctc ttt gtg ttc agc 1824
Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn Leu Phe Val Phe Ser
595 600 605
cca gac aca ggt gct gtc tct ggc tcc tac cga gtt cga gcc ctg gac 1872
Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg Val Arg Ala Leu Asp
610 615 620
tac tgg gcc cga cca ggc ccc ttc tcg gac cct gtg ccg tac ctg gag 1920
Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Pro Tyr Leu Glu
625 630 635 640
gtc cct gtg cca aga ggg ccc cca tcc ccg ggc aat cca tga 1962
Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly Asn Pro
645 650
<210> 4
<211> 653
<212> PRT
<213> 人类α-己醛糖酸盐水解酶
<400> 4
Met Arg Pro Leu Arg Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Leu Leu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu Val
20 25 30
His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg
35 40 45
Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr
50 55 60
Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val
65 70 75 80
Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His Trp Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr
100 105 110
His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Glu Asn Gln Leu Leu Pro
115 120 125
Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser Gly His Phe Thr Asp Phe Glu
130 135 140
Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys Asp Leu Val Ser Ser Leu Ala
145 150 155 160
Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu Ala His Val Ser Lys Trp Asn
165 170 175
Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His His Asp Phe Asp Asn Val Ser
180 185 190
Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Asp Ala Cys Ser Glu Gly
195 200 205
Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg Leu Gly Gly Pro Gly Asp Ser
210 215 220
Phe His Thr Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ser Trp Gly Leu Leu Arg His
225 230 235 240
Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr Gly Glu Ala Gly Val Arg Leu
245 250 255
Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ile
260 265 270
Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile Arg Gln Leu Phe Pro
275 280 285
Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu Ala Asp Pro Leu Val
290 295 300
Gly Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg Ala Asp Val Thr Tyr Ala Ala
305 310 315 320
Met Val Val Lys Val Ile Ala Gln His Gln Asn Leu Leu Leu Ala Asn
325 330 335
Thr Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Asp Asn Ala Phe
340 345 350
Leu Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala Gln Arg Thr Leu Thr Ala Arg
355 360 365
Phe Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Val Gln Leu Leu Arg Lys
370 375 380
Pro Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu Ala Leu Leu Asp Glu Glu Gln
385 390 395 400
Leu Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val Leu Asp Ser Asn His
405 410 415
Thr Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro Gln Gly Pro Ala Asp
420 425 430
Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser Asp Asp Thr Arg Ala
435 440 445
His Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg Leu Arg Gly Val Pro
450 455 460
Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr Leu Asp Asn Gly Leu
465 470 475 480
Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly Arg Pro Val Phe Pro
485 490 495
Thr Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala Glu Asp Pro Val Ala
500 505 510
Ala Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg Leu Thr Leu Arg Pro
515 520 525
Ala Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His Val Cys Ala Arg Pro
530 535 540
Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg Ala Leu Pro Leu Thr
545 550 555 560
Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu His Val Gly Ser Lys
565 570 575
Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln Asp Gly Lys Ala Tyr
580 585 590
Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn Leu Phe Val Phe Ser
595 600 605
Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg Val Arg Ala Leu Asp
610 615 620
Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Pro Tyr Leu Glu
625 630 635 640
Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly Asn Pro
645 650

Claims (22)

1.一种改造酶，包含与一人类β-葡萄糖醛酸苷酶的氨基酸序列至少80％相同的一氨基酸序列，其中与所述人类β-葡萄糖醛酸苷酶相较，所述改造酶显现出一较高量的α-己醛糖酸盐水解酶酶活性。
2.如权利要求1所述的改造酶，其中所述人类β-葡萄糖醛酸苷酶包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的改造酶，其中所述改造酶在所述如SEQ ID NO:2所示的序列中对应于残基T204、Q279、K438、N484、N502、S503、Y504、S506、Y508、H509、G542、T545、L565、W587、F592、T594、E595、P598、R600、G603、N604、K606，及/或P636的一残基处包含一取代。
4.如权利要求3所述的改造酶，其中所述改造酶在N484、N502、S503、S506、H509、F592、E595、N604，及/或K606处包含一取代。
5.如权利要求3所述的改造酶，其中残基204为T或K；残基279为Q或H；残基438为K或M；残基484为S、D、H、R、S或C；残基502为N、D或K；残基503为A、D、Y、P、H或V；残基504为Y、G或C；残基506为S或G；残基508为Y或D；残基509为H、A或P；残基542为G或D；残基545为T或A；残基565为L或A；残基587为W或T；残基592为F或Y；残基594为T或L；残基595为L、V、Q或G；残基598为P或D；残基600为R或A；残基603为G或E；残基604为Y、S、A或T；残基606为Q、F或L；且残基636为P或S。
6.如权利要求1-5任一项所述的改造酶，其中所述改造酶在所述如SEQ ID NO:2所示的序列中对应于残基S447、G542、L565、W587、R600、G603，及/或P636的残基处不包含一取代。
7.如权利要求3所述的改造酶，其中所述改造酶包含残基S484、D502、A503、G506、A509、D542、A545、Y592、V595、S604，及/或F606。
8.如权利要求3所述的改造酶，其中所述改造酶包含残基H279、C484、K502、Y503、G504、G506、P509、A545、A565、L594、Q595、A604，及/或F606。
9.如权利要求3所述的改造酶，其中所述改造酶包含残基D484、K502、Y503、G506、D508、P509、A545、Y592、L594、G595、D598、T604、F606，及/或S636。
10.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1-9任一项所述的改造酶的核酸序列。
11.一种宿主细胞，其包含如权利要求10所述的核酸分子。
12.一种医药组合物，包含如权利要求1-9任一项所述的改造酶以及一医药上可接受的载体。
13.一种在受试者中治疗黏多糖贮积症的方法，包含对一有需要的受试者施用如权利要求1-9任一项所述的改造酶。
14.一种发展候选酶置换疗法的方法，所述候选酶置换疗法用于在具有与缺陷酶相关的疾病的受试者中治疗该疾病，该方法包含：
选择一模板酶，其中所述模板酶对该受试者而言是内源性的，且在该受试者体内正常地表达；以及
改变所述模板酶以获得一改造酶，其中与所述模板酶的目标酶活性相较，所述改造酶显现出增加目标酶活性，所述目标酶活性是所述缺陷酶的野生型对应物的酶活性；
其中所述改造酶为用于治疗该疾病的候选酶置换疗法。
15.一种鉴定候选酶置换疗法的方法，所述候选酶置换疗法用于在具有与缺陷酶相关的疾病的受试者中治疗该疾病，该方法包含：
提供改造酶的库，其中在所述库中的每种改造酶为一模板酶的变体，所述模板酶对该受试者而言为内源性的，且在该受试者体内正常地表达；以及
测定所述库的目标酶活性，其中所述目标酶活性为所述缺陷酶的野生型对应物的酶活性；
其中，与所述模板酶的目标酶活性相较，显现出一增加目标酶活性的一改造酶为用于治疗该疾病的候选酶置换疗法。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中该疾病为溶酶体贮积症，且所述缺陷酶为溶酶体酶。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述缺陷酶为人类α-己醛糖酸盐水解酶，且所述模板酶为人类β-葡萄糖醛酸苷酶。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述模板酶包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述改造酶在所述如SEQ ID NO:2所示的序列中对应于残基T204、Q279、K438、N484、N502、S503、Y504、S506、Y508、H509、G542、T545、L565、W587、F592、T594、E595、P598、R600、G603、N604、K606，及/或P636的残基处包含一取代。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述目标酶活性为4-甲基伞形酮-α-L-己醛糖酸盐的水解作用。
21.如权利要求14-20任一项所述的方法，进一步包含确定所述候选酶置换疗法是否在一动物模型或具有该疾病的受试者体内诱导一免疫反应。
22.如权利要求21所述的方法，进一步包含选择不诱导免疫反应的候选酶置换疗法，或与由所述缺陷酶诱导的免疫反应相较，诱导较低量的免疫反应的候选酶置换疗法。
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