CN103037895B

CN103037895B - 活性高度磷酸化人类n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的制备及其用途

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Publication number: CN103037895B
Application number: CN201180035900.4A
Authority: CN
Inventors: V·科帕卡; M·C·斐拉德; A·O·奥克哈马菲; K·阿拉亚
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2031-07-22
Also published as: ES2616263T3; AR082319A1; AU2011280937A1; SMT201700106B; IL224125B; JP6030553B2; US8765437B2; CA2805673C; ZA201300286B; AR119552A2; BR112013001558B1; SI2595650T1; PE20131140A1; EP2595650B1; JP2016178950A; RU2013107765A; US8940513B2; IL260282B; US20160186149A1; MX2013000908A

Abstract

本发明提供活性高度磷酸化人类N‑乙酰半乳糖胺‑6‑硫酸酯酶(GALNS)的组合物、医药组合物及制剂，产生及纯化GALNS的方法，及在诊断、防治或治疗疾病及病状，特别包括GALNS酶缺乏所引起或相关的溶酶体储积疾病，例如黏多糖病(Mucopolysaccharidosis)Iva(MPS IVa或莫奎欧(Morquio)A综合征）的用途。

Description

活性高度磷酸化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的制备及其用途

相关申请的交叉引用

本申请请求2010年7月22日提交的美国临时专利申请第61/366,714号的优先权和权益，其公开内容通过引用全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及细胞及分子生物学及医药技术领域，特别是活性高度磷酸化人类溶酶体硫酸酯酶的制备及其在管理与溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的溶酶体储积疾病中的用途。具体的，本发明涉及活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的制备及其在管理黏多糖病(Mucopolysaccharidosis)IVa(MPS IVa或莫奎欧A综合征)及与GALNS缺乏相关的其它溶酶体储积疾病中的用途。

现有技术

溶酶体储积疾病(LSD)由细胞内为溶酶体中细胞废物降解所必需的特定溶酶体酶缺乏所致。此等溶酶体酶的缺乏导致未降解的“储积物质”在溶酶体内累积，由此导致溶酶体膨胀及功能障碍且最终导致细胞及组织损伤。许多溶酶体酶已经鉴别且与其相关疾病关联。一旦缺失酶已经鉴别，治疗即可简化成高效递送替代酶至患者受影响组织的单一问题。

一种治疗溶酶体储积疾病的方式为静脉内酶替代疗法(ERT)(Kakkis,ExpertOpin.Investig.Drugs11(5):675-685,2002)。ERT利用血管结构将酶自单一投药位点运送至大多数组织。一旦所述酶广泛分布，其必须被吸收至细胞中。在溶酶体酶的独特特征中发现摄取至细胞中的基础。溶酶体酶构成单独的一类由处于末端甘露糖残基6-位置的磷酸酯限定的糖蛋白。甘露糖-6-磷酸酯以高亲和力及特异性由可见于大多数细胞表面上的受体结合(Munier-Lehmann等人,Biochem.Soc.Trans.24(1):133-136,1996；Marnell等人,J.Cell.Biol.99(6):1907-1916,1984)。每条多肽链具有2个甘露糖-6-磷酸酯结合位点的甘露糖-6-磷酸酯受体(MPR)(Tong等人,J. Biol.Chem.264:7962-7969,1989)引导酶自血液摄取至组织接着介导细胞内向溶酶体中的运送。

大规模产生溶酶体酶涉及在哺乳动物细胞系中的表达。目标在于使重组酶主要分泌至周围生长培养基中以供收集及下游加工。在用于大规模产生溶酶体酶的理想系统中，酶将经高效磷酸化接着主要被引向细胞表面(即，用于分泌)而非主要引向溶酶体。如上所述，磷酸化溶酶体酶的这种分配与正常细胞中发生的情况完全相反。制备用于产生溶酶体酶的细胞系着重于将每摩尔酶的甘露糖-6-磷酸酯含量最大化，但特征在于低比产率。产生含有高含量甘露糖-6-磷酸酯部分的溶酶体酶的体外尝试成败参半(Canfield等人，美国专利第6,537,785号)。体外酶展现高含量甘露糖-6-磷酸酯以及高含量未经修饰的末端甘露糖。甘露糖-6-磷酸酯与甘露糖受体之间对溶酶体酶的竞争使得高剂量酶为达成有效性所必需，且可导致不利于所治疗个体的较大免疫原性。

硫酸酯酶构成独特的溶酶体酶亚类。硫酸酯酶使硫酸酯从各种底物，包括例如类固醇、碳水化合物、蛋白聚糖及糖脂裂解。所有已知真核硫酸酯酶都在其催化位点处含有半胱氨酸残基。硫酸酯酶活性需要将此半胱氨酸残基翻译后修饰成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)。半胱氨酸至FGly翻译后酶活化紧接于翻译之后，在硫酸酯酶靶向溶酶体之前，在内质网内在未折叠硫酸酯酶上发生(Dierks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11963-11968，1997)。催化此反应的甲酰甘氨酸产生酶是硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)。SUMF1中导致溶酶体硫酸酯酶中FGly形成异常的突变会导致人类的多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple SulfataseDeficiency，MSD)强调此独特翻译后修饰的重要性(Diez-Ruiz等人,Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.6:355-379,2005)。

因此，溶酶体硫酸酯酶制品的治疗有效性取决于制品中甘露糖-6-磷酸酯含量及活性酶的存在。

因此，本领域需要用于大规模制备治疗有效的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶以管理由此类溶酶体硫酸酯酶缺乏引起或与之相关的溶酶体储存病症的高效多产系统。

发明内容

本发明涉及如下发现：当内涵体酸化有缺陷的CHO-K1细胞系衍生物(称为G71)经工程改造成表现重组人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)时，经修饰G71细胞部分通过防止物质流失至制备用细胞系的溶酶体隔室中而产生高产率的活性高度磷酸化重组溶酶体硫酸酯酶。在一实施方式中，本发明提供一种END3互补群细胞系，其共表现重组人类SUMF1与重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，从而产生高产率的活性高度磷酸化酶。示例性细胞系为G71、G71S及其衍生物，所述衍生物保留G71的所需性质，即能够产生高产率的活性高度磷酸化重组溶酶体硫酸酯酶。共表现重组人类SUMF1与重组溶酶体硫酸酯酶的END3互补群修饰的CHO-K1细胞系的应用将尤其适用于制备用于通过酶替代疗法(ERT)来管理溶酶体储积疾病的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶。

在第一方面，本发明特征在于一种在END3互补群CHO细胞或其衍生物中产生能够达成治疗用途量的活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的新方法。在一宽泛实施方式中，所述方法包含以下步骤：(a)培养CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物；(b)制备能够在CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中表达活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物之第一哺乳动物表达载体；(c)制备能够在CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中表达重组人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物之第二哺乳动物表达载体；(d)以第一及第二表达载体转染CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物；(e)选择及克隆表达活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物之转染物；及(f)最优化用于制备高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的细胞培养加工方法。重组人类溶酶体硫酸酯酶选自下组：芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸(iduronate)-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶(sulfamidase)/肝素(heparin)-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

所述方法涉及以下步骤：将编码所有或部分溶酶体硫酸酯酶的cDNA及编码所有或部分人类SUMF1的cDNA转染至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，将分别能够表达编码活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶及人类SUMF1的第一及第二表达载体同时转染至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，将第一及第二表达载体依序转染至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，使用编码全长人类溶酶体硫酸酯酶的cDNA，而在其它实施方式中，使用编码其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA。在一些实施方式中，使用编码全长人类SUMF1的cDNA，而在其它实施方式中，使用编码其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA。在一些实施例中，使用多个表达载体将人类溶酶体硫酸酯酶及人类SUMF1 cDNA同时或依序转移至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，使用单个表达载体将人类溶酶体硫酸酯酶及人类SUMF1 cDNA同时转移至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在优选实施方式中，CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物为G71细胞系、G71S细胞系，或G71或G71S衍生物。

在优选实施方式中，所述方法包含自END3互补群CHO细胞系或其衍生物产生活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶，例如芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)或N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在特别优选的实施方式中，所述方法包含自END3互补群CHO细胞系或其衍生物产生活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。END3互补群细胞系为保留END3互补群细胞系性质(诸如内涵体酸化有缺陷)的任何经修饰的CHO细胞系。在优选实施方式中，CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物为G71细胞系、G71S细胞系，或G71或G71S衍生物。

在第二方面，本发明提供一种内涵体酸化缺乏的哺乳动物细胞系，其特征在于其能够产生能够达成溶酶体硫酸酯酶的治疗性使用量的活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶。在优选实施方式中，本发明提供称为G71、G71S或其衍生物的CHO-K1衍生的END3互补群细胞系，其能够产生高产率的活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶，藉此能够达成此等治疗性溶酶体硫酸酯酶的大规模产生。在更优选的实施方式中，细胞系以至少约0.5皮克/细胞/天、优选至少约0.75皮克/细胞/天、更优选至少约1.0皮克/细胞/天且甚至更优选至少约1.25皮克/细胞/天的量表达且分泌重组人类溶酶体硫酸酯酶。

END3互补群细胞系为保留END3互补群细胞系性质(诸如内涵体酸化有缺陷)的任何经修饰的CHO细胞系。在一实施方式中，END3互补群CHO细胞系衍生自G71或其衍生物且包含(a)重组人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)的表达载体及(b)重组人类溶酶体硫酸酯酶的表达载体，其中所述重组人类溶酶体硫酸酯酶选自下组：芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在优选实施方式中，END3互补群CHO细胞系包含重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表达载体。在更优选实施方式中，END3互补群CHO细胞系表达且分泌重组人类GALNS。在另一优选实施方式中，END3互补群CHO细胞系选自下组：克隆4、克隆5、克隆C6、克隆C2、克隆C5、克隆C7、克隆C10、克隆C11及克隆C30。在更优选的实施方式中，END3互补群CHO细胞系为克隆C2。在另一较优选实施方式中，END3互补群CHO细胞系适于在悬浮液中生长。

在第三方面，本发明提供根据本发明方法产生且藉此以能够达成溶酶体硫酸酯酶的治疗性使用量存在的重组人类溶酶体硫酸酯酶。溶酶体硫酸酯酶可为全长蛋白质或其片段、突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，必要时可对本发明的溶酶体硫酸酯酶或其片段、突变体、变体或衍生物进行修饰以增强其稳定性或药物动力学性质(例如聚乙二醇化、突变诱发、融合、结合)。在较优选实施方式中，酶为人类溶酶体硫酸酯酶、人类溶酶体硫酸酯酶的具有天然硫酸酯酶的生物活性的片段、或与人类溶酶体硫酸酯酶具有实质性氨基酸序列同源性的多肽。在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为源于或衍生自人类或哺乳动物序列的蛋白质。在其它实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为其缺乏会导致诸如以下人类疾病的酶：异染性脑白质营养不良(Metachromic Leukodystrophy)或MLD(即芳基硫酸酯酶A(ARSA))、马拉二氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)或MPS VI(即芳基硫酸酯酶B(ARSB))、亨特综合征(Hunter syndrome)或MPS II(即艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS))、圣菲利柏(Sanfilippo)A综合征或MPS IIIa(即磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH))、圣菲利柏D综合征或MPS IIId(即N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S))及莫奎欧A综合征或MPS IVa(即，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。在一尤其优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为其缺乏会导致莫奎欧A综合征或MPS IVa的酶(即N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。在另一尤其优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为其缺乏与诸如多种硫酸酯酶缺乏症或MSD的人类疾病相关的酶(即N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。

溶酶体硫酸酯酶也可源于或衍生自人类或哺乳动物序列。在本发明的其它实施方式中，在其各方面，溶酶体硫酸酯酶的氨基酸序列与人类或哺乳动物溶酶体硫酸酯酶氨基酸序列的相应部分一致。在其它实施方式中，多肽部分为来自人类或哺乳动物的天然溶酶体硫酸酯酶。在其它实施方式中，溶酶体硫酸酯酶多肽在至少约25、50、100、150或200个氨基酸的长度或整个多肽长度范围内与人类或哺乳动物酶的天然溶酶体硫酸酯酶氨基酸序列基本上同源(即氨基酸序列一致性为至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。人类GALNS的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:4中，其中氨基酸27至522对应于分泌性前体蛋白。在一些实施方式中，此GALNS酶包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:4的氨基酸27至522至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列；或与SEQID NO:4的氨基酸27至522一致的序列。GALNS酶优选保留对应于在分泌性前体蛋白位置53处的Cys(SEQ ID NO:4的氨基酸79)的催化位点氨基酸，其能够转化成C_α-甲酰甘氨酸。GALNS酶也可在活性位点空腔中保留其它氨基酸，包括至少1、2、3、4、5、6、7、8或所有带电荷氨基酸：Asp288、Asn289、Asp39、Asp54、His236、Lys140、His142、Lys310及α螺旋：Arg83。Sukegawa,Human Molecular Genetics,2000,第9卷,第9期1283-1290，以全文引用的方式纳入本文中，其描述使患者GALNS活性降低的其它突变且将各种突变的严重性与其在酶内的各别3维位置相关联。在其它实施方式中，待施用溶酶体硫酸酯酶的个体为人类。

在优选实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为由内涵体酸化缺乏的细胞系(例如CHO衍生的END3互补群细胞系)产生的高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶。END3互补群细胞系为保留END3互补群细胞系性质(诸如内涵体酸化有缺陷)的任何经修饰的CHO细胞系。在一优选实施方式中，CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物为G71细胞系、G71S细胞系，或G71或G71S衍生物。或者，溶酶体硫酸酯酶可由在允许高度磷酸化重组溶酶体硫酸酯酶以相对较高产率，例如以至少约0.5皮克/细胞/天、至少约0.75皮克/细胞/天、至少约1.0皮克/细胞/天或至少约1.25皮克/细胞/天的量表达及分泌的条件下培养的任何宿主细胞，例如任何CHO细胞或CHO细胞衍生系产生。

在更优选的实施方式中，重组人类溶酶体硫酸酯酶具有高含量磷酸化寡糖(即每条蛋白质链大于约0.25条、优选大于0.5条且更优选大于约0.75条双磷酸化寡甘露糖链)。

在一些实施方式中，本发明提供一种具有指定高含量磷酸化寡糖的重组人类溶酶体硫酸酯酶，例如GALNS。举例而言，溶酶体硫酸酯酶具有每条单体蛋白质链0.5至1.0条双磷酸化寡甘露糖链、或每条单体蛋白质链0.5至0.9条双磷酸化寡甘露糖链、或每条单体蛋白质链0.5至0.8条双磷酸化寡甘露糖链、或每条单体蛋白质链0.5至0.75条双磷酸化寡甘露糖链、或每条单体蛋白质链0.54至0.75条双磷酸化寡甘露糖链。涵盖其它类似范围，例如每条单体蛋白质链至少0.4、0.45、0.5、0.55、0.6或0.65条双磷酸化寡甘露糖链，至多每条单体蛋白质链0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.98或1.0条双磷酸化寡甘露糖链，或任何此等数目的任何组合。在优选实施方式中，酶为重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，例如SEQ ID NO:4的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

在一些实施方式中，重组人类溶酶体硫酸酯酶具有活性位点半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)转化的高百分比(即至少约50%、55%、60%或65%，优选至少约70%、75%、80%、85%、90%或95%)。在优选实施方式中，酶为活性重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)且活性位点半胱氨酸残基为在位置53(SEQ ID NO:4的位置79)的Cys。

在特定实施方式中，重组人类溶酶体硫酸酯酶具有高含量磷酸化寡糖，例如本文所述每条单体蛋白质链任何范围或含量的双磷酸化寡甘露糖链；以及活性位点半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)转化的高百分比，例如本文所述的任何百分比。在优选实施方式中，酶为活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，例如SEQ ID NO:4的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

在任何前述实施方式中，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝(Coomassie Blue)染色或通过SDS-毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)所测定，至少99.5%、至少99%、至少98.5%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%或至少65%的重组人类溶酶体硫酸酯酶(例如GALNS(SEQ ID NO:4))呈前体形式。

此外，例如GALNS(SEQ ID NO:4)的溶酶体硫酸酯酶视情况也展现大于在不表达重组人类SUMF1的宿主细胞(例如CHO细胞或CHO衍生的细胞)中产生的具有相同氨基酸序列的对照溶酶体硫酸酯酶的比活性至少约30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的比活性。

在任何前述实施方式中，例如GALNS(SEQ ID NO:4)的所述溶酶体硫酸酯酶展现至成成纤维细胞中的比摄取量(specific uptake)(K_uptake)为约0.1至10nM、或约0.1至7nM、或约0.5至5nM、或约1至5nM、或约1至3.5nM、约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM或约3.5nM、或任何此等数目的任何组合。

在任何前述实施方式中，至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%或至少约80%的重组人类溶酶体硫酸酯酶(例如GALNS(SEQ ID NO:4)结合甘露糖-6-磷酸酯受体柱。

根据此方面，提供溶酶体硫酸酯酶的任何此等实施方式的纯化制品，其中如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色或通过另一测定纯度的方法(例如在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE，随后用考马斯蓝或银染色；或通过HPLC(包括C4逆相(RP)或C3RP)或尺寸排阻层析(SEC)进行层析分离，)所测定，例如GALNS(SEQ ID NO:4)的溶酶体硫酸酯酶组分具有至少约90%、95%、97%、98%或99%的纯度。在一些实施方式中，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色或通过另一检测前体的方法(例如在还原条件下进行SDS-PAGE，以考马斯蓝或银染色；或通过HPLC(例如C4逆相(RP)、C3RP)或尺寸排阻层析(SEC)进行层析分离；或电泳分离与层析分离的组合，例如依次进行SDS-PAGE及毛细管凝胶电泳(SDS-CGE))所测定，纯化制品的显著量的溶酶体硫酸酯酶组分呈分泌性前体形式(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%前体)。

在特定实施方式中，纯化制品的溶酶体硫酸酯酶组分具有高含量磷酸化寡糖，例如本文所述的每条单体蛋白质链任何范围或含量的双磷酸化寡甘露糖链；以及活性位点半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)转化的高百分比，例如本文所述的任何百分比。在更特定的实施方式中，纯化制品具有如本文所述的K_uptake。

在相关方面，本发明提供含有本文所述的任何溶酶体硫酸酯酶或纯化制品、以及无菌医药学上可接受的稀释剂、载剂及/或赋形剂的无菌组合物。此等无菌组合物可采用溶液或视情况于小瓶中的可通过添加无菌稀释剂复原的冻干粉末形式。

在第四方面，本发明提供一种纯化由本发明方法产生的重组人类溶酶体硫酸酯酶的方法。在优选实施方式中，使用两柱方法(染料-配位体层析，例如蓝色-琼脂糖凝胶(Blue-Sepharose)；及阳离子交换层析，例如SE Hi-Cap)来纯化溶酶体硫酸酯酶，所述方法包含至少五个纯化步骤：(1)过滤收集物，即表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)及重组人类溶酶体硫酸酯酶的END3互补群CHO细胞系或其衍生物的培养基；(2)将经过滤收集物的pH值调整至pH4.5(以诱导污染性蛋白质沉淀)；(3)将经pH值调整的经过滤收集物装载于染料-配位体柱(例如蓝色-琼脂糖凝胶柱)上，洗涤所述柱且自所述柱洗脱溶酶体硫酸酯酶；(4)将来自染料-配位体柱的洗脱液装载于阳离子交换柱(例如SE Hi-Cap柱)上，洗涤所述柱且自所述柱洗脱溶酶体硫酸酯酶；及(5)超滤且渗滤来自阳离子交换的洗脱液。可选地，通过超滤将步骤(1)中过滤的收集物浓缩10-20倍，随后调整pH值。可选地，在调配缓冲液中调配步骤(5)中经超滤及渗滤的溶酶体硫酸酯酶。在特别优选的实施方式中，溶酶体酶为重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

在另一优选实施方式中，使用三柱方法(捕捉层析，例如阳离子交换SE Hi-Cap；中间层析，例如染料-配位体Capto Blue、锌螯合琼脂糖凝胶FF或Capto Adhere；及精制(polishing)层析，例如ToyoPearl丁基650M、苯基琼脂糖凝胶Hi-Sub或苯基琼脂糖凝胶Low-Sub)来纯化溶酶体硫酸酯酶，所述方法包含至少五个纯化步骤：(1)通过例如Sartocon卡匣(Cassettes)(30kDa，Hydrosart)超滤收集物，即表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)及重组人类溶酶体硫酸酯酶的END3互补群CHO细胞系或其衍生物的培养基；(2)将经过滤收集物的pH值调整至pH4.5(以诱导污染性蛋白质沉淀)；(3)将经pH值调整的经过滤收集物装载于捕获柱(例如Fractogel EMD SE Hi-CAP(M)阳离子交换柱)上，洗涤所述柱且自所述柱洗脱溶酶体硫酸酯酶；(4)将来自捕获柱的洗脱液装载于中间柱(例如染料-配位体CaptoBlue、锌螯合琼脂糖凝胶FF或Capto Adhere)上，洗涤所述柱且自所述柱洗脱溶酶体硫酸酯酶；及(5)将所述洗脱液装载于精制柱(例如ToyoPearl丁基650M、苯基琼脂糖凝胶Hi-Sub或苯基琼脂糖凝胶Low-Sub)上，洗涤所述柱且自所述柱洗脱溶酶体硫酸酯酶。在调配缓冲液中调配来自步骤(5)的经洗脱溶酶体硫酸酯酶。可选地，超滤来自步骤(5)的经洗脱溶酶体硫酸酯酶接着调配于调配缓冲液中。可选地，使来自步骤(4)中柱的溶酶体硫酸酯酶暴露于pH3.5的环境以达成低pH值病毒失活，随后装载于步骤(5)中的精制柱上。在特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

在另一优选实施方式中，溶酶体硫酸酯酶使用经设计以减少溶酶体硫酸酯酶的蛋白水解消化(即剪切(clipping))的不同三柱方法(捕捉或固定金属亲和层析(IMAC)，例如染料-配位体Capto Blue、锌螯合琼脂糖凝胶FF或Capto Adhere；中间层析，例如FractogelEMD SE Hi-Cap阳离子交换；及精制层析，例如ToyoPearl丁基650M、苯基琼脂糖凝胶Hi-Sub或苯基琼脂糖凝胶Low-Sub)纯化，所述方法包含至少六个纯化步骤：(1)过滤收集物，即表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)及重组人类溶酶体硫酸酯酶的哺乳动物细胞系，例如END3互补群CHO细胞系或其衍生物的培养基，经过滤收集物通过例如Sartocon卡匣(30kDa，Hydrosart)超滤/渗滤，产生浓缩过滤收集物，例如20倍浓缩，及木炭过滤所述浓缩过滤收集物；(2)将经木炭过滤的浓缩收集物装载于捕捉或IMAC柱(例如染料-配位体Capto Blue、锌螯合琼脂糖凝胶FF或Capto Adhere)上，在使溶酶体硫酸酯酶保留在捕获柱上的条件下洗捕获柱，且自捕获柱洗脱溶酶体硫酸酯酶；(3)可选地，用过滤器(例如Mustang Q过滤器)过滤捕获柱的洗脱液以去除病毒；(4)调整捕获柱的洗脱液或经过滤洗脱液的pH至酸性pH，例如pH4.5±0.1，接着过滤捕获柱的经调整为酸性pH的洗脱液或经过滤洗脱液；(5)将捕获柱的经过滤经调整为酸性pH的洗脱液或经过滤洗脱液装载于中间柱(例如Fractogel EMDSE Hi-CAP阳离子交换柱)上，在使溶酶体硫酸酯酶保留在中间柱上的条件下洗中间柱，且自中间柱洗脱溶酶体硫酸酯酶；(6)调整中间柱洗脱液的pH至低pH(例如pH3.5±0.1)以使病毒失活；及(7)将中间阳离子交换柱的低pH病毒失活的洗脱液装载于精制柱(例如疏水性相互作用层析(HIC)柱，例如ToyoPearl丁基650M、苯基琼脂糖凝胶Hi-Sub或苯基琼脂糖凝胶Low-Sub)上，在使溶酶体硫酸酯酶保留在精制柱上的条件下洗精制柱，且自精制柱洗脱溶酶体硫酸酯酶。在一个优选实施方式中，纯化过程中包括步骤(3)。在另一优选实施方式中，纯化过程中省略步骤(3)。可选地，(8)将步骤(7)的经洗脱溶酶体硫酸酯酶经缓冲液交换至制品中，例如包括(但不限于)本文所述的制品，诸如20mMNaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、30mM精氨酸HCl、2%(w/v)山梨糖醇(pH5.4)，且将制品中经洗脱溶酶体硫酸酯酶的浓度调整至适当浓度，例如3mg/mL；(9)通过经病毒过滤器及DNA过滤器过滤来去除存在经纯化溶酶体硫酸酯酶的制品中的任何残余病毒及DNA；及(10)非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯20(PS20或吐温-20)添加至经纯化溶酶体硫酸酯酶的制品中。经纯化溶酶体硫酸酯酶的最终制品(散装药物)储存在2-8℃或冷冻。在特别优选的实施方式中，纯化过程中包括步骤(8)至(10)。在特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

在一些实施方式中，在步骤(1)中在约6.5的pH值下收集收集物。在一些实施方式中，步骤(1)中的木炭过滤器为Zeta Plus R55活性碳过滤器。在一些实施方式中，步骤(2)中之捕获柱为Zn-IMAC柱。在一些实施方式中，Zn-IMAC柱为Zn螯合琼脂糖凝胶FF柱。在一些实施例中，步骤(3)中的过滤器为Mustang Q过滤器。在一些实施例中，来自步骤(2)或(3)的洗脱液或经过滤洗脱液的酸性pH值在步骤(4)中调整至约4.5±0.1。在一些实施例中，步骤(5)中的中间柱为阳离子交换柱。在一些实施例中，阳离子交换柱为Fractogel EMD SE Hi-Cap柱。在一些实施方式中，步骤(6)的来自中间柱的洗脱液的低pH值在步骤(6)中调整至约3.5±0.1。在一些实施方式中，步骤(7)中的精制柱为疏水性相互作用层析(HIC)柱。在一些实施方式中，HIC柱为ToyoPearl丁基650M柱。

在一些实施方式中，制品包含20mM NaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、30mM精氨酸HCl、2%(w/v)山梨糖醇(pH5.4)。在一些实施方式中，非离子表面活性剂为聚山梨醇酯20(PS20)。在一些实施方式中，制品中溶酶体硫酸酯酶的浓度调整至约3mg/mL。在一些实施方式中，病毒过滤器为DV20过滤器且DNA过滤器为Mustang Q过滤器。在一些实施方式中，添加至制品中的非离子表面活性剂为聚山梨醇酯20(PS20)，最终浓度为0.01%(w/v)。

在第五方面，本发明提供一种活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性突变体、变体或衍生物的纯化制品，其适用于治疗罹患由GALNS酶缺乏引起(例如第IVa型黏多糖病(MPS IVa)或莫奎欧A综合征)或与GALNS酶缺乏相关(例如多种硫酸酯酶缺乏症(MSD))的溶酶体储积疾病的个体。在优选实施方式中，活性高度磷酸化重组人类GALNS的纯化制品具有GALNS酶组分，其具有(a)至少约90%、95%、97%、98%或99%的纯度，如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色或银染色所测定；(b)位置53的半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)(SEQ ID NO:4的位置79)至少约80%、85%、90%或95%的转化率；(c)在位置178及397的天冬酰胺残基的N-连接糖基化，其中与位置178的天冬酰胺残基连接的一些寡甘露糖链经双磷酸化；(d)每条单体蛋白质链0.5至1.0、或0.5至0.9、或0.5至0.8、或0.5至0.75、或0.54至0.75条双磷酸化寡甘露糖链(例如每条单体蛋白质链至少0.4、0.45、0.5、0.55、0.6或0.65且多达0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.98或1.0条双磷酸化寡甘露糖链、或任何此等数目的任何组合)；及(e)至少65%或至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%)的GALNS酶呈前体形式，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色或通过SDS-毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)所测定。此外，GALNS酶可视情况(f)展现大于在不表达重组人类SUMF1的宿主细胞(例如CHO细胞或CHO衍生的细胞)中产生的具有相同氨基酸序列的对照GALNS酶的比活性至少约30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的比活性。可选地，GALNS酶展现至成纤维细胞中的比摄取量(K_uptake)为约0.1至10nM、或约0.1至7nM、或约0.5至5nM、或约1至5nM、或约1至3.5nM、约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM或约3.5nM、或任何此等数目的任何组合。

在还原条件下进行SDS-PAGE时或如通过SDS-CGE所测定，经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS由以下组成：约55-60kDa的主带(即占可见蛋白质至少约75%、或至少80%、优选至少约85%、更优选至少约90%、且甚至更优选至少约95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的前体人类GALNS)及在约39kDa及约19kDa的次带(即占可见蛋白质小于约25%、小于约20%、优选小于约15%、更优选小于约10%、且甚至更优选小于约5%、小于约3%、小于约2%、小于约1.5%、小于约1%或小于约0.5%的成熟或经加工人类GALNS)。在特别优选的实施方式中，在还原条件下进行SDS-PAGE时或如通过SDS-CGE所测定，经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS基本上由以下组成：约55-60kDa的单一带(即前体人类GALNS)。在一实施方式中，经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS适用于治疗MPS IVa或莫奎欧A综合征。在一实施方式中，经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS适用于治疗MSD。

在第六方面，本发明提供一种治疗完全或部分由溶酶体硫酸酯酶缺乏引起或与溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的疾病的方法。所述方法包含施用由本发明方法产生的治疗性重组人类溶酶体硫酸酯酶，其中所述溶酶体硫酸酯酶与MPR受体结合且跨越细胞膜输送，进入细胞中且递送至细胞内的溶酶体。

在一实施方式中，所述方法包含治疗罹患溶酶体硫酸酯酶缺乏症的个体，其包含向有需要的个体施用治疗有效量的所述溶酶体硫酸酯酶，其中所述溶酶体硫酸酯酶为由CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物产生的重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，所述方法包含单独或与医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合施用治疗性重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物。优选实施方式包括针对待治疗个体(优选哺乳动物且最优选人类)的需要来最优化剂量以最有效地改善溶酶体硫酸酯酶缺乏症。

此等治疗性溶酶体硫酸酯酶尤其适用于例如治疗罹患由溶酶体硫酸酯酶缺乏引起的溶酶体储积疾病的患者，诸如罹患异染性脑白质营养不良或MLD、VI型黏多糖病(MPSVI)或马拉二氏综合征、II型黏多糖病(MPS II)或亨特综合征、IIIa型黏多糖病(MPS IIIa)或圣菲利柏A综合征、IIId型黏多糖病(MPS IIId)或圣菲利柏D综合征及IVa型黏多糖病(MPS IVa)或莫奎欧A综合征的患者。在特别优选的实施方式中，溶酶体储积疾病为MPS IVa或莫奎欧A综合征且溶酶体硫酸酯酶为重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在其它实施方式中，本发明提供包含引起溶酶体储积疾病的缺乏的溶酶体硫酸酯酶及医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的医药组合物。

在另一实施方式中，所述方法包含治疗罹患与一种或多种溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的溶酶体储积疾病的个体，所述治疗包含向有需要的个体施用治疗有效量的溶酶体硫酸酯酶，其中所述溶酶体硫酸酯酶为由CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物产生的重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，所述方法包含单独或与医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合施用治疗性重组人类GALNS酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物。在特别优选的实施方式中，溶酶体储积疾病为多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)。

在特别优选的实施方式中，CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物为G71细胞系、G71S细胞系，或其G71或G71S衍生物。

在另一实施方式中，本发明提供一种酶替代疗法的方法，所述方法通过向需要所述酶替代疗法的个体施用治疗有效量的溶酶体硫酸酯酶来达成，其中患者的细胞具有含有不足以防止或减少对细胞的损害量的溶酶体硫酸酯酶的溶酶体，藉此足以防止或减少对细胞的损害量的溶酶体硫酸酯酶进入溶酶体中。细胞可在CNS之内或之外或无需由毛细管壁与血液分开，所述毛细管壁的内皮细胞通过紧密接合而紧密密封以防止活性剂扩散。

在一特定实施方式中，本发明提供包含具有生物活性的活性重组人类溶酶体硫酸酯酶的组合物及医药组合物，所述活性重组人类溶酶体硫酸酯酶在目标溶酶体中减少、缺乏或不存在，且施用于个体。优选活性人类溶酶体硫酸酯酶包括(但不限于)芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺酰胺酶/乙酰肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。在优选实施方式中，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶为活性重组人类溶酶体硫酸酯酶。

在优选实施方式中，本发明提供一种通过向罹患MPS IVa或莫奎欧A综合征或MSD的个体施用治疗有效量的本文所述的任何重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、纯化制品及/或无菌组合物来治疗所述个体的方法。

在更优选的实施方式中，本发明提供一种通过向罹患MPS IVa或莫奎欧A综合征或MSD的个体施用治疗有效量的由END3互补群细胞产生的重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)来治疗所述个体的方法，其中所述重组人类GALNS的活性位点半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化程度较高(即至少约50%、优选至少约70%、更优选至少约90%，甚至更优选至少约95%转化率)且所述重组人类GALNS的磷酸化程度较高(即每条蛋白质链大于约0.25条、优选大于0.5条且更优选大于约0.75条双磷酸化寡甘露糖链)。

在特别优选的实施方式中，本发明提供一种通过向罹患MPS IVa或莫奎欧A综合征或MSD的个体施用治疗有效量的具有GALNS酶组分的经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS制品来治疗所述个体的方法，所述GALNS酶组分具有：(a)至少约90%、95%、97%、98%或99%的纯度，如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色或银染色所测定；(b)位置53的半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)(SEQ ID NO:4的位置79)至少约80%、85%、90%或95%的转化率；(c)每条单体蛋白质链0.5至1.0、或0.5至0.9、或0.5至0.8、或0.5至0.75、或0.54至0.75条双磷酸化寡甘露糖链(例如每条单体蛋白质链至少0.4、0.45、0.5、0.55、0.6或0.65且至多0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.98或1.0条双磷酸化寡甘露糖链、或任何此等数目的任何组合)；及(d)至少65%或至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%)的GALNS酶呈前体形式，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色或通过SDS-毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)所测定。此外，GALNS酶视情况还可(e)展现大于在不表达重组人类SUMF1的宿主细胞(例如CHO细胞或CHO衍生的细胞)中产生的具有相同氨基酸序列的对照GALNS酶的比活性至少约30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的比活性。可选地，GALNS酶展现至成纤维细胞中的比摄取量(K_uptake)为约0.1至10nM、或约0.1至7nM、或约0.5至5nM、或约1至5nM、或约1至3.5nM、约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM或约3.5nM、或任何此等数目的任何组合。

在还原条件下进行SDS-PAGE时或如通过SDS-CGE所测定，经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS由以下组成：约55-60kDa的主带(即占可见蛋白质至少约75%、或至少约80%、优选至少约85%、更优选至少约90%、且甚至更优选至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约98.5%、至少约99%或至少约99.5%的前体人类GALNS)及在约39kDa及约19kDa的次带(即占可见蛋白质小于约25%、或小于约20%、优选小于约15%、更优选小于约10%、且甚至更优选小于约5%、小于约3%、小于约2%、小于约1.5%、小于约1%或小于约0.5%的成熟或经加工人类GALNS)。在还原条件下进行SDS-PAGE时或如通过SDS-CGE所测定，在更特别优选的实施方式中，经纯化活性高度磷酸化重组人类GALNS基本上由约55-60kDa的单一带(即前体人类GALNS)组成。

在一些实施方式中，个体罹患MPS IVa或莫奎欧A综合征。在一些实施方式中，个体罹患MSD。

还涵盖优选由本发明方法产生的本发明的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶在制备用于治疗上述溶酶体储积疾病的药剂中的相应用途。

在第七方面，本发明提供医药组合物，其包含如上文所描述的适用于治疗完全或部分由此溶酶体硫酸酯酶缺乏引起或与此溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的疾病的活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶，及一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。在优选实施方式中，所述医药组合物包含通过本发明方法产生的活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物，及一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。此等医药组合物可适于通过若干途径，诸如鞘内、非经肠、表面、鼻内、吸入或经口投药来施用。在优选实施方式中，医药组合物适于非经肠投药。本方面范畴内涵盖特征在于编码全长溶酶体硫酸酯酶或其片段、突变体、变体或衍生物的核酸序列的实施方式，其可在活体内投入受溶酶体酶缺乏影响的细胞中。

在更优选的实施方式中，医药组合物包含通过本发明方法产生的活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物，及一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂于包含一种或多种缓冲剂及一种或多种稳定剂的制品中。在某些实施方式中，所述组合物包含可有效减少所述GALNS酶去磷酸化的量的磷酸盐缓冲剂；及稳定量的一种或多种选自下组的稳定剂：氨基酸盐、氨基酸缓冲剂、表面活性剂及多元醇；其中所述制品的pH值为约5.0-5.8。

在一些实施方式中，GALNS酶包含与SEQ ID NO:4的氨基酸27至522至少95%一致的氨基酸序列，且具有：(i)至少约95%的纯度，如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色所测定，(ii)位置53的半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)至少约80%的转化率，及(iii)可选地，每条单体蛋白质链0.5至0.8条双磷酸化寡甘露糖链，其中至少70%的所述GALNS酶呈前体形式，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色所测定。在一些实施方式中，GALNS酶的纯度为至少95%，如通过RP-HPLC所测定。在一些实施方式中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的GALNS酶呈前体形式，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色所测定。在一些实施方式中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的GALNS酶呈前体形式，如通过SDS-毛细管凝胶电泳所测定。在一些实施方式中，GALNS酶在位置53的半胱氨酸残基有至少约90%转化成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)。在一些实施方式中，50%至80%GALNS酶结合至甘露糖-6-磷酸酯受体柱。在一些实施方式中，GALNS酶展现至成纤维细胞中的比摄取量(K_uptake)为约1至5nM。在一些实施方式中，GALNS酶展现至成纤维细胞中的比摄取量(K_uptake)为约1至3.5nM。

制品中GALNS或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的浓度为约0.1至10mg/mL、优选约0.5至5mg/mL且更优选约0.5至1.5mg/mL。

在某些实施方式中，制品包含可有效减少所述GALNS酶去磷酸化的量的磷酸盐缓冲剂。在相关实施方式中，磷酸盐缓冲剂为NaH₂PO₄或其等效物。在另一实施方式中，制剂另外包含第二缓冲剂。在一实施方式中，第二缓冲剂为乙酸盐缓冲剂。在另一实施方式中，乙酸盐缓冲剂为NaOAc/HOAc或其等效物。示例性缓冲剂更详细描述于发明详述中。

考虑到制剂中NaOAc/HOAc或其等效物的浓度为约5至100mM、优选约5至50mM、且更优选约10至30mM。在一相关实施方式中，制剂中NaH₂PO₄或其等效物的浓度为约5至100mM、优选约25至100mM、且更优选约25至75mM。在某些实施方式中，制剂的pH值为约pH4.5-6.5、优选约pH5.0-6.0、且更优选约pH5.0-5.8。

在另一实施方式中，制剂包含稳定量的一种或多种选自下组的稳定剂：氨基酸盐、氨基酸缓冲剂、表面活性剂及多元醇。在一实施方式中，稳定剂为精氨酸或组氨酸盐或缓冲剂，可选为精氨酸盐酸盐。在一相关实施方式中，稳定剂为聚山梨醇酯，可选为聚山梨醇酯20。在另一实施方式中，稳定剂为三元或三元以上糖醇，可选为山梨糖醇。示例性稳定剂更详细描述于发明详述中。

在某些实施方式中，稳定剂选自精氨酸盐酸盐或其等效物、吐温-20(聚山梨醇酯20)或其等效物、及山梨糖醇或其等效物。在一些实施方式中，制剂中精氨酸盐酸盐或其等效物的浓度为约5至200mM、优选约10至100mM、且更优选约10至50mM。在另一实施方式中，制剂中吐温-20或其等效物的浓度为约0.001至1.0%(w/v)、优选约0.005至0.2%(w/v)、且更优选约0.005至0.015%(w/v)。在一相关实施方式中，制剂中山梨糖醇或其等效物的浓度为约0.1至10%(w/v)、优选约0.5至5%(w/v)、且更优选约1.0至3.0%(w/v)。在一实施方式中，制剂包含精氨酸盐或缓冲剂、聚山梨醇酯及多元醇。

本发明另外提供一种防止重组人类GALNS酶去磷酸化的方法，其包含混合GALNS酶与磷酸盐缓冲剂以使磷酸盐缓冲剂的最终浓度介于约25mM与75mM之间。在示例性实施方式中，例如当在室温(例如25℃)下储存1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月之后测试时，相较于相同酶于1mM磷酸盐缓冲液中的制剂，去磷酸化的量得以降低。

在特别优选的实施方式中，医药组合物包含通过本发明方法产生的活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物，及一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂于包含NaOAc/HOAc及NaH₂PO₄作为缓冲剂，及精氨酸盐酸盐、吐温-20(聚山梨醇酯20)及山梨糖醇作为稳定剂的制剂中。制剂中GALNS的浓度为约1.0+/-0.5mg/mL。制剂中NaOAc/HOAc的浓度为约20+/-10mM，且制剂中NaH₂PO₄的浓度为约50+/-25mM。制剂的pH值为pH5.4+/-0.4。制剂中精氨酸盐酸盐的浓度为约30+/-20mM。制剂中吐温-20的浓度为约0.01+/-0.005%(w/v)。制剂中山梨糖醇的浓度为约2.0+/-1.0%(w/v)。

在另一方面，本发明提供一种检测溶酶体硫酸酯酶活性的方法，其包含(a)在促进维持软骨细胞分化的条件下培养来自罹患溶酶体硫酸酯酶缺乏症的患者(例如罹患莫奎欧综合征的患者)的软骨细胞；(b)使所述软骨细胞与降解硫酸角质素(keratan sulfate)的溶酶体硫酸酯酶接触；及(c)检测细胞中硫酸角质素的含量，其中相较于未与溶酶体硫酸酯酶接触的细胞，与溶酶体硫酸酯酶接触的细胞中的硫酸角质素含量降低指示溶酶体硫酸酯酶活性。在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些实施方式中，在包含胰岛素生长因子1(IGF1)、转型生长因子β(TGF-β)、运铁蛋白(transferrin)、胰岛素及抗坏血酸的培养基中进行培养。在一些实施方式中，通过共焦显微术或经由与抗硫酸角质素抗体结合来检测硫酸角质素。所述方法可用任何溶酶体硫酸酯酶来进行，所述酶包括天然存在或重组人类酶或其片段或变体，包括包含与无信号序列的前体人类酶或其成熟形式至少80%、85%、90%、95%或100%一致的氨基酸序列的变体。

在另一方面，本发明提供一种用于测量重组人类溶酶体酶降解天然底物的活性的基于细胞的试验。所述方法包含(a)在溶酶体酶天然底物累积的条件下培养溶酶体酶缺乏的经分离人类细胞；(b)使所述细胞与所述溶酶体酶接触；(c)溶解所述细胞；(d)向细胞溶解产物中添加酶，所述酶(i)对所述天然底物具有特异性，且(ii)使小寡糖自所述天然底物裂解；(e)以可检测部分标记所述小寡糖；(f)可选分离所述经标记的小寡糖；(g)检测所述经标记的小寡糖；及(h)通过比较(i)来自与所述溶酶体酶接触的细胞的经标记小寡糖的量与(ii)来自未与所述溶酶体酶接触的细胞的经标记小寡糖的量来测定所述溶酶体酶降解天然底物的活性，其中(h)(i)相较于(h)(ii)降低指示所述溶酶体酶降解天然底物的活性。在一实施方式中，小寡糖为单糖、双糖或三糖。在一相关实施方式中，小寡糖为双糖。在一些实施方式中，溶酶体酶选自下组：芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些实施方式中，溶酶体酶为α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase，IDU)。在一些实施方式中，溶酶体酶为酸性α-葡糖苷酶(α-glucosidase，GAA)。在一些实施方式中，溶酶体酶为β-葡萄糖苷酸酶(β-glucoronidase，GUSB)。在一些实施方式中，溶酶体酶为β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，GLB1)。

可用于基于细胞的试验中的合适人类细胞包括待测试的因溶酶体酶缺乏而可累积溶酶体酶天然底物的任何人类细胞。举例而言，可使用天然展现活性完全(100%)或部分缺乏(例如活性降低30%、50%、70%、80%、90%、95%或95%以上)的细胞。可使用表达活性减弱的突变酶的细胞、或源于罹患溶酶体储积疾病(例如黏多糖病)的患者的细胞。可使用例如经由向编码基因或其启动子或其它调控区引入突变而经重组改变以剔除或降低溶酶体酶活性的细胞。可使用经处理以降低溶酶体酶活性(例如用反义物(antisense)或RNAi处理以降低酶表达)的细胞。

使小寡糖自碳水化合物裂解(消化)且对溶酶体酶的天然底物具有“特异性”(即主要消化所述天然底物)的适合酶可由普通技术人员加以选择。举例而言，对于检测GALNS或GLB1(降解硫酸角质素的酶)的活性，步骤(d)的酶可为角质素酶II(Keratanase II)或主要对硫酸角质素起作用的任何酶。作为另一实例，对于检测IDU、ARSB、IDS或GUSB(降解硫酸皮肤素(dermatan sulfate)的酶)，步骤(d)的酶可为软骨素酶ABC(Chondroitinase ABC)或主要对硫酸皮肤素起作用的任何酶。作为另一示例，对于检测IDU、IDS、SGHS、G6S或GUSB(降解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)的酶)，步骤(d)的酶可为乙酰肝素酶(Heparanase)I或乙酰肝素酶II或两者。作为另一示例，对于检测GAA(降解肝糖的酶)，步骤(d)的酶可为α-淀粉酶或主要对肝糖起作用的任何酶。

这种基于细胞的方法在检测溶酶体酶活性方面具有极大灵敏性。在一些实施方式中，当溶酶体酶的浓度低至约10nM、或约5nM、或约1nM、或约0.75nM、或约0.5nM、或约0.25nM、或约0.1nM、或约0.05nM、或约0.01nM、或约0.005nM、或约1pM、或约0.5pM时，溶酶体酶活性可检测。

本发明的其它特征及优点将根据以下发明详述而变得显而易知。然而，应了解尽管发明详述及特定实施例指示本发明的优选实施方式，但其仅以说明方式给出，因为根据此发明详述，在本发明的精神及范畴内的各种变化及修改将变得为本领域技术人员显而易知。

附图简要说明

图1描述人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

图2描述人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

图3描述人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。

图4描述人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。经加工的GALNS中不存在N端含26个氨基酸的信号肽。

图5描述经加工的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)(SEQ ID NO:5)的结构及特征。1)加工前酶的分子量为约55kDa，2)转化成C_α-甲酰甘氨酸的半胱氨酸在位置53处，3)溶酶体中的经加工形式由二硫桥键联接，4)2N连接的糖基化位点在位置178及397处，且5)BisP见于Asn178而非Asn397上。

图6展示来自用人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)与人类GALNS表达载体共转染的G71S细胞的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表达。(A)在96孔中针对活性GALNS的G71S克隆筛检。(B)G71S克隆GALNS产率，以皮克/细胞/天计。

图7说明用于大规模产生表达人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及其变体的G71S细胞的WAVE生物反应器控制器的示意图。

图8展示在4℃(菱形)或-70℃(三角形)下储存后，经纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)酶活性的稳定性。

图9展示依次通过(A)蓝色琼脂糖凝胶6速流层析及(B)Fractogel SE Hi-CAP层析对人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的纯化。纯度通过SDS-PAGE的考马斯蓝染色(左)及通过使用抗GALNS(IVA)抗体进行的蛋白质印迹法(右)加以测定。

图10展示通过超滤/渗滤(UF/DF)、Fractogel SE Hi-Cap层析、Zn螯合琼脂糖凝胶层析及ToyoPearl丁基650M层析对人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的纯化。纯度通过SDS-PAGE的考马斯蓝染色(左上)及通过使用抗GALNS抗体(右上)、抗组织蛋白酶L抗体(左下)及抗CHOP(中国仓鼠卵巢细胞蛋白)(右下)进行的蛋白质印迹法加以测定。

图11展示用于第I/II阶段过程(左边)及第III阶段过程(右边)的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)回收及纯化过程的流程图。

图12展示根据第I/II阶段过程(泳道3)或第III阶段过程(泳道5)纯化的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的比较。通过在还原条件下进行SDS-PAGE来分离5微克(5μg)经纯化GALNS，且凝胶用考马斯蓝染色。泳道1对应于15μL SeeBlue Plus2标记。以kDa计的分子量在经染色凝胶左边加以指示。

图13显示观测到在经IDU处理的GM01391细胞中硫酸皮肤素底物的量剂量依赖性降低。

图14显示观测到在经ARSB处理的GM00519细胞中硫酸皮肤素底物的量剂量依赖性降低。

图15展示经培养的滑膜细胞对未标记(圆圈)或与A488(正方形)或A555(三角形)结合的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的摄取。

图16展示在5℃、25℃或40℃下储存1或2个月后经纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的稳定性，如在包含15mM精氨酸盐酸盐、30mM精氨酸盐酸盐、15mM NaCl或30mM NaCl(图中分别标为51、52、54或55)的制剂中在pH5.0、pH5.4或pH5.8(图中分别标为A、B或C)下所指示。通过在储存后制剂中GALNS聚集体的峰面积百分比(%)来度量稳定性，所述百分比如通过尺寸排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)所测定。

图17展示在5℃、25℃或40℃下储存2个月后经纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)酶活性的稳定性，如在包含15mM精氨酸盐酸盐、30mM精氨酸盐酸盐、15mM NaCl或30mM NaCl(图中分别标为为51、52、54或55)的制剂中在pH5.0、pH5.4或pH5.8(图中分别标为A、B或C)下所指示。

图18展示在5℃、25℃或40℃下储存2个月后经纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的糖基化概况，如在如所指示的包含15mM精氨酸盐酸盐、30mM精氨酸盐酸盐、15mM NaCl或30mM NaCl的制剂中在pH5.0、pH5.4或pH5.8下所指示。在用PNG酶F消化GALNS酶以裂解天冬酰胺N-连接寡糖之后，通过毛细管电泳(CE)测量双磷酸化甘露糖7(BPM7)的百分比。参考物指示在5℃、25℃或40℃下储存2个月的参考批次GALNS的BPM7百分比，如在包含100mM磷酸盐缓冲剂的制剂中所指示。

图19展示在5℃、25℃或40℃下储存2个月后经纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的稳定性，如在包含15mM精氨酸盐酸盐、30mM精氨酸盐酸盐、15mM NaCl或30mMNaCl(图中分别标为51、52、54或55)的制剂中在pH5.0、pH5.4或pH5.8(图中分别标为A、B或C)下所指示。通过在储存之后制剂中GALNS酶的峰面积百分比(%)来度量GALNS酶的稳定性，所述百分比如逆相高效液相层析(RP-HPLC)所测定。

发明详述

本发明涉及发现一种方法，其使对大规模制备重组溶酶体硫酸酯酶的需要与对高效靶向溶酶体且因此具治疗有效性的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶产物的需求一致。

溶酶体酶制品的治疗有效性视彼制中甘露糖-6-磷酸酯的含量而定。通过内质网及早期高尔基体(Golgi)中的翻译后修饰来将磷酸酯添加至目标糖蛋白中。折叠的溶酶体酶显示由寡糖修饰酶所识别的独特三级决定子(tertiary determinant)。所述决定子由一组逐一隔开的赖氨酸构成且见于大多数溶酶体酶上，即使不存在一级序列同源性。修饰酶UDP-GlcNAc磷酸转移酶与蛋白质决定子结合且向寡糖上邻近于结合位点的末端甘露糖残基的6-位置添加GlcNAc-1-磷酸酯；第二酶磷酸二酯α-GlcNAc酶接着裂解GlcNAc-磷酸酯键以产生甘露糖-6-磷酸酯末端寡糖(Canfield等人,美国专利第6,537,785号)。甘露糖-6-磷酸酯修饰的目的在于使溶酶体酶自分泌途径转向细胞内的溶酶体途径。携带甘露糖-6-磷酸酯的酶由反式高尔基体中的MPR结合且运送至溶酶体而非细胞表面。

除在溶酶体酶寡糖上存在甘露糖-6-磷酸酯标记外，酶的溶酶体运送视自反式高尔基体堆栈的末端出现的运输内涵体的酸化而定。用可扩散碱性分子化学淬灭此等内涵体内的酸性环境会使囊泡内含物(包括溶酶体酶)排出进入细胞外环境中(Braulke等人,Eur.J. Cell Biol.43(3):316-321,1987)。酸化需要包埋在内涵体膜内的特定液泡ATP酶(Nishi等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3(2):94-103,2002)。预期此ATP酶的失效会以损害溶酶体运送为代价来增加溶酶体酶的分泌。预期携带液泡ATP酶缺陷的制备用细胞系将会防止磷酸化重组酶非产生性地转移至细胞内溶酶体隔室。

1984年，产生并表征内涵体酸化有特定缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞突变体(Park等人,Somat.Cell Mol.Genet.17(2):137-150,1991)。对CHO-K1细胞进行化学突变诱发且针对在毒素存在下在高温下的存活进行选择。此等毒素需要内涵体酸化来完全表达其致死性(Marnell等人,J. Cell.Biol.99(6):1907-1916,1984)。在先前研究中，选择作用机制不同的两种毒素的混合物以避免选择毒素特异性抗性。原理为尽管导致对一种特定毒素具有抗性的偶然突变的概率较小，但对两种完全不同的毒素具有特异性的两种同时偶然突变的概率为不存在的。在高温下进行选择以允许温度敏感性突变。此遗传筛检产生两种突变体，其中一种称为G.7.1(G71)，其在高温下对毒素具有抗性。G71中的损害并非归因于两种毒素的摄取或作用机制，而由克隆不能在高温下酸化内涵体所引起。这种不能在许可温度(34℃)下也显现，但程度较轻。还发现G71细胞在高温下为铁营养缺陷型，尽管自培养基正常摄取转铁蛋白(Timchak等人,J. Biol.Chem.261(30):14154-14159,1986)。因为铁仅在低pH值下自运铁蛋白释放，所以尽管运铁蛋白摄取正常，但仍存在铁营养缺陷指示内涵体酸化障碍。另一研究证明酸化缺陷主要在内涵体而非溶酶体中显现(Stone等人,J.Biol.Chem.262(20):9883-9886,1987)。关于G71的数据与突变导致负责内涵体酸化的液泡ATP酶去稳定的结论一致。去稳定在高温(39.5℃)下最明显，但即便在较低温度(34℃)下还部分表达。对两种内源性溶酶体酶组织蛋白酶D(cathepsin D)及α-葡糖苷酶在G71细胞中的运输的研究(Park等人,Somat.Cell Mol.Genet.17(2):137-150,1991)显示两种酶在高温下均定量分泌，且酶的糖基化未受影响。磷酸化酸性α-葡糖苷酶的分泌在非许可温度下显著增强。

溶酶体硫酸酯酶制品的治疗有效性不仅视甘露糖-6-磷酸酯的含量而定，而且视彼制品中活性酶的存在而定。所有已知硫酸酯酶都在其催化位点处含有半胱氨酸残基；此半胱氨酸残基经翻译后修饰成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)以使酶活化。由硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)催化的此半胱氨酸至FGly翻译后酶活化紧接于翻译之后，在硫酸酯酶靶向溶酶体之前，在内质网内在未折叠硫酸酯酶上发生(Dierks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11963-11968,1997)。SUMF1中导致溶酶体硫酸酯酶中FGly形成异常的突变会导致人类的多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)强调此独特翻译后修饰的重要性(Diez-Ruiz等人,Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.6:355-379,2005)。

因此，G71细胞，即内涵体酸化有缺陷的突变CHO细胞共表达重组人类硫酸酯酶修饰酶(SUMF1)与人类溶酶体硫酸酯酶的能力为大规模产生适用于管理由此等溶酶体硫酸酯酶缺乏引起或与此等溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的溶酶体储存病症的活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶提供机制。

I.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属技术中的普通技术人员通常理解相同的含义。以下参考书目为本领域技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY(第2版1994)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker编,1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS,5TH ED.,R.Rieger等人(编),Springer Verlag(1991)；及Hale及Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。

本文中所引用的各公开、专利申请、专利及其它参考文献在不与本发明不一致的限度内以全文引用的方式纳入本文。

此处应注意，除非上下文中另外明确规定，否则如本说明书及随附权利要求中所使用，单数形式的“一”及“所述”包括复数个指示物。

如本文所用，除非另有规定，否则以下术语具有属于其的含义。

“等位基因变体”指某一基因占据相同遗传基因座(genetic locus)的两种或两种以上多态性形式的任一种。等位基因变异通常经由突变产生，且可导致群体内的表型多态性(phenotypic polymorphism)。基因突变可为沉默的(即编码的多肽无变化)或可编码氨基酸序列改变的多肽。“等位基因变体”也指源于遗传等位基因变体的mRNA转录物的cDNA，以及由其编码的蛋白质。

“扩增”指复制多核苷酸序列且从而扩大为较多数目多核苷酸分子所用的任何手段，例如通过反转录、聚合酶链反应及连接酶链反应。

若序列为第一序列的多核苷酸与序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则相对于第二序列而言，第一序列为“反义序列”。

“cDNA”指呈单链或双链形式的与mRNA互补或一致的DNA。

在本文中使用熟知记法来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端为5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。5'至3'添加核苷酸至新生RNA转录物的方向称为转录方向。序列与mRNA相同的DNA链称为“编码链”；在序列与自DNA转录的mRNA相同的DNA链上且位于5'至RNA转录物的5'端的序列称为“上游序列”；在序列与RNA相同的DNA链上且为3'至编码RNA转录物的3'端的序列称为“下游序列”。

“互补”指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑兼容性或所述表面匹配在一起。因此，所述两个分子可描述为互补的，且此外，接触面特征彼此互补。若第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合搭配物的核苷酸序列一致，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5'-TATAC-3'的多核苷酸与序列为5'-GTATA-3'的多核苷酸互补。若与对象核苷酸序列互补的序列与参考核苷酸序列基本上一致，则核苷酸序列与参考核苷酸序列“基本上互补”。

“保守性取代”指用功能类似氨基酸取代多肽中的氨基酸。以下六组各自含有对于彼此而言为保守性取代的氨基酸：

※1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

※2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

※3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

※4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

※5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

术语“片段”在关于多肽使用时指由于在蛋白质的N端或C端或两端截断及/或通过缺失蛋白质的内部部分或区域而短于全长多肽的多肽。多肽的片段可通过本领域中已知的方法产生。

术语“突变体”在关于多肽使用时指蛋白质的一个或多个氨基酸已经不同氨基酸取代的多肽。氨基酸取代可为如上定义的保守性取代，或可为非保守性取代。突变多肽可通过本领域中已知方法产生。

术语“衍生物”在关于多肽使用时指通过如(但不限于)以下技术加以化学修饰的多肽：泛素化(ubiquitination)、标记(例如用放射性核种或各种酶)、诸如聚乙二醇化(即用聚乙二醇衍生)的共价聚合物连接及通过化学合成如鸟氨酸的通常不存在于人类蛋白质中的氨基酸来进行插入或取代。衍生多肽可通过本领域中已知方法产生。

术语“衍生物”在关于细胞系使用时指为亲本细胞系的后代的细胞系；举例而言，此术语包括自亲本细胞传代或亚克隆且保留所要性质的细胞、亲本细胞系的已经突变且针对所要性质的保留加以选择的后代，及亲本细胞系的已经改变成含有不同表达载体或不同外源添加的核酸的后代。

“检测”指测定样品中分析物的存在、不存在或量，且可包括定量样品中或样品中每个细胞中分析物的量。

“可检测部分”或“标记”指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段来检测的组成。举例而言，适用标记包括³²P、³⁵S、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如在ELISA中通常所用)、生物素-抗生蛋白链菌素(streptavadin)、地高辛(digoxigenin)、可利用抗血清或单克隆抗体的半抗原及蛋白质，或序列与目标互补的核酸分子。可检测部分常产生可用于定量样品中经结合的可检测部分的量的可测量信号，诸如放射性信号、产色性信号或荧光信号。可检测部分可以共价方式或经由离子、范德华力(van der Waals)或氢键纳入引物或探针中或与引物或探针连接，例如纳入放射性核苷酸，或可由抗生蛋白链菌素识别的经生物素标记的核苷酸。可检测部分可为可直接或间接检测的。间接检测可涉及第二可直接或间接检测部分与可检测部分结合。举例而言，可检测部分可为结合搭配物的配位体，所述结合搭配物诸如生物素，其为抗生蛋白链菌素的结合搭配物；或核苷酸序列，其为其可特异性杂交的互补序列的结合搭配物。结合搭配物本身可为可直接检测的，举例而言，抗体本身可用荧光分子标记。结合搭配物也可为可间接检测的，举例而言，具有互补核苷酸序列的核酸可为分支DNA分子的一部分，所述分支DNA分子又可经由与其它经标记的核酸分子杂交来检测。(参见例如Fahrlander等人,Bio/Technology6:1165,1988)。通过例如闪烁计数、密度测定法或流动式细胞测量术来达成信号的定量。

“诊断”意谓鉴别病理病状的存在或性质。诊断方法在其特异性及选择性方面有所不同。尽管特定诊断方法可能不会提供对病状的确定性诊断，但若所述方法提供有助于诊断的阳性指示(positive indication)则足矣。

术语“有效量”意谓足以对个体的健康状况、病变及疾病产生所要结果或足以达成诊断目的的剂量。所要结果可包含剂量接受者的主观或客观改善。“治疗有效量”指可对健康有效产生预定有益效应的药剂的量。

“编码”指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列充当生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA及mRNA)或确定氨基酸序列的其它聚合物及大分子的模板的固有性质及由此产生的生物性质。因此，若由基因产生的mRNA的转录及翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则彼基因编码蛋白质。基因或cDNA的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中)与用作转录模板的非编码链两者可称作编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质及RNA的核苷酸序列可包括内含子。

“等效剂量”指含有相同量的活性剂的剂量。

“表达控制序列”指多核苷酸中的调控与的可操作地连接的核苷酸序列的表达(转录及/或翻译)的核苷酸序列。“可操作地连接”指两部分之间的功能关系，其中一部分的活性(例如调控转录的能力)会对另一部分产生作用(例如序列的转录)。表达控制序列可包括例如(但不限于)启动子(例如诱导性或组成性启动子)、增强子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子的拼接信号及终止密码子的序列。

“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含表达控制序列与需经表达的核苷酸序列可操作地连接。表达载体包含足以用于表达的顺式作用组件；用于表达的其它组件可由宿主细胞或体外表达系统供给。表达载体包括本领域中已知的所有表达载体，诸如粘粒、质粒(例如裸露或包含于脂质体)及纳有重组子的病毒。

“高度磷酸化”、“高程度磷酸化”及“高含量磷酸化寡糖”指至少50%溶酶体硫酸酯酶经由磷酸化寡糖与阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸酯受体结合的溶酶体硫酸酯酶制品。结合的特征进一步在于对与甘露糖-6-磷酸酯的竞争的敏感性。高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶也可指每条蛋白质链具有至少0.25条、优选至少0.5条且更优选至少0.75条双磷酸化寡甘露糖链的溶酶体硫酸酯酶。或者，高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶(GALNS)可指在成纤维细胞中的比摄取量K_uptake(产生半数最大摄取值的酶/配位体的浓度)为约0.1至10nM、或约0.1至7nM、或约0.5至5nM、或约1至5nM、或约1至3.5nM、约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM或约3.5nM、或任何此等数目的任何组合的酶。

如本文所用的“双磷酸化寡甘露糖链”指含有甘露糖的寡糖链，其与溶酶体硫酸酯酶中的天冬酰胺残基N-连接且包含两个甘露糖-6-磷酸酯残基。通常，双磷酸化寡甘露糖链具有7个甘露糖残基，即双磷酸甘露糖7(BPM7)，其与两个GlcNAc残基连接，所述两个GlcNAc残基又与溶酶体硫酸酯酶中的天冬酰胺残基连接。

“活性”、“活化”及“高程度活化”指至少50%、55%、60%、65%、优选至少70%、75%、80%、85%、90%或95%的蛋白质活性位点半胱氨酸残基已经翻译后修饰成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的溶酶体硫酸酯酶制品。或者，“活性”、“活化”及“高程度活化”指展现比活性大于在不表达重组人类SUMF1的宿主细胞(例如CHO细胞或CHO衍生的细胞)中产生的具有相同氨基酸序列的对照溶酶体硫酸酯酶的比活性至少约30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的溶酶体硫酸酯酶制品。溶酶体硫酸酯酶的适合对照制品优选具有与高度活性制品相同的氨基酸序列，且在相同宿主细胞(例外为宿主细胞不表达重组人类SUMF1)中由相同基因使用相同启动子或调控序列表达，在相同或类似培养条件(包括持续相同培养时期)下产生，且视情况纯化至与高度活性制品相同或类似的程度。

“活性高度磷酸化”指至少50%、优选至少70%、更优选至少90%且甚至更优选至少95%的蛋白质活性位点半胱氨酸残基已经翻译后修饰成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)且每条蛋白质链具有至少0.25条、优选至少0.5条且更优选至少0.75条双磷酸化寡甘露糖链的溶酶体硫酸酯酶制品。

术语“生物活性”指保留全长多肽的至少实质量(例如至少约50%、优选至少约70%且更优选至少约90%)的一种或多种生物活性的多肽(即酶)片段、其突变体、变体或衍生物。当关于溶酶体硫酸酯酶使用时，其生物活性片段、突变体、变体或衍生物保留至少实质量的硫酸酯酶活性(即硫酸酯自其目标底物裂解)。当关于硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)使用时，其生物活性片段、突变体、变体或衍生物保留至少实质量的产生甲酰甘氨酸的活性(即将溶酶体硫酸酯酶的活性位点半胱氨酸残基修饰成C_α-甲酰甘氨酸(FGly))。

术语“纯度”或“纯”在关于多肽使用时指所分析的多肽相较于可使用特定方法检测的任何污染物质的量。对于本发明的重组溶酶体硫酸酯酶，“纯度”可通过使硫酸酯酶制品在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE电泳分离，随后用考马斯蓝或银染色，或通过HPLC层析分离(例如C4逆相(RP)、C3RP)或通过任何其它层析分离(例如尺寸排除(SEC)及其类似方法)测定。使用此等方法的任一种，本发明的经纯化重组溶酶体硫酸酯酶的纯度为至少约80%或至少约85%、优选至少约90%、更至少约95%、且甚至更优选至少约97%、98%或99%。

术语“前体”或“前体形式”指哺乳动物细胞所分泌的重组溶酶体硫酸酯酶形式，即缺乏信号序列，但缺乏通常存在于溶酶体中的某些修饰，例如蛋白质的内部裂解。术语“成熟”、“成熟形式”、“经加工”或“经加工形式”指通常存在于溶酶体中的重组溶酶体硫酸酯酶形式。对于本发明的重组溶酶体硫酸酯酶，“前体”或“前体形式”及“成熟”、“成熟形式”、“经加工”或“经加工形式”的相对丰度可通过使硫酸酯酶制品在还原条件下进行SDS-PAGE电泳分离，随后用考马斯蓝或银染色，或通过HPLC层析分离(例如C4逆相(RP)、C3RP)或通过任何其它层析分离(例如尺寸排除(SEC)及其类似方法)、或电泳分离与层析分离的组合(例如SDS-PAGE接着毛细管凝胶电泳(SDS-CGE))来测定。使用此等方法，本发明的经纯化重组溶酶体硫酸酯酶由至少约65%、70%或75%、优选至少约80%或85%、更优选至少约90%、且甚至更优选至少约95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%的“前体”或“前体形式”组成。或者，使用此等方法，本发明的经纯化重组溶酶体硫酸酯酶由小于约35%、30%或25%、优选小于约20%或15%、更优选小于约10%、且甚至更优选小于约5%、3%、2%、1.5%、1%或0.5%的“成熟”、“成熟形式”、“经加工”或“经加工形式”组成。在一些实施方式中，仅检测到“前体”或“前体形式”，即硫酸酯酶制品在还原条件下进行SDS-PAGE时或通过SDS-CGE测定，基本上由单一可检测带组成；或通过HPLC分析时，基本上由单一峰组成。

在两个或两个以上多核苷酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性”百分比指当就最大对应加以比较及比对时，两个或两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量。

“连接子”指以共价方式或经由离子、范德华力或氢键联接两个其它分子的分子，例如在5'端与一个互补序列杂交且在3'端与另一互补序列杂交，由此联接两个非互补序列的核酸分子。

“低程度磷酸化”或“低磷酸化”指如下溶酶体硫酸酯酶制品，其中至成纤维细胞中的摄取量具有大于10nM的半数最大浓度或结合甘露糖-6-磷酸酯受体柱的溶酶体硫酸酯酶的分数小于约25%。

“天然存在”当应用于物体时指所述物体可见于自然界中。举例而言，存在于可自自然界来源分离的生物体(包括病毒)中且未由人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。

“医药组合物”指适于用于目标动物(包括人类及哺乳动物)中的医药用途的组合物。医药组合物包含药理学上有效量的治疗性溶酶体硫酸酯酶且还包含一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。医药组合物涵盖如下组合物，其包含活性成分及组成载剂、稀释剂或赋形剂的惰性成分、以及由任何两种或两种以上成分组合、复合或聚集或由一种或多种成分解离或由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产物。因此，本发明的医药组合物涵盖通过掺和本发明的溶酶体硫酸酯酶与一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂加以制备的任何组合物。

“医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”指任何标准医药载剂、稀释剂、缓冲剂及赋形剂，诸如(但不限于)磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、5%右旋糖水溶液、及乳液(诸如油/水或水/油乳液)、以及各种类型的湿润剂及/或佐剂。适合医药载剂、稀释剂或赋形剂及制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Co.,Easton,1995)中。优选医药载剂、稀释剂或赋形剂视活性剂的预定投药模式而定。典型投药模式包括例如(但不限于)经肠(例如经口)或非经肠(例如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内)注射；或表面、经皮或经黏膜投药。

“医药学上可接受的盐”为可调配至溶酶体硫酸酯酶中以达成医药用途的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)及氨或有机胺的盐。

“多核苷酸”指由核苷酸单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(“DNA”)及核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包含包括非天然存在的碱基、参与和其它核苷酸的键联(除天然存在的磷酸二酯键以外)的核苷酸或包括经由除磷酸二酯键外的键连接的碱基的核酸类似物。因此，核苷酸类似物包括例如(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、膦酸甲酯、对掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)及其类似物。此等多核苷酸可例如使用自动DNA合成器加以合成。术语“核酸”通常指较大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常指一般不超过约50个核苷酸的较短的多核苷酸。应了解当用DNA序列(即A、T、G、C)表示核苷酸序列时，还包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”置换“T”。

“多肽”指由氨基酸残基、其相关天然存在的结构变体及合成非天然存在的类似物经由肽键连接所构成的聚合物、其相关天然存在的结构变体及合成非天然存在的类似物。合成多肽可例如使用自动多肽合成器加以合成。术语“蛋白质”通常指较大多肽。术语“肽”通常指较短多肽。在本文中使用熟知记法来描绘多肽序列：多肽序列的左手端为胺基端；多肽序列的右手端为羧基端。

“引物”指能够与指定多核苷酸模板特异性杂交且为互补多核苷酸的合成提供起始点的多核苷酸。当将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下(即在核苷酸、互补多核苷酸模板，及诸如DNA聚合酶的聚合用试剂存在下)时发生此合成。引物通常为单链，但可为双链。引物通常为脱氧核糖核酸，但多种合成及天然存在的引物也适用于许多应用。引物与模板互补(引物经设计以与所述模板杂交来充当合成的起始位点)，但无需反映模板的精确序列。在所述情况下，引物与模板的特异性杂交视杂交条件的严谨性而定。引物可用例如产色性、放射性或荧光部分加以标记且用作可检测部分。

“探针”在关于多核苷酸使用时指能够与另一多核苷酸的指定序列特异性杂交的多核苷酸。探针与目标互补多核苷酸特异性杂交，但无需反映模板的精确互补序列。在所述情况下，探针与目标的特异性杂交视杂交条件的严谨性而定。探针可用例如产色性、放射性或荧光部分加以标记且用作可检测部分。

“预防性”处理是出于降低显现病变风险的目的而向不展现疾病征兆或仅展现早期征兆的个体施用的治疗。本发明化合物可作为防治性治疗来给与以降低显现病变的可能性或若显现，则使病变的严重性最小。

“重组多核苷酸”指具有不天然联接在一起的序列的多核苷酸。经扩增或组装的重组多核苷酸可包括在适合载体中，且所述载体可用于转型适合宿主细胞。包含重组多核苷酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。接着在重组宿主细胞中表达基因以产生例如“重组多肽”。重组多核苷酸也可发挥非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。

“与…特异性杂交”、“特异性杂交”或“与…选择性杂交”指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞)DNA或RNA中时，核酸分子在严谨条件下优先与彼序列结合、双螺旋化(duplexing)或杂交。

术语“严谨条件”指探针将优先与其目标子序列杂交且在较小程度上与其它序列杂交或完全不与其它序列杂交所处的条件。在诸如南方及北方杂交(Southern andNorthern hybridization)的核酸杂交实验的情况下，“严谨杂交”及“严谨杂交洗涤条件”视序列而定，且在不同环境参数下不同。关于核酸杂交的广泛指南见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes 第2章第I部分“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,New York中。一般而言，选择高度严谨杂交及洗涤条件为在确定离子强度及pH值下比特定序列的热解链点(Tm)低约5℃。Tm为50%目标序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定离子强度及pH值下)。极严谨条件选择为等于特定探针的Tm。

在DNA或RNA印迹法中使在过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的严谨杂交条件的一示例为：含有1mg肝素的50%福尔马林(formalin)，在42℃下，进行杂交隔夜。高度严谨洗涤条件之一示例为：在72℃下，0.15M NaCl，持续约15分钟。严谨洗涤条件之一示例为：在65℃下0.2×SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook等人)。通常，在高严谨性洗涤之前进行低严谨性洗涤以去除背景探针信号。例如超过100个核苷酸的双螺旋的示例性中等严谨性洗涤为：在45℃下，1×SSC，持续15分钟。例如超过100个核苷酸的双螺旋的示例性低严谨性洗涤为：在40℃下，4-6×SSC，持续15分钟。一般而言，在特定杂交试验中，信噪比为对于无关探针观测到的信噪比的2倍(或2倍以上)指示检测到特异性杂交。

诊断或治疗的“个体”为人类或非人类动物，包括哺乳动物或灵长类动物。

在两种核酸或多肽的情况下，词组“基本上同源”或“基本上一致”一般指当就最大对应加以比较及比对时，两个或两个以上序列或子序列具有至少40%、60%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸或氨基酸残基一致性，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量。优选基本一致性在长度为至少约50个残基的序列区域范围内，更优选在至少约100个残基的区域范围内存在，且最优选序列在至少约150个残基范围内为基本上一致。在一最优选实施方式中，序列在比较生物聚合物的任一者或两者的整个长度范围内为基本上一致。

对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试及参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。接着序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

可例如通过Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，通过Needleman及Wunsch,J. Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法，通过Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988的相似性搜寻法，通过此等算法的计算机化工具(威斯康星遗传学软件包(W isconsin Genetics Software Package),GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或通过目视检查来进行序列的最优选比对以作比较。

适用算法的一个示例为PILEUP。PILEUP使用渐进性成对比对产生一组相关序列的多重序列比对以显示关系及序列一致性百分比。它还绘制显示用于产生比对的聚类关系的树或树形图。PILEUP使用Feng及Doolittle,J. Mol.Evol.35:351-360,1987的渐进性比对方法的简化形式。所用方法类似于由Higgins及Sharp,CABIOS5:151-153,1989描述的方法。程序可比对多达300个序列，每个可具有5,000个核苷酸或氨基酸的最大长度。多重比对程序始于两个最类似序列的成对比对，产生两个经比对序列的聚类。此聚类接着与下一最相关序列或经比对序列的聚类比对。两个序列聚类通过简单延伸两个个别序列的成对比对来进行比对。通过一系列渐进成对比对来达成最终比对。通过指定特定序列及其用于序列比较的区域的氨基酸或核苷酸坐标且通过指定程序参数来执行程序。举例而言，可使用以下参数来将参考序列与其它测试序列比较以测定序列一致性百分比关系：预设空隙权重(3.00)、预设空隙长度权重(0.10)及加权末端空隙。适用于产生序列多重比对的另一算法为Clustal W(Thompson等人,Nucleic Acids Research22:4673-4680,1994)。

适用于测定序列一致性及序列相似性百分比的算法的另一示例为BLAST算法，其描述于Altschul等人，J. Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。此算法涉及首先通过鉴别查询序列中长度W的短字来鉴别高得分序列对(HSP)，其在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值临限计分T。T称为邻近字计分临限值(Altschul等人,J. Mol.Biol.215:403-410,1990)。此等初始邻近字匹配充当起始搜寻的种子以发现含有所述种子的较长HSP。字匹配接着沿各序列双向延伸直至累积比对计分可增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖赏计分；始终>0)及N(错配残基的处罚计分；始终<0)来计算累积计分。对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累积计分。各方向的字匹配延伸在下列情况下停止：累积比对计分自其所达成的最大值减少量X；归因于一个或多个负计分残基比对的累积，累积计分变为0或0以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T及X决定比对的敏感性及速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、预期值(E)10、M=5、N=-4、及两链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、预期值(E)10，及BLOSUM62计分矩阵作为默认值(参见Henikoff及Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915,1989)。

除计算序列一致性百分比外，BLAST算法还进行两个序列之间类似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一个类似性量度为最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指标。举例而言，若在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01、且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列类似。

如下所述，两个核酸序列或多肽为基本上一致的另一指标为由第一核酸编码的多肽可与由第二核酸编码的多肽起免疫交叉反应。因此，举例而言，当两个肽仅在保守性取代方面不同时，多肽通常与第二多肽基本上一致。如本文所述，两个核酸序列为基本上一致的另一指标为两个分子在严谨条件下彼此杂交。

“基本上纯”或“经分离”意谓目标物质为所存在的主要物质(即以摩尔计，在组合物中量大于任何其它个别大分子物质)，且基本上纯化的部分为目标物质占所有存在的大分子物质的至少约50%(以摩尔计)的组合物。一般而言，基本上纯的组合物意谓约80%至90%或90%以上的存在于组合物中的大分子物质为相关纯化物质。若组合物基本上由单一大分子物质组成，则目标物质经纯化至基本均质(通过熟知检测方法不能检测出组合物中的污染物质)。出于此定义的目的，溶剂物质、小分子(<500道尔顿)、稳定剂(例如BSA)及元素离子物质不视为大分子物质。在一些实施方式中，本发明的溶酶体硫酸酯酶为基本上纯的或经分离。在一些实施方式中，本发明的溶酶体硫酸酯酶相对于用于其合成的大分子起始物质而言为基本上纯的或经分离。在一些实施方式中，本发明的医药组合物包含基本上纯化或分离的治疗性溶酶体硫酸酯酶与一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂掺和。

“治疗性”处理为出于减弱或消除病变征兆或症状的目的而向展现那些征兆或症状的个体施用的治疗。征兆或症状可为生物化学、细胞、组织、功能、主观或客观征兆或症状。本发明的溶酶体硫酸酯酶可作为治疗性治疗剂或为达成诊断而给与。

“治疗指数”指高于最小治疗量且低于不可接受毒性量的剂量范围(量及/或时序)。

“治疗”指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。

如本文所用的术语“单位剂型”指适于作为单一剂量用于人类及动物个体的物理个别单元，各单元含有预定量的本发明的溶酶体硫酸酯酶，所述预定量以在与一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂联合的情况下足以产生所要效应的量来计算。本发明的新颖单位剂型的规格视所用特定溶酶体硫酸酯酶及需达成的效应以及与宿主中各溶酶体硫酸酯酶相关的药效学而定。

II.产生溶酶体硫酸酯酶

在一方面，本发明的特征在于一种产生能够达成活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的治疗性使用量的此等酶的新颖方法。一般而言，所述方法的特征在于用编码人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA及编码全长溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA转型适合细胞系。本领域技术人员可制备除本文中明确描述的表达构建体以外的表达构建体以达成在适合经转染细胞系中最优选产生此等溶酶体硫酸酯酶。此外，本领域技术人员可容易地设计编码天然存在的SUMF1或与天然存在的全长酶具有相同或类似生物活性的溶酶体硫酸酯酶的生物活性片段、变体、突变体或衍生物的cDNA的片段。

宿主细胞

用于产生重组溶酶体硫酸酯酶的宿主细胞为内涵体酸化缺乏的细胞系，其特征在于其能够产生能够达成此等溶酶体硫酸酯酶的治疗性使用量的此等溶酶体硫酸酯酶。本发明提供一种CHO-K1衍生的END3互补群细胞系，称为G71。本发明还提供一种适合于在无血清悬浮培养物中生长的G71细胞系，称为G71S。本发明还提供已经进一步亚克隆或含有不同表达质粒的G71及G71S细胞系的衍生物。

含有且表达编码重组蛋白质的DNA或RNA的细胞在本文中称为经遗传修饰的细胞。含有且表达编码重组蛋白质的DNA或RNA的哺乳动物细胞称为经遗传修饰的哺乳动物细胞。将DNA或RNA引入至细胞中通过已知转染方法，诸如(但不限于)电穿孔、显微注射、微弹轰击(microprojectile bombardment)、磷酸钙沉淀、改进型磷酸钙沉淀、阳离子脂质处理、光穿孔(photoporation)、融合方法、受体介导的转移或聚凝胺(polybrene)沉淀来达成。或者，DNA或RNA可通过用病毒载体感染来引入。产生表达编码重组蛋白质的DNA或RNA的细胞(包括哺乳动物细胞)的方法描述于以下申请中：同在申请中的Richard F Selden、DouglasA.Treco及Michael W.Heartlein(1994年11月4日申请)的标题为“In Vivo ProteinProduction and Delivery System for Gene Therapy”的美国专利申请第08/334,797号；Richard F Selden、Douglas A.Treco及Michael W.Heartlein(1994年11月4日申请)的标题为“In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin forGene Therapy”的美国专利申请第08/334,455号；及Douglas A.Treco、MichaelW.Heartlein及Richard F Selden(1994年4月20日申请)的标题为“TargetedIntroduction of DNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for GeneTherapy”的美国专利申请第08/231,439号。此等申请各自的提示以全文引用的方式明确纳入本文中。

在优选实施方式中，用于产生重组溶酶体硫酸酯酶的宿主细胞为内涵体酸化缺乏的细胞系，其特征在于其能够产生能够达成此等溶酶体硫酸酯酶的治疗性使用量的此等溶酶体硫酸酯酶。在优选实施优选中，本发明提供一种称为G71的由CHO-K1衍生的END3互补群细胞系，及一种称为G71S的适合于在无血清悬浮培养物中生长的G71细胞系，所述细胞系共表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)与重组溶酶体硫酸酯酶，且因此能够产生高产率的如“定义”中所指定的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶，藉此能够达成治疗性溶酶体硫酸酯酶的大规模产生。在最优选的实施方式中，G71或G71S细胞系或其衍生物以至少约0.5皮克/细胞/天、优选至少约0.75皮克/细胞/天、更优选至少约1.0皮克/细胞/天且甚至更优选至少约1.25皮克/细胞/天的量表达及分泌重组溶酶体硫酸酯酶。

载体及核酸构建体

用于表达重组蛋白质(人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)或溶酶体硫酸酯酶或两者)的核酸构建体可为于经转染哺乳动物细胞中染色体外(游离)表达的核酸构建体或随机地或在预先选定的靶向位点处经由同源重组整合至受体细胞的基因组中的核酸构建体。除重组蛋白质编码序列外，染色体外表达的构建体还包含足以在细胞中表达所述蛋白质及视情况构建体复制的序列。其通常包括启动子、重组蛋白质编码DNA及聚腺苷酸化位点。编码重组蛋白质的DNA以使其表达处于启动子控制下的方式定位于构建体中。可选地，构建体可含有其它组分，诸如以下一种或多种：拼接位点、增强子序列、在适当启动子控制下的选择标记基因、在适当启动子控制下的可扩增标记基因及基质附着区(matrix attachmentregion，MAR)或本领域中已知会增强其所插入区域的表达的其它组件。

在DNA构建体整合至细胞的基因组中的那些实施方式中，其需仅包括重组蛋白质编码核酸序列。可选地，其可包括启动子及增强子序列、聚腺苷酸化位点、拼接位点、编码选择标记的核酸序列、编码可扩增标记的核酸序列、基质附着区(MAR)或本领域中已知会增强其所插入区域的表达的其它组件，及/或与受体细胞中的基因组DNA同源的DNA，以使DNA的整合靶向基因组中的选定位点(以靶向DNA或DNA序列)。

细胞培养方法

在适于细胞生长及DNA或RNA表达条件下培养含有编码重组蛋白质的DNA或RNA的哺乳动物细胞。可使用已知方法及本文所述的方法鉴别表达重组蛋白质的彼等细胞，且可使用已知方法及本文还有描述的方法分离及纯化重组蛋白质，在存在或不存在扩大重组蛋白质产生的情况下。可例如经由筛检(诸如PCR筛检、通过DNA印迹分析进行筛检或针对重组蛋白质的表达进行筛检)显示指示存在编码重组蛋白质的DNA或RNA的表型的经遗传修饰哺乳动物细胞来进行鉴别。含有经合并的重组蛋白质编码DNA的细胞的选择可通过以下达成：在DNA构建体中包括选择标记，随后在仅适于表达选择标记基因的彼等细胞存活的条件下培养含有选择标记基因的经转染或经感染细胞。所引入的DNA构建体的进一步扩增可通过以下来实现：在适当条件下培养经遗传修饰哺乳动物细胞(例如在仅有含有可扩增标记基因的多个复本的细胞可存活的药物浓度存在下培养含有可扩增标记基因的经遗传修饰哺乳动物细胞)。

如本文所述，可通过检测表达产物来鉴别表达重组蛋白质的经遗传修饰哺乳动物细胞。举例而言，表达活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的哺乳动物细胞可通过夹心式酶免疫试验来鉴别。抗体可被引向活性剂部分。

溶酶体硫酸酯酶的变体

在某些实施方式中，活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶突变体或变体可经制备且将适用于可使用活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的多种应用。多肽的氨基酸序列突变体或变体可为取代型、插入型或缺失型突变体或变体。缺失型突变体或变体缺乏天然蛋白质的并非为功能或免疫原性活性所必需的一个或多个残基。一种常见类型的缺失型突变体或变体为缺乏分泌信号序列或引导蛋白质与细胞的特定部分结合的信号序列的缺失型突变体或变体。插入型突变体或变体通常涉及在多肽中的非端点处添加物质。此可包括插入免疫反应性抗原决定基或仅单一残基。下文论述还称作融合蛋白的末端添加物。

变体可与如上所述的未经修饰溶酶体硫酸酯酶基本上同源或基本上一致。优选变体为以下变体：其为保留溶酶体硫酸酯酶的至少一些生物活性(例如硫酸酯酶活性)的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽变体。其它优选变体包括保留人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的至少一些硫酸酯酶活性的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶多肽变体。

取代型突变体或变体通常在蛋白质内的一个或多个位点处将野生型多肽的一个氨基酸交换为另一氨基酸，且可经设计成在不损失其它功能或性质的情况下调节多肽的一个或多种特性，诸如(但不限于)对抗蛋白水解裂解的稳定性。此类取代优选为保守性的，即一个氨基酸经具有类似形状及电荷的氨基酸置换。保守性取代在本领域中为熟知的且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

本发明的一方面涵盖产生糖基化位点突变体或变体，其中溶酶体硫酸酯酶的O-连接或N-连接糖基化位点已经突变。此等突变体或变体将产生关于活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的生物活性、物理结构及底物结合潜力的重要信息。在特定方面，预期可产生活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽的其它突变体或变体，其保留生物活性但底物结合活性增大或减小。同样，特别涵盖活性位点或催化区域的突变以产生底物结合活性改变的蛋白质突变体或变体。在此等实施方式中，将活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的序列与其它相关酶的序列进行比较且使选定残基特异性突变。

自作为1号氨基酸的推定胺基末端对成熟蛋白质的氨基酸进行编号，可适用的示例性突变包括例如取代所有或一些可能经糖基化的天冬酰胺，包括重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的位置178及397(参见图5)。

底物结合可由在溶酶体硫酸酯酶的活性位点处/附近的突变来改变。考虑到此等突变为示例性的，本领域技术人员将认识到可使酶序列发生其它突变以提供关于此蛋白质及其活性的其它结构及功能信息。

为了构建诸如上述的突变体或变体，本领域技术人员可采用熟知标准技术。特别涵盖N端缺失、C端缺失、内部缺失以及随机及点突变诱发。

N端及C端缺失为缺失突变诱发形式，其利用例如在C端或N端区域的末端附近存在适合单一限制位点。DNA在所述位点处裂解且切割末端由诸如BAL31、外切核酸酶III、DNaseI及S1核酸酶的核酸酶降解。再联接两末端会产生一系列在限制位点周围具有不同尺寸缺失的DNA。可使用本领域中的标准技术及本说明书中所述的技术来试验由此突变体表达的蛋白质的适当生物功能，例如酶活性。对内部缺失突变体可采用类似技术，通过使用两个经适当置放的限制位点，藉此允许产生精确确定的缺失，且使末端如上所述再连接。

还涵盖局部消化突变体。在此等情况下，本领域技术人员将采用“高频切酶(frequent cutter)”，其视反应时间的长短而定在众多位置切割DNA。因此，通过改变反应条件，将有可能产生一系列不同尺寸的突变体，接着可针对活性对其进行筛检。

还可通过用例如DNase I切割DNA序列且插入编码3、6、9、12(等)个氨基酸的一段核苷酸并再连接末端来进行随机插入型突变。一旦产生此种突变，即可针对由野生型蛋白质所呈现的各种活性对突变体进行筛检。

还可采用点突变诱发以特定鉴别哪些氨基酸残基在与溶酶体硫酸酯酶生物活性相关的特定活性方面为重要的。因此，本领域技术人员将能够在DNA链中产生单碱基变化以产生改变的密码子及误义突变。

可改变特定蛋白质的氨基酸以产生等效物，或甚至改良的第二代分子。此等改变涵盖在不明显损失与诸如抗体的抗原结合区域或底物分子或受体上结合位点结构的相互作用结合能力的情况下取代蛋白质的既定氨基酸。因为蛋白质的相互作用能力及性质限定彼蛋白质的生物功能活性，所以可在蛋白质序列及其潜在DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，且仍获得具有类似性质的蛋白质。因此，如下文所论述，可在不明显损失生物效用或活性的情况下，在基因的DNA序列中作出各种变化。

在作出此等变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。公认氨基酸的相对亲水性特性促成所得蛋白质的二级结构，所述二级结构又限定蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原及其类似物)的相互作用。各氨基酸已基于其疏水性及电荷特征被赋予亲水性指数(Kyte及Doolittle,J. Mol.Biol.,157(1):105-132,1982，以引用的方式纳入本文中)。一般而言，氨基酸可经具有类似亲水性指数或计分的其它氨基酸取代且仍会产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效的蛋白质。

另外，可基于亲水性有效进行类似氨基酸的取代。以引用的方式纳入本文中的美国专利4,554,101指出蛋白质受邻近氨基酸的亲水性支配的最大局部平均亲水性与所述蛋白质的生物性质相关。同样，氨基酸可经取代成具有类似亲水性值的另一氨基酸且仍获得生物等效且免疫等效的蛋白质。

可用于本发明的此情况中的示例性氨基酸取代包括(但不限于)交换精氨酸及赖氨酸；谷氨酸及天冬氨酸；丝氨酸及苏氨酸；谷氨酰胺及天冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸。本领域技术人员将熟知考虑需要保留一些或所有生物活性同时改变蛋白质的二级结构的其它此种取代。

预期用于制备本发明的多肽的另一类型的变体为使用肽模拟物。仿真物为仿真蛋白质二级结构的组件的含肽分子。参见例如Johnson等人,“Peptide Turn Mimetics”,BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY,Pezzuto等人编,Chapman and Hall,New York(1993)。在使用肽仿真物背后的潜在基本原理为蛋白质的肽骨架主要以有助于分子相互作用(诸如抗体与抗原的分子相互作用)的方式存在以定向氨基酸侧链。预期肽模拟物允许类似于天然分子的分子相互作用。此等原理可连同上述原理一起使用以工程改造具有溶酶体硫酸酯酶的许多天然性质但特征改变且甚至改良的第二代分子。

溶酶体硫酸酯酶的经修饰糖基化

还可产生糖基化样式相对于亲本多肽经修饰的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶变体，例如缺失一个或多个碳水化合物部分及/或添加一个或多个不存在于天然多肽中的糖基化位点。

糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸及天冬酰胺-X-苏氨酸(X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)为碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。在多肽中存在这些三肽序列的任一种都会产生潜在糖基化位点。因此，可通过改变氨基酸序列以使其含有此等三肽序列的一种或多种来添加N-连接糖基化位点至多肽中。O-连接糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。O-连接糖基化位点可通过在原始多肽的序列中插入或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来添加。

域转换

溶酶体硫酸酯酶蛋白质的各种部分具有大量序列同源性。可鉴别溶酶体硫酸酯酶多肽中可改变其功能的突变。此等研究因至少两个原因而可能为重要的。首先，其提供以下合理期望：此基因的其它同源物、等位基因变体及突变体可存在于相关物种，诸如大鼠、兔、猴、长臂猿(gibbon)、黑猩猩、猿、狒狒、母牛、猪、马、绵羊及猫中。在分离此等同源物、变体及突变体后，且连同其它分析，可鉴别某些活性或功能域。其次，此将为对如上所述的分子进行进一步突变分析提供起点。一种可利用此信息的方式在于“域转换”。

域转换涉及使用不同但相关的多肽产生重组分子。举例而言，通过将溶酶体硫酸酯酶(例如N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶)的序列与来自另一来源的类似溶酶体硫酸酯酶的序列进行比较，且与此等多肽的突变体及等位基因变体进行比较，可关于此等分子的功能重要区域进行预测。接着有可能转换此等分子的相关域以试图确定此等区域在溶酶体储存病症中对酶功能及效应的关键程度。此等分子可具有其它价值，因为此等“嵌合体”尽管不同于天然分子，但可能提供相同或甚至增强的功能。

基于目前鉴别的众多溶酶体硫酸酯酶，对突变及其对二级结构的预测影响的进一步分析将加深此理解。预期转换介于溶酶体硫酸酯酶之间的域的突变体将提供关于此等分子与其所相互作用的多肽的结构/功能关系的适用信息。

融合蛋白

除上述突变外，本发明另外涵盖产生称为融合蛋白的特定种类的插入型变体。此分子通常具有天然分子的所有或实质部分，其在N端或C端与第二多肽的所有部分或一部分连接。举例而言，融合通常采用来自其它物种的前导序列(leader sequence)以允许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一适用融合包括添加诸如抗体抗原决定基的免疫活性域以有助于融合蛋白的纯化。在融合接合处或附近包括裂解位点将有助于在纯化后去除外来多肽。其它适用融合包括功能域(诸如来自酶的活性位点)、糖基化域、细胞靶向信号或跨膜区域的连接。

有各种市售融合蛋白表达系统可用于本发明中。尤其适用的系统包括(但不限于)麸胱甘肽S-转移酶(GST)系统(Pharmacia,Piscataway,NJ)、麦芽糖结合蛋白系统(NEB,Beverley,MA)、FLAG系统(IBI,New Haven,CT)、6×His系统(Qiagen,Chatsworth,CA)。此等系统能够产生仅携带少量不可能影响重组多肽的抗原性能力的其它氨基酸的重组多肽。举例而言，FLAG系统与6×His系统均仅添加短序列，已知两者均具弱抗原性且不会不利地影响多肽折叠成其天然构形。预期适用的另一N端融合为在蛋白质或肽的N端区域处Met-Lys二肽的融合。这种融合可使蛋白质表达或活性有利地增加。

一种尤其适用的融合构建体可为活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽或其片段与半抗原融合以增强溶酶体硫酸酯酶融合构建体的免疫原性的融合构建体。此可适用于产生针对活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的抗体以能够达成蛋白质的检测。在其它实施方式中，可制备将增强溶酶体硫酸酯酶相关组合物靶向特定位点或细胞的融合构建体。

其它融合构建体包括具有所要性质的异源肽，例如使溶酶体硫酸酯酶靶向特定器官、组织或细胞类型的基序。在优选实施方式中，包括靶向骨骼的肽的融合构建体，例如与溶酶体硫酸酯酶融合的6个天冬氨酸残基(6×Asp或6D)可使酶靶向骨骼中的特定部位。

还涵盖包括具有所要性质的异源多肽(例如延长血清半衰期的Ig恒定区或供靶向的抗体或其片段)的其它融合构建体。其它融合系统产生多肽杂合体，其中需要自所要多肽切除融合搭配物。在一实施方式中，融合搭配物由含有蛋白酶特异性识别序列的肽序列与重组活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽连接。适合序列的示例为由烟草蚀刻病毒蛋白酶(Tobacco Etch Virus protease)(Life Technologies,Gaithersburg,MD)或因子Xa(NewEngland Biolabs,Beverley,MA)所识别的序列。

衍生物

如上所述，衍生物指通过如(但不限于)以下的技术加以化学修饰的多肽：泛素化、标记(例如用放射性核种或各种酶)、诸如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)的共价聚合物连接及通过化学合成诸如鸟氨酸的氨基酸来进行插入或取代。溶酶体硫酸酯酶的衍生物也适用作治疗剂且可通过本发明方法产生。

聚乙二醇(PEG)可与通过本发明方法产生的溶酶体硫酸酯酶连接以提供较长活体内半衰期。PEG基团可具有任何适宜分子量且可为直链或分支链。PEG的平均分子量将优选介于约2千道尔顿(“kDa”)至约100kDa、更优选约5kDa至约50kDa、最优选约5kDa至约10kDa范围内。PEG基团将一般经由PEG部分上的反应性基团(例如醛基、胺基、硫醇基或酯基)与蛋白质部分上的反应性基团(例如醛基、胺基或酯基)进行酰化或还原性烷基化来与本发明的溶酶体硫酸酯酶连接。添加PEG部分至相关多肽可使用本领域中熟知的技术进行。参见例如国际公开第WO96/11953号及美国专利第4,179,337号。

溶酶体硫酸酯酶多肽与PEG的连接通常发生在水相中且可易于通过逆相分析HPLC来监测。聚乙二醇化肽可易于通过制备HPLC纯化且通过分析HPLC、氨基酸分析及激光脱附质谱分析表征。

标记

在一些实施方式中，治疗性溶酶体硫酸酯酶经标记以有助于其检测。“标记”或“可检测部分”为可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段来检测的组成。举例而言，适用于本发明中的标记包括(但不限于)放射性标记(例如³²P)、荧光团(例如荧光素)、电子致密剂、酶(例如ELISA中通常所用)、生物素、地高辛、或半抗原以及蛋白质，所述半抗原以及蛋白质可例如通过将放射性标记纳入半抗原或肽中变得可检测，或用于检测可与半抗原或肽起特异性反应的抗体。

适用于本发明中标记的示例包括(但不限于)荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、得克萨斯红(Texas red)、罗丹明(rhodamine)及其类似物)、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(例如辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase)、碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase)及通常用于ELISA中的其它酶)及比色标记(诸如胶态金、有色玻璃或塑料珠粒(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等))。

可根据本领域中熟知的方法使标记与溶酶体硫酸酯酶的所要组分直接或间接偶合。优选地，在一实施方式中，使用异氰酸酯试剂结合本发明的活性剂来使标记与溶酶体硫酸酯酶共价结合。在本发明的一方面，本发明的双官能异氰酸酯试剂可用于使标记与溶酶体硫酸酯酶结合以形成不连接活性剂的标记溶酶体硫酸酯酶结合物。标记溶酶体硫酸酯酶结合物可用作合成本发明的经标记结合物的中间物或可用于检测溶酶体硫酸酯酶结合物。如上所指示，可使用多种标记，其中标记的选择视所需敏感性、与溶酶体硫酸酯酶的所要组分结合的容易性、稳定性要求、可用仪器及处置规定而定。非放射性标记常常通过间接手段连接。一般而言，配位体分子(例如生物素)与溶酶体硫酸酯酶共价结合。接着配位体与另一分子(例如抗生蛋白链菌素)结合，所述另一分子固有地为可检测的或与信号系统(诸如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。

本发明的溶酶体硫酸酯酶还可与信号产生化合物直接结合，例如与酶或荧光团结合。适用作标记的酶包括(但不限于)水解酶，特别是磷酸酶、酯酶及糖苷酶(glycosidase)；或氧化酶，特别是过氧化酶。适用作标记的荧光化合物(即荧光团)包括(但不限于)荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基、伞酮(umbelliferone)等。适合荧光团的其它示例包括(但不限于)曙红(eosin)、TRITC-胺、奎宁(quinine)、荧光素W、吖啶黄(acridineyellow)、丽丝胺罗丹明(lissamine rhodamine)、B磺酰氯赤藓红(B sulfonyl chlorideerythroscein)、钌(参，联吡啶)、得克萨斯红、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide)等。适用作标记的化学发光化合物包括(但不限于)荧光素及2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺(luminol)。关于可用于本发明方法中的各种标记系统或信号产生系统的评述，参见美国专利第4,391,904号。

用于检测标记的手段为本领域技术人员所熟知。因此，举例而言，当标记具放射性时，检测手段包括闪烁计数器或如自动放射摄影术中的照相胶片。当标记为荧光标记时，其可通过用适当波长的光激发荧光染料并检测所得荧光来检测。可通过使用如电荷耦合器件(charge coupled device，CCD)或光电倍增器(photomultiplier)及其类似物的电子检测器来目视检测荧光。类似地，可通过提供酶的适当底物并检测所得反应产物来检测酶标记。可简单地通过观测与标记相关的颜色来检测比色标记或化学发光标记。适用于本发明方法中的其它标记及检测系统将易于为本领域技术人员显而易知。此等经标记的调节剂及配位体可用于诊断疾病或健康状况。

在一优选实施方式中，方法包含自内涵体运输有缺陷的细胞系产生活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的步骤。在特别优选的实施方式中，方法包含自CHO细胞系G71或其衍生物产生活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的步骤。诸如(但不限于)GALNS的溶酶体硫酸酯酶的产生包含以下步骤：(a)产生共表达重组人类溶酶体硫酸酯酶(例如N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))与重组人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)的G71或G71衍生物细胞系；(b)培养人类溶酶体硫酸酯酶与SUMF1共表达细胞系；及(c)按比例放大人类溶酶体硫酸酯酶与SUMF1共表达细胞系至生物反应器中以产生溶酶体硫酸酯酶。在优选实施方式中，基本上如本文在以下所述，将人类溶酶体硫酸酯酶(例如N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))及人类SUMF1cDNA亚克隆至哺乳动物表达载体中

为产生细胞系，用人类GALNS哺乳动物表达载体、人类SUMF1哺乳动物表达载体及选择标记基因共转染G71或G71S(适应于在无血清悬浮培养物中生长的G71克隆)，且选择稳定转型体。在稳定转染物的第一轮亚克隆后，使用荧光底物选择细胞系且明确指定。分别分析G71或G71S细胞系在具有微载体(microcarrier)的旋转器中或在悬浮培养物中的细胞比产率(皮克产物/细胞)。鉴别人类GALNS的最优选产生者且按比例放大至生物反应器中以产生临床前物质。

在另一实施方式中，本发明提供一种测量重组人类溶酶体酶降解天然底物的活性的基于细胞的试验。所述方法包含(a)在溶酶体酶的天然底物累积的条件下培养溶酶体酶缺乏的经分离人类细胞；(b)使所述细胞与所述溶酶体酶接触；(c)溶解所述细胞；(d)向细胞溶解产物中添加酶，所述酶(i)对所述天然底物具有特异性，且(ii)使小寡糖自所述天然底物裂解；(e)以可检测部分标记所述小寡糖；(f)可选分离所述经标记的小寡糖；(g)检测所述经标记的小寡糖；及(h)通过比较(i)来自与所述溶酶体酶接触的细胞的经标记小寡糖的量与(ii)来自未与所述溶酶体酶接触的细胞的经标记小寡糖的量来测定所述溶酶体酶降解天然底物的活性，其中(h)(i)相较于(h)(ii)的降低指示所述溶酶体酶降解天然底物的活性。在一实施方式中，小寡糖为单糖、双糖或三糖。在一相关实施方式中，小寡糖为双糖。

在一些实施方式中，溶酶体酶选自下组：芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些实施方式中，溶酶体酶为α-L-艾杜糖醛酸酶(IDU)。在一些实施方式中，溶酶体酶为酸性α-葡糖苷酶(GAA)。在一些实施方式中，溶酶体酶为β-葡萄糖苷酸酶(GUSB)。在一些实施方式中，溶酶体酶为β-半乳糖苷酶(GLB1)

可用于基于细胞的试验中的适合人类细胞包括待测试的因溶酶体酶缺乏而可累积溶酶体酶的天然底物的任何人类细胞。举例而言，可使用天然展现活性完全(100%)或部分缺乏(例如活性降低30%、50%、70%、80%、90%、95%或95%以上)的细胞。可使用表达活性减弱的突变酶的细胞、或源于罹患溶酶体储积疾病(例如黏多糖病)的患者的细胞。可使用例如经由向编码基因或其启动子或其它调控区引入突变而经重组改变以剔除或降低溶酶体酶活性的细胞。可使用经处理以降低溶酶体酶活性(例如用反义物或RNAi处理以降低酶表达)的细胞。

使小寡糖自碳水化合物裂解(消化)且对溶酶体酶的天然底物具有“特异性”(即主要消化所述天然底物)的适合酶可由普通技术人员加以选择。举例而言，对于检测GALNS或GLB1(降解硫酸角质素的酶)的活性，步骤(d)的酶可为硫酸角质素酶II或主要对硫酸角质素起作用的任何酶。作为另一示例，对于检测IDU、ARSB、IDS或GUSB(降解硫酸皮肤素的酶)，步骤(d)的酶可为软骨素酶ABC或主要对硫酸皮肤素起作用的任何酶。作为另一示例，对于检测IDU、IDS、SGHS、G6S或GUSB(降解硫酸乙酰肝素的酶)，步骤(d)的酶可为乙酰肝素酶I或乙酰肝素酶II或两者。作为另一示例，对于检测GAA(降解肝糖的酶)，步骤(d)的酶可为α-淀粉酶或主要对肝糖起作用的任何酶。

III.纯化溶酶体硫酸酯酶

含有重组人类GALNS的生物反应器物质经0.2μm无菌过滤且保持在4℃下。将生物反应器物质直接装载于捕获柱上，或通过超滤浓缩10至20倍，随后装载于捕获柱上。将生物反应器物质或经浓缩生物反应器物质的pH值调整至pH4.5，接着装载于蓝色-琼脂糖凝胶柱上，依序用20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH4.5)及20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH6.0)洗涤，且用20mM乙酸盐/磷酸盐、100mM NaCl(pH7.0)洗脱。接着将蓝色-琼脂糖凝胶柱洗脱液装载于Fractogel SE Hi-Cap上，依序用20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH5.0)及20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH5.5)洗涤，且用20mM乙酸盐/磷酸盐、50-350mM NaCl梯度(pH5.5)洗脱。在10mM NaOAc、1mM NaH₂PO₄、0.005%吐温-80(吐温-80)(pH5.5)中调配Fractogel SE Hi-Cap洗脱液。

或者，将含有重组人类GALNS的生物反应器物质通过超滤浓缩20倍，随后装载于捕获柱上。将经浓缩生物反应器物质的pH值调整至pH4.5，过滤接着装载于Fractogel SE Hi-Cap柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH4.5)及10mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH5.0)洗涤，且用10mM乙酸盐/磷酸盐、140mM NaCl(pH5.0)洗脱。接着将Fractogel SEHi-Cap柱洗脱液调整至500mM NaCl(pH7.0)且装载于Zn螯合琼脂糖凝胶(Zn-IMAC)柱上，用10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl、10mM咪唑(pH7.0)洗涤，且用10mM乙酸盐/磷酸盐、125mMNaCl、90mM咪唑(pH7.0)洗脱。将Zn螯合琼脂糖凝胶(Zn-IMAC)柱洗脱液调整至pH3.5以达成低pH值病毒失活，调整至10mM乙酸盐/磷酸盐、2M NaCl(pH5.0)，接着装载于ToyoPearl丁基650M柱上，用10mM乙酸盐/磷酸盐、2M NaCl(pH5.0)洗涤，且以10mM乙酸盐/磷酸盐、0.7MNaCl(pH5.0)洗脱。将ToyoPearl丁基650M洗脱液超滤且渗滤于20mM乙酸盐、1mM磷酸盐、150mM NaCl(pH5.5)中，接着在20mM乙酸盐、1mM磷酸盐、150mM NaCl、0.01%吐温-20(pH5.5)中调配。

或者，过滤含有重组人类GALNS的生物反应器物质，通过超滤/渗滤浓缩20倍，接着经活性碳过滤，随后装载于捕获柱上。经浓缩的生物反应器物质在电导率约55±5mS/cm下装载于Zn螯合琼脂糖凝胶FF(Zn-IMAC)柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、500mM NaCl(pH7.0)及10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl(pH7.0)(缓冲液A)洗涤，接着用70%缓冲液A与30%10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl、300mM咪唑(pH7.0)(缓冲液B)的混合物洗脱。Zn螯合琼脂糖凝胶FF(Zn-IMAC)柱洗脱液调整至电导率约6.0±0.5mS/cm及pH7.0且装载于Mustang Q过滤器上以潜在去除病毒。Mustang Q滤液调整至pH4.5±0.1，依次经CUNO60ZA过滤器及0.2μm线内过滤器过滤，接着装载于Fractogel EMD SE Hi-Cap(M)柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH4.5)及80%缓冲液A(10mM乙酸盐/磷酸盐(pH5.0))与20%缓冲液B(10mM乙酸盐/磷酸盐、250mM NaCl(pH5.0))的混合物洗涤，且用20%-75%缓冲液B(于80%-25%缓冲液A中)的线性梯度洗脱。Fractogel EMD SE Hi-Cap柱洗脱液接着通过添加0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH3.4)调整至pH3.5±0.1以达成低pH值病毒失活。低pH值病毒失活的Fractogel EMD SE Hi-Cap柱洗脱液调整至2M NaCl及pH5.0(通过添加0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0))，接着装载于ToyoPearl丁基650M柱上，用10mM乙酸盐/磷酸盐、2M NaCl(pH5.0)(缓冲液A)洗涤，接着用35%缓冲液A与65%缓冲液B(10mM乙酸盐/磷酸盐(pH5.0))的混合物洗脱。ToyoPearl丁基650M洗脱液缓冲液交换至20mM NaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、30mM精氨酸盐酸盐、2%(w/v)山梨糖醇(pH5.4)中，且可选调整至3mg/mL GALNS的最终浓度。经缓冲液交换且浓度经调整的GALNS经病毒过滤器(DV20)及DNA过滤器(Mustang Q)过滤以去除任何残余病毒及DNA。添加吐温-20(也称为聚山梨醇酯20或PS20)至最终浓度0.01%(w/v)，从而产生散装原料药(BDS)。BDS储存在2-8℃下或冷冻。

或者，过滤含有重组人类GALNS的生物反应器物质，通过超滤/渗滤浓缩20倍，接着经活性碳过滤，随后装载于捕获柱上。经浓缩的生物反应器物质在电导率约50±5mS/cm下装载于Zn螯合琼脂糖凝胶FF(Zn-IMAC)柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、500mM NaCl(pH7.0)及10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl(pH7.0)(缓冲液A)洗涤，接着用70%缓冲液A与30%10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl、300mM咪唑(pH7.0)(缓冲液B)的混合物洗脱。Zn螯合琼脂糖凝胶FF(Zn-IMAC)柱洗脱液用1.75M乙酸盐(pH4.0)调整至pH4.5±0.1，经MilliporeCOHC过滤器过滤，以30:70(v/v)比率与10mM乙酸盐/磷酸盐(pH4.5)掺合，接着在电导率<7mS/cm下装载于Fractogel EMD SE Hi-Cap(M)柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、50mMNaCl(pH4.5)及80%缓冲液A(10mM乙酸盐/磷酸盐(pH5.0))与20%缓冲液B(10mM乙酸盐/磷酸盐、250mM NaCl(pH5.0))的混合物洗涤，且用20%-75%缓冲液B(于80%-25%缓冲液A中)的线性梯度洗脱。Fractogel EMD SE Hi-Cap柱洗脱液接着通过添加0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH3.4)调整至pH3.5±0.1以达成低pH值病毒失活。低pH值病毒失活的Fractogel EMD SEHi-Cap柱洗脱液调整至2M NaCl及pH5.05±0.1(通过添加0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0))，与10mM乙酸盐/磷酸盐(pH5)(含有5M NaCl以达成2M NaCl浓度)掺合，接着装载于ToyoPearl丁基650M柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、2M NaCl(pH4.4±0.1)及10mM乙酸盐/磷酸盐、2.5M NaCl(pH5.0)(缓冲液A)洗涤，接着依次用100%至32%缓冲液A及0%至68%缓冲液B(10mM乙酸盐/磷酸盐(pH5.0))的线性梯度及32%缓冲液A与68%缓冲液B的混合物洗脱。ToyoPearl丁基650M洗脱液缓冲液交换至20mM NaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、30mM精氨酸盐酸盐、2%(w/v)山梨糖醇(pH5.4)中，且可选调整至3mg/mL GALNS的最终浓度。经缓冲液交换且浓度经调整的GALNS经病毒过滤器(DV20)及DNA过滤器(Mustang Q)过滤以去除任何残余病毒及DNA。添加吐温-20(也称为聚山梨醇酯20或PS20)至最终浓度0.01%(w/v)，从而产生散装原料药(BDS)。BDS储存在2-8℃下或冷冻。

下文详述重组人类GALNS的纯化，且下文详述根据自以上方案修改的程序纯化重组人类GALNS。

重组人类GALNS酶如实施例III中所述表达于G71S细胞中且如实施例V或实施例VI中所述加以纯化。本发明的经纯化重组人类GALNS可与文献报导的其它GALNS制品进行比较。Masue等人,J. Biochem.110:965-970,1991描述来自人类胎盘的GALNS的纯化及表征。发现经纯化酶的分子质量为120kDa，由40kDa及15kDa的多肽组成，后者显示为糖蛋白。因此，Masue等人GALNS酶似乎对应于图5中描述的经加工形式。Bielicki等人,Biochem.J.279:515-520,1991描述来自人类肝的GALNS的纯化及表征。当通过SDS-PAGE分析时，酶在非还原条件下具有70kDa的分子质量且在还原条件下具有分子质量57kDa、39kDa及19kDa。Bielicki等人,Biochem J.311:333-339,1995描述来自中国仓鼠卵巢细胞的重组人类GALNS的纯化及表征。在进行SDS-PAGE时，发现经纯化酶在非还原条件下具有58-60kDa的分子质量且在还原条件下具有55-57kDa、39kDa及38kDa的分子质量。因此，Bielicki等人GALNS酶似乎对应于图5中描述的酶的加工前(前体)形式与经加工形式的混合物。相比较而言，本发明的重组人类GALNS酶几乎完全由酶的前体形式组成(参见图9及图12)，或主要(即至少约85%)由酶的前体形式组成(参见图10)。

IV.溶酶体硫酸酯酶及溶酶体储积疾病

溶酶体硫酸酯酶为全长酶或其至少保留酶的实质量(例如至少约50%、优选至少约75%、且更优选至少约90%)的基本上所有或所有治疗活性或生物活性(例如硫酸酯酶活性)的任何片段、突变体、变体或衍生物。

在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为若未经表达或产生，或若表达或产生显著降低，则将导致疾病，包括(但不限于)溶酶体储积疾病的溶酶体硫酸酯酶。在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为若不经表达或产生，或若表达或产生显著降低，可能不会导致疾病，但其不存在或表达或产生降低与疾病，包括(但不限于)溶酶体储积疾病相关的溶酶体硫酸酯酶。优选地，溶酶体硫酸酯酶源于人类或自人类获得。

优选地，在溶酶体储积疾病的治疗中，溶酶体硫酸酯酶为见于细胞中的酶，其若未经表达或产生，或表达或产生显著降低，则将导致溶酶体储积疾病。或者，在溶酶体储积疾病的治疗中，溶酶体硫酸酯酶为如下酶，其不存在或表达或产生显著降低与疾病相关，但其不存在或表达或产生显著降低本身可能不会导致疾病。优选地，溶酶体硫酸酯酶源于人类或白人类获得。

优选地，酶为溶酶体硫酸酯酶，诸如芳基硫酸酯酶A(ARSA)(Genbank登录号NP_000478(同功异型物a)、Genbank登录号NP_001078897(同功异型物b)及其它变体)、芳基硫酸酯酶B/N-乙酰葡糖胺4-硫酸酯酶(ARSB)(Genbank登录号P15848)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)(Genbank登录号NP_000193(同功异型物a)、Genbank登录号NP_006114(同功异型物b))、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)(Genbank登录号NP_000190)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)(Genbank登录号NP_002067)及半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)(Genbank登录号NP_000503)。溶酶体储积疾病及其中缺乏的适用作治疗剂的溶酶体硫酸酯酶的表格如下：

溶酶体储积疾病缺乏的溶酶体硫酸酯酶

II型黏多糖病亨特综合征艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶

Ilia型黏多糖病圣菲利柏综合征磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶

IIID型黏多糖病圣菲利柏综合征 N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶

IVA型黏多糖病莫奎欧综合征 N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶

VI型黏多糖病 N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶

异染性脑白质营养不良(MLD) 芳基硫酸酯酶A

多种硫酸酯酶缺乏症(MSD) 多种硫酸酯酶

在优选实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为由内涵体酸化缺乏的细胞系产生的重组人类溶酶体硫酸酯酶。在更优选实施方式中，重组人类溶酶体硫酸酯酶具有活性且具有高含量的如在“定义”下指定的磷酸化寡糖。在最优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

因此，可使用本发明方法来治疗或预防的溶酶体储积疾病包括(但不限于)异染性脑白质营养不良或MLD、马拉二氏综合征或MPS VI、亨特综合征或MPS II、圣菲利柏A综合征或MPS IIIa、圣菲利柏D综合征或MPS IIId，及莫奎欧A综合征或MPS IVa。在特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为其缺乏会引起莫奎欧A综合征或MPS IVa的溶酶体硫酸酯酶。在另一特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶为其缺乏与人类溶酶体储积疾病，诸如多种硫酸酯酶缺乏症或MSD相关的溶酶体硫酸酯酶。

因此，根据上表，对于各疾病，溶酶体硫酸酯酶将优选包含疾病中缺乏的特定活性溶酶体硫酸酯酶。举例而言，对于涉及MPS II的方法，优选酶为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIIA的方法，优选酶为磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIID的方法，优选酶为N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶。对于涉及MPS IVA的方法，优选酶为半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。对于涉及MPSVI的方法，优选酶为N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶。对于涉及异染性脑白质营养不良(MLD)的方法，优选酶为芳基硫酸酯酶A。对于涉及多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)的方法，酶可为芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B/N-乙酰葡糖胺4-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶或半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，且优选酶为半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

V.IVA型黏多糖病(莫奎欧综合征，MPS IVA)

IVA型黏多糖病(莫奎欧综合征，MPS IVa)为属于黏多糖储积疾病群的遗传性常染色体隐性疾病。莫奎欧综合征由为降解两种葡糖胺聚糖(GAG)硫酸角质素(KS)及软骨素-6-硫酸酯(C6S)所需的溶酶体酶缺乏所引起。具体的，MPS IVa的特征在于不存在酶N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及KS在尿中排泄。GALNS的缺乏导致异常大量的黏多糖在骨骼组织的主要组分透明软骨中累积。所有患者都患有全身性骨骼结构不良。其它症状在不同患者间的严重性有所不同，且尤其可包括听力丧失、白内障、脊椎不稳定性、心脏瓣膜疾病及呼吸道问题。

GALNS使KS的半乳糖-6-硫酸酯及C6S的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯的硫酸酯键水解。人类GALNS表达为仅具有2个潜在天冬酰胺连接的糖基化位点的55-60kDa前体蛋白。甘露糖-6-磷酸酯(M6P)为存在于GALNS分子上的寡糖的一部分。M6P由溶酶体细胞表面的受体所识别且因此对于GALNS的高效摄取至关重要。

如同所有硫酸酯酶，GALNS需要由硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)基因所编码的甲酰甘氨酸-活化酶(FGE)加工以获得活性。由于此活化步骤涉及将活性位点半胱氨酸残基翻译后修饰成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)，所以重组硫酸酯酶的过度表达会导致产生具有低比活性的硫酸酯酶(即经活化与未经活化硫酸酯酶的混合物)与具有低产生效价(即未经活化的硫酸酯酶降解及/或不分泌)的硫酸酯酶两者。

本发明的一个目标在于提供一种适用于治疗莫奎欧综合征及由酶N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏引起或与酶N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏相关的其它疾病(例如多种硫酸酯酶缺乏症(MSD))的活性高度磷酸化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。所述种活性高度磷酸化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶能够定位于KS及C6S累积的组织，具有足够M6P含量以供高效摄取，具有足够高的FGly百分比以达成酶活性，且具有相对较高的产生程度。

应了解本文所述的本发明方法适用于产生其它溶酶体硫酸酯酶，例如芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B/N-乙酰葡糖胺4-硫酸酯酶(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)及N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)，所述其它溶酶体硫酸酯酶适用于治疗由其缺乏引起或特征在于其缺乏的溶酶体储积疾病。

VI.医药组合物及投药

本发明的溶酶体硫酸酯酶可通过多种途径来施用。对于口服制品，溶酶体硫酸酯酶可单独使用或与适当添加剂组合使用以制备锭剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，例如与熟知添加剂，诸如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与黏合剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁；及必要时与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂及调味剂组合。

可通过将本发明的溶酶体硫酸酯酶溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(诸如植物油或其它类似油、合成脂族酸甘油酯、高碳脂族酸酯或丙二醇)中；且必要时与熟知添加剂(诸如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂及防腐剂)一起调配来将本发明的溶酶体硫酸酯酶调配成注射制品。

本发明的溶酶体硫酸酯酶可以待经吸入递送的气溶胶制剂形式加以利用。本发明的溶酶体硫酸酯酶可经调配于经加压的可接受的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气及其类似物中。

此外，本发明的溶酶体硫酸酯酶可通过与多种基质，诸如乳化基质或水溶性基质混合而制成栓剂。本发明的溶酶体硫酸酯酶可经由栓剂经直肠施用。栓剂可包括诸如可可脂、卡波蜡(carbowax)及聚乙二醇的载剂，其在体温下熔融，但在室温下凝固。

可提供用于经口或经直肠投药的本发明的溶酶体硫酸酯酶的单位剂型，诸如糖浆、酏剂及悬浮液，其中各剂量单位(例如，一茶匙量、一汤匙量、锭剂或栓剂)含有预定量的含有溶酶体硫酸酯酶的活性剂。类似地，用于注射或静脉内投药的单位剂型可包含呈于无菌水、生理食盐水或另一医药学上可接受的载剂中的溶液形式的溶酶体硫酸酯酶。

在实际使用中，可根据熟知医药混配技术使本发明的溶酶体硫酸酯酶作为活性成分与一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂一起组合成均匀混杂物。载剂、稀释剂或赋形剂可视投药(例如经口或非经肠(包括静脉内))所需的优选制品形式而定采用多种形式。在制备用于口服剂型的溶酶体硫酸酯酶组合物时，可采用任何常用医药介质，诸如，在口服液体制品(例如悬浮液、酏剂及溶液)的情况下为水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂及其类似物；或在口服固体制品(例如散剂、硬胶囊及软胶囊及锭剂)的情况下的载剂，诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、黏合剂、崩解剂及其类似物，其中固体口服制品优于液体制品。

本发明提供本文所述的任何GALNS酶制品的制剂，视情况蛋白质浓度为约0.1至5mg/mL(或0.5至1.5mg/mL)，且视情况pH值为约5-5.8，所述制剂包含(i)可有效减少所述GALNS酶去磷酸化量的磷酸盐缓冲剂；及(ii)稳定量的一种或多种选自下组的稳定剂：氨基酸盐、氨基酸缓冲剂、表面活性剂及多元醇。在一些实施方式中，制剂可包含第二缓冲剂。在某些实施方式中，制剂包含本文所述的任何经纯化重组人类GALNS酶制品、浓度介于约25mM与约75mM之间的磷酸盐缓冲剂、浓度介于约10mM与约30mM之间的乙酸盐缓冲剂、及会减少蛋白质聚集的稳定剂。在一些实施方式中，制剂包含精氨酸或组氨酸盐或缓冲剂、及可选的非离子表面活性剂、及可选的三元或三元以上多元醇(糖醇)。在特定实施方式中，制剂包含精氨酸盐或缓冲剂、聚山梨醇酯(可选聚山梨醇酯20)及山梨糖醇。在任何此等实施方式中，磷酸盐缓冲剂可为NaH₂PO₄。在任何此等实施方式中，乙酸盐缓冲剂可为NaOAc/HOAc。

第二缓冲剂可为适于维持pH值在所要范围内的任何试剂。适合缓冲剂包括Tris、柠檬酸盐、丁二酸盐、乙酸盐、葡糖酸盐或其它有机酸缓冲剂。在一些实施方式中，稳定剂为氨基酸盐或缓冲剂，可选为精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸或谷氨酸的盐或缓冲剂。在一些实施方式中，稳定剂为表面活性剂，可选为非离子表面活性剂。适当的表面活性剂包括聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188或184)、聚氧乙烯衍生物、聚氧丙烯衍生物、单月桂酸钠及SDS。已知非离子表面活性剂的非限制性示例包括具有环氧烷(通常环氧乙烷且通常6-30个环氧乙烷基团)的脂族一级或二级直链或分支链醇或酚。其它已知非离子表面活性剂包括单烷基或二烷基烷醇酰胺、烷基聚葡糖苷及多羟基脂肪酸酰胺。已知阴离子表面活性剂的非限制性示例包括烷基硫酸、烷基醚硫酸、烷芳基磺酸、烷基丁二酸、烷基磺基丁二酸、N-烷氧基肌氨酸、烷基磷酸、烷基醚磷酸、烷基醚羧酸及α-烯烃磺酸的钠盐、铵盐及单乙醇胺盐、二乙醇胺盐及三乙醇胺盐。烷基通常含有8至18个碳原子且可不饱和。烷基醚硫酸盐、烷基醚磷酸盐及烷基醚羧酸盐可含有每个分子1至10个环氧乙烷或环氧丙烷单元且优选含有每个分子2至3个环氧乙烷单元。已知阴离子表面活性剂包括月桂基硫酸钠或月桂基硫酸铵及月桂基醚硫酸钠或月桂基醚硫酸铵。已知两性表面活性剂的非限制性示例包括烷基胺氧化物、烷基甜菜碱、烷基酰胺基丙基甜菜碱、烷基磺基甜菜碱、烷基甘氨酸盐、烷基羧基甘氨酸盐、烷基两性丙酸盐、烷基酰胺基丙基羟磺酸甜菜碱、酰基牛磺酸盐及酰基谷氨酸盐，其中烷基及酰基具有8至18个碳原子。

在一些实施方式中，稳定剂为多元醇或糖，优选三元或三元以上糖醇。适合多元醇包括赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、麦芽糖醇、纤维二糖醇(cellobiitol)、乳糖醇、甘露糖醇、苏糖醇(threitol)、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、内消旋肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油(glycerol)及丙三醇(glycerin)。已知多元醇还包括衍生自乳糖、海藻糖(trehalose)及水苏糖(stachyose)的醇。已知非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖(melezitose)及棉子糖(raffinose)。已知糖还包括木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖；三糖，诸如棉子糖；及多糖，诸如葡聚糖。

本发明还提供一种防止经纯化重组人类GALNS酶去磷酸化的方法，其包含混合所述GALNS酶与可有效减少去磷酸化量的磷酸盐缓冲剂，可选达到介于约25mM与约75mM之间的磷酸盐缓冲剂最终浓度。在一些实施方式中，经纯化重组人类GALNS酶还与第二缓冲剂，包括上述任何试剂混合。在一些实施方式中，酶还与稳定量的一种或多种选自下组的稳定剂混合：氨基酸盐、氨基酸缓冲剂、表面活性剂及多元醇。在示例性实施方式中，例如当在室温(例如25℃)下储存1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月之后测试时，相较于相同酶于1mM磷酸盐缓冲液中的制剂，去磷酸化的量得以减少。在特定实施方式中，在40℃下储存此等时期之后进行加速稳定性测试。

在某些实施方式中，GALNS制剂中去磷酸化的减少(相较于1mM磷酸盐缓冲液)可为至少约2%、约3%、约4%、约5%、约10%、约15%、约20%、约30%、约40%或约50%或50%以上。在另一实施方式中，GALNS上双磷酸化甘露糖7(BPM7)在制剂中的含量为约25%至约40%、或约30%至35%。

在任何前述制剂或方法的实施方式中，GALNS酶都可以是重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸27至522至少95%一致的氨基酸序列，且(i)具有至少约95%的纯度，如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色所测定，(ii)具有位置53的半胱氨酸残基向Cα-甲酰甘氨酸(FGly)至少约80%的转化率，及(iii)具有每条单体蛋白质链0.5至0.8条双磷酸化寡甘露糖链，其中至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的所述GALNS酶呈前体形式，如在还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色，或通过SDS-毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)所测定。

就经皮投药途径而言，经皮递送药物的方法公开于Remington's PharmaceuticalSciences,第17版(Gennaro等人编Mack Publishing Co.,1985)中。真皮或皮肤贴片为用于经皮递送本发明的溶酶体硫酸酯酶的优选手段。贴片优选提供诸如DMSO的吸收增强剂以增加溶酶体硫酸酯酶的吸收。用于经皮药物递送的其它方法公开于美国专利第5,962,012号、第6,261,595号及第6,261,595号中，这些专利各以全文引用的方式纳入本文中。

医药学上可接受的赋形剂(诸如载剂、佐剂、载体或稀释剂)为市售的。此外，医药学上可接受的辅助物质，诸如pH值调整剂及缓冲剂、张力调整剂、稳定剂、湿润剂及其类似物也是市售的。

在这些方面的每一方面中，溶酶体硫酸酯酶组合物包括(但不限于)适于经口、经直肠、表面、非经肠(包括皮下、肌肉内及静脉内)、经肺(经鼻或经颊吸入)或经鼻投药的组合物，但在任何既定情况下，最适合途径都将部分取决于所治疗病状的性质及严重性及活性成分的性质。示例性投药途径为经口及静脉内途径。溶酶体硫酸酯酶组合物可便利地以单位剂型提供且通过制药技术中熟知的任何方法来制备。

由于锭剂及胶囊剂易于施用，故其代表最有利的口服单位剂型，在所述情况下明显会采用固体医药载剂。必要时，锭剂可通过标准水性或非水性技术进行包衣。活性溶酶体硫酸酯酶在此等组合物中的百分比当然可变化且宜介于所述单位的重量的约2%至约60%之间。

本发明的溶酶体硫酸酯酶组合物可囊封于病毒包膜或微脂粒中或与病毒包膜或微脂粒连接或纳入细胞中来施用。微脂粒为胶束(micellular)颗粒，其通常为球形且常为脂质。脂质体为由双层膜形成的微脂粒。适合微脂粒包括(但不限于)单层微脂粒及多层脂质微脂粒或脂质体。可使用诸如在例如美国专利第4,394,448号中所述技术的标准技术自多种脂质或磷脂化合物制备此等微脂粒及脂质体，所述脂质或磷脂化合物诸如磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、糖脂、神经节苷脂等。此等微脂粒或脂质体可用于以细胞内方式施用溶酶体硫酸酯酶且递送溶酶体硫酸酯酶至目标器官。相关溶酶体硫酸酯酶的控制释放还可使用囊封达成(参见例如美国专利第5,186,941号)。

可使用使溶酶体硫酸酯酶组合物稀释至血流中或优选至少在血脑障壁外的任何投药途径。优选溶酶体硫酸酯酶组合物经周边、最优选经静脉内或通过心导管(cardiaccatheter)来施用。颈静脉内及颈动脉内注射也适用。溶酶体硫酸酯酶组合物可局部或区域性施用，诸如腹膜内、皮下或肌肉内施用。在一方面，溶酶体硫酸酯酶组合物与一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂一起施用。

本领域技术人员将易于了解剂量可随特定溶酶体硫酸酯酶、症状严重性及个体对副作用的易感性而变化。既定溶酶体硫酸酯酶的优选剂量可易于由本领域技术人员利用各种手段来确定，所述手段包括(但不限于)在患者、测试动物体内及在体外进行的剂量反应及药物动力学评估。

待施用的剂量也可视个体需要、所要效应、所用特定溶酶体硫酸酯酶及所选投药途径而定。溶酶体硫酸酯酶的剂量在约0.2pmol/kg至约20nmol/kg范围内，优选剂量在2pmol/kg至2nmol/kg范围内，且尤其优选剂量在2pmol/kg至200pmol/kg范围内。或者，溶酶体硫酸酯酶的剂量可在0.01mg/kg至1000mg/kg范围内，优选剂量可在0.1mg/kg至100mg/kg范围内，且尤其优选剂量在0.1mg/kg至10mg/kg范围内。此等剂量将受例如(但不限于)特定溶酶体硫酸酯酶、医药组合物的形式、投药途径及特定溶酶体硫酸酯酶的作用部位的影响。

本发明的溶酶体硫酸酯酶适用于动物且特别是人类的治疗性、防治性及诊断性介入。溶酶体硫酸酯酶可显示在特定组织优先累积。对于诊断性用途而言，优选医学适应症包括例如与相关目标器官(例如肺、肝、肾、脾)相关的任何病状。

本发明方法可用于治疗多种不同疾病病状。在某些实施方式中，特别关注在疾病病状中使用本发明方法，在所述疾病病状中，先前已鉴别具有所要活性的溶酶体硫酸酯酶，但其中溶酶体硫酸酯酶未充分地递送至目标部位、区域或隔室而不能产生完全令人满意的治疗结果。就此等溶酶体硫酸酯酶而言，产生活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的本发明方法可用于增强溶酶体硫酸酯酶的治疗功效及治疗指数。

治疗意欲涵盖与递送溶酶体硫酸酯酶相关的对个体有益的任何结果，包括患上疾病的可能性降低、预防疾病、减缓、阻止或逆转疾病的进展或改善与折磨宿主的疾病病状相关的症状，其中改善或益处在广义上加以使用以至少指代某一参数(例如与所治疗的病理学病状相关的症状，诸如与其相关的发炎及疼痛)量值的减小。同样，治疗还包括以下情况：完全抑制(例如防止发生或阻止，例如终止)病理学病状或至少与其相关的症状，以使宿主不再罹患所述病理学病状或至少不再罹患表征所述病理学病状的症状。

根据本发明方法，多种宿主或个体为可治疗的。此等宿主一般为“哺乳动物”，其中此等术语用以广泛地描述属于哺乳纲(class mammalia)内的有机体，包括食肉目动物(例如狗及猫)、啮齿目动物(例如小鼠、天竺鼠(guinea pig)及大鼠)及灵长目动物(例如人类、黑猩猩及猴)。在许多实施方式中，宿主将为人类。

目前已大体地描述了本发明，经由以下参考以下实施例，可更容易地了解本发明，这些实施例提供用于产生及纯化活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的示例性方案及其在治疗溶酶体储积疾病中的用途。这些实施例仅出于说明性目的提供，而并不意在以任何方式限制本发明的范畴。已作出努力来确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差及偏差。

实施例

实施例I

人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)及人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的哺乳动物表达载体

目标在于构建适于在经稳定转染的细胞中产生足够量的具有改良磷酸化程度的活性溶酶体硫酸酯酶的哺乳动物表达载体。

编码含374个氨基酸的多肽的全长人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)cDNA(参见美国专利申请第US20005/0123949号，公开日期2005年6月9日；及第US2004/0229250号，公开日期2004年11月8日，两者均以全文引用的方式纳入本文中)克隆至含有人类CMV增强子-启动子及多重克隆位点的哺乳动物表达载体cDNA4(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通过存在牛生长激素聚腺苷酸化序列来确保高效的转录终止。选择标记为在EM-7启动子及SV40早期聚腺苷酸化序列控制下的零霉素(zeocin)抗性基因。所得质粒称为pcDNA4SUMF1。图1及图2中分别展示人类SUMF1多核苷酸(SEQ ID NO:1)及多肽(SEQ ID NO:2)序列。

编码含522个氨基酸的多肽(包括含26个氨基酸的信号肽)的全长人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)cDNA(参见Tomatsu等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.181(2):677-683,1991)克隆至含有与兔β-血球蛋白(globin)IVS2内含子连接的人类CMV强化子-启动子及多重克隆位点的哺乳动物表达载体pCIN(BioMarin)中。通过存在牛生长激素聚腺苷酸化序列来确保高效的转录终止。选择标记为携带点突变以降低酶效率的新霉素(neomycin)磷酸转移酶基因。以弱HSV-tk启动子进一步阻止减弱的标记。所得质粒称为pCIN4A。图3及图4中分别展示人类GALNS多核苷酸(SEQ ID NO:3)及多肽(SEQ ID NO:4)序列。

为了增加SUMF1及GALNS的表达量，骨架/基质附着区(MAR)组件(参见Mermod等人,美国专利第7,129,062号)克隆至SUMF1及GALNS表达质粒中。

通过用BamHI及HincII消化经P<1_68X_X NcoI填充的MAR(Selexis)，接着将释放的MAR片段插入用BglII及NruI消化的pcDNA4SUMF1中来制备BMAR SUMF1。

用HindIII及XbaI消化经P<1_68NcoI填充的(MAR)SV40EGFP(Selexis)以去除EGFP基因，接着插入用HindIII及XbaI消化而自pcDNA4SUMF1释放的SUMF1基因来制备PMARSUMF1。

用PmeI及SpeI消化BMAR SUMF1以去除SUMF1基因，接着插入用PmeI及SpeI消化而自pCIN4A释放的GALNS基因来制备BMAR4A。

用HindIII及XbaI消化经P<1_68NcoI填充的(MAR)SV40EGFP(Selexis)以去除EGFP基因，接着插入用HindIII及XbaI消化而自pCIN4A释放的GALNS基因来制备PMAR4A。

全长人类GALNS cDNA还克隆入哺乳动物表达载体pcDNA4(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。用HindIII及XbaI消化pCDNA4SUMF1以去除SUMF1cDNA，且用HindIII及XbaI消化pCIN4A以分离GALNS cDNA。GALNS cDNA HindIII/XbaI片段连接至pcDNA4载体HindIII/XbaI片段中。所得质粒称为pcDNA4-4A。

使用自New England Biolabs获得的酶进行限制性作图(restriction mapping)来确认pCIN4A、BMAR及pCDNA4-4A表达载体中GALNS基因的完整性。PMAR4A表达载体未经定位。

图5中描述人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的经完全加工形式的结构。GALNS表达为具有含26个氨基酸的信号肽序列的含522个氨基酸的多肽。含496个氨基酸的GALNS多肽以所述酶的分子量约55-60kDa的加工前(前体)形式分泌。在活性GALNS中，在前体或经完全加工的GALNS多肽的位置53(对应于全长GALNS多肽的位置79)处的半胱氨酸残基已由硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)转化成C_α-甲酰甘氨酸(FGly)。在溶酶体中，GALNS在经完全加工的GALNS多肽的位置325后裂解，从而产生约40kDa及19kDa的GALNS肽片段。此等GALNS肽由经完全加工的GALNS多肽的位置282及393处的半胱氨酸(C)残基之间的二硫桥键来联接。在经完全加工的GALNS多肽的位置178及397处存在两个典型N-连接糖基化位点。N178上已发现包含2个甘露糖-6-磷酸酯残基的双磷酸化甘露糖7(BPM7)，但N397上未有发现。

实施例II

共表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)与人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S细胞系

目标在于产生能够产生具有改良磷酸化程度的活性溶酶体硫酸酯酶的细胞系。

G71细胞(Rockford K.Draper)直接源于CHO-K1(ATCC CCL-61)。G71细胞系为内涵体酸化温度敏感的CHO-K1突变体，已观测到在高温下，所述突变体会产生若干酶的总蛋白质分泌及甘露糖残基上磷酸化的差异(Park等人,Somat.Cell Mol.Genet.17(2):137-150,1991；Marnell等人,J. Cell.Biol.99(6):1907-1916,1984)。

将G71细胞维持于34℃下补充有2.5%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、庆大霉素(gentamycin)及两性霉素(amphotericin)的BioWhittaker UltraCHO培养基中。

为易于使用细胞系产生蛋白质，用将贴壁依赖性血清依赖性哺乳动物细胞适于高密度无血清悬浮培养的方案(Sinacore等人,Mol.Biotechnol.15(3):249-257,2000)使贴壁G71细胞预先适应于无血清生长培养基，从而产生无血清悬浮培养适应性细胞系G71S。或者，如Sinacore等人所概述，可使贴壁G71细胞在如下文所述经稳定转染后适应于无血清生长培养基。

根据如Selexis所述的MARtech II方案将人类SUMF1与人类GALNS表达载体(实施例I)的成对组合(pcDNA4SUMF1加pCIN44A、BMAR SUMF1加BMAR4A或PMAR SUMF1加PMAR4A)转染至生长于补充有抗生素-抗霉剂溶液(Antibiotic-Antimycotic Solution)(100IU青霉素(Penicillin)、10mg链霉素(Streptomycin)、25μg两性霉素B，Cellgro)的培养基中的G71S细胞中。使转染物池在补充有5%经γ照射的胎牛血清(FBS，JRH)、200μg/mL G418(AGScientific)及200μg/mL匀霉素(Invitrogen)的UltraCHO培养基(Cambrex)中生长，且通过在96孔板中于相同生长培养基中进行限制稀释加以克隆。通过细胞筛检(Cell Screen，Innovatis)成像来监测克隆生长。使用酶捕捉活性ELISA针对活性GALNS筛检所有克隆(参见实施例IV)。通过用GALNS活性的酶捕捉活性ELISA值除以4天期间每天的细胞生长量(Vi-细胞,Beckman Coulter)来计算细胞产率。

产生以下202个G71S克隆且针对活性GALNS加以筛检：用pcDNA4SUMF1加pCIN4A共转染的86个克隆、用BMAR SUMF1加BMAR4A共转染的65个克隆、及用PMAR SUMF1加PMAR4A共转染的51个克隆。最初基于高含量活性GALNS自96孔组织培养板选择克隆(图6A)。使用酶捕捉活性ELISA来测量GALNS活性且用ng/mL(y轴)表示。x轴展示用于SUMF1及GALNS表达的3个共转染条件：hCMV启动子，无MAR；hCMV启动子，有MAR；及SV40启动子，有MAR。各条柱表示来自各别群体的单一克隆。在此96孔克隆筛检中未说明细胞密度且并非所有共转染的G71S克隆都显示于此图中。

选择产生最高活性GALNS的G71S克隆进行产率分析(图6B)。每日细胞产率以皮克/细胞/天计且通过用GALNS活性除以当天的细胞密度来获得。此图显示在以每个烧瓶5×10⁵个细胞接种之后的第四天(96小时)。使用酶捕捉活性ELISA来试验克隆的GALNS，以皮克/细胞/天计(y轴)。阳性对照由表达GALNS的BHK及CHO克隆(BioMarin)组成。各垂直条柱表示单一克隆。由pCIN4A克隆产生活性GALNS，但仅稍高于试验背景。

通过96孔筛检及4天产率试验进行的克隆分析说明相较于无MAR组件的表达载体的共转染，具有MAR组件的表达载体的共转染使G71S克隆产率增加。经BMAR4A+BMAR SUMF1共转染的克隆呈现池快速产生、克隆快速生长、及能够比最高产生性PMAR4A克隆产生2倍以上活性GALNS，且相较于缺乏MAR组件的CHO4A与BHK4A克隆增加多达10倍。

使用Sinacore等人,Mol.Biotechnol.15(3):249-257,2000中概述的方案使表达GALNS的G71S克隆适应于无血清生长培养基。整个适应过程都在选择试剂(200μg/mL匀霉素及200μg/mL新霉素)存在下进行。在T烧瓶中培养的表达GALNS的G71克隆如下进行划分：(1)至含有Cambrex UltraCHO培养基及5%FBS(批号8L2242)的125mL振荡器中；(2)至含有JRH302M培养基(产生培养基)及5%FBS的125mL振荡器中；及(3)至T烧瓶中作为备用(UltraCHO、5%FBS)。一旦产生悬浮培养物，即丢弃贴壁细胞，且起始FBS中断。当3代的生长率恢复至>0.5(1/天)且活力>95%时，FBS浓度降低50%。使细胞处于任何既定FBS浓度下至少3代。一旦适应于在2.5%FBS中生长，细胞即直接置于无血清培养基中。使细胞堆积于含有10%(v/v)DMSO的新鲜培养基中。测试试验解冻物以确保细胞经受得住冷冻过程。来自BMAR4A+BMAR SUMF1转染的表达GALNS的两个G71S克隆(克隆4及5)需要约15代来适应于无血清悬浮培养。还分离来自pcDNA4SUMF1加pCIN4A转染的表达GALNS的克隆C6且使其适应于无血清培养。

基本上如上所述将人类SUMF1与人类GALNS表达载体(实施例I)的成对组合(pcDNA4SUMF1加pCDNA4-4A)转染至G71S细胞中，例外之处为使用200μg/mL匀霉素(Invitrogen)进行选择。基本上如上所述，分离表达GALNS的六个克隆C2、C5、C7、C10、C11及C30且使其适应于无血清悬浮培养。

实施例III

大规模培养表达人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S细胞系

目标在于测量来自表达人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S克隆的酶产量。大规模培养共表达人类SUMF1与人类GALNS的适应无血清悬浮培养的G71S细胞系且评估其活性GALNS酶产量。

因为对于G71S宿主细胞系，适应无血清悬浮培养相对较快，所以确定可在以灌注模式操作的WAVE生物反应器中进行产生。WAVE生物反应器在接种体积方面允许较大灵活性，因为按比例放大可直接在袋中进行，从而降低污染风险且加快物质产生。图7展示WAVE生物反应器配置的示意图。该图展示测力计(load cell)以灌注模式通过测定袋重并调整馈料及收集速率以维持所要体积来监测袋中的培养基体积。在10L袋中，还通过插入至袋中的探针控制pH值为所需设定点。

以1L规模产生来自表达GALNS的G71S克隆4及5的物质。在此等操作中未控制培养物pH值。WAVE袋的操作限制为一天3个容器体积的产量(VV/天)。为了防止物质的任何失活，目标细胞特定灌注速率(CSPR)为0.3奈升/细胞/天，从而使GALNS酶的平均滞留时间为八小时。因此，维持袋中的细胞密度在每毫升约10-12×10⁶个细胞。表达GALNS的G71S克隆4及5的生长率分别为0.16及0.20。直接自袋进行渗移(Bleed)以维持目标细胞密度。

因为先前已显示GALNS在pH6下稳定，所以收集流体pH值调整至介于5.5与6.5之间的pH值以维持酶活性。这通过定时快速添加与离开反应器的收集物线内混合的5体积%pH4.0柠檬酸钠缓冲液来达成。将经调整的收集流体储存在4℃下，随后进行下游加工。表达GALNS的两个G71S克隆4与5的平均效价为约4.2mg/L，相关比产率为约1.25皮克/细胞/天。

以类似方式大规模培养表达GALNS的G71S克隆C2、C5、C6、C7、C10、C11及C30且评估其活性GALNS酶产量。

实施例IV

测量人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的浓度及活性

开发酶联免疫吸附试验(ELISA)来测量共表达人类SUMF1与人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S克隆的GALNS酶浓度及活性。

酶捕捉活性ELISA

在经与ELISA板结合的抗GALNS特异性抗体捕捉之后，酶捕捉活性ELISA测量固相中GALNS酶的活性。

缓冲液。缓冲液A(碳酸盐缓冲液)：将3.09公克Na₂CO₃及5.88公克NaHCO₃溶解于900mL去离子(DI)H₂O中，接着添加DI H₂O至1000mL的最终体积。检查pH值处于9.4与9.6之间，接着过滤-灭菌。为用每孔100μL完全涂布一个96孔微板，将19μL抗GALNS抗体稀释至一个管(12mL)中。缓冲液B(ELISA封闭缓冲液及连续稀释缓冲液)：1×酸性PBS、0.05%吐温-20及2%BSA，用乙酸调整至pH6.5。缓冲液B^W(洗涤缓冲液)：100mM NaOAc及0.05%吐温-20，用乙酸调整至pH6.5。缓冲液C(底物缓冲液)：25mM乙酸钠、1mM NaCl、0.5mg/mL脱盐BSA及0.01%迭氮化钠，用冰乙酸调整至pH4.0。缓冲液D(β-半乳糖苷酶缓冲液)：300mM磷酸氢二钠、0.1mg/mL BSA、0.01%迭氮化钠及0.01%吐温-20，用磷酸调整至pH7.2。缓冲液E(终止缓冲液)：350mM甘氨酸及440mM碳酸盐缓冲液，用6M NaOH调整至pH10.7。

试剂。抗GALNS IgG抗体：多克隆兔抗体为自血清纯化的蛋白G。在D-PBS中，总蛋白质=3.17mg/mL(BCA)。等分试样(19μL)储存在-20℃下，各自使用一次。4MU-Gal-6-S底物(固体；440MW)：于DI水中制备100mM储备物且储存在4℃下。β-半乳糖苷酶(Sigma G-4155)：在使用前于缓冲液D中稀释成12μg/mL。

方案：使抗GALNS抗体与板结合：Nunc MaxiSorp ELISA板(Nalge/NuncInternational,Fisher编号12-565-135)用于缓冲液A中的最终蛋白质浓度为5μg/mL的抗GALNS抗体涂布。为了制备此溶液，解冻一个19μL等分试样，于微量离心机中简短旋转(10秒)以收集液体。将19μL全部转移至12mL缓冲液A中。通过反转来剧烈混合，接着倾入储集器中，随后使用多通道移液器装载板(每孔100μL)。覆盖板且在4℃下孵育过夜。去除未结合的抗GALNS抗体：用缓冲液B^W浇注三次来洗涤板。封闭：用缓冲液B(每孔320μL)封闭板，接着覆盖板且在37℃下孵育1小时。在封闭步骤期间制备经纯化GALNS标准物及测试样品(未知)的一系列稀释液：在缓冲液B中将标准物稀释至试验的线性范围的高端(A列中的128ng/mL)，接着在96孔板上的B-G列中连续稀释(2倍)。泳道H为缓冲液空白(即无GALNS酶)。首先，制备500μL于缓冲液B中的128ng/mL浓度。接着，在缓冲液B中进行2倍连续稀释(250μL至250μL中)直至达到2ng/mL。去除封闭缓冲液：在封闭步骤后，丢弃缓冲液B。使GALNS酶标准物及测试样品与抗GALNS抗体结合：用每孔100μL的经连续稀释的标准物及测试样品(一式两份操作)装载板。覆盖板且在37℃下孵育1小时。去除GALNS抑制品：通过用缓冲液B^W浇注三次来洗涤板。添加GALNS底物(第一反应)：制备足够用于每孔装载100μL的最终底物溶液(在使用前1小时内制备)。于缓冲液C中将4MU-Gal-6-S储备溶液(100mM)稀释至1mM。每孔装载100μL。覆盖板且在37℃下孵育30分钟。添加β-半乳糖苷酶(第二反应)：向各孔中添加50μL含12μg/mlβ-半乳糖苷酶的缓冲液D。覆盖板且在37℃下孵育15分钟。终止反应：向各孔中添加100μL缓冲液E(终止缓冲液)以使释放的4MU离子化。转移至荧光板：转移(一次8个孔)来自ELISA板各孔250μL中的200μL至黑色未处理平底微量滴定板(荧光板,Costar编号3915)。读取荧光：使用SOFTmax PRO程序(366nm激发，446nm发射，435nm截止)在Gemini板读取器(Molecular Devices Corporation)中读取板。

GALNS ELISA

GALNS ELISA使用夹心式免疫试验测量细胞培养条件培养基或其它过程样品中GALNS酶的浓度。

缓冲液。缓冲液A(碳酸盐缓冲液)：将3.09公克Na₂CO₃及5.88公克NaHCO₃溶解于900mL去离子(DI)H₂O中，接着添加DI H₂O至1000mL的最终体积。检查pH值处于9.4与9.6之间，接着过滤-灭菌。为用每孔100μL完全涂布一个96孔微板，将19μL抗GALNS抗体稀释至一个管(12mL)中。缓冲液B(ELISA封闭缓冲液及连续稀释缓冲液)：1×酸性PBS、0.05%吐温-20及2%BSA，用乙酸调整至pH6.5。缓冲液B^W(洗涤缓冲液)：100mM NaOAc及0.05%吐温-20，用乙酸调整至pH6.5。缓冲液F(终止缓冲液)：2N H₂SO₄：总计600mL，添加100mL12N H₂SO₄及500mLMilliQ水。

试剂。抗GALNS IgG抗体：兔多克隆抗体为自血清纯化的蛋白G。在D-PBS中，总蛋白质=3.17mg/mL(BCA)。等分试样(19μL)储存在-20℃下，各自使用一次。经HRP结合的检测抗体(RIVAH)：最终经结合抗体1:100稀释至D-PBS/1%BSA中且以120μL等分试样储存在-20℃下以供使用一次。TMB EIA底物试剂盒(BioRad编号172-1067)。

方案。使抗GALNS抗体与板结合：Nunc MaxiSorp ELISA板(Nalge/NuncInternational,Fisher编号12-565-135)经于缓冲液A中的最终蛋白质浓度为5μg/mL的抗GALNS抗体涂布。为了制备此溶液，使一个19μL等分试样解冻，于微量离心机中简短旋转(10秒)以收集液体。将19μL全部转移至12mL缓冲液A中。通过反转来剧烈混合，接着倾入储集器中，随后使用多通道移液器装载板(每孔100μL)。覆盖板且在37℃下(对流孵育箱)孵育2小时。不使用热封闭。去除未结合的抗GALNS抗体：用缓冲液B^W浇注三次来洗涤板。封闭：用缓冲液B(每孔320μL)封闭板，接着覆盖板且在37℃下孵育1小时。在封闭步骤期间制备经纯化GALNS标准物及测试样品(未知)的一系列稀释液：在缓冲液B中将标准物稀释至试验线性范围的高端(A列中的40ng/mL)，接着在96孔板上的B-G列中连续稀释(2倍)。泳道H为缓冲液空白(即无GALNS酶)。首先，制备500μL于缓冲液B中的40ng/mL浓度。接着，在缓冲液B中进行2倍连续稀释(250μL至250μL中)直至达到0.625ng/mL。去除封闭缓冲液：在封闭步骤后，丢弃缓冲液B。使GALNS酶标准物及测试样品与抗GALNS抗体结合：用每孔100μL的经连续稀释标准物及测试样品(一式两份操作)装载板。覆盖板且在37℃下孵育1小时。洗涤：通过用缓冲液B^W浇注三次来洗涤板。结合检测抗体结合物：使抗体RIVAH的一个等分试样(120μL)解冻，于微量离心机中简短旋转(10秒)以收集液体。将120μL全部稀释至11.9mL缓冲液B中且将管剧烈反转以进行混合。倾至储集器中且用多通道移液器每孔添加100μL。覆盖板且在37℃下孵育30分钟。洗涤：通过用缓冲液B^W浇注三次来洗涤板。TMB底物：通过混合1.2mL溶液B与10.8mL溶液A来制备最终底物溶液。倾至储集器中且用多通道移液器每孔添加100μL。覆盖板且在37℃下孵育15分钟。终止溶液：将12mL2N H₂SO₄终止溶液吸移至储集器中且用多通道移液器每孔添加100μL。温和地轻拍以进行混合。读取A450：在板读取器中读取板。

GALNS比活性试验

GALNS比活性试验使用GALNS特异性底物测量GALNS于溶液中的酶活性。

缓冲液。所有缓冲液均使用MilliQ H₂O。稀释缓冲液(DB)：对于1LDB，将1.74mL乙酸、0.75g乙酸钠、233.6mg NaCl、2mL50%吐温-20及10mL1%迭氮化钠溶解于MilliQ H₂O中，且若pH值小于3.95则用0.1M NaOH，若pH值大于4.05则用0.1M乙酸调整pH值至4.0+/-0.5。最终浓度为：19.5mM乙酸、5.5mM乙酸钠、1mM NaCl、0.1%吐温-20及0.01%迭氮化钠。磷酸盐缓冲液(PB)：对于1L PB，将13.9g NaH₂PO₄-H₂O及55g NaHPO₄-7H₂O溶解于MilliQ H₂O中，且调整pH值至7.2。最终浓度为300mM NaPi。终止缓冲液(SB)：对于1L SB，将26.2g甘氨酸及46.6g碳酸钠溶解于MilliQ H₂O中，且用NaOH调整pH值至10.6。试验缓冲液(AB)：于DB中1:50稀释4MU-Gal-6S储备物(最终2mM)。β-半乳糖苷酶缓冲液(βGB)：25μg/mLβ-半乳糖苷酶于300mM NaPi中，pH7.2。

试剂。4MU-Gal-6S：100mM于H₂O中(Toronto Research Chemicals目录号M334480)。β-半乳糖苷酶：Sigma G-4155。4-甲基伞酮(4MU标准物)：Sigma M-1381(于DMSO中的10mM储备溶液)。

方案。对GALNS酶进行连续稀释。对于经纯化及经调配的GALNS(约1.5mg/ml)，于含有DB的低蛋白粘附的微量离心管(USA Scientific目录号1415-2600)中1:10,000稀释样品，随后进行1:1连续稀释。将100μL DB置于低蛋白结合96孔板中。在第一列中，吸移100μLGALNS样品。此刻沿板向下(96孔板上的A-G)进行连续稀释(1:1)。孔H中不添加样品(空白)。此试验的线性范围为1-75ng/mL。使用相同程序来制备4MU标准曲线。于DB中1:100稀释10mM4MU的DMSO储备溶液。通过在第一孔中添加50μL50μM4MU来起始4MU标准曲线，接着连续稀释。向96孔荧光板中添加50μL于AB中稀释的底物(2mM4MU-半乳糖-6S于DB中)。在37℃下预孵育底物10分钟。向50μL含底物的AB中添加100μL GALNS及4MU标准物的连续稀释液中的50μL。在37℃下孵育30分钟(此第一反应自底物去除硫酸盐)，淬灭第一反应且通过添加50μL β-半乳糖苷酶(于βGB中稀释β-半乳糖苷酶储备物至25μg/mL)来起始第二反应。磷酸盐抑制GALNS且pH值增加还会终止GALNS反应。所得pH值此刻处于β-半乳糖苷酶的最优选pH值范围。在37℃下孵育此第二反应15分钟。通过添加100μL SB来使释放的4MU离子化。在96孔荧光板读取器上读取Ex355Em460。酶活性计算(在37℃下于pH4.0缓冲液中)：1单位=μmol4MU释放量/min；活性=μmol4MU/min/mL；比活性=μmol4MU/min/mg。蛋白质浓度计算：使用GALNS的消光系数(在280nm下，1mg/mL=1.708个吸光度单位)。

实施例V

纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)

目标在于获得大量重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。使共表达人类SUMF1及人类GALNS的经稳定转染的G71细胞在生物反应器培养条件下生长，且自细胞培养基纯化活性GALNS酶。

液相层析装置。Amersham Pharmacia Biotech AKTA explorer900系统，利用Unicorn控制软件。

蛋白质分析方法。遵循SDS-PAGE、考马斯蓝染色(B101-02-COOM)、蛋白质印迹法及布莱德福(Bradford)蛋白质试验的标准程序。通过活性产生来评估纯化操作，且GALNS产物的纯度通过SDS-PAGE目视评估。通过使用抗GALNS抗体的蛋白质印迹法来检测经加工的杂质的存在。使用布莱德福蛋白质试验测量蛋白质浓度。通过使用1.708的消光系数进行A₂₈₀测量来对最终经纯化GALNS蛋白的浓度进行测量。

层析树脂。蓝色琼脂糖凝胶6FF(GE Healthcare,批号306346)及Fractogel SEHi-Cap(Merck KgaA,FC040894449)。

GALNS酶活性测定。使用小荧光底物4-甲基伞酮酰基-6-S-GAL(4-MU-6-S-GAL)来测定GALNS比活性。GALNS比活性试验涉及两步反应，其中在将GALNS与底物一起孵育某一时间以释放荧光标签后必需添加β-半乳糖苷酶。使用荧光板读取器进行测量。

用平衡缓冲液(EQB，50mM NaOAc、10mM NaCl(pH5.8))平衡10DG脱盐柱(Bio-RAD)。所有缓冲液均使用MilliQ H₂O。将三(3)mL经纯化GALNS(0.5-2mg/mL)装载于脱盐柱上，洗脱且使用EQB以4mL等分试样收集于单独试管中。使用GALNS的消光系数(在280nm下，1mg/mL=1.708个吸光度单位)来计算蛋白质浓度。

将经脱盐GALNS样品连续稀释(1:1)于稀释缓冲液(DB，50mM NaOAc、1mM NaCl(pH4.0)+0.5mg/mL BSA)中。在使用前通过将50mg/mL BSA储备物(不超过5%CV)装载于先前用milliQ H₂O平衡的G25柱上来将BSA储备物脱盐。将100μL经脱盐GALNS样品吸移于低蛋白结合96孔板第一列中，且沿板向下(96孔板上A-G列)吸移连续稀释的GALNS样品。100μL DB吸移至最后一个孔(H)中。此试验的线性范围的上限为200ng/mL，且线性范围为3-200ng/mL。进行相同程序以用4-甲基伞酮(4MU)(Sigma M-1381，于DMSO中的10mM储备物)制备标准曲线。100L GALNS及4MU的连续稀释液中的50μL转移至新96孔荧光板(黑底板)中。添加50μL2mM4MU-半乳糖-6S(于milliQ H₂O中)至待试验的样品中，且在37℃下孵育30分钟。淬灭此第一反应，且通过添加50μL β-半乳糖苷酶(Sigma G-4155，储备物于300mM NaPi(pH7.2)中稀释至12μg/mL)，且在37℃下孵育15分钟。通过添加100μL终止缓冲液(甘氨酸/碳酸盐(pH10.6))使释放的4MU离子化。在96孔荧光板读取器(激发355nm，发射460nm)上读取板。1单位定义为1μmol释放的4MU/min，酶活性以μmol4MU/min/mL给出，且比活性以μmol4MU/min/mg给出，所有都在37℃下，于pH4.0缓冲液中。

第一纯化过程。第一纯化过程包括超滤(UF)步骤，接着为2柱纯化过程。

1.收集物过滤(HF)：使生物反应器物质经0.2μm无菌过滤。

2.超滤(UF)：生物反应器物质通过经30kD Sartocon膜超滤而浓缩10-20倍。

3.pH4.5调整：在室温下用pH值调整缓冲液(1.75M NaOAc(pH4.0))将浓缩的生物反应器物质(UF(20倍))调整至pH4.5且无菌过滤，随后装载于蓝色琼脂糖凝胶柱上。

4.蓝色琼脂糖凝胶6速流(FF)：将经调整为pH4.5的UF(20倍)装载于蓝色琼脂糖凝胶柱上且如表1及图9A中所示来洗脱GALNS蛋白。

表1：蓝色琼脂糖凝胶6速流层析

步骤	CV*	缓冲液
			平衡	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH4.5
装载		UF产物，调整至pH4.5，过滤
			洗涤1	4	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH4.5
洗涤2	8	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH6.0
			洗脱	8	20mM乙酸盐/磷酸盐、100mM NaCl，pH7.0
洗提	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、1M NaCl，pH7.0
			消毒	4	0.1N NaOH，0.5小时
再生	5	H₂O
			储存	3	20%ETOH

*CV：柱体积。流速=92cm hr^-1

5.Fractogel SE Hi-Cap：将来自蓝色琼脂糖凝胶柱的洗脱液调整至pH4.3且装载于Fractogel SE Hi-Cap柱上且如表2及图9B中所示来洗脱GALNS蛋白。

表2：Fractogel SE Hi-Cap层析

步骤	CV*	缓冲液
			平衡	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH4.3
装载		调整至pH4.3且用MQ水1:1稀释的蓝色琼脂糖凝胶洗脱液
			洗涤1	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH5.0
洗涤2	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH5.5
			洗脱	20	20mM乙酸盐/磷酸盐、50-350mM NaCl梯度，pH5.5
再生1	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、500mM NaCl，pH5.5
			再生2	5	20mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl，pH4.3
消毒	5	0.5N NaOH，0.5小时
			再生3	4	H₂O
储存	3	20%EtOH

*CV：柱体积。流速=150cm hr^-1

通过分级、丢弃洗脱前的“肩”(pre-elution shoulder)及洗脱后的“尾”(post-elution tail)来收集洗脱液中的GALNS蛋白。

6.最终UF/HF：如上所述，来自Fractogel SE Hi-CAP柱的洗脱液通过超滤加以浓缩且无菌过滤。

调配。在10mM NaOAc、1mM NaH₂PO₄、0.005%吐温-80(pH5.5)中调配经纯化GALNS蛋白。

稳定性研究。通过在4℃及-70℃下于各别温度下储存GALNS样品的小等分试样来监测最终调配的经纯化GALNS随时间的稳定性。在某些时间点，在37℃水浴中快速解冻冷冻样品的等分试样，随后测量活性。图8显示经纯化GALNS在4℃及-70℃下于调配缓冲液中稳定多达至少79天的时期。

第一纯化过程结果。表3显示由悬浮培养生物反应器中的G71S克隆4产生的3种GALNS蛋白制品的纯化产率。在所有情况下，通过SDS-PAGE目检估计纯度都为约95%。

表3：来自WAVE反应器的G71S克隆4的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)纯化产率

图9展示通过(A)蓝色琼脂糖凝胶6速流层析、随后(B)Fractogel SE Hi-CAP层析分离的GALNS蛋白的SDS-PAGE。凝胶用考马斯蓝(左)或抗GALNS抗体(右)染色。对于蛋白质印迹法，1:5000稀释抗GALNS兔抗体，且二次抗体为抗碱性磷酸酯酶兔抗体。GALNS蛋白在SDS-PAGE上具有约55-60kDa的表观分子量，此与所述酶的缺乏含26个氨基酸残基的信号肽以及在325位置后缺乏裂解的分泌性加工前(前体)形式的预期尺寸一致。

N端表征。通过LC/MS确定经纯化GALNS蛋白的N端。N端序列为APQPPN，其对应于GALNS的缺乏含26个氨基酸残基的信号肽的分泌形式的预测N端(比较图4及图5中的人类GALNS多肽序列)。

第二纯化过程。第二纯化过程包括超滤/渗滤(UF/DF)步骤，接着为3柱纯化过程。

1.超滤(UF/DF)：通过在pH5.5下经30kD Sartocon膜超滤/渗滤将生物反应器物质浓缩20倍。

2.pH4.5调整：在室温下用pH值调整缓冲液(1.75M NaOAc(pH4.0))将浓缩的生物反应器物质(UF/DF(20倍))调整至pH4.5且无菌过滤，随后装载于Fractogel EMD SE Hi-Cap柱上。

3.Fractogel EMD SE Hi-Cap：将调整为pH4.5的UF/DF(20倍)装载于FractogelEMD SE Hi-Cap柱上，依序用10mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH4.5)及10mM乙酸盐/磷酸盐、50mM NaCl(pH5.0)洗涤，且用10mM乙酸盐/磷酸盐、140mM NaCl(pH5.0)洗脱GALNS蛋白。

5.Zn螯合琼脂糖凝胶FF：将来自Fractogel EMD SE Hi-Cap柱的洗脱液调整至500mM NaCl(pH7.0)且装载于Zn螯合琼脂糖凝胶FF(Zn-IMAC)柱上，用10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl、10mM咪唑(pH7.0)洗涤，且用10mM乙酸盐/磷酸盐、125mM NaCl、90mM咪唑(pH7.0)洗脱GALNS蛋白。

6.pH值3.5调整：将来自Zn螯合琼脂糖凝胶FF柱的含有GALNS蛋白的洗脱液调整至pH3.5以达成低pH值病毒失活，接着调整至10mM乙酸盐/磷酸盐、2M NaCl(pH5.0)。

7.ToyoPearl丁基650M：将来自Zn螯合琼脂糖凝胶FF柱的经调整为低pH值的洗脱液装载于ToyoPearl丁基650M柱上，用10mM乙酸盐/磷酸盐、2M NaCl(pH5.0)洗涤，且用10mM乙酸盐/磷酸盐、0.7M NaCl(pH5.0)洗脱GALNS蛋白。

8.最终UF/HF：将来自ToyoPearl丁基650M洗脱液的洗脱液超滤且渗滤于20mM乙酸盐、1mM磷酸盐、150mM NaCl(pH5.5)中。

调配。在10mM NaOAc/HOAc、1mM NaH₂PO₄、150mM NaCl、0.01%吐温-20(pH5.5)中调配经纯化GALNS蛋白。

第二纯化过程结果。表4显示使用第二纯化过程由悬浮培养生物反应器中的G71S克隆C2产生的GALNS蛋白的回收率。如通过C3RP-HPLC所测定，经调配的GALNS酶(即前体与成熟或经加工形式一起)的纯度为约98%。如通过SDS-毛细管凝胶电泳所测定，GALNS酶的前体形式的百分比为约85%。

表4：G71S克隆C2的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)回收率

加工步骤	回收率(%)
		pH值调整	96
Fractogel SE Hi-Cap柱	98
		Zn-IMAC柱	89
低pH值病毒失活	89
		ToyoPearl丁基650M柱	99
调配	99
		总计	70

图10显示通过超滤/渗滤(UF/DF)、Fractogel SE Hi-CAP层析、Zn螯合琼脂糖凝胶FF层析及ToyoPearl丁基650M层析分离的GALNS酶的SDS-PAGE。凝胶用考马斯蓝(左上)、抗GALNS抗体(右上)、抗组织蛋白酶L(左下)及抗CHO蛋白(CHOP，右下)染色。对于蛋白质印迹法，1:5000稀释抗GALNS兔多克隆抗体，且二次抗体为抗兔AP结合物；1:1000稀释抗组织蛋白酶L山羊多克隆抗体，且二次抗体为抗山羊HRP结合物；且1:1000稀释抗CHOP兔多克隆抗体，且二次抗体为抗兔HRP结合物。前体GALNS酶在SDS-PAGE上具有约55-60kDa的表观分子量，且GALNS酶的成熟或经加工形式在SDS-PAGE上具有约39kDa及约19kDa的表观分子量。

第一纯化过程的概述。使用已自标准组列(standard train)改进的纯化组列(purification train)(参见表5)来纯化GALNS酶。生物反应器收集物质经0.2μm无菌过滤且保持在4℃下，随后装载于蓝色琼脂糖凝胶捕获柱上。经过滤的生物反应器物质直接装载或通过超滤浓缩多达15倍。因为下游纯化步骤(即SP琼脂糖凝胶层析，随后为苯基琼脂糖凝胶层析)不产生足够纯的GALNS，所以必须改进纯化组列。使用SE Hi-Cap层析作为对两个下游纯化柱的替代产生2柱纯化过程，最终物质的纯度得以显著改良，且总GALNS回收率自约22%显著增加至约80%。如通过C4-RP层析所测定，GALNS酶(基本上由前体形式组成，参见图9)的纯度粗略估计为>95%，且经纯化的GALNS酶在4℃下及在-70℃下均在调配缓冲液中保持稳定达79天以上。

表5：第一人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)纯化组列

步骤	正常过程	改进过程
			1	HF(1×)	HF(1×)
2*	UF(5×)	UF(15×)
			3	pH4.5调整	pH4.5调整
4	蓝色琼脂糖凝胶6FF	蓝色琼脂糖凝胶6FF
			5	SP琼脂糖凝胶	SE Hi-Cap
6	苯基琼脂糖凝胶Hi-Sub	最终UF/DF
			7	最终UF/DF

*此步骤视情况选用。

第二纯化过程概述。GALNS酶还使用第二纯化组列(参见表6)纯化。总GALNS回收率为约70%且如通过C4-RP层析所测定，GALNS酶(包括前体与成熟或经加工形式两种，参见图10)的纯度粗略估计为约97%。

表6：第二人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)纯化组列

步骤	过程
		1	HF(1×)
2	UF/DF(20×)
		3	pH4.5调整
4	SE Hi-Cap
		5	Zn螯合琼脂糖凝胶
6	pH3.5调整
		7	ToyoPearl丁基650M
8	最终UF/DF

此等试验指示上述用于制备重组溶酶体硫酸酯酶的方案提供一种高效产生大量高度纯化酶(特别是人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的分泌性加工前(前体)形式)的方法。

实施例VI

在剪切最小情况下纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)

对重组酶的蛋白水解消化的控制为产生及调配蛋白质基治疗剂中所关心的问题。目标在于获得大量呈分泌性加工前(前体)形式的重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。开发一种允许在由蛋白酶(特别是组织蛋白酶L)所致的剪切最小的情况下大规模制备人类GALNS的产生方法。

如本文所用，“最小剪切”指通过还原条件下进行SDS-PAGE然后进行考马斯蓝染色，或通过SDS-毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)所判断，在最终经纯化制剂中GALNS至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%完整。

在开发用于大规模制备GALNS的产生方法期间，发达酶的约55kDa分泌性前体形式易经在酸性pH值下具有活性的蛋白酶(特别是组织蛋白酶L)蛋白水解降解。蛋白酶降解GALNS会产生GALNS的成熟剪切形式，其可在还原条件下进行的SDS-PAGE上作为约40kDa及约19kDa的两条带被观察到。此蛋白水解剪切由阳离子交换柱捕捉步骤所需的低pH值(即4.5至5.0)加剧。此pH值范围提供有利于细胞培养收集物中存在的酸性蛋白酶(诸如组织蛋白酶)活性的条件。

在GALNS回收及纯化过程中作出变化以使可剪切分泌至细胞培养基中的GALNS的蛋白酶的存在及/或活性最小。

描述用于大规模制备GALNS的示例性回收及纯化过程的流程图展示于图11中。左边的过程显示第I/II阶段过程中使用的类似于以上实施例V中所述纯化组列的回收及纯化过程，其产生可变量的归因于组织蛋白酶L活化的剪切，在约6-30%肽链的范围内，如通过在还原条件下操作SDS-PAGE，随后进行考马斯蓝染色(参见图12，泳道3)所测定；或在65.3%至93.7%范围内的GALNS完整前体形式，如通过SDS-CGE所判断(参见表8)。SDS-PAGE方法提供目视但更定性的蛋白质降解信息，而SDS-CGE方法提供关于最终经纯化制剂中存在的完整蛋白质%的更定量信息。

图11中右边的过程显示第III阶段过程中使用的回收及纯化过程，其产生最小剪切，在98%至99.6%范围内的GALNS完整前体形式，如通过在还原条件下操作SDS-PAGE，随后进行考马斯蓝染色(参见图12，泳道5)，或通过SDS-CGE(参见表8)所判断。

过程变化的概述。为了降低GALNS剪切的程度及可变性，考虑2个因素：(i)在中性pH值下蛋白酶活性显著较小；及(ii)阳离子交换层析与固定金属亲和层析(IMAC)两种步骤均使蛋白酶与GALNS分离。第III阶段过程(参见图11，右边)利用此等因素且帮助降低纯化程序期间GALNS的剪切。这是通过转换前2个柱步骤的顺序，且在pH6.5至7.0下捕捉于Zn-IMAC柱上来达成。转换前2个柱还使得相较于在第I/II阶段过程(参见图11，左边)中使用的较具酸性的pH值(即pH5.5)，在较高pH值(即pH6.5)下收集及储存细胞培养收集物较便利。在pH6.5下储存无细胞收集物会降低细胞培养流体中存在的蛋白酶(例如组织蛋白酶)活化的可能性，藉此防止或降低GALNS的剪切。

第III阶段过程。以下概述GALNS的示例性第III阶段过程回收及纯化中的各步骤。

1.无细胞收集物(1×)。使共表达人类SUMF1与人类GALNS的经稳定转染的G71细胞如实施例III中所述在生物反应器培养条件下生长。在pH6.5下收集含有GALNS的生物反应器物质(即细胞培养流体)，且使用依次为CUNO30SP02A、CUNO90ZA08A及0.2μm CUNOBioAssure过滤器的过滤组列加以过滤。

2.UF/DF(20×)。细胞培养流体经超滤/渗滤(UF/DF)至电导率≤7mS/cm的10mM磷酸盐/乙酸盐、50mM NaCl(pH6.5)中。使用Sartocon30kDa Hydrosart卡匣进行UF/DF步骤。将细胞培养流体浓缩20倍。为了进行比较，在pH5.5下进行第I/II阶段过程UF/DF步骤。第III阶段过程中的较高pH值会降低GALNS经无细胞收集物中存在的蛋白酶剪切的可能性。

3.木炭过滤器。UF/DF(20×)物质经Zeta Plus R55活性碳(Z1274)过滤，接着使用0.2μm过滤器加以无菌过滤，随后储存在2-8℃下。木炭过滤器显著降低在装载随后Zn-IMAC柱后的压力。

4.固定金属亲和层析(IMAC)。Zn固定金属亲和层析(Zn-IMAC)柱用10mM磷酸盐/乙酸盐、500mM NaCl(pH7.0)平衡，且在约55±5mS/cm的电导率下用经木炭过滤的UF/DF(20×)物质(通过添加含有2.5M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH9.2)维持在pH7.0±0.1下)装载。经装载的柱依次用10mM磷酸盐/乙酸盐、500mM NaCl(pH7.0)及10mM磷酸盐/乙酸盐、125mM NaCl(pH7.0)(缓冲液A)洗涤。用70%缓冲液A与30%缓冲液B(10mM磷酸盐/乙酸盐、125mM NaCl、300mM咪唑，pH7.0)的混合物自柱洗脱GALNS。

5.Mustang Q过滤器。Zn-IMAC柱洗脱液调整至约6.0±0.5mS/cm的电导率，pH7.0，且装载于Mustang Q过滤器上以去除病毒。

6.pH值调整及过滤。Mustang Q滤液调整至pH4.5±0.1，依次使用CUNO60ZA过滤器及0.2μm线内过滤器过滤，接着装载于阳离子交换柱上。

7.阳离子交换层析。Fractogel SE HiCap阳离子交换柱用10mM磷酸盐/乙酸盐、50mM NaCl(pH4.5)平衡，且在<7mS/cm的电导率下用调整至pH4.5±0.1的经过滤的MustangQ滤液装载。经装载的柱依次用10mM磷酸盐/乙酸盐、50mM NaCl(pH4.5)；及10mM磷酸盐/乙酸盐(pH5.0)(缓冲液A)与10mM磷酸盐/乙酸盐、250mM NaCl(pH5.0)(缓冲液B)的80%:20%混合物洗涤。用20至75%缓冲液B于80%至25%缓冲液A中的线性梯度(即50至190mM NaCl)自柱洗脱GALNS。

8.保持低pH值以达成病毒失活。Fractogel SE HiCap洗脱液通过添加0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH3.4)而酸化至pH3.5±0.1以达成病毒失活，在低pH值下保持约1小时，通过添加0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)再调整至pH5.0±0.1，接着装载于疏水性相互作用层析(HIC)精制柱上。

9.疏水性相互作用层析(HIC)。ToyoPearl丁基650M HIC柱用10mM磷酸盐/乙酸盐、2M NaCl(pH5.0)平衡，且用调整至2M NaCl(pH5.0)的低pH值病毒失活的Fractogel SEHiCap洗脱液装载。经装载的柱用10mM磷酸盐/乙酸盐、2M NaCl(pH5.0)(缓冲液A)洗涤。用35%缓冲液A与65%缓冲液B(10mM磷酸盐/乙酸盐pH5.0)的混合物自柱洗脱GALNS。

10.缓冲液交换及调整rhGALNS至3mg/mL。ToyoPearl丁基650M HIC洗脱液缓冲液交换至20mM乙酸盐、50mM磷酸盐、30mM精氨酸、2%(v/v)山梨糖醇(pH5.4)中，接着于相同缓冲液中调整至3mg/mL的最终GALNS浓度。

11.通过过滤去除病毒及DNA。使用病毒过滤器(DV20)及DNA过滤器(Mustang Q)过滤经缓冲液交换的ToyoPearl丁基650M HIC洗脱液以去除任何残余病毒及DNA。

12.添加PS20至0.01%。病毒及DNA经过滤的经缓冲液交换的ToyoPearl丁基650MHIC洗脱液调整至0.01%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20或吐温-20)。

13.BDS储存在2-8℃下或冷冻。经纯化GALNS的最终制剂，即散装原料药(BDS)储存在2-8℃下或冷冻。

结果。如SDS-PAGE结果(参见图12泳道5)中所见，主带的表观分子质量为约55kDa，与对GALNS单体的预期值一致。使用第I/II阶段过程产生的批号AP400802(泳道3)中在约40kDa及约19kDa的表观分子质量下迁移的条带为GALNS的由Q348与G349间的蛋白水解剪切所产生的降解产物。在使用第III阶段过程产生的批号BMN110-0110-001(泳道5)中此剪切大大降低。在两种制品中均存在迁移略微慢于约40kDa裂解产物的次带。

其它过程变化的概述。开发一种改进的第III阶段过程以处理某些挑战：(i)在浓缩收集物中形成沉淀；(ii)在Zn-IMAC捕捉步骤GALNS损失；(iii)在ToyoPearl丁基步骤期间洗涤部分中GALNS损失；及(iv)在ToyoPearl丁基步骤的洗脱液中存在高含量CHOP杂质。

改进的第III阶段过程。以下概述GALNS的示例性第III阶段过程回收及纯化中的各步骤。

1.无细胞收集物(1×)。使共表达人类SUMF1与人类GALNS的经稳定转染的G71细胞如实施例III中所述在生物反应器培养条件下生长。在pH6.5下收集含有GALNS的生物反应器物质(即细胞培养流体)，且使用依次为Millipore DOHC、Millipore XOHC及0.2μmMillipore SHC过滤器的过滤组列加以过滤。

2.UF/DF(20×)。细胞培养流体经超滤/渗滤(UF/DF)至电导率≤7mS/cm的10mM磷酸盐/乙酸盐、50mM NaCl(pH6.5)中。使用Sartocon30kDa Hydrosart卡匣进行UF/DF步骤。将细胞培养流体浓缩20倍。

3.木炭过滤器。UF/DF(20×)物质经Zeta Plus R55活性碳(Z1274)过滤，接着使用0.2μm过滤器加以无菌过滤，随后储存在2-8℃下。

4.固定金属亲和层析(IMAC)。Zn固定金属亲和层析(Zn-IMAC)柱用50mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)冲洗，以50mM ZnSO₄装料，用50mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)冲洗，接着用含有5mM咪唑的10mM磷酸盐/乙酸盐、500mM NaCl(pH7.0)平衡。经平衡的Zn-IMAC在约50±5mS/cm电导率下用经木炭过滤的UF/DF(20×)物质(在装载Zn-IMAC柱期间，通过以75:25(v/v)比率与含有2.5M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH9.2±0.1)线内掺合而维持在pH7.0±0.1下)装载。经装载的柱依次用10mM磷酸盐/乙酸盐、500mM NaCl(pH7.0)及10mM磷酸盐/乙酸盐、125mM NaCl(pH7.0)(缓冲液A)洗涤。用70%缓冲液A与30%缓冲液B(10mM磷酸盐/乙酸盐、125mM NaCl、300mM咪唑，pH7.0)的混合物自柱洗脱GALNS。

5.pH值调整及过滤。Zn-IMAC柱洗脱液用1.75M乙酸盐(pH4.0)调整至pH4.5±0.1，接着使用Millipore COHC过滤器加以过滤。在装载阳离子交换柱期间，经过滤物质以30:70(v/v)比率与10mM磷酸盐/乙酸盐(pH4.5)线内掺合。

6.阳离子交换层析。Fractogel SE HiCap阳离子交换柱用10mM磷酸盐/乙酸盐、50mM NaCl(pH4.5)平衡，且在<7mS/cm电导率下用经调整为pH4.5且过滤的Zn-IMAC柱洗脱液装载。经装载的柱依次用10mM磷酸盐/乙酸盐、50mM NaCl(pH4.5)；及10mM磷酸盐/乙酸盐(pH5.0)(缓冲液A)与10mM磷酸盐/乙酸盐、250mM NaCl(pH5.0)(缓冲液B)的80%:20%混合物洗涤。用20%至75%缓冲液B于80%至25%缓冲液A中的线性梯度(即50至190mM NaCl)自柱洗脱GALNS。

7.保持低pH值以达成病毒失活。Fractogel SE HiCap洗脱液通过添加0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH3.4)而酸化至pH3.5±0.1以达成病毒失活，保持在低pH值下约1小时(在12-23℃的温度下)，通过添加0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)再调整至pH5.0±0.1，与含有5M NaCl的10mM磷酸盐/乙酸盐缓冲液(pH5)掺合以达成2M NaCl的最终浓度，接着经0.2μm过滤器过滤，随后装载于疏水性相互作用层析(HIC)精制柱上。

8.疏水性相互作用层析(HIC)。ToyoPearl丁基650M HIC柱用10mM磷酸盐/乙酸盐、2M NaCl(pH4.4)平衡，且用调整至2M NaCl(pH4.3-4.4)的经过滤的低pH值病毒失活的Fractogel SE HiCap洗脱液装载。经装载的柱依次用10mM磷酸盐/乙酸盐、2M NaCl(pH4.4)；及10mM磷酸盐/乙酸盐、2.5M NaCl(pH5.0)(缓冲液A)洗涤。依次用100%至32%缓冲液A于0至68%缓冲液B(10mM磷酸盐/乙酸盐(pH5.0))中的线性梯度(即2.5至0.8MNaCl)；及32%缓冲液A与68%缓冲液B的混合物(即0.8M NaCl)自柱洗脱GALNS。

9.缓冲液交换、通过过滤去除DNA及病毒、及调整rhGALNS至3mg/mL。ToyoPearl丁基650M HIC洗脱液经缓冲液交换至20mM乙酸钠、50mM磷酸钠、30mM精氨酸盐酸盐、2%(w/v)山梨糖醇(pH5.4)中。使用DNA过滤器(Mustang Q)及病毒过滤器(DV20)过滤经缓冲液交换的ToyoPearl丁基650M HIC洗脱液以去除任何残余DNA及病毒。经过滤且经缓冲液交换的ToyoPearl丁基650M HIC洗脱液接着于与以上相同的缓冲液中调整至3mg/mL的最终GALNS浓度。

10.添加PS20至0.01%。DNA及病毒已过滤的经缓冲液交换的ToyoPearl丁基650MHIC洗脱液调整至0.01%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20或吐温-20)。

11.BDS储存在2-8℃下或冷冻。经纯化GALNS的最终制剂，即散装原料药(BDS)通过0.2μm Millipak200过滤器进入最终储存容器中且在袋中在2-8℃下储存或冷冻。

结果。在此改进的第III阶段过程后，GALNS与Zn-IMAC及ToyoPearl丁基柱的结合得以改良，且ToyoPearl丁基洗脱液中的CHOP杂质减少。通过此改进的第III阶段过程纯化的GALNS在测试的所有性质(例如下表7中的性质)方面都类似于通过上述第III阶段过程纯化的酶。

由第III阶段回收及纯化过程所制备rhGALNS的表征。使用第III阶段过程纯化的GALNS与由第I/II阶段过程纯化的酶进行比较。表征结果在表7中给出。尽管两种GALNS制品看起来在测试的所有性质方面均类似，但相较于由第I/II阶段过程纯化的酶，由第III阶段过程纯化的酶显示显著较少的剪切。

表7：由第I/II阶段过程及第III阶段过程纯化的GALNS的比较

*CHOP：中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白质污染物

**使用第III阶段过程自得自相同200L cMFG反应器的物质纯化的其它rhGALNS批次的SEC-HPLC数据显示>99%的完整蛋白质。

表8比较使用第I/II阶段过程(65.3-93.7%)或第III阶段过程(98-99.6%)制备的批次中最终经纯化制剂中完整GALNS的百分比，使用SDS-CGE方法。此处获得的值支持自SDS-PAGE方法获得的结果且显示由于对纯化过程所作改进，剪切程度得以显著降低。

表8：由第I/II阶段过程及第III阶段过程纯化的完整GALNS%的比较(根据SDS-CGE)

GALNS批号	所用过程	完整GALNS%
			11333P53	第I/II阶段	82.7%
11333P71	第I/II阶段	85.6%
			11333P79	第I/II阶段	93.7%
11333P90	第I/II阶段	82.6%
			11428P15	第I/II阶段	80.1%
NP400801	第I/II阶段	65.3%
			AP400802	第I/II阶段	73.6%
AP400803	第I/II阶段	78.5%
			AP400804	第I/II阶段	82.9%
P400902	第III阶段	98%
			11615P56	第III阶段	98.5%
11615P71	第III阶段	98.4%
			11615P78	第III阶段	98.9%
11615P81	第III阶段	98.1%
			11780P15	第III阶段	99.6%

此等试验指示上述用于在剪切最小的情况下制备重组溶酶体硫酸酯酶的方案提供一种高效产生大量高度纯化酶(特别是人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的分泌性加工前(前体)形式)的方法。

实施例VII

表征经纯化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)

G71细胞系会产生高甘露糖磷酸化程度大于在普通哺乳动物细胞系中所注意到高甘露糖磷酸化程度且未经磷酸化的高甘露糖寡糖含量相应较低的蛋白质(例如溶酶体酶)。将如本文定义的包含高含量双磷酸化高甘露糖寡糖的溶酶体硫酸酯酶(例如重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))与Canfield等人,美国专利6,537,785中获得的不包含复合寡糖且仅展现高甘露糖寡糖的分子进行比较。

为测定溶酶体硫酸酯酶上未经磷酸化的高甘露糖的含量，本领域技术人员可使用所释放寡糖的外切糖苷酶定序(exoglycosidase sequencing)(“FACE定序”)来确定未经磷酸化的高甘露糖寡糖链的百分比。在正常批次-释放FACE概况分析凝胶上，未经磷酸化的高甘露糖与特定复合寡糖(例如寡甘露糖6及完全唾液酸化的双触复合物)共迁移。接着通过酶促定序来区分未经磷酸化的高甘露糖与其它寡糖。

为确定表达于G71S细胞中的经纯化溶酶体硫酸酯酶(例如重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))是否展现磷酸化增加，测定溶酶体硫酸酯酶上甘露糖-6-磷酸酯(M6P)的含量、以及所述酶与M6P受体(MPR)结合的能力。

通过荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)及通过MPR-琼脂糖凝胶树脂层析来分析表达于G71S细胞中且经纯化的重组人类GALNS酶。FACE系统使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离、定量及测定自糖蛋白释放的寡糖的序列。FACE上寡甘露糖7双磷酸酯(O7P)带的相对强度(Hague等人,Electrophoresis19(15):2612-20,1998)及保留在MPR柱上的活性百分比(Cacia等人,Biochemistry37(43):15154-61,1998)给出每摩尔蛋白质的磷酸化程度的可靠量度。

比活性。在37℃下，使用小荧光底物4-甲基伞酮酰基-6-S-GAL(4MU-Gal-6S)测定重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的比活性。使用此试验，经纯化GALNS的比活性为165μmol/min/mg(0.165U/mg)。

人类血清稳定性。测定GALNS的离体血清稳定性。人类血清(Sigma H-4522)经0.2μm PES过滤器过滤灭菌，且于T-25细胞培养烧瓶中在37℃下在10%CO₂氛围中预孵育4mL经过滤灭菌的人类血清1小时(此时pH值为7.4±0.1)。添加0.4mL脱盐经纯化GALNS(使用Bio-RAD10DG柱使2mg/mL经纯化GALNS脱盐至PBS中)至预孵育的人类血清或含有0.5mg/LBSA的PBS对照中。在指定时间点(例如0、1、3.5、7.5及26小时)取出100μL样品且添加至900mL淬灭缓冲液(QB，50mM NaOAc(pH5.6)+150mM NaCl+0.5mg/mL BSA+0.001%吐温-80)中。样品储存在4℃下直至准备测量GALNS酶活性。

使用酶捕捉活性ELISA测量GALNS酶活性。通过外推残余GALNS酶活性%的指数衰减曲线，经纯化GALNS的离体血清半衰期估计为217小时。

摄取至滑膜细胞(软骨细胞)中。测定GALNS吸收至滑膜细胞(软骨细胞)中的能力。

在37℃下在5%CO₂中于12孔盘中在生长培养基(汉姆氏(Ham's)F12+10%FBS)中培养软骨细胞(ATCC编号CRL-1832)。对3个样品的摄取分析需要4×12孔板。经纯化GALNS样品及GALNS参考物于acPBS/BSA(酸性PBS+200μg/mL BSA)中稀释至1μM。自1μM储备物，制备GALNS样品及参考物的摄取稀释曲线：50.5μL(1μM rhASB)至5mL摄取试验稀释液(UAD，DMEM+2mM L-谷氨酰胺+0.5mg/mL BSA)中，从而产生10nM GALNS样品及参考物，其通过于UAD中进行连续2倍稀释而进一步连续稀释至5、2.5、1.25、0.62、0.31及0.16nM。吸出来自汇合软骨细胞的12孔盘的生长培养基，添加1mL UAD(空白)或GALNS样品或参考物的连续稀释液至孔中，且在37℃下在10%CO₂孵育箱中孵育4小时。吸出摄取培养基，倾斜各盘完全吸出，且各孔用1mL PBS冲洗一次。吸出PBS且通过每孔添加0.5mL胰蛋白酶(trypsin)/EDTA(0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA(Mediatech25-053-CI，批次25053025))使软骨细胞脱离。在自板脱离后，软骨细胞经等分至在冰上预冷的Eppendorf管中(总计30个管)。冷却经胰蛋白酶处理的软骨细胞，接着在微量离心机(microfuge)中在低速下集结(4000rpm，3分钟)。完全吸出胰蛋白酶，用1mL PBS冲洗细胞集结块，重复微量离心及吸出步骤一次。添加200μL细胞溶解缓冲液(CLB，50mM乙酸钠(pH5.6)+0.1%Triton X-100)至各管中。通过脉冲涡旋三次使细胞集结块再悬浮。再悬浮后，细胞溶解混合物在-80℃下储存隔夜，或直接加以分析。

在室温下解冻细胞溶解产物且当解冻时转移至冰中。涡旋细胞溶解产物以再悬浮任何可见固体物质，接着在微量离心机中在4℃下在14Krpm下旋转10分钟以集结不溶性物质。上清液转移至一组新鲜管中且丢弃集结块。接着对上清液进行GALNS活性试验。通常作七点稀释曲线(以10nM开始且以0.16nM结束，连续两倍稀释)，其包括在两侧上相当均一的预期K_uptake。通过使用单独蛋白质(protein-only)分子量来计算起始样品的摩尔浓度。

基于单一位点配位体结合，经纯化GALNS摄取至滑膜细胞中的Kd为4.9nM。

甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受体板结合试验。在板结合试验中测定GALNS与甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受体结合的能力。用4μg/mL M6P受体涂布FluoroNunc高结合板。经涂布的板用每孔250μL洗涤缓冲液(WB，TBS+0.05%吐温20)洗涤两次，且用每孔200μL封闭及稀释缓冲液(BDB，Pierce SuperBlock缓冲液，批号CA46485)封闭非特异性结合。在室温(RT)下孵育板1小时。在此封闭步骤期间，经纯化GALNS样品(0.5-2mg/mL，在4℃下储存2周)于BDB中稀释至10nM，接着于稀释缓冲液(DB，50mM NaOAc、1mM NaCl(pH4.0)+0.5mg/mL BSA)中连续稀释(250μL+250μL)至5、2.5、1.25、0.62、0.31及0.16nM。如上用WB洗涤经封闭的板，且将经稀释的GALNS样品以每孔100μL一式两份地分配至孔中且在室温下孵育1小时。在此孵育步骤期间，通过将0.1mL100mM6S-半乳糖-4MU储备物(储存于H₂O中，-20℃)稀释至5mL DB中来制备2mM活性底物，且在37℃水浴中预温热。在孵育后，如上用WB将板洗涤两次，且添加100μL经稀释的底物并测定GALNS比活性。

使用所述试验，基于单一位点结合，经纯化GALNS与M6P受体结合的Kd为2.4nM。

甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受体柱结合。在柱结合试验中测定GALNS与甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受体结合的能力。根据制造商的说明书制备M6P受体柱。M6P受体来自Peter Lobel实验室，柱树脂为NHS活化树脂(Bio-RAD Affi-Gel15)，柱尺寸为0.7mL。用10个柱体积(CV)的平衡缓冲液(EQ，酸性PBS(pH6.0)，其含有5mMβ-甘油磷酸酯、0.05%吐温20、5mM葡萄糖-1-磷酸酯及0.02%NaN₃)以0.25ml/min的流速平衡M6P受体柱。将6μg经纯化GALNS(每200μl)以0.1ml/min的流速装载于M6P受体柱上。用10CV EQ以0.25mL/min的流速将未结合的GALNS洗出柱。使用0-100%洗脱缓冲液(EL，酸性PBS(pH6.0)，其含有5mMβ-甘油磷酸酯、0.05%吐温20、5mM甘露糖-6-磷酸酯及0.02%NaN3)梯度(10CV)，接着2CV的100%EL将结合的GALNS洗脱出柱。用3CV EQ再平衡柱。

使用GALNS ELISA，与M6P受体结合的经纯化GALNS的百分比测定为56%。

通过毛细管电泳(CE)进行总寡糖分析。为了测定GALNS上的甘露糖-6-磷酸化程度，如Ma等人,Anal.Chem.71(22):5185-5192,1999中所述通过毛细管电泳(CE)确定GALNS上总寡糖的N-连接碳水化合物概况。所述方法使用PNG酶F裂解天冬酰胺N-连接寡糖。分离裂解的寡糖且用荧光染料衍生，且施加于G10旋转柱以去除过量染料。电泳分离经纯化的经荧光标记的寡糖，随后使用MDQ-CE软件(32Karat7.0版)对峰进行定量。

使用此试验，经纯化GALNS的双磷酸化甘露糖7(BPM7)、单磷酸化甘露糖6(MPM6)及含有寡糖的唾液酸的量分别为每摩尔酶0.58摩尔、每摩尔酶0.08摩尔及不可检测。含有BPM7的GALNS蛋白的百分比估计为29%。

Bis7寡糖表征。确定双磷酸化甘露糖7(BPM7)寡糖在GALNS上的位置。位置178的天冬酰胺(Asn)残基经N-连接糖基化成BPM7。位置397的Asn残基未经N-连接糖基化成BPM7，但发现其主要为寡甘露糖型糖。

羟基磷灰石亲和力。开发一种确定GALNS是否具有靶向骨骼的能力的体外骨骼模型。制备4mg/mL HTP-DNA等级羟基磷灰石(Bio-RAD)悬浮液且于DBS+50μg/mL BSA(pH7.4)中平衡。在添加50μg/mL BSA后，经纯化GALNS于DBS(pH7.4)中脱盐。在96孔板中于DBS+50μg/mL BSA(pH7.4)中连续稀释脱盐的GALNS，最终浓度为约2mg/mL。50μL经连续稀释的GALNS转移至96孔过滤板(Millipore编号MSGVN2210，亲水性PVDF，低蛋白结合，22μm微孔尺寸)中。添加50μL羟基磷灰石悬浮液至过滤板的含有经连续稀释的GALNS的孔中且在37℃下在适度震荡下孵育1小时。对板进行真空过滤。

通过如上所述的HPLC或GALNS酶活性来分析真空过滤上清液。经纯化GALNS对羟基磷灰石的Kd为3-4.0μM。

表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)的G71S细胞系产生具有较高活化量(即活性位点半胱氨酸残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化率)的溶酶体硫酸酯酶。

为了确定与SUMF1共表达于G71S细胞中的经纯化重组溶酶体硫酸酯酶(例如人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))是否展现增加的活化，测定经纯化溶酶体硫酸酯酶上活性位点半胱氨酸残基向FGly的转化量。

GALNS活化。通过LC/MS(TFA)测定GALNS的活化百分比，即活性位点半胱氨酸(Cys)残基向C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化百分比。Cys、FGly及Gly的TIC/1000分别为39、1840及183，指示约90%的经纯化GALNS呈活性(即FGly)形式。

概述。表9展示表达于G71S克隆4细胞中重组GALNS的表征的概述。表10展示表达于G71S克隆C2细胞中重组GALNS的表征的概述。

表9：由G71S克隆4产生的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表征

表10：由G71S克隆C2产生的人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表征

试验种类	GALNS
		比活性：活性/蛋白质	6.4U/mg
纯度，C4-RP所测	97%
		尺寸，SEC所测	115kDa(均二聚体)
摄取量：成纤维细胞	3.4nM
		效价	6.4mg/L(测试的4个批次)
M6P受体板结合	5.7nM
		CE所测M6P含量：总碳水化合物%	34.5%
M6P含量：每摩尔GALNS的M6P摩尔数	0.69

此等结果证明经纯化重组人类GALNS具有高程度活化及高程度甘露糖6-磷酸酯磷酸化。因此，共表达SUMF1与溶酶体硫酸酯酶(即GALNS)的G71S细胞高效产生活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶。此等溶酶体硫酸酯酶上的高甘露糖残基的含量增加使得经细胞上的MPR摄取增加。

实施例VIII

重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)在体外莫奎欧软骨细胞中的摄取及活性

评估体外莫奎欧软骨细胞的溶酶体对重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的摄取及GALNS降解硫酸角质素(KS)的能力。

来自罹患IVa型黏多糖病(MPS IVa，莫奎欧综合征)的患者的软骨细胞的GALNS活性降低且展现KS的溶酶体累积。使用自MPS IVa患者的骼脊(iliac crest)活检体分离的软骨细胞来建立MPS IVa的体外模型。然而，初级软骨细胞在培养中去分化(de-differentiate)且丧失其软骨细胞特征。因此，建立培养条件以诱导软骨细胞体外分化。

在IGF-1、TGF-β、运铁蛋白、胰岛素及抗坏血酸(软骨细胞生长培养基，Lonza编号CC-3225)存在下在海藻酸盐珠粒中培养自MPS IVa患者分离的软骨细胞，称为MQCH。每周更换两次培养基，持续6至15周的实验持续时间。此等培养条件诱导软骨细胞表型表达及分化。此等MQCH细胞表达软骨细胞标记，包括性别决定区Y-盒9(Sox9)、胶原蛋白II、胶原蛋白X、软骨寡聚基质蛋白质及聚集蛋白聚糖mRNA，如通过使用自MQCH细胞培养物分离的RNA进行定量RT-PCR分析所测量。此等经培养的MQCH细胞还产生细胞外基质。

执行共焦显微检查以确认MQCH细胞累积KS。8周培养物中的MQCH细胞经胰蛋白酶处理，细胞旋涂(cytospun)于玻璃载片上，固定于丙酮中，且冷冻直至使用。在解冻后，细胞经再水合且分别使用抗KS单克隆抗体(Chemicon)及Alexa-488(绿色)结合的山羊抗兔抗体作为一次及二次抗体进行染色。MQ-CH细胞显示与溶酶体KS累积一致的点状细胞内染色。

为确定经纯化重组人类GALNS是否可由MQCH细胞吸收至溶酶体中且降解KS，每周两次使6周MQCH细胞培养物与10nM重组人类GALNS一起孵育9周。通过共焦显微法测量GALNS摄取量及KS清除率。所用一次抗体为：(a)抗GALNS兔多克隆抗体及抗溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)单克隆抗体，或(b)抗KS单克隆抗体及抗LAMP-1多克隆抗体。所用二次抗体为：Alexa-488(绿色)结合的抗体用以检测抗GALNS或抗KS抗体，或Alexa-555或Alexa-594(红色)结合的抗体用以检测抗LAMP-1抗体)。将MQCH细胞制品固定于含有将核染色的DAPI的封固剂(mountant)中。

观测到在经GALNS处理的MQCH细胞中，GALNS酶及KS与溶酶体标记LAMP-1显著共定位。在MQCH暴露于重组人类GALNS后，细胞内KS的量降低。

还使用GALNS酶捕捉ELISA及GALNS比活性ELISA(均描述于以上实施例IV中)来测量GALNS摄取量。表达GALNS的正常人类软骨细胞(NHKC)用作阳性对照。如表11及12中所示，未经处理的MQCH细胞不具有可检测的GALNS酶或活性，而用10nM GALNS处理9周的MQCH细胞具有显著GALNS酶及活性。

表11：使用MQCH细胞的GALNS酶捕捉ELISA

	MQCH细胞	NHKC
			未作处理	N.D.^a	0.12^b
10nM GALNS，持续9周	3.99	0.88

^a未检测；^bng GALNS抗原/μg总蛋白质

表12：使用MQCH细胞的GALNS比活性试验

	MQCH细胞	NHKC
			未作处理	N.D.^a	2.76^b
10nM GALNS，持续9周	3.68	5.15

^a未检测；^bGALNS活性/ng抗原

此等结果证明体外经纯化重组人类GALNS由莫奎欧软骨细胞吸收至溶酶体中且可降解溶酶体KS。此等莫奎欧软骨细胞适用作体外功效模型来测试会降解KS的溶酶体硫酸酯酶，诸如GALNS。

实施例IX

基于细胞的体外试验中重组人类溶酶体酶降解天然底物的活性

开发基于细胞的体外试验来测量重组人类溶酶体酶(例如溶酶体硫酸酯酶)降解天然底物的活性。

重组人类溶酶体酶(例如溶酶体硫酸酯酶)的酶活性通常通过使用人工荧光底物进行无细胞体外试验加以测量(对于GALNS，参见实施例4)。然而，测量的酶活性视人工底物的尺寸(即单糖单元的数目)而定。此外，测量酶在不反映活体内情况的环境中的活性。因此，无细胞体外试验并不考虑溶酶体酶裂解天然底物的能力或其经吸收至目标细胞中且定位于溶酶体的能力。

开发一种基于细胞的体外试验来测量两种重组人类溶酶体酶(α-L-艾杜糖醛酸酶(IDU)及芳基硫酸酯酶B(ARSB))降解其天然底物(即细胞内含硫酸皮肤素(DS)的底物)的活性。DS含有可变硫酸化的艾杜糖醛酸β(1-3)-N-乙酰基-半乳糖胺β(1-4)双糖单元。

在12孔板中培养ARSB缺乏的GM00519人类成纤维细胞或IDU缺乏的GM01391人类成纤维细胞至汇合，且培养物在汇合后维持3-6周以允许细胞内DS累积。

汇合后的GM00519或GM01391细胞接着分别暴露于饱和剂量的重组人类ARSB(10nM)或重组人类IDU(25nM)中4-5天。收集、溶解并离心未经处理及经溶酶体硫酸酯酶处理的细胞。

细胞溶解产物中的溶酶体酶活性通过测定细胞的残余DS含量来测量，所述测定包括以下步骤：(1)溶解细胞；(2)使用细胞溶解产物中的软骨素ABC裂解酶(EC4.2.2.4)使含DS底物特异性消化至双糖中；(3)用荧光染料(例如2-胺基-吖啶酮，AMAC)标记DS双糖；(4)分离DS双糖(例如通过毛细管区电泳，CZE)；及(5)检测经标记的DS双糖(例如通过激光诱导荧光，LIF)。此等方法描述于例如Zinellu等人,Electrophoresis2:2439-2447,2007及Lamari等人,J. Chromatogr.B730:129-133,1999中(评述于Volpi等人,Electrophoresis29:3095-3106,2008中)。

表13展示使用经ARSB处理的GM00519细胞时DS的降解百分比，如通过测量作为主要DS双糖的含有N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯的双糖(4S双糖)的量所测定。使用经IDU处理的GM01391细胞获得类似结果。

表13：基于细胞的体外试验中ARSB对DS的消耗

^a降解百分比由测量在CZE-LIF扫描中检测到的来自经ARSB处理细胞相较于未经处理细胞的溶解产物中的4S双糖的曲线下面积来计算

以上试验指示目标细胞吸收重组人类ARSB及IDU，其接着经定位至溶酶体，在此处其降解其天然底物细胞内DS。

进行剂量寻找实验以确定在此基于细胞的试验中IDU变为速率限制时的浓度。GM01391细胞于12孔板中培养。在汇合后4周时，细胞暴露于各种浓度(0.8nM至25nM)的IDU中6或26小时。如上所述制备及加工细胞溶解产物。经测定，IDU在1nM以下未变为速率限制。

在第二剂量寻找实验中，在汇合后3周时的GM01391细胞暴露于各种浓度(0.01nM至0.2nM)的IDU中2天。如上所述制备及加工细胞溶解产物。在此实验中，将已知量的内标单糖GlcNAc-6S掺入细胞溶解产物中以在加工期间控制回收率。如图13中所示，观测到经IDU处理的GM01391细胞中DS底物量呈剂量依赖性降低。

在类似剂量寻找实验中，在汇合后3周时GM00519细胞暴露于各种浓度(0.001nM至0.06nM)ARSB中5天。如上所述制备及加工细胞溶解产物。在此实验中，将已知量的内标单糖GlcNAc-6S掺入细胞溶解产物中以在加工期间控制回收率。如图14中所示，观测到经ARSB处理的GM00519细胞中DS底物的量呈剂量依赖性降低。

开发一种基于细胞的体外试验来测量重组人类溶酶体硫酸酯酶GALNS降解其天然底物(即细胞内含硫酸角质素(KS)的底物)的活性。

如以上实施例8中所述来培养GALNS缺乏的MQCH细胞且用1nM或10nM的重组人类GALNS处理。在处理后，制备MQCH细胞溶解产物且用使较大KS寡糖裂解成KS双糖的硫酸角质素酶II(EC3.2.1)消化。如以上关于DS双糖所述，KS双糖用AMAC标记，通过CZE分离且通过LIF检测。将GlcNAc-6S(一种KS单糖)作为内标掺入细胞溶解产物中以在加工期间控制回收率。测量两种特征性KS双糖(Gal6S-GlcNAc6S及Gal-GlcNAc6S)的量，且由所回收的GlcNAc6S量修正所得数据。表14展示使用经GALNS处理的MQCH细胞时KS的降解百分比，如通过测量两种特征性KS双糖的量所测定。

表14：基于细胞的体外试验中GALNS对KS的消耗

	Gal6S-GlcNAc6S	Gal-GlcNAc6S
			1nM GALNS	85.7^a	78.5^b
10nM GALNS	88.6	81.5

^a,b降解百分比通过测量在CZE-LIF扫描中检测到的来自经GALNS处理的细胞相较于未经处理的MQCH细胞的溶解产物中的Gal6S-GlcNAc6S及Gal-GlcNAc6S的曲线下面积，且针对掺加对照GlcNAc6S的曲线下面积进行调整来计算。

以上试验指示目标细胞吸收重组人类GALNS，其接着经定位至溶酶体，在此处GALNS降解其天然底物细胞内KS。

总之，此等结果证明重组人类溶酶体酶ARSB、IDU及GALNS降解其天然底物的活性可在基于细胞的体外试验中加以测量及定量。应了解此基于细胞的体外试验可容易地加以改进以测量及定量其它溶酶体硫酸酯酶以及多种重组溶酶体酶的活性。

实施例X

递送重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)至特定组织

评估表达于G71细胞中且经纯化的重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)在其施用给小鼠后递送至受GALNS缺乏影响或与GALNS缺乏相关的特定组织的能力。

硫酸角质素的高度特异性分布产生IVa型黏多糖病(MPS IVA)或莫奎欧综合征的极具特征性表型。硫酸角质素主要见于软骨(关节骨生长板、心瓣膜、喉及鼻中隔)及角膜中，且此等组织在MPS IVA患者中展现硫酸角质素累积。因此，对于MPS IVA或莫奎欧综合征中缺乏的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，重要的是显示GALNS酶向长骨生长板、心瓣膜、角膜、喉及鼻的递送。为检查作为不良血管化目标的此等特定组织，在小鼠中研究荧光GALNS的递送。

在小鼠中测试两种免疫组织化学染色法：(1)与Alexa488结合的人类GALNS及(2)未结合的人类GALNS。使用Molecular Probes Alexa Fluor488C₅顺丁烯二酰亚胺标记试剂盒(A-10254)来进行人类GALNS与Alexa488的结合。顺丁烯二酰亚胺结合化学产生1:1的标记与蛋白质的比率。

为了确认荧光标签并不干扰GALNS摄取，使用经培养滑膜细胞(ATCC编号CRL-1832)进行免疫细胞化学实验。使用标准摄取试验来比较未结合的GALNS与结合的GALNS(GALNS-A488或GALNS-A555)。细胞与GALNS酶一起孵育4小时，随后用α-L-艾杜糖醛酸酶(IDU)追踪2小时。结果显示Alexa488结合并不干扰细胞摄取。图15展示GALNS、GALNS-A488及GALNS-A555的估计Kd值。因为标记使酶失活，所以通过细胞溶解产物而非酶活性的抗原ELISA来测量摄取量。测出未结合及结合的GALNS酶的Kd值大约相等。

为了测定荧光标签的稳定性，一旦GALNS酶纳入细胞中后，即对未结合及结合的GALNS进行免疫染色。用于染色的一次抗体为蛋白G纯化的抗GALNS兔抗体，浓度为1μg/mL。使用MetaMorph软件，在Leica IRE2宽视场落射荧光(epi-fluorescent)显微镜上获取所有影像。由于存在平面外光，因此需要对影像堆栈解卷积(Deconvolution)以测量此等影像中的共定位。使用AutoQuant/AutoDeblur观测软件，使用理论点散布函数(盲算法)来进行解卷积。

免疫染色显示与经GALNS-A488物质放大的信号重叠相当良好。所观测到的敏感性增加是由于一次抗体及二次抗体均为多克隆抗体。

为确定GALNS酶是否靶向溶酶体，用Molecular Probes Lysotracker或定位于溶酶体中的另一酶对经培养滑膜细胞进行免疫染色。Lysotracker似乎显示与GALNS-488酶有一定程度重迭；然而，染色并不均一。用重组人类N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)(一种溶酶体酶)追踪2小时确实显示与GALNS有一定程度共定位。

以上实验显示GALNS-A488酶由细胞吸收且定位至溶酶体，且可用于测定活体内生物分布。

进行两项活体内研究。第一预备研究为在正常Balb/c小鼠尾静脉中进行单次剂量(10mg/kg)快速注射，接着每隔一天在正常Balb/c小鼠尾静脉中多次(5次)注射10mg/kg进行第二研究。表15及表16分别描述第一及第二研究的实验计划。

表15：第一预备研究的实验设计

组	总计	2小时时间点	24小时时间点
				PBS对照	4	2	2
GALNS-A488	4	2	2
				未标记的GALNS	4	2	2
未标记的ASB	1	1	0

表16：第二研究的实验设计

组	总计	2小时时间点	4小时时间点	8小时时间点
					PBS对照	2	1	0	1
PBS/Cys对照	4	2	0	2
					GALNS-A488	9	3	3	3
未标记的GALNS	6	3	0	3
					未标记的ASB	3	2	0	1

在第一预备研究中，在2小时及24小时时间点收集心脏、肝及胫骨/股骨关节。在第二研究中，在2小时、4小时及8小时时间点收集心脏、肾、肝，及带有四头肌及比目鱼肌的骨骼。对于两项研究，心脏、肾及肝均浸渍固定于4%多聚甲醛(PFA)中4天，以石蜡包埋，接着切片成7μm厚度。第二研究中包括肌肉的骨骼浸渍固定于4%PFA中8天，脱钙，以石蜡包埋，且切片成7μm厚度。

用Zeiss激光扫描共焦显微镜获得经GALNS-A488注射的小鼠的影像。对于第一预备研究中的分析，每个心瓣膜及肝脏样品获得一个共焦堆栈且用于体积分析。每个生长板样品获得两个共焦堆栈且用于体积分析。在第二研究中，每个心瓣膜、肾及肝样品获得一个共焦堆栈且用于体积分析；每个生长板及静息软骨区(zone of rest cartilage，zrc)样品获得两个共焦堆栈且用于体积分析。

来自共焦显微成像研究的结论为：(1)有可能检测活体内荧光GALNS；(2)信号具有特异性(不存在背景)且定位为溶酶体；(3)证明在肝脏中的窦状隙细胞(sinusoidal cell)中存在GALNS；(5)在心脏中，GALNS酶存在于隔膜及心房中，但更重要的是其在心瓣膜层面上清楚可见，在此处在多次注射后其分布更深；(6)在股骨/胫骨接合处，GALNS酶存在于骨骼(骺)的矿化部分以及骨髓中。GALNS存在于生长板中。更具体的，GALNS富集于静息区(或储备软骨区)的软骨细胞中，存在于增殖区的起始处，且在生长板末端的骨化区中大量再现。尽管难以定量多次注射的累积效应，但第二研究似乎显示较宽分布。表17展示共焦显微成像研究的概述。

表17：GALNS在小鼠中的生物分布

组织	定位
		骨骼(股骨)
矿化区	是
		骨髓	是
生长板	是
		心脏
心瓣膜	是
		心房	是
隔膜	是
		肝脏
肝细胞	否

组织	定位
		窦状隙细胞	是

对于二次染色，初始步骤为使GALNS一次抗体最优化。用含蛋白G纯化的抗GALNS兔抗体的1:100至1:400稀释液对各种组织染色。第一预备研究中的结果指示对于高信噪比1:100的稀释液为最优选。此结果在第二研究中经确认。以1:100的一次抗体稀释液及1:1000的二次抗体稀释液加工其余载片。

当用蛋白G纯化的抗GALNS抗体染色时，用GALNS给药的Balb/c小鼠的信号超过对照(即用PBS-Cys给药的小鼠)的信号。为确认GALNS酶定位于溶酶体中，用抗LAMP1抗体将切片染色。LAMP1为溶酶体的标记。影像显示在抗LAMP1抗体与抗GALNS抗体之间有重叠，从而指示GALNS酶定位于溶酶体中。

总之，两项活体内研究指示GALNS生物分布与血管形成有关，即较多血管化组织含有较多荧光信号。更重要地，研究证明在莫奎欧综合征中的硫酸角质素累积部位存在GALNS，即使此等部位经不良血管化亦然。

实施例XI

人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的制剂

目标在于研究各种赋形剂(如缓冲剂、等张剂及稳定剂)对本发明制剂中重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的活性及结构的影响。

如实施例V中所述制备GALNS酶。

如实施例VII中所述对GALNS酶进行表征。

在实施例V中，经纯化重组人类GALNS酶调配于10mM NaOAc/HOAc、1mM NaH₂PO₄、150mM NaCl及0.005%或0.01%吐温-20(pH5.5)中。应注意在低浓度磷酸盐缓冲液储存后，GALNS酶发生去磷酸化。因此，磷酸盐缓冲剂浓度增加至100mM NaH₂PO₄。在高浓度磷酸盐缓冲液中储存后，未观测到GALNS酶的显著去磷酸化。然而，在5℃、25℃或40℃下储存后观测到可溶性GALNS聚集体，且在40℃下储存后观测到不溶性GALNS聚集体。

在第一研究中，评估稳定剂浓度及pH值对重组GALNS稳定性的影响。经纯化重组GALNS酶调配于20mM NaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、0.01%吐温-20及4%蔗糖或2%山梨糖醇中。测试的稳定剂：15mM或30mM精氨酸盐酸盐(精氨酸HCl)；及15mM或30mM NaCl。测试的pH值：5.0、5.4及5.8。pH5.8制剂经测定在pH5.8至6.0范围内。酶制剂在5℃、25℃或40℃下储存长达2个月后，使用实施例VI中描述的各种试验分析GALNS酶。

通过用尺寸排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)对GALNS酶进行概况分析来确定各种制剂中可溶性聚集体的形成。15mM与30mM精氨酸盐酸盐两者的存在均抑制可溶性聚集体的增长，如通过SEC-HPLC所确定(图16)。

使用体外酶活性试验测量制剂中GALNS酶活性的稳定性。在5℃下，在精氨酸盐酸盐或NaCl存在下，GALNS酶活性稳定；在25℃下，在精氨酸盐酸盐或NaCl存在下，GALNS酶活性略微降低；且在40℃下，含有NaCl的制剂中GALNS酶活性展现最小稳定性(图17)。

在用PNG酶F消化酶以裂解天冬酰胺N-连接寡糖后，通过毛细管电泳(CE)测量双磷酸化甘露糖7(BPM7)的百分比来研究制剂中GALNS酶的去磷酸化。在5℃、25℃或40℃下2个月后，所有酶制剂中的GALNS酶在BPM7%方面的糖基化概况都类似于用于I期临床制剂中参考批次GALNS的糖基化概况(图18)。

通过用逆相高效液相层析(RP-HPLC)对GALNS酶进行概况分析来测定GALNS酶在制剂中的纯度。在5℃或25℃下2个月后，制剂均不展现任何峰面积变化；在40℃下，含有精氨酸盐酸盐的制剂在pH5.0及pH5.4下也不展现任何峰面积变化，但含有NaCl的制剂在pH5.0及pH5.4下及所有制剂在pH5.8下展现峰面积减小(图19)。在RP-HPLC层析图中，制剂中观测到峰后肩(post-peak shoulder)。含有30mM精氨酸盐酸盐的GALNS制剂展现最不显著的峰后肩。

实施例XII

人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的示例性制剂

以下实施例提供关于用于调配包含重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突变体、变体或类似物的组合物的参数的导则，所述组合物适用于治疗莫奎欧综合征或MPS IVa。用于调配本发明GALNS组合物的参数包括(但不限于)维持pH值的缓冲剂、等张性调整剂、不存在或存在稳定剂、及不存在或存在其它赋形剂、载剂、稀释剂及其类似物。

在实施例XI中，重组GALNS以约1mg/mL的浓度配制。优选GALNS以在约0.1至10mg/mL、优选约0.5至5mg/mL、且更优选约0.5至1.5mg/mL的范围内的浓度配制。在一实施方式中，本发明的GALNS组合物的制剂具有约1+/-0.5mg/mL的GALNS酶浓度。

在实施例XI中，重组GALNS酶在pH5.0、5.4及5.8下调配于20mM NaOAc/HOAc、50mMNaH₂PO₄中。优选缓冲剂为NaOAc/HOAc或其等效物；及NaH₂PO₄或其等效物，其中NaOAc/HOAc浓度范围为约5至100mM、优选约5至50mM、且更优选约10至30mM，且NaH₂PO₄浓度范围为约5至100mM、优选约25至100mM、且更优选约25至75mM。在一示例性实施方式中，本发明的GALNS组合物的制剂具有约20+/-10mM的NaOAc/HOAc缓冲剂浓度及约50+/-25mM的NaH₂PO₄缓冲剂浓度。

制剂的优选pH值为约pH4.5-6.5、优选约pH5.0-6.0、且更优选约pH5.0-5.8。在一实施方式中，本发明的GALNS组合物的制剂具有约pH5.4+/-0.4的pH值。

在实施例XI中，重组GALNS酶调配于15mM或30mM精氨酸盐酸盐或NaCl中。优选稳定剂为精氨酸盐酸盐或其等效物，其中浓度范围为约5至200mM、优选约10至100mM、且更优选约10至50mM。在一示例性实施方式中，本发明的GALNS组合物的制剂具有约30+/-20mM的精氨酸盐酸盐浓度。

在实施例XI中，重组GALNS酶调配于0.01%吐温-20中。优选稳定剂为吐温-20(也称作聚山梨醇酯-20)或其等效物，其中浓度范围为约0.001至1.0%(w/v)、优选约0.005至0.2%(w/v)、且更优选约0.005至0.015%(w/v)。在一实施方式中，本发明GALNS组合物的制剂具有约0.01% +/-0.005%(w/v)的吐温-20浓度。

在实施例XI中，重组GALNS酶调配于4%蔗糖或2%山梨糖醇中。优选稳定/低温保护剂/张力剂为山梨糖醇或其等效物，其中浓度范围为约0.1至10%(w/v)、优选约0.5至5%(w/v)、且更优选约1.0至3.0%(w/v)。本发明GALNS组合物的一种示例性制剂具有约2.0% +/-1.0%(w/v)的山梨糖醇浓度。

因此，本发明的GALNS酶组合物的一种示例性制剂展示于表18中。

表18：重组人类GALNS的示例性制剂

*pH值通过用冰乙酸(HOAc)或1N氢氧化钠(NaOH)滴定来调整。

实施例XIII

重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及其它溶酶体硫酸酯酶在溶酶体硫酸酯酶活性缺乏小鼠中的效应

评估本发明的活性高度磷酸化人类溶酶体硫酸酯酶(例如重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))在溶酶体硫酸酯酶活性缺乏小鼠中的效应。

重组人类GALNS蛋白在G71S细胞中表达且加以纯化。其它重组人类溶酶体硫酸酯酶可基本上根据本文所述方法或通过本领域中已知的程序加以表达及纯化。

已描述人类溶酶体硫酸酯酶缺乏症的若干小鼠模型，包括：异染性脑白质营养不良(MLD)(芳基硫酸酯酶A缺乏症)(Hess等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14821-14826,1996)、VI型黏多糖病(MPS VI)或马拉二氏综合征(芳基硫酸酯酶B缺乏症)(Evers等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8214-8219,1996)、II型黏多糖病(MPS II)或亨特综合征(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏症)(Muenzer等人,Acta Paediatr.增刊91(439):98-99,2002；Cardone等人,Hum.Mol.Genet.15:1225-1236,2006)、IIIa型黏多糖病(MPS IIIa)或圣菲利柏A综合征(磺酰胺酶/乙酰肝素-N-硫酸酯酶缺乏症)(Bhaumik等人,Glycobiology9(12):1389-1396,1999)、IVa型黏多糖病(MPS IVa)或莫奎欧A综合征(N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏症)(Tomatsu等人,Hum.Mol.Genet.12:3349-3358,2003)及多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)(硫酸酯酶修饰因子1缺乏症)(Settembre等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:4506-4511,2007)。IIId型(MPS IIId)黏多糖病或圣菲利柏D综合征(N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶缺乏症)的小鼠模型尚待描述。

人类溶酶体硫酸酯酶缺乏症的小鼠模型可用于评估酶替代疗法(ERT)作为治疗溶酶体储存病症的手段的可行性。举例而言，MPS IVa基因剔除小鼠(GALNS^-/-小鼠；Tomatsu等人,Hum.Mol.Genet.12:3349-3358,2003)不具有可检测的GALNS酶活性且显示增加尿葡糖胺聚糖(GAG)(即硫酸角蛋白(keratin sulfate)及软骨素-6-硫酸酯)及GAG在多个组织及器官(例如肝、肾、脾、心脏、脑、骨髓及软骨)中累积。然而，GALNS^-/-小鼠并不显示与人类疾病相关的骨骼异常。已开发另一MPS IVa小鼠模型，其表达非活性人类GALNS及突变的非活性内源小鼠GALNS(GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠；Tomatsu等人,Hum.Mol.Genet.14:3321-3335,2005)。在不具有可检测的GALNS酶活性的GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠中，尿GAG排泄量增加，GAG在多个组织(包括内脏器官、脑、角膜、骨骼、韧带及骨髓)中累积，溶酶体储存在多个组织中为显著的且骨骼储存为明显的。GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠中的病理性变化不同于在GALNS^-/-小鼠中观测到的那种变化。然而，与GALNS^-/-小鼠类似，GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠不显示与人类疾病相关的骨骼异常。因此，GALNS^-/-或GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠可用于研究施用重组人类GALNS对增加的尿GAG及GAG在组织中累积的影响。

每周给与4周龄GALNS^-/-、GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}或野生型小鼠静脉内注射(n=每组至少6或8只小鼠)各种剂量的重组人类GALNS(例如0.1、0.3、1、3、10mg/kg)或载剂对照直至16-20周龄，接着处死以进行组织学检查。收集小鼠的尿且如所述测定尿GAG排泄量(Tomatsu等人,Hum.Mol.Genet.12:3349-3358,2003)。如所述进行各种组织的病理学检查(Tomatsu等人,Hum.Mol.Genet.12:3349-3358,2003)。

使用GALNS^-/-或GALNS^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠，预期本发明的重组人类GALNS会显示能够降低：(1)尿GAG排泄量；(2)GAG在多个组织(例如内脏器官、脑、角膜、骨骼、韧带及骨髓)中的累积；(3)溶酶体在多个组织中的储存；及(4)骨骼储存。

研究重组人类GALNS在多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)小鼠模型中的效应(SUMF1^-/-小鼠；Settembre等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:4506-4511,2007)。因为SUMF1^-/-小鼠显示常在生命早期死亡，所以早于以上关于GALNS^-/-小鼠所述的时间，起始用重组人类GALNS注射此等小鼠。

遵循本领域中已知的程序，研究其它重组人类溶酶体硫酸酯酶(即芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺酰胺酶/乙酰肝素-N-硫酸酯酶及N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶)在MLD(ASA^-/-小鼠；Hess等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14821-14826,1996)、MPS VI(As1-s^-/-小鼠；Evers等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8214-8219,1996)、MPS II(ids^y/-小鼠；Cardone等人,Hum.Mol.Genet.15:1225-1236,2006)、MPS IIIa(Bhaumik等人,Glycobiology9(12):1389-1396,1999)及MSD(SUMF1^-/-小鼠；Settembre等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:4506-4511,2007)的小鼠模型中的效应。

实施例XIV

用重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及其它溶酶体硫酸酯酶治疗患有IVA型黏多糖病(或莫奎欧综合征)或其它溶酶体硫酸酯酶缺乏症的人类患者

预期显现诸如经诊断有IVA型黏多糖病(MPS IVa或莫奎欧综合征)的患者的溶酶体硫酸酯酶缺乏症的临床表型的人类患者用重组酶(即人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))进行酶替代疗法。所有罹患溶酶体硫酸酯酶缺乏症的患者都显现以下一些临床迹象：其溶酶体中的储积物质在内脏及软组织中过度或有害累积，正如不同程度的与特定溶酶体储积疾病相关的功能障碍或恶化之健康状况所显现的迹象。所有MPS IVa患者都显现以下一些临床迹象：骨骼畸形、身材矮小及步态异常、及/或葡糖胺聚糖(GAG)在血液或尿中累积，以及不同程度的功能障碍。

优选在罹患溶酶体硫酸酯酶缺乏症的患者中监测酶含量以确认在其组织中溶酶体硫酸酯酶不存在或活性降低。溶酶体酶活性为另一正常个体的10%以下、优选5%以下、更优选2%以下且甚至更优选1%以下的患者为适于用适当溶酶体硫酸酯酶治疗的候选者。可在实施疗法之前、期间及之后收集数据以测定患者的溶酶体硫酸酯酶活性。

通过测量溶酶体硫酸酯酶的底物(即葡糖胺聚糖(GAG))的尿排泄量随时间的降低百分比来测定功效。将罹患溶酶体硫酸酯酶缺乏症的患者的尿GAG含量与正常排泄含量及/或罹患相同溶酶体硫酸酯酶缺乏症的未经治疗的患者的含量及/或相同患者在实施溶酶体硫酸酯酶疗法之前的含量进行比较。在实施溶酶体硫酸酯酶疗法后未降解GAG的排泄量降低大于25%、优选降低大于50%之降低是测定个体对疗法的反应的有效手段。

还可根据与溶酶体储积疾病相关病变的征兆及症状的减轻来测定功效。可通过用于测定溶酶体、细胞或组织中GAG降低程度的组织生检及细胞及/或溶酶体的检查来测定功效。功效可通过功能评估来测定，所述功能评估可以是客观或主观的(例如疼痛或功能困难减轻、肌力或精力增加、心输出量增加、运动耐久性、体重变化、高度或外貌的变化及其类似功能评估)。

医药组合物包含表达于G71S细胞中且经纯化的重组人类GALNS，且根据本领域中已知程序来加以调配。优选静脉内施用本发明的医药组合物。

研究向MPS IVa患者施用重组人类GALNS的效应的初始临床研究的基本设计涉及开放标记的剂量增加安全性/功效研究，其中以固定时间间隔向患者静脉内施用各种剂量的酶(例如(但不限于)每周进行酶注射)。

对于MPS IVa患者，通过测量例如减少血液或尿GAG(其可能在ERT数周内观测到)、在心、肺及/或运动功能测试中增大耐久性(其可能在ERT数月内观测到)及/或骨骼变化及/或身体生长(其可能在ERT数年内观测到)来测定功效。

尿GAG测量适用于确定适当剂量方案，以及通过测量尿GAG排泄量随时间的降低百分比来测定功效。

可采用各种耐久性测试，包括例如(但不限于)行走测试(6或12分钟内行走的距离)、爬楼梯(梯级数/分钟)及肺/呼吸功能，包括心脏功能(ECG，超音心动图(echocardiogram))、肺功能(FVC，FEV₁，峰值流量)。

对于经受长时期治疗的较年轻患者，可测量生长(高度)。

可使用本发明方法治疗或预防的溶酶体硫酸酯酶活性缺乏相关性溶酶体储积疾病为：异染性脑白质营养不良(MLD)、VI型黏多糖病(MPS VI)或马拉二氏综合征、II型黏多糖病(MPS II)或亨特综合征、IIIa型黏多糖病(MPS IIIa)或圣菲利柏A综合征、IIId型黏多糖病(MPS IIId)或圣菲利柏D综合征、IVa型黏多糖病(MPS IVa)或莫奎欧A综合征、或多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)。对于各溶酶体储积疾病，重组溶酶体硫酸酯酶将包含特定溶酶体硫酸酯酶。

对于涉及MLD的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为芳基硫酸酯酶A。对于涉及MPS VI的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为芳基硫酸酯酶B。对于涉及MPS II的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIIA的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为磺酰胺酶/乙酰肝素-N-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIID的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶。对于涉及MPS IVA的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。对于涉及MSD的方法，优选溶酶体硫酸酯酶为N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

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预期本领域技术人员能想到如以上说明性实例中所阐述的本发明的众多修改及变化。因此仅应对本发明施以如随附权利要求中出现的限制。

Claims

1.一种纯化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的方法，所述GALNS酶由SEQID NO:4的氨基酸27至522组成，其中所述GALNS酶：

(i)在非还原条件下进行SDS-PAGE时，经考马斯蓝染色测定具有至少95％的纯度，

(ii)具有位置53的半胱氨酸残基转化为C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的至少50％转化率，及

(iii)每条单体蛋白质链具有0.5至0.8条双磷酸化寡甘露糖链，

且其中经SDS-CGE测定至少98％的所述GALNS酶系呈前体形式，所述方法包括：

a)过滤含有由表达人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)及所述重组人类GALNS酶的哺乳动物细胞系分泌的所述GALNS酶的培养基，超滤/渗滤所述经过滤的培养基，从而所述经超滤/渗滤的培养基浓缩20倍，及木炭过滤所述浓缩20倍的经超滤/渗滤的培养基；

b)步骤a)所述经木炭过滤的经20倍超滤/渗滤的培养基装载于Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱上，在使所述GALNS酶保留在所述柱上的条件下清洗所述柱，及从所述柱洗脱所述GALNS酶；

c)可选地，经过滤器过滤步骤b)中的所述Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱的洗脱液以去除病毒；

d)调整步骤b)的所述Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱的洗脱液或步骤c)的滤液的pH至pH4.5±0.1，且过滤所述经调整为pH 4.5±0.1的所述Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱的洗脱液或所述滤液；

e)所述经调整为pH 4.5±0.1的所述Zn螯合FF捕获柱的洗脱液或步骤d)的滤液装载于Fractogel EMD SE Hi-Cap阳离子交换柱上，在使所述GALNS酶保留在所述柱上的条件下清洗所述柱，且从所述柱洗脱所述GALNS酶；

f)调整步骤e)所述的Fractogel EMD SE Hi-Cap阳离子交换柱的洗脱液的pH至pH 3.5±0.1以使病毒失活；

g)将步骤f)所述的pH 3.5±0.1病毒失活的洗脱液调节到pH 5.0，然后将所述pH5.0经调节的病毒失活洗脱液装载于ToyoPearl丁基650M精制柱上，在使所述GALNS酶保留在所述柱上的条件下清洗所述柱，且从所述柱洗脱所述GALNS酶；

h)使步骤g)所述的ToyoPearl丁基650M精制柱的洗脱液经缓冲液交换至包含20mMNaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、30mM精氨酸盐酸盐、2％w/v山梨糖醇，pH 5.4的制剂中，且调整所述GALNS酶在所述制剂中的浓度至3mg/mL；

i)通过DV20过滤器及Mustang Q过滤器过滤步骤h)中所述经缓冲液交换的制剂来去除任何残余病毒及/或DNA；及

j)添加聚山梨醇酯20至步骤i)中所述的制剂中到终浓度0.01％w/v。

2.一种制剂，其包含：

(a)按权利要求1所述纯化的重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，所述GALNS酶由SEQ ID NO:4的氨基酸27至522组成，且

(iii)每条单体蛋白质链具有0.5至0.8条双磷酸化寡甘露糖链，

其中至少经SDS-CGE测定98％的所述GALNS酶系呈前体形式，及(b)一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，其包含：

(i)可有效减少所述GALNS酶去磷酸化量的磷酸盐缓冲剂；及

(ii)稳定量的一种或多种选自下组的稳定剂：氨基酸盐、氨基酸缓冲剂、表面活性剂及多元醇；

其中所述制剂的pH为5.0-5.8，所述一种或多种稳定剂是精氨酸盐酸盐，吐温-20，和山梨糖醇。

3.如权利要求2所述的制剂，其中所述制剂还包含第二缓冲剂。

4.如权利要求2所述的制剂，其中经RP-HPLC测定所述GALNS酶的纯度为至少95％。

5.如权利要求2所述的制剂，其中50％至80％的所述GALNS酶结合至甘露糖-6-磷酸酯受体柱。

6.如权利要求2所述的制剂，其中所述GALNS酶展现摄入成纤维细胞中的比摄取量Kuptake为1至5nM。

7.如权利要求2所述的制剂，其中所述GALNS酶展现摄入成纤维细胞中的比摄取量Kuptake为1至3.5nM。

8.如权利要求2所述的制剂，其中GALNS酶的浓度为0.5至1.5mg/mL。

9.如权利要求3所述的制剂，其中所述磷酸盐缓冲剂是NaH₂PO₄并且所述第二缓冲剂是NaOAc/HOAc。

10.如权利要求9所述的制剂，其中NaOAc/HOAc的浓度为10至30mM及NaH₂PO₄的浓度为25至75mM。

11.如权利要求2所述的制剂，其中精氨酸盐酸盐的浓度为10至50mM，吐温-20的浓度为0.005％至0.015％w/v，及山梨糖醇的浓度为1.0％至3.0％w/v。

12.如权利要求3所述的制剂，其中所述第二缓冲剂是乙酸盐缓冲剂。

13.一种制剂，其包含：

(iii)每条单体蛋白质链具有0.5至0.8条双磷酸化寡甘露糖链，

其中在还原条件下进行SDS-PAGE时，经考马斯蓝染色测定至少98％所述GALNS酶呈前体形式，及

(b)一种或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，其包含：

(i)NaOAc/HOAc及NaH₂PO₄作为缓冲剂，其中NaOAc/HOAc的浓度为20+/-10mM及NaH₂PO₄的浓度为50+/-25mM；

(ii)精氨酸盐酸盐、吐温-20及山梨糖醇作为稳定剂，其中精氨酸盐酸盐的浓度为30+/-20mM，吐温-20的浓度为0.01+/-0.005％w/v，及山梨糖醇的浓度为2.0％+/-1.0％w/v；及

(iii)pH 5.4+/-0.4。

14.如权利要求2-13中任一项所述的制剂在制备用于治疗罹患IVa型黏多醣病(MPSIVa)或莫奎欧A症候群的个体的药物中的用途，所述制剂包含经纯化的重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的组合物，所述经纯化的GALNS按权利要求1所述方法纯化。