KR20150038715A

KR20150038715A - 고도로 인산화된 활성 인간 n-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 제조 및 이것의 용도

Info

Publication number: KR20150038715A
Application number: KR1020157007141A
Authority: KR
Inventors: 비쉬 콥파카; 미쉘 클라우드 벨라드; 아우구스투스 오. 오카마페; 키디스티 아라야
Original assignee: 바이오마린 파머수티컬 인크.
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2015-04-08
Also published as: RU2013107765A; WO2012012718A2; IL260282B; HUE033163T2; AU2011280937A1; KR20130105605A; RU2607376C2; KR101598897B1; CY1118934T1; PE20171799A1; CN103037895B; CL2017000498A1; CL2013000219A1; IL224125B; MX2013000908A; LT2595650T; PE20171798A1; CN103037895A; US20160186149A1; DK2595650T3

Abstract

본 발명은 활성의 고도로 인산화된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 조성물, 및 이것의 약제학적 조성물 및 조제물, 및 특히 GALNS 효소의 결핍에 의해 야기되거나 또는 결핍과 관련된 리소좀 저장 질병, 예를 들어 점액다당류증 IVa(MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군)을 포함하는, 질병 및 질환의 진단, 예방 또는 치료에서 이것의 용도를 제공한다.

Description

고도로 인산화된 활성 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 제조 및 이것의 용도{MANUFACTURE OF ACTIVE HIGHLY PHOSPHORYLATED HUMAN N-ACETYLGALACTOSAMINE-6-SULFATASE AND USES THEREOF}

본 발명은 2010년 7월 22일 출원된 미국 가특허출원 제61/366,714호의 우선권 및 이익을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 전문이 참조로 포함되어 있다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 세포 및 분자생물학 및 의약의 기술 분야, 특히 활성의 고도로 인산화된 인간 리소좀 설파타제 효소의 제조 및 리소좀 설파타제 효소 결핍과 관련된 리소좀 저장 질병의 관리에서 이것의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 제조 및 점액다당류증 IVa(MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군) 및 GALNS와 관련된 다른 리소좀 저장 질병의 관리에서 이것의 용도에 관한 것이다.

리소좀 저장 질병(Lysosomal storage disease, LSD)은 리소좀 내 세포 폐기물의 분해에 필수적인 세포 내에서 특이적 리소좀 효소의 결핍으로부터 초래된다. 이러한 리소좀 효소의 결핍은 미분해 "저장 물질"의 리소좀 내에서 축적을 유발하는데, 이는 리소좀의 팽윤과 기능부전 및 궁극적으로 조직 손상을 야기한다. 다수의 리소좀 효소가 확인되었으며 그것의 관련 질병과 상관관계가 있었다. 일단 상실 효소가 확인되면, 치료는 환자의 영향받은 조직에 대체 효소를 효율적으로 전달하는 유일한 문제로 감소될 수 있다.

리소좀 저장 질병을 치료하기 위한 한 방법은 정맥주사 효소 대체 치료(enzyme replacement therapy, ERT)(Kakkis, Expert Opin . Investig . Drugs 11(5): 675-685, 2002)에 의한다. ERT는 단일 투여 부위로부터 대부분의 조직에 효소를 운반하는 맥관 구조를 이용한다. 일단 효소가 크게 분포되면, 이는 세포 내로 취해져야 한다. 세포 내로 흡수를 위한 기반은 리소좀 효소의 독특한 특정에서 발견된다. 리소좀 효소는 말단 만노스 잔기의 6-위치에서 포스페이트에 의해 정해지는 글라이코단백질의 별개의 분류를 구성한다. 만노스-6-포스페이트는 대부분의 표면 상에서 발견되는 수용체에 의해 높은 친화도 및 특이성으로 결합된다(Munier-Lehmann et al., Biochem . Soc . Trans. 24(1): 133-136, 1996; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). 폴리펩타이드 사슬 당 2개의 만노스-6-포스페이트 결합 부위를 가지는(Tong et al., J. Biol . Chem . 264:7962-7969, 1989) 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor, MPR)는 혈액으로부터 조직으로 효소의 흡수를 지시한 다음, 라이소좀에 대한 세포내 경로를 매개한다.

리소좀 효소의 대규모 생성은 포유류 세포주에서 발현을 수반한다. 목표는 채취를 위하여 주변 성장 배지 내로 재조합 효소의 우세한 분비 및 하류로 처리하는 것이다. 리소좀 효소의 대규모 생성을 위한 이상적인 시스템에서, 효소는 효율적으로 인산화된 다음 주로 리소좀보다는 세포 표면에 대해 주로 보내진다(즉, 분비를 위함). 상기 기재한 바와 같이, 인산화된 리소좀 효소의 이런 분할은 정상 세포에서 일어나는 것의 정확히 반대이다. 리소좀 효소 생성을 위하여 사용된 세포주의 제조는 효소의 몰 당 만노스-6-포스페이트 수준을 최소화하는 것에 중점을 두지만, 낮은 특이적 생산성을 특징으로 한다. 높은 수준의 만노스-6-포스페이트 모이어티를 함유하는 리소좀 효소의 생성에서 시험관내 시도는 혼합된 성공을 초래하였다(Canfield 등, 미국특허 제6,537,785호). 시험관내 효소는 고수준의 만노스-6-포스페이트를 나타낼 뿐만 아니라 고수준의 미변형 말단 만노스를 나타낸다. 만노스-6-포스페이트와 리소좀 효소에 대한 만노스 수용체 간의 경쟁은 유효성을 위하여 고용량의 효소에 대한 필요를 초래하지만, 치료되는 피험체의 손상에 대해 더 큰 면역원성을 야기할 수 있었다.

설파타제는 리소좀 효소의 독특한 하위분류를 구성한다. 설파타제는, 예를 들어 스테로이드, 탄수화물, 프로테오글라이칸 및 당지질을 포함하는 다양한 기질로부터 설파타제 에스터를 절단한다. 모든 알려진 진핵생물 설파타지는 그것의 촉매 부위에서 시스테인 잔기를 함유한다. 설파타제 활성은 이 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 번역 후 변형을 필요로 한다. 시스테인에서 FGly으로 번역 후 변형 활성화는 리소좀에 대한 설파자제의 표적화 전, 번역 직후 미폴딩 설파타제 상의 소포체 내에서 일어난다(Dierks et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94: 11963-11968, 1997). 이 반응을 촉매하는 포밀글라이신-생성 효소는 설파타제 변형 인자 1(sulfatase modifying factor 1, SUMF1)이다. 이 독특한 번역후 변형의 중요성을 강조하는 것은, 리소좀 설파타제 효소 내 손상된 FGly 형성을 초래하는 SUMF1에서의 돌연변이가 사람에서 다중 설파타제 결핍증(Multiple Sulfatase Deficiency, MSD)을 야기한다는 사실이다(Diez-Ruiz et al., Annu . Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005).

따라서 리소좀 설파타제 효소 제제의 치료적 유효성은 해당 제제 내 만노스-6-포스페이트의 수준 및 활성 효소의 존재에 의존한다.

따라서, 이러한 리소좀 설파타제 효소의 결핍에 의해 야기되거나 결핍과 관련된 리소좀 저장 장애의 관리를 위한 치료적으로 유효한, 활성인 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 대규모 제조를 위한 효율적이며 생산적인 시스템을 위한 필요가 당업계에 존재한다.

본 발명은 엔도솜 산성화에서 결함이 있는 CHO-K1 세포주 유도체(G71로 명명)가 유전자조작되어 재조합 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)을 발현시킬 때, 변형된 G71 세포가 제조하는 세포주의 리소좀 구획에 대한 물질의 손실을 부분적으로 방지함으로써 고수율의 활성 고도로 인산화된 재조합 리소좀 설파타제 효소를 생성한다는 발견에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 재조합 인간 SUMF1 및 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 공동발현시키는 END3 상보적 그룹 세포주를 제공하여, 고수율의 활성의 고도로 인산화된 효소를 초래한다. 대표적인 세포주는 G71, G71S 및 이들의 유도체인데, 이는 원하는 G71 특성, 즉 고수율의 활성화의 고도로 인산화된 재조합 리소좀 설파타제 효소를 생성하는 능력을 보유한다. 재조합 인간 SUMF1 및 재조합 리소좀 설파타제 효소를 공동발현시키는 END3 상보적 기 변형 CHO-K1 세포주의 이런 적용은 효소 대체 치료(ERT)에 의한 리소좀 저장 질병의 관리를 위해 사용되는 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 제조에 특히 유용하다.

제1 양태에서, 본 발명은 END3 상보적 기 CHO 세포 또는 이것의 유도체에서 그것의 치료 용도를 가능하게 하는 양으로 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 생성하는 신규 방법을 특징으로 한다. 넓은 실시형태에서, 본 방법은 (a) CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체를 배양시키는 단계; (b) CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 중에서 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 발현시킬 수 있는 제1 포유류 발현 벡터를 제조하는 단계; (c) CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 중에서 재조합 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 발현시킬 수 있는 제2 포유류 발현 벡터를 제조하는 단계; (d) CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체를 제1 및 제2 발현 벡터로 트랜스펙션 시키는 단계; (e) 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 발현시키는 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체의 트랜스펙션체를 선별하고 클로닝하는 단계; 및 (f) 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 제조하기 위한 세포 배양 처리 방법을 최적화시키는 단계를 포함한다. 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소는 아릴설파타제 A(arylsulfatase A, ARSA), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB), 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-설파타제, IDS), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH), N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 방법은 리소좀 설파타제 효소의 모두 또는 부분을 암호화시키는 cDNA 및 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 내로 인간 SUMF1의 모두 또는 부분을 암호화시키는 cDNA를 트랜스펙션시키는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 및 인간 SUMF1을 각각 암호화시키는, 발현가능한 제1 및 제2 발현 벡터는 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 내로 동시에 트랜스펙션된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 발현 벡터는 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 내로 순차적으로 트랜스펙션된다. 일부 실시형태에서, 전장 인간 리소좀 설파타제 효소를 암호화하는 cDNA가 사용되는 반면, 다른 실시형태에서 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 cDNA가 사용된다. 일부 실시형태에서, 전장 인간 SUMF1을 암호화하는 cDNA가 사용되는 반면, 다른 실시형태에서 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 cDNA가 사용된다. 일부 실시형태에서, 다양한 발현 벡터가 사용되어 인간 리소좀 설파타제 효소 및 인간 SUMF1 cDNA를 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 내로 동시에 또는 순차적으로 전달한다. 일부 실시형태에서, 단일 발현 벡터가 사용되어 인간 리소좀 설파타제 효소 및 인간 SUMF1 cDNA를 동시에 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체 내로 전달한다. 바람직한 실시형태에서, CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체는 G71 세포주, G71S 세포주, 또는 G71 또는 G71S 유도체이다.

바람직한 실시형태에서, 해당 방법은 END3 상보적 기 CHO 세포주 또는 이것의 유도체로부터 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 아릴설파타제 A(ARSA), 아릴설파타제 B(ARSB), 이듀로네이트-2-설파타제(IDS), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH), N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S) 또는 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 생성하는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 해당 방법은 END3 상보적 기 CHO 세포주 또는 이것의 유도체로부터 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 생성하는 단계를 포함한다. END3 상보적 기 세포주는 END3 상보적 기 세포주의 특성, 예컨대 결함 엔도좀 산성화를 보유하는 임의의 변형된 CHO 세포주이다. 바람직한 실시형태에서, CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체는 G71 세포주, G71S 세포주 또는 G71 또는 G71S 유도체이다.

제2 양태에서, 본 발명은 치료적으로 리소좀 설파타제 효소의 사용을 가능하게 하는 양으로 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 생성하는 능력을 특징으로 하는 엔도솜 산성화-결핍 포유류 세포주를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 고수율의 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 생성함으로써, 이러한 리소좀 설파타제 효소의 대규모 생성을 가능하게 하는 G71, G71S 또는 이것의 유도체로 지정된 CHO-K1-유래 END3 상보적 기 세포주를 제공한다. 더 바람직한 실시형태에서, 세포주는 적어도 약 0.5, 바람직하게는 적어도 약 0.75, 더 바람직하게는 적어도 약 1.0 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 1.25 피코그램/세포/일의 양으로 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 발현시키고 분비한다.

END3 상보적 기 세포주는 END3 상보적 기 세포주, 예컨대 결함있는 엔도솜 산성화의 특성을 보유하는 임의의 변형된 CHO 세포주이다. 한 실시형태에서, END3 상보적 기 CHO 세포주는 G71 또는 이것의 유도체로부터 유래되며, (a) 재조합 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)에 대한 발현 벡터 및 (b) 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소에 대한 발현 벡터를 포함하되, 해당 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소는 아릴설파타제 A(ARSA), 아릴설파타제 B(ARSB), 이듀로네이트-2-설파타제(IDS), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH), N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, END3 상보적 기 CHO 세포주는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)에 대한 발현 벡터를 포함한다. 더 바람직한 실시형태에서, END3 상보적 기 CHO 세포주는 재조합 인간 GALNS를 발현하고 분비한다. 다른 바람직한 실시형태에서, END3 상보적 기 CHO 세포주는 클론 4, 클론 5, 클론 C6, 클론 C2, 클론 C5, 클론 C7, 클론 C1O, 클론 C11 및 클론 C30으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 실시형태에서, END3 상보적 기 CHO 세포주는 클론 C2이다. 다른 바람직한 실시형태에서, END3 상보적 기 CHO 세포주는 현탁액 중에서 성장에 적합하다.

제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라서 생성되고, 이에 의해 치료적으로 리소좀 설파타제 효소를 사용할 수 있게 하는 양으로 존재하는 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 제공한다. 리소좀 설파타제 효소는 전장 단백질 또는 이것의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체는 그것의 안정성 또는 약동학적 특성을 향상시키기 위하여 요망되는 것으로 변형될 수 있다(예를 들어, 페길화, 돌연변이유발, 융합, 컨쥬게이션). 바람직한 실시형태에서, 효소는 인간 리소좀 설파타제 효소, 천연 설파타제 효소의 생물학적 활성을 가지는 인간 리소좀 설파타제 효소의 단편 또는 인간 리소좀 설파타제 효소와 실질적인 아미노산 서열 상동성을 가지는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 인간 또는 포유류 서열, 기원 또는 유래의 단백질이다. 다른 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 그것의 결핍이 인간 질병을 야기하는 것, 예컨대 이염백질이영양증 또는 MLD(Metachromic Leukodystrophy), 즉, 아릴설파타제 A(ARSA)), 마르토-라미증후군 또는 MPS VI 즉, 아릴설파타제 B(ARSB)), 헌터증후군 또는 MPS II, 즉, 이듀로네이트-2-설파타제(IDS)), 산필립포 A 증후군 또는 MPS IIIa, 즉, 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH)), 산필립포 D 증후군 또는 MPS IIId, 즉, N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S)) 및 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS IVa(즉, N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS))이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 그것의 결핍이 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS IVa를 야기하는 것, 즉, N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS))를 야기하는 것이다. 다른 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 그것의 결핍이 인간 질병, 예컨대 다중 설파타제 결핍증 또는 MSD와 관련된 것(즉, N-아세틸갈락토사민- 6-설파타제(GALNS))이다.

리소좀 설파타제 효소는 또한 인간 또는 포유류 서열 기원 또는 유래일 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 각각의 양태에서, 리소좀 설파타제 효소s는 인간 또는 포유류 리소좀 설파타제 효소 아미노산 서열의 대응하는 부분에 대한 아미노산 서열과 동일하다. 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 모이어티는 인간 또는 포유류로부터의 천연 리소좀 설파타제 효소이다. 다른 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드는 인간 또는 포유류 효소의 천연 리소좀 설파타제 효소 아미노산 서열과 적어도 약 25, 50, 100, 150, 또는 200개의 아미노산 서열의 길이, 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 상동성이다(즉, 아미노산 서열에서 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일). 일부 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다. 인간 GALNS의 아미노산 서열은 서열번호 4에서 제시되며, 이것의 아미노산 27 내지 522는 분비된 전구체 단백질에 대응한다. 일부 실시형태에서, 이 GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 동일한 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진다. GALNS 효소는 C_α-포밀글라이신으로 전환도리 수 있는 분비된 전구체 단백질의 위치 53에서 Cys과 대응하는 촉매 부위 아미노산(서열번호 4의 아미노산 79)을 보유한다. GALNS 효소는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 모든 하전된 아미노산: Asp288, Asn289, Asp39, Asp54, His236, Lysl40, His 142, Lys310 및 α-나선: Arg83을 포함하는 활성 부위 공동 내에 다른 아미노산을 보유할 수 있다. 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 문헌[Sukegawa, Human Molecular Genetic s, 2000, Vol. 9, No. 9 1283-1290]는 환자에서 GALNS 활성을 감소시키고 효소 내에서 그것 각각의 3-차원 위치로 다양한 돌연변이의 강도와 관련되는 추가적인 돌연변이를 기재한다. 다른 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소가 투여되는 피험체는 인간이다.

바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 엔도솜 산성화-결핍 세포주, 예를 들어 a CHO-유래 END3 상보적 기 세포주에 의해 생성된 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소이다. END3 상보적 기 세포주는 END3 상보적 기 세포주, 예컨대 결함 엔도솜 산성화의 특성을 보유하는 임의의 변형된 CHO 세포주이다. 바람직한 실시형태에서, CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체는 G71 세포주, G71S 세포주, 또는 G71 또는 G71S 유도체이다. 대안적으로, 리소좀 설파타제 효소는 임의의 숙주 세포, 예를 들어 임의의 CHO 세포 또는 CHO 세포-유래 계통에 의해 생성될 수 있으며, 상대적으로 고수율, 예를 들어 적어도 약 0.5, 적어도 약 0.75, 적어도 약 1.0, 또는 적어도 약 1.25 피코그램/세포/일의 양으로 고도로 인산화된 재조합 리소좀 설파타제 효소의 발현 및 분비를 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다.

더 바람직한 실시형태에서, 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소는 고수준의 인산화된 올리고당(즉, 단백질 사슬 당 약 0.25 초과, 바람직하게는 0.5 초과, 및 더 바람직하게는 약 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬)을 가진다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 구체화된 고수준의 인산화된 올리고당을 갖는 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 GALNS를 제공한다. 예를 들어, 리소좀 설파타제 효소는 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 1.0의 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.9 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 모노머 단백질 사슬 당 0.54 내지 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가진다. 다른 유사한 범위, 예를 들어 모노머 단백질 사슬 당 적어도 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6 또는 0.65의 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 모노머 단백질 사슬 당 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 0.98 또는 1.0까지의 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 이들 숫자의 임의의 조합이 고려된다. 바람직한 실시형태에서, 효소는, 예를 들어 서열번호 4의 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다.

일부 실시형태에서, 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소는 활성 부위 시스테인 잔기의 Ca- 포밀글라이신(FGly)로 전환의 높은 백분율(즉, 적어도 약 50%, 55%, 60% 또는 65%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)을 가진다. 바람직한 실시형태에서, 효소는 활성 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이며, 활성 부위 시스테인 잔기는 위치 53에서 Cys이다(서열번호 4의 위치 79).

특정 실시형태에서, 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소는 활성 부위 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 전환의 높은 백분율, 예를 들어 본 명세서에 기재된 임의의 백분율과 함께 고수준의 인산화된 올리고당, 예를 들어 본 명세서에 기재된 모노머 단백질 사슬 당 비스-인산화된 올리고만노스 사슬의 임의의 범위 또는 수준을 가진다. 바람직한 실시형태에서, 효소는 예를 들어 서열번호 4의 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다.

앞의 실시형태 중 어떤 것에서, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98.5%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 또는 적어도 65%의 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 GALNS(서열번호 4)는 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때 또는 SDS-모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) 염색에 의해 결정되는 전구체 형태로 있다.

추가로, 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 GALNS(서열번호 4)는 선택적으로 또한 재조합 인간 SUMF1을 발현시키지 않는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 CHO-유래 세포)에서 생성된 동일 아미노산 서열의 대조군 리소좀 설파타제 효소의 특정 활성보다 적어도 약 30% 초과의(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2-배, 2.5-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 30-배, 40-배 또는 50-배) 특이적 활성을 나타낸다.

앞의 실시형태 중 어떤 것에서, 기재된 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 GALNS(서열번호 4)는 약 0.1 내지 10nM, 또는 약 0.1 내지 7nM, 또는 약 0.5 내지 5nM, 또는 약 1 내지 5nM 또는 약 1 내지 3.5nM, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM 또는 약 3.5nM 또는 이들 숫자의 임의의 조합인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타낸다.

앞의 실시형태 중 어떤 것에서, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%의 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 GALNS(서열번호 4)는 만노스-6-포스페이트 수용체 칼럼에 결합한다.

이 양태에 따라서, 리소좀 설파타제 효소의 이들 실시형태 중 어떤 것의 정제된 제제가 제조되며, 이때 리소좀 설파타제 효소 성분, 예를 들어 GALNS(서열번호 4)는 비-환원 조건 하에 또는 순도를 결정하는 다른 방법(예를 들어, 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 다음에 쿠마씨 블루 또는 은에 의한 염색, 또는 C4 역상(reverse phase, RP) 또는 C3 RP 또는 크기배제 크로마토그래피(size exclusion 크로마토그래피, SEC)를 포함하는 HPLC에 의한 크로마토그래피 분리)이 실시될 때 쿠마씨 블루 염식으로 결정되는 바와 같은 적어도 약 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 순도를 가진다. 일부 실시형태에서, 정제된 제제의 리소좀 설파타제 효소 성분의 상당한 양은 환원 조건 하에서 또는 전구체를 검출하는 다른 방법(예를 들어, 쿠마씨 블루 또는 은 염색에 의한 환원 조건 하에 SDS-PAGE 또는 HPLC에 의한 크로마토그래피 분리(예를 들어 C4 역상(RP), C3 RP) 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 또는 전기이동 분리 및 크로마토그래피 분리의 조합, 예를 들어 SDS-PAGE 다음에 모세관 겔 전기영동(SDS-CGE))이 실시될 때 쿠마씨 블루 염색으로 결정되는 바와 같이 분비된 전구체 형태(예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5% 전구체)로 존재한다.

특정 실시형태에서, 정제된 제제의 리소좀 설파타제 효소 성분은 높은 백분율, 예를 들어 본 명세서에 기재된 임의의 백분율의 활성 부위 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 전환과 함께 고수준, 예를 들어 본 명세서에 기재된 모노머 단백질 사슬 당 비스-인산화된 올리고만노스 사슬의 어떤 범위 또는 수준의 인산화된 올리고당을 가진다. 더 구체적인 실시형태에서, 정제된 제제는 본 명세서에 기재된 K흡수를 가진다.

관련 양태에서, 본 발명은 리소좀 설파타제 효소 또는 본 명세서에 기재된 정제된 제제 중 어떤 것을 멸균의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제와 함께 함유하는 멸균 조성물을 제공한다. 이러한 멸균 조성물은 용액 또는, 선택적으로 바이알 내에서 멸균 희석제의 첨가에 의해 원상태로 될 수 있는 동결건조된 분말의 형태를 취할 수 있다.

제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소의 정제방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 적어도 5개의 정제 단계를 포함하는 2-칼럼 과정(염료-리간드 크로마토그래피, 예를 들어 블루-세파로스(Blue-Sepharose) 및 양이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 SE Hi-Cap)을 사용하여 정제된다: (1) 채취물, 즉 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 및 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 발현시키는 END3 상보적 기 CHO 세포주 또는 이것의 유도체로부터의 배양배지를 여과시키는 단계; (2) 여과된 채취물을 pH 4.5로 pH 조절하는 단계(오염 단백질의 침전을 유발); (3) 염료-리간드 칼럼, 예를 들어 블루-세파로스 칼럼 상에 pH-조절된 여과 채취물을 로딩하고, 해당 칼럼을 세척하며, 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계; (4) 염료-리간드 칼럼으로부터 양이온 교환 칼럼, 예를 들어 SE Hi-캡 칼럼 상으로 용리액을 로딩하고, 칼럼을 세척하며, 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계; 및 (5) 양이온 교환으로부터 용리액을 초미세여과 및 정용여과시키는 단계. 선택적으로, 단계 (1)에서 여과된 채취물은 pH를 조절하기 전 초미세여과에 의해 10 내지 20배로 농축된다. 선택적으로, 단계 (5)의 초미세여과 및 정용여과된 리소좀 설파타제 효소는 조제물 완충제 중에서 조제된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다.

다른 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 적어도 5개의 정제 단계: (1) 채취물, 즉 예를 들어 Sartocon 카세트(30kDa, Hydrosart)에 의해 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 및 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 발현시키는 END3 상보적 기 CHO 세포주 또는 이것의 유도체로부터의 배양배지를 초미세여과시키는 단계; (2) 여과된 채취물을 pH 4.5로 pH 조절하는 단계(오염 단백질의 침전을 유발); (3) 포획 칼럼, 예를 들어 프락토겔 EMD SE Hi-CAP(M) 양이온 교환 상에 pH-조절 여과된 채취물을 로딩하고, 칼럼을 세척하며 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계; (4) 포획 칼럼으로부터 중간체 칼럼, 예를 들어 염료-리간드 Capto Blue, 아연 킬레이팅 세파로스 FF 또는 Capto Adhere 상으로 용리액을 로딩하고, 칼럼을 세척하며 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계; 및 (5) 폴리싱 칼럼, 예를 들어 ToyoPearl 뷰틸 650M, 페닐 세파로스 Hi-Sub 또는 페닐 세파로스 Low-Sub 상에 용리액을 로딩하고, 칼럼을 세척하며 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계를 포함하는 3-칼럼 과정(포획 크로마토그래피, 예를 들어 양이온 교환 SE Hi-Cap; 중간체 크로마토그래피, 예를 들어 염로-리간드 Capto Blue, 아연 킬레이팅 세파로스 FF 또는 Capto Adhere; 및 폴리싱 크로마토그래피, 예를 들어 ToyoPearl 뷰틸 650M, 페닐 세파로스 Hi-Sub 또는 페닐 세파로스 Low-Sub)을 사용하여 정제된다. 단계 (5)로부터 용리된 리소좀 설파타제 효소는 조제물 완충제 중에서 조제된다. 선택적으로, 단계 (5)로부터 용리된 리소좀 설파타제 효소는 초미세여과된 다음 조제물 완충제 중에서 조제된다. 선택적으로, 단계 (4)의 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소는 단계 (5)의 폴리싱 칼럼 상에 로딩 전 낮은 pH 불활성화를 위하여 pH 3.5에 노출된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다.

다른 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 적어도 6개의 정제 단계:(1) 채취물, 즉 포유류 세포주, 예를 들어 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 및 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 발현시키는 END3 상보적 기 CHO 세포주 또는 이것의 유도체로부터의 배양 배지를 여과시키고, 여과된 채취물을, 예를 들어 Sartocon 카세트(30kDa, Hydrosart)에 의해 초미세여과/정용여과시키며, 농축된, 예를 들어 20X 농축된 여과 채취물을 초래하고, 농축된 여과 채취물을 차콜 여과시키는 단계; (2) 포획 또는 IMAC 칼럼, 예를 들어 염료-리간드 Capto Blue, 아연 킬레이팅 세파로스 FF 또는 Capto Adhere 상에 차콜 여과, 농축된 채취물을 로딩하고, 리소좀 설파타제 효소가 포획 칼럼 상에 보유되는 조건 하에 포획 칼럼을 세척하며, 포획 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계; (3) 선택적으로, 바이러스 제거를 위하여 필터, 예를 들어 Mustang Q 필터를 갖는 포획 칼럼으로부터 용리액을 여과시키는 단계; (4) 용리액 또는 포획 칼럼으로부터 여과된 용리액의 pH를 산 pH, 예를 들어 pH 4.5±0.1로 조절한 다음, 포획 칼럼으로부터 산 pH-조절된 용리액 또는 여과된 용리액을 여과시키는 단계; (5) 포획 칼럼으로부터 중간체 칼럼, 예를 들어 프락토겔 EMD SE Hi-CAP 양이온 교환 칼럼 상으로 여과된, 산 pH-조절된 용리액 또는 여과된 용리액을 로딩하며, 중간체 칼럼을 리소좀 설파타제 효소가 중간체 칼럼 상에 보유되는 조건 하에 세척하고, 중간체 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계; (6) 바이러스 불활성화를 위하여 중간체 칼럼으로부터 용리액의 pH를 낮은 pH, 예를 들어 pH 3.5±0.1로 조절하는 단계; 및 (7) 중간체 양이온 교환 칼럼으로부터 폴리싱 칼럼, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction 크로마토그래피, HIC) 칼럼, 예를 들어ToyoPearl 뷰틸 650M, 페닐 세파로스 Hi-Sub 또는 페닐 세파로스 Low-Sub으로부터 불활성화된 낮은 pH 바이러스를 로딩하고, 리소좀 설파타제 효소가 폴리싱 칼럼 상에 보유되는 조건 하에서 폴리싱 칼럼을 세척하고, 폴리싱 칼럼으로부터 리소좀 설파타제 효소를 용리시키는 단계를 포함하는 리소좀 설파타제 효소의 단백질 분해, 즉, 클리핑(clipping)을 감소시키도록 지정된 상이한 3-칼럼 과정(포획 또는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC), 예를 들어 염료-리간드 Capto Blue, 아연 킬레이팅 세파로스 FF 또는 Capto Adhere; 중간체 크로마토그래피, 예를 들어 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 양이온 교환; 및 폴리싱 크로마토그래피, 예를 들어 ToyoPearl 뷰틸 650M, 페닐 세파로스 Hi-Sub 또는 페닐 세파로스 Low-Sub)을 사용하여 정제된다. 바람직한 실시형태에서, 단계 (3)은 정제 과정에 포함된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 (3)은 정제 과정에서 생략된다. 선택적으로, (8) 단계 (7)로부터 용리된 리소좀 설파타제 효소는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 30mM 아르기닌 HCl, 2%(w/v) 솔비톨, pH 5.4를 포함하는 본 명세서에 기재된 해당 조제물을 포함하는 조제물로 교환된 완충제이며, 조제물 내에 용리된 리소좀 설파타제 효소의 농도는 적절한 농도, 예를 들어 3㎎/㎖로 조절되며; (9) 정제된 리소좀 설파타제 효소의 조제물 내 존재하는 임의의 잔여 바이러스 및 DNA는 바이러스 필터 및 DNA 필터를 통해 여과에 의해 제거되고; (10) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 20(PS20 또는 Tween- 20)은 정제된 리소좀 설파타제 효소의 조제물에 첨가된다. 정제된설파타제 효소(Bulk Drug Substance)의 최종 조제물은 2 내지 8℃ 또는 냉동상태로 저장된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 단계 (8) 내지 (10)은 정제 과정에 포함된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다.

일부 실시형태에서, 채취는 약 6.5의 pH에서 단계 (1)에서 수집된다. 일부 실시형태에서, 단계 (1)의 차콜 여과는 Zeta Plus R55 활성탄 여과이다. 일부 실시형태에서, 단계 (2)의 포획 칼럼은 Zn-IMAC 칼럼이다. 일부 실시형태에서, Zn-IMAC 칼럼은 Zn-킬레이트 세파로스 FF 칼럼이다. 일부 실시형태에서, 단계 (3)의 필터는 Mustang Q 필터이다. 일부 실시형태에서, 단계 (2) 또는 (3)으로부터 용리액 또는 여과된 용리액의 산 pH는 단계 (4)에서 약 4.5±0.1로 조절된다. 일부 실시형태에서, 단계 (5)의 중간체 칼럼은 양이온 교환 칼럼이다. 일부 실시형태에서, 양이온 교환 칼럼은 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼이다. 일부 실시형태에서, 단계 (6)으로부터 용리액의 낮은 pH는 단계 (6)에서 약 3.5±0.1로 조절된다. 일부 실시형태에서, 단계 (7)의 폴리싱 칼럼은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼이다. 일부 실시형태에서, HIC 칼럼은 ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼이다.

일부 실시형태에서, 조제물은 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 30mM 아르기닌 HCl, 2%(w/v) 솔비톨을 pH 5.4에서 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 20(PS20)이다. 일부 실시형태에서, 조제물 내 리소좀 설파타제 효소의 농도는 약 3㎎/㎖로 조절된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 필터는 DV20 필터이며 DNA 필터는 Mustang Q 필터이다. 일부 실시형태에서, 조제물에 첨가된 비이온성 계면활성제는 0.01%(w/v)의 최종 농도로 폴리솔베이트 20(PS20)이다.

제5 양태에서, 본 발명은 GALNS 효소 결핍에 의해 야기된 리소좀 저장 질병(예를 들어 점액다당류증 IVa형(MPS IVa) 또는 모르퀴오 A 증후군)) 또는 결핍과 관련된 리소좀 저장 질병(예를 들어, 다중 설파타제 결핍증(MSD))에 걸린 피험체를 치료하는데 유용한 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 돌연변이체, 변이체 또는 유도체의 정제된 제제를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS의 정제된 제제는 다음을 가지는 GALNS 효소 성분을 가지며: (a) 비환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때, 쿠마씨 블루 염색 또는 은 염색으로 결정되는 바와 같은 적어도 약 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 순도; (b) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)(서열번호 4의 위치 79)으로 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% 전환; (c) 위치 178 내지 397의 아스파리긴 잔기에서 N-연결된 글라이코실화로서, 위치 178에서 아스파라긴 잔기에 부착된 일부 올리고만노스 사슬은 비스-인산화됨; (d) 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 1.0, 또는 0.5 내지 0.9, 또는 0.5 내지 0.8, 또는 0.5 내지 0.75, 또는 0.54 내지 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬(예를 들어, 적어도 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 또는 0.65 및 모노머 단백질 사슬 당 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 0.98, 또는 1.0까지의 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 이들 숫자 중 어떤 것의 임의의 조합); 및 (e) 적어도 65%, 또는 적어도 70%(예를 들어 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5%)의 GALNS 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE가 실시될 때 또는 SDS-모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 결정되는 바와 같은 전구체 형태로 존재한다. 추가로, GALNS 효소는 선택적으로 또한 (f) 재조합 인간 SUMF1을 발현시키지 않는 숙주 세포(예를 들어 CHO 세포 또는 CHO-유래 세포) 내에서 생성된 동일 아미노산 서열의 대조군 GALNS 효소의 특이적 활성을 적어도 약 30% (e.g. , 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2-배, 2.5-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 30-배, 40-배 또는 50-배) 초과하는 특이적 활성을 나타낸다. 선택적으로, GALNS 효소는 약 0.1 내지 10nM, 또는 약 0.1 내지 7nM, 또는 약 0.5 내지 5nM, 또는 약 1 내지 5nM, 또는 약 1 내지 3.5nM, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM 또는 약 3.5nM, 또는 이들 숫자 중 어떤 것의 임의의 조합인 섬유아세포 내로 특정 섭취(K흡수)를 나타낸다.

정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS는 약 55-60kDa(즉, 적어도 약 75%, 또는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 눈에 보이는 단백질이 되는 전구체 인간 GALNS)의 주요 밴드 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때, 또는 SDS-CGE에 의해 결정되는 바와 같이 ~39kDa 및 ~19kDa(즉, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 바람직하게는 약 15% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1.5% 미만, 약 1% 또는 약 0.5% 미만의 눈에 보이는 단백질이 되는 성숙 또는 처리된 인간 GALNS)에서 부수적 밴드로 이루어진다. 특히 바람직한 실시형태에서, 정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE가 실시될 때, 또는 SDS-CGE에 의해 결정되는 바와 같이 특히 약 55-60kDa(즉, 전구체 인간 GALNS)의 단일 결합으로 이루어진다. 한 실시형태에서, 정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS는 MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군을 치료하는데 유용하다. 한 실시형태에서, 정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS는 MSD를 치료하는데 유용하다.

제6 양태에서, 해당 발명은 리소좀 설파타제 효소의 결핍에 의해 모두 또는 부분적으로 야기된 질병, 또는 리소좀 설파타제 효소의 결핍과 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 본 발명의 방법에 의해 생성되는 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 투여하는 단계를 포함하되, 리소좀 설파타제 효소는 MPR 수용체와 결합하며, 세포 막을 가로질러 수송되고, 세포 내 리소좀에 전달된다.

한 실시형태에서, 해당 방법은 상기 리소좀 설파타제 효소의 치료적 유효량을 치료가 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 리소좀 설파타제 효소의 결핍증에 걸린 피험체를 치료하는 단계를 포함하되, 상기 리소좀 설파타제 효소는 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체에 의해 생성된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체이다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 치료적 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 단독으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시형태는 치료되는 피험체, 바람직하게는 포유류 및 가장 바람직하게는 인간의 필요에 대해 투약량을 최적화하는 단계, 가장 효과적으로는 리소좀 설파타제 효소의 결핍증을 개선시키는 단계를 포함한다.

이러한 치료적 리소좀 설파타제 효소는, 예를 들어 리소좀 설파타제 효소의 결핍증에 의해 야기되는 리소좀 저장 질병에 걸린 환자, 예컨대 이염백질이영양증 또는 MLD, 점액다당류증 VI 형(MPS VI) 또는 마르토-라미증후군, 점액다당류증 II 형(MPS II) 또는 헌터증후군, 점액다당류증 III 형(MPS IIIa) 또는 산필립포 A 증후군, 점액다당류증 IIId 형(MPS IIId) 또는 산필립포 D 증후군 및 점액다당류증 IVa 형(MPS IVa) 또는 모르퀴오 A 증후군에 걸린 환자의 치료에서 특히 유용하다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 저장 질병은 MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군이며 리소좀 설파타제 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 또한 리소좀 저장 질병을 야기하는 결핍 리소좀 설파타제 효소 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 실시형태에서, 해당 방법은 리소좀 설파타제 효소의 치료적 유효량을 치료가 필요한 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 하나 이상의 리소좀 설파타제 효소의 결핍과 관련된 리소좀 저장 질병에 걸린 피험체를 치료하는 단계를 포함하되, 상기 리소좀 설파타제 효소는 CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체에 의해 생성된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체이다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 치료적 재조합 인간 GALNS 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 단독으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 저장 질병은 다중 설파타제 결핍증(MSD)이다.

특히 바람직한 실시형태에서, CHO-유래 END3 상보적 기 세포 또는 이것의 유도체는 G71 세포주, G71S 세포주 또는 이것의 G71 또는 G71S 유도체이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 효소 대체가 필요한 피험체에게 치료적 유효량의 리소좀 설파타제 효소를 투여하는 것에 의한 효소 대체 치료방법을 제공하되, 환자의 세포는 세포에 대한 손상을 방지하거나 감소시키는데 불충분한 양의 리소좀 설파타제 효소를 함유하는 리소좀을 가지고, 이에 의해 충분한 양의 리소좀 설파타제 효소 가 세포에 대한 손상을 방지하거나 감소시키도록 리소좀에 유입된다. 세포는 CNS 내에 있을 수 있고 또는 CNS가 없을 수 있으며 또는 활성제의 확산에 대해 밀착연접에 의해 내피세포가 단단히 밀봉되는 모세관 벽에 의해 혈관으로부터 유발되지 않아도 된다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 표적 리소좀 내에서 감소되고, 결핍되거나 또는 부재인 생물학적 활성을 가지는 활성의 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물을 제공하며, 이는 피험체에게 투여된다. 바람직한 활성 인간 리소좀 설파타제 효소는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아릴설파타제 A, 아릴설파타제 B, 이듀로네이트-2-설파타제, 설파미다제/헤파린-N-설파타제, N-아세틸글루코사민-6-설파타제 및 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, N-아세틸갈락토사민-6-설파타제는 활성 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소이다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 임의의 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS), 정제된 제제 및/또는 본 명세서에 기재된 멸균 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여함으로써 MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군, 또는 MSD에 거린 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.

더 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 END3 상보적 기 세포에 의해 생성된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 치료적 유효량을 피험체에게 투여함으로써 MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군 또는 MSD에 걸린 피험체를 치료하는 방법을 제공하되, 재조합 인간 GALNS는 활성 부위 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 고수준의 전환(즉, 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95% 전환), 및 고수준의 인산화(즉, 단백질 사슬 당 약 0.25 초과, 바람직하게는 0.5 초과, 및 더 바람직하게는 약 0.75 초과의 비스-인산화된 올리고만노스 사슬)를 가진다.

특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 하기를 갖는 GALNS 효소 성분을 가지는 정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS 제조의 치료적 유효량을 피험체에게 투여함으로써 MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군 또는 MSD에 걸린 피험체를 치료하는 방법을 제공한다: (a) 비환원 조건 하에 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루 염색 또는 은 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 순도; (b) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)(서열번호 4의 위치 79)으로 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 전환; (c) 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 1.0 또는 0.5 내지 0.9 또는 0.5 내지 0.8 또는 0.5 내지 0.75 또는 0.54 내지 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬(예를 들어, 모노머 단백질 사슬 당 적어도 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6 또는 0.65 및 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 0.98 또는 1.0까지 비스-인산화된 올리고만노스 사슬, 또는 이들 숫자 중 어떤 것의 임의의 조합); 및 (d) GALNS 효소의 적어도 65% 또는 적어도 70%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5%)는 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때 또는 SDS-모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 크마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 전구체 형태로 존재한다. 게다가, GALNS 효소는 선택적으로 또한 (e) 재조합 인간 SUMF1을 발현시키지 않는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 CHO-유래 세포)에서 생성된 동일 아미노산 서열의 대조군 GALNS 효소의 특이적 활성보다 적어도 약 30%(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2-배, 2.5-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 30-배, 40-배 또는 50-배) 초과의 특이적 활성을 나타낼 수 있다. 선택적으로, GALNS 효소는 약 0.1 내지 10nM, 또는 약 0.1 내지 7nM, 또는 약 0.5 내지 5nM, 또는 약 1 내지 5nM 또는 약 1 내지 3.5nM, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM 또는 약 3.5nM, 또는 이들 숫자 중 어떤 것의 임의의 조합인 섬유아세포 내로 특이적 섭취(K흡수)를 나타낸다.

정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS는 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때, 또는 SDS-CGE로 결정되는 바와 같이 약 55-60kDa(즉, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 98.5%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.5%의 눈에 보이는 단백질이 되는 전구체 인간 GALNS)의 주요 밴드 및 ~39kDa 및 ~19kDa(즉, 약 25% 미만, 또는 약 20% 미만, 바람직하게는 약 15% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만 및 훨씬 더 바람직하게는 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1.5% 미만, 약 1% 미만 또는 약 0.5%의 눈에 보이는 단백질이 되는 성숙 또는 처리된 인간 GALNS)에서 부수적 밴드로 이루어진다. 더 특히 바람직한 실시형태에서, 정제된, 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 GALNS는 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때, 또는 SDS-CGE에 의해 결정되는 바와 같이 약 55-60kDa(즉, 전구체 인간 GALNS)의 단일 밴드로 본질적으로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 피험체는 MPS IVa 또는 모르퀴오 A 증후군에 걸려있다. 일부 실시형태에서, 피험체는 MSD에 걸려있다.

상기 기재된 리소좀 저장 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 방법에 의해 바람직하게 생성되는 본 발명의 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 대응하는 사용이 또한 생각된다.

제7 양태에서, 본 발명은 이러한 리소좀 설파타제 효소의 결핍증에 의해 모두 또는 부분적으로 야기되거나 또는 리소좀 설파타제 효소 결핍증과 관련된 질병을 치료하는데 유용한 본 명세서에서 상기 기재한 것과 같은 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 방법에 의해 생성된 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은 몇몇 경로, 예컨대 척추강내, 비경구, 국소, 비강내, 흡입 또는 경구 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 본 양태의 범주 내에 리소좀 효소 결핍증에 의해 영향받은 세포 내로 생체내에서 투여될 수 있는 전장 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 특징으로 하는 실시형태가 있다.

더 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 완충제 및 하나 이상의 안정제를 포함하는 조제물 내 본 발명의 방법에 의해 생성된 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 상기 GALNS 효소의 탈인산화를 감소시키기에 효과적인 인산염 완충제의 양; 및 아미노산 염, 아미노산 완충제, 계면활성제 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안정제의 안정화 양을 포함하되; 상기 조제물은 약 5.0-5.8의 pH에 있다.

일부 실시형태에서, GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, (i) 비환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도, (ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 적어도 약 80% 전환, 및 (iii) 선택적으로 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지되, 상기 GALNS 효소의 적어도 70%는 환원 조건 하에 SDS-PAGE 가 실시될 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 전구체 형태로 존재한다. 일부 실시형태에서, GALNS 효소는 RP-HPLC로 결정되는 바와 같은 적어도 95% 순수하다. 일부 실시형태에서, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%의 GALNS 효소는 환원 조건 하에 SDS-PAGE 가 실시될 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 전구체 형태로 존재한다. 일부 실시형태에서, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%의 GALNS 효소는 SDS-모세관 겔 전기영동에 의해 결정되는 바와 같은 전구체 형태로 존재한다. 일부 실시형태에서, GALNS 효소는 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 적어도 약 90% 전환을 가진다. 일부 실시형태에서, GALNS 효소의 50% 내지 80%는 만노스-6-포스페이트 수용체 칼럼에 결합한다. 일부 실시형태에서, GALNS 효소는 약 1 내지 5nM인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타낸다. 일부 실시형태에서, GALNS 효소는 약 1 내지 3.5nM인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타낸다.

조제물 내 GALNS 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체의 농도는 약 0.1 내지 10㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.5 내지 5㎎/㎖ 및 더 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5㎎/㎖이다.

특정 실시형태에서, 조제물은 상기 GALNS 효소의 탈인산화를 감소시키는데 효과적인 인산염 완충제의 양을 포함한다. 관련된 실시형태에서, 인산염 완충제는 NaH₂PO₄ 또는 그것의 동등물이다. 추가 실시형태에서, 조제물은 제2 완충제를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서 제2 완충제는 아세테이트 완충제이다. 다른 실시형태에서, 아세테이트 완충제는 NaOAc/HOAc 또는 이것의 동등물이다. 대표적인 완충제는 상세한 설명에서 더욱 상세하게 기재된다.

조제물 내 NaOAc/HOAc 또는 그것의 동등물의 농도는 약 5 내지 100mM, 바람직하게는 약 5 내지 50mM, 및 더 바람직하게는 약 10 내지 30mM이다. 관련 실시형태에서, 조제물 내 NaH₂PO₄ 또는 그것의 동등물의 동등물의 농도는 약 5 내지 100mM, 바람직하게는 약 25 내지 100mM, 및 더 바람직하게는 약 25 내지 75mM이다. 특정 실시형태에서, 조제물의 pH는 약 pH 4.5-6.5, 바람직하게는 약 pH 5.0-6.0, 및 더 바람직하게는 약 pH 5.0-5.8이다.

또 다른 실시형태에서, 조제물은 아미노산 염, 아미노산 완충제, 계면활성제 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안정제의 안정화 양을 포함한다. 한 실시형태에서, 안정제는 아르기닌 또는 히스티딘 염 또는 완충제, 선택적으로 아르기닌 염산염이다. 관련 실시형태에서, 안정제는 폴리솔베이트, 선택적으로 폴리솔베이트 20이다. 추가 실시형태에서, 안정제는 3가 또는 더 고차의 당 알코올, 선택적으로 솔비톨이다. 대표적인 안정제는 상세한 설명에서 더욱 상세하게 기재된다.

특정 실시형태에서, 안정제는 아르기닌 HCl 또는 그것의 동등물, Tween-20 (폴리솔베이트 20) 또는 그것의 동등물 및 솔비톨 또는 그것의 동등물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조제물 내 아르기닌 HCl 또는 그것의 동등물의 농도는 5 내지 200mM, 바람직하게는 약 10 내지 100mM, 및 더 바람직하게는 약 10 내지 50mM이다. 다른 실시형태에서, 조제물 내 Tween-20 또는 그것의 동등물의 농도는 약 0.001 내지 1.0%(w/v), 바람직하게는 약 0.005 내지 0.2%(w/v) 및 더 바람직하게는 약 0.005 내지 0.015%(w/v)이다. 관련 실시형태에서, 조제물 내 솔비톨 또는 그것의 동등물의 농도는 약 0.1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.5 내지 5%(w/v), 및 더 바람직하게는 약 1.0 내지 3.0%(w/v)이다. 한 실시형태에서, 조제물은 아르기닌 염 또는 완충제, 폴리솔베이트, 및 폴리올을 포함한다.

본 발명은 약 25mM 및 75mM인 인산염 완충제의 최종 농도로 GALNS 효소와 인산염 완충제를 혼합하는 단계를 포함하는 재조합 인간 GALNS 효소의 탈인산화 방지 방법을 추가로 제공한다. 대표적인 실시형태에서, 인산화 양은 예를 들어 실온에서(예를 들어 25℃) 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월의 저장 후 1mM 인산염 완충제 중에서 동일 효소의 조제물과 비교하여 감소된다.

특히 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 완충제로서 NaOAc/HOAc 및 NaH₂PO₄, 및 안정제로서 아르기닌 HCl, Tween-20(폴리솔베이트 20) 및 솔비톨을 포함하는 조제물 내 본 발명의 방법에 의해 생성된 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 조제물 내 GALNS의 농도는 약 1.0 +/- 0.5㎎/㎖이다. 조제물 내 NaOAc/HOAc의 농도는 약 20 +/- 10mM이며, 조제물 내 NaH₂PO₄의 농도는 약 50 +/- 25mM이다. 조제물의 pH는 pH 5.4 +/- 0.4이다. 조제물 내 아르기닌 HCl의 농도는 약 30 +/- 20mM이다. 조제물 내 Tween-20의 농도는 약 0.01 +/- 0.005%(w/v)이다. 조제물 내 솔비톨의 농도는 약 2.0 +/- 1.0%(w/v)이다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) 연골세포 분화의 유지를 촉진하는 조건 하에서, 리소좀 설파타제 효소 결핍증에 걸린 환자, 예를 들어 모르퀴오 증후군에 걸린 환자로부터의 연골세포를 배양시키는 단계; (b) 케라탄 설페이트를 분해시키는 리소좀 설파타제 효소와 연골세포를 접촉시키는 단계; 및 (c) 세포 내 케라탄 설페이트의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 리소좀 설파타제 효소의 활성을 검출하는 방법을 제공하되, 리소좀 설파타제 효소와 접촉시키지 않은 세포와 비교하여 리소좀 설파타제 효소와 접촉시킨 세포 내 감소된 케라탄 설페이트 수준은 리소좀 설파타제 효소 활성의 표시한다. 일부 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다. 일부 실시형태에서, 배양 단계는 인슐린 성장 인자 1(인슐린 growth factor 1, IGF1), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 트랜스페린, 인슐린 및 아스코르브산을 포함하는 배지 내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 케라탄 설페이트는 공초점 현미경에 의해, 또는 항-케라탄 설페이트 항체에 결합을 통해 검출된다. 해당 방법은 자연적으로 발생하는 또는 재조합 인간 효소, 또는 이것의 단편 또는 변이체를 포함하고, 신호 서열 없이 전구체 인간 효소와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체, 또는 이것의 성숙 형태를 포함하는 임의의 리소좀 설파타제 효소에 의해 수행될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 천연 물질을 분해하기 위한 재조합 인간 리소좀 효소의 활성을 측정하기 위한 세포-기반 분석을 제공한다. 해당 방법은 (a) 리소좀 효소를 위한 천연물질이 축적되는 조건 하에 리소좀 효소 내 결핍된 분리된 인산 세포를 배양시키는 단계; (b) 세포를 리소좀 효소와 접촉시키는 단계; (c) 세포를 용해하는 단계; (d)(i) 천연 물질에 특이적이고, 천연 물질로부터 작은 올리고당을 절단하는 효소를 세포 용해물에 첨가하는 단계; (e) 작은 올리고당을 검출가능한 모이어티로 표지하는 단계; (f) 선택적으로 표지된 작은 올리고당을 분리하는 단계; (g) 표지된 작은 올리고당을 검출하는 단계; 및 (h)(i) 리소좀 효소와 접촉시킨 세포로부터의 표지된 작은 올리고당의 양과 (ii) 리소좀 효소와 접촉시키지 않은 세포로부터의 표지된 작은 올리고당의 양을 비교함으로써 천연 물질을 분해시키는 리소좀 효소의 활성을 결정하는 단계를 포함하되, (h)(ii)와 비교하여 (h)(i)에서 환원은 천연 물질을 분해하는 리소좀 효소의 활성을 표시한다. 한 실시형태에서, 작은 올리고당은 단당류, 이당류 또는 삼당류이다. 관련 실시형태에서, 작은 올리고당은 이당류이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 아릴설파타제 B (ARSB), 이듀로네이트-2-설파타제(IDS), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH), N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 α-L-이듀로니다제(IDU)이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 산 α-글루코시다제(GAA)이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 β-글루코로니다제(GUSB)이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 β-갈락토시다제(GLB1)이다.

세포-기반 분석에 사용될 수 있는 적합한 인간 세포는 시험되는 리소좀 효소에 결핍된 임의의 인간 세포를 포함하여, 리소좀 효소에 대한 천연 물질을 축적할 수 있다. 예를 들어, 활성의 전체(100%) 또는 부분적 결핍, 예를 들어 활성의30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 감소 또는 그 이상을 천연적으로 나타내는 세포가 사용될 수 있다. 감소된 활성을 갖는 돌연변이체 효소를 발현시키는 세포, 또는 리소좀 저장 질병, 예를 들어 점액다당류증에 걸린 환자로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어 암호화 유전자 또는 그것의 프로모터 또는 다른 조절 영역에 돌연변이를 도입하는 것을 통해 리소좀 효소 활성을 녹아웃 또는 감소시키도록 재조합적으로 변경된 세포가 사용될 수 있다. 리소좀 효소 활성을 감소시키도록 처리된, 예를 들어 효소 발현을 감소시키기 위해 안티센스 또는 RNAi로 처리된 세포가 사용될 수 있다.

탄수화물로부터 작은 올리고당을 절단(분해)하고 리소좀 효소의 천연 기질에 "특이적"(즉, 대부분 분해)인 적합한 효소는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, GALNS 또는 GLB 1(케라탄 설페이트를 분해하는 효소)의 활성 검출을 위하여, 단계 (d)의 효소는 케라타나제 II 또는 케라탄 설페이트 상에서 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 예로서, IDU, ARSB, IDS 또는 GUSB(더마탄 설페이트를 분해하는 효소)의 검출을 위하여, 단계 (d)의 효소는 콘드로이티나제 ABC 또는 주로 더마탄 설페이트 상에서 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 예로서, IDU, IDS, SGHS, G6S 또는 GUSB(헤파린 설페이트를 분해하는 효소)의 검출을 위하여, 단계 (d)의 효소는 헤파리나제 I 또는 헤파리나제 II, 또는 둘 다 일 수 있다. 또 다른 예로서, GAA(글라이코겐을 분해하는 효소)의 검출을 위하여, 단계 (d)의 효소는 α-아밀라제 또는 글라이코겐 상에서 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다.

이 세포-기반 방법은 리소좀 효소 활성을 검출하는 것에 대단한 민감도가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소 활성은 리소좀 효소 농도가 약 10nM, 또는 약 5nM, 또는 약 1nM, 또는 약 0.75nM, 또는 약 0.5nM, 또는 약 0.25nM, 또는 약 0.1nM, 또는 약 0.05nM, 또는 약 0.01nM, 또는 약 0.005nM, 또는 약 1 pM, 또는 약 0.5 pM만큼 낮을 때 검출가능하다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시형태로 주어지는 상세한 설명 및 구체적 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 전신과 범주 내의 다양한 변화 및 변형은 이 상세한 설명에서 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.

도 1은 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)(서열번호 1)의 뉴클레오타이드 서열을 기재한 도면;
도 2는 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)(서열번호 2)의 아미노산 서열을 기재한 도면;
도 3은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)(서열번호 3)의 뉴클레오타이드 서열을 기재한 도면;
도 4는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)(서열번호 4)의 아미노산 서열을 기재한 도면. N-말단에서 26개 아미노산의 신호 펩타이드는 처리된 GALNS에 없다;
도 5는 처리된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)(서열번호 5)의 구조 및 특징을 도시한 도면;
도 6은 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 및 인간 GALNS 발현 벡터와 함께 공동-트랜스펙션된 G71S 세포로부터 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 발현을 도시한 도면. (a) 96-웰(well)에서 활성 GALNS를 위한 G71S 클론 스크린. (b) 피코그램/세포/일로 G71S 클론 GALNS 생산성;
도 7은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 및 이것의 변이체를 발현시키는 G71S 세포의 대규모 생성을 위해 사용된 WAVE 바이오리액터 컨트롤러의 구성도를 도시한 도면;
도 8은 4℃(다이아몬드)에서 또는 -70℃(삼각형)에서 저장 시 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소 활성의 안정성을 도시한 도면;
도 9는 (a) 블루 세파로스 6 속성 유동 크로마토그래피 다음에 (b) 프락토겔 SE Hi-CAP 크로마토그래피의 정제를 도시한 도면. 정제는 SDS-PAGE의 쿠마씨 블루 염색에 의한(왼쪽) 및 항-GALNS(IVA) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의한(오른쪽) 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 정제를 나타낸다. 정제는 SDS-PAGE의 쿠마씨 블루 염색에 의해(왼편) 및 항-GALNS(IVA) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해(오른편) 결정된다;
도 10은 초미세여과/정용여과(UF/DF), 프락토겔 SE Hi-Cap 크로마토그래피, Zn-킬레이팅세파로스 크로마토그래피 및 ToyoPearl 뷰틸 650M 크로마토그래피에 의한 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 정제를 도시한 도면. 정제는 SDS-PAGE의 쿠마씨 블루 염색에 의해(상부 왼편) 및 항-GALNS 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해(상부 오른편), 항-카텝신 L 항체(하단 왼편) 및 항-CHOP(중국 햄스터 난소 세포 단백질)(하단 오른편)에 의해 결정된다;
도 11은 I/II 상 처리(왼편) 및 III상 처리(오른편)에 대해 사용된 인간 N-아세틸갈락토사민- 6-설파타제(GALNS) 회수 및 정제 처리를 위한 공정흐름도를 도시한 도면;
도 12는 I/II 상 처리(레인 3) 또는 III 상 처리(레인 5)에 따라 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 비교를 도시한 도면. 5 마이크로그램(5㎍)의 정제된 GALNS를 환원 조간 하에 SDS-PAGE에 의해 분리시켰고, 겔을 쿠마씨 블루로 염색하였다. 레인 1은 15㎕의 SeeBlue Plus2Marker에 대응한다.kDa의 분자량은 염색된 겔의 왼편에 표시된다;
도 13은 IDU-처리 GM01391 세포 내 관찰된 더마탄 설페이트 기질 양의 용량 의존적 감소를 도시한 도면;
도 14는 ARSB-처리 GM00519 세포에서 관찰된 더마탄 설페이트 기질 양의 용량 의존적 감소를 도시한 도면;
도 15는 배양된 활막세포에 의한 미표지된(원) 또는 A488(사각형) 또는 A555(삼각형)로 컨쥬게이트 된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 흡수를 도시한 도면;
도 16은 pH 5.0, pH 5.4 또는 pH 5.8(각각 A, B 또는 C로 지정된 패널)에서 15mM 아르기닌 HCl, 30mM 아르기닌 HCl, 15mM NaCl 또는 30mM NaCl(각각 51, 52, 54 또는 55로 지정된 패널)를 포함하는 조제물 중에서 표시되는 바와 같이 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 1 또는 2개월 동안 저장 시 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소의 안정성을 도시한 도면. 안정성은 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 결정되는 바와 같이 저장 후 조제물 내 GALNS 응집물의 피크 영역 백분율(%)로 측정된다;
도 17은 pH 5.0, pH 5.4 또는 pH 5.8(각각 A, B 또는 C로 지정된 패널)에서 15mM 아르기닌 HCl, 30mM 아르기닌 HCl, 15mM NaCl 또는 30mM NaCl(각각 51, 52, 54 또는 55로 지정된 패널)을 포함하는 조제물 중에서 표시되는 바와 같이 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 2개월 동안 저장 시 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소 안정성을 도시한 도면;
도 18은 표시되는 바와 같이 pH 5.0, pH 5.4 또는 pH 5.8에서 15mM 아르기닌 HCl, 30mM 아르기닌 HCl, 15mM NaCl 또는 30mM NaCl을 포함하는 조제물 중에서 표시되는 바와 같이 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 2개월 동안 저장 시 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소의 글라이코실 프로파일을 도시힌 도면. 비스-인산화된 만노스 7(BPM7) 백분율을 아스파라긴 N-결합 올리고당을 절단하기 위한 PNGase F로 GALNS 효소의 분해 후 모세관 전기영동(CE)에 의해 측정하였다. 기준은 100mM 인산염 완충제를 포함하는 조제물 중에서 표시되는 바와 같이 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 2개월 동안 저장한 GALNS의 기준 로트에 대한 BPM7 백분율을 표시한다.
도 19는 pH 5.0, pH 5.4 또는 pH 5.8(각각 A, B 또는 C로 지정된 패널)에서 15mM 아르기닌 HCl, 30mM 아르기닌 HCl, 15mM NaCl 또는 30mM NaCl(각각 51, 52, 54 또는 55로 지정된 패널)을 포함하는 조제물 중에서 표시되는 바와 같이 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 2개월 동안 저장 시 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소의 안정성을 도시한 도면. GALNS 효소의 안정성을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 결정하는 바와 같은 저장 후 조제물 중에서 GALNS 효소의 피크 면적 백분율(%)로 측정하였다.

본 발명은 표적 리소좀에서 효율적이고, 따라서 치료적으로 유효한, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소 생성물의 필요와 재조합 리소좀 설파타제 효소의 대규모 제조에 대한 필요를 조화시키는 방법의 발견에 관한 것이다.

리소좀 효소 제제의 치료적 유효성은 해당 제제 내 만노스-6-포스페이트 수준에 의존한다. 포스페이트는 소포체 및 초기 골지(Golgi)에서 번역 후 변형에 의해 표적 글라이코단백질에 첨가된다. 폴딩된 리소좀 효소는 올리고당 변형 효소에 의해 인식된 독특한 3차 결정소를 나타낸다. 결정소는 특이적으로 스페이싱된 리신의 세트로 구성되며, 1차 서열 상동성의 부재에도 불구하고 대부분의 리소좀 효소에서 발견된다. 변형 효소인 UDP-GlcNAc 포스포트랜스퍼라제는 단백질 결정소에 결합되며, 결합 부위 근처의 올리고당 상의 말단 만노스 잔기의 6-위치에 GlcNAc-1 -포스페이트를 첨가하고; 그 다음에 제2 효소인 포스포다이에스터 α-GlcNAcase는 GlcNAc-포스페이트 결합을 절단하여 만노스-6-포스페이트 말단의 올리고당을 제공한다(Canfield et al., 미국특허 제6,537,785호). 만노스-6-포스페이트 변형의 목적은 세포 내 분비 경로로부터 리소좀 경로로 리소좀 효소를 우회시키는 것이다. 만노스-6-포스페이트-함유 효소는 후기 골지 내 MPR에 의해 결합되고 세포 표면 대신 리소좀에 보내진다.

리소좀 효소 올리고당 상의 만노스-6-포스페이트 마커의 존재에 추가로, 효소의 리소좀 경로는 후기 골지 스택의 말단으로부터 나타나는 수송 엔도좀의 산성화에 의존한다. 확산가능한 염기성 분자를 갖는 이들 엔도좀 내 산성 환경의 화학적 퀀칭은 리소좀 효소를 포함하는 세포 밖 환경에 소포 내용물의 배출을 초래한다(Braulke et al., Eur . J. Cell Biol . 43(3): 316-321, 1987). 산성화는 엔도솜 막 내에 포매된 특이적 액포 ATPase를 필요로 한다(Nishi et al., Nat. Rev. Mol . Cell Biol . 3(2): 94-103, 2002). 이런 ATPase의 불이행은 리소좀 경로를 희생하여 리소좀 효소의 분비를 향상시키는 것으로 기대된다. 액포 ATPase에서 결함을 운반하는 세포주를 제조하는 것은 세포내 리소좀 구획으로 인산화된 재조합 효소의 비-생산적 우회를 방지하는 것으로 기대된다.

1984년에, 엔도솜 산성화에 특이적으로 결함이 있는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 돌연변이체가 만들어졌고, 특징지어졌다(Park et al., Somat . Cell Mol . Genet. 17(2): 137-150, 1991). CHO-K1 세포는 화학적으로 돌연변이 유발되었고, 독소의 존재하에 상승된 온도에서 생존을 위해 선택되었다. 이들 독소는 그것의 치사율의 전체 발현을 위해 엔도좀 산성화를 필요로 한다(Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). 이전의 연구에서, 상이한 작용 메커니즘을 갖는 2가지 독소의 칵테일이 독소-특이적 내성의 선택을 피하도록 선택되었다. 원칙은 하나의 특정 독소에 대한 내성을 초래하는 유리한 돌연변이의 가능성은 작지만, 2가지의 완전히 상이한 독소에 대한 2회의 동시의 유리한 돌연변이의 가능성은 존재하지 않는다는 것이다. 선별은 온도-민감 돌연변이를 허용하는 상승된 온도에서 수행되었다. 이 유전적 스크린은 2개의 돌연변이체를 초래하는데, 이중 하나는 상승된 온도에서 독소에 내성이 있는 G.7.1(G71)로 지정되었다. G71의 병변은 2가지 독소의 흡수 또는 작용 메커니즘에 기인하지 않지만, 상승된 온도에서 엔도솜을 산성화하는 클론의 불능으로부터 초래된다. 이 불능은 또한 보다 적다고 할지라도, 허용온도(34℃)에서 분명하다. G71 세포는 또한 배지로부터 트랜스페린의 정상 흡수에도 불구하고 상승 온도에서 철에 대한 영양요구성이 되는 것으로 발견되었다(Timchak et al., J. Biol . Chem. 261(30): 14154-14159, 1986). 철이 낮은 pH에서만 트랜스페린으로부터 방출되기 때문에, 정상 트랜스페린 흡수에도 불구하고 철에 대한 영양요구성은 엔도솜 산성화의 불이행을 나타내었다. 다른 연구는 산성화 결함이 리소좀보다는 엔도솜에서 주로 확대되었다는 것을 증명하였다(Stone et al., J. Biol . Chem . 262(20): 9883-9886, 1987). G71의 데이터는 돌연변이가 엔도솜 산성화를 초래하는 액포 ATPase의 불안정화를 초래한다는 결과와 일치하였다. 불안정화는 상승된 온도(39.5℃)에서 가장 명백하지만, 더 낮은 온도(34℃)에서 조차 부분적으로 발현되었다. G71 세포에서 2개의 내인성 리소좀 효소, 카텝신 D 및 알파-글루코시다제의 수송 연구는(Park et al., Somat . Cell Mol . Genet. 17(2): 137-150, 1991)는 효소가 둘 다 상승된 온도에서 정량적으로 분비되며, 효소의 글라이코실화는 영향받지 않는다는 것을 나타내었다. 인산화된 산 알파-글루코시다제의 분비는 비-허용온도에서 상당히 향상되었다.

리소좀 설파타제 효소 제제의 치료적 유효성은 만노스-6-포스페이트의 수준에 의존할 뿐만 아니라, 해당 제제 내 활성 효소의 존재에 의존한다. 모든 공지된 설파타제는 그것의 촉매 부위에서 시스테인 잔기를 함유하며; 이 시스테인 잔기는 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 번역 후 변형되어 효소를 활성화시킨다. 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)에 의해 촉매되는 FGly로 이 시스테인의 번역 후 효소 활성화는 리소좀에 설파타제의 표적화 전, 번역 후 즉시 미폴딩 설파타제 상의 소포체 내에서 일어난다(Dierks et al., Pwc . Natl . Acad . Sci . USA 94: 11963-11968, 1997). 이 독특한 번역 후 변형의 중요성은 리소좀 설파타제 효소 내 손상된 FGly 형성을 초래하는 SUMF1에서 돌연변이가 사람에서 다중 설파타제 결핍증(MSD)을 야기한다는 사실에 의해 강조된다(Diez-Ruiz et al., Annu . Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005).

따라서, 재조합-인간 설파타제 변형 효소(SUMF1) 및 인간 리소좀 설파타제 효소를 공동발현시키는 엔도솜 산성화에 결함이 있는 돌연변이체 CHO 세포인 G71 세포의 능력은 이러한 리소좀 설파타제 효소의 결핍증에 의해 야기되거나 이와 관련된 리소좀 저장 장애의 관리에 유용한 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소의 대규모 생성을 위한 메커니즘을 제공한다.

I. 정의

달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 다음의 참조문헌은 본 발명에 사용된 다수의 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 문헌[Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].

각 간행물, 특허 출원, 특허 및 본 명세서에 인용된 다른 참고문헌은 본 개시와 일관성이 없지않은 정도로 전문이 참조로 포함된다.

본 명세서에 사용되고 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 것과 같은, 단수 형태의 표현은 달리 명확하게 문맥에서 표시되지 않는다면 복수의 대상을 포함하는 것임에 주목한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 다음의 용어는 달리 특정되지 않는다면 그것들에게 주어진 의미를 가진다.

"대립형질 변이체"란 동일 유전자 좌위를 점유하는 유전자의 2 이상의 다형성 형태 중 어떤 것을 지칭한다. 대립형질 변형은 돌연변이를 통해 자연적으로 일어나며, 집단 내 표현형 다형성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵(즉, 암호화된 폴리펩타이드에서 변화 없음)일 수 있거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. "대립형질 변이체"란 또한 유전적 대립형질 변이체뿐만 아니라 그에 의해 암호화된 단백질의 mRNA 전사체로부터 유래된 cDNA를 지칭한다.

"증폭"이란 폴리뉴클레오타이드 서열이 복제되고 따라서 다수의 폴리뉴클레오타이드 분자 내로 확장되는 것에 의한 임의의 수단, 예를 들어 역전사, 중합효소 연쇄 반응 및 리가제 연쇄 반응을 지칭한다.

서열이 제1 서열인 폴리뉴클레오타이드가 서열이 제2 서열인 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화한다면, 제1 서열은 제2 서열에 대해 "안티센스 서열"이다.

"cDNA"란 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 mRNA와 상보적인 또는 동일한 DNA를 지칭한다.

통상적인 표기법은 폴리뉴클레오타이드 서열을 기재하기 위하여 본 명세서에서 사용된다: 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 왼편 말단은 5'-말단이며; 이중-가닥 폴리뉴틀레오타이드 서열의 왼편 방향은 5'-방향으로 언급된다. 초기 RNA 전사체에 뉴클레오타이드의 5'에서 3'으로 첨가 방향은 전사 방향으로 언급된다. mRNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥은 "암호 가닥"으로 언급되며; 해당 DNA로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 가지며, RNA 전사체의 5' 내지 5'-말단에 위치된 DNA 가닥 상의 서열은 "상류 서열"로 언급되고; RNA와 동일한 서열을 가지며 RNA 전사체를 암호화하는 3' 내지 3' 말단인 DNA 가닥 상의 서열은 "하류 서열"로 언급된다.

"상보적"이란 2개의 폴리뉴클레오타이드의 상호작용하는 표면과 함께 위상 양립성 또는 매칭을 지칭한다. 따라서, 2개의 분자는 상보적으로 기재될 수 있으며, 더 나아가 접촉 표면 특징은 서로 상보적이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 제2 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 결합 상대의 뉴클레오타이드 서열과 동일하다면, 제2 폴리뉴클레오타이드와 상보적이다. 따라서, 서열 5'-TATAC-3'의 폴리뉴클레오타이드는 서열이 5'-GTATA-3'인 폴리뉴클레오타이드에 상보적이다. 뉴클레오타이드 서열은 대상 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일하다면 기준 뉴클레오타이드 서열에 "실질적으로 상보적"이다.

"보존적 치환"이란 기능적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 폴리펩타이드의 치환을 지칭한다. 다음의 6개의 기는 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

용어 "단편"은 폴리펩타이드에 대해 사용될 때, 단백질의 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 다에서 절단 때문에, 및/또는 해당 단백질의 내부 부분 또는 영역의 결실에 의해 전장 폴리펩타이드보다 더 짧은 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드의 단편은 당업계에 공지된 방법에 의해 만들어질 수 있다.

용어 "돌연변이체"는 폴리펩타이드에 대해 사용될 때, 해당 단백질의 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 지칭한다. 아미노산 치환은 상기 정의된 바와 같은 보존적 치환일 수 있거나, 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 돌연변이체 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해 만들어질 수 있다.

용어 "유도체"는 폴리펩타이드에 대해 사용될 때, 예를 들어 제한되는 것은 아니지만, 유비퀴틴화, 표지(예를 들어 방사선핵종 또는 다양한 효소), 공유적 폴리머 부착, 예컨대 페길화, 즉, 폴리에틸렌 글라이콜에 의한 유도체화) 및 인간 단백질에서 보통 생기지 않는 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 및 치환과 같은 기법에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 지칭한다. 유도체 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해 만들어질 수 있다.

용어 "유도체"는 세포주에 대해 사용될 때, 모 세포주의 후손인 세포주를 지칭하며; 예를 들어 이 용어는 모 세포로부터 통과되거나 서브클로닝된 세포를 포함하고, 원하는 특성의 보유를 위해 돌연변이되고 선택된 원하튼 특성의 모 세포주의 후손 및 상이한 발현 벡터 또는 상이한 외인성으로 첨가된 핵산을 함유하도록 변경된 모 세포주의 후손을 보유한다.

"검출하는"이란 샘플 내 분석물의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 것을 지칭하며, 이는 샘플 내 또는 샘플 내 세포마다의 분석물의 양을 정량화하는 것을 포함할 수 있다.

"검출가능한 모이어티" 또는 "표지"란 스펙트럼분석, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 지칭한다. 예를 들어 유용한 표지는 ³²P, ³⁵P, 형광 염료, 고전자 밀도 시약, 효소(예를 들어, 보통 ELISA에서 사용되는 것과 같음), 바이오틴-스트렙타비딘, 다이옥시게닌, 햅텐 및 항혈청 및 단클론성 항체에 대해 이용가능한 단백질, 표적에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 검출가능한 모이어티는 종종 측정가능한 신호, 예컨대 방사성, 색소생산성 또는 형광 신호를 만들어내는데, 이는 샘플 내 검출가능한 모이어티에 결합된 양을 정량화하기 위하여 사용될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 공유적으로 또는 이온 결합, 반데르발스 결합 또는 수소 결합, 예를 들어 방사성 뉴클레오타이드 또는 스트렙타비딘에 의해 인식된 비오틴화된 뉴클레오타이드의 포함을 통해 프라이머 또는 프로브에 포함되거나 또는 부착될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능할 수 있다. 간접적 검출은 검출가능한 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 제2의 검출가능한 모이어티의 결합을 수반할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 결합 상대, 예컨대 스트렙타비딘에 대한 결합 상대인 비오틴, 또는 특이적으로 혼성화될 수 있는 상보적 서열에 대한 결합 상대인 뉴클레오타이드 서열의 리간드일 수 있다. 결합 상대는 그 자체를 직접 검출가능할 수 있으며, 항체는 그 자체를 형광 분자로 표지할 수 있다. 결합 상대는 또한 간접적으로 검출가능할 수 있으며, 예를 들어 상보적 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 결국 다른 표지된 핵산 분자와 혼성화를 통해 검출가능한 분지된 DNA 분자의 부분일 수 있다. (예를 들어 문헌[Fahrlander et al., Bio/Technology 6: 1165, 1988] 참조). 신호의 정량화는, 예를 들어 섬광계수, 덴시토미트리, 또는 유세포분석기에 의해 달성된다.

"진단적"이란 병리적 상태의 존재 또는 특성을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그것의 특이성 및 선택성에서 다르다. 특정 진단 방법이 질환의 최종적인 진단을 제공하지 않을 수 있지만, 이는 해당 방법이 진단에 도움을 주는 긍정적 징후를 제공한다면, 충분하다.

용어 "유효량"은 건강 상태, 병적 측면, 및 피험체의 질병 또는 진단 목적 상에서 원하는 결과를 생성하는데 충분한 투약량을 의미한다. 원하는 결과는 투약량의 수용인에서 주관적 또는 객관적인 개선을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 건강 상에서 의도된 유리한 효과를 생성하는데 효과적인 작용제(agent)의 양을 지칭한다.

"암호화하는"이란 정해진 서열의 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정해진 서열의 아미노산 중 하나 및 그것으로부터 초래되는 생물학적 특성을 가지는 생물학적 처리에서 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 특이적 서열, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 내재하는 특성을 지칭한다. 따라서, mRNA의 전사 및 번역이 유전자가 세포 또는 다른 생물학적 시스템 내 단백질을 생성하는 것에 의해 생성된다면 유전자는 단백질을 암호화한다. 암호화 가닥, 즉, mRNA 서열과 동일하고, 보통 서열 목록에 제공되는 뉴클레오타이드 서열, 및 전사를 위한 주형으로서 사용되는 유전자 또는 cDNA의 비-암호화 가닥은 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다. 달리 특정되지 않는다면, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 형태를 축퇴시키고 동일 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"등가량"이란 동일한 양의 활성제를 함유하는 용량을 지칭한다.

"발현 제어 서열"이란 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는(전사 및/또는 번역) 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "작동가능하게 연결된"이란 한 부분의 활성(전사를 조절하는 능력)이 다른 부분에서 작동(예를 들어, 서열의 전사)을 초래하는 두 부분 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 발현 제어 서열은, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 프로모터의 서열(예를 들어 유도성 또는 구성적), 인핸서, 전사 종결자, 시작 코돈, 즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다.

"발현 벡터"란 뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 구성요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 구성요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 모든 것, 예컨대 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드 또는 리포좀 내 함유됨) 및 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스를 포함한다.

"고도로 인산화된", "고수준의 인산화" 및 "고수준의 인산화된 올리고당"이란 적어도 50%의 리소좀 설파타제 효소가 인산화된 올리고당을 통해 양이온-독립적 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합하는 리소좀 설파타제 효소의 제조를 지칭한다. 결합은 추가로 만노스-6-포스페이트와 경쟁에 대한 민감도를 특징으로 한다. 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소는 또한 단백질 사슬 당 적어도 0.25, 바람직하게는 적어도 0.5, 및 더 바람직하게는 적어도 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 갖는 리소좀 설파타제 효소를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소(GALNS)는 섬유아세포에서 특이적 흡수, 즉 K흡수(최대 흡수 값의 절반을 수득하는 효소/리간드의 농도)가 약 0.1 내지 10nM, 또는 약 0.1 내지 7nM, 또는 약 0.5 내지 5nM, 또는 약 1 내지 5nM, 또는 약 1 내지 3.5nM, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM 또는 약 3.5nM, 또는 이들 숫자 중 어떤 것의 임의의 조합인 효소를 지칭할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "비스-인산화된 올리고만노스 사슬"은 리소좀 설파타제 효소 내 아스파라긴 잔기에 N-연결된 만노스-함유 올리고당 사슬을 지칭하며, 2개의 만노스-6-포스페이트 잔기를 포함한다. 전형적으로, 비스-인산화된 올리고만노스 사슬은 7개의 만노스 잔기, 즉, 2개의 GlcNAc 잔기에 연결되고, 결국 리소좀 설파타제 효소 내 아스파라긴 잔기에 연결되는 비스-포스페이트 만노스 7(BPM7)을 가진다.

"활성", "활성화된" 및 "고수준의 활성화"는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 단백질 활성 부위 시스테인 잔기가 번역 후 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 변형된 리소좀 설파타제 효소의 제조를 지칭한다. 대안적으로, "활성", "활성화된" 및 "고수준의 활성화"는 재조합 인간 SUMF1를 발현시키지 않는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 CHO-유래 세포)에서 생성된 동일 아미노산 서열의 대조군 리소좀 설파타제 효소의 특이적 활성보다 적어도 약 30%(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2-배, 2.5-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 30-배, 40-배 또는 50-배) 초과의 특이적 활성을 나타내는 리소좀 설파타제 효소의 제조를 지칭한다. 리소좀 설파타제 효소의 적합한 대조군 제제는 바람직하게는 고도로 활성인 제제와 동일한 아미노산 서열을 가지며, 숙주 세포가 재조합 인간 SUMF1을 발현시키지 않는 것을 제외하고 동일 숙주 세포 내 동일 프로모터 또는 조절 서열(들)을 사용하여 동일 유전자에 의해 발현되고, 동일한 배양 시간 기간 동안 포함하는 동일 또는 유사한 배양 조건 하에 생성되며, 선택적으로 고도로 활성인 제제와 동일 또는 유사한 정도로 정제된다.

"활성의 고도로 인산화된"은 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%의 단백질의 활성 부위 시스테인 잔기가 번역 후 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 변형되고, 단백질 사슬 당 적어도 0.25, 바람직하게는 적어도 0.5, 및 더 바람직하게는 적어도 0.75 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지는 리소좀 설파타제 효소의 제조를 지칭한다.

용어 "생물학적으로 활성인"이란 전장 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성의 적어도 실질적인 양(예를 들어 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 및 더 바람직하게는 적어도 약 90%)을 보유하는 이것의 폴리펩타이드(즉, 효소) 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 리소좀 설파타제 효소에 대해 사용될 때, 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체는 적어도 실질적인 양의 설파타제 활성(즉, 그것의 표적 기질로부터 설페이트 에스터의 절단)을 보유한다. 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)에 대해 사용될 때, 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체는 적어도 실질적인 양의 포밀글라이신-생성 활성, 즉 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 리소좀 설파타제 효소의 활성 부위 시스테인 잔기의 변형을 보유한다.

폴리펩타이드에 대해 사용될 때 용어 "순도" 또는 "순수한"이란 특정 방법을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 오염 물질과 비교하여 분석되는 폴리펩타이드의 양을 지칭한다. 본 발명의 재조합 리소좀 설파타제 효소에 대해, "순도"는 설파타제 효소 제제에 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 전기영동적 분리를 실시한 다음, 쿠마씨 블로 또는 은으로 염색하거나, 또는 HPLC에 의한 크로마토그래피 분리에 의해(예를 들어, C4 역상(RP), C3 RP) 또는 임의의 다른 크로마토그래피 분리, 예를 들어 크기 배제(SEC) 등에 의해 결정될 수 있다. 이들 방법 중 어떤 하나를 사용하여, 본 발명의 정제된 재조합 리소좀 설파타제 효소는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 97%, 98% 또는 99%의 순도를 가진다.

용어 "전구체" 또는 "전구체 형태"는 포유류 세포로부터 분비된, 즉 신호 서열이 없지만, 특정 변형, 예를 들어 리소좀 내에서 보통 일어나는 단백질의 내부 절단이 없는 재조합 리소좀 설파타제 효소의 형태를 언급한다. 용어 "성숙", "성숙 형태", "처리된" 또는 "처리된 형태"는 리소좀 내 보통 존재하는 재조합 리소좀 설파타제 효소의 형태를 지칭한다. 본 발명의 재조합 리소좀 설파타제 효소에 대해, 상대적으로 풍부한 "전구체" 또는 "전구체 형태" 및 "성숙", "성숙 형태", "처리된" 또는 "처리된 형태"는 설파타제 효소 제제에 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 전기영동 분리를 실시한 다음 쿠마씨 블루 또는 은으로 염색하거나, 또는 HPLC(예를 들어, C4 역상(RP), C3 RP)에 의한 크로마토그래피 분리에 의해 또는 임의의 다른 크로마토그래피 분리, 예를 들어 크기 배제(SEC) 등에 의해, 또는 전기영동 분리 및 크로마토그래피 분리의 조합, 예를 들어 SDS-PAGE 다음에 모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 결정될 수 있다. 이들 방법을 사용하여, 본 발명의 정제된 재조합 리소좀 설파타제 효소는 적어도 약 65%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5% "전구체" 또는 "전구체 형태"로 이루어진다. 대안적으로, 이들 방법을 사용하여, 본 발명의 정제된 재조합 리소좀 설파타제 효소는 약 35%, 30% 또는 25% 미만, 바람직하게는 약 20% 또는 15% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 5%, 3%, 2%, 1.5%, 1% 또는 0.5% 미만의 "성숙", "성숙 형태", "처리된" 또는 "처리된 형태"로 이루어진다. 일부 실시형태에서, "전구체" 또는 "전구체 형태" 만이 검출된다(즉, 설파타제 효소 제제는 본질적으로 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때, 또는 SDS-CGE에 의해 결정되는 바와 같이 단일의 검출가능한 밴드로 또는 HPLC에 의해 분석될 때 단일 피크로 이루어진다).

둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 내용에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" %는 최대 대응을 위해 비교하고 배열할 때, 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 구체화된 백분율을 가지거나 또는 동일한 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.

"링커"는 공유적으로, 또는 이온 결합, 반데르발스 결합 또는 수소 결합을 통해 2개의 다른 분자를 결합시키는 분자, 예를 들어 5' 말단에서 하나의 상보적 서열에 및 3' 말단에서 다른 상보적 서열에 혼성화하고, 따라서 2개의 비-상동적 서열을 결합시키는 핵산 서열을 지칭한다.

"저 수준의 인산화" 또는 "낮은 인산화"는 섬유아세포 내로 흡수가 10nM 초과의 절반의 최대 농도를 가지거나 또는 만노스-6-포스페이트 수용체 칼럼에 결합하는 리소좀 설파타제 효소의 분획이 약 25% 미만인 리소좀 설파타제 효소의 제조를 지칭한다.

대상에 적용되는 "자연적으로-발생하는"이란 대상이 천연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 천연의 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않는 유기체(바이러스를 포함) 내 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연적으로-발생하는 것이다.

"약제학적 조성물"은 인간 및 포유류를 포함하는 피험체 동물에서 약제학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 치료적 리소좀 설파타제 효소의 약리학적 유효량을 포함하며, 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물은 활성 성분(들), 및 담체, 희석제 또는 부형제를 구성하는 비활성 성분(들)뿐만 아니라 성분 중 어떤 2가지 이상의 조합, 복합화 또는 응집으로부터, 또는 하나 이상의 성분의 해리로부터, 또는 하나 이상의 성분의 반응 또는 상호작용의 다른 유형으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 초래되는 임의의 생성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 리소좀 설파타제 효소를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합함으로써 만들어지는 임의의 조성물을 포함한다.

"약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 인산염 완충 식염수 용액, 덱스트로스의 5% 수용액과 같은 표준 약제학적 담체, 희석제, 완충제 및 부형제 중 어떤 것, 및 에멀젼, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 보조제를 지칭한다. 적합한 약제학적 담체, 희석제 또는 부형제 및 조제물은 문헌[Remington' s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기재된다. 바람직한 약제학적 담체, 희석제 또는 부형제는 활성제의 의도된 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여방식은, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 장용(예를 들어 경구) 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내) 주사; 또는 국소, 경피 또는 경점막 투여를 포함한다.

"약제학적으로 허용가능한 염"은, 예를 들어 금속 염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약제학적 용도를 위한리소좀 설파타제 효소로 조제될 수 있는 염이다.

"폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위로 구성된 폴리머를 지칭한다.

폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA")뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비-자연적으로 발생하는 염기, 자연적으로 발생하는 포스포다이에스터 결합 이외의 다른 뉴클레오타이드와 결합으로 맞물리는 뉴클레오타이드를 포함하며, 또는 포스포다이에스터 결합 이외의 결합을 통해 부착된 염기를 포함하는 것을 포함한다. 따라서, 뉴클레오타이드 유사체는, 예를 들어 제한없이, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로트라이에스터, 포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(펩타이드-nucleic acid, PNA) 등을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 자동화된 DNA 신시사이저를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "핵산"은 전형적으로 거대 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드, 일반적으로 약 50개 이하의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열에 의해 표시될 때(즉, A, T, G, C) 이는 또한 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함하며, 이때 "U"는 "T"로 대체된다는 것이 이해될 것이다.

"폴리펩타이드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 펩타이드 결합을 통해 연결된 이것의 합성 비-자연적으로 발생하는 유사체, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 이것의 합성 비-자연적으로 발생하는 유사체로 구성되는 폴리머를 지칭한다. 합성 폴리펩타이드는 예를 들어 자동화된 폴리펩타이드 신시사이저를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "단백질"은 전형적으로 거대 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "펩타이드"는 전형적으로 짧은 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드 서열을 나타내기 위하여 본 명세서에서 통상적인 명명법이 사용된다: 폴리펩타이드 서열의 왼편 말단은 아미노-말단이며; 폴리펩타이드 서열의 오른편 말단은 카복실-말단이다.

"프라이머"는 지정된 폴리뉴클레오타이드 주형에 특이적으로 혼성화될 수 있고, 상보적 폴리뉴클레오타이드의 합성을 위한 개시 지점을 제공하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 합성은 폴리뉴클레오타이드 프라이머가 합성이 유도되는 조건 하에, 즉 뉴클레오타이드, 상보적 폴리뉴클레오타이드 주형, 및 DNA 폴리머라제와 같은 폴리머화를 위한 작용제의 존재하에 위치될 때 일어난다. 프라이머는 전형적으로 단일-가닥일지만, 이중-가닥일 수 있다. 프라이머는 전형적으로 데옥시리보핵산이지만, 매우 다양한 합성 및 자연적으로 발생하는 프라이머가 다양한 용도를 위해 유용하다. 프라이머는 그것이 혼성화하도록 지정되는 주형에 상보적이어서 합성 개시를 위한 부위로서 작용하지만, 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우에, 주형에 프라이머의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격함에 의존한다. 프라이머는, 예를 들어 색소생산성, 방사성 또는 형광 모이어티로 표지될 수 있고, 검출가능한 모이어티로서 사용될 수 있다.

"프로브"는 폴리뉴클레오타이드에 대해 사용될 때, 다른 폴리뉴클레오타이드의 지정 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 프로브는 표적 상보적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화하지만, 주형의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우에, 표적에 대한 프로브의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격함에 의존한다. 프로브는, 예를 들어 색소생산성, 방사성 또는 형광 모이어티로 표지될 수 있으며, 검출가능한 모이어티로 사용될 수 있다.

"예방적" 처치는 병적측면이 발생할 위험을 감소시킬 목적을 위하여 질병의 징후를 나타내지 않거나 단지 조기 징후를 나타내는 피험체에게 투여되는 처치이다. 본 발명의 화합물은 병적 측면이 발생할 가능성을 감소시키거나 또는 병적측면이 발생하였다면 중증도를 최소화하기 위한 예방적 처치로 주어질 수 있다.

"재조합 폴리뉴클레오타이드"는 함께 자연적으로 결합되지 않는 서열을 가진는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 증폭된 또는 조립된 재조합 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터 내에 포함될 수 있고, 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환 시키기 위하여 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포는 "재조하 숙주 세포"로 언급된다. 그 다음에 유전자는, 예를 들어 "재조합 폴리펩타이드"를 생성하기 위하여 재조합 숙주 세포 내에서 발현된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드는 비-암호화 기능(예를 들어, 프로모터, 복제원점, 리보솜-결합 부위 등)도 제공할 수 있다.

"특이적으로 혼성화하는", "특이적 혼성화" 또는 "선택적으로 혼성화하는"은 서열이 복합체 혼합물(예를 들어 전체 세포) DNA 또는 RNA에 존재할 때 엄격 조건 하에 특정 뉴클레오타이드 서열에 우선적으로 핵산 분자가 결합하고, 듀플렉스화하며, 혼성화하는 것을 지칭한다.

용어 "엄격한 조건"은 프로브가 그것의 표적 하위서열에 우선적으로 혼성화하고, 다른 서열에 대해 보다 적게 혼성화하거나, 또는 다른 서열과 전혀 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 서던 및 노던 혼성화와 같은 핵산 혼성화 실험에 대해서 "엄격한 혼성화" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경적 변수 하에서 상이하다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York]에서 발견된다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열적 융점(T_m)보다 낮은 약 5℃가 되도록 선택된다. T_m은 50%의 표적 서열이 완벽하게 매치된 프로브에 혼성화도는 온도이다(정해진 이온 강도 및 pH 하에서). 매우 엄격한 조건이 특정 프로브에 대한 T_m과 동일하게 되도록 선택된다.

서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 이상의 상보적 잔기를 가지는 상보적 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1㎎의 헤파린과 함께 50% 포르말린이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 매우 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.15M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2X SSC 세척이다(SSC 완충제의 기재에 대해 문헌[Sambrook et al] 참조). 종종, 매우 엄격한 세척은 배경 프로브 신호를 제거하기 위하여 낮은 엄격 세척에 의해 진행된다. 예를 들어 100개 이상의 뉴클레오타이드의 듀플렉스에 대한 중간 엄격 세척의 예는 45℃에서 15분 동안 1x SSC이다. 예를 들어 100개 이상의 뉴클레오타이드의 듀플렉스에 대한 낮은 엄격 세척의 예는 40℃에서 15분 동안 4-6x SSC이다. 일반적으로, 특정 혼성화 분석에서 미관련 프로브에 대해 관찰한 것보다 2x (또는 더 높은) 신호 대 노이즈 비는 구체적 혼성화의 검출을 표시한다.

진단 또는 치료의 "피험체"는 인간 또는 포유류 또는 영장류를 포함하는 비-인간 동물이다.

2개의 핵산 또는 폴리펩타이드의 내용에서 어구 "실질적으로 상동성" 또는 "실질적으로 동일한"은 다음의 서열 비교 알고리즘 또는 시각적 검사 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 비교되고 배열될 때, 일반적으로 적어도 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가지는 2 이상의 서열 또는 서열들을 지칭한다. 바람직하게는, 실질적 동일성은 길이로 적어도 약 50 잔기인 서열 영역에 걸쳐, 더 바람직하게는 적어도 약 100개의 잔기 영역에 걸쳐 존재하며, 가장 바람직하게는 서열은 적어도 약 150개의 잔기에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 가장 바람직한 실시형태에서, 서열은 비교 바이오폴리머 중 하나 또는 둘 다의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.

서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열에 대해 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되며, 하위서열 좌표가 지정되고, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 변수가 지정된다. 그 다음에 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 변수를 기반으로 기준 서열에 대해 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.

예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988]의 유사성 방법을 위한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 수행에 의해(위스콘신주 메디슨 575 사이언스 드라이브에 소재한 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 시각적 조사에 의해 비교를 위한 최적의 서열 정렬이 수행될 수 있다.

유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP는 점진적, 쌍 정렬을 사용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다양한 서열 정렬을 만들어서 서열 동일성의 관계 및 백분율을 나타낸다. 이는 또한 정렬을 만들기 위해 사용된 클러스터링 관계를 나타내는 트리(tree) 또는 덴도그램(dendogram)을 플롯팅한다. PILEUP는 문헌[Feng & Doolittle, J. Mol . Evol . 35:351-360, 1987]의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용한다. 사용되는 방법은 문헌[Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153, 1989]에 의해 기재된 방법과 유사하다. 프로그램은 각각 5,000개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 최대 길이로 300개까지의 서열을 정렬할 수 있다. 다양한 정렬 처리는 2개의 가장 유사한 서열의 쌍 정렬에 의해 시작되며 2개의 정렬된 서열의 클러스터를 생성한다. 그 다음에 이 클러스터는 다음의 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 클로스터로 정렬된다. 서열의 2개의 클러스터는 2개의 개개 서열의 쌍 정렬의 단순 확장에 의해 정렬된다. 일련의 점진적 쌍 정렬에 의해 최종 정렬이 달성된다. 이 프로그램은 특정 서열 및 그것의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 좌표를 서열 비교 영역에 지정하고, 프로그램 변수를 지정함으로써 실행된다. 예를 들어, 하기의 변수를 사용하여 기준 서열을 다른 시험 서열과 비교하여 서열 동일성 관계 백분율을 결정할 수 있다: 디폴트 갭 가중치(3.00), 디폴트 갭 길이 가중치(0.10), 및 가중치를 준 끝부분 갭. 서열들의 다중 정렬을 생성시키는데 유용한 다른 알고리즘은 Clustal W이다(Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994).

서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적절한 알고리즘의 다른 예는 BLAST 알고리즘이며, 이는 문헌[Altschul, et al., J. Mol . Biol. 215:403-410, 1990]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공공연하게 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드(word)와 함께 정렬되는 경우 일부 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍(high scoring sequence pair, HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-410, 1990). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 그 후, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한도까지 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 워드 히트가 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M(매칭되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 0 초과) 및 N(미스매칭된 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 점수를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성치로부터 X의 양만큼 하락한 경우, 하나 이상의 음성으로 스코어링된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 된 경우, 또는 어느 한쪽 서열의 끝부분에 도달한 경우, 각각의 방향으로의 워드 히트의 확장이 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드길이(W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열용으로, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89:10915, 1989] 참조).

서열 동일성 백분율을 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 또한 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 측정치는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 가능성을 가리키는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면 핵산이 기준 서열과 유사한 것으로 고려된다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다는 것의 추가적인 표시는, 이하에 기재되는 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 제2 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어, 2개의 펩타이드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 것의 다른 표시는 2개의 분자가 본원에 기술된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서로 혼성화 한다는 것이다.

"실질적으로 순수한" 또는 "분리된"이란 대상 종이 우세하게 존재하는 종이라는 것을 의미하고(즉, 몰 농도 기준으로, 조성물 내의 어떤 다른 개개의 거대분자 종보다 풍부함), 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상(몰농도 기준)을 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 거대분자 종의 약 80% 내지 90% 또는 그 이상이 관심의 정제된 종이라는 것을 의미한다. 조성물이 단일 거대분자 종으로 본질적으로 구성된다면, 대상 종이 본질적인 균질성으로 정제된 것이다(통상적인 검출 방법에 의해 조성물 내에서 오염 종이 검출될 수 없다). 용매 종, 소형 분자(500 달톤 미만), 안정제(예를 들어, BSA), 및 원소성 이온 종은 이러한 정의의 목적을 위해 거대분자 종으로 고려되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 실질적으로 순수하거나 또는 분리된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 이들의 합성에서 사용된 거대분자 출발 물질과 관련하여 실질적으로 순수하거나 또는 분리된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합된 실질적으로 정제되거나 또는 분리된 치료적 리소좀 설파타제 효소를 포함한다.

"치료적" 처치는 징후 또는 증상을 감소시키거나 또는 제거하기 위한 목적을 위하여 병적 측면의 징후 또는 증상을 나타내는 피험체에 투여되는 치료이다. 해당 징후 또는 증상은 생화학적, 세포적, 병리학적, 조직학적, 기능적, 주관적 또는 객관적일 수 있다. 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 치료적 처치로서 또는 진단을 위하여 제공될 수 있다.

"치료지수"는 최소 치료량 초과 및 허용불가능한 독성의 양 미만인 용량 범위(양 및/또는 시간)를 지칭한다.

"처치"는 예방적 처치 또는 치료적 처치 또는 진단적 처치를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "단위 제형"은 인간 및 동물 피험체에 대한 일원화된 투약량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 본 발명의 리소좀 설파타제 효소의 사전 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 신규 단위 제형에 대한 세부사항은 사용된 특정 리소좀 설파타제 효소 및 달성되는 효과 및 숙주 내 각 리소좀 설파타제 효소와 관련된 약동학에 의존한다.

II. 리소좀 설파타제 효소의 생성

한 양태에서, 본 발명은 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소를 이러한 효소의 치료적 용도를 가능하게 하는 양으로 생성하는 신규한 방법을 특징으로 한다. 일반적으로, 해당 방법은 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체에 대해 암호화하는 cDNA 및 전장 리소좀 설파타제 효소 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 cDNA를 갖는 적합한 세포주의 형질전환을 특징으로 한다. 당업자는 이러한 리소좀 설파타제 효소의 최적의 생성을 위하여 이것과 함께 적합한 트랜스펙션된 세포주 내에서 본 명세서에 표현적으로 기재된 것 이외의 발현 구성체를 제조할 수 있다. 게다가, 당업자는 자연적으로 발생하는 전장 효소와 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 소유하는 자연적으로 발생하는 SUMF1 또는 리소좀 설파타제 효소의 생물학적으로 활성인 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 암호화하는 cDNA의 단편을 용이하게 설계할 수 있다.

숙주 세포

재조합 리소좀 설파타제 효소를 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 효소의 사용을 치료적으로 가능하게하는 양으로 이러한 설파타제 효소를 생성하는 능력을 특징으로 하는 엔도솜 산성화-결핍 세포주이다. 본 발명은 G71로 지정된 CHO-K1-유래, END3 상보적 기 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 G71S로 지정된 무혈청 현탁액 배양물 내 성장에 적합한 G71 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 추가로 서브클로닝되거나 또는 상이한 발현 플라스미드를 함유하는 G71 및 G71S 세포주의 유도체를 제공한다.

재조합 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 함유하고 발현시키는 세포는 유전적으로 변형된 세포로서 본 명세서에서 언급된다. 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 함유하고 발현시키는 포유류 세포는 유전적으로 변형된 포유류 세포로서 언급된다. 세포 내로 DNA 또는 RNA의 도입은, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 전기영동, 미세주입법, 유전자 총, 인산 칼슘 침전, 변형된 인산 칼슘 침전, 양이온성 지질 처리, 포토레이션(photoporation), 융합 방법, 수용체 매개 전달 또는 폴리브렌(polybrene) 침전과 같은 공지된 트랜스펙션 방법에 의한다. 대안적으로, DNA 또는 RNA는 바이러스 벡터로 감염에 의해 도입될 수 있다. 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 발현시키는 포유류 세포를 포함하는 세포 생성 방법은 공동계류중인 Richard F Selden, Douglas A. Treco 및 Michael W. Heartlein에 의한 미국특허출원 제08/334,797호(발명의 명칭: "In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy", 출원일: 1994년 11월 4일); Richard F Selden, Douglas A. Treco and Michael W. Heartlein에 의한 미국특허출원 제08/334,455호(발명의 명칭: "In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin for Gene Therapy", 출원일: 1994년 11월 4일) 및 Douglas A. Treco, Michael W. Heartlein and Richard F Selden에 의한 미국특허출원 제08/231,439호(발명의 명칭: "Targeted Introduction of DNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for Gene Therapy", 출원일: 1994년 4월 20일)가 기재된다. 각각의 이들 출원의 교시는 본 명세서에 전문이 참조로 명백하게 포함된다.

바람직한 실시형태에서, 재조합 리소좀 설파타제 효소를 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 효소의 사용을 치료적으로 가능하게 하는 양으로 이러한 리소좀 설파타제 효소를 생성하는 능력을 특징으로 하는 엔도솜 산성화-결핍 세포주이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 G71로 지정된 CHO-K1-유래, END3 상보적 기 세포주, 및 G71S로 지정된 무혈청 현탁액 배양물 내 성장에 적합한 G71 세포주를 제공하며, 이들은 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 및 재조합 리소좀 설파타제 효소를 공동-발현시키고, 따라서 "정의"에서 구체화된 바와 같은 고수율의 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소를 생성할 수 있고, 이에 의해 치료적 리소좀 설파타제 효소의 대규모 생성을 가능하게 한다. 가장 바람직한 실시형태에서, G71 또는 G71S 세포주 또는 이것의 유도체는 적어도 약 0.5, 바람직하게는 적어도 약 0.75, 더 바람직하게는 적어도 약 1.0, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 1.25 피코그램/세포/일의 양으로 재조합 리소좀 설파타제 효소를 발현시키고 분비한다.

벡터 및 핵산 구성체

재조합 단백질을 발현시키는데 사용된 핵산 구성체, 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 또는 리소좀 설파타제 효소 또는 둘 다는 트랜스펙션된 포유류 세포 내에서 염색체 외로(에피솜으로) 발현된 것 또는 무작위로 또는 상동성 재조합을 통해 사전-선택된 표적화된 부위에서 수용자의 세포 게놈 내로 통합된 것일 수 있다. 염색체 외로 발현된 구성체는 재조합 단백질-암호화 서열에 추가로, 세포 내 단백질의 발현에 및 선택적으로 구성체의 복제에 충분한 서열을 포함한다. 전형적으로 프로모터, 재조합 단백질-암호화 DNA 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 재조합 단백질을 암호화하는 DNA는 발현이 프로모터의 제어 하에 있는 이러한 방식으로 구성체 내에 위치된다. 선택적으로, 구성체는 다음 중 하나 이상과 같은 추가적인 성분을 함유할 수 있다: 분할 부위, 인핸서 서열, 적합한 프로모터의 대조군 하에서 선별가능한 마커 유전자, 적합한 프로모터의 대조군 하에서 증폭가능한 마커 유전자 및 매트릭스 부착 영역(matrix attachment region, MAR) 또는 그것이 삽입된 영역의 발현을 향상시키는 당업계에 공지된 다른 구성요소.

DNA 구성체가 세포의 게놈 내로 통합되는 실시형태에서, 단지 재조합 단백질-암호화 핵산 서열을 포함할 필요가 있다. 선택적으로, 프로모터 및 인핸서 서열, 폴리아데닐화 부위 또는 부위들, 스플라이스 부위 또는 부위들, 선별가능한 마커 또는 마커들을 암호화하는 핵산, 증폭가능한 마커를 암호화하는 핵산 서열, 매트릭스 부착 영역(MAR) 또는 그것이 삽입된 영역의 발현을 향상시키는 당업계에 공지된 다른 구성요소, 및/또는 수용자 세포 내 게놈 DNA에 상동성인 DNA를 포함하여 게놈 내 선별 부위에 DNA 통합을 표적화(DNA 또는 DNA 서열을 표적화)할 수 있다.

세포 배양 방법

재조합 단백질-암호화 DNA 또는 RNA를 함유하는 포유류 세포는 세포 성장 및 DNA 또는 RNA의 발현에 적합한 조건 하에 배양된다. 재조합 단백질을 발현시키는 해당 세포는 공지된 방법 및 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 확인될 수 있고, 재조합 단백질은 공지된 방법 및 또한 재조합 단백질의 증폭과 함께 또는 증폭 없이 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 분리되거나 정제될 수 있다. 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 존재를 표시하는 표현형을 나타내는 유전적으로 변형된 포유류 세포의 스크리닝, 예컨대 PCR 스크리닝, 서던 블롯 분석에 의한 스크리닝 또는 재조합 단백질의 발현을 위한 스크리닝을 통해 확인이 수행될 수 있다. 포함된 재조합 단백질-암호화 DNA를 함유하는 세포의 선별은 선별가능한 마커 유전자를 발현시키는 해당 세포 만의 생존에 적합한 조건 하에 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 트랜스펙션되거나 또는 감염된 세포의 이후의 배양과 함께 DNA 구성체 내 선별가능한 마커를 포함함으로써 수행될 수 있다. 도입된 DNA 구성체의 추가 증폭은 적절한 조건 하에서 유전적으로 변형된 포유류 세포를 배양시킴으로써(예를 들어 증폭가능한 마커 유전자의 다양한 복제물을 함유하는 세포만이 생존할 수 있는 약물 농도의 존재에서 증폭가능한 마커 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 포유류 세포를 배양시킴) 달성될 수 있다.

재조합 단백질을 발현시키는 유전적으로 변형된 포유류 세포는 발현 생성물의 검출에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 예를 들어, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소를 발현시키는 포유류 세포는 샌드위치 효소 면역분석에 의해 확인될 수 있다. 항체는 활성제 부분으로 향할 수 있다.

리소좀 설파타제 효소의 변이체

특정 실시형태에서, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소 돌연변이체 또는 변이체가 제조될 수 있고, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소가 사용될 수 있는 다양한 적용에서 유용할 것이다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열 돌연변이체 또는 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 돌연변이체 또는 변이체일 수 있다. 결실 돌연변이체 또는 변이체는 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기를 결여한다. 결실 돌연변이체 또는 변이체의 보통의 유형은 분비 신호 서열 또는 단백질이 특정 세포 부분에 결합하도록 지시하는 신호 서열을 결여하는 것이다. 삽입 돌연변이체 또는 변이체는 전형적으로 폴리펩타이드 내 비-말단 지점에서 물질의 첨가를 수반한다. 이는 면역반응성 에피토프 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 또한 융합 단백질로 불리는 말단 첨가가 이하에 논의된다.

변이체는 상기 시작한 바와 같은 미변형 리소좀 설파타제 효소와 실질적으로 상동성 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 바람직한 변이체는 리소좀 설파타제 효소 적어도 일부의 생물학적 활성, 예를 들어 설파타제 활성을 보유하는 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드의 변이체인 것이다. 다른 바람직한 변이체는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 적어도 일부의 설파타제 활성을 보유하는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 폴리펩타이드의 변이체를 포함한다.

치환 돌연변이체 또는 변이체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 야생형 폴리펩타이드의 한 아미노산을 다른 것으로 교환하고, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 다른 기능 또는 특성의 손실 없이 단백질분해 절단에 대한 안정성과 같은 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다.이 종류의 치환은 바람직하게는 보존적이며, 즉 하나의 아미노산은 유사한 형태 및 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 알라닌에서 세린; 아르기닌에서 리신; 아스파라긴에서 글루타민에서 히스티딘; 아스파테이트에서 글루타메이트; 시스테인에서 세린; 글루타민에서 아스파라긴; 글루타메이트에서 아스파테이트; 글라이신에서 프롤린; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민; 아이소류신에서 류신 또는 발린; 류신에서 발린 또는 아이소류신; 리신에서 아르기닌; 메티오닌에서 류신 또는 아이소류신; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌; 세린에서 트레오닌; 트레오닌에서 세린; 트립토판에서 티로신; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린에서 아이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다.

본 발명의 한 양태는 리소좀 설파타제 효소의 O- 또는 N-연결된 글라이코실화 부위가 돌연변이된 글라이코실화 부위 돌연변이체 또는 변이체를 생성하는 단계를 고려한다. 이러한 돌연변이체 또는 변이체는 생물학적 활성, 물리적 구조 및 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 기질 결합 가능성에 관계된 중요한 정보를 수득할 것이다. 특정 양태에서, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드의 다른 돌연변이체 또는 변이체는 생물학적 활성을 보유하지만 증가되거나 감소된 기질 결합 활성을 가지도록 만들어질 수 있는 것으로 고려된다. 이와 같이, 활성 부위 또는 촉매 영역의 돌연변이는 변경된 기질 결합 활성을 갖는 단백질 돌연변이체 또는 변이체를 만들어내기 위하여 특히 고려된다. 이러한 실시형태에서, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 서열은 다른 관련된 효소 및 선택된 잔기가 특이적으로 돌연변이되는 것과 비교된다.

유용할 수 있는 대표적인 돌연변이인 아미노산 번호 1로서 추정적 아미노산 말단으로부터 성숙 단백질의 아미노산을 넘버링하는 것은, 예를 들어 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 위치 178 및 397을 포함하는 모든 또는 일부의 잠재적으로 글라이코실화된 아스파라긴의 치환을 포함한다(도 5 참조).

기질 결합은 리소좀 설파타제 효소의 활성 부위에서/활성 부위 근처에서 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 이러한 돌연변이를 고려하여, 당업자는 효소 서열의 다른 돌연변이가 이 단백질 및 그것의 활성에 대해 추가적인 구조적 및 기능적 정보를 제공하도록 만들어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.

상기 기재한 바와 같은 돌연변이체 또는 변이체를 구성하기 위하여, 당업자는 잘 공지된 표준 기법을 사용할 수 있다. N-말단 결실, C-말단 결실, 내부 결실뿐만 아니라 무작위 및 점 돌연변이유발이 구체적으로 고려된다.

N-말단 및 C-말단 결실은, 예를 들어 C- 또는 N-말단 영역의 말단 근처의 적합한 단일 제한 부위의 존재를 이용하는 결실 돌연변이유발의 형태이다. DNA는 해당 부위에서 절단되고, 절단된 말단은 BAL31, 엑소뉴클레아제 III, DNase I, 및 SI 뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 의해 분해된다. 2개 말단의 재결합은 제한 부위 주변에서 다른 크기의 결실을 갖는 일련의 DNA를 생성한다. 이러한 돌연변이체로부터 발현된 단백질은 당업계의 표준 기법을 사용하여 적절한 생물학적 기능, 예를 들어 효소 활성에 대해 분석될 수 있고, 본 명세서에 기재된다. 유사한 기법이 2개의 적합하게 위치된 제한 부위를 사용함으로써 내부 결실 돌연변이체에 대해 사용될 수 있고, 이에 의해 정확히 정해진 결실이 만들어지고, 상기와 같이 말단이 재결찰되도록 한다.

또한 부분적 분해 돌연변이체가 고려된다. 이러한 예에서, 당업자는 반응 시간의 길이에 의존하여 수많은 위치에서 DNA를 절단하는 "빈번한 절단기"를 사용한다. 따라서, 반응 조건을 다르게 함으로써, 다양한 크기의 일련의 돌연변이체를 만들어낼 수 있으며, 그 다음에 이는 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

무작위 삽입 돌연변이는 또한 DNase I로 DNA 서열을 절단하고, 예를 들어 3, 6, 9, 12 등의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드의 연장을 삽입하며, 말단을 재결찰시킴으로써 수행될 수 있다. 일단 이러한 돌연변이가 만들어지면, 돌연변이체는 야생형 단백질에 의해 존재되는 다양한 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

점 돌연변이유발이 또한 사용되어 아미노산 잔기가 리소좀 설파타제 효소 생물학적 활성과 관련된 특정 활성에서 중요한 특수성이 확인될 수 있다. 따라서, 당업자는 변경된 코돈 및 미스센스 돌연변이를 초래하는 DNA 가닥 내 단일 염기 변화를 만들어낼 수 있다.

특정 단백질의 아미노산은 동등물 또는 심지어 개선된 2차-생성 분자를 만들도록 변경될 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자 또는 수용체 상의 결합 부위와 같은 구조를 갖는 상호 결합 능력의 주목할 만한 손상 없이 단백질의 주어진 아미노산의 치환을 고려한다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정하는 단백질의 상호 능력 및 특성 때문에, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열 및 그것의 근본적인 DNA 암호 서열 내에서 만들어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 따라서 다양한 변형이 이하에 논의하는 바와 같이 그것의 생물학적 이용성 또는 활성의 주목할 만한 손상 없이 유전자의 DNA 서열 내에서 만들어질 수 있다.

이러한 변화를 만드는 것에서, 아미노산의 수치료 지수(Hydropathic index)가 고려될 수 있다. 아미노산의 상대적 수치료 특징은 결과 단백질의 2차 구조에 기여하는데, 이는 결국 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 정한다. 각각의 아미노산은 그것의 소수성 및 하전 특성을 기준으로 수치료 지수가 할당되었다(본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Kyte & Doolittle, J. Mol . Biol ., 157(1): 105- 132, 1982]). 일반적으로, 아미노산은 유사한 수치료 지수 또는 점수를 가지며, 또한 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래하는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 즉, 여전히 생물학 기능적으로 동등한 단백질을 얻는다.

추가로, 유사 아미노산의 치환은 친수성을 기준으로 효과적으로 만들어질 수 있다. 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허 제4,554,101호는 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같은 단백질의 가장 큰 국부 평균 친수성을 언급하며, 단백질의 생물학적 특성과 관련된다. 이와 같이, 아미노산은 다른 유사한 친수성 값을 가지도록 치환될 수 있고, 여전히 생물학적으로 동등하고 면역학적으로 동등한 단백질을 얻는다.

본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 대표적인 아미노산 치환은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 아이소류신을 교환하는 것을 포함한다. 일부 또는 모든 생물학적 활성의 보유에 대한 필요를 고려하는 한편 단백질의 2차 구조를 변경시키는 다른 이러한 치환은 당업자에게 잘 공지될 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제조를 위해 고려되는 다른 유형의 변이체는 펩타이드 모방체의 사용이다. 모방체는 단백질 2차 구조의 구성요소를 모방하는 펩타이드-함유 분자이다. 예를 들어 문헌[Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993)]를 참조한다. 펩타이드 모방체 사용 뒤에 있는 근본적인 이유는 분자의 상호작용, 예컨대 항체 및 항원의 상호작용을 촉진시키는 것과 같은 방식으로 단백질의 펩타이드 백본이 아미노산 곁사슬을 주로 향하게 하도록 존재하는 것이다. 펩타이드 모방체는 천연 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용할 것으로 기대된다. 이런 원칙은 상기 기재한 원칙과 함께 사용되어 리소좀 설파타제 효소의 다수 천연 특성을 가지지만, 변경된 심지어 개선된 특징을 갖는 제2 세대 분자를 유전자 조작할 수 있다.

리소좀 설파타제 효소의 변형된 글라이코실화

활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 변이체는 또한 모 폴리펩타이드에 대해 변형된 글라이코실화 형태를 가지도록, 예를 들어 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실하고/하거나 천연 폴리펩타이드 내 존재하지 않는 하나 이상의 글라이코실화 부위를 첨가하도록 생성될 수 있다.

글라이코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결일 수 있다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 곁사슬에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X- 세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 곁사슬에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 폴리펩타이드 내 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글라이코실화 부위를 만든다. 따라서 N-연결된 글라이코실화 부위는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 폴리펩타이드에 부가될 수 있으므로, 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유한다. O-연결된 글라이코실화는 하이드록시아미노산에, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있지만, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다. O-연결된 글라이코실화 부위는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 폴리펩타이드 서열 내로 삽입하거나 치환함으로써 첨가될 수 있다.

도메인 스위칭

리소좀 설파타제 효소 단백질의 다양한 부분은 다량의 서열 상동성을 소유한다. 돌연변이는 그것의 기능을 변경할 수 있는 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드에서 확인될 수 있다. 이들 연구는 잠재적으로 적어도 2가지 이유에 대해 중요하다. 첫째로, 그것들은 이 유전자의 또 다른 상동체, 대립형질 변이체 및 돌연변이체는 관련된 종, 예컨대 래트, 토끼, 원숭이, 긴팔원숭이, 침팬지, 유인원, 개코원숭이, 소, 돼지, 말, 양 및 고양이에 존재할 수 있는 합리적 기대를 제공한다. 이들 상동체, 변이체 및 돌연변이체의 분리 시, 및 다른 분석과 함께, 특정 활성 또는 기능적 도메인이 확인될 수 있다. 둘째로, 이는 상기 기재된 것과 같은 분자의 추가 돌연변이 분석을 위한 시작 지점을 제공할 것이다. 이 정보가 이용될 수 있는 한 가지 방법은 "도메인 스위칭"이다.

도메인 스위칭은 상이하지만 관련된 폴리펩타이드를 사용하는 재조합 분자의 생성을 수반한다. 예를 들어, 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 서열을 다른 공급원으로부터의 유사한 리소좀 설파타제 효소의 서열과 및 이들 폴리펩타이드의 돌연변이체 및 대립형질 변이체와 비교함으로써, 이들 분자의 기능적으로 중요한 영역에서와 같은 예측을 할 수 있다. 그 다음에, 리소좀 저장 장애에서 효소 기능 및 효과에 대한 이들 영역의 임계를 결정하기 위한 노력에서 이들 분자의 관련된 도메인을 스위칭하는 것이 가능하다. 이들 분자는 이들 "키메라"가 천연 분자와 구별될 수 있는 한편, 가능하게는 동일 또는 심지어 향상된 기능을 제공한다는 점에서 추가적인 가치를 가질 수 있다.

현재 확인되는 수많은 리소좀 설파타제 효소를 기반으로, 추가적인 돌연변이 분석 및 2차 구조 상에서 그것의 예측된 효과가 이것의 이해를 위하여 첨가될 것이다. 리소좀 설파타제 효소 사이의 도메인을 스위칭하는 돌연변이체는 이들 분자 및 그것들이 상호작용하는 폴리펩타이드의 구조/기능 관계에 대한 유용한 정보를 제공할 것이다.

융합 단백질

상기 기재한 돌연변이에 더하여, 본 발명은 융합 단백질로 알려진 삽입 변이체의 구체화된 종류의 생성을 추가로 고려한다. 이 분자는 일반적으로 제2 폴리펩타이드의 모두 또는 일부에 대해 N- 또는 C-말단에서 연결된 천연 분자의 모두 또는 실질적인 부분을 가진다. 예를 들어, 융합은 전형적으로 이종성 숙주 내 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위하여 다른 종으로부터의 리더 서열을 사용한다. 다른 유용한 융합은 항체 에피토프와 같은 면역적으로 활성인 도메인의 첨가를 포함하여, 융합 단백질의 정제를 용이하게 한다. 융합 접합에서 또는 근처에서 절단 부위의 포함은 정제 후 관련없는 폴리펩타이드의 제거를 용이하게 할 것이다. 다른 유용한 융합은 효소로부터의 활성 부위, 글라이코실화 도메인, 세포 표적화 신호 또는 막 관통 영역과 같은 기능적 도메인의 연결을 포함한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 상업적으로 입수가능한 융합 단백질 발현 시스템이 있다. 특히 유용한 시스템은, 이에 제한되는 것은 아니지만 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase, GST) 시스템(뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 Pharmacia), 말토스 결합 단백질 시스템(매사추세츠주 베벌리에 소재한 NEB), FLAG 시스템(코네티컷주 뉴 헤이븐에 소재한 IBI), 6xHis 시스템(캘리포니아주 채츠워스에 소재한 Qiagen)을 포함한다. 이들 시스템은 단지 소수의 추가적인 아미노산을 함유하는 재조합 폴리펩타이드를 생성할 수 있는데, 이는 재조합 폴리펩타이드의 항원 능력에 영향을 미칠 것 같지 않다. 예를 들어, FLAG 시스템과 6xHis 시스템은 둘 다 단지 짧은 서열을 첨가하며, 둘 다 불량하게 항원성이되는 것으로 알려져 있고, 폴리펩타이드가 그것의 본래의 입체구조로 폴딩되는 것에 불리하게 영향을 미치지 않는다. 유용한 것으로 고려되는 다른 N-말단 융합은 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 영역에서 Met-Lys 다이펩타이드의 융합이다. 이러한 융합은 단백질 발현 또는 활성에서 유리한 증가를 생성할 수 있다.

특히 유용한 구성체는 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드 또는 이것의 단편이 리소좀 설파타제 효소 융합 구성체의 면역원성을 향상시키기 위하여 햅텐에 융합되는 것일 수 있다. 이는 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소에 대한 항체의 생성이 단백질의 검출을 가능하게 하는데 유용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 특이적 부위 또는 세포에 리소좀 설파타제 효소-관련된 조성물의 표적화를 향상시키는 융합 구성체가 만들어질 수 있다.

원하는 특성을 갖는 이종성 펩타이드, 예를 들어 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 대해 리소좀 설파타제 효소를 표적화하는 모티프를 포함하는 다른 융합 구성체. 바람직한 실시형태에서, 뼈 표적화 펩타이드를 포함하는 융합 구성체, 예를 들어 리소좀 설파타제 효소에 융합된 6 아스파트산 잔기(6xAsp 또는 6D)는 특히 뼈 부위에 효소를 표적화 할 수 있다.

원하는 특성의 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 다른 융합 구성체, 예를 들어 표적화를 위한 혈청 반감기 또는 항체 또는 이것의 단편을 연정하기 위한 Ig 불변 영역이 또한 고려된다. 다른 융합 시스템은 원하는 폴리펩타이드로부터 융합 상대를 절단하는 것이 바람직한 폴리펩타이드 혼성체를 생성한다. 한 실시형태에서, 융합 상대는 프로테아제에 대해 특이적 인식 서열을 함유하는 펩타이드 서열에 의해 재조합 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드에 연결된다. 적합한 서열의 예는 담배식각바이러스(Tobacco Etch Virus)(메릴랜드주 게이더스버그에 소재한 Life Technologies) 또는 인자 Xa(매사추세츠주 베벌리에 소재한 New England Biolabs)에 의해 인식되는 것이다.

유도체

상기 언급된 바와 같이, 유도체는 예를 들어 및 제한없이 유비퀴틴화, 표지(예를 들어 방사선핵종 또는 다양한 효소), 공유적 폴리머 부착, 예컨대 페길화, 즉, 폴리에틸렌 글라이콜에 의한 유도체화) 및 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 및 치환과 같은 기법에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 지칭한다. 리소좀 설파타제 효소의 유도체는 또한 치료제로서 유용하며 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있다.

폴리에틸렌 글라이콜(PEG)은 생체 내에서 더 긴 반감기를 제공하는 본 발명의 방법에 의해 생성되는 리소좀 설파타제 효소에 부착될 수 있다. PEG 기는 임의의 편리한 분자량을 가질 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다. PEG의 평균 분자량은 바람직하게는 약 2 킬로달톤("kDa") 내지 약 100kDa, 더 바람직하게는 약 5kDa 내지 약 50kDa, 더 바람직하게는 약 5kDa 내지 약 10kDa의 범위에 있을 것이다. PEG 기는 일반적으로 단백질 모이어티 상의 반응기(예를 들어, 알데하이드, 아미노 또는 에스터 기)에 대해 PEG 모이어티(예를 들어, 알데하이드, 아미노, 티올 또는 에스터 기) 상의 반응기를 통하여 아실화 또는 환원적 알킬화를 통해 본 발명의 리소좀 설파타제 효소에 부착될 것이다. 관심의 폴리펩타이드에 PEG 모이어티의 첨가는 당업계에 잘 공지된 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 국제특허출원 WO 96/11953 및 미국특허 제4,179,337호를 참조한다.

PEG와 리소좀 설파타제 효소 폴리펩타이드의 결찰은 보통 수성상에서 일어나며 역상 분석 HPLC에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다. 페길화된 펩타이드는 분취 HPLC에 의해 용이하게 정제될 수 있고 분석 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저이탈 질량분석법에 의해 특징지어질 수 있다.

표지

일부 실시형태에서, 치료적 리소좀 설파타제 효소는 그것의 검출을 용이하게 하기 위하여 표지된다. "표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 스펙트럼분석, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용에 적합한 표지는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 방사성 표지(예를 들어, ³²P), 형광단(예를 들어, 플루오레세인), 고전자 밀도 시약, 효소(예를 들어 보통 ELISA에서 사용되는 것), 바이오틴, 다이곡시제닌 또는 햅텐뿐만 아니라, 예를 들어 햅텐 또는 펩타이드 내로 방사성 표지를 포함함으로써 검출가능하게 될 수 있는 단백질 또는 햅텐 또는 펩타이드에 특이적으로 반응성인 항체를 검출하는데 사용될 수 있는 단백질을 포함한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 표지의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 형광 염료(예를 들어 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성표지(예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³²P), 효소(예를 들어, 호스 래디시퍼옥시다아제, 알카라인 포스파타제 및 ELISA에서 보통 사용되는 다른 것) 및 표색 표지, 예컨대 콜로이드성 금, 착색된 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)를 포함한다.

표지는 당업계에 잘 공지된 방법에 따른 리소좀 설파타제 효소의 원하는 성분에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 바람직하게는 한 실시형태에서 표지는 본 발명에 따른 활성제의 컨쥬게이션을 위한 아이소시아네이트 시약을 사용하여 리소좀 설파타제 효소에 공유적으로 결합된다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 2작용성 아이소시아네이트 시약은 리소좀 설파타제 효소에 표지를 컨쥬게이트하기 위해 사용되어 그것에 부착된 활성제 없이 표지 리소좀 설파타제 효소 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 표지 리소좀 설파타제 효소 컨쥬게이트는 본 발명에 따른 표지된 컨쥬게이트의 합성을 위해 중간체로서 사용될 수 있거나 또는 리소좀 설파타제 효소 컨쥬게이트를 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 표시된 바와 같이, 요구되는 선택성, 리소좀 설파타제 효소의 원하는 성분과 컨쥬게이션의 용이함, 안정성의 필요, 이용가능한 기기 및 폐기 규정에 따라서 표지의 선택과 함께 매우 다양한 표지가 사용될 수 있다. 비-방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어, 바이오틴)은 리소좀 설파타제 효소에 공유적으로 결합된다. 그 다음에 리간드는 본래부터 검출가능하거나 또는 신호 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 공유적으로 결합된 다른 분자(예를 들어 스트렙타비딘)에 결합된다.

본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 또한, 예를 들어 효소 또는 형광단과 컨쥬게이션에 의해 신호-생성 화합물에 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 표지로서 사용에 적합한 효소는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하이드롤라제, 특히 포스파타제, 에스터라제 및 글라이코시다제 또는 옥시도타제, 특히 페록시다제를 포함한다. 표지로서 사용에 적합한 형광성 화합물, 즉 형광단은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 엄벨리페론 등을 포함한다. 적합한 형광단의 추가 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에오신, TRITC-아민, 퀴닌, 플루오레세인 W, 아크리딘 옐로, 리사민 로다민, B 설포닐 클로라이드 에리트로세인, 루테늄(트리스, 바이피리디늄), 텍사스 레드, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 등을 포함한다. 표지로서 사용에 적합한 화학발광 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 루시페린 및 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 예를 들어 루미놀을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호 생성 시스템의 검토를 위해, 미국특허 제4,391,904호를 참조한다.

검출가능한 표지를 위한 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 표지가 방사성인 경우, 검출을 위한 수단은 섬광계수기 또는 방사선자동사진과 같은 사진필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우, 이는 적절한 빛의 파장을 갖는 형광색소를 여기시키고, 얻어진 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 전하결합소자(charge coupled device, CCD) 또는 광전자증배관과 같은 전자 검출기의 사용에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소적 표지는 효소에 대해 적절한 기질을 제공하고 얻어진 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 표색 또는 화학발광 표지는 단순히 표지와 관련된 색을 관찰함으로써 검출될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용에 적합한 다른 표지 및 검출 시스템은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 이러한 표지된 조절인자 및 리간드는 질병 또는 건강 상태의 진단에 사용될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 방법은 엔도솜 수송에 결함이 있는 세포주로부터 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소를 생성하는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본 방법은 CHO 세포주 G71, 또는 이것의 유도체로부터 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 생성하는 단계를 포함한다. 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 GALNS와 같은 리소좀 설파타제 효소의 생성은 다음의 단계를 포함한다: (a) 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 및 재조합 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)을 공동-발현시키는 G71 또는 G71 유도체 세포주를 발생시키는 단계; (b) 인간 리소좀 설파타제 효소 및 SUMF1 공동-발현 세포주를 배양시키는 단계; 및 (c) 리소좀 설파타제 효소의 생성을 위한 바이오리액터에 인간 리소좀 설파타제 효소 및 SUMF1 공동-발현 세포주를 정률증가시키는 단계. 바람직한 실시형태에서, 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 및 인간 SUMF1 cDNA는 본 명세서에서 이하에 기재되는 바와 같이 기본적으로 포유류 발현 벡터 내에 서브클로닝된다.

세포주 발생을 위하여, 무혈청 현탁액 배양물 내 성장에 적합한 G71 또는 G71S, G71 클론은 인간 GALNS 포유류 발현 벡터, 인간 SUMF1 포유류 발현 벡터 및 선별가능한 마커 유전자로 공동-트랜스펙션되며, 안정한 형질전환체가 선별되었다. 안정한 트랜스펙션체의 서브클로닝의 제1 라운드 후, 세포주는 형광성 기질을 사용하여 선별되었고, 특이적으로 지정된다. G71 또는 G71S 세포주는 마이크로담체와 함께 교반기 내에서 또는 현탁 배양물 내에서 각각 세포-특이적 생산성(생성물/세포의 pg)에 대해 분석되었다. 인간 GALNS의 최고의 생산자가 확인되었고 임상전 물질의 생성을 위해 바이오리액터에 정률증가된다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 천연 물질을 분해하는 재조합 인간 리소좀 효소의 활성을 측정하기 위한 세포기반 분석을 제공한다. 해당 방법은 (a) 리소좀 효소에 대한 천연 기질이 축적되는 조건 하에 리소좀 효소에서 결핍된 분리된 인간 세포를 배양시키는 단계; (b) 세포를 리소좀 효소와 접촉시키는 단계; (c) 세포를 용해시키는 단계; (d) 세포 용해물에 (i) 천연 기질에 특이적인 효소 및 (ii) 천연 기질로부터의 작은 올리고당을 절단하는 효소를 첨가하는 단계; (e) 검출가능한 모이어티로 작은 올리고당을 표지하는 단계; (f) 선택적으로 표지된 작은 올리고당을 분리하는 단계; (g) 표지된 작은 올리고당을 검출하는 단계; 및 (h)(i) 리소좀 효소와 접촉시킨 세포로부터 표지된 작은 올리고당의 양을 (ii)리소좀 효소와 접촉시키지 않은 세포로부터의 표지된 작은 올리고당의 양과 비교함으로써 천연 기질을 분해시키는 리소좀 효소의 활성을 결정하는 단계를 포함하되, (h)(ii)와 비교하여 (h)(ii)의 감소는 천연 기질을 분해하는 리소좀 효소의 활성을 표시한다. 한 실시형태에서, 작은 올리고당은 단당류, 이당류 또는 삼당류이다. 관련 실시형태에서, 작은 올리고당은 이당류이다.

일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 아릴설파타제 B (ARSB), 이듀로네이트-2-설파타제(IDS), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH), N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 α-L-이듀로니다제(IDU)이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 산 α-글루코시다제(GAA)이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 β-글루코로니다제(GUSB)이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소는 β-갈락토시다제(GLB1)이다.

세포 기반 분석에 사용될 수 있는 적합한 인간 세포는 시험되는 리소좀 효소가 결핍된 임의의 인간 세포를 포함하여, 리소좀 효소에 대한 천연 기질을 축적시킬 수 있다. 예를 들어, 활성에서 전체(100%) 또는 부분적 결핍, 예를 들어 활성의 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 감소 또는 초과를 자연적으로 나타내는 세포가 사용될 수 있다. 감소된 활성을 갖는 돌연변이체 효소를 발현시키는 세포 또는 리소좀 저장 질병, 예를 들어 점액다당류증에 걸린 환자로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어 암호화 유전자 또는 그것의 프로모터 또는 다른 조절 영역에 돌연변이를 도입하는 것을 통해 리소좀 효소 활성을 녹아웃 또는 감소시키도록 재조합적으로 변경된 세포가 사용될 수 있다. 리소좀 효소 활성을 감소시키도록 처리된, 예를 들어 효소 발현을 감소시키도록 안티센스 또는 RNAi로 처리된 세포가 사용될 수 있다.

탄수화물로부터 작은 올리고당을 절단하고(분해하고) 리소좀 효소의 천연 기질에 "특이적"(즉, 대부분 분해)인 적합한 효소는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, GALNS 또는 GLB 1(케라탄 설페이트를 분해하는 효소)의 활성 검출을 위해, 단계 (d)의 효소는 케라타나제 II 또는 주로 케라탄 설페이트 상에서 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 예로서, IDU, ARSB, IDS 또는 GUSB(더마탄 설페이트를 분해하는 효소)의 검출을 위해, 단계 (d)의 효소는 콘드로이티나제 ABC 또는 더마탄 설페이트 상에서 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 예로서, IDU, IDS, SGHS, G6S 또는 GUSB(헤파린 설페이트를 분해하는 효소)의 검출을 위해, 단계 (d)의 효소는 헤파리나제 I 또는 헤파리나제 II 또는 둘 다일 수 있다. 다른 예에서와 같이, GAA의 검출을 위해(글라이코겐을 분해하는 효소), 단계 (d)의 효소는 α-아밀라제 또는 글라이코겐 상에서 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다.

이 세포 기반 방법은 큰 선택성으로 리소좀 효소 활성을 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리소좀 효소 활성은 리소좀 효소의 농도가 약 10nM, 또는 약 5nM, 또는 약 1nM, 또는 약 0.75nM, 또는 약 0.5nM, 또는 약 0.25nM, 또는 약 0.1nM, 또는 약 0.05nM, 또는 약 0.01nM, 또는 약 0.005nM, 또는 약 1 pM, 또는 약 0.5 pM만큼 낮을 때 검출가능하다.

III. 리소좀 설파타제 효소의 정제

재조합 인간 GALNS를 함유하는 바이오리액터 물질은 0.2㎛ 멸균여과되었고 4℃에서 유지되었다. 바이오리액터 물질은 포획 칼럼 상에 직접 로딩되거나, 또는 초미세여과에 의해 10- 내지 20-배 농축된 후 포획 칼럼 상에 로딩되었다. 바이오리액터 물질 또는 농축된 바이오리액터 물질은 pH 4.5로 pH가 조절된 다음 블루-세파로스 칼럼 상에 로딩되고, 20mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl, pH 4.5 및 20mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl으로 pH 6.0에서 순차적으로 세척하며, 20mM 아세테이트/포스페이트, 100mM NaCl로 pH 7.0에서 용리시켰다. 그 다음에 블루-세파로스 칼럼 용리액은 프락토겔 SE Hi-Cap 상에 로딩되고, 20mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 5.0에서 및 20mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 5.5에서 순차적으로 세척되며, 20mM 아세테이트/포스페이트, 50-350mM NaCl 구배로 pH 5.5에서 용리된다. 프락토겔 SE Hi-Cap 용리액을 10mM NaOAc, 1mM NaH₂PO₄, 0.005% Tween-80 중의 pH 5.5에서 조제하였다.

대안적으로, 재조합 인간 GALNS를 함유하는 바이오리액터 물질을 초미세여과에 의해 20-배로 농축시킨 다음 포획 칼럼 상에 로딩하였다. 농축된 바이오리액터 무질을 pH 4.5로 pH 조절하였고, 여과한 다음 프락토겔 SE Hi-Cap 칼럼 상에 로딩하였으며, 10mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl, pH 4.5 및 10mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 5.0에서 순차적으로 세척하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 140mM NaCl로 pH 5.0에서 용리시켰다. 그 다음에 프락토겔 SE Hi-Cap 칼럼 용리액을 500mM NaCl로 pH 7.0에서 조절하였고, Zn-킬레이팅 세파로스(Zn-IMAC) 칼럼 상에 로딩하였으며, 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl, 10mM 이미다졸로 pH 7.0에서 세척하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl, 90mM 이미다졸로 pH 7.0에서 용리시켰다. Zn-킬레이팅 세파로스(Zn-IMAC) 칼럼 용리액을 낮은 pH 불활성화를 위하여 pH 3.5로 조절하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0으로 조절한 다음, ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl로 pH 5.0에서 세척하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 0.7M NaCl로 pH 5.0에서 용리시켰다. ToyoPearl 뷰틸 650M 용리액을 20mM 아세테이트, 1mM 포스페이트, 150mM NaCl로 pH 5.5에서 초미세여과 및 정용여과시킨 다음, 20mM 아세테이트, 1mM 포스페이트, 150mM NaCl, 0.01% Tween-20로 pH 5.5에서 조제하였다.

대안적으로, 재조합 인간 GALNS를 함유하는 바이오리액터 물질을 여과시켰고, 초미세여과/정용여과에 의해 20-배로 농축시킨 다음, 활성탄을 통해 여과시킨 후 포획 칼럼 상에 로딩하였다. 농축된 바이오리액터 물질을 ~55±5 mS/㎝의 전도도에서 Zn-킬레이팅 세파로스 FF(Zn-IMAC) 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 500mM NaCl, pH 7.0 및 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl, pH 7.0(완충제 A)으로 순차적으로 세척한 다음 70%의 완충제 A 및 30%의 10mM 아세테이트/포스페이트의 혼합물, 125mM NaCl, 300mM 이미다졸로 pH 7.0에서(완충제 B) 용리시켰다. Zn-킬레이팅 세파로스 FF(Zn-IMAC) 칼럼 용리액을 ~6.0±0.5 mS/㎝의 전도도 및 pH 7.0으로 조절하였고, 바이러스의 잠재적인 제거를 위해 Mustang Q 필터 상에 로딩하였다. Mustang Q 여과액을 pH 4.5±0.1로 조절하였고, CUNO 60ZA 필터를 통해 여과한 후에 0.2㎛ 인라인 필터로 여과하였고, 그 다음에 프락토겔 EMD SE Hi-Cap(M) 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 4.5에서 및 80%의 완충제 A(10mM 아세테이트/포스페이트, pH 5.0) 및 20%의 완충제 B(10mM 아세테이트/포스페이트, 250mM NaCl, pH 5.0)의 혼합물로 순착적으로 세척하였고, 선형 구배 20%-75%의 완충제 B(80%-25%의 완충제 A 중에서)로 용리시켰다. 그 다음에 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼 용리액을 0.2M 시트레이트 완충제의 첨가에 의해 pH 3.5±0.1로 조절하고, 낮은 pH 바이러스 불활성화를 위해 pH 3.4로 조절하였다. 낮은 pH 바이러스 불활성화된 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼 용리액을 2M NaCl로 조절하였고, pH 6.0에서 0.2M 시트레이트 완충제의 첨가로 pH 5.0으로 조절한 다음 ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl로 pH 5.0(완충제 A)에서 세척한 다음, 35%의 완충제 A 및 65%의 완충제 B(10mM 아세테이트/포스페이트, pH 5.0)의 혼합물을 용리시켰다. ToyoPearl 뷰틸 650M 용리액은 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 30mM 아르기닌 HCl, 2%(w/v) 솔비톨로 pH 5.4에서 완충제 교환되고, 선택적으로 3㎎/㎖ GALNS의 최종 농도로 조절되었다. 완충제 교환되고 농도 조절된 GALNS는 바이러스 필터(DV20) 및 DNA 필터(Mustang Q)를 통해 여과되어, 임의의 잔여 바이러스 및 DNA를 제거한다. Tween-20(또한 폴리솔베이트 20 또는 PS20로 알려짐)은 0.01%(w/v)의 최종 농도로 첨가되어, 거대 약물 물질(Bulk Drug Substance, BDS)을 초래한다. BDS는 2 내지 8℃에서 또는 냉동으로 저장된다.

대안적으로, 재조합 인간 GALNS를 함유하는 바이오리액터 물질이 여과되며, 초미세여과/정용여과에 의해 20-배로 농축된 다음, 활성탄을 통해 여과되어 포획 칼럼 상에 로딩된다. 농축된 바이오리액터 물질이 전도도 ~50±5 mS/㎝에서 Zn-킬레이팅 세파로스 FF(Zn-IMAC) 칼럼 상에 로딩되었고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 500mM NaCl, pH 7.0 및 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl로 pH 7.0(완충제 A)에서 순차적으로 세척된 다음, 70%의 완충제 A 및 30%의 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl, 300mM 이미다졸의 혼합물로 pH 7.0(완충제 B)에서 용리시켰다. Zn-킬레이팅 세파로스 FF(Zn-IMAC) 칼럼 용리액을 pH 4.5±0.1로 1.75M 아세테이트에 의해 pH 4.0로 조절하였고, Millipore COHC 필터를 통해 여과하며, 10mM 아세테이트/포스페이트로 pH 4.5에서 30:70(v/v) 비로 배합한 다음, 7m/㎝ 미만의 전도도에서 프락토겔 EMD SE Hi-Cap(M) 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 4.5에서 및 80%의 완충제 A(10mM 아세테이트/포스페이트, pH 5.0) 및 20%의 완충제 B(10mM 아세테이트/포스페이트, 250mM NaCl, pH 5.0)의 혼합물로 순차적으로 세척하였으며, 선형 구배 20%-75%의 완충제 B(완충제 A 중의 80%-25%)로 용리시켰다. 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼 용리액을 그 다음에 0.4M 시트레이트 완충제의 첨가에 의해 pH 3.5±0.1로, 낮은 pH 바이러스 불활성화에 대해 pH 3.4로 조절하였다. 낮은 pH 바이러스 불활성화된 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼 용리액을 2M NaCl로 조절하였고, 0.4M 시트레이트 완충제의 첨가에 의해 pH 6.0에서 pH 5.05±0.1로 조절하였으며, pH 5에서 10mM 아세테이트/포스페이트와 배합하고, 5M NaCl을 함유하여 2M NaCl의 농도를 달성한 다음, ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼 상에 로딩하였으며, 10mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 4.4±0.1 및 10mM 아세테이트/포스페이트, 2.5M NaCl로, pH 5.0(완충제 A)에서 순차적으로 세척함 다음, 선형구배 100% 내지 32%의 완충제 A 및 0% 내지 68%의 완충제 B(10mM 아세테이트/포스페이트, pH 5.0) 다음에 32% 완충제 A 및 68% 완충제 B의 혼합물로 용리시켰다. ToyoPearl 뷰틸 650M 용리액은 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 30mM 아르기닌 HCl, 2%(w/v) 솔비톨로 pH 5.4에서 교환된 완충제였고, 선택적으로 3㎎/㎖ GALNS의 최종 농도로 조절된다. 완충제 교환되고 농도 조절된 GALNS를 바이러스 필터(DV20) 및 DNA 필터(Mustang Q)를 통해 여과시켜 임의의 잔사 바이러스 및 DNA를 제거하였다. Tween-20(폴리솔베이트 20 또는 PS20로 알려짐)을 0.01%(w/v)의 최종 농도로 첨가하였고, 거대 약물 물질(BDS)를 초래하였다. BDS를 2 내지 8℃에서 또는 냉동으로 저장시켰다.

재조합 인간 GALNS의 정제를 이하에 상세하게 기재하며, 상기 프로토콜로부터 변형된 과정에 따라서 재조합 인간 GALNS의 정제를 이하에 기재한다.

재조합 인간 GALNS 효소를 실시예 III에 기재된 바와 같이 및 실시예 V 또는 실시예 VI에 기재된 바와 같이 G71S 세포 내에서 발현시켰다. 본 발명의 정제된 재조합 인간 GALNS를 GALNS의 다른 기록된 제제와 비교할 수 있다. 문헌[Masue et al., J. Biochem. 110:965-970, 1991]은 인간 태반으로부터 GALNS의 정제 및 특성규명을 기재하고 있다. 정제된 효소는 40kDa 및 15kDa의 폴리펩타이드로 이루어진 120kDa의 분자량을 가지는 것으로 발견되었으며, 이중 15kDa의 폴리펩타이드는 글라이코단백질이 되는 것으로 나타났다. 따라서, Masue 등의 GALNS 효소는 인간 간으로부터 GALNS의 정제 및 특성규명을 기재한 문헌[Bielicki et al., Biochem. J. 279:515-520, 1991]의 도 5에 도시된 처리된 형태에 대응하는 거으로 나타난다. SDS-PAGE에 의해 분석될 때, 해당 효소는 비환원 조건 하에 70kDa의 분자량 및 환원 조건 하에 57kDa, 39kDa 및 19kDa의 분자량을 가진다. 문헌[ Bielicki et al., Biochem J. 311: 333-339, 1995]은 중국 햄스터 난소 세포로부터 재조합 인간 GALNS의 정제 및 특성규명을 기재한다. SDS-PAGE 상의 정제된 효소는 비환원 조건 하에서 58-60kDa의 분자량 및 환원 조건 하에서 55-57kDa, 39kDa 및 38kDa의 분자량을 가지는 것으로 발견되었다. 따라서, Bielicki 등의 GALNS 효소는 효소의 사전 처리된(전구체) 형태 및 도 5에 도시된 처리 형태에 대응하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 본 발명의 재조합 인간 GALNS 효소는 거의 완전히 효소의 전구체 형태(도 9 및 도 12) 또는 대부분(즉, 적어도 약 85%) 효소의 전구체 형태(도 10 참조)로 이루어진다.

IV. 리소좀 설파타제 효소 및 리소좀 저장 질병

리소좀 설파타제 효소는 적어도 실질적인 양(예를 들어, 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 및 더 바람직하게는 적어도 약 90%), 실질적으로 모두 또는 효소의 치료적 또는 생물학적 활성(예를 들어 설파타제 활성)의 모두를 보유하는 전장 효소 또는 이것의 임의의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체이다.

일부 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는, 그것이 발현되거나 생성되지 않는다면, 또는 발현 또는 생성에서 실질적으로 감소된다면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리소좀 저장 질병을 포함하는 질병이 생기게 하는 것이다. 일부 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는, 그것이 발현되거나 생성되지 않는다면, 또는 발현 또는 생성에서 실질적으로 감소된다면 질병이 생기지 않을 수는 있지만, 질병의 부재 또는 감소된 발현 또는 생성이, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리소좀 저장 질병을 포함하는 질병과 관련된 것이다. 바람직하게는, 리소좀 설페이트 효소는 인간으로부터 유래되거나 획득된다.

바람직하게는, 리소좀 저장 질병의 치료에서, 리소좀 설파타제 효소는 발현 또는 생성되지 않는다면 또는 발현 또는 생성이 실질적으로 감소된다면, 리소좀 저장 질병을 생기게 하는 세포 내에서 발견되는 효소이다. 대안적으로 리소좀 저장 질병의 치료에서, 리소좀 설파타제 효소는, 그것의 부재 또는 실질적으로 감소된 발현 또는 생성 그 자체가 질병을 생기게 할 수는 없지만, 그것의 부재 또는 실질적으로 감소된 발현 또는 생성이 질병과 관련된 효소이다. 바람직하게는, 리소좀 설파타제 효소는 인간으로부터 유래되거나 획득된다.

바람직하게는, 해당 효소는 리소좀 설파타제 효소, 예컨대 아릴설파타제 A(ARSA)(Genbank 등록번호. NP_000478(이소형 a), Genbank 등록번호. NP_001078897 (이소형 b) 및 다른 변이체), 아릴설파타제 B/N-아세틸글루코사민 4-설파타제(ARSB)(Genbank 등록번호. P15848), 이듀로네이트-2-설파타제(IDS)(Genbank 등록번호. NP_000193 (이소형 a), Genbank 등록번호. NP_006114 (이소형 b)), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH)(Genbank 등록번호. NP_000190), N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S)(Genbank 등록번호. NP_002067) 및 갈락토스 6-설파타제/N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)(Genbank 등록번호. NP_000503)이다. 치료제로서 유용한 리소좀 저장 질병 및 그것에서 결핍된 리소좀 설파타제 효소의 표는 다음과 같다:

리소좀 저장 질병 리소좀 설파타제 결핍증

점액다당류증 II형 헌터증후군 이듀로네이트-2-설파타제

점액다당류증 IIIA형 산필리포 증후군 설파미다제/헤파린-N-설파타제

점액다당류증 IIID형 산필리포 증후군 N-아세틸글루코사민 6-설파타제

점액다당류증 IVA형 모르퀴오 증후군 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제

점액다당류증 VI형 N-아세틸갈락토사민 4-설파타제

이염백질이영양증(MLD) 아릴설파타제 A

다중 설파타제 결핍증(MSD) 다중 설파타제

바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 엔도솜 산성화-결핍 세포주에 의해 생성된 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소이다. 더 바람직한 실시형태에서, 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소는 활성이며 "정의" 하에 구체환된 것과 같은 고수준의 인산화된 올리고당을 가진다. 가장 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 활성의 고도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)이다.

따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 치료되거나 또는 예방되는 리소좀 저장 질병은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 이염색백색질장애 또는 MLD, 마르토-라미증후군 또는 MPS VI, 헌터증후군 또는 MPS II, 산필립포 A 증후군 또는 MPS IIIa, 산필립포 D 증후군 또는 MPS IIId 및 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS IVa를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 그것의 결핍이 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS IVa를 야기하는 것이다. 다른 특히 바람직한 실시형태에서, 리소좀 설파타제 효소는 그것의 결핍이 인간 리소좀 저장 질병, 예컨대 다중 설파타제 결핍증 또는 MSD와 관련된 것이다.

따라서 상기 표마다, 각 질병에 대해 리소좀 설파타제 효소는 질병에서 결핍된 특이적 활성 리소좀 설파타제 효소를 포함한다. 예를 들어, MPS II를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 효소는 이듀로네이트-2-설파타제이다. MPS IIIA를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 효소는 설파미다제/헤파린-N-설파타제이다. MPS IIId를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 효소는 N-아세틸글루코사민 6-설파타제이다. MPS IVA를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 효소는 갈락토스 6-설파타제/N-아세틸갈락토사민-6-설파타제이다. MPSVI를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 효소는 N-아세틸갈락토사민 4-설파타제이다. 이염백질이영양증(MLD)을 수반하는 방법에 대해, 바람직한 효소는 아릴설파타제 A이다. 다중 설파타제 결핍증(MSD)을 수반하는 방법에 대해, 효소는 아릴설파타제 A, 아릴설파타제 B/N-아세틸글루코사민 4-설파타제, 이듀로네이트-2-설파타제, 설파미다제/헤파린-N-설파타제, N-아세틸글루코사민-설파타제 또는 갈락토스 6-설파타제/N-아세틸갈락토사민-6-설파타제일 수 있으며, 바람직한 효소는 갈락토스 6-설파타제/N-아세틸갈락토사민-6-설파타제이다.

V. 점액다당류증 TYPE IVA ( 모르퀴오 증후군, MPS IVA )

점액다당류증 IVA형(모르퀴오 증후군, MPS IVa)은 점액다당류저장 질병의 그룹에 속하는 유전적, 상염색체 열성 질병이다. 모르퀴오 증후군은 2개의 글라이코사미노글라이칸(GAG), 케라탄 설페이트(KS) 및 콘드로이틴-6-설페이트(C6S)의 분해에 필요한 리소좀 효소의 결핍에 의해 야기된다. 구체적으로, MPS IVa는 효소 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 부재, 및 소변으로 KS의 배출을 특징으로 한다. GALNS의 결여는 골격조직의 주요 성분인 유리질 연골 내 비정상적으로 다량의 점액다당류의 축적을 야기한다. 모든 환자는 전신성 골이형성증을 가진다. 다른 증상은 환자에 따라 중증도가 다르며, 그 중에서도 모발 손실, 백내장, 척추 불안정성, 심장판막증 및 호흡기 증상을 포함할 수 있다.

GALNS는 KS로부터 갈락토스-6-설페이트 및 C6S로부터의 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트의 설페이트 에스터 결합을 가수분해한다. 인간 GALNS는 단지 2개의 잠재적 아스파라긴-연결된 글라이코실화 부위를 갖는 55-60kDa 전구체 단백질로서 발현된다. 만노스-6- 포스페이트(M6P)는 GALNS 분자 상에 존재하는 올리고당의 부분이다. M6P는 리소좀 세포 표면에서 수용체에 의해 인식되고, 결과적으로 GALNS의 효율적 섭취에 결정적이다.

모든 설파타제와 같이, GALNS는 활성을 얻기 위하여 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 유전자에 의해 암호화되는 포밀글라이신-활성화 효소(FGE)에 의해 처리될 필요가 있다. 이 활성화 단계 때문에, 활성 부위 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 번역 후 변형, 즉 재조합 설파타제의 과발현을 수반하는 것은 낮은 특이적 활성(즉, 활성화된 설파타제 효소와 비활성화된 설파타제 효소의 혼합)을 갖고, 낮은 생성 역가(즉, 비활성화된 설파타제의 분해 및/또는 미분비)를 갖는 설파타제 효소의 생성을 야기할 수 있다.

본 발명의 목적은 효소 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 결핍에 의해 야기되거나 또는 관련된 모르퀴오 증후군 및 다른 질병, 예를 들어 다중 설파타제 결핍증(MSD)의 치료에 유용한 활성의 고도로 인산화된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 효소를 제공하는 것이다. 이러한 활성의 고도로 인산화된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 효소는 KS 및 C6S가 축적되는 조직에 대해 국소화되는 능력을 가지며, 효율적인 흡수를 위한 충분한 M6P 수준을 가지고, 효소 활성에 대한 것에서 충분히 높은 FGly%를 가지고, 상대적으로 높은 생성 수준을 가진다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 방법은 다른 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 아릴설파타제 A(ARSA), 아릴설파타제 B/N-아세틸글루코사민 4-설파타제(ARSB), 이듀로네이트-2-설파타제(IDS), 설파미다제/헤파린-N-설파타제(SGSH) 및 N-아세틸글루코사민-설파타제(G6S)의 생성에 적당한 것으로 이해되어야 하며, 이것들은 이것의 결핍에 의해 야기되거나 또는 결핍을 특징으로 하는 리소좀 저장 질병의 치료에 유용하다.

VI. 약제학적 조성물 및 투여

본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 경구 제제에 대해, 리소좀 설파타제 효소는 단독으로 또는 적절한 첨가제, 예를 들어 통상적인 첨가제와, 예컨대 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 결합제와, 예컨대 결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 붕해제와, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 또는 카복시메틸셀룰로스나트륨; 윤활제와, 예컨대 탈크 또는 스테아르산 마그네슘; 및 원한다면 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 향미제와 조합하여 사용되어 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만들 수 있다.

본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글라이세라이드, 고차 지방족 산의 에스터 또는 프로필렌 글라이콜 중에서; 원한다면 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장제, 현탁제, 에멀젼화제, 안정제 및 보존제와 함께 그것들을 용해시키고, 현탁시키거나 또는 에멀젼화 함으로써 주사용 제제로 조제될 수 있다.

본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 조제물 중에 이용될 수 있다. 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 가압된 허용가능한 추진제, 예컨대 다이클로로다이플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 조제될 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 에멀젼화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 함께 혼합됨으로써 좌약으로 만들어질 수 있다. 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 좌약을 통해 직장에 투여될 수 있다. 좌약은 체온에서는 용융되지만 실온에서는 고형화되는 비히클, 예컨대 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글라이콜을 포함할 수 있다.

경구 또는 직장 투여를 위한 본 발명의 리소좀 설파타제 효소의 단위 제형, 예컨대 시럽, 엘릭시르 및 현탁액이 제공될 수 있되, 각각의 제형, 예를 들어 티스푼, 테이블스푼, 정제 또는 좌약은 사전결정된 양의 활성제를 함유하는 리소좀 설파타제 효소를 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 제형은 멸균수 내 용액으로서 리소좀 설파타제 효소, 생리 식염수 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

실제 사용에서, 본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 통상적인 약제학적 화합물 기법에 따라 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 와의 본질적인 혼합에서 활성 성분으로서 합쳐질 수 있다. 담체, 희석제 또는 부형제는 투여, 예를 들어 경구 또는 비경구(정맥주사를 포함)에 요망되는 제제의 바람직한 형태에 의존하여 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 제형을 위한 리소좀 설파타제 효소 조성물의 제조에서, 보통의 약제학적 수단 중 어떤 것, 예컨대 경구 액체 제제, 예를 들어 현탁액, 엘릭시르 및 용액의 경우에 물, 글라이콜, 오일, 알코올, 향미제, 보존제, 착색제 등; 또는 경구 고체 제제, 예를 들어 분말, 경질 및 연질 캡슐 및 정제의 경우에 담체, 예컨대 전분, 당, 미정질셀룰로스, 희석제, 과립제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등이 사용될 수 있으며, 고체 경루 제제가 액체 제제보다 바람직하다.

본 발명은 선택적으로 약 0.1 내지 5㎎/㎖(또는 0.5 내지 1.5㎎/㎖) 단백질의 농에서, 및 선택적으로 (i) 상기 GALNS 효소의 탈인산화를 감소시키기에 효과적인 인산염 완충제의 양; 및 (ii) 아미노산 염, 아미노산 완충제, 계면활성제 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안정제의 안정량을 포함하는 약 5-5.8의 pH에서 본 명세서에 기재된 GALNS 효소 중 어떤 것의 조제물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조제물은 제2 완충제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조제물은 본 명세서에 기재된 정제된 재조합 인간 GALNS 효소 제제, 약 25mM 내지 약 75mM의 농도에서 인산염 완충제, 약 1OmM 내지 약 30mM의 농도에서 아세테이트 완충제, 및 단백질 응집을 감소시키는 안정제 중 어떤 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조제물은 아르기닌 또는 히스티딘 염 또는 완충제, 및 선택적으로 비이온성 계면활성제, 및 선택적으로 3가의 또는 더 고차의 폴리올(당 알코올)을 포함한다. 특이적 실시형태에서, 조제물은 아르기닌 염 또는 완충제, 폴리솔베이트, 선택적으로 폴리솔베이트 20 및 솔비톨을 포함한다. 이들 실시형태 중 어떤 것에서, 인산염 완충제는 NaH₂PO₄일 수 있다. 이들 실시형태 중 어떤 것에서, 아세테이트 완충제는 NaOAc/HOAc일 수 있다.

제2 완충제는 원하는 범위 내에서 pH를 유지하기에 적합한 임의의 작용제일 수 있다. 적합한 완충제는 Tris, 시트레이트, 숙시네이트, 아세테이트, 글루코네이트 또는 다른 유기산 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안정제는 아미노산 염 또는 완충제, 선택적으로 아르기닌, 리신, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 또는 글루탐산의 염 또는 완충제이다. 일부 실시형태에서, 안정제는 계면활성제, 선택적으로 비이온성 계면활성제이다. 적합한 계면활성제는 폴리솔베이트, 예를 들어 폴리솔베이트 20 또는 폴리솔베이트 80, 폴록사머, 예를 들어 폴록사머 188 또는 184, 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시프로필렌 유도체, 모노라우릴산나트륨 및 SDS를 포함한다. 공지된 비이온성 계면활성제의 비제한적 예는 지방족, 1차 또는 2차 선형 또는 분지형 사슬 알코올 또는 페놀을 알킬렌 옥사이드, 일반적으로 에틸렌 옥사이드 및 일반적으로 6-30 에틸렌 옥사이드 기와 함께 포함한다. 다른 공지된 비이온성 계면활성제는 모노- 또는 다이-알킬 알카놀아마이드, 알킬 폴리글루코사이드 및 폴리하이드록시 지방산 아마이드를 포함한다. 공지된 음이온성 계면활성제의 비제한적 예는 알킬 설페이트, 알킬 에터 설페이트, 알카릴 설포네이트, 알킬 숙시네이트, 알킬 설포숙시네이트, N-알코일 사르코시네이트, 알킬 포스페이트, 알킬 에터 포스페이트, 알킬 에터 카복실레이트 및 α-올레핀 설포네이트의 나트륨, 암모늄 및 모노-, 다이- 및 트라이-에탄올아민 염을 포함한다. 알킬 기는 일반적으로 8 내지 18개의 탄소 원자를 함유할 수 있고 비치환될 수 있다. 알킬 에터 설페이트, 알킬 에터 포스페이트 및 알킬 에터 카복실레이트는 분자당 1 내지 10개의 에틸렌 옥사이드 또는 프로필렌 옥사이드 단위를 함유할 수 있고, 바람직하게는 분자당 2 내지 3개의 에틸렌 옥사이드 단위를 함유한다. 공지된 음이온성 계면활성제는 황산나트륨 또는 라우릴 황산암모늄 및 라우릴에터황산나트륨 또는 라우릴에터황산암모늄을 포함한다. 알려진 양쪽성 계면활성제의 비제한적 예는 알킬 아민 옥사이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도프로필 베타인, 알킬 설포베타인, 알킬 글라이시네이트, 알킬 카복시글라이시네이트, 알킬 암포프로피오네이트, 알킬 아미도프로필하이드록시술타인, 아실 타우레이트 및 아실 글루타메이트를 포함하되, 알킬 및 아실 기는 8 내지 18개의 탄소 원자를 가진다.

일부 실시형태에서, 안정제는 폴리올 또는 당, 바람직하게는 3가 또는 더 고차의 당 알코올이다. 적합한 폴리올은 에리트리톨, 아라비톨, 말티톨, 셀로비톨, 락티톨, 만니톨, 트레이톨, 솔비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글라이세롤 및 글라이세린을 포함한다. 공지된 폴리올은 또한 락토스, 트레할로스 및 스타키오스로부터 유래된 알코올을 포함한다. 공지된 비환원성 당은 수크로스, 트레할로스, 솔보스, 멜레지토스 및 라피노스를 포함한다. 공지된 당은 또한 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스, 삼당류, 예컨대 라피노스, 및 다당류, 예컨대 덱스트란을 포함한다.

본 발명은 또한 상기 GALNS 효소와 탈인산화를 감소시키는데 유효한 인산염 완충제의 양을 선택적으로 약 25mM 내지 약 75mM 인산염 완충제의 최종 농도로 혼합하는 단계를 포함하는, 정제된 재조합 인간 GALNS 효소의 탈인산화를 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 정제된 재조합 인간 GALNS 효소는 또한 상기 기재한 어떤 작용제를 포함하는 제2 완충제와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 해당 효소는 또한 아미노산 염, 아미노산 완충제, 계면활성제 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안정제의 안정화 양과 혼합된다. 대표적인 실시형태에서, 탈인산화의 양은, 예를 들어 실온에서(예를 들어, 25℃) 저장의 1주, 2 주, 3 주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 후 시험될 때, 1mM 인산염 완충제 중의 동일 효소 조제물과 비교하여 감소된다. 특이적 실시형태에서, 가속화된 안정성 시험은 40℃에서 이러한 시간 기간 동안 저장 후 수행된다.

특정 실시형태에서, GALNS 조제물(1mM 인산염 완충제와 비교하여) 내 탈인산화의 감소는 적어도 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50% 또는 초과일 수 있다. 다른 실시형태에서, 조제물 내 GALNS 상의 비스-인산화된 만노스 7(BPM7)의 수준은 약 25% 내지 약 40%, 또는 약 30% 내지 35%이다.

앞서 언급한 조제물 또는 방법의 실시형태에서, GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소일 수 있고, 이는 (i) 비환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고, (ii) 위치 53의 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 적어도도 80% 전환을 지니며, (iii) 모노머 단백질 사슬당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지되, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%의 상기 GALNS 효소는 환원 조건 하에 SDS-PAGE가 실시될 때, 또는 SDS-모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 전구체 형태로 존재한다.

경피 경로의 투여에 대해, 약물의 경피 투여 방법이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, (Gennaro et al., Eds. Mack Publishing Co., 1985)]에 개시된다. 진피 또는 피부 패치는 본 발명의 리소좀 설파타제 효소의 경피 전달을 위한 바람직한 수단이다. 패치는 바람직하게는 리소좀 설파타제 효소의 흡수를 증가시키기 위해 흡수 인핸서, 예컨대 DMSO를 제공한다. 경피 약물 전달을 위한 다른 방법은 미국특허 제5,962,012호, 제6,261,595호 및 제6,261,595호에 개시되며, 이것의 각각은 전문이 참조로 포함된다.

비히클, 보조제, 담체 또는 희석제와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제는 상업적으로 입수가능하다. 게다가, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 등장 조절제, 안정제, 보습제 등이 또한 상업적으로 입수가능하다.

각각의 이들 양태에서, 리소좀 설파타제 효소 조성물은 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로가 치료되는 질환의 중증도 및 활성 성분의 특성에 부분적으로 의존할 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니지만, 경구, 직장, 국소, 비경구(피하, 근육내 및 정맥내를 포함), 폐(비강 또는 구강 흡입) 또는 비강 투여를 포함한다. 대표적인 투여 경로는 경구 및 정맥내 경로이다. 리소좀 설파타제 효소 조성물은 단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있고, 약학분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

그것의 용이한 투여를 위하여, 정제 및 캡슐은 고체 약제학적 담체가 분명히 사용되는 경우에 가장 유리한 경구 제형을 나타낸다. 원한다면, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기법에 의해 코팅될 수 있다. 이들 조성물 내 활성 리소좀 설파타제 효소의 백분율은, 물론 다를 수 있으며, 약 2중량% 내지 약 60중량%의 단위로 편리하게 존재할 수 있다.

본 발명의 리소좀 설파타제 효소 조성물은 바이러스 외피 또는 소포 내에 캡슐화되거나 또는 바이러스 외피 또는 소포에 부착되고, 또는 세포 내에 포함되어 투여될 수 있다. 소포는 보통 구형이며 빈번하게 지방질인 미셀 입자이다. 리포좀은 이중층 막으로부터 형성된 소포이다. 적합한 소포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단층판(unilamellar) 소포 및 다층판(multilamellar) 지질 소포 또는 리포좀을 포함한다. 이러한 소포 및 리포좀은, 예를 들어 미국특허 제4,394,448호에 기재된 것과 같은 표준 기법을 사용하여 넓은 범위의 지질 또는 인지질 화합물, 예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고마이엘린, 당지질, 강글리오사이드 등으로부터 만들어질 수 있다. 이러한 소포 또는 리포좀은 세포 내로 리소좀 설파타제 효소를 투여하고, 리소좀 설파타제 효소를 표적 기관에 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 관심의 리소좀 설파타제 효소의 제어된 방출은 또한 캡슐화를 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어 미국특허 제5,186,941호를 참조).

혈류 내로, 또는 바람직하게는 적어도 혈액-뇌 장벽의 바깥으로 리소좀 설파타제 효소 조성물을 희석시키는 임의의 투여 경로가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 리소좀 설파타제 효소 조성물은 말초적으로, 더 바람직하게는 정맥내로 또는 심장 카테터에 의해 투여된다. 경정맥내 및 경동맥내 주사가 또한 유용하다. 리소좀 설파타제 효소 조성물은 국소로 또는 지역적으로, 예컨대 복막 내로, 피하로 또는 근육 내로 투여될 수 있다. 한 양태에서, 리소좀 설파타제 효소 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 투여된다.

당업자는 용량 수준이 특이적 리소좀 설파타제 효소의 작용, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 피험체의 감수성에 따라 다를 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 주어진 리소좀 설파타제 효소에 대한 바람직한 투약량은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 환자에서, 시험 동물에서 및 시험관 내에서 수행된 용량 반응 및 약동학적 평가를 포함하는 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정가능할 것이다.

투여되는 투약량은 또한 개개의 필요, 원하는 효과, 사용되는 특정 리소좀 설파타제 효소 및 선택된 투여 경로에 의존할 수 있다. 리소좀 설파타제 효소의 투약량은 약 0.2p㏖/㎏ 내지 약 20 n㏖/㎏의 범위에 있으며, 바람직한 투약량은 2p㏖/㎏ 내지 2 n㏖/㎏의 범위에 있고, 특히 바람직한 투약량은 2p㏖/㎏ 내지 200p㏖/㎏의 범위에 있다. 대안적으로, 리소좀 설파타제 효소의 투약량은 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위에 있을 수 있고, 바람직한 투약량은 0.1 내지 100㎎/㎏의 범위에 있을 수 있으며, 특히 바람직한 투약량은 0.1 내지 10㎎/㎏의 범위에 있다. 이들 투약량은, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 특정 리소좀 설파타제 효소, 약제학적 조성물의 형태, 투여 경로 및 특정 리소좀 설파타제 효소의 활성 부위에 의해 영향받을 것이다.

본 발명의 리소좀 설파타제 효소는 동물에서 및 특히 인간에서, 치료적, 예방적 및 진단적 개입에 유용하다. 리소좀 설파타제 효소는 특정 조직 내 우선적인 축적을 나타낼 수 있다. 진단적 사용을 위한 바람직한 의학적 징후는, 예를 들어 관심의 표적 기관(예를 들어, 폐, 간, 신장, 비장)과 관련된 임의의 질환을 포함한다.

대상 방법은 다양한 상이한 질병 상태의 치료에서 용도를 발견한다. 특정 실시형태에서, 원하는 활성을 가지는 리소좀 설파타제 효소가 앞서 확인되었지만, 리소좀 설파타제 효소가 표적 부위, 영역 또는 구획에 적절히 전달되지 않는 질병 상태에서 완전히 만족스러운 치료 결과를 만들기 위한 대상 방법의 사용에 특정 관심이 있다. 이러한 리소좀 설파타제 효소에 의해, 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소를 생성하는 대상 방법은 리소좀 설파타제 효소의 치료 효능 및 치료지수를 향상시키는데 사용될 수 있다.

치료는 질병을 획득할 감소된 가능성, 질병의 방지, 질병의 진행을 늦춤, 정지 또는 반전, 또는 숙주가 걸린 질병 상태와 관련된 증상의 개선을 포함하는 리소좀 설파타제 효소의 투여와 관련된 피험체에 대한 어떤 유리한 결과를 포함하는 것을 의미하며, 여기서 개선 또는 이득은 적어도 변수 규모의 감소, 예를 들어 치료되는 병적 상태와 관련된 증상, 예컨대 염증 및 이와 관련된 통증 규모의 감소를 지칭하는 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병적 상태 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제된, 예를 들어 일어나는 것이 방지되거나 중단된, 예를 들어 종결된 상황을 포함하므로, 숙주는 더 이상 병적 상태에 걸려 있지 않고, 또는 적어도 더 이상 병적 질환을 특징으로 하는 증상에 걸려있지 않다.

다양한 숙주 또는 피험체가 대상 방법에 따라 치료될 수 있다. 일반적으로 이러한 숙주는 "포유류" 또는 "포유동물"이며, 여기서 이들 용어는 육식동물목(예를 들어 개 및 고양이), 쥐목(예를 들어 마우스, 기니아피그 및 래트) 및 영장류(예를 들어 인간, 침팬지 및 원숭이)를 포함하는 포유류 강 내에 있는 유기체를 기재하도록 넓게 사용된다. 다수의 실시형태에서, 숙주는 인간일 것이다.

현재 본 발명에 일반적으로 기재된 바와 같이, 생성을 위한 대표적인 프로토콜 및 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소의 정제 및 리소좀 저장 질병의 치료에서 그것의 사용을 제공하는 다음의 실시예에 대한 다음의 언급을 통해 더 용이하게 이해될 수 있다. 실시예는 단지 예시적 목적을 위하여 제공되며, 어떤 방식으로 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였지만, 물론 일부 실험적 오차 및 편차가 허용되어야 한다.

실시예

실시예 I

인간 설파타제 변형 인자 1( SUMF1 ) 및 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6-설파타제(GALNS)에 대한 포유류 발현 벡터

본 목적은 개선된 인산화 수준을 갖는 활성 리소좀 설파타제 효소의 충분한 양으로 안정하게 트랜스펙션된 세포를 생성하는데 적절한 포유류 발현 벡터를 구성하는 것이다.

374 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 전장 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) cDNA(미국특허출원 20005/0123949, 공개일 2005년 7월 9일 및 미국특허출원 2004/0229250, 공개일 2004년 11월 8일, 둘 다 본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)를 인간 CMV 인핸서-프로모터 및 복수의 클로닝 부위를 함유하는 포유류 발현 벡터cDNA4 (캘리포니아 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 효율적인 전사 종결을 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 존재에 의해 보장하였다. 선별 마커는 EM-7 프로모터 및 SV40 초기 폴리아데닐화 서열의 대조군 하의 제오신 저항 유전자였다. 얻어진 플라스미드를 pcDNA4 SUMF1으로 지정하였다. 인간 SUMF1 폴리뉴클레오타이드(서열번호 1) 및 폴리펩타이드(서열번호2) 서열을 각각 도 1 및 도 2에 나타낸다.

26 아미노산 신호 펩타이드를 포함하는 522 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 전장 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) cDNA(문헌[Tomatsu et al., Biochem . Biophys . Res. Commun. 181(2):677-683, 1991] 참조)를 토끼 β-글로빈 IVS2 인트론에 연결된 인간 CMV 인핸서-프로모터 및 복수의 클로닝 부위를 함유하는 포유류 발현 벡터 pCIN (BioMarin) 내로 클로닝하였다. 효율적인 전자 종결을 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 존재에 의해 보장하였다. 선별 마커 효소 효율성을 감소시키는 점 돌연변이를 운반하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자이었다. 약화된 마커는 약한 HSV-tk 프로모터에 의해 추가로 장애를 가졌다. 얻어진 플라스미드를 pCIN 4A로 지정하였다. 인간 GALNS 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3) 및 폴리펩타이드(서열번호 4) 서열을 도 3 및 도 4에 각각 나타낸다.

SUMF1 및 GALNS의 발현 수준을 증가시키기 위하여, 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(MAR) 구성요소(Mermod 등의 미국특허 제7,129,062호를 참조)를 SUMF1 및 GALNS 발현 플라스미드 내로 클로닝시켰다.

MAR(Selexis)을 채운 P<1_68 X_X NcoI을 BamHI 및 HincII로 분해시칸 다음, 방출된 MAR 단편을 BglII 및 Nrul로 분해시킨 pcDNA4 SUMF1 내로 삽입함으로써 BMAR SUMF1을 만들었다.

EGFP 유전자를 제거하기 위하여 (MAR)SV40 EGFP(Selexis)로 채운 P<1_68 NcoI을 HindIII 및 XbaI로 분해한 다음, HindIII 및 XbaI로 분해에 의해 pcDNA4 SUMF1으로부터 방출된 SUMF1 유전자를 삽입함으로써 PMAR SUMF1을 만들었다.

SUMF1 유전자를 제거하기 위하여 PmeI 및 SpeI로 BMAR SUMF1을 분해시킨 다음, PmeI 및 SpeI로 분해에 의해 pCIN 4A로부터 방출된 GALNS 유전자를 삽입함으로써 함으로써 BMAR 4A를 만들었다.

EGFP 유전자를 제거하기 위하여 (MAR)SV40 EGFP(Selexis)을 채운 P<1_68 NcoI을 HindIII 및 XbaI로 분해시킨 다음, HindIII 및 XbaI로 분해에 의해 pCIN 4A로부터 방출된 GALNS 유전자를 삽입함으로써 PMAR 4A를 만들었다.

전장 인간 GALNS cDNA를 포유류 발현 벡터 pcDNA4(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 내로 클로닝시켰다. pCDNA4 SUMF1를 HindIII 및 XbaI로 분해시켜 SUMF1 cDNA를 제거하였고, pCIN 4A를 HindIII 및 XbaI로 분해시켜 GALNS cDNA를 분리시켰다. GALNS cDNA HindlDZXbaI 단편을 pcDNA4 벡터 HindIII/XbaI 단편에 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드를 pcDNA4-4A로 지정하였다.

pCIN 4A, BMAR 및 pCDNA4-4A 발현 벡터 내 GALNS 유저자의 통합을 New England Biolabs로부터 얻은 효소를 사용하여 제한 맵핑에 의해 확인하였다. PMAR 4A 발현 벡터는 맵핑하지 않았다.

인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 완전히 처리된 형태의 구조를 도 5에 도시한다. GALNS를 26 아미노산 신호 펩타이드 서열을 갖는 522 아미노산 폴리펩타이드로 발현시켰다. 496 아미노산 GALNS 폴리펩타이드를 약 55-60kDa의 분자량을 갖는 효소의 사전-처리(전구체) 형태로 분비시켰다. 활성 GALNS에서, 전구체 또는 완전히 처리된 GALNS 폴리펩타이드의 위치 53(전장 GALNS 폴리펩타이드의 위치 79에 대응)에서 시스테인 잔기를 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)에 의해 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 전환시켰다. 리소좀에서, 완전히 처리된 GALNS 폴리펩타이드의 위치 325 뒤에 GALNS를 절단시켰고, 약 40kDa 및 19kDa의 GALNS 펩타이드 단편을 초래한다. 이들 GALNS 펩타이드는 완전히 처리된 GALNS 폴리펩타이드의 위치 282 및 393에서 시스테인 잔기 사이의 이황화 브릿지에 의해 결합된다. 완전히 처리된 GALNS 폴리펩타이드의 위치 178 및 397에서 2개의 양이온성 N-말단 글라이코실화 부위가 있다. 2 만노스-6- 포스페이트 잔기를 포함하는 비스-인산화된 만노스 7(BPM7)을 N178에서 발견하였지만, N397에서는 아니다.

실시예 II

인간 설파타제 변형 인자 1( SUMF1 ) 및 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6-설파타제(GALNS)를 공동발현시키는 G71S

본 목적은 개선된 인산화 수준을 갖는 활성 리소좀 설파타제 효소를 생성할 수 있는 세포주를 발생시키는 것이다.

G71 세포(Rockford K. Draper)는 CHO-K1(ATCC CCL-61)로부터 직접 유래되었다. G71 세포주는 엔도솜의 산성화에 대해 CHO-K1의 온도-민감성인 돌연변이체이인데, 이는 상승된 온도에서 몇몇 효소에 대해 만노스 잔기 상의 전체 단백질 분비 및 인산화에서 차이를 얻는 것이 관찰되었다(Park et al., Somat . Cell Mol . Genet. 17(2): 137-150, 1991; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984).

2.5% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 겐타마이신 및 암포테리신으로 보충한 BioWhittaker UltraCHO 배지 내 34℃에서 G71 세포를 유지하였다.

단백질 생성을 위한 세포수의 더 용이한 사용을 위하여, 고밀도 무혈청 현탁 배양물에 부착비 의존적, 혈청-의존적 포유류 세포를 적응시키기 위한 프로토콜을 사용하여 부착 G71 세포를 무혈청 성장 배지에 사전-적응시켰고(Sinacore et al., Mol. Biotechnol . 15(3):249-257, 2000), 무혈청 현탁 배양물 적응된 세포주인 G71S를 초래하였다. 대안적으로, 이하에 기재하는 바와 같이 안정하게 트랜스펙션시킨 후 부착 G71 세포를 Sinacore 등에서 약술하는 바와 같이 무혈청 성장 배지에 적응시킬 수 있다.

pcDNA4 SUMF1 + pCIN4 4A, BMAR SUMF1 + BMAR 4A, 또는 PMAR SUMF1 + PMAR 4A 중 하나인 인간 SUMF1 및 인간 GALNS 발현 벡터(실시예 I)의 짝지어진 조합을 항생제-항진균성 용액(100 IU 페니실린, 10㎎ 스트렙토마이신, 25㎍ 암포테리신 B, Cellgro)으로 보충한 배양 배양물 내에서 성장시킨 G71S 세포 내로 Selexis에 의해 기재된 MARtech II 프로토콜에 따라서 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션체 풀을 5% γ-조사된 소태아혈청(FBS, JRH), 200㎍/㎖ G418(AG Scientific) 및 200 ㎍/㎖ Zeocin(Invitrogen)으로 보충한 UltraCHO 배지(Cambrex) 내에서 성장시켰고, 동일 성장 배지 내 96-웰 플레이트 내 희석을 제한함으로써 클로닝시켰다. Cell Screen(Innovatis) 이미징으로 클론 성장을 모니터링하였다. 활성 GALNS에 대해 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 모든 클론을 스크리닝하였다(실시예 IV 참조). 4일의 기간에 걸쳐, GALNS 활성에 대해 효소 포획 활성 ELISA를 1일 당 세포 성장(Vi-Cell, Beckman Coulter)으로 나눔으로써 세포 생산성을 계산하였다.

202 G71S 클론을 만들었고 활성 GALNS에 대해 스크리닝하였다: pcDNA4 SUMF1+ pCIN 4A으로 공동-트랜스펙션시킨 86 클론, BMAR SUMF1 + BMAR 4A로 공동-트랜스펙션시킨 65 클론, 및 PMAR SUMF1 + PMAR 4A로 공동-트랜스펙션시킨 51 클론. 96-웰 조직 배양 플레이트로부터의 고수준의 활성 GALNS를 기반으로 클론을 초기에 선별하였다(도 6a). 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 GALNS 활성을 측정하였고 ng/㎖(y-axis)로 표시하였다. x-축은 SUMF1 및 GALNS 발현에 대해 사용한 3개의 공동-트랜스펙션 조건을 나타낸다: MAR가 없는 hCMV 프로모터, MAR이 있는 hCMV 프로모터 및 MAR이 있는 SV40 프로모터. 각 막대는 각각의 집단으로부터의 단일 클론을 나타낸다. 세포 밀도는 96-웰 클론 스크린에서 설명되지 않았고, 모든 공동-트랜스펙션된 G71S 클론이 이 도면에 표시된 것은 아니다.

G71S 클론을 생성하는 가장 높은 활성 GALNS를 생산성 분석을 위해 선택하였다(도 6b). 매일의 세포 생산성을 pg/세포/일로 측정하였고, GALNS 활성을 해당 날짜에 세포 밀도로 나눔으로써 얻었다. 이 도면은 5x10⁵ 세포/플라스크에서 시딩 후 제4일(96 시간)을 나타낸다. pg/세포/일(y-축)에서 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 GALNS에 대해 클론을 분석하였다. 양성 대조군은 BHK를 발현시키는 GALNS 및 CHO 클론(BioMarin)으로 이루어졌다. 각각의 수직 막대는 단일 클론을 표시한다. 활성 GALNS는 pCIN 4A 크론에 의해 생성되었지만, 단지 미미하게 분석 배경 이상이었다.

96-웰 스크린 및 4-일 생산성 분석에 의한 클론 분석은, 발현 벡터와 MAR 구성요소의 공동 트랜스펙션이 MAR 구성요소가 없는 발현벡터의 공동-트랜스펙션과 비교하여 G71S 클론의 생산성을 증가시킨다는 것을 증명하였다. BMAR 4A + BMAR SUMF1 공동-트랜스펙션된 클론은 빠른 풀 생성, 빠른 클론 성장 및 가장 큰 PMAR 4A 클론의 생성보다 2배 더 크게 활성인 GALNS를 생성하는 능력 및 CHO 4A 및 MAR 구성요소가 없는 BHK 4A를 넘어서 10배까지의 증가를 증명하였다.

GALNS 발현 G71S 클론은 문헌[Sinacore et al., Mol . Biotechnol . 15(3):249-257, 2000]에 약술된 프로토콜을 사용하여 무혈청 성장 배지에 적합하였다. 전체 적응을 선별 작용제 둘 다(200 ㎍/㎖에서 제오신 및 200 ㎍/㎖에서 네오마이신)의 존재에서 행하였다. T-플라스크 내에서 배양시킨 GALNS 발현 G71 클론을 다음과 같이 분할시켰다: (1) Cambrex UltraCHO 배지 및 5% FBS(로트 # 8L2242)와 함께 125㎖ 진탕기; (2) JRH 302M 배지(생성 배지) 및 5% FBS로 125㎖ 진탕기; 및 (3)예비로서 T-플라스크(UltraCHO, 5% FBS). 일단 현탁 배양물이 확립되면, 부착 세포를 폐기하였고, FBS로부터의 이유(weaning)를 시작하였다. 3회의 통과 동안 성장 속도가 0.5(1/일) 초과로 되돌아오고, 생존력이 95% 초과가 될 때, FBS 농도는 50%로 감소되었다. 세포는 최소 3회 통과 동안 임의의 주어진 FBS 농도로 남아있었다. 일단 2.5% FBS 내 성장에 적합하게 되면, 세포를 무혈청 배지 내로 직접 취하였다. 세포를 10%(v/v) DMSO와 함께 신선한 배지 내에 저장하였다. 냉동 과정동안 세포가 생존해 있다는 것을 보장하기 위하여 실험 해동을 시험하였다. BMAR 4A + BMAR SUMF1 트랜스펙션으로부터의 2개의 GALNS 발현 G71S 클론, 즉 클론 4 및 5는 무혈청 현탁 배양물에 적응을 위해 대략 15회 통과시켰다. pcDNA4 SUMF1 + pCIN 4A 트랜스펙션으로부터의 GALNS 발현 클론인 C6을 분리시켰고, 무혈청 배양물에 적응시켰다.

선별을 위해 200㎍/㎖ Zeocin(Invitrogen)을 사용한 것을 제외하고 기본적으로 상기 기재한 바와 같이, 인간 SUMF1과 인간 GALNS 발현 벡터의 짝지어진 조합(실시예 I), pcDNA4 SUMF1 + pCDNA4-4A을 G71S 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 6가지의 GALNS 발현 클론, C2, C5, C7, C10, C11 및 C30을 분리시켰고, 기본적으로 상기 기재한 바와 같이 무혈청 현탁 배양물에 적응시켰다.

실시예 III

G71S 세포주 발현 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 대규모 배양물

목적은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 발현시키는 G71S 클론으로부터의 효소 생성을 측정하는 것이다. 인간 SUMF1 및 인간 GALNS를 공동발현시키는 G71S 세포주에 적합한 무혈청 현탁 배양물을 대규모로 배양시켰고, 활성 GALNS 효소에 대해 평가하였다.

무혈청 현탁 배양물에 대한 적응은 G71S 숙주 세포주에 대해 상대적으로 빠르기 때문에, 관류 방식으로 작동된 WAVE 바이오리액터에서 생성이 행해질 수 있었다. 정률증가가 백 내에서 직접 행해질 수 있기 때문에 WAVE 바이오리액터는 접종물 용적에서 더 큰 유연성을 허용하였고, 이는 오염 위험을 감소시키며, 물질의 생성을 더 신속히 처리하였다. 도 7은 WAVE 바이오리액터 설정의 구성도를 도시한다. 다이어그램은 백의 중량을 결정하고 요망되는 용적을 유지하기 위하여 공급 및 채취 속도를 조절함으로써 백 내 배지 용적을 로딩 세포가 모니터링하는 관류 방식으로 나타낸다. 10ℓ 백에서, 또한 백 내에 삽입된 프로브에 의해 원하는 설정 지점으로 pH를 조절한다.

GALNS 발현 G71S 클론 4 및 5로부터 물질을 1ℓ 규모로 생성하였다. 배양물 pH를 이들 실행으로 조절하였다. WAVE 백의 작업 한계는 1일당 3개의 용기 용적(VV/일)의 처리량(throughput)이다. 물질의 임의의 불활성화를 방지하기 위하여, 표적 세포 특이적 관류 속도(cell specific perfusion rate, CSPR)는 0.3nl/세포/일이었고, 이는 GALNS 효소에 대해 8시간의 평균 체류 시간을 초래하였다. 따라서, 백 내의 세포 밀도는 대략 10-12 x 1O⁶ 세포/㎖로 유지되었다. GALNS 발현 G71S 클론 4 및 5에 대한 성장 속도는 각각 0.16 및 0.20이었다. 표적 세포 밀도를 유지하기 위한 출혈을 백으로부터 직접 행하였다.

GALNS가 pH 6으로 안정한 것으로 나타난 이후로, 채취 유체 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하여 효소 활성을 유지하였다. 반응기를 벗어난 채취와 연계되도록 혼합된 pH 4.0 시트르산나트륨 완충제의 5용적%의 일정시간 볼루스 첨가로 이것을 수행하였다. 조절된 채취 유체를 하류 처리 전 4℃에서 저장하였다. 2개의 GALNS 발현 G71S 클론 4 및 5는 약 1.25 pg/세포/일의 관련된 특이적 생산성을 갖는 약 4.2㎎/ℓ의 역가를 평균하였다.

GALNS 발현 G71S 클론, C2, C5, C6, C7, C10, C11 및 C30을 유사하게 대규모로 배양시켰고, 활성 GALNS 효소 생성에 대해 평가하였다.

실시예 IV

인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 농도 및 활성의 측정

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 진행하여 인간 SUMF1 및 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 공동 발현시키는 G71S 클론으로부터의 GALNS 효소 농도 및 활성을 측정하였다.

효소 포획 활성 ELISA

효소 포획 활성 ELISA로 고체상 내 GALNS 효소의 활성을 측정한 다음, ELISA 플레이트에 결합된 항-GALNS 특이적 항체에 의한 포획을 측정하였다.

완충제. 완충제 A(탄산염 완충제): 900㎖의 탈이온(DI) H₂0 중에서 3.09 그램의 Na₂C0₃ 및 5.88 그램의 NaHC0₃을 용해시킨 다음, 1000㎖의 최종 용적으로 DI H₂0를 첨가하였다. pH가 9.4와 9.6 사이에 있다는 것을 확인한 다음, 여과 멸균시킨다. 웰 당 100㎕로 하나의 96-웰 마이크로플레이트를 완전히 코팅하기 위하여 19㎕의 항-GALNS 항체를 하나의 튜브(12㎖) 내로 희석시킨다. 완충제 B(ELISA Blocking 완충제 및 연속 희석 완충제): 1x 산성 PBS, 0.05% Tween-20 및 2% BSA, 아세트산으로 pH를 6.5로 조절하였다. 완충제 B^w(세척 완충제): 100mM NaOAc 및 0.05% Tween-20, 아세트산으로 pH를 6.5로 조절하였다. 완충제 C(기질 완충제): 25mM 아세트산나트륨, 1mM NaCl, 0.5㎎/㎖ 탈염 BSA 및 0.01% 아지드화 나트륨, 빙초 아세트산으로 pH를 4.0으로 조절하였다. 완충제 D(β-갈락토시다제 완충제): 300mM 제2인산나트륨, 0.1㎎/㎖ BSA, 0.01% 아지드화 나트륨 및 0.01% Tween-20, 인산으로 pH를 7.2로 조절하였다. 완충제 E(정지 완충제): 350mM 글라이신 및 440mM 탄산염 완충제, 6M NaOH로 pH를 10.7로 조절하였다.

시약. 항-GALNS IgG 항체: 다클론성 토끼 항체는 혈청으로부터 정제한 단백질 G이다. D-PBS에서, 전체 단백질=3.17㎎/㎖(BCA). 알리쿼트(aliquot)(19㎕)를 각 1회 사용을 위해 -20℃에서 저장한다. 4MU-Gal-6-S 기질(고체; 440 MW): 저장액을 100mM 탈이온수 중에서 제조하고 4℃에서 저장한다. β-갈락토시다제(Sigma G-4155): 사용 전 완충제 D 중에서 12 ㎍/㎖로 희석.

프로토콜: 플레이트에 항-GALNS 항체의 결합: Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트 (Nalge/Nunc International, Fisher # 12-565-135)를 완충제 A 중의 5㎍/㎖의 최종 단백질 농도에서 항-GALNS 항체로 코팅한다. 이 용액을 제조하기 위하여, 19㎕ 알리쿼트를 해동시키고, 간단히(10초) 마이크로원심분리기 내에서 교반시켜 액체를 수집하였다. 모두 19㎕를 12㎖의 완충제 A 내로 이동시킨다. 반전에 의해 격렬하게 혼합시킨 다음 저장소에 부은 후, 다채널 피펫터를 사용하여 플레이트 로딩(웰 당 100㎕)하였다. 플레이트를 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 미결합 항-GALNS 항체의 제거: 완충제 B^w로 3회 잠기게 함으로써 플레이트를 세척하였다. 차단: 완충제 B(웰 당 320㎕)로 플레이트를 차단한 다음, 플레이트를 덮고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 단계 동안 정제된 GALNS 표준 및 시험 샘플(미제시)의 연속 희석물을 제조: 분석의 선형 범위의 높은 쪽 끝에 대해 표준을 완충제 B 중에서 희석시킨 다음(A행에서 128ng/㎖), 96-웰 플레이트 상의 B-G행에서 연속적으로 희석시켰다(2-배). 레인 H는 완충제 블랭크이다(즉, GALNS 효소 없음). 우선, 완충제 B 중의 128ng/㎖에서 500㎕의 농도로 제조한다. 그 다음에, 2 ng/㎖에 도달할 때까지 완충제 B중에서 2-배 연속 희석시킨다(250㎕에서 250㎕로). 차단 완충제를 제거: 차단 단계 후, 완충제 B를 버린다. GALNS 효소 표준과 시험 샘플을 항-GALNS 항체에 결합시킴: 100㎕/웰의 연속 희석된 표준 및 시험 샘플을 함께 플레이트에 로딩하였다(2회 실행). 플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. GALNS 억제제를 제거: 완충제 B^w로 3회 잠기게 함으로써 플레이트를 세척하였다. GALNS 기질을 첨가(제1 반응): 웰 당 100㎕ 로딩을 위해 충분한 최종 기질 용액을 제조한다(사용 전 1시간 이하에 제조). 완충제 C 내에서 4MU-Gal-6-S 저장 용액(100mM)을 1mM로 희석시킨다. 웰 당 100㎕를 로딩한다. 플레이트를 덮고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. β-갈락토시다제(제2 반응)를 첨가: 각 웰에 완충제 D 중에서 50㎕의 12㎍/㎖ β-갈락토시다제를 첨가한다. 플레이트를 덮고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. 반응 중단: 각 웰에 100㎕의 완충제 E(정지 완충제)를 첨가하여 방출된 4MU를 이온화시킨다. 플루오로플레이트에 전달: 검정색의 미처리 넓적 바닥 마이크로타이터 플레이트(Fluoroplate, Costar #3915)에 ELISA 플레이트의 각 웰로부터 250㎕ 중 200㎕의 전달(한 번에 8개 웰). 형광 판독: SOFTmax PRO 프로그램(366 ㎚ 여기, 446㎚ 방출, 435㎚ 컷오프)을 사용하여 Gemini plate 판독기(Molecular Devices Corporation)에서 플레이트를 판독한다.

GALNS ELISA

GALNS ELISA로 샌드위치 면역분석을 사용하는 세포 배양 조건화된 배지 내 GALNS 효소 또는 다른 처리의 샘플의 농도를 측정하였다.

완충제. 완충제 A(탄산염 완충제): 900㎖의 탈이온(DI) H₂0 중에서 3.09 그램의 Na₂C0₃ 및 5.88 그램의 NaHC0₃을 용해시킨 다음, 1000㎖의 최종 용적으로 DI H₂0를 첨가하였다. pH가 9.4 내지 9.6이 되는 것을 확인한 다음, 여과-멸균시켰다. 웰 당 100㎕로 하나의 96-웰 마이크로플레이트를 완전히 코팅하기 위하여 19㎕의 항-GALNS 항체를 하나의 튜브(12㎖) 내로 희석시킨다. 완충제 B(ELISA Blocking 완충제 및 연속 희석 완충제): 1x 산성 PBS, 0.05% Tween-20 및 2% BSA, 아세트산으로 pH를 6.5로 조절하였다. 완충제 B^w(세척 완충제): 100mM NaOAc 및 0.05% Tween-20, 아세트산으로 pH를 6.5로 조절하였다. 완충제 F(정지 완충제): 2N H₂S0₄: 100㎖의 12N H₂S0₄ 및 500㎖ MilliQ 워터를 전체 600㎖로 첨가하였다.

시약. 항-GALNS IgG 항체: 토끼 다클론성 항체는 혈청으로부터 정제한 단백질 G이다. D-PBS에서, 전체 단백질=3.17㎎/㎖(BCA). 알리쿼트(19㎕)를 각 1회 사용을 위해 -20℃에서 저장한다. HRP-컨쥬게이트된 검출 항체(RIVAH): 최종 컨쥬게이트된 항체를 D-PBS/1 BSA 내로 1:100으로 희석시키고, 1회 사용을 위해 -20℃에서120 알리쿼트 중에 저장시켰다. TMB EIA 기질 키트(BioRad #172-1067).

프로토콜: 플레이트에 항-GALNS 항체의 결합: Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트 (Nalge/Nunc International, Fisher # 12-565-135)를 완충제 A 중의 5㎍/㎖의 최종 단백질 농도에서 항-GALNS 항체로 코팅한다. 이 용액을 제조하기 위하여, 19㎕ 알리쿼트를 해동시키고, 간단히(10초) 마이크로원심분리기 내에서 교반시켜 액체를 수집하였다. 모두 19㎕를 12㎖의 완충제 A 내로 이동시킨다. 반전에 의해 격렬하게 혼합시킨 다음 저장소에 부은 후, 다채널 피펫터를 사용하여 플레이트 로딩(웰 당 100㎕)하였다. 플레이트를 덮고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다(컨벡션 인큐베이터). 열 차단을 사용하지 않는다. 미결합 항-GALNS 항체의 제거: 완충제 B^w로 3회 잠기게 함으로써 플레이트를 세척하였다. 차단: 완충제 B(웰 당 320㎕)로 플레이트를 차단한 다음, 플레이트를 덮고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 단계 동안 정제된 GALNS 표준 및 시험 샘플(미제시)의 연속 희석물을 제조: 분석의 선형 범위의 높은 쪽 끝에 대해 표준을 완충제 B 중에서 희석시킨 다음(A행에서 40ng/㎖), 96-웰 플레이트 상의 B-G 행에서 연속적으로 희석시켰다(2-배). 레인 H는 완충제 블랭크이다(즉, GALNS 효소 없음). 우선, 완충제 B 중의 40ng/㎖에서 500㎕의 농도로 제조한다. 그 다음에, 0.625ng/㎖에 도달할 때까지 완충제 B 중에서 2-배 연속 희석시킨다(250㎕에서 250㎕로). 차단 완충제를 제거: 차단 단계 후, 완충제 B를 버린다. GALNS 효소 표준과 시험 샘플을 항-GALNS 항체에 결합시킴: 100㎕/웰의 연속 희석된 표준 및 시험 샘플을 함께 플레이트에 로딩하였다(2회 실행). 플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척: 완충제 B^w로 3회 잠기게 함으로써 플레이트를 세척하였다. 검출 항체 컨쥬게이트에 결합: 항체 RIVAH의 한 알리쿼트(120㎕)를 해동시키고 마이크로원심분리기 내에서 간단히(10초) 교반시켜 액체를 수집하였다. 모두 120㎕를 11.9㎖ 완충제 B로 희석시켰고, 튜브 내로 격렬하게 반전시켜 혼합하였다. 저장소 내에 부었고 다채널 피펫터에 의해 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세척: 완충제 B^w로 3회 잠기게 함으로써 플레이트를 세척하였다. TMB 기질: 1.2㎖의 용액 B를 10.8㎖의 용액 A와 혼합함으로써 최종 기질 용액을 제조하였다. 저장소 내로 부었고 다채널 피펫터에 의해 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 정지 용액: Pipette 12㎖의 2N H₂SO₄ 정지 용액을 저장소 내로 피펫팅하고 다채널 피펫터에 의해 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 혼합을 위해 부드럽게 두드렸다. 판독 A450: 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독한다.

GALNS 특이적 활성 분석

GALNS 특이적 활성 분석으로 GALNS-특이적 기질을 사용하는 용액 내 GALNS의 효소 활성을 측정한다.

완충제. 모든 완충제에 대해 MilliQ H₂0를 사용한다. 희석 완충제(DB): 1ℓ의 DB에 대해 1.74㎖ 아세트산, 0.75 g 아세트산나트륨, 233.6㎎ NaCl, 2㎖의 50% Tween-20 및 10㎖의 1% 아지드화 나트륨을 MilliQ H₂0 내로 용해시키고, pH가 3.95 미만이라면 0.1M NaOH로, pH가 4.05 초과라면 0.1M 아세트산으로 pH를 4.0 +/- 0.5으로 조절하였다. 최종 농도: 19.5mM 아세트산, 5.5mM 아세트산나트륨, 1mM NaCl, 0.1% Tween-20 및 0.01% 아지드화 나트륨. 인산염 완충제(PB): 1ℓ PB에 대해, MilliQ H₂0 중에서 13.9 g NaH₂PO₄-H₂0 및 55g NaHPO₄-7H₂0를 용해시키고, pH를 7.2로 조절한다. 최종 농도는 300mM NaPi이다. 정지 완충제(SB): 1ℓ SB에 대해, MilliQ H₂0 중에서 26.2 g 글라이신 및 46.6 g 탄산나트륨을 용해시켰고, NaOH에 의해 pH를 10.6으로 조절하였다. 분석 완충제(AB): DB(최종 2mM) 중에서 4MU-Gal-6S 저장액 1:50을 희석시켰다. β-갈락토시다제 완충제(βGB): 300mM NaPi 중에서 25㎍/㎖ β-갈락토시다제, pH 7.2.

시약. 4MU-Gal-6S: H₂0 중의 100mM(Toronto Research Chemicals Cat. # M334480). β-갈락토시다제: Sigma G-4155. 4-메틸움벨리페론(4MU 표준): Sigma M-1381 (DMSO 중의 10mM).

프로토콜. GALNS 효소의 연속 희석을 수행. 정제 및 조제된 GALNS(~1.5㎎/㎖)를 위해, 샘플을 1:1 연속 희석 전 DB를 함유하는 저 단백질 부착 마이크로원심분리 튜브(USA Scientific Cat#1415-2600) 내에서 샘플 1:10,000으로 희석시킨다.저 단백질-결합 96-웰 플레이트 내에 100㎕의 DB를 둔다. 제1 행에서, 100㎕의 GALNS 샘플을 피펫팅한다. 이제 플레이트(96-웰 플레이트 상에서 A-G)를 연속적으로 희석시킨다(1:1). 웰(H)에 어떤 샘플도 첨가하지 않았다(블랭크). 이 분석의 선형 범위는 1-75ng/㎖이다. 4MU 표준 곡선을 제조하기 위해 동일 과정을 사용한다. DB 내 DMSO 1:100중에서 10mM 4MU를 희석시켰다. 제1 웰 내에서 50μM 4MU의 50㎕를 첨가함으로써 4MU 표준 곡선을 시작한 다음, 연속적으로 희석시켰다. AB(DB 중의 2mM 4MU-갈락토스-6S) 중에서 희석시킨 기질의 50㎕를 96-웰 형광 플레이트에 첨가한다. 37℃에서 10분 동안 기질을 사전인큐베이션시킨다. 100㎕의 GALNS 및 4MU 연속희석물 중 50㎕를 AB 내 기질의 50㎕에 첨가한다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고(이런 제1 반응은 기질로부터 설페이트를 제거한다), 제1 반응을 퀀칭하며, 50㎕의 β-갈락토시다제의 첨가로 제2 반응을 시작한다(βGB 중에서 25 ㎍/㎖로 β-갈락토시다제 저장액을 희석시킴). 인산염은 GALNS를 억제하며, pH의 증가는 또한 GALNS 반응을 정지시킨다. 얻어진 pH는 현재 β-갈락토시다제의 최적 pH 범위에 있다. 37℃에서 15분 동안 이런 제2 반응을 인큐베이션한다. 100㎕ SB의 첨가로 4MU를 이온화 방출시켰다. 96-웰 형광 플레이트 판독기 상에서 Ex355 Em460을 판독한다. 효소 활성 계산(pH 4.0 완충제에서 37℃): 1 단위 = μ㏖ 4MU 방출/분; 활성 = μ㏖ 4MU/분/㎖; 특이적 활성 = μ㏖ 4MU/분/㎎. 단백질 농도 계산: GALNS의 사용 흡광계수(280nm에서 1㎎/㎖ = 1.708 흡광도).

실시예 V

인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 정제

본 목적은 다량의 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 얻는 것이다. 인간 SUMF1 및 인간 GALNS를 공동발현시키는 안정하게 트랜스펙션된 G71 세포를 바이오리액터 배양 조건 하에 성장시켰고, 활성 GALNS 효소를 세포 배지로부터 정제하였다.

액체 크로마토그래피 장치. Unicorn 제어 소프트웨어를 이용하는 Amersham Pharmacia Biotech AKTA 익스플로러 900 시스템.

단백질 분석 방법. SDS-PAGE, 쿠마씨 블루 염색(B101-02-COOM), 웨스턴 블롯팅 및 Bradford 단백질 분석을 위해 표준 방법을 따랐다. 활성 수율을 평가하기 위하여 정제 실행을 평가하였고, GALNS 생성물의 순도를 SDS-PAGE에 의해 시각적으로 평가하였다. 처리된 불순물의 존재를 항-GALNS 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다. Bradford 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 최종 정제된 GALNS 단백질의 농도를 1.708의 흡광계수를 사용하여 A₂₈₀ 측정으로 측정하였다.

크로마토그래피 수지. 블루 세파로스 6 FF(GE Healthcare, 로트 #306346) 및 프락토겔 SE Hi-Cap(Merck KgaA, FC040894449).

GALNS 효소 활성 결정. 소 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-6-S-GAL(4-MU-6-S-GAL)을 사용하여 GALNS 특이적 활성을 결정하였다. GALNS 특이적 활성은 2-단계 반응을 수반하되, β-갈락토시다제의 첨가는 형광 태그를 방출하기 위해 특정 시간 동안 기질과 함께 GALNS의 인큐베이션 후 필요하다. 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정을 하였다.

10DG 탈염 칼럼(Bio-RAD)을 평형 완충제(EQB, 50mM NaOAc, 10mM NaCl, pH 5.8)로 평형화시켰다. MilliQ H₂0를 모든 완충제에 대해 사용하였다. 삼(3)㎖의 정제된 GALNS(0.5-2㎎/㎖)를 탈염 칼럼 상에 로딩하였고, 용리시켰으며, EQB를 사용하여 별개의 테스트 튜브 내에 4㎖ 알리쿼트로 수집하였다. GALNS의 흡광계수를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다(280㎚에서 1㎎/㎖ = 1.708 흡광도 단위).

탈염 GALNS 샘플을 희석 완충제(DB, 50mM NaOAc, 1mM NaCl, pH 4.0 + 0.5㎎/㎖ BSA) 중에서 연속적으로 희석시켰다(1:1). BSA 저장액을 탈염시킨 후 milliQ H₂0로 사전에 평형화시킨 G25 칼럼 상에 50㎎/㎖ BSA 저장액(5% 이하 CV)을 로딩함으로써 사용하였다. 100㎕의 탈염 GALNS 샘플을 저 단백질 결합 96-웰 플레이트의 제1 행에 피펫팅하였고, 연속적으로 희석시킨 GALNS 샘플을 플레이트(96-웰 플레이트 상의 A-G행) 아래로 피펫팅하였다. 100㎕의 DB를 마지막 웰(H) 내로 피펫팅하였다. 이 분석의 선형 범위의 상단은 200 ng/㎖이며, 선형 범위는 3-200 ng/㎖이다. 4-메틸움벨리페론(4MU)(Sigma M-1381, DMSO 중의 10mM 저장액)으로 표준 곡선을 제조하기 위해 동일 과정을 수행하였다. GALNS 및 4MU의 100㎕의 연속 희석물 중의 50㎕를 새로운 96-웰 형광 플레이트(검정색 바닥 플레이트)에 전달하였다. 50㎕의 2mM 4MU-갈락토스-6S(milliQ H₂0)를 분석되는 샘플에 첨가하였고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이런 제1 반응을 퀀칭시켰고, 제2 반응을 50㎕의 β-갈락토시다제(Sigma G- 4155, 300mM NaPi 중에서 12㎍/㎖로 희석된 저장액, pH 7.2)의 첨가로 개시하였으며, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100㎕의 정지 완충제(글라이신/탄산염, pH 10.6)을 첨가함으로써 방출된 4MU를 이온화시켰다. 플레이트를 96-웰 형광 플레이트 판독기(여기 355㎚, 방출 460㎚)에서 판독하였다. 1 단위를 1 μ㏖ 4MU 방출/분으로 정의하였고, 효소 활성은 μ㏖ 4MU/분/㎖로 제공하였으며, 특이적 활성은 모두 37℃에서 pH 4.0 완충제 중에서 μ㏖ 4MU/분/㎎로 제공된다.

제1 정제 과정. 제1 정제 과정은 초미세여과 (UF) 단계 후 2-칼럼 정제 과정을 포함한다.

1. 채취 여과(Harvest Filtration, HF): 바이오리액터 물질을 0.2㎛ 멸균여과시켰다.

2. 초미세여과(UF): 바이오리액터 물질을 30 kD Sartocon 막을 통해 초미세여과에 의해 10-20X로 농축시켰다.

3. pH 4.5 조절: 농축된 바이오리액터 물질(UF (20X))을 실온에서 pH 조절 완충제(1.75M NaOAc, pH 4.0)로 pH를 4.5로 조절하였고, 멸균 여과 시킨 후 블루 세파로스 칼럼에 로딩하였다.

4. 블루 세파로스 6 속성 유동(Fast Flow, FF): pH 4.5 조절 UF(20X)를 블루 세파로스 칼럼 상에 로딩하였고, GALNS 단백질을 표 1 및 도 9a에 표시된 바와 같이 용리시켰다.

블루 세파로스 6 속성 유동 크로마토그래피
단계	CV ^*	완충제
평형	5	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 4.5
로딩		UF 생성물, pH4.5로 조절, 여과됨
세척 1	4	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 4.5
세척 2	8	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 6.0
용리	8	20mM 아세테이트/인산염, 100mM NaCl, pH 7.0
스트립	5	20mM 아세테이트/인산염, 1M NaCl, pH 7.0
위생처리	4	0.1N NaOH, 0.5시간
재생	5	H₂O
저장	3	20% ETOH
*CV: 칼럼 용적. 유속=92㎝ hr^-1

5. 프락토겔 SE Hi-Cap: 블루 세파로스 칼럼으로부터의 용리액을 pH 4.3로 조절하였고, 프락토겔 SE Hi-Cap 칼럼 상에 로딩하였으며, GALNS 단백질을 표 2 및 도 9b에 나타낸 바와 같이 용리시켰다.

프락토겔 SE Hi-Cap 크로마토그래피
단계	CV ^*	완충제
평형	5	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 4.3
로딩		pH 4.3으로 조절된 블루 세파로스 용리액 및 MQ 워터로 1:1 희석
세척 1	5	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 5.0
세척 2	5	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 5.5
용리	20	20mM 아세테이트/인산염, 50-350mM NaCl 구배, pH 5.5
재생 1	5	20mM 아세테이트/인산염, 500mM NaCl, pH 5.5
재생 2	5	20mM 아세테이트/인산염, 50mM NaCl, pH 4.3
위생처리	5	0.1N NaOH, 0.5시간
재생3	4	H₂O
저장	3	20% EtOH
*CV: 칼럼 용적. 유속=150㎝ hr^-1

용리액 중의 GALNS 단백질을 분획화에 의해 수집하였고, 용리 전 숄더 용리 후 꼬리를 폐기하였다.

6. 최종 UF/HF: 프락토겔 SE Hi-Cap 칼럼으로부터의 용리액을 초미세여과에 의해 농축시켰고, 상기 기재한 바와 같이 멸균여과시켰다.

조제물. 정제한 GALNS 단백질을 10mM NaOAc, 1mM NaH₂PO₄, 0.005% Tween-80, pH 5.5 중에서 조제하였다.

안정성 연구. 각각 실온에서 GALNS 샘플의 소량의 알리쿼트를 저장함으로써 시간 작용으로서 최종 조제 정제된 GALNS의 안정성을 4℃ 및 -70℃에서 모니터링하였다. 특정 시점에, 냉동 샘플의 알리쿼트를 37℃에서 빠르게 해동시킨 후 활성을 측정하였다. 도 8은 조제물 완충제 내 적어도 79일까지의 기간에 걸쳐 정제된 GALNS가 4℃ 및 -70℃에서 안정하다는 것을 나타낸다.

제1 정제 과정 결과. 표 3은 정제가 현탁 배양물 바이오리액터 내 G71S 클론 4로부터 생성된 GALNS 단백질의 3개 제제를 수득한다는 것을 나타낸다. 모든 경우에 약 95%가 되는 SDS-PAGE에 의해 정제를 시각적으로 평가하였다.

WAVE 반응기로부터 G71S 클론으로부터의 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제 ( GALNS ) 정제 수율
수율
단계	제제 1	제제 2	제제 3	평균	표준 편차
UF	해당없음	100	100	100	0
블루 세파로스 6 FF	93	103	101	99	5.3
SE Hi-Cap	90	87	90	89	1.7

도 9는 (a) 블루 세파로스 6 속성 유동F 크로마토그래피 다음에 (b) 프락토겔 SE Hi-CAP 크로마토그래피에 의해 분리되는 GALNS 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다. 겔을 쿠마씨 블루(왼쪽) 또는 항-GALNS 항체(오른쪽)로 염색하였다. 웨스턴 블롯에 대해, 항-GALNS 토끼 항체를 1:5000으로 희석시켰고, 2차 항체는 항-알카라인 포스파타제 토끼 항체이었다. GALNS 단백질은 SDS-PAGE 상에서 ~55-60kDa의 분명한 분자량을 가졌고, 26 아미노산 잔기 신호 펩타이드가 없고, 또한 위치 325 후에 절단이 없는 효소의 분비된 사전-처리된(전구체) 형태의 예상된 크기와 일치하였다.

N-말단 특성규명. 정제된 GALNS 단백질의 N-말단을 LC/MS로 결정하였다. N-말단 서열은 APQPPN이었으며, 이는 26 아미노산 잔기 신호 펩타이드가 없는 GALNS의 분비 형태의 예측된 N-말단에 대응한다(도 4 및 도 5에서 인간 GALNS 폴리펩타이드 서열과 비교).

제2 정제 과정. 제2 정제 과정은 초미세여과/정용여과(UF/DF) 단계 다음에 3-칼럼 정제 과정을 포함하였다.

1. 초미세여과(UF/DF): 바이오리액터 물질을 pH 5.5에서 30 kD Sartocon 막을 통해 초미세여과/정용여과에 의해 20X로 농축시켰다.

2. pH 4.5 조절: 농축된 바이오리액터 물질(UF/DF(20X))을 실온에서 pH 조절 완충제(1.75M NaOAc, pH 4.0)로 pH 4.5로 조절하였고, 멸균 여과시킨 후 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼 상에 로딩하였다.

3. 프락토겔 EMD SE Hi-Cap: pH 4.5 조절된 UF/DF(20X)를 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 4.5에서 및 10mM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl로 pH 5.0에서 순차적으로 세척하였으며, GALNS 단백질을 10mM 아세테이트/포스페이트, 140mM NaCl, pH 5.0로 용리시켰다.

5. Zn-킬레이팅 세파로스 FF: 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 칼럼으로부터의 용리액을 500mM NaCl, pH 7.0으로 조절하였고, Zn-킬레이팅 세파로스 FF (Zn-IMAC) 칼럼 상에 로딩하였으며, 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH 7.0으로 세척하였고, GALNS 단백질을 10mM 아세테이트/포스페이트, 125mM NaCl, 90mM 이미다졸, pH 7.0으로 용리시켰다.

6. pH 3.5 조절: GALNS 단백질을 함유하는 Zn-킬레이팅 세파로스 FF 칼럼으로부터의 용리액을 낮은 pH 바이러스 불활성화를 위해 pH 3.5로 조절한 다음 10mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0로 조절하였다.

7. ToyoPearl 뷰틸 650M: Zn-킬레이팅 세파로스 FF 칼럼으로부터 낮은 pH 조절 용리액을 ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼 상에 로딩하였고, 10mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0으로 세척하였으며, GALNS 단백질을 10mM 아세테이트/포스페이트, 0.7M NaCl, pH 5.0으로 용리시켰다.

8. 최종 UF/HF: ToyoPearl 뷰틸 650M 용리액으로부터의 용리액을 20mM 아세테이트, 1mM 포스페이트, 150mM NaCl, pH 5.5 중에서 초미세여과 및 정용여과시켰다.

조제물. 정제된 GALNS 단백질을 10mM NaOAc/HOAc, 1mM NaH₂PO₄, 150mM NaCl, 0.01% Tween-20, pH 5.5 중에서 제조하였다.

제2 정제 과정 결과. 표 4는 제2 정제 과정을 사용하여 현탁 배양물 중의 G71S 클론 C2로부터 생성한 GALNS 단백질에 대한 회수를 나타낸다. 조제된 GALNS 효소(즉, 함께 전구체 및 성숙 또는 처리된 형태)의 정제는 C3 RP-HPLC에 의해 결정되는 바와 같이 약 98%였다. GALNS 효소의 전구체 형태의 백분율은 SDS-모세관 겔 전기영동에 의해 결정되는 바와 같이 약 85%였다.

G71S 클론 C2 에 대한 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제 ( GALNS ) 회수
과정 단계	회수(%)
pH 조절	96
프락토겔 SE Hi-Cap 칼럼	98
Zn-IMAC 칼럼	89
Low pH 바이러스 불활성화	89
ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼	99
조제물	99
전체	70

도 10은 초미세여과/정용여과(UF/DF), 프락토겔 SE Hi-CAP 크로마토그래피, Zn-킬레이팅 세파로스 FF 크로마토그래피 및 ToyoPearl 뷰틸 650M 크로마토그래피에 의해 분비된 GALNS 효소의 SDS-PAGE를 나타낸다. 겔을 쿠마씨 블루(상부 왼쪽), 항-GALNS 항체(상부 오른쪽), 항-카텝신 L(하부 왼쪽) 및 항-CHO 단백질(CHOP, 하부 오른쪽)로 염색하였다. 웨스턴 블롯을 위해, 항-GALNS 토끼 다클론성 항체를 1:5000으로 희석시켰고, 2차 항체는 항-토끼 AP 컨쥬게이트였다; 항-카텝신 L 염소 다클론성 항체를 1:1000으로 희석시켰고, 2차 항체는 항-염소 HRP 컨쥬게이되었으며; 항-CHOP 토끼 다클론성 항체를 1:1000으로 희석시켰고, 2차 항체는 항-토끼 HRP 컨쥬게이트였다. 전구체 GALNS 효소는 SDS-PAGE 상에서 ~55-60kDa의 분명한 분자량을 가졌고, GALNS 효소의 성숙 또는 처리된 형태는 SDS-PAGE 상에서 ~39kDa 및 ~19kDa의 분명한 분자량을 가졌다.

제1 정제 과정의 요약. 표준 트레인으로부터 변형된 정제 트레인을 사용하여 GALNS 효소를 정제하였다(표 5 참조). 바이오리액터 채취 물질을 0.2㎛ 멸균여과시켰고, 4℃에서 유지한 후 블루-세파로스 포획 칼럼 상에 로딩하였다. 여과된 바이오리액터 물질을 직접 로딩하거나 또는 초미세여과에 의해 15X까지 농축시켰다. 하류 정제 단계 때문에 정제 트레인의 변형이 필요하며, SP 세파로스 크로마토그래피 다음에 페닐 세파로스 크로마토그래피는 충분히 순수한 GALNS를 수득하지 못했다. 2개의 하류 정제 칼럼에 대한 대체물로서 SE Hi-Cap 크로마토그래피를 사용하는 것은 2-칼럼 정제 과정을 초래하며, 최종 물질의 순도를 상당히 개선시키고, 전반적인 GALNS 회수는 -22% 내지 -80%로 상당히 증가되었다. C4-RP 크로마토그래피에 의해 결정되는 GALNS 효소의 정제(본질적으로 전구체 형태로 이루어짐, 도 9 참조)로 거의 95% 초과로 추정하였으며, 정제된 GALNS 효소는 4℃와 -70℃에서 79일 초과 동안 조제 완충제 중에 남아있었다.

제1 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제 ( GALNS ) 정제 트레인
단계	정상 과정	변형된 과정
1	HF(1X)	HF(1X)
2^*	UF(5X)	UF(15X)
3	pH 4.5 조절	pH 4.5 조절
4	블루-세파로스 6 FF	블루 세파로스 6 FF
5	Sp 세파로스	SE Hi-캡
6	페닐 세파로스 Hi-Sub	최종 UF/DF
7	최종 UF/DF
*이 단계는 선택적이다

제2 정제 과정의 요약. 제2 정제 트레인을 사용하여 GALNS 효소를 또한 정제하였다(표 6). 전체 GALNS 회수는 약 70%이었고, C4-RP 크로마토그래피로 결정한 것과 같은 GALNS 효소(전구체와 성숙 또는 처리된 형태를 포함, 도 10 참조)의 순도는 거의 약 97%가 되는 것으로 추정되었다.

제2 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제 ( GALNS ) 정제 트레인
단계	과정
1	HF(1X)
2	UF/DF(20X)
3	pH 4.5 조절
4	SE Hi-캡
5	Zn-킬레이팅 세파로스
6	pH 3.5 조절
7	ToyoPearl 뷰틸 650M
8	최종 UF/DF

이들 분석은 재조합 리소좀 설파타제 효소를 제조하기 위한 상기 기재한 프로토콜이 다량의 고도로 정제된 효소, 특히 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 분비된 사전-처리된(전구체) 형태의 생성을 위해 효율적인 방법을 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예 VI

최소의 클리핑에 의한 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 정제

재조합 효소의 단백질 분해 제어는 단백질-기반 치료제의 생성 및 조제에 관한 것이다. 본 목적은 분비된 사전-처리된(전구체) 형태로 다량의 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)를 얻는 것이다. 프로테아제, 특히 카텝신 L로부터 최소의 클리핑에 의해 인간 GALNS의 대규모 제조를 허용하는 생성 과정을 진행시켰다.

본 명세서에서 사용되는 것과 같은, "최소 클리핑"은 환원 조건 하에 SDS-PAGE 다음에 쿠마씨 블루 염색되거나 또는 SDS-모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 판단되는 바와 같이 최종 정제 조제물 내에서 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 무결함인 것을 의미한다.

GALNS의 대규모 제조를 위한 생성 과정의 진행 동안, 효소의 ~55kDa 분비된 전구체 형태는 산 pH에서 활성인 프로테아제, 특히 카텝신 L에 의한 단백질 분해가 되기 쉬운 것으로 발견되었다. GALNS의 프로테아제 분해는 GALNS의 성숙, 클리핑된 형태를 만들어내는데, 이는 환원 조건 하에 SDS-PAGE 상의 ~40kDa 및 ~19 kD에서 2개의 밴드로 보여질 수 있다. 이 단백질분해 클리핑은 양이온 교환 칼럼 캡처 단계에 필요한 낮은 pH(즉, 4.5 내지 5.0)에 의해 악화되었다. 이 pH 범위는 세포 배양 채취물에 존재하는 카텝신과 같은 산성 프로테아제의 활성에 바람직한 조건을 제공한다.

세포 배양 배지 내로 분비된 GALNS를 클리핑할 수 있는 프로테아제의 존재 및/또는 활성을 최소화하는 GALNS 회수 및 정제 과정에서 변화를 만들었다.

GALNS의 대규모 제조 동안 대표적인 회수 및 정제 과정을 도시하는 흐름도를 도 11에 나타낸다. 왼쪽의 과정은 실시예 V에서 상기 기재한 정제 트레인과 유사한 I/II 상에 사용된 회수 및 정제 과정을 나타내는데, 이는 다양한 양의 클리핑을 초래하며, 환원 조건 하에 SDS-PAGE 실행 후 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는(도 12, 레인 3) 카텝신 L의 활성화에 기인하는 펩타이드 사슬의 -6-30%의 범위에 있고, 또는 SDS-CGE에 의해 판단되는 바와 같이(표 8 참조) GALNS의 65.3% 내지 93.7% 무결함 전구체 형태의 범위에 있다. SDS-PAGE 방법은 시각적이지만, 더 정량적인 단백질 분해의 정보를 제공하는 반면, SDS-CGE 방법은 최종 정제된 조제물에 존재하는 무결함 단백질%에 대한 더 정량적인 정보를 제공한다.

도 11의 오른쪽 과정은 III 상 과정에서 사용된 회수 및 정제 과정을 나타내는데, 이는 최소 클리핑을 초래하고, 환원 조건 하에 SDS-PAGE 다음에 쿠마씨 블루 염색에 의해(도 12, 레인 5) 또는 SDS-CGE에 의해(표 8)에 의해 판단되는 바와 같이 GALNS의 98% 내지 99.6% 무결함 전구체 형태의 범위에 있다.

과정 변화의 개요. GALNS 클리핑의 정도 및 가변성을 감소시키기 위하여, 2개의 인자를 고려하였다: (i) 프로테아제는 중성 pH에서 상당히 덜 활성이며; (ii) 양이온 교환 크로마토그래피와 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 단계는 GALNS로부터의 프로테아제를 분리한다. III 상 과정(도 11, 오른쪽 참조)은 이들 인자를 활용하며, 정제 과정 동안 GALN의 클리핑을 감소시킨다. 이는 pH 6.5 내지 7.0에서 Zn-IMAC 칼럼 상의 포획과 함께 처음 2개의 칼럼 단계의 순서를 전환함으로써 달성된다. 처음 2개 칼럼의 이런 전환은 수집을 편리하게 만들며, I/II 상 과정(도 11의 왼쪽 참조)에서 사용된 더 산성인 pH(즉, pH 5.5)와 비교하여 더 높은 pH(즉, pH 6.5)에서 세포 배양 채취물을 저장한다. pH 6.5에서 무세포 채취물의 저장은 세포 배양 유체에 존재하는 프로테아제, 예를 들어 카텝신의 활성화 가능성을 감소시키고, 이에 의해 GALNS의 클리핑을 방지하거나 감소시킨다.

III상 과정. GALNS에 대한 대표적인 III상 과정 회수 및 정제에서 각 단계를 이하에 요약한다.

1. 무세포 채취(IX). 인간 SUMF1 및 인간 GALNS를 공동-발현시키는 안정적으로 트랜스펙션시킨 G71 세포를 실시예 III에 기재된 바와 같은 바이오리액터 배양 조건 하에서 성장시켰다. GALNS를 함유하는 바이오리액터 물질(즉, 세포 배양 유체)을 pH 6.5에서 수집하였고, CUNO 30SP02A의 여과 트래인을 사용하여 여과시킨 후, CUNO 90ZA08A, 및 0.2㎛ CUNO BioAssure 필터를 사용하여 여과시켰다.

2. UF/DF (20X). 세포 배양물 유체를 7 mS/㎝ 이하의 전도도에서 10mM 포스페이트/아세테이트, 50mM NaCl, pH 6.5로 초미세여과/정용여과(UF/DF)시켰다. Sartocon 30kDa Hydrosart 카세트를 사용하여 UF/DF 단계를 수행하였다. 세포 배양물 유체를 20X로 농축시켰다. 비교를 위하여, I/II 상 과정 UF/DF 단계를 pH 5.5에서 수행하였다. III 상 과정에서 더 높은 pH는 무세포 채취물에 존재하는 프로테아제에 의해 GALNS의 클리핑 가능성을 감소시킨다.

3. 차콜 여과. UF/DF(20X) 물질을 Zeta Plus R55 활성탄(Z1274)을 통해 여과시킨 다음 2 내지 8℃에서 저장 전 0.2㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과시켰다. 차콜 여과는 이후의 Zn-IMAC 칼럼 로딩 시 압력이 상당히 감소되었다.

4. 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC). Zn-고정 금속 친화성 크로마토그래피(Zn-IMAC) 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 500mM NaCl, pH 7.0 중에서 평형화시켰고, ~55±5 mS/㎝의 전도도에서 2.5M NaCl를 함유하는 50mM 인산염 완충제, pH 9.2의 첨가에 의해 pH 7.0±0.1에서 차콜 여과된 UF/DF(20X) 물질과 함께 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 500mM NaCl, pH 7.0 다음에 10mM 포스페이트/아세테이트, 125mM NaCl, pH 7.0(완충제 A)로 세척하였다. GALNS를 70% 완충제 A 및 30% 완충제 B(10mM 포스페이트/아세테이트, 125mM NaCl, 300mM 이미다졸, pH 7.0)의 혼합물로 칼럼으로부터 용리시켰다.

5. Mustang Q 필터. Zn-IMAC 칼럼 용리액을 pH 7.0에서 ~6.0±0.5 mS/㎝의 전도도로 조절하였고, Mustang Q 필터 상에 로딩하여 바이러스를 제거하였다.

6. pH 조절 및 여과. Mustang Q 여과액을 pH 4.5±0.1로 조절하였고, CUNO 60ZA 필터 다음에 0.2㎛ 인라인 필터를 사용하여 여과시킨 다음, 양이온 교환 칼럼 상에 로딩하였다.

7. 양이온 교환 크로마토그래피. 프락토겔 SE HiCap 양이온 교환 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 50mM NaCl, pH 4.5에 평형화시켰고, 7 mS/㎝의 전도도에서 pH 4.5±0.1로 조절된 여과된 Mustang Q 여과액과 함께 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 50mM NaCl, pH 4.5 다음에 10mM 포스페이트/아세테이트, pH 5.0(완충제 A)과 10mM 포스페이트/아세테이트, 250mM NaCl, pH 5.0(완충제 B)의 80%:20% 혼합물로 세척하였다. GALNS를 80% 내지 25% 완충제 A(즉, 50 내지 190mM NaCl) 중의 20 내지 75% 완충제 B의 선형구배로 칼럼으로부터 용리시켰다.

8. 바이러스 불활성화를 위한 낮은-pH 보유. 프락토겔 SE HiCap 용리액을 바이러스 불활성화를 위하여 0.2M 시트레이트 완충제, pH 3.4의 첨가에 의해 pH 3.5±0.1로 산성화시켰고, ~1시간 동안 낮은 pH에서 보유하였으며, 0.2M 시트레이트 완충제, pH 6.0의 첨가에 의해 pH 5.0±0.1으로 재조절한 다음, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 폴리싱 칼럼 상에 로딩하였다.

9. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC). ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 2M NaCl, pH 5.0 중에서 평형화시켰고, 2M NaCl, pH 5.0로 조절된 낮은-pH 바이러스 불활성화된 프락토겔 SE HiCap 용리액으로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 2M NaCl, pH 5.0(완충제 A)로 세척하였다. GALNS를 35% 완충제 A 및 65% 완충제 B(10mM 포스페이트/아세테이트, pH 5.0)의 혼합물로 칼럼으로부터 용리시켰다.

10. 완충제 교환 및 3㎎/㎖로 rhGALNS의 조절. ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 20mM 아세테이트, 50mM 포스페이트, 30mM 아르기닌, 2%(v/v) 솔비톨, pH 5.4 내로 완충제 교환한 다음, 동일 완충제 내 3㎎/㎖의 최종 GALNS 농도로 조절하였다.

11. 여과에 의한 바이러스 및 DNA 제거. 바이러스 필터(DV20) 및 DNA 필터(Mustang Q)를 사용하여 임의의 잔사 바이러스 및 DNA를 제거하기 위해 완충제 교환된 ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 여과하였다.

12. 0.01%로 첨가된 PS20. 바이러스 및 DNA 여과되고, 완충제 교환된 ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 0.01%(v/v) 폴리솔베이트 20(PS20 또는 Tween-20)으로 조절하였다.

13. 2 내지 8℃ 또는 냉동으로 BDS 저장. 정제된 GALNS, 즉 거대 약물 물질(BDS)의 최종 조제물을 2 내지 8℃에서 또는 냉동으로 저장시켰다.

결과. SDS-PAGE 결과(도 12, 레인 5를 참조)에서 알 수 있는 바와 같이, 주요 밴드의 명백한 분자량은 ~55kDa이었고, GALNS 모노머에 대해 예상한 값과 일치하였다. I/II 상 과정을 사용하여 만든(레인 3) 로트# AP400802 내 ~40kDa 및 ~19kDa의 분명한 분자량으로 이동하는 밴드는 Q348과 G349 사이의 단백질 분해 클리핑으로부터 초래되는 GALNS의 분해 생성물이다. 이 클리핑은 III상 과정을 사용하여 만들어진(레인 5) 로트# BMN110-0110-001에서 크게 감소되었다. ~40kDa 절단 생성물보다 약간 더 느리게 이동하는 제제 둘 다에서 부수적 밴드가 있다.

추가 과정 변화의 검토. 변형된 III 상 과정을 특정 시험감염을 처리하기 위해 진행시켰다: (i) 농축된 채취에서 침전물의 형성; (ii) Zn-IMAC 포획 단계에서 GALNS의 손실; (iii) ToyoPearl 뷰틸 단계 동안 세척 분획 내 GALNS의 손실; 및 (iv) ToyoPearl 뷰틸 단계의 용리액 내 고수준의 CHOP 불순물의 존재.

변형된 III 상 과정. GALNS에 대한 대표적인 III 상 과정 회수 및 정제에서 각각의 단계를 이하에 요약한다.

1. 무세포 채취물(IX). 인간 SUMF1 및 인간 GALNS를 공동발현시키는 안정하게 트랜스펙션된 G71 세포를 실시예 III에 기재된 바와 같은 바이오리액터 배양 조건 하에 성장시켰다. GALNS를 함유하는 바이오리액터 물질(즉, 세포 배양물 유체)을 pH 6.5에서 수집하였고, Millipore DOHC의 여과 트레인 다음에 Millipore XOHC, 및 0.2㎛ Millipore SHC 필터를 사용하여 여과시켰다.

2. UF/DF (20X). 세포 배양물 유체를 7 mS/㎝ 이하의 전도도에서 10mM 포스페이트/아세테이트, 50mM NaCl, pH 6.5 내로 초미세여과/정용여과(UF/DF)시켰다. Sartocon 30kDa Hydrosart 카세트를 사용하여 UF/DF 단계를 수행하였다. 세포 배양물 유체를 20X로 농축시켰다.

3. 차콜 필터. UF/DF(20X) 물질을 Zeta Plus R55 활성탄(Z1274)을 통해 여과시킨 다음, 2 내지 8℃에서 저장 전 0.2㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과시켰다.

4. 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC). Zn-고정 금속 친화성 크로마토그래피(Zn-IMAC) 칼럼을 50mM 아세테이트 완충제, pH 5.0로 세정하였고, 50mM ZnS04로 채웠으며, 50mM 아세테이트 완충제, pH 5.0로 세정한 다음, 5mM 이미다졸을 함유하는 10mM 포스페이트/아세테이트, 500mM NaCl, pH 7.0 중에서 평형화시켰다. Zn-IMAC 칼럼 로딩 동안 75:25(v/v) 비로 2.5M NaCl을 함유하는 50mM 인산염 완충제, pH 9.2±0.1과 함께 배합함으로써 평형화된 Zn-IMAC를 ~50±5 mS/㎝의 전도도에서 pH 7.0±0.1에서 차콜 여과된 UF/DF(20X) 물질로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 500mM NaCl, pH 7.0로 세척한 후, 10mM 포스페이트/아세테이트, 125mM NaCl, pH 7.0(완충제 A)로 세척하였다. GALNS를 70% 완충제 A 및 30% 완충제 B(10mM 포스페이트/아세테이트, 125mM NaCl, 300mM 이미다졸, pH 7.0)의 혼합물로 칼럼으로부터 용리시켰다.

5. pH 조절 및 여과. Zn-IMAC 칼럼 용리액을 1.75M 아세테이트, pH 4.0에 의해 pH 4.5±0.1로 조절한 다음, Millipore COHC 필터를 사용하여 여과시켰다. 여과된 물질을 양이온 교환 칼럼의 로딩 동안 30:70(v/v) 비로 10mM 포스페이트/아세테이트, pH 4.5와 함께 배합하였다.

6. 양이온 교환 크로마토그래피. 프락토겔 SE HiCap 양이온 교환 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 50mM NaCl, pH 4.5 중에서 평형화시켰고, 7 mS/㎝ 미만의 전도도에서 pH 4.5-조절 및 여과된 Zn-IMAC 칼럼 용리액으로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 50mM NaCl, pH 4.5 다음에 10mM 포스페이트/아세테이트, pH 5.0 (완충제 A) 및 10mM 포스페이트/아세테이트, 250mM NaCl, pH 5.0 (완충제 B)의 80%:20% 혼합물로 세척하였다. GALNS를 80% 내지 25% 완충제 A(즉, 50 내지 190mM NaCl) 중의 20% 내지 75% 완충제 B의 선형 구배로 칼럼으로부터 용리시켰다.

7. 바이러스 불활성화를 위한 낮은-pH 보유. 프락토겔 SE HiCap 용리액을 0.4M 시트레이트 완충제, pH 3.4의 첨가에 의한 바이러스 불활성화를 위해 pH 3.5±0.1로 산성화시켰고, pH for ~1 시간(12-23℃의 온도에서) 동안 낮은 pH에서 보유하였고, 0.4M 시트레이트 완충제, pH 6.0의 첨가에 의해 pH 5.0±0.1로 재조절하였으며, 5M NaCl을 함유하는 10mM 포스페이트/아세테이트 완충제, pH 5와 배합하여 2M NaCl의 최종 농도를 달성한 다음, 0.2㎛ 필터를 통해 여과시킨 후 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 폴리싱 칼럼 상에 로딩하였다.

8. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC). ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 2M NaCl, pH 4.4 중에서 평형화시켰고, 2M NaCl, pH 4.3-4.4으로 조절된 여과된, 낮은-pH 바이러스 불활성화된 프락토겔 SE HiCap 용리액으로 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 10mM 포스페이트/아세테이트, 2M NaCl, pH 4.4 다음에 10mM 포스페이트/아세테이트, 2.5M NaCl, pH 5.0(완충제 A)으로 세척하였다. GALNS를 0 내지 68% 완충제 B(10mM 포스페이트/아세테이트, pH 5.0)(즉, 2.5 내지 0.8M NaCl) 중의 100% 내지 32% 완충제 A의 선형구배 다음에 32% 완충제 A 및 68% 완충제 B(즉, 0.8M NaCl)의 혼합물로 칼럼으로부터 용리시켰다.

9. 완충제 교환, 여과에 의한 DNA 및 바이러스 제거, 및 3㎎/㎖로 rhGALNS의 조절. ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 20mM 아세트산나트륨, 50mM 인산나트륨, 30mM 아르기닌-HCl, 2%(w/v) 솔비톨, pH 5.4로 완충제 교환하였다. 완충제 교환한 ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 여과하여 DNA 필터(Mustang Q) 및 바이러스 필터(DV20)를 사용하여 임의의 잔사 DNA 및 바이러스를 제거하였다. 그 다음에 여과된, 완충제 교환된 ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 상기와 같이 동일 완충제 중의 3㎎/㎖의 최종 GALNS 농도로 조절하였다.

10. 0.01%로 첨가된 PS20. DNA 및 바이러스를 여과하였고, 완충제 교환한 ToyoPearl 뷰틸 650M HIC 용리액을 0.01% (v/v) 폴리솔베이트 20(PS20 또는 Tween-20)로 조절하였다.

11. 2 내지 8℃에서 또는 냉동으로 BDS 저장. 정제된 GALNS의 최종 조제물, 즉, 거대 약물 물질(BDS)을 최종 저장 용기 내로 0.2㎛ Millipak 200 필터를 통과시켰고, 2 내지 8℃에서 또는 냉동으로 백 내에 저장시켰다.

결과. 이 변형된 III 상 과정에 따라서, Zn-IMAC 및 ToyoPearl 뷰틸 칼럼에 GALNS의 결합이 개선되었고, ToyoPearl 뷰틸 용리액 내 CHOP 불순물이 감소되었다. 이 변형된 III 상에 의해 정제된 GALNS는 상기 기재한 III 상에 의해 정제된 효소에 대해 시험한 모든 특성(예를 들어, 이하의 표 7에 있는 것)과 비슷하다.

III 상 회수 및 정제 과정에 의해 만들어진 rhGALNS 의 특성규명

III 상 과정을 사용하여 정제한 GALNS를 I/II 상 과정에 의해 정제된 효소와 비교하였다. 특성규명 결과를 표 7에 제공한다. GALNS 제제는 둘 다 시험한 모든 특성이 유사하지만, III 상에 의해 정제된 효소는 I/II 상 과정에 의해 정제된 것과 비교하여 상당히 더 적은 클리핑을 나타내었다.

I/II 상 및 III 상 과정에 의해 정제된 GALNS 의 비교
특성	분석 방법	TPB050109 (III상 과정)	AP400802 (I/II상 과정)
특이적 활성	형광 기질	10.2 U/㎎	13.9 U/㎎
글리코실화 프로파일	CZE	35.9% BPM7	34.9% BPM7
클리핑	SDS-CGE	98.7% 무결함	73.2% 무결함
크기 변이체	SEC-HPLC	98.7% 무결함**	99.9% 무결함
UV 불순물	RP-HPLC	99.5% 순수	99.7% 순수
CHOP*	ELISA	<33 ppm	46 ppm
CHOP: 중국햄스터 난소 숙주 세포 단백질 오염물 *99% 초과의 무결함 단백질을 나타낸 III 상 과정을 사용하여 동일 200L cMFG 반응기로부터 얻은 물질로부터 정제된 다른 rhGALNS 로트에 대한 SEC-HPLC 데이터

표 8은 I/II 상 과정(65.3-93.7%) 또는 III 상 과정(98-99.6%) 중 하나를 사용하여 제조한 로트 내 최종 정제 조제물에서 SDS-CGE 방법을 사용하여 무결함 GALNS 백분율과 비교한다. 여기서 얻은 값은 SDS-PAGE 방법으로부터 얻은 결과를 지지하며, 클리핑 정도는 정제 과정으로 만들어진 변형 결과로서 상당히 감소되었다는 것을 나타낸다.

I/II상 및 III상 과정에 의해 정제한 무결함 GALNS %의 비교(SDS- CGE 에 의한)
GALNS 로트번호	사용한 과정	무결함 GALNS
11333P53	I/II상	82.7%
11333P71	I/II상	85.6%
11333P79	I/II상	93.7%
11333P90	I/II상	82.6%
11428P15	I/II상	80.1%
NP400801	I/II상	65.3%
AP400802	I/II상	73.6%
AP400803	I/II상	78.5%
AP400804	I/II상	82.9%
P400902	III상	98%
11615P56	III상	98.5%
11615P71	III상	98.4%
11615P78	III상	98.9%
11615P81	III상	98.1%
11780P15	III상	99.6%

이들 분석은 최소 클리핑을 갖는 재조합 리소좀 설파타제 효소를 제고하기 위해 상기 기재한 프로토콜이 대량의 고도로 정제된 효소, 특히 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 분비된 사전-처리된(전구체) 형태의 생성을 위한 효율적인 방법을 제공한다는 것을 표시한다.

실시예 VII

정제된 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 특성규명

본 명세서에 정의되는 바와 같이, G71 세포주는 평균 포유류 세포주 및 대응적으로 더 낮은 수준의 비인산화된 고-만노스 올리고당에서 주목되는 것보다 더 큰 수준의 고-만노스 인산화 수준을 갖는 단백질(예를 들어 리소좀 효소)을 생성한다. 본 명세서에 정의되는 바와 같은 고수준의 비스-인산화된 고-만노스 올리고당을 포함하는 리소좀 설파타제 효소(예를 들어, 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS))를 복합 올리고당을 포함하지 않고 단지 고 만노스 올리고당을 나타내는, Canfield 등의 미국특허 제6,537,785호에서 얻은 분자와 비교하였다.

리소좀 설파타제 효소 상에서 비인산화된 고-만노스 수준을 결정하기 위하여, 당업자는 방출된 올리고당의 엑소글라이코시다제 시퀀싱("FACE 서열")을 사용하여 비인산화된 고-만노스 올리고당 사슬의 백분율을 정확히 찾을 수 있다. 정상 로트-방출 FACE 프로파일링 겔 상에서, 비인산화된 고 만노스는 특정 복합 올리고당(예를 들어, 올리고만노스 사슬 6 및 완전히 시알릴화된 2안테나 복합체)과 공동-이동된다. 그 다음에 비인산화된 고 만노스를 효소적 시퀀싱에 의해 다른 올리고당으로부터 분회시킨다.

G71S 세포 내에서 발현된 정제된 리소좀 설파타제 효소(예를 들어, 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS))가 증가된 인산화를 나타내는지 여부를 결정하기 위하여, 리소좀 설파타제 효소 상의 만노스-6-포스페이트(M6P) 수준뿐만 아니라 M6P 수용체(MPR)에 결합된 효소의 능력을 결정하였다.

G71S 세포 내에서 발현되고 정제된 재조합 인간 GALNS 효소를 형광 보조 탄수화물 전기영동에 의해 및 MPR-세파로스 수지 상의 크로마토그래피에 의해 분석하였다. FACE 시스템은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 사용하여 글라이코단백질로부터 방출된 올리고당의 서열을 분리하고, 정량화하며 결정한다. FACE 상의 올리고만노스 사슬 7 비스-포스페이트(07P)의 상대적 강도(Hague et al., Electrophoresis 19(15): 2612-20, 1998) 및 MPR 칼럼 상에 보유된 활성%(Cacia et al., Biochemistry 37(43): 15154-61, 1998)는 단백질의 몰 당 인산화 수준의 믿을 만한 수준을 제공한다.

특이적 활성. 37℃에서 작은 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-6-S-GAL(4MU-Gal-6S)을 사용하여 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 특이적 활성을 결정하였다. 이 분석을 사용하여, 정제된 GALNS의 특이적 활성은 165 μ㏖/분/㎎(0.165 U/㎎)이었다.

인간 혈청 안정성. GALNS의 생체 밖 혈청 안정성을 결정하였다. 인간 혈청 (Sigma H-4522)을 0.2㎛ PES 필터를 통해 여과 멸균 시켰고, 4㎖의 여과 멸균된 인간 혈청을 T-25 세포 배양 플라스크 내에서 37℃에서 1시간 동안 10% C0₂ 의 분위기에서 사전 인큐베이션시켰다(이 지점에서 pH는 7.4±0.1이다). 0.4㎖의 탈염, 정제된 GALNS(2㎎/㎖ 정제된 GALNS를 Bio-RAD 10DG 칼럼을 사용하여 PBS 내로 탈염시켰음)를 사전-인큐베이션시킨 인간 혈청 또는 0.5㎎/ℓ BSA를 함유하는 PBS 대조군에 첨가하였다. 100㎕ 샘플을 지정 시점(예를 들어, 0, 1, 3.5, 7.5 및 26시간)에 회수하였고, 900㎖의 퀀칭 완충제(QB, 50mM NaOAc, pH 5.6+150mM NaCl+0.5㎎/㎖ BSA+0.001 Tween-80)에 첨가하였다. GALNS 효소 활성을 측정하기 위한 준비를 할 때까지 샘플을 4℃에서 저장하였다.

GALNS 효소 활성을 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 측정하였다. 잔여 GALNS 효소 활성%의 지수함수형 붕괴 곡선을 추론함으로써, 정제된 GALNS의 생체 밖 혈청 반감기가 217 시간이 되는 것으로 추정하였다.

활막세포(연골세포) 내로 흡수. 활막세포(연골세포) 내로 흡수되는 GALNS의 능력을 결정하였다.

연골세포(ATCC 번호 CRL-1832)를 12-웰 디쉬 내 5% C0₂ 중의 37℃에서 성장 배지(Ham's F12 + 10% FBS) 내에서 배양시켰다. 3개의 샘플 흡수의 분석은 4 x 12 웰 플레이트를 필요로 한다. 정제된 GALNS 샘플 및 GALNS 기준을 acPBS/BSA(산성 PBS + 200㎍/㎖ BSA) 중의 1μM로 희석시켰다. 1μM 저장액으로부터, GALNS 샘플 및 기준에 대한 흡수 희석 곡선을 제조하였다: 10nM GALNS 샘플 및 기준을 야기하는 5㎖ 흡수 분석 희석물(UAD, DMEM + 2mM L-글루타민 + 0.5㎎/㎖ BSA) 내로 50.5㎕(1μM rhASB), 이를 UAD에서 연속 2-배 희석에 의해 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31 및 0.16nM로 추가로 연속적으로 희석시켰다. 컨플루언시(confluent) 연골세포의 12-웰 디쉬로부터의 성장 배지를 흡입하였고, 1㎖의 UAD(블랭크) 또는 단계 희석의 GALNS 샘플 또는 기준을 웰에 첨가하였으며, 10% C0₂ 인큐베이터 내 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 흡수 배지를 흡입하였고, 완성도를 위해 각 디쉬를 기울였으며, 각 웰을 1㎖ PBS로 1번 세정하였다. PBS를 흡입하였고, 연골세포를 웰 당 0.5㎖ 트립신/EDTA(0.25% 트립신/0.1% EDTA(Mediatech 25-053-CI, 로트 25053025))를 첨가함으로써 분리시켰다. 플레이트로부터 분리 후, 연골세포를 얼음 상에서 냉각시킨 에펜도르프 튜브 내로 알리쿼팅시켰다(전체 30 튜브). 트립신화된 연골세포를 냉각시킨 다음 원심분리기에서 저속으로 펠렛화시켰다(3분 동안 4000rpm). 트립신을 완전히 흡입하였고, 세포 펠렛을 1㎖ PBS로 세정시켰으며, 원심분리기 및 흡입 단계를 1회 반복하였다. 200㎕의 세포 용해 완충제(CLB, 50mM 아세트산나트륨, pH 5.6 + 0.1% Triton X-100)를 각 튜브에 첨가하였다. 세포 펠렛을 펄스-교반에 의해 3회 재현탁시켰다. 재현탁 후, 세포 용해 혼합물을 밤새 -80℃에서 저장하거나 또는 직접 분석하였다.

세포 용해물을 실온에서 해동시키고 해동되었을 때 얼음에 옮겼다. 세포 용해물을 교반시켜 임의의 가시적 고체 물질을 재현탁시킨 다음, 4℃에서 10분 동안 14 Krp에서 원심분리기 내에서 회전시켜 불용성 물질을 펠렛화하였다. 상청액을 신선한 튜브 세트에 옮겼고, 펠렛을 폐기하였다. 그 다음에 GALNS 활성 분석을 상청액 상에서 수행하였다. 7-점 희석 곡선(10nM에서 출발하고 0.16nM에서 끝나는 연속 2-배 희석)을 보통 수행하며, 이는 양 측면에서 상당히 고르게 예상된 K_흡수를 일괄하여 다룬다. 출발 물질의 몰 농도를 단백질-유일의 분자량을 사용하여 계산하였다.

정제한 GALNS는 4.9nM의 단일-부위 리간드 결합을 기반으로 활막세포 내로 흡수에 대한 K_d를 가졌다.

만노스 -6- 포스페이트 ( M6P ) 수용체 플레이트 결합 분석. 만노스-6-포스페이트(M6P) 수용체에 결합되는 GALNS의 능력을 플레이트 결합 분석에서 결정하였다. FluoroNunc 고 결합 플레이트를 4㎍/㎖ M6P 수용체로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 250㎕/웰의 세척 완충제(WB, TBS + 0.05% Tween 20)로 2회 세척하였고, 비특이적 결합을 200㎕/웰의 차단 및 희석 완충제(BDB, Pierce SuperBlock 완충제, 로트 #CA46485)로 차단시켰다. 플레이트를 1시간 동안 실온(RT)에서 인큐베이션시켰다. 이 차단 단계 동안, 정제된 GALNS 샘플(2주 동안 4℃에서 저장한 0.5-2㎎/㎖)을 BDB 내에서 10nM로 희석시킨 다음, 희석 완충제(DB, 50mM NaOAc, 1mM NaCl, pH 4.0 + 0.5㎎/㎖ BSA)(250㎕+250㎕) 중에서 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31 및 0.16nM에 이르기까지 단계적으로 희석시켰다. 차단된 플레이트를 상기와 같이 WB로 세척하였고, 희석시킨 GALNS 샘플을 100㎕/웰에서 2회 웰 내로 제공하였으며, 1시간 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 단계 동안, 2mM 활성 기질을 0.1㎖의 100mM 6S-갈락토스-4MU 저장액(-20℃ H₂0 중에 저장 )을 5㎖ DB로 희석시킴으로써 제조하였고, 37℃ 수욕 내에서 사전 가온시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 상기와 같이 WB로 2회 세척하였고, 100㎕ 희석 기질을 첨가하였으며, GALNS 특이적 활성을 결정하였다.

분석을 사용하여 정제된 GALNS는 2.4nM의 단일-부위 결합을 기반으로 M6P 수용체에 결합에 대한 K_d를 가졌다.

만노스 -6- 포스페이트 ( M6P ) 수용체 칼럼 결합. 만노스-6-포스페이트(M6P) 수용체에 결합되는 GALNS의 능력을 칼럼 결합 분석에서 결정하였다. M6P 수용체 칼럼을 제조업자의 설명서에 따라 제조하였다. M6P 수용체는 Peter Lobel's laboratory제이었고, 칼럼 수지는 NHS 활성화 수지(Bio- RAD Affi-Gel 15)이었으며, 칼럼 크기는 0.7㎖이었다. M6P 수용체 칼럼을 0.25㎖/분의 유속에서 평형화 완충제(EQ, 5mM β-글라이세로포스페이트, 0.05% Tween 20, 5mM 글루코스-1-포스페이트 및 0.02% NaN₃를 함유하는 산성 PBS, pH 6.0)의 10 칼럼 용적(CV)으로 평형화시켰다. 6㎍의 정제된 GALNS(200㎕ 당)을 O.1㎖/분의 유속에서 M6P 수용체 칼럼 상에 로딩하였다. 미결합 GALNS를 0.25㎖/분의 유속에서 EQ의 10 CV를 갖는 칼럼에서 세척하였다. 0-100% 용리 완충제(EL, 5mM β- 글라이세로포스페이트, 0.05% Tween 20, 5mM 만노스-6-포스페이트 및 0.02% NaN₃를 함유하는 산성 PBS, pH 6.0) 구배(10 CV) 다음에 2 CV의 100% EL을 사용하여 칼럼으로부터 결합 GALNS를 용리시켰다. 칼럼을 EQ의 3CV로 재평형화시켰다.

GALNS ELISA를 사용하여, M6P 수용체에 결합된 정제된 GALNS의 백분율이 56%가 되는 것으로 결정하였다.

모세관 전기영동(CE)에 의한 전체 올리고당 분석. GALNS 상에서 만노스-6-인산화 수준을 결정하기 위하여, GALNS 상의 전체 올리고당의 N-연결된 탄수화물 프로파일을 문헌[Ma et al., Anal. Chem. 71(22):5185-5192, 1999]에 기재되는 바와 같이 모세관 전기영동(CE)에 의해 결정하였다. 아스파라긴 N-연결된 올리고당을 절단하기 위하여 PNGase F에 해당 방법을 사용하였다. 절단된 올리고당을 분리시켰고, 형광 염료로 유도체화하였으며, G10 스핀 칼럼에 적용하여 과량의 염료를 제거하였다. 정제된, 형광으로 표지된 올리고당을 전기영동적으로 분리시켰고, 피크를 MDQ-CE 소프트웨어(32 Karat Ver. 7.0)를 사용하여 순차적으로 정량시켰다.

이 분석을 사용하여, 정제된 GALNS에 대한 올리고당을 함유하는 비스-인산화된 만노스 7(BPM7), 모노-인산화된 만노스 6(MPM6) 및 시알산의 양은 각각 0.58 ㏖/몰 효소, 0.08 ㏖/몰 효소 및 검출불가능이었다. BPM7을 함유하는 GALNS 단백질의 백분율은 29%가 되는 것으로 추정하였다.

Bis7 올리고당 특성규명. GALNS 상의 비스-인산화된 만노스 7(BPM7) 올리고당의 위치를 결정하였다. 위치 178에서 아스파라긴(Asn) 잔기는 BPM7에 N-연결 글라이코실화되었다. 위치 397에서 Asn 잔기는 BPM7에 N-연결 글라이코실화되지 않았지만, 대부분 올리고만노스 사슬-유형 당이 되는 것으로 발견되었다.

하이드록시 아파타이트 친화성. 시험관내 뼈 모델을 진행시켜 GALNS가 뼈에 표적화하는 능력을 가지는지 여부를 결정하였다. 4㎎/㎖ HTP-DNA 등급 하이드록시 아파타이트(Bio-RAD) 현탁액을 제조하였고, DBS + 50 ㎍/㎖ BSA, pH 7.4에서 평형화시켰다. 50 ㎍/㎖ BSA의 첨가 후 정제된 GALNS를 DBS, pH 7.4에서 탈염시켰다. 대략 2㎎/㎖의 최종 농도에서 탈염된 GALNS를 96-웰 플레이트 내 DBS + 50 ㎍/㎖ BSA, pH 7.4로 단계 희석시켰다. 50㎕의 단계 희석한 GALNS를 96-웰 필터 플레이트(Millipore #MSGVN2210, 친수성 PVDF, 저 단백질 결합, 22㎛ 기공 크기)에 옮겼다. 50㎕의 하이드록시 아파타이트 현탁액을 단계 희석시킨 GALNS를 함유하는 필터 플레이트의 웰에 첨가하였고, 약하게 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트에 진공 여과를 실시하였다.

진공 필터 상청액을 상기 기재한 바와 같이 HPLC 또는 GALNS 효소 활성에 의해 분석하였다. 정제한 GALNS는 3-4.0μM의 하이드록시 아파타이드에 대한 Kd를 가진다.

인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)을 발현시키는 G71S 세포주는 더 높은 양의 활성화(즉, 활성 부위 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)으로 전환)을 가지는 리소좀 설파타제 효소를 생성한다.

G71S 세포 내 SUMF1와 공동발현된 정제된 재조합 리소좀 설파타제 효소(예를 들어, 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS))가 증가된 활성화를 나타내는지 여부를 결정하기 위하여, 정제된 리소좀 설파타제 효소 상에서 활성 부위 시스테인 잔기의 FGly의 전환 양을 결정하였다.

GALNS 활성화. 활성화 백분율, 즉 GALNS의 활성 부위 시스테인(Cys) 시스테인 잔기의 C_α-포밀글라이신(FGly)의 전환 백분율을 LC/MS(TFA)로 결정하였다. Cys, FGly 및 Gly에 대한 TIC/1000는 각각 39, 1840 및 183이었으며, 이는 정제된 GALNS의 약 90%가 활성(즉, FGly) 형태로 존재한다는 것을 표시한다.

요약. 표 9는 G71S 클론 4 세포에서 발현된 재조합 GALNS의 특성규명의 요약을 나타낸다. 표 10은 G71S 클론 C2 세포에서 발현된 재조합 GALNS의 특성규명의 요약을 나타낸다.

G71S 클론 4로부터 생성된 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 특성규명
분석 범주	GALNS
특이적 활성:ELISA에 의한 활성/항원	0.165 U/㎎
특이적 활성: 활성/단백질	7.7 U/㎎
C4-RP에 의한 순도	> 95%(6개의 로트를 시험)
SEC에 의한 크기	115kDa(호모다이머)
37℃에서 혈청 안정성	217 시간
흡수: 연골세포	4.9nM
흡수: 섬유아세포	5.0nM
흡수: 조골세포	7.8nM
생산성	1.3pg/세포/일
역가	4.2㎎/ℓ
M6P 수용체 플레이트 결합	2.4nM
M6P 수용체 칼럼 결합: 결합%	56%
CE에 의한 M6P 함량: 전체 탄수화물%	29%
M6P 함량: ㏖ M6P/㏖ GALNS	0.58
CE에 의한 시알산 함량	1%
하이드록시아파타이트 친화성	4μM
활성화:FGly%	90%

G71S 클론 C2 로부터 생성된 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 특성규명
분석 범주	GALNS
특이적 활성: 활성/단백질	6.4 U/㎎
C4-RP에 의한 순도	97%
SEC에 의한 크기	115kDa(호모다이머)
흡수: 섬유아세포	3.4nM
역가	6.4㎎/ℓ(4개의 로트를 시험)
M6P 수용체 플레이트 결합	5.7nM
CE에 의한 M6P 함량: 전체 탄수화물%	34.5%
M6P 함량:㏖ M6P/㏖ GALNS	0.69

이들 결과는 정제된 재조합 인간 GALNS가 고수준의 활성화 및 고수준의 만노스 6-포스페이트 인산화를 가진다는 것을 증명한다. 따라서, SUMF1 및 리소좀 설파타제 효소(즉, GALNS)를 공동-발현시키는 G71S 세포는 활성의 고도로 인산화된 리소좀 설파타제 효소를 효율적으로 생성한다. 이러한 리소좀 설파타제 효소 상의 고 만노스 잔기의 증가된 수준은 세포 상의 MPR에 의한 증가된 흡수를 야기한다.

실시예 VIII

시험관내 모르퀴오 연골세포에서 재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6-설파타제(GALNS)의 흡수 및 활성

시험관 내 케라탄 설페이트(KS)를 분해시키기 위한 모르퀴오 연골세포의 리소좀 및 GALNS의 능력에 의한 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 흡수를 평가하였다.

점액다당류증 IVa형(MPS IVa, 모르퀴오 증후군)이 있는 환자로부터의 연골세포는 감소된 GALNS 활성을 가지며, KS의 리소좀 축적을 나타낸다. MPS IVa 환자의 장골능 생검으로부터 분리된 연골세포를 사용하여 MPS IVa의 시험관내 모델을 추정하였다. 그러나 1차 연골세포는 탈분화되었고, 배양물에서 그것의 연골세포 특징을 상실한다. 따라서, 배양 조건을 확립하여 시험관내 연골세포 분화를 유발하였다.

MPS IVa 환자로부터 분리된 연골세포를 MQCH로 지정하였고, IGF-1, TGF-β, 트랜스페린, 인슐린 및 아스코르브산(연골세포 성장 배지, Lonza #CC-3225)의 존재에서 알긴산염 비드 내에서 배양시켰다. 배양 배지를 실험 기간인 6 내지 15주 동안 1주일 당 2회 변화시켰다. 이들 배양 조건은 연골세포 표현형의 발현 및 분화를 유발하였다. 이들 MQCH 세포는 MQCH 세포의 배양물로부터 분리시킨 RNA를 사용하여 정량적 RT-PCR 분석에 의해 측정한 바와 같이 성별 결정 영역 Y-box 9(Sox 9), 콜라겐 II, 콜라겐 X, 연골 올리고머 매트릭스 단백질 및 어그리간(aggregan) mRNA를 포함하는 연골세포 마커를 발현시켰다. 이들 배양된 MQCH 세포는 또한 세포밖 매트릭스를 설명한다.

MQCH 세포가 KS를 축적시킨 것을 확인하기 위하여 공초점 현미경을 수행하였다. 8-주 배양물 내 MQCH 세포를 트립신화하였고, 유리 슬라이드 상에서 사이토스핀하였고, 아세톤 중에서 고정하였으며, 사용까지 냉동시켰다. 해동 후, 세포를 재수화시키고, 1차 및 2차 항체로서 항-KS 단클론성 항체(Chemicon) 및 Alexa-488(green) 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 항체를 각각 사용하여 염색하였다. MQ-CH 세포는 반점이 있는 세포내 염색을 나타내었고, 이는 리소좀 KS 축적과 일치한다.

정제된 재조합 인간 GALNS가 리소좀 내로 MQCH 세포를 취하고 KS를 분해시키는지 여부를 결정하기 위하여, 6-주 MQCH 세포 배양물을 9주 동안 1주일에 1회 10nM 재조합 인간 GALNS와 함께 배양시켰다. GALNS 흡수 및 KS 클리어런스를 공초점 현미경으로 측정하였다. 사용한 1차 항체는: (a) 항-GALNS 토끼 다클론성 항체 및 항-리소좀 관련 막 단백질-1(LAMP-1) 단클론성 항체, 또는 (b) 항-KS 단클론성 항체 및 항-LAMP-1 다클론성 항체였다. 사용한 2차 항체는 항-GALNS 또는 항-KS 항체를 검출하기 위한 Alexa-488(녹색) 컨쥬게이된 항체, 또는 항-LAMP-1 항체를 검출하기 위한 Alexa-555 또는 -594(적색) 컨쥬게이트된 항체이었다. 핵을 염색시키는 DAPI를 함유하는 양으로 MQCH 세포 제조를 시작하였다.

리소좀 마커, LAMP-1에 의한 GALNS 효소 및 KS의 상당한 공동-편재화를 GALNS-처리 MQCH 세포에서 관찰하였다. 재조합 인간 GALNS에 MQCH의 노출 시, 세포내 KS의 양을 감소시켰다.

상기 실시예 IV에 기재된 바와 같이 GALNS 효소 포획 ELISA 및 GALNS 특이적 활성 ELISA를 사용하여 GALNS 흡수를 측정하였다. GALNS를 발현시키는 정상 인간 연골세포(NHKC)를 양성 대조군으로 사용하였다. 표 11 및 표 12에 나타낸 바와 같이, 미처리 MQCH 세포는 GALNS 효소 또는 활성을 가지는 반면, 10nM GALNS로 9주 동안 처리한 MCQH 세포는 상당한 GALNS 효소 및 활성을 가졌다.

MQCH 세포를 사용하는 GALNS 효소 포획 ELISA
	MQCH 세포	NHKC
처리 없음	N.D.^a	0.12^b
9주 동안 10nM GALNS	3.99	0.88
^a검출되지 않음:^bng GALNS 항원/㎍ 전체 단백질

MQCH 세포를 사용하는 GALNS 특이적 활성
	MQCH 세포	NHKC
처리 없음	N.D.^a	2.76^b
9주 동안 10nM GALNS	3.68	5.15
^a검출되지 않음:^bGALNS 활성/ng 항원

이들 결과는 정제된 재조합 인간 GALNS이 모르퀴오 연골세포에 의해 리소좀 내로 취해지며, 시험관내 리소좀 KS를 분해시킬 수 있다는 것을 증명한다. 이들 모르퀴오 연골세포는 KS를 분해시키는 GALNS와 같은 리소좀 설파타제 효소를 시험하기 위한 시험관내 효능 모델로서 유용하다.

실시예 IX

시험관내 세포-기반 분석에서 천연 기질을 분해하기 위한 재조합 인간 리소좀 효소의 활성

세포 기반 시험관내 분석을 진행하여 재조합 인간 리소좀 효소, 예를 들어 천연 기질을 분해하는 리소좀 설파타제 효소의 활성을 측정하였다.

인공 형광 기질을 사용하여 재조합 인간 리소좀 효소, 예를 들어 리소좀 설파타제 효소의 효소 활성을 무세포 시험관내 분석으로 전형적으로 측정한다(GALNS에 대한 실시예 4 참조). 그러나, 측정된 효소 활성은 인공 기질의 크기, 즉 단당류 단위의 수에 의존적이다. 추가로, 효소 활성을 생체내 상황을 반영하지 않는 환경에서 측정한다. 따라서 무세포 시험관내 분석은 천연 기질을 절단하는 리소좀 효소의 능력 또는 표적 세포 내로 취해지고 리소좀에 대해 국소화되는 그것의 능력을 고려하지 않았다.

세포 기반 시험관내 분석을 진행시켜 2개의 재조합 인간 리소좀 효소, 즉 알파-L-이듀로니다제(IDU) 및 아릴설파타제 B(ARSB)의 그것의 천연 기질, 즉 세포내 더마탄 설페이트(DA)-함유 기질을 분해시키기 위한 활성을 측정하였다. DS는 일정치 않게 설페이트화된 이듀론산β(1-3)-N-아세틸-갈락토사민β(1-4) 이당류 단위를 함유한다.

ARSB-결핍 GM00519 인간 섬유아세포 또는 IDU-결핍 GM01391 인간 섬유아세포를 12-웰 플레이트에서 컨플루언시로 배양시켰고, 배양물을 컨플루언시 후 3 내지 6주 동안 유지시켜 세포내 DS를 축적시켰다.

그 다음에 컨플루언시 후 GM00519 또는 GM01391 세포를 각각 재조합 인간 ARSB(10nM) 또는 재조합 인간 IDU(25nM)의 포화 용량에 4-5일 동안 노출시켰다. 미처리 및 리소좀 설파타제 효소-처리 세포를 채취하였고, 용해하였으며, 원심분리시켰다.

세포 용해물 내 리소좀 효소 활성을 다음에 의해 세포의 잔여 DS 함량을 결정함으로써 측정하였다: (1) 세포를 용해시키는 단계; (2) 세포 용해물 내 콘드로이틴 ABC 리가제(EC 4.2.2.4)를 사용하여 이당류 내로 DS-함유 기질을 특이적으로 분해시키는 단계; (3) 형광 염료(예를 들어, 2-아미노-아크리돈, AMAC)으로 DS 이당류를 표지하는 단계; (4) DS 이당류를 분리시키는 단계(예를 들어, 모세관 구역 전기영동(capillary zone electrophoresis, CZE)에 의해); 및 (5) 표지된 DS 이당류를 검출하는 단계(예를 들어 레이저-유발 형광(laser-induced fluorescence, LIF)). 이러한 방법은, 예를 들어 문헌[Zinellu et al., Electrophoresis 2:2439-2447, 2007] 및 문헌[Lamari et al., J. Chromatogr. B 730: 129-133, 1999(문헌[Volpi et al., Electrophoresis 29:3095-3106, 2008]에서 검토)]에 기재되어 있다.

표 13은 우세한 DS 이당류인 N-아세틸갈락토사민-4-설페이트(4S 이당류)를 함유하는 이당류의 양을 측정함으로써 결정되는 바와 같이 ARSB로 처리한 GM00519 세포를 사용하는 DS의 분해 백분율을 나타낸다. IDU로 처리한 GM01391 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.

세포 기반 시험관내 분석에서 ARSB 에 의한 DS 의 검출
세포의 연령 (주)	GM00519 세포 (분해%) ^a
3	86
4	92
5	92
6	89
^a미처리 세포와 비교하여 ARSB-처리로부터 용해물 내 CZE-LIF에서 검출한 4S 이당류의 곡선하면적을 측정함으로써 분해 백분율을 계산하였다

상기 분석은 표적 세포가 재조합 인간 ARSB 및 IDU를 취하였고, 이것이 그 후에 천연 기질인 세포내 DS를 분해하는 리소좀으로 편재화된다는 것을 나타내었다.

IDU가 이 세포기반 분석에서 속도 제한이 되는 농도를 결정하기 위하여 용량 발견 실험을 수행하였다. GM01391 세포를 12-웰 플레이트에서 배양시켰다. 4주에 컨플루언시 후, 세포를 6 또는 26시간 동안 0.8nM 내지 25nM의 다양한 농도의 IDU에 노출시켰다. 세포 용해물을 제조하였고 상기 기재한 바와 같이 처리하였다. 1nM 미만으로 속도를 제한하지 않도록 IDU를 결정하였다.

제2 용량 발견 실험에서, 3주 컨플루언시 후에 GM01391 세포를 2일 동안 0.01 내지 0.2nM의 다양한 농도에 노출시켰다. 세포 용해물을 제조하였고 상기와 같이 처리하였다. 처리 동안 회수를 위한 조절을 위하여 이 실험에서 내부 표준 단당류인 GlcNAc-6S의 알려진 양을 세포 용해물 내로 섞었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, DS 기질 양의 용량 의존적 감소를 IDU-처리 GM01391 세포에서 관찰하였다.

유사한 용량 발견 실험에서, 컨플루언시 후 3주에 GM00519 세포를 0.001 내지 0.06nM의 ARSB의 다양한 농도에 5일 동안 노출시켰다. 세포 용해물을 제조하였고 상기와 같이 처리하였다. 이 실험에서, 처리 동안 회수를 위한 조절을 위하여 내부 표준 단당류인 GlcNAc-6S의 알려진 양을 세포 용해물 내로 섞었다. 도 14에 나타내는 바와 같이, DS 기질 양의 용량 의존적 감소는 ARSB-처리된 GM00519 세포에서 관찰되었다.

세포-기반 시험관내 분석을 진행하여 천연 기질, 즉 세포내 케라탄 설페이트(KS)-함유 기질을 분해하는 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소인 GALNS의 활성을 측정하였다.

GALNS-결핍 MQCH 세포를 상기 실시예 8에 기재된 바와 같이 배양하였고, 1 또는 10nM에서 재조합 인간 GALNS로 처리하였다. 처리 후, MQCH 세포 용해물을 제조하였고 더 큰 KS 올리고당을 KS 이당류로 쪼개는 케라타나제 II(EC 3.2.1)로 분해하였다. DS 이당류에 대해 상기 기재한 바와 같이 KS 이당류를 AMAC로 표지하였고, CZE로 분리시켰으며, LIF로 검출하였다. 처리 동안 회수를 위한 조절을 위하여 내부 표준으로서 세포 용해물 내로 GlcNAc-6S, KS 단당류를 섞었다. 2개의 특징적 KS 이당류, Gal6S-GlcNAc6S 및 Gal-GlcNAc6S를 측정하였고, 얻은 데이트를 회수한 Gal-GlcNAc6S의 양으로 보정하였다. 표 14는 2개의 특징적 KS 이당류의 양을 측정하는 것에 의해 결정되는 바와 같이 GALNS로 처리된 MQCH 세포를 사용하는 KS의 분해%를 나타낸다.

세포기반 시험관내 분석에서 GALNS 에 의한 KS의 고갈
	Gal6S - GlcNAc6S	Gal- GlcNAc6S
1nM GALNS	85.7^a	78.5^b
10nM GALNS	88.6	81.5
^a,b 미처리 MQCH 세포와 비교하여 GALNS-처리로부터 용해물 내 CZE-LIF 스캔에서 검출된 Gal6S-GlcNAc6S 및 Gal-GlcNAc6S의 곡선하면적을 측정하고, 급증 대조군 GlcNAc6S의 곡선하 면적을 조절함으로써 분해%를 계산하였다

상기 분석은 표적 세포가 재조합 인간 GALNS를 취하며, 이것이 그 다음에 GALNS가 그것의 천연 기질인 세포내 KS를 분해하는 리소좀으로 편재화된다는 것을 나타내었다.

전반적으로, 이들 결과는 천연 기질을 분해하기 위한 재조합 인간 리소좀 효소, ARSB, IDU 및 GALNS의 활성이 세포기반 시험관내 분석에서 측정되고 정량화될 수 있다는 것을 증명하였다. 이 세포 기반 시험관내 분석은 다른 리소좀 설파타제 효소뿐만 아니라 매우 다양한 재조합 리소좀 효소의 활성을 측정하고 정량화하도록 용이하게 변형될 수 있다는 것이 인식되어야 한다.

실시예 X

특이적 조직에 재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 전달

마우스에 투여 시 GALNS의 결핍에 의해 영향받거나 또는 결핍과 관련된 특정 조직에 전달되도록 G71 세포내에서 발현되고 정제된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 능력을 평가하였다.

케라탄 설페이트의 고도로 특이적인 분포는 점액다당류증 IVa 형(MPS IVA) 또는 모르퀴오 증후군의 매우 특징적인 표현형을 제공한다. 케라탄 설페이트는 연골(관절 뼈 성장판, 심장판막, 후두 및 비강 격막) 및 각막에서 주로 발견되며, 이것은 MPS IVA 환자에서 케라탄 설페이트 축적을 나타내는 이들 조직이다. 따라서, MPS IVA 또는 모르퀴오 증후군에서 결핍된 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)에 대해, 긴 뼈의 성장판, 심장판막, 각막, 후두 및 코에 GALNS 효소의 전달을 나타내는 것을 중요하다. 불량하게 혈관화된 표적인 이들 특이적 조직을 보기 위하여, 형광 GALNS의 전달을 마우스에서 조사하였다.

2가지의 면역조직화학적 염색 방법을 마우스에서 시험하였다: (1) Alexa 488와 컨쥬게이트된 인간 GALNS 및 (2) 분자 프로브 Alexa Fluor 488 C5 말레이미드 표지 키트(A-10254)를 사용하여 비컨쥬게이트된 인간 GALNS. Alexa 488에 인간 GALNS의 컨쥬게이션을 수행하였다. 말레이미드 컨쥬게이션 화학은 단백질 비에 대해 1:1 표지를 초래하였다.

형광 태그가 GALNS의 흡수를 방해하지 않았다는 것을 확인하기 위하여, 배양된 활막세포(ATCC # CRL- 1832)를 사용하여 면역세포화학 실험을 행하였다. 표준 흡수 분석을 사용하여 비컨쥬게이트된 GALNS와 컨쥬게이트된 GALNS(GALNS-A488 또는 GALNS-A555)를 비교하였다. 2시간 동안 α-L-이듀로니다제(IDU)로 이후의 추적에 의해 4시간 동안 GALNS 효소와 함께 세포를 인큐베이션시켰다. 결과는 Alexa 488 컨쥬게이션이 세포 흡수를 방해하지 않았다는 것을 나타낸다. 도 15는 GALNS, GALNS-A488, 및 GALNS-A555에 대해 추정된 Kd를 나타낸다. 효소 활성보다는 세포 용해물의 항원 ELISA에 의해 흡수를 측정하였는데 표지가 효소를 불활성화시키기 때문이다. 비컨쥬게이트되고 컨쥬게이트된 GALNS 효소의 Kd는 대략 동일한 것으로 결정하였다.

일단 GALNS 효소가 세포 내로 포함되면 형광 태그의 안정성을 결정하기 위하여, 비컨쥬게이트되고 컨쥬게이트된 GALNS 상의 면역 염색을 수행하였다. 염색을 위해 사용한 1차 항체는 1 ㎍/㎖의 농도에서 단백질 G-정제된 항-GALNS 토끼 항체이었다. MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 Leica IRE2 광시야 epi-형광 현미경에서 모든 이미지를 촬영하였다. 이미지 더미의 디콘볼루션(Deconvolution)은 각변형 빛의 존재에 기인하여 이들 이미지의 공동 편재화를 측정하는데 필요하였다. 디콘볼루션을 행하였다.

이론적 점상 강도 분포 함수(블라인드 알고리즘)을 사용하는 AutoQuant/AutoDeblur 시각화 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션을 행하였다.

면역 염색은 GALNS-A488 물질로 증폭시킨 신호와 꽤 양호한 중첩을 나타내었다. 민감성에서 관찰된 증가는 다클론성인 1차 항체 및 2차 항체에 기인한다.

GALNS 효소가 리소좀에 표적화되었는지 여부를 결정하기 위하여, 리소좀 내에 편재화된 분자 프로브 Lysotracker 또는 다른 효소와 함께 배양시킨 활막세포의 면역염색을 수행하였다. Lysotracker는 GALNS-488 효소와 일부 중첩을 보이는 것으로 나타났지만; 염색은 균일하지 않았다. 리소좀 효소인 재조합 인간 N-아세틸갈락토스 아민-4-설파타제(rhASB)에 의한 2시간 추적은 GALNS와 일부 공동편재화를 나타내었다.

상기 실험은 GALNS-A488 효소가 세포에 의해 취해지고 리소좀으로 편재화되며, 생체내 생분포를 결정하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.

2가지의 생체내 연구를 수행하였다. 제1 파일럿 연구는 정상 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥 내 1회 용량의(10㎎/㎏) 볼루스 주사이었고, 그 다음에 제2 연구는 정상 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥 내 10㎎/㎏의 다른 날 마다 다회(5) 주사된다. 표 15 및 표 16은 각각 제1 및 제2 연구에 대한 실험 계획을 기재한다.

제1 파일럿 연구의 실험 설계
그룹	전체	2시간 시점	24시간 시점
PBS 대조군	4	2	2
GALNS-A488	4	2	2
미표지 GALNS	4	2	2
미표지 ASB	1	1	0

제2 연구의 실험 설계
그룹	전체	2시간 시점	4시간 시점	8시간 시점
PBS 대조군	2	1	0	1
PBS/Cys 대조군	4	2	0	2
GALNS-A488	9	3	3	3
미표지 GALNS	6	3	0	3
미표지 ASB	3	2	0	1

제1 파일럿 연구에서, 심장, 간 및 경골/대퇴골 관절을 2시간 및 24시간 시점에 채취하였다. 제2 연구에서, 심장, 신장, 간 및 뼈를 사두근 및 가자미근과 함께 2시간, 4시간 및 8시간 시점에 채취하였다. 두 연구에 대해, 심장, 신장 및 간을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)에서 4일 동안 담지 고정시켰고, 파라핀 포매시킨 다음, 7㎛ 두께로 절편화하였다. 제2 연구에서 근육을 포함하는 뼈를 4% PFA 중에서 8일 동안 담지 고정시켰고, 석회질을 제거하였으며, 파라핀 포매시키고, 7㎛ 두께로 절편화하였다.

GALNS-A488 주사 마우스의 이미지를 Zeiss 레이저 스캐닝 공초점 현미경 상에서 획득하였다. 제1 파일럿 연구에서 분석을 위하여, 샘플 당 하나의 공초점 스택을 심장 판막 및 간에 대해 획득하였고, 용적측정 분석을 위해 사용하였다. 2개의 공초점 스택/샘플을 성장판에 대해 획득하였고, 용적측정 분석을 위해 사용하였다. 제2 연구에서, 심장 판막, 신장 및 간에 대한 하나의 공초점 스택/샘플을 획득하였고, 용적측정 분석을 위해 사용하였으며; 성장판 및 나머지 연골 구역(zone of rest cartilage, zrc)에 대한 2개의 공초점 스택/샘플을 획득하였고 용적측정 분석을 위해 사용하였다.

공초점 현미경 이미징 연구로부터의 결론은: (1) 생체내 형광 GALNS를 검출하는 것이 가능하며; (2) 신호는 특이적(배경의 부재)이고 편재화는 리소좀이며; (3) GALNS의 존재는 간의 동공모양 세포에서 증명되었고; (5) 심장에서, GALNS 효소는 격막 및 심방에 존재하지만, 더 중요하게는 다수 회 주사 후 더 깊이 분포되는 심장판막의 수준에서 분명하게 눈에 보이며; (6) 대퇴골/경골 접합에서, GALNS 효소는 뼈(골단)뿐만 아니라 골수의 석화된 부분에 존재하였다. GALNS는 성장판에 존재하였다. 더 구체적으로는, GALNS는 나머지 구역의 연골세포에서 흔하였고(또는 저장 연골의 구역), 증식 구역의 시작에 존재하며, 성장판 마지막의 골화부에서 풍부하게 다시 나타났다. 다수 회 주사의 누적적 효과를 정량화하는 것이 어렵지만, 제2 연구는 더 넓은 분포를 나타내는 것으로 보였다. 표 17은 공초점 현미경 이미징 연구의 요약이다.

마우스에서 GALNS 의 생분포
조직	편재화
뼈(대퇴골)
석회 영역	있음
골수	있음
성장판	있음
심장
판막	있음
심방	있음
격막	있음
간
간세포	없음
동공모양 세포	있음

2차 염색을 위하여, 개시 단계는 GALNS 1차 항체의 최적화였다. 단백질 G-정제된 항-GALNS 토끼 항체와 함께 1:100 내지 1:400의 희석으로 다양한 조직을 염색하였다. 제1 파일럿 연구의 결과는 1:100의 희석이 높은 신호 대 노이즈 비에 대해 최적화되었다는 것을 나타내었다. 이 결과는 제2 연구에서 확인하였다. 1:100의 1차 항체 희석 및 1:1000의 2차 항체 희석으로 남은 슬라이드를 처리하였다.

GALNS와 함께 투여된 Balb/c 마우스에 대한 신호는 단백질 G-정제된 항-GALNS 항체로 염색했을 때 상기 대조군(즉, PBS-Cys 투여된 마우스) 신호를 가졌다. GALNS 효소가 리소좀 내에서 편재화되는 것을 확인하기 위하여, 절편을 항-LAMP1 항체로 염색하였다. LAMP1은 리소좀에 대한 마커이다. 이미지는 항-LAMP1과 항-GALNS 항체 사이의 중첩을 나타내었으며, 이는 GALNS 효소가 리소좀 내에서 편재화되었다는 것을 나타낸다.

전반적으로, 2개의 생체내 연구는 GALNS 생분포가 혈관 발달과 연결되며, 즉 더 혈관발달된 조직은 더 형광성인 신호를 함유한다는 것을 나타낸다. 더 중요하게는, 해당 연구는 모르퀴오 증후군의 케라탄 설페이트 축적 부위에서, 이들 부위가 불량하게 혈관발달되었다고 하더라도, GALNS의 존재를 증명한다.

실시예 XI

인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 조제물

본 목적은 본 발명의 조제물 내 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 활성 및 구조 상에서 다양한 부형제, 예를 들어 완충제, 등장제 및 안정제의 효과를 조사하는 것이다.

GALNS 효소를 실시예 V에 기재된 바와 같이 제조하였다.

GALNS 효소는 실시예 VII에 기재된 것을 특징으로 하였다.

실시예 V에서, 정제된, 재조합 인간 GALNS 효소를 10mM NaOAc/HOAc, 1mM NaH₂PO₄, 150mM NaCl 및 0.005% 또는 0.01% Tween-20 중의 pH 5.5에서 조제하였다. 저 농도의 인산염 완충제에서 저장 시 GALNS 효소의 탈인산화가 발생한 것을 주목하였다. 따라서, 인산염 완충제 농도를 100mM NaH₂PO₄로 증가시켰다. 고 농도 인산염 완충제에서 저장 시, GALNS 효소의 상당한 탈인산화가 관찰되지 않았다. 그러나, GALNS의 가용성 응집물을 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 저장시 관찰하였고, GALNS의 불용성 응집물을 40℃에서 저장시 관찰하였다.

제1 연구에서, 재조합 GALNS의 안정성에서 안정제 농도 및 pH의 효과를 평가하였다. 정제된 재조합 GALNS 효소를 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 0.01% Tween-20, 및 4% 수크로스 또는 2% 솔비톨에서 조제하였다. 시험한 안정제: 15mM 또는 30mM 아르기닌 염산염(아르기닌 HCl); 및 15mM 또는 30mM NaCl. 시험한 pH : 5.0, 5.4 및 5.8. pH 5.8. pH 5.8 내지 6.0에서 다양하도록 조제물을 결정하였다. 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 2개월까지 동안 효소 조제물을 저장한 후, 실시예 VI에 기재된 다양한 분석을 사용하여 GALNS 효소를 분석하였다.

크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 GALNS 효소를 프로파일링함으로써 다양한 조제물 내 가용성 응집물의 형성을 결정하였다. 15mM와 30mM 아르기닌 HCl의 존재는 SEC-HPLC에 의해 결정되는 바와 같은 가용성 응집물의 성장을 억제하였다(도 16).

조제물 내 GALNS 효소 활성의 안정성을 시험관 내 효소 활성 분석을 사용하여 측정하였다. 5℃에서, GALNS 효소 활성은 아르기닌 HCl 또는 NaCl의 존재에서 안정하였고; 25℃에서, GALNS 효소 활성은 아르기닌 HCl 또는 NaCl 중 하나의 존재에서 약간 감소되었으며; 40℃에서, 조제물을 함유하는 NaCl에서 GALNS 효소 활성은 최소의 안정성을 나타내었다(도 17).

아스파라긴 N-연결된 올리고당을 절단하기 위한 PNGase F에 의한 효소의 분해 후 모세관 전기영동(CE)에 의해 비스-인산화된 만노스 7(BPM7)의 백분율을 측정함으로써 조제물 내 GALNS 효소의 탈인산화를 조사하였다. 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 2개월 후, 모든 효소 조제물 내 GALNS 효소는 I상 임상 조제물에 사용된 GALNS의 기준 로트의 글라이코실화 프로파일과 유사한 BPM7%에 대해 글라이코실화 프로파일을 가졌다(도 18).

조제물 내 GALNS 효소의 정제를 역상-고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의한 효소 프로파일링에 의해 결정하였다. 5℃ 또는 25℃에서 2개월 후, 조제물 중 어떤 것도 임의의 피크 영역 변화를 나타내지 않았다; 40℃에서, pH 5.0 및 pH 5.4에서 조제물을 함유하는 아르기닌 HCl은 어떤 피크 영역 변화를 나타내지 않았지만, pH 5.0 및 pH 5.4에서 조제물을 함유하는 HCl 및 pH 5.8에서 모든 조제물은 피크 영역에서 감소를 나타내었다(도 19). RP-HPLC 크로마토그램에서, 조제물에서 후-피크 숄더를 관찰하였다. 30mM 아르기닌 HCl을 함유하는 GALNS 조제물은 적어도 우세한 후-피크 숄더를 나타내었다.

실시예 XII

인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제(GALNS)의 대표적인 조제물

다음의 실시예는 모르퀴오 증후군 또는 MPS IVa의 치료에 유용한 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 이것의 유사체를 포함하는 조성물을 조제하기 위하여 사용되는 변수에 대한 가이드를 제공한다. 본 발명의 GALNS 조성물을 조제하기 위해 사용되는 변수는, 이에 제한되는 것은 아니지만, pH를 유지하기 위한 완충제, 등장 조절제, 안정제의 부재 또는 존재, 및 다른 부형제의 부재 또는 존재, 비히클 등을 포함한다.

실시예 XI에서, 재조합 GALNS를 약 1㎎/㎖의 농도에서 조제하였다. 바람직한 GALNS를 약 0.1 내지 10㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.5 내지 5㎎/㎖, 및 더 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5㎎/㎖의 범위에 있는 농도에서 조제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 GALNS 조성물의 조제물은 약 1 +/- 0.5㎎/㎖의 GALNS 효소 농도를 가진다.

실시예 XI에서, 재조합 GALNS 효소를 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄ 중의 pH 5.0, 5.4 및 5.8에서 조제하였다. 바람직한 완충제는 NaOAc/HOAc 또는 그것의 동등물, 및 NaH₂PO₄, 또는 그것의 동등물이며, NaOAc/HOAc 농도는 약 5 내지 100mM, 바람직하게는 약 5 내지 50mM, 및 더 바람직하게는 약 10 내지 30mM의 범위에 있고, NaH₂PO₄ 농도는 약 5 내지 100mM, 바람직하게는 약 25 내지 100mM, 및 더 바람직하게는 약 25 내지 75mM의 범위에 있다. 대표적인 실시형태에서, 본 발명의 GALNS 조성물의 조제물은 약 20 +/- 10mM의 NaOAc/HOAc 완충제 농도 및 약 50 +/- 25mM의 NaH₂PO₄ 완충제 농도를 가진다.

조제물의 바람직한 pH는 약 pH 4.5-6.5, 바람직하게는 약 pH 5.0-6.0, 및 더 바람직하게는 약 pH 5.0-5.8이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 GALNS 조성물의 조제물은 약 pH 5.4 +/- 0.4의 pH를 가진다.

실시예 XI에서, 재조합 GALNS 효소는 15mM 또는 30mM 아르기닌 HCl 또는 NaCl 중에서 조제하였다. 바람직한 안정제는 약 5 내지 200mM, 바람직하게는 약 10 내지 100mM, 및 더 바람직하게는 약 10 내지 50mM의 범위에 있는 농도를 갖는 아르기닌 HCl, 또는 그것의 동등물이다. 대표적인 구체예에서, 본 발명의 GALNS 조성물의 조제물은 약 30 +/- 20mM의 아르기닌 HCl 농도를 가진다.

실시예 XI에서, 재조합 GALNS 효소는 0.01% Tween-20 중에서 조제되었다. 바람직한 안정제는 약 0.001 내지 1.0%(w/v), 바람직하게는 약 0.005 내지 0.2%(w/v), 및 더 바람직하게는 약 0.005 내지 0.015%(w/v) 범위에 있는 농도를 갖는 Tween-20(폴리솔베이트-20으로 공지됨) 또는 그것의 동등물이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 GALNS 조성물의 조제물은 약 0.01% +/- 0.005%(w/v)의 Tween-20 농도를 가진다.

실시예 XI에서, 재조합 GALNS 효소는 4% 수크로스 또는 2% 솔비톨 내에서 조제된다. 바람직한 안정제/세포보호제/등장제는 솔비톨, 또는 그것의 동등물이며, 약 0.1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.5 내지 5%(w/v), 및 더 바람직하게는 약 1.0 내지 3.0%(w/v)의 범위에 있는 농도를 가진다. 본 발명의 GALNS 조성물의 대표적인 조제물은 약 2.0% +/- 1.0%(w/v)의 솔비톨 농도를 가진다.

따라서, 본 발명의 GALNS 효소 조성물을 표 18에 나타낸다.

재조합 인간 GALNS 의 대표적인 조제물
성분 분류	성분 유형	농도 범위
활성성분	재조합 인간 GALNS	1.0+/-0.5㎎/㎖
완충제	NaOAc/HOAc 아세트산나트륨, 3수화물*	20mM+/-10mM (2.72㎎/㎖+/-1.36㎎/㎖) 및 pH 5.4+/-0.4
완충제	NaH₂PO₄ 인산나트륨, 1염기성 1수화물	50mM+/-25mM (6.90㎎/㎖+/-3.45㎎/㎖)
안정제	아르기닌 HCl	30mM+/-20mM (6.32㎎/㎖+/-4.11㎎/㎖)
안정제	Tween-20	0.01(w/v)+/-0.005%(w/v) (0.1㎎/㎖+/-0.05㎎/㎖)
안정제, 세포보호제 및 등장제	솔비톨	2.0%(w/v)+/-1.0%(w/v) (20㎎/㎖+/-10㎎/㎖)
*pH는 빙초산(HOAc) 또는 1N 수산화나트륨(NaOH)와 적정에 의해 조절됨

실시예 XIII

리소좀 설파타제 효소 활성이 결핍된 마우스에서 재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 및 다른 리소좀 설파타제 효소의 효과

리소좀 설파타제 효소 활성이 결핍된 마우스에서 본 발명의 활성의 고도로 인산화된 인간 리소좀 설파타제 효소, 예를 들어 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)의 효과를 평가한다.

재조합 인간 GALNS 단백질을 G71S 세포 내에서 발현시키고 정제하였다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 다른 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소가 발현되고 정제될 수 있다.

인간 리소좀 설파타제 효소 결핍의 몇몇 마우스 모델이 기재되며, 하기를 포함한다: 이염백질이영양증 (MLD)(아릴설파타제 A 결핍증), (Hess et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 93: 14821-14826, 1996), 점액다당류증 VI 형(MPS VI) 또는 마르토-라미증후군(아릴설파타제 B 결핍증)(Evers et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8214-8219, 1996), 점액다당류증 II 형(MPS II) 또는 헌터증후군(이듀로네이트-2-설파타제 결핍증)(Muenzer et al., Acta Paediatr . Suppl . 91(439):98-99, 2002; Cardone et al., Hum. Mol . Genet. 15: 1225-1236, 2006), 점액다당류증 type IIIa(MPS IIIa) 또는 산필립포 A 증후군(설파미다제/헤파린-N-설파타제 결핍증)(Bhaumik et al., Glycobiology 9(12): 1389-1396, 1999), 점액다당류증 IVa 형(MPS IVa) 또는 모르퀴오 A 증후군(N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 결핍증)(Tomatsu et al., Hum. Mol . Genet. 12:3349- 3358, 2003), 및 다중 설파타제 결핍증(MSD)(설파타제 변형 인자 1 결핍증)(Settembre et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 104:4506-4511, 2007). 점액다당류증 IIId 형(MPS IIId) 또는 산필립포 D 증후군(N-아세틸글루코사민-6-설파타제 결핍증)의 마우스 모델은 이제 기재한다.

인간 리소좀 설파타제 효소 결핍증의 마우스 모델을 사용하여 리소좀 저장 장애를 치료하기 위한 수단으로서 효소 대체 치료(enzyme replacement therapy, ERT)의 실행가능성을 평가할 수 있다. 예를 들어, MPS IVa 녹아웃 마우스(GALNS ^-/- 마우스; Tomatsu et al., Hum. Mol . Genet. 12:3349-3358, 2003)를 검출가능한 GALNS 효소 활성을 가지지 않았고, 증가된 소변 글라이코사미노글라이칸(GAG), 즉 케라틴 설페이트 및 콘드로이틴-6-설페이트 및 다수의 조직 및 기관, 예를 들어 간, 신장, 비장, 심장, 뇌, 골수 및 연골에서 GAG 축적을 나타내었다. 그러나 GALNS ^-/- 마우스는 인간 질병과 관련된 골격 이상을 나타내지 않았다. 다른 MPS IVa 마우스 모델은 불활성 인간 GALNS 및 돌연변이될 불활성 내인성 마우스 GALNS(GALNS ^{tm(hC79.mC76S)slu} 마우스; Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 14:3321- 3335, 2005)를 발현시키는 것을 진행시켰다. 검출가능한 GALNS 효소 활성을 가지지 않는 GALNS(GALNS ^{tm(hC79.mC76S)slu} 마우스에서, 소변 GAG 배설이 증가되었고, GAG는 내장기관, 뇌, 각막, 뼈, 인대 및 골수를 포함하는 다수의 조직에 축적되었고, 리소좀 저장이 다수의 조직에 표시되며, 뼈 저장은 명백하다. GALNS ^tm( ^hC79 ^. ^mC76S ^)slu 마우스에서 병적 변경은 GALNS ^-/- 마우스에서 관찰된 것과 상이하다. 그러나, GALNS ^-/- 마우스와 같이, GALNS ^{tm(hC79.mC76S)slu} 마우스는 인간 질병과 관련된 골격 이상을 나타내지 않았다. 따라서, GALNS ^-/- 또는 GALNS ^tm ⁽ ^hC79 ^. ^mC76S ^)slu 마우스는 증가된 소변 GAG 및 조직내 GAG 축적 상에서 재조합 인간 GALNS의 투여 효과를 조사하기 위해 사용될 수 있다.

4주령의 GALNS ^-/- 또는 GALNS ^tm ⁽ ^hC79 ^. ^mC76S ^)slu 또는 야생형 마우스에게 16 내지 20주령까지 다양한 용량의 재조합 인간 GALNS(예를 들어, 0.1, 0.3, 1, 3, 10㎎/㎏) 또는 비히클 대조군의 매주 정맥내 주사(n = 그룹 당 적어도 6 또는 8마리)가 주어진 다음, 족직학적 검사를 위해 희생시켰다. 마우스로부터 소변을 수집하고, 소변 GAG 배출을 기재된 바와 같이 결정한다(Tomatsu et al., Hum. Mol . Genet. 12:3349-3358, 2003). 다양한 조직의 병리학적 검사를 기재된 바와 같이 수행한다(Tomatsu et al., Hum. Mol . Genet. 12:3349-3358, 2003).

GALNS ^-/- 또는 GALNS ^tm ⁽ ^hC79 ^. ^mC76S ^)slu 마우스를 사용하여, 본 발명의 재조합 인간 GALNS는 다음을 감소시키는 능력을 증명하는 것으로 기대된다: (1) 소변 GAG 배출; (2) 다수의 조직, 예를 들어 내장기관, 뇌, 각막, 뼈, 인대 및 골수에서 GAG의 축적; (3) 다수의 조직에서 리소좀 저장; 및 (4) 뼈 저장.

재조합 인간 GALNS의 효과를 다중 설파타제 결핍증(MSD)의 마우스 모델에서 조사한다(SUMFl ^-/- 마우스; Settembre et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:4506-4511, 2007). SUMFl ^-/- 마우스가 아직 어릴 때 빈번한 사망률을 나타내기 때문에, 재조합 인간 GALNS를 갖는 이들 마우스의 주입은 GALNS ^-/- 마우스에 대해 상기 기재한 것보다 더 빨리 개시한다.

당업계에 공지된 방법에 따라서, 다른 재조합 인간 리소좀 설파타제 효소, 즉, 아릴설파타제 A, 아릴설파타제 B, 이듀로네이트-2-설파타제, 설파미다제/헤파린-N-설파타제 및 N-아세틸글루코사민-6-설파타제의 효과를 MLD의 마우스 모델에서 조사한다(ASA ^-/- 마우스; Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14821-14826, 1996), MPS VI(Asl-s^-/- 마우스; Evers et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8214-8219, 1996), MPS II(ids ^y ^/- 마우스; Cardone et al., Hum. Mol . Genet. 15: 1225-1236, 2006), MPS IIIa(Bhaumik et al., Glycobiology 9(12): 1389-1396, 1999) 및 MSD(SUMF1 ^-/- 마우스; Settembre et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:4506-4511, 2007).

실시예 XIV

재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 설파타제 ( GALNS ) 및 다른 리소좀 설파타제 효소에 의한 점액다당류 IVA형(또는 모르퀴오 증후군) 또는 다른 리소좀 설파타제 효소 결핍증에 걸린 인간의 치료

리소좀 설파타제 효소 결핍증의 임상적 표현형을 나타내는 인간환자, 예컨대 점액다당류증 IVA 형(MPS IVa 또는 모르퀴오 증후군)으로 진단된 환자는 재조합 효소, 즉 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS)에 의한 효소 대체 치료를 위해 고려된다. 리소좀 설파타제 효소 결핍증에 걸린 모든 환자는 기능 손상 정도를 달리하거나 또는 특정 리소좀 저장 질병과 관련된 건강 상태를 악화시킴으로써 확인된 그들의 리소좀 내 저장 물질의 과량의 또는 해로운 내장 및 연조직 축적의 일부 임상증거를 나타낸다. 모든 MPS IVa 환자는 뼈 변형, 저신장 및 비정상보형 및/또는 혈액 또는 소변 내 글라이코사미노글라이칸의 축적의 일부 임상 증거를 나타내며, 기능손상 정도는 다르다.

바람직하게는, 효소 수준은 리소좀 설파타제 효소 결핍증에 걸린 환자에서 모니터링하여 그들의 조직 내 리소좀 설파타제 효소의 부재 또는 감소된 활성을 확인한다. 다른 정상 피험체에서 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더 바람직하게는 2% 미만 및 훨씬 더 바람직하게는 1% 미만의 리소좀 효소 활성을 갖는 환자는 적절한 리소좀 설파타제 효소에 의한 처리를 위한 적합한 후보이다. 치료 전, 치료 동안 및 치료 후 환자의 리소좀 설파타제 효소 활성을 결정하기 위하여 데이터를 수집할 수 있다.

시간에 따른 기질, 즉 리소좀 설파타제 효소의 글라이코사미노글라이칸(GAG)의 소변 배출에서 감소%를 측정함으로써 효능을 결정한다. 리소좀 설파타제 효소 결핍증에 걸린 환자에서 소변 GAG 수준을 정상 배출 수준 및/또는 동일 리소좀 설파타제 효소 결핍증에 걸린 미처리 환자에서 수준 및/또는 리소좀 설파타제 효소로 치료 전 동일 환자에서 수준과 비교한다. 리소좀 설파타제 효소에 의한 치료 후 미분해 GAG의 배출에서 25% 초과의 감소, 바람직하게는 50% 초과의 감소는 치료에 대한 개체의 반응을 측정하기 위한 유효한 의미이다.

리소좀 저장 질병과 관련된 병적측면의 감소된 징후 및 증상에 따라 효능을 결정할 수 있다. GAG가 리소좀, 세포 또는 조직 내에서 감소되는 정도를 결정하기 위한 세포 및/또는 라이소좀의 조직 생검 및 검사에 의해 효능을 결정할 수 있다. 객관적 또는 주관적일 수 있는 기능적 평가(예를 들어 감소된 통증 또는 기능의 곤란, 증가된 근육 강도 또는 체력, 증가된 심박출량, 지구적 운동, 체중, 신장 또는 외모의 변화 등)에 의해 효능을 결정할 수 있다.

재조합 인간 GALNS를 포함하는 약제학적 조성물을 G71S 세포 내에서 발현시키고 정제하였으며, 당업계에 공지된 방법에 따라서 조제하였다. 본 발명의 약제학적 조성물을 정맥내로 투여하는 것은 바람직하다.

MPS IVa 환자에 대한 재조합 인간 GALNS의 투여 효과를 조사하기 위한 초기 임상 연구의 기본적 설계는 개방표지, 다양한 용량의 효소가 고정된 간격으로 환자에게 정맥내로 투여되는 용량점증 안전성/효능 연구, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 매주의 효소 주사를 수반한다.

MPS IVa 환자에 대해, 예를 들어 ERT의 몇주 이내에 관찰될 가능성이 있는 감소된 혈액 또는 소변 GAG, ERT의 몇 개월 이내에 관찰될 가능성이 있는 심장, 폐 및/또는 운동 기능의 시험에서 증가된 지구력 및/또는 ERT의 몇 년 이내에 관찰될 가능성이 있는 근육 변화 및/또는 신체 성장을 측정함으로써 결정된다.

소변 GAG 측정은 시간에 따른 소변 GAG 배출에서 감소%를 측정함으로써 적절한 용량 섭생을 확립할 뿐만 아니라 효능을 결정하는데 유용하다.

예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 걷기 시험(6 또는 12분 내에 걸은 거리), 오르내리기(분 당 계단) 및 심장 기능(ECG, 심초음파), 폐 기능(FVC, FEV1; 최대 호기량)을 포함하는 폐/호흡 기능을 포함하는 다양한 지구력 시험이 사용될 수 있다.

연장된 시간 기간동안 처리를 받는 젊은 환자에 대해, 성장(신장)이 측정될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 처리되거나 방지될 수 있는 리소좀 설파타제 효소 활성의 결핍증과 관련된 리소좀 저장 질병은 이염백질이영양증(MLD), 점액다당류증 VI형(MPS VI) 또는 마르토-라미증후군, 점액다당류증 II형(MPS II) 또는 헌터증후군, 점액다당류증 IIIa 형(MPS IIIa) 또는 산필립포 A 증후군, 점액다당류증 IIId 형(MPS IIId) 또는 산필립포 D 증후군, 점액다당류증 IVa 형(MPS IVa) 또는 모르퀴오 A 증후군 또는 다중 설파타제 결핍증(MSD)이다. 각 리소좀 저장 질병에 대해, 재조합 리소좀 설파타제 효소는 특이적 리소좀 설파타제 효소를 포함한다.

MLD를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 아릴설파타제 A이다. MPS VI을 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 아릴설파타제 B이다. MPS II를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 이듀로네이트-2-설파타제이다. MPS IDA를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 설파미다제/헤파린-N-설파타제이다. MPS IIId를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 N-아세틸글루코사민-6-설파타제이다. MPS IVA를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제이다. MSD를 수반하는 방법에 대해, 바람직한 리소좀 설파타제 효소는 N-아세틸갈락토사민- 6-설파타제이다.

*****

상기 설명한 실시예에서 제시한 것과 같은 본 발명의 수많은 변형 및 변화는 당업자에게 떠오를 것으로 예상된다. 결론적으로 첨부하는 특허청구범위에 나타낸 바와 같은 이러한 제한만이 본 발명에 적용되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC. <120> MANUFACTURE OF ACTIVE HIGHLY PHOSPHORYLATED HUMAN N-ACETYLGALACTOSAMINE-6-SULFATASE ENZYMES AND USES THEREOF <130> WO/2012/012718 <140> PCT/US2011/045011 <141> 2011-07-22 <150> US61/366,714 <151> 2010-07-22 <160> 5 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human Sulfatase Modifying Factor 1 (SUMF1) Polynucleotide Sequence <400> 1 atggctgcgc ccgcactagg gctggtgtgt ggacgttgcc ctgagctggg tctcgtcctc 60 ttgctgctgc tgctctcgct gctgtgtgga gcggcaggga gccaggaggc cgggaccggt 120 gcgggcgcgg ggtcccttgc gggttcttgc ggctgcggca cgccccagcg gcctggcgcc 180 catggcagtt cggcagccgc tcaccgatac tcgcgggagg ctaacgctcc gggccccgta 240 cccggagagc ggcaactcgc gcactcaaag atggtcccca tccctgctgg agtatttaca 300 atgggcacag atgatcctca gataaagcag gatggggaag cacctgcgag gagagttact 360 attgatgcct tttacatgga tgcctatgaa gtcagtaata ctgaatttga gaagtttgtg 420 aactcaactg gctatttgac agaggctgag aagtttggcg actcctttgt ctttgaaggc 480 atgttgagtg agcaagtgaa gaccaatatt caacaggcag ttgcagctgc tccctggtgg 540 ttacctgtga aaggcgctaa ctggagacac ccagaagggc ctgactctac tattctgcac 600 aggccggatc atccagttct ccatgtgtcc tggaatgatg cggttgccta ctgcacttgg 660 gcagggaagc ggctgcccac ggaagctgag tgggaataca gctgtcgagg aggcctgcat 720 aatagacttt tcccctgggg caacaaactg cagcccaaag gccagcatta tgccaacatt 780 tggcagggcg agtttccggt gaccaacact ggtgaggatg gcttccaagg aactgcgcct 840 gttgatgcct tccctcccaa tggttatggc ttatacaaca tagtggggaa cgcatgggaa 900 tggacttcag actggtggac tgttcatcat tctgttgaag aaacgcttaa cccaaaaggt 960 cccccttctg ggaaagaccg agtgaagaaa ggtggatcct acatgtgcca taggtcttat 1020 tgttacaggt atcgctgtgc tgctcggagc cagaacacac ctgatagctc tgcttcgaat 1080 ctgggattcc gctgtgcagc cgaccgcctg cccaccatgg actga 1125 <210> 2 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human Sulfatase Modifying Factor 1 (SUMF1) Polypeptide Sequence <400> 2 Met Ala Ala Pro Ala Leu Gly Leu Val Cys Gly Arg Cys Pro Glu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Cys Gly Ala Ala 20 25 30 Gly Ser Gln Glu Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Leu Ala Gly 35 40 45 Ser Cys Gly Cys Gly Thr Pro Gln Arg Pro Gly Ala His Gly Ser Ser 50 55 60 Ala Ala Ala His Arg Tyr Ser Arg Glu Ala Asn Ala Pro Gly Pro Val 65 70 75 80 Pro Gly Glu Arg Gln Leu Ala His Ser Lys Met Val Pro Ile Pro Ala 85 90 95 Gly Val Phe Thr Met Gly Thr Asp Asp Pro Gln Ile Lys Gln Asp Gly 100 105 110 Glu Ala Pro Ala Arg Arg Val Thr Ile Asp Ala Phe Tyr Met Asp Ala 115 120 125 Tyr Glu Val Ser Asn Thr Glu Phe Glu Lys Phe Val Asn Ser Thr Gly 130 135 140 Tyr Leu Thr Glu Ala Glu Lys Phe Gly Asp Ser Phe Val Phe Glu Gly 145 150 155 160 Met Leu Ser Glu Gln Val Lys Thr Asn Ile Gln Gln Ala Val Ala Ala 165 170 175 Ala Pro Trp Trp Leu Pro Val Lys Gly Ala Asn Trp Arg His Pro Glu 180 185 190 Gly Pro Asp Ser Thr Ile Leu His Arg Pro Asp His Pro Val Leu His 195 200 205 Val Ser Trp Asn Asp Ala Val Ala Tyr Cys Thr Trp Ala Gly Lys Arg 210 215 220 Leu Pro Thr Glu Ala Glu Trp Glu Tyr Ser Cys Arg Gly Gly Leu His 225 230 235 240 Asn Arg Leu Phe Pro Trp Gly Asn Lys Leu Gln Pro Lys Gly Gln His 245 250 255 Tyr Ala Asn Ile Trp Gln Gly Glu Phe Pro Val Thr Asn Thr Gly Glu 260 265 270 Asp Gly Phe Gln Gly Thr Ala Pro Val Asp Ala Phe Pro Pro Asn Gly 275 280 285 Tyr Gly Leu Tyr Asn Ile Val Gly Asn Ala Trp Glu Trp Thr Ser Asp 290 295 300 Trp Trp Thr Val His His Ser Val Glu Glu Thr Leu Asn Pro Lys Gly 305 310 315 320 Pro Pro Ser Gly Lys Asp Arg Val Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Met Cys 325 330 335 His Arg Ser Tyr Cys Tyr Arg Tyr Arg Cys Ala Ala Arg Ser Gln Asn 340 345 350 Thr Pro Asp Ser Ser Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala Asp 355 360 365 Arg Leu Pro Thr Met Asp 370 <210> 3 <211> 1569 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human N-Acetylgalactosamine-6_Sulfatase (GALNS) Polynucleotide Sequence <400> 3 atggcggcgg ttgtcgcggc gacgaggtgg tggcagctgt tgctggtgct cagcgccgcg 60 gggatggggg cctcgggcgc cccgcagccc cccaacatcc tgctcctgct catggacgac 120 atgggatggg gtgacctcgg ggtgtatgga gagccctcca gagagacccc gaatttggac 180 cggatggctg cagaagggct gcttttccca aacttctatt ctgccaaccc tctgtgctcg 240 ccatcgaggg cggcactgct cacaggacgg ctacccatcc gcaatggctt ctacaccacc 300 aacgcccatg ccagaaacgc ctacacaccg caggagattg tgggcggcat cccagactcg 360 gagcagctcc tgccggagct tctgaagaag gccggctacg tcagcaagat tgtcggcaag 420 tggcatctgg gtcacaggcc ccagttccac cccctgaagc acggatttga tgagtggttt 480 ggatccccca actgccactt tggaccttat gacaacaagg ccaggcccaa catccctgtg 540 tacagggact gggagatggt tggcagatat tatgaagaat ttcctattaa tctgaagacg 600 ggggaagcca acctcaccca gatctacctg caggaagccc tggacttcat taagagacag 660 gcacggcacc accccttttt cctctactgg gctgtcgacg ccacgcacgc acccgtctat 720 gcctccaaac ccttcttggg caccagtcag cgagggcggt atggagacgc cgtccgggag 780 attgatgaca gcattgggaa gatactggag ctcctccaag acctgcacgt cgcggacaac 840 accttcgtct tcttcacgtc ggacaacggc gctgccctca tttccgcccc cgaacaaggt 900 ggcagcaacg gcccctttct gtgtgggaag cagaccacgt ttgaaggagg gatgagggag 960 cctgccctcg catggtggcc agggcacgtc actgcaggcc aggtgagcca ccagctgggc 1020 agcatcatgg acctcttcac caccagcctg gcccttgcgg gcctgacgcc gcccagcgac 1080 agggccattg atggcctcaa cctcctcccc accctcctgc agggccggct gatggacagg 1140 cctatcttct attaccgtgg cgacacgctg atggcggcca ccctcgggca gcacaaggct 1200 cacttctgga cctggaccaa ctcctgggag aacttcagac agggcattga tttctgccct 1260 gggcagaacg tttcaggggt cacaactcac aatctggaag accacacgaa gctgcccctg 1320 atcttccacc tgggacggga cccaggggag aggttccccc tcagctttgc cagcgccgag 1380 taccaggagg ccctcagcag gatcacctcg gtcgtccagc agcaccagga ggccttggtc 1440 cccgcgcagc cccagctcaa cgtgtgcaac tgggcggtca tgaactgggc acctccgggc 1500 tgtgaaaagt tagggaagtg tctgacacct ccagaatcca ttcccaagaa gtgcctctgg 1560 tcccactag 1569 <210> 4 <211> 522 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human N-acetylgalactosamine-6-Sulfatase (GALNS) Polypeptide Sequence <400> 4 Met Ala Ala Val Val Ala Ala Thr Arg Trp Trp Gln Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ala Gly Met Gly Ala Ser Gly Ala Pro Gln Pro Pro Asn 20 25 30 Ile Leu Leu Leu Leu Met Asp Asp Met Gly Trp Gly Asp Leu Gly Val 35 40 45 Tyr Gly Glu Pro Ser Arg Glu Thr Pro Asn Leu Asp Arg Met Ala Ala 50 55 60 Glu Gly Leu Leu Phe Pro Asn Phe Tyr Ser Ala Asn Pro Leu Cys Ser 65 70 75 80 Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg Leu Pro Ile Arg Asn Gly 85 90 95 Phe Tyr Thr Thr Asn Ala His Ala Arg Asn Ala Tyr Thr Pro Gln Glu 100 105 110 Ile Val Gly Gly Ile Pro Asp Ser Glu Gln Leu Leu Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Lys Lys Ala Gly Tyr Val Ser Lys Ile Val Gly Lys Trp His Leu Gly 130 135 140 His Arg Pro Gln Phe His Pro Leu Lys His Gly Phe Asp Glu Trp Phe 145 150 155 160 Gly Ser Pro Asn Cys His Phe Gly Pro Tyr Asp Asn Lys Ala Arg Pro 165 170 175 Asn Ile Pro Val Tyr Arg Asp Trp Glu Met Val Gly Arg Tyr Tyr Glu 180 185 190 Glu Phe Pro Ile Asn Leu Lys Thr Gly Glu Ala Asn Leu Thr Gln Ile 195 200 205 Tyr Leu Gln Glu Ala Leu Asp Phe Ile Lys Arg Gln Ala Arg His His 210 215 220 Pro Phe Phe Leu Tyr Trp Ala Val Asp Ala Thr His Ala Pro Val Tyr 225 230 235 240 Ala Ser Lys Pro Phe Leu Gly Thr Ser Gln Arg Gly Arg Tyr Gly Asp 245 250 255 Ala Val Arg Glu Ile Asp Asp Ser Ile Gly Lys Ile Leu Glu Leu Leu 260 265 270 Gln Asp Leu His Val Ala Asp Asn Thr Phe Val Phe Phe Thr Ser Asp 275 280 285 Asn Gly Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Glu Gln Gly Gly Ser Asn Gly 290 295 300 Pro Phe Leu Cys Gly Lys Gln Thr Thr Phe Glu Gly Gly Met Arg Glu 305 310 315 320 Pro Ala Leu Ala Trp Trp Pro Gly His Val Thr Ala Gly Gln Val Ser 325 330 335 His Gln Leu Gly Ser Ile Met Asp Leu Phe Thr Thr Ser Leu Ala Leu 340 345 350 Ala Gly Leu Thr Pro Pro Ser Asp Arg Ala Ile Asp Gly Leu Asn Leu 355 360 365 Leu Pro Thr Leu Leu Gln Gly Arg Leu Met Asp Arg Pro Ile Phe Tyr 370 375 380 Tyr Arg Gly Asp Thr Leu Met Ala Ala Thr Leu Gly Gln His Lys Ala 385 390 395 400 His Phe Trp Thr Trp Thr Asn Ser Trp Glu Asn Phe Arg Gln Gly Ile 405 410 415 Asp Phe Cys Pro Gly Gln Asn Val Ser Gly Val Thr Thr His Asn Leu 420 425 430 Glu Asp His Thr Lys Leu Pro Leu Ile Phe His Leu Gly Arg Asp Pro 435 440 445 Gly Glu Arg Phe Pro Leu Ser Phe Ala Ser Ala Glu Tyr Gln Glu Ala 450 455 460 Leu Ser Arg Ile Thr Ser Val Val Gln Gln His Gln Glu Ala Leu Val 465 470 475 480 Pro Ala Gln Pro Gln Leu Asn Val Cys Asn Trp Ala Val Met Asn Trp 485 490 495 Ala Pro Pro Gly Cys Glu Lys Leu Gly Lys Cys Leu Thr Pro Pro Glu 500 505 510 Ser Ile Pro Lys Lys Cys Leu Trp Ser His 515 520 <210> 5 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Pro Gln Pro Pro Asn Ile Leu Leu Leu Leu Met Asp Asp Met Gly 1 5 10 15 Trp Gly Asp Leu Gly Val Tyr Gly Glu Pro Ser Arg Glu Thr Pro Asn 20 25 30 Leu Asp Arg Met Ala Ala Glu Gly Leu Leu Phe Pro Asn Phe Tyr Ser 35 40 45 Ala Asn Pro Leu Cys Ser Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg 50 55 60 Leu Pro Ile Arg Asn Gly Phe Tyr Thr Thr Asn Ala His Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Val Gly Gly Ile Pro Asp Ser Glu Gln 85 90 95 Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Lys Ala Gly Tyr Val Ser Lys Ile Val 100 105 110 Gly Lys Trp His Leu Gly His Arg Pro Gln Phe His Pro Leu Lys His 115 120 125 Gly Phe Asp Glu Trp Phe Gly Ser Pro Asn Cys His Phe Gly Pro Tyr 130 135 140 Asp Asn Lys Ala Arg Pro Asn Ile Pro Val Tyr Arg Asp Trp Glu Met 145 150 155 160 Val Gly Arg Tyr Tyr Glu Glu Phe Pro Ile Asn Leu Lys Thr Gly Glu 165 170 175 Ala Asn Leu Thr Gln Ile Tyr Leu Gln Glu Ala Leu Asp Phe Ile Lys 180 185 190 Arg Gln Ala Arg His His Pro Phe Phe Leu Tyr Trp Ala Val Asp Ala 195 200 205 Thr His Ala Arg Val Tyr Ala Ser Lys Pro Phe Leu Gly Thr Ser Gln 210 215 220 Arg Gly Arg Tyr Gly Asp Ala Val Arg Glu Ile Asp Asp Ser Ile Gly 225 230 235 240 Lys Ile Leu Glu Leu Leu Gln Asp Leu His Val Ala Asp Asn Thr Phe 245 250 255 Val Phe Phe Thr Ser Asp Asn Gly Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Glu 260 265 270 Gln Gly Gly Ser Asn Gly Pro Phe Leu Cys Gly Lys Gln Thr Thr Phe 275 280 285 Glu Gly Gly Met Arg Glu Pro Ala Leu Ala Trp Trp Pro Gly His Val 290 295 300 Thr Ala Gly Gln Val Ser His Gln Leu Gly Ser Ile Met Asp Leu Phe 305 310 315 320 Thr Thr Ser Leu Ala Leu Ala Gly Leu Thr Pro Pro Ser Asp Arg Ala 325 330 335 Ile Asp Gly Leu Asn Leu Leu Pro Thr Leu Leu Gln Gly Arg Leu Met 340 345 350 Asp Arg Pro Ile Phe Tyr Tyr Arg Gly Asp Thr Leu Met Ala Ala Thr 355 360 365 Leu Gly Gln His Lys Ala His Phe Trp Thr Trp Thr Asn Ser Trp Glu 370 375 380 Asn Phe Arg Gln Gly Ile Asp Phe Cys Pro Gly Gln Asn Val Ser Gly 385 390 395 400 Val Thr Thr His Asn Leu Glu Asp His Thr Lys Leu Pro Leu Ile Phe 405 410 415 His Leu Gly Arg Asp Pro Gly Glu Arg Phe Pro Leu Ser Phe Ala Ser 420 425 430 Ala Glu Tyr Gln Glu Ala Leu Ser Arg Ile Thr Ser Val Val Gln Gln 435 440 445 His Gln Glu Ala Leu Val Pro Ala Gln Pro Gln Leu Asn Val Cys Asn 450 455 460 Trp Ala Val Met Asn Trp Ala Pro Pro Gly Cys Glu Lys Leu Gly Lys 465 470 475 480 Cys Leu Thr Pro Pro Glu Ser Ile Pro Lys Lys Cys Leu Trp Ser His 485 490 495

Claims

재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소를 정제하는 방법으로서, 상기 GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 상기 GALNS 효소는
(i) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고,
(ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀 글라이신(FGly)으로 적어도 약 50% 전환을 지니며,
(iii) 선택적으로, 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지고,
상기 GALNS 효소의 적어도 97%는 SDS-모세관 겔 전기영동(SDS-capillary gel electrophoresis, SDS-CGE)에 의해 결정되는 바와 같은 상기 전구체 형태로 존재하며, 상기 방법은
a) 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)을 발현시키는 포유류 세포주로부터 분비된 상기 GALNS 효소 및 상기 재조합 인간 GALNS 효소를 함유하는 배양 배지를 여과시키며, 상기 여과된 배양 배지를 초미세여과/정용여과시키고, 상기 초미세여과/정용여과된 배양배지를 차콜 여과시키는 단계;
b) 포획 칼럼 상에 단계 a)로부터의 상기 차콜 여과된 초미세여과/정용여과 배양 배지를 로딩하고, 상기 GALNS 효소가 상기 포획 칼럼 상에 보유되는 조건 하에서 상기 포획 칼럼을 세척하며, 상기 포획 칼럼으로부터 상기 GALNS 효소를 용리시키는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)의 상기 포획 칼럼으로부터 얻어진 상기 용리액을 바이러스를 제거하기 위한 필터를 통해 여과시키는 단계;
d) 단계 b)의 상기 포획 칼럼으로부터의 용리액 또는 단계 c)로부터 상기 여과액의 pH를 산 pH로 조절하고, 상기 포획 칼럼으로부터의 상기 산 pH-조절된 용리액 또는 산 pH-조절된 여과액을 여과시키는 단계;
e) 단계 d)의 상기 포획 칼럼으로부터의 산 pH-조절된 용리액 또는 산 pH-조절된 Q 여과액을 중간체 칼럼 상에 로딩하고, GALNS 효소가 상기 중간체 칼럼 상에 보유되는 조건 하에 중간체 칼럼을 세척하며, 상기 중간체 칼럼으로부터 상기 GALNS 효소를 용리시키는 단계;
f) 단계 e)의 중간체 칼럼으로부터의 상기 용리액을 바이러스 불활성화를 위해 낮은 pH로 조절하는 단계; 및
g) 단계 f)로부터의 낮은 pH 바이러스 불활성화된 용리액을 폴리싱 칼럼 상에 로딩하고, GALNS 효소가 상기 폴리싱 칼럼 상에 보유되는 조건 하에서 상기 폴리싱 칼럼을 세척하며, 상기 폴리싱 칼럼으로부터 상기 GALNS 효소를 용리시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 단계 a)에서 약 20X로 농축되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 a)의 상기 차콜 필터는 Zeta Plus R55 활성탄 필터인 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)의 상기 포획 칼럼은 Zn-고정 금속 친화성 크로마토그래피(Zn-immobilized metal affinity chromatography, Zn-IMAC) 칼럼인 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 Zn-IMAC 칼럼은 Zn-킬레이팅 세파로스 FF 칼럼인 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 c)가 수행되고, 상기 필터는 Mustang Q 필터인 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)의 상기 포획 칼럼으로부터의 상기 용리액 또는 단계 c)의 상기 여과액의 상기 pH가 단계 d)에서 약 4.5±0.1로 조절되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 e)의 상기 중간체 칼럼은 양이온 교환 칼럼인 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 양이온 교환 칼럼은 프락토겔 EMD SE HiCap 칼럼인 것인 방법.
제1항에 있어서, 바이러스 불활성화를 위한 산 pH는 단계 f)에서 약 3.5±0.1로 조절되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 g)의 상기 폴리싱 칼럼은 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC) 칼럼인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 HIC 칼럼은 ToyoPearl 뷰틸 650M 칼럼인 것인 방법.
제1항에 있어서,
h) 단계 g)의 폴리싱 칼럼으로부터의 상기 용리액을 조제물로 완충제 교환하는 단계;
i) 바이러스 필터 및 DNA 필터에 의해 단계 h)로부터의 상기 완충제 교환된 조제물을 여과시킴으로써 임의의 잔사 바이러스 및 DNA를 제거하는 단계; 및
j) 단계 i)로부터의 상기 조제물에 비이온성 계면활성제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 단계 h)의 상기 조제물은 pH 5.4에 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 30mM 아르기닌 HCl, 2%(w/v) 솔비톨을 서 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 단계 h)의 상기 조제물 내 상기 GALNS 효소는 약 3㎎/㎖로 조절된 것인 방법.
제13항에 있어서, 단계 i)의 상기 바이러스 필터는 DV20 필터이며, 단계 i)의 상기 DNA 필터는 Mustang Q 필터인 것인 방법.
제13항에 있어서, 단계 j)의 상기 비-이온성 계면활성제는 폴리솔베이트 20(PS20)이되, 최종 형성에서의 PS20의 상기 농도는 0.01%(w/v)인 것인 방법.
재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소의 정제방법으로서, 상기 GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 상기 GALNS 효소는
(i) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고,
(ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀 글라이신(FGly)으로 적어도 약 50% 전환을 지니며,
(iii) 선택적으로, 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지고,
상기 GALNS 효소의 적어도 97%는 SDS-CGE에 의해 결정되는 바와 같은 상기 전구체 형태로 존재하며, 상기 방법은
a) 인간 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)을 발현시키는 포유류 세포주로부터 분비된 상기 GALNS 효소 및 상기 재조합 인간 GALNS 효소를 함유하는 배양 배지를 여과시키고, 상기 여과된 배양 배지를 초미세여과/정용여과시킴으로써, 상기 초미세여과/정용여과된 배양배지가 약 20X로 농축되고, 20X 농축된 초미세여과/정용여과된 배양배지를 차콜 여과시키는 단계;
b) Zn-킬레이팅 세파로스 FF 포획 칼럼 상에 단계 a)로부터의 상기 차콜 여과된 20X 초미세여과/정용여과 배양 배지를 로딩하고, 상기 GALNS 효소가 상기 포획 칼럼 상에 보유되는 조건 하에서 상기 포획 칼럼을 세척하며, 상기 포획 칼럼으로부터 상기 GALNS 효소를 용리시키는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)의 상기 Zn-킬레이팅 세파로스 FF 포획 칼럼으로부터의 상기 용리액을 바이러스를 제거하기 위한 필터를 통해 여과시키는 단계;
d) 단계 b)의 상기 Zn-킬레이팅 세파로스 FF 포획 칼럼으로부터의 용리액 또는 단계 c)로부터 상기 여과액의 pH를 약 pH 4.5±0.1로 조절하고, 상기 Zn-킬레이팅 세파로스 FF 포획 칼럼으로부터의 상기 pH 4.5-조절된 용리액 또는 여과액을 여과시키는 단계;
e) 단계 d)의 상기 Zn-킬레이팅 세파로스 FF 포획 칼럼으로부터의 pH 4.5-조절된 용리액 또는 여과액을 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 양이온 교환 칼럼 상에 로딩하고, GALNS 효소가 상기 칼럼 상에 보유되는 조건 하에 칼럼을 세척하며, 상기 칼럼으로부터 상기 GALNS 효소를 용리시키는 단계;
f) 단계 e)의 프락토겔 EMD SE Hi-Cap 양이온 교환 칼럼으로부터의 상기 용리액을 바이러스 불활성화를 위해 약 pH 3.5±0.1로 조절하는 단계;
g) 단계 f)로부터의 pH 3.5 바이러스 불활성화된 용리액을 ToyoPearl 뷰틸 650 M 폴리싱 칼럼 상에 로딩하고, GALNS 효소가 상기 폴리싱 칼럼 상에 보유되는 조건 하에서 상기 칼럼을 세척하며, 상기 칼럼으로부터 상기 GALNS 효소를 용리시키는 단계;
h) 단계 g)의 ToyoPearl 뷰틸 650M 폴리싱 칼럼으로부터의 상기 용리액을 pH 5.4에서 20mM NaOAc/HOAc, 50mM NaH₂PO₄, 30mM 아르기닌 HCl, 2%(w/v) 솔비톨을 포함하는 조제물로 완충제 교환하고, 상기 조제물 내 상기 GALNS 효소의 상기 농도를 약 3㎎/㎖로 조절하는 단계;
i) DV20 필터 및 Mustang Q 필터에 의해 단계 h)에서 상기 완충제 교환된 조제물을 여과시킴으로써 어떤 잔사 바이러스 및/또는 DNA를 제거하는 단계; 및
j) 단계 i)로부터의 상기 조제물에 폴리솔베이트 20(PS20)을 0.01(w/v)의 최종 농도로 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제18항에 따라 정제된 조성물로서, 상기 조성물은 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소를 포함하며, 상기 GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 상기 GALNS 효소는
(i) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고,
(ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀 글라이신(FGly)으로 적어도 약 50% 전환을 지니며,
(iii) 선택적으로, 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지고,
상기 GALNS 효소의 적어도 98%는 SDS-CGE에 의해 결정되는 상기 전구체 형태로 존재하는 것인 조성물.
점액다당류증 IVa 형(MPS IVa) 또는 모르퀴오 A 증후군에 걸린 피험체의 치료방법으로서, 제1항 또는 제18항에 따라 정제된 조성물의 치료적 유효량을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 정제된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소를 포함하고, 상기 GALNS 효소는 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 상기 GALNS 효소는
(i) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고,
(ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀 글라이신(FGly)으로 적어도 약 50% 전환을 지니며,
(iii) 선택적으로, 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지고,
상기 GALNS 효소의 적어도 98%는 SDS-CGE에 의해 결정되는 상기 전구체 형태로 존재하는 것인 방법.
조제물로서,
(a) 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소로서, 상기 GALNS 효소기 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 또한
(i) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고,
(ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀 글라이신(FGly)으로 적어도 약 50% 전환을 지니며,
(iii) 선택적으로, 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지되,
상기 GALNS 효소의 적어도 97%는 SDS-CGE에 의해 결정되는 바와 같은 상기 전구체 형태로 존재하는 것인, 상기 GALNS 효소; 및
(b) (i) 상기 GALNS 효소의 탈인산화를 감소시키기에 유효한 인산염 완충제의 양; 및
(ii) 아미노산 염, 아미노산 완충제, 계면활성제 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안정제의 안정화 량
을 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하되,
상기 조제물은 약 5.0 내지 5.8의 pH에 있는 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 조제물 내 상기 인산염 완충제는 약 25mM 내지 75mM의 농도에 있는 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 조제물은 제2 완충제, 선택적으로 아세테이트 완충제를 더 포함하는 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 안정제는 아르기닌 또는 히스티딘 염 또는 완충제, 선택적으로 아르기닌 염산염인 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 안정제는 폴리솔베이트, 선택적으로 폴리솔베이트 20인 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 안정제는 3가 또는 더 고차의 당 알코올, 선택적으로 솔비톨인 것인 조제물.
제21항에 있어서, 아르기닌 염 또는 완충제, 폴리솔베이트 및 폴리올을 포함하는 것인 조제물.
GALNS 효소와 인산염 완충제를 약 25mM 내지 75mM인 인산염 완충제의 최종 농도로 GALNS 효소와 인산염 완충제를 혼합하는 단계를 포함하는 재조합 인간 GALNS 효소의 탈인산화 방지방법.
제21항에 있어서, 상기 GALNS 효소는 RP-HPLC에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 95% 순수한 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 GALNS 효소의 50% 내지 80%가 만노스-6-포스페이트 수용체 칼럼에 결합되는 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 GALNS 효소는 약 1 내지 5nM인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타내는 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 GALNS 효소는 약 1 내지 3.5nM인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타내는 것인 조제물.
제21항에 있어서, GALNS 효소의 상기 농도는 약 0.5 내지 1.5㎎/㎖인 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 완충제는 NaOAc/HOAc 및 NaH₂PO₄인 것인 조제물.
제34항에 있어서, NaOAc/HOAc의 상기 농도는 약 10 내지 30mM이며, NaH₂PO₄의 상기 농도는 약 25 내지 75mM인 것인 조제물.
제21항에 있어서, 상기 안정제는 아르기닌 HCl, Tween-20 및 솔비톨인 것인 조제물.
제36항에 있어서, 아르기닌 HCl의 상기 농도는 약 10 내지 50mM이며, Tween-20의 상기 농도는 약 0.005% 내지 0.015%(w/v)이고, 솔비톨의 상기 농도는 약 1.0% 내지 3.0%(w/v)인 것인 조제물.
조제물로서,
(a) 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(GALNS) 효소로서, 상기 GALNS 효소가 서열번호 4의 아미노산 27 내지 522와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 또한
(i) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시할 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 적어도 약 95%의 순도를 가지고,
(ii) 위치 53에서 시스테인 잔기의 C_α-포밀 글라이신(FGly)으로 적어도 약 50% 전환을 지니며,
(iii) 모노머 단백질 사슬 당 0.5 내지 0.8 비스-인산화된 올리고만노스 사슬을 가지되,
상기 GALNS 효소의 적어도 97%는 환원 조건 하에서 SDS-PCGE가 실시될 때 쿠마씨 블루 염색에 의해 결정되는 바와 같은 상기 전구체 형태로 존재하는 것인 상기 GALNS 효소; 및
(b) (i) 완충제로서 NaOAc/HOAc 및 NaH₂PO₄; 및
(ii) 안정제로서 아르기닌 HCl, Tween-20 및 솔비톨; 및
(iii) 약 5.4 +/- 0.4의 pH
를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조제물.
제38항에 있어서, 상기 GALNS 효소는 RP-HPLC로 결정되는 바와 같은 적어도 95% 순수한 것인 조제물.
제38항에 있어서, 상기 GALNS 효소의 50% 내지 80%는 만노스-6-포스페이트 수용체 칼럼에 결합되는 것인 조제물.
제38항에 있어서, 상기 GALNS 효소는 약 1 내지 5nM인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타내는 것인 조제물.
제38항에 있어서, 상기 GALNS 효소는 약 1 내지 3.5nM인 섬유아세포 내로 특이적 흡수(K흡수)를 나타내는 것인 조제물.
제38항에 있어서, 상기 GALNS 효소의 농도는 약 1.0 +/- 0.5㎎/㎖인 것인 조제물.
제38항에 있어서, 상기 NaOAc/HOAc의 농도는 약 20 +/- 10mM 이며, NaH₂PO₄의 상기 농도는 약 50 +/-25mM인 것인 조제물.
제38항에 있어서, 상기 아르기닌 HCl의 농도는 약 30 +/- 20mM이며, 상기 Tween-20의 상기 농도는 약 0.01% +/- 0.005%(w/v)이고, 상기 솔비톨의 농도는 약 2.0% +/- 1.0%(w/v)인 것인 조제물.
제45항에 있어서, 상기 NaOAc/HOAc의 농도는 약 20 +/- 10mM이고, NaH₂PO₄의 상기 농도는 약 50 +/-25mM인 것인 조제물.