KR20070100299A - 재조합 인간 성장 호르몬의 발현 및 정제 방법 - Google Patents

재조합 인간 성장 호르몬의 발현 및 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 인간 성장 호르몬(hGH)을 생산, 정제 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 숙주 또는 배양 배지 예를 들어, 효모, 곤충, 포유동물 및 박테리아 세포로부터 실질적으로 정제된 hGH를 생산, 정제 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 중합체 또는 기타 분자에 결합되어 있는 hGH를 정제하는데에도 유용하다.

Description

재조합 인간 성장 호르몬의 발현 및 정제 방법{METHODS FOR EXPRESSION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE}
관련 출원에 대한 상호 참조 문헌
본 출원은 미국 가 명세서 출원 제60/638,616호(2004년 12월 22일 출원), 미국 가 명세서 출원 제60/655,744호(2005년 2월 23일 출원), 미국 가 명세서 출원 제60/680,977호(2005년 5월 13일 출원) 및 미국 가 명세서 출원 제60/727,968호(2005년 10월 17일 출원)[상기 출원의 상세한 설명은 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용됨]의 우선권의 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 인간 성장 호르몬(hGH)을 생산, 정제 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 숙주로부터 실질적으로 정제된 hGH를 생산, 정제 및 분리하는 방법에 관한 것이다.
성장 호르몬(GH) 초 유전자군(supergene family)[Bazan, F. Immunology Today 11:350-354 (1990); Mott, H. R. and Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]은 구조적 특성이 유사한 단 백질 세트를 의미한다. 이 단백질 군에 속하는 각 일원들은 4개의 나선형 묶음(helical bundle)을 포함한다. 아직 상기 군에 속하는 일원 중 동정되지 않은 일원들이 존재하지만, 이 군에 속하는 몇몇 일원들로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반성 락토겐, 적혈구 생성 촉진 인자(EPO), 혈소판 증식 인자(TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴(oncostatin) M, 섬모 신경 영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 토우 인터페론, 엡실론 인터페론, 과립구 집락 형성 인자(G-CSF), 과립구-대식 세포 집락 형성 인자(GM-CSF), 대식 세포 집락 형성 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀(cardiotrophin)-1 (CT-1) ("GH 초 유전자군"). GH 초 유전자군의 일원들은 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 상동성을 가지지만, 2차 구조 및 3차 구조가 유사하다. 공유하는 구조적 특징들로 인하여 이 유전자군에 속하는 새로운 일원들이 용이하게 동정될 수 있다.
인간의 성장 호르몬은 주로 인간의 정상적인 성장과 발육을 조절하는 역할을 한다. 이러한 천연 생성 단일 사슬 뇌하수체 호르몬은 191개의 아미노산 잔기로 이루어져 있으며, 분자량은 약 22 kDa이다. hGH는 다수의 생물학적 효과 예를 들어, 직선 성장(linear growth)(신체 원인론), 수유, 대식 세포의 활성화 및 인슐린-유사 효과 및 당뇨병 유발 효과 들을 나타낸다[Chawla, R.외 다수, Ann. Rev. Med. 34:519-547 (1983); Isaksson, O.외 다수, Ann. Rev. Physiol, 47:483-499 (1985); Hughes, J. and Friesen, H., Ann. Rev. Physiol, 47:469-482 (1985)]. hGH의 구조 는 널리 알려져 있으며(Goeddel, D.외 다수, Nature 281:544-548 (1979)), 상기 hGH의 3차원 구조는 X-선 결정학에 의해 규명되었다[de Vos, A.외 다수, Science 255:306-312 (1992)]. 이 단백질은 조밀한 입상 구조를 띠고 있으며, 4개의 양 친매성 알파 나선 묶음(N-말단으로부터 시작하여 A∼D라 칭함)이 루프에 의해 연결되어 있다. hGH는 또한 4개의 시스테인 잔기를 포함하는데, 이 잔기는 2개의 분자 내 이 황화물 결합에 관여한다[C53은 C165와 쌍을 이루고, C182는 C189와 쌍을 이룸]. 상기 호르몬은 글리코실화되지 않으며, 이.콜라이(E.coli) 내에서 분비형으로서 발현된다[Chang, C외 다수, Gene 55:189-196 (1987)].
다수의 천연 생성 hGH 돌연 변이체가 동정되었다. 이 돌연 변이체는 hGH-V[Seeburg, DNA 1: 239 (1982); 미국 특허 제4,446,235호, 동 제4,670,393호 및 동 제4,665,180호; 이들은 본원에 참고용으로 인용됨]와 20 kDa의 hGH(hGH의 32∼46번 잔기가 결실됨)[Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U.외 다수, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978)]를 포함한다. 뿐만 아니라, 다수의 hGH 변이체는 전사 후 가공, 번역 후 가공, 분비 과정, 대사 과정 및 기타 생리적 과정으로부터 생성되는 것으로 보고된바 있다[Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)]. hGH의 생물학적 효과는 이것과 특정 세포 수용체와의 상호 작용으로부터 유래된다. 이 호르몬은 태반성 락토겐 및 프로락틴을 포함하는 동종 단백질 군의 일원이다. 그러나, hGH는 종 특이성이 광범위하고 클로닝된 신체성(somatogenic) 수용체[Leung, D.외 다수, Nature 330:537-543 (1987)] 또는 프로락틴 수용체[Boutin, J.외 다수, Cell 53:69-77 (1988)]와 결합한다는 점에서 상기 군의 일원들 중에서도 특이하다. 구조적 연구 및 생화학적 연구를 바탕으로 하여, 최유성 결합 도메인 및 신체성 결합 도메인에 대한 기능성 맵이 제안된바 있다[Cunningham, B. and Wells, J., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 3407 (1991)]. hGH 수용체는 조혈/사이토카인/성장 인자 수용체 군의 일원으로서, 기타 성장 인자 수용체 중 몇몇 예를 들어, 인터루킨(IL)-3, IL-4 및 IL-6 수용체, 과립구 대식 세포 집락 형성 인자(GM-CSF) 수용체, 적혈구 생성 촉진 인자(EPO) 수용체 및 G-CSF 수용체를 포함한다. 문헌[Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6934-6938 (1990)]을 참조하시오. 사이토카인 수용체 군의 일원들은 4개의 보존적 시스테인 잔기와 트립토판-세린-X-트립토판-세린 모티프(경막 부위 외부에만 존재)를 포함한다. 상기 보존적 서열은 단백질-단백질 상호 작용에 관여하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌[Chiba et al, Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992)]을 참조하시오. hGH와 이것의 수용체의 외부 도메인(hGHbp) 간 상호 작용은 호르몬-수용체 상호 작용중에서 가장 널리 알려져 있다. 고 해상도 X-선 결정학적 데이터[Cunningham, B.외 다수., Science, 254:821-825 (1991)]에 따르면, hGH는 2개의 수용체 결합 위치를 보유하고, 분자 상의 개별 위치에서 2개의 수용체 분자와 연속적으로 결합한다고 한다. 상기 2개의 수용체 결합 위치를, 제I 위치 및 제II 위치라 부른다. 제I 위치는 D 나선 부의 카복시 말단부와 A 나선 부의 일부 그리고 A-B 루프를 포함하며, 제II 위치는 A 나선 부의 아미노 말단 부위와 C 나선 부의 일부를 포함한다. GH와 이의 수용체 간의 결합은 연속적으로 일어나는 것으로서, 제I 위치와의 결합이 제일 먼저 일어난다. 이후 제II 위치는 제2 GH 수용체와 결합하 며, 그 결과 호르몬에 대한 세포 반응을 유도하는 수용체 이량체화와 세포 내 신호 전달 경로의 활성화가 일어나게 된다. 제II 위치에 G120R 치환이 발생한 hGH 뮤테인은 하나의 hGH 수용체를 결합시킬 수 있지만, 2개의 수용체를 이량체화할 수는 없다. 상기 뮤테인은 시험관 내에서 hGH 길항제로서 작용하는데, 아마도 세포 내 신호 전달 경로를 활성화하지 않고서 수용체 위치를 점유하여 작용하는 것으로 생각된다[Fuh, G.외 다수, Science 256:1677-1680 (1992)].
재조합 hGH는 다수의 징후를 치료하는 치료제로서 승인되었다. hGH 결핍증은 예를 들어, 수 십년 동안 호르몬을 외부로부터 투여하여 성공적으로 치료해 오고 있는, 소인증을 유발한다. hGH 결핍증(GHD)의 유형으로서는 소아 GHD, 소아기 유발성 성인 GHD 및 성인 유발성 성인 GHD를 포함한다. hGH 결핍증 이외에도, hGH는 또한 신부전(소아기), 터너 증후군 및 AIDS 환자에서 발생하는 악액질의 치료용으로서 승인되었다. 최근 들어, 식품 의약품 관리국(FDA)이 hGH를 비-GH-의존성 저 신장증(short-stature) 치료용으로서 승인한 바 있다. hGH는 또한 현재 노인들의 노화, 노약, 단장 증후군 및 울혈성 심부전의 치료제로서 연구되고 있다. hGH 치료의 대상 층으로서는 특발성 저 신장증(ISS)이 발생한 소아와 GHD-유사 증후군이 발생한 성인을 포함한다. 재조합 hGH는 현재 매일 주사하는 제품으로서 판매되고 있으며, 이 제품들 중 5가지의 주요 제품들이 출시되었다: 휴머트로프(Humatrope)™ (Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin)™ (Genentech), 노르디트로핀(Norditropin)™ (Novo-Nordisk), 제노트로핀(Genotropin)™ (Pfizer) 및 사이젠(Saizen)/세로스팀(Serostim)™ (Serono). 그러나, 성장 호르몬을 치료제로서 사 용함에 있어서는 생체 내 반감기가 짧은 단백질을 사용하여야 하기 때문에, 최대의 효능을 얻기 위해서는 매일 피하 주사하여 투여되어야 한다는 단점이 있다[MacGillivray외 다수, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 1806-1809 (1996)]. 생산 비용을 낮추고, 환자가 보다 용이하게 투여할 수 있도록 만들며, 효능과 안전성 프로필을 개선하고, 경쟁적 이점을 제공할 기타 특성들을 창출함으로써, hGH 작동제 및 길항제의 투여 효과를 개선 시키는 데에 상당한 노력이 기울여 지고 있다. 예를 들어, 제넨테크(Genentech) 및 알커미스(Alkermes)는 이미 소아 성장 호르몬 결핍증에 대한 치료제로서 뉴트로핀 데포(Nutropin Depot)™(hGH의 데포 제형)를 시판하였다. 이 데포(depot)는 투여 횟수를 줄일 수 있지만(매일 1회 투여하는 것이 아니라, 2∼3주에 1회 투여함), 원하지 않는 부작용 예를 들어, 생체 적합성의 감소 및 주사시 통증을 일으켜서, 2004년에는 급기야 판매가 중지되었다. 다른 제품인 페그비소먼트(Pegvisomant)™(Pfizer) 또한 최근에 FDA 승인을 얻었다. 이 페그비소먼트™는 고도의 선택성을 갖는 성장 호르몬 수용체의 길항제로서 작용하는, hGH의 유전자 조작 유사체로서, 말단 비대증 치료제로서 알려져 있다[van der Lelydhl 다수, The Lancet 358:1754-1759(2001)]. 페그비소먼트™의 아미노산 측 쇄 잔기 중 몇몇은 폴리에틸 글리콜(PEG) 중합체에 의해 유도체화되지만, 이 제품 역시 매일 1회씩 투여하여야 하므로, 약학적 특성이 최적이라고 할 수는 없다. PEG화 및 데포 제형화 이외에도, hGH의 기타 투여 경로 예를 들어, 흡입 및 경구 투여형은 현재 예비 임상 개발 및 임상 개발의 초기 단계에 있으나, 이들 중 어느 것도 아직 FDA 승인을 받지는 못했다. 그러므로, 성장 호르몬 활성을 나타내되, 혈청 중 반감기가 연장되어 hGH의 치료 수준이 보다 개선되었고, 치료 반감기도 증가한 폴리펩티드가 필요하다.
최근 들어, 단백질 과학 분야에서 완전히 새로운 기술이 보고되었는데, 이 기술은 단백질 예를 들어, hGH의 위치-특이적 변형에 따른 다수의 한계점을 극복할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 새로운 성분이 원핵 생물인 에스테리챠 콜라이(Escherichia coli; E.coli)[예를 들어, L. Wang외 다수., (2001), Science 292:498-500] 및 진핵 생물인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae; S.cerevisiae)[예를 들어, J. Chin외 다수, Science 301:964-7 (2003)]단백질 생합성 기작에 첨가되었는데, 이로써 생체 내에서 유전적으로 암호화되지 않는 아미노산을 단백질에 통합할 수 있게 되었다. 숙주 세포에 제공된 구조물은 비 천연 암호화 아미노산을 hGH 폴리펩티드 내부로 치환시키기 위한, 선택 코돈(selector codon) 및 직교 tRNA 합성 효소(orthogonal tRNA synthase) 및/또는 직교 tRNA를 포함하는 hGH 폴리펩티드 암호화 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 새로운 화학적, 물리학적 또는 생물학적 성질을 갖는 신규 아미노산 대다수 예를 들어, 광 친화성 표지 및 광 이성체화 아미노산, 광 가교 아미노산[예를 들어, Chin, J. W.외 다수. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024; 및 Chin, J. W.외 다수., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027], 케토 아미노산, 중원자 함유 아미노산, 그리고 글리코실화된 아미노산은, 이 방법을 이용함으로써 앰버 코돈인 TAG에 따라서 이.콜라이 및 효모 내에 존재하는 단백질에 효율적이며 고 신뢰도를 가지고 통합된다. 예를 들어, 문헌[J. W. Chin외 다수, (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137; J. W. Chin외 다수., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11]을 참조하시오. 상기 참고 문헌들은 모두 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다. 이러한 연구 결과를 통하여, 20개의 공통된 아미노산(유전자-암호화 아미노산)에서 발견되는 작용기 모두에 대해 화학적으로 비활성인 화학 작용기를 선택적이고 통상적으로 도입할 수 있으며, 이로써 안정한 공유 결합을 형성하기 위해 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다는 사실이 입증되었다. 비-유전자 암호화 아미노산이 단백질로 통합되는 능력으로 인하여, 천연 생성 작용기 예를 들어, 리신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 설프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노기 등을 대신할 수 있는 중요한 화학 작용기를 도입할 수 있다. 임의의 화학 작용기는 20개의 공통 유전자 암호화 아미노산에서 발견되는 작용기에 비활성이지만, 안정한 결합을 형성하기 위해 정확하고 효율적으로 반응하는 것으로 알려져 있다.
친수성 중합체인 폴리(에틸렌 글리콜)(약칭, "PEG")의 공유 결합은 수용성, 생체 적합성, 혈청 내 반감기 및 치료 반감기를 증가시키고, 면역원성 및 생물 활성을 조정하거나, 또는 다수의 생물 활성 분자 예를 들어, 단백질, 펩티드 및 구체적으로 소수성 분자의 순환 시간을 연장시키는 수단이다. PEG는 제약학 분야, 인공 주입물 분야 및 생체 혼화성, 무독성 및 무 면역원성이 중요한 기타 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다. PEG의 목적 특성을 최대화하기 위하여, PEG 중합체 또는 생 물학적으로 활성인 분자에 결합된 중합체의 수화 상태 및 총 분자량은 통상적으로 PEG 중합체 결합과 관련된 유리한 특성 예를 들어, 증가한 수용성 및 순환 반감기에 영향을 미칠 수 있을 정도로 충분히 양호하고 커야 하되, 모 분자의 생물 활성에 악영향을 미쳐서는 안 된다. PEG의 분자량은 실질적으로 바람직하여야 하는데, 예를 들어, 약 100∼100,000 Da 또는 그 이상인 것이 바람직할 수 있다[예를 들어, 0.1∼50 kDa 또는 10∼40 kDa일 수도 있음]. 분지형 사슬인 PEG 예를 들어, 각 사슬의 분자량이 1∼100 kDa인(예를 들어, 1∼50 kDa 또는 5∼20 kDa) PEG 분자도 사용될 수 있다.
PEG 유도체는 종종 반응성 화학 작용기 예를 들어, 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기, N-말단 및 탄수화물 부분을 통하여 생물학적으로 활성인 분자에 결합한다. 단백질 및 기타 분자는 종종 일정한 수의 반응 위치(중합체 결합에 적합한 위치)를 갖는다. 중합체 결합에 의한 변형에 가장 적당한 위치는 수용체 결합에 있어서 중요한 역할을 하며, 분자의 생물 활성을 보유하는데에도 필수적이다. 결과적으로, 생물 활성 분자 상에 존재하는 반응 위치에 중합체 사슬이 무작위로 결합하면, 종종 중합체-변형 분자의 생물 활성이 상당히 감소하거나 또는 이러한 활성을 완전히 상실하게 된다[R. Clark외 다수, (1996), J. Biol. Chem., 271 :21969-21977]. 표적 분자에 원하는 이점을 부여하는데에 충분한 중합체 분자량을 갖는 컨쥬게이트를 형성하기 위해서, 선행 기술 분야의 접근법은 통상적으로 분자에 다수의 중합체 팔(arm)을 랜덤하게 결합시켜, 모 분자의 생물 활성이 감소하거나 또는 완전히 상실될 위험성을 증가시키는 단계를 포함한다.
단백질에 PEG 유도체를 결합시키는 위치를 형성하는 반응 부위는 단백질 구조에 의해 지정된다. 효소를 비롯한 단백질은 다양한 알파-아미노산 서열[일반식: H2N-CHR-COOH]로 이루어져 있다. 하나의 아미노산 중 알파 아미노 부위(H2N-)는 인접 아미노산의 카복실 부위(-COOH)에 결합되어, -(NH-CHR-CO)n-[식 중, 아랫 첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있음]로 표시될 수 있는 아미드 결합을 형성한다. R로서 표시되는 단편은 단백질 생물 활성 및 PEG 유도체 결합에 대한 반응성 위치를 포함할 수 있다.
예를 들어, 아미노산 리신의 경우, 엡실론 위치와 알파 위치에 -NH2 부분이 존재한다. 엡실론 -NH2는 염기성 pH 조건 하에 반응할 수 있다. PEG를 이용한 단백질 유도체화 분야의 기술 중 대부분은 단백질에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 -NH2 부분에 결합하기 위한 PEG 유도체를 개발하는데에 초점이 맞추어져 왔다["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]. 그러나, 이러한 PEG 유도체는 모두 단백질 표면상에 존재하는 다수의 리신 잔기와 선택적으로 결합할 수 없다는 공통된 한계점을 갖는다. 이점은 예를 들어, 효소 활성 위치에 존재하는 리신 잔기가 단백질 활성에 상당한 영향을 미치는 경우, 또는 수용체 결합 위치의 경우와 같이, 리신 잔기가 기타 생물 분자와 단백질의 상호 작용을 매개하는데에 일정한 역할을 하는 경우에 중요한 의미를 가질 수 있다.
현존하는 단백질 PEG화 방법에 있어서 두 번째로 중요한 한계점은 PEG 유도체가 목적으로 하는 잔기 이외의 잔기와 원치않는 부 반응을 일으킬 수 있다는 점이다. 히스티딘은 반응성 이미노 부분(-N(H)-로 표시함)을 함유하지만, 다수의 화학적으로 반응성인 화학종(즉, 엡실론 -NH2와 반응하는 화학종)도 또한 -N(H)-와 반응할 수 있다. 이와 유사하게, 아미노산 시스테인의 측 쇄는 유리 설프히드릴기(-SH로 표시함)를 보유한다. 몇몇 경우에서, 리신의 엡실론 -NH2 기에서 유도되는 PEG 유도체는 또한 시스테인, 히스티딘 또는 기타 잔기와 반응한다. 이로써 복합체 즉, PEG-유도체화 생물 활성 분자의 이종 혼합체를 형성할 수 있고, 또한 이에 따라서 표적화된 생물 활성 분자의 활성이 파괴될 위험도 가질 수 있다. 널리 규명되어 있고 예측 가능한 단백질 표면 상의 특정 위치들에서 생물 활성 분자와 하나 이상의 PEG 중합체가 선택적으로 커플링될 수 있도록 만드는, 단백질 내 단일 위치에 화학적 작용기를 도입시킬 수 있는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.
리신 잔기 이외에, 당 업계에서는 기타 아미노산 측 쇄 예를 들어, 시스테인, 히스티딘 및 N-말단을 표적화하는 활성화 PEG 시약의 개발에 상당한 노력이 기울여지고 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제6,610,281호(본원에 참고용으로 인용됨) 및 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조하시오. 시스테인 잔기는 위치-배향 돌연 변이 유발법과 기타 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 위치-선택적으로 단백질 구조에 도입될 수 있으며, 그 결과로 생성된 유리 설프히드릴 부분 은 티올-반응성 작용기를 보유하는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 하지만, 이러한 연구는, 유리 설프히드릴기를 도입하는 과정에서 결과로 생성되는 단백질의 발현, 폴딩 및 안정성을 악화시킬 수 있다는 점에서 쉽지 않다. 그러므로, 통상적으로 단백질에서 발견되는 설프히드릴기 및 기타 화학적 작용기와 혼화성임과 동시에(즉, 원치 않는 부 반응을 일으키지 않음과 동시에), 단백질에 하나 이상의 PEG 중합체를 선택적으로 커플링시킬 수 있는 화학적 작용기를 생물 활성 분자에 도입하는 수단을 갖는 것이 바람직할 것이다.
당 업계의 예를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 단백질의 측 쇄, 구체적으로 리신 아미노산 측 쇄 상의 -NH2 부분과 시스테인 측 쇄 상의 -SH 부분을 결합시키기 위하여 개발된 다수의 유도체는 이의 합성 및 사용시 문제점을 안고 있다. 이들 중 일부는 단백질과 불안정한 결합 즉, 가수 분해되어 수성 환경 예를 들어 혈류 중에서 분해, 절단 또는 불안정한 상태로 되는 불안정한 결합을 형성한다. 이들 중 일부는 보다 안정한 결합을 형성하기는 하지만, 이 결합이 형성되기 전에 가수 분해되는데, 이는 곧, PEG 유도체 상에 존재하는 반응기가 단백질이 결합할 수 있게 되기 전까지는 불활성화될 수 있음을 의미한다. 이들 중 일부는 약간의 독성을 띠고 있으므로, 생체 내에서 사용하기에는 그다지 적당하지 않다. 이들 중 일부는 반응 속도가 너무 느려서 실질적으로 유용하기 않다. 이들 중 일부는 단백질 활성을 담당하는 위치에 결합함으로써 단백질의 활성을 상실시킨다. 이들 중 일부는 이것들이 결합할 위치에 비 특이적일 뿐만 아니라, 바람직한 활성을 상실시키고 결 과의 재현성을 손상시킬 수도 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분으로 단백질을 변형시키는 것과 관련된 문제점들을 극복하기 위해서, 보다 안정하거나(예를 들어, 미국 특허 출원 제6,602,498호 참조; 본원에 참고용으로 인용됨), 또는 분자 및 표면상에 존재하는 티올 부분과 선택적으로 반응하는(예를 들어, 미국 특허 제6,610,281호; 본원에 참고용으로 인용됨) PEG 유도체를 개발하여 왔다. 당 업계에서는 선택적으로 반응하여 안정한 화학 결합을 형성함에 따라서 생리 환경 하에서 화학적으로 비활성인 PEG 유도체 개발의 필요성이 요구되고 있다.
그러므로, 현재, 인간 치료용으로서 적당한, 실질적으로 순수한 형태인 hGH 폴리펩티드를 제공해야 할 필요성이 요망되고 있다. 뿐만 아니라, 효율성이 높고 비용 절감 효과가 있는 거대 규모 생산에 부응하는, 제약학적 등급의 hGH 폴리펩티드 생산 방법을 개발할 필요가 있는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 재조합 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 hGH 폴리펩티드를 생산 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 재조합 숙주 예를 들어, 원핵 생물 세포 숙주, 박테리아 숙주 또는 이.콜라이 숙주로부터 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 생산 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다: (a) 음 이온 교환 크로마토그래피 및 (b) 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC). PEG화된 hGH 폴리펩티드를 정제하는 방법은 다음의 부가 단계들을 포함한다: (c) hGH 폴리펩티드와 PEG를 반응시켜 hGH-PEG 컨쥬게이트를 형성하는 단계; 및 (d) 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트를 음 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계.
다른 구체예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다: (a) 음 이온 교환 크로마토그래피; (b) 수산화인회석 크로마토그래피; 및 (c) 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC). PEG화된 hGH 폴리펩티드를 정제하는 방법은 다음의 부가 단계들을 포함한다: (d) hGH 폴리펩티드와 PEG를 반응시켜 hGH-PEG 컨쥬게이트를 형성하는 단계; 및 (e) 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트를 음 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계.
하나의 구체예에서, 상기 재조합 숙주는 원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구체예에서, 재조합 숙주는 hGH 폴리펩티드를 포함하는 불용성 아세포 성분 예를 들어, 봉입체(inclusion body)를 생산하는 임의의 숙주 세포 예를 들어, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 및 박테리아 세포 예를 들어, 이.콜라이를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료로서는, 예를 들어, 알킬- 또는 아릴-치환 매트릭스 예를 들어, 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스 예를 들어, 아가로즈, 가교 아가로즈, 세파로즈, 셀룰로즈, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스, 그리고 혼합 형 수지 예를 들어, 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 재료는 페닐 세파로즈 수지를 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 분리된, 실질적으로 정제된 형태의 hGH 폴리펩티드로서는 예를 들어, 성숙 hGH, 성숙 hGH 변이체, hGH 폴리펩티드, hGH 폴리펩티드 변이체 및 폴리(에틸렌 글리콜)에 컨쥬게이트화된 hGH를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 분리된, 실질적으로 정제된 형태의 hGH 폴리펩티드는 성숙 hGH의 하나 이상의 생물 활성을 나타낼 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 분리된, 실질적으로 정제된 형태의 hGH 폴리펩티드는 포유동물의 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 분리된, 실질적으로 정제된 형태의 hGH 폴리펩티드는 인간의 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, HIC 단계에서 얻어진 hGH 폴리펩티드는 수용성 중합체와 공유 결합할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 다른 구체예에서, 상기 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 포함한다.
비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 발현시키고 이의 PEG화 형을 정제하면, 위치 특이적 방식으로 변형된 치료용의 hGH 분자를 얻을 수 있다. hGH 폴리펩티드의 천연 암호화 아미노산을 PEG화시키면, 바람직하지 않은 위치에서 hGH 폴리펩티드를 PEG화시킬 수 있고/있거나 불순물일 수 있는 원치 않는 폴리펩티드를 PEG화시킬 수 있다. hGH 폴리펩티드를 위치-특이적으로 PEG화시키기 위해 비천연 암호화 아미노산을 이용하는 방법을 통하여, 위와 같은 경우에 필요로 하는 정제 단계를 불필요하게 만들 수 있다.
다른 구체예에서, 하나 이상의 비천연 생성 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 다른 분자 예를 들어, PEG에 컨쥬게이트화시키면, 비천연 아미노산에 컨쥬게이트화시 이용되는 독특한 화학 반응으로 인하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 제공한다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 다른 분자 예를 들어, PEG에 컨쥬게이트화시키는 방법은, 컨쥬게이트화 이전에 또는 이후에 수행되는 다른 정제 기술로써 수행되어, 실질적으로 순수한 hGH 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
도 1은 8 리터 들이 발효 공급액의 유량을 나타내는 것이다.
도 2는 5리터 규모의 발효 공정을 나타내는 것이다.
도 3의 패널 A 및 패널 B는 세포질 주변 방출 및 균질화에 의해 제조된 hGH 폴리펩티드의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 5 리터 규모의 발효에 있어서 진행 공정을 나타내는 것이다.
도 5는 선형인 30 kDa PEG의 화학 구조를 나타내는 것이다.
정의
본 발명은 본원에 개시된 특정 방법, 절차, 세포주, 구조물 및 시약에 한정되지 않고 다양할 수 있음을 알아두어야 한다. 뿐만 아니라, 본원에 사용된 용어는 오로지 특정 구체예를 예시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오로지 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다는 사실도 유념해야 한다.
본원 및 첨부된 청구항에 사용된, 단수를 나타내는 "하나(a)", "하나의(an)" 및 "상기(the)"란 용어는, 본 명세서의 내용 중에서 달리 특정하지 않는 한 복수의 것을 포함한다. 그러므로 예를 들어, "hGH"(a "hGH")는, 이러한 단백질 하나 이상을 의미하는 것으로서, 당 업자에게 공지된 균들물 등도 포함한다.
달리 특정하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당 업자에게 통상적으로 이해되고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법, 장치 및 재료들이 본 발명을 실시 또는 시험하는데에 사용될 수도 있지만, 본원에는 바람직한 방법, 장치 및 재료들이 기술되어 있다.
본원에 언급된 모든 공보 및 특허 문헌들은 예를 들어, 본원에 개시된 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 공보에 기술된 방법 및 구조물을 기술 및 개시하기 위해 참고용으로 인용되어 있다. 본원에 논의된 공보는 본 출원의 출원일 이전에 공표용으로서 제공된 것이다. 본원에 있어서 어떠한 공지의 문헌들도 본원의 발명자들이 선행 발명에 의해 개시된 사항보다 앞서서 자격을 부여받지 못한다는 것에 대해서 자인하는 것으로 해석되어서는 아니 될 것이다.
미국 가 명세서 출원 제11/046,432호는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다. 미국 가 명세서 출원 제11/046,432호에는 hGH의 천연 생성 아미노산 서열, 비천연 암호화 아미노산을 통합하기 위한 위치 선택, 그리고 비천연 암호화 아미노산, 비천연 암호화 아미노산 hGH 폴리펩티드 및 변형 비천연 암호화 아미노산 hGH 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법, 조성물, 기술 및 계획에 관하여 기술되어 있다.
본원에 사용된 "단백질"이란 용어는, 아미노산의 중합체 또는 아미노산의 다양한 중합체들의 복합체를 포함하며, 특정 길이를 갖는 아미노산 중합체를 의미하지는 않는다. 그러므로, 예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드는 재조합 기술, 화학적 또는 효소적 합성법을 사용하여 생산되었는지, 아니면 천연 생성되었는지에 따라서 단백질의 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화 등에 의하여 변형 또는 유도체화된 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하기도 한다. "단백질"이란 용어는 특히, 본원에 정의된 바와 같은 변이체를 포함한다. "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 본원에서 호환적으로 사용되는 용어로서, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 즉, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드 및 단백질에 관한 설명에도 해당되는 것이고, 그 역으로도 마찬가지이다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 암호화 아미노산인 아미노산 중합체 및 천연 생성 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 임의의 길이를 갖는 아미노산 사슬 예를 들어, 전장 단백질을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 결합되어 있다.
본원에 사용된 "성장 호르몬" 또는 "GH"란, 생물 활성에 상관없이, 그리고 합성 또는 제조 방법 예를 들어, 재조합 방법(cDNA, 게놈성 DNA, 합성 DNA 또는 핵산의 기타 형태로부터 생산), 시험관 내 및 생체 내에서 핵산 분자를 미세 주입함에 의한 방법, 합성 및 트랜스게닉 유전자 활성화 방법에 상관없이, 인간 성장 호르몬과, GH 유사체, GH 아형, GH 모의체, GH 단편, 혼성 GH 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 상동체, 글리코실화 패턴 변이체, 변이체, 스플라이싱 변이체 및 이들의 뮤테인의 생물 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다. "hGH 폴리펩티드" 또는 "hGH"라는 용어는 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 발생한 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 천연 생성 hGH의 다양한 아미노산 위치가 치환된 대표적인 치환체 예를 들어, 작동제 활성 및 단백질 분해 효소 내성을 증가시키고, 폴리펩티드를 길항제로 전환하며, 면역원성과 수용체 결합 특성등을 조정하는 치환체는 "hGH 폴리펩티드"라는 용어에 포함된다.
완전히 전장인 천연 생성 GH 아미노산 서열과 성숙한 천연 생성 GH 아미노산 서열, 그리고 천연 생성 돌연 변이체에 관하여는 본원에 개시되어 있다[각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 해당]. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 기타 임의의 성장 호르몬 폴리펩티드 서열과 실질적으로 상동성이다. hGH의 다수의 천연 생성 돌연 변이체가 동정되었다. 그 예로서는 hGH-V[Seeburg, DNA 1: 239 (1982); 미국 특허 제4,446,235호, 동 제4,670,393호 및 동 제4,665,180호(본원에 참고용으로 인용됨)] 및 20-kDa hGH(hGH의 32∼46번 잔기가 결실됨)[Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U.외 다수, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978)]를 포함한다. 태반 성장 호르몬에 관하여는 문헌[Igout, A.외 다수, Nucleic Acids Res. 17(10):3998 (1989)]에 기술되어 있다. 뿐만 아니라, 전사 후 가공, 번역 후 가공, 분비 과정, 대사 과정 및 기타 생리적 과정에서 생성된 다수의 hGH 변이체는 단백 분해되는 2개의 사슬 변이체를 포함한다고 보고된 바 있다[Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)]. hGH 돌연 변이체 및 돌연 변이 hGH 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관하여는 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 미국 특허 제5,534,617호; 동 제5,580,723호; 동 제5,688,666호; 동 제5,750,373호; 동 제5,834,250호; 동 제5,834,598호; 동 제5,849,535호; 동 제5,854,026호; 동 제5,962,411호; 동 제5,955,346호; 동 제6,013,478호; 동 제6,022,711호; 동 제6,136,563호; 동 제6,143,523호; 동 제6,428,954호; 동 제6,451,561호; 동 제6,780,613호 및 미국 특허 출원 공보 2003/0153003(본원에 참고용으로 인용됨)에 개시된 것들을 포함한다. "hGH"란 용어는, 또한 비천연 암호화 아미노산의 위치-배향 치환이 발생한 재조합 인간 성장 호르몬을 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
본원에 개시된 hGH의 아미노산 위치에 관한 번호는 달리 특정하지 않는 한 서열 번호 2의 위치를 바탕으로 한다[즉, 서열 번호 1, 3 또는 기타 hGH 서열을 바탕으로 하여 비교될 경우]. 당 업자는 서열 번호 1, 2, 3 또는 기타 임의의 GH 서열에 상응하는 아미노산 위치는 임의의 기타 hGH 분자 예를 들어, hGH 융합체, 변이체 및 단편에서 용이하게 동정될 수 있음을 파악할 수 있다. 예를 들어, 서열 정렬 프로그램 예를 들어, BLAST는 서열 번호 1, 2, 3 또는 기타 GH 서열의 위치에 해당하는, 단백질 내 특정 위치를 정렬 및 동정하는데에 사용될 수 있다. 서열 번호 1, 2, 3 또는 기타 GH 서열을 참고로 하였을 때, 본원에 기술된 아미노산의 치환, 결실 또는 부가는 또한, 본원에 기술되어 있거나 또는 당 업계에 공지된 hGH 융합체, 변이체 및 단편 등의 상응하는 위치에 발생한 치환, 결실 또는 부가를 의미하기도 하며, 이 또한 본 발명에 포함되는 것이다.
시판되고 있는 hGH 제제는 다음과 같은 상품명으로 시판되고 있다: 휴머트로프(Humatrope)™ (EliLilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin)™ (Genentech), 노르디트로핀(Norditropin)™ (Novo-Nordisk), 제노프로핀(Genotropin)™ (Pfizer) 및 사이젠(Saizen)/세로스팀(Serostim)™ (Serono).
"hGH 폴리펩티드"라는 용어는 또한 약학적으로 허용 가능한 염 및 전구 약물과, 천연 생성 hGH의 염, 다형체, 수화물, 용매 화합물, 생물 활성 단편, 생물 활성 변이체 및 입체 이성체의 전구 약물, 그리고 천연 생성 hGH 및 이의 폴리펩티드 융합체의 작동제, 모의체 및 길항제 변이체를 포함한다. 아미노 말단, 카복시 말단 또는 이 둘다에 부가 아미노산을 포함하는 융합체는 "hGH 폴리펩티드"라는 용어에 포함된다. 대표적인 융합체로서는 예를 들어, 메티오닐 성장 호르몬[재조합 발현을 통하여 형성된 hGH의 N-말단에 메티오닌이 결합되어 있는 것], 정제를 위한(예를 들어, 폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프와의) 융합체, 혈청 알부민 결합 펩티드와의 융합체 및 혈청 단백질 예를 들어, 혈청 알부민과의 융합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,750,373호에는, 신규 단백질 예를 들어, 각각의 수용체 분자에 대한 결합 특성이 변형된 성장 호르몬 및 항체 단편의 변이체를 선택하는 방법에 관하여 기술되어 있다. 이 방법은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 사상 파지인 M13의 외피 단백질 제III 유전자의 카복시 말단 도메인에 융합시키는 단계를 포함한다.
다양한 문헌에는 중합체 컨쥬게이트화 또는 글리코실화에 의해 폴리펩티드를 변형하는 방법이 개시되어 있다. "hGH 폴리펩티드"란 용어는 중합체 예를 들어, PEG에 컨쥬게이트화된 폴리펩티드를 포함하며, 시스테인, 리신 또는 기타 잔기의 하나 이상의 부가 유도체를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 hGH 폴리펩티드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있는데, 여기서 링커 또는 중합체에 컨쥬게이트화된 아미노산은 본 발명에 따라서 비천연 아미노산일 수 있거나, 또는 당 업계에 공지된 기술 예를 들어, 리신 또는 시스테인과의 커플링을 이용하여 천연 암호화 아미노산에 컨쥬게이트화될 수 있다.
본 발명은 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 보유하는 hGH 폴리펩티드와, 기타 물질 예를 들어, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광 가교제; 방사성 핵종; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광 친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트화제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제 리보핵산; 생체 적응 재료; 나노 입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 기타 분자와 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 기; 광 케이지화된 부분(photocaged moiety); 광 이성체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유도체; 바이오틴 유사체; 중원자 통합 부분; 화학적으로 분해 가능한 기; 광 절단 가능 기; 연장된 측 쇄; 탄소-결합 당; 산화 환원-활성화제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소 표지화된 부분; 생체 물리학적 프로브; 인광 기; 화학 발광기; 전자 조밀 기(electron dense group); 자성 기; 삽입 기(intercalating group); 발색 단; 에너지 전이제; 생물학적 활성 제제; 검출 가능한 표지; 소 분자; 양자 점(quantum dot); 나노 전달체(nanotransmitter); 방사성 뉴클레오티드; 방사성 전달체(radiotransmitter); 중성자 포획제(neutron capture agent) 또는 상기 것들의 임의의 조합체, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질의 컨쥬게이트를 제공한다.
hGH 폴리펩티드와 중합체의 컨쥬게이트화에 관하여도 보고된 바 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,849,535호, 동 제6,136,563호 및 동 제6,608,183호를 참조하시오. 미국 특허 제4,904,584호에는 PEG화된 리신이 흠결된 폴리펩티드에 관하여 개시되어 있는데, 여기서 하나 이상의 리신 잔기는 흠결되거나 또는 기타 임의의 아미노산 잔기와 치환된다고 한다. WO 99/67291에는, 단백질과 PEG의 컨쥬게이트화 방법에 관하여 개시되어 있는데, 여기서 단백질 상에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 결실되어 있으며, 이 단백질은 단백질과 컨쥬게이트화되기에 충분한 조건 하에 PEG와 접촉된다고 한다. WO 99/03887에는, 성장 호르몬 상과에 속하는 폴리펩티드의 PEG화 변이체에 관하여 개시되어 있는데, 여기서 시스테인 잔기는 폴리펩티드의 특정화된 부위에 위치하는 불필수 아미노산 잔기와 치환된다고 한다. WO 00/26354에는, 알레르기 유발성이 감소된 글리코실화 폴리펩티드 변이체의 생산 방법에 관하여 개시되어 있는데, 이는 상응하는 모 폴리펩티드와 비교하였을 때 하나 이상의 부가 글리코실화 위치를 포함한다. 미국 특허 제5,218,092호에는, 원래의 폴리펩티드에 비하여 하나 이상의 부가 탄수화물 사슬을 도입하기 위하여 과립구 집락 형성 인자(G-CSF) 및 기타 폴리펩티드를 변형하는 것에 관하여 개시되어 있다.
"hGH 폴리펩티드"란 용어는, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 발생한 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 비 천연 아미노산 변형과 함께, 하나 이상의 천연 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 천연 생성 hGH 폴리펩티드 중 다양한 아미노산 위치에 있어서의 대표적인 치환에 관하여는 기술된 바 있는데, 그 예로서는 hGH 폴리펩티드의 생물 활성 중 하나 이상을 조정하는 치환 예를 들어, 작동제 활성 및 폴리펩티드 가용성을 증가시키는 치환, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 치환, 단백질 분해 효소에 대한 민감성을 감소시키는 치환 등을 포함하며, 이와 같이 치환이 발생한 폴리펩티드는 "hGH 폴리펩티드"라는 용어에 포함된다. 몇몇 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 생물 활성을 조정하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 부가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조정할 수 있거나, 수용체의 이량체화를 조정(예를 들어, 상승 또는 감소)할 수 있거나, 수용체의 이량체를 안정화할 수 있거나, 순환 반감기를 조정할 수 있거나, 치료 반감기를 조정할 수 있거나, 폴리펩티드의 안정성을 조정할 수 있거나, 단백질 분해 효소에 의한 절단을 조정할 수 있거나, 투여량을 조정할 수 있거나, 방출 또는 생체 적합성을 조정할 수 있거나, 정제를 촉진할 수 있거나 또는 특정 투여 경로를 개선 또는 변경할 수 있다.
이와 유사하게, hGH 폴리펩티드는 폴리펩티드의 검출 특성을 개선 시키고(예를 들어, GFP), 정제 특성 또는 기타 특성을 개선 시키는, 단백질 분해 효소 절단 서열, 반응기, 항체-결합 도메인(예를 들어, FLAG 또는 폴리-His) 또는 기타 친화성을 바탕으로 하는 서열(예를 들어, FLAG, 폴리-His, GST 등) 또는 결합 분자(예를 들어, 바이오틴)을 포함할 수 있다. hGH 폴리펩티드는 분비 신호 서열을 포함할 수 있다. 분비 신호 서열의 예로서는 예를 들어, 원핵 생물 분비 신호 서열, 진핵 생물 분비 신호 서열, 박테리아 내 발현을 위해 5'-최적화된 진핵 생물 분비 신호 서열, 신규의 분비 신호 서열, 펙트산염 분해 효소 분비 신호 서열, OmpA 분비 신호 서열 및 파지 분비 신호 서열을 포함할 수 있다. 분비 신호 서열의 예로서는, STII(원핵 생물), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모) 및 트랜스포존으로부터 유래된 신호 서열 bla를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"hGH 폴리펩티드"라는 용어는 또한 예를 들어, 비 천연 암호화 아미노산 측 쇄에 의하여 동일하거나 또는 상이한 비천연 암호화 아미노산 측 쇄, 천연-암호화 아미노산 측 쇄에 직접 결합되었거나, 또는 링커에 의해 간접적으로 결합된, 동형 이량체, 이형 이량체, 동형 다량체 및 이형 다량체를 포함한다. Cys-Cys 이황화 결합에 의해 직접적으로 결합되어 있는 hGH 이량체에 관하여는 문헌[Lewis, U. J.외 다수, J. Biol. Chem. 252:3697-3702 (1977); Brostedt, P. and Roos, P., Prep. Biochem. 19:217-229 (1989)]에 기술되어 있다. 대표적인 링커로서는 예를 들어, 수용성 중합체 예를 들어, 다양한 길이의 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란 또는 폴리펩티드를 포함한다.
"hGH 폴리펩티드"란 용어는 또한 글리코실화된 hGH 예를 들어, 임의의 아미노산 위치가 글리코실화된 폴리펩티드 즉, N-결합 또는 O-결합 글리코실화된 폴리펩티드를 포함한다. 단일의 뉴클레오티드가 변형된 변이체는 또한 hGH 폴리펩티드의 생물 활성 변이체로서 간주된다. 뿐만 아니라, 스플라이싱 변이체도 포함된다. "hGH 폴리펩티드"란 용어는 또한 하나 이상의 임의의 hGH 폴리펩티드 또는 임의의 기타 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소 분자, 링커, 리간드 또는 기타 임의의 종류의 생물 활성 분자가 화학적 수단에 의하여 결합되어 있거나 또는 융합 단백질로서 발현되는, hGH 폴리펩티드 이형 이량체, 동형 이량체, 이형 다량체 또는 동형 다량체, 그리고 예를 들어, 특정 부위의 결실 또는 기타 변형을 포함하지만 생물 활성은 여전히 보유하는 폴리펩티드 유사체를 포함한다.
당 업자는 특정 hGH 서열 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 임의의 기타 hGH 분자 예를 들어, hGH 융합체, 변이체 및 이의 단편 등에서 용이하게 확인할 수 있다는 사실을 알게 될 것이다. 예를 들어, 서열 정렬 프로그램 예를 들어, BLAST는 특정 GH 서열에 존재하는 위치와 상응하는 단백질 내 특정 위치를 정렬 및 동정하는데에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "원래의 hGH(native hGH)"란, hGH 예를 들어, 천연 생성 hGH, 이의 유사체 및 변이체로서 정의되는 것으로서, 정확하게 폴딩되었고 올바른 이황화 결합만을 함유하는 hGH이다. hGH은 또한 4개의 시스테인 잔기를 함유하는데, 이 잔기는 2개의 분자 내 이황화 결합에 관여한다: C53은 C165와 쌍을 이루고, C182는 C189와 쌍을 이루거나, hGH의 유사체 및 변이체에 존재하는 아미노산 잔기의 상동체와 쌍을 이룬다.
"불용성 hGH"란, 재조합 숙주 세포 또는 관련 재조합 숙주 세포에 의해서 생산되는 침전형 또는 응집형 hGH를 의미하며, 이것은 만일 부정확한 이황화 결합이 형성되었거나 또는 이황화 결합이 형성되어 있지 않을 경우에는 생물학적으로 비활성인 형태를 갖게 될 수 있다. 불용성 hGH는 봉입체 또는 굴절체(refractile body)에 포함될 수 있는데, 즉, 이는 위상 차 현미경에서 관찰할 수 있거나 또는 관찰할 수 없다. 불용성 hGH는 당 업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 가용성 hGH를 불용성으로 만들어 생산될 수 있다.
"부적당하게 폴딩된 hGH"란, 이황화 결합이 잘못 형성되었거나 또는 형성되지 않은, 생물학적으로 활성이 떨어지는 형태를 갖는 hGH를 의미한다. 부적당하게 폴딩된 hGH는 불용성일 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다.
본원에 사용된 "hGH 변이체"란 용어는, 성숙한 hGH 및 hGH 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. "hGH 변이체"는 예를 들어, 성숙 단백질 내 하나 이상의 위치에서 일어나는 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가, 성숙한 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서 일어나는 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가 및/또는 성숙한 단백질 내 하나 이상의 위치에서 일어나는 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해서 생산될 수 있다. 예를 들어, hGH 변이체는 10개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 아미노산을 부가 또는 결실하여 생산될 수 있다. hGH 변이체는 또한 변역 후 변형 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화 및 인산화 등을 포함할 수 있다. "hGH 변이체"란 용어는, 구체적으로 성숙한 hGH 서열의 돌연 변이체, 대립 형질 변이체, 상동체 및 융합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. hGH 변이체는 또한 펩티드 모의체 또는 "펩토이드(peptoid)"를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. WO 91/04282를 참조하시오.
"실질적으로 정제된"이란 용어는, 천연 형성 환경 즉, 원래의 세포, 또는 숙주 세포(재조합 생산된 hGH 폴리펩티드인 경우)에서 발견되는 단백질과 일반적으로 공존하거나 이와 상호 작용하는 성분이 실질적으로 존재하지 않거나 또는 근본적으로 존재하지 않는 hGH 폴리펩티드를 의미한다. 실질적으로 세포 내 물질이 존재하지 않을 수 있는 hGH는 오염 단백질(contaminating protein)의 건조 중량의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만인 단백질 제제를 포함한다. hGH 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의하여 재조합 생산될 때, 단백질은 세포 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 또는 그 미만으로 존재할 수 있다. hGH 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합 생산될 때, 단백질은 배양 배지 중에 세포 건조 중량의 약 5 g/ℓ, 약 4 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ, 약 750 ㎎/ℓ, 약 500 ㎎/ℓ, 약 250 ㎎/ℓ, 약 100 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ, 약 10 ㎎/ℓ 또는 약 1 ㎎/ℓ 또는 그 미만으로 존재할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 "실질적으로 정제된" hGH 폴리펩티드는 순도 수준이 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 구체적으로 약 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 및 보다 구체적으로 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상 또는 그 이상일 수 있다[예를 들어, SDS/PAGE 분석법, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기 영동법에 의해 측정함].
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"란, 재조합 숙주 세포를 생산하기 위한 방법으로서 당 업계에 공지된, 삽입법 예를 들어, 직접 섭취법(direct uptake), 형질 도입, f-교배 또는 기타 방법에 상관없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 의미한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 비 통합형 벡터 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
본원에 사용된 "배지" 또는 "배지(복수형)"라는 용어는, 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 임의의 숙주 세포 예를 들어, 박테리아 숙주 세포, 진핵 생물 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 생물 숙주 세포, 이.콜라이, 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포를 지지하거나 또는 포함할 수 있는 견고한 지지체, 그리고 세포 내용물을 포함한다. 그러므로, 상기 용어는 숙주 세포가 성장한 배지, 예를 들어, hGH 폴리펩티드가 분비된 배지 예를 들어, 증식 단계 이전 또는 이후의 배지를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 예를 들어, hGH 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되고, 숙주 세포가 용해 및 파괴되어 hGH 폴리펩티드를 방출하는 경우, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함할 수 있다.
본원에 있어서 단백질 리폴딩(protein refolding)에 관하여 사용된 "환원제"란, 설프히드릴기를 환원된 상태로 유지시키고 분자 내 또는 분자 간 이황화 결합을 환원시키는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적당한 환원제로서는 예를 들어, 디티오트레이톨(DTT), 2-머캡토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄에티올) 및 환원 글루타치온을 포함한다. 다양한 환원제가 본 발명의 방법에 사용되기에 적당하다는 사실을 당 업자는 용이하게 파악할 수 있다.
본원에 있어서 단백질 리폴딩에 관하여 사용된 "산화제"란 용어는, 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적당한 산화제로서는 산화된 글루타치온, 시스틴, 시스타민, 산화 디티오트레이톨, 산화 에리트레이톨 및 산소를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 산화제가 본 발명의 방법에 사용되기에 적당하다는 사실을 당 업자는 용이하게 파악할 수 있다.
본원에 사용된 "변성 제제" 또는 "변성제"란, 단백질의 가역적 언폴딩(unfolding)을 유발시킬 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 변성 제제 또는 변성제의 세기는 특정 변성 제제 또는 변성제의 농도와 특성에 의해 결정될 것이다. 적당한 변성 제제 또는 변성제는 케이오트로프(chaotrope), 세제, 유기 용매, 수혼화성 용매, 인지질 또는 이러한 제제 중 2개 이상의 조합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적당한 케이오트로프로서는 우레아, 구아니딘 및 티오시안산나트륨을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유용한 세제로서는 강력 세제 예를 들어, 황산 나트륨 도데실 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton) 세제), 사코실(Sarkosyl), 순한 비-이온계 세제(예를 들어, 디기토닌), 순한 양이온 세제 예를 들어, N→2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 순한 이온 세제(예를 들어, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트) 또는 양쪽성 이온 세제 예를 들어, 설포베타인(양쪽성 작용제), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트(CHAPS) 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유기의 수혼화성 용매 예를 들어, 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, C2∼C4 알칸올 예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히, C2∼C4 알칸디올 예를 들어, 에틸렌-글리콜)이 변성제로 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 천연 생성 인지질 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체 예를 들어, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.
본원에 사용된 "리폴딩(refolding)"이란, 이황화 결합 함유 폴리펩티드를 부적당하게 폴딩되었거나 또는 폴딩되지 않은 상태에서, 이황화 결합과 관련하여 원래 형태 또는 적당히 폴딩된 형태로 변형시키는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 의미한다.
본원에 사용된 "코폴딩(cofolding)"이란, 특히, 각각 상호 작용을 하고, 그 결과 폴딩되지 않거나 또는 부적당하게 폴딩된 폴리펩티드를 원래의 적당히 폴딩된 폴리펩티드로 변형시키는 2개 이상의 폴리펩티드를 사용하는 레폴딩 과정, 반응 또는 방법을 의미한다.
"비천연 암호화 아미노산(non-naturally encoded amino acid)"이란, 20개의 공통 아미노산 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인 중 어느 것도 아닌 아미노산을 의미하는 것이다. 용어 "비천연 암호화 아미노산"의 동의어로서 사용될 수 있는 기타 용어로는 "비천연 아미노산(non-natural amino acid)", "인위적 아미노산(unnatural amino acid)", "비천연 생성 아미노산(non-naturally-occurring amino acid)" 및 다양하게 하이픈 표시된(variously hyphenated) 것과 하이픈 표시되지 않은(non-hyphenated) 것이 있다. "비천연 암호화 아미노산"이란 용어는, 또한 천연 암호화 아미노산(예를 들어, 20개의 공통 아미노산 또는 피롤리신 및 셀레노시스테인)의 변형(예를 들어, 번역 후 변형)에 의해 생성되되, 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 사슬에 천연적으로 통합되지 않는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 비천연 생성 아미노산의 예로서는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "수용성 중합체"란 용어는, 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 의미한다. 수용성 중합체가 hGH 폴리펩티드에 결합하면 변화 예를 들어, 증가 또는 조정된 혈청 반감기, 변형되지 않은 형태의 것에 비하여 증가 또는 조정된 치료 반감기, 조정된 면역원성, 조정된 물리적 회합 특성 예를 들어, 응집 및 다량체 형성 특성, 변형된 수용체 결합성 및 변형된 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 초래할 수 있다. 수용성 중합체는 그것 만의 생물 활성을 가질 수 있거나 또는 가질 수 없으며, 다른 물질 예를 들어, 하나 이상의 hGH 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 생물 활성 분자에 hGH를 결합시킬 때에 사용될 링커로서 이용될 수 있다. 적당한 중합체로서는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피오날데히드, 모노 C1∼C10 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 제5,252,714호에 개시), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리 아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 황산덱스트란을 포함하는 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 산화폴리프로필렌/산화에틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당, 올리고당, 글리칸, 셀룰로즈 및 셀룰로즈 유도체 예를 들어, 메틸셀룰로즈 및 카복시메틸 셀룰로즈, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜과 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파타미드 등, 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 수용성 중합체의 예로서는, 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"아미노 말단 변형 기"란, 폴리펩티드의 아미노 말단에 결합 될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 이와 유사하게, "카복시 말단 변형 기"란, 폴리펩티드의 카복시 말단에 결합 될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 말단 변형 기로서는, 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질 예를 들어, 혈청 알부민, 또는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 기타 부분을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된, "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"이란 용어는, 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이들의 유도체를 의미한다. "폴리알킬렌 글리콜"이란 용어는, 선형 및 분지형 중합체 둘 다를 포함하며, 이의 평균 분자량은 0.1∼100 kDa이다. 기타 예시적인 구체예에 관하여는 예를 들어, 상업용 공급자 카탈로그 예를 들어, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카탈로그인 "생물 의학 분야의 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications)"(2001)에 나열되어 있다.
당 업계 및 본원에 있어서 사용된 "작용기", "활성 부분", "활성화기", "이탈기", "반응 위치", "화학적 반응기" 및 "화학적 반응 부분"이란 용어는, 분자의 별개의(distinct), 정의할 수 있는(definable) 일부 또는 단위를 의미한다. 이 용어들은 화학 분야에 있어서 어느 정도 유사한 의미로 통용되고 있으며, 본원에서는 몇몇 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자들과 반응성인 분자의 일부를 나타내는 것으로 사용되고 있다.
본원에 있어서 "결합" 또는 "링커"란 용어는, 보통 화학 반응의 결과로서 형성되는 기 또는 결합을 의미하는 것으로서, 통상적으로는 공유 결합이다. 가수 분해에 안정한 결합이란, 예를 들어, 생리 조건 하에 장기간 동안(무한정) 유용한 pH 값을 갖는 물에서 실질적으로 안정하고 이 물과 반응하지 않는 결합을 의미한다. 가수 분해에 불안정하거나 또는 분해될 수 있는 결합이란, 결합이 물 또는 수용액 예를 들어, 혈액 중에서 분해될 수 있음을 의미한다. 효소에 불안정하거나 또는 분해될 수 있는 결합이란, 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 경우를 의미한다. 당 업계에서 이해되는 바에 의하면, PEG 및 관련 중합체는 중합체 주쇄과 중합체 분자의 말단 작용기 중 하나 이상 사이에 존재하는 링커 기 또는 중합체 주쇄 내에 존재하는 분해 가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카복시산 또는 활성화된 PEG 카복시산과 알콜기가 반응함으로써 생물 활성 제제 상에 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리 조건 하에 가수 분해되어 제제를 방출한다. 기타 가수 분해에 의해 분해될 수 있는 결합으로서는 카보네이트 결합; 아민과 알데히드의 반응으로 생성된 이민 결합; 알콜과 포스페이트 기의 반응으로 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드와 알데히드의 반응 생산물인 히드라존 결합; 알데히드와 알콜의 반응 생산물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알콜의 반응 생산물인 오르토에스테르 결합; 예를 들어, 중합체 예를 들어, PEG의 말단에 존재하는 아민기와, 펩티드의 카복실기에 의해 형성된 펩티드 결합; 그리고, 예를 들어, 중합체의 말단에 존재하는 포스포라미디트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록시기에 의하여 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "생물학적으로 활성인 분자", "생물학적으로 활성인 부분" 또는 "생물학적으로 활성인 제제"란 용어는, 생물 계, 경로, 분자 또는 유기체 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간과 관련된 상호 작용의 임의의 물리적 특성 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용된 생물학적으로 활성인 분자로서는, 인간 또는 기타 동물의 질병을 진단, 치료, 완화, 처치 또는 예방하기 위한 임의의 물질, 또는 인간이나 동물의 신체적 또는 정신적 건강을 강화시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적으로 활성인 분자의 예로서는 펩티드, 단백질, 효소, 소 분자 약물, 중독성이 강한 환각제, 중독성이 없는 환각제, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세 입자 및 미셀을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적당한, 생물학적으로 활성인 제제 군은, 약물, 전구 약물, 방사성 핵종, 조영제, 중합체, 항생제, 살 진균제, 항-바이러스제, 소염제, 항-종양제, 심 혈관계 제제, 안정제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드계 제제 및 미생물 유래 독소 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"이 작용성 중합체(bifunctional polymer)"란, 다른 부분(예를 들어, 아미노산 측기)과 특이적으로 반응하여 공유 결합 또는 비 공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 개별 작용기들을 포함하는 중합체를 의미한다. 생물학적으로 활성인 특정 성분상에 존재하는 기와 반응성인 작용기를 하나 갖고, 제2의 생물 성분상에 존재하는 기와 반응성인 다른 기를 갖는 이 작용성 링커는 제1의 생물학적 활성 성분, 이 작용성 링커 및 제2의 생물학적 활성 성분을 포함하는 컨쥬게이트를 형성하는데에 사용될 수 있다. 다양한 화합물을 펩티드에 결합시키기 위한 다수의 방법 및 링커 분자들에 관하여는 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호, 동 제4,659,839호, 동 제4,414,148호, 동 제4,699,784호, 동 제4,680,338호 및 동 제4,569,789호(본원에 참고용으로 인용됨)를 참조하시오. "다 작용성 중합체(multi-functional polymer)"란, 다른 부분(예를 들어, 아미노산 측기)과 특이적으로 반응하여 공유 결합 또는 비 공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 개별 작용기들을 포함하는 중합체를 의미한다. 이 작용성 중합체 또는 다 작용성 중합체는 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있으며, hGH와 결합하고 있는 하나 이상의 분자들 간에 특히 바람직한 공간 또는 형태를 확보하도록 선택될 수 있다.
치환기가 통상의 화학식(좌→우로 표시)으로 특정되는 경우, 이는 또한 화학적으로 동일한 치환기(화학식을 우→좌로 표시)를 포함하는데, 예를 들어, 화학식 -CH2O-는 화학식 -OCH2-와 동일한 것이다.
본원에 사용된 "조정된 혈청 반감기"란, 변형된 hGH의 순환 반감기가 변형되지 않은 hGH의 순환 반감기에 비하여 증가 또는 감소 된 경우를 의미한다. 혈청 반감기는 hGH를 투여한 이후 여러 시점에서 혈액 시료를 채취하여, 각 시료 중에 존재하는 분자의 농도를 측정함으로써 구할 수 있다. 혈청 농도와 시간과의 상관성을 이용하여 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 혈청 반감기는 예를 들어, 만족할 만한 방식으로 투여할 수 있게 되거나 또는 독성 효과를 피할 수 있을 경우, 약 2배 증가하는 것이 바람직하지만, 이보다 더 적게 증가하는 경우도 유용할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 증가 정도는 약 3배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 이상이다.
본원에 사용된 "조정된 치료 반감기"란 용어는, hGH 폴리펩티드를 치료적 유효량 투여하였을 때, 변형되지 않은 hGH 폴리펩티드를 치료적 유효량 투여하였을 경우에 비하여 반감기가 증가 또는 감소 된 경우를 의미한다. 치료적 반감기는 투여 후 여러 시점에서 분자의 약물 동력학적 특성 및/또는 약물 동태학적 특성을 측정함으로써 구하여지는 것이다. 치료적 반감기가 증가하게 되면, 바람직하게는, 특히 유리한 투여 방식, 특히 유리한 총 투여량이 될 수 있거나, 또는 원치 않는 효과를 피할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 치료적 반감기의 증가는 변형 분자의 증가된 효능, 변형 분자와 표적의 증가 또는 감소 된 결합 능, 효소 예를 들어, 단백질 분해 효소에 의한 분자의 증가 또는 감소 된 분해능, 또는 변형되지 않은 분자의 작용 기작 또는 기타 매개 변수의 증가 또는 감소에 의한 것이다.
핵산 또는 단백질에 사용되는 "분리된"이란 용어는, 이 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합하는 기타 세포 성분들 중 최소한 일부로부터 유리된 경우를 의미하거나, 또는 이 핵산 또는 단백질이 그것이 생체 내 또는 시험관 내 생산될 때의 농도보다 더 높은 수준으로 농축되는 경우를 의미하는 것이다. 이는 균질한 상태일 수 있다. 분리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 용액 예를 들어, 수용액 중에 존재할 수 있다. 약학 조성물의 성분은 부가의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 것일 수 있다. 순도 및 균질성은 통상적으로 분석용 화학 기술 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 측정된다. 제제에 가장 많이 존재하는 단백질은 실질적으로 정제된 상태이다. 구체적으로, 분리된 유전자는 유전자에 측접하여있고 목적 유전자 이외의 단백질을 암호화하는 개방 해독틀로부터 분리된다. "정제된"이란 용어는, 핵산 또는 단백질이 전기 영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 나타내는 경우를 의미한다. 구체적으로, 상기 의미는 핵산 또는 단백질의 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 그 이상인 경우를 의미하는 것일 수 있다.
"핵산"이란 용어는, 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태인 중합체를 의미한다. 특별히 한정하지 않는 한, 상기 용어는 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 생성 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 특별히 한정하지 않는 한, 상기 용어는 또한 PNA(펩티도핵산)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 기술에 사용되는 DNA 유사체(포스포로티오에이트 및 포스포로아미데이트 등)를 의미하기도 한다. 달리 특정하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열, 그리고 명백히 제시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 이루어질 수 있다[Batzer외 다수, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka외 다수, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini외 다수Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)].
"아미노산"이란 용어는, 천연 생성 및 비 천연 생성 아미노산과, 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 의미한다. 천연 암호화 아미노산으로서는 20개의 공통 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)과 피롤리신 및 셀레노시스테인이 있다. 아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 즉, 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기와 결합 된 α-탄소를 갖는 화합물을 의미하며, 그 예로서는 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄이 있다. 이러한 유사체는 변형된 R기를 갖거나(예를 들어, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조는 유지하고 있다.
본원에서 아미노산은 이의 일반적으로 알려진 명명법(3 문자 표시 또는 1 문자 표시; IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의하여 추천)에 따라서 칭할 수 있다. 이와 유사하게, 뉴클레오티드도 일반적으로 통용되는 1 문자 암호로 칭할 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열과 핵산 서열에 모두 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"란, 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 의미하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않을 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전 암호의 축퇴성으로 인하여, 기능적으로 동일한 다수의 핵산은 임의의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산인 알라닌을 암호화한다. 그러므로, 알라닌이 임의의 코돈에 의하여 특정되는 위치마다, 상기 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변형시키지 않고, 해당하는 코돈 중 임의의 코돈으로 변형될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이"라고 하며, 이는 보존적으로 변형되는 변이의 일종이다. 본원에서 폴리펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 나타내기도 한다. 당 업자는 핵산 내 각 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와, 일반적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG는 제외)은 변형되어 기능상 동일한 분자를 생성할 수 있다는 사실을 당 업자는 깨닫게 될 것이다. 그러므로, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변이는 기술된 각 서열에 내재한다.
아미노산 서열에 있어서, 당 업자는 암호화된 서열 중 하나의 아미노산 또는 낮은 비율로 존재하는 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가는, 그 변형으로 인해서 아미노산의 결실, 아미노산의 부가 또는 아미노산의 치환(화학적으로 유사한 아미노산과의 치환)을 유도하는 경우 "보존적으로 변형된 변이체"를 생성시킨다는 사실을 파악하게 될 것이다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적 변형 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립 형질체에 부가하는 것으로서, 이들을 배제하는 것은 아니다.
기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업자에게 공지되어 있다. 이하 8개의 군들 중 각각은 서로에 대하여 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
[예를 들어, 문헌(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)) 참조]
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열 중에서 "상동성인" 또는 "상동성 %"란 용어는, 동일한 2개 이상의 서열 또는 종속 서열을 의미한다. 만약 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 비율이, 비교 윈도우(comparison window)에 대하여 최대로 상동성을 갖도록 비교 및 정렬되거나, 또는 지정된 부위에 대하여 최대로 상동성을 갖도록 비교 및 정렬될 때와 동일한 경우[이하의 서열 비교 알고리즘(또는 당 업자가 사용 가능한 기타 알고리즘) 중 하나를 사용하여 측정하거나, 또는 수동적 정렬 및 시각적 관찰에 의하여 측정하였을 때 동일한 경우], (즉, 특정 부위에 대한 상동성 비율이 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 인 경우), 그 서열은 "실질적으로 상동성인" 서열이다. 상기 상동성은 길이가 약 50 아미노산 또는 뉴클레오티드 이상인 부위, 또는 길이가 75∼100 아미노산 또는 뉴클레오티드인 부위, 또는 지정되지 않은 경우에는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 거쳐 존재하는 부위에서 찾아볼 수 있다.
서열 비교에 있어서, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준인 참고 서열로서의 기능을 갖는다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 참고 서열은 컴퓨터에 입력되며, 종속 서열 좌표는 필요할 경우 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램의 매개 변수는 지정된다. 디폴트 프로그램 매개 변수가 사용될 수 있거나, 또는 대안 매개 변수가 지정될 수 있다. 이후 서열 비교 알고리즘은 참고 서열에 대한 시험 서열의 서열 상동성 %를 프로그램 매개 변수에 입각하여 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우(comparison window)"는, 20∼600 개, 일반적으로는 약 50∼200 개, 더욱 일반적으로는 약 100∼150 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접 위치의 번호 중 임의의 번호를 갖는 분절에 대한 참고 기준을 포함한다[단, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 이후에 인접 위치와 동일한 번호를 갖는 참고 서열과 비교될 수 있음]. 비교용 서열의 정렬 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 국소 상동성 알고리즘(Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c), 상동성 정렬 알고리즘(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443), 유사성 검색 방법(Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA; the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터에 의한 실행, 또는 수동식 정렬법 및 시각에 의한 관찰(예를 들어, Ausubel외 다수, Current Protocols in Molecular Biology (1995 증보판))에 의해 수행될 수 있다.
서열 상동성 %와 서열 유사성 %를 측정하는데에 적당한 알고리즘의 일례로서는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며, 이 알고리즘에 관하여는 각각 문헌[Altschul외 다수 (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul외 다수 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 개시되어 있다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공중이 이용 가능하게 되어 있다. 상기 BLAST 알고리즘 매개 변수인 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트값으로서, 단어 길이(W) = 11, 기대치(E) = 10, M = 5, N = -4를 이용하고, 양 서열을 비교한다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램은 디폴트값으로서, 단어 길이 = 3 및 기대치(E) = 10을 이용하고, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)는 정렬값(B) = 50, 기대치(E) = 10, M = 5, N = -4를 이용하고, 양 서열을 비교한다. 상기 BLAST 알고리즘은 통상적으로 "저 복잡도(low complexity)" 필터를 작동시키지 않고 수행된다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 간 유사성을 통계학적으로 분석하기도 한다[예를 들어, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 참조]. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성에 관한 한 가지 척도는, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 우연히 매치될 확률에 대한 지표를 제공하는 최소 총 확률(smallest sum probability; P(N))이다. 예를 들어, 시험 핵산과 참고 핵산 비교시 최소 총 확률이 약 0.2 미만, 약 0.01 미만 또는 약 0.001 미만이면, 이 핵산은 참고 서열과 유사한 것으로 간주 될 수 있다.
"~에 선택적으로(또는 특이적으로) 혼성화된다"라는 어구는, 서열이 복합 혼합체(예를 들어, 총 세포 DNA 또는 RNA, 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)에 존재할 때, 엄중한 혼성화 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자가 결합, 이중체 형성 또는 혼성화하는 경우를 의미한다.
"엄중한 혼성화 조건"이란 어구는, 당 업계에 공지된 바와 같이, 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건 하에 DNA, RNA, PNA 서열 또는 기타 핵산 모의체 또는 이들의 조합체와 혼성화되는 조건을 의미한다. 통상적으로, 엄중한 조건 하에, 프로브는 핵산의 복합 혼합체(예를 들어, 총 세포 DNA 또는 RNA, 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 중에 존재하는 표적 종속 서열에 혼성화 될 것이지만, 복합 혼합체 중에 존재하는 다른 서열과는 혼성화하지 않는다. 엄중한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 조건 하에는 상이할 것이다. 길이가 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 관한 상세한 지침은 문헌[Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 살펴볼 수 있다. 일반적으로, 엄중한 조건은 한정된 이온 세기를 갖는 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5∼10℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은, (제한된 이온 세기, pH 및 핵산 농도 하에서) 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열과 혼성화되는 온도이다[표적 서열이 Tm에서 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%가 평형 상태로 점유됨]. 엄중한 조건은, pH가 7.0∼8.3일 때 염 농도가 약 1.0 M 나트륨 이온 미만, 통상적으로 약 0.01∼1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염 이온 농도)이고, 온도가 약 30℃ 이상이며(짧은 프로브(예를 들어, 10∼50 뉴클레오티드)의 경우), 온도가 약 60℃ 이상인(긴 프로브(예를 들어, 50 뉴클레오티드 이상)의 경우) 경우일 수 있다. 엄중한 조건은 또한 불안정화제 예를 들어 포름아미드를 첨가하여 형성할 수도 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 있어서, 양성 시그널은 백그라운드 혼성화가 2배 이상, 임의로는 10배 이상일 경우일 수 있다. 대표적인 엄중 혼성화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5×SSC 및 1% SDS, 42℃에서 항온 처리, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온 처리, 0.2×SSC 중에서 세척, 및 65℃의 0.1% SDS에서 세척. 이러한 세척은 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 또는 그 이상 동안에 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "진핵 생물"이란 용어는, 계통 발생 도메인인 유케리아(Eucarya)에 속하는 유기체로서, 예를 들어, 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충, 파충류 및 조류 등), 섬모충, 식물(예를 들어, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 조류 등), 진균, 효모, 편모류, 미 포자충 및 원생 생물을 포함한다.
본원에 사용된 "진핵 생물 이외의"이란 용어는, 진핵 생물 이외의 유기체를 의미한다. 예를 들어, 진핵 생물 이외의 유기체는 진정 세균[예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 서모스 서모필러스(Thermus thermophilus), 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 등] 계통 발생 도메인에 속하는 것이거나, 또는 고 세균[예를 들어, 메타노코커스 재너쉬(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 서모오토트로피큠(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium) 예를 들어, 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리아 종 NRC-1, 아키오글로버스 펄기두스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 애우로피륨 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등] 계통 발생 도메인에 속하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 "개체"란 용어는, 동물, 몇몇 구체예에서는 포유동물, 그리고 다른 구체예에서는 치료, 관찰 또는 실험 대상인 인간을 의미하는 것이다.
본원에 사용된 "유효량"이란 용어는, 투여될 비천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 의미하는 것으로서, 치료될 질병, 병상 또는 질환의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 양을 의미한다. 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 강화 및/또는 치료적 처치를 위하여 투여될 수 있다.
"강화하다" 또는 "강화"란 용어는, 효능 또는 원하는 효과의 지속 기간을 증가 또는 연장하는 것을 의미한다. 그러므로, 치료제의 효과를 강화한다고 할 때의 "강화"란 용어는, 계에 대한 기타 치료제의 효능 또는 지속 기간 즉, 효과의 지속 기간을 증가 또는 연장시키는 능력을 의미하는 것이다. 본원에 사용된 "강화 유효량(enhancing-effective amount)"이란, 목적 계 내에서 다른 치료제의 효과를 강화하는 데에 적당한 양을 의미하는 것이다. 환자에 사용될 때, 이러한 용도로서 효과적인 양은 질병, 질환 또는 병상의 중증도와 진행 결과, 치료 경험, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료하는 의사의 판단에 따라서 달라질 것이다.
본원에 사용된 "변형된"이란 용어는, 소정의 폴리펩티드에 임의의 변화 예를 들어, 폴리펩티드의 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 번역시 변형 또는 번역 후 변형에 의한 변화가 가하여진 경우를 의미한다. "(변형된)"과 같은 형태의 용어는, 논의되고 있는 폴리펩티드가 임의로 변형된 경우 즉, 논의 중인 폴리펩티드가 변형된 것일 수 있거나 또는 변형되지 않은 것일 수 있는 경우를 의미한다.
"번역 후 변형된"이란 용어는, 천연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩티드 사슬에 통합된 후 이 아미노산에 발생하는 임의의 변형을 의미하는 것이다. 상기 용어는 예를 들어, 생체 내 번역시 변형, 시험관 내 번역시 변형(예를 들어, 무 세포 번역 계), 생체 내 번역 후 변형, 그리고 시험관 내 번역 후 변형을 포함한다.
예방 분야 있어서, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 특정 질병, 질환 또는 병상에 민감하거나 또는 이러한 질병, 질환 또는 병상이 발병할 위험이 있는 환자에게 투여된다. 이러한 양을 "예방학적 유효량"이라 정의한다. 이 경우, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태 및 체중 등에 따라서 달라진다. 이와 같이 예방학적 유효량은 통상의 실험(예를 들어, 투여량 증량 임상 실험(dose escalation clinical trial))을 통하여 결정된다는 사실은 당 업자에게 널리 공지되어 있다.
"보호된"이란 용어는, 임의의 반응 조건 하에 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 막는 "보호기" 또는 부분이 존재함을 의미한다. 상기 보호기는 보호될 화학 반응기의 종류에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어, 만일 화학 반응기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 만일 화학 반응기가 티올이면, 보호기는 오르토피리딜디설파이드일 수 있다. 만일 화학 반응기가 카복실산 예를 들어, 부타논산 또는 프로피온산, 또는 히드록실기이면, 보호기는 벤질 또는 알킬 기 예를 들어, 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 기타 당 업계에 공지된 보호기 예를 들어, 광 불안정기(photolabile group) 예를 들어, Nvoc 및 MeNvoc도 또한 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 기타 당 업계에 공지된 보호기는 또한 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수도 있다.
예를 들어, 차단기/보호기는 다음과 같은 것들로부터 선택될 수 있다:
Figure 112007052157078-PCT00001
기타 보호기에 관하여는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)]에 기술되어 있다.
치료 분야에 있어서, (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 질병, 질환 또는 병상의 증상을 최소한 부분적으로나마 지연시키거나 또는 치료하기에 충분한 양만큼, 이 질병, 병상 또는 질환이 이미 발병한 환자에게 투여된다. 이러한 양을 "치료학적 유효량"이라 정의하고, 이 양은 질병, 질환 또는 병상의 중증도 및 경과, 치료 경험, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료중인 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 치료학적 유효량은 통상의 실험(예를 들어, 투여량 증량 임상 실험)을 통하여 결정된다는 사실은 당 업자에게 널리 공지되어 있다.
"치료"라는 용어는 예방학적 및/또는 치료학적 처치를 의미한다.
본원에 제시된 비천연 암호화 아미노산 폴리펩티드는, 하나 이상의 원자가 일반적으로 천연에서 발견되는 원자의 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의하여 치환된, 동위 원소 표지화 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물에 통합될 수 있는 동위 원소의 예로서는 수소, 탄소, 질소, 산소, 플루오르 및 염소의 동위 원소 예를 들어, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl을 포함한다. 본원에 개시된 임의의 동위 원소 표지화 화합물예를 들어, 방사성 동위 원소 예를 들어, 3H 및 14C가 통합되어 있는 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 검정법(drug and/or substrate tissue distribution assay)에 유용할 수 있다. 뿐만 아니라, 동위 원소 예를 들어, 중수소 즉, 2H와의 치환을 통하여, 대사 안정성이 증가됨에 따른 치료상의 이점 예를 들어, 생체 내 반감기가 증가하거나 또는 투여량이 감소할 수 있다.
모든 이성체 예를 들어, 입체 이성체, 거울상 이성체 및 이들의 혼합물이 본원에 개시된 조성물의 일부로서 고려된다. 부가의 또는 추가의 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산 폴리펩티드는, 추후 원하는 효과(예를 들어, 원하는 치료 효과)를 얻기 위하여 사용되는 대사 산물을 생산할 필요가 있는 유기체에 투여됨에 따라서 대사된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사 산물도 포함된다.
몇몇 경우에 있어서, 비천연 암호화 아미노산 폴리펩티드는 호변 이성체로서 존재할 수 있다. 뿐만 아니라, 본원에 기술된 비천연 암호화 아미노산 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 용매 예를 들어, 물 및 에탄올 등과 함께, 용매화되지 않은 형태 및 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 용매화된 형태는 또한 본원에 개시되어 있는 것으로 생각된다. 당 업자는 본원의 화합물 중 일부가 몇몇 호변 이성체 형태로 존재할 수 있음을 파악할 것이다. 이러한 호변 이성체 모두는 본원에 기술된 조성물의 일부로서 간주된다.
상세한 설명
I. 서론
하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 hGH 분자가 본 발명에 제공된다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 하나 이상의 인위적 아미노산을 갖는 상기 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 하나의 구체예에서, 하나 이상의 번역 후 변형은 분자 예를 들어, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광 가교제, 방사성 핵종, 세포 독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광 친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트화제, 보조 인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적응 재료, 나노 입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 부분, 방사성 부분, 신규 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 기, 광 케이지화된 부분, 악티닌 방사선 여기 부분, 광 이성체와 부분, 바이오틴, 바이오틴 유도체, 바이오틴 유사체, 중원자 통합 부분, 화학 절단 기, 광 절단 기, 연장된 측 쇄, 탄소-결합 당, 산화 환원-활성화제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소 표지화 부분, 생물 물리학적 프로브, 인광성 기, 화학 발광성 기, 전자 조밀 기, 자성 기, 삽입 기, 발색 단, 에너지 전이제, 생물학적 활성 제제, 검출 가능한 표지, 소 분자, 양자 점, 나노 전달체, 방사성 뉴클레오티드, 방사성 전달체, 중성자 포획제 또는 상기 것들의 임의의 조합체, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질의 결합을 포함하며, 여기서, 특정 반응기에 적당하다고 당 업자에게 공지된 화학적 방법을 이용하여 제1 반응기를 포함하는 하나 이상의 인위적 아미노산에 제2 반응기를 결합시킬 수도 있다. 본 발명의 변형된 hGH 폴리펩티드에 관한 임의의 구체예에서, 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 하나 이상의 인위적 아미노산(예를 들어, 케토 작용기를 함유하는 인위적 아미노산)은, 하나 이상의 번역 후 변형이 당 부분을 포함하는 경우에 사용된다. 임의의 구체예에서, 번역 후 변형은 생체 내 즉, 진핵 생물 세포 또는 진핵 생물 이외의 세포 내에서 가하여진다.
임의의 구체예에서, 단백질은 번역 후 변형이 보통 다른 종류의 숙주 세포에 의해서는 가하여지지 않는 경우, 하나의 숙주 세포에 의해 생체 내에서 가하여지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 임의의 구체예에서, 단백질은 번역 후 변형이 보통 진핵 생물 이외의 세포에 의해서는 가하여지지 않는 경우, 진핵 생물 세포에 의해 생체 내에서 가하여지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 번역 후 변형의 예로서는, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미트산염 부가, 인산화 및 당 지질-결합 변형 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 아스파라긴에 올리고당을 결합시키는 경우[예를 들어, 올리고당이 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우]를 포함한다. 다른 구체예에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 세린이나 트레오닌에 올리고당을 결합시키는 경우[예를 들어, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등]를 포함한다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합체 등을 포함할 수 있다. 분비 시그널 서열의 예로서는 원핵 생물 분비 시그널 서열, 진핵 생물 분비 시그널 서열, 박테리아 내 발현을 위하여 5'-최적화된 진핵 생물 분비 시그널 서열, 신규의 분비 시그널 서열, 펙테이트 분해 효소 분비 시그널 서열, OmpA 분비 시그널 서열 및 파지 분비 시그널 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 분비 시그널 서열의 예로서는 STII (원핵 생물), Fd GIII 및 M13 (파지), Bgl2 (효모) 및 트랜스포존으로부터 유래된 시그널 서열 bla를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 인위적 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 인위적 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있는데, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 상이한 인위적 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 임의의 구체예에서, 천연 생성 단백질에 존재하는 하나 이상(전부는 아님)의 특정 아미노산은 인위적 아미노산으로 치환된다.
본 발명은 성장 호르몬, 구체적으로 hGH를 주성분으로 하는 조성물 및 이를 바탕으로 하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 포함한다. hGH에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 도입시키면, 특이적 화학 반응, 예를 들어, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 화학 반응에 관여하지만, 공통으로 생성되는 20개의 아미노산과는 반응하지 않는, 컨쥬게이트 화학 물질을 얻을 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH는, 비천연 암호화 아미노산의 측 쇄를 통하여 수용성 중합체 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결 또는 결합된다. 본 발명은 PEG 유도체를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시키는, 매우 효율적인 방법을 제공하는데, 즉, 이 방법은 비-유전 암호화 아미노산 예를 들어, 20개의 천연 통합 아미노산에서는 발견되지 않는 작용기 또는 치환기 예를 들어, 케톤 부분을 함유하는 아미노산을, 선택 코돈에 따라서 단백질에 통합하는 과정, 및 추후 이 아미노산을 적당히 반응성인 PEG 유도체로 변형시키는 과정을 포함한다. 일단 통합되면, 아미노산 측 쇄는 이후 당 업자에게 비천연 암호화 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적당한 것으로 공지된 화학적 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 공지된 화학적 방법으로서는 다양한 것이 있으며, 이는 또한 본 발명에서 수용성 중합체를 단백질에 통합시키는데에 적당하다.
본 발명은 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 보유하는 hGH 폴리펩티드와, 기타 물질 예를 들어, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체; 광 가교제; 방사성 핵종; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광 친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트화제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제성 리보핵산; 생체 적응 재료; 나노 입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 기; 광 케이지화된 부분; 악티닌 방사선 여기 부분; 광 이성체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유도체; 바이오틴 유사체; 중원자 통합 부분; 화학 절단 기; 광 절단 기; 연장된 측 쇄; 탄소-결합 당; 산화 환원-활성화제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소 표지화 부분; 생물 물리학적 프로브; 인광성 기; 화학 발광성 기; 전자 조밀 기; 자성 기; 삽입 기; 발색 단; 에너지 전이제; 생물학적 활성 제제; 검출 가능한 표지; 소 분자; 양자 점; 나노 전달체; 방사성 뉴클레오티드; 방사성 전달체; 중성자 포획제 또는 상기 것들의 임의의 조합체; 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질의 컨쥬게이트를 제공한다.
PEG가 생체 적응 재료의 표면을 변형시키는데에 사용될 수 있다는 사실은 당 업계에 널리 알려진 사실이다[예를 들어, 미국 특허 제6,610,281호; Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci., 3(1):125-136 (2000); 본원에 참고용으로 인용됨]. 상기 PEG 유도체는 반응성 부분에 의해 중합체에 직접 결합될 수 있다. 대안적으로, 상기 PEG 유도체는 한쪽 말단에 반응성 부분을 갖는 결합제를 통상적으로 활성화된 중합체에 결합시켜, 말단부에 반응성 부분을 갖는 중합체를 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한쪽 말단에 반응기를 갖는 결합제와 반응하여, PEG 중합체와 결합제 사이에 공유 결합을 형성하게 되고, 또한 상기 반응기는 중합체의 말단부에 위치하게 된다. 친핵성 및 친전자성 부분 예를 들어, 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알콜, 카복실레이트, 알데히드, 케톤 및 티오에스테르 등은 당 업자에게 공지되어 있다. PEG 유도체는 생체 혼화성, 안정성, 가용성과 같은 특성 및 면역원성의 흠결 등의 특성이 중요한 부분을 차지하는 경우, 분자 및 표면 특성을 개질시키는 데에 사용될 수 있으며, 또한 이전에 당 업계에 공지된 수단에 비하여 단백질에 PEG 유도체를 결합시키는, 선택성이 보다 우수한 수단을 제공하는데에 사용될 수 있다.
II. 성장 호르몬 초 유전자 군
이하의 단백질은 성장 호르몬(GH) 초 유전자군에 속하는 유전자에 의하여 암호화되는 것들이다[Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)]: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 적혈구 생성 촉진 인자(EPO), 혈소판 증식 인자 (TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴(oncostatin) M, 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 토우 인터페론, 과립구 집락 형성 인자(G-CSF), 과립구-대식 세포 집락 형성 인자(GM-CSF), 대식 세포 집락 형성 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀(cardiotrophin)-1 (CT-1) ("GH 초 유전자군"). 이 유전자군에 속하는 부가의 일원들은 유전자 클로닝 및 서열 결정을 통하여 앞으로 동정될 것으로 기대된다. GH 초 유전자군에 속하는 일원들은, 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 상동성을 가짐에도 불구 하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유하는 구조적 특성으로 인하여, 유전자군의 새로운 일원들을 용이하게 동정할 수 있고, 본원에 기술된 비천연 아미노산을 사용하는 방법과 이를 포함하는 조성물이 발명되었다. GH 초 유전자군의 일원들 간 구조적 상동성 정도라면, 비천연 암호화 아미노산은 본 발명을 이용하여 GH 초 유전자군에 속하는 임의의 일원에 통합될 수 있다. 이 단백질군에 속하는 각각의 일원은 4개의 나선형 묶음을 포함한다.
다수의 사이토카인 예를 들어, G-CSF (Zink외 다수, FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink외 다수, Biochemistry 33:8453 (1994); Hill외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K.외 다수. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al, J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992), IL-4 (Redfield외 다수, Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers외 다수, Science 256:1673-1677 (1992)) 및 IL-5 (Milburn외 다수, Nature 363: 172-176 (1993))의 구조는 X-선 회절법과 NMR 연구에 의해 측정될 수 있으며, 측정한 결과 1차적 서열 상동성이 거의 존재하지 않았음에도 불구하고, GH 구조와 상당 부분 동일함을 알 수 있었다. IFN은 모델링 및 기타 연구를 바탕으로 하였을 때, 상기 단백질 군의 일원인 것으로 생각된다[Lee외 다수, J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgolo외 다수, Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan외 다수, Structure 4:1453 (1996); Klaus외 다수, J. Mol. Biol. 274:661 (1997)]. EPO는 모델링 및 돌연 변이 유발 연구를 바탕으로 하였을 때, 상기 단백질 군의 일원인 것으로 생각된다[Boissel외 다수, J. Biol. Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wen외 다수, J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)]. 상기 사이토카인 및 성장 인자 모두는 하나의 거대 유전자군을 포함하는 것으로 생각된다.
유사한 2차 구조 및 3차 구조를 공유하는 것 이외에도, 상기 단백질 군에 속하는 일원들은 세포 내 신호 전달 경로를 활성화하는 세포 표면 수용체를 올리고머화시켜야 하는 특성을 공유한다. 몇몇 GH 군에 속하는 일원 예를 들어, GH 및 EPO는 한 가지 종류의 수용체에 결합하여 이것이 동종 이량체를 형성하도록 만든다. 상기 군의 기타 일원 예를 들어, IL-2, IL-4 및 IL-6은 한 가지 이상의 종류의 수용체에 결합하여, 이 수용체가 이종 이량체 또는 그 보다 더 큰 응집체를 형성하도록 만든다[Davis외 다수, (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa외 다수, (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]. 돌연 변이 유발 연구 결과, GH와 마찬가지로, 기타 사이토카인 및 성장 인자는 다수의(통상적으로 2개) 수용체 결합 위치를 함유하며, 이 사이토카인 및 성장 인자의 동계열 수용체에 연속적으로 결합한다는 사실을 알 수 있다[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews외 다수, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476]. GH와 마찬가지로, 상기 기타 군에 속하는 일원들의 1차적 수용체 결합 위치는 주로 4개의 알파 나선 부 및 A-B 루프에 존재한다. 수용체 결합에 관여하는 나선형 묶음 내에 존재하는 특정 아미노산은 군의 일원 들마다 상이하다. GH 초 유전자군의 일원과 상호 작용하는 대부분의 세포 표면 수용체는 구조적으로 관련되어 있으며, 또한 제2의 거대 복수 유전자군을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,608,183호를 참조하시오.
GH 초 유전자군에 속하는 여러 가지 일원에 관한 돌연 변이 연구를 통하여 일반적으로 도달하게 되는 결론은, 알파 나선 부를 연결하는 루프는 일반적으로 수용체 결합에 관여하지 않는다는 사실이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 대부분의(전부는 아닌) 유전자군의 일원에 있어서 수용체 결합에 필수적이지는 않은 것으로 보인다. 이러한 이유로, 상기 B-C 루프는 본원에 기술된 바와 같이 GH 초 유전자군에 속하는 일원들 중에서 비천연 암호화 아미노산과 치환될 수 있다. (GH 상과에 속하는 인터페론/IL-10 유사 일원의) A-B 루프, C-D 루프 (및 D-E 루프)도 또한 비천연 생성 아미노산과 치환될 수 있다. A 나선 부와 인접하는 아미노산 및 말단부에 존재하는 나선 부로부터 멀리 떨어져 존재하는 아미노산은 또한 수용체 결합에 관여하지 않는 성향이 있으며, 또한 이는 비천연 생성 아미노산을 도입시키는 위치가 될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 루프 구조의 임의의 위치 예를 들어, A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 아미노산에서 치환된다. 몇몇 구체예에 있어서, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 아미노산에서 치환된다.
GH 군에 속하는 임의의 일원 예를 들어, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-1O, IL-12 p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론은 N-결합 당 및/또는 O-결합 당을 포함한다, 단백질 내 글리코실화 위치는 대부분 루프 부위에만 존재하며 알파 나선 묶음에는 존재하지 않는다. 일반적으로 루프 부위는 수용체 결합에 관여하지 않고, 당 기의 공유 결합 위치가 되기 때문에, 상기 루프 부위는 단백질에 비천연-생성 아미노산을 치환에 의해 도입시키기 위한 유용한 위치일 수 있다. 단백질에 N- 및 O-결합 글리코실화 위치를 포함하는 아미노산은 비천연 생성 아미노산 치환에 대한 위치일 수 있는데, 그 이유는 이 아미노산이 표면에 노출되어 있기 때문이다. 그러므로, 천연 단백질은 글리코실화 위치에서 이 단백질과 결합되어 있는 벌키한 당 기를 묵인할 수 있으며, 이 글리코실화 위치는 수용체 결합 위치로부터 멀리 떨어져서 위치하는 성향이 있다.
상기 GH 초 유전자군의 부가적인 일원은 앞으로 발견될 것이다. GH 초 유전자군에 속하는 새로운 일원들은 예측 단백질 서열의 컴퓨터-보조 2차 및 3차 구조 분석과, 특정 표적에 결합하는 분자를 동정하도록 고안된 선택 기술에 의해 동정될 수 있다. GH 초 유전자군의 일원들은 통상적으로 비-나선형 아미노산(루프 부위)에 의해 연결되어 있는 4개 또는 5개의 양 친매성 나선 부를 보유한다. 상기 단백질은 N-말단에 소수성 시그널 서열을 함유하여 세포로부터의 분비를 촉진할 수 있다. 이와 같이 나중에 발견된 GH 초 유전자군의 일원도 본 발명에 포함된다. 관련 출원으로서는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 출원(발명의 명칭: "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"; 2005년 8월 18일자 발행됨(WO 05/074650))이 있다.
그러므로, hGH에 관한 설명은 예시적 목적으로 기술된 것이지 본원에 기술된 방법, 조성물, 계획 및 기술의 범위를 한정하고자 기술된 것은 아니다. 뿐만 아니라, 본원에 있어서 hGH 폴리펩티드에 관한 언급 시에는 임의의 성장 호르몬을 예로 들어 일반적으로 통용되는 용어를 사용하고자 하였다. 따라서, hGH 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본원에 기술된 변형법 및 화학적 방법은 GH 초 유전자군의 임의의 일원 예를 들어, 본원에 구체적으로 나열된 일원들에도 동등하게 사용될 수 있다.
III. 선택 코돈(Selector Codon)
본 발명의 선택 코돈은 단백질 생합성 기작의 유전자 암호 틀을 확장시키는 것이다. 예를 들어, 선택 코돈은 독특한 3 염기 코돈, 넌센스 코돈 예를 들어, 종결 코돈 예를 들어, 앰버 코돈(UAG), 오커 코돈(ochre codon), 또는 오팔 코돈(opal codon; UGA), 인위적 코돈, 4 염기 이상 코돈 또는 희귀 코돈(rare codon) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 당 업자는 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있는 선택 코돈의 갯 수가, hGH 폴리펩티드의 최소한의 일부를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드 내에서 다양할 수 있음(예를 들어, 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)을 용이하게 파악할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 생체 내에서 하나 이상의 인위적 아미노산을 통합시키기 위한 종결 코돈인 선택 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 종결 코돈 예를 들어, UAG를 인지하는 O-tRNA가 생산되며, 이 O-tRNA는 원하는 인위적 아미노산과 함께 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 상기 O-tRNA는 천연 생성되는 숙주의 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 인지되지 않는다. 통상적인 위치-배향 돌연 변이 유발법은 종결 코돈 예를 들어, TAG를 목적 폴리펩티드 내 목적 위치에 도입시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J.R.외 다수. (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802]을 참조하시오. O-RA, O-tRNA 및 목적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 생체 내에서 화합할 때, 인위적 아미노산은 UAG 코돈에 따라서 통합되며, 그 결과 특정 위치에 인위적 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 생성하게 된다.
생체 내 인위적 아미노산의 통합은 진핵 생물의 숙주 세포를 거의 동요시키지 않고 이루어질 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA 예를 들어, 앰버 억제 tRNA와, 진핵 생물 방출 인자(예를 들어, eRF)(이 인자는 종결 코돈에 결합하여 리보좀으로부터 성장하고 있는 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 의존적이기 때문에, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA 및/또는 억제 tRNA의 발현 수준을 상승시킴으로써 조정될 수 있다.
인위적 아미노산은 또한 희귀 코돈으로 암호화될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 단백질 합성 반응에 있어서 아르기닌 농도가 감소하면, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의해 Ala를 삽입하는데에 효율적일 것으로 판단된다. 예를 들어, 문헌[Ma외 다수, Biochemistry, 32:7939 (1993)]을 참조하시오. 이 경우, 합성 tRNA는 (에스케리치아 콜라이에 소수 존재하는) 천연 생성 tRNA-Arg과 경쟁한다. 몇몇 유기체는 삼중 코돈을 모두 사용하지 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 내 할당되지 않은 코돈인 AGA는 시험관 내 전사/번역 추출물 중에 존재하는 아미노산을 삽입하는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997)]을 참조하시오. 본 발명의 성분들은 이와 같은 희귀 코돈을 생체 내에서 사용하도록 생산될 수 있다.
선택 코돈은 또한 확장된 코돈 예를 들어, 4 염기 이상 코돈 예를 들어, 4 염기 코돈, 5 염기 코돈, 6 염기 코돈 또는 그 이상의 염기로 이루어진 코돈을 포함한다. 4 염기 코돈의 예로서는, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함한다. 5 염기 코돈의 예로서는, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU 및 UAGGC 등을 포함한다. 본 발명의 하나의 특징은 구조 틀 이동 억제(frameshift suppression)를 바탕으로 하는 확장 코돈을 사용하는 것이다. 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈은 예를 들어, 하나 또는 여러 개의 인위적 아미노산을 동일한 단백질에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 돌연 변이된 O-tRNA 예를 들어, 특정 구조틀 이동 억제 tRNA(안티 코돈 루프 예를 들어, 8∼10개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 안티 코돈 루프 보유)가 존재하는 경우, 4개 이상의 염기 코돈은 하나의 아미노산으로 해독된다. 다른 구체예에서, 안티 코돈 루프 예를 들어, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 5개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 또는 6개 이상의 염기로 이루어진 코돈 또는 그 이상의 염기로 이루어진 코돈은 해독될 수 있다. 생성 가능한 4 염기 코돈에는 256가지가 존재하므로, 다수의 인위적 아미노산은 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈을 이용하여 동일한 세포 내에서 암호화될 수 있다. 문헌[Anderson외 다수, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조하시오.
예를 들어, 4-염기 코돈은 생체 내 생합성 방법을 이용하여 인위적 아미노산을 단백질에 통합하는 경우에 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Ma외 다수, (1993) Biochemistry, 32:7939; 및 Hohsaka외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34]을 참조하시오. CGGG 및 AGGU는 2개의 화학적으로 아실화된 구조 틀 이동 억제 tRNA와 함께 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 생체 내에서 스트렙타비딘에 동시에 통합시키는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Hohsaka외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194]을 참조하시오. 생체 내 연구에 있어서, 무어(Moore)외 다수는 NCUA 안티 코돈을 갖는 tRNALeu 유도체가 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 능력이 있음을 관찰하였고, 또한 사중체인 UAGA는 0∼-1 틀을 약간 해독하면서, 13∼26%의 효율로 UCUA 안티 코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 해독될 수 있음을 발견하였다. 문헌[Moore외 다수, (2000) J. Mol. Biol., 298:195]을 참조하시오. 하나의 구체예에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 바탕으로 한 확장 코돈(기타 원치 않는 위치에서 미스 센스 통독(readthrough) 및 구조 틀 이동 억제를 줄일 수 있는 코돈)이 본 발명에 사용될 수 있다.
소정의 계에 있어서, 선택 코돈은 또한 내인성 계가 천연 염기 코돈을 이용하지 않는(또는 드물게 이용하는) 경우, 천연의 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이는 천연의 3 염기 코돈을 인지하는 tRNA가 흠결된 계 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 계을 포함한다.
선택 코돈은 인위적 염기 쌍을 포함할 수도 있다. 이러한 인위적 염기 쌍은 추가로 현존하는 유전자 알파벳을 확장시킨다. 하나의 잉여(extra) 염기 쌍은 삼중 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기 쌍의 특징은 안정하고 선택적인 염기 쌍 형성과, 중합 효소에 의하여 고 신뢰도로 DNA에 염기 쌍을 효율적으로 통합시키는 것, 그리고 합성하고자 하는 인위적 염기 쌍을 합성한 이후에 효율적으로 프라이머를 연속 증폭시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 인위적 염기쌍에 관한 설명은 예를 들어, 문헌[Hirao외 다수., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182]에 기술되어 있다. 또한, 문헌[Wu, Y.외 다수., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630]을 참조하시오. 기타 관련 문헌은 이하에 나열되어 있다.
생체 내 사용함에 있어서, 인위적 뉴클레오시드는 막 투과성으로서, 인산화되어 상응하는 삼인산염을 형성한다. 뿐만 아니라, 증가된 유전자 정보는 안정하여 세포 내 효소에 의해 파괴되지 않는다. 예전에, 베너(Benner)외 다수에 의한 연구에서는 정형화된 왓슨-크릭 쌍 형성시와는 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였었는데, 여기서 가장 주목할 만한 사항은 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들어, 문헌[Switzer외 다수, (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322; 및 Piccirilli외 다수, (1990) Nature. 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602]을 참조하시오. 상기 염기들은 일반적으로 천연 염기와 어느 정도 쌍을 잘못 형성하므로, 효소에 의해 복제될 수 없다. 쿨(Kool)과 그의 동료 들은, 염기들 사이의 소수성 팩킹 상호 작용(hydrophobic packing interaction)이 수소 결합을 대신하여 염기 쌍을 형성할 수 있음을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; 및 Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825]을 참조하시오. 전술한 조건을 모두 만족시킬 수 있는 인위적 염기쌍을 개발하기 위한 노력의 일환으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 그의 동료 들은 인위적 소수성 염기 시리즈를 체계적으로 합성하여 이에 관해 연구하였다. PICS:PICS 자가-쌍은 천연 염기 쌍보다 더 안정한 것으로 파악되며, 또한 이는 에스케리치아.콜라이 DNA 중합 효소 I의 Klenow 단편(KF)에 의하여 DNA에 효율적으로 통합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McMinn외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-6; 및 Ogawa외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274]을 참조하시오. 3MN:3MN 자가-쌍은 생물학적 기능을 발휘하는데에 충분한 효율과 선택성으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ogawa외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803]을 참조하시오. 그러나, 상기 양 염기들은 추가의 복제에 대해서는 서열 종결자로서 작용한다. 최근 들어, 돌연 변이 DNA 중합 효소는 PICS 자가 쌍을 복제하는데에 사용될 수 있는 것으로 변화하고 있다. 뿐만 아니라, 7AI 자가 쌍은 복제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tae외 다수, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439]을 참조하시오. 신규의 금속성 염기 쌍인 Dipic:Py도 개발되었는데, 이는 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714]을 참조하시오. 확장 코돈 및 인위적 코돈이 본질적으로 천연 코돈에 직교형이기 때문에, 본 발명의 방법은 이러한 특성을 이용하여 이러한 코돈들을 위한 직교 tRNA를 생산할 수 있다.
번역 바이패스 계(translational bypassing system)은 또한 원하는 폴리펩티드에 인위적 아미노산을 통합시키는데에 사용될 수도 있다. 번역 바이패스 계에서는, 큰 서열이 유전자에 통합되지만, 이는 단백질로 번역되지는 않는다. 이 서열은 리보좀이 서열을 건너뛴 후 삽입부의 하류에서 번역을 재개할 수 있도록 만드는 신호로서 사용되는 구조를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물에 사용되는 목적 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 일부)는 핵산에 의하여 암호화된다. 통상적으로, 상기 핵산은 하나 이상의 선택 코돈, 2개 이상의 선택 코돈, 3개 이상의 선택 코돈, 4개 이상의 선택 코돈, 5개 이상의 선택 코돈, 6개 이상의 선택 코돈, 7개 이상의 선택 코돈, 8개 이상의 선택 코돈, 9개 이상의 선택 코돈, 10개 이상의 선택 코돈을 포함한다.
목적 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 당 업자에게 널리 공지되어 있고 본원에 기술된 방법들을 이용하여 돌연 변이가 유발되며, 그 결과 예를 들어, 인위적 아미노산을 통합시키기 위한 하나 이상의 선택 코돈을 포함하게 될 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질에 대한 핵산은 돌연 변이 유발되어 하나 이상의 선택 코돈을 포함하게 되며, 그 결과 하나 이상의 인위적 아미노산을 통합할 수 있게 된다. 본 발명은 임의의 변이체 예를 들어, 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 임의의 단백질의 돌연 변이체를 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명은 또한 해당 핵산 즉, 하나 이상의 인위적 아미노산을 암호화하는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하는 임의의 핵산을 포함한다.
목적 단백질 예를 들어, hGH 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 용이하게 돌연 변이되어 폴리펩티드 중 임의의 원하는 위치에 시스테인을 도입할 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 다양한 기타 분자를 목적 단백질에 도입하는데에 널리 이용된다. 시스테인을 폴리펩티드 중 원하는 위치에 통합하기에 적당한 방법 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,608,183호에 기술된 방법 및 표준적인 돌연 변이 유발 기술은 당 업자에게 공지되어 있다.
IV. 비천연 암호화 아미노산
다양한 종류의 비천연 암호화 아미노산이 본 발명에 사용하기에 적당하다. 임의의 수의 비천연 암호화 아미노산이 hGH 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입된 비천연 암호화 아미노산은 실질적으로 20개의 공통된 유전-암호화 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 화학적으로 비활성이다. 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 20개의 공통 아미노산에서는 찾아 볼 수 없는 작용기(예를 들어, 아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기)와 효율적이고 선택적으로 반응하여 안정한 컨쥬게이트를 형성하는 측 쇄 작용기를 포함한다.
알파 아미노산의 일반 구조식은 다음과 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112007052157078-PCT00002
비천연 암호화 아미노산은 통상적으로 상기 화학식[식 중, R기는 20개의 천연 아미노산에 사용되는 것을 제외한 임의의 치환기임]을 갖는 임의의 구조를 가지며, 이는 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있다. 본 발명의 비천연 암호화 아미노산은 통상적으로 측 쇄 구조에만 존재하는 천연 아미노산과 상이하지만, 이 비천연 암호화 아미노산은 천연 아미노산이 천연 생성 폴리펩티드에서 형성되는 것과 동일한 방식으로, 다른 아미노산 예를 들어, 천연 또는 비천연 암호화 아미노산과 아미 드 결합을 형성한다. 그러나, 이 비천연 암호화 아미노산은 천연 아미노산과 구별되는 측 쇄 기를 갖는다. 예를 들어, R은 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노 기 등, 또는 이들의 임의의 조합체를 포함하기도 한다. 기타 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 비천연 생성 아미노산으로서는, 광활성화 가교제, 스핀-표지화 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규의 작용기를 갖는 아미노산, 기타 분자들과 공유 또는 비공유 상호 작용을 하는 아미노산, 광 케이지화 및/또는 광 이성체화 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산 예를 들어, 당 치환 세린, 기타 탄수화물 변형 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르 포함 아미노산, 중원자 치환 아미노산, 화학적으로 분해 가능하고/가능하거나 광 분해 가능한 아미노산, 천연 아미노산에 비하여 측 쇄가 연장된 아미노산 예를 들어, 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소 예를 들어, 약 5개 이상 또는 약 10개의 탄소를 갖는 장쇄 탄화수소를 갖는 아미노산, 탄소-결합 당-함유 아미노산, 산화 환원-활성화 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용하기에 적당할 수 있으며, 수용성 중합체와 반응하는데에 유용한, 대표적인 비천연 암호화 아미노산으로서는 카보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카바지드, 아지드 및 알킨 반응기를 갖는 비천연 암호화 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구체예에 있어서, 비천연 암호화 아미노산은 당 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로서는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로서는 또한 아미노산과 당 사이의 천연-생성 N- 또는 O-결합이 천연에서는 일반적으로 찾아 볼 수 없는 공유 결합(예를 들어, 알켄, 옥심, 티오에테르 및 아미드 등)으로 치환된 경우를 포함한다. 뿐만 아니라, 이러한 아미노산의 예로서는 일반적으로 천연-생성 단백질에서 살펴볼 수 없는 당 예를 들어, 2-데옥시-글루코즈 및 2-데옥시갈락토즈 등을 포함한다.
본원에 제공된 다수의 비천연 암호화 아미노산들은 시판중에 있으며, 이것의 공급체의 예로서는, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(St. Louis, MO, USA), 노바바이오켐(Novabiochem; EMD 바이오사이언시스社의 지사, Darmstadt, Germany) 또는 펩테크(Peptech)(Burlington, MA, USA)를 들 수 있다. 시판되고 있지 않은 비천연 아미노산은 본원에 제공된 방법 또는 당 업자에게 공지되어 있는 표준적인 방법을 이용하여 합성되기도 한다. 유기 합성 기술에 관하여는 예를 들어, 문헌[Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry, March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); 및 Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조하시오. 뿐만 아니라, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885도 참조하시오. 신규의 측 쇄를 함유하는 인위적 아미노산 이외에, 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 인위적 아미노산은 또한 변형 주쇄 구조 예를 들어, 이하 화학식 II 및 화학식 III의 구조를 포함하기도 한다.
Figure 112007052157078-PCT00003
Figure 112007052157078-PCT00004
[상기 식 중, Z는 OH, NH2, SH, NH-R', 또는 S-R'이고; 동일하거나 또는 상이할 수 있는 X 및 Y는 통상적으로 S 또는 O를 포함하며, 동일하거나 또는 상이할 수도 있는 R 및 R'는 통상적으로 상기 화학식 I을 갖는 인위적 아미노산에 있어서 전술한 R기를 구성하는 것과 동일한 목록 및 수소로부터 선택됨]
예를 들어, 본 발명의 인위적 아미노산은 임의로는 상기 화학식 II 및 화학식 III으로 표시된 바와 같이 아미노 또는 카복실 기에 치환이 발생할 수도 있다. 이러한 종류의 인위적 아미노산으로서는, 20개의 공통 천연 아미노산 또는 인위적 측 쇄에 상응하는 측 쇄를 갖는, α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카복실 레이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, α-탄소에서 치환이 일어난 아미노산으로서는, 임의로는 L, D 또는 α-α-이중 치환 아미노산 예를 들어, D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 구조적 대안물로서는 환형 아미노산 예를 들어, 프롤린 유사체와 3, 4, 6, 7, 8 및 9 원 고리를 갖는 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산 예를 들어, 치환 β-알라닌 및 γ-아미노부티르산을 포함한다.
다수의 인위적 아미노산은 천연 아미노산 예를 들어, 티로신, 글루타민 및 페닐알라닌 등을 바탕으로 하며, 본 발명에 사용하기에 적당하다. 티로신 유사체로서는 파라-치환 티로신, 오르토-치환 티로신 및 메타-치환 티로신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서 치환 티로신은 케토 기(예를 들어, 아세틸 기), 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 히드록시아민, 티올 기, 카복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C6∼C20 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기, 알키닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 다수 치환된 아릴 고리도 고려할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 글루타민 유사체로서는 α-히드록시 유도체, γ-치환 유도체, 환형 유도체 및 아미드 치환 글루타민 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 대표적 페닐알라닌 유사체로서는 파라-치환 페닐알라닌, 오르토-치환 페닐알라닌 및 메타-치환 페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서 상기 치환기는 히드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 아지도, 요도, 브로모, 케토 기(예를 들어, 아세틸 기), 벤조일 또는 알키닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 인위적 아미노산의 구체예로서는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파길옥시-페닐알라닌 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 다양한 인위적 아미노산의 구조의 예에 관하여는 예를 들어, 문헌[WO 2002/085923, 발명의 명칭 "In vivo incorporation of unnatural amino acids."]에 개시되어 있다. 또한 부가의 메티오닌 유도체에 관하여는, 본원에 참고용으로 인용된 문헌[Kiick외 다수, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24]을 참조하시오.
하나의 구체예에서, 인위적 아미노산(예를 들어, p-(프로파길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 hGH 폴리펩티드 조성물이 제공된다. p-(프로파길옥시)-페닐알라닌을 포함하는 다양한 조성물과, 예를 들어, 단백질 및/또는 세포도 제공되어 있다. 하나의 측면에서, p-(프로파길옥시)-페닐알라닌 인위적 아미노산을 포함하는 조성물은 또한 직교 tRNA도 포함한다. 인위적 아미노산은 직교 tRNA에 결합(예를 들어, 공유 결합)될 수 있는데, 예를 들어, 아미노-아실 결합에 의해 직교 tRNA에 공유 결합 될 수 있거나, 직교 tRNA의 말단 리보즈 당의 3'-OH 또는 2'-OH에 공유 결합 될 수 있다.
단백질에 통합될 수 있는 인위적 아미노산을 통하여 화학적 부분은 단백질의 다양한 이점을 제공하며, 또한 이 부분을 이용하여 단백질을 조작할 수도 있다. 예를 들어, 케토 작용기의 독특한 반응성은 시험관 내 및 생체 내에서 다수의 히드라진- 또는 히드록실아민-함유 시약 중 임의의 것으로 단백질을 선택적으로 변형시킬 수 있도록 만들어 준다. 예를 들어, 중 원자 인위적 아미노산은 X-선 구조 데이터를 동조하는데에 유용할 수 있다. 인위적 아미노산을 이용하여 중 원자를 위치-특이적으로 도입하면, 중 원자에 대한 위치를 선택할 때에 선택성과 융통성을 제공할 수도 있다. 예를 들어, 광 반응성 인위적 아미노산(예를 들어, 벤조페논 및 아릴아지드(예를 들어, 페닐아지드) 측 쇄를 갖는 아미노산)은 단백질의 생체 내 및 시험관 내 광가교에 효율적일 수 있다. 광 반응성 인위적 아미노산의 예로서는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이후 광 반응성 인위적 아미노산을 포함하는 단백질은 의도하는 바에 따라서 광 반응기의 여기를 일시적으로 제어함으로써 가교 될 수 있다. 하나의 예에서, 인위적 아미노산의 메틸기는 예를 들어, 핵 자기 공명법 및 진동 분광법에 사용되는 국부 구조 및 동력학에 대한 프로브인, 동위 원소 표지화 메틸기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알키닐 또는 아지도 작용기는 [3+2] 고리화 첨가 반응을 통하여 분자와 함께 단백질을 선택적으로 변형시킬 수 있다.
폴리펩티드의 아미노 말단에 통합된 비천연 아미노산은 20개의 천연 아미노산에 사용되는 치환기를 제외한 임의의 치환기인 R기와, α-아미노산에 보통 존재하는 -NH2기와 상이한 제2 반응기로 이루어질 수 있다(화학식 I 참조). 유사한 비천연 아미노산은 카복실 말단에서 제2 반응기(α-아미노산에 보통 존재하는 -COOH기와 상이한 기)와 함께 통합될 수 있다(화학식 I 참조).
본 발명의 인위적 아미노산은 선택되어 20개의 천연 아미노산에서는 찾아볼 수 없는 부가적인 특성을 제공하도록 고안될 수 있다. 예를 들어, 인위적 아미노산은 이것이 통합될 단백질의 생물학적 특성을 개질 하도록 디자인 및 선택될 수도 있다. 예를 들어, 인위적 아미노산을 단백질에 포함시킴으로써, 다음과 같은 특성들이 개질 될 수도 있다: 독성, 생 분포 특성, 용해도, 안정성 예를 들어, 온도, 가수 분해, 산화 안정성, 효소 분해에 대한 내성, 정제 및 가공의 용이성, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매 활성, 산화 환원 전위, 반감기, 다른 분자와의 반응 능력 예를 들어, 공유 결합 반응 또는 비 공유 결합 반응 능력 등. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 제11/046,432호에는 다수의 상이한 비천연 암호화 아미노산에 관하여 논의되어 있다.
인위적 아미노산의 화학 합성
본 발명에 사용하기에 적당한 인위적 아미노산 중 다수는 예를 들어, 시그마(USA) 또는 알드리치(Milwaukee, WI, USA)로부터 시판중에 있다. 시판되고 있지 않은 인위적 아미노산들은 본원 또는 다양한 문헌에 제시된 바와 같은 방법이나 또 는 당 업자에게 공지된 표준적인 방법을 이용하여 합성되기도 한다. 유기 합성 기술에 관해서는, 예를 들어, 문헌[Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry, March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); 및 Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조하시오. 인위적 아미노산의 합성 방법에 관하여 기술되어 있는 부가의 문헌으로서는, 예를 들어, 문헌[WO 2002/085923, 발명의 명칭 "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas외 다수, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc, 3315-3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C.외 다수 (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1- methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine) . J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues . J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Immune Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton외 다수, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; 그리고, Subasinghe외 다수, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7]을 참조하시오. 또한, 본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 공보 US 2004/0198637 (발명의 명칭 "Protein Arrays")도 참조하시오.
예를 들어, p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성에 관하여는 본원에 참고용으로 인용된 문헌[Zhang, Z.외 다수., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]을 참조하시오. 기타 카보닐-함유 아미노산은 당 업자에 의하여 유사하게 생산될 수 있다. 카보닐 작용기는 히드라진-, 히드라지드-, 히드록실아민- 또는 세미카바지드-함유 시약과 수용액 중 온화한 조건 하에 선택적으로 반응하여, 상응하는 히드라존, 옥심 또는 세미카바존 결합을 각각 형성할 수 있으며, 여기서 상기 결합은 생리적 조건 하에 안정하다. 예를 들어, 문헌[Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)]을 참조하시오. 더욱이, 카보닐기의 독특한 반응성으로 인하여 기타 아미노산 측 쇄의 존재 하에서 선택적 변형이 이루어질 수 있 다. 예를 들어, 문헌[Cornish, V. W.외 다수., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Mahal, L. K.외 다수, Science 276:1125-1128 (1997)]을 참조하시오.
인위적 아미노산의 생합성
아미노산과 기타 화합물을 생산하는 다수의 생합성 경로는 이미 세포 내에 존재한다. 특정의 인위적 아미노산의 생합성 방법은 천연에서(예를 들어, 세포 내에서) 수행될 수 없지만, 본 발명은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 인위적 아미노산의 생합성 경로는 신규 효소를 첨가하거나 또는 현존하는 숙주 세포 경로를 변형함으로써 숙주 세포 내에서 진행되기도 한다. 추가의 신규 효소는 천연 생성 효소 또는 인공 진화 효소이기도 하다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌[WO 2002/085923 (발명의 명칭; "In vivo incorporation of unnatural amino acids")]의 생합성은 기타 유기체로부터 유래하는 공지의 효소를 조합하여 첨가함으로써 진행시킨다. 이러한 효소 유전자는, 진핵 생물 세포를 이 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환 시킴으로써, 진핵 생물 세포에 도입될 수 있다. 상기 유전자가 세포 내에서 발현될 때, 이 유전자는 원하는 화합물을 합성하는 효소적 경로를 제공한다. 임의적으로 첨가되는 효소의 종류에 관하여는 이하 실시예에 예시되어 있다. 부가의 효소 서열은 예를 들어, Genebank에서 살펴볼 수 있다. 인공적으로 진화된 효소는 또한 동일한 방식으로 세포에 부가되기도 한다. 이러한 방식으로 세포의 세포 내 기구와 공급원은 조작되어 인위적 아미노산을 생산하게 되는 것이다.
생합성 경로에 이용되는 신규 효소를 생산하거나, 현존하는 경로를 진화시키 기 위해서는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 맥시겐 인코포레이티드(Maxygen, Inc.; www.maxygen.com에서 정보를 얻을 수 있음)에 의해 개발된 반복적 재조합법(recursive recombination)은 신규 효소와 경로를 개발 및 개척하는데에 사용되기도 한다. 예를 들어, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; 및 Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751]을 참조하시오. 이와 유사하게, 제넨코(Genencor; www.genencor.com으로부터 정보를 얻을 수 있음)에 의해 개발된 디자인패스(DesignPath)™는 대사 경로 조작법 예를 들어, 세포 내에서 O-메틸-L-티로신을 생성하기 위한 경로를 조작하는 방법에 사용되기도 한다. 이 기술은 신규 유전자 예를 들어, 기능 유전체학을 통하여 동정된 신규 유전자를 조합하여 사용하고, 분자 진화 및 디자인에 의해 숙주 유기체 내에 현존하는 경로를 재구성한다. 다이버사 코포레이션(Diversa Corporation)(www.diversa.com에서 정보를 얻을 수 있음)은 또한 예를 들어, 새로운 경로를 개척하기 위해 유전자 라이브러리 및 유전자 경로를 신속하게 스크리닝하는 기술을 제공한다.
통상적으로, 본 발명의 조작된 생합성 경로를 통해 생산된 인위적 아미노산은 단백질을 효과적으로 생합성 하는데에 충분한 농도(예를 들어, 천연의 세포 내에 존재하는 양이되, 다른 아미노산의 농도에 영향을 미친다거나 또는 세포 내 공급원을 고갈시키는 정도는 아님)로 생산된다. 이러한 방식으로 생체 내에서 생산되 는 통상의 농도는 약 10∼약 0.05 mM이다. 일단, 세포가 플라스미드(즉, 특정 경로에 바람직한 효소를 생산하는데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드)로 형질 전환되어 인위적 아미노산이 생산되면, 생체 내 선택법은 또한 리보좀 단백질 합성 및 세포 성장 둘 다를 위한 인위적 아미노산의 생산을 더욱 최적화하는데에 사용되기도 한다.
인위적 아미노산의 세포 내 흡수
세포에 의한 인위적 아미노산 흡수(uptake)는, 예를 들어, 단백질에 통합될 인위적 아미노산을 고안 및 선택하는데에 있어서 하나의 문제점으로 인식되고 있다. 예를 들어, α-아미노산의 전하 밀도가 높으면, 그러한 화합물은 세포를 투과하지 못할 것이다. 천연 아미노산은 단백질 계 운반 계의 밀집 시스템(collection)을 통하여 진핵 생물 세포로 흡수된다. 인위적 아미노산 중 어느 것이 세포에 의해 취하여지는지를 평가하는 신속 스크리닝법이 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 공보 US 2004/0198637(발명의 명칭 "Protein Arrays")의 독성 검정법과; 문헌[Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785]을 참조하시오. 비록 흡수는 다양한 검정법에 의해 용이하게 분석되지만, 세포 내 흡수 경로에 순응하는 인위적 아미노산을 고안하는 것에 관한 대안은 생체 내에서 아미노산을 합성하기 위한 생합성 경로를 제공ㅎ하는 것이다.
V. 인위적 아미노산을 포함하는 폴리펩티드
인위적 아미노산의 통합은 다양한 목적 예를 들어, 단백질 구조 및/또는 기능상의 변화를 맞추기 위하거나, 크기, 산성도, 친핵성, 수소 결합능, 소수성, 단백질 분해 효소 표적 위치에의 접근 가능성을 바꾸기 위하거나, 부분(예를 들어, 단백질 어레이용 부분)을 표적화하기 위하거나, 생물학적으로 활성인 분자를 부가하기 위하거나, 중합체를 결합시키기 위하거나, 방사성 핵종을 결합시키기 위하거나, 혈청 반감기를 조정하기 위하거나, 조직 투과성을 조정하기 위하거나(예를 들어, 종양), 능동 수송을 조정하기 위하거나, 조직, 세포 또는 기관의 특이성 또는 분포를 조정하기 위하거나, 면역원성을 조정하기 위하거나, 단백질 분해 효소에 대한 내성을 조정하기 위해서 행하여질 수 있다. 인위적 아미노산을 포함하는 단백질은 강화되었거나 또는 새로운 촉매 또는 생물 물리학적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 특성들은 단백질에 인위적 아미노산을 포함시킴으로써 변형되기도 한다: 독성, 생물 분포, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 특성 및/또는 광 화학적 특성, 촉매능, 반감기(예를 들어, 혈청 반감기), 다른 분자와 반응하는 능력(예를 들어, 공유 결합 반응 능력 또는 비 공유 결합 반응 능력) 등. 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들어, 신규의 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(예를 들어, 항체)로서 유용할 뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질 구조 및 기능 연구에 유용하다. 예를 들어, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652]을 참조하시오.
본 발명의 하나의 측면에서, 조성물은 하나 이상, 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 인위적 아미노산을 보유하는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 상기 인위적 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있는데, 즉, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 상이한 인위적 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 단백질 내에 존재하는 특정 아미노산을 하나 이상(모두는 아님) 보유하는 단백질을 포함하며, 이 특정 아미노산은 인위적 아미노산과 치환된다. 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 소정의 단백질에 있어서, 인위적 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있다[예를 들어, 단백질은 상이한 종류의 인위적 아미노산을 2개 이상 포함할 수 있거나, 또는 동일한 인위적 아미노산을 2개 포함할 수 있음]. 2개 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 소정의 단백질에 있어서, 인위적 아미노산은 동일하거나 또는 상이하거나, 또는 동일한 종류의 인위적 아미노산 다수와 하나 이상의 인위적 아미노산의 조합체일 수 있다.
하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 특징을 이룬다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 생산된 하나 이상의 인위적 아미노산을 보유하는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하기도 한다. 부형제(예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 부형제)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.
하나 이상의 인위적 아미노산을 보유하는 목적 단백질 또는 폴리펩티드를 진 핵 생물 세포 내에서 합성함으로써, 단백질 또는 폴리펩티드는 통상적으로 진핵 생물의 번역 후 변형을 포함할 것이다. 임의의 구체예에서, 단백질은 하나 이상의 인위적 아미노산과, 진핵 생물 세포에 의하여 생체 내에서 가하여진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 상기 번역 후 변형은 원핵 생물 세포에 의해서는 가하여지지 않는다. 상기 번역 후 변형의 예로서는 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미트산염 부가, 인산화, 당 지질-결합 변형 및 글리코실화 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 아스파라긴에 올리고당[예를 들어, 올리고당이 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc]이 결합하는 것을 포함한다. 진핵 생물 단백질의 N-결합 올리고당의 몇몇 예가 나열되어 있는 표 1을 참조하시오[부가 잔기도 존재할 수 있으나, 별도로 표시하지는 않음]. 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 결합 또는 GalNAc-트레오닌 결합, GlcNAc-세린 결합 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 세린이나 트레오닌에 올리고당[예를 들어, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등]을 결합시키는 것을 포함한다.
Figure 112007052157078-PCT00005
또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체의 단백 분해 가공, 다중 서브 유닛 단백질로의 조립 또는 거대 분자로의 조립, 세포 내 다른 위치에서의 번역[예를 들어, 기관 예를 들어, 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등에서의 번역, 또는 분비 경로를 통한 번역]을 포함한다. 임의의 구체예에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열 예를 들어, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그 또는 GST 융합체 등을 포함한다. 본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 제4,963,495호 및 동 제6,436,674호에는 hGH 폴리펩티드의 분비를 개선시키도록 고안된 구조물에 관하여 상세히 기록되어 있다.
인위적 아미노산의 하나의 이점은 그것이 부가적 분자를 첨가하는데에 사용될 수 있는 부가의 화학 부분을 제공한다는 점이다. 이와 같은 변형은 진핵 생물 세포 또는 진핵 생물 이외의 세포에서와 같이 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 번역 후 변형은 인위적 아미노산을 통하여 이루어진다. 예를 들어, 번역 후 변형은 친 핵-친 전자 반응을 통하여 이루어질 수 있다. 현재 단백질을 선택적으로 변형시키는데에 사용되는 대부분의 반응들은, 친 핵 반응 파트너와 친 전자 반응 파트너 사이에 공유 결합을 형성하는 것[예를 들어, α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측 쇄의 반응]을 포함한다. 이러한 경우 선택성은 단백질 내 존재하는 친핵성 잔기의 수와 접근 가능성에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에 있어서, 보다 선택적인 기타 반응 예를 들어, 인위적 케토 아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 시험관 내 및 생체 내 반응이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cornish외 다수., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal외 다수., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang외 다수., (2001) Science 292:498-500; Chin외 다수., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin외 다수., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024; Wang외 다수., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100:56-61; Zhang외 다수., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746; 및 Chin외 다수., (2003) Science. 301:964-7; 상기 문헌들은 모두 본원에 참고용으로 인용됨]을 참조하시오. 이로써, 임의의 단백질을 일군의 시약 예를 들어, 형광단, 가교제, 당 유도체 및 세포 독성 분자로써 선택적으로 표지화할 수 있다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "Glycoprotein Synthesis")도 참조하시오. 예를 들어, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형은 또한 스타우딩거(Staudinger) 결찰법(예를 들어, 트리아릴포스핀 시약 이용)을 통해서도 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kiick외 다수, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24]을 참조하시오.
본 발명은 인위적 아미노산을 유전적으로 통합시키는 것을 포함하는, 기타 단백질의 고 효율 선택 변형법을 제공한다. 단백질에 부가될 수 있는 분자로서는 염료, 형광단, 가교제, 당 유도체, 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체), 광 가교제, 세포 독성 화합물, 친화성 표지, 바이오틴 유도체, 수지, 비드, 제2(또는 제3, 제4....) 단백질 또는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA, RNA 등), 금속 킬레이트화제, 보조 인자, 지방산 및 탄수화물 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 단백질에 인위적 아미노산을 통합하는 단계(여기서, 상기 인위적 아미노산은 제1 반응기를 포함함); 그리고 이 단백질과 제2의 반응기를 포함하는 분자[예를 들어, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광 가교제, 방사성 핵종, 세포 독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광 친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트화제, 보조 인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제 리보핵산, 당, 생체 적응 재료, 나노 입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 부분, 방사성 부분, 신규 작용기, 기타 분자와 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 기, 광 케이지화된 부분, 악티닌 방사선 여기 부분, 광 이성체화 부분, 바이오틴, 바이오틴 유도체, 바이오틴 유사체, 중원자 통합 부분, 화학 절단기, 광 절단기, 연장된 측 쇄, 탄소-결합 당, 산화 환원-활성화제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소 표지화된 부분, 생체 물리학적 프로브, 인광 기, 화학 발광기, 전자 조밀 기, 자성 기, 삽입 기, 발색 단, 에너지 전이제, 생물학적 활성 제제, 검출 가능한 표지, 소 분자, 양자 점, 나노 전달체, 방사성 뉴클레오티드, 방사성 전달체, 중성자 포획제 또는 상기 것들의 임의의 조합체, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질]를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
VI. 비-유전자-암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 생체 내 생산법
본 발명의 hGH 폴리펩티드는, 천연-생성 계에서 암호화되지 않는 아미노산에 부가하거나 또는 이 아미노산을 치환하기 위해, 변형된 tRNA 및 tRNA 합성 효소를 이용하여 생체 내에서 생산될 수 있다.
천연-생성 계에서 암호화되지 않는 아미노산을 이용하는 tRNA 합성 효소 및 tRNA를 생산하는 방법에 관하여는, 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(출원 번호 10/126,927) 및 2003/0108885(출원 번호 10/126,931)에 기술되어 있다. 이러한 방법들은 번역 계에 원래부터 존재하는 tRNA 또는 합성 효소와는 독립적으로 작용하는 번역 기작을 만드는 단계를 포함한다(이러한 이유로 "직교형(orthogonal)"이라 칭함). 통상적으로, 번역 계은 직교 tRNA(O-tRNA)와 직교형 아미노아실 tRNA 합성 효소(O-RS)를 포함한다. 통상적으로, 상기 O-RS는 번역 계 내에서 하나 이상의 비천연 생성 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로(preferentially) 아미노아실화하고, 이 O-tRNA는 계 내에서 기타 tRNA에 의해 인지되지 않는 하나 이상의 선택 코돈을 인지한다. 이후, 번역 계은 암호화된 선택 코돈에 따라서 비천연 암호화 아미노산을 이 계 내에서 생산되는 단백질에 삽입하여, 암호화된 폴리펩티드 내 위치에 아미노산을 "치환"한다.
다양한 종류의 직교 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성 효소는, 당 업계에 폴리펩티드에 특정 합성 아미노산을 삽입하는 것으로 알려져 있으며, 이는 일반적으로 본 발명에 사용하기에 적당하다. 예를 들어, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소에 관하여는 문헌[Wang, L.외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) 및 Zhang, Z.외 다수, Biochem. 42(22): 6735-6746 (2003)]에 개시되어 있다. 대표적인 O-RS 또는 이의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 또한 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885(본원에 각각 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 상응하는 O-tRNA 분자(O-RS용)에 관하여도, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(출원 번호 10/126,927) 및 2003/0108885(출원 번호 10/126,931)에 기술되어 있다.
아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소 계의 예에 관하여는 문헌[Chin, J. W.외 다수, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)]에 개시되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 대표적인 O-RS 서열로서는 뉴클레오티드 서열 즉, 서열 번호 14∼16 및 29∼32와 아미노산 서열 즉, 서열 번호 46∼48 및 61∼64[본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0108885(출원 번호 10/126,931)에 개시됨]를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적당한 대표적 O-tRNA 서열로서는, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0108885(출원 번호 10/126,931)에 개시되어 있는 뉴클레오티드 서열 즉, 서열 번호 1∼3을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 비천연 암호화 아미노산에 특이적인 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소 쌍에 관한 기타 예에 관하여는, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(출원 번호 10/126,927)에 기술되어 있다. 에스.세레비지애(S. cerevisiae) 내 케토- 및 아지드-함유 아미노산 둘 다를 통합하는 O-RS 및 O-tRNA에 관하여는 문헌[Chin, J. W.외 다수, Science 301:964-967 (2003)]에 기술되어 있다.
기타 몇몇 직교형 쌍에 관하여도 보고된 바 있다. 에스.세레비지애 tRNA로부터 유래된 글루타미닐(예를 들어, Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785), 아스파틸(예를 들어, Pastrnak, M.외 다수., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286) 및 티로실(예를 들어, Ohno, S.외 다수., (1998) J. Biochem. (Tokyo. Jpn) 124:1065-1068; 및 Kowal, A. K.외 다수., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273) 계 및 합성 효소는, 이.콜라이 내에서 인위적 아미노산을 통합하는데에 유효한 것으로 기술되어 있다. 이.콜라이 글루타밀[예를 들어, Kowal, A. K.외 다수., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273] 및 티로실[예를 들어, Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641] 합성 효소로부터 유래하는 계은 에스.세레비지애에 사용될 수 있다고 기술되어 있다. 상기 이.콜라이 티로실 계은 생체 내 즉, 포유동물 세포 내에서 3-요도-L-티로신을 통합하는데에 사용되어 왔다. 문헌[Sakamoto, K.외 다수., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699]을 참조하시오.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소를 사용하는 것은 비천연 암호화 아미노산을 암호화하는 특정 코돈을 선택하는 과정을 포함한다. 임의의 코돈이 사용될 수 있지만, 일반적으로는 상기 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소가 발현되는 세포 내에서 거의 사용되지 않거나 또는 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표적인 코돈으로서는 넌 센스 코돈 예를 들어, 종결 코돈(앰버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈과 기타 천연의 3-염기 코돈(거의 사용되지 않거나 또는 전혀 사용되지 않는 코돈)을 포함한다.
특정 선택 코돈(들)은 당 업계에 공지된 돌연 변이 유발법(예를 들어, 위치-특이적 돌연 변이 유발법, 카세트 돌연 변이 유발법, 제한 선택 돌연 변이 유발법 등)을 이용하여 hGH 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 적당한 위치에 도입될 수 있다.
비천연 암호화 아미노산을 통합하는데에 사용될 수 있는 단백질 생합성 기작의 성분 예를 들어, O-RS, O-tRNA 및 직교형 0-tRNA/O-RS 쌍을 생산하는 방법에 관하여는 문헌[Wang, L.외 다수, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W.외 다수, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기술되어 있다. 비천연 암호화 아미노산의 생체 내 통합 방법 및 이를 위한 조성물에 관하여는 본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(출원 번호 10/126,927)에 기술되어 있다. 유기체의 생체 내 번역 계에 사용되는 직교 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍을 선택하는 방법에 관하여도 또한 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(출원 번호 10/126,927) 및 2003/0108885(출원 번호 10/126,931)에 기술되어 있다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 PCT 공보 WO 04/035743(발명의 명칭 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins,")에는, 케토 아미노산의 통합에 사용되는 직교형 RS 및 tRNA 쌍에 관하여 기술되어 있다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 PCT 공보 WO 04/094593(발명의 명칭 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code")에는, 진핵 생물 숙주 세포 내에서 비천연 암호화 아미노산을 통합하는 데에 사용되는 직교형 RS 및 tRNA 쌍에 관하여 기술되어 있다.
하나 이상의 재조합 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 생산하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 제1 유기체 예를 들어, 원핵 생물 유기체 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, 에이.펄기두스, 피.퓨리오서스, 피.호리코시, 에이.페르닉스, 티.서모필러스 등, 또는 진핵 생물 유기체로부터 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)로부터 유래하는 RS 라이브러리(임의로는 돌연 변이체)를 생산하는 단계; (b) 비천연 암호화 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 직교 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 일원에 대해 RS 라이브러리(임의로는 돌연 변이 RS)를 선택(및/또는 스크리닝)하여, 활성(임의로는 돌연 변이) RS 풀(pool)을 제공하는 단계; 및/또는 (c) 비천연 암호화 아미노산의 부재 하에서 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(예를 들어, 돌연 변이 RS)에 대한 풀을 선택(임의로는 네거티브 선택)하여, 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계[여기서 상기 하나 이상의 재조합 O-RS는 O-tRNA를 비천연 암호화 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시킴].
하나의 구체예에서, 상기 RS는 불활성 RS이다. 상기 불활성 RS는 활성 RS를 돌연 변이시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 불활성 RS는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 약 10개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 예를 들어, 알라닌으로 돌연 변이시킴으로써 생산될 수 있다.
돌연 변이 RS의 라이브러리는 당 업계에 공지된 다양한 기술 예를 들어, 단백질 3차원 RS 구조를 바탕으로 한 합리적 고안법이나, 랜덤 또는 합리적 고안 기술에 있어서의 RS 뉴클레오티드 돌연 변이 유발법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연 변이 RS는 위치-특이적 돌연 변이법, 랜덤 돌연 변이법, 다양성 발현 재조합 돌연 변이법, 키메라 구조물, 합리적 고안법 및 기타 본원 및 당 업계에 공지된 방법에 의하여 발생 될 수 있다.
하나의 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 활성인 일원 예를 들어, 직교 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 일원에 대하여 RS(임의로는 돌연 변이 RS) 라이브러리를 선택(및/또는 스크리닝)하는 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: 포지티브 선택 마커 또는 스크리닝 마커 예를 들어, 항생제 내성 유전자 등과, RS(임의로는 돌연 변이 RS) 라이브러리를 다수의 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 포지티브 선택 마커 및/또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 선택 코돈 예를 들어, 앰버, 오커 또는 오팔 코돈을 포함함]; 선택 제제의 존재 하에서 다수의 세포들을 생육시키는 단계; 포지티브 선택 마커 또는 스크리닝 마커 내에 존재하는 하나 이상의 선택 코돈을 억제하여, 선택 제제 및/또는 스크리닝 제제의 존재 하에서 생존하는(또는 특이 반응을 나타내는) 세포를 동정함으로써, 활성인 RS(임의로는 돌연 변이 RS) 풀을 함유하는 포지티브 선택 세포의 하위 세트를 제공하는 단계. 임의로, 상기 선택 제제 및/또는 스크리닝 제제의 농도는 다양할 수 있다.
하나의 측면에서, 상기 포지티브 선택 마커는 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT) 유전자이고, 상기 선택 코돈은 CAT 유전자 내에 존재하는 앰버 종결 코돈이다. 임의적으로, 상기 포지티브 선택 마커는 β-락타마제 유전자이고, 상기 선택 코돈은 β-락타마제 유전자 내에 존재하는 앰버 종결 코돈이다. 다른 측면에서, 상기 포지티브 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 바탕으로 하는 스크리닝 마커(예를 들어, 세포 표면 마커)를 포함한다.
하나의 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(임의로는 돌연 변이 RS)의 풀을 네거티브 선택 또는 스크리닝하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포지티브 선택 또는 스크리닝을 통하여 얻어진 활성(임의로는 돌연 변이) RS 풀과 함께 네거티브 선택 또는 스크리닝 마커를 다수의 제2 유기체 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 네거티브 선택 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 선택 코돈(예를 들어, 항생제 내성 유전자 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸 전이 효소(CAT) 유전자)을 포함함]; 및 비천연 암호화 아미노산과 스크리닝 제제 또는 선택 제제가 보강된 제1 매질 중에서 생존하거나 또는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내되, 비천연 암호화 아미노산과 스크리닝 제제 또는 선택 제제가 보강되지 않은 제2 매질 중에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적인 반응을 나타내지 못하는 세포를 동정하여, 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계. 예를 들어, CAT 동정 프로토콜은 적당한 O-RS 재조합체를 확인함에 있어서 임의로는 포지티브 선택 수단 및/또는 네거티브 스크리닝 수단으로서의 역할을 한다. 예를 들어, 클론 풀은 임의로는, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 존재하거나 또는 존재하지 않는, CAT 함유 생장 평판(하나 이상의 선택 코돈 포함)상에서 복제되기도 한다. 그러므로, 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 평판 상에서만 생장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로서 간주된다. 하나의 측면에서, 선택(및/또는 스크리닝) 제제의 농도는 다양하다. 몇몇 측면에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 상이하다. 그러므로, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체로서는 임의로 다음과 같은 것들을 포함하기도 한다: 원핵 생물, 진핵 생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균, 효모, 고 세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물 등. 다른 구체예에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 바탕으로 하는 스크리닝 마커를 포함한다.
다른 구체예에서, 활성 RS(임의로는 돌연 변이 RS) 풀을 스크리닝 또는 선택(예를 들어, 네거티브 선택)하는 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: 포지티브 선택 단계로부터 활성 돌연 변이 RS 풀을 분리하는 단계; 네거티브 선택 마커 또는 스크리닝 마커와 활성(임의로는 돌연 변이) RS를 다수의 제2 유기체 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 네거티브 선택 마커 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 선택 코돈(예를 들어, 하나 이상의 선택 코돈을 포함하는, 독성 마커 유전자 예를 들어, 리보뉴클레아제 바나제(ribonuclease barnase) 유전자)을 포함함]; 및 비천연 암호화 아미노산이 보강되지 않은 제1 매질 중에서 생존하거나 또는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내되, 비천연 암호화 아미노산이 보강된 제2 매질 중에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지 못하는 세포를 동정하여, 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계[여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-RS는 비천연 암호화 아미노산에 특이적임]. 하나의 측면에서, 하나 이상의 선택 코돈은 2개 이상의 선택 코돈을 포함한다. 이러한 구체예에서, 임의적으로, 하나 이상의 선택 코돈은 2개 이상의 선택 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이할 수 있다[예를 들어, 이 유기체는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균, 효모, 고 세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물 등일 수도 있다]. 뿐만 아니라, 몇몇 측면에서는, 네거티브 선택 마커가 리보뉴클레아제 바나제 유전자(하나 이상의 선택 코돈을 포함함)를 포함하기도 한다. 기타 측면에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 바탕으로 하는 스크리닝 마커를 포함하기도 한다. 본원의 구체예에서, 스크리닝 방법 및/또는 선택 방법은 스크리닝 및/또는 선택 엄중도를 다양하게 조정할 수도 있다.
하나의 구체예에서, 하나 이상의 재조합 직교형 아미노 아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 생산하는 방법은 추가로 다음의 단계들을 포함할 수도 있다: (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 분리하는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유래된 O-RS(임의로는 돌연 변이된 O-RS)의 제2 세트를 생산하는 단계; 및 (f) 돌연 변이된 O-RS가 우선적으로 O-tRNA를 아미노아실화시키는 능력을 갖게 될 때까지 상기 (b) 단계 및 (c) 단계를 반복 수행하는 단계. 임의적으로, 상기 단계 (d)∼(f)는 약 2회 이상 반복 수행된다. 하나의 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유래된 돌연 변이 O-RS의 제2 세트는 돌연 변이 유발법 예를 들어, 랜덤 돌연 변이 유발법, 위치-특이적 돌연 변이 유발법, 재조합법 또는 이들 방법의 조합법에 의해 생산될 수 있다.
전술한 방법에 있어서, 선택/스크리닝 단계 예를 들어, 포지티브 선택/스크리닝 단계 (b), 네거티브 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 포지티브 및 네거티브 선택/스크리닝 단계인 (b) 및 (c) 둘 다의 엄중도는 다양한 선택/스크리닝 엄중도를 포함하기도 한다. 다른 구체예에서, 포지티브 선택/스크리닝 단계 (b), 네거티브 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 포지티브 및 네거티브 선택/스크리닝 단계인 (b) 및 (c) 둘 다에서는 리포터를 사용하는데, 여기서 상기 리포터는 형광도-활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 검출되거나, 또는 상기 리포터는 발광도에 의해 검출된다. 임의적으로, 상기 리포터는 세포 표면에 디스플레이되거나, 또는 파지 디스플레이되며, 비천연 암호화 아미노산 또는 유사체가 관여하는 친화도 또는 촉매 활성을 바탕으로 하여 선택된다. 하나의 구체예에서, 돌연 변이된 합성 효소는 세포 표면 상에 디스플레이되거나, 또는 파지 디스플레이된다.
재조합 직교 tRNA(O-tRNA)를 생산하는 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 제1 유기체로부터 하나 이상의 tRNA 예를 들어, 억제 tRNA 유래 돌연 변이 tRNA 라이브러리를 생산하는 단계; (b) RS의 부재 하에서 제2 유기체로부터 유래된 아미노 아실-tRNA 합성 효소(RS)로 아미노아실화된 tRNA(임의로는 돌연 변이 tRNA)에 대한 라이브러리를 선택(예를 들어, 네거티브 선택) 또는 스크리닝하여, tRNA(임의로는 돌연 변이 tRNA) 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 직교형 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 일원들에 대하여 tRNA(임의로는 돌연 변이 tRNA) 풀을 선택 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계[여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 선택 코돈을 인지하고 제2 유기체로부터 유래된 RS에 의해서는 효과적으로 인지되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨]. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 tRNA는 억제 tRNA이고/이거나, 천연 및/또는 비 천연 염기로 이루어진 독특한 3 염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌 센스 코돈, 희귀 코돈, 인위적 코돈, 4개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 코돈이다. 하나의 구체예에서, 재조합 O-tRNA는 직교성(orthogonality)이 개선되었다. 몇몇 구체예에서, O-tRNA는 변형되지 않고서도, 제2 유기체로부터 제1 유기체로 도입되기도 한다. 다수의 구체예에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이하며, 임의로는 예를 들어, 원핵 생물(예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 에스케리치아 콜라이, 할로박테리움 등), 진핵 생물, 포유동물, 진균, 효모, 고 세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물 등으로부터 선택된다. 뿐만 아니라, 상기 재조합 tRNA는 임의로 비천연 암호화 아미노산에 의해 아미노아실화되기도 하는데, 여기서, 상기 비천연 암호화 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통하여 생체 내에서 생합성 된다. 비천연 암호화 아미노산은 임의로는 최소한 제1 유기체 또는 제2 유기체용 성장 배지에 첨가되기도 한다.
하나의 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 아미노아실화된 tRNA(임의로는 돌연 변이 tRNA)의 라이브러리를 선택(예를 들어, 네거티브 선택) 또는 스크리닝 하는 단계(단계 (b))는 다음의 단계들을 포함한다: 독성 마커 유전자를 도입하는 단계[여기서, 상기 독성 마커 유전자는 하나 이상의 선택 코돈(또는 독성 제제 또는 정균제를 생성시키는 유전자, 또는 유기체에 필수적인 유전자)을 포함하며, 이러한 마커 유전자는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하고, (임의로는 돌연 변이) tRNA의 라이브러리는 제2 유기체로부터 유래하는 다수의 세포에 도입됨]; 및 생존하는 세포를 선택하는 단계[여기서, 상기 생존하는 세포는 하나 이상의 직교 tRNA 또는 비 기능성 tRNA를 포함하는 tRNA(임의로는 돌연 변이 tRNA) 풀을 함유함]. 예를 들어, 생존 세포는 비교비 세포 밀도 검정법(comparison ratio cell density assay)에 의해 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 선택 코돈을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 관한 다른 구체예에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바나제 유전자이며, 여기서, 상기 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 임의적으로, 상기 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 도입된 직교형 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 일원에 대하여 (임의로는 돌연 변이) tRNA 풀을 선택 또는 스크리닝하는 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 포지티브 선택 또는 스크리닝 마커 유전자를, O-RS, 그리고 (임의로는 돌연 변이) tRNA 풀과 함께 제2 유기체로부터 유래하는 다수의 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 포지티브 마커 유전자는 약물 내성 유전자(예를 들어, 하나 이상의 선택 코돈 예를 들어, 하나 이상의 앰버 종결 코돈을 포함하는 β-락타마제 유전자), 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 독성 제제를 해독시키는 유전자를 포함함]; 및 선택 제제 또는 스크리닝 제제 예를 들어, 항생제의 존재 하에서 생육된 생존 세포 또는 스크리닝 된 세포를 동정하여, 하나 이상의 재조합 tRNA를 갖는 세포 풀을 제공하는 단계[여기서, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 이 재조합 tRNA는 또한 하나 이상의 선택 코돈에 따라서, 포지티브 마커 유전자에 의해 암호화된 번역 산물에 아미노산을 도입함]. 다른 구체예에서, 선택 및/또는 스크리닝 제제의 농도는 다양하다.
특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 형성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 제1 유기체로부터 하나 이상의 tRNA로부터 유래하는 돌연 변이 tRNA 라이브러리를 생산하는 단계; (b) 제1 유기체로부터 유래하는 RS의 부재 하에서 제2 유기체로부터 얻은 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)에 의해 아미노아실화된 tRNA(임의로는 돌연 변이 tRNA)에 대하여 라이브러리를 네거티브 선택 또는 스크리닝하여, (임의로는 돌연 변이) tRNA 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 직교형 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 일원들에 대하여 (임의로는 돌연 변이) tRNA 풀을 선택 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계. 상기 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 선택 코돈을 인지하고, 제2 유기체로부터 유래하는 RS에 의해 효과적으로 인지되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 이 방법은 또한 (d) 제3 유기체로부터 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)로부터 유래하는 (임의로는 돌연 변이) RS 라이브러리를 생산하는 단계; (e) 비천연 암호화 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 일원에 대하여 돌연 변이 RS 라이브러리를 선택 또는 스크리닝하여, 활성(임의로는 돌연 변이) RS 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연 암호화 아미노산의 부재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성(임의로는 돌연 변이) RS에 대한 풀을 네거티브 선택 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 제공하는 단계[여기서, 상기 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연 암호화 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS와, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 포함함]를 포함한다. 이 방법에 의해 생산된 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍도 포함된다. 예를 들어, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 예를 들어, mutRNATyr-mutTyrRS 쌍 예를 들어, mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적으로, 상기 제1 유기체 및 제3 유기체가 동일한(예를 들어, 메타노코커스 재너쉬) 방법도 포함한다.
제2 유기체의 생체 내 번역 계에 사용되는 직교 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍을 선택하는 방법도 본 발명에 포함된다. 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: 제1 유기체로부터 분리 또는 유래하는 마커 유전자, tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)를 제2 유기체로부터 유래하는 제1 세포 세트에 도입하는 단계; 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터 얻은 이중체 세포 세트에 도입하는 단계; 및 이중체 세포 중에서 생존하지 못하는 제1 세트 내 생존 세포를 선택하거나, 또는 이중체 세포 세트 내에서 이러한 반응을 나타내지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포를 스크리닝하는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트 및 이중체 세포 세트는 선택 제제 또는 스크리닝 제제의 존재 하에서 생육되고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체 내 번역 계 내에서 사용되는 직교 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍을 포함한다. 하나의 구체예에서, 비교 및 선택 또는 스크리닝하는 방법은 생체 내 상보성 검정법을 포함한다. 선택 제제 또는 스크리닝 제제의 농도는 다양할 수 있다.
본 발명의 유기체로서는 다양한 종류의 것들과 이들의 조합체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 유기체는 임의로는 원핵 생물 유기체 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, 에이.펄기두스, 피.퓨리오서스, 피.호리코시, 에이.페르닉스, 티.서모필러스 등이다. 대안적으로, 상기 유기체는 임의로 진핵 생물 유기체 예를 들어, 식물(예를 들어, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 등과 같은 고등 식물), 조류(algae), 원생 생물, 진균(예를 들어, 효모), 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충 및 절지 동물(anthropod) 등) 등을 포함한다. 하나의 구체예에서, 제2 유기체는 원핵 생물 유기체 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, 에이.펄기두스, 피.퓨리오서스, 피.호리코시, 에이.페르닉스, 티.서모필러스 등이다. 대안적으로 상기 제2 유기체는 진핵 생물 유기체 예를 들어, 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균, 포유동물 세포 등일 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 제1 유기체 및 제2 유기체는 상이하다.
VII. hGH 폴리펩티드 내 비천연 생성 아미노산의 위치
본 발명은 하나 이상의 비천연 생성 아미노산을 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드에 통합하는 것에 관한 것이다. 하나 이상의 비천연 생성 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않는 특정 위치에 통합될 수 있다. 이와 같은 통합은, "보존적" 치환 예를 들어, 소수성 아미노산과 소수성 아미노산의 치환, 벌키한 아미노산과 벌키한 아미노산의 치환, 친수성 아미노산과 친수성 아미노산의 치환 및/또는 비천연 생성 아미노산을 활성과는 무관한 위치에 삽입함으로써 가능하다.
GH 예를 들어, hGH 부위는 다음과 같이 표시할 수 있는데, 여기서, hGH 내 아미노산 위치는 가운데 열에 나타내었다(서열 번호 2):
Figure 112007052157078-PCT00006
비천연 암호화 아미노산과의 치환 위치로서 바람직한 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드 내의 위치를 선택하기 위하여 다양한 생화학적 및 구조적 연구가 수행될 수 있다. 당 업자는 상기 폴리펩티드 사슬 중 임의의 위치가 비천연 암호화 아미노산을 통합시키는 선택 방법에 적당하고, 이러한 선택은 임의의 목적을 위하거나 또는 별다르지 않은 목적을 위한 합리적 디자인 또는 랜덤한 선택법을 바탕으로 할 수 있다는 사실을 용이하게 파악할 수 있다. 원하는 위치를 선택함으로써, 임의의 바람직한 특성 또는 활성[예를 들어, 작동제, 초-작동제(super-agonist), 역 작동제(inverse agonist), 길항제, 수용체 결합 조정 인자 및 수용체 활성 조정 인자로서의 활성 또는 특성, 이량체 또는 다량체를 형성하는 활성 또는 특성, 천연 분자와 차이가 없는 활성 또는 특성, 또는 폴리펩티드의 물리적 또는 화학적 성질(예를 들어, 가용성, 응집성 또는 안정성)을 조정하는 활성 또는 특성]을 갖는 GH 분자 예를 들어, hGH 분자를 생산해낼 수 있다. 예를 들어, GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드의 생물 활성에 필요한 폴리펩티드 내 위치는, 당 업계에 공지되어 있는 점 돌연 변이 분석법, 알라닌 스캐닝법 또는 상동체 스캐닝법을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cunningham, B. and Wells, J., Science, 244:1081-1085 (1989) (GH, 예를 들어, hGH의 생체 활성에 중요한 잔기 14개의 동정에 관함); 및 Cunningham, B.외 다수. Science 243: 1330-1336 (1989) (상동체 스캐닝 돌연 변이 유발법을 사용하여 항체 및 수용체 에피토프를 동정하는 것에 관함)]을 참조하시오. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,580,723호; 동 제5,834,250호; 동 제6,013,478호; 동 제6,428,954호; 및 동 제6,451,561호에는, 표적 물질을 이용하여 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 활성 도메인을 동정함으로써 폴리펩티드 예를 들어, hGH의 구조 및 기능을 체계적으로 분석하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연 변이 유발법에 의하여 생물 활성에 중요한 것으로 동정된 잔기들 이외의 잔기들은, 폴리펩티드가 추구하고자 하는 목적 활성에 따라서 비천연 암호화 아미노산으로 치환될 우수한 후보 위치일 수 있다. 대안적으로, 생물 활성에 중요한 것으로 동정된 위치들도 또한, 폴리펩티드가 추구하고자 하는 목적 활성에 따라서 비천연 암호화 아미노산으로 치환될 우수한 후보 잔기 일 수 있다. 폴리펩티드 사슬 상의 각 위치를 비천연 암호화 아미노산으로 간단하게 연속 치환하여, 이 폴리펩티드의 활성에 대한 효과를 관찰하기 위한 대안도 있다. 당 업자는, 비천연 아미노산과의 치환에 필요한 위치를 선택하여 임의의 폴리펩티드에 도입하는 임의의 수단, 기술 또는 방법이 본 발명에 사용하기에 적당하다는 사실을 파악할 수 있다.
비천연 암호화 아미노산과의 치환에 대해 관용(tolerant)하는 것으로 보이는 단백질의 부위를 결정하기 위해, 결실이 발생한 hGH 폴리펩티드의 천연-생성 돌연 변이체의 구조 및 활성도 또한 관찰될 수 있다. 예를 들어, hGH에 관한 문헌[Kostyo외 다수, Biochem. Biophys. Acta, 925: 314 (1987); Lewis, U.외 다수, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978)]을 참조하시오. 유사한 방식으로, 단백질 분해 효소 절단 및 모노클로날 항체는 hGH 수용체와의 결합에 관여하는 hGH의 부위를 동정하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cunningham, B.외 다수, Science 243: 1330-1336 (1989); Mills, J.외 다수, Endocrinology, 107:391-399 (1980); Li, C, Mol. Cell. Biochem., 46:31-41 (1982); 134∼149번 잔기 사이에 있는 아미노산을 폴리펩티드의 활성을 상실시키지 않고 결실시킬 수 있다고 개시됨]을 참조하시오. 일단 비천연 암호화 아미노산과의 치환에 대해 관용하지 않는(intolerant) 것으로 보이는 잔기가 제거되면, 나머지 위치들 각각에서 발생하는 것으로 추정되는 치환의 영향력은 hGH 및 이의 결합 단백질의 3차원 결정 구조로부터 확인할 수 있다. hGH에 관한 문헌[de Vos, A.외 다수, Science, 255:306-312 (1992)]에 따르면, hGH의 모든 결정 구조는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) (3HHR, 1AXI 및 1HWG 포함) (PDB, www.rcsb.org) 즉, 단백질 및 핵산의 거대 분자에 대한 3차원 구조 데이터를 포함하는 중앙 집중 데이터 베이스에서 입수 가능하다고 한다. 만일, 3차원 구조 데이터를 입수할 수 없으면, 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 연구하기 위한 모델을 확립할 수 있다. 그러므로, 당 업자는 비천연 암호화 아미노산과 치환될 수 있는 아미노산 위치를 쉽게 동정할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 폴리펩티드의 나선형 2차 구조 또는 베타 시트형 2차 구조를 파괴하지 않는 단백질 부위에 위치하고 있는 하나 이상의 비천연 생성 아미노산을 포함한다.
비천연 암호화 아미노산의 통합을 위한 대표적인 잔기는 잠재적인 수용체 결합 부위(예를 들어, 제I 위치 및 제II 위치)로부터 배제된 잔기 일 수 있고, 용매에 완전히 또는 부분적으로 노출될 수 있으며, 인접 잔기들과 최소한으로 수소 결합 상호 작용을 하거나 또는 전혀 하지 않고, 인접하는 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있으며, 수용체에 결합되었거나 또는 결합되지 않은 hGH의 3차원 결정 구조, 2차, 3차 또는 4차 구조에 의해 예측되는 바에 의하면, 가요성이 큰 부위(예를 들어, C-D 루프) 또는 구조적으로 견고한 부위(예를 들어, B 나선 부) 내에 존재할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 hGH 내 2차 구조에 상응하는 다음과 같은 부위들 중 하나 이상의 부위 내에 존재하는 임의의 위치에 통합된다: 서열 번호 2의 1∼5번 위치(N-말단부), 6∼33번 위치(A 나선 부), 34∼74번 위치(A 나선 부와 B 나선 부 사이의 부위 즉, A-B 루프), 75∼96번 위치(B 나선 부), 97∼105번 위치(B 나선 부 및 C 나선 부 사이의 부위 즉, B-C 루프), 106∼129번 위치(C 나선 부), 130∼153번 위치(C 나선 부 및 D 나선 부 사이의 부위 즉, C-D 루프), 154∼183번 위치(D 나선 부), 184∼191번 위치(C-말단부). 다른 구체예에서, 본 발명의 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드는, 서열 번호 2의 N-말단부(1∼5), A-B 루프의 N-말단부(32∼46); B-C 루프(97∼105), C-D 루프(132∼149) 및 C-말단부(184∼191)에 해당하는 부위들로 이루어진 군으로부터 선택되는, GH 예를 들어, hGH의 부위들 중 하나 이상의 부위에 위치하는 하나 이상의 아미노산에 대해 치환된, 하나 이상의 비천연 생성 아미노산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 다음과 같은 위치에 상응하는 GH 예를 들어, hGH의 위치들 중 하나 이상의 위치에 통합된다: 서열 번호 2의 1번 위치 앞(즉, N-말단부), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 번 위치(즉, 단백질의 카복실 말단부) 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들.
하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치로는, 서열 번호 2의 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187 번 위치에 상응하는 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다.
하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치의 하위 세트로서는, 서열 번호 2의 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187 번 위치에 상응하는 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. GH 예를 들어, hGH의 결정 구조와, 이것과 GH 수용체 예를 들어, hGH 수용체와의 상호 작용을 관찰함으로써, 상기 아미노산 잔기의 측 쇄는 용매와 완전히 또는 부분적으로 접촉 가능하며, 비천연 암호화 아미노산의 측 쇄는 단백질 표면으로부터 비껴나와 용매가 존재하는 쪽을 향할 수 있다는 사실을 알 수 있다.
하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치들로서는, 서열 번호 2의 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155 번 위치에 상응하는 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. GH 예를 들어, hGH의 결정 구조와, 이것과 GH 수용체 예를 들어, hGH 수용체와의 상호 작용을 관찰함으로써, 상기 아미노산 잔기의 측 쇄 들은 용매에 완전히 노출되고, 원래 잔기의 측 쇄는 용매가 존재하는 쪽을 향한다는 사실을 알 수 있다.
하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치의 하위 세트로서는, 서열 번호 2의 30, 74 및 103 번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치의 기타 하위 세트로서는, 서열 번호 2의 35, 92, 143 및 145 번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치의 추가 하위 세트로서는, 서열 번호 2의 35, 92, 131, 134, 143 및 145 번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치의 또 다른 하위 세트로서는, 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103 및 145 번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 대표적인 위치의 또 다른 하위 세트로서는, 서열 번호 2의 35, 92, 143 및 145 번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. 임의의 구체예에서, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서는 서열 번호 2의 35번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다.
몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH에 통합된 비천연 암호화 아미노산 중 하나 이상은 카보닐기 예를 들어, 케톤기를 포함한다. 임의의 구체예에서, GH 예를 들어, hGH에 통합된 비천연 암호화 아미노산 중 하나 이상은 파라-아세틸페닐알라닌이다. 몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH는 다수의 비천연 암호화 아미노산을 함유하고, GH 예를 들어, hGH에 통합된 비천연 암호화 아미노산 중 하나 이상은 파라-아세틸페닐알라닌이다. 몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH는 다수의 비천연 암호화 아미노산을 포함하고, GH 예를 들어, hGH에 통합된 실질적으로 모든 비천연 암호화 아미노산은 파라-아세틸페닐알라닌이다.
몇몇 구체예에서, 비천연 생성 아미노산은 하나 이상의 위치 예를 들어, 다음의 위치들에 상응하는 위치에서 수용성 중합체와 결합한다: 서열 번호 2의 1번 위치 앞(즉, N-말단부), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 번 위치(즉, 단백질의 카복실 말단부), 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 생성 아미노산은 예를 들어, 다음과 같은 위치들 중 하나 이상의 위치에 해당하는 위치에서 수용성 중합체와 결합한다: 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 생성 아미노산은 예를 들어, 다음과 같은 위치들 중 하나 이상의 위치에 해당하는 위치에서 수용성 중합체와 결합한다: 서열 번호 2의 35, 92, 143, 145 번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 생성 아미노산은 예를 들어, 다음과 같은 위치들 중 하나 이상의 위치에 해당하는 위치에서 수용성 중합체와 결합한다: 서열 번호 2의 35, 92, 131, 134, 143, 145 번 위치 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 생성 아미노산은 예를 들어, 다음과 같은 위치들 중 하나 이상의 위치에 해당하는 위치에서 수용성 중합체와 결합한다: 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103, 145 번 위치 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 생성 아미노산은 예를 들어, 다음과 같은 위치들 중 하나 이상의 위치에 해당하는 위치에서 수용성 중합체와 결합한다: 서열 번호 2의 35, 92, 143, 145 번 위치 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 위치. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 생성 아미노산은 예를 들어, 서열 번호 2의 35 번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치에서 수용성 중합체와 결합한다.
몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH에 결합한 수용성 중합체(들)는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자(PEG)를 포함한다. 중합체 예를 들어, PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 통상적으로, 선형 중합체 예를 들어, 본 발명에 사용된 PEG는 분자량이 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다. 통상적으로, 분지형 중합체 예를 들어, 본 발명에 사용된 PEG는 분자량이 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa일 수 있다. 중합체 예를 들어, PEG에 관하여는 본원에 보다 상세히 설명되어 있다. 임의의 구체예에서, GH 예를 들어, hGH와 수용성 중합체 예를 들어, PEG 사이의 결합은 옥심 결합이다.
본 발명의 임의의 구체예는 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체와 결합되어 있는 GH 예를 들어, hGH을 포함하는 조성물을 포함하는데, 여기서, 상기 공유 결합은 옥심 결합이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용성 중합체는 PEG 예를 들어, 선형 PEG이다. 옥심 결합에 의하여 GH 예를 들어, hGH에 결합된 하나 이상의 선형 PEG를 포함하는 몇몇 구체예에서, 상기 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의하여 GH 예를 들어, hGH에 결합된 선형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의하여 GH 예를 들어, hGH에 결합된 하나 이상의 분지형 PEG를 포함하는 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa일 수 있다. 옥심 결합에 의하여 GH 예를 들어, hGH에 결합된 분지형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 40 kDa이다. 몇몇 구체예에서, GH는 GH 예를 들어, hGH이고, 임의의 구체예에서, GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2와 약 80% 이상 상동성인 서열을 가지고; 몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 서열을 가진다. 몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH는 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 함유하며; 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 옥심 결합은 비천연 암호화 아미노산과 하나 이상의 수용성 중합체 사이에 형성된다. 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 카보닐 기 예를 들어, 케톤 기를 함유하며; 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 파라-아세틸페닐알라닌이다. 몇몇 구체예에서, 파라-아세틸페닐알라닌은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 치환된다.
그러므로, 몇몇 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 공유 결합에 의해 결합되어 있는 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 공유 결합은 옥심 결합이다. 임의의 구체예에서, 수용성 중합체는 PEG이며, 상기 PEG는 선형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 선형 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 선형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 임의의 구체예에서, 수용성 중합체는 분지형 PEG인 PEG이다. 이러한 구체예에서, 분지형 PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 분지형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 40 kDa이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 비천연 암호화 아미노산을 함유하며, 상기 GH는 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, PEG와 공유 결합에 의해 결합되어 있으며, 상기 공유 결합은 비천연 암호화 아미노산과 수용성 중합체 예를 들어, PEG 사이의 옥심 결합이다. 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합된다. 임의의 구체예에서, 수용성 중합체는 PEG이고, 상기 PEG는 선형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 선형 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 선형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, 상기 PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 임의의 구체예에서, 상기 PEG는 분지형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 분지형 PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 분지형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 40 kDa이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 카보닐-함유 비천연 암호화 아미노산인 비천연 암호화 아미노산을 함유하고, 상기 GH는 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합되어 있으며, 상기 공유 결합은 비천연 암호화 카보닐-함유 아미노산과 수용성 중합체 예를 들어, PEG 사이의 옥심 결합이다. 몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 카보닐-함유 아미노산은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합된다. 임의의 구체예에서, 수용성 중합체는 PEG이고, 상기 PEG는 선형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 선형 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 선형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, 상기 PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 임의의 구체예에서, 상기 PEG는 분지형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 분지형 PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 분지형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 40 kDa이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 케톤 기를 포함하는 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 GH는 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합되어 있으며, 상기 공유 결합은 케톤 기 함유 비천연 암호화 아미노산과 수용성 중합체 예를 들어, PEG 사이의 옥심 결합이다. 몇몇 구체예에서, 케톤 기 함유 비천연 암호화 아미노산은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합된다. 임의의 구체예에서, 수용성 중합체는 PEG이고, 상기 PEG는 선형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 선형 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 선형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, 상기 PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 임의의 구체예에서, 상기 PEG는 분지형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 분지형 PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 분지형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 40 kDa이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 GH는 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합되어 있으며, 상기 공유 결합은 파라-아세틸페닐알라닌과 수용성 중합체 예를 들어, PEG 사이의 옥심 결합이다. 몇몇 구체예에서, 파라-아세틸페닐알라닌은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합된다. 임의의 구체예에서, 수용성 중합체는 PEG이고, 상기 PEG는 선형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 선형 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 선형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, 상기 PEG의 분자량은 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 임의의 구체예에서, 상기 PEG는 분지형 PEG이다. 이러한 구체예에서, 분지형 PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된 분지형 PEG를 포함하는 임의의 구체예에서, PEG의 분자량은 약 40 kDa이다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 2를 포함하는 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 파라-아세틸페닐알라닌과 치환되며, 이 파라-아세틸페닐알라닌은 분자량이 약 30 kDa인 선형 PEG에 옥심 결합에 의해 결합되어 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해서 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 GH 예를 들어, hGH는 하나 이상의 위치 예를 들어, 다음의 위치들에 상응하는 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다: 서열 번호 2의 1번 위치 앞(즉, N-말단부), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 번 위치(즉, 단백질의 카복실 말단부), 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103, 143 및 145번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35, 92, 143 및 145번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35, 92, 131, 134, 143 및 145 번 위치 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103 및 145번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35, 92, 143 및 145번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 치환되어 있다. PEG가 선형 PEG인 구체예에서, PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해서 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 GH 예를 들어, hGH는 하나 이상의 위치 예를 들어, 다음의 위치들에 상응하는 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다: 서열 번호 2의 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 번 위치(즉, 단백질의 카복실 말단부), 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103, 143 및 145번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 파라-아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35, 92, 143 및 145번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 파라-아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35, 92, 131, 134, 143 및 145번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 파라-아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 30, 35, 74, 92, 103 및 145번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 파라-아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35, 92, 143 및 145번 위치, 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 파라-아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG 예를 들어, 선형 PEG에 결합된 GH 예를 들어, hGH를 포함하는 호르몬 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 GH 예를 들어, hGH는 예를 들어, 서열 번호 2의 35번 위치, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들에 상응하는 위치 중 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 파라-아세틸페닐알라닌이 치환되어 있다. PEG가 선형 PEG인 구체예에서, PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 GH 예를 들어, hGH를 제공하는데, 여기서, 상기 GH 예를 들어, hGH는 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 함유하며, 상기 GH는 공유 결합에 의해 다수의 수용성 중합체 예를 들어, 다수의 PEG에 결합되어 있으며, 상기 공유 결합 중 하나 이상은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산과 수용성 중합체 예를 들어, PEG 사이의 옥심 결합이다. 상기 GH 예를 들어, hGH는 약 2∼100개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 2∼50개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 2∼25개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 2∼10개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 2∼5개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 5∼100개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 5∼50개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 5∼25개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 5∼10개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 10∼100개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 10∼50개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 10∼20개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 20∼100개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 20∼50개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG, 또는 약 50∼100개의 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합될 수 있다. 상기 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 본원에 개시된 임의의 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 암호화 아미노산은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산 즉, 카보닐-함유 비천연 암호화 아미노산 예를 들어, 케톤-함유 비천연 암호화 아미노산 예를 들어, 파라-아세틸페닐알라닌을 포함한다. 몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH는 파라-아세틸페닐알라닌을 포함한다, 몇몇 구체예에서, 상기 파라-아세틸페닐알라닌은 서열 번호 2의 35번 위치에 해당하는 위치에서 GH 예를 들어, hGH에 통합될 수 있으며, 여기서, 상기 파라-아세틸페닐알라닌은 옥심 결합에 의해 중합체 중 하나 예를 들어, PEG 중 하나에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체 예를 들어, PEG 중 하나 이상은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산과의 공유 결합에 의해 GH 예를 들어, hGH에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 상기 공유 결합은 옥심 결합이다. 몇몇 구체예에서, 다수의 수용성 중합체 예를 들어, PEG는 다수의 비천연 암호화 아미노산과의 공유 결합에 의하여 GH 예를 들어, hGH에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 공유 결합은 옥심 결합이고; 몇몇 구체예에서, 다수의 공유 결합은 옥심 결합이며; 몇몇 구체예에서, 실질적으로 모든 상기 결합은 옥심 결합이다. 다수의 수용성 중합체 예를 들어, PEG는 선형, 분지형 또는 선형과 분지형의 임의의 조합형일 수 있다. 하나 이상의 선형 PEG를 통합하는 구체예에서, 선형 PEG의 분자량은 약 0.1∼약 100 kDa, 또는 약 1∼약 60 kDa, 또는 약 20∼약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 하나 이상의 분지형 PEG를 통합하는 구체예에서, 분지형 PEG의 분자량은 약 1∼약 100 kDa, 또는 약 30∼약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 다수의 수용성 중합체 예를 들어, PEG를 사용하는 구체예는 일반적으로, 단일 PEG가 사용되는 구체예의 경우보다 분자량이 낮은 중합체를 사용할 것이라는 사실을 알게 될 것이다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 다수의 PEG의 전체 분자량은 약 0.1∼500 kDa, 또는 약 0.1∼200 kDa, 또는 약 0.1∼100 kDa, 또는 약 1∼1000 kDa, 또는 약 1∼500 kDa, 또는 약 1∼200 kDa, 또는 약 1∼100 kDa, 또는 약 10∼1000 kDa, 또는 약 10∼500 kDa, 또는 약 10∼200 kDa, 또는 약 10∼100 kDa, 또는 약 10∼50 kDa, 또는 약 20∼1000 kDa, 또는 약 20∼500 kDa, 또는 약 20∼200 kDa, 또는 약 20∼100 kDa, 또는 약 20∼80 kDa, 약 20∼60 kDa, 약 5∼100 kDa, 약 5∼50 kDa, 또는 약 5∼20 kDa이다.
인간 GH 길항제로서는 서열 번호 2의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 및 127 번 위치, 또는 1번 위치에 부가된 부분(즉, N-말단부), 또는 이 위치들의 임의의 조합 위치, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 기타 GH 서열 중 상응하는 아미노산 위치에 치환이 일어난 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 비천연 암호화 아미노산은 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드 내 소정의 위치와 치환될 수 있거나, 또는 이 위치에 통합될 수 있다. 일반적으로, 특정 비천연 암호화 아미노산은 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드와 이의 수용체의 3차원 결정 구조의 관찰 결과, 보존적 치환에 대한 선호도(즉, 아릴계 비천연 암호화 아미노산 예를 들어, p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파길티로신과 Phe, Tyr 또는 Trp의 치환), 그리고 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드에 도입하고자 하는 특이적 컨쥬게이트화 화학 과정[예를 들어, 알킨부를 보유하는 수용성 중합체와의 휘스겐 [3+2] 고리 첨가 반응, 또는 포스핀부를 통합하는 아릴 에스테르를 보유하는 수용성 중합체와의 아미드 결합 형성 과정을 수행하고자 한다면, 4-아지도 페닐알라닌을 도입하는 과정]을 바탕으로 하여 통합되도록 선택된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 인위적 아미노산[이 인위적 아미노산은 제1 반응기를 포함함]을 단백질에 통합하는 과정; 및 이 단백질과 제2 반응기를 포함하는 분자(예를 들어, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광 가교제, 방사성 핵종, 세포 독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광 친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트화제, 보조 인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적응 재료, 나노 입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 부분, 방사성 부분, 신규 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 기, 광 케이지화된 부분, 악티닌 방사선 여기 부분, 광 이성체와 부분, 바이오틴, 바이오틴 유도체, 바이오틴 유사체, 중원자 통합 부분, 화학 절단 기, 광 절단 기, 연장된 측 쇄, 탄소-결합 당, 산화 환원-활성화제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소 표지화 부분, 생물 물리학적 프로브, 인광성 기, 화학 발광성 기, 전자 조밀 기, 자성 기, 삽입 기, 발색 단, 에너지 전이제, 생물학적 활성 제제, 검출 가능한 표지, 소 분자, 양자 점, 나노 전달체, 방사성 뉴클레오티드, 방사성 전달체, 중성자 포획제 또는 상기 것들의 임의의 조합체, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질)를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제1 반응기는 상기 제2 반응기와 반응하여, [3+2] 고리 첨가 반응을 통해 인위적 아미노산에 상기 분자를 결합시킨다. 하나의 구체예에서, 상기 제1 반응기는 알키닐 또는 아지도 부분이며, 상기 제2 반응기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들어, 상기 제1 반응기는 알키닐 부(예를 들어, 인위적 아미노산인 p-프로파길옥시페닐알라닌의 경우)이며, 상기 제2 반응기는 아지도 부이다. 다른 구체예에서, 상기 제1 반응기는 아지도 부(예를 들어, 인위적 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌의 경우)이며, 상기 제2 반응기는 알키닐 부이다.
몇몇 경우, 비천연 암호화 아미노산 치환은 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드 내에서의 기타 부가, 치환 또는 결실과 함께 발생하여, GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드의 기타 생물학적 특성을 발휘시킬 것이다. 몇몇 경우, 기타 부가, 치환 또는 결실은 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드의 안정성(예를 들어, 단백 분해에 대한 저항성)을 증가시킬 수 있거나, 또는 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드와 이의 수용체 사이의 친화성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 서열 번호 2의 F1OA, F1OH, F1OI; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, I179T 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환부를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 기타 부가, 치환 또는 결실은 (예를 들어, 이.콜라이 또는 기타 숙주 세포 내에서 발현될 경우) GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드의 가용성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 부가, 치환 또는 결실은 이.콜라이 또는 기타 재조합 숙주 세포 내에서 발현된 이후 폴리펩티드 가용성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이.콜라이 또는 기타 재조합 숙주 세포 내에서 발현된 이후 폴리펩티드 가용성을 증가시는 비천연 아미노산을 통합하기 위한 다른 위치 이외의 위치는 천연 암호화 아미노산 또는 비천연 아미노산과의 치환을 위해 선택된다. 몇몇 구체예에서, GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조정하거나, 수용체의 이량체화를 조정하거나(예를 들어, 증가 또는 감소시키거나), 수용체의 이량체를 안정화하거나, 순환 반감기를 조정하거나, 방출 또는 생체 적합성을 조정하거나, 정제를 촉진하거나, 또는 구체적인 투여 경로를 개선 시키거나 바꾸는, 기타 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제시된 바와 같이 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 도입하는 이외에, 다음과 같은 치환부 중 하나 이상을 도입하여 GH 예를 들어, hGH 변이체와 이의 수용체와의 친화성을 증가시킬 수 있다: F1OA, F1OH 또는 F1OI; M14W, M14Q 또는 M14G; H18D; H21N; R167N; D171S; E174S; F176Y 및 I179T. 이와 유사하게, GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 검출(예를 들어, GFP), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 운반, 전구 약물 방출 또는 활성화, hGH 크기 감소 또는 기타 폴리펩티드의 특성을 개선 시키는, 화학 절단 서열 또는 효소 절단 서열, 단백질 분해 효소 절단 서열, 반응기, 항체-결합 도메인(예를 들어, FLAG 또는 폴리-His) 또는 기타 친화성을 바탕으로 하는 서열(예를 들어, FLAG, 폴리-His 또는 GST 등) 또는 결합 분자(예를 들어, 바이오틴)를 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산을 치환하면 GH 길항제 예를 들어, hGH 길항제를 생산하게 된다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합을 위한 대표적인 위치의 하위 세트로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: 서열 번호 2의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127 번 위치, 또는 1번 위치 앞의 부가 부, 또는 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 상응하는 아미노산 위치들, 또는 기타 GH 서열의 상응하는 아미노산 위치들. 몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH 길항제는 GH가 길항제로서 작용할 수 있도록 만드는, 1∼5(N-말단부), 6∼33 (A 나선 부), 34∼74 (A 나선 부와 B 나선 부 사이의 부위 ,즉 A-B 루프), 75∼96 (B 나선 부), 97∼105 (B 나선 부와 C 나선 부 사이의 부위 즉, B-C 루프), 106∼129 (C 나선 부), 130∼153 (C 나선 부와 D 나선 부 사이의 부위 즉, C-D 루프), 154∼183 (D 나선 부), 184∼191 (C-말단부) 부위에 하나 이상의 치환 부를 포함한다. 다른 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산의 대표적 통합 위치는 A 나선 부의 아미노 말단 부위와 C 나선 부의 일부의 내부에 존재하는 잔기 들을 포함한다. 다른 구체예에서, G120과 비천연 암호화 아미노산 예를 들어, p-아지도-L-페닐알라닌 또는 O-프로파길-L-티로신의 치환이 일어난다. 다른 구체예에서, 전술한 치환은 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드를 GH 길항제 예를 들어, hGH 길항제로 만드는 부가적 치환과 함께 일어난다. 예를 들어, 비천연 암호화 아미노산은 본원에서 동정된 위치들 중 하나에서 치환되며, 이와 동시에 G120(예를 들어, G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F 또는 G120E)에서도 치환이 일어난다. 몇몇 구체예에서, 상기 GH 길항제 예를 들어, hGH 길항제는 GH 분자 예를 들어, hGH 분자의 수용체 결합 부위에 존재하는 수용성 중합체에 결합되어 있는 비천연 암호화 아미노산을 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산과 치환된다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 GH 폴리펩티드 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 추가로 (천연-생성 아미노산과 치환될) 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 치환 부를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 다음과 같은 GH 부위들 예를 들어, hGH 부위들에 존재하는 하나 이상의 잔기들은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산으로 치환된다: 1∼5 (N-말단부); 32∼46 (A-B 루프의 N-말단 부); 97∼105 (B-C 루프); 및 132∼149 (C-D 루프); 및 184∼191 (C-말단부). 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 다음과 같은 GH 부위 예를 들어, hGH의 부위들에 존재하는 하나 이상의 잔기들은 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산으로 치환된다: 1∼5 (N-말단부), 6∼33 (A 나선 부), 34∼74 (A 나선 부와 B 나선 부 사이의 부위 즉, A-B 루프), 75∼96 (B 나선 부), 97∼105 (B 나선 부와 C 나선 부 사이의 부위 즉, B-C 루프), 106∼129 (C 나선 부), 130∼153 (C 나선 부와 D 나선 부 사이의 부위 즉, C-D 루프), 154∼183 (D 나선 부), 184∼191 (C-말단부). 몇몇 경우에 있어서, 하나 이상의 비천연 암호화 잔기들은 하나 이상의 저 분자량 선형 또는 분지형 PEG(분자량 약 5∼20 kDa 이하)와 결합하여, 단일의 고 분자량 PEG에 결합된 잔기들에 비하여 결합 친화성 및 혈청 반감기가 상당히 증가하게 된다.
몇몇 구체예에서, GH 예를 들어, hGH의 다음과 같은 잔기 들 중 2개 이하는 다음과 같은 위치에서 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산으로 치환된다: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187 번 위치. 몇몇 경우, 다음과 같은 치환 부 쌍이 형성된다: K38X* 및 K140X*; K41X* 및 K145X*; Y35X* 및 E88X*; Y35X* 및 F92X*; Y35X* 및 Y143X*; F92X* 및 Y143X*[여기서, X*는 비천연 암호화 아미노산을 나타냄]. 2개 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 바람직한 위치는 다음과 같은 잔기 들의 조합을 포함한다: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187 번 잔기. 2개 이상의 비천연 암호화 아미노산의 통합 위치로서 특히 바람직한 위치는 다음과 같은 잔기 들의 조합을 포함한다: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155 번 잔기.
GH 예를 들어, hGH 내에 존재하는 2개 이상의 비천연 암호화 아미노산의 바람직한 통합 위치는 다음과 같은 잔기 들의 조합을 포함한다: 서열 번호 2의 1번 위치앞(즉, N-말단부), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 번 잔기(즉, 단백질의 카복실 말단부) 또는 이 잔기들의 임의의 조합.
VIII. hGH 폴리펩티드 활성 및 hGH 폴리펩티드와 hGH 폴리펩티드 수용체와의 친화도 측정
hGH의 활성은 당 업계에 공지된 몇몇 기술 중 임의의 것 예를 들어, IM9 세포 상에서의 pSTAT5 검정법 또는 세포 결합 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 변형 hGH 폴리펩티드의 생물 활성을 평가하기 위하여, hGH와 이의 수용체 사이의 상호 작용을 관찰하는 검정법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 전사 군의 일원인 STAT5의 신호 전달 인자 및 활성자의 티로신 인산화를 측정하는 검정법[인간 IM-9 림프구 세포 주(ATCC, Manassas, VA) 내]이 사용될 수 있다.예를 들어, 문헌[Silva외 다수, Mol. Endocrinol. (1996) 10(5):508-518]을 참조하시오. 검정 매질[무 페놀-레드 RPMI, 1OmM Hepes, 1% 열 불활성화 숯/덱스트란 처리 FBS, 피루브산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신] 중에 있는 상기 IM-9 세포에 영양분을 공급하지 않고 밤새도록 방치한 후, 여기에 37℃에서 10분 동안 hGH 폴리펩티드를 12 군데의 시점에서 투여하여 이 세포를 자극한다. 자극된 세포를 1% 포름알데히드로 고정한 후, 1 시간 동안 얼음 상에서 90% 얼음-냉각 메탄올로 투과 처리하였다. STAT5 인산화 수준은, 실온에서 30분 동안 세포 내 염색법(1차 포스포-STAT5 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA) → PE-컨쥬게이트화 2차 항체 이용)으로 염색하여 검출하였다. Flowjo 소프트웨어(Tree Star Inc., Ashland, OR)로 분석하여 얻어진 데이터를 이용하는 FACS 어레이 상에서 시료 포착(sample acquisition)을 수행하였다. 시그마플롯(SigmaPlot)을 이용하여 평균 형광도 세기(MFI)를 단백질 농도에 대해 그래프로 도시한 투여량 반응 곡선에서 EC50 값을 얻었다.
대안적으로는, 세포주 예를 들어, 래트 성장 호르몬 수용체로 안정하게 형질 감염시킨 BAF3 내에서 BrdU를 이용하여 증식 연구도 수행할 수 있다. 혈청을 공급하지 않은 래트 성장 호르몬 수용체인 GHR과, (L43R) 발현 BAF3 세포주인 2E2-2B12-F4를 96-웰 평판 내에 5×104 세포/웰의 밀도로 도말 하였다. 12 군데의 시점에서 hGH 단백질을 세포에 첨가하여 이 세포를 활성화함과 동시에, 50 uM BrdU (Sigma, St. Louis, MO)로 표지화하였다. 배양액 중에서 48 시간 경과 한 후, 실온에서 30분 동안 100 ul의 BD 사이토픽스(cytofix)/사이토펌(cytoperm) 용액(BD Biosciences)으로 세포를 고정/투과 처리하였다. BrdU 에피토프를 발현시키기 위하여, 고정/투과 처리된 세포를 30 ug/웰의 DNase (Sigma)로 37℃에서 1 시간 동안 처리하였다. APC-컨쥬게이트화 항-BrdU 항체(BD Biosciences)로 면역 형광 염색하여 FACS 어레이 상에서 시료 분석을 할 수 있었다.
hGH 수용체는 문헌[McFarland et al, Science, 245: 494-499 (1989) 및 Leung, D.외 다수, Nature, 330:537-543 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. hGH 폴리펩티드 활성은 표준적이거나 공지된 시험관 내 또는 생체 내 검정법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, hGH의 존재 하에서 증식하는 세포 주(예를 들어, hGH 수용체 또는 락토겐 수용체를 발현하는 세포 주)는 hGH 수용체 결합을 관찰하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Clark, R.외 다수., J. Biol. Chem. 271(36):21969 (1996); Wada외 다수., Mol. Endocrinol. 12:146-156 (1998); Gout, P. W.외 다수. Cancer Res. 40, 2433-2436 (1980); WO 99/03887]을 참조하시오. 비천연 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH 폴리펩티드 또는 비-PEG화 폴리펩티드에 있어서, 호르몬과 이의 수용체 사이의 친화도는 바이아코어(BIAcore)™ 바이오센서(GE Healthcare)를 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,849,535호; Spencer, S. A.외 다수, J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988)]을 참조하시오. hGH 활성을 시험하기 위한 생체 내 동물 모델은 예를 들어, 문헌[Clark et al, J. Biol. Chem. 271(36):21969-21977 (1996)]에 개시된 것들을 포함한다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 이량체화 능력에 대한 검정법은 문헌[Cunningham, B.외 다수, Science, 254:821-825 (1991) 및 Fuh, G.외 다수, Science, 256: 1677-1680 (1992)]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 여기에 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 것이다. 검정 방법에 관한 참고 문헌 발췌는 독점적인 것은 아니며, 당 업자는 원하는 최종 결과를 확인하는데에 유용한 다른 검정법을 알고 있을 것이다.
본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 공보 2005/0170404(2005년 6월 28일 출원, 발명의 명칭 "Modified Growth Hormone Polypeptides and Their Uses,")에는, 하나 이상의 비천연 생성 아미노산, 비천연 암호화 아미노산, 직교 tRNA, 직교형 아미노 아실 tRNA 합성 효소를 통합하는데에 필요한 hGH 잔기 들과, 이 hGH를 특성 규명하는 방법에 관하여 더욱 상세히 설명되어 있다.
IX. 효능, 생체 내 작용 반감기 및 약물 동력학적 매개 변수의 측정
수용성 중합체 부분에 폴리펩티드를 컨쥬게이트화 시키거나 또는 컨쥬게이트화 시키지 않은 hGH 폴리펩티드를 구성함으로써 생물 반감기를 연장시키는 것이 본 발명의 중요한 측면이다. hGH 폴리펩티드 혈청 농도를 신속하게 감소시킴으로써, 컨쥬게이트화된 hGH 폴리펩티드 및 컨쥬게이트화되지 않은 hGH 폴리펩티드 및 이의 변이체로 처리하였을 때의 생물 반응을 평가하는 것이 중요하게 되었다. 본 발명의 컨쥬게이트화된 hGH 폴리펩티드 및 컨쥬게이트화되지 않은 hGH 폴리펩티드 및 이의 변이체의 혈청 반감기는 또한 피하 또는 정맥 내 투여 이후에 연장될 수 있다[예를 들어, ELISA 방법 또는 1차 스크리닝 검정법에 의해 측정 가능]. ELISA 또는 RIA 키트[BioSource International사 제품 (Camarillo, CA) 또는 Diagnostic Systems Laboratories 제품 (Webster, TX)]가 사용될 수 있다. 생체 내 생물 반감기의 측정은 본원에 기술된 바와 같이 수행된다.
비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 기능상 생체 내 반감기 및 효능은 문헌[Clark, R.외 다수, J. Biol Chem. 271(36): 21969-21977 (1996)]에 기술된 절차에 따라서 측정될 수 있다.
비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 약물 동력학적 매개 변수는 정상의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 수컷 래트(N = 처리군 당, 동물 5 마리) 내에서 평가될 수 있다. 동물에 25 ug/래트(정맥 내 투여) 또는 50 ug/래트(피하 투여) 씩 1회 투여하여, 예정한 시간표에 따라서 약 5∼7개의 혈액 시료를 취할 것인데, 일반적으로 수용성 중합체에 컨쥬게이트화 되지 않은 비천연 엄호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대해서는 약 6 시간에 걸쳐서, 그리고 비천연 암호화 아미노산을 포함하고 수용성 중합체에 컨쥬게이트화 된 hGH 폴리펩티드에 대해서는 약 4일에 걸쳐서 혈액 시료를 취한다. 몇몇 종류의 hGH 폴리펩티드에 대한 약물 동력학적 데이터는 널리 연구되고 있으며, 이는 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대하여 얻어진 데이터와 직접 비교될 수 있다. hGH의 연구에 관한 문헌[Mordenti J.외 다수, Pharm. Res. 8(11):1351-59 (1991)]을 참조하시오.
약물 동력학적 매개 변수는 또한 영장류 예를 들어, 사이노몰거스 원숭이(cyanomogus monkey)를 이용하여 측정될 수 있다. 통상적으로, 1회 피하 주사 또는 정맥 내 주사하고, 시간이 경과 함에 따라서 혈청 hGH 수준을 관찰한다.
본 발명에 따른 hGH 폴리펩티드의 특이 활성은 당 업계에 공지된 다양한 검정법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 따라서 얻어지고 또한 정제된 hGH 폴리펩티드 뮤테인 또는 이의 단편의 생물 활성은 본원에 개시되어 있거나 본원이 참고하고 있는 방법, 또는 당업자에게 개시되어 있는 방법에 의해서 시험될 수 있다.
X. hGH 폴리펩티드의 치료적 용도
상기 hGH 작동제 폴리펩티드는 예를 들어, 성장 지연증 및 면역성 질환을 치료하고, 심장 기능을 활성화하는데에 유용할 수 있다. 성장 지연증 개체로서는 예를 들어, 터너 증후군 개체, GH-결핍 개체(소아 포함), 성장판이 폐쇄되기 약 2∼3년 전 정상적인 성장 곡선이 지연 또는 지체되었던 소아(때로는 "정상 단신 소아(short normal children)"라고도 칭함) 및 GH에 대한 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I) 반응이 화학적으로 차단된 개체(즉, 글루코코르티코이드 처리에 의해 차단된 개체) 또는 예를 들어, GH에 대한 IGF-I의 반응성이 자연적으로 감소 된 성인 환자를 포함한다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 다음과 같은 병상을 가지는 개체들을 치료하는데에 유용할 수 있다: 소아 성장 호르몬 결핍증, 특발성 단신증, 소아기에 발병하는 성인 성장 호르몬 결핍증, 성인이 되었을 때에 발병하는 성인 성장 호르몬 결핍증, 또는 2차 성장 호르몬 결핍증. 성인이 되었을 때에 성장 호르몬 결핍증을 앓고 있다는 진단을 받은 성인은 뇌하수체에 종양이 있거나 또는 방사선에 노출되었을 수 있다. 예를 들어, 대사 증후군, 두부 손상, 비만, 골 다공증 또는 우울증과 같은 병상은 성인에 있어서 성장 호르몬 결핍증-유사 증상을 나타낼 수 있다.
작동제 hGH 변이체는 이것의 면역 기능을 증가시킴으로써[이러한 면역 기능의 증가가 항체 또는 세포를 매개로 한 것인지, 그리고 면역계가 hGH 폴리펩티드 처리된 숙주에 내재하는 것인지 또는 공여체로부터 hGH 폴리펩티드가 투여된 숙주 수용체에 이식된 것인지(예를 들어, 골수 이식)에 따라서], 포유 동물의 면역계를 자극하는 역할을 할 수 있다. "면역성 질환"으로서는, 개체 면역계의 항원에 대한 항체 또는 세포 반응이 정상 개체의 경우에 비하여 감소 된 임의의 병상 예를 들어, 약물 치료(예를 들어, 화학 요법 치료)에 의해 면역성이 떨어지는 작은 비장을 가지는 개체의 병상을 포함한다. 면역성 질환이 발병한 개체의 예로서는 예를 들어, 노인 환자, 화학 요법 또는 방사선 요법 수행중인 개체, 주요 질병으로부터 회복중인 개체, 또는 막 수술을 받으려는 개체, AIDS 환자, 선천적 및 후천적 B-세포 결핍증 환자 예를 들어, 저 감마글로불린 혈증 환자, 일반적 변형 무 감마 글로불린 혈증 환자 및 선택적 면역 글로불린 결핍증 환자[예를 들어, IgA 결핍증, 바이러스 예를 들어, (잠복 기간이 환자의 면역 반응에 걸리는 시간보다 짧은) 광견병 바이러스 감염 환자; 및 유전 질환 예를 들어, 디죠지 증후군 환자]를 포함한다.
hGH 길항제 폴리펩티드는 거인증, 말단 거대증, 당뇨병 및 당뇨병으로 인한 합병증(당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경증), 눈 혈관 질환(예를 들어, 증식성 신생 혈관 생성 관련 질환), 신장병 및 GH-반응성 악성 종양의 치료에 유용할 수 있다. 눈 혈관 질환의 예로서는 망막증(예를 들어, 미성숙 또는 겸상 적혈구 빈혈증에 의해 유발) 및 황반 변성증을 포함한다. GH-반응성 악성 종양의 예로서는, 빌름 종양, 육종(예를 들어, 골 육종), 유방암, 결장암, 전립선암 및 갑상선 암과, GH 수용체 mRNA를 발현하는 조직[즉, 태반, 흉선, 뇌, 침샘, 전립선, 골수, 주쇄 근, 기관, 척수, 망막, 림프 소절 및 버킷 림프종, 대장암, 폐암, 림프성 백혈병 및 흑색종의 조직]의 암을 포함한다.
본 발명의 GH 작동제 폴리펩티드 예를 들어, hGH 작동제 폴리펩티드는 예를 들어, 만성 신부전, 만성 신부전(CRI) 관련 성장 장애, 터너 증후군 관련 단신증, 소아기 프라더 윌리 증후군(PWS), HIV 환자의 소모성 악액질, 임신중 저체중아(SGA), 비만 및 골 다공증의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드 예를 들어, PEG화 hGH는 단백질 또는 펩티드에 적당한 임의의 통상적인 경로 예를 들어, 비 경구 예를 들어, 피하 주사 또는 정맥 내 주사를 포함하는 주사, 또는 기타 임의의 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 조성물은 다수의 경로 예를 들어, 경구, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 피하, 국소, 설하, 또는 직장 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. (변형되었거나 또는 변형되지 않은) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀을 통하여 투여될 수도 있다. 이러한 투여 경로 및 적당한 제형에 관하여는 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 예를 들어, PEG화 hGH 폴리펩티드는 단독 투여될 수 있거나 또는 기타 적당한 성분 예를 들어, 약학적 담체와 함께 투여될 수 있다.
hGH의 평균 투여량은 다양할 수 있으며, 특히 전문의의 추천 및 처방에 따라서 정해져야 한다. hGH의 정확한 양은, 치료될 병상의 정확한 유형, 치료될 환자의 병상, 그리고 조성물 중 기타 성분들과 같은 인자들에 따라서 결정되는 것이 바람직하다. 투여될 양은 hGH를 이용하는 치료법을 바탕으로 하여 당 업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방식으로 제조될 수 있다.
XI. 본 발명에 사용되는 일반적 재조합 핵산 사용 방법
본 발명의 다수의 구체예에서, 목적으로 하는 hGH 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 종종 재조합 방법을 사용하여 분리 및 클로닝된다. 이러한 구체예는 예를 들어, 단백질 발현시, 또는 hGH 폴리펩티드로부터 유래하는 변이체, 유도체, 발현 카세트 또는 기타 서열을 생산하는 때에 적용된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 이종 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 숙주 세포 내에서 hGH를 분리하는 방법 및 GH를 생산하는 방법에 관하여는 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제4,601,980호, 동 제4,604,359호, 동 제4,634,677호, 동 제4,658,021호, 동 제4,898,830호, 동 제5,424,199호, 동 제5,795,745호, 동 제5,854,026호, 동 제5,849,535호, 동 제6,004,931호, 동 제6,022,711호, 동 제 6,143,523호 및 동 제6,608,183호에 기술되어 있다.
비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하여 합성된 후, 관련 아미노산 잔기(들)을 도입(즉, 통합 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)하도록 뉴클레오티드 서열을 바꾸어 줌으로써 생산될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 종래 방법에 따라서 위치-배향 돌연 변이 유발법에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 대안적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 화학적 합성법 예를 들어, 목적 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하여 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 방법, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포 내에서 우선적으로 이용되는 코돈을 선택함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 목적 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드는 PCR, 결찰법 또는 결찰 연쇄 반응에 의하여 합성 및 조립될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 이용되어 있는 문헌[Barany외 다수., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); 미국 특허 제6,521,427호]을 참조하시오.
본 발명은 재조합 유전자학 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 기술을 이용한다. 본 발명에 사용되는 일반적 방법이 개시되어 있는 기본적인 교과서로서는 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., 1994)]을 포함한다.
분자 생물학적 기술에 관하여 개시되어 있는 일반적인 교과서로서는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook외 다수, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") 및 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel외 다수, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., 공동 출판(1999 년 증보판) ("Ausubel")]을 포함한다. 상기 교과서에는 벡터 및 프로모터를 사용하는 돌연 변이 유발법, 그리고 예를 들어, 인위적 아미노산, 직교 tRNA, 직교 tRNA 합성 효소 및 이들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 선택 코돈을 포함하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 생산과 관련된 기타 다수의 주제에 관하여 기술되어 있다.
다수의 목적 예를 들어, 신규의 합성 효소 또는 tRNA를 생산하거나, tRNA 분자를 돌연 변이시키거나, 합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 돌연 변이시키거나, tRNA 라이브러리를 생산하거나, 합성 효소 라이브러리를 생산하거나, 선택 코돈을 생산하거나, 목적 단백질 또는 폴리펩티드 내에 인위적 아미노산을 암호화하는 선택 코돈을 삽입하기 위하여, 본 발명에서는 다양한 유형의 돌연 변이 유발법이 사용된다. 이러한 돌연 변이 유발법으로서는 위치-배향 돌연 변이 유발법, 랜덤 점 돌연 변이 유발법, 상동성 재조합법, DNA 셔플링 또는 기타 반복 돌연 변이 유발법, 키메라 구성법, 우라실 함유 주형을 이용하는 돌연 변이 유발법, 올리고뉴클레오티드-배향 돌연 변이 유발법, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연 변이 유발법, 갭이 형성된 이중체 DNA를 이용하는 돌연 변이 유발법 등, 또는 이러한 방법의 임의의 조합법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적으로 적당한 방법으로서는 점 미스 매치 수선법, 수선 기능-흠결 숙주 변종을 이용하는 돌연 변이 유발법, 제한-선택법 및 제한-정제법, 결실 돌연 변이 유발법, 총 유전자 합성에 의한 돌연 변이 유발법, 이중 사슬 파괴 수선법 등을 포함한다. 돌연 변이 유발법 예를 들어, 키메라 구조물을 이용하는 돌연 변이 유발법도 본 발명에 포함된다. 하나의 구체예에서, 돌연 변이 유발법은 천연 생성 분자, 또는 변형 또는 돌연 변이된 천연 생성 분자에 관한 공지의 정보 예를 들어, 서열, 서열 비교 결과, 물리적 특성, 2차, 3차 또는 4차 구조, 결정 구조 등에 의하여 유도될 수 있다.
본원에 인용되어 있는 교과서 및 실시예에는 이러한 방법에 관하여 기술되어 있다. 부가 정보는 다음과 같은 문헌 및 이에 인용된 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다: Ling외 다수, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale외 다수, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel외 다수, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass외 다수, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzvmol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzvmol. 154:329-350 (1987); Taylor외 다수, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor외 다수, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers외 다수, 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers외 다수, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer외 다수, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer외 다수, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz외 다수, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer외 다수, Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984); Carter외 다수, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells외 다수, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar외 다수, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells외 다수, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom외 다수, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber외 다수., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); 및 I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). 전술한 방법들 중 다수의 방법에 관한 부연 설명은 문헌[Methods in Enzymology Volume 154; 다양한 돌연 변이 유발법으로 인한 문제점들을 해결하기 위한 유용한 방안에 관하여 기술됨]에서 살펴볼 수 있다..
예를 들어, 본 발명의 돌연 변이 유발법 예를 들어, 합성 효소 라이브러리를 돌연 변이시키는 방법 또는 tRNA를 변형시키는 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 예를 들어, 자동화 합성기[Needham-VanDevanter외 다수, Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)]를 이용하는, 문헌[Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, (1981)]에 기술된 고상 포스포라미다이트 트리에스테르법에 따라서 화학적으로 합성된다.
본 발명은 또한 직교 tRNA/RS 쌍을 통하여 인위적 아미노산을 생체 내 통합하는데에 사용되는 진핵 생물 숙주 세포, 진핵 생물 이외의 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이기도 하다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조물(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터) 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 유전적으로 조작(예를 들어, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염)된다. 예를 들어, 직교 tRNA, 직교 tRNA 합성 효소 및 유도체화될 단백질의 암호화 부위는 목적으로 하는 숙주 세포 내에서 작용하는 유전자 발현 제어 요소에 작동 가능하도록 결합 된다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 나출 폴리뉴클레오티드, 또는 컨쥬게이트화된 폴리뉴클레오티드의 형태를 가질 수 있다. 상기 벡터는 표준적인 방법 예를 들어, 전기 천공법(Fromm외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), 바이러스 벡터에 의한 감염법, 작은 비드 또는 소립자로 이루어진 매트릭스 내 또는 표면상에 존재하는 핵산과 소립자의 고속 충격 관통법(Klein외 다수, Nature 327, 70-73 (1987)) 등에 의해서 세포 및/또는 미생물의 내부에 도입된다.
조작된 숙주 세포는 예를 들어, 스크리닝 단계, 프로모터 활성화 또는 형질 전환체 스크리닝과 같은 조작에 적당하도록 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포는 임의로는 트랜스게닉 유기체 내에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 세포 분리 및 배양(예를 들어, 후속 핵산 분리)에 관한 기타 유용한 참고 문헌으로서는, 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Payne외 다수 (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
표적 핵산을 세포 내에 도입시키기 위한 널리 공지된 몇몇 방법이 수행될 수 있는데, 이 방법 중 임의의 방법이 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 방법으로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: DNA 함유 박테리아 원형질체와 수용체 세포를 융합하는 방법, 전기 천공법, 추진성 충격법(projectile bombardment) 및 바이러스 벡터의 감염법(이하 상세히 설명함) 등. 박테리아 세포는 본 발명의 DNA 구조물을 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는데에 사용될 수 있다. 상기 박테리아는 대수기까지 생육시키고, 이 박테리아 내에 존재하는 플라스미드는 당 업계에 공지된 다수의 방법에 의해 분리될 수 있다[예를 들어, Sambrook 참조]. 뿐만 아니라, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 키트가 시판되고 있다[예를 들어, EasyPrep™, FlexiPrep™, GE Healthcare사 제품; StrataClean™, Stratagene사 제품; 및 QIAprep™, Qiagen사 제품]. 이후, 분리 및 정제된 플라스미드는 기타 플라스미드를 생산하도록 추가로 조작되며, 이 플라스미드는 세포를 형질 감염하는데에 사용되거나, 또는 관련 벡터에 통합되어 유기체를 감염시키는데에 사용된다. 통상적인 벡터는 전사 및 번역 종결 인자, 전사 및 번역 개시 서열, 그리고 특정 표적 핵산의 발현을 조절하는데에 유용한 프로모터를 함유한다. 상기 벡터는 임의로는 일반적인 발현 카세트(하나 이상의 독립적인 종결 인자 서열과, 진핵 생물 또는 원핵 생물 내에서 카세트를 복제시킬 수 있는 서열, 또는 이 서열 둘 다를 함유하는 발현 카세트) 예를 들어, 셔틀 벡터와, 원핵 생물 계 및 진핵 생물 계 둘다에 대한 선택 마커를 포함한다. 벡터는 원핵 생물, 진핵 생물 또는 둘 다에서 복제 및 통합되기에 적당하다. 문헌[Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts외 다수, Nature, 328:731 (1987); Schneider, E.외 다수, Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger(모두 상동)]을 참조하시오. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지에 관한 카탈로그는 예를 들어, ATCC에 의해 제공되는 "박테리아 및 박테리오파지에 관한 ATCC 카탈로그(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992; Gherna et al (eds), ATCC)"에 제공되어 있다. 서열 결정 및 클로닝하는 기본적인 방법과 분자 생물학적 측면 및 이에 깔려있는 이론적 사항에 관하여는 문헌[Watson외 다수 (1992) Recombinant DNA Second Edition, Scientific American Books, NY]에서 살펴볼 수 있다. 뿐만 아니라, 본질적으로 임의의 핵산(및 실질적으로 (표준적이거나 또는 비 표준적으로) 표지화된 임의의 핵산)은 다수의 상업적 공급처 예를 들어, 미들랜드 서티파이드 리에이전트 컴퍼니(Midland Certified Reagent Company)(Midland, TX, www.mcrc.com), 더 그레이트 아메리칸 진 컴퍼니(The Great American Gene Company)(Ramona, CA, www.genco.com), 익스프레스진 인코포레이티드(ExpressGen Inc.)(Chicago, IL, www.expressgen.com), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(Alameda, CA) 등으로부터 주문 제작될 수 있거나 또는 보통으로 구입할 수 있다.
XII. 진핵 생물 이외의 세포 및 진핵 생물 세포 내에서의 발현
클로닝된 hGH 폴리뉴클레오티드를 고 수준으로 발현시키기 위해서는, 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 전사, 전사/번역 종결 인자를 유도하는 강한 프로모터와, 단백질을 암호화하는 핵산의 경우에는, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 위치를 함유하는 발현 벡터에 서브 클로닝하는 것이 일반적이다. 적당한 박테리아 프로모터에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 이에 관하여는 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수 및 Ausubel외 다수]에 기술되어 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드를 발현하기 위한 박테리아 발현 계는 예를 들어, 이.콜라이, 바실러스 속, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애어루기노사, 슈도모나스 퓨티다 및 살모넬라로부터 얻을 수 있다(Palva et al, Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)). 이러한 발현 계용 키트는 시판중에 있다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵 생물 발현 계에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있다. 직교 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성 효소가 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 발현시키는데에 사용되는 경우, 발현용 숙주 세포는, 이 숙주 세포가 직교형 구성 성분을 사용하는 능력을 바탕으로 하여 선택된다. 대표적인 숙주 세포로서는 그램-양성 박테리아(예를 들어, 비.브레비스, 비.서브틸리스 또는 스트렙토마이세스)와 그램-음성 박테리아(이.콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애어루기노사, 슈도모나스 퓨티다), 그리고 효모 및 기타 진핵 생물 세포를 포함한다. 0-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 진핵 생물 숙주 세포 또는 진핵 생물 이외의 숙주 세포는 유용할 정도로 다량으로 인위적 아미노산을 포함하는 단백질을 합성하는 능력을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 조성물은 임의로는 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상, 10 ㎎ 이상, 100 ㎎ 이상, 1 g 이상의 인위적 아미노산 포함 단백질, 또는 생체 내 단백질 생산 방법을 효과적으로 수행할 수 있는 양만큼의 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[재조합 단백질 생산 방법 및 정제 방법에 관한 상세한 설명은 본원에 제공됨]. 다른 측면에서, 본 발명의 단백질은 임의로는 예를 들어, (예를 들어, 부피 약 1nl∼약 100 ℓ 이상인) 세포 용해물, 완충액, 약학적 완충액, 또는 기타 액체 현탁액 중에, 이것들 1 ℓ당 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상, 또는 10 ㎎ 이상의 농도로(이에 한정되는 것은 아님) 조성물 중에 존재한다. 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 진핵 생물 세포 또는 진핵 생물 이외의 세포 중 단백질의 다량 생산 방법(예를 들어, 시험관 내 번역과 같은 기타 방법에서 통상적으로 사용 가능한 양보다 다량 생산하는 방법)은 본 발명의 특징을 이룬다.
본 발명의 진핵 생물 숙주 세포 또는 진핵 생물 이외의 숙주 세포는 다량의 유효량으로 인위적 아미노산을 포함하는 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 인위적 아미노산을 포함하는 단백질은 예를 들어, 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지 및/또는 완충액 중 10 ㎍/ℓ 이상, 50 ㎍/ℓ 이상, 75 ㎍/ℓ 이상, 100 ㎍/ℓ 이상, 200 ㎍/ℓ 이상, 250 ㎍/ℓ 이상, 또는 500 ㎍/ℓ 이상, 1 ㎎/ℓ 이상, 2㎎/ℓ 이상, 3 ㎎/ℓ 이상, 4 ㎎/ℓ 이상, 5 ㎎/ℓ 이상, 6 ㎎/ℓ 이상, 7 ㎎/ℓ 이상, 8 ㎎/ℓ 이상, 9 ㎎/ℓ 이상, 10 ㎎/ℓ 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ㎎/ℓ 이상, 1 g/ℓ, 5 g/ℓ, 10 g/ℓ의 농도로 생산될 수 있다.
발현 계, 배양 및 분리
hGH는 임의의 수의 적당한 발현 계 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아 내에서 발현될 수 있다. 대표적인 발현 계에 관하여는 이하에 설명하였다.
효모
본원에 사용된 "효모"란 용어는, hGH를 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 다양한 효모 중 임의의 것을 포함한다. 이러한 효모로서는 유포자 효모류(ascosporogenous yeasts)(엔도마이세탈레스; Endomycetales) 담자균 효모 및 불완전 진균(Fungi imperfecti)(블레오마이세츠; Blastomycetes) 군에 속하는 효모를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유포자 효모류는 2개의 군으로 나눈다. 즉, 스페르모프토라세아에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세아에(Saccharomycetaceae). 상기 사카로마이세타세아에는 4개의 하위 군인 쉬조사카로마이코이디아에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들어, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이디아에(Nadsonioideae), 리포마이코이디아에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이디아에(Saccharomycoideae) (예를 들어, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스 속)으로 이루어져 있다. 상기 담자균 효모로서는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 상기 불완전 진균(블레오마이세츠) 군에 속하는 효모는 2개의 군으로 나눈다. 즉, 스포로볼로마이세타세아에(Sporobolomycetaceae)(예를 들어, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세아에(Cryptococcaceae)(예를 들어, 칸디다(Candida) 속).
본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 균 종으로서는, 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 쉬조사카로마이세스 속, 한세뉼라(Hansenula) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 것들 예를 들어, 피.파스토리스(P. pastoris), 피.길레리몬디(P. guillerimondii), 에스.세레비지애(S. cerevisiae), 에스.칼스베르겐시스(S. carlsbergensis), 에스.디아스타티쿠스(S. diastaticus), 에스.더글라시(S. douglasii), 에스.클루이베리(S. kluyveri), 에스.노르벤시스(S. norbensis), 에스.오비포르미스(S. oviformis), 케이.락티스(K. lactis), 케이.프래길리스(K. fragilis), 씨.알비칸스(C. albicans), 씨.말토사(C. maltosa) 및 에이치.폴리모파(H. polymorpha)가 있다.
hGH을 발현시티는데에 적당한 효모를 선택하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 발현용 효모 숙주를 선택함에 있어서, 적당한 숙주로서는 예를 들어, 분비 능이 뛰어난 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 그리고 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 효모는 일반적으로 다수의 공급체 예를 들어, 이스트 제네틱 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center), 생물 물리학 및 의학 물리학 부, 캘리포니아 대학(Berkeley, CA) 및 미국 모식균 배양 수집소("ATCC") (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있다.
"효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되고 있는 효모들을 포함한다. 상기 용어는 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA를 수용한 원래의 효모 숙주 세포의 자손을 포함한다. 동일한 부모 세포의 자손은 우발적 또는 의도적 돌연 변이가 발생하기 때문에, 원래의 부모 세포와 형태, 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요는 없다. 부모와 충분히 유사하여 관련 특성 예를 들어, hGH 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 부모 세포의 자손은 상기 정의에 따른 숙주 세포의 자손에 포함된다.
다수의 효모 숙주에 형질 전환 시키는데에 사용되는 발현 및 형질 전환 벡터 예를 들어, 잉여 염색체 레플리콘 또는 통합 벡터가 개발되었다. 예를 들어, 에스.세레비지애(Sikorski외 다수, GENETICS (1989) 122:19; Ito외 다수, J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); 씨.알비칸스(Kurtz외 다수, MOL. CELL. BlOL. (1986) 6:142); 씨.말토사(Kunze외 다수, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); 에이치.폴리모파(Gleeson외 다수, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp외 다수, MoL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302); 케이.프래길리스(Das외 다수, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); 케이.락티스(De Louvencourt외 다수, J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg외 다수, BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); 피.길레리몬디(Kunze외 다수, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); 피.파스토리스(미국 특허 제5,324,639호; 동 제4,929,555호; 및 동 제4,837,148호; Cregg외 다수, MOL. CELL. BlOL. (1985) 5:3376); 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(Beach외 다수, NATURE (1982) 300:706); 및 와이.리폴리티카(Y. lipolytica); 에이.니듈란스(A. nidulans)(Ballance외 다수, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn외 다수, GENE (1983) 26:205-221; 및 Yelton외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); 에이.나이저(A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); 티.리시아(T. reesia)(EP 0 244 234); 및 사상 진균 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357)[상기 각 문헌은 본원에 참고용으로 인용됨]용의 발현 벡터가 개발되었다.
효모 벡터에 대한 제어 서열로서는 당 업자에게 공지된 것들이 있는데, 그 예로서는 알콜 탈수소효소(ADH)(EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코즈-6-포스페이트 이성화 효소; 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈 수소 효소(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프락토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(EP 0 329 203)와 같은 유전자로부터 얻어지는 프로모터 부위를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 산성 포스파타제를 암호화하는 효모 PHO5 유전자는 또한 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다[Miyanohara et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1]. 효모 숙주에 사용되는 기타 적당한 프로모터 서열은 3-포스포글리서레이트 키나제용 프로모터[Hitzeman외 다수, J. BlOL. CHEM. (1980) 255:12073]; 및 기타 해당 효소 예를 들어, 피루베이트 탈 탄소 효소, 트리오즈포스페이트 이성화 효소 및 포스포글루코즈 이성화 효소용 프로모터[Holland외 다수, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess외 다수, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149]를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 제어된다는 부가적인 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알콜 탈수소 효소 2; 이소시토크롬 C; 산성 포스파타제; 메탈로티오닌; 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소; 질소 대사와 관련된 분해 효소; 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 관여하는 효소용의 프로모터 부위를 포함할 수 있다. 효모 내 발현시 사용되는 적당한 벡터 및 프로모터에 관하여는 EP 0 073 657에 더욱 상세히 기술되어 있다.
효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서의 기능을 가질 수도 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS)은 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 부위와 결합하여 합성 혼성 프로모터를 형성할 수 있다. 이와 같은 혼성 프로모터의 예로서는 GAP 전사 활성화 부위에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 미국 특허 제4,880,734호 및 동 제4,876,197호를 참조하시오. 혼성 프로모터의 다른 예로서는 ADH2, GAL4, GAL1O 또는 PHO5 유전자의 조절 서열이 해당 효소 유전자인 GAP 또는 PyK와 합체되어 있는 프로모터를 포함한다. EP 0 164 556을 참조하시오. 뿐만 아니라, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합 효소와 결합하여 전사를 개시하는 능력을 가지는 비-효모 기원의 천연 생성 프로모터를 포함할 수 있다.
효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 기타 조절 요소로서는 종결 인자 예를 들어, GAPDH 또는 에놀라아제 유전자 유래 종결 인자를 포함한다[Holland외 다수, J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385]. 뿐만 아니라, 2 μ 플라스미드 기원으로부터 유래한 복제 기원은 효모용으로서 적당하다. 효모용으로 사용하기에 적당한 선택 유전자로서는 효모 플라스미드 내에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 문헌[Tschumper외 다수, GENE (1980) 10:157; Kingsman외 다수, GENE (1979) 7:141]을 참조하시오. 상기 trp1 유전자는 트립토판이 존재하는 환경 하에서 생육하는 능력이 흠결된 효모의 돌연 변이종에 선택 마커를 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결핍 효모 변종(ATCC 20,622 또는 38,626)은 Leu2 유전자를 보유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
외인성 DNA를 효모 숙주에 도입하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있으며, 통상적으로는 알칼리 양이온으로 처리된 스페로플라스트(spheroplast)의 형질 전환법 또는 원형 효모 숙주 세포의 형질 전환법을 포함한다. 예를 들어, 효모의 형질 전환법은 문헌[Hsiao외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 및 Van Solingen외 다수, J. BACT. (1977) 130:946]에 기술된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 그러나, DNA를 세포로 도입하는 기타 방법 예를 들어, 핵내 주입법, 전기 천공법 또는 원형질체 융합법도 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 이후, 효모 숙주 세포는 당 업자에게 공지된 표준적인 기술을 이용하여 배양될 수 있다.
이종 단백질을 효모 숙주 세포 내에서 발현시키는 또 다른 방법이 당 업자에게 공지되어 있다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[미국 특허 출원 제20020055169호, 미국 특허 제6,361,969호; 동 제6,312,923호; 동 제6,183,985호; 동 제6,083,723호; 동 제6,017,731호; 동 제5,674,706호; 동 제5,629,203호; 동 제5,602,034호; 동 제5,089,398호; 미국 재심사 특허 RE37,343 및 RE35,749; PCT 특허 출원 공보 WO 99/078621; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556]을 참조하시오. 또한 본원에 참고용으로 인용된 문헌[Gellissen외 다수, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(1-2):79-93; Romanos외 다수, YEAST (1992) 8(6):423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7]을 참조하시오.
효모 숙주 변종은 당 업자에게 공지된 표준적인 반회분식 발효법을 이용하여 증폭 단계시 발효조 내에서 생육 될 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 제어 방식의 차이점을 보완하도록 적응될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효에는 단일 글루코즈 공급물, 복합적 질소 공급원(예를 들어, 카세인 가수 분해물) 그리고 다수의 비타민 보충물이 필요할 수 있다. 이와는 반대로, 메탄올자화성 효모인 피.파스토리스는 글리세롤, 메탄올, 그리고 미량의 무기 공급물이 필요할 수 있으나, 최적 생육과 발현을 위해서는 간단히 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수도 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,324,639호; Elliott외 다수, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; 및 Fieschko외 다수, BIOTECH. BlOENG. (1987) 29:1113]을 참조하시오.
그러나, 이러한 발효 방법은 사용된 효모 숙주 변종과는 독립적인 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 최대로 생육시키기 위해서는 증식 단계 중 생육 제한 영양소(통상적으로는 탄소)를 발효기에 가할 수 있다. 뿐만 아니라, 발효 방법에 있어서는, 일반적으로 적당한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인 및 기타 최소 영양소(비타민, 미량 무기물 및 염 등)를 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아(Pichia) 용으로서 사용하기에 적당한 발효 배지의 예는 미국 특허 제5,324,639호 및 동 제5,231,178호(본원에 참고용으로 인용됨)에 기술되어 있다.
바큘로바이러스-감염 곤충 세포
"곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"란 용어는, 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용되는 곤충을 의미하는 것이다. 상기 용어는 형질 감염된 원래 곤충 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 부모 세포의 자손은 우발적 또는 의도적 돌연 변이가 발생하기 때문에, 원래의 부모 세포와 형태, 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요는 없다. 부모와 충분히 유사하여 관련 특성 예를 들어, hGH 폴리펩티드 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 부모 세포의 자손은 상기 정의에 따른 숙주 세포의 자손에 포함된다.
hGH 발현에 적당한 곤충 세포의 선택 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 몇몇 곤충 세포종 예를 들어, 아에데스 아에집티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 곤충 세포종 중 몇몇은 시판되고 있다. 발현용 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적당한 숙주로서는 예를 들어, 분비 능이 뛰어난 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 그리고 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 곤충은 일반적으로 다수의 공급체 예를 들어, 인섹트 제네틱 스톡 센터(Insect Genetic Stock Center), 생물 물리학 및 의학 물리학 부, 캘리포니아 대학(Berkeley, CA) 및 미국 모식균 배양 수집소("ATCC") (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있다.
일반적으로, 바큘로바이러스-감염 곤충 발현 계의 성분으로서는 운반 벡터, 일반적으로 박테리아 플라스미드(바큘로바이러스 게놈 단편과, 발현될 이종 유전자를 삽입하기 위한 편리한 제한 위치 둘 다를 함유); 운반 벡터 내에 바큘로바이러스-특이 단편에 상동성인 서열을 보유하는 야생형 바큘로바이러스(이종 유전자의 상동성 재조합에 의해 바큘로바이러스 게놈 내에 도입 가능); 및 적당한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구성하고, 세포를 형질 감염시키며, 플라크를 선택하고, 배양액 중에서 세포를 생육시키는 등에 사용되는 재료, 방법 및 기술에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 이에 관한 매뉴얼은 이러한 기술에 관하여 설명하고 있다.
이종 유전자를 운반 벡터에 삽입한 이후, 상기 벡터 및 야생형 바이러스 게놈 유전자는 벡터와 바이러스 게놈이 재조합되는 곤충 숙주 세포 내에 형질 감염된다. 팩킹된 재조합 바이러스는 발현되며, 재조합 플라크는 동정 및 정제된다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 계에 사용되는 재료 및 방법은 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA)로부터 키트의 형태로 시판되고 있다. 이와 같은 기술은 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있으며, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)]에 상세히 설명되어 있다. 뿐만 아니라, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); 및 O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]도 참조하시오.
실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 계를 이용하여 다양한 이종 단백질을 생산하는 방법에 관하여는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,368,825호; 동 제6,342,216호; 동 제6,338,846호; 동 제6,261,805호; 동 제6,245,528호, 동 제6,225,060호; 동 제6,183,987호; 동 제6,168,932호; 동 제6,126,944호; 동 제6,096,304호; 동 제6,013,433호; 동 제5,965,393호; 동 제5,939,285호; 동 제5,891,676호; 동 제5,871,986호; 동 제5,861,279호; 동 제5,858,368호; 동 제5,843,733호; 동 제5,762,939호; 동 제5,753,220호; 동 제5,605,827호; 동 제5,583,023호; 동 제5,571,709호; 동 제5,516,657호; 동 제5,290,686호; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082를 참조하시오.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 계에 유용한 벡터에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 바큘로바이러스 오토그라파캘리포니카(Autographacalifornica) 핵 다면체 바이러스(AcNPV)(헬퍼(helper)-독립성 바이러스 발현 벡터)로부터 유래하는 곤충 발현 및 운반 벡터를 포함한다. 이 계로부터 유래하는 바이러스 발현 벡터는 일반적으로 강력한 바이러스 다면체 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로 문헌[O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조하시오.
외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈 내에 삽입하기 이전에, 프로모터, 리더(원하는 경우), 목적으로 하는 암호화 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 전술한 성분들은 통상적으로 중간 대체 구조물(intermediate transplacement construct)(운반 벡터) 내에서 조립된다. 중간 중재 구조물은 종종 레플리콘 예를 들어, 숙주 예를 들어, 박테리아 내에서 안정하게 유지될 수 있는 잉여 염색체 요소(예를 들어, 플라스미드) 내에 유지된다. 상기 레플리콘은 복제 계을 가지므로, 클로닝 및 증폭에 적당한 숙주 내에 유지될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 플라스미드는 다면체 단백질(polyhedrin) 폴리아데닐화 신호[Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177]와 원핵 생물 암피실린-내성(amp) 유전자, 그리고 이.콜라이 내 선택 및 증식용 복제 기원을 포함할 수 있다.
AcNPV 내에 외래 유전자를 도입하는데에 일반적으로 사용되는 하나의 운반 벡터로서는 pAc373이 있다. 당 업자에게 공지된 다수의 기타 벡터 예를 들어, pVL985(다면체 단백질 개시 코돈이 ATG에서 ATT로 바뀜)도 디자인되었으며, 이 pVL985는 ATT로부터 32 염기쌍 하류에 BamHI 클로닝 위치가 도입되어 있다. 문헌[Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)]을 참조하시오. 기타 시판되고 있는 벡터로서는 예를 들어, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)를 포함한다.
이종 유전자를 삽입한 이후, 운반 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주에 공동 형질 감염된다. 이종 DNA를 바큘로바이러스 내 원하는 위치에 도입하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith외 다수, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31]을 참조하시오. 예를 들어, 삽입은 상동성 이중 교차 재조합에 의해 유전자 예를 들어, 다면체 단백질 유전자에서 일어날 수 있으며; 삽입은 또한 원하는 바큘로바이러스 유전자 내에 조작되어 도입된 제한 효소 위치에서도 일어날 수 있다. 문헌[Miller외 다수, BiOESSAYS (1989) 11(4):91]을 참조하시오.
형질 감염은 전기 천공법에 의해 이루어질 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501]을 참조하시오. 대안적으로, 리포좀은 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스로 곤충 세포를 형질 감염시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Liebman외 다수, BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36; Graves외 다수, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura외 다수, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt외 다수, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert외 다수, NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai외 다수, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin외 다수, NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost외 다수, GENE (1997) 190:139; Jakobsson외 다수, J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles외 다수, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376; Reverey외 다수, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10; Stanley외 다수, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk외 다수, J. VlROL. (1994) 68(2):766; 및 Peng외 다수, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274]을 참조하시오. 시판중인 리포좀으로서는 예를 들어, 셀펙틴(Cellfectin)® 및 리포펙틴(Lipofectin)® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA)을 포함한다. 뿐만 아니라, 인산칼슘 형질 감염법이 사용될 수도 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19):5667; 및 Mann and King, J. GEN. VlROL. (1989) 70:3501]을 참조하시오.
바큘로바이러스 발현 벡터는 일반적으로 바큘로바이러스 프로모터를 함유한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 중합 효소에 결합하여, 암호화 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 5' 말단에 인접하여 존재하는 전사 개시 부위를 가질 것이다. 이 전사 개시 부위는 통상적으로 RNA 중합 효소 결합 위치와 전사 개시 위치를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 또한 제2 도메인("인핸서"라 칭함)을 가질 수 있으며, 이 인핸서가 존재하면 이 프로모터는 구조 유전자와 멀리 떨어져 존재하게 된다. 뿐만 아니라, 발현은 조절되거나 또는 구성적일 수 있다.
감염 주기의 후반부에 다량으로 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로서는 바이러스 다면체 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래하는 서열[FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 및 0 155 476]과 p10 단백질을 암호화하는 유전자[Vlak외 다수, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765]를 포함한다.
새로 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스로 팩킹되고, 이후 생장한 플라크는 당 업자에게 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다. 문헌[Miller외 다수, BIOESSAYS (1989) 11(4):91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)]을 참조하시오.
재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 몇몇 곤충 세포에 감염시키기 위한 목적으로 개발되었다. 예를 들어, 재조합 바큘로바이러스는, 그 중에서도 특히 아에데스 아에집티(ATCC No. CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC No. CRL-8910), 드로소필라 멜라노개스터(ATCC No. 1963), 스포도프테라 프루기페르다 및 트리코플러시아 니에 사용하기 위한 것으로서 개발되었다. 문헌[Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell외 다수, J. VIROL. (1985) 56:153; Smith외 다수, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156]을 참조하시오. 일반적으로, 문헌[Fraser외 다수, IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225]을 참조하시오. 더욱 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 계 용으로 사용된 세포주로서는 일반적으로, Sf9 (스포도프테라 프루기페르다) (ATCC No. CRL-1711), Sf21 (스포도프테라 프루기페르다) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (트리코플러시아 니) 및 High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (트리코플러시아 니)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바큘로바이러스내 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현/발현 양자를 위한 세포 및 배양 배지는 시판되고 있으며, 세포 배양 기술에 관하여는 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있다.
이.콜라이, 슈도모나스 종 및 기타 원핵 생물
박테리아 발현 기술은 당 업자에게 공지되어 있다. 다양한 벡터가 박테리아 숙주 내에서 사용될 수 있다. 벡터는 하나의 복사체이거나, 또는 소수 또는 다수의 복사체로 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현용으로 사용될 수 있다. 벡터에 관한 다수의 문헌, 다수의 벡터의 상업적 이용 가능성, 그리고 벡터와 이 벡터의 제한 맵 그리고 특성에 관하여 기술되어 있는 매뉴얼에 관하여, 본원에서는 더 이상 논의할 필요는 없다. 널리 알려져 있는 바와 같이, 벡터는 일반적으로 선택이 가능한 마커를 포함하는데, 여기서 상기 마커는 세포 독성 제제 내성, 원 영양성 또는 면역성을 제공할 수 있다. 종종, 상이한 특성을 제공하는 다수의 마커들이 존재한다.
박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합 효소와 결합할 수 있고 암호화 서열(예를 들어, 구조 유전자)→mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 전사 개시 부위를 가질 것이다. 이러한 전사 개시 부위는 통상적으로 RNA 중합 효소 결합 위치와 전사 개시 위치를 포함한다. 박테리아 프로모터는 또한 작동자(operator)라고 불리는 제2의 도메인 즉, RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합 효소 결합 위치에 중첩되어 존재할 수 있는 도메인을 가질 수 있다. 유전자 억제자 단백질이 작동자에 결합하여 특정 유전자의 전사를 억제할 수 있을 때, 작동자는 네거티브 조절 방식(유도성)으로 전사를 가능하게 한다. 구성적 발현은 네거티브 조절 요소 예를 들어, 작동자가 존재하지 않을 때 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 프지티브 조절은, 일반적으로 유전자 활성자(activator) 단백질 결합 서열이 RNA 중합 효소 결합 서열에 인접하여(5') 존재할 경우, 이 유전자 활성자 단백질 결합 서열에 의하여 일어날 수 있다. 유전자 활성자 단백질의 예로서는, 에스케리치아 콜라이(이.콜라이) 내 lac 오페론의 전사 개시를 도와주는 대사물 활성자 단백질(CAP)이 있다[Raibaud외 다수, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]. 그러므로, 발현은 포지티브 방식이나 네거티브 방식으로 조절될 수 있으며, 또한 이에 따라서 전사가 강화 또는 감소 될 수 있는 것이다.
대사 경로 효소를 암호화하는 서열이 프로모터 서열로서 특히 유용하다. 그 예로서는 당(예를 들어, 갈락토즈, 락토즈(lac)(Chang외 다수, NATURE (1977) 198:1056) 및 말토즈) 대사 효소로부터 유래 된 프로모터 서열을 포함한다. 부가 예로서는 생합성 효소 예를 들어, 트립토판(trp) 생합성 효소로부터 유래 된 프로모터 서열을 포함한다[Goeddel외 다수, NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton외 다수, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; 미국 특허 제4,738,921호; EPO 공보 036 776 및 121 775; 본원에 참고용으로 인용됨]. g-락타마제(bla) 프로모터 계[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], 박테리오파지 람다 PL[Shimatake외 다수, NATURE (1981) 292:128] 및 T5 [미국 특허 제4,689,406호] 프로모터 계 또한 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강력한 프로모터 예를 들어, T7 프로모터를 이용하여, hGH를 높은 수준으로 유도하는 것이다. 이러한 벡터의 예에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 pET29 시리즈(Novagen)와, pPOP 벡터(WO99/05297)를 포함한다. 이러한 발현 계는 숙주 세포의 생존력 또는 성장 매개 변수를 악화시키지 않고서도 숙주 내에서 hGH를 높은 수준으로 생산한다. pET19 (Novagen)는 당 업계에 공지된 또 다른 벡터이다.
뿐만 아니라, 천연에서 생성되지 않는 합성 프로모터는 또한 박테리아 프로모터로서도 작용한다. 예를 들어, 하나의 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열은 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합하여, 합성 혼성 프로모터를 생성할 수 있다[미국 특허 제4,551,433호; 본원에 참고용으로 인용됨]. 예를 들어, tac 프로모터는 trp 프로모터와 lac 오페론 서열 둘 다를 포함하는 혼성 trp-lac 프로모터로서, lac 억제자에 의해 조절되는 프로모터이다[Amann외 다수, GENE (1983) 25:167; de Boer외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. 더욱이, 박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합 효소와 결합하여 전사를 개시하는 능력을 가지는 비-박테리아 기원의 천연 생성 프로모터를 포함할 수 있다. 비-박테리아 기원의 천연 생성 프로모터는 또한 친화 가능한 RNA 중합 효소와 커플링되어 원핵 생물 내에서 몇몇 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수도 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소/프로모터 계는 커플링 된 프로모터 계의 일례이다[Studier외 다수, J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor외 다수, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074]. 뿐만 아니라, 혼성 프로모터는 또한 박테리오파지 프로모터와 이.콜라이 작동자 부위로 이루어질 수도 있다[EPO 공보 267 851].
프로모터 서열을 작동시키는 것 이외에, 효과적인 리보좀 결합 위치는 또한 원핵 생물 내에서 외래 유전자를 발현시키는데에도 유용하다. 이.콜라이 내에 존재하는 리보좀 결합 위치를 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열이라고 부르며, 이 위치는 개시 코돈(ATG)과 이 개시 코돈의 3∼11 뉴클레오티드 상류에 위치하는, 길이 3∼9 뉴클레오티드인 서열을 포함한다[Shine외 다수, NATURE (1975) 254:34]. 상기 SD 서열은, 이.콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이에 염기쌍을 형성함으로써, mRNA가 리보좀에 결합하는 것을 촉진하는 것으로 생각된다[Steitz외 다수 "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. 약한 리보좀-결합 위치를 갖는 진핵 생물 유전자 및 원핵 생물 유전자의 발현도 촉진하는 것으로 생각된다[Sambrook외 다수 "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].
"박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"라는 용어는, 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되고 있는 박테리아를 포함한다. 상기 용어는 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA가 형질 감염된 원래의 박테리아 숙주 세포의 자손을 포함한다. 동일한 부모 세포의 자손은 우발적 또는 의도적 돌연 변이가 발생하기 때문에, 원래의 부모 세포와 형태, 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요는 없다. 부모와 충분히 유사하여 관련 특성 예를 들어, hGH 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 부모 세포의 자손은 상기 정의에 따른 숙주 세포의 자손에 포함된다.
hGH의 발현에 적당한 숙주 박테리아의 선택법은 당 업자에게 공지되어 있다. 발현용 박테리아 숙주를 선택함에 있어서, 적당한 숙주는 특히, 우수한 봉입체(inclusion body) 형성 능 및 낮은 단백 분해 활성을 나타내고, 전체적으로 강건한 것들을 포함할 수 있다. 박테리아 숙주는 일반적으로 다양한 공급원 예를 들어, 박테리아 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center), 생물 물리학 및 의학 물리학 부, 캘리포니아 대학(Berkeley, CA) 및 미국 모식균 배양 수집소("ATCC") (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있다. 산업적/제약학적 발효는 일반적으로 K 변종(예를 들어, W3110)으로부터 유래 된 박테리아 또는 B 변종(예를 들어, BL21)로부터 유래 된 박테리아를 이용한다. 이들 변종은 성장 매개 변수가 잘 알려져 있으며, 강건하기 때문에 특히 유용하다. 뿐만 아니라, 이들 변종은 비-병원성으로서, 안전 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 하나의 구체예에서, 상기 이.콜라이 숙주는 DH10B의 변종 예를 들어, DH10B(fis)이다. 적당한 이.콜라이 숙주의 기타 예로서는 BL21, DH10B 변종 또는 이들의 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 구체예에서, 상기 이.콜라이 숙주는 W3110 변종이다. 재조합 숙주 세포 변종은 원하는 특성을 최적화하도록 유전자 돌연 변이를 통하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 변종은 유전적으로 변형되어 대사상 중요한 유전자 예를 들어, 탄소 공급원 대사, 아미노산 대사 또는 프로테아제 생산에 관여하는 유전자의 발현을 조정할 수 있다. 이러한 유전자는 목적 숙주 변종 내에서 발현을 감소, 증가, 녹아웃(knock-out) 또는 녹인(knock-in)시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 변종 W3110은 아라비노즈 대사에 관여하는 하나 이상의 유전자 예를 들어, araB 유전자가 유전적으로 돌연 변이되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 변종은 기타 유전자를 유전적으로 돌연 변이시키거나 또는 녹아웃시키도록 변형될 수 있다. 유전자를 돌연 변이시키거나 또는 녹아웃시키기 위한 방법에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있다. 변종은 또한 돌연 변이되어, 전장 hGH의 생산을 증가시키고/증가시키거나 프로테아제에 대한 외인성 화학 억제제를 첨가할 필요성을 최소화시키도록 내인성 단백질 분해 효소 활성을 조정할 수도 있다. 기타 숙주 세포 변종으로서는 BL21을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 관한 다른 구체예에서, 이.콜라이 숙주는 프로테아제(-) 변종으로서 예를 들어, OMP- 및 LON-이 있다. 숙주 세포 변종은 슈도모나스 속에 속하는 종들 예를 들어, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애어루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 슈도모나스 퓨티다 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 슈도모나스 플루오레센스 바이오바 1(MB101)은 재조합체 생산에 유용한 것으로 알려져 있으며, 치료용 단백질 생산 방법에 유용하다. 슈도모나스 발현 계의 예로서는, 다우 케미칼 컴파니(The Dow Chemical Company)(Midland, MI, www.dow.com)로부터 시판되고 있는 발현 계(숙주 변종)을 포함한다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제4,755,465호 및 동 제4,859,600호에는, hGH 생산용 숙주 세포로서 슈도모나스 변종을 사용하는 것에 관하여 기술되어 있다.
일단, 재조합 숙주 세포 변종이 확립되면(즉, 발현 구조물이 숙주 세포 내에 도입되고, 적당한 발현 구조물을 갖는 숙주 세포가 분리되면), 재조합 숙주 세포 변종은 hGH 생산에 적당한 조건 하에 배양된다. 당 업자에게 명백할 수 있듯이, 재조합 숙주 세포 변종의 배양 방법은 사용된 발현 구조물의 성질과 숙주 세포의 특성에 따라서 달라질 것이다. 재조합 숙주 변종은 보통 당 업자에게 공지된 방법을 이용하여 배양된다. 제조합 숙주 세포는 통상적으로 동화 가능한 탄소 공급원, 질소 및 무기 염을 함유하고, 임의로는 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 기타 당 업자에게 공지된 단백질 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 최적의 생장을 위한 배지 또는 공급액의 조성 및/또는 영양소 요구량은, 재조합 숙주 세포에 따라서 다를 수 있으며/다를 수 있거나, 제조 규모(즉, 소규모인가 아니면 대규모인가)에 따라서도 달라질 수 있다. 예를 들어, 필수 미량 금속 또는 비타민은 성장 조건이 변화하고/변화하거나 대안적 숙주 세포가 이용됨에 따라서 바뀔 수 있다. hGH 폴리펩티드의 생산을 최적화하기 위해서, 유도에 적당한 조건은 사용된 재조합 숙주 세포, 발현 구조물 및/또는 변형 예를 들어, 숙주 세포에 가하여진 돌연 변이 예를 들어, 아라비노즈 유도 수준의 변화에 따라서 바뀔 수 있다. 발효시 아라비노즈 수준은 약 0.0001∼약 0.1%, 예를 들어, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.0095%, 0.009%, 0.0085%, 0.008%, 0.0075%, 0.007%, 0.0065%, 0.006%, 0.0055%, 0.005%, 0.0045%, 0.004%, 0.0035%, 0.003%, 0.0025%, 0.002%, 0.0015%, 0.001%, 0.00095%, 0.0009%, 0.00085%, 0.0008%, 0.00075%, 0.0007%, 0.00065%, 0.0006%, 0.00055%, 0.0005%, 0.00045%, 0.0004%, 0.00035%, 0.0003%, 0.00025%, 0.0002%, 0.00015%, 0.0001% 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 아라비노즈 수준은 0.0005∼0.05%이다. 몇몇 구체예에서, 상기 아라비노즈 수준은 0.001∼0.02%이다. 수집을 위해 변형을 가하여 세포 밀도를 더욱 높게 만들 수도 있으며; 그러한 경우 제2 공급물도 첨가할 수 있다. 숙주 세포 배양을 위한 액체 배지는 임의로, 원하지 않는 미생물의 생장을 막기 위한 항생제 또는 항진균제 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 화합물 예를 들어, 항생제를 함유할 수도 있다. 재조합 숙주 세포는, 세포를 수집하거나(변이 hGH가 세포 내에 축적될 경우) 또는 회분식 또는 연속식으로 배양 상청액을 수집하는, 회분 식 또는 연속식으로 배양될 수 있다. 원핵 생물 숙주 세포 내에서의 생산에 있어서는, 회분식 배양 및 세포 수집 방식이 바람직하다.
억제를 조정하거나, 억제를 연속적으로 유지시키거나 또는 억제를 유도할 수도 있다. 당 업자는 비천연 암호화 아미노산이, 세포 생장 중 상이한 여러 시점에서 세포 배양액에 첨가될 수 있거나, 또는 세포가 생장하는 동안 내내 배양액 중에 존재하도록 만들 수 있다는 사실을 용이하게 파악할 수 있다. 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 hGH에 통합시키기 위해서는, 숙주 세포에 의해 hGH 발현이 유도되기 이전에, 유도되는 때에 또는 유도된 이후에, 배양액에 상기 비천연 암호화 아미노산을 첨가할 수 있다. 하나의 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 hGH 발현이 유도되기 이전에 첨가된다. 하나의 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 유도가 일어나기 약 1 시간 전에 첨가된다. 다른 구체예에서, 비천연 암호화 아미노산은 세포가 생장하는 동안 내내 존재한다.
hGH(가용성이든, 분비형이든, 또는 불용성이든)를 발현하는 재조합 숙주 세포는 다양한 배양액 부피로 생육될 수 있다. 본 발명의 방법은 작은 실험실 규모의 부피뿐만 아니라, 거대한 상업적 규모의 부피로서 적당하다. 본원에 개시된 본 발명의 방법은 보다 큰 배양 부피로 규모를 조정할 수 있다는 사실을 당 업자는 용이하게 파악할 수 있다. 거대 규모의 상업용 배양 부피는 여러 가지일 수 있는데, 예를 들어, 1 리터 이상∼수백 리터 이상, 수천 리터 이상, 5000 리터, 10,000 리터, 20,000 리터, 30,000 리터, 40,000 리터, 50,000 리터, 100,000 리터까지, 또는 그 이상일 수 있다. 거대 규모의 부피로 생산함에 있어서는, 전체 공정 중 몇몇 단계는 수정하여야 할 것이라는 사실을 당 업자는 용이하게 알 수 있다.
본 발명의 hGH는 보통 재조합 계 내에서 발현된 이루에 정제된다. hGH는 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 박테리아 숙주 세포 내에서 생산되는 hGH는 가용성이 거의 없거나 또는 불용성(봉입체 형)이다. 불용성 단백질일 경우, 단백질은 숙주 세포 용해물로부터 원심 분리에 의해 수집될 수 있으며, 세포를 추가로 균질화 할 수도 있다. 가용성이 거의 없는 단백질의 경우, 화합물 예를 들어, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 첨가하면 부분적으로 가용성인 단백질을 침전시킬 수 있다. 이후 침전된 단백질은 원심 분리에 의해 편리하게 수집될 수 있다. 재조합 숙주 세포는 분쇄 또는 균질화되어 당 업자에게 공지된 다수의 방법을 이용하여 세포 내에서 봉입체를 방출하도록 만들 수 있다. 숙주 세포 분쇄 또는 균질화는 널리 공지된 기술 예를 들어, 효소 세포 분쇄, 초음파 처리, 다운스 균질화 또는 고압 방출 분쇄 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 관한 하나의 구체예에서, 고압 방출 기술은 hGH의 봉입체를 방출시키기 위해 이.콜라이 숙주 세포를 파괴하는데에 사용된다.
이후 불용성 또는 침전된 hGH는 당 업계에 공지된 다수의 적당한 용해제 중 임의의 것을 이용하여 용해될 수 있다. hGH는 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드를 이용하여 용해될 수 있다. 용해된 hGH의 부피는 최소화되어, 관리가 용이한 회분 크기를 갖는 다량의 회분을 생산할 수 있어야 한다. 이러한 요소는 재조합 숙주가 부피 수천 리터인 회분 내에서 생장할 수 있는, 상업용인 거대 규모로 맞추는데에 중요할 수 있다. 뿐만 아니라, hGH를 거대 규모의 상업용으로(특히, 인간의 의약용으로) 생산하는 경우, 기계와 용기, 또는 단백질 생산물 자체에 손상을 줄 수 있는 강력한 화학 물질은 가능한 한 사용하지 말아야 한다. 본 발명의 방법에 있어서, hGH 봉입체를 용해하기 위해서는 강력한 변성제인 구아니딘 하이드로클로라이드 대신에 보다 약한 변성제인 우레아를 사용할 수도 있는 것으로 파악된다. 우레아를 사용하면 hGH의 제조 및 정제 공정에 사용되는 스테인레스 스틸 장치에 손상을 줄 위험성이 상당히 줄어 듦과 동시에, hGH 봉입체도 효율적으로 용해할 수 있다.
가용성 hGH 단백질의 경우, hGH는 세포질 주변 공간이나 배양 배지 속으로 분비될 수 있다. 뿐만 아니라, 가용성 hGH는 숙주 세포의 세포질에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 이전에 가용성 hGH를 농축하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 hGH를 농축시키기 위해서는 당 업자에게 공지된 표준적인 기술이 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 당 업자에게 공지된 표준적인 기술은 숙주 세포를 파괴하고 이 숙주 세포의 세포질 또는 세포질 주변 공간으로부터 가용성 hGH를 방출시키는데에 사용될 수 있다.
hGH가 융합 단백질로서 생산될 때, 상기 융합 서열은 제거될 수 있다. 효소적 절단 또는 화학적 절단에 의해 융합 서열을 제거할 수 있다. 융합 서열을 효소적으로 제거하는 것은 당 업자에게 공지된 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 융합 서열을 제거하기 위한 효소의 선택은 융합체의 성질에 의해 결정될 것이며, 반응 조건은 당 업자가 잘 알고 있을 효소를 선택함으로써 특정될 것이다. 화학적 절단은 당 업자에게 공지된 시약 예를 들어, 브롬화시아노겐, TEV 프로테아제 및 기타 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 절단된 hGH는 당 업자에게 공지된 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제될 수 있다. 그러한 방법은 당 업자가 잘 알고 있을 융합 서열 및 hGH의 본질과 특성에 따라서 결정될 것이다. 정제 방법으로서는 크기별 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography), 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 상기 방법들의 임의의 조합법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
hGH는 또한 단백질 용액으로부터 DNA를 제거하기 위해 정제될 수도 있다. DNA는 당 업계에 공지된 임의의 방법 예를 들어, 침전법 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으나, 핵산 침전제 예를 들어, 황산프로타민을 사용하는 침전법에 의해서도 제거될 수 있다. hGH는 널리 공지된 표준적인 방법 예를 들어, 원심 분리 또는 여과에 의해서도 침전된 DNA로부터 분리될 수 있다. 숙주 핵산 분자를 제거하는 것은 hGH가 인간을 치료하는데에 사용되는 경우에 중요한 요인이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용 가능한 수준으로 감소시킨다.
소규모 또는 대규모 발효 방법은 또한 단백질 발현 계 예를 들어, 발효조, 진탕 플라스크, 유동층 생물 반응기, 중공 섬유 생물 반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물 반응기 시스템에서도 실행될 수 있다. 이러한 방법들은 각각 회분식, 반회분식 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다.
본 발명의 인간 hGH 폴리펩티드는 일반적으로 당 업계의 표준적인 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물은 원심 분리 또는 여과되어, 이로부터 세포 파편을 제거할 수 있다. 상청액은 원하는 부피로 농축 또는 희석되거나, 또는 적당한 완충액으로 다이아필터링(diafiltering)된 후, 추가 정제를 위해 컨디셔닝(conditioning)될 수도 있다. hGH 폴리펩티드의 정제는 원형 hGH 폴리펩티드로부터 탈아민화 형 및 절단형 hGH 폴리펩티드 변이체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
다음과 같은 대표적인 방법들 중 임의의 방법이 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 정제하는데에 사용될 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온-교환 크로마토그래피 또는 양이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, DEAE SEPHAROSE 사용); 실리카 상 크로마토그래피; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 역상 HPLC; 겔 여과법(예를 들어, SEPHADEX G-75 사용); 소수성 상호 작용 크로마토그래피; 크기별 배제 크로마토그래피; 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외 여과/다이아필터링; 에탄올 침전법; 황산 암모늄 침전법; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피; 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전 초법), 분별 용해도(예를 들어, 황산 암모늄 침전법), SDS-PAGE 또는 추출.
본 발명의 단백질 예를 들어, 인위적 아미노산을 포함하는 단백질, 인위적 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 인위적 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등은 당 업자에게 공지되어 널리 사용되고 있는 표준적인 방법에 따라서, 부분적으로 또는 실질적으로 균질화되어 정제될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 당 업자에게 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법 예를 들어, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 또는 염기 추출법, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기 영동법 등에 의해 회수 및 정제될 수 있다. 단백질 리폴딩 단계는 원하는 바에 따라서, 올바르게 폴딩된 성숙한 단백질을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 기타 적당한 방법은 고순도이어야 하는 마지막 정제 단계에서 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 인위적 아미노산에 대해 생성된 항체(또는 인위적 아미노산을 포함하는 단백질)가 정제 시약 예를 들어, 하나 이상의 인위적 아미노산(들)을 포함하는 단백질의 친화성을 바탕으로 하는 정제 시약으로 사용된다. 원하는 바에 따라서 일단 부분적으로 또는 균질하게 정제되면, 폴리펩티드는 다양한 용도 예를 들어, 검정용 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구용 시약 및/또는 항체 생산용 면역원으로서 사용되기도 한다.
본원에 인용된 기타 참고 문헌 이외에, 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당 업자에게 알려져 있다[예를 들어, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymologv Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag외 다수 (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; 및 Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; 및 이 문헌에 인용된 문헌 참조].
진핵 생물 숙주 세포 또는 진핵 생물 이외의 숙주 세포 내에서 인위적 아미노산을 포함하는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 생산함에 있어서 한 가지 이점은, 단백질 또는 폴리펩티드는 통상적으로 그것이 원래 가졌던 형태로 폴딩 될 것이라는 점이다. 그러나, 본 발명의 임의의 구체예에서, 당 업자는, 합성, 발현 및/또는 정제 이후의 단백질은 관련 폴리펩티드의 목적으로 하는 형태와 상이한 형태를 가질 수 있다는 사실을 알 것이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 발현된 단백질은 임의로는 변성된 후 재변성된다. 이러한 과정은 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 샤페로닌(chaperonin)을 목적 단백질 또는 폴리펩티드에 가하거나, 카오트로픽 제제(chaotropic agent) 예를 들어, 구아니딘 HCl 중에 단백질을 용해시키거나, 또는 단백질 이 황화물 이성체화 효소를 이용하여 진행된다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 재-폴딩시켜 바람직한 형태를 취하게 만드는 것이 때로는 바람직할 수도 있다. 예를 들어, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌이 목적으로 하는 번역 산물에 가하여질 수 있다. 단백질을 환원, 변성 및 재변성하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있다[Debinski외 다수. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; 및 Buchner외 다수., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270]. 예를 들어, 데빈스키(Debinski) 외 다수의 문헌에는 구아니딘-DTE 중 봉입체 단백질의 변성 및 환원에 관하여 기술되어 있다. 단백질은 예를 들어, 산화 글루타치온 및 L-아르기닌을 함유하는 산화 환원 완충액 중에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 흘러 들어가거나 또는 이동하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 기타 발현 산물과 접촉할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
hGH의 원핵 생물 내 생산의 경우, 생산된 hGH는 미스 폴딩되어 생물 활성이 흠결 또는 감소할 수도 있다. 단백질의 생물 활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 미스 폴딩된 hGH는 예를 들어, 하나 이상의 카오트로픽 제제(예를 들어, 우레아 및/또는 구아니딘)과, 이황화 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캡토에탄올, 2-ME)를 이용하여, 폴리펩티드 사슬을 용해(hGH가 불용성인 경우), 언폴딩 및 환원시켜 리폴딩 할 수 있다. 카오트로프(chaotrope)의 농도가 적당할 때, 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하면, 이황화 결합이 재형성될 수 있다. hGH는 당 업계에 공지된 표준적인 방법 예를 들어, 미국 특허 제4,511,502호, 동 제4,511,503호 및 동 제4,512,922호에 개시된 방법을 이용하여 리폴딩될 수 있다.
리폴딩 후, hGH는 추가로 정제될 수 있다. hGH는 당 업자에게 공지된 다양한 기술 예를들어, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 이들 기술 중 임의의 기술을 조합 사용하여 정제될 수 있다. 추가의 정제 과정은 정제된 단백질을 건조 또는 침전시키는 단계를 포함할 수도 있다.
정제 이후, hGH는 당 업계에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법 예를 들어, 한외 여과법, 다이아필터링 및 투석에 의해 상이한 완충액으로 교환되고/교환되거나, 농축될 수 있다. 단일의 정제 단백질로서 제공되는 hGH는 응집 및 침전될 수도 있다. 완충액 교환 또는 폴리펩티드 농축시 사용되는 다양한 물질들에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있다.
정제된 hGH는 순도가 90% 이상[역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC, 또는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, SDS-PAGE로 측정], 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다. hGH 순도에 관한 정확한 수치와는 상관없이, hGH는 약품으로서 사용되기에 충분한 순도를 가지거나, 또는 추가의 공정 예를 들어, 수용성 중합체 예를 들어, PEG와의 컨쥬게이트화와 같은 공정을 수행하기에 충분히 순수하다.
임의의 hGH 분자는 기타 활성 성분 또는 단백질(부형제, 담체, 안정화제 및 혈청 알부민 등)의 부재 하에 치료제로서 사용될 수 있거나, 또는 다른 단백질 또는 중합체와 복합체를 형성할 수 있다.
XIII. 정제 방법
다양한 분리 단계들 중 임의의 단계는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 팽창층 흡착(expanded bed adsorption), 또는 이들 방법의 임의의 조합법 및/또는 이들 방법을 (임의의 적당한 순서로) 반복 수행하여 얻어진 임의의 hGH 혼합물 또는 hGH를 포함하는, 세포 용해물, 추출물, 배양 배지, 봉입체, 숙주 세포의 세포질 주변 공간, 숙주 세포의 세포질 또는 기타 물질을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에 개시된 기술을 수행하는데에 사용되는 장치 및 기타 필요한 물질들은 시판중에 있다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록계 및 전체 시스템은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems; Foster City, CA), 바이오-래드 래보레토리즈 인코포레이션(Bio-Rad Laboratories, Inc.; Hercules, CA) 및 GE 헬스케어 인코포레이션(GE Healthcare, Inc.; Piscataway, NJ)로부터 구입할 수 있다. 크로마토그래피에 사용되는 재료 예를 들어, 교환 기질 재료, 배지 및 완충액도 상기 회사들로부터 구입할 수 있다.
본원에 기술된 컬럼 크로마토그래피 방법 중 평형 처리 단계 및 기타 단계 예를 들어, 세척 및 용리 단계는 특화된 장치 예를 들어, 펌프를 이용하여 보다 신속하게 진행될 수 있다. 시판중인 펌프로서는 힐로드(HILOAD)® 펌프 P-50, 정량 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901 및 펌프 P-903 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
분획 수집기의 예로서는 레디프랙(RediFrac) 분획 수집기, FRAC-100 및 FRAC-200 분획 수집기와 슈퍼프랙(SUPERFRAC)® 분획 수집기(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 포함한다. 혼합기는 또한 pH 및 선형 농도 구배를 형성하는데에 사용될 수도 있다. 시판중인 혼합기로서는 구배 혼합기(Gradient Mixer) GM-1과 인-라인 혼합기(In-Line Mixers; GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 포함한다.
크로마토그래피 과정은 임의의 시판 모니터로 모니터링될 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도율과 같은 정보를 수집하는데에 사용될 수 있다. 검출기의 예로서는 모니터 UV-1, 유비코드(UVICORD)® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 전도율 모니터(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 포함한다. 실제로, 전체 시스템 예를 들어, 다양한 AKTA® 시스템(GE Healthcare; Piscataway, NJ)이 시판중에 있다.
본원에 언급된 바와 같이, 제1 hGH 혼합물의 pH는 임의의 후속 분리 단계를 수행하기 이전에 조정할 수 있다. 뿐만 아니라, 제1 hGH 혼합물 또는 임의의 후속 혼합물은 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 농축될 수 있다. 뿐만 아니라, 제1 hGH 혼합물 또는 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용리 완충액은 당 업자에게 공지된 기술을 이용하여 그 다음 분리 단계에 사용하기에 적당한 완충액으로 교환될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
하나의 구체예에서, 그리고 임의의 부가 단계에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 제1 hGH 혼합물 상에서 수행될 수 있다. 문헌[ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, GE Healthcare (Piscataway, NJ)]을 참조하시오. 시판중인 이온 교환 컬럼으로서는 HITRAP®, HIPREP® 및 HILOAD® 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 포함한다. 이러한 컬럼은 강력한 음이온 교환 수지 예를 들어, Q 세파로즈® 패스트 플로우(Q SEPHAROSE® Fast Flow), Q 세파로즈® 하이 퍼포먼스(Q SEPHAROSE® High Performance) 및 Q 세파로즈® XL(Q SEPHAROSE® XL); 강력한 양이온 교환 수지 예를 들어, SP 세파로즈® 하이 퍼포먼스(SP SEPHAROSE® High Performance), SP 세파로즈® 패스트 플로우(SP SEPHAROSE® Fast Flow) 및 SP 세파로즈® XL(SP SEPHAROSE® XL); 약한 음이온 교환 수지 예를 들어, DEAE 세파로즈® 패스트 플로우(DEAE SEPHAROSE® Fast Flow); 및 약한 양이온 교환 수지 예를 들어, CM 세파로즈® 패스트 플로우(CM SEPHAROSE® Fast Flow; GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용한다. 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 정제 과정 중 임의의 단계에서 hGH로써 수행하여, 실질적으로 정제된 hGH를 분리해 낼 수 있다. 공급원 30 Q(Source 3OQ) 및 공급원 30S(Source 3OS)는 이온 교환 매질이다(GE Healthcare).
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적당한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스로서는 섬유 상, 다공성, 비-다공성, 미소 과립형, 비드 형 또는 가교 양이온 교환 매트릭스 재료를 포함한다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 재료로서는 셀룰로즈, 아가로즈, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르 또는 이들 재료 중 임의의 것의 복합 재료를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
양이온 교환 매트릭스는 강력한 양이온 교환 수지 및 약한 양이온 교환 수지를 포함하는 임의의 적당한 양이온 교환 수지일 수 있다. 강력한 양이온 교환 수지는 광범위한 pH에서 이온화된 채로 존재할 수 있으며, 또한 광범위한 pH에서 hGH와 결합할 수 있다. 그러나, 약한 양이온 교환 수지는 pH에 따라서 이온화될 수도 있고 이온화되지 않을 수도 있다. 예를 들어, 약한 양이온 교환 수지는 pH가 약 4 또는 5 이하일 때 하전되지 않을 수 있다. 강력한 양이온 교환 수지의 적당한 예로서는 하전된 작용기 예를 들어, 설포프로필(SP), 메틸 설포네이트(S) 또는 설포에틸(SE) 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 양이온 교환 매트릭스는 pH 약 2.5∼약 6.0에서 hGH와 결합하는 강력한 양이온 교환 수지일 수 있다. 대안적으로, 강력한 양이온 교환 수지는 pH 약 2.5∼약 5.5에서 hGH와 결합할 수 있다. 상기 양이온 교환 매트릭스는 pH 약 3.0에서 hGH와 결합하는 강력한 양이온 교환 수지일 수 있다. 대안적으로, 상기 양이온 교환 매트릭스는 강력한 양이온 교환 수지일 수 있으며, pH 약 6.0∼약 8.0에서 hGH와 결합할 수 있다. 상기 양이온 교환 매트릭스는 pH 약 8.0∼약 12.5에서 hGH와 결합하는 강력한 양이온 교환 수지일 수 있다. 대안적으로, 상기 강력한 양이온 교환 수지는 pH 약 8.0∼약 12.0에서 hGH와 결합할 수 있다.
hGH를 로딩하기 이전에, 양이온 교환 매트릭스는 예를 들어, 수 컬럼 부피의 희석액, 약산 예를 들어, 4 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)으로 평형 처리될 수 있다. 평형 처리 이후, hGH를 첨가하고, 컬럼을 수 회 세척한 다음, 실질적으로 정제된 hGH를 용리시킬 수 있으며, 이 경우에도 약산성 용액 예를 들어, 약한 아세트산 용액 또는 인산 용액을 사용한다. 예를 들어, 약 2∼4 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH3)을 사용하여 이 컬럼을 세척할 수 있다. 예를 들어, 2∼4 컬럼 부피의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5) 또는 0.05M 아세트산 나트륨(0.1M 염화나트륨과 혼합)(pH 5.5)을 사용하여 추가로 세척할 수도 있다. 대안적으로, 당 업계에 공지된 방법을 이용하여, 양이온 교환 매트릭스를 평형 처리시킬 수 있다[수 컬럼 부피의 희석액 및 약염기 이용].
대안적으로, 양이온 교환 매트릭스와 완충액[매트릭스로부터 hGH를 치환하기에 충분히 낮은 pH 또는 이온 세기를 갖는 완충액]을 접촉시킴으로써 실질적으로 정제된 hGH를 용리시킬 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 2.5∼약 6.0일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 용리 완충액의 pH는 약 2.5∼약 5.5, 약 2.5∼약 5.0일 수 있다. 상기 용리 완충액의 pH는 약 3.0일 수 있다. 뿐만 아니라, 용리 완충액의 양은 매우 다양할 수 있으며, 일반적으로는 약 2∼약 10 컬럼 부피일 것이다. 더욱이, 당 업자에게 공지된 적당한 완충액 예를 들어, 시트르산염, 인산염, 포름산염, HEPES 및 MES 완충액(농도 = 약 5∼약 100 mM 이상)이 사용될 수 있다.
양이온 교환 수지 매트릭스에 hGH을 흡착한 이후에, 실질적으로 정제된 hGH는 용리될 수 있는데, 이때에는 매트릭스로부터 hGH를 치환하기에 충분히 높은 pH 또는 이온 세기를 갖는 완충액과 매트릭스를 접촉시킨다. 용리 완충액의 pH는 약 8.0∼약 12.5일 수 있다. 더욱 구체적으로, 용리 완충액의 pH는 약 8.0∼약 12.0일 수 있다. 실질적으로 정제된 hGH의 고 pH 용리에 사용하기에 적당한 완충액으로서는, 시트르산염, 인산염, 포름산염, 아세트산염, HEPES 및 MES 완충액(농도 = 약 5∼약 100 mM 이상)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 0.1 M 붕산 칼륨, 0.6 M 염화칼륨, 0.1 mM EDTA(pH 8.7)을 포함하는 완충액이 사용될 수 있다. 실질적으로 정제된 hGH는 또한 표준적인 완충액 예를 들어, 비신(bicine) 완충액[약 50∼100 mM 비신, 약 75 mM 비신; 25∼약 100 mM 염화 나트륨, 특히, 약 50 mM 염화나트륨 및 약 0.05∼약 0.5 EDTA, 더욱 구체적으로, 약 0.1 mM EDTA(pH 7.5) 포함]을 이용하여 용리될 수도 있다.
역상 크로마토그래피
RP-HPLC를 수행하여 당 업자에게 공지된 적당한 절차에 따라서 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson외 다수, ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier외 다수, J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani외 다수, J. CHROM. (1986) 359:391-402]을 참조하시오. RP-HPLC를 hGH에 대하여 수행할 수 있으며, 그 결과 실질적으로 정제된 hGH를 분리할 수 있다. 이러한 관점에서, 다양한 길이를 갖는(약 C3∼약 C30 이상, 약 C3∼약 C20 이상, 또는 약 C3∼약 C18 이상) 알킬 작용기를 보유하는 실리카 유도체화 수지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 중합체 수지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 앰버크롬 CG1000sd 수지(TosoHaas Amberchrome CG1OOOsd resin)가 사용될 수 있다. 알킬 사슬 길이가 다양한 시아노 또는 중합체 수지도 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 RP-HPLC 컬럼은 용매 예를 들어, 에탄올로 세척할 수 있다. 공급원 RP 컬럼은 RP-HPLC 컬럼의 또 다른 예이다.
이온 쌍 형성 제제(ion pairing-agent)와 유기 개질제 예를 들어, 메탄올, 이소프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적당한 용리 완충액을 RP-HPLC 컬럼으로부터 hGH를 용리하는데에 사용할 수도 있다. 가장 일반적으로 사용되는 이온 쌍 형성 제제로서는 아세트산, 포름산, 과 염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄 및 아세트산트리에틸암모늄을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 용리는 하나 이상의 구배 조건 또는 등 조건[분리 시간과 피크 폭을 줄이는데에 바람직한 구배 조건] 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 구배는 수중 용매 약 5∼약 80 %(v/v), 약 5∼약 75 %(v/v), 약 5∼약 70 %(v/v), 약 5∼약 65 %(v/v), 약 5∼약 60 %(v/v), 약 5∼약 55 %(v/v), 또는 약 10∼약 50 %(v/v) 일 수 있다. 다른 방법은 용매 농도 범위가 상이한, 2가지 구배를 적용하는 것을 포함한다. 본원에 사용하기에 적당한 용리 완충액의 예로서는 아세트산암모늄 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
재조합 이.콜라이 숙주로부터 유래된 hGH는 역상 크로마토그래피에 의해 분리 또는 정제될 수 있다. hGH는 예를 들어, SOURCE RP 컬럼[아세토니트릴 구배 = 약 10∼약 60 % 아세토니트릴]을 이용하여 분리될 수 있다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피 정제 기술
hGH에 대해서 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)를 수행할 수 있다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, GE Healthcare (Piscataway, NJ)]을 참조하시오. 적당한 HIC 매트릭스로서는 알킬- 또는 아릴-치환 매트릭스 예를 들어, 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스 예를 들어, 아가로즈, 가교 아가로즈, 세파로즈, 셀룰로즈, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스 및 혼합된 형태의 수지 예를 들어, 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 시판중인 소수성 상호 작용 컬럼 크로마토그래피로서는 히트랩(HITRAP)®, 하이프렙(HIPREP)® 및 힐로드(HILOAD)® 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)과, TSK겔 페닐-650S 및 페닐-5PW(30 um) 수지(Tosoh Bioscience)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
간단히 요약하면, 로딩하기 이전에, HIC 컬럼을 당 업자에게 공지된 표준 완충액 예를 들어, 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄 함유 HEPES, 또는 pH 6.5의 인산나트륨 용액 중 황산암모늄, 또는 pH7∼8의 TRIS 용액 중 황산나트륨으로 평형 처리시킬 수 있다. 황산암모늄은 HIC 컬럼을 로딩시키기 위한 완충액으로서 사용될 수 있다. hGH을 로딩시킨 후, 본원에 기술된 조건하에서 표준적인 완충액을 사용하여 이 컬럼을 세척하여, 원치 않는 물질은 제거하되 HIC 컬럼상에 hGH는 체류시킬 수 있다. hGH은 약 3∼약 10 컬럼 부피의 표준적인 완충액 예를 들어, EDTA와 평형 처리 완충액보다 낮은 농도의 황산 암모늄을 함유하는 HEPES 완충액, 또는 아세트산/염화나트륨 완충액과 함께 용리될 수 있다. 예를 들어, 인산칼륨 염의 구배를 점차 줄여가면서 hGH 분자를 용리할 수도 있다. 이 용리 완충액에 용리 강화제 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 글리세롤 또는 우레아(0.5∼1.5 M)도 첨가할 수 있다. 이후, 용리액을 예를 들어, 여과법 예를 들어, 다이아필터링 또는 한외 여과법에 의해 농축할 수 있다. 다이아필터링을 이용하여 hGH을 용리 시키는데에 사용되는 염을 제거할 수 있다.
기타 정제 기술
다른 분리 기술 예를 들어, 겔 여과법(GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1022-18, GE Healthcare, Piscataway, NJ; 본원에 참고용으로 인용됨), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피[적당한 매트릭스로서는 HA-울트로겔(HA-Ultrogel), 하이 레솔루션(High Resolution; Calbiochem), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT Ceramic Hydroxyapatite; BioRad), 바이오-겔 HTP 하이드록시아파타이트(Bio-Gel HTP Hydroxyapatite; BioRad)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아님], HPLC, 팽창 층 흡착법, 한외 여과법, 다이아필터링 및 동결 건조법 등을 제1 hGH 혼합물 또는 임의의 후속 혼합물에 대해 수행하여, 과량의 염을 제거하고, 다음 분리 단계 또는 최종 약품의 제형을 위하여, 완충액과 적당한 완충액을 교체할 수 있다.
상기 hGH 분자 내에 존재하는 비천연 암호화 아미노산도 비천연 암호화 아미노산을 함유하지 않는 기타 세포 내 단백질로부터 분리할 때에 이용될 수 있다. 비천연 암호화 아미노산은 독특한 화학적 작용기를 포함할 수 있기 때문에, 이러한 독특한 작용기를 다른 분자에 커플링시켜 실질적인 정제 단계를 실시할 수 있다. 예를 들어, 비천연 암호화 아미노산은 다른 단백질로부터의 분리를 촉진하는 기타 분자에 커플링될 수 있다. 비천연 아미노산과의 커플링에 사용되는 이러한 분자들로서는, PEG 및 기타 중합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
실질적으로 정제된 hGH를 포함하여 hGH의 수율은 당 업자에게 공지된 기술들을 이용하여 본원에 기술된 각 단계에서 모니터될 수 있다. 이러한 기술은 또한 마지막 분리 단계를 수행한 이후에 실질적으로 정제된 hGH의 수율을 평가하는데에 사용될 수도 있다. 예를 들어, hGH의 수율은 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 몇몇 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼 예를 들어, 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC; 그리고 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 것을 사용하여 모니터될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 각 정제 단계 이후의 hGH 수율은, 각 정제 단계에 사용되는 출발 물질 중 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 이상, 또는 약 99.9% 이상, 또는 약 99.99% 이상의 hGH일 수 있다.
순도는 표준적인 기술 예를 들어, SDS-PAGE를 사용하거나, 또는 웨스턴 블럿 및 ELISA 검정법을 사용하여 hGH를 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 네거티브 대조구 효모 발효액 및 양이온 교환 회수물로부터 분리된 단백질에 대하여 생산될 수 있다. 항체는 또한 오염 숙주 세포 단백질의 존부에 대한 프로브로서도 사용될 수 있다.
RP-HPLC 물질인 Vydac C4 (Vydac)은 표면에 C4-알킬 사슬을 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질성 불순물로부터 폴리펩티드를 분리하는 방법은 소수성 상호 작용 세기의 차이를 바탕으로 한다. 용리는 희석된 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 걸어주어 수행된다. 예비 HPLC는 스테인리스 스틸 컬럼[2.8∼ 3.2 리터의 Vydac C4 실리카겔로 충진]을 이용하여 수행된다. 상기 하이드록시아파타이트 울트로겔 용리물은 트리플루오로아세트산을 첨가하여 산성화된 후에 Vydac C4 컬럼 상에 로딩된다. 세척 및 용리를 위해서, 희석된 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 걸어준다. 분획을 수집하고, 그 즉시 인산염 완충액으로 중화시킨다. IPC 한계 내에 있는 폴리펩티드 분획을 모은다.
DEAE 세파로즈(GE Healthcare) 물질은 세파로즈 비드의 표면에 공유 결합되어 있는 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어져 있다. 선택한 폴리펩티드를 DEAE 기에 결합시키는 과정은 이온 상호 작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 체류하지 않고 컬럼을 통과한다. 이 물질들이 씻겨져 나간 후, 낮은 pH의 아세테이트 완충액으로 컬럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 이후, 상기 컬럼을 중성의 인산염 완충액으로 세척하고, 폴리펩티드는 이온 세기를 점점 높여가면서 완충액과 함께 용리시킨다. 이때, 컬럼은 DEAE 세파로즈 패스트 플로우로 충진시킨다. 컬럼 부피는 폴리펩티드 로딩량이 3∼10 ㎎ 폴리펩티드/㎖ 겔이 되도록 맞춘다. 컬럼을 물과 평형 완충액(인산 나트륨/인산 칼륨)으로 세척한다. 모아진 HPLC 용리 분획을 로딩하고, 이 컬럼을 평형 완충액으로 세척한다. 이후 상기 컬럼을 세척 완충액(아세트산나트륨 완충액)으로 세척한 후 다시 평형 완충액으로 세척한다. 마지막으로, 폴리펩티드가 용리 완충액(염화나트륨, 인산나트륨/인산 칼륨)과 함께 이 컬럼으로부터 용리되어 나오면, 주 용리 프로필(master elution profile)에 따라서 단일 분획으로 수집한다. DEAE 세파로즈 컬럼의 용리액을 비 전도율(specified conductivity)이 되도록 조정한다. 결과로 생성된 약물을 테플론 병으로 멸균 여과하고, 이를 -70℃에 보관한다.
hGH의 수율과 순도를 평가하는데에 사용될 수 있는 방법 및 절차로서는 브래드포드 검정법(Bradford assay), SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마쉬 염색 SDS-PAGE, 질량 분광법(예를 들어, MALDI-TOF) 및 기타 당 업자에게 공지된 단백질 특성 규명 방법을 포함한다. 부가적인 방법으로서는 다음의 방법들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: SDS-PAGE와 단백질 염색법의 병행법, 면역 블럿팅, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분광법(matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry; MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전 초법, 분석용 음이온 교환법, 크로마토포커싱 및 원편광 이색성(circular dichroism) 분석법.
사용될 수 있는 또 다른 방법은, 내독소를 제거하는 단계를 포함한다. 내독소로서는 그램-네거티브 숙주 세포 예를 들어, 에스케리치아 콜라이의 외막 상에 존재하는 지질 다당체(LPS)가 있다. 내독소 수준을 낮추는 방법에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 이용하는 정제 기술, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 여과법 및 이들 방법의 조합법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형법 및 부가의 방법에서는 오염 물질 예를 들어, 목적 폴리펩티드와 함께 이동하는 단백질을 제거할 필요가 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 리물러스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 검정법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
비록 본 발명은 특정 구체예, 방법, 구조물 및 용도를 참고로 하여 기술되어 있지만, 당 업자는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 기술된 시약, 재료 및 정제 조건은 당 업자에 의해 변형될 수 있음은 자명한 사실이다. 예를 들어, 고 용량의 수지는 그러한 고 용량의 수지가 필요한 크로마토그래피 단계에서 대체될 수 있다.
XIV. 대안적 시스템 내에서의 발현
몇몇 기술을 사용하여 인위적 아미노산을 비-재조합 숙주 세포, 돌연 변이 숙주 세포 또는 무 세포 계 내에 존재하는 단백질로 도입할 수 있다. 이러한 계은 또한 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 생산하는데에도 적당하다. 아미노산을 반응성 측 쇄 예를 들어, Lys, Cys 및 Tyr로 유도체화 하면, 리신이 N2-아세틸-리신으로 전환되었다. 화학적 합성법도 인위적 아미노산을 통합시키는 직접적인 방법을 제공한다. 최근, 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 원래의 화학적 결찰 방법을 개발함에 따라서, 더욱 큰 단백질을 만들 수 있게 되었다. 예를 들어, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000)]을 참조하시오. 화학적 펩티드 결찰법 및 원래의 화학적 결찰법에 관하여는, 본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 제6,184,344호, 미국 특허 공보 2004/0138412, 미국 특허 공보 2003/0208046, WO 02/098902 및 WO 03/042235에 기술되어 있다. 원하는 인위적 아미노산과 화학적으로 아실화된 억제 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관 내 추출물에 첨가하는 일반적인 시험관 내 생합성법에서는, 실질적으로 여러가지 크기를 갖는 다양한 단백질에 100개 이상의 인위적 아미노산을 위치-특이적으로 통합시킨다. 예를 들어, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method or site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); 및 J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989)]을 참조하시오. 광범위한 작용기가 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기작 및 신호 전달에 관한 연구용으로 도입되었다.
야생형 합성 효소의 무작위적 혼잡 작용(promiscuity)을 연구하기 위해 생체 내 방법(선택 압 통합법; selective pressure incorporation)이 개발되었다. 예를 들어, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999)]을 참조하시오. 영양 요구성 변종즉, 세포에게 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 스위치-오프(switch-off)된 변종은 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지 중에서 생장하는 반면에, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 생장 단계 중 정상기가 시작되면, 천연 아미노산은 고갈되어 인위적 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현을 유도시키면, 인위적 유사체를 함유하는 단백질이 축적된다. 예를 들어, 이러한 기법을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌을 단백질에 통합시켰을 때, 쉽게 확인될 수 있는 2개의 특징적인 쇼울더 부(shoulders)가 UV 스펙트럼 대역에 나타나고[예를 들어, C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)]; 트리플루오로메티오닌은 박테리오파지 T4 리소자임 중 메티오닌을 대체하며, 그 결과 트리플루오로메티오닌과 키토올리고당 리간드의 상호 작용을 19F NMR에 의해 분석할 수 있으며[예를 들어, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997)]; 트리플루오로루신은 루신 대신에 통합되어, 루신-지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학 안정성이 증가하게 되는 것이다. 예를 들어, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001)]을 참조하시오. 뿐만 아니라, 셀레노메티오닌과 텔루로메티오닌은 다양한 재조합 단백질에 통합되어, X-선 결정 분석에 있어서 상 분석을 용이하게 만들어 준다. 예를 들어, 문헌[W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); 및 N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997)]을 참조하시오. 알켄 또는 알킨 작용기를 보유하는 메티오닌 유사체도 효과적으로 통합되어, 화학적 수단에 의해 단백질을 추가로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282 (2000); 및 K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); 미국 특허 제6,586,207호; 미국 특허 공보 2002/0042097(본원에 참고용으로 인용됨)]을 참조하시오.
본 방법의 성공 여부는, 일반적으로 단백질 번역의 신뢰도를 보장하기 위해서는 고도의 선택성을 필요로 하는 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 인위적 아미노산 유사체가 인지되는지 여부에 달려있다. 본 방법의 범위를 확대하기 위한 한 가지 방편은 아미노아실-tRNA 합성 효소의 기질 특이성을 완화시키는 것으로서, 이는 제한된 수의 경우에 이루어지고 있다. 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성 효소(PheRS) 내에서 Ala294를 Gly로 치환시키면, 기질 결합 포켓의 크기가 늘어나게 되는데, 그 결과 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의해 tRNAPhe이 아실화된다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994)]을 참조하시오. 이러한 돌연 변이 PheRS를 보유하는 에스케리치아 콜라이 변종은 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 통합할 수 있다. 예를 들어, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); 및 N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)]을 참조하시오. 이와 유사하게, 에스케리치아 콜라이의 티로실-tRNA 합성 효소의 아미노산 결합 위치에 인접하여 일어난 점 돌연 변이 Phe130Ser은 아자티로신이 티로신보다 더 효율적으로 통합될 수 있도록 만들어 주는 것으로 파악된다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000)]을 참조하시오.
인위적 아미노산을 단백질에 생체 내 통합시키는 다른 기법은 교정 기작(proofreading mechanism)을 갖는 합성 효소를 개질하는 것이다. 이러한 합성 효소는 동계열 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 구별할 수 없으므로 이를 활성화할 수도 없다. 이러한 오류는 별도의 위치에서 교정되는데, 즉, tRNA로부터 잘못 운반된 아미노산을 탈 아실화 하여 단백질 번역의 신뢰도를 유지하게 되는 것이다. 만일, 합성 효소의 교정 작용이 불능하게 되면, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 편집 작용(edit function)을 피해서 통합될 수 있다. 최근, 발릴-tRNA 합성 효소(ValRS)를 이용하여 이러한 연구 결과를 입증한 바 있다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001)]을 참조하시오. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)로 tRNAVal을 잘못 아실화할 수 있으며; 이후 이러한 비-동계열 아미노산은 편집 도메인에 의해 가수 분해된다. 에스케리치아 콜라이 염색체의 랜덤한 돌연 변이 유발법 수행 후, ValRS의 편집 위치에 돌연 변이가 일어난 돌연 변이 에스케리치아 콜라이 변종이 선택된다. 이와 같은 편집 기능-흠결 ValRS는 tRNAVal이 Cys을 잘못 운반하게 만든다. Abu는 입체적으로 Cys과 유사하기 때문에[Cys의 -SH기는 Abu의 -CH3로 치환됨], 돌연 변이 에스케리치아 콜라이 변종이 Abu의 존재 하에 생육할 때 돌연 변이 ValRS는 또한 Abu를 단백질에 통합시킨다. 질량 스펙트럼 분석 결과, 발린의 약 24%가 원래 단백질 내 각각의 발린 위치에서 Abu에 의해 치환됨을 알 수 있다.
고상 합성법 및 반합성법도 또한 신규 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 문헌 및 이에 인용된 참고 문헌을 참조하시오: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. , Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, Am J Chem Soc. 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 11(3):255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng. 1(3):151-157 (1987); 및 Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 266(5183):243 (1994).
화학적 변형법이 다양한 인위적 측 쇄 예를 들어, 보조 인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 시험관 내에서 단백질에 도입하는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science. 238(4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem. 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc. 88:3153-3154 (1966); 및 Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242(4881):1038-1040 (1988)]을 참조하시오.
대안적으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성법은 시험관 내에서 합성된 단백질에 몇몇 생물 물리학적 프로브를 통합시키는데에 사용되었다. 다음의 문헌들 및 이에 인용된 참고 문헌들을 참조하시오: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem. 62:483-514 (1993); 및 Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci. 83(22):8604-8608 (1986).
화학적으로 아미노아실화된 억제 tRNA를, 목적으로 하는 앰버 넌센스 돌연 변이를 포함하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써, 인위적 아미노산은 시험관 내에서 단백질에 위치-특이적으로 통합될 수 있다는 사실에 대해서는 이미 규명된 바 있다. 이러한 접근법을 활용하여, 다수의 20개 공통 아미노산과 구조적으로 유사한 상동체 예를 들어, 페닐알라닌과 플루오로페닐알라닌을, 특정 아미노산에 대한 영양 요구 변종을 이용하여 치환할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak외 다수., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa외 다수, FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site- specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); 및 Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조하시오.
예를 들어, 종결 코돈인 UAG를 인지하는 억제 tRNA가 제조되었으며, 이 억제 tRNA는 아미노산으로써 화학적으로 아미노아실화되었다. 통상적인 위치-배향 돌연 변이 유발법은 단백질 유전자 내에 존재하는 목적 위치에 종결 코돈인 TAG를 도입시키는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3): 791-802 (1988)]을 참조하시오. 아실화된 억제 tRNA와 돌연 변이 유전자가 시험관 내 전사/번역 계에 통합되었을 때, 인위적 아미노산은 특정 위치에 특정 아미노산을 함유하는 단백질을 형성시키는 UAG 코돈에 따라서 통합되었다. [3H]-Phe을 이용하는 실험 및 α-히드록시산을 이용하는 실험을 통하여, 목적으로 하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정되는 위치에 통합되며, 이러한 아미노산은 단백질 내 어느 위치에도 통합되지 않는다는 사실이 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Noren외 다수, 상동; Kobayashi외 다수, (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; 및 Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)]을 참조하시오.
tRNA는 임의의 방법 또는 기술 예를 들어, 화학적 또는 효소적 아미노아실화에 의해 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.
아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성 효소 또는 기타 효소 분자 예를 들어, 리보자임에 의해 이루어질 수 있다. "리보자임"이란 용어는 "촉매 RNA"라는 용어와 호환된다. 세크(Cech)와 동료 들은[Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle외 다수, 1987, Concepts Biochem. 64:221-226], 촉매(리보자임) 역할을 할 수 있는 천연 생성 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매는 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에서만 작용하는 것으로 파악되지만, 최근 들어 리보자임을 인공적으로 진화시켜, 촉매 작용의 레파토리를 다양한 화학 반응으로 확대시킨 바 있다. 연구 결과 RNA 분자 자체의 (2')3'-말단부에서 아미노아실-RNA 결합을 촉매할 수 있는 RNA 분자[Illangakekare외 다수, 1995 Science 267:643-647)]와, 하나의 RNA 분자에서 다른 RNA 분자로 아미노산을 운반할 수 있는 RNA 분자[Lohse외 다수, 1996, Nature 381:442-444]를 확인하였다.
본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0228593에는, 리보자임을 구성하는 방법과, tRNA와 천연 암호화 및 비천연 암호화 아미노산의 아미노아실화에서의 리보자임의 용도에 관하여 기술되어 있다. tRNA를 아미노아실화할 수 있는 효소 분자 예를 들어, 리보자임의 기질-고정형은 아미노아실화된 산물을 효율적으로 친화 정제할 수 있게 만들 수 있다. 적당한 기질의 예로서는 아가로즈, 세파로즈 및 자성 비드를 포함한다. 아미노아실화용 리보자임의 기질-고정형을 제조하는 방법과 이의 용도에 관하여는, 본원에 참고용으로 인용된 문헌[Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 및 미국 특허 출원 공보 2003/0228593]에 기술되어 있다.
화학적 아미노아실화 방법으로서는 다음과 같은 문헌에서 소개된 방법들(아미노아실화에 합성 효소를 사용하지 않는 방법)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: Hecht와 동료(Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517), 및 Schultz, Chamberlin, Dougherty and others (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D.외 다수 Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti외 다수. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W.외 다수 Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E.외 다수 J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T.외 다수 J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34) (상기 문헌들 모두 본원에 참고용으로 인용됨). 이러한 방법들 또는 기타 화학적 아미노아실화 방법은 tRNA 분자를 아미노아실화하는데에 사용될 수 있다.
촉매성 RNA를 생산하는 방법은 랜덤화된 리보자임 서열의 별도 풀(pool)을 제조하는 단계, 이 풀에 대해 배향 진화(directed evolution)를 수행하는 단계, 이 풀을 원하는 아미노아실화 활성에 대해 스크리닝하는 단계 및 원하는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임 서열을 선택하는 단계를 포함한다.
리보자임은 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 부위들 예를 들어, GGU 모티프 및 U-풍부 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 U-풍부 부위는 아미노산 기질의 인지를 촉진하며, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기 쌍을 형성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 이와 아울러, 상기 GGU 모티프 및 U-풍부 부위는 아미노산과 tRNA를 동시에 인지하는 것을 촉진하며, 또한 그에 따라서 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화도 촉진한다.
리보자임은 부분적으로 랜덤화된 r24미니와 tRNAAsn CCCG를 컨쥬게이트화하는 시험관 내 선택법을 수행한 후, 활성 클론에서 살펴볼 수 있는 공통 서열을 체계적으로 조작하여 제조될 수 있다. 이 방법에 의해 얻어지는 대표적인 리보자임을 "Fx3 리보자임"이라 칭하며, 이에 관하여는 미국 특허 출원 공보 2003/0228593(이의 내용은 본원에 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있고, 또한 이 리보자임은 동종 비천연 아미노산을 운반하는 다양한 아미노아실-tRNA 합성용인 다용도 촉매로서 작용한다.
기재상에서 고정화시키면, 아미노아실화된 tRNA를 효율적으로 친화 정제할 수 있다. 적당한 기재의 예로서는 아가로즈, 세파로즈 및 자성 비드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리보자임은 RNA의 화학 구조를 이용하여 수지상에 고정될 수 있으며, 예를 들어, RNA의 리보즈 상에 존재하는 3'-cis-디올은 과요드산염으로 산화되어, 이 수지상에 RNA를 효율적으로 고정시키는 해당 디알데히드를 생성할 수 있다. 저렴한 히드라지드 수지를 비롯한 다양한 유형의 수지들이 사용될 수 있으며, 여기서, 환원성 아민화를 통하여 수지와 리보자임 간의 상호 작용을 비가역적 결합으로 만들 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 주로 컬럼 상 아미노아실화 기술에 의해 촉진될 수 있다. 문헌[Kourouklis외 다수 Methods 2005; 36:239-4]에는 컬럼계 아미노아실화 계에 관하여 기술되어 있다.
아미노아실화된 tRNA의 분리는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 한 가지 적당한 방법은 완충액 예를 들어, 아세트산나트륨 용액(10 mM EDTA포함), 50 mM의 N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM KCl(pH 7.0), 10 mM EDTA를 함유하는 완충액, 또는 단순히 EDTA 완충수(pH 7.0)와 함께, 컬럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리시키는 것이다.
번역 반응에 의하여 생성된 폴리펩티드 내 선택 위치에서 이 tRNA가 아미노아실화된 아미노산을 통합하기 위해, 아미노아실화 tRNA가 번역 반응에 가하여질 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 계의 예로서는, 세포 용해물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포 용해물은 도입 mRNA로부터 폴리펩티드를 시험관 내 번역하는데에 필요한 반응 성분을 제공한다. 이러한 반응 성분의 예로서는 리보좀 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 연장 인자 및 번역과 관련된 부가 인자들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 번역 계는 일군의 번역 계이거나 또는 개별적으로 구획화된 번역 계일 수 있다. 일군의 번역 계는 반응 성분들을 단일의 구획에서 화합시키지만, 구획화된 번역 계는 번역의 효율을 줄일 수 있는 반응 산물로부터 번역 반응 성분들을 구분한다. 이러한 번역 계는 시판중에 있다.
뿐만 아니라, 커플링된 전사/번역 계가 사용될 수 있다. 커플링된 전사/번역 계는 도입 DNA를 상응하는 mRNA로 전사시켜, 이후 반응 성분에 의해 번역시킬 수 있다. 시판중인 커플링된 전사/번역 계의 예로서는 신속 번역 계(Rapid Translation System; RTS, Roche Inc.)가 있다. 이 계는 번역 성분들 예를 들어, 리보좀과 번역 인자들을 제공하는 이.콜라이 용해물 함유 혼합물을 포함한다. 뿐만 아니라, RNA 중합 효소는 도입 DNA를 번역에 사용될 mRNA 주형으로 전사시키기 위해 포함된다. RTS는 반응 구획 예를 들어, 공급/소모 구획 및 전사/번역 구획 사이에 존재하는 막을 이용하여 반응 성분들을 구획화할 수 있다.
tRNA의 아미노아실화는 기타 제제 예를 들어, 트랜스퍼라제, 중합 효소, 촉매 항체 및 다중 작용성 단백질 등에 의해 수행될 수 있다.
문헌[Lu외 다수, Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69]에는, 단백질을 인위적 아미노산을 함유하는 합성 펩티드에 화학적으로 결찰 시키는 방법에 관하여 기술되어 있다[발현된 단백질 결찰].
미세 주입 기술로도 인위적 아미노산을 단백질에 통합시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science. 268:439 (1995); 및 D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000)]을 참조하시오. 남아프리카 발톱 개구리(Xenopus) 난모 세포에 시험관 내에서 생산된 2 종류의 RNA를 공동 주입하였다: 즉, 목적 아미노산 위치에 UAG 종결 코돈을 포함하는 표적 단백질을 암호화하는 mRNA와, 원하는 인위적 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제 tRNA. 이후 난모 세포의 번역 기작은 UAG로 특정되는 위치에 인위적 아미노산을 삽입한다. 이러한 방법은 일반적으로 시험관 내 발현 계에는 맞지 않는 필수적인 막 단백질에 관한 생체 내 구조-기능 연구를 가능하게 하였다. 그 예로서는, 형광 아미노산을 타키키닌 뉴로키닌-2 수용체에 통합시켜 형광 공명 에너지 전이에 의해 거리를 측정하는 방법[예를 들어, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996)]; 바이오틴화된 아미노산을 통합하여 이온 통로 내 표면-노출 잔기를 동정하는 방법[예를 들어, J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997)]; 케이지화된 티로신 유사체를 사용하여 실시간 이온 통로의 형태 변화를 관찰하는 방법[예를 들어, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998)]; 그리고, 알파 히드록시 아미노산을 사용하여 이온 통로 주쇄를 이의 관문 기작(gating mechanisms)을 찾아내기 위한 형태로 바꾸는 방법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); 및 T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001)]을 참조하시오.
생체 내에서 인위적인 아미노산을 단백질에 직접 통합시키는 능력은 다양한 이점 예를 들어, 돌연 변이 단백질을 고수율로 얻을 수 있는 이점, 기술적 용이함, 세포 또는 살아있는 유기체 내에서도 돌연 변이 단백질에 관하여 연구할 수 있는 가능성을 열어주었다는 점과, 이러한 돌연 변이 단백질을 치료용 및 진단용으로 사용할 수 있다는 점 등을 제공한다. 다양한 크기, 산성도, 친핵성, 소수성 및 기타 특성들을 갖는 인위적 아미노산을 단백질에 포함시키는 능력은, 단백질 기능을 프로빙하고 새로운 특성을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생산하기 위해 단백질의 구조를 합리적이고 체계적으로 조작할 수 있는 가능성을 매우 넓혀줄 수 있다. 그러나, 이러한 조작은, 단백질 번역에 있어서 고도의 신뢰성을 얻는데에 필요한 tRNA-합성 효소간 상호 작용의 복잡한 성질 때문에 어렵다.
파라-F-Phe, 효모 앰버 억제 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성 효소 쌍을 위치-특이적으로 통합하고자 하는 시도는, p-F-Phe 내성, Phe 영양 요구성 에스케리치아 콜라이 변종 내에서 행하여지고 있다. 예를 들어, 문헌[R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998)]을 참조하시오.
뿐만 아니라, 무 세포(시험관 내) 번역 계를 이용하여 본 발명의 hGH 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수도 있다. 번역 계는 세포 계 또는 무 세포 계일 수 있으며, 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수도 있다. 세포 번역 계로서는 전 세포 제조물 예를 들어, 투과 처리된 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서, 목적으로 하는 핵산 서열은 mRNA 또는 번역된 mRNA로 전사될 수 있다. 무 세포 번역 계는 시판중에 있으며, 다수의 상이한 종류의 계들은 널리 공지되어 있다. 무 세포 계의 예로서는 원핵 생물의 용해물 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 용해물, 및 진핵 생물의 용해물 예를 들어, 맥아 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상 적혈구 용해물, 토끼 난모 세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대부분의 변형은 진핵 생물 계에서만 일어날 수 있기 때문에, 진핵 생물 추출물 또는 용해물은 결과로 생성되는 단백질이 글리코실화, 인산화 또는 변형될 때에 바람직할 수 있다. 이러한 추출물 및 용해물 중 일부는 시판중에 있다[Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif; Amersham; Arlington Heights, Ill.; GIBCO/BRL; Grand Island, N. Y.]. 분비형 단백질을 번역하는데에 유용한 막상 추출물 예를 들어, 마이크로솜 막을 함유하는 개의 췌장 추출물도 입수할 수 있다. 주형으로서 mRNA(시험관 내 번역) 또는 DNA(시험관 내 전사 및 번역의 혼합형)를 포함할 수 있는 이와 같은 계에서, 시험관 내 합성법은 리보좀에 의해 유도된다. 무 세포 단백질 발현 계의 개발에 상당한 노력이 가하여지고 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001); Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); 및 Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허 공보 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785]을 참조하시오. 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 다른 접근법으로서는 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel외 다수, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)]을 참조하시오. 이 연구법에서, 퓨로마이신에 결합된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형되면, 비천연 아미노산은 또한 펩티드에도 통합될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 해독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획하게 된다. 만일 결과로 생성된 mRNA-펩티드 컨쥬게이트가 시험관 내 검정법에서 흥미로운 특성을 갖는 것으로 파악되면, 이의 본질은 mRNA 서열로부터 용이하게 규명될 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 동정하기 위해 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 보다 최근에는, 정제된 성분을 이용하는 시험관 내 리보좀 번역을 통하여 비천연 암호화 아미노산으로 치환된 펩티드를 합성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌[A. Forster외 다수, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)]을 참조하시오.
재구성된 번역 계가 사용될 수도 있다. 또한 정제된 번역 인자 혼합물뿐만 아니라, 용해물의 혼합물 또는 정제된 번역 인자 예를 들어, 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 연장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자가 보충된 용해물도 mRNA를 단백질로 성공적으로 번역시키는 데에 사용될 수 있다. 무 세포 계는 또한 전사/번역 계와 커플링될 수 있는데, 이때 DNA는 이 계에 도입되어 mRNA 및 번역된 mRNA로 전사된다[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel외 다수 editors, Wiley Interscience, 1993); 본원에 참고용으로 인용됨]. 진핵 생물 전사 계 내에서 전사된 RNA는 이종 핵 내 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리부를 보유하는 성숙한 mRNA의 형태일 수 있는데, 이는 임의의 번역 계에서는 이점으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA는 망상 적혈구 용해 계 내에서 고효율로 번역된다.
XV. hGH 폴리펩티드에 커플링된 거대 분자 중합체
본원에 기술된 조성물, 방법, 기술 및 계획을 이용하여 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 다양한 변형을 가할 수 있다. 이와 같은 변형으로서는 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에 추가의 작용기 예를 들어, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광 가교제; 방사성 핵종; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광 친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트화제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제 리보핵산; 생체 적응 재료; 나노 입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 기타 분자와 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 기; 광 케이지화된 부분; 악티닌 방사성 여기 부분; 광 이성체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유도체; 바이오틴 유사체; 중원자 통합 부분; 화학 절단 기; 광 절단 기; 연장된 측 쇄; 탄소-결합 당; 산화 환원-활성화제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소 표지화된 부분; 생체 물리학적 프로브; 인광 기; 화학 발광기; 전자 조밀 기; 자성 기; 삽입 기; 발색 단; 에너지 전이제; 생물학적 활성 제제; 검출 가능한 표지; 소 분자; 양자 점; 나노 전달체; 방사성 뉴클레오티드; 방사성 전달체; 중성자 포획제 또는 상기 것들의 임의의 조합체, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질의 컨쥬게이트를 통합시키는 것을 포함한다. 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 계획에 관한 예시적이고 비 제한적인 예로서, 다음의 설명은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 거대 분자 중합체를 가하는 것에 초점이 맞추어질 것이며, 이때, 여기에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 계획은 기타 작용기 예를 들어 상기 나열된 작용기들을 부가하는데에 사용될 수 있음(필요에 따라서 당 업자가 본원에 개시된 바를 참고로 하여 적당히 변형할 수 있음)을 이해할 수 있을 것이다.
다양한 거대 분자 중합체와 기타 분자들이 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합되어 hGH 폴리펩티드의 생물학적 특성을 조정할 수 있으며/있거나, hGH 분자에 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 이와 같은 거대 분자 중합체들은 천연 암호화 아미노산, 비천연 암호화 아미노산, 또는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용성 치환기, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 가하여진 임의의 치환기 또는 작용기를 통하여, hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 이 중합체의 분자량은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000 Da 이상일 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000 Da일 수 있는데, 예를 들어, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼50,000 Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼40,000 Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼40,000 Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼40,000 Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼40,000 Da일 수 있다.
본 발명은 실질적으로 동종인 중합체:단백질 컨쥬게이트 제제를 제공한다. 본원에 사용된 "실질적으로 동종"이란, 중합체:단백질 컨쥬게이트 분자가 전체 단백질의 절반보다 크게 관찰되는 경우를 의미한다. 상기 중합체:단백질 컨쥬게이트는 생물 활성을 가지며, 본원에 제공된 "실질적으로 동종인" PEG화 hGH 폴리펩티드 제제는 동종 제제의 이점 예를 들어, 할당 대 할당 약물 동력학적 임상 분석에 있어서 예측 가능성을 제공하기 쉽다는 점을 나타내기에 충분히 동종인 제제이다.
또한, 중합체:단백질 컨쥬게이트 분자의 혼합물을 제조하는 방법을 선택함에 있어서, 본원에 제공된 이점은 상기 혼합물에 포함된 단일 중합체:단백질 컨쥬게이트의 비율을 선택할 수 있다는 점이다. 그러므로, 원하는 경우, 결합된(즉, 이중, 삼중 및 사중으로 결합된) 중합체 부분을 다수 포함하는 다양한 단백질 혼합물을 제조할 수 있으며, 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 상기 컨쥬게이트와 단일 중합체:단백질 컨쥬게이트를 화합할 수 있을 뿐만 아니라, 단일 중합체:단백질 컨쥬게이트를 소정의 비율로 포함하는 혼합물을 얻을 수도 있다.
선택된 중합체는 수용성일 수 있으므로, 이 중합체에 결합된 단백질은 수성 환경 예를 들어, 생리적 환경에서 침전되지 않는다. 상기 중합체는 분지형 또는 비 분지형일 수 있다. 최종 산물 제제를 치료용으로 사용함에 있어서, 상기 중합체는 약학적으로 허용 가능할 것이다.
중합체의 예로서는, 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시-캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜 및 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 이의 유사체, 특히, 폴리옥시에틸렌 글리콜(폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG라고도 알려짐)); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 다당 및 이의 유도체 예를 들어, 덱스트란 및 덱스트란 유도체 예를 들어, 카복시메틸덱스트란, 황산 덱스트란, 아미노덱스트란; 셀룰로즈 및 이의 유도체 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로즈, 히드록시알킬 셀룰로즈; 키틴 및 이의 유도체 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카복시메틸키틴, 카복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알지네이트; 황산콘드로이친; 알부민; 풀루란 및 카복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르타미드; 말산 무수물 공중합체 예를 들어, 스티렌 말산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 알산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 이의 공중합체; 이의 삼량체; 이의 혼합물; 및 상기 중합체의 유도체들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리에틸렌 글리콜 분자 : 단백질 분자의 비율은 반응 혼합물에서의 농도에 따라서 달라질 것이다. 일반적으로, 최적 비율(미반응 단백질 또는 중합체가 최소한의 과량으로 존재할 때의 반응 효율의 관점에서)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량과 이용 가능한 반응기의 수에 의하여 결정될 수 있다. 분자량에 관하여, 통상적으로 중합체의 분자량이 클수록, 단백질에 결합할 수 있는 중합체 분자의 수는 적어진다. 이와 유사하게, 이러한 매개 변수들을 최적화할 때 중합체를 분지화하는 것도 고려하여야 한다. 일반적으로, 분자량이 클수록(또는 분지화 정도가 높을수록) 중합체 : 단백질 비율은 더욱 커진다.
본원에 사용된 바와 같이, PEG:hGH 폴리펩티드 컨쥬게이트를 고려할 때, "치료학적 유효량"이란 용어는, 환자에게 원하는 이점을 제공하는 양을 의미하는 것이다. 상기 양은 개체마다 상이할 것이며, 다수의 인자 예를 들어, 환자의 전체적인 몸 상태와 치료될 병상의 잠재적 원인에 따라서도 달라질 것이다. 치료에 사용되는 hGH 폴리펩티드의 양은 허용 가능한 변화율을 제공하고, 원하는 반응을 유리한 수준으로 유지시킨다. 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량은 공중이 이용가능한 자료와 방법을 통하여 당 업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
수용성 중합체는 선형, 포크형 또는 분지형과 같은 임의의 구조적 형태를 가질 수 있다. 통상적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜) 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 기타 수용성 중합체도 사용될 수 있다. 예를 들어, PEG는 본 발명의 임의의 구체예를 기술하는데에 사용된다.
PEG는 시판되고 있으며 널리 공지된 수용성 중합체이거나, 또는 당 업자에게 공지된 방법에 따라서 에틸렌 글리콜을 개환 중합 반응시켜 제조될 수 있다[Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]. "PEG"란 용어는 광범위하게는 크기 또는 PEG 말단부의 변형 여부와는 상관없이, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 의미로서, 다음과 같은 화학식에 따라서 hGH 폴리펩티드에 결합된 형태로서 나타낼 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
[상기 식 중, n은 2∼10,000이고, X는 H 또는 말단부 변형기 예를 들어, C1∼4알킬, 보호기 또는 말단 변형 기임]
몇몇 경우에 있어서, 본 발명에 사용된 PEG는 한쪽 말단부가 히드록시 또는 메톡시로 종결된다[즉, X는 H 또는 CH3임; "메톡시 PEG"]. 대안적으로, 상기 PEG는 반응기로 종결되어, 이중 작용성 중합체를 형성할 수 있다. 통상적인 반응기는 20개의 공통 아미노산에서 살펴볼 수 있는 작용기[예를 들어, 말레이미드기, 활성화된 카보네이트(예를 들어, p-니트로페닐 에스테르), 활성화 에스테르(예를 들어, N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르) 및 알데히드], 그리고 20개의 공통 아미노산에 대해서는 비활성이지만, 비천연 암호화 아미노산에 존재하는 상보성 작용기와는 특이적으로 반응하는 작용기와 반응하는데에 일반적으로 사용되는 반응기들을 포함할 수 있다. 상기 화학식에서 Y로서 표시되는 PEG의 다른 쪽 말단부는 천연-생성 또는 비천연 암호화 아미노산을 통하여 hGH 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 결합할 것임에 주목하여야 한다. 몇몇 구체예에서, 강력한 친핵체(예를 들어, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 및 세미카바지드)는 비천연 암호화 아미노산에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카바존을 형성할 수 있으며, 때로는, 적당한 환원제로 처리함으로써 환원될 수도 있다. 대안적으로, 강력한 친핵체는 비천연 암호화 아미노산을 통하여 hGH 폴리펩티드에 통합되어, 수용성 중합체 내에 존재하는 케톤 또는 알데히드 기와 우선적으로 반응하는데에 사용될 수도 있다.
실제로, 원하는 바에 따라서 임의의 분자량 예를 들어, 약 100∼100,000 달톤(Da)[때로는 0.1∼50 kDa 또는 10∼40 kDa] 이상을 갖는 PEG를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. PEG의 분자량은 다양할 수 있는데 예를 들어, 약 100∼약 100,000 Da 이상일 수 있다. PEG의 분자량은 약 100∼약 100,000 Da 이상일 수 있는데, 예를 들어, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 100∼50,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 100∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 1,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 5,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 10,000∼40,000 Da이다. 분지형 사슬 형태를 띠고 있는 PEG 예를 들어, 각 사슬의 분자량이 1∼100 kDa(예를 들어, 1∼50 kDa 또는 5∼20 kDa)인 PEG 분자도 사용될 수 있다. 분지 사슬형 PEG의 분자량은 예를 들어, 약 1,000∼약 10,000 Da일 수 있다. 분지 사슬형 PEG의 분자량은, 약 1,000∼약 100,000 Da일 수 있는데, 예를 들어, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분지 사슬형 PEG의 분자량은 약 1,000∼50,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 분지 사슬형 PEG의 분자량은 약 1,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 분지 사슬형 PEG의 분자량은 약 5,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 분지 사슬형 PEG의 분자량은 약 5,000∼20,000 Da이다. 다양한 PEG 분자에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[쉐어워터 폴리머 인코포레이션(Shearwater Polymers, Inc.) 카탈로그, 넥타 서라퓨틱스(Nektar Therapeutics) 카탈로그]에 개시되어 있다.
일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단부는 비천연 암호화 아미노산과의 반응에 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, PEG 유도체를 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체는 비천연 암호화 아미노산의 측 쇄 상에 존재하는 화학 작용기와 반응성인 화학 작용기를 함유한다.
수용성 중합체의 중합체 주쇄는 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 다양한 수용성 중합체 예를 들어, 폴리(에틸렌)글리콜 및 기타 관련 중합체 예를 들어, 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)도 본 발명의 실시에 사용하기에 적당하며, PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)이라는 용어는 상기 분자들 전부를 포함하는 의미로 사용될 수 있음을 이해하여야 할 것이다. PEG라는 용어에는 임의의 형태를 띠는 폴리(에틸렌 글리콜) 예를 들어, 이중 작용성 PEG, 다중 현수형(multiarmed) PEG, 유도체화 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 현수형(pendant) PEG(즉, 중합체 주쇄에 현수하는 하나 이상의 작용기를 보유하는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 분해 가능한 결합을 보유하는 PEG를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
통상적으로 PEG는 투명하고, 무색이고, 무취이며, 수용성이고, 열 안정성이며, 다수의 화학 제제에 비활성인 것으로서, 가수 분해 또는 저급화되지 않고, 일반적으로는 비-독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체 적합성인 것으로 생각되는데, 즉, PEG는 살아있는 조직 또는 유기체에 해를 가하지 않고 이들과 함께 공존할 수 있다. 보다 구체적으로, PEG는 실질적으로 비-면역원성인데, 즉, PEG는 체 내에서 면역 반응을 유발시키지 않는다. 체 내에서 바람직한 몇몇 기능을 보유하는 분자 예를 들어, 생물학적 활성 제제에 결합할 때, 상기 PEG는 이 제제를 마스킹(masking)하고, 임의의 면역 반응을 감소 또는 없앨 수 있으며, 그 결과 유기체는 제제가 존재하더라도 견딜 수 있게 된다. PEG 컨쥬게이트는 실질적으로 면역 반응을 유발시키지 않거나, 또는 응고나 기타 바람직하지 않은 현상을 유도하지 않는 경향이 있다. 화학식 -CH2CH2O-(CH2CH2O)n--CH2CH2- [식 중, n은 약 3∼약 4,000이고, 통상적으로는 약 20∼약 2,000임]를 갖는 PEG는 본 발명에 사용하기에 적당하다. 분자량이 약 800∼약 100,000 Da인 PEG는 본 발명의 몇몇 구체예에서 중합체 주쇄으로서 특히 유용하다. PEG의 분자량은 광범위할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. PEG의 분자량은 약 100∼약 100,000 Da일 수 있는데, 예를 들어, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 100∼50,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 100∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 1,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 5,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, PEG의 분자량은 약 10,000∼40,000 Da이다.
중합체 주쇄는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 주쇄는 일반적으로 당 업계에 알려져 있다. 통상적으로, 분지형 중합체는 중앙에 분지 중심부(branch core moiety)가 있으며, 이 중앙 분지 중심에는 다수의 선형 중합체 사슬이 결합되어 있다. 일반적으로 산화 에틸렌을 다양한 폴리올 예를 들어, 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지형 PEG가 사용된다. 중앙 분지 부는 또한 몇몇 아미노산 예를 들어, 리신으로부터 유래 될 수도 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반식 R(-PEG-OH)m[식 중, R은 중심부 예를 들어, 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유래되고, m은 팔의 갯 수임]으로 나타낼 수 있다. 다중 현수형 PEG 분자 예를 들어, 미국 특허 제5,932,462호, 동 제5,643,575호; 동 제5,229,490호; 동 제4,289,872호; 미국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469; 및 WO 93/21259 (각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 개시된 것들도 중합체 주쇄으로 사용될 수 있다.
분지형 PEG는 또한 PEG(--YCHZ2)n [식 중, Y는 결합기이고, Z는 일정한 길이의 원자 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화 말단기임]으로 나타낼 수 있는 포크형 PEG의 형태를 가질 수도 있다.
또 다른 분지형인, 현수형 PEG는 PEG 사슬의 말단부보다는 PEG 주쇄를 따라서 반응기 예를 들어, 카복실 기를 가진다.
이와 같은 형태의 PEG 이외에, 중합체는 또한 주쇄 내 약하거나 또는 분해 가능한 결합을 포함하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수 분해될 수 있는 중합체 주쇄에 에스테르 결합을 형성하도록 제조될 수 있다. 이하에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수 분해 결과 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단할 수 있다:
-PEG-CO2-PEG-+H2O → PEG-CO2H+HO-PEG-
폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG란 용어는 당 업계에 공지된 모든 형태의 것 예를 들어, 본원에 개시된 모든 형태의 것들을 나타내고 또한 이것들을 포함하는 것이라는 사실은 당 업자에 의해 이해될 수 있다.
기타 다수의 중합체들도 본 발명에 사용하기에 적당하다. 몇몇 구체예에서, 2∼약 300개의 말단부를 보유하며 수용성인 중합체 주쇄는 본 발명에 특히 유용하다. 적당한 중합체의 예로서는, 기타 폴리(알킬렌 글리콜) 예를 들어, 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 이들의 공중합체(예를 들어, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체), 이들의 삼량체, 이들의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 다양할 수도 있지만, 통상적으로는 약 800∼약 100,000 Da, 종종 약 6,000∼약 80,000 Da이다. 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 약 100∼약 100,000 Da일 수 있는데, 예를 들어, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 약 100∼50,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 약 100∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 약 1,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 약 5,000∼40,000 Da이다. 몇몇 구체예에서, 중합체 주쇄를 이루는 각 사슬의 분자량은 약 10,000∼40,000 Da이다.
당 업자는 실질적으로 수용성인 주쇄에 관하여 상기 나열한 사항들은 결코 한정적인 것은 아니며, 단지 예시적인 것에 불과하고, 전술한 특성을 갖는 중합체 재료들 모두는 본 발명에 사용하기에 적당한 것으로 간주된다는 사실을 알게 될 것이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 중합체 유도체는 "다중 작용성"인 것으로서, 즉, 중합체 주쇄는 2개 이상의 말단부를 가지며, 또는 약 300개의 말단부를 가질 수도 있고, 작용기로 작용화되거나 또는 활성화될 수도 있는 것이다. 다중 작용성 중합체 유도체로서는 2개의 말단부를 갖는 선형 중합체(각 말단부는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 작용기에 결합 됨)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
수용성 중합체는 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 수용성 중합체는 hGH 폴리펩티드에 통합된 비천연 암호화 아미노산, 또는 비천연 암호화 아미노산 또는 천연 암호화 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연 암호화 아미노산 또는 천연 암호화 아미노산에 첨가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 결합될 수 있다. 대안적으로, 상기 수용성 중합체는 천연-생성 아미노산(예를 들어, 시스테인, 리신 또는 N-말단 잔기의 아민 기)을 통하여 비천연 암호화 아미노산이 통합되어 있는 hGH 폴리펩티드에 결합된다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개의 비천연 아미노산을 포함하는데, 여기서, 상기 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산(들)은 수용성 중합체(예를 들어, PEG 및/또는 올리고당)에 결합되어 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 또한 수용성 중합체에 결합되어 있는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 천연 암호화 아미노산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합되어 있는 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산과, 수용성 중합체에 결합되어 있는 하나 이상의 천연 생성 아미노산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명에 사용된 수용성 중합체는 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기를 컨쥬게이트화되지 않은 형태의 hGH 폴리펩티드보다 연장시킨다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)는 약리학적 성질, 약물 동력학적 성질 또는 약물 동태학적 성질 예를 들어, 생체 내 반감기를 변형(예를 들어, 증가 또는 감소)시키도록 맞출 수 있다. 몇몇 구체예에서, hGH의 반감기는 변형되지 않은 폴리펩티드의 경우보다, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배, 10배, 50배 또는 약 100배 이상 증가된다.
수용성 중합체가 hGH 폴리펩티드에 결합하는 정도 및 위치는 1번 위치에 있는 hGH 폴리펩티드 수용체 또는 결합 파트너와 hGH 폴리펩티드의 결합을 조정할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이 결합은 hGH 폴리펩티드가 1번 위치에서 Kd 약 400 nM 이하, Kd 150 nM 이하, 그리고 몇몇 경우에는 Kd 약 100 nM 이하로[평형 결합 검정법(equilibrium binding assay)에 의해 측정됨] hGH 폴리펩티드 수용체와 결합하도록 정렬된다[hGH에 관한 문헌 즉, Spencer외 다수, J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) 참조].
중합체를 활성화시키고, 펩티드를 컨쥬게이트화시키는 방법 및 화학적 원리에 관하여는 여러 문헌에 개시되어 있으며 당 업계에도 공지되어 있다. 중합체를 활성화시키는데에 보통 사용되는 방법들로서는 작용기를 브롬화시아노겐, 과요드산염, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐설폰, 카보디이미드, 설포닐 할로겐화물, 트리클로로프리아진 등으로 활성화하는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L.외 다수, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991)].
PEG를 작용기화 및 컨쥬게이트화시키는 것에 관한 몇몇 문헌과 전공 논문을 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조하시오.
중합체를 활성화하는 방법에 관하여는 WO 94/17039, 미국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제5,281,698호 및 WO 93/15189에서 찾아볼 수 있으며, 활성화된 중합체와 효소 예를 들어, 응고 인자 VIII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 과산화물 디스뮤타제(superoxide dismutase)(Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985) 사이의 컨쥬게이트화에 관하여도 공지되어 있다. 인용된 모든 참고 문헌과 특허는 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
반응 산물은 추후 소수성 상호 작용 크로마토그래피되어, 유리 PEG로부터 PEG화된 hGH 폴리펩티드 변이체를 분리할 수 있게 된다. 적당한 조건은 가교 복합체 대 목적 컨쥬게이트의 상대적 크기에 따라서 달라지며, 이러한 크기는 당 업자에 의하여 용이하게 결정된다. 목적으로 하는 컨쥬게이트를 함유하는 용리물은 한회 여과법에 의해 농축되어, 다이아필터링에 의해 탈염될 수 있다.
필요하다면, 소수성 크로마토그래피로부터 얻어진 PEG화 hGH 폴리펩티드는 당 업자에게 공지된 하나 이상의 방법 예를 들어, 친화성 크로마토그래피; 음이온-교환 크로마토그래피 또는 양이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, DEAE SEPHAROSE 사용); 실리카 상 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과법(예를 들어, SEPHADEX G-75 사용); 소수성 상호 작용 크로마토그래피; 크기별 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외 여과법/다이아필터링; 에탄올 침전법; 황산 암모늄 침전법; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전 초법 이용), 분별 용해도(예를 들어, 황산 암모늄 침전 이용) 또는 추출에 의해 추가로 정제될 수도 있다. 겉보기 분자량은 GPC에 의해서, 구상 단백질 표준과 비교함으로써 측정될 수 있다[Preneta, AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306]. hGH-PEG 컨쥬게이트의 순도는 단백 분해(예를 들어, 트립신 분해) 수행 후, 질량 분광 분석법을 실시함으로써 평가될 수 있다[Pepinsky RB.외 다수, J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)].
본 발명의 hGH 폴리펩티드를 이루는 아미노산에 결합되어 있는 수용성 중합체는 또한 아무런 제한 없이 유도체화 또는 치환될 수 있다.
기타 PEG 유도체 및 일반적인 PEG화 기술
hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있는 기타 대표적인 PEG 분자와, PEG화 방법으로서는 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 공보 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; 미국 특허 제 6,646,110호; 동 제5,824,778호; 동 제5,476,653호; 동 제5,219,564호; 동 제5,629,384호; 동 제5,736,625호; 동 제4,902,502호; 동 제5,281,698호; 동 제5,122,614호; 동 제5,473,034호; 동 제5,516,673호; 동 제5,382,657호; 동 제6,552,167호; 동 제6,610,281호; 동 제6,515,100호; 동 제6,461,603호; 동 제6,436,386호; 동 제6,214,966호; 동 제5,990,237호; 동 제5,900,461호; 동 제5,739,208호; 동 제5,672,662호; 동 제5,446,090호; 동 제5,808,096호; 동 제5,612,460호; 동 제5,324,844호; 동 제5,252,714호; 동 제6,420,339호; 동 제6,201,072호; 동 제6,451,346호; 동 제6,306,821호; 동 제5,559,213호; 동 제5,747,646호; 동 제5,834,594호; 동 제5,849,860호; 동 제5,980,948호; 동 제6,004,573호; 동 제6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 개시된 것들을 포함한다. 본원에 개시된 PEG 분자들 중 임의의 것은 임의의 형태 예를 들어, 단일 사슬형, 분지형 사슬, 다중 현수형 사슬, 단일 작용성, 이중 작용성, 다중 작용성 또는 이들 형태의 임의의 조합형으로서 사용될 수 있다.
혈청 알부민에 대한 친화성 강화
다양한 분자들이 또한 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 융합되어 혈청 중 hGH 폴리펩티드의 반감기를 조정할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분자들은 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합 또는 융합되어, 이로써 동물 체내 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성이 강화될 수 있다.
예를 들어, 몇몇 경우에 있어서, hGH 폴리펩티드 및 알부민 결합 서열의 재조합 융합체도 제조된다. 대표적인 알부민 결합 서열로서는 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유래 된 알부민 결합 도메인[예를 들어, Makrides et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) and Sjolander et al, J Immunol. Methods 201:115-123 (1997) 참조], 또는 문헌[예를 들어, Dennis외 다수, J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)]에 기술된 바와 같은 알부민-결합 펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 몇몇 경우에 있어서, 지방산은 혈청 알부민과의 결합을 촉진한다. 예를 들어, 문헌[Kurtzhals외 다수, Biochem. J. 312:725-731 (1995)]을 참조하시오.
다른 구체예에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 직접적으로 융합된다. 당 업자들은 기타 다양한 분자들도 본 발명의 hGH에 결합하여 혈청 알부민 또는 기타 혈청 성분과의 결합을 조정할 수 있음을 알게 될 것이다.
XVI. hGH 폴리펩티드의 글리코실화
본 발명은 당 잔기를 보유하는 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산이 통합되어 있는 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 상기 당 잔기는 천연의 것(예를 들어, N-아세틸글루코사민) 또는 천연의 것이 아닌 것(예를 들어, 3-플루오로갈락토즈)일 수 있다. 당은 N- 또는 O-결합 글리코시드 결합(예를 들어, N-아세틸갈락토즈-L-세린) 또는 비천연 결합(예를 들어, 옥심 또는 해당 C-결합 글리코시드 또는 S-결합 글리코시드)에 의해 비천연 암호화 아미노산에 결합 될 수 있다.
당(예를 들어, 글리코실) 부분은 생체 내 또는 시험관 내에서 hGH 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 카보닐-함유 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 아미노옥시기로 유도체화된 당으로 변형되어, 옥심 결합을 통해 결합된 상응하는 글리코실화 폴리펩티드로 생성된다. 일단, 비천연 암호화 아미노산에 결합되면, 당은 글리코실트랜스퍼라제 및 기타 효소로 처리되어 변형될 수 있으며, 그 결과 hGH 폴리펩티드에 결합된 올리고당을 생산할 수 있게 된다. 예를 들어, 문헌[H. Liu외 다수. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조하시오.
XII. GH 초 유전자군의 일원인 이량체와 다량체
본 발명은 또한, GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 예를 들어, 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 GH가 다른 GH 초 유전자군의 일원 또는 이의 변이체, 또는 임의의 기타 폴리펩티드(즉, 비-GH 초 유전자군의 일원이거나 이의 변이체인 폴리펩티드)가, 폴리펩티드 주쇄에 직접 결합하거나 또는 링커를 통해 결합하는 경우인, GH 초 유전자군의 일원으로 이루어진 조합체(예를 들어, hGH 및 hGH 유사체) 예를 들어, 동종 이량체, 이종 이량체, 동종 다량체 또는 이종 다량체(즉, 삼량체 및 사량체 등)를 제공한다. 단량체의 경우에 비하여 상기 조합체의 경우는 분자량이 크기 때문에, GH 초 유전자군의 일원 예를 들어, hGH 이량체 또는 다량체 컨쥬게이트는 새롭거나 또는 바람직한 특성들 예를 들어, 상이한 약리학적, 약물 동력학적 또는 약물 동태학적으로 조정된(단량체 GH 초 유전자군 일원의 경우보다 조정된) 치료 반감기 또는 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 몇몇 구체예에서, GH 초 유전자군의 일원 예를 들어, 본 발명의 hGH 이량체는 GH 초 유전자군의 일원의 수용체의 이량체화도 조정할 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 GH 초 유전자 군의 일원인 이량체 또는 다량체는 GH 초 유전자군의 일원의 수용체 길항제, 작동제 또는 조정제로서 작용할 것이다.
몇몇 구체예에서, 이량체 또는 다량체를 포함하는 hGH에 속하는 하나 이상의 hGH 분자들은 제II 위치 결합 부위 내에 존재하는 수용성 중합체와 결합된 비천연 암호화 아미노산을 포함한다. 이와 같이, 이량체 또는 다량체인 hGH 분자 각각은 제I 위치 경계면을 통하여 hGH 폴리펩티드 수용체와 결합할 수 있지만, 제II 위치 경계면을 통해서는 제2의 hGH 폴리펩티드 수용체와 결합할 수 없다. 그러므로, hGH 폴리펩티드 이량체 또는 다량체는 2개의 분명한 hGH 폴리펩티드 수용체 각각의 I번 결합 위치를 점유할 수 있지만, hGH 분자는 수용성 중합체가 제II 위치 부에 존재하는 비-유전 암호화 아미노산에 결합되어 있으므로, 상기 hGH 폴리펩티드 수용체는 hGH 폴리펩티드 리간드의 제II 위치 부위를 점유할 수는 없으며, 이량체 또는 다량체는 hGH 폴리펩티드 길항체로서 작용하게 된다. 몇몇 구체예에서, 이량체 또는 다량체를 포함하는 hGH 폴리펩티드에 속하는 하나 이상의 hGH 분자는 제I 위치 결합 부위 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합되어 있는 비천연 암호화 아미노산을 포함하므로, 제II 위치 부위에 결합할 수 있다. 대안적으로, 몇몇 구체예에서, 이량체 또는 다량체를 포함하는 hGH 폴리펩티드 내에 존재하는 하나 이상의 hGH 분자는, 제I 위치 또는 제II 위치 결합 부위 내에 존재하지 않는 위치에 존재하는 수용성 중합체에 결합되어 있는 비천연 암호화 아미노산을 포함하므로, 상기 양 위치들은 결합에 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, hGH 분자는, 제I 위치나 제II 위치를 가지도록 조합될 수 있거나, 또는 결합에 사용되는 두 위치를 모두 가지도록 조합될 수 있다. hGH 분자의 조합체 중 하나 이상이 결합에 사용될 제I 위치를 가지고, 하나 이상이 결합에 사용될 제II 위치를 가지도록 상기 hGH 분자를 조합하여, 원하는 활성 또는 특성을 갖는 분자를 제공할 수 있다. 뿐만 아니라, 결합에 사용될 수 있는 상기 제I 위치와 제II 위치를 모두 가지는 hGH 분자를 조합하면 초-작동제인 hGH 분자를 생산할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드는 직접적으로 결합하거나, 또는 예를 들어, Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 이황화 결합을 통하여 결합 된다. 몇몇 구체예에서, 결합형 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원은 이량체화를 촉진하는 상이한 비천연 암호화 아미노산을 포함할 것이다.
대안적으로, 상기 2개의 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원은 링커에 의해 결합 된다. 임의의 이종- 또는 동종-이작용성 링커가 상기 2개의 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드를 결합하는데에 사용될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 동일하거나 또는 상이한 1차 서열을 보유할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드를 묶어주는 데에 사용된 링커는 모두 이중 작용성 PEG 시약일 수 있다. 이러한 링커는 분자량 또는 분자의 길이가 다양할 수 있다. 보다 크거나, 또는 보다 작은 분자량을 갖는 링커는 hGH과 결합된 실체 사이의 공간적 관계나 형태를 바람직하게 만들어주는데에 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 아령 모양의 구조를 갖는 수용성 이중 작용성 링커를 제공하는데, 이 링커는 a) 중합체 주쇄의 첫 번째 말단 이후로 제1 작용기를 포함하고, b) 중합체 주쇄의 두 번째 말단 이후로 제2 작용기를 포함한다. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 비 반응성이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 분지형 분자 구조 중 하나 이상의 팔을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 덴드리머형일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 GH 초 유전자군의 일원인 hGH(수용성 활성화 중합체와의 반응에 의해 형성됨)를 포함하는 다량체를 제공한다.
XVIII. 투여 방법 및 약학 조성물
본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어, 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하는 hGH, 합성 효소, 단백질 등)은, 예를 들어, 적당한 약학 담체와 함께 치료용으로서 사용되기도 한다. 예를 들어, 이러한 조성물은 치료학적으로 유효량의 화합물과, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로서는 염수, 완충 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제형은 투여 방식에 맞추어 제조된다. 일반적으로 단백질 투여 방법은 당 업자에게 널리 알려져 있으며, 본 발명의 폴리펩티드의 투여 방법에 맞추어질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 치료 조성물은 당 업자에게 공지된 방법에 따라서, 하나 이상의 적당한 시험관 내 및/또는 생체 내 동물 질병 모델 내에서 임의로 시험되어, 효능과 조직 대사를 확인하고 투여량을 측정할 수 있다. 특히, 투여량은 처음에는 상대적 검정법에서, 활성, 안정성 또는 기타 척도 즉, 천연 아미노산 상동체에 대한 인위적 아미노산 상동체의 비교 결과(예를 들어, 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하도록 변형된 hGH 폴리펩티드와 천연 아미노산 hGH 폴리펩티드의 비교)에 의해 결정될 수 있다.
분자를 혈액이나 조직 세포와 궁극적으로 접촉하도록 도입시키는데에 보통 사용되는 경로 중 임의의 경로에 의하여 투여가 이루어진다. 본 발명의 인위적 아미노산 폴리펩티드는 임의의 적당한 방식으로 투여되는데, 임의로는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여된다. 이러한 본 발명의 폴리펩티드를 환자에게 투여하는데에 적당한 방법이 행하여 질 수 있고, 한 가지 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데에 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 다른 경로보다 더욱 즉효적이고 효과적인 작용 또는 반응을 나타낼 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는, 부분적으로는 투여되는 특정 조성물에 의해 결정되고, 또한 이 조성물을 투여하는데에 사용된 특정 방법에 의해서도 결정된다. 그러므로, 본 발명의 약학 조성물의 적당한 제형이 다양하게 존재할 수 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 단백질 또는 펩티드에 적당한 임의의 통상적 경로 예를 들어, 비 경구 투여 경로 예를 들어, 주사 예를 들어, 피하 주사 또는 정맥 내 주사, 또는 주사나 주입에 관한 임의의 기타 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 조성물은 다수의 경로 예를 들어, 경구 투여, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 국소 투여, 설하 투여 또는 직장 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. (변형 또는 변형되지 않은) 인위적 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 투여 경로 및 적당한 제형에 관하여는 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있다. 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 기타 적당한 성분 예를 들어, 약학 담체와 함께 투여될 수 있다.
비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 단독으로, 또는 기타 적당한 성분들과 함께 에어로졸 제형으로 제조되어(즉, "분무화"되어), 흡입에 의해 투여될 수 있다. 에어로졸 제형은 허용 가능한 가압 추진제 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 프로판 및 질소 등이 담긴 용기에 넣을 수 있다.
비 경구 투여용 예를 들어, 관절 내(관절의 내부), 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복강 내 및 피하 투여용으로서 적당한 제형은, 수성 및 비 수성, 등장성 멸균 주사 용액(산화 방지제, 완충액, 정균제 및 제형을 투여받는 개체의 혈액과 등장성이 되도록 만들어 주는 용질 함유), 그리고 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비 수성 멸균 현탁액을 포함한다. hGH의 제형은 단위 투여용 또는 복수 투여용 밀봉 용기 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있다.
비 경구 투여 및 정맥 내 투여는 투여 방법으로서 바람직하다. 특히, 천연 아미노산 상동체 치료제 용으로 이미 사용되고 있는 투여 경로(예를 들어, EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및/또는 기타 임의의 약학적으로 전달될 단백질 용으로 사용되고 있는 투여 경로)는, 현재 사용되고 있는 제형과 함께, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다.
본 발명에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은, 용도에 따라서 경시적으로 환자의 체 내에서 유리한 치료 반응을 나타내거나, 또는 기타 적당한 활성을 나타내는데에 충분하다. 투여량은 특정 벡터 또는 제형의 효능, 그리고 사용된 인위적 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기와 환자의 상태뿐만 아니라, 치료 받을 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 투여량은 또한 특정 벡터나 제형 등을 특정 환자에게 투여하였을 때에 동반되는 임의의 부작용 발생 여부, 특징 및 정도에 의해 결정된다.
질병(예를 들어, 암, 유전병, 당뇨병 또는 AIDS 등)의 치료 또는 예방 시 투여되는 벡터 또는 제형의 유효량을 결정함에 있어서, 전문의는 순환 혈장 내 수준, 제형 독성, 질병의 진행 상태 및/또는 관련이 있는 경우에는, 항-인위적 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산 수준을 고려한다.
예를 들어, 체중 70㎏인 환자의 경우 투여될 투여량은, 통상적으로 관련 조성물의 활성이나 혈청 반감기가 변함에 따라서 맞추어지는, 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 같다. 본 발명의 벡터 또는 약학 제형은 공지된 임의의 통상적 치료법 예를 들어, 항체 투여, 백신 투여, 세포 독성 제제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체 또는 생물 반응 개질제 등의 투여에 의해 치료 조건을 보완할 수 있다.
투여에 있어서, 본 발명의 제형은 관련 제형의 LD-50 또는 ED-50에 의해 결정된 비율 및/또는 다양한 농도(예를 들어, 환자의 체중 및 전체적 건강 상태에 따라 맞추어질 농도)에서의 인위적 아미노산 폴리펩티드에 의한 부작용 관찰 결과에 따라서 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여될 수 있다.
만일, 현재 제형을 주입받고 있는 환자가 발열, 오한 또는 근육통을 겪고 있다면, 이 환자는 적당한 양의 아스피린, 이부프로펜, 아세타미노펜 또는 기타 진통제/해열제를 복용한다. 주입시 반응 예를 들어, 발열, 근육통 및 오한과 같은 반응을 겪고 있는 환자는 다음번 주입하기 30분 전에 미리 아스피린, 아세타미노펜 또는 예를 들어, 디펜히드라민을 복용한다. 메페리딘은 해열제와 항히스타민제에 대한 반응이 더뎌져서 오한과 근육통이 더욱 심해질 때에 사용한다. 세포 주입은 반응의 중증도에 따라서 천천히 하거나 또는 중단할 수 있다.
본 발명의 인간 hGH 폴리펩티드는 포유동물 개체에 직접 투여될 수 있다. 투여 경로는 개체에 hGH 폴리펩티드를 도입하는데에 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 본 발명의 구체예에 따른 hGH 폴리펩티드 조성물은, 비록 주어진 상황에 가장 적당한 경로는 치료될 병상의 특성과 중증도에 따라 달라지겠지만, 경구 투여, 직장 내 투여, 국소 투여, 흡입(예를 들어, 에어로졸), 협측 투여(예를 들어, 설하), 질내 투여, 비 경구 투여(예를 들어, 피하, 근육 내, 피 내, 관절 내, 흉박 공간 내, 복강 내, 뇌 내, 동맥 내 또는 정맥 내 투여), 국소 투여(즉, 피부와 점막 표면 예를 들어, 기도 표면) 및 경피 투여용으로 적당한 조성물을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 화합물의 제형은 단위 투여용 또는 복수 투여용 밀봉 용기 예를 들어, 앰플이나 바이알 내에 제공될 수 있다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 단위 투여용 주사 제제(예를 들어, 용액, 현탁액 또는 유액)으로 혼합물 중에 제조될 수 있다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 또한 연속 주입(예를 들어, 미니펌프 예를 들어, 삼투압 펌프 사용), 단일 복용 환약 또는 서방형 데포 제형으로써 투여될 수 있다.
투여에 적당한 제형은 수성 및 비 수성 용액, 등장성 멸균 주사 용액(산화 방지제, 완충액, 정균제 및 제형을 등장성이 되도록 만들어 주는 용질 함유), 그리고 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비 수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 이미 기술된 유형의 정제로 제조될 수 있다.
동결-건조는 본 발명의 단백질 제제로부터 물을 제거하는데에 흔히 사용되는 단백질 제공 기술이다. 동결-건조 또는 동결 건조법은, 건조될 물질이 처음에 동결되었다가, 이후 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경 하에서 승화되어 제거되는 것을 원리로 하는 방법이다. 부형제는 미리 동결 건조된 제형에 포함되어 동결-건조 과정 동안에 안정성을 증강시키고/증강시키거나, 저장시 동결된 생산물의 안정성을 개선시킬 수 있다[Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) 및 Arakawa외 다수 Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)].
약제의 분무 건조법도 당 업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Broadhead, J.외 다수, "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]을 참조하시오. 소 분자 약제에 더하여, 다양한 생물 물질들 예를 들어, 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모가 분무 건조되었다. 분무 건조법은 액상 약학 제제를 미세하고, 먼지가 일지 않거나 또는 응집된 분말을 한번에 변환시킬 수 있기 때문에 유용한 기술이다. 이의 기본 원리는 다음과 같이 4단계로 이루어져 있다: a) 공급 용액을 스프레이에 분무하는 단계 ; b) 스프레이와 공기를 접촉시키는 단계; c) 스프레이를 건조시키는 단계; 및 d) 건조 공기로부터 건조된 생산물을 분리하는 단계. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,235,710호 및 동 제6,001,800호에는, 분무 건조법에 의해 재조합 적혈구 생성 촉진 인자의 제조 방법에 관하여 기술되어 있다.
본 발명의 약학 조성물 및 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물과, 조성물을 투여하는데에 사용되는 특정 방법에 의해서 결정된다. 그러므로, 본 발명의 약학 조성물(임의로는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 포함)로 이루어진 적당한 제형이 다수 존재한다[예를 들어, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985 참조].
적당한 담체로서는, 숙신산염, 인산염, 붕산염, HEPES, 시트르산염, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 이미다졸, 아세트산염, 중탄산염 및 기타 유기산을 함유하는 완충액; 산화 방지제 예를 들어, 아스코르브산; 저 분자량 폴리펩티드 예를 들어, 약 10개 이하의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 단백질 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 아스파라긴, 아르기닌, 글루타메이트 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예를 들어, 트레할로즈, 수크로즈, 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들어, EDTA; 2가 금속 이온 예를 들어, 아연, 코발트 또는 구리의 이온; 당 알콜 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 짝 이온 예를 들어, 나트륨 이온; 및/또는 비이온계 계면 활성제 예를 들어, 트윈(Tween)™(예를 들어, 트윈 80(폴리소르베이트 80) 및 트윈 20(폴리소르베이트 20; PS20)), 플루로닉스(Pluronics)™ 및 기타 플루론산 예를 들어, 플루론산 F68(폴록사머 188) 또는 PEG를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적당한 계면 활성제로서는 예를 들어, 폴리(산화에틸렌)-폴리(산화프로필렌)-폴리(산화에틸렌)게 폴리에테르 즉, (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(산화프로필렌)-폴리(산화에틸렌)-폴리(산화프로필렌) 즉, (PPO-PEO-PPO), 또는 이들의 조합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 플루로닉스™, R-플루로닉스™, 테트로닉스(Tetronics)™ 및 R-테트로닉스(R-Tetronics)™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)으로 시판되고 있으며, 또한 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제4,820,352호에 상세히 기술되어 있다. 기타 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체도 적당한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제들의 조합물은, 하나 이상의 스트레스 예를 들어, 진동으로부터 받는 스트레스에 대하여 PEG화된 hGH를 안정화하는데에 사용될 수 있다. 전술한 계면활성제 중 일부는 "팽창제(bulking agents)"라고도 칭할 수 있다. 일부는 또한 "강장 개선제(tonicity modifiers)"라고도 칭할 수 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드 예를 들어, 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합된 hGH 폴리펩티드는 또한 지연 방출형 시스템으로서 또는 그의 일부로서 투여될 수도 있다. 지연 방출형 조성물은 예를 들어, 성형된 제품 예를 들어, 필름 또는 미세 캡슐의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 지연 방출형 매트릭스는 생체 혼화성 재료 예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)[Langer외 다수, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)], 아세트산 에틸렌 비닐[Langer외 다수, 상동] 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 [EP 133,988], 폴리락티드(폴리락트산)[미국 특허 제3,773,919호; EP 58,481], 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 다가 무수물, L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman외 다수, Biopolymers, 22, 547-556 (1983)], 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 황산콘드로이친, 카복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 이소루신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 지연 방출형 조성물은 또한 리포좀으로 포집된 화합물을 포함한다. 화합물을 함유하는 리포좀은 다음과 같은 문헌에 개시된 방법에 의하여 제조된다: DE 3,218,121; Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; 미국 특허 제4,619,794호; EP 143,949; 미국 특허 제5,021,234호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 EP 102,324를 포함한다. 상기 참고 문헌 및 특허는 모두 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
리포좀으로 포집된 hGH 폴리펩티드는 예를 들어, 문헌[DE 3,218,121; Eppstein외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; 미국 특허 제4,619,794호; EP 143,949; 미국 특허 제5,021,234호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 EP 102,324]에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 널리 공지되어 있으며, 당 업자에 의하여 실험을 통해 용이하게 결정될 수 있다. 리포좀의 몇몇 예에 관하여는 예를 들어, 문헌[Park JW외 다수., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC외 다수, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW외 다수, Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB외 다수, Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3): 109-118 (2002); Mamot C외 다수, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 개시되어 있다. 상기 참고 문헌 및 특허는 모두 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
본 발명에 있어서 환자에게 투여된 투여량은 시간이 경과함에 따라서 개체에게 유리한 반응을 일으키기에 충분하여야 한다. 비 경구 투여될 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 총 약학적 유효량은, 치료적 판단에 따라서 좌우되겠지만, 일반적으로는 약 0.01∼약 100 ㎍/㎏/일, 또는 환자 체중 1㎏당 약 0.05∼약 1 ㎎/㎏이다. 투여 횟수는 또한 치료적 판단에 따라서 다르며, 인간에 대하여 사용 승인을 받은 시판 hGH 폴리펩티드 제품들보다 더 자주 투여될 수 있거나, 더 드물게 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 PEG화된 hGH 폴리펩티드는 전술한 투여 경로 중 임의의 경로를 통하여 투여될 수 있다.
당 업자는 전술한 바를 이용하여 본 발명을 충분히 응용할 수 있다. 이하 실시예는 예시를 위한 것이지, 어떠한 방식으로든 본 발명의 청구항이나 본 발명의 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다.
이하 실시예는 예시를 위한 목적으로서 제공되는 것이며, 본 발명의 청구 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
8 리터 규모 발효
본 실시예는 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 사용되는 발현 방법에 관하여 기술하고 있다. 숙주 세포는 직교 tRNA, 직교형 아미노아실 tRNA 합성 효소 및 선택 코돈을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 구조물로 형질 감염시켰다.
제조 방법
멸균 염기인 5.5 M의 탄산칼륨(0.5 ℓ)를 제조한 후, 증기 또는 여과에 의해 멸균하였다. 멸균 25%(v/v) 폴리알킬렌 소포제 예를 들어, 스트럭톨(Struktol) J673(0.1 ℓ)을 준비하고 이 또한 증기로 멸균하였다. 산은 첨가하지 않았다. 농축 공급 배지(정확히 4 ℓ)를 준비하고, 이를 여과하여 멸균시킨 다음, 멸균 탱크 또는 생물 공정 백에 집어넣었다.
발효조를 환경 설정하였다. 이 발효조를 3.91 ℓ 기저 염 용액(base salt solution)으로 멸균하였다. 발효조를 다음과 같은 조건 하에 두었다: 온도 = 37℃, pH = 6.9, 1 VVM 공기. 0.092 ℓ 농축 공급 배지를 발효조에 첨가하였다. 50 ㎎/㎖의 카나마이신을 4 ㎖ 첨가하였다.
글리세롤 및 아라비노즈(임의로는 효모 추출물) 용액과 다음과 같은 시약을 준비하였다:
미량 금속(증기 멸균 또는 여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ
Na3 시트르산염 74
FeCl3.6H2O 27
CoCl2.6H2O 2
Na2MoO4.2H2O 2
ZnSO4.7H2O 3
MnSO4.nH2O 2
CuCl2.2H2O 1.3
CaCl2.2H2O 1
H3BO3 0.5
비타민(여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ
니아신 6.1
판토텐산 5.4
피리독신.HCl 1.4
티아민.HCl 1
리보플라빈 0.42
바이오틴 0.06
엽산 0.04
글루코즈(증기 멸균 또는 여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ ℓ
글루코즈 600 1.8∼2
1 M MgSO4 (증기 멸균 또는 여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ
MgSO4.7H2O 246
황산 암모늄, 400 g/ℓ(증기 멸균 또는 여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ
황산 암모늄 400
5.5 M K2CO3 (증기 멸균 또는 여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ또는 ℓ/ℓ
K2CO3 760
H2O 0.76
1M L-루신 (여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ또는 ℓ/ℓ
L-루신 131
진한 HCl 0.1
1M L-이소루신 (여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ또는 ℓ/ℓ
L-이소루신 131
진한 HCl 0.1
기저 염, 1× (증기 멸균 또는 여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ또는 ℓ/ℓ
Na2HPO4.7H2O 15.4
KH2PO4 6.8
NH4Cl4 4
농축 공급액
성분 ℓ/ℓ
황산 암모늄 용액 0.194
글루코즈 용액 0.537
마그네슘 용액 0.029
미량 금속 농축 용액 0.045
비타민 농축 용액 0.045
L-이소루신 0.054
L-루신 0.096
회분 배지
성분 g/ℓ 또는 ℓ/ℓ
기저 염 용액(1×) 0.977
농축 공급 배지 0.023
공정
이하 표 2에는 수행된 공정에 관하여 기술되어 있다.
일 시계 시간(시) 작업 내용
-2 0800 -46 1㎕의 글리세롤 스톡을 이용하여 초기 배양(2 ㎖)을 개시하였다. 배양액을 OD600이 2∼6이 될 때까지 37℃및 250 rpm에서 진탕 시켰다.
-1 0800 -22 150 ㎕의 초기 배양액을 정확히 150 ㎖인 배지(진탕 배양용 플라스크)에 넣었다. 배양액을 통기 해 주면서 28∼37℃에서 OD600이 2∼5가 될 때까지 항온 처리하였다.
1 0600 0 종균 배양액 100 ㎖를 발효조에 넣었다.
1 1400 8 공급 펌프의 작동을 개시하였다. 정확한 작동 시간은 배양액이 회분 영양소를 다 소비할 때로 정하였다. 농축 공급 배지 약 2.6 ℓ를 19.5 시간에 걸쳐서 배양액에 공급하였다(현재 공급 스케쥴에 따름). 최소 공급 속도는 0.31 ㎖/분으로 하였으며, 최대 공급 속도는 6 ㎖/분으로 하였다. 필요에 따라서, DO(용해 산소)는 교반 및 산소 공급의 연속 과정으로 조절하였다.
2 0830 26.5 80% 글리세롤 환약 200 ㎖를 배양액에 첨가하고, 공급 스케쥴은 농축 공급액을 가할 때와 같이 유지시켰다.
2 0930 27.5 농축 공급액의 공급을 중단하였다. 공급액을 40% 글리세롤 용액으로 바꾸고, 공급 라인을 정화하였다. 공급도 중단하였다. 비천연 아미노산 pAF를 최종 농도 4 mM이 될 때까지 첨가하였다. 20% 아라비노즈 환약 8 ㎖로 배양액의 발현을 유도하였다.
2 1130 29.5 40% 글리세롤 공급액의 공급을 시작하였다.
2 1930 37.5 세포를 수집하였다. 밀집 습윤 세포 밀도(tight wet cell density)는 0.2∼0.3 ㎏/ℓ로 하였다. 세포 페이스트를 -80℃에 동결시켰다.
공급 스케쥴은 이하 표 3에 나타내었으며, 발효 공급액의 유량은 도 1에 나타내었다. 도 2 또한 참조하시오.
대략적 시간(시) 유량 (㎖/분) 주의
0 0 나타낸 시간은 접종 후의 시간이다.
8 0
8 0.31 유량은 한 세트 시점에서 다음 세트 시점으로 비례하여 증가시켰다.
10 0.42
12 0.57
14 0.77
16 1.04
18 1.40
20 1.90
22 2.57
24 3.47
26 4.69
27.5 6.00 발효 라인을 40%의 글리세롤로 정화한 후 27.5 시간 경과시 흐름을 중단시켰다.
27.5 0.00
29.5 0
29.5 1.90 40% 글리세롤 공급은 29.5 시에 개시하였다.
37.5 1.90
37.5 0 발효물을 수집하였다.
본 공정에 있어서 유도 단계(단계 IV) 및 수집 단계(단계 V)에 변형을 가하였다. 배양액의 OD600이 약 100∼120에 이르렀을 때, a) 글리세롤 환약을 유도 단계에 들어가기 1시간 30분 전에 투여하였고; b) 또한 유도 단계에 들어가기 1 시간 전에 pAF를 가하여 효모 추출물/글리세롤을 공급하기 시작하였으며; c) 그 다음, 유도 단계에 들어갔을 때 아라비노즈를 첨가하여; d) 8시간 동안 유도를 진행시켰다.
실시예 2
hGH 정제, PEG화 및 hGH-PEG 정제 공정용 세포질 제조(이. 콜라이 사용)
1. 세포 분해 및 hGH 산화
850 g의 박테리아 세포 펠렛을 2550 ㎖(3 부피)의 20 mM TRIS(pH8.5) 용해 완충액 중에 재현탁하여, 25%가 고체인 혼합물을 만들었다. 발효액 중 약 4 ℓ의 배양액으로부터 850 g의 박테리아 펠렛을 얻을 것이다. 이 혼합물을 실온에서 30∼60 분 동안 교반 하고, 현탁액을 미세 유동화 처리기(Microfluidizer)에 2회 통과시켜 15,000 psi에서 냉각시켰다. 4℃에서 45분 동안 원심 분리시키고(JA 10 로터)(13,500 × g), 상청액을 수집하였다. 새로이 제조된 0.1 M GSSG(FW 612.6)를 첨가하여 GSSG:hGH의 몰비를 약 16으로 만들었다. 혼합물을 교반하여 잘 섞고, 1 M의 NaOH로 pH를 7.2∼7.4로 맞추었다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 잘 교반한 후, 전도율이 1.6∼1.9 mS/㎝가 될 때까지 물로 희석시켰다. 이 시료를 "GHQFF로드"라고 명명하였다.
2. 컬럼 1 - Q 세파로즈 FF 크로마토그래피
컬럼 치수는 다음과 같았다: INdEX100/500, lOO ㎜ I.D. x 21.5 cm = 1688 ㎖. GHQFF 완충액 A는 전도율이 0.5 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS(pH 6.5)로 이루어져 있으며, GHQFF 완충액 B는 전도율이 90 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS, 1 M NaCl(pH 6.5)로 이루어져 있었다. 시료를 처리하는데에 있어서의 유량은 90 ㎖/분으로 하였으며, 세척하는데에 있어서의 유량은 40 ㎖/분으로 하였다.
AKTA 시스템은 발열 방지 처리하였다. QFF 컬럼을 발열 방지 처리 및 평형 처리하기 위해서, "QFF 디파이 에퀴(QFF depy equi)" 프로그램을 이용하였는데: 이 때, 이 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ 물과 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고 30분 동안 항온 처리한 후, 3 컬럼 부피의 GHQFF 완충액 B로 세척하고 나서, 다시 4 컬럼 부피의 GHQFF 완충액 A로 평형 처리하였다.
시료 "GHQFF로드"를 음이온 교환 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 GH QFF 완충액 A로 세척한 다음, 4 컬럼 부피의 6% GHQFF 완충액 B(완충액 A 중)와 함께 용리하였다. 주요 피크를 나타내는 분획을 수집하였다. 시료 수집은 대략 0.85 mS/cm 및 166 mAU인 시점에서 개시하였으며, 약 220 mAU인 시점에서 종결하였다. 수집된 용리액을 "GHQFF풀"이라 명명하였으며, 이때의 용리액은 갈색 계통의 오렌지색이었다. 상기 풀을 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 3개의 회분에서 얻어진 단계별 평균 수율은 84.7%이었다.
컬럼을 2∼3 컬럼 부피의 GHQFF 완충액 B로 세척하였다. 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl을 안으로 펌핑하고, 컬럼을 1∼6일 동안 항온 처리하였다. 만일 컬럼을 6일 이내에 사용하지 않는다면, 이 컬럼을 1 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl, 3 컬럼 부피의 완충액 B, 2 컬럼 부피의 MilliQ 물, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH로 헹구었다.
3∼5 주기마다 컬럼을 추가로 세척하였다. 1 M NaOH/1 M NaCl과 함께 항온 처리한 후, 다음과 같은 단계들을 수행하였다: 2.5 컬럼 부피의 Q 컬럼 세정 완충액을 사용하여 상향류 방식으로 컬럼을 세척하고, 60∼80 시간 동안 항온 처리한 다음, 1.5 컬럼 부피의 MilliQ 물, 1 컬럼 부피의 0∼70% EtOH, 5 컬럼 부피의 70% EtOH, 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH로 세척하였다. Q 컬럼 세정 완충액은 0.5% Triton X-1OO과 0.1 M 아세트산으로 이루어져 있다.
3. UF/DF (한외 여과/다이아필터링) I
다음과 같은 필터를 이용하여 본 공정을 수행하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트(Sartorius Sartocon Slice 1OK Hydrosart cassette), 1000 ㎠. GHQFF풀 시료는 약 450 ㎖(또는 체류 플라스크(retentate flask) 내 약 200 ㎖)로 농축하였다. 이후, 이 시료를 2.7 ℓ(6 부피)의 GHCHT 완충액 A(10 mM Bis-TRIS, 1 mM MgCl2(pH 6.3) 포함)로 다이아필터링하였다. 체류액(retentate)을 수집한 후, 시스템을 300 ㎖의 완충액으로 헹구고, 이 헹굼 용액을 체류액과 합하였다. 이 체류액을 4,000 rpm (2,862 x g)에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 수집하였다. 이 상청액을 "GHCHT로드"라 명명하였다. 이 시료를 2 시간 이내에 처리하거나 또는 4℃에서 밤새도록 보관하여 두었다.
4. 컬럼 2 - 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT) 크로마토그래피(제I형 CHT, 40 ㎛)
컬럼 치수는 다음과 같았다: INdEX100/500, lOO ㎜ I.D. x 10.5 cm = 824㎖. GHCHT 완충액 A는 전도율이 0.94 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS, 1mM MgCl2(pH 6.3)로 이루어져 있으며, GHCHT 완충액 B는 전도율이 80.5 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS, 0.5 M MgCl2(pH 6.3)로 이루어져 있었다. 시료를 처리하는데에 있어서의 유량은 90 ㎖/분으로 하였으며, 세정하는데에 있어서의 유량은 40 ㎖/분으로 하였다.
AKTA 시스템은 발열 방지처리하였다. CHT 컬럼을 발열 방지 처리 및 평형 처리하기 위해서, "CHT 디파이 에퀴(CHT depy equi)" 프로그램을 이용하였는데: 이 때, 이 CHT 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ 물과 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고 30분 동안 항온 처리한 후, 3 컬럼 부피의 0.5 M NaPO4/pH 7.0로 세척하고 나서, 다시 4 컬럼 부피의 GHCHT 완충액 A로 평형 처리하였다. 이후 GHCHT로드 시료를 컬럼 상에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 GHCHT 완충액 A로 세척하였다.
0∼40% GHCHT 완충액 B(5 컬럼 부피)로 선형 구배를, 40% GHCHT 완충액 B(3 컬럼 부피)로 계단식 구배를 걸어주어 용리한 다음, 100% GHCHT 완충액 B(2 컬럼 부피)로 세척하였다. 주요 피크를 나타내는 분획을 수집하였다. 수집은 28% GHCHT 완충액 B, 약 26mAU, 20mS/cm일 때에 시작하여, 40% GHCHT 완충액 B, 약 86mAU, 34mS/cm일 때에 종결하였다. 수집한 용리액을 "GHCHT풀"이라 명명하였다. 이 풀을 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 3개의 회분에서 얻어진 단계별 평균 수율은 96.3%이었다.
CHT 컬럼을 3 컬럼 부피의 0.5 M NaPO4/pH 7.0로 세척하였다. 이 컬럼을 이 인산염 완충액 중에 담가두거나, 또는 다음과 같이 처리하였다: 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1 M NaCl, 3 컬럼 부피의 0.5 M NaPO4/pH 7.0, 2.5 컬럼 부피의 MilliQ 물, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH를 이용하여 상향류 방식으로 컬럼을 세척하였다.
5. 컬럼 3 - 페닐 세파로즈 HP 크로마토그래피
컬럼 치수는 다음과 같았다: INdEX100/500, lOO ㎜ I.D. x 9.7 cm = 761㎖. GHPhe 완충액 A는 전도율이 163 mS/cm로서, 20 mM NaPO4, 2 M NaCl(pH 7.0)로 이루어져 있으며, GHPhe 완충액 B는 전도율이 3.2 mS/cm로서, 20 mM NaPO4(pH 7.0)로 이루어져 있었다. 시료를 처리하는데에 있어서의 유량은 90 ㎖/분으로 하였으며, 세정하는데에 있어서의 유량은 40 ㎖/분으로 하였다.
AKTA 시스템은 발열 방지 처리하였다. Phe 컬럼을 발열 방지 처리 및 평형 처리하기 위해서, "PheHP 디파이 에퀴(PheHP depy equi)" 프로그램을 이용하였는데: 이 때, 이 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ 물과 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고 30분 동안 항온 처리한 후, 4 컬럼 부피의 GHPhe 완충액 A로 평형 처리하였다.
고형 NaCl을 GHCHT풀에 첨가하여 2 M이 되게 만들었다. 이 혼합물을 실온에서 1∼2 시간 동안 교반하여 용해시키고, 이 용액을 약 20℃로 승온시켰다. NaCl의 필요량 (Z g)을 계산하였다: (V + Z/4000) x 2 x 58.44 = Z, 또는 Z = 116.88V/(1- 116.88/4000)[여기서, V는 GHCHT풀의 부피(ℓ)임].
GHCHT풀 + NaCl 혼합물을 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 3 컬럼 부피의 GHPhe 완충액 A로 세척하였다. 용리는 다음과 같이 여러 가지로 구배를 걸어주어 수행하였다: 10% GHPhe 완충액 B(3 컬럼 부피), 10∼80% GHPhe 완충액 B(7 컬럼 부피), 80% GHPhe 완충액 B(2 컬럼 부피) 및 100% GHPhe 완충액 B(3 컬럼 부피). 주요 피크를 나타내는 분획을 수집하였다. 수집은 46.7% GHPhe 완충액 B, 약 17.3mAU, 111mS/cm일 때에 시작하여, 80% GHPhe 완충액 B, 약 43mAU, 54mS/cm일 때에 종결하였다. 수집한 용리액을 "GHPhe풀"(무색 용액)이라 명명하였다. 그 다음 단계를 2 시간 이내에 수행하거나, 그렇지 않을 경우에는 이 풀을 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 3개의 회분에서 얻어진 단계별 평균 수율은 94.6%이었다.
상기 Phe 컬럼을 2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 이용하여 상향류 방식으로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 다음, 3 컬럼 부피의 GHPhe 완충액 A, 3 컬럼 부피의 MilliQ 물, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH로 세척하였다. 3∼5 주기 수행 이후, Phe 컬럼을 2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 사용하여 상향류 방식으로 세척하고, 30분 동안 항온 처리하였으며, 3 컬럼 부피의 GHPhe 완충액 A, 3 컬럼 부피의 MilliQ 물, 0∼70% EtOH(1 컬럼 부피), 3 컬럼 부피의 70% EtOH로 세척하고, 20% EtOH 중에 보관하였다.
6. UF/DF (한외 여과/다이아필터링) II
다음과 같은 필터를 이용하여 본 공정을 수행하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 1000 ㎠. GHPhe 풀을 약 450 ㎖(또는 체류 플라스크 중 약 200 ㎖)가 될 때까지 농축하였다. 이후, 이것을 20 mM 구연산나트륨, 20 g/ℓ 글리신 및 5 g/ℓ 만니톨(pH 6.0)로 이루어진 2.7 ℓ(6-부피)의 GH 제형 완충액과 함께 다이아필터링하였다. 이 시료를 약 360 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 체류액을 수집하였다. 이 시스템을 300 ㎖의 GH 제형 완충액으로 헹구고, 헹굼 용액을 체류액과 합하였다. 이 체류액을 4,000 rpm (2,862 x g)에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 수집하였다. 상청액을 "Y35pAF-cBx" 또는 "공정 내 벌크(in-process bulk)"라 명명하였다. 상기 공정 내 벌크를 분취 하여 -80℃에 보관하였다.
Y35pAF의 전체 수율은 발효액 1ℓ당 435 ㎎이었다. 순도는 3가지의 HPLC 방법(RP-HPLC, SEC-HPLC, IEX-HPLC) 및 SDS- PAGE 분석법을 통한 결과를 바탕으로 하였을 때 90%를 초과하였다.
7.UF/DF (한외 여과/다이아필터링) IIa
다음과 같은 농축기/필터를 사용하여 본 공정을 수행하였다: YM1O 막(63.5 mm)이 장착된 아미콘 교반 셀(Amicon Stirred Cell)(200 ㎖). 반응 완충액은 20 mM 아세트산나트륨, 20 g/ℓ 글리신, 5 g/ℓ 만니톨, 1 mM EDTA(pH 4.0)으로 이루어져 있다. 단계 6으로부터 얻은 공정 내 벌크 일부를 사용하였으며(예를 들어, 250 ㎎의 Y35pAF), pH는 10∼12%(v/v)의 10% 아세트산을 가하여 약 4로 맞추었다. 시료를 25∼50 ㎖가 되도록 농축하고, 반응 완충액을 가하여 부피가 약 180 ㎖가 되도록 만들었다. 이 과정을, 완충액 총 교환량의 500배를 넘을 때까지 반복 수행하였다. 시료를 부피 약 25 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 체류액을 수집하고 2,000 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 임의의 침전물을 제거하였다. 상청액에 날짜와 함께 Y35pAF-cBx/pH4라고 표시하여 두었다.
Y35pAF-cBx/pH4의 단백질 농도는 20-배 희석된 시료의 A276을 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 0.818). 이 반응 완충액을 희석하여, Y35pAF-cBx/pH4의 농도를 8 ㎎/㎖로 맞추었다.
8. PEG화 반응
몰 비 PEG:Y35pAF = 10을 적용하여 30K MPEG-옥시아민의 필요량을 계산하였다. PEG 분말을 측량하여, 이를 실온에서 천천히 8 ㎎/㎖의 Y35pAF 용액에 첨가하고, 각각 첨가한 후 압설기로 혼합하였다. 반응 혼합물을 28℃에서 18∼48 시간 동안 천천히 진탕시켰다. PEG화 여부는 SDS 겔을 전개시켜 확인하였다. 반응을 통해 hGH와 PEG 사이에 옥심 결합이 형성되었다.
9. 컬럼 4 - 공급원 Q 크로마토그래피(30 ㎛)
컬럼의 치수는 다음과 같았다: XK26/20, 26 ㎜ I.D. x 17 ㎝ = 90 ㎖. 공급원 Q 완충액 A(Source Q Buffer A)는 전도율이 0.9 mS/cm로서, 10 mM TRIS(pH 7.0)로 이루어져 있다. 공급원 Q 완충액 B는 전도율이 93 mS/cm로서, 10 mM TRIS, 1 M NaCl(pH 7.0)로 이루어져 있다. 유량은 6 ㎖/분이었다.
AKTA 시스템은 발열 방지 처리하였다. 공급원 Q 컬럼을 발열 방지 처리 및 평형 처리하기 위해서, "공급원 Q 디파이 에퀴(SourceQ depy equi)" 프로그램을 실행하였는데: 이때, 이 공급원 Q 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ 물과 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고 30분 동안 항온 처리한 후, 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 B로 세척한 다음, 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 A로 평형 처리하였다.
20%(v/v)의 0.5 M TRIS 염기를 단계 8의 반응 혼합물에 첨가하였다. 9 부피의 공급원 Q 완충액 A와 10 부피의 MilliQ 물을 이용하여 20배 희석시켰다. 그 다음, 이 혼합물을 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 A로 세척하였다. 0∼10% 공급원 Q 완충액 B(20 컬럼 부피)로 선형 구배를 걸어주면서 용리시켰다. 첫 번째로 주요 피크를 나타내는 분획을 수집하였다. 수집된 용리액에 "공급원 Q 풀"이라 표시하였다. 이 풀을 4℃에서 밤새도록 보관하였다.
10. UF/DF ( 한외 여과/ 다이아필터링 ) III
다음과 같은 농축기/필터를 사용하여 본 공정을 수행하였다: YM1O 막(63.5 mm)이 장착된 아미콘 교반 셀(200 ㎖). WHO 완충액은 2.5 g/ℓ NaHCO3, 20 g/ℓ 글리신, 2 g/ℓ 만니톨, 2 g/ℓ 락토즈(pH 7.3)로 이루어져 있다.
공급원 Q 풀을 20∼30 ㎖가 될 때까지 농축하고 WHO 완충액을 가하여 180 ㎖가 되도록 만들었다. 이 과정을, 완충액 총 교환량의 600배를 넘을 때까지 반복 수행하였다. 시료를 농축하여 2㎎/㎖ 또는 원하는 농도가 되도록 만들었다. 체류액을 수집하고, 후드 내 0.2 ㎛의 막으로 여과 멸균하였다. 멸균 시료를 "PEG30-cY35pAF"라 명명하였다.
PEG30-cY35pAF와 균등한 hGH의 농도는 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 0.818)(3회 희석 및 측정). 단계 7로부터 얻어진 물질의 전체 수율은 약 20%이다. PEG-Y35pAF 순도는 HPLC 및 SDS-PAGE 분석 결과를 바탕으로 하였을 때 95%를 넘었다.
실시예 3
hGH 정제, PEG화 및 hGH-PEG 정제 공정용 세포질 주변 제제(이.콜라이 사용)
1. hGH의 세포질 주변 방출
약 4 리터의 발효액으로부터 얻은 800 그램의 박테리아 세포 펠렛을 3200 ㎖(4 부피)의 PR 완충액(50 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0.07% Triton X-100, pH 8.0; 전도율 = 3 mS/cm)(4∼6℃) 내에 재현탁하여, 20%의 고체를 얻었다. 이 현탁액을 1 시간 동안 4∼6℃에서 교반한 후, 8M의 우레아 150 ㎖를 첨가하여 최종 우레아 농도를 0.3 M이 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 1 시간 동안 4∼6℃에서 교반 하였다. 이 현탁액을 4℃에서 25분 동안 원심 분리하였다(15,000 x g)[J20 로터 (Avanti J20 XP centrifuge-Beckman Coulter)]. 상청액을 수집하고, 그 부피를 측정하였다(약 3.4 ℓ). 시료에 날짜와 함께 "PRS"라고 표시하여 두었다.
2. UF/DF(한외 여과/ 다이아필터링 ) I
다음과 같은 필터를 이용하여 본 공정을 수행하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 1000 ㎠. 부가의 매개 변수로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 여과 유량 = 80 ㎖/분 및 TMP = 약 14 psi.
1N NaOH을 사용하여 이 시스템을 발열 방지 처리하고, 30∼45분 동안 순환시켰다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 약 2 리터의 MilliQ 물로 헹구었다. QFF 완충액 A (10 mM Bis-TRIS, pH 6.5)로 5분 이상 동안 평형 처리하였다. PRS를 부피 약 1.6 리터(또는 체류 용기 내 약 1.4 리터)가 될 때까지 농축시켰다. 이후, 이를 5 부피(약 7 리터)의 QFF 완충액 A와 함께 다이아필터링 하였다. 체류액을 수집한 다음, 이 시스템을 300 ㎖의 완충액으로 헹구고, 헹굼 용액을 체류액과 합하였다. 합한 시료에 "QFF로드"(갈색)라 표시하여 두었다. 이 시료를 2 시간 이내에 처리하거나, 아니면 4℃에 밤새도록 보관하여 두었다.
이 시스템을 MilliQ 물로 헹구고, 1 N NaOH를 30∼45분 동안 순환시켜 세정하였다. 이후 pH가 8 미만이 되었을 때 MilliQ 물을 사용하여 헹굼을 멈추었다. 이 카세트를 0.1N NaOH 중에 보관하여 두었다.
3. 컬럼 1 - Q 세파로즈 FF 크로마토그래피
컬럼 치수는 다음과 같았다: 50 ㎜ I.D. x 6.3 cm = 123 ㎖(XK26/20 컬럼). 유량은 35 ㎖/분이었다. QFF 완충액 A는 전도율이 0.6 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS(pH 6.5)로 이루어져 있었다. 고 염 완충액은 전도율이 156 mS/cm로서, 10 mM TRIS, 2M NaCl(pH 7.0)로 이루어져 있었다. QFF 완충액 B는 전도율이 11.5 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS, 0.1 M NaCl(pH 6.5)로 이루어져 있었다.
AKTA 시스템은 발열 방지처리하였다. 이를 위해 "AKTA 디파이(AKTA depy)" 프로그램을 3회 실행하였는데: 이때, 모든 완충액 라인은 처음 프로그램 실행 시에는 MilliQ 물에 두었고, 이후 두 번째 프로그램 실행 시에는 1N NaOH 중에 두었다. 30분 동안 항온 처리한 다음, 완충액 라인을 다시 MilliQ 물에 두어서 세 번째로 프로그램을 실행하였다. "QFF 디파이 에퀴" 프로그램을 실행하여 발열 방지 처리를 하였으며, QFF 컬럼을 평형 처리시킨 후; 이 QFF 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ H2O와 2 컬럼 부피의 1 N NaOH/1M NaCl로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 후, 3 컬럼 부피의 고염 완충액으로 세척하고 나서, 다시 4 컬럼 부피의 QFF 완충액 A로 평형 처리하였다.
"QFF로드"를 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 QFF 완충액 A와 5.5 컬럼 부피의 15% QFF 완충액 B(완충액 A 중)로 세척하였다. 용리는 4.5 컬럼 부피의 60% QFF 완충액 B(완충액 A 중)와 함께 수행하였으며, 이때 용리 피크를 나타내는 분획을 모았다. 모아진 용리액에 "QFF풀"(밝은 황색)이라 표시하여 두었다. 이 풀을 4℃에서 밤새도록 보관하였다.
컬럼을 3 컬럼 부피의 고염 완충액으로 세척하였다. 이후 3 컬럼 부피의 1 N NaOH/1M NaCl을 안으로 펌핑하고, 컬럼을 1∼6일 동안 항온 처리하였다. 만일 컬럼을 6일 이내에 사용하지 않는다면, 이 컬럼을 1 컬럼 부피의 1 N NaOH/ 1M NaCl, 3 컬럼 부피의 고염 완충액, 3 컬럼 부피의 MilliQ 물, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH 또는 10 mM NaOH로 헹구었다. 3∼5 주기마다 컬럼을 추가로 세척한 후, 1 N NaOH/1 M NaCl과 함께 항온 처리한 다음, 3 컬럼 부피의 Q 컬럼 세정 완충액(0.5% Triton X-1OO, 0.1 M 아세트산)을 사용하여 컬럼을 상향류 방식으로 세척하고, 60∼80 시간 동안 항온 처리한 다음, 1.5 컬럼 부피의 MilliQ 물, 1 컬럼 부피의 0∼70% EtOH, 5 컬럼 부피의 70% EtOH 및 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH로 세척하였다.
4. 컬럼 2 - 페닐 세파로즈 HP 크로마토그래피
컬럼 치수는 다음과 같았다: 50 ㎜ I.D. x 7.5 cm = 147 ㎖(XK26/20 컬럼). 유량은 35 ㎖/분이었다. Phe 완충액 A는 전도율이 156 mS/cm로서, 10 mM TRIS, 2M NaCl(pH 7.0)로 이루어져 있었다. Phe 완충액 B는 전도율이 0.9 mS/cm로서, 10 mM TRIS(pH 7.0)로 이루어져 있었다.
AKTA 시스템은 발열 방지처리하였다. "AKTA 디파이" 프로그램을 3회 실행하였는데: 이때, 모든 완충액 라인은 처음 프로그램 실행 시에는 MilliQ 물에 두었고, 이후 두 번째 프로그램 실행 시에는 1N NaOH 중에 두었다. 30분 동안 항온 처리한 다음, 모든 완충액 라인을 다시 MilliQ 물에 두어서 세 번째로 프로그램을 실행하였다. "PheHP 디파이 에퀴(PheHP depy equi)" 프로그램을 실행하여 발열 방지 처리를 하였으며, Phe 컬럼을 평형 처리시킨 후; 이 QFF 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ H2O와 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 후, 4 컬럼 부피의 Phe 완충액 A로 평형 처리하였다.
고형 NaCl을 QFF 풀에 첨가하여 2 M이 되도록 만들었다. 이 혼합물을 실온에서 1∼2 시간 동안 교반하여 NaCl을 용해시키고, 이 용액을 약 20℃로 승온시켰다. NaCl의 필요량 (Z g)은 다음과 같이 계산하였다: (V + Z/4000) x 2 x 58.44 = Z, 또는 Z = 116.88V/(1- 116.88/4000)[여기서, V는 QFF 풀의 부피(ℓ)임].
QFF풀 + NaCl을 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 Phe 완충액 A로 세척하였다. 용리는 다음과 같이 여러 가지로 구배를 걸어주어 수행하였다: 0∼45% B 선형 구배(10 컬럼 부피), 45% B 단계(2 컬럼 부피) 및 100% B 단계(3 컬럼 부피). 구배 용리 시 주요 피크를 나타내는 분획을 수집하였다. 수집한 용리액에 "Phe풀"(무색 용액)이라 표시하였다. 그 다음 단계를 수행하거나, 그렇지 않으면 이 풀을 4℃에 보관하였다.
2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 사용하여 상기 Phe 컬럼을 상향류 방식으로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 다음, 3 컬럼 부피의 Phe 완충액 A, 3 컬럼 부피의 H2O, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH 또는 10 mM NaOH로 세척하였다. 3∼5 주기 실행 이후, 2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 사용하여 Phe 컬럼을 상향류 방식으로 세척하고, 30분 동안 항온 처리하였으며, 3 컬럼 부피의 GH Phe 완충액 A, 3 컬럼 부피의 H2O, 0∼70% EtOH(1 컬럼 부피), 3 컬럼 부피의 70% EtOH로 세척하고, 마지막으로 20% EtOH 중에 보관하였다.
5. UF/DF (한외 여과/다이아필터링) II
다음과 같은 필터를 이용하여 본 공정을 수행하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 200 ㎠. 부가의 매개 변수로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 여과 유량 = 15 ㎖/분 및 TMP = 약 14 psi. 예비 제형 완충액은 20 mM의 시트르산나트륨, 20 g/ℓ의 글리신, 5 g/ℓ의 만니톨(pH 6.0)(전도율 = 4.7 mS/㎝).
1N NaOH를 사용하여 이 시스템을 발열 방지 처리하고, 30∼45분 동안 순환시켰다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 약 2 리터의 MilliQ 물로 헹구었다. 예비 제형 완충액을 이용하여 5분 이상 동안 평형 처리하였다.
GH Phe 풀을 약 350 ㎖(또는 체류 플라스크 내 약 200 ㎖)로 농축하였다. 이후, 2.1 리터(약 6 부피)의 예비 제형 완충액으로 다이아필터링하였다. 이후 이 시료를 약 350 ㎖가 되도록 농축하고, 체류액을 수집하였다. 이 시스템을 300 ㎖의 완충액으로 헹구고, 이 헹굼 용액을 체류액과 합하였다. 이 체류액을 4,000 rpm (2,862 x g)에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 수집하였다. 상청액에 "Y35pAF-pBx"라 표시하여 두었으며, 이를 또한 "공정 내 벌크"라고도 하였다.
Y35pAF-pBx의 단백질 농도는 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 0.818). 공정 내 벌크를 4℃에 보관할 수 있다. 장기 보관을 위해, 상기 공정 내 벌크를 분취 하여 -80℃에 보관하였다.
MilliQ 물로 이 시스템을 헹구고, 1N NaOH를 30∼45분 동안 순환시켜 세척하였다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 MilliQ 물로 헹구었다. 카세트는 0.1 N NaOH 내에 보관하였다.
6. UF/DF (한외 여과/다이아필터링) IIa
다음과 같은 농축기/필터를 사용하여 본 공정을 수행하였다: YM1O 막(76 mm)이 장착된 아미콘 교반 셀(350 ㎖). 반응 완충액(전도율 = 2.6 mS/㎝)은 20 mM 아세트산나트륨, 20 g/ℓ 글리신, 5 g/ℓ 만니톨, 1 mM EDTA(pH 4.0)로 이루어져 있다.
이 시스템을 파이로클린(Pyroclean)으로 발열 방지 처리하였다. 모든 성분들을 파이로클린 내에서 30분 동안 항온 처리하였다. MilliQ 물로 A205가 0.01 미만이 될 때까지 헹구었다.
상기 공정 내 벌크 일부(300 ㎎)의 pH는, 10%의 아세트산을 10∼12%(v/v) 첨가하여 약 4로 맞추었다. 이 시료를 25∼50 ㎖가 되도록 농축하고, 반응 완충액을 첨가하여 부피 약 350 ㎖가 되도록 만들었다. 이 과정을, 완충액 총 교환량의 500배를 넘을 때까지 반복 수행하였다. 시료를 부피 약 30 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 체류액을 수집하고 2,000 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 임의의 침전물을 제거하였다. 상청액에 날짜와 함께 "Y35pAF-pBx/pH4"라고 표시하여 두었다. 장기 보관을 위해, 상기 공정 내 벌크를 분취하여 -80℃에 보관하였다.
Y35pAF-pBx/pH4의 단백질 농도는 20 배 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 0.818). 반응 완충액으로 희석하여 Y35pAF-pBx/pH4의 농도를 8 ㎎/㎖가 되도록 맞추었다.
7. PEG화 반응
몰 비 PEG:Y35pAF = 5를 적용하여 30K MPEG-옥시아민의 필요량을 계산하였다. PEG 분말을 측량하여, 이를 실온에서 천천히 8 ㎎/㎖의 Y35pAF-pBx/pH4 용액에 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 28℃에서 39∼50 시간 동안 천천히 교반 하면서 놓아두었다. PEG화 여부는 SDS-PAGE를 전개시켜 확인하였다. 반응을 통해 hGH와 PEG 사이에 옥심 결합이 형성되었다.
8. 컬럼 3 - 공급원 Q 크로마토그래피(30 ㎛)
컬럼의 치수는 다음과 같았다: XK26/20, 26 ㎜ I.D. x 17 ㎝ = 90 ㎖. 유량은 8 ㎖/분이었다. 공급원 Q 완충액 A는 전도율이 0.9 mS/cm로서, 10 mM TRIS(pH 7.0)로 이루어져 있다. 공급원 Q 완충액 B는 전도율이 87 mS/cm로서, 10 mM TRIS, 1 M NaCl(pH 7.0)로 이루어져 있다.
AKTA 시스템을 발열 방지 처리하기 위해, "AKTA 디파이" 프로그램을 3회 실행하였는데: 이때, 모든 완충액 라인은 처음 프로그램 실행 시에는 MilliQ 물에 두었고, 이후 두 번째 프로그램 실행 시에는 1N NaOH 중에 두었다. 30분 동안 항온 처리한 다음, 모든 완충액 라인을 다시 MilliQ 물에 두어서 세 번째로 프로그램을 실행하였다. 공급원 Q 컬럼을 발열 방지 처리 및 평형 처리하기 위해서, "공급원 Q 디파이 에퀴" 프로그램을 실행하였는데: 이때, 이 공급원 Q 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ 물과 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고 30분 동안 항온 처리한 후, 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 B로 세척한 다음, 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 A로 평형 처리하였다.
20%(v/v)의 0.5 M TRIS 염기를 이전 단계의 반응 혼합물에 첨가하였다. 9 부피의 공급원 Q 완충액 A와 10 부피의 MilliQ 물을 이용하여 20배 희석시켰다. 희석 물질을 0.45 ㎛ 필터에 통과시켰다. 그 다음, 이 여과물을 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 A로 세척하였다. 0∼10% 공급원 Q 완충액 B(20 컬럼 부피)로 선형 구배를 걸어주어 용리시켰다. 프랙(Frac)-950을 사용하여 용리 분획을 수집하였다(13 ㎖/분획). SDS-PAGE를 첫 번째 주요 피크를 나타내는 분획에 대해 전개하여 풀을 확인하였다. 풀링된 분획에 "공급원 Q 풀"이라 표시하였다. 풀을 밤새도록 4℃에 보관하였다.
9. UF/DF(한외 여과/다이아필터링) III
다음과 같은 농축기/필터를 사용하여 본 공정을 수행하였다: YM1O 막(76 mm)이 장착된 아미콘 교반 셀(350 ㎖). 예비 제형 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨, 20 g/ℓ 글리신, 5 g/ℓ 만니톨(pH 6.0)으로 이루어져 있으며, 전도율은 4.7 mS/㎝였다.
이 시스템을 파이로클린으로 발열 방지 처리하였다. 모든 성분을 파이로클린 중에서 30분 동안 항온 처리하였다. MilliQ 물로 A205가 0.01 미만이 될 때까지 헹구었다.
공급원 Q 풀을 20∼40 ㎖가 될 때까지 농축하고, 예비 제형 완충액을 가하여 부피가 약 350 ㎖가 되도록 만들었다. 이 과정을, 완충액 총 교환량의 600배를 넘을 때까지 반복 수행하였다. 시료를 농축하여 2㎎/㎖ 또는 원하는 농도가 되도록 만들었다. 체류액을 수집하고, 후드 내 0.2 ㎛의 막으로 여과 멸균하였다. 멸균 시료를 "PEG30-pY35pAF"라 명명하였다.
PEG30-pY35pAF와 균등한 hGH의 농도는 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 0.818)(3회 희석 및 측정). PEG-pY35pAF를 4℃에 보관할 수 있다. 장기 보관을 위해, 상기 PEG-pY35pAF를 분취하여 -80℃에 보관하였다.
변종 DH10B(fis)와 W3110(araB 유전자가 녹 아웃됨)을 이용하여 세포질 주변 방출 제조물을 얻었다. 상기 양 변종을 직교 tRNA, 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소와 hGH 구조물로 형질 전환시켰다. PEG-Y35pAF 순도는 HPLC와 SDS-PAGE 분석 결과를 바탕으로 하였을 때 95%를 넘었다.
실시예 4.
hGH 제조법의 비교: 세포질 주변 방출 대 세포질 방출( 균질화 )
도 3의 패널 A 및 패널 B는 이.콜라이 내에서 생산된 hGH의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 것이다. 세포질 주변 방출 회분(발효액 번호 050425B2; 세포 페이스트 800 g)과 세포질 회분(미세 유동화기로 분해; 발효액 번호 050414B1; 세포 페이스트 60 g)을 준비했다. 각 회분을, 123 ㎖들이 Q FF 컬럼에, 10 mM Bis-TRIS(pH 6.5)로 이루어진 QFF 완충액 A와, 10 mM Bis-TRIS(pH 6.5)로 이루어진 QFF 완충액 B, 그리고 0.1M NaCl와 함께 전개시켰다. 3개로 나누어 용리시켰다: 15, 60 및 100% 완충액 B(각각 15 mM NaCl, 60 mM NaCl 및 100 mM NaCl). 분리물을 분취하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 패널 A 및 패널 B의 래인은 다음과 같다: 래인 1 = WHO hGH 표준; 래인 2 = 로딩액; 래인 3 = BE/FT; 래인 4 = 15% 완충액 B; 래인 5 = 60% 완충액 B; 및 래인 6 = 100% 완충액 B.
실시예 5
5 리터 규모 발효 공정
본 실시예는 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 사용되는 발현 방법에 관하여 기술하고 있다. 여기서 사용된 숙주 세포의 변종은 변형된 W3110 세포주였다. 숙주 세포를 직교 tRNA, 직교형 아미노아실 tRNA 합성 효소 및 선택 코돈을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 구조물로 형질 전환시켰다. 공정 흐름도는 도 4에 도시하였다.
제조 방법
다음과 같이 시약들을 제조하였다.
미량 금속(증기 멸균된 것)
성분 g/ℓ
Na3 시트르산염 74
FeCl3.6H2O 27
CoCl2.6H2O 2
Na2MoO4.2H2O 2
ZnSO4.7H2O 3
MnSO4.nH2O 2
CuCl2.2H2O 1.3
CaCl2.2H2O 1
H3BO3 0.5
비타민(여과 멸균된 것)
성분 g/ℓ
니아신 6.1
판토텐산 5.4
피리독신.HCl 1.4
티아민.HCl 1
리보플라빈 0.42
바이오틴 0.06
엽산 0.04
1 M MgSO4 (증기 멸균된 것)
성분 g/ℓ
MgSO4.7H2O 246
15% 수산화 암모늄, 모든 성분에 대해서 NH3*형태
성분 ℓ/ℓ
15% 수산화암모늄 1
기저 염, 모든 성분에 있어서 1× (증기 멸균된 것)
성분 g/ℓ
Na2HPO4.7H2O 15.4
KH2PO4 6.8
NH4Cl4 4
농축 공급액(무균 혼합된 멸균 성분)
성분 g 또는 ℓ/ℓ
농축 글리세롤, 100%(w/v) 0.41
1M 황산 마그네슘 용액* 0.051
비타민 0.051
미량 원소 0.051
물 0.451
*: 증기 멸균 후 첨가
회분 배지
성분 ℓ/ℓ
기저 염 용액(1×) 0.98
농축 공급액 0.02
카나마이신 스톡(50 ㎎/㎖) 0.001
*: 증기 멸균 후 첨가
마코(Marcor) 효모 추출물/글리신 혼합물 (증기 멸균됨)
성분 g/ℓ 또는 ℓ/ℓ
효모 추출물 분말 200 g
농축 글리세롤 100%(w/v) 0.171
전체에 대한 카나마이신 스톡(여과 멸균됨)
성분 ㎎/㎖ ㎖
카나마이신 50 3
사용시, 다음과 같은 시약들을 준비하였다.
전체에 대한 p-아세틸페닐알라닌(pAF)* (여과 멸균됨)
성분 g 또는 ㎖
p-아세틸페닐알라닌 4 g
1M HCl 6.25 ㎖
물 12.5 ㎖
*:최종 부피는 21.25 ㎖가 됨. 여과 후 생성된 용액 모두를 사용함
전체에 대한 L-(+)-아라비노즈 20% (여과 멸균됨)
성분 g/ℓ ㎖
L-(+)-아라비노즈 200 1.25
*: 여과 후 생성된 용액 모두를 사용함
각각의 발효에 있어서, 다음과 같이 수행하였다. 25% 스트럭톨 673(0.1 ℓ)를 제조한 후 이를 증기로 멸균하였다. pH 조절과 질소 공급을 위해 15% NH3*H2O(0.3 ℓ)을 제조하였다. pH 조절을 위해 10% H3PO4(0.2 ℓ)를 제조하였다. 농축 공급액(1 ℓ)를 공급 용기 1에서 제조하였다. YE/글리세롤 혼합물(2 ℓ)을 각각 공급 용기 2에서 제조하였다.
발효조를 셋-업(set-up)하였다. 발효조를 2.5 ℓ 기저 염 용액으로 멸균하였다. 그 다음, 발효조를 다음과 같은 조건 하에 두었다: 온도 = 37℃, pH = 6.9, 1.0 VVM 공기(5 ℓ 공정 부피 기준)(공기 유량은 2 VVM 이하까지 증가시킬 수 있다 ).
농축 공급액을 발효조에 첨가하고, 여기에 50 ㎎/㎖의 카나마이신을 2.5 ㎖ 첨가하였다.
공정 스케쥴
제 1일(I 단계)
이.콜라이 MCB(마스터 세포 은행(master cell bank); 글리세롤 스톡)으로부터 약 1 ul를 찍어내고, 글리세롤 스톡 1 ㎕를 배양 튜브 내 2 ㎖의 회분 배지 + 카나마이신에 옮겼다. 회분 배지의 조성에 관하여는 전술하였다.
제 2일(II 단계 및 III 단계)
II 단계:
배양 튜브 내에 존재하는 세포의 밀도가 약 1∼6(OD6O0)이 되었다. 0.01∼2 ㎖의 배양 튜브 내 배양액을 60 ㎖의 회분 배지 + 카나마이신(250 ㎖ 들이 진탕 플라스크 내)으로 옮겼다. 탄소를 영양 공급받은 건강한 세포만을 사용하였다. 회분 배지의 조성에 관하여는 전술하였다.
III 단계:
최초 OD600이 약 0.05가 되도록 발효조에 균을 접종시켰다. 단계 II에 필요한 세포의 양(ℓ)은 다음과 같이 계산할 수 있다:
(플라스크 OD600이 4일 경우)
{(2.5ℓ × 0.05)÷4} = 0.031 ℓ
세포를 약 10 시간 동안 회분 방식으로 생육시켰다. 구체적인 시간은 배양에 따라서 소모되는 글리세롤의 양으로써 알 수 있었다. STIRR 속도가 급감한 후, pO2 시그널이 증가하는 것을 통해 글리세롤이 고갈되었음을 알 수 있다. 농축 글리세롤을 공급하기 시작하였다. 공급 속도는 다음과 같은 수학식 I을 바탕으로 계산할 수 있다:
Figure 112007052157078-PCT00007
[상기 식 중,
μset = 0.15 h-1이고;
X(O) = Yx/s * 8.0 g/ℓ이며;
V(O) = 2.5 ℓ이고;
Exp(μset*0) = l이며;
Sf= 400 g/ℓ임]
상기 값을 등식 즉, F(O)에 대입하였더니, 7.5 ㎖/h가 나왔다. 척도인자(scaling factor)를 적용시키면, 실제 F(O)'는 8.6 ㎖/h가 될 것이다.
F(t)'= F(O)'* Exp(μset*t). 여기서, t = 13 시간이고, F(t)'= 60.4 ㎖/시간이다. 1시간 동안의 유량은 60.4 ㎖/시간으로 하였다.
공급액 2의 공급 개시시 pAF를 전개시켰다. 이 pAF를 첨가하고나서 1 시간 후에 아라비노즈로 유도 단계를 수행하였다. 공급액 2의 최종 유량은 수집시까지 유지시켰다.
제 3일(IV 및 V 단계)
IV 단계:
배양액의 OD600은 약 50∼60에 이르렀다. 유도시키기 1 시간 전(공급 시간 = 14 시간), 1) 농축 공급액(공급 속도 = 6.4 ㎖/시간)의 공급을 중단하였다. 2) YE/글리세롤(200 g YE 및 170 g 글리세롤/ℓ) 공급액의 공급을 108.7 ㎖/시간의 공급 속도로 개시하였다. 3) 4.0 g의 pAF를 함유하는 21.25 ㎖의 환약을 첨가하였다. 15% 수산화 암모늄과 10% 인산을 이용하여 pH를 6.9에서부터 계속 조절하여 원하는 수준으로 맞추었다. 3a) 공급액 2의 공급 속도를 3 시간 동안 지속적으로 증가시켜, 공급 17 시간 만에 141.3 ㎖/시간이 되도록 만들었다. 배양액 OUR은 약 250 mmol/ℓ/시간으로 유지시켰다. 3b) 1 시간 동안 탄소 공급원을 이동시켰다. 3c) 적당한 양의 세포(OD600 * ㎖ = 2)를 SDS-PAGE 분석용으로 사용하였다.
유도 단계에서(공급 시간 = 15 시간), 1.25 ㎖의 20%(w/v 또는 200 g/ℓ) L-(+)-아라비노즈를 이용하여 유도를 수행하였다. 적당한 양의 세포(OD600 * ㎖ = 2)를 사용하여 유도 단계 이후 4 시간, 6 시간 및 8 시간 경과시 SDS-PAGE 분석을 하였다. 유도 단계는 8 시간 동안 지속시켰다.
V 단계:
배양액의 OD600을 유도 단계 마지막에 체크하였다. 적당한 양의 세포(OD600 * ㎖ = 2)를 사용하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 2 × 200 ㎖의 배양액을 원심 분리로 수집한 다음, ELISA로 평가하였다. 버킷 원심 분리(15,000 g, 22분)를 수행하여 세포를 수집하고, 이 세포를 -80℃에서 동결시켰다.
이 공정을 100 리터 배양액 규모로 확대하였다.
실시예 6
hGH 정제, PEG화 및 hGH-PEG 정제 공정용 세포질 주변 제조법(이.콜라이 사용)
1. hGH의 세포질 주변 방출
1.9 ㎏의 박테리아 세포 페이스트를 약 7.6 ℓ(4 부피)의 PR 완충액(4℃; 50 mM TRIS, 10 mM EDTA, 0.07% Triton X-100, pH 8.0)에 재현탁하여, 20%의 고체를 얻었다. 4℃에서 1 시간 동안 이 현탁액을 교반한 다음, 8 M의 우레아를 첨가하여 최종 우레아 농도가 0.3 M이 되도록 만들었다. 상기 8 M 우레아 용액을, 제조 후 48 시간 이내에 사용하였다. 이후, 이 현탁액을 1 시간 동안 4℃에서 교반하였다. 상기 현탁액을 고정 각 J20 로터(Avanti J20 XP 원심 분리--Beckman Coulter)(4℃) (15,000 × g)에서 45분 동안 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고, 이의 부피를 측정하였다(약 7.7 ℓ). 이 시료에 날짜와 함께 "PRS"라 표시하여 두었다.
상기 PRS를 프리필터(prefilter)[사토퓨어(Sartopure) GF2 1.2 ㎛ 캡슐 (1000 ㎠)(Part # 5571303P800B)]로 통과시켜 여과하였다.. 여과 유량은 0.86 ℓ/ 분이었다[펌프 셋팅 1(MasterFlex I/P Model 7529-10)]. 여과물을 수집하고 여기에 날짜와 함께 "PRSF"라고 표시하여 두었다. 이 PRSF의 부피를 측정하였다.
이 PRSF를 사토포어 2(Sartopore 2) 0.8 + 0.45 ㎛ 필터 캡슐(500 ㎠)(Part # 5441306G700B)에 통과시켜 여과하였다. 여과물을 수집하고, 여기에 날짜와 함께 "PRSFF"라 표시하여 두었다. PRSFF의 부피를 측정하였다.
공정 내 분석법으로서는 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 포함하며, 이를 통하여 hGH가 참고 기준에 비해 올바른 형태로 존재하는지 여부, A276 측정치 및 정량용 ELISA 결과를 확인할 수 있다.
2. UF/DF(한외 여과/다이아필터링) I - QFF로의 완충액 교환
본 공정에서는 다음과 같은 필터를 사용하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 2 × 1000 ㎠. 부가의 매개 변수로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 여과(투과) 유량 = 100∼160 ㎖/분, 공급압 = 24∼26 psi 및 체류압 = 5∼6 psi.
1N NaOH를 사용하여 이 시스템을 발열 방지 처리하고, 30∼45분 동안 순환시켰다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 약 4 리터의 MilliQ 물로 헹구었다. QFF 완충액 A(10 mM Bis-TRIS, pH 6.5)로 5분 이상 동안 평형 처리하였다. PRSFF를 원래 부피의 약 10분의 1이 될 때까지 농축시켰다. 이후, 이를 8 부피의 QFF 완충액 A와 함께 다이아필터링 하였다. 체류액을 3∼5분 동안 재순환시켰다. 체류액을 수집한 다음, 이 시스템을 300∼350㎖의 QFF 완충액 A로 플러 싱(flushing)하고, 헹굼 용액을 체류액과 합하였다. 합한 시료를 사토포어 2(Sartopore 2) 0.8 + 0.45 ㎛ 캡슐(500 ㎠)(Part # 5441306G700B)에 통과시켜 여과한 후, 여과물을 수집하여, 여기에 날짜와 함께 "QFF로드"라 표시하여 두었다. 이 여과물은 갈색을 띠었다. QFF 로드의 부피를 측정한 다음, QFF 로드를 2 시간 이내에 처리하거나 또는 4℃에 밤새도록 보관하여 두었다.
이 시스템을 MilliQ 물로 헹구고, 1N NaOH를 30∼45 분 동안 순환시켜 세정하였다. 이후, pH가 8 미만이 되었을 때에 MilliQ 물로 헹구는 과정을 종결하였다. 카세트를 0.1N NaOH 중에 보관하였다.
공정 내 분석법으로서는 총 단백질 양을 정량하기 위해 A276을 측정하는 방법, 다음 단계에 사용될 QFF의 로딩 양을 결정하는 방법, ELISA, LAL 및 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 포함한다.
3. 컬럼 1 - Q 세파로즈 FF 크로마토그래피
Q 세파로즈 패스트 플로우(GE Healthcare)를 사용하였다. 컬럼 치수는 다음과 같았다: 70 ㎜ I.D. x 16 cm = 616 ㎖(INdEX70/500 컬럼). 작동 용량은 1 ㎖의 QFF당 총 단백질 150 ㎎(140∼160 ㎎, A276 기준) 또는 10 ㎎ GH(ELISA 기준)이었다. 유량은 100 ㎖/분이었다(선형 속도 = 156 ㎝/h). QFF 완충액 A는 전도율이 0.6 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS(pH 6.5)로 이루어져 있었다. QFF 완충액 B는 전도율이 11.5 mS/cm로서, 10 mM Bis-TRIS, 0.1 M NaCl(pH 6.5)로 이루어져 있었다.
AKTA 엑스플로러 시스템을 발열 방지 처리하였다. 이를 위해 "AKTA 디파이" 프로그램을 3회 실행하였는데: 이때, 모든 완충액 라인은 처음 프로그램 실행 시에는 MilliQ 물에 두었고, 이후 두 번째 프로그램 실행 시에는 1N NaOH 중에 두었다. 30분 동안 항온 처리한 다음, 완충액 라인을 다시 MilliQ 물에 두어서 세 번째로 프로그램을 실행하였다. "QFF 디파이 에퀴" 프로그램을 실행하여 발열 방지 처리를 하였으며, QFF 컬럼을 30 ㎝/h 선형 속도로 평형 처리시킨 후; 이 QFF 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ H2O와 2 컬럼 부피의 1 N NaOH/1M NaCl로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 후, 3 컬럼 부피의 Q 완충액 C(10 mM TRIS, 2 M NaCl, pH 7.0, 전도율 = 156 mS/cm)로 세척하고 나서, 다시 4 컬럼 부피의 QFF 완충액 A로 평형 처리하였다.
이후, "QFF로드"를 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 4 컬럼 부피의 QFF 완충액 A로 세척한 다음, 7 컬럼 부피의 10% QFF 완충액 B(완충액 A 중)으로 세척하였다. 용리는 6 컬럼 부피의 60% QFF 완충액 B(완충액 A 중)와 함께 수행하였다. 이 컬럼은 3 컬럼 부피의 QFF 완충액 B로 세척할 수 있다. 용리 피크를 나타내는 분획들을 모았다. 모아진 용리액에 날짜와 함께 "QFF풀"이라 표시하여 두었다. 이 풀을 2 시간 이내에 처리하거나, 그렇지 않을 경우에는 4℃에서 밤새도록 보관하였다.
컬럼을 3 컬럼 부피의 Q 완충액 C로 세척하였다. 이후 3 컬럼 부피의 1 N NaOH/1M NaCl을 안으로 펌핑하고, 이 컬럼을 1∼6일 동안 항온 처리하였다. 만일 컬럼을 6일 이내에 사용하지 않는다면, 1 컬럼 부피의 1 N NaOH/ 1M NaCl, 3 컬럼 부피의 Q 완충액 C, 3 컬럼 부피의 MilliQ 물, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH 또는 10 mM NaOH로 이 컬럼을 헹구었다. 3∼5 주기마다 컬럼을 추가로 세척한 후, 1 N NaOH/1 M NaCl과 함께 항온 처리한 다음, 3 컬럼 부피의 Q 컬럼 세정 완충액(0.5% Triton X-1OO, 0.1 M 아세트산)을 이용하여 상향류 방식으로 세척하고, 60∼80 시간 동안 항온 처리한 다음, 1.5 컬럼 부피의 MilliQ 물, 1 컬럼 부피의 0∼70% EtOH, 5 컬럼 부피의 70% EtOH 및 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH로 세척하였다.
4M NaCl을 QFF 풀에 첨가하여, 최종 농도가 0.1M이 되도록 하였다. 생산물을 사토바인드(Sartobind) Q1OOX 필터(Part #Q100X)로 통과시켜 여과하고, QFF 완충액 B로 예비-평형 처리시킨 다음, 내독소를 제거하였다. 여과액을 수집하여 이에 날짜와 함께 "QFF 풀 Q"라고 표시해 두었다. 여과액을 2 시간 이내에 처리하거나 또는 4℃에 밤새도록 보관하여 두었다.
QFF 풀 Q를 사토브란(Sartobran) 0.45 + 0.2 ㎛ 필터 캡슐(300 ㎠)(Part # 5231307H500B)에 통과시키고, 여과액을 수집하였다. 이 여과액에 날짜와 함께 "QFF 풀 QF"라 표시하여 두었다. 상기 QFF 풀QF를 2 시간 이내에 처리하거나 또는 4℃에 밤새도록 보관하여 두었다.
공정 내 분석법으로서는 A276을 측정하는 방법, ELISA, LAL 및 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 포함한다.
4. 컬럼 2 - 페닐 세파로즈 HP 크로마토그래피
페닐 세파로즈 고 성능 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였다. 컬럼 치수는 다음과 같았다: 100 ㎜ I.D. x 9.7 cm = 761 ㎖(INdEX1OO/500 컬럼). 작동 용량은 1 ㎖의 페닐 HP당, 총 단백질 4.5∼9 ㎎, 바람직하게는 6∼8 ㎎(A276 기준)이었다. 유량은 100 ㎖/분이었다(선형 속도 = 76.4 ㎝/h). Phe 완충액 A는 20 mM TRIS, 0.4M 시트르산 나트륨(pH 7.0)으로 이루어져 있었다. Phe 완충액 B는 전도율이 0.9 mS/cm로서, 10 mM TRIS(pH 7.0)로 이루어져 있었다.
AKTA 엑스플로러 시스템은 발열 방지처리하였다. "AKTA 디파이" 프로그램을 3회 실행하였는데: 이때, 모든 완충액 라인은 처음 프로그램 실행 시에는 MilliQ 물에 두었고, 이후 두 번째 프로그램 실행 시에는 1N NaOH 중에 두었다. 30분 동안 항온 처리한 다음, 모든 완충액 라인을 다시 MilliQ 물에 두어서 세 번째로 프로그램을 실행하였다. "PheHP 디파이 에퀴"를 실행하여 발열 방지 처리를 하였으며, Phe 컬럼을 평형 처리시킨 후(선형 속도 = 30 ㎝/h); 이 Phe 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ H2O와 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 후, 4 컬럼 부피의 Phe 완충액 A로 평형 처리하였다.
1.4 M의 시트르산 나트륨을 QFF 풀QF에 첨가하여 최종 농도 0.4 M이 되도록 만들었다. 이 혼합물을 실온에서 약 1 시간 동안 교반하여, 상기 시트르산 나트륨을 용해시키고, 그 용액을 16℃ 이상으로 승온시켰다. QFF 풀QF + 구연산Na를 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 4 컬럼 부피의 Phe 완충액 A로 세척하고, 9∼17 컬럼 부피의 27% Phe 완충액 B(완충액 A 중)로 세척하였다. 27% Phe 완충액 B를 이용하는 세척 시간은 컬럼에 로딩된 총 단백질의 양에 따라서 달랐다. 단백질을 많이 로딩할수록, 27% Phe 완충액 B의 컬럼 부피는 더욱 줄었다. 8∼10 컬럼 부피의 48% Phe 완충액 B(완충액 A 중)로 용리하였다. 이 컬럼을 다시 100% Phe 완충액 B로 세척하였다. 48% B 용리 피크를 수집하여 여기에 "Phe 풀"이라 표시하여 두었다. 2 시간 이내에 다음 단계를 수행하거나, 그렇지 않을 경우에는 상기 풀을 4℃에 밤새도록 보관하여 두었다.
상기 Phe 컬럼을 2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 이용하여 상향류 방식으로 세척하고, 30분 동안 항온 처리한 다음, 3 컬럼 부피의 Phe 완충액 A, 3 컬럼 부피의 H2O, 그리고 2.5 컬럼 부피의 20% EtOH 또는 10 mM NaOH로 세척하였다. 3∼5 주기 실행 이후, Phe 컬럼을 2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 이용하여 상향류 방식으로 세척하고, 30분 동안 항온 처리하였으며, 3 컬럼 부피의 Phe 완충액 A, 3 컬럼 부피의 H2O, 0∼70% EtOH(1 컬럼 부피), 3 컬럼 부피의 70% EtOH로 세척하고, 마지막으로 20% EtOH 또는 10 mM NaOH 중에 보관하였다.
공정 내 분석법으로서는 A276을 측정하는 방법, ELISA, LAL 및 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 포함한다.
5. UF/DF II - 공정 내 벌크 GH의 제조
다음과 같은 필터를 이용하여 본 공정을 수행하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 1000 ㎠. 부가의 매개 변수로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 여과(투과)유량 = 50∼90 ㎖/분 및 공급압 = 20∼27 psi 및 체류압 = 3∼4 psi. UF/DF II 완충액은 10 mM의 인산 나트륨, 20 g/ℓ 글리신, 그리고 5 g/ℓ의 만니톨(pH 7.0)로 이루어졌다.
1N NaOH를 사용하여 이 시스템을 발열 방지 처리하고, 30∼45분 동안 순환시켰다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 약 4 리터의 MilliQ 물로 헹구었다. UF/DF II 완충액을 이용하여 5분 이상 동안 평형 처리하였다.
Phe 풀을 약 700∼900 ㎖(또는 체류 플라스크 내 약 500∼700 ㎖)로 농축하였다. 이후, 4.2∼5.4 리터(약 6 부피)의 UF/DF II 완충액으로 다이아필터링하였다. 이후 체류액을 3∼5분 동안 재순환시킨 다음, 체류액을 수집하였다. 이 시스템을 100∼200 ㎖의 UF/DF II 완충액으로 플러싱하고, 이 헹굼 용액을 체류액과 합하였다. 합하여진 시료를 사토브란 0.45+0.2 ㎛ 캡슐(150 ㎠)(Part # 5231307H400B)로 여과하고, 여과액을 "Y35pAF-pBx"라 명명하였으며, 이를 또한 "공정 내 벌크"라고도 하였다.
Y35pAF-pBx의 단백질 농도는 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 1.037). 공정 내 벌크는 1주일 정도까지 4℃에 보관할 수 있다. 장기 보관을 위해, 상기 공정 내 벌크를 분취 하여 -80℃에 보관하였다.
MilliQ 물로 이 시스템을 헹구고, 1N NaOH를 30∼45분 동안 순환시켜 세정하였다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 MilliQ 물로 헹구었다. 카세트는 0.1 N NaOH 내에 보관하였다.
공정 내 분석법으로서는 RP-HPLC, A276을 측정하는 방법, ELISA, LAL 및 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 포함한다.
6. UF/DF IIa - PEG화를 위한 농축 및 완충액 교환
다음과 같은 필터를 이용하여 본 공정을 수행하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 200 ㎠. 부가의 매개 변수로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 여과(투과) 유량 = 12∼14 ㎖/분 및 공급압 = 약 25 psi 및 체류압 = 0∼0.5 psi. 반응 완충액(전도율 = 2.6 mS/㎝)은 20 mM의 아세트산 나트륨, 20 g/ℓ 글리신, 5 g/ℓ의 만니톨, 1 mM EDTA(pH 4.0)로 이루어졌다.
1N NaOH을 사용하여 이 시스템을 발열 방지 처리하고, 30∼45분 동안 순환시켰다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 약 2 리터의 MilliQ 물로 헹구었다. 반응 완충액을 이용하여 5분 이상 동안 평형 처리하였다.
단계 5에서 얻어진, 일정 량의 공정 내 벌크에 3.7%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여 pH를 약 4로 맞추었다. 이후, 이 벌크를 농축시켜 사용된 출발 hGH의 양을 기준으로 8㎎/㎖의 농도가 되도록, 목표 부피로 줄였다. 이후, 이 시료를 5 부피의 반응 완충액으로 다이아필터링하였다. 체류액을 3∼5분 동안 재순환시킨 다음, 수집하였다. 이 시스템에 80∼120 ㎖의 반응 완충액을 플러싱하고, 체류액과 합하였다. 합하여진 체류액을 사토브란 0.45 + 0.2 ㎛ 캡슐(150 ㎠)(Part # 5231307H400B)로 여과하였다. 이 여과액에 날짜와 함께 "Y35pAF-pBx/pH4"라 표시하였다. 이 시료를 밤새도록 4℃에 보관할 수 있다.
Y35pAF-pBx/pH4의 단백질 농도는 20배 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 1.037). 이를 반응 완충액으로 희석하여 Y35pAF-pBx/pH4의 농도를 7 ㎎/㎖(5∼9 ㎎/㎖)로 맞추었다.
7. PEG화 반응
35번 위치의 티로신이 p-아세틸-페닐알라닌으로 치환된 hGH(Y35pAF)의 분자량은 22,149 Da이었으며, mPEG-옥시아민의 분자량은 30,961 Da이었다. 미국 특허 공보 2005/0170404의 야생형 성숙 hGH의 서열 중 서열 번호 2를 참조하시오. 도 5는 사용된 PEG의 화학 구조를 나타내는 것이다. PEG:Y35pAF의 몰 비(5)를 이용하여, 30 K MPEG-옥시아민의 필요량을 계산하였다. PEG 분말을 계량하여 이를 25∼28℃에서 7 ㎎/㎖의 Y35pAF 용액에 첨가한 후 천천히 저어 주었다. 커다란 고체 PEG 조각을 손으로 깨뜨렸다. 마지막으로 첨가한 후, 반응 혼합물을 39∼50 시간 동안 천천히 저어 주면서 28℃의 온도에 놓아두었다. 이 반응으로 인하여 hGH와 PEG 사이에 옥심 결합이 형성되었다.
공정 내 분석법으로서는 PEG화 여부를 확인하기 위한 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 포함한다.
8. 컬럼 3 - 공급원 30Q 크로마토그래피
공급원 30Q는 GE 헬스케어로부터 구입하였다. 컬럼의 치수는 다음과 같았다: 70 ㎜ I.D. x 17.5 ㎝ = 673 ㎖(INdEX 70/500 컬럼). 작동 용량은 1 ㎖의 공급원 Q당, 2.4 ㎎(1∼2.8 ㎎) GH이었다. 유량은 8 ㎖/분이었다(선형 속도 = 125 ㎝/h). 공급원 Q 완충액 A는 5 mM TRIS(pH 7.0)로 이루어져 있다. 공급원 Q 완충액 B는 5 mM TRIS, 0.1 M NaCl(pH 7.0)로 이루어져 있다.
AKTA 엑스플로러 시스템을 발열 방지 처리하기 위해, "AKTA 디파이" 프로그 램을 3회 실행하였는데: 이때, 모든 완충액 라인은 처음 프로그램 실행 시에는 MilliQ 물에 두었고, 이후 두 번째 프로그램 실행 시에는 1N NaOH 중에 두었다. 30분 동안 항온 처리한 다음, 모든 완충액 라인을 다시 MilliQ 물에 두어서 세 번째로 프로그램을 실행하였다. 공급원 Q 컬럼을 발열 방지 처리 및 평형 처리하기 위해서, "공급원 Q 디파이 에퀴" 프로그램을 이용하였는데: 이때, 이 공급원 Q 컬럼을 2 컬럼 부피의 MilliQ 물과 2 컬럼 부피의 1 M NaOH/1M NaCl로 세척하고 30분 동안 항온 처리한 후, 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 B로 세척한 다음, 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 A로 평형 처리하였다.
20%(v/v)의 0.5 M TRIS 염기를 이전 단계(단계 7)의 반응 혼합물에 첨가하였다. 이후, 상기 시료를 사토브란 0.45 + 0.2 ㎛ 필터 캡슐(150 ㎠)(Part # 5231307H400B)로 여과하였다. 9 부피의 공급원 Q 완충액 A와 10 부피의 MilliQ 물을 이용하여 20배 희석시켰다. 희석된 시료를 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 공급원 Q 완충액 A로 세척하였다. 0∼50% 공급원 Q 완충액 B(10 컬럼 부피)로 선형 구배를 걸어주어 용리하였다. 약 1/5 컬럼 부피/분획이 되었을 때 분획을 수집하였다. SE-HPLC 및 비-환원성 SDS-PAGE 분석법을 첫 번째 주요 피크에 대해 수행하여 풀을 측정하였다. 풀링된 분획에 날짜와 함께 "공급원 Q"라 표시하여 두었다. 이 풀을 밤새도록 4℃에 보관하였다.
9. UF/DF(한외 여과/다이아필터링) III - 제형화된 벌크의 농축 및 완충액 교환
본 공정에서는 다음과 같은 필터를 사용하였다: 사토리우스 사토콘 슬라이스 10K 하이드로사트 카세트, 200 ㎠. 부가의 매개 변수로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 여과(투과) 유량 = 12∼14 ㎖/분, 공급압 = 약 25 psi 및 체류압 = 0∼0.5 psi.
1N NaOH를 사용하여 이 시스템을 발열 방지 처리하고, 30∼45분 동안 순환시켰다. 이후, pH가 8 이하로 떨어질 때까지 이 시스템을 약 2 리터의 MilliQ 물로 헹구었다. 제형화 완충액을 이용하여 5분 이상 동안 평형 처리하였다.
공급원 Q 풀(단계 3.6)을 목표 부피 8㎎/㎖ 농도(사용한 출발 물질의 양을 기준)가 될 때까지 농축시켰다. 6-부피의 제형화 완충액을 이용하여 다이아필터링을 수행하였다. 체류액을 3∼5 분 동안 재순환시킨 후, 이 체류액을 수집하였다. 이 시스템을 50∼100 ㎖의 제형화 완충액으로 플러싱하고, 이 플러싱 액을 체류액과 합하였다. 합하여진 체류액을, 생물학적 안전성을 갖는 후드와 클래스 100 후드 내에서 멸균 기술을 이용하여, 사토브란 0.45 + 0.2 ㎛ 캡슐(150 ㎠)(Part # 5231307H400B)로 여과하였다. 멸균 시료를 "PEG30-pY35pAF"라 명명하였다.
PEG30-pY35pAF의 균등한 hGH 농도는 희석된 시료의 A276를 측정하여 구하였다(A276 1㎎/㎖ = 1.145)(3회 희석 및 측정). PEG-pY35pAF를 4℃에서 3일 정도까지 보관할 수 있다. 장기 보관을 위해, 상기 PEG-pY35pAF를 분취하여 -80℃에 보관하였다.
본 공정에서는 변종 W3110으로부터 유래하는 재료를 사용하였다. 이 변종 숙주 세포를 직교 tRNA, 직교형 아미노아실 tRNA 합성 효소 및 hGH 구조물로 형질 전환시켰다. PEG-pY35pAF의 순도는 HPLC와 SDS-PAGE 분석 결과를 바탕으로 하였을 때 95%보다 컸다.
완전 방출 검정법은 PEG-pY35pAF의 특징 예를 들어, 모양, 용해 시간, 상동성 및 순도, 효능, 안전성 및 기타 특징 예를 들어, pH를 평가하는 검정법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 평가를 위한 시험 방법으로서는 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE, SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, CEX- HPLC, 숙주 세포 단백질 측정법, 잔류 DNA 측정법, 농도에 대한 A276, 세포 증식 검정법, LAL, 발열원, 증식 불가 특성(sterility), 미생물 존재량(미생물 한계량; microbial limit), 칼 피셔(함수량), 함량의 균일성 및 삼투압의 측정법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
UF/DF III의 완충액 교환에 사용된 완충액은 임의의 적당한 완충액일 수 있다. UF/DF III 이후의 부가적 단계들로서는 동결 건조 단계를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 동결 건조법은 당 업자에게 공지된 표준적 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 방법은 약 2.7 ㎏의 박테리아 세포 펠렛을 사용하여 수행하였다.
실시예 7
부가적 방법
SDS-PAGE에 의한 순도 분석
다음의 방법은 공정 내 및 최종 벌크 재조합 hGH 및 PEG-재조합 hGH 컨쥬게이트의 순도를 SDS-PAGE → 총 단백질 염색법으로 측정하는데에 사용되었다. 임의 의 하전된 분자 예를 들어, 단백질은 전기장에 존재할 때 이동하게 될 것이다. 전기장 안에서의 단백질 이동 속도는 전기장의 세기, 단백질의 전체 하전량 및 마찰 저항에 따라 달라진다. 마찰 저항은 단백질의 크기 및 모양에 따른 함수이다. 과량의 SDS의 존재 하에서 변성될 때, 대부분의 단백질은 SDS와 일정 중량비(constant weight ratio)로 결합하여, 본질적으로 동일한 전하 밀도를 갖게 되며, 단백질 크기에 따라서 폴리아크릴아미드 겔 내에서 이동한다. 겔 전기 영동법에 의해 분리된 단백질은 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색으로 확인될 수 있다.
이러한 방법에 필요한 장치로서는 다음과 같은 것들 또는 이의 등가물 들을 포함한다: X셀 슈어락 미니-셀(XCell Surelock Mini-Cell)(Invitrogen), 열 블록(+70∼80℃로 설정), 동력 공급 장치(200V 이하), 미량 원심 분리기[예를 들어, 벡맨 쿨터 마이크로퓨즈(Beckman Coulter Microfuge) 18 또는 22R] 및 왕복 진탕기. NuPAGE MOPS SDS 전개 완충액(2OX, Invitrogen PN NP0001)에 포함된 시약들로서는 다음과 같은 것들이 있다: NuPAGE MES SDS 전개 완충액(2OX, Invitrogen PN NP0002); NuPAGE LDS 시료 완충액(4X, Invitrogen PN NP0007); NuPAGE 시료 환원제(10X, Invitrogen PN NP0009); 12% Bis-Tris NuPAGE 예비 성형 겔, 1.0 ㎜ x 10-웰(Invitrogen PN NP0341BOX); 4∼12% Bis-Tris NuPAGE 예비 성형 겔, 1.0 ㎜ x 10-웰(Invitrogen PN NP0321BOX); 예비-염색 분자량 마커(SeeBlue Plus2, Invitrogen PN LC5925); MilliQ-고급 H2O 또는 등가물; 심플리블루 세이프스테 인(SimplyBlue SafeStain)(Invitrogen PN LC6065) 또는 등가물; 참고 기준(WHO rhGH 기준; rhGH(Y35pAF-pB2/pB3, 2 ㎎/㎖)에 대한 보정 용액; pEG-rhGH 컨쥬게이트(PEG30-pY35p AF-O1, 2 ㎎/㎖)에 대한 보정 용액. 당 업계에 공지된 표준적인 기술을 이용하여 기준 물질의 단백질 농도와 시험 물질의 단백질 농도를 측정하였다.
예비-PEG화 정제 단계 시료의 분석
비-환원 조건 하에 3 ㎍의 참고 기준(RS, 예를 들어, 보정 용액 Y35pAF-pB2/pB3)을 준비하였다. 이 참고 기준 3 ㎍을 4 × LDS 및 MilliQ H2O에 첨가하여, 1×LDS 중 28 ㎕의 시료를 얻었다. 이와 유사하게, 비-환원 조건 하에 rhGH 시험 물질을 준비하였다. rhGH 시험 물질과 참고 기준 둘 다를 70∼80℃에서 8∼10 분 동안 가열하고 원심분리한 다음, 겔에 로딩하였다. 12% Bis-Tris NuPAGE 예비 성형 겔을 제조자의 지침에 따라서 1X MOPS SDS 전개 완충액으로 제조하였다. 이 겔에는 다음과 같은 물질들을 로딩시켰다: 예비-염색한 분자량 마커, 3 ㎍ 참고 기준, 시험 물질. 또한 최대 200 V로 세팅하여 50분 동안 전개시켰다. 이 겔을 증류수 중에서 항온 처리하고, 심플리블루 또는 이의 등가물과 함께 진탕 해 주면서 염색한 다음, 물로 탈색하였다. 시험 물질의 주요 밴드 위치를 3 ㎍ 참고 기준의 주요 밴드 위치와 비교하였다.
정제된 공정 내 벌크 rhGH의 분석
20 ㎍ 및 1 ㎍의 참고 기준(RS, 예를 들어, WHO rhGH)을 비-환원 조건 및 환원 조건 하에 준비하였다. 비-환원 조건에 있어서, 20 ㎍ 또는 1 ㎍의 참고 기준을 4 X LDS와 MilliQ H2O에 첨가하여, 1×LDS 중 28 ㎕의 시료를 얻었다. 환원 조건에 있어서는, 20 ㎍ 또는 1 ㎍의 참고 기준을 4 × LDS, 1OX 환원제 및 MilliQ H2O에 첨가하여, 1×LDS 및 1× 환원제 중 28 ㎕의 시료를 얻었다. rhGH 시험 물질과 참고 기준을 둘 다를 70∼80℃에서 8∼10 분 동안 가열하고 원심분리한 다음, 겔에 로딩하였다. 12% Bis-Tris NuPAGE 예비 성형 겔을 제조자의 지침에 따라서 1X MOPS SDS 전개 완충액 중에서 전개시켰다[하나의 유닛은 비-환원 조건용이고, 다른 유닛은 환원 조건용임]. 이 겔에는 다음과 같은 물질들을 로딩시켰다: 예비-염색한 분자량 마커, 1 ㎍ 참고 기준, 20 ㎍ 참고 기준, 블랭크 래인(blank lane). 또한, 시험 물질은 최대 200 V로 세팅하여 50분 동안 전개시켰다. 이 겔을 증류수 중에서 항온 처리하고, 심플리블루 또는 이의 등가물로 진탕 해 주면서 염색한 다음, 물로 탈색하였다. rhGH 시험 물질의 주요 밴드 위치를 20 ㎍ 참고 기준의 주요 밴드 위치와 비교하였다. rhGH 시험 물질 래인에 있어서, 주요 밴드 이외에 다른 밴드는, 1㎍ 참고 기준(5%) 래인의 주요 밴드보다 진하지 않았다.
rhGH의 PEG화 및 PEG-rhGH의 정제 결과 분석
참고 기준(RS, 예를 들어, 보정 용액 PEG30-pY35pAF-01)을 비-환원성 조건 하에 준비하였다. 5㎍의 PEG30-pY35pAF-01을 4X LDS 및 MilliQ H2O에 첨가하여, 최종적으로 1 × LDS 중 시료 28 ㎕를 얻었다. 분석된 방법에 따라서, 5∼20 ㎍의 시험 물질을 4X LDS와 MilliQ H2O에 첨가하여, 최종적으로 1 × LDS 중 시료 28 ㎕를 얻었다. PEG화 반응 혼합물용으로서는, 15∼20 ㎍의 시험 물질을 사용하였다. PEG 화 반응 혼합물의 분석을 위해서, 다음의 것들을 비교하였다: a) PEG(pH 4)를 첨가하기 이전 연속적인 농도로 존재하는 rhGH[PEG화 반응 혼합물 중에 잔류하는 비-PEG화 rhGH의 상대적 비율 측정 가능]; 및 b) 반응 혼합물의 1/10 희석액 10 ㎕. PEG화 이후 정제 과정에서는 컬럼 분획으로부터 얻은 시험 물질 5∼20 ㎍을 사용하였다. PEG-rhGH 컬럼 분획을 분석하기 위해서, 일정 부피의 각 컬럼 분획들(통상적으로, 각 컬럼 분획 당 21 ㎕)을 사용하여 컬럼 분획들을 비교하였다.
PEG-rhGH 시험 물질 또는 PEG-rhGH 참고 기준 시료는 가열하지 않았다. 시료를 원심 분리하고, 이를 4∼12%의 Bis-Tris NuPAGE 예비 성형 겔[제조자의 지침에 따라서, 1 × MES SDS 전개 완충액으로 제조] 상에 로딩하였다. 이 겔에는 다음과 같은 물질들을 로딩시켰다: 예비-염색한 분자량 마커, 5 ㎍ 참고 기준, 시험 물질. 또한, 최대 200 V로 세팅하여 35분 동안 상기 물질들을 전개시켰다. 이 겔을 증류수 중에서 항온 처리하고, 심플리블루 또는 이의 등가물로 진탕 해 주면서 염색한 다음, 물로 탈색하였다.
PEG-rhGH 시험 물질의 전기 이동 그림을 PEG-rhGH 참고 기준으로 얻은 전기 이동 그림과 정합 되어야 한다.
최종 PEG화 rhGH 생산물의 분석
10 ㎍ 의 참고 기준(RS, 예를 들어, 보정 용액인 PEG3O-pY35pAF-01)를 비-환원 조건 및 환원 조건 하에 준비하였다. 10ug의 PEG3O-pY35pAF-01(2 ㎎/㎖)을 4 × LDS와 MilliQ H2O에 첨가하여, 최종적으로 1 × LDS 중 시료 28 ㎕를 얻었다. 환원 조건에 있어서는, 10 ㎍의 참고 기준을 4 × LDS, 1O × 환원제 및 MilliQ H2O에 첨가하여, 1×LDS 및 1× 환원제 중 28 ㎕의 시료를 얻었다. 이와 유사하게, 비-환원 조건 및 환원 조건 하에 10 ㎍의 PEG화된 rhGH 시험 물질을 얻었다. 이 PEG-rhGH 시험 물질 및 PEG-rhGH 참고 기준은 가열하지 않았으나, 이를 4∼12%의 Bis-Tris NuPAGE 예비 성형 겔[제조자의 지침에 따라서, 1 × MES SDS 전개 완충액으로 제조] 상에 로딩하기 이전에, 스냅 원심 분리시켰다. 이 겔에는 예비-염색한 분자량 마커, 10 ㎍ 참고 기준, 블랭크 래인(잠재적 이동 효과를 최소화시킴), 시험 물질의 순서대로 로딩하였으며, 이때, 최대 200 V로 세팅하여 35분 동안 전개시켰다. 이 겔을 증류수 중에서 항온 처리하고, 심플리블루 또는 이의 등가물로 진탕 해 주면서 염색한 다음, 물로 탈색하였다.
PEG-rhGH 시험 물질의 전기 영동 그림은 PEG-rhGH 참고 기준의 전기 영동 그림과 정합하여야 한다. 상기 PEG-rhGH 시험 물질의 전기 영동 그림은 PEG-rhGH 참고 기준의 전기 영동 그림과 정합하여야 한다. 참고 기준과 매치되지 않는 밴드는 분해된 산물 또는 응집체일 수 있다. 고분자량 밴드는 응집체임을 나타내며, 저분자량 밴드는 더 이상 PEG에 컨쥬게이트화되지 않는 폴리펩티드임을 알 수 있다.
CEX-HPLC/IEX-HPLC에 의한 rhGH의 순도 및 화학적 분해 결과 분석
다음의 방법을 사용하여 PEG화 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)의 상대적 순도 및 잠재적 화학 분해 특성(즉, 탈아민화)을 평가하였다[양이온 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC) 이용]. CEX-HPLC는 단백질과 수지상에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호 작용을 원리로 한다. 양이온 교환 크로마토그래피는 음으로 하전된 수지에 결합하는 단백질의 양 하전 이온을 이용한다. 아스파라긴(Asn) 잔기의 rhGH탈아민화에 관한 일반적인 구조 변형과 이러한 CEX-HPLC법을 통하여, 탈아민화된 PEG화 및 비-PEG화 rhGH 및 탈아민화 중간 물질을 분리할 수 있다. 이 방법을 사용하여 PEG화 rhGH를 동정할 수 있었으며 순도도 측정할 수 있었다. 이 기법을 사용하여 rhGH의 몇몇 부분적 분해 산물을 확인할 수 있다.
이러한 방법에 사용되는 장치는 다음의 부품들 또는 이의 등가물들을 포함한다: UV/Vis 분광계(Agilent 8453 또는 등가물); 50 ㎕ 석영 큐벳; 0.5 ㎖의 비바스핀(Vivaspin) 농축기(필요한 경우; 비바사이언스(Vivascience) 10,000 MWCO, PES, VS0102 또는 등가물); PD-10, NAP-10, 또는 NAP-5 컬럼(GE Healthcare, Cat. #17-0851-01, 17-0853-01, 17-0854-01); HPLC 바이알 및 캡(올테크(Alltech) 100 ㎕ 스크루형 캡 폴리프로필렌 바이알 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개혈 스크루형 캡 #73044 또는 이의 등가물); 1 ℓ 및 2 ℓ들이 무균 유리병; 컬럼 - PolyCAT A 4.6 x 200 ㎜, 5μ, 1000 A(PolyLC, 204CT0510) 및 PolyCAT A 가드 컬럼, 4.6 x 10 mm, 5μ, 1000 A(PolyLC, JGCCT0510); 선형 구배를 걸어줄 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기구[예를 들어, 진공 탈기 장치, 4차 펌프, 서모스탯 자동 샘플러, 서모스탯 컬럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD) 및 켐스테이션(Chemstation) 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 에이질런트(Agilent) 1100 HPLC].
달리 특정하지 않는 한, 물(Milli-Q 고급 또는 등가물)에 포함된, 본 공정 실시용 시약 및 고체 화학 물질은 분석용 또는 그보다 더 고급의 것이었으며, 용매 는 HPLC급 이상이었다. 달리 특정하지 않는 한, 시약의 보관 및 공정 단계는 실온에서 행하여 졌다. 이러한 화학 물질의 예로서는, 아세트산 암모늄, 스펙트럼 A2149, HPLC 급 또는 등가물; 아세토니트릴, 피셔(Fisher) A998, HPLC 급 또는 등가물; 중탄산 암모늄, 플루카(Fluka) #09830, 울트라 > 99.5% 또는 등가물; 빙초산, 피셔 #64-19-7, HPLC 급 또는 등가물; 시트르산 나트륨의 이수화물, 스펙트럼 S0165, USP 급 또는 등가물; 글리신, 스펙트럼 AM125 또는 등가물; 만니톨, 스펙트럼 MA165 또는 등가물; 6N HCl, 말링크로트(Mallinckrodt) 2662-46 또는 등가물을 포함한다.
이동 상 A 완충액은 50 mM 아세트산 암모늄(pH 4.25), 40% 아세토니트릴(AcCN)이었으며, 이동 상 B 완충액은 500 mM 아세트산 암모늄(pH 4.25), 40% AcCN이었다. 제조된 부가 시약은 10% 아세트산; 탈아민화용 완충액: 30 mM 중탄산암모늄(pH 9.0); 및 시료 희석 완충액: 20 mM 시트르산 나트륨, 20 g/ℓ 글리신, 5 g/ℓ 만니톨(pH 6.0)이었다[각각은 0.22 ㎛ PES 필터(Corning #431098 또는 등가물)를 사용하여 멸균 여과함].
세계 보건 기구(WHO) rhGH((Cat. # 98/574)를 비-PEG화 hGH 표준으로 사용하였다. 이것을 1.0 ㎖의 물에서 재구성한 후 1.1 ㎎/㎖로 희석(희석 완충액 이용)하여 사용하였다. 10%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여 pH를 3.8∼4.3으로 만들고, 최종 농도는 1.0 ㎎/㎖(허용 범위 = 0.9∼1.1 ㎎/㎖)로 만들었다. 다른 비-PEG화 hGH 표준 즉, 보정 용액 Y35pAF-pB2/pB3도 유사한 방식으로 제조하였다. PEG화 hGH 표준 즉, 보정 용액 PEG30-pY35pAF-01도 또한 유사한 방식으로 제조하였다.
PEG화 해상 용액(Resolution Solution)인 PEG30-pY35pAF-01 보정 용액은, PD-10, Nap-10 또는 Nap-5 탈염 컬럼을 사용하여 30 mM 중탄산암모늄(pH 9.0) 완충액으로 교환된 완충액이었다. 기준 물질은 0.5 ㎖들이 비바스핀 농축기로 약 2 ㎎/㎖(허용 범위 = 1.9∼2.1 ㎎/㎖)까지 농축시켰으며, 시료는 37℃에서 24 시간 동안 항온 처리하였다. 시료 및 필요한 시료의 일부를 희석 완충액을 사용하여 1.1 ㎎/㎖로 희석시키고, 10%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여 pH를 3.8∼4.3으로 만들었으며, 이때의 최종 농도는 1.0 ㎎/㎖(허용 범위 = 0.9∼1.1 ㎎/㎖)였다.
시험 물질을 희석 완충액을 사용하여 1.1 ㎎/㎖로 희석시키고, 10%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여 pH를 3.8∼4.3으로 만들었으며, 이때의 최종 농도는 1.0 ㎎/㎖(허용 범위 = 0.9∼1.0 ㎎/㎖)였다. 기준 물질 및 시험 물질의 단백질 농도는 당 업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 측정하였다.
공정
다음과 같은 조건으로 기구를 셋-업하였다: 1) 컬럼: PolyCAT A 204CT0510 및 JGCCT0510; 2) 자동 샘플러 온도: 실온; 3) 펌프 셋업: 계단식 구배: 81.5∼108.5 mM 아세트산암모늄(pH 4.25)(7∼13% B) → 108.5∼500 mM 아세트산 암모늄(pH 4.25)(13∼100% B); 4) 이하 표 4 참조; 5) 주입기 셋업: 주입: 기준 물질 주입; 주입 부피 = 25 ㎕; 견인 속도 = 50 ㎕/분; 주입 속도 = 50 ㎕/분; 바늘 세척 = 15 ㎕ H2O; 종료 시간: 펌프; 6) DAD 시그널: 이하 표 5 참조; 피크 폭: > 0.1 분; 슬릿 = 4 ㎜; 종료 시간: 펌프; 7) 컬럼 서모스탯: 온도 = 30℃; 온도 기록.
시간 이동 상 A 이동 상 B 유량(㎖/분) 압력(bar)
0 100 0 1.0 140
10 100 0 1.0 140
11 93 7 1.0 140
91 87 13 1.0 140
102 0 100 1.0 140
118 0 100 1.0 140
119 100 0 1.0 140
151 100 10 1 140
시료 Bw 참고 물질 Bw 단위
280 4 600 100 ㎚
276 4 600 100 ㎚
214 8 600 100 ㎚
220 4 600 100 ㎚
250 8 600 100 ㎚
컬럼을 10∼15 컬럼 부피의 100% 이동 상 A로 평형 처리하였다. 25∼50 ㎕의 PEG화 보정 용액 PEG30-pY35pAF-O1을 주입하였다. 체류 시간 56.97분(± 0.5 분)일 때 주요 PEG화 피크를 나타내는 물질이 용리되었다. 그 다음, 25∼50 ㎕의 WHO 또는 보정 용액 Y35pAF-pB2/pB3을 주입하고 HPLC 프로그램을 실행하였다. 체류 시간 98.54 분(± 0.5 분)[주요 PEG화 피크에 대한 상대적 체류 시간 = 1.73 ± 0.01]일 때 주요 비-PEG화 피크를 나타내는 물질이 용리되었다.
이후 25∼50 ㎕의 PEG화 해상 용액을 주입하였다. 얻어진 크로마토그램에서, 주요 PEG화 피크는 체류 시간 56.97 분(± 0.5 분)일 때 얻어졌으며, PEG화 탈아민 피크는 주요 피크에 대한 상대적 체류 시간인, 체류 시간 0.79 ± 0.02분[45.23 ± 0.3 분; 현재의 조건에서는 해상 시간 = 2.3 ± 0.02 분]에 용리되었다.
이후, 25∼50 ㎕의 PEG화 시험 물질을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 이 시료를 3회 전개하였으며, 여기서 얻어진 평균 체류 시간을 기록하였다. 크로마토그램을 흡광도(280 ㎚)에 대해 도시하였다.
데이터 분석
PEG화 rhGH 시험 물질의 체류 시간을 보정 용액 PEG30-pY35pAF-01의 체류 시간과 비교하였다. 시험 물질의 평균 순도를 다음의 식을 이용하여 계산하였다: (주요 피크의 통합 표면적(Integration area)/모든 피크의 통합 표면적) × 100%. 여기서, 피크는 용매의 피크를 무시한 경우의 값임.
SEC-HPLC에 의한 rhGH의 순도 측정
이 과정은 크기별 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 이용하여 PEG화 rhGH 및 공정 내 물질을 포함하는 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)의 순도를 평가하기 위한 것이다. 본 시험은 시료, PEG화 시료 및 비-PEG화 시료 중 고 분자량의 이량체 및 기타 관련 물질로부터 단량체를 분리하는데에 이용된다. SEC-HPLC는 이동 상 분자가 투과하는 다공성 매트릭스로서 정지 상을 이용하는 기술이다. 공극 구조에 들어갈 수 있을 정도로 작은 시료 분자는 잠시 머무르게 되고, 큰 분자들은 배제되어 컬럼을 신속하게 빠져 나간다. 그러므로, 크기별 배제 크로마토그래피란 분자를 크기에 따라서 분리하는 방법으로서, 이 때의 크로마토그래피 용리 시간은 특정 분자마다 독특하다. 이 방법은 단량체(PEG화 및 비-PEG화) rhGH의 비율을 측정하는데에 사용된다. 이 기술을 이용하여 이량체 및 기타 고분자량 단백질을 관찰할 수 있다.
이 기술에 대한 참조 문헌으로서는 문헌[European Pharmacopoeia 2002, p. 193; British Pharmacopoeia 2001, p.1941; "High-Performance Size-Exclusion Chromatographic Determination of the Potency of Biosynthetic Human Growth Hormone Products", R.M. Riggin외 다수 Journal of Chromatography 435(1988), p. 307-318]이 있다.
본 방법에 사용되는 장치들로서는 다음의 것들 또는 이의 등가물을 포함한다: UV/Vis 분광계(Agilent 8453 또는 등가물); 50 ul 석영 큐벳; 0.5 ㎖의 비바스핀 농축기(필요한 경우; 비바사이언스 10,000 MWCO, PES, VS0102 또는 등가물); HPLC 바이알 및 캡(올테크 100 ul 스크루형 캡 폴리프로필렌 바이알 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개혈 스크루형 캡 #73044 또는 이의 등가물); 1 ℓ 및 2 ℓ 들이 무균 유리병; 컬럼 - 토소하스(Tosohaas) TSK 수퍼 SW3000 18675 및 수퍼 SW 가드 컬럼 18762, 실리카계 크기별 배제 HPLC 컬럼(치수 = 4.6 × 300 ㎜, 입도 = 4 ㎛ 및 공극 크기 = 250A)(치수 = 4.6 × 35 ㎜이고, 입도 4 μ인 가드 컬럼과 연결됨); 선형 구배를 걸어줄 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기구[예를 들어, 진공 탈기 장치, 4차 펌프, 서모스탯 자동 샘플러, 서모스탯 컬럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD) 및 굴절 지수 검출기(RID) 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 에이질런트 1100 HPLC].
달리 특정하지 않는 한, 물(Milli-Q 고급 또는 등가물)에 포함된, 본 공정 실시용 시약 및 고체 화학 물질은 분석용 또는 그보다 더 고급의 것이었으며, 용매는 HPLC급 이상이었다. 달리 특정하지 않는 한, 시약의 보관 및 처리 단계는 실온에서 행하여 졌다. 이러한 화학 물질의 예로서는, 일 염기성 인산 나트륨의 일 수화물, 스펙트럼 USP 등급 S0130 또는 등가물; 이 염기성 인산 나트륨의 칠 수화물, 스펙트럼 USP 등급 S0140 또는 등가물; 2-프로판올, 피셔 HPLC 등급 A451-4 또는 등가물을 포함한다.
이동 상 완충액은 97%의 63mM 인산 나트륨(pH 7.0), 3%의 2-프로판올이었다. 용액 A는 25 mM 인산 나트륨(pH 7.0)이었다. 상기 두 완충액을 0.22 ㎛의 PES 필터(Corning #431098 또는 등가물)를 사용하여 여과하였다.
세계 보건 기구(WHO) rhGH(Cat. # 98/574)를 비-PEG화 hGH 기준으로 사용하였다. 이것을 1.0 ㎖의 물에 재구성한 후 WHO 완충액 중 농도 1 ㎎/㎖가 되도록 희석하여 사용하였다(허용 범위 = 0.9∼1.1 ㎎/㎖). 다른 비-PEG화 hGH 표준 즉, 보정 용액 Y35pAF-pB2/pB3도 유사한 방식으로 제조하고, 이를 20 mM의 시트르산 나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6)로 희석하였다. PEG화 hGH 표준 즉, 보정 용액 PEG30-pY35pAF-01도 또한 유사한 방식으로 제조하고, 이를 20 mM의 시트르산 나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6)로 희석하였다. 해상 용액에 있어서, PEG30-pY35pAF-02 즉, 고 분자량 표준은 1 ㎎/㎖의 농도로 만들었다(허용 범위 = 0.9∼1.1 ㎎/㎖). 이 용액은 약 33%의 PEG-PEG-GH(66.5% PEG-GH)를 함유한다. 시험 물질을 용액 A로 약 1.0 ㎎/㎖까지 희석시켰다(허용 범위 = 0.9∼1.1 ㎎/㎖). 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 모든 시료의 농도를 측정하였다. 임의의 적당한 완충액을 사용하여 시료를 희석시켰다.
공정
다음과 같은 조건으로 기구를 셋-업하였다: 1) 컬럼: TSK 수퍼 SW3000 18675 및 가드 컬럼 18762; 2) 펌프 셋 업: 일정 구배: 유량 = 0.3 ㎖/분; 지속 시간: 25 분; 최대 압력: 120 bar; 3) 주입기 셋 업 -- 주입: 표준 주입; 주입 부피: 10 ㎕; 견인 속도: 100 ㎕/분; 주입 속도 = 100 ㎕/분; 바늘 세척 = 100 ul H2O; 종료 시간: 펌프; 4) DAD 시그널: 이하 표 6 참조; 피크 폭: > 0.05 분; 슬릿 = 2 ㎚; 종료 시간: 펌프; 5) RID 시그널 -- 온도: 35℃; 반응 시간: > 0.2 분 4초, 표준; 6) 컬럼 서모스탯: 온도 = 23℃; 온도 기록.
시료 Bw 참고 물질 Bw 단위
214 4 600 100 ㎚
276 4 600 100 ㎚
220 8 600 100 ㎚
280 4 600 100 ㎚
250 8 600 100 ㎚
컬럼은 10 컬럼 부피(50 ㎖ = 166분, 0.3 ㎖/분)의 이동 상으로 평형 처리하였으며, RID는 20분 이상 동안 정화한 후, 시료를 주입하였다. DAD 및 RI 검출기는 시료를 전개시키기 이전에 자동으로 밸런스를 맞추어 졌다.
20 ㎕의 보정 용액 Y35pAF-pB2/pB3(또는 WHO 표준)을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 얻어진 크로마토그램에 있어서, 주요 비-PEG화 피크를 나타내는 물질은 체류 시간 약 12.96분(± 0.05 분)에 용리되었다. 고 분자량 비-PEG화 rhGH 이량체는 주요 피크에 대한 상대적 시간 즉, 체류 시간 0.94 ± 0.02에 용리되었다. 고 분자량 응집체는 체류 시간 7.3∼8.0 분에 용리되었다.
20 ㎕의 보정 용액 PEG30-pY35pAF-O1을 주입하였다. 주요 PEG화 피크를 나타내는 물질은 체류 시간 약 8.33(± 0.08)분[비-PEG화 rhGH에 상대적인 체류 시간 으로서는 0.64 분]에 용리되었다. 고 분자량 PEG화 rhGH 응집체는 8.0 분이 지나서야 용리되었다.
20 ㎕의 해상 용액을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 주요 PEG화 피크를 나타내는 물질은 체류 시간 약 8.28분에 용리되었고, 고 분자량 화학종은 7.54 분[주요 PEG화 피크에 상대적인 시간으로서는 0.9 분(± 0.05 분)]에 용리되었다.
20 ㎕의 시험 물질을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 시료를 3회 전개하여, 평균 체류 시간을 구하였다. rhGH 시험 물질의 체류 시간을 rhGH 기준 물질의 체류 시간과 비교하였다.
시험 물질로부터 얻어진 SEC-HPLC 데이터를 참고 물질로부터 얻어진 데이터와 비교하였다. 비-PEG화 rhGH의 순도를 측정하기 위해, rhGH 시험 물질의 통합된 주요 피크 표면적을 총 피크 표면적과 비교하였으며, rhGH 시험 물질 중 단량체 비율을 다음의 식에 따라서 계산하였다: (rhGH 시료의 주요 피크 표면적 / 총 피크 표면적) × 100%. rhGH 시험 물질 중 이량체 및/또는 고 분자량 응집체의 비율을 계산하였다. 용매로 인한 피크는 무시하였다. PEG화 rhGH의 순도를 측정하기 위하여, PEG화 rhGH 시료의 통합된 주요 피크 표면적을 총 피크 표면적과 비교하였으며, PEG-rhGH 시료 중 PEG화된 단량체의 비율을 다음의 식을 이용하여 계산하였다: (PEG-rhGH 시료의 주요 피크 표면적 / 총 피크 표면적) × 100%. PEG화 이량체, 고 분자량 응집체 및 비-PEG화 단량체의 PEG화 rhGH 시험 물질 중 비율을 계산하였다. 용매로 인한 피크는 무시하였다. 주요 PEG화 hGH 피크가 나타나기 이전의 크로마트그램 내 용리 피크는 고 분자량의 화학종의 피크를 나타내는 것이다. 이러한 고 분자량의 화학종으로서는 이량체(예를 들어, PEG-PEG-hGH 및 기타 생성 가능한 이량체) 또는 가용성 응집체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 주요 PEG화 hGH 피크 이후에 나타나는 피크들은 저 분자량 화학종의 피크를 나타내는 것이다. 이러한 저 분자량의 화학종으로서는 비-PEG화 단량체 및 PEG화 hGH의 절단형을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
RP-HPLC에 의한 rhGH의 순도 및 화학적 분해 분석
다음의 방법은 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)의 상대적 순도와 잠재적 화학 분해 특성(탈아민화 및 산화)을, C4 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 평가하기 위한 것이다. RP-HPLC는 상대적 소수성을 바탕으로 하여 분자들을 분리하는 기술이다. 시료는 탄화수소 사슬이 공유 결합되어 있는 실리카 정지 상을 통과한다. 목적 분자는 이 정지 상에 머무르게 되고, 일정 용매는 용리되어 나간다. 크로마토그래피 용리 시간은 각 분자의 특징을 이룬다. 이 방법은 친수성과, 구조 변형 예를 들어 탈아민화와 관련된 체류 행동의 미묘한 차이를 바탕으로 하여 rhGH를 분리한다. 본 방법은 rhGH의 동일성을 지지해 주고 순도를 평가할 수 있도록 해 준다. 본 기술을 통하여 rhGH의 부분 분해 산물이 일부 관찰된다.
이 기술에 관한 참고 문헌으로서는 문헌[European Pharmacopoeia 2002, p. 193; British Pharmacopoeia 2001, p.1938 - 1939; A Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatographic Method for Characterization of Biosynthetic Human Growth Hormone", R.M. Riggin외 다수 Analytical Biochemistry 167, 199-209 (1987)]을 포함한다.
본 방법에 사용되는 장치들로서는 다음의 것들 또는 이의 등가물을 포함한다: UV/Vis 분광계(Agilent 8453 또는 등가물); 50 ul 석영 큐벳; PD-10, Nap-10 또는 Nap-5(시료 부피에 따라 다름; GE Healthcare Nap5 컬럼 17-0853-02 또는 등가물); 0.5 ㎖의 비바스핀 농축기(필요한 경우; 비바사이언스 10,000 MWCO, PES, VSO 102 또는 등가물); HPLC 바이알 및 캡(올테크 100 ㎕ 스크루형 캡 폴리프로필렌 바이알 #12962, TFE 선형 캡 #73048, 개혈 스크루형 캡 #73044 또는 이의 등가물); 1ℓ 및 2ℓ들이 무균 유리병; 컬럼 - 바이닥(Vydac) C4 214ATP 54, C4-실리카 역상 HPLC 컬럼(치수 = 4.6 × 250 ㎜, 입도 = 5μ 및 공극 크기 = 300 A); 선형 구배를 걸어줄 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기구[예를 들어, 진공 탈기 장치, 4차 펌프, 서모스탯 자동 샘플러, 서모스탯 컬럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD) 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 에이질런트 1100 HPLC].
달리 특정하지 않는 한, 물(Milli-Q 고급 또는 등가물)에 포함된, 본 공정 실시용 시약 및 고체 화학 물질은 분석용 또는 그보다 더 고급의 것이었으며, 용매는 HPLC급 이상이었다. 달리 특정하지 않는 한, 시약의 보관 및 처리 단계는 실온에서 행하여 졌다. 이러한 화학 물질의 예로서는, TRIS-트로메타민, USP급, 스펙트럼 TR149 또는 이의 등가물; N-프로판올, HPLC 급, 99.9%, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 34871 또는 이의 등가물; 중탄산 암모늄, 울트라 > 99.5%, 플루카 # 09830 또는 이의 등가물.
탈아민화 조절용 완충액은 30 mM의 중탄산 암모늄(pH 9.0)이었다. 산화 조절용 완충액은 50 mM TRIS(pH 7.5)였다. 각각의 용액을 0.22 ㎛의 PES 필터(Corning #431098 또는 등가물)를 이용하여 멸균 여과하였다. 이동 상: 710 ㎖의 50 mM TRIS-HCl(pH 7.5); 290 ㎖의 n-프로판올(또는 기타 적당한 부피의 71% 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 29% n-프로판올)이었다. 6.05 g의 트로메타민(USP급, 스펙트럼 # TR149 또는 이의 등가물)을 0.95 ℓ의 MilliQ 물에 용해시켰다. 이 용액을 HCl을 사용하여 pH 7.5로 만들고, MilliQ 물을 사용하여 부피를 1 ℓ까지 만들었다. 상기 2개의 용매(TRIS 및 프로판올)를 혼합한 다음, 이 혼합물을 0.22 ㎛ PES 필터(Corning #431098 또는 등가물)를 사용하여 멸균 여과하였다. 컨디셔닝 용액은 50% AcCN:H2O, 0.1% TFA였다.
기준 물질로서 사용된 시료는, 1.0 ㎖의 물(농도 = 1.9∼2.1 ㎎/㎖)과 rhGH 참고 기준 물질(농도 = 1.9∼2.1 ㎎/㎖)로 재구성된, 세계 보건 기구(WHO) rhGH(Cat. # 98/574)를 포함하였다. 이 WHO 기준 물질을 30 mM 중탄산 암모늄(pH 9.0) 완충액으로 완충액 교환하여 탈아민화 해상 용액을 제조하였다[시료 부피에 따라서, PD-10, Nap-10 또는 Nap-5 탈염 컬럼 사용]. 기준 물질은 0.5 ㎖들이 비바스핀 농축기로 1.9∼2.1 ㎎/㎖까지 농축시켰으며, 시료는 37℃에서 24 시간 동안 항온 처리하였다. 산화 해상 용액으로서, WHO 기준 물질을 50 mM TRIS(pH 7.5) 완충액으로 완충액 교환하였다[시료 부피에 따라서, PD-10, Nap-10 또는 Nap-5 탈염 컬럼 사용]. 기준 물질은 0.5 ㎖들이 비바스핀 농축기로 약 1.9∼2.1 ㎎/㎖까지 농축시켰으며, 여기에 H2O2를 첨가하여 최종 농도가 0.015%가 되도록 만들었다. 반응물을 4℃에서 24 시간 동안 항온 처리하였다. 여기에 0.5∼1 ㎕의 카탈라아제(20 ㎎/㎖)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 시험 시료에 있어서, 시험 물질을 단백질 농도 2.0 ㎎/㎖가 되도록 희석하였다.
공정
다음과 같은 조건으로 기구를 셋-업하였다: 1) 컬럼: 바이닥(Vydac) C4 214ATP 54 컬럼; 2) 펌프 셋 업: 일정 구배: 유량 = 0.5 ㎖/분; 지속 시간: 60 분; 최대 압력: 200 bar; 3) 자동 샘플러 온도: 4℃; 4) 주입기 셋 업 -- 주입: 표준 주입; 주입 부피: 20 ㎕; 견인 속도: 100 ㎕/분; 바늘 세척 = 100 ul 물; 주입 속도: 100 ㎕/분, 종료 시간: 펌프; 5) DAD 시그널: 이하 표 7 참조; 피크 폭: > 0.1 분; 슬릿 = 4 ㎚; 종료 시간: 60 분; 6) 컬럼 서모스탯: 온도 = 45℃; 온도 기록; 7) 예비 통합 단계(켐스테이션 소프트웨어, 에이질런트) 슬로프 감도: 0.1; 피크 폭: 0.5; 제외 표면적(area reject): 1.0; 제외 높이(height reject): 1.0; 통합 ON: 10 분.
시료 Bw 참고 물질 Bw 단위
220 4 600 100 ㎚
276 4 600 100 ㎚
214 8 600 100 ㎚
220 4 600 100 ㎚
컬럼을 300 ㎖의 컨디셔닝 용액(50% AcCN, H2O, 0.1% TFA)으로 예비 컨디셔닝시켰다(유량 = 0.5∼1.5 ㎖/분). 컬럼을 사용하기 전에, 또는 피크가 넓게 퍼져 컨디셔닝 용액(200 ∼300 ㎖)으로 컬럼을 다시 컨디셔닝해야 할 상태에 이르기 전에, 예비적으로 평형 처리하였다. 이 컬럼을 10 컬럼 부피(41.5 ㎖ = 83분, 0.5 ㎖/분)의 이동상으로 평형 처리하였다.
자동 샘플러를 이용하여 20 ㎕의 기준 물질을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. WHO 기준 물질의 체류 시간이 32.5∼35 분이 아닐 경우, 이동 상의 조성을 조절하고, 컬럼을 다시 평형 처리한 다음, 기준 물질을 다시 전개시켰다. 이때, 체류 시간이 32.5 분 미만이면, 이동 상 1 ℓ당 5 ㎖ 미만의 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)을, 그리고 체류 시간이 35분 이상이면, 2 ㎖ 미만의 n-프로판올을 첨가하여 조절할 것을 권장하였다. 프로판올이 증발할 수 있기 때문에, 기준 물질은 매일 전개시켜야 하며, 이에 따라서 시료는 시험되고, 완충액은 조정되었다.
20 ㎕의 탈아민화 해상 용액을 주입하고 HPLC 프로그램을 실행하였다. 데스아미도-hGH는 주요 피크에 상대적인 시간으로서는 약 0.88 ± 0.33 분의 체류 시간에 작은 피크를 나타내었다. hGH와 데스아미도-hGH로 인한 피크 사이의 해상도는 1.0 이상이었으며(현재의 조건으로는 해상도 = 1.29 ± 0.04), hGH 피크의 대칭 팩터(symmetry factor)는 0.8∼1.8이었다(현재의 조건으로는 해상도 = 1.26 ± 0.06).
20 ㎕의 산화 해상 용액을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 산화된-hGH는 주요 피크에 상대적인 시간으로서는 약 0.8분의 체류 시간에 작은 피크를 나타내었다.
20 ㎕의 시험 물질을 주입하고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 시료를 3회 전개하여, 평균 체류 시간을 구하였다.
데이터 분석
시험 물질의 평균 체류 시간을 rhGH 참고 기준 또는 WHO 표준과 비교하였다. 시험 물질의 평균 순도를 계산하였다: (주요 피크의 통합 표면적 / 모든 피크의 통합 표면적) × 100%. 용매로 인한 임의의 피크는 무시하였다. 크로마토그램을 흡광도(220 ㎚)에 대해서 나타내었다.
본원에 기술된 실시예 및 구체예들은 예시를 위한 것으로서, 이의 취지에 비추어 당 업자는 다양한 유형의 변형 또는 변화를 줄 수 있으며, 또한 그러한 변형은 본 출원의 사상과 범위, 그리고 첨부된 청구의 범위 이내에 포함된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원들은 본원에 그 자체로서 모든 목적의 참고 문헌으로 인용되어 있는 것이다.
인용된 서열
서열 번호 서열 명
1 hGH의 전장 아미노산 서열
2 hGH의 성숙 아미노산 서열(아형)
3 hGH의 32∼46번 잔기가 결실된 20 kDa의 hGH 변이체
SEQUENCE LISTING <110> Buechler, Ying Lieu, Ricky Ong, Michael Bussell, Stuart Knudsen, Nick Cho, Ho S. <120> METHODS FOR EXPRESSION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE <130> AMBX-0078.00PCT <150> 60/638,616 <151> 2004-12-22 <150> 60/655,744 <151> 2005-02-23 <150> 60/680,977 <151> 2005-05-13 <150> 60/727,968 <151> 2005-10-17 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 50 55 60 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 85 90 95 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 115 120 125 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 165 170 175

Claims (12)

  1. (a) 생육을 촉진하는 조건 하에 비천연 암호화 아미노산(non-naturally encoded amino acid)을 함유하는 액상 영양 배지 중에서, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포에 의한, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH의 생산을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 상기 hGH를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 세포 생육 중에 연속적으로, 유도 이전 시점, 유도 시점 또는 유도 이후 시점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시점에 첨가하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 유도와 동시에 첨가하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 암호화 아미노산은 유도 약 1 시간 전에 첨가하는 것인 방법.
  5. (a) 제1항의 (c) 단계로부터 얻어진 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 매트릭스로부터 hGH를 용리 및 수집하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 hGH와 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 HIC 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하여, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 실질적으로 순수한 hGH를 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포는 원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 실질적으로 정제된 hGH는 성숙 hGH, 성숙 hGH 변이체, hGH 폴리펩티드 및 hGH 폴리펩티드 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a) 이후의 추가 단계로서, 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된 hGH와 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. (a) hGH-PEG 컨쥬게이트를 형성하기에 충분한 조건 하에, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 유도체화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트와 음이온 교환 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집함으로써 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트를 분리 및 정제하여, 실질적으로 정제된 hGH-PEG 컨쥬게이트를 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. (a) 생육을 촉진하는 조건 하에, 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 액상 영양 배지 중에서, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포에 의한, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH의 생산을 유도하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계로부터 얻어진 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된 hGH와 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하는 단계;
    (e) 상기 단계 (d)로부터 얻어진 hGH와 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 HIC 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하여 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH를 제공하는 단계;
    (f) hGH-PEG 컨쥬게이트를 형성하기에 충분한 조건 하에, 상기 단계 (e)로부터 얻어진 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 유도체화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 반응시키는 단계; 및
    (g) 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트와 음이온 교환 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집함으로써 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트를 분리 및 정제하여, 실질적으로 정제된 hGH-PEG 컨쥬게이트를 제공하는 단계
    를 포함하는, 실질적으로 정제된 hGH-PEG 컨쥬게이트를 분리하는 방법.
  11. (a) 생육을 촉진하는 조건 하에, 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 액상 영양 배지 중에서, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포에 의한, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH의 생산을 유도하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)로부터 얻어진 hGH와 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 HIC 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집하여 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH를 제공하는 단계;
    (e) hGH-PEG 컨쥬게이트를 형성하기에 충분한 조건 하에, 상기 단계 (d)로부터 얻어진 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 유도체화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 반응시키는 단계; 및
    (f) 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트와 음이온 교환 매트릭스를, 상기 매트릭스에 상기 hGH가 결합할 수 있는 조건 하에 접촉시킨 후, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스로부터 상기 hGH를 용리 및 수집함으로써 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트를 분리 및 정제하여, 실질적으로 정제된 hGH-PEG 컨쥬게이트를 제공하는 단계
    를 포함하는, 실질적으로 정제된 hGH-PEG 컨쥬게이트를 분리하는 방법.
  12. (a) 생육을 촉진하는 조건 하에, 비천연 암호화 아미노산을 함유하는 액상 영양 배지 중에서, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포에 의한, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH의 생산을 유도하는 단계;
    (c) hGH-PEG 컨쥬게이트를 형성하기에 충분한 조건 하에, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH와 유도체화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 반응시키는 단계; 및
    (d) 상기 hGH-PEG 컨쥬게이트를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150038715A (ko) * 2010-07-22 2015-04-08 바이오마린 파머수티컬 인크. 고도로 인산화된 활성 인간 n-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 제조 및 이것의 용도

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
JP2007515410A (ja) * 2003-12-03 2007-06-14 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド ＧｌｙｃｏＰＥＧ化卵胞刺激ホルモン
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
JP4951527B2 (ja) 2005-01-10 2012-06-13 バイオジェネリックス アーゲー 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
WO2007092475A2 (en) * 2006-02-06 2007-08-16 Franklin And Marshall College Site-specific incorporation of fluorinated amino acids into proteins
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
JP2010505874A (ja) * 2006-10-03 2010-02-25 ノヴォ ノルディスク アー／エス ポリペプチドコンジュゲートの精製方法
ES2406267T3 (es) 2007-04-03 2013-06-06 Biogenerix Ag Métodos de tratamiento usando G-CSF glicopegilado
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
GB0713880D0 (en) * 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
ES2476690T3 (es) 2008-02-27 2014-07-15 Novo Nordisk A/S Moléculas conjugadas del Factor VIII
SI3050576T1 (sl) * 2008-04-29 2021-08-31 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Spojine pegiliranega rekombinantnega humanega rastnega hormona
US9422559B2 (en) 2010-06-02 2016-08-23 Shi-Lung Lin Production and utilization of a novel anti-cancer drug in therapy
US9399773B2 (en) 2012-08-10 2016-07-26 Shi-Lung Lin Production and extraction of MicroRNA precursor as drug for cancer therapy
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
ES2640947T3 (es) * 2009-05-11 2017-11-07 Pfenex, Inc. Producción de proteínas recombinantes utilizando métodos de selección no antibióticos y la incorporación de aminoácidos no naturales en las mismas
NZ600361A (en) * 2009-12-21 2014-06-27 Ambrx Inc Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
SG187736A1 (en) 2010-08-17 2013-03-28 Ambrx Inc Modified relaxin polypeptides and their uses
RU2566267C2 (ru) 2010-09-14 2015-10-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ очистки пегилированного эритропоэтина
BR112013017980A2 (pt) 2011-01-14 2017-06-27 Redwood Bioscience Inc polipeptídeos de imunoglobulina marcado com aldeído e método de uso dos mesmos
EP2742127B1 (en) 2011-08-12 2019-10-09 Mello Biotechnology, Inc. Inducable expression from the eukaryotic pol-2 promoter in prokaryotes
CA2864300A1 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Atyr Pharma, Inc. Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases
JP6231559B2 (ja) * 2012-06-05 2017-11-15 シージェイ ヘルスケア コーポレイションＣｊ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 高グリコシル化された持続型ヒト成長ホルモンタンパク質の製造方法及び精製方法
US10196662B2 (en) 2012-08-10 2019-02-05 Mello Biotechnology, Inc. Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors
CA2840809C (en) * 2012-09-19 2016-06-21 Amy L. Heaton Methods and compositions for increasing growth hormones
US9198889B2 (en) 2012-09-19 2015-12-01 Quality IP Holdings, LLC Methods for treating post-traumatic stress disorder
US20140080887A1 (en) * 2012-09-19 2014-03-20 Basic Research L.L.C. Methods for improving linear growth response in children
US8747922B2 (en) 2012-09-19 2014-06-10 Quality Ip Holdings, Inc. Methods and compositions for increasing sex steroids and growth hormones
US8747921B2 (en) 2012-09-19 2014-06-10 Quality Ip Holdings, Inc. Methods for improving health in humans
US10300101B2 (en) 2012-09-19 2019-05-28 Quality IP Holdings, LLC Methods and compositions for enhancing or maintaining fertility
US10292957B2 (en) 2012-09-20 2019-05-21 Quality IP Holdings, LLC Compositions and methods for treating fibromyalgia
US8747923B2 (en) 2012-09-20 2014-06-10 Quality Ip Holdings, Inc. Methods for improving health in canines
US8715752B2 (en) 2012-09-20 2014-05-06 Quality Ip Holdings, Inc. Compositions for increasing human growth hormone levels
CA2885527C (en) * 2012-09-20 2021-07-20 Quality IP Holdings, LLC Compositions and methods for improving health in animals
US9066953B2 (en) 2012-09-20 2015-06-30 Quality IP Holdings, LLC Methods for increasing endurance and fat metabolism in humans
WO2014137903A2 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Genzyme Corporation Integrated continuous manufacturing of therapeutic protein drug substances
DK3460054T3 (da) 2013-03-15 2021-01-18 Atyr Pharma Inc Histidyl-tRNA-syntetase-Fc-konjugater
TWI709569B (zh) 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途
TWI671312B (zh) 2014-01-17 2019-09-11 美商健臻公司 無菌層析法及製法
WO2016011281A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-21 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. FORMULATIONS OF AN ALBUMIN-hGH FUSION PROTEIN
EP3384026A1 (en) 2015-12-02 2018-10-10 Shi-Lung Lin Use of microrna precursors as drugs for inducing cd34-positive adult stem cell expansion
WO2017095458A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Chih-Li Lin A COMPOSITION AND METHOD OF USING miR-302 PRECURSORS AS DRUGS FOR TREATING ALZHEIMER'S DISEASES
JP2019515677A (ja) 2016-04-26 2019-06-13 アール．ピー．シェーラー テクノロジーズ エルエルシー 抗体複合体ならびにそれを作製および使用する方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
AU2018219283B2 (en) 2017-02-08 2022-05-19 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
US10894072B2 (en) 2017-02-13 2021-01-19 IP Quality Holdings, LLC Compositions and methods for treating fibromyalgia
SG11202101860UA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Genzyme Corp Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes
CA3141128A1 (en) 2019-06-17 2020-12-24 Molecular Technologies Laboratories Llc Therapeutic pegylated growth hormone antagonists
MX2022002337A (es) 2019-08-27 2022-06-08 Tonix Pharma Ltd Polipéptidos de tff2 modificados.
CN114555646A (zh) * 2019-10-17 2022-05-27 Jcr制药股份有限公司 血清白蛋白与生长激素的融合蛋白的制造方法
CN113388609B (zh) * 2021-06-21 2022-09-13 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的纯化方法
WO2023196596A2 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Absci Corporation Trna synthetases and methods of use thereof

Family Cites Families (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4898830A (en) 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
JPS5630925A (en) * 1979-08-21 1981-03-28 Sumitomo Chem Co Ltd Purification of human growth hormone
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4670393A (en) 1982-03-22 1987-06-02 Genentech, Inc. DNA vectors encoding a novel human growth hormone-variant protein
US4446235A (en) 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US5089398A (en) 1983-02-22 1992-02-18 Chiron Corporation Enhanced yeast transcription employing hybrid GAPDH promoter region constructs
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4859600A (en) 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4689406A (en) 1983-08-10 1987-08-25 Amgen Enhancement of microbial expression of polypeptides
EP0142641B1 (de) 1983-09-26 1991-01-16 Udo Dr. Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
US4880734A (en) 1984-05-11 1989-11-14 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4738921A (en) 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4963495A (en) 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
US4837148A (en) 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4665180A (en) 1984-11-06 1987-05-12 Petrolite Corporation Substituted tetrahydropyrimidines and octahydrophenanthridines
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US5186933A (en) 1986-12-30 1993-02-16 Baylor College Of Medicine Synthesis and immunogenicity of rotavirus genes using a baculovirus expression system
WO1988007082A1 (en) 1987-03-16 1988-09-22 American Biogenetic Sciences, Inc. Recombinant baculovirus occlusion bodies in vaccines and biological insecticides
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5688763A (en) 1987-06-12 1997-11-18 Hammonds, Jr.; R. Glenn Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein
US5057417A (en) 1987-06-12 1991-10-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein
CA1317244C (en) 1987-07-24 1993-05-04 Ernest Seigo Kawasaki Production of biologically active forms of csf using a baculovirus (acnpv)-insect cell expression system
WO1989001037A1 (en) 1987-07-24 1989-02-09 Cetus Corporation Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
US5063158A (en) 1987-11-09 1991-11-05 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vector comprising both transcriptional and translational activating sequences
US5192669A (en) 1987-11-09 1993-03-09 Eli Lilly And Company Method to produce recombinant proteins using an expression vector comprising transcriptional and translational activating sequences
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US5674706A (en) * 1988-05-06 1997-10-07 Chiron Corporation High level expression of proteins in yeast
CA1324969C (en) * 1988-05-06 1993-12-07 Jeffrey R. Shuster High level expression of proteins in yeast
FR2631974B1 (fr) 1988-05-31 1992-12-11 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede de preparation et son application en tant que vecteur d'expression de genes
US5262322A (en) 1988-06-24 1993-11-16 Genentech, Inc. Host transformed with yeast gene and ubiquitin/polypeptide fusions
US5108919A (en) * 1988-06-24 1992-04-28 Genentech, Inc. Dna sequences encoding yeast ubiquitin hydrolase
AU4197389A (en) 1988-08-05 1990-03-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The In vivo infection of live insects with a recombinant baculovirus
GB8819453D0 (en) 1988-08-16 1988-09-21 Roy P Production of bluetongue virus non-structural proteins using baculovirus expression vector
NZ230425A (en) 1988-09-02 1992-07-28 Molecular Eng Ass Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector
US6780613B1 (en) * 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
WO1990004788A1 (en) * 1988-10-28 1990-05-03 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
US5688666A (en) 1988-10-28 1997-11-18 Genentech, Inc. Growth hormone variants with altered binding properties
EP0446299A4 (en) 1988-11-18 1992-05-13 The Regents Of The University Of California Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
CA2006596C (en) * 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
AU5187190A (en) 1989-02-23 1990-09-26 University Of Ottawa Improved baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
EP0460071A4 (en) 1989-02-24 1993-02-03 Cell Analysis Systems, Inc. Method and apparatus for determining a proliferation index of a cell sample
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2247656T3 (es) 1989-04-19 2006-03-01 Enzon, Inc. Un proceso para formar un polipeptido modificado que comprende un polipeptido y un oxido de polialquileno.
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
CA2033070A1 (en) 1989-05-17 1990-11-18 Lois K. Miller Baculovirus expression vectors
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5350836A (en) 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5162601A (en) 1989-11-22 1992-11-10 The Upjohn Company Plant potyvirus expression vector with a gene for protease
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
FR2664905B1 (fr) 1990-07-18 1994-08-12 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
WO1992001800A1 (en) * 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
WO1992002628A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 Chiron Corporation Expression of human cmv glycoprotein-h using the baculovirus-insect cell expression system
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
CA2090969C (en) 1990-09-04 2001-08-21 Russell Arthur Brierley Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
US5492821A (en) * 1990-11-14 1996-02-20 Cargill, Inc. Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DE69129154T2 (de) * 1990-12-03 1998-08-20 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5231178A (en) 1991-01-16 1993-07-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
WO1992016619A1 (en) 1991-03-19 1992-10-01 Us Army Expression of influenza nucleoprotein antigens in baculovirus
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6126944A (en) * 1991-04-26 2000-10-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Baculovirus expression vectors and recombinant antigens for detecting type-specific antibodies to herpes simplex virus
JP3417558B2 (ja) * 1991-05-10 2003-06-16 ジェネンテク，インコーポレイテッド 配位子作用薬および拮抗薬の選択
WO1992022653A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5290686A (en) 1991-07-31 1994-03-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of influenza a M2 protein in baculovirus
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
JPH07505915A (ja) 1992-04-14 1995-06-29 コーネル　リサーチ　ファウンデーション、インコーポレーテッド 樹枝状巨大分子およびその製造法
US5516657A (en) 1992-05-11 1996-05-14 Cambridge Biotech Corporation Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound proteins
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5762939A (en) * 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
EP0721475B1 (de) * 1993-10-02 1997-04-23 Basf Aktiengesellschaft Copolymerisate auf ethylenbasis und ihre verwendung als fliessverbesserer in erdölmitteldestillaten
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
US5605792A (en) * 1993-11-04 1997-02-25 The Ohio State University Research Foundation Infectious bursal disease virus VP2 fusion protein expressed by baculovirus, use as diagnostic
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5597709A (en) 1994-01-27 1997-01-28 Human Genome Sciences, Inc. Human growth hormone splice variants hGHV-2(88) and hGHV-3(53)
FR2715664B1 (fr) 1994-01-31 1996-04-12 Proteine Performance Sa Baculovirus recombinant et son utilisation pour la production d'anticorps monoclonaux.
JP3090586B2 (ja) * 1994-03-15 2000-09-25 片倉工業株式会社 システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルスおよびその製造法並びにこれを利用する有用タンパク質の製造法
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) * 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5686110A (en) 1994-06-02 1997-11-11 Enzon, Inc. Water soluble complex of an alkyl or olefinic end capped polyalkylene oxide and a water insoluble substance
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US6403375B1 (en) 1994-08-24 2002-06-11 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Establishment of Trichoplusia ni cell lines in serum-free medium for recombinant protein and baculovirus production
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5871986A (en) * 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
EP0788375A2 (en) 1994-11-09 1997-08-13 Robin Ewart Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
AU4659296A (en) 1994-12-21 1996-07-10 Progressive Solutions, Inc. Product handling process and system
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
EP0842275A1 (en) 1995-02-17 1998-05-20 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM
FR2732035B1 (fr) * 1995-03-23 1997-05-30 Agronomique Inst Nat Rech Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede
NZ308772A (en) * 1995-05-17 1999-04-29 Du Pont Recombinant baculovirus insecticides
AU5893696A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
DE122006000003I2 (de) 1995-09-21 2011-01-13 Genentech Inc Varianten des menschlichen wachstumshormons
US5861279A (en) * 1996-01-17 1999-01-19 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists
WO1997026332A1 (en) 1996-01-17 1997-07-24 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
CN100471521C (zh) 1996-08-02 2009-03-25 奥索·麦克尼尔药品公司 含有与n-末端共价结合的单个水溶性聚合物的多肽类
US5980948A (en) * 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6017731A (en) * 1996-12-13 2000-01-25 Chiron Corporation Method for expression of heterologous proteins in yeast
ATE200030T1 (de) 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
GB9703406D0 (en) 1997-02-19 1997-04-09 Chiron Spa Expression of heterologous proteins
US6323322B1 (en) 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
EP1015612B1 (en) * 1997-05-27 2005-01-26 Hanil Synthetic Fiber Co., Ltd. Process for preparing recombinant proteins using highly efficient expression vector from saccharomyces cerevisiae
US5965393A (en) * 1997-07-01 1999-10-12 National Institute Of Immunology Method for enhancing foreign gene expression in baculovirus expression vector system
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
EP1012184B1 (en) 1997-07-14 2007-10-10 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
GB9715660D0 (en) 1997-07-25 1997-10-01 Zeneca Ltd Proteins
JP2001512684A (ja) 1997-08-05 2001-08-28 カイロン コーポレイション 新規のｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子配列およびそれらの使用方法
DE19735593C2 (de) 1997-08-15 1999-08-26 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie
US6090584A (en) 1997-08-21 2000-07-18 University Technologies International Inc. Baculovirus artificial chromosomes and methods of use
US5989868A (en) * 1997-09-12 1999-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli
PT1015576E (pt) * 1997-09-16 2005-09-30 Egea Biosciences Llc Metodo para a sintese quimica completa e montagem de genes e de genomas
AU752037B2 (en) * 1997-09-26 2002-09-05 Uab Research Foundation Reduced antigenic cells and uses therefor
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6201072B1 (en) * 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
DE19748489A1 (de) * 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics Gmbh Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren
US6448369B1 (en) * 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
EP0924298A1 (en) 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
WO1999045130A1 (en) 1998-03-04 1999-09-10 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Baculovirus expression system and method for high throughput expression of genetic material
ATE279430T1 (de) * 1998-03-05 2004-10-15 Chiron Corp Verfahren zur verbesserung der serum halbwertszeit von biologisch aktiven molekülen
WO1999045964A1 (en) * 1998-03-12 1999-09-16 Shearwater Polymers, Incorporated Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
KR100264953B1 (ko) 1998-04-03 2001-03-02 박현우 재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제
NZ507456A (en) 1998-04-28 2003-10-31 Applied Research Systems Process and conjugated forms of PEGylated interferon- beta with polyethylene glycol (PEG) wherein the thiol reactive polyol agent is mono-methoxylated
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
US6160089A (en) * 1998-07-08 2000-12-12 Mitsui Chemicals, Inc. Method for secretory production of human growth hormone
US6168932B1 (en) * 1998-07-13 2001-01-02 Parker Hughes Institute Recombinant DTctGMCSF fusion toxin in a baculovirus expression vector system
US6245528B1 (en) * 1998-07-28 2001-06-12 Academia Sinica Latent baculovirus expression system
US6368825B1 (en) * 1998-08-10 2002-04-09 Academia Sinica Baculovirus containing minimal CMV promoter
AU764144B2 (en) * 1998-08-28 2003-08-14 Gryphon Therapeutics, Inc. Polyamide chains of precise length, methods to manufacture them and their conjugates
JP2002526078A (ja) 1998-09-18 2002-08-20 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド インターフェロン−イプシロン
WO2000020032A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Trustees Of Dartmouth College RECOMBINANT CAT ALLERGEN, Fel dI, EXPRESSED IN BACULOVIRUS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CAT ALLERGY
US6420339B1 (en) * 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
ATE365210T1 (de) 1998-10-30 2007-07-15 Novozymes As Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität
US6451346B1 (en) * 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
US6281211B1 (en) * 1999-02-04 2001-08-28 Euro-Celtique S.A. Substituted semicarbazides and the use thereof
US6342216B1 (en) * 1999-03-17 2002-01-29 The Board Of Regents, The University Of Texas System Therapy of cancer by insect cells containing recombinant baculovirus encoding genes
US6994986B2 (en) * 1999-03-17 2006-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford University In vitro synthesis of polypeptides by optimizing amino acid metabolism
JP4707237B2 (ja) 1999-03-17 2011-06-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 外因性アミノ酸および新規ａｔｐ再生システムを用いたインビトロ高分子生合成の方法
US6337191B1 (en) * 1999-03-22 2002-01-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Vitro protein synthesis using glycolytic intermediates as an energy source
US7083791B2 (en) * 1999-03-25 2006-08-01 Genesis Research & Development Corporation Limited Methods for enhancing immune responses by fibroblast growth factor receptor 5 polypeptides
CA2369758C (en) * 1999-04-16 2007-04-03 Wm. Marsh Rice University Functionalized poly(propylene fumarate) and poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol)
US6514729B1 (en) 1999-05-12 2003-02-04 Xencor, Inc. Recombinant interferon-beta muteins
US6261805B1 (en) * 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
US6485937B1 (en) 1999-10-15 2002-11-26 The Rockefeller University System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae
US6348558B1 (en) * 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
ES2321800T5 (es) 1999-12-22 2017-02-17 Nektar Therapeutics Procedimiento de preparación de ésteres de 1-benzotriazolil carbonato de polímeros solubles en agua
AU781839B2 (en) 1999-12-22 2005-06-16 Nektar Therapeutics Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
WO2001062827A2 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
WO2001062299A2 (en) * 2000-02-28 2001-08-30 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
US6586207B2 (en) * 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
GB0012997D0 (en) 2000-05-26 2000-07-19 Eurogene Limited Gene delivery
JP2002030098A (ja) 2000-07-17 2002-01-29 Institute Of Immunology Co Ltd バキュロウィルスの発芽ウイルスからウイルスエンベロープを回収する方法
US6635691B2 (en) * 2000-08-21 2003-10-21 Ivoclar Vivadent Ag Dental material containing a component which contracts during thermal treatment
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU7338501A (en) * 2000-09-08 2002-03-22 Gryphon Sciences Polymer-modified synthetic proteins
US6436386B1 (en) * 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
TW593427B (en) * 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
KR100401296B1 (ko) 2000-12-27 2003-10-11 드림바이오젠 주식회사 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법
TWI246524B (en) * 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
WO2002086075A2 (en) * 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute Methods and composition for the production of orthoganal trna-aminoacyltrna synthetase pairs
US20040038242A1 (en) * 2001-07-30 2004-02-26 Edmonds Brian Taylor Novel secreted proteins and their uses
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
KR100948532B1 (ko) 2001-11-07 2010-03-23 넥타르 테라퓨틱스 분지형 중합체 및 그의 공액체
AP2004003050A0 (en) * 2001-11-20 2004-06-30 Pharmacia Corp Chemically modified human growth hormone conjugates
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
WO2003101972A1 (en) 2002-05-30 2003-12-11 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
US7189811B2 (en) * 2002-09-06 2007-03-13 National Institute Of Immunology Process for solubilization of recombinant proteins expressed as inclusion body
WO2004026251A2 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Pharmacia Corporation Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
DK1578949T3 (da) 2002-10-16 2009-07-27 Scripps Research Inst Stedspecifik optagelse af keto-aminnosyrer hos proteiner
US6927042B2 (en) 2002-10-16 2005-08-09 The Scripps Research Institute Glycoprotein synthesis
AU2003300389B2 (en) 2002-12-22 2009-10-08 The Scripps Research Institute Protein arrays
CA2520875A1 (en) * 2003-03-31 2004-10-21 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7618775B2 (en) 2003-04-17 2009-11-17 The Scripps Research Institute Expanding the eukaryotic genetic code
WO2005003294A2 (en) 2003-06-18 2005-01-13 The Scripps Research Institute Unnatural reactive amino acid genetic code additions
ATE471385T1 (de) 2003-07-07 2010-07-15 Scripps Research Inst Zusammensetzungen aus orthogonalen lysyl-trna- und aminoacyl-trna-synthetasepaaren und deren verwendung
WO2005007870A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 The Scripps Research Institute COMPOSITIONS OF ORTHOGONAL LEUCYL-tRNA AND AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS AND USES THEREOF
EP1658366A4 (en) 2003-07-07 2006-08-09 Scripps Research Inst COMPOSITIONS OF ORTHOGONAL GLUTAMYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASEPAARES AND THEIR USES
JP2007507510A (ja) * 2003-09-30 2007-03-29 スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に外因性タンパク質を産生するためのプロセスおよびそれからタンパク質を精製するためのプロセス
ES2831379T3 (es) 2003-10-09 2021-06-08 Ambrx Inc Derivados poliméricos para la modificación selectiva de proteínas
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EA200602097A1 (ru) * 2004-11-09 2007-04-27 Ю Эс Ви ЛИМИТЕД Новый способ очистки гормона роста человека

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150038715A (ko) * 2010-07-22 2015-04-08 바이오마린 파머수티컬 인크. 고도로 인산화된 활성 인간 n-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 제조 및 이것의 용도

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