BR112013001558B1 - Método para purificar enzima n-acetilgalactosamina-6-sulfatase (galns) recombinante, formulação que compreende a referida enzima, e uso da mesma - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PURIFICAR ENZIMA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE (GALNS) RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE A REFERIDA ENZIMA E SEU USO NO TRATAMENTO DE MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IVa (MPS IVa) OU SÍNDROME DE MORQUIO A, BEM COMO FORMULAÇÃO. Esta invenção fornece composições de N- acetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS) humana fosforilada altamente ativas e composições farmacêuticas e formulações das mesmas, métodos para produzir e purificar GALNS, e seu uso no diagnóstico, na profilaxia ou tratamento de doenças e condições incluindo, em particular, as doenças de armazenamento lisosso-mal que são causadas por, ou associadas com, uma deficiência na enzima GALNS, por exemplo, Mucopolissacaridose IVa (MPS IVa ou síndrome de Morquio A).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica a prioridade e benefício do Pedido Provisório US 61/366.714, depositado em 22 de julho de 2010, a divulgação do qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se aos campos técnicos da biologia e medicina celular e molecular, especialmente à fabricação de enzimas de sulfatase lisossomais humanas fosforiladas altamente ativas e seu uso no controle das doenças por armazenamento lisossomal associadas à deficiência da enzima sulfatase lisossomal. Em particular, a presente invenção refere-se à fabricação da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante fosforilada altamente ativa (GALNS) e sua utilização no controle de Mucopolissacaridose IVa (MPS IVa ou síndrome de Morquio A) e outras doenças por armazenamento lisossomal, associadas a uma deficiência de GALNS.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Doenças de depósito lisossomal (LSDs) resultam da deficiência de enzimas lisossomais dentro da célula específica que são essenciais para a degradação de resíduos celulares no lisossoma. A deficiência de enzimas lisossomais leva a tal acúmulo dentro do lisossoma de “material de armazenamento” não degradado, o que provoca inchaço e mau funcionamento dos lisossomos e, finalmente, danos celulares e aos tecidos. O grande número de enzimas lisossomais foi identificado e correlacionado com suas doenças relacionadas. Uma vez que a enzima ausente foi identificada, o tratamento pode ser reduzido ao único problema de distribuir eficientemente uma enzima de substituição aos tecidos afetados de pacientes.

[004] Uma forma de tratar doenças de armazenamento lisossomal é pela terapia de substituição de enzima intravenosa (ERT) (Kakkis, Expert Opin. Investig. Drugs 11(5): 675-685, 2002). ERT aproveita a vasculatura para carregar a enzima de um local único de administração para a maioria dos tecidos. Uma vez que a enzima foi amplamente distribuída, ela deve ser absorvida nas células. A base para fixação em células encontra-se em uma característica única de enzimas lisossomais. As enzimas lisossomais constituem uma classe separada de glicoproteínas definida pelo fosfato na posição 6 de resíduos de manose terminais. A manose-6-fosfato é ligada com alta afinidade e especificidade por um receptor encontrado na superfície da maioria das células (Munier-Lehmann et al., Biochem. Soc. Trans. 24(1): 133-136, 1996; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). O receptor do manose-6-fosfato (MPR), que tem dois sítios de ligação de manose-6- fosfato por cadeia de polipeptídeos (Tong et al., J. Biol. Chem. 264:7962-7969, 1989), direciona a absorção da enzima do sangue para o tecido e depois media o roteamento intracelular para o lisossoma.

[005] A produção em larga escala de enzimas lisossomais envolve a expressão em linhagens celulares de mamíferos. O objetivo é a secreção predominante da enzima recombinante no meio de crescimento circundante para coleta e processamento a jusante. Em um sistema ideal para a produção em larga escala de enzimas lisossomais, a enzima seria eficientemente fosforilada e então direcionada principalmente em direção à superfície da célula (isto é, para a secreção), ao invés principalmente do lisossoma. Conforme descrito acima, esta divisão das enzimas lisossomais fosforiladas é exatamente o oposto do que ocorre em células normais. A fabricação de linhagens celulares usadas para a produção de enzimas lisossômicas centra-se na maximização do nível de manose-6-fosfato por mol da enzima, mas caracteriza-se pela baixa produtividade específica. Tentativas in vitro de produzir enzimas lisossomais contendo altos níveis de frações de manose-6-fosfato resultaram em sucesso misto (Canfield et al., Patente US 6.537.785). A enzima in vitro apresenta altos níveis de manose-6- fosfato, bem como níveis elevados de manose terminal sem modificações. A concorrência entre os receptores de manose-6-fosfato e manose para enzima lisossômica resulta na necessidade de altas doses de enzima para a eficácia e poderia levar a maior imunogenicidade em detrimento do indivíduo a ser tratado.

[006] As sulfatases constituem uma subclasse exclusiva de enzimas lisossomais. As sulfatases clivam ésteres de sulfato de uma variedade de substratos, incluindo, por exemplo, esteróides, carboidratos, proteolgicanos e glicolipídeos. Todas as sulfatases eucarióticas conhecidas contêm um resíduo de cisteína em seu sítio catalítico. A atividade de sulfatase requer modificação pós-traducional deste resíduo de cisteína para Cα-formilglicina (FGly). A cisteína para ativação de enzima pós-traducional FGly ocorre dentro de retículo endoplasmático nas sulfatases desdobradas imediatamente após a tradução, antes do direcionamento das sulfatases para o lisossoma (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11963-11968, 1997). A enzima de geração de formilglicina que catalisa esta reação é o fator de modificação de sulfatase 1 (SUMF1). O destaque da importância desta modificação pós-translational única é o fato de que mutações em SUMF1, que resultam na formação de FGly deficiente em enzimas sulfatase lisossomais, causam Deficiência de Sulfatase Múltipla (MSD) no homem (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355379, 2005).

[007] Nesse sentido, a eficácia terapêutica de uma preparação de enzima de sulfatase lisossomal depende do nível de manose-6-fosfato, na presença da enzima ativa, naquela preparação.

[008] Assim, existe uma necessidade na técnica por um sistema eficiente e produtivo para a fabricação em larga escala de enzimas de sulfatase lisossomais terapeuticamente eficazes, fosforiladas altamente ativas para controle de distúrbios de armazenamento lisossomal causados por ou associados a uma deficiência de tais enzimas de sulfatase lisossomais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção refere-se à verificaçãoverificação de que quando um derivado da linhagem celular CHO-K1 (designado G71) que é deficiente na acidificação endossomal é manipulado para expressar o fator modificador da sulfatase humana recombinante 1 (SUMF1), as células G71 modificadas produzem rendimentos elevados de enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes ativas altamente fosforiladas em parte, evitando a perda de material para o compartimento lisossomal da linhagem celular de produção. Em uma modalidade, a invenção fornece uma linhagem celular de grupo de complementação END3 que coexpressa a SUMF1 recombinante humana e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante (GALNS), o que resulta em rendimentos elevados de enzima fosforilada altamente ativa. Linhagens celulares exemplare são G71, G71S, e derivados destas, que retêm a propriedade desejada de G71, ou seja, a capacidade de produzir elevados rendimentos das enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes altamente fosforiladas ativadas. Esta aplicação de uma linhagem celular CHO-K1 modificada pelo grupo de complementação END3 coexpressando a SUMF1 recombinante humana e uma enzima de sulfatase lisossomal recombinante seria especialmente útil para a fabricação de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas a serem usadas para tratamento de doenças de armazenamento lisossômico por terapia de reposição de enzima (ERT).

[0010] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um novo método de produção de enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes fosforiladas altamente ativas ou fragmentos, mutantes, variantes ou seus derivados biologicamente ativos, em uma célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou um derivado da mesma, em quantidades que permitam o seu uso terapêutico. Em uma modalidade geral, o método compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma, (b) preparar um primeiro vetor de expressão mamífero capaz de expressar a enzima de sulfatase lisossomal recombinante humana altamente fosforilada ativa ou fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo na célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivado da mesma, (c) preparar um segundo vetor de expressão mamífero capaz de expressar o fator modificador da sulfatase humana recombinante 1 (SUMF1) ou um fragmento, mutante, variante ou derivado do mesmo biologicamente ativo na célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivado da mesma, (d) transfectar a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivado da mesma, com os primeiro e segundo vetores de expressão; (e) selecionar e clonar um transfectante de uma célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma que expressa o a enzima de sulfatase lisossomal recombinante humana altamente fosforilada ativa ou fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo, e (f) otimizar um método de processo de cultura de células para a fabricação da enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante altamente fosforilada ou fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo. A enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglucosamina-sulfatase (G6S) e N-acetilgalactosamina-6- sulfatase (GALNS).

[0011] O método envolve as etapas de transfectar um cDNA que codifica a totalidade ou parte da enzima de sulfatase lisossomal e um cDNA que codifica a totalidade ou parte da SUMF1 humana em uma célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma. Em algumas modalidades, os primeiro e segundo vetores de expressão, que são capazes de expressar a codificação da enzima de sulfatase lisossomal recombinante humana altamente fosforilada ativa e SUMF1 humana, respectivamente, são transfectados simultaneamente para a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivado da mesma. Em algumas modalidades, os primeiro e segundo vetores de expressão são transfectados para a célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma sequencialmente. Em algumas modalidades, um cDNA que codifica uma enzima de sulfatase lisossomal humana de comprimento total é usado, enquanto que em outras modalidades, um cDNA que codifica um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo é usado. Em algumas modalidades, um cDNA que codifica uma SUMF1 de comprimento total humano é usado, enquanto que em outras modalidades um cDNA que codifica um fragmento, mutante, variante ou derivado biologicamente ativo é usado. Em algumas modalidades, múltiplos vetores de expressão são usados para transferir a enzima de sulfatase lisossomal humana e cDNAs de SUMF1 humana simultaneamente ou sequencialmente para dentro da célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma. Em algumas modalidades, um único vetor de expressão é usado para transferir a enzima de sulfatase lisossomal humana e cDNAs de SUMF1 humana simultaneamente na célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma. Em uma modalidade preferida, a célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma é uma linhagem celular G71, uma linhagem celular G71S, ou um derivado de G71 ou G71S.

[0012] Em uma modalidade preferida, o método compreende a produção de uma enzima de sulfatase lisossomal recombinante humana altamente fosforilada ativa, por exemplo, arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS),sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglucosamina- sulfatase (G6S) ou N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS), a partir de uma linhagem celular CHO do grupo de complementação END3 ou um derivado da mesma. Em uma modalidade particularmente preferida, o processo compreende a produção da N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS), a partir de uma linhagem celular CHO do grupo de complementação END3 ou um derivado da mesma. Uma linhagem celular do grupo de complementação END3 é qualquer linhagem celular CHO modificada, que retém as propriedades de uma linhagem celular do grupo de complementação END3, tais como a acidificação endossomal defeituosa. Em uma modalidade preferida, a célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma é uma linhagem celular G71, uma linhagem celular G71S, ou um derivado de G71 ou G71S.

[0013] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma linhagem celular de mamífero deficiente em acidificação endossomal caracterizada pela sua capacidade de produzir enzimas sulfatase lisossomais humanas recombinantes fosforiladas altamente ativas, em quantidades que permitam a utilização da enzima de sulfatase lisossomal terapeuticamente. Em modalidades preferidas, a invenção fornece linhagens celulares do grupo de complementação END3 derivada de CHO-K1, designadas G71, G71S, ou seus derivados, que são capazes de produzir rendimentos elevado das enzimas sulfatase lisossomais humanas recombinantes fosforiladas altamente ativas, permitindo assim que a produção em larga escala de tais enzimas sulfatase lisossomais terapêuticas. Em modalidades mais preferidas, a linhagem celular que expressa e segreta uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante em quantidades de pelo menos cerca de 0,5, preferencialmente pelo menos cerca de 0,75, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,0, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,25 picogramas/célula/dia.

[0014] Uma linhagem celular do grupo de complementação END3 é qualquer linhagem celular de CHO modificada, que retém as propriedades de uma linhagem celular do grupo de complementação END3, tais como acidificação endossomal defeituosa. Em uma modalidade, linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é derivada de G71 ou um derivado da mesma, e compreende (a) um vetor de expressão para o fator de modificação da sulfatase humana recombinante 1 (SUMF1) e (b) um vetor de expressão para uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, em que a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH), N- acetilglucosamina-sulfatase (G6S) e N-acetilgalactosamina-6- sulfatase (GALNS). Em uma modalidade preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 compreende o vetor de expressão para a N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante (GALNS). Em uma modalidade mais preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 que expressa e segreta GALNS recombinantes humanas. Em outra modalidade preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é selecionada a partir do grupo consistindo no clone 4, clone 5, clone C6, clone C2, clone C5, clone C7, clone C10, clone C11 e clone C30. Em uma modalidade mais preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é o clone C2. Em outra modalidade preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é adaptada para o crescimento em suspensão.

[0015] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece enzimas de sulfatase lisossomais humanas recombinantes produzidas de acordo com os métodos da presente invenção e, assim, presente em quantidades que permitem a utilização das enzimas de sulfatase lisossomais terapeuticamente. As enzimas de sulfatase lisossomais podem ser proteínas de comprimento total, ou fragmentos, mutantes, variantes ou seus derivados. Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal ou fragmento, mutante, variante ou seu derivado de acordo com a invenção pode ser modificada como desejado para aumentar a sua estabilidade ou as propriedades farmacocinéticas (por exemplo, PEGuilação, mutagênese, fusão, conjugação). Em modalidades preferidas, a enzima é uma enzima de sulfatase lisossomal humana, um fragmento da enzima de sulfatase lisossomal humana, com uma atividade biológica de uma enzima sulfatase nativa, ou um polipeptídeo que tem homologia de sequência de aminoácidos substancial com a enzima de sulfatase lisossomal humana. Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal é uma proteína de sequência, origem ou derivação mamífera ou humana. Em outras modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal é tal que a sua deficiência causa uma doença humana, tais como Leucodistrofia Metacrômica ou MLD (isto é, arilsulfatase A (ARSA)), síndrome de Maroteaux-Lamy ou MPS VI (isto é, arilsulfatase B (ARSB)), síndrome de Hunter ou MPS II (isto é, iduronato-2-sulfatase (IDS)), síndrome de Sanfilippo A ou MPS IIIa (isto é, sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH)), síndrome de Sanfilippo D ou MPS IIId (ou seja, N- acetilglucosamina-sulfatase (G6S)) e síndrome de Morquio A ou MPS IVa (isto é, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS)). Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima de sulfatase lisossomal é tal que sua deficiência causa a síndrome de Morquio A ou MPS IVa (isto é, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS)). Em outra modalidade particularmente preferida, a enzima de sulfatase lisossomal é tal que a sua deficiência está associada com uma doença humana, tais como Deficiência de Sulfatase Múltipla ou MSD (isto é, N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS)).

[0016] A enzima de sulfatase lisossomal também pode ser de origem ou derivação de sequência humana ou mamífera. Ainda em outras modalidades da invenção, em cada um dos seus aspectos, a enzima de sulfatase lisossomal é idêntica na sequência de aminoácidos para a porção correspondente de uma sequência de aminoácidos da enzima de sulfatase lisossomal de humano ou de mamífero. Em outras modalidades, a porção de polipeptídeo é a enzima de sulfatase lisossomal nativa a partir de ser humano ou mamífero. Em outras modalidades, o polipeptídeo da enzima de sulfatase lisossomal é substancialmente homólogo (isto é, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos) ao longo de um comprimento de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 150 ou 200 aminoácidos, ou todo o comprimento do polipeptídeo, para a sequência de aminoácidos da enzima de sulfatase lisossomal nativa da enzima humana ou mamífera. Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal é N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS). A sequência de aminoácidos de GALNS humana está descrita na SEQ ID NO: 4, da qual os aminoácidos 27 a 522 corresponder à proteína precursora secretada. Em algumas modalidades, esta enzima GALNS compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% , 97%, 98%, ou 99% idêntica aos aminoácidos 27 a 522 da SEQ ID NO: 4, ou uma sequência idêntica aos aminoácidos 27 a 522 da SEQ ID NO: 4. A enzima GALNS retém preferencialmente os aminoácidos do sítio catalítico correspondentea à Cys na posição 53 da proteína do precursor secretada (aminoácido 79 da SEQ ID NO: 4), que é capaz de ser convertida em Cα-formilglicina. A enzima GALNS também pode reter outros aminoácidos na cavidade do sítio ativo, incluindo, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou todos os aminoácidos carregados: Asp288, Asn289, Asp39, Asp54, His236, Lysl40, His142, Lys310 e uma a-hélice: Arg83. Sukegawa, Human Molecular Genetics, 2000, vol. 9, N ° 9 1283-1290, aqui incorporado por referência em sua totalidade, descreve mutações adicionais que diminuem a atividade da GALNS em pacientes e correlaciona a severidade das mutações diferentes para a sua respectiva localização tridimensional no interior da enzima. Em outras modalidades, o indivíduo ao qual a enzima de sulfatase lisossomal deve ser administrada é humano.

[0017] Em modalidades preferidas, a enzima de sulfatase lisossomal é uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante altamente fosforilada produzida por uma linhagem celular deficiente em acidificação endossomal, por exemplo, uma linhagem celular do grupo de complementação END3 derivada de CHO. Uma linhagem celular do grupo de complementação END3 é qualquer linhagem celular CHO modificada, que retém as propriedades de uma linhagem celular do grupo de complementação END3, tais como acidificação endossomal defeituosa. Em uma modalidade preferida, a célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou derivado da mesma é uma linhagem celular G71, uma linhagem celular G71S, ou um derivado de G71 ou G71S. Alternativamente, a enzima de sulfatase lisossomal pode ser produzida por qualquer célula hospedeira, por exemplo, qualquer célula CHO ou linhagem celular derivada de CHO, cultivadas sob condições que permitem a expressão e secreção da enzima de sulfatase lisossomal recombinante altamente fosforilada em rendimento relativamente elevado, por exemplo, em quantidades de pelo menos cerca de 0,5, pelo menos cerca de 0,75, pelo menos cerca de 1,0, ou pelo menos cerca de 1,25 picogramas/célula/dia.

[0018] Em modalidades mais preferidas, a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante tem um alto nível de oligossacarídeos fosforilados (isto é, maior do que cerca de 0,25, preferencialmente maior do que 0,5, e mais preferencialmente maior do que cerca de 0,75 cadeia de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína).

[0019] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, por exemplo, GALNS, com um alto nível especificado de oligossacarídeos fosforilados. Por exemplo, a enzima de sulfatase lisossomal tem de 0,5 a 1,0 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, ou de 0, 5 a 0,9 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, ou 0,5 a 0,8 cadeias de oligomanose bis- fosforiladas por proteína monomérica cadeia, ou 0,5-0,75 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, ou 0,54 a 0,75 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica. Outras faixas semelhantes são contempladas, por exemplo, pelo menos, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6 ou 0,65 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, até 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,98 ou 1,0 cadeias de oligomanose bis- fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, ou qualquer combinação de qualquer um desses números. Em modalidades preferidas, a enzima é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS), por exemplo, da SEQ ID NO: 4.

[0020] Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante tem uma percentagem elevada (isto é, pelo menos, cerca de 50%, 55%, 60%, ou 65%, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85 %, 90% ou 95%) de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo de Cα-formilglicina (FGly). Em modalidades preferidas, a enzima é uma N-acetilgalactosamina-6- sulfatase recombinante humana ativa (GALNS) e o resíduo de cisteína do sítio ativo é a Cys na posição 53 (posição 79 da SEQ ID NO: 4).

[0021] Em modalidades particulares, a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante tem um alto nível de oligossacarídeos fosforilados, por exemplo, qualquer uma das faixas ou níveis de cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica aqui descrita, juntamente com uma elevada percentagem de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo de Cα-formilglicina (FGly), por exemplo, qualquer uma das percentagens aqui descritas. Em modalidades preferidas, a enzima é uma N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS), por exemplo, da SEQ ID NO: 4.

[0022] Em qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos 99,5%, pelo menos 99%, pelo menos 98,5%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, ou, pelo menos, 65% da enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, por exemplo, GALNS (SEQ ID NO: 4), está na forma de precursor como determinado por coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou pela eletroforese de gel capilar de SDS (SDS-CGE).

[0023] Além disso, a enzima de sulfatase lisossomal, por exemplo, GALNS (SEQ ID NO: 4), opcionalmente, também apresenta uma atividade específica que é pelo menos cerca de 30% (por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes , 40 vezes ou 50 vezes) maior do que a atividade específica de uma enzima de sulfatase lisossomal de controle da mesma sequência de aminoácidos que foi produzida em células hospedeiras (por exemplo, células CHO ou células derivados de CHO) que não expressam a SUMF1 recombinante humana.

[0024] Em qualquer uma das modalidades precedentes, a enzima de sulfatase lisossomal descrita, por exemplo, GALNS (SEQ ID NO: 4), apresenta uma absorção específica (Kuptake) em fibroblastos, que é cerca de 0,1 a 10 nM, ou cerca de 0,1 a 7 nM , ou cerca de 0,5 a 5 nM, ou cerca de 1 a 5 nM, ou cerca de 1 a 3,5 nM, de cerca de 1 nM, de cerca de 1,5 nM, de cerca de 2 nM, cerca de 2,5 nM, de cerca de 3 nM ou cerca de 3,5 nM, ou qualquer combinação de qualquer um desses números.

[0025] Em qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca 80% da enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, por exemplo, GALNS (SEQ ID NO: 4), liga uma coluna de receptor de manose-6-fosfato.

[0026] De acordo com este aspecto, as preparações purificadas de qualquer uma destas modalidades da enzima de sulfatase lisossomal são fornecidas em que o componente da enzima de sulfatase lisossomal, por exemplo, GALNS (SEQ ID NO: 4) tem uma pureza de pelo menos cerca de 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99%, como determinado por coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições não redutoras ou através de um outro método de determinação do grau de pureza (por exemplo, SDS-PAGE, sob condições de redução ou não redutoras seguida pela coloração com azul de Coomassie ou prata, ou separação por cromatografia por HPLC, incluindo a fase reversa C4 (RP) ou C3 RP), ou cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)). Em algumas modalidades, uma quantidade significativa do componente de enzima de sulfatase lisossomal da preparação purificada está sob a forma de precursor secretado (por exemplo, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97 %, 98%, 98,5%, 99% ou 99,5% de precursor), tal como determinado pela coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras ou por outro método de detecção de precursor (por exemplo, SDS-PAGE sob condições de redução com coloração de azul de Coomassie ou de prata, ou separação cromatográfica por HPLC (por exemplo, fase reversa C4 (RP), C3 RP) ou cromatografia por exclusão de tamanho SEC), ou uma combinação de separação eletroforética e separação por cromatografia, por exemplo, SDS-PAGE seguida por electroforese em gel capilar (SDS- CGE)).

[0027] Em modalidades particulares, o componente de enzima de sulfatase lisossomal da preparação purificada tem um nível elevado de oligossacarídeos fosforilados, por exemplo, qualquer uma das faixas ou níveis de cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica aqui descrita, juntamente com uma elevada percentagem de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo de Cα- formilglicina (FGly), por exemplo, quaisquer das percentagens aqui descritas. Em modalidades mais particulares, a preparação purificada tem uma Kuptake tal como aqui descrito.

[0028] Em aspectos relacionados, a invenção fornece composições estéreis, contendo qualquer uma das enzimas de sulfatase lisossomais ou preparações purificadas descritas neste documento, em conjunto com um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável estéril. Tais composições estéreis podem tomar a forma de soluções ou de pó liofilizado, opcionalmente, em frascos, que podem ser reconstituídos por adição de um diluente estéril.

[0029] Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método para purificar enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes humanas produzidas pelos métodos da presente invenção. Em uma modalidade preferida, as enzimas de sulfatase lisossomais são purificadas utilizando um processo de duas colunas (cromatografia de corante- ligante, por exemplo, Blue-Sepharose e cromatografia de troca catiônica, por exemplo, SE Hi-Cap) compreendendo, pelo menos, cinco etapas de purificação: (1) filtragem da colheita, ou seja, o meio de cultura de uma linhagem celular CHO do grupo de complementação END3 ou um derivado da mesma, que expressa o fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) e a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, (2) ajuste do pH da colheita filtrada para o pH 4,5 (para induzir a precipitação das proteínas contaminantes), (3) carregar a colheita filtrada com pH ajustado sobre uma coluna de corante-ligante, por exemplo, coluna de Blue-Sepharose, lavando a coluna e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal da coluna, e (4) carregar o eluato da coluna de corante-ligante em uma coluna de troca catiônica, por exemplo, coluna SE Hi-Cap, lavando a coluna e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna, e (5) e ultrafiltrar e diafiltrar o eluato da troca catiônica. Opcionalmente, a colheita filtrada na etapa (1) é concentrada 10 a 20 vezes por ultrafiltragem antes de ajustar o pH. Opcionalmente, a enzima sulfatase lisossomal ultrafiltrada e diafiltrada na etapa (5) é formulada em um tampão de formulação. Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima lisossomal é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS).

[0030] Em outra modalidade preferida, as enzimas de sulfatase lisossomais são purificadas utilizando um processo de três colunas (cromatografia por captura, por exemplo, cromatografia intermediária de troca catiônica SE Hi-Cap, por exemplo, corante-ligante Capto Blue, Sepharose FF Quelante de Zn ou Capto Adhere; e cromatografia de polimento, por exemplo, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi- Sub ou Phenyl Sepharose Low-Sub) que compreende, pelo menos, cinco etapas de purificação: (1) ultrafiltragem a colheita, ou seja, o meio de cultura a partir de uma linhagem celular CHO do grupo de complementação END3 ou derivado da mesma, que expressa o fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) e a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, por, por exemplo, Cassetes de Sartocon, (30 kDa, Hydrosart), (2) ajustar o pH da colheita filtrada para o pH 4,5 (para induzir a precipitação de proteínas contaminantes), (3) carregar a colheita filtrada com pH ajustado em uma coluna de captura, por exemplo, Fractogel EMD SE Hi-CAP (M) de troca catiônica, lavando a coluna e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal da coluna, e (4) carregar o eluato da coluna de captura para uma coluna intermediária, por exemplo, corante-ligante Capto Blue, Sepharose FF Quelante de Zn ou Capto Adhere, lavando a coluna e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna, e (5) carregar o eluato em uma coluna de polimento, por exemplo, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi- Sub ou Phenyl Sepharose Low-Sub, lavando a coluna e eluindo da enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna. A enzima de sulfatase lisossomal eluída a partir da etapa (5) é formulada em um tampão de formulação. Opcionalmente, a enzima de sulfatase lisossomal eluída a partir da etapa (5) é ultrafiltrada e, em seguida, formuladas em um tampão de formulação. Opcionalmente, a enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna na etapa (4) é exposta a um pH de 3,5 para a inativação viral de baixo pH antes do carregamento sobre a coluna de polimento na etapa (5). Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é uma N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS).

[0031] Em outra modalidade preferida, as enzimas de sulfatase lisossomais são purificadas utilizando um processo de três colunas diferentes (cromatografia de afinidade de metal imobilizado ou de captura (IMAC), por exemplo, corante-ligante Capto Blue, Sepharose FF Quelante de Zn ou Capto Adhere; cromatografia intermediária, por exemplo, Fractogel EMD SE Hi-Cap de troca catiônica, e cromatografia de polimento, por exemplo, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub ou Phenyl Sepharose Low-Sub) concebida para reduzir a digestão proteolítica (isto é, clipping) da enzima de sulfatase lisossomal compreende a pelo menos seis etapas de purificação: (1) filtragem da colheita, ou seja, meio de cultura a partir de uma linhagem celular mamífera, por exemplo, uma linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 ou um derivado da mesma, que expressa o fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) e a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, ultrafiltragem/diafiltragem da colheita filtrada através, por exemplo, de Cassetes de Sartocon (30 kDa, Hydrosart), resultando em uma colheita filtrada concentrada, por exemplo, 20X concentrada e carvão filtrando a colheita filtrada concentrada, (2) carregar o carvão filtrado colheita concentrada em uma captura ou coluna IMAC, por exemplo, corante-ligante Capto Blue, Sepharose FF Quelante de Zn ou Capto Adhere, lavando a coluna de captura sob condições tais que a enzima de sulfatase lisossomal é retida na coluna de captura, e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna de captura, (3) opcionalmente, filtrar o produto de eluição a partir da coluna de captura com um filtro, por exemplo, um filtro Mustang Q, para remoção de vírus, e (4) ajustar o pH do eluato ou eluato filtrado a partir da coluna de captura para um pH ácido, por exemplo, pH 4,5 ± 0,1 , em seguida, filtrar o eluato ácido de pH ajustado ou eluato filtrado a partir da coluna de captura, (5) carregar o filtrado, eluato com pH ajustado ácido ou eluato filtrado a partir da coluna de captura em uma coluna intermediária, por exemplo, coluna de troca catiônica Fractogel EMD SE Hi-CAP, lavando a coluna intermediária em condições tais que a enzima de sulfatase lisossomal é retida na coluna intermediária, e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna intermediária, (6) ajustar o pH do eluato a partir da coluna intermediária para um pH baixo, por exemplo, pH 3,5 ± 0,1, para inativação viral, e (7) carregar o eluato viral inativado de baixo pH a partir da coluna de troca catiônica intermediária para uma coluna de polimento, por exemplo, coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), por exemplo, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub ou Phenyl Sepharose Low-Sub, lavando a coluna de polimento em condições tais que a enzima de sulfatase lisossomal é retida na coluna de polimento, e eluindo a enzima de sulfatase lisossomal a partir da coluna de polimento. Em uma modalidade preferida, a etapa (3) é incluída no processo de purificação. Em outra modalidade preferida, a etapa (3) é omitida no processo de purificação. Opcionalmente, (8) a enzima de sulfatase lisossomal eluída a partir da etapa (7) tem o tampão trocado em uma formulação, por exemplo, incluindo, mas não limitado a essas formulações aqui descritas, tal como 20 mM de NaOAc/HOAc, 50 mM de NaH2PO4, 30 mM de arginina HCl, 2% de sorbitol (p/v), pH 5,4, e a concentração da enzima de sulfatase lisossomal eluída na formulação é ajustada até uma concentração apropriada, por exemplo, 3 mg/mL, (9) qualquer vírus residual e DNA presente na formulação da enzima de sulfatase purificada lisossomal são removidos por filtragem através de um filtro viral e um filtro de DNA, e (10) um tensoativo não-iônico, por exemplo, polissorbato 20 (PS20 ou Tween-20), é adicionado à formulação da enzima de sulfatase purificada lisossomal. A formulação final da enzima desulfatase lisossomal purificada (a Substância da Droga A Granel) é armazenada a 2 a 8 °C ou congelada. Em uma modalidade particularmente preferida, as etapas (8) a (10) são incluídas no processo de purificação. Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS).

[0032] Em algumas modalidades, a colheita é recolhida na etapa (1) a um pH de cerca de 6,5. Em algumas modalidades, o filtro de carvão vegetal na etapa (1) é um filtro de carvão ativado Zeta Plus R55. Em algumas modalidades, a coluna de captura na etapa (2) é uma coluna de Zn-IMAC. Em algumas modalidades, a coluna de Zn-IMAC é uma coluna de Sepharose FF Quelante de Zn. Em algumas modalidades, o filtro na etapa (3) é um filtro Mustang Q. Em algumas modalidades, o pH ácido do eluato ou eluato filtrado obtido na etapa (2) ou (3) é ajustado na etapa (4) a cerca de 4,5 ± 0,1. Em algumas modalidades, a coluna intermediária na etapa (5) é uma coluna de troca catiônica. Em algumas modalidades, a coluna de troca catiônica é uma coluna Fractogel EMD SE Hi-Cap. Em algumas modalidades, o pH baixo do eluato da coluna intermediária do etapa (6) é ajustado na etapa (6) para cerca de 3,5 ± 0,1. Em algumas modalidades, a coluna de polimento na etapa (7) é uma coluna de cromatografia por interação hidrofóbica (HIC). Em algumas modalidades, a coluna de HIC é uma coluna de ToyoPearl Butyl 650M.

[0033] Em algumas modalidades, a formulação compreende 20 mM de NaOAc/HOAc, 50 mM de NaH2PO4, 30 mM de arginina HCl, 2% (p/v) de sorbitol, pH 5,4. Em algumas modalidades, o tensoativo não-iônico é o polissorbato 20 (PS20). Em algumas modalidades, a concentração de enzima de sulfatase lisossomal na formulação está ajustada a cerca de 3 mg/mL. Em algumas modalidades, o filtro é um filtro viral DV20 e o filtro de DNA é um filtro Mustang Q. Em algumas modalidades, o tensoativo não-iônico adicionado à formulação é o polissorbato 20 (PS20) a uma concentração final de 0,01% (p/v).

[0034] Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma preparação purificada de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS) ou mutantes, variantes ou seu derivado biologicamente ativos úteis no tratamento de um paciente que padeça de uma doença de armazenamento lisossomal que é causada por (por exemplo, Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS RVA) ou síndrome de Morquio A) ou associada com (por exemplo, Deficiência de Sulfatase Múltipla (MSD)) uma deficiência na enzima GALNS. Em uma modalidade preferida, a preparação purificada da GALNS humana recombinante fosforilada altamente ativa tem um componente de enzima GALNS tendo: (a) uma pureza de pelo menos cerca de 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% como determinado pela coloração com azul de Coomassie ou coloração de prata, quando submetida à SDS-PAGE sob condições não redutoras (b) pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, ou 95% da conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα- formilglicina (FGly) (posição 79 da SEQ ID NO: 4), (c) glicosilação ligada a N em que os resíduos de asparagina nas posições 178 e 397, em que algumas das cadeias de oligomanose ligadas ao resíduo de asparagina na posição 178 são bis-fosforiladas, (d) 0,5 a 1,0, ou de 0,5 a 0,9, ou 0,5 a 0,8, ou 0,5 a 0,75, ou 0,54 a 0,75 cadeias de oligomanose bis- fosforiladas por cadeia de proteína monomérica (por exemplo, pelo menos, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, ou 0,65 e até 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,98, ou 1,0 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, ou qualquer combinação de qualquer um destes números), e (e) pelo menos 65 %, ou pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% ou 99,5%) da enzima GALNS está na forma de precursor, conforme determinado por coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou por SDS- eletroforese em gel capilar (SDS-CGE). Além disso, a enzima GALNS pode, opcionalmente, também (f) apresenta uma atividade específica que é pelo menos cerca de 30% (por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes , 40 vezes ou 50 vezes) maior do que a atividade específica de uma enzima GALNS de controle a mesma sequência de aminoácidos que foi produzida em células hospedeiras (por exemplo, células CHO ou células derivadas de CHO) que não expressam SUMF1 recombinante humana . Opcionalmente, a enzima GALNS apresenta uma absorção específica (Kuptake) em fibroblastos que é cerca de 0,1 a 10 nM, ou cerca de 0,1 a 7 nM, ou cerca de 0,5 a 5 nM, ou cerca de 1 a 5 nM, ou cerca de 1 a 3,5 nM, a cerca de 1 nM, de cerca de 1,5 nM, de cerca de 2 nM, cerca de 2,5 nM, de cerca de 3 nM ou cerca de 3,5 nM, ou qualquer combinação de qualquer um desses números.

[0035] A GALNS humana recombinante fosforilada altamente ativa purificada consiste em uma banda principal de cerca de 55 a 60 kDa (isto é, GALNS humano precursora, pelo menos, cerca de 75%, ou, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,5% das proteínas visíveis) e bandas menores a ~39 kDa e ~19 kDa (isto é, GALNS humana madura ou transformada menor do que cerca de 25%, menos do que cerca de 20%, preferencialmente menos do que cerca de 15%, mais preferencialmente menos do que cerca de 10%, e ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 5%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 1% ou menos do que cerca de 0,5% das proteínas visíveis), quando sujeitas a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou como determinado por SDS-CGE. Em uma modalidade particularmente preferida, a GALNS humana recombinante altamente fosforilada ativa, purificada consiste essencialmente em uma única banda de aproximadamente 55-60 kDa (isto é, GALNS humana precursora) quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou como determinado por SDS-CGE. Em uma modalidade, a GALNS humana recombinante altamente fosforilada ativa, purificada é útil para o tratamento de MPS IVa ou síndrome de Morquio A. Em uma modalidade, a GALNS humana recombinante altamente fosforilada ativa, purificada é útil para o tratamento de MSD.

[0036] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de doenças causadas totalmente ou em parte, por uma deficiência, ou estão associadas a uma deficiência, de uma enzima de sulfatase lisossomal. O método compreende a administração de uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante terapêutica produzida pelos métodos da presente invenção, em que a enzima de sulfatase lisossomal se liga a um receptor de MPR e é transportada através da membrana celular, entra na célula e é entregue para os lisossomas na célula.

[0037] Em uma modalidade, o método compreende o tratamento de um indivíduo sofrendo de uma deficiência de uma enzima de sulfatase lisossomal que compreende a administração ao indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida enzima de sulfatase lisossomal, em que a referida enzima de sulfatase lisossomal é uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante ou um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo produzido por uma célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante terapêutica, ou um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo do mesmo, sozinho ou em combinação com um Carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As modalidades preferidas incluem a otimização da dosagem às necessidades dos indivíduos a serem tratados, preferencialmente mamíferos, e mais preferencialmente seres humanos, de forma mais eficaz para melhorar a deficiência da enzima de sulfatase lisossomal.

[0038] Tais enzimas sulfatase lisossomais terapêuticas são particularmente úteis, por exemplo, no tratamento de pacientes que sofrem de doenças de armazenamento lisossômico causadas por uma deficiência de uma enzima de sulfatase lisossomal, tais como pacientes que sofrem de Leucodistrofia Metacromática ou MLD, Mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI) ou síndrome de Maroteaux-Lamy, Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) ou síndrome de Hunter, Mucopolissacaridose tipo IIIa (MPS IIIa) ou síndrome de Sanfilippo A, Mucopolissacaridose tipo IIId (MPS IIId) ou síndrome de Sanfilippo D, e Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A. Em uma modalidade particularmente preferida, a doença de armazenamento lisossomal é MPS IVa ou síndrome de Morquio A e a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Ainda em outras modalidades, a invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo a enzima de sulfatase lisossomal deficiente que causa a doença de armazenamento lisossomal e um Carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0039] Em outra modalidade, o método compreende o tratamento de um paciente que padeça de uma doença de armazenamento lisossomal que está associada a uma deficiência em uma ou mais enzimas de sulfatase lisossomais que compreende a administração ao indivíduo que dele necessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma enzima de sulfatase lisossomal, em que a referida enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é uma N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) ou um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo produzido por uma célula do grupo de complementação END 3 derivada de CHO ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende a administração da enzima GALNS humana recombinante terapêutica ou um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo, isoladamente ou em combinação com um Carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade particularmente preferida, a doença de armazenamento lisossomal é Deficiência de Sulfatase Múltipla (MSD).

[0040] Em modalidades particularmente preferidas, a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivado da mesma é uma linhagem celular G71, uma linhagem celular G71S ou um derivado de G71 ou G71S.

[0041] Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de terapia de substituição de enzimas, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de enzima de sulfatase lisossomal a um indivíduo com necessidade de terapia de substituição de enzimas, em que as células do paciente têm lisossomas que contêm quantidades insuficientes da enzima de sulfatase lisossomal para prevenir ou reduzir os danos às células, por meio de que uma quantidade suficiente da enzima de sulfatase lisossomal introduz os lisossomas para prevenir ou reduzir os danos às células. As células podem estar dentro ou fora do SNC ou não precisam ser compensadas a partir do sangue por paredes capilares, cujas células endoteliais estão intimamente seladas para difusão de um agente ativo por junções apertadas.

[0042] Em uma modalidade particular, a invenção fornece composições e composições farmacêuticas que compreendem uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante ativa, com uma atividade biológica que é reduzida, deficiente ou ausente no lisossoma alvo e que é administrado ao indivíduo. Enzimas de sulfatase lisossomais humanas ativas preferidas incluem, mas não estão limitados a, arilsulfatase A, arylsulfatse B, iduronato-2-sulfatase, sulfamidase/heparano-N-sulfatase, N-acetilglucosamina-6-sulfatase e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. Em uma modalidade preferida, N- acetilgalactosamina-6-sulfatase é a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante ativa.

[0043] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo sofrendo de MPS IVa ou síndrome de Morquio A, ou MSD, pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das N- acetilgalactosamina-6- sulfatase recombinante humana (GALNS), preparações purificadas e/ou composições estéreis aqui descritas.

[0044] Em uma modalidade mais preferida, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo sofrendo de MPS IVa ou síndrome de Morquio A, ou MSD, pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-acetilgalactosamina-6- sulfatase recombinante humana ( GALNS) produzida por células do grupo de complementação END3, em que a GALNS recombinante humana tem um elevado grau de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo de Cα-formilglicina (FGly) (isto é, pelo menos cerca de 50%, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de conversão), e os níveis elevados de fosforilação (ou seja, superiores a cerca de 0,25, preferencialmente maior do que 0,5, e mais preferencialmente maior do que cerca de 0,75 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína).

[0045] Em uma modalidade particularmente preferida, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo sofrendo de MPS IVa ou síndrome de Morquio A, ou MSD, pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma preparação de GALNS recombinante humana altamente fosforilada ativa, purificada que tem um componente de enzima GALNS tendo: (a) uma pureza de pelo menos cerca de 90%, 95%, 97%, 98% ou 99%, como determinado pela coloração com azul de Coomassie ou coloração de prata, quando submetida a SDS-PAGE sob condições não redutoras, (b) pelo menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 de Cα-formilglicina (FGly) (posição 79 da SEQ ID NO: 4), e (c) de 0,5 a 1,0, ou 0,5 a 0,9, ou 0,5 a 0,8 ou 0,5 a 0,75, ou 0,54 a 0,75 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica (por exemplo, pelo menos, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6 ou 0,65 e até 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,98, ou 1,0 cadeia de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, ou qualquer combinação de qualquer um destes números), e (d) pelo menos 65%, ou pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% ou 99,5%) da enzima GALNS está na forma de precursor, tal como determinado pela coloração com azul de Coomassie quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou por SDS-eletroforese em gel capilar (SDS-CGE). Além disso, a enzima GALNS pode, opcionalmente, também (e) exibir uma atividade específica que é pelo menos cerca de 30% (por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes , 40 vezes ou 50 vezes) maior do que a atividade específica de uma enzima GALNS de controle da mesma sequência de aminoácidos que foi produzida em células hospedeiras (por exemplo, células CHO ou células derivadas de CHO) que não expressam a SUMF1 recombinante humana. Opcionalmente, a enzima GALNS apresenta uma absorção específica (Kuptake) em fibroblastos que é cerca de 0,1 a 10 nM, ou cerca de 0,1 a 7 nM, ou cerca de 0,5 a 5 nM, ou cerca de 1 a 5 nM, ou cerca de 1 a 3,5 nM, a cerca de 1 nM, de cerca de 1,5 nM, de cerca de 2 nM, cerca de 2,5 nM, de cerca de 3 nM ou cerca de 3,5 nM, ou qualquer combinação de qualquer um desses números.

[0046] A GALNS humana recombinante fosforilada altamente ativa purificada consiste em uma banda principal de cerca de 55 a 60 kDa (isto é, GALNS humana do precursor sendo, pelo menos, cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, preferencialmente pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 98,5%, pelo menos cerca de 99% ou, pelo menos, cerca de 99,5% das proteínas visíveis) e bandas menores a ~39 kDa e ~19 kDa (isto é, GALNS humana madura ou transformada sendo menos do que cerca de 25%, ou menos do que cerca de 20%, preferencialmente menos do que cerca de 15%, mais preferencialmente menos do que cerca de 10%, e ainda mais preferencialmente menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 1% ou menos do que cerca de 0,5% das proteínas visíveis), quando submetidas a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou como determinado por SDS-CGE. Em uma modalidade mais particularmente preferida, a GALNS humana recombinante altamente fosforilada ativa, purificada consiste essencialmente em uma única banda de aproximadamente 55 a 60 kDa (isto é, GALNS humana precursora) quando submetidas a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou como determinado por SDS-CGE.

[0047] Em algumas modalidades, o indivíduo está sofrendo de MPS IVa ou síndrome de Morquio A. Em algumas modalidades, o indivíduo sofre de MSD.

[0048] A utilização correspondente de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas da presente invenção, que são preferencialmente produzidas por métodos da presente invenção, na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças de armazenamento lisossômico descritas acima também é contemplada.

[0049] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo uma enzima de sulfatase lisossomal recombinante humana altamente fosforilada ativa como descrito acima que é útil para o tratamento de doenças causadas totalmente ou em parte, por, ou estão associadas com a deficiência em tal enzima de sulfatase lisossomal, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana recombinante altamente fosforilada ativa ou fragmento, mutante, variante ou derivado biologicamente ativo, produzidos pelos métodos da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições farmacêuticas podem ser apropriadas para administração por várias vias, tais como por via intratecal, parentérica, tópica, administração intranasal ou por inalação oral. Em uma modalidade preferida, as composições farmacêuticas que são adequadas para administração parenteral. Dentro do escopo deste aspecto são modalidades que caracterizam as sequências de ácidos nucleicos que codificam as enzimas de sulfatase lisossomais de comprimento completo ou fragmentos, mutantes, variantes ou seus derivados, que podem ser administrados in vivo em células afetadas com uma deficiência da enzima lisossomal.

[0050] Em uma modalidade mais preferida, a composição farmacêutica compreende uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS) ou um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo, produzidos pelos métodos da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis de uma formulação que compreende um ou mais agentes de tamponamento e um ou mais estabilizadores. Em certas modalidades, a composição compreende uma quantidade de tampão de fosfato eficaz para reduzir a desfosforilação da referida enzima GALNS, e uma quantidade estabilizadora de um ou mais estabilizadores selecionados entre o grupo que consiste em sais de aminoácidos, tampões de aminoácidos, tensoativos e polióis; em que a referida formulação está a um pH de cerca de 5,0 a 5,8.

[0051] Em algumas modalidades, a enzima GALNS compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idênticas aos aminoácidos 27 a 522 da SEQ ID NO: 4, e tem: (i) uma pureza de pelo menos cerca de 95% como determinado pela coloração com azul de Coomassie quando submetida a SDS-PAGE sob condições não redutoras, (ii) pelo menos cerca de 80% da conversão do resíduo de cisteína na posição 53 de Cα-formilglicina (FGly), e (iii) opcionalmente, entre 0,5 a 0,8 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, em que pelo menos 70% da referida enzima GALNS está na forma de precursor, tal como determinado pela coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras. Em algumas modalidades, a enzima GALNS é pelo menos 95% pura, tal como determinado por RP-HPLC. Em algumas modalidades, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% da enzima GALNS está na forma de precursor, tal como determinado pela coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras. Em algumas modalidades, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% da enzima GALNS está na forma de precursor, tal como determinado pela SDS-eletroforese em gel capilar. Em algumas modalidades, a enzima GALNS tem pelo menos cerca de 90% da conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGly). Em algumas modalidades, entre 50% a 80% da enzima GALNS se liga a uma coluna do receptor de manose-6-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima de GALNS apresenta uma absorção específica (Kuptake) em fibroblastos que é de cerca de 1 a 5 nM. Em algumas modalidades, a enzima GALNS apresenta uma absorção específica (Kuptake) em fibroblastos, que é cerca de 1 a 3,5 nM.

[0052] A concentração de GALNS ou fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo na formulação é de cerca de 0,1 a 10 mg/mL, preferencialmente de cerca de 0,5 a 5 mg/mL e mais preferencialmente desde cerca de 0,5 a 1,5 mg/mL.

[0053] Em certas modalidades, a formulação compreende uma quantidade de tampão de fosfato eficaz para reduzir a desfosforilação da referida enzima GALNS. Em modalidades relacionadas, o tampão de fosfato é NaH2PO4 ou seu equivalente. Em outra modalidade, a formulação compreende adicionalmente um segundo tampão. Em uma modalidade, o segundo tampão é um tampão de acetato. Em outra modalidade, o tampão de acetato é NaOAc/HOAc ou o seu equivalente. Tampões exemplares são descritos em maior detalhe na Descrição Detalhada.

[0054] Considera-se que a concentração de NaOAc/HOAc ou o seu equivalente na formulação é de cerca de 5 a 100 mM, preferencialmente de cerca de 5 a 50 mM, e mais preferencialmente de cerca de 10 a 30 mM. Em uma modalidade relacionada, a concentração de NaH2PO4 ou o seu equivalente na formulação é de cerca de 5 a 100 mM, preferencialmente de cerca de 25 a 100 mM, e mais preferencialmente de cerca de 25 a 75 mM. Em certas modalidades, o pH da formulação é de cerca de pH 4,5 a 6,5, preferencialmente cerca de pH 5,0 a 6,0, e mais preferencialmente cerca de pH 5,0 a 5,8.

[0055] Ainda em outra modalidade, a formulação compreende uma quantidade estabilizadora de um ou mais estabilizadores selecionados entre o grupo que consiste em sais de aminoácidos, tampões de aminoácidos, tensoativos e polióis. Em uma modalidade, o estabilizador é um sal de arginina ou histidina ou tampão, opcionalmente cloridrato de arginina. Em uma modalidade relacionada, o estabilizador é um polissorbato, opcionalmente, polissorbato 20. Em outra modalidade, o estabilizador é um álcool de açúcar tri-hídricos ou mais elevado, opcionalmente sorbitol. Estabilizadores exemplares são descritos em maior detalhe na Descrição Detalhada.

[0056] Em certas modalidades, os estabilizadores são selecionados a partir de arginina HCl, ou seu equivalente, Tween-20 (Polissorbato 20), ou seu equivalente, e sorbitol, ou o seu equivalente. Em algumas modalidades, a concentração de arginina HCl ou o seu equivalente na formulação é de cerca de 5 a 200 mM, preferencialmente de cerca de 10 a 100 mM, e mais preferencialmente desde cerca de 10 a 50 mM. Em outra modalidade, a concentração de Tween-20 ou o seu equivalente na formulação é de cerca de 0,001 a 1,0% (p/v), preferencialmente de cerca de 0,005 a 0,2% (p/v), e mais preferencialmente de cerca de 0,005-0,015 % (p/v). Em uma modalidade relacionada, a concentração de sorbitol, ou o seu equivalente na formulação é de cerca de 0,1 a 10% (p/v), preferencialmente de cerca de 0,5 a 5% (p/v), e mais preferencialmente de cerca de 1,0 a 3,0% (p/v). Em uma modalidade, a formulação compreende um sal de arginina ou tampão, um polissorbato, e um poliol.

[0057] A invenção fornece ainda um método de prevenção de desfosforilação de uma enzima GALNS humana recombinante compreendendo a mistura da enzima GALNS e um tampão de fosfato, a uma concentração final do tampão de fosfato que se encontra entre cerca de 25 mM e 75 mM. Em modalidades exemplares, a quantidade de desfosforilação é reduzida em comparação com uma formulação da mesma enzima em tampão de fosfato a 1 mM, por exemplo, quando testada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses de armazenamento à temperatura ambiente (por exemplo, 25°C).

[0058] Em uma modalidade particularmente preferida, a composição farmacêutica compreende uma N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS) ou um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo, produzidos pelos métodos da presente invenção e um ou mais Carreadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes ou excipientes de uma formulação compreendendo NaOAc/HOAc e NaH2PO4 como agentes de tamponamento, e arginina HCl, Tween-20 (Polissorbato 20) e sorbitol como estabilizadores. A concentração de GALNS na formulação é de cerca de 1,0 +/- 0,5 mg/mL. A concentração de NaOAc/HOAc na formulação é de cerca de 20 +/- 10 mM, e a concentração de NaH2PO4 na formulação é de cerca de 50 +/- 25 mM. O pH da formulação é um pH de 5,4 +/- 0,4. A concentração de arginina HCl na formulação é de cerca de 30 +/- 20 mM. A concentração de Tween-20 na formulação é de cerca de 0,01 +/- 0,005% (p/v). A concentração de sorbitol na formulação é de cerca de 2,0 +/- 1,0% (p/v).

[0059] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para detectar a atividade de uma enzima de sulfatase lisossomal que compreende (a) cultivar as células de condrócitos a partir de um paciente que sofra de deficiência de sulfatase enzima lisossomal, por exemplo, um paciente que sofre de síndrome de Morquio, sob condições que promovem a manutenção da diferenciação dos condrócitos, (b) colocar em contato os condrócitos com uma enzima de sulfatase lisossomal que degrada o sulfato de queratano, e (c) detectar os níveis de sulfato de keratan nas células, em que um nível de sulfato de queratano reduzido nas células em contato com a enzima de sulfatase lisossomal em comparação com células não contactadas com a enzima de sulfatase lisossomal é indicativo da atividade da enzima de sulfatase lisossomal. Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal é N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em algumas modalidades, a cultura é realizada em meios contendo o fator de crescimento de insulina 1 (IGF-1), factor de crescimento transformador beta (TGF-β), transferrina, insulina e ácido ascórbico. Em algumas modalidades, o sulfato de queratano é detectado pela microscopia confocal, ou através da ligação ao anticorpo de sulfato anti-queratano. O método pode ser realizado com qualquer enzima de sulfatase lisossomal, incluindo a enzima humana recombinante ou de ocorrência natural, ou fragmentos ou as suas variantes, incluindo as variantes que compreendem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à enzima humana do precursor, sem sequência de sinal, ou a forma madura da mesma.

[0060] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um ensaio à base de células para a medição da atividade de uma enzima lisossomal humana recombinante para degradar substratos naturais. O método compreende (a) cultivar uma célula humana isolada deficiência na enzima lisossomal, em condições em que os substratos naturais para a enzima lisossomal se acumulam, (b) colocar em contato a célula com a enzima lisossomal, (c) lisar a célula, (d) adicionar ao lisado da célula uma enzima que (i) é específica para os substratos naturais, e (ii) clivar pequenos oligossacarídeos a partir dos substratos naturais, (e) marcar os oligossacarídeos pequenos com uma porção detectável, (f) opcionalmente, separar os oligossacarídeos pequenos marcados, (g) detectar os oligossacarídeos pequenos marcados, e (h) determinar a atividade da enzima lisossomal para degradar os substratos naturais pela comparação (i) da quantidade de oligossacarídeos pequenos marcados a partir das células em contato com a enzima lisossomal com (ii) a quantidade dos oligossacarídeos pequenos marcados a partir das células não contactadas com a enzima lisossomal, em que a redução em (h) (i) em relação a (h) (ii) indica a atividade da enzima lisossomal para degradar substratos naturais. Em uma modalidade, o oligossacarídeo pequeno é um mono-, di-, ou tri-sacarídeo. Em uma modalidade relacionada, o oligossacarídeo pequeno é um dissacarídeo. Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglucosamina- sulfatase (G6S) e N -acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é α-L-iduronidase (IDU). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é o ácido α-glucosidase (GAA). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é β- glucoronidase (GUSB). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é β-galactosidase (GLB1).

[0061] Células humanas adequadas que podem ser usadas no ensaio baseado em células incluem qualquer célula humana que é deficiente na enzima lisossomal a ser testada, de tal modo que podem acumular os substratos naturais para a enzima lisossomal. Por exemplo, as células naturalmente exibindo uma deficiência total (100%) ou parcial na atividade, por exemplo, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% de redução ou mais na atividade, podem ser usadas. As células que expressam uma enzima mutante com atividade reduzida, ou células derivadas de pacientes que sofrem de uma doença de armazenamento lisossomal, por exemplo, uma mucopolissacaridose, podem ser usadas. As células recombinantemente alteradas para nocaute ou para reduzir a atividade da enzima lisossomal, por exemplo, através da introdução de uma mutação no gene que codifica ou o seu promotor ou outra região reguladora, podem ser usadas. As células tratadas para reduzir a atividade da enzima lisossomal, por exemplo, tratadas com RNAi ou anti-senso para reduzir a expressão da enzima, podem ser usadas.

[0062] As enzimas apropriadas que clivam (digerem) os oligossacarídeos pequenos de carboidratos e que são "específicas para" (isto é, predominantemente digerem) os substratos naturais da enzima lisossomal podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, para a detecção da atividade de GALNS ou GLB 1 (enzimas que degradam o sulfato de queratano) a enzima da etapa (d) pode ser Keratanase II ou qualquer outra enzima que atua principalmente sobre sulfato de queratano. Como outro exemplo, para a detecção de IDU, ARSB, IDS ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de dermatano), a enzima da etapa (d) pode ser Condroitinase ABC ou qualquer enzima que atua principalmente sobre sulfato de dermatano. Como outro exemplo, para a detecção de IDU, IDS, SGHS, G6S ou GUSB (enzimas que degradam sulfato de heparano), a enzima da etapa (d) pode ser heparanase I ou heparanase II, ou ambas. Ainda como outro exemplo, para a detecção de GAA (uma enzima que degrada o glicogênio), a enzima da etapa (d) pode ser uma α-amilase ou qualquer enzima que atua principalmente no glicogênio.

[0063] Este método baseado em células é capaz de grande sensibilidade na detecção da atividade da enzima lisossomal. Em algumas modalidades, a atividade da enzima lisossomal é detectável quando a concentração da enzima lisossomal é tão baixa quanto cerca de 10 nM, ou cerca de 5 nM, ou cerca de 1 nM, ou cerca de 0,75 nM, ou cerca de 0,5 nM, ou cerca de 0,25 nM, ou cerca de 0,1 nM, ou cerca de 0,05 nM, ou cerca de 0,01 nM, ou cerca de 0,005 nM, ou cerca de 1 pM, ou de cerca de 0,5 pM.

[0064] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas da invenção, são dados a título de ilustração apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0065] A Figura 1 descreve a sequência de nucleotídeo do fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) (SEQ ID NO: 1).

[0066] A Figura 2 descreve a sequência de aminoácidos do fator de modificação da sulfatase humana 1 (SUMF1) (SEQ ID NO: 2).

[0067] A Figura 3 descreve a sequência de nucleotídeo da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS) (SEQ ID NO: 3).

[0068] A Figura 4 descreve a sequência de aminoácidos da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS) (SEQ ID NO: 4). O peptídeo de sinal de 26 aminoácidos no N-terminal está ausente em GALNS processada.

[0069] A Figura 5 ilustra a estrutura e as características da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana processada (GALNS) (SEQ ID NO: 5).

[0070] A Figura 6 mostra a expressão da N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS) de células G71S co-transfectadas com fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) e vetores de expressão de GALNS humanos. (A) tela de clone de G71S para GALNS ativa em 96 poços. (B) produtividade de GALNS do clone G71S em picogramas por célula por dia.

[0071] A Figura 7 ilustra um diagrama esquemático do controlador de biorreactor WAVE usado para produção em grande escala de células G71S que expressam a N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS) e suas variantes.

[0072] A Figura 8 mostra a estabilidade da atividade da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana purificada (GALNS) após armazenamento a 4 °C (diamantes) ou a -70 °C (triângulos).

[0073] A Figura 9 mostra a purificação da N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS) por (A) cromatografia de Fluxo Rápido de Blue Sepharose 6 seguida por (B) cromatografia com Fractogel SE Hi- CAP. A pureza é determinada por coloração com azul de Coomassie de SDS-PAGE (esquerda) e por Western blotting utilizando um anticorpo anti-GALNS (IVA) (direita).

[0074] A Figura 10 mostra a purificação da N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase humana (GALNS) por ultrafiltragem/diafiltragem (UF/DF), cromatografia em Fractogel SE Hi-Cap, cromatografia por Sepharose quelante de Zn e cromatografia com ToyoPearl Butyl 650M. A pureza é determinada por coloração com azul de Coomassie de SDS-PAGE (em cima à esquerda) e por Western blotting utilizando um anticorpo anti- GALNS (canto superior direito), um anticorpo anti-catepsina L (inferior esquerdo) e um anti-CHOP (proteínas da Células de Ovário de Hamster Chinês (canto inferior direito).

[0075] A Figura 11 mostra os diagramas de fluxo de processo para o processo de recuperação e purificação da N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS) usado para o processo da Fase I/II (lado esquerdo) e processo da Fase III (direita).

[0076] A Figura 12 mostra a comparação da N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase humana (GALNS) purificada de acordo com o processo da fase I/II (pista 3), ou o processo da Fase III (pista 5). Cinco microgramas (5 μg) de GALNS purificada foram separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras, e o gel foi corado com azul de Coomassie. A pista 1 corresponde a 15 μL do marcador de SeeBlue Plus2. Os pesos moleculares estão indicados em kDa à esquerda do gel corado.

[0077] A Figura 13 mostra que um decréscimo dependente da dose na quantidade de substrato de sulfato de dermatano foi observado nas células GM01391 tratadas com IDU.

[0078] A Figura 14 mostra que um decréscimo dependente da dose na quantidade de substrato de sulfato de dermatano foi observado nas células GM00519 tratadas com ARSB.

[0079] A Figura 15 mostra a absorção de N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS), ou não marcada (círculos) ou conjugada com A488 (quadrados) ou A555 (triângulos) pelos sinoviócitos cultivados.

[0080] A Figura 16 mostra a estabilidade da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana purificada (GALNS) após o armazenamento durante 1 ou 2 meses a 5 °C, a 25 °C ou a 40 °C, conforme indicado em uma formulação compreendendo 15 mM de arginina HCl, 30 mM de Arginina HCl, 15 mM de NaCl e 30 mM de NaCl (painéis designados 51, 52, 54 ou 55, respectivamente), no pH 5,0, pH 5,4 ou pH 5,8 (painéis designado A, B ou C, respectivamente). A estabilidade foi medida pela percentagem (%) da área de pico dos agregados de GALNS na formulação após o armazenamento, tal como determinado pela cromatografia por exclusão de tamanho- cromatografia líquida de alto desempenho (SEC-HPLC).

[0081] A Figura 17 mostra a estabilidade da atividade da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana purificada (GALNS) após armazenamento durante 2 meses a 5 °C, a 25°C ou a 40°C, conforme indicado em uma formulação compreendendo 15 mM de arginina HCl, 30 mM de arginina HCl, 15 mM de NaCl e 30 mM de NaCl (painéis designados 51, 52, 54 ou 55, respectivamente), no pH 5,0, pH 5,4 ou pH 5,8 (painéis designados A , B ou C, respectivamente).

[0082] A Figura 18 mostra o perfil de glicosilação da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana purificada (GALNS) após armazenamento durante 2 meses a 5 °C, a 25°C ou a 40°C, conforme indicado em uma formulação compreendendo 15 mM de arginina HCl, 30 mM de arginina HCl, 15 mM de NaCl e 30 mM de NaCl, no pH 5,0, pH 5,4 ou pH 5,8, tal como indicado. A porcentagem de manose 7 bis- fosforilada (BPM7) foi medida pela electroforese capilar (CE) após a digestão com a enzima de GALNS com PNGase F para clivar os oligossacarídeos N-ligados à asparagina. Referência indica a percentagem BPM7 para um lote de referência de GALNS armazenado durante 2 meses a 5 °C, a 25°C ou a 40°C, conforme indicado em uma formulação compreendendo 100 mM de tampão de fosfato.

[0083] A Figura 19 mostra a estabilidade da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana purificada (GALNS) após armazenamento durante 2 meses a 5 °C, a 25°C ou a 40°C como indicado em uma formulação compreendendo 15 mM de arginina HCl, 30 mM de arginina HCl, 15 mM de NaCl e 30 mM de NaCl (painéis designados 51, 52, 54 ou 55, respectivamente), no pH 5,0, pH 5,4 ou pH 5,8 (painéis designados A, B ou C, respectivamente). A estabilidade da enzima GALNS foi medida pelo percentual (%) da área de pico da enzima GALNS na formulação após armazenamento como determinado pela cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho (RP- HPLC).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0084] A presente invenção refere-se à verificação de um método que concilia a necessidade de fabricação em grande escala de enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes com a necessidade de um produto da enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa que é eficaz em atingir os lisossomas e, portanto, é terapeuticamente eficaz.

[0085] A eficácia terapêutica de uma preparação da enzima lisossomal depende do nível de manose-6-fosfato nessa preparação. O fosfato é adicionado à glicoproteína alvo por uma modificação pós- translacional no retículo endoplasmático e no início de Golgi. As enzimas lisossomais dobradas exibem um determinante terciário único que é reconhecido por uma enzima de modificação de oligossacarídeo. O determinante é composto por um conjunto de lisinas especificamente espaçadas e é encontrado na maioria das enzimas lisossomais apesar da ausência de homologia da sequência primária. A enzima de modificação, UDP-GlcNAc-fosfotransferase, se liga ao determinante da proteína e adiciona GlcNAc-1-fosfato à posição-6 de resíduos de manose terminais nos oligossacarídeos próximas ao sítio de ligação, uma segunda enzima, fosfodiéster α-GlcNAcase, depois cliva a ligação de GlcNAc-fosfato para se obter um oligossacarídeo terminal de manose-6-fosfato (Canfield et al., Patente US 6.537.785). O objectivo da modificação do manose-6-fosfato é desviar as enzimas lisossomais da via secretora para a via lisossomal no interior da célula. A enzima portadora do manose-6-fosfato está ligada pela MPR no Golgi trans e encaminhada para o lisossoma, em vez de para a superfície celular.

[0086] Além da presença do marcador de manose-6-fosfato em oligossacarídeos de enzimas lisossomais, encaminhamento lisossomal das enzimas depende da acidificação do tráfico de endossomas emergindo da extremidade da pilha de Golgi trans. A têmpera química do ambiente ácido dentro destes endossomas com moléculas básicas difusíveis resulta na expulsão dos conteúdos vesiculares, incluindo as enzimas lisossomais, para o meio extracelular (Braulke et al., Eur J. Cell Biol 43 (3): 316-321, 1987). A acidificação requer uma ATPase vacuolar específica incorporado no interior da membrana do endossoma (Nishi et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol 3 (2): 94-103, 2002). A falha desta ATPase está prevista para aumentar a secreção de enzimas lisossomals, a expensas do roteamento lisossomal. A fabricação de linhagens celulares que carregam os defeitos na ATPase vacuolar seria esperada para evitar o desvio não produtivo da enzima recombinante fosforilada para o compartimento intracelular lisossomal.

[0087] Em 1984, os mutantes de células do ovário de hamster chinês (CHO) especificamente defeituosos na acidificação endosomal foram gerados e caracterizados (Park et al., Somat Mol. Cell Genet 17(2): 137-150, 1991). As células CHO-K1 foram quimicamente mutagenizadas e selecionadas para a sobrevivência, a temperaturas elevadas na presença de toxinas. Estas toxinas exigiram acidificação endossomal para a plena expressão de sua letalidade (Marnell et al., J. Cell Biol 99(6): 1907-1916, 1984.). No estudo anterior, uma mistura de duas toxinas com diferentes mecanismos de ação foi escolhida para evitar a seleção da resistência específica da toxina. O princípio é que enquanto que a probabilidade das mutações casuais que resultam na resistência a uma toxina específica é pequena, a probabilidade de duas mutações simultâneas fortuitas específicas para duas toxinas inteiramente diferentes é inexistente. As seleções foram realizadas a uma temperatura elevada para permitir mutações sensíveis à temperatura. Esta tela genética resultou em dois mutantes, um dos quais foi designado G.7.1 (G71), que foram resistentes a toxinas a temperaturas elevadas. A lesão no G71 não foi devido à absorção ou mecanismo de ação das duas toxinas, mas resulta de uma incapacidade do clone para acidificar endossomas a temperaturas elevadas. Esta incapacidade também foi evidente a temperaturas permissivas (34°C), embora em menor grau. As células G71 também foram encontradas por serem auxotróficas para o ferro, a temperaturas elevadas, apesar da absorção normal de transferrina a partir do meio (Timchak et al., J. Biol Chem 261 (30): 14154-14159, 1986). Uma vez que o ferro foi liberado a partir da transferrina apenas em um pH baixo, a auxotrofia para ferro apesar da captação de transferrina normal indicou uma falha na acidificação endosomal. Outro estudo demonstrou que o defeito de acidificação foi manifestado primeiramente em endossomas, em vez de lisossomas (Stone et al., J. Biol Chem 262 (20): 9883-9886, 1987). Os dados sobre G71 foram consistentes com a conclusão de que uma mutação resultou na desestabilização da ATPase vacuolar responsável pela acidificação endossomal. A desestabilização foi mais evidente a temperaturas elevadas (39,5 °C), mas foi parcialmente expressa,mesmo a temperaturas mais baixas (34°C). Um estudo sobre o tráfico de duas enzimas lisossomais endógenas, catepsina D e alfa- glucosidase, em células G71 (Park et al., Somat. Mol. Cell. Genet. 17 (2): 137-150, 1991) mostraram que ambas as enzimas eram quantitativamente secretadas a temperaturas elevadas, e a glicosilação das enzimas não foi afetada. A secreção de alfa-glucosidase ácida fosforilada foi significativamente aumentada a temperaturas não permissivas.

[0088] A eficácia terapêutica de uma preparação de enzima de sulfatase lisossomal não só depende do nível de manose-6-fosfato, mas também depende da presença da enzima ativa nessa preparação. Todas as sulfatases conhecidas contém um resíduo de cisteína no seu sítio catalítico, o resíduo de cisteína é modificado após a tradução de Cα-formilglicina (FGly) para ativar a enzima. Esta cisteína para a ativação da enzima pós-traducional FGly, a qual é catalisada pelo fator de modificação de sulfatase 1 (SUMF1), ocorre dentro do retículo endoplasmático em sulfatases desdobradas imediatamente após a tradução, antes do direcionamento das sulfatases ao lisossoma (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11963-11968, 1997). A importância desta modificação pós-traducional única é realçada pelo fato de que as mutações em SUMF1, que resultam na formação de FGly deficiente em enzimas de sulfatase lisossomais, causam Deficiência em Sulfatase Múltiplo (MSD) no homem (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev . Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005).

[0089] Assim, a capacidade das células G71, células de CHO mutantes que são defeituosas na acidificação endosomal, para coexpressar a enzima de modificação de sulfatase humana recombinante (SUMF1) e uma enzima de sulfatase lisossomal humana fornece um mecanismo para a produção em grande escala das enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes humanas fosforiladas altamente ativas úteis para a gestão de distúrbios de armazenamento lisossomal causados por ou associados a uma deficiência de tais enzimas de sulfatase lisossomais.

I. DEFINIÇÕES

[0090] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que normalmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. As referências a seguir fornecem a uma pessoa versada na técnica uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2a ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

[0091] Cada publicação, pedido de patente, patente e outras referências aqui citadas são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, na medida em que não é incompatível com a presente divulgação.

[0092] Nota-se aqui que, como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência plural a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0093] Tal como usado aqui, os termos a seguir têm os significados a eles atribuídos, salvo especificação em contrário.

[0094] "Variante alélica" refere-se a qualquer de duas ou mais formas polimórficas de um gene que ocupa o mesmo local genético. As variações alélicas surgem naturalmente por mutação e podem resultar em polimorfismo fenotípico nas populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (isto é, sem alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar os polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos alteradas. "Variantes alélicas" também se referem aos cDNAs derivados de transcritos de mRNA de variantes alélicas genéticas, bem como às proteínas codificadas por elas.

[0095] "Amplificação" refere-se a qualquer meio pelo qual uma sequência de polinucleotídeo é copiada e assim expandido para um maior número de moléculas de polinucleotídeo, por exemplo, pela transcrição inversa, reação em cadeia da polimerase, e reação em cadeia da ligase.

[0096] Uma primeira sequência é uma "sequência antisenso" em relação a uma segunda sequência se um polinucleotídeo cuja sequência é a primeira sequência especificamente híbrida com um polinucleotídeo cuja sequência é a segunda sequência.

[0097] "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar ou idêntico a um mRNA, quer na forma de cadeia dupla ou de cadeia simples.

[0098] A notação convencional é aqui usada para descrever sequências de polinucleotídeo: a extremidade do lado esquerdo de uma sequência de polinucleotídeo de cadeia simples é a extremidade 5'; a direção do lado esquerdo de uma sequência polinucleotídica de cadeia dupla é referida como o direção 5’. A adição da direção 5' a 3' de nucleotídeos para os transcritos nascentes de RNA é referida como a direção de transcrição. A cadeia de DNA possuindo a mesma sequência que um mRNA é referida como a "cadeia de codificação", sequências na cadeia de DNA possuindo a mesma sequência que um mRNA transcrito a partir desse DNA e que estão localizadas 5' para a extremidade 5' do transcrito de RNA são denominadas "sequências a montante"; sequências na cadeia de DNA possuindo a mesma sequência do RNA e que são 3' à extremidade 3' do transcrito de RNA de codificação são referidas como "sequências a jusante".

[0099] "Complementar" refere-se à compatibilidade topológica ou combinação em conjunto com as superfícies de interação de dois polinucleotídeos. Assim, as duas moléculas podem ser descritas como complementares e, além disso, as características da superfície de contato são complementares umas às outras. Um primeiro polinucleotídeo é complementar a um segundo polinucleotídeo se a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo é idêntica à primeira sequência de nucleotídeo do parceiro de ligação de polinucleotídeo do segundo polinucleotídeo. Assim, o polinucleotídeo cuja sequência 5'- TATAC-3 'é complementar a um polinucleotídeo cuja sequência é 5'- GTATA-3'. A sequência de nucleotídeo é "substancialmente complementar" a uma sequência de nucleotídeo de referência se a sequência complementar à sequência de nucleotídeo do indivíuo é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de referência.

[00100] "Substituição conservativa" refere-se à substituição de um polipeptídeo de um aminoácido com um aminoácido funcionalmente semelhante. Os seguintes seis grupos, cada um contêm aminoácidos que são substituições conservativas de uns aos outros; 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F) Tirosina (Y), Triptofano (W).

[00101] O termo "fragmento", quando usado em referência a polipeptídeos refere-se aos polipeptídeos que são mais curtos do que o comprimento total do polipeptídeo em virtude de truncagem em qualquer extremidade N-terminal ou C-terminal da proteína, ou ambos, e/ou pela deleção de uma porção interna ou região da proteína. Os fragmentos de um polipeptídeo podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica.

[00102] O termo "mutante", quando usado em referência aos polipeptídeos refere-se aos polipeptídeos nos quais um ou mais aminoácidos da proteína foram substituídos por um aminoácido diferente. A substituição de um aminoácido pode ser uma substituição conservativa, conforme acima definido, ou pode ser uma substituição não conservativa. Polipeptídeos mutantes podem ser gerados por processos conhecidos na técnica.

[00103] O termo "derivado" quando usado em referência aos polipeptídeos refere-se aos polipeptídeos quimicamente modificados por tais técnicas, por exemplo, e não por limitação, como ubiquitinação, marcação (por exemplo, com radionuclídeos ou enzimas diferentes), ligação de polímero covalente tais como peguilação (isto é, derivatização com polietilenoglicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos, tais como ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. Os polipeptídeos derivados podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica.

[00104] O termo "derivado" quando usado em referência às linhagens celulares refere-se às linhagens celulares que são descendentes da linhagem celular progenitora, por exemplo, este termo inclui células que foram passadas ou subclonadas a partir de células- mãe e retém a propriedade desejada, descendentes da linhagem celular progenitoras que foram mutados e selecionados para a retenção da propriedade desejada, e os descendentes da linhagem celular progenitoras que foram alterados para conter vetores de expressão diferentes, ou diferentes ácidos nucleicos adicionados exogenamente.

[00105] "Detecção" refere-se à determinação da presença, ausência ou quantidade de um analito em uma amostra e pode incluir quantificar a quantidade de analito em uma amostra ou por célula em uma amostra.

[00106] "Porção detectável" ou um "marcador" refere-se a uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou meios químicos. Por exemplo, marcadores úteis incluem 32P, 35S, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, como é geralmente usado em ELISA), biotina-estreptavadina, dioxigenina, haptenos e proteínas para as quais os anticorpos anti-soros ou anticorpos monoclonais estão disponíveis, ou moléculas de ácido nucleico com uma sequência complementar a um alvo. A porção detectável gera muitas vezes um sinal mensurável, tal como um sinal radioativo, cromogênico ou fluorescente, que pode ser usado para quantificar a quantidade de porção detectável ligada em uma amostra. A porção detectável pode ser incorporada ou ligada a um iniciador ou sonda, quer covalentemente ou através de ligações iônicass, de van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, incorporação de nucleotídeos radioativos ou nucleotídeos biotinilados que são reconhecidos por estreptavadina. A porção detectável pode ser direta ou indiretamente detectável. A detecção indireta pode envolver a ligação de uma segunda porção direta ou indiretamente detectável à porção detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser o ligante de um parceiro de ligação, tal como a biotina, que é um parceiro de ligação para estreptavadina, ou uma sequência de nucleotídeo, que é o parceiro de ligação para uma sequência complementar, para a qual pode hibridar especificamente. O parceiro de ligação pode ele próprio ser diretamente detectável, por exemplo, um anticorpo pode ser ele próprio marcado com uma molécula fluorescente. O parceiro de ligação também pode ser indiretamente detectável, por exemplo, um ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeo complementar pode ser parte de uma molécula de DNA ramificada que é por sua vez detectável através da hibridação com outras moléculas de ácido nucleico marcadas. (Ver, por exemplo, Fahrlander et al., Bio/Technology 6: 1165, 1988). A quantificação do sinal é conseguida por, por exemplo, contagem de cintilação, densitometria ou citometria de fluxo.

[00107] "Diagnóstico" significa identificar a presença ou natureza de uma condição patológica. Métodos de diagnóstico diferem na sua especificidade e seletividade. Enquanto um determinado método de diagnóstico pode não fornecer um diagnóstico definitivo de uma condição, é suficiente que o método forneça uma indicação positiva que ajuda no diagnóstico.

[00108] A expressão "quantidade eficaz" significa uma dosagem suficiente para produzir um resultado desejado em um estado de saúde, patologia e doença de um indivíduo, ou para um propósito de diagnóstico. O resultado desejado pode compreender uma melhoria subjetiva ou objetiva no receptor da dosagem. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um agente eficaz para produzir o efeito benéfico pretendido para a saúde.

[00109] "Codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeo em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA ou um mRNA, que servem como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos, tendo ou uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência de aminoácidos definida e as propriedades biológicas delas resultantes. Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA produzido por esse gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a cadeia de codificação, a sequência de nucleotídeo que é idêntica à sequência de mRNA e é normalmente fornecida nas listagens de sequência, e cadeia não codificante, usada como modelo para a transcrição, de um gene ou cDNA pode ser referida como codificando a proteína ou outro produto daquele gene ou cDNA. A menos que especificado em contrário, uma "sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucleotídeo que são versões degeneradas uma da outra e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. As sequências de nucleotídeo que codificam as proteínas e RNA podem incluir íntrons.

[00110] "Dose equivalente" refere-se a uma dosagem, que contém a mesma quantidade de agente ativo.

[00111] "Sequência de controle de expressão" refere-se a uma sequência de nucleotídeo em um polinucleotídeo que regula a expressão (transcrição e/ou tradução) de uma sequência de nucleotídeo operacionalmente ligada à mesma. "Operacionalmente ligada" refere-se a uma relação funcional entre duas partes, em que a atividade de uma parte (por exemplo, a capacidade de regular a transcrição) resulta em uma ação na outra parte (por exemplo, a transcrição da sequência). As sequências de controle de expressão podem incluir, por exemplo, e sem limitação, sequências de promotores (por exemplo, induzíveis ou constitutivas), intensificadores, terminadores de transcrição, um códon de iniciação (isto é, ATG), sinais de splicing para íntrons e códons de parada.

[00112] "Vetor de expressão" refere-se a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle da expressão operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeo a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de cis-ação suficientes para expressão; outros elementos para a expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos os conhecidos na técnica, tais como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nu, ou contido em lipossomas) e vírus que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[00113] "Altamente fosforilada", "alto nível de fosforilação" e "nível elevado de oligossacarídeos fosforilados" referem-se a preparações de enzimas de sulfatase lisossomais, em que pelo menos 50% da enzima de sulfatase lisossomal liga-se ao cátion independente do receptor de manose-6-fosfato através dos oligossacarídeos fosforilados. A ligação é ainda caracterizada pela sensibilidade à competição com manose-6- fosfato. Uma enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada pode também referir-se a uma enzima de sulfatase lisossomal com pelo menos 0,25, preferencialmente pelo menos 0,5, e mais preferencialmente pelo menos 0,75 cadeias de oligomanose bis- fosforiladas por cadeia de proteína. Alternativamente, uma enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada (GALNS) pode referir-se a uma enzima, em que a absorção específica, Kuptake (concentração de enzima/ligante que produz metade do valor da absorção máxima), em fibroblastos é cerca de 0,1 a 10 nM, ou cerca de 0,1 a 7 nM, ou cerca de 0,5 a 5 nM, ou cerca de 1 a 5 nM, ou cerca de 1 a 3,5 nM, de cerca de 1 nM, de cerca de 1,5 nM, de cerca de 2 nM, cerca de 2,5 nM, de cerca de 3 nM ou cerca de 3,5 nM , ou qualquer combinação de qualquer um desses números.

[00114] "Cadeias de oligomanose bis-fosforiladas", como aqui usado, referem-se às cadeias de oligossacarídeos contendo manose que são N-ligadas aos resíduos de asparagina nas enzimas de sulfatase lisossomais e compreendem dois resíduos de manose-6-fosfato. Tipicamente, as cadeias de oligomanose bis-fosforiladas tem 7 resíduos de manose, isto é, bis-fosfato manose 7 (BPM7), que estão ligados a dois resíduos de GlcNAc, os quais por sua vez estão ligados ao resíduo de asparagina na enzima de sulfatase lisossomal.

[00115] "Ativo", "ativado" e "alto nível de ativação" refere-se às preparações de enzimas de sulfatase lisossomais, em que pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, preferencialmente pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do resíduo de cisteína do sítio ativo da proteína foram modificados pós-tradução de Cα-formilglicina (FGly).Alternativamente, "ativo", "ativado" e "elevado grau de ativação" refere- se às preparações de enzimas de sulfatase lisossomais que exibem uma atividade específica que é pelo menos cerca de 30% (por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes , 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes ou 50 vezes) maior do que a atividade específica de uma enzima de sulfatase lisossomal de controle da mesma sequência de aminoácidos que foi produzida em células hospedeiras (por exemplo, células CHO ou células derivadas de CHO) que não expressam SUMF1 recombinante humana. Uma preparação de controle adequado da enzima de sulfatase lisossomal preferencialmente tem a mesma sequência de aminoácidos como a preparação altamente ativo, e é expressa pelo mesmo gene utilizando o mesmo promotor ou sequência (s) reguladora na mesma célula hospedeira, exceto pelo fato de que a célula hospedeira não expressa a SUMF1 recombinante humana, é produzida sob as condições de cultura idênticas ou similares, incluindo para o mesmo período de tempo de cultura, e, opcionalmente, é purificado na mesma medida ou semelhante, como a preparação altamente ativa.

[00116] "Altamente fosforilada ativa" refere-se às preparações de enzimas de sulfatase lisossomais em que pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% do resíduo de cisteína do sítio ativo da proteína foi modificado pós-tradução de Cα-formilglicina (FGly) e com pelo menos 0,25, preferencialmente pelo menos 0,5, e mais preferencialmente pelo menos 0,75 cadeias de oligomanose bis-fosforiladas por cadeia de proteína.

[00117] O termo "biologicamente ativo" refere-se aos fragmentos de polipeptídeos {isto é, enzima), mutantes, variantes ou seus derivados que retêm pelo menos uma quantidade substancial (por exemplo, pelo menos cerca de 50%, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%) de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo de comprimento total. Quando usado em referência a uma enzima de sulfatase lisossomal, um fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo, pelo menos, retém uma quantidade substancial de atividade de sulfatase (isto é, a clivagem dos ésteres de sulfato a partir de substratos alvo). Quando usado em referência ao fator de modificação de sulfatase 1 (SUMF1), um seu fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo, pelo menos, retém uma quantidade substancial de formilglicina geradora de atividade (por exemplo, a modificação de um resíduo de cisteína do sítio ativo da enzima de sulfatase lisossomal de Cα-formilglicina (FGly)).

[00118] O termo "pureza" ou "pura" quando usado em referência aos polipeptídeos refere-se à quantidade de polipeptídeo a ser analisada em relação a quaisquer contaminantes que podem ser detectados através de um método particular. Para as enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes da presente invenção, a "pureza" pode ser determinada sujeitando a preparação de enzima de sulfatase à separação eletroforética por SDS-PAGE sob redução ou condições não redutoras seguida pela coloração com azul de Coomassie ou prata, ou pela separação cromatográfica por HPLC (por exemplo, fase reversa C4 (RP), C3 RP) ou por qualquer outra separação cromatográfica, por exemplo, por exclusão de tamanho (SEC) e semelhantes. Usando qualquer um destes métodos, as enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes purificadas da invenção têm uma pureza de pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, preferencialmente pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 97%, 98% ou 99%.

[00119] O termo "precursor" ou "forma precursora" refere-se à forma da enzima de sulfatase lisossomal recombinante que é secretada a partir de uma célula de mamífero, isto é, sem a sequência de sinal, mas que não possuindo determinadas modificações, por exemplo, clivagem interna de proteínas, que normalmente ocorrem no lisossoma. O termo "maduro", "forma madura", "processado" ou "forma processada" refere- se à forma da enzima de sulfatase lisossomal recombinante que normalmente existe no lisossoma. Para as enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes da presente invenção, a abundância relativa do "precursor" ou "forma precursora" e "madura", “forma madura", "processada" ou "forma processada" pode ser determinada sujeitando a preparação de enzima de sulfatase à separação eletroforética por SDS-PAGE sob condições redutoras seguida pela coloração com Azul de Coomassie ou prata, ou pela separação cromatográfica por HPLC (por exemplo, fase reversa C4 (RP), C3 RP) ou por qualquer outra separação cromatográfica, por exemplo, exclusão de tamanho (SEC) e semelhantes, ou uma combinação da separação eletroforética e separação cromatográfica, por exemplo, SDS-PAGE seguida pela eletroforese em gel capilar (SDS-CGE). Utilizando estes métodos, as enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes purificadas da presente invenção consiste em, pelo menos, cerca de 65%, 70%, ou 75%, preferencialmente pelo menos cerca de 80% ou 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% ou 99,5% do "precursor" ou "forma precursora". Alternativamente, utilizando estes métodos, as enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes purificadas da presente invenção consistem em menos de cerca de 35%, 30% ou 25%, preferencialmente menos do que cerca de 20% ou 15%, mais preferencialmente menos do que cerca de 10%, e ainda mais preferencialmente menos do que cerca de 5%, 3%, 2%, 1,5%, 1% ou 0,5% de "maduro", “forma madura", "processada" ou "forma processada". Em algumas modalidades, apenas o "precursor" ou a "forma precursora" é detectada (isto é, a preparação de enzima de sulfatase consiste essencialmente em uma única banda detectável quando submetida à SDS-PAGE sob condições redutoras, ou como determinado por SDS-CGE, ou um pico único, quando analisado por HPLC.

[00120] Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma percentagem especificada de nucleotídeo ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um dos algoritmos de comparação de sequências seguintes ou por inspeção visual.

[00121] "Ligante" refere-se a uma molécula que liga duas outras moléculas, quer covalentemente ou através de ligações iônicas, de van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência complementar na extremidade 5 'e a outra sequência complementar na extremidade 3 ', que se junta às duas sequências não complementares.

[00122] "Baixo nível de fosforilação" ou "baixa fosforilação" refere-se a uma preparação de enzimas de sulfatase lisossomais em que a absorção em células de fibroblastos tem uma metade da concentração máxima maior do que 10 nM, ou a porção das enzimas de sulfatase lisossomais, que liga uma coluna do receptor de manose-6-fosfato é inferior a cerca de 25%.

[00123] "De ocorrência natural" tal como aplicada a um objeto refere- se ao fato de o objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

[00124] "Composição farmacêutica" refere-se a uma composição adequada para utilização farmacêutica em um indivíduo animal, incluindo humanos e mamíferos. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de uma enzima de sulfatase lisossomal terapêutica e também compreende um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Uma composição farmacêutica que compreende uma composição que compreende o ingrediente(s) ativo, e o ingrediente(s) inerte que constituem o veículo, diluente ou excipiente, bem como qualquer produto que resulta, direta ou indiretamente, a partir da combinação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou a partir de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Deste modo, as composições farmacêuticas da presente invenção abrangem qualquer composição preparada pela mistura de uma enzima de sulfatase lisossomal da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00125] "Carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer um dos veículos, diluentes, tampões e excipientes farmacêuticos convencionais, tais como, por exemplo, e não por limitação, uma solução salina tamponada com fosfato, solução aquosa a 5% de dextrose , e emulsões, tais como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes umectantes e/ou adjuvantes. Os veículos, diluentes ou excipientes e formulações farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. 19. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Os veículos, diluentes ou excipientes farmacêuticos preferidos dependem do modo pretendido de administração do agente ativo. Modos de administração típicos incluem, por exemplo, e não limitação, injeção (enteral (por exemplo, oral) ou parenteral, por exemplo, subcutâneo, intramuscular, intravenoso ou intraperitoneal), ou tópico, transdérmico ou transmucosal.

[00126] Um "sal farmaceuticamente aceitável" é um sal que pode ser formulado em uma enzima de sulfatase lisossomal para utilização farmacêutica, incluindo, por exemplo, sais de metais (sódio, potássio, magnésio, cálcio, etc) e sais de amônia ou aminas orgânicas.

[00127] "Polinucleotídeo" refere-se a um polímero composto por unidades de nucleotídeo. Os polinucleotídeos incluem ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente, tais como ácido desoxirribonucleico ("DNA") e ácido ribonucleico ("RNA"), bem como análogos de ácidos nucleicos. Análogos de ácido nucleico incluem aqueles que incluem bases de ocorrência não natural, nucleotídeos que se envolvem em relações com outros nucleotídeos que não a ligação do fosfodiéster de ocorrência natural ou que incluem bases ligadas através de ligações que não as ligações de fosfodiéster. Assim, os análogos de nucleotídeo incluem, por exemplo, e sem limitação, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2-O-metil-ribonucleotídeo, ácidos nucleicos de peptídeo (PNA) e semelhantes. Tais polinucleotídeos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando um sintetizador de DNA automático. O termo "ácido nucleico" tipicamente refere-se aos polinucleotídeo grandes. O termo "oligonucleotídeo" tipicamente refere- se a polinucleotídeos curtos, em geral, não superiores a cerca de 50 nucleotídeo. Deve-se compreender que quando uma sequência de nucleotídeo é representada por uma sequência de DNA (isto é, A, T, G, C), o que também inclui uma sequência de RNA (isto é, A, U, G, C) em que "U" substitui "T."

[00128] "Polipeptídeo" refere-se a um polímero composto por resíduos de aminoácidos, e variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e os análogos sintéticos de ocorrência não natural do mesmo ligados através de ligações peptídicas, variantes estruturais de ocorrência natural e análogos sintéticos de ocorrência não natural sintéticos dos mesmos. Os polipeptídeos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando um sintetizador de polipeptídeo automático. O termo "proteína" refere-se tipicamente aos polipeptídeos grandes. O termo "peptídeo" refere-se tipicamente aos polipeptídeos curtos. A notação convencional é aqui usada para descrever sequências de polipeptídeos: a extremidade do lado esquerdo de uma sequência de polipeptídeo é o amino-terminal, a extremidade do lado direito de uma sequência de polipeptídeo é o terminal carboxila.

[00129] "Iniciador" refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de hibridizar especificamente com um modelo de polinucleotídeo designado e fornecer um ponto de iniciação para a sintese de um polinucleotídeo complementar. Tal síntese ocorre quando o iniciador do polinucleotídeo é colocado sob condições nas quais é induzida a síntese, isto é, na presença de nucleotídeo, um modelo de polinucleotídeo complementar e um agente para a polimerização, tais como a polimerase do DNA. Um iniciador é tipicamente de cadeia simples, mas pode ser de cadeia dupla. Iniciadores são tipicamente ácidos desoxirribonucleicos, mas uma grande variedade de iniciadores sintéticos e de ocorrência natural são úteis para muitas aplicações. Um iniciador é complementar ao modelo para o qual foi concebido para hibridizar para servir como um local para a iniciação da síntese, mas não precisa refletir a sequência exata do modelo. Em tal caso, a hibridização específica do iniciador com o modelo depende do rigor das condições de hibridização. Os iniciadores podem ser marcados com, por exemplo, frações cromogênicas, radioativas ou fluorescentes e usadas como frações detectáveis.

[00130] "Sonda", quando usado em referência a um polinucleotídeo, refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de hibridizar especificamente com uma sequência designada de outro polinucleotídeo. Uma sonda especificamente hibridiza com um polinucleotídeo complementar alvo, mas não precisa refletir a sequência exata complementar do modelo. Em tal caso, a hibridização específica da sonda para o alvo depende do rigor das condições de hibridização. As sondas podem ser marcadas com, por exemplo, frações cromogênicas, radioativas ou fluorescentes e usadas como porções detectáveis.

[00131] Um tratamento "profilático" é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença ou exibe apenas sinais precoces com a finalidade de diminuir o risco de desenvolvimento da patologia. Os compostos da presente invenção podem ser administrados como um tratamento profilático para reduzir o risco de desenvolvimento de uma patologia, ou para minimizar a gravidade da patologia, se desenvolvida.

[00132] "Polinucleotídeo recombinante" refere-se a um polinucleotídeo tendo sequências que não estão naturalmente unidas. Um polinucleotídeo recombinante amplificado ou montado pode ser incluído em um vetor adequado e o vetor pode ser usado para transformar uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo recombinante é referida como uma "célula hospedeira recombinante". O gene é então expresso na célula hospedeira recombinante para produzir, por exemplo, um "polipeptídeo recombinante". Um polinucleotídeo recombinante pode servir uma função não codificante (ex., promotor, origem de replicação, um sítio de ligação de ribossoma, etc), também.

[00133] "Hibridizar especificamente a", "hibridização específica", ou "hibridizar seletivamente a" refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula de ácido nucleico, preferencialmente a uma determinada sequência de nucleotídeo, sob condições rigorosas quando essa sequência está presente em um DNA ou RNA de mistura complexa (por exemplo, celular total).

[00134] O termo "condições rigorosas" refere-se às condições sob as quais uma sonda irá hibridizar preferencialmente para a sua subsequência alvo, e em menor extensão, ou não totalmente, para outras sequências. "Hibridização rigorosas" e "condições de lavagem de hibridização rigorosas", no contexto das experiências de hibridização de ácidos nucleicos, tais como hibridizações Southern e Northern são dependentes da sequência e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um extenso guia de hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York. Geralmente, as condições altamente rigorosas de hibridização e de lavagem são selecionadas para serem cerca de 5°C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica, a uma força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente adaptada. Condições muito rigorosas são selecionadas por serem iguais à Tm para uma sonda particular.

[00135] Um exemplo de condições de hibridização rigorosas para hibridização de ácidos nucleicos complementares que têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em uma Southern ou Northern blot é de 50% de formalina, com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente rigorosas é de 0,15 M de NaCl a 72°C durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem rigorosas é uma lavagem 0,2X SSC a 65 ° C durante 15 minutos (ver, Sambrook et al. para uma descrição do tampão SSC). Muitas vezes, uma lavagem de rigor elevado é precedida por uma lavagem de baixo rigor para remover o sinal da sonda de fundo. Um exemplo de lavagem de rigor médio para uma cadeia dupla de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45°C durante 15 minutos. Um exemplo de lavagem de baixo rigor para um duplexo de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos. Em geral, a razão sinal-ruído de 2x (ou superior) do que a observada para uma sonda não relacionada no teste de hibridização particular, indica a detecção de uma hibridização específica.

[00136] Um "indivíduo" de diagnóstico ou tratamento é um humano ou animal não humano, incluindo um mamífero ou um primata.

[00137] A frase "substancialmente homóloga" ou "substancialmente idêntica" no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere- se geralmente a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 40%, 60%, 80%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de nucleotídeo ou resíduos de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um dos algoritmos de comparação de sequências a seguir ou por inspeção visual. Preferencialmente, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, mais preferencialmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e mais preferencialmente as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. Em uma modalidade mais preferida, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento de um ou ambos os biopolímeros de comparação.

[00138] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, em que as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências de teste e de referência são as sequências de entrada para um computador, são designadas coordenadas de subsequência, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequência para a sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.

[00139] O alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, com o método de busca de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual.

[00140] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas utilizando alinhamentos progressivos, aos pares para mostrar a relação e percentagem de identidade de sequência. É possível também gerar uma árvore ou dendograma mostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Biol. Evol. 35:351360, 1987. O método usado é semelhante ao método descrito por Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-153, 1989. O programa pode alinhar até 300 sequências, cada uma com um comprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento em pares das duas sequências mais semelhantes, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este agrupamento é então alinhado com a próxima sequência mais relacionada ou agrupamento de sequências alinhadas. Dois agrupamentos de sequências são alinhados por uma extensão simples do alinhamento aos pares de duas sequências individuais. O alinhamento final é alcançado por uma série de alinhamentos progressivos, aos pares. O programa é executado com a designação de sequências específicas e seus aminoácidos ou coordenadas de nucleotídeo para regiões de comparação de sequência e designando os parâmetros do programa. Por exemplo, uma sequência de referência pode ser comparada a outras sequências de teste para determinar a percentagem da relação da identidade de sequência usando os seguintes parâmetros: peso de espaço padrão (3,00), peso de comprimento de espaço padrão (0,10), e espaços de extremidades ponderadas. Outro algoritmo que é útil para gerar alinhamentos múltiplos de sequências é Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994).

[00141] Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade da sequência e a similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de sequência de alta pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, o que corresponder ou satisfazer alguma pontuação de limiar de valor positivo T quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Estes acertos de palavra de vizinhança iniciais agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. Pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre> 0) e N (pontuação de penalização para resíduos não correspondentes; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. As extensões dos acertos de palavras em cada direção são interrompidas quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa, ou o fim de qualquer sequência for atingido. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 , 1989).

[00142] Em adição ao cálculo do percentual da identidade da sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993 ). Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma em uma comparação entre o ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor do que cerca de 0,01, e mais preferencialmente menor do que cerca de 0.001.

[00143] Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reticulado com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Assim, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam uma à outra sob condições rigorosas, como aqui descrito.

[00144] "Substancialmente puro" ou "isolado" significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar, mais abundante que qualquer outra espécie macromolecular individuais na composição) e uma porção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura significa que cerca de 80% a 90% ou mais das espécies macromoleculares presentes na composição é a espécie purificada de interesse. A espécie objeto é purificada até uma homogeneidade essencial (as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) se a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Espécies solventes, pequenas moléculas (<500 Daltons), estabilizadores (por exemplo, BSA) e espécies de íons elementares não são consideradas espécies macromoleculares para os fins desta definição. Em algumas modalidades, as enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção são substancialmente puras ou isoladas. Em algumas modalidades, as enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção são substancialmente puras ou isoladas em relação aos materiais de partida macromoleculares usados na sua síntese. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção compreende uma forma substancialmente purificada ou isolada da enzima de sulfatase lisossomal terapêutica misturada com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00145] Um tratamento "terapêutico" é um tratamento administrado a um indivíduo que exibe sinais ou sintomas da patologia com o objetivo de diminuir ou eliminar esses sinais ou sintomas. Os sinais e sintomas podem ser bioquímicos, celulares, histológicos e funcionais, subjetivos ou objetivos. As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser administradas como um tratamento terapêutico ou de diagnóstico.

[00146] "Índice terapêutico" refere-se à faixa de doses (quantidade e/ou tempo) acima do valor mínimo terapêutico e abaixo de uma quantidade inaceitavelmente tóxica.

[00147] "Tratamento" refere-se a um tratamento profilático ou tratamento terapêutico ou tratamento de diagnóstico.

[00148] O termo "forma de dosagem unitária", tal como aqui usado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e animais, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de enzima de sulfatase lisossomal da presente invenção, calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As especificações para as novas formas de dosagem unitárias da presente invenção dependem da enzima de sulfatase lisossomal específica empregada e do efeito a ser alcançado, e da farmacodinâmica associada a cada enzima de sulfatase lisossomal no hospedeiro.

II. PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE SULFATASE LISOSSOMAIS

[00149] Em um aspecto, a presente invenção apresenta um novo método de produção de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas em quantidades que permitem a utilização terapêutica de tais enzimas. Em geral, o método inclui a transformação de uma linhagem celular apropriada com o cDNA que codifica o fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) ou um seu fragmento, mutante, variante ou seu derivado biologicamente ativo do mesmo e um cDNA que codifica a enzima de sulfatase lisossomal de comprimento completo ou um fragmento, mutante, variante ou derivado biologicamente ativo. Os versados na técnica podem preparar os Constructos de expressão que não estejam expressamente aqui descritos para a produção ideal de tais enzimas de sulfatase lisossomais em linhagens celulares transfectadas adequadas com os mesmos. Além disso, os versados na técnica podem facilmente conceber fragmentos de cDNA que codificam os fragmentos biologicamente ativos, variantes, mutantes ou derivados da SUMF1 de ocorrência natural ou enzimas de sulfatase lisossomais, que possuem a mesma atividade biológica ou similar às enzimas de comprimento total de ocorrência natural.

Células Hospedeiras

[00150] As células hospedeiras usadas para produzir enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes são linhagens celulares deficientes em acidificação endossomal caracterizadas pela sua capacidade de produzir tais enzimas de sulfatase lisossomais, em quantidades que permitam a utilização da enzima terapeuticamente. A invenção fornece uma linhagem celular complementação de grupo END3 derivada de CHO-K1, designado por G71. A invenção fornece também uma linhagem celular G71, que foi adaptada para crescimento em cultura de suspensão livre de soro, designada G71S. A invenção também fornece derivados de G71 e linhagens celulares G71S que foram subclonadas adicionalmente ou que contém plasmídeos de expressão diferentes.

[00151] As células que contêm e expressam o DNA ou RNA que codifica uma proteína recombinante são aqui referidas como células geneticamente modificadas. As células de mamífero que contêm e expressam o DNA ou RNA que codifica a proteína recombinante são referidos como células de mamíferos geneticamente modificadas. Introdução do DNA ou RNA nas células é através de um método de transfecção conhecido, tais como, por exemplo, e não por limitação, electroporação, microinjecção, bombardeamento com microprojéteis, precipitação com fosfato de cálcio, precipitação com fosfato de cálcio modificado, tratamento de lípido catiônico, fotoporação, metodologias de fusão, transferência mediada pelo receptor, ou a precipitação de polibreno. Alternativamente, o DNA ou o RNA pode ser introduzido por infecção com um vetor viral. Os métodos de produção para células, incluindo células de mamífero, que expressam o DNA ou o RNA que codificam uma proteína recombinante estão descritos nos pedidos de patentes co-pendentes US 08/334.797, intitulado " In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy", por Richard F Selden, Douglas A. Treco e Michael W. Heartlein (depositado em 04 de novembro de 1994); US 08/334.455, intitulado "In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin for Gene Therapy ", por Richard F Selden, Douglas A. Treco e Michael W. Heartlein (depositado em 4 de novembro de 1994) e US 08/231.439, intitulado "Targeted Introduction of DNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for Gene Therapy", por Richard F. Selden, Douglas A. Treco, Michael W. Heartlein e (depositado em 20 de abril de 1994). Os ensinamentos de cada um destes pedidos são aqui expressamente incorporados por referência na sua totalidade.

[00152] Em modalidades preferidas, a célula hospedeira usada para produzir enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes é uma linhagem celular deficiente em acidificação endossomal caracterizada pela sua capacidade de produzir tais enzimas de sulfatase lisossomais, em quantidades que permitam a utilização da enzima terapeuticamente. Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma Linhagem celular de grupo de complementação END3 derivada de CHO-K1, designada por G71, e uma linhagem celular G71 que foi adaptada para crescimento em cultura de suspensão livre de soro, designada G71S, que co- expressam o fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) e uma enzima de sulfatase lisossomal recombinante, e são, portanto, capazes de produzir altos rendimentos de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas, conforme especificado em "DEFINIÇÕES", permitindo a produção em larga escala de enzimas de sulfatase lisossomais terapêuticas. Na maioria das modalidades preferidas, a linhagem celular G71 ou G71S, ou derivado da mesma, que expressa e segreta enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes em quantidades de pelo menos cerca de 0,5, preferencialmente pelo menos cerca de 0,75, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,0, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,25 picogramas/célula/dia.

Vetores e Constructos de Ácido Nucleico

[00153] Um construto de ácido nucleico usado para expressar a proteína recombinante, seja fator de modificação de sulfatase humana 1 (SUMF1) ou enzima de sulfatase lisossomal ou ambos, pode ser um que seja expresso extracromossomicamente (epissomicamente) na célula de mamífero ou um transfectado que integra, aleatoriamente ou em um local pré-selecionado através de recombinação homóloga direcionada, no genoma da célula recipiente. Um construto que é expresso extracromossomicamente compreende, além das sequências de codificação da proteína recombinante, sequências suficientes para a expressão da proteína nas células e, opcionalmente, para a replicação do construto. Ele inclui, tipicamente, um promotor, DNA que codifica a proteína recombinante e um sítio de poliadenilação. O DNA que codifica a proteína recombinante está posicionado no construto de tal forma que a sua expressão está sob o controle do promotor. Opcionalmente, um construto pode conter componentes adicionais, tais como um ou mais dos seguintes: um local de junção, uma sequência intensificadora, um gene marcador selecionável sob o controle de um promotor adequado, um gene marcador amplificável, sob o controle de um promotor adequado, e uma região de ligação da matriz (MAR) ou outro elemento conhecido na técnica que aumenta a expressão da região em que está inserida.

[00154] Naquelas modalidades em que o construto de DNA integrase no genoma da célula, é preciso incluir apenas as sequências de ácidos nucleicos que codificam a proteína recombinante. Opcionalmente, pode incluir um promotor e uma sequência intensificadora, um local de poliadenilação, ou locais, ou um local ou locais de junção, sequências de ácidos nucleicos que codificam um marcador ou marcadores selecionáveis, sequências de ácidos nucleicos que codificam um marcador amplificável, uma região de ligação da matriz (MAR) ou outro elemento conhecido na técnica que aumenta a expressão da região em que se insere, e/ou DNA homólogo ao DNA genômico na célula receptora, para atingir a integração do DNA a um sítio selecionado no genoma (ao DNA alvo ou sequências de DNA).

Métodos de Culturas Celulares

[00155] As células de mamífero que contêm o DNA ou RNA que codifica a proteína recombinante são cultivadas sob condições adequadas para o crescimento das células e a expressão do DNA ou RNA. Estas células que expressam a proteína recombinante podem ser identificadas, através de métodos conhecidos e dos métodos aqui descritos, e a proteína recombinante pode ser isolada e purificada, utilizando os métodos conhecidos e os métodos aqui descritos, também, com ou sem amplificação da produção de proteína recombinante. A identificação pode ser realizada, por exemplo, por meio de triagem de células de mamíferos geneticamente modificadas que exibem um fenótipo indicativo da presença de DNA ou RNA que codifica a proteína recombinante, tal como triagem de PCR, triagem por análise de Southern blot ou triagem para a expressão da proteína recombinante. A seleção das células que contêm o DNA que codifica a proteína recombinante incorporada pode ser conseguida através da inclusão de um marcador selecionável no construto de DNA, com cultura subsequente das células transfectadas ou infectadas, contendo um gene de marcador selecionável, em condições adequadas para a sobrevivência apenas daquelas células que expressam o gene marcador selecionável. A amplificação adicional do construto de DNA introduzido pode ser efetuada por cultura de células de mamíferos geneticamente modificadas sob condições apropriadas {por exemplo, a cultura de células de mamíferos geneticamente modificadas que contêm um gene marcador amplificável, na presença de uma concentração de uma droga na qual as células que contêm apenas várias cópias do gene marcador amplificável pode sobreviver).

[00156] As células de mamífero geneticamente modificadas que expressam a proteína recombinante podem ser identificadas, como descrito aqui, por detecção do produto de expressão. Por exemplo, as células de mamíferos que expressam as enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas podem ser identificadas através de um imunoensaio de enzima em sanduíche. Os anticorpos podem ser direcionados para a parte de agente ativo.

Variantes das Enzimas de Sulfatase Lisossomais

[00157] Em certas modalidades, mutantes ou variantes da enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa podem ser preparado e serão úteis em uma variedade de aplicações em que as enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas podem ser usadas. Os mutantes ou variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo podem ser mutantes ou variantes substitutas, de inserção ou de deleção. Os mutantes ou variantes de deleção não têm um ou mais resíduos da proteína nativa, que não são essenciais para a função ou atividade imunogénica. Um tipo comum de mutante ou variante de exclusão é um sem as sequências de sinal secretoras ou sequências de sinais direcionando uma proteína para se ligar a uma parte específica de uma célula. Os mutantes ou variantes de inserção tipicamente envolvem a adição de material em um ponto não-terminal no polipeptídeo. Isto pode incluir a inserção de um epítopo imunoreativo ou simplesmente um resíduo único. Adições terminais, também chamadas de proteínas de fusão, são discutidas a seguir.

[00158] As variantes podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas à enzima sulfatase lisossomal não modificada, tal como estabelecido acima. Variantes preferidos são aquelas que são variantes de um polipeptídeo da enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa que retém pelo menos uma parte da atividade biológica, por exemplo, atividade de sulfatase, da enzima de sulfatase lisossomal. Outras variantes preferidas incluem variantes de um polipeptídeo de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humano que retêm pelo menos uma parte da atividade da sulfatase da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana.

[00159] Os mutantes ou as variantes de substituição tipicamente trocam um aminoácido do polipeptídeo de tipo selvagem por outro em um ou mais sítios dentro da proteína, e pode ser concebido para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, tal como, por exemplo, e não para limitação da estabilidade contra a clivagem proteolítica, sem a perda de outras funções ou propriedades. Substituições deste tipo preferencialmente são conservadoras, isto é, um aminoácido é substituído por outro de forma e de carga semelhantes. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as alterações de: alanina por serina; arginina para lisina; asparagina por glutamina ou histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina ou metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptofano para tirosina; tirosina por triptofano ou fenilalanina e valina por isoleucina ou leucina.

[00160] Um aspecto da presente invenção contempla a geração de mutantes ou variantes de sítio de glicosilação em que o sítio de glicosilação O-ou N-ligado da enzima de sulfatase lisossomal foi mutado. Tais mutantes ou variantes irão gerar informação importante em relação à atividade biológica, estrutura física e potencial de ligação ao substrato da enzima de sulfatase lisossomal fosforilada altamente ativa. Em aspectos particulares, é contemplado que outros mutantes ou variantes do polipeptídeo da enzima de sulfatase lisossomal fosforilada altamente ativa podem ser gerados que retêm a atividade biológica, mas que aumenta ou diminui a atividade de ligação ao substrato. Como tal, as mutações do sítio ativo ou da região catalítica são particularmente contempladas, a fim de gerar os mutantes ou variantes da proteína com atividade de ligação ao substrato alterada. Em tais modalidades, a sequência da enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa é comparada com a das outras enzimas relacionadas e resíduos selecionados são especificamente mutados.

[00161] A numeração dos aminoácidos da proteína madura do terminal amino putativo, como o aminoácido número 1, mutações exemplares que podem ser úteis incluem, por exemplo, a substituição da totalidade ou de algumas das asparaginas potencialmente glicosiladas, incluindo as posições 178 e 397 da N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase recombinante humana (GALNS) (ver Figura 5).

[00162] A ligação ao substrato pode ser modificada por mutações no/junto ao sítio ativo da enzima de sulfatase lisossomal. Levando em consideração que essas mutações são exemplares, aqueles versados na técnica reconhecerão que outras mutações da sequência de enzima podem ser feitas para fornecer informações estruturais e funcionais adicionais sobre esta proteína e a sua atividade.

[00163] A fim de construir mutantes ou variantes tais como os descritos acima, uma pessoa versada na técnica pode empregar tecnologias padrão bem conhecidas. Especificamente são contempladas deleções de N-terminais, deleções de C-terminais, deleções internas, assim como a mutagênese aleatória e pontual.

[00164] Deleções em N-terminal e C-terminal são formas de mutagênese de deleção que levam vantagem, por exemplo, da presença de um sítio de restrição adequado único próximo da extremidade da região C-ou N-terminal. O DNA é clivado no local e as extremidades cortadas são degradadas por nucleases, tais como BAL31, exonuclease III, DNase I, e nuclease S1. Reunir as duas extremidades produz uma série de DNAs com deleções de tamanho variável em torno do sítio de restrição. As proteínas expressas a partir de tal mutante podem ser ensaiadas para a função biológica adequada, ex., atividade enzimática, utilizando técnicas padrão na técnica, e descritas na especificação. Técnicas semelhantes podem ser empregadas para os mutantes de deleção interna, usando dois sítios de restrição apropriadamente colocados, permitindo desse modo que uma deleção definida com precisão seja feita, e as extremidades a serem religadas como acima.

[00165] Também são contemplados os mutantes de digestão parcial. Em tais casos, uma pessoa versada na técnica poderia empregar um "cortador frequente" que corta o DNA em vários locais, dependendo da duração do tempo de reação. Assim, através da variação das condições de reação, será possível gerar uma série de mutantes de tamanho variável, que podem então ser triados para a atividade.

[00166] A mutação de inserção aleatória também pode ser realizada por corte da sequência de DNA com uma DNase I, por exemplo, e a inserção de um trecho de nucleotídeo que codifica 3, 6, 9, 12, etc, amino ácidos e religando a extremidade . Uma vez que tal mutação é feita os mutantes podem ser rastreados para várias atividades apresentadas pela proteína do tipo selvagem.

[00167] A mutagênese pontual pode ser também empregada para identificar com particularidade quais resíduos de aminoácidos são importantes em atividades particulares associadas com a atividade biológica da enzima de sulfatase lisossomal. Assim, uma pessoa versada na técnica será capaz de gerar alterações de uma única base na cadeia de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação sem sentido.

[00168] Os aminoácidos de uma proteína particular podem ser alterados para criar um equivalente, ou mesmo uma molécula de segunda geração melhorada. Tais alterações contemplam a substituição de um determinado aminoácido da proteína sem perda apreciável da capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação ao antígeno de anticorpos ou locais de ligação em moléculas de substrato ou receptores. Uma vez que é a capacidade interativa e natureza de uma proteína que define que a atividade biológica da proteína funcional, certas substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência da proteína, e a sua sequência de DNA codificadora subjacente, e mesmo assim obter uma proteína com propriedades semelhantes. Assim, várias modificações podem ser feitas nas sequências de DNA de genes sem perda apreciável da sua utilidade ou atividade biológica, tal como discutido abaixo.

[00169] Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. É aceito que o caráter hidropático relativo dos aminoácidos contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e semelhantes. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base na sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol, 157 (1): 105-132, 1982, aqui incorporado por referência). Geralmente, os aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem um índice hidropático ou pontuação semelhante e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica semelhante, isto é, ainda obter uma proteína equivalente funcionalmente biológico.

[00170] Além disso, a substituição de aminoácidos similares pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A Patente US 4.554.101, aqui incorporada por referência, afirma que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteína. Como tal, um aminoácido pode ser substituído por outro possuindo um valor de hidrofilicidade semelhante e ainda obter uma proteína biologicamente equivalente e imunologicamente equivalente.

[00171] Substituições de aminoácidos exemplares que podem ser usadas neste contexto da presente invenção incluem, mas não se limitam a troca de arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina e valina, leucina e isoleucina. Outras tais substituições que levam em conta a necessidade de retenção de parte ou da totalidade da atividade biológica, enquanto a alteração da estrutura secundária da proteína será bem conhecida por aqueles versados na técnica.

[00172] Outro tipo de variante que é contemplado para a preparação de polipeptídeos de acordo com a invenção é a utilização de miméticos de peptídeos. Os miméticos são moléculas que contém peptídeos que imitam elementos da estrutura secundária da proteína. Veja, por exemplo, Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" em BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993). A lógica subjacente ao uso de miméticos de peptídeos é que o esqueleto peptídico das proteínas existe principalmente para orientar as cadeias de aminoácidos laterais, de tal maneira a facilitar interações moleculares, tais como os de anticorpos e antígenos. Um mimético de peptídeo é esperado para permitir interações moleculares semelhantes à molécula natural. Estes princípios podem ser usados, em conjunto com os princípios acima descritos, para a engenharia de moléculas de segunda geração que possuem muitas das propriedades naturais das enzimas de sulfatase lisossomais, mas com características alteradas e ainda melhoradas.

Glicosilação Modificada de Enzimas de Sulfatase Lisossomal

[00173] As variantes de uma enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa também podem ser produzidas que têm um padrão de glicosilação modificado em relação ao polipeptídeo parental, por exemplo, deleção de uma ou mais porções do carboidrato, e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no polipeptídeo nativo.

[00174] A glicosilação é tipicamente N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. A presença de qualquer uma destas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Deste modo, sítios de glicosilação ligados a N podem ser adicionados a um polipeptídeo através da alteração da sequência de aminoácidos de tal modo que ela contenha uma ou mais destas sequências de tripeptídeo. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usados. Sítios de glicosilação O-ligados podem ser adicionados através da inserção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do polipeptídeo original.

Comutação de Domínio

[00175] Várias porções de proteínas da enzima de sulfatase lisossomal possuem uma grande quantidade de homologia de sequência. As mutações podem ser identificadas em polipeptídeos da enzima de sulfatase lisossomal, que podem alterar a sua função. Estes estudos são potencialmente importantes por, pelo menos, duas razões. Primeiro, eles fornecem uma expectativa razoável de que ainda outros homólogos, variantes alélicas e mutantes deste gene podem existir em espécies relacionadas, tais como o rato, coelho, macaco, gibão, chimpanzé, babuíno, vaca, porco, cavalo, ovelha e gato. Após isolamento destes homólogos, variantes e mutantes, e em conjunto com outras análises, certos domínios ativos ou funcionais podem ser identificados. Em segundo lugar, isto irá fornecer um ponto de partida para a análise mutacional adicional da molécula, como descrito acima. Uma forma em que esta informação pode ser explorada é em "comutação de domínio".

[00176] A comutação de domínio envolve a geração de moléculas recombinantes que utilizam polipeptídeos diferentes, mas relacionados. Por exemplo, pela comparação da sequência de uma enzima de sulfatase lisossomal, por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase, com a de uma enzima de sulfatase lisossomal semelhante de outra fonte, e com os mutantes e variantes alélicas destes polipeptídeos, pode-se fazer previsões quanto às regiões funcionalmente importantes de tais moléculas. É possível, então, comutar domínios relacionados destas moléculas em um esforço para determinar a criticidade destas regiões para a função da enzima e os efeitos em distúrbios de armazenamento lisossomal. Estas moléculas podem ter valor adicional na medida em que estas "quimeras" podem ser distinguidas a partir de moléculas naturais, enquanto possivelmente fornecendo a mesma função ou ainda melhorada.

[00177] Com base nas inúmeras enzimas de sulfatase lisossomais sendo agora identificados, análise adicionais de mutações e seu efeito previsto na estrutura secundária irá se adicionar a este entendimento. É contemplado que os mutantes que alternam entre os domínios de enzimas de sulfatase lisossomais fornecerão informações úteis acerca das relações de estrutura/função destas moléculas e os polipeptídeos com os quais elas interagem.

Proteínas de Fusão

[00178] Em adição às mutações descritas acima, a presente invenção contempla ainda a geração de um tipo especializado de variante insercional conhecida como uma proteína de fusão. Esta molécula tem geralmente a totalidade ou uma parte substancial da molécula nativa, ligada na extremidade N-ou C-terminal, para a totalidade ou uma porção de um segundo polipeptídeo. Por exemplo, as fusões tipicamente empregam sequências líderes de outras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. Outra fusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente ativo, tal como um epítopo de anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um sítio de clivagem na ou perto da junção de fusão irá facilitar a remoção do polipeptídeo estranho após purificação. Outras fusões úteis incluem ligação de domínios funcionais, tais como sítios ativos de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de direcionamento celulares ou regiões de transmembrana.

[00179] Existem vários sistemas de expressão de proteína de fusão disponíveis comercialmente que podem ser usados na presente invenção. Sistemas particularmente úteis incluem, mas não estão limitados a, sistema de glutationa S-transferase (GST) (Pharmacia, Piscataway, NJ), o sistema de proteína de ligação de maltose (NEB, Beverley, MA), o sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), o sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estes sistemas são capazes de produzir polipeptídeos recombinantes tendo apenas um pequeno número de aminoácidos adicionais, que provavelmente não afetam a capacidade antigênica do polipeptídeo recombinante. Por exemplo, tanto o sistema FLAG e o sistema 6xHis adicionam apenas sequências curtas, ambos os quais são conhecidos por serem fracamente antigênicos e que não afetam adversamente a dobra do polipeptídeo para a sua conformação nativa. Outra fusão N-terminal que é contemplada por ser útil é a fusão de um dipeptídeo Met-Lis na região N-terminal da proteína ou peptídeos. Tal fusão pode produzir aumentos benéficos na expressão da proteína ou atividade.

[00180] Um construto de fusão particularmente útil pode ser um no qual um polipeptídeo da enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa ou um seu fragmento, está fundido com um hapteno para aumentar a imunogenicidade de um construto de fusão de enzima de sulfatase lisossomal. Isto pode ser útil na produção de anticorpos para a enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa para permitir a detecção da proteína. Em outras modalidades, um construto de fusão pode ser feito, que irá melhorar o direcionamento lisossomal da enzima de sulfatase relacionada com composições para um local específico ou célula.

[00181] Outros constructos de fusão, incluindo um peptídeo heterólogo com as propriedades desejadas, por exemplo, um motivo para direcionar a enzima de sulfatase lisossomal para um determinado órgão, tecido ou tipo de célula. Em uma modalidade preferida, um construto de fusão incluindo um peptídeo de direcionamento à osso, por exemplo, 6 resíduos de ácido aspártico (6xAsp ou 6D) fundidos a um enzima de sulfatase lisossomal podem ter como alvo a enzima para sítios particulares no osso.

[00182] Outros constructos de fusão incluindo um polipeptídeo heterólogo com as propriedades desejadas, por exemplo, uma região constante de Ig para prolongar a meia-vida sérica ou um anticorpo ou um fragmento do mesmo para direcionamento também são contemplados. Outros sistemas de fusão produzem híbridos de polipeptídeos onde é desejável excisar o parceiro de fusão a partir do polipeptídeo desejado. Em uma modalidade, o parceiro de fusão é ligado ao polipeptídeo da enzima de sulfatase lisossomal recombinante altamente fosforilada ativa por uma sequência peptídica contendo uma sequência de reconhecimento para uma protease específica. Exemplos de sequências apropriadas são as reconhecidas pela protease do Tobacco Etch Virus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Fator Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).

Derivativos

[00183] Conforme indicado acima, um derivado refere-se aos polipeptídeos quimicamente modificados por meio de técnicas tais como, por exemplo, e não por limitação, a ubiquitinação, rotulagem, (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), a ligação de polímeros covalente tais como peguilação (derivatização com polietilenoglicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos, tais como ornitina. Derivados da enzima de sulfatase lisossomal também são úteis como agentes terapêuticos e podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção.

[00184] O polietileno glicol (PEG) pode ser ligado à enzima de sulfatase lisossomal produzida pelos métodos da presente invenção para fornecer uma maior meia-vida in vivo. O grupo de PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG, preferencialmente, irá variar entre cerca de 2 kiloDaltons ("kDa") e cerca de 100 kDa, mais preferencialmente de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, mais preferencialmente de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Os grupos PEG serão geralmente ligados às enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção por meio de acilação ou alquilação redutora por meio de um grupo reativo na porção PEG (por exemplo, um aldeído, amino, tiol, ou um grupo éster) com um grupo reativo na parte de proteína (por exemplo, um grupo de aldeído, amino, ou éster). A adição de frações PEG aos polipeptídeos de interesse pode ser realizada usando técnicas bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Publicação Internacional N°. WO 96/11953 e Patente US N°. 4.179.337.

[00185] Ligação do polipeptídeo da enzima de sulfatase lisossomal com PEG normalmente ocorre na fase aquosa e pode ser facilmente monitorada por HPLC de fase inversa analítica. Os peptídeos PEGuilados podem ser facilmente purificados por HPLC preparativa e caracterizados por HPLC analítica, análise de aminoácidos e espectrometria de massa de dessorção a laser.

Marcadores

[00186] Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase terapêutico lisossomal é marcada para facilitar a sua detecção. Um "marcador" ou "porção detectável" é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, químicos, imunoquímicos ou outros físicos. Por exemplo, marcadores adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, marcadores radioativos (por exemplo, 32P), fluoróforos (por exemplo, fluoresceina), reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, como é geralmente usado em ELISA), biotina, digoxigenina, ou haptenos bem como as proteínas que podem serdetectáveis, por exemplo, incorporando um radiomarcador no peptídeo ou hapteno, ou usado para detectar anticorpos especificamente reativos com o hapteno ou peptídeo.

[00187] Exemplos de marcadores adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, vermelho de Texas, rodamina, e semelhantes), radiomarcadores (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32P), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e outras comummente usadas em um ELISA), e marcadores colorimétricos, tais como ouro coloidal, vidro colorido ou esferas plásticas (por exemplo, poliestireno, polipropileno, latex, etc.).

[00188] O marcador pode ser acoplado direta ou indiretamente ao componente desejado da enzima de sulfatase lisossomal de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Preferencialmente, o marcador de uma modalidade é ligado de forma covalente à enzima de sulfatase lisossomal utilizando um reagente de isocianato para a conjugação de um agente ativo de acordo com a invenção. Em um aspecto da invenção, os reagentes de isocianato bifuncionais da presente invenção podem ser usados para conjugar um marcador a uma enzima de sulfatase lisossomal, para formar um conjugado da enzima de sulfatase lisossomal do marcador sem um agente ativo ligado a este. O conjugado da enzima de sulfatase lisossomal do marcador pode ser usado como um intermediário para a síntese de um conjugado marcado de acordo com a invenção, ou pode ser usado para detectar o conjugado da enzima de sulfatase lisossomal. Como indicado acima, uma grande variedade de marcadores pode ser usada, com a escolha do marcador de acordo com a sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com o componente desejado da enzima de sulfatase lisossomal, requisitos de estabilidade e instrumentação disponível e disposições de eliminação. Marcadores não radioativos são muitas vezes associados por meios indiretos. Geralmente, uma molécula de do ligante (por exemplo, biotina) é ligada covalentemente à enzima de sulfatase lisossomal. O ligante se liga então a outra molécula (por exemplo, estreptavidina), que é ou inerentemente detectável ou covalentemente ligada a um sistema de sinal, tal como uma enzima detectável, um composto fluorescente ou um composto quimioluminescente.

[00189] As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção também podem ser conjugadas diretamente a compostos geradores de sinal, por exemplo, por conjugação com uma enzima ou um fluoroforo. As enzimas adequadas para uso como marcadores incluem, mas não estão limitadas a, hidrolases, particularmente fosfatases, esterases e glicosidases, ou oxidotases, particularmente peroxidases. Compostos fluorescentes, isto é, fluoroforos, adequados para utilização como marcadores incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, etc. Exemplos adicionais de fluoroforos adequados referem-se, mas não estão limitados a, eosina, TRITC-amina, quinina, fluoresceína W, acridina amarela, lissamina rodamina, eritrosceína de cloreto de sulfonila B, rutênio (tris, bipiridinio), Texas Red, nicotinamida-adenina- dinucleotídeo, flavina adenina dinucleotídeo, etc. Os compostos quimioluminescentes adequados para utilização como marcadores incluem, mas não estão limitados a, luciferina e 2,3- dihidroftalazinedionas, por exemplo, luminol. Para uma revisão de vários sistemas de marcação e de produção de sinal que podem ser usados nos métodos da presente invenção, ver a Patente US 4.391.904.

[00190] Os meios para a detecção de marcadores são bem conhecidos dos versados na técnica. Assim, por exemplo, onde o marcador é radioativo, meios de detecção incluem um contador de cintilação ou um filme fotográfico, como em autorradiografia. Onde o marcador é um marcador fluorescente, pode ser detectado pela excitação do fluorocromo com o comprimento de onda da luz apropriado e detectação da fluorescência resultante. A fluorescência pode ser detectada visualmente, pelo uso de detectores eletrônicos, tais como dispositivos acoplados à carga (CCD) ou fotomultiplicadores e afins. De modo semelhante, marcadores enzimáticos podem ser detectados, fornecendo os substratos apropriados para a enzima e detectando o produto reacional resultante. Marcadores colorimétricos ou quimioluminescentes podem ser detectados simplesmente observando a cor associada com o marcador. Outros sistemas de marcação e de detecção adequados para utilização nos métodos da presente invenção serão facilmente evidentes para os versados na técnica. Tais moduladores e ligantes marcados podem ser usados para o diagnóstico de uma doença ou estado de saúde.

[00191] Em uma modalidade preferida, o método compreende a etapa de produção de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas de linhagens celulares com defeitos no tráfico endossomal. Em uma modalidade particularmente preferida, o método compreende a etapa de produção de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS) a partir da linhagem celular de CHO G71, ou um derivado da mesma. A produção das enzimas de sulfatase lisossomais, tais como, por exemplo, e não por limitação, GALNS, compreende as etapas de: (a) desenvolvimento de uma linhagem celular derivada de G71 ou G71 que co-expressa uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante, por exemplo, N- acetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), e fator modificador da sulfatase humana recombinante 1 (SUMF1), (b) cultura da enzima de sulfatase lisossomal humana e linhagens celulares coexpressando a SUMF1, e (c) ampliação da enzima de sulfatase lisossomal humana e Linhagens celulares coexpressando a SUMF1 para o bioreactor para a produção das enzimas de sulfatase lisossomais. Em modalidades preferidas, a enzima de sulfatase lisossomal humana, por exemplo, N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS), e cDNAs de SUMF1 humanas são subclonadas em vetores de expressão de mamíferos, basicamente, como descrito aqui abaixo.

[00192] Para o desenvolvimento da linhagem celular, G71 ou G71S, um clone G71 adaptado para crescimento em cultura de suspensão livre de soro, foi co-transfectado com um vetor de expressão de mamífero GALNS humano, um vetor de expressão de mamífero de SUMF1 humano, e um gene marcador selecionável, e os transformantes estáveis foram selecionados. Depois de um primeiro ciclo de subclonagem de transfectantes estáveis, as linhagens celulares foram selecionadas utilizando o substrato fluorescente e especificamente designadas. As linhagens celulares G71 ou G71S foram analisadas quanto a produtividade específica por célula (pg de produto/célula) em centrífugas com microtransportadores ou em cultura em suspensão, respectivamente. Os melhores produtores de GALNS humana foram identificados e dimensionados para cima para o bioreactor para a produção do material pré-clínico.

[00193] Em outra modalidade, a invenção fornece um ensaio a base de célula para a medição da atividade de uma enzima lisossomal recombinante humana para degradar substratos naturais. O método compreende (a) a cultura de uma célula humana isolada deficiente na enzima lisossomal, em condições em que os substratos naturais para a enzima lisossomal se acumulam, (b) colocar em contato a célula com a enzima lisossomal, (c) lise da célula, (d) adicionar ao lisado da célula uma enzima que (i) é específica para os substratos naturais, e (ii) cliva pequenos oligossacarídeos partir dos substratos naturais, (e) marcação dos oligossacarídeos pequenos com uma porção detectável, (f) opcionalmente separar os pequenos oligossacarídeos marcados, (g) detectar os pequenos oligossacarídeos marcados, e (h) determinar a atividade da enzima lisossomal para degradar os substratos naturais comparando (i) a quantidade de pequenos oligossacarídeos marcados a partir de células em contato com a enzima lisossomal com (ii) a quantidade de pequenos oligossacarídeos marcados a partir das células que não estão em contato com a enzima lisossomal, em que a redução em (h) (i) em relação a (h) (ii) indica a atividade da enzima lisossomal para degradar substratos naturais. Em uma modalidade, o oligossacarídeo pequeno é um mono-, di-, ou tri-sacarídeo. Em uma modalidade relacionada, o oligossacarídeo pequeno é um dissacarídeo.

[00194] Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é selecionado a partir do grupo consistindo em arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglucosamina-sulfatase (G6S) e N-acetilgalactosamina-6- sulfatase (GALNS). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é α- L-iduronidase (IDU). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é a α-glucosidase ácida (GAA). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é β-glucoronidase (GUSB). Em algumas modalidades, a enzima lisossomal é β-galactosidase (GLB1).

[00195] Células humanas adequadas que podem ser usadas no ensaio a base de células incluem qualquer célula humana que é deficiente na enzima lisossomal a ser testada, de tal modo que podem acumular os substratos naturais para a enzima lisossomal. Por exemplo, as células exibindo naturalmente uma deficiência total (100%) ou parcial da atividade, por exemplo, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de redução da atividade, podem ser usadas. As células que expressam uma enzima mutante com atividade reduzida, ou células derivadas de pacientes que sofrem de uma doença de armazenamento lisossomal, por exemplo, uma mucopolissacaridose podem ser usadas. As células recombinantemente alteradas para nocaute ou redução da atividade da enzima lisossomal, por exemplo, através da introdução de uma mutação ao gene de codificação ou o seu promotor ou outra região reguladora, podem ser usadas. As células tratadas para reduzir a atividade da enzima lisossomal, por exemplo, tratadas com anti-senso ou RNAi para reduzir a expressão da enzima, podem ser usadas.

[00196] As enzimas apropriadas que clivam (digerem) oligossacarídeos pequenos a partir de carboidratos e que são "específicas para" (isto é, predominantemente digerem) os substratos naturais da enzima lisossomal podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, para a detecção da atividade de GALNS ou GLB 1 (enzimas que degradam o sulfato de queratano) a enzima da etapa (d) pode ser Keratanase II ou qualquer outra enzima que atua principalmente sobre sulfato de queratano. Como outro exemplo, para a detecção de IDU, ARSB, IDS ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de dermatano), a enzima da etapa (d) pode ser Condroitinase ABC ou qualquer enzima que atua principalmente sobre o sulfato de dermatano. Como outro exemplo, para a detecção de IDU, IDS, SGHS, G6S ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de heparano), a enzima da etapa (d) pode ser heparanase I ou II heparanase, ou ambas. Ainda como outro exemplo, para a detecção de GAA (uma enzima que degrada o glicogênio), a enzima da etapa (d) pode ser uma α-amilase ou qualquer enzima que atua principalmente no glicogênio.

[00197] Este método a base de células é capaz de grande sensibilidade na detecção de atividade da enzima lisossomal. Em algumas modalidades, a atividade da enzima lisossomal é detectável quando a concentração da enzima lisossomal é tão baixa quanto cerca de 10 nM, ou cerca de 5 nM, ou cerca de 1 nM, ou cerca de 0,75 nM, ou cerca de 0,5 nM, ou cerca de 0,25 nM, ou cerca de 0,1 nM, ou cerca de 0,05 nM, ou cerca de 0,01 nM, ou cerca de 0,005 nM, ou cerca de 1 pM, ou de cerca de 0,5 pM.

III. PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS DE SULFATASE LISOSSOMAIS

[00198] O material do biorreator contendo GALNS recombinante humana foi 0,2 μm estéril por filtragem e mantido a 4°C. O material do biorreator foi ou carregado em uma coluna de captura diretamente, ou concentrado 10 a 20 vezes por ultrafiltragem antes de carregar sobre uma coluna de captura. O material de biorreator ou material de biorreator concentrado teve o pH ajustado para o pH 4,5 e em seguida carregado em uma coluna de Blue-Sepharose, lavada sequencialmente com 20 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5 e 20 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 6,0 e eluída com 20 mM de acetato/fosfato, 100 mM de NaCl, pH 7,0. O eluato da coluna Blue-Sepharose foi então carregado em Fractogel SE Hi-Cap, lavado sequencialmente com 20 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 5,0 e 20 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 5,5, e eluído com 20 mM de acetato/fosfato, gradiente de 50 a 350 mM de NaCl, pH 5,5. O eluato da Fractogel SE Hi-Cap foi formulado em 10 mM de NaOAc, 1 mM de NaH2PO4, 0,005% de Tween-80, pH 5,5.

[00199] Em alternativa, o material do biorreator contendo GALNS recombinante humana foi concentrado 20 vezes por ultrafiltragem antes de carregar sobre uma coluna de captura. O material do biorreator concentrado reve o pH ajustado para o pH 4,5, filtrado e em seguida carregado em uma coluna Fractogel SE Hi-Cap, lavado sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5 e 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 5,0, e eluído com 10 mM de acetato/fosfato, 140 mM de NaCl, pH 5,0. O eluato da coluna de Fractogel SE Hi-Cap foi então ajustado para 500 mM de NaCl, pH 7,0 e carregado em uma coluna de Sepharose quelante de Zn (Zn- IMAC), lavado com 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 7,0 , e eluído com 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, 90 mM de imidazol, pH 7,0. O eluato da coluna de Sepharose quelante de Zn (Zn-IMAC) foi ajustada para pH 3,5 para inativação viral de pH baixo, ajustado para 10 mM de acetato/fosfato, NaCl a 2 M, pH 5,0, e em seguida carregado em uma coluna de ToyoPearl Butyl 650M, lavado com 10 mM de acetato/fosfato, NaCl a 2 M, pH 5,0, e eluído com 10 mM de acetato/fosfato, NaCl a 0,7 M, pH 5,0. O eluatode ToyoPearl Butyl 650M foi ultrafiltrado e dia-filtrado em 20 mM de acetato, 1 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, pH 5,5, e depois formulado em 20 mM de acetato, 1 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, 0,01% de Tween-20 , pH 5,5.

[00200] Em alternativa, o material do biorreator contendo GALNS recombinante humana foi filtrado, concentrado 20 vezes por ultrafiltragem/diafiltragem, e, em seguida, filtrado através de carvão ativado antes de carregar em uma coluna de captura. O material do biorreator concentrado foi carregado para uma coluna de Sepharose FF Quelante de Zn (Zn-IMAC) a uma condutividade ~55 ± 5 mS/cm, lavado sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, 500 mM de NaCl, pH 7,0 e 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, pH 7,0 (tampão A), e em seguida eluído com uma mistura de 70% do tampão A e 30% de 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, 300 mM de imidazol, pH 7,0 (tampão B). O eluato da coluna de Sepharose FF Quelante de Zn (Zn- IMAC) foi ajustado para uma condutividade de ~6,0 ± 0,5 mS/cm e pH 7,0 e carregado em um filtro Mustang Q para a remoção de vírus potencial. O filtrado do Mustang Q foi ajustado para o pH 4,5 ± 0,1, filtrado através de um filtro CUNO 60ZA seguido por um filtro embutido de 0.2 μm, e em seguida carregado em uma coluna Fractogel EMD SE Hi-Cap (M), lavado sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5 e uma mistura de 80% do tampão A (10 mM de acetato/fosfato, pH 5,0) e 20% do tampão B (10 mM de acetato/fosfato, 250 mM de NaCl , pH 5,0), e eluído com um gradiente linear de 20% a 75% do tampão B (80% a 25% do tampão A). O eluato da coluna de Fractogel EMD SE Hi-Cap foi então ajustado para o pH 3,5 ± 0,1 por adição de tampão de citrato a 0,2 M, pH 3,4 para inativação viral de pH baixo. O eluato da coluna de Fractogel EMD SE Hi-Cap inativado de baixo pH viral foi ajustado para NaCl a 2M e a pH 5,0 pela adição do tampão de citrato a 0,2 M, pH 6,0, e em seguida carregado em uma coluna de ToyoPearl Butyl 650M, lavado com 10 mM de acetato/fosfato , NaCl a 2 M, pH 5,0 (tampão A), e depois foi eluído em uma mistura de 35% do tampão A e 65% do tampão B (10 mM de acetato/fosfato, pH 5,0). O eluatoda ToyoPearl Butyl 650M teve o tampão trocado para 20 mM de NaOAc/HOAc, 50 mM de NaH2PO4, 30 mM de arginina HCl, 2% (p/v) de sorbitol, pH 5,4 e opcionalmente ajustado para uma concentração final de 3 mg/mL de GALNS. O tampão trocado e GALNS de concentração ajustada foram filtrados através de um filtro viral (DV20) e um filtro de DNA (Mustang Q) para remover qualquer vírus residual e DNA. Tween-20 (também conhecido como polissorbato 20 ou PS20) foi adicionado a uma concentração final de 0,01% (p/v),resultando na Substância da Droga a Granel (BDS). A BDS foi armazenada a 2-8 °C ou congelada.

[00201] Em alternativa, o material do biorreator contendo GALNS recombinante humana foi filtrado, concentrado 20 vezes por ultrafiltragem/diafiltragem, e, em seguida, filtrado através de carvão ativado antes de carregar em uma coluna de captura. O material do biorreator concentrado foi carregado para uma coluna de Sepharose FF Quelante de Zn (Zn-IMAC) a uma condutividade ~50 ± 5 mS/cm, lavado sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, 500 mM de NaCl, pH 7,0 e 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, pH 7,0 (tampão A), e em seguida eluído com uma mistura de 70% do tampão A e 30% de 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, 300 mM de imidazol, pH 7,0 (tampão B). O eluato da coluna de Sepharose FF Quelante de Zn (Zn- IMAC) foi ajustado para um pH de 4,5 ± 0,1 com 1,75 M de acetato, pH 4,0, filtrado através de um filtro Millipore COHC, misturado com 10 mM de acetato/fosfato, pH 4,5, em uma razão de 30: 70 (v/v), em seguida, carregado sobre uma coluna Fractogel EMD SE Hi-Cap (M) a uma condutividade <7 mS/cm, lavado sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5 e uma mistura de 80% de tampão A (10 mM de acetato/fosfato, pH 5,0) e 20% de tampão B (10 mM de acetato/fosfato, 250 mM de NaCl, pH 5,0), e eluído com um gradiente linear de 20% a 75% de tampão B (80% a 25% de tampão A). O eluato da coluna de Fractogel EMD SE Hi-Cap foi então ajustado para o pH 3,5 ± 0,1 por adição de 0,4 M de tampão de citrato, pH 3,4 para a inativação viral a pH baixo. O eluato da coluna de Fractogel EMD SE Hi- Cap de baixo pH viral inativado foi ajustado para NaCl a 2M até pH 5,05 ± 0,1 por adição de 0,4 M de tampão de citrato, pH 6,0, misturado com 10 mM de acetato/fosfato, pH 5, contendo 5M de NaCl para obter uma concentração de NaCl a 2M e, em seguida carregado em uma coluna de ToyoPearlButyl 650M, lavado sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, NaCl a 2 M, pH 4,4 ± 0,1 e 10 mM de acetato/fosfato, 2,5 M NaCl, pH 5,0 ( tampão A), e em seguida eluído em um gradiente linear de 100% a 32% de tampão A e 0% a 68% de tampão B (10 mM de acetato/fosfato, pH 5,0) seguida por uma mistura de 32% do tampão A e 68% do tampão B. O eluato de ToyoPearl Butyl 650M teve o tampão trocado por 20 mM de NaOAc/HOAc, 50 mM de NaH2PO4, 30 mM de arginina HCl, 2% (p/v) de sorbitol, pH 5,4 e opcionalmente ajustada a uma concentração final de 3 mg/mL de GALNS. O tampão trocado e a concentração de GALNS ajustada foi filtrada através de um filtro viral (DV20) e um filtro de DNA (Mustang Q) para remover qualquer vírus residual e DNA. Tween-20 (também conhecido como Polissorbato 20 ou PS20) foi adicionado a uma concentração final de 0,01% (p/v),resultando na Substância da Droga a Granel (BDS). A BDS foi armazenada a 2 a 8 °C ou congelada.

[00202] A purificação da GALNS recombinante humana é descrita em detalhe abaixo, e a purificação da GALNS recombinante humana seguindo procedimentos modificados a partir dos protocolos acima são descritas em detalhe abaixo.

[00203] A enzima GALNS recombinante humana foi expressa em células G71S, tal como descrito no Exemplo III e purificada como descrito no Exemplo V ou Exemplo VI. A enzima GALNS recombinante humana da invenção pode ser comparada com outras preparações documentadas de GALNS. Masue et al., J. Biochem. 110:965-970, 1991 descreveram a purificação e caracterização de GALNS da placenta humana. A enzima purificada foi encontrada por ter uma massa molecular de 120 kDa, que consiste em polipeptídeos de 40 kDa e 15 kDa, o último dos quais foi mostrado por ser uma glicoproteína. Assim, a enzima GALNS de Masue et al. parece corresponder à forma processada representada na Figura 5. Bielicki et al., Biochem. J. 279:515-520, 1991 descreveram a purificação e caracterização daGALNS do fígado humano. Quando analisada por SDS-PAGE, a enzima tinha uma massa molecular de 70 kDa em condições não redutoras e massas moleculares de 57 kDa, 39 kDa e 19 kDa sob condições redutoras. Bielicki et al., Biochem J. 311: 333-339, 1995 descreveu a purificação e caracterização da GALNS recombinante humana a partir de células de ovário de hamster chinês. A enzima purificada em SDS- PAGE mostrou ter uma massa molecular de 58 a 60 kDa em condições não redutoras e massas moleculares de 55 a 57 kDa, 39 kDa e 38 kDa sob condições redutoras. Assim, o Bielicki et al. as enzimas GALNS parecem corresponder a uma mistura da forma pré-processada (precursor) da enzima e a forma processada representada na Figura 5. Em contraste, a enzima GALNS recombinante humana da invenção consiste quase inteiramente na forma precursora da enzima (ver Figura 9 e Figura 12), ou, predominantemente (ou seja, pelo menos, cerca de 85%) da forma precursora da enzima (ver Figura 10).

IV. ENZIMAS DE SULFATASE LISOSSOMAIS E DOENÇAS DE ARMAZENAMENTO LISOSSOMAL

[00204] A enzima de sulfatase lisossomal é uma enzima de comprimento completo ou qualquer fragmento, variante, mutante ou derivado da mesma, que retém pelo menos uma quantidade substancial (por exemplo, pelo menos cerca de 50%, preferencialmente pelo menos cerca de 75%, e mais preferencialmente menos pelo menos cerca de 90%), substancialmente toda, ou toda a atividade terapêutica ou biológica (por exemplo, atividade de sulfatase) da enzima.

[00205] Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal é uma que, se não for expressa ou produzida, ou se uma redução substancial na expressão ou produção, daria origem a uma doença, incluindo mas não se limitando a, doenças de armazenamento lisossomal. Em algumas modalidades, a enzima de sulfatase lisossomal é uma que, se não for expressa ou produzida, ou se uma redução substancial na expressão ou produção, não pode dar origem a uma doença, mas cuja ausência ou redução da expressão ou a produção está associada com a doença, incluindo, mas não se limitam a, doenças de armazenamento lisossomal. Preferencialmente, a enzima de sulfatase lisossomal é derivada ou obtida a partir de um ser humano.

[00206] Preferencialmente, no tratamento de doenças de armazenamento lisossomal, a enzima de sulfatase lisossomal é uma enzima que se encontra em uma célula que não se expressa ou produzida ou é substancialmente reduzida na expressão ou produção, daria origem a uma doença de armazenamento lisossomal. Como alternativa, no tratamento de doenças de armazenamento lisossomal, a enzima sulfatase lisossomal é uma enzima cuja ausência ou expressão substancialmente reduzida ou produção está associada com a doença, embora a sua falta ou expressão substancialmente reduzida ou produção, não pode por si só dar origem à doença. Preferencialmente, a enzima de sulfatase lisossomal é derivada ou obtida a partir de um ser humano.

[00207] Preferencialmente, a enzima é uma enzima de sulfatase lisossomal, tais como arilsulfatase A (ARSA) (número de acessão ao GenBank NP_000478 (isoforma a), número de acessão GenBank NP_001078897 (isoforma b) e outras variantes), arilsulfatase B/N- acetilglucosamina 4-sulfatase (ARSB) (Número de acessão ao Genbank P15848), iduronato-2-sulfatase (IDS) (número de acessão ao GenBank NP_000193 (isoforma a), número de acessão ao GenBank NP_006114 (isoforma b)), sulfamidase/heparina-N -sulfatase (SGSH) (número de acessão ao GenBank NP_000190), N-acetilglucosamina-sulfatase (G6S) (número de acessão GenBank NP_002067) e Galactose 6- sulfatase/N-acetilgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) (número de acessão ao GenBank NP_000503 ). Uma tabela de doenças de armazenamento lisossomal e as enzimas de sulfatase lisossomais deficiente aqui, quais são mais úteis como agentes terapêuticos, é dada a seguir: Doença de Armazenamento Lisossomal Deficiência de Sulfatase Lisosomal Síndrome de Hunter de mucopolissacaridose tipo II Iduronato-2-sulfatase Síndrome de Sanfilippo de mucopolissacaridose tipo IIIA Sulfamidase/heparin-N- sulfatase Síndrome de Sanfilippo de mucopolissacaridose tipo IIID N- acetilglicosamina 6-sulfatase Síndrome de Morquio do mucopolissacaridose tipo IVA N- acetilgalactosamina-6-sulfatase Mucopolissacaridose tipo VI N- acetilgalactosamina 4-sulfatase Leucodistrofia metacromática (DLM) Arilsulfatase A Deficiência de Sulfatases Múltipla (MSD) Várias sulfatases

[00208] Em modalidades preferidas, a enzima de sulfatase lisossomal é uma enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante produzida por uma linhagem celular deficiente em acidificação endossomal. Em modalidades mais preferidas, a enzima de sulfatase lisossomal humana recombinante é ativo e tem um elevado nível de oligossacarídeos fosforilados, como especificado em "DEFINIÇÕES". Na maioria das modalidades preferidas, a enzima de sulfatase lisossomal é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante altamente fosforilada ativa (GALNS).

[00209] Deste modo, as doenças de armazenamento lisossomal que podem ser tratadas ou prevenidas pelos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Leucodistrofia Metacrômica ou MLD, síndrome de Maroteaux-Lamy ou MPS VI, síndrome de Hunter ou MPS II, síndrome de Sanfilippo A ou MPS IIIa, síndrome de Sanfilippo D ou MPS IIId, e síndrome de Morquio A ou MPS IVa. Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima de sulfatase lisossomal é tal que a sua deficiência causa a síndrome de Morquio A ou MPS IVa. Em outra modalidade particularmente preferida, a enzima de sulfatase lisossomal é tal que a sua deficiência está associada com uma doença de armazenamento lisossomal humana, tais como Deficiência de Sulfatase Múltipla ou MSD.

[00210] Deste modo, conforme a tabela acima, para cada uma das doenças da enzima de sulfatase lisossomal que compreenderia preferencialmente uma enzima de sulfatase lisossomal específica ativa deficiente na doença. Por exemplo, por métodos que envolvem MPS II, a enzima preferida é iduronato-2-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIIA, a enzima preferida é sulfamidase/heparina-N- sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIID, a enzima preferida é a N-acetilglucosamina 6-sulfatase. Métodos que envolvem a MPS IVA, a enzima preferida é galactose 6-sulfatase/N-acetilgalactosamina-6- sulfatase. Para os métodos que envolvem MPSVI, a enzima preferida é N-acetilgalactosamina 4-sulfatase. Para os métodos que envolvem Leucodistrofia metacromática (MLD), a enzima preferida é arilsulfatase A. Para os métodos que envolvem Deficiência de Sufatase Múltipla (MSD), a enzima pode ser arilsulfatase A, arilsulfatase B/N- acetilglucosamina 4-sulfatase, iduronato-2-sulfatase, sulfamidase/heparina de N-sulfatase, N-acetilglucosamina-sulfatase ou 6-sulfatase/N-acetilgalactosamina-6-sulfatase galactose, e a enzima preferida é 6-sulfatase/N-acetilgalactosamina-6-sulfatase galactose.

V. MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IVA (SÍNDROME DE MORQUIO, MPS IVA)

[00211] A mucopolissacaridose tipo IVA (Síndrome de Morquio, MPS IVa) é uma doença autossômica recessiva hereditária que pertence ao grupo de doenças de armazenamento de mucopolissacarídeos. A síndrome de Morquio é causada por uma deficiência de uma enzima lisossomal necessária para a degradação de dois glicosaminoglicanos (GAGs), sulfato de queratano (KS) e sulfato de condroitina-6-(C6S). Especificamente, MPS IVa é caracterizada pela ausência da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS), e a excreção de KS na urina. A falta de GALNS resulta na acumulação de quantidades anormalmente elevadas de mucopolissacarídeos na cartilagem de hialina, um componente principal do tecido esquelético. Todos os pacientes têm uma displasia esquelética sistêmica. Outros sintomas variam em gravidade de paciente para paciente, e pode incluir a perda de audição, a catarata, a instabilidade vertebral, doença cardíaca valvular e problemas respiratórios, entre outros.

[00212] GALNS hidrolisa ligações de éster sulfato da galactose-6- sulfato, a partir de KS e N-acetilgalactosamina-6-sulfato de C6S. A GALNS humana é expressa como uma proteína precursora de 55 a 60 kDa com apenas 2 sítios de glicosilação ligados a asparagina potenciais. Manose-6-fosfato (M6P) faz parte dos oligossacarídeos presentes na molécula de GALNS. M6P é reconhecido por um receptor na superfície da célula lisossomal e, por conseguinte, é essencial para a absorção eficiente de GALNS.

[00213] Como todas as sulfatases, GALNS precisa ser processada por uma enzima ativadora de formilglicina (FGE) codificada pelo gene do factor de modificação da sulfatase 1 (SUMF1) para obter atividade. Devido a esta etapa de ativação, que envolve a modificação pós- tradução de um resíduo de cisteína do sítio ativo de Cα-formilglicina (FGly), a sobre-expressão de sulfatases recombinantes pode levar tanto a produção de enzimas sulfatase com atividade específica baixa (isto é, uma mistura de enzimas de sulfatase ativadas e não ativadas) e com a título de produção baixo (isto é, degradação e/ou não secreção de sulfatases não ativadas).

[00214] Um objeto da presente invenção consiste em fornecer uma enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana altamente fosforilada ativa é útil para o tratamento da síndrome de Morquio e outras doenças, por exemplo, Deficiência de Sulfatase Múltipla (MSD), que são causadas por ou associadas a uma deficiência na enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase. Tal enzima N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana altamente fosforilada ativa tem a capacidade de localizar tecidos em que KS e C6S se acumulam, tem níveis de M6P adequados para a absorção eficiente, tem percentagem suficientemente elevada de FGly para a atividade da enzima, e tem níveis de produção relativamente elevados.

[00215] Deve ser entendido que os métodos da invenção aqui descritos são aplicáveis à produção de outras enzimas de sulfatase lisossomais, por exemplo, arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B/N- acetilglucosamina 4-sulfatase (ARSB), iduronato-2- sulfatase (IDS), sulfamidase/heparina-N-sulfatase (SGSH) e N-acetilglucosamina- sulfatase (G6S), úteis para o tratamento de doenças de armazenamento lisossomal que são causadas ou caracterizadas pela sua deficiência destas.

VI. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

[00216] As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser administradas por uma variedade de vias. Para as preparações orais, as enzimas de sulfatase lisossomais podem ser usadas sozinhas ou em combinação com aditivos apropriados para fazer comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com ligantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegradores, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose de sódio; com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e, se desejado, com diluentes, agentes de tamponamento, agentes umectantes, conservantes e agentes aromatizantes.

[00217] As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser formuladas em preparações para injeção por dissolução, suspensão ou emulsificação delas em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros semelhantes, glicerídeos de ácido alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propilenoglicol, e, se desejado, com aditivos convencionais tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabilizadores e conservantes.

[00218] As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser usadas nas formulações de aerossol para serem administradas através de inalação. As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser formuladas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.

[00219] Além disso, as enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser feitas em supositórios pela mistura com uma variedade de bases, tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser administradas por via retal por meio de um supositório. O supositório pode incluir veículos tais como manteiga de cacau, carboceras, polietileno glicóis que se fundem à temperatura do corpo, no entanto, são solidificados à temperatura ambiente.

[00220] As formas de dosagem unitárias das enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção para administração oral ou retal tais como xaropes, elixires e suspensões podem ser fornecidas, em que cada dosagem unitária, por exemplo, colher de chá cheia, colher de sopa, comprimido ou supositório contém uma quantidade predeterminada de uma enzima de sulfatase lisossomal contendo agente ativo. Do mesmo modo, as formas de dosagem unitárias para administração intravenosa ou injeção podem compreender a enzima de sulfatase lisossomal como uma solução em água estéril, solução salina normal ou outro Carreador farmaceuticamente aceitável.

[00221] Em uso prático, as enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção podem ser combinadas como o ingrediente ativo em mistura íntima com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis convencionais, de acordo com técnicas de composição farmacêutica. O Carreador, diluente ou excipiente pode ter uma ampla variedade de formas dependendo da forma preferível de preparação desejada para administração, por exemplo, oral ou parentérica (incluindo intravenosa). Na preparação das composições de enzimas de sulfatase lisossomais para a forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos usuais pode ser empregado, tal como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e semelhantes no caso de preparações líquidas orais, por exemplo, suspensões, elixires e soluções, ou veículos tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e semelhantes no caso de preparações sólidas orais, por exemplo, pós , cápsulas duras e moles e comprimidos, com as preparações orais sólidas sendo mais preferidas as preparações líquidas.

[00222] A presente invenção fornece formulações de qualquer uma das preparações de enzima GALNS aqui descritas, opcionalmente, a uma concentração de cerca de 0,1 a 5 mg/mL (ou 0,5 a 1,5 mg/ml) de proteína e, opcionalmente, a um pH de cerca de 5 a 5,8, que compreende (i) uma quantidade do tampão de fosfato eficaz para reduzir a desfosforilação da referida enzima GALNS, e (ii) uma quantidade estabilizadora de um ou mais estabilizadores selecionados entre o grupo que consiste em sais de aminoácidos, tampões de aminoácidos, tensoativos e polióis. Em algumas modalidades, a formulação pode compreender um segundo agente de tamponamento. Em certas modalidades, as formulações compreendem qualquer uma das preparações da enzima GALNS humana recombinante purificada aqui descritas, em um tampão de fosfato em uma concentração entre cerca de 25 mM e cerca de 75 mM, um tampão de acetato com uma concentração entre cerca de 10 mM e cerca de 30 mM, e um estabilizador que reduz a agregação de proteínas. Em algumas modalidades, a formulação compreende um sal de arginina ou histidina ou tampão, e opcionalmente um tensoativo não iônico e, opcionalmente, um poliol trihídrico ou superior (álcool de açúcar). Em modalidades específicas, a formulação compreende um sal de arginina ou tampão, um polissorbato, opcionalmente, polissorbato 20, e um sorbitol. Em qualquer uma destas modalidades, o tampão de fosfato pode ser NaH2PO4. Em qualquer uma destas modalidades, o tampão de acetato pode ser NaOAc/HOAc.

[00223] O segundo agente de tamponamento pode ser qualquer agente adequado para manter o pH dentro da faixa desejada. Os tampões adequados incluem Tris, citrato, succinato, acetato, gluconato, ou outros tampões de ácido orgânico. Em algumas modalidades, o estabilizador é um sal de aminoácido ou tampão, opcionalmente, um sal ou um tampão de arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ou ácido glutâmico. Em algumas modalidades, o estabilizador é um tensoativo, opcionalmente, um tensoativo não iônico. Os tensoativos adequados incluem polissorbatos, por exemplo, polissorbato 20 ou polissorbato 80, poloxâmeros, por exemplo, polixâmero 188 ou 184, derivados de polioxietileno, derivados de polioxipropileno, monolaurato de sódio, e SDS. Os exemplos não limitantes de tensoativos não iônicos conhecidos incluem álcoois ou fenóis de cadeia linear ou ramificada primários ou secundários com óxidos de alquileno, geralmente óxido de etileno e, geralmente 6 a 30 grupos de óxido de etileno. Outros tensoativos não iônicos conhecidos incluem mono-ou di-alquil alcanolamidas, poliglucosídeos de alquila, e amidas de ácidos graxos polihidroxílicos. Exemplos não limitantes de tensoativos aniônicos conhecidos incluem o sódio, amônio, e sais de mono-, di-, e tri- etanolamina de sulfatos de alquila, sulfatos de éter de alquila, sulfonatos de alcarila, succinatos de alquila, sulfosuccinato de alquila, sarcosinatos de N-alcoíla, fosfatos de alquila, alquil-éter-fosfatos, carboxilatos de alquil éter, e α-olefina-sulfonatos. Os grupos alquila contêm geralmente de 8 a 18 átomos de carbono e podem ser insaturados. Os sulfatos de éter de alquila, fosfatos de éter de alquila, e carboxilatos de éter de alquila podem conter 1 a 10 unidades de óxido de etileno ou óxido de propileno por molécula, e contêm preferencialmente 2 a 3 unidades de óxido de etileno por molécula. Tensoativos aniônicos conhecidos incluem sulfato de sódio ou de lauril amônio e sulfato de éter de sódio ou de lauril amôinio. Exemplos não limitantes de tensoativos anfotéricos incluem óxidos de alquil aminas conhecidos, alquil betainas, alquil amidopropil betainas, alquil sulfobetaínas, glicinatos de alquila, alquil carboxiglicinatos, alquil anfopropionatos, alquil amidopropil hidroxisultaínas, tauratos de acila, glutamatos de acila e em que os grupos alquila e acila têm de 8 a 18 átomos de carbono.

[00224] Em algumas modalidades, o estabilizador é um poliol ou açúcar, preferencialmente, um álcool de açúcar tri-hídricos ou superior. Os polióis adequados incluem eritritol, arabitol, maltitol, celobiitol, lactitol, manitol, treitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e glicerina. Os polióis conhecidos também incluem álcoois derivados de lactose, trealose, estaquiose, e açúcares não redutores conhecidos incluem sacarose, trealose, sorbose, melezitose e rafinose. Os açúcares conhecidos também incluem xilose, manose, glucose, frutose, dissacarídeos tais como lactose, maltose, sacarose, trissacarídeos tais como a rafinose, e polissacarídeos tais como dextrano.

[00225] A invenção também fornece um método de prevenção da desfosforilação da enzima GALNS recombinante humana purificada, compreendendo misturar a referida enzima GALNS e uma quantidade de um tampão de fosfato eficaz para reduzir a desfosforilação, opcionalmente, para uma concentração final entre cerca de 25 mM e cerca de 75 mM de tampão de fosfato. Em algumas modalidades, a enzima GALNS recombinante humana purificada também é misturada com um segundo agente de tamponamento, incluindo qualquer dos agentes descritos acima. Em algumas modalidades, a enzima também é misturada com uma quantidade estabilizadora de um ou mais estabilizadores selecionados entre o grupo que consiste em sais de aminoácidos, tampões, tensoativos de aminoácidos e polióis. Em modalidades exemplares, a quantidade de desfosforilação é reduzida em comparação com uma formulação da mesma enzima em tampão de fosfato a 1 mM, por exemplo, quando testada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses de armazenamento à temperatura ambiente (por exemplo, 25°C). Em modalidades específicas, o teste de estabilidade acelerado é realizado depois do armazenamento durante tais períodos de tempo, a 40°C.

[00226] Em certas modalidades, a redução na desfosforilação na formulação de GALNS (em comparação com o tampão de fosfato a 1 mM) pode ser pelo menos cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, a cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15% , cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40% ou cerca de 50% ou superior. Em outra modalidade, o nível de manose 7 bis-fosforilada (BPM7) na GALNS na formulação é de cerca de 25% a cerca de 40%, ou cerca de 30% a 35%.

[00227] Em modalidades de qualquer uma das formulações precedentes e métodos, a enzima GALNS pode ser uma enzima de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante (GALNS) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idênticas aos aminoácidos 27 a 522 da SEQ ID NO: 4, e (i) tendo uma pureza de pelo menos cerca de 95%, como determinado pela coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições não redutoras, (ii) que tem pelo menos cerca de 80% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 em Cα-formilglicina (FGly), e (iii) possuindo entre 0,5 a 0,8 cadeias de oligomanose bis- fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, em que pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% da referida enzima GALNS está na forma de precursor, tal como determinado por coloração com azul de Coomassie, quando submetida a SDS-PAGE sob condições redutoras, ou através de eletroforese em gel capilar SDS (SDS-CGE).

[00228] Com relação às vias de administração transdérmicas, os métodos para administração transdérmica de drogas são divulgados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edição, (Gennaro et al., Eds. Mack Publishing Co., 1985). Adesivos dérmicos ou de pele são um meio preferido para a administração transdérmica de enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção. Adesivos preferencialmente fornecem um intensificador de absorção, tais como DMSO, para aumentar a absorção das enzimas de sulfatase lisossomais. Outros métodos para a administração transdérmica de drogas são divulgados nas Patentes US 5.962.012, 6.261.595, e 6.261.595, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.

[00229] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, Carreadores ou diluentes, são comercialmente disponíveis. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ajuste de pH e de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade, estabilizadores, agentes umectantes e similares, estão também disponíveis comercialmente.

[00230] Em cada um destes aspectos, as composições das enzimas de sulfatase lisossomais incluem, mas não estão limitados a, composições apropriadas para administração oral, retal, tópica, parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, e intravenosa), pulmonar (inalação nasal ou bucal), ou administração nasal, embora a via mais adequada em qualquer caso determinado irá depender, em parte, da natureza e gravidade das condições a serem tratadas e da natureza do ingrediente ativo. Exemplos de vias de administração são as vias oral e intravenosa. As composições das enzimas de sulfatase lisossomais podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia.

[00231] Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e as cápsulas representam a forma unitária mais vantajosa de dose ora vantajosal, caso em que os veículos farmacêuticos sólidos são obviamente empregados. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosas ou não aquosas padrão. A percentagem de uma enzima de sulfatase lisossomal ativa nestas composições pode, claro, ser variada e pode convenientemente estar entre cerca de 2 por cento a cerca de 60 por cento do peso da unidade.

[00232] As composições da enzima de sulfatase lisossomal da presente invenção podem ser administradas encapsuladas em ou ligadas a envelopes virais ou vesículas, ou incorporadas em células. As vesículas são partículas micelulares que são geralmente esféricos e que são frequentemente lipídicas. Os lipossomas são vesículas formadas a partir de uma membrana de dupla camada. Vesículas apropriadas incluem, mas não estão limitados a, vesículas unilamelares e vesículas lipídicas multilamelares ou lipossomas. Tais vesículas e lipossomas podem ser feitas a partir de uma grande variedade de lípidos de fosfolípidos ou compostos, tais como a fosfatidilcolina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina, glicolípidos, gangliósidos, etc, usando técnicas convencionais, tais como os descritos em, por exemplo, Patente US 4.394.448. Tais vesículas ou lipossomas podem ser usadas para administrar as enzimas de sulfatase lisossomais intracelularmente e para fornecer as enzimas de sulfatase lisossomais para os órgãos alvo. A libertação controlada de uma enzima de sulfatase lisossomal de interesse pode também ser conseguida utilizando encapsulação (ver, por exemplo, Patente US 5.186.941).

[00233] Qualquer via de administração que dilui a composição de enzima de sulfatase lisossomal para a corrente sanguínea, ou, preferencialmente, pelo menos fora da barreira sangue-cérebro, pode ser usada. Preferencialmente, a composição de enzima de sulfatase lisossomal é administrada perifericamente, mais preferencialmente por via intravenosa ou por cateter cardíaco. Injeções intrajugulares e intracarotídeas também são úteis. As composições de enzimas de sulfatase lisossomais podem ser administradas localmente ou regionalmente, tais como por via intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Em um aspecto, as composições de enzimas de sulfatase lisossomais são administradas com um ou mais carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00234] As pessoas versadas na técnica irão prontamente compreender que os níveis de dose podem variar em função da enzima de sulfatase lisossomal específica, a gravidade dos sintomas e da susceptibilidade do indivíduo a efeitos secundários. As dosagens preferidas para uma determinada enzima de sulfatase lisossomal são prontamente determináveis por aqueles versados na técnica por uma variedade de meios incluindo, mas não limitado a, resposta à dose e avaliações farmacocinéticas realizados em pacientes, em testes com animais e in vitro.

[00235] As dosagens a serem administradas também podem depender das necessidades individuais, do efeito desejado, a enzima de sulfatase lisossomal específica usada, e da via de administração escolhida. As dosagens de uma enzima de sulfatase lisossomal variam de cerca de 0,2 pmol/kg a cerca de 20 nmol/kg, as dosagens preferidas variam de 2 pmol/kg a 2 nmol/kg, e dosagens particularmente preferidas variam de 2 pmol/kg a 200 pmol/kg. Alternativamente, as dosagens da enzima de sulfatase lisossomal podem ser na faixa de 0,01 a 1000 mg/kg, as doses preferidas podem estar na faixa de 0,1 a 100 mg/kg, e dosagens particularmente preferidas variam de 0,1 a 10 mg/kg. Estas dosagens serão influenciadas, por exemplo, e não por limitação, pela enzima de sulfatase lisossomal específica, a forma da composição farmacêutica, a via de administração, e o local de ação da enzima de sulfatase lisossomal específica.

[00236] As enzimas de sulfatase lisossomais da presente invenção são úteis para intervenção terapêutica, profilática e de diagnóstico em animais, e em particular em seres humanos. Enzimas de sulfatase lisossomais podem mostrar acumulação preferencial em tecidos particulares. As indicações médicas preferidas para utilizações de diagnóstico incluem, por exemplo, qualquer condição associada a um órgão-alvo de interesse (por exemplo, pulmão, fígado, rim, baço).

[00237] Os métodos objeto encontram aplicação no tratamento de uma variedade de diferentes condições de doença. Em certas modalidades, de particular interesse é a utilização dos métodos objeto em condições de doença em que uma enzima de sulfatase lisossomal com atividade desejada foi previamente identificada, mas em que a enzima de sulfatase lisossomal não é adequadamente entregue para o sítio alvol, área ou compartimento para produzir um resultado terapêutico totalmente satisfatório. Com tais enzimas de sulfatase lisossomais, os métodos objeto de produção de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas podem ser usados para melhorar a eficácia terapêutica e índice terapêutico da enzima de sulfatase lisossomal.

[00238] O tratamento destina-se a abranger qualquer resultado benéfico para um indivíduo associado com a administração de uma enzima de sulfatase lisossomal incluindo uma menor probabilidade de contrair uma doença, prevenção de uma doença, retardo, parada ou inversão, progressão de uma doença ou uma melhoria dos sintomas associados com a condição da doença que afeta o hospedeiro, onde a melhoria ou benefício é usado em um sentido amplo para se referir a, pelo menos, uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, sintomas, associados com a condição patológica a ser tratada, tais como inflamação e dor associada. Como tal, o tratamento inclui também situações em que a condição patológica, ou, pelo menos, sintomas associados com a mesma, são completamente inibidos, por exemplo, impedidos de acontecer ou interrompidos, por exemplo, terminados, de modo que o hospedeiro não sofra da condição patológica, ou pelo menos já não sofre dos sintomas que caracterizam a condição patológica.

[00239] Uma variedade de hospedeiros ou indivíduos é tratável de acordo com os métodos objeto. Geralmente tais hospedeiros são "mamíferos" ou "mamífero", em que estes termos são usados amplamente para descrever organismos que estão dentro da classe mammalia, incluindo as ordens carnívoras (por exemplo, cães e gatos), (por exemplo, roedores (ex., camundongos, porquinhos da índia, e ratos), e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés e macacos). Em muitas modalidades, os hospedeiros serão os seres humanos.

[00240] Tendo agora descrito genericamente a invenção, a mesma pode ser mais facilmente compreendida através da seguinte referência aos seguintes exemplos, que fornecem exemplos de protocolos para a produção e purificação de enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas e à sua utilização no tratamento de doenças lisossomais de armazenamento. Os exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma. Esforços têm sido feitos para assegurar a exatidão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc), mas alguns erros experimentais e desvios devem, evidentemente, ser permitidos.

EXEMPLOS EXEMPLO I VETORES DE EXPRESSÃO DE MAMÍFERO PARA O FATOR DE MODIFICAÇÃO DA SULFATASE HUMANA 1 (SUMF1) E N- ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS)

[00241] O objetivo foi construir vetores de expressão de mamíferos adequados para produção em células transfectadas de modo estável quantidades adequadas das enzimas de sulfatase lisossomal ativas com níveis de fosforilação aprimorados.

[00242] O cDNA do fator de modificação da sulfatase humana 1 (SUMF1) de comprimento completo (ver o Pedido de Patente US 2005/0123949, data de publicação 9 de junho de 2005, e US 2004/0229250, data de publicação 8 de novembro de 2004, ambos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade), que codifica um peptídeo de 374 aminoácidos,foi clonado no vetor de expressão mamífero cDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contém o promotor intensificador de CMV humano e um sítio de clonagem múltiplo. A terminação do transcripto eficiente foi garantida pela presença da sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. O marcador de seleção foi um gene de resistência à zeocina sob o controle do promotor EM-7 e sequência de poliadenilação precoce SV40. O plasmídeo resultante foi designado pcDNA4 SUMF1. O polinucleotídeo de SUMF1 humana (SEQ ID NO: l) e sequências de polipeptídeo (SEQ ID NO:2) são mostrados na Figura 1 e Figura 2, respectivamente.

[00243] O cDNA de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS) de comprimento total (ver Tomatsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (2) :677-683, 1991), que codifica um polipeptídeo de 522 aminoácido incluindo um peptídeo de sinal de 26 aminoácidos, foi clonado no vetor de expressão mamífero pCIN (BioMarin), que contém o Promotor intensificador de CMV humano ligado ao íntron de IVS2 de β-globina de coelho e um sitio de clonagem múltiplo. A terminação do transcripto eficiente foi garantida pela presença da sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. O marcador de seleção foi um gene de neomicina-fosfotransferase, que transporta uma mutação pontual para diminuir a eficiência da enzima. O marcador atenuado foi ainda mais prejudicado com o promotor de HSV- tk fraco. O plasmídeo resultante foi designado pCIN 4A. O polinucleotídeo GALNS humano (SEQ ID NO: 3) e sequências de polipeptídeo (SEQ ID NO: 4) são apresentadas na Figura 3 e Figura 4, respectivamente.

[00244] A fim de aumentar os níveis de expressão de SUMF1 e GALNS, elementos de andaime/região de ligação de matriz (MAR) (ver Mermod et al., Patente US 7.129.062) foram clonados nos plasmídeos de expressão de SUMF1 e GALNS.

[00245] BMAR SUMF1 foi preparada pela digestão de MAR (Selexis) cheia de P <1_68 X_X NcoI com BamHI e HincII, e em seguida pela inserção do fragmento MAR liberado na pcDNA4 SUMF1 digerida com BglII e NruI.

[00246] PMAR SUMF1 foi feita pela digestão de SV40 EGFP (Selexis) cheia de P <1_68 NcoI (MAR) com HindIII e XbaI para remover o gene EGFP e em seguida inserindo o gene SUMF1, que foi liberado da pcDNA4 SUMF1 pela digestão com HindIII e XbaI.

[00247] BMAR 4A foi preparado pela digestão de BMAR SUMF1 com PmeI e SpeI para remover o gene SUMF1, e, em seguida, inserir o gene GALNS, que foi libertado da pCIN 4A pela digestão com PmeI e SpeI.

[00248] PMAR 4A foi preparada pela digestão de SV40 EGFP (Selexis) cheia de P <1_68 NcoI (MAR) com HindIII e XbaI para remover o gene EGFP e em seguida inserindo o gene GALNS, que foi liberado da pCIN 4A pela digestão com HindIII e XbaI.

[00249] O cDNA de GALNS humana de comprimento total também foi clonado no vetor de expressão mamífero pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). pCDNA4 SUMF1 foi digerido com HindIII e XbaI para remover o cDNA da SUMF1 e pCIN 4A foi digerido com HindIII e XbaI para isolar o cDNA de GALNS. O fragmento de cDNA de GALNS HindIII/XbaI foi ligado ao fragmento HindIII/XbaI do vetor pcDNA4. O plasmídeo resultante foi designado pcDNA4-4A.

[00250] A integridade do gene GALNS nos vetores de expressão pCIN 4A, BMAR e pCDNA4-4A foi confirmada por mapeamento de restrição usando enzimas obtidas a partir de New England Biolabs. O vetor de expressão PMAR 4A não foi mapeado.

[00251] A estrutura da forma totalmente processada da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS) está representada na Figura 5. GALNS é expressa como um polipeptídeo de 522 aminoácidos com uma sequência de peptídeo de sinal de 26 aminoácidos. Um polipeptídeo de GALNS de 496 aminoácidos é segregado como uma forma pré-processada (precursor) da enzima tendo um peso molecular de cerca de 55-60 kDa. Na GALNS ativa, o resíduo de cisteína na posição 53 do precursor ou polipeptídeo GALNS totalmente processado (correspondente à posição 79 do polipeptídeo GALNS de comprimento completo) foi convertido em Cα-formilglicina (FGly) pelo fator de modificação da sulfatase 1 (SUMF1). No lisossoma, a GALNS é clivada depois da posição 325 do polipeptídeo de GALNS totalmente processado, resultando em fragmentos de peptídeos de GALNS de cerca de 40 kDa e 19 kDa. Estes peptídeos de GALNS são unidos por uma ponte de dissulfureto entre os resíduos de cisteína (C) nas posições 282 e 393 dos polipeptídeos de GALNS totalmente processados. Existem dois sítios de glicosilação ligados a N canônicos nas posições 178 e 397 dos polipeptídeos de GALNS totalmente processados. A manose 7 bis-fosforilada (BPM7), compreendendo resíduos de 2 manose-6-fosfato, foi encontrada em N178, mas não em N397.

EXEMPLO II LINHAGENS CELULARES G71S COEXPRESSANDO O FATOR DE MODIFICAÇÃO DA SULFATASE HUMANA 1 (SUMF1) E N- ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS)

[00252] O objetivo era desenvolver linhagens celulares capazes de produzir enzimas de sulfatase lisossomais ativas com níveis de fosforilação aprimorados.

[00253] Células G71 (Rockford K. Draper) foram obtidos diretamente a partir de CHO-K1 (ATCC CCL-61). A linhagem celular G71 é uma mutante sensível à temperatura de CHO-K1 em relação à acidificação dos endossomas, o que tem sido observado para dar origem a diferenças na secreção de proteína total e a fosforilação em resíduos de manose de várias enzimas a temperaturas elevadas (Park et al., Somat Cell Mol. Genet. 17 (2): 137-150, 1991; Marnell et al., J. Cell Biol 99 (6): 1907-1916, 1984).

[00254] As células G71 foram mantidas a 34°C em meio BioWhittaker C UltraCHO suplementado com 2,5% de soro fetal de vitelo, 2 mM de glutamina, gentamicina e anfotericina.

[00255] A fim de permitir uma utilização mais fácil das linhagens celulares para a produção da proteína, as células G71 aderentes foram pré-adaptadas ao meio de crescimento sem soro, utilizando um protocolo para adaptação dependente de ancoragem, células de mamíferos dependentes de soro para a cultura em suspensão livre de soro de alta densidade (Sinacore et al., Mol. Biotechnol. 15 (3) :249-257, 2000), resultando linha celular adapatada à cultura em suspensão sem de soro, G71S. Como alternativa, as células G71 aderentes, depois de terem sido transfectadas de forma estável, tal como descrito abaixo, podem ser adaptadas ao meio de crescimento sem soro como descrito em Sinacore et al.

[00256] Combinações pareadas da SUMF1 humana e vetores de expressão de GALNS humana (Exemplo I), ou pcDNA4 SUMF1 mais pCIN4 4A, BMAR SUMF1 mais BMAR 4A, ou PMAR SUMF1 mais PMAR 4A, foram transfectadas após o protocolo MARtech II como descrito por Selexis em células G71S cultivadas em meio de cultura suplementado com solução de Antibiótico-Antimicótico (100 IU de Penicilina, 10 mg de estreptomicina, 25 μg de Anfotericina B, Cellgro). Agrupamentos de transfectantes foram cultivados em meio UltraCHO (Cambrex), suplementado com 5% de soro fetal bovino Y-irradiado (FBS, JRH), 200 μg/mL de G418 (AG Scientific) e 200 μg/mL de Zeocina (Invitrogen), e clonados pela diluição limitante em placas de 96 poços no mesmo meio de crescimento. O crescimento do clone foi monitorado por imagens de Cell Screen (Innovatis). Todos os clones foram triados usando uma ELISA de atividade de captura de enzima para GALNS activas (ver Exemplo IV). A produtividade celular foi calculado dividindose a atividade de captura de enzima de ELISA epela atividade de GALNS por crescimento celular (Vi-Cell, Beckman Coulter), por dia, durante um período de 4 dias.

[00257] 202 clones de G71S foram gerados e triados para GALNS ativa: 86 clones co-transfectados com pcDNA4 SUMF1 mais pCIN 4A, 65 clones co-transfectados com BMAR SUMF1 mais BMAR 4A, e 51 clones co-transfectados com PMAR SUMF1 mais PMAR 4A. Os clones foram inicialmente inicializados com base nos altos níveis de GALNS ativa a partir das placas de cultura de tecido de 96 poços (Figura 6A). A atividade de GALNS foi medida usando uma ELISA de atividade de captura de enzima e representada em ng/mL (eixo y). O eixo x mostre as três condições de co-transfecção usadas para a expressão de SUMF1 e GALNS: promotor hCMV sem MAR, promotor hCMV com MAR, e promotor SV40 with MAR. cada barra representa um clone único da respectiva população. A densidade da célula não foi contabilizada nesta triagem de clone de 96 poços e nem todos os clones de G71S co- transfectados são exibidos nesta figura.

[00258] Os clones G71S produtores da GALNS com atividade mais alta foram escolhidos para análise da produtividade (Figura 6B). A produtividade celular foi medida diariamente em pg/célula/dia e obtida dividindo a atividade de GALNS pela densidade celular para aquele dia. Esta figura mostra o quarto dia (96 horas) após a semeação em 5x 105 células/frasco. Os clones foram testados quanto a GALNS usando uma ELISA de atividade de captura de enzima em pg/célula/dia (eixo y). Os controles positivos consistiram em GALNS que expressam clones de BHK e CHO (BioMarin). Cada barra vertical representa um único clone. A GALNS ativa foi produzida por clones de pCIN 4A, mas apenas marginalmente acima da base do ensaio.

[00259] A análise dos clones pela tela de 96 poços e ensaio produtividade de 4 dias demonstrou que a co-transfecção dos vetores de expressão com elementos MAR aumentou a produtividade dos clones G71S, em comparação com a co-transfecção de vetores de expressão sem elementos MAR. Os clones co-transfectadas BMAR 4A + BMAR SUMF1 demonstraram a geração de agrupamento rápido, rápido crescimento do clone, e capacidade de produzir GALNS mais do que 2 vezes mais ativas do que os clones de PMAR 4A de mais alta produção, e um até um aumento de 10 vezes em relação a clones CHO 4A e BHK 4A faltando elementos MAR.

[00260] Os clones G71S que expressam GALNS foram adapatados ao meio de crescimento livre de soro usando o protocolo indicado em Sinacore et al., Mol. Biotechnol. 15(3):249-257, 2000. A adaptação total foi feita na presença de ambos agentes de seleção (zeocina a 200 μg/mL e neomicina a 200 μg/mL). Os clones G71 que expressam GALNS cultivados em frascos T foram divididos como segue: (1) em um agitador de 125 mL com o meio Cambrex UltraCHO e 5% de FBS (lote # 8L2242); (2) em um agitador de 125 mL com o meio JRH 302M (meio de produção) e 5% de FBS; e (3) em frascos T como uma reserva (UltraCHO, 5% FBS). Uma vez que as culturas de suspensão foram estabelecidas, as células aderentes foram descartadas, e o desmame de FBS foi iniciado. Quando a taxa de crescimento retornou para > 0,5 (l/dia) por 3 passagens e a viabilidade foi > 95%, a concentração de FBS foi reduzida em 50%. As células foram deixadas em qualquer concentração de FBS determinada por um mínimo de 3 passagens. Uma vez adaptadas ao crescimento em 2,5% FBS, as células foram tomadas diretamente no meio livre de soro. As células foram depositadas em meio fresco com 10% (v/v) de DMSO. o derretimento experimental foi testado para garantir que as células sobreviveram ao processo de congelamento. Dois clones G71S que expressam GALNS a partir da transfecção de BMAR 4A + BMAR SUMF1, clones 4 e 5 levaram aproximadamente 15 passagens para adaptação à cultura de suspensão livre de soro. Um clone que expressa GALNS a partir da transfecção pcDNA4 SUMF1 mais pCIN 4A, C6, também foi isolado e adaptado para a cultura livre de soro.

[00261] As combinações pareadas dos vetores de expressão de GALNS humana e SUMF1 humana (Exemplo I), pcDNA4 SUMF1 mais pCDNA4-4A, foram transfectadas em células G71S basicamente como descrito acima, exceto 200 μg/mL de Zeocina (Invitrogen) foi usado para seleção. Seis clones expressando GALNS, C2, C5, C7, C10, C11 e C30, foram isolados e adaptados para cultura de suspensão livre de soro basicamente como descrito acima.

EXEMPLO III CULTURA EM GRANDE ESCALA DAS LINHAGENS CELULARES G71S EXRESSANDO N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS)

[00262] O objetivo era medir a produção da enzima a partir dos clones G71S expressando N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS). A cultura em suspensão sem soro adaptada às linhagens celulares G71S que coexpressam SUMF1 humana e GALNS humana foram cultivadas em grande escala e avaliadas quanto à produção de enzima de GALNS ativa.

[00263] Uma vez que a adaptação à cultura em suspensão sem soro foi relativamente rápida para a linhagem celular hospedeira G71S, decidiu-se que a produção poderia ser realizada em um biorreator WAVE operado em modo de perfusão. O biorreator WAVE permite uma maior flexibilidade em termos de volume de inoculo porque o aumento de escala pode ser feito diretamente no saco, reduzindo o risco de contaminação e acelerando a produção de material. A Figura 7 mostra o esquema de configuração do biorreator WAVE. O diagrama mostra, no modo de perfusão, que uma célula de carga controla o volume do meio no saco através da determinação do peso do saco e ajustando as taxas de alimentação e de coleta para manter o volume desejado. No saco de 10 L, o pH também é controlado para o ponto de ajuste desejado por uma sonda que é inserida dentro do saco.

[00264] O material dos clones G71S 4 e 5 expressando GALNS 4 e 5 foi produzido em escala de 1L. O pH da cultura não foi controlado nestes ensaios. A limitação operacional do saco WAVE é uma taxa de transferência de 3 volumes de recipiente por dia (VV/dia). A fim de evitar qualquer inativação do material, a taxa de perfusão da célula alvo específica (RPCA) foi de 0,3 nl/célula/dia, o que resulta em um tempo de residência médio de oito horas para as enzimas GALNS. Portanto, a densidade das células no saco foi mantida a aproximadamente 10 a 12 x 106 células/mL. A taxa de crescimento de clones 4 e 5 G71S que expressam GALNS foi de 0,16 e 0,20, respectivamente. Sangramentos para manter a densidade de células-alvo foram feitos diretamente a partir do saco.

[00265] O pH do fluido coletado foi ajustado para um pH entre 5,5 e 6,5 para manter a atividade enzimática, uma vez que GALNS foi mostrada previamente por ser estável no pH 6. Isto foi conseguido pela adição de um bolus temporizado de 5% em volume de tampão de citrato de sódio no pH 4,0 misturado em linha com a colheita saindo do reator. O líquido coletado ajustado foi armazenado a 4 °C antes do processamento a jusante. Os dois clones G71S 4 e 5 que expressam GALNS tem títulos médios de cerca de 4,2 mg/L, com uma produtividade associada específica de cerca de 1,25 pg/célula/dia.

[00266] Os clones G71S expressando GALNS, C2, C5, C6, C7, C10, C11 e C30, foram igualmente cultivados em grande escala e avaliados para a produção da enzima GALNS ativa.

EXEMPLO IV MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E ATIVIDADE DA N- ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS)

[00267] Ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs) foram desenvolvidos para medir a concentração e atividade da enzima GALNS dos clones G71S que co-expressam a SUMF1 humana e N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS).

ELISA de Atividade de Captura de Enzima

[00268] A ELISA de atividade de captura de enziam mede a atividade da enziam GALNS na fase sólida, seguindo a captura por um anticorpo específico anti-GALNS ligado a uma placa ELISA.

[00269] Tampões. Tampão A (Tampão de Carbonato): dissolver 3,09 gramas de Na2CO3 e 5,88 gramas de NaHCO3 em 900 mL de H2O deionizada (DI), depois adicionar H2O DI para um volume final de 1000 mL. Verificar que o pH está entre 9,4 e 9,6, depois esterelizar o filtro. Para revestir completamente uma microplaca de 96-poços com 100 μL por poço, diluir 19 μL de um anticorpo anti-GALNS em um tubo (12 mL). Tampão B (Tampão Bloqueador de ELISA e Tampão de Diluição em Série):1 x PBS Ácido, 0,05% Tween-20 e 2% BSA, ajustado para o pH 6,5 com ácido acético. Tampão BW (Tampão de Lavagem): 100 mM de NaOAc e 0,05% de Tween-20, adjustado para o pH 6,5 com ácido acético. Tampão C (Tampão de Substrato): 25 mM de Acetato de Sódio, 1 mM de NaCl, 0,5 mg/mL de BSA dessalgado e 0,01% de azida de sódio, ajustado para o pH 4,0 com ácido acético glacial. Tampão D (Tampão de β-Galactosidase): 300 mM de fosfato de sódio dibásico, 0,1 mg/ml de BSA, 0,01% de azida de sódio e 0,01% Tween-20, ajustado para o pH 7,2 com ácido fosfórico. Tampão E (Tampão de Parada): 350 mM de glicina e 440 mM de Tampão de Carbonato, ajustado para o pH 10,7 com 6 M de NaOH.

[00270] Reagents. Anticorpo IgG anti-GALNS: anticorpos de Coelho policlonais são a Proteína G purificada a partir do soro. Em D-PBS, proteína total = 3,17 mg/mL (BCA). Alíquotas (19 μL) são armazenadas a -20°C para uso de uma por vez. O substrato 4MU-Gal-6-S (Sólido; 440 MW): 100 mM do estoque preparado em água DI e armazenado a 4°C. β-Galactosidase (Sigma G-4155): diluir para 12 μg/mL no Tampão D antes do uso.

[00271] Protocolo: Ligar o anticorpo anti-GALNS à placa: uma placa Nunc MaxiSorp ELISA (Nalge/Nunc International, Fisher # 12-565-135) é revestida com o anticorpo anti-GALNS a uma concentração final de proteína de 5 μg/mL no Tampão A. Para preparar esta solução, descongelar uma alíquota de 19 μL, girar brevemente (10 seg) em uma microcentrífuga para coletar o líquido. Transferir todos os 19 μL em 12 mL do Tampão A. Misturar vigorosamente por inverção, depois derramar em um reservatório, seguido pelo carregamento da placa (100 μL por poço) usando uma pipeta de multi-canal. Cobrir a placa e incubar a 4°C durante a noite. Remover o anticorpo anti-GALNS não ligado: lavar a placa pela inundação com Tampão BW três vezes. Bloqueio: bloquear a placa com Tampão B (320 μL por poço), depois cobrir a placa e incubar a 37°C por 1 h. Preparar uma série de diluição da GALNS purificada padrão e amostras de teste (desconhecidas) durante a etapa de bloqueio: o padrão é diluído no Tampão B para a extremidade alta da faixa linear do ensaio (128 ng/mL na Fileira A), depois serialmente diluído (2-vezes) nas fileiras B a G em uma placa de 96 poços. A pista H é o tampão em branco (i.e., nenhuma enzima GALNS). Primeiro, preparar 500 μL de uma concentração a 128 ng/mL no Tampão B. Depois, diluir em série 2-vezes o Tampão B (250 μL em 250 μL) até chegar a 2 ng/mL. Remover o tampão de bloqueio: após a etapa de bloqueio, o Tampão B é descartado. Ligar a enzima GALNS padrão e amostras de teste ao anticorpo anti-GALNS: carregar a placa com 100 μL/poço do padrão serialmente diluído e amostras de teste (executar em duplicata). Cobrir a placa e incubar a 37°C por 1 h. Remover inibidores de GALNS: lavar a placa pela inundação com Tampão BW, três vezes. Adicionar substrato de GALNS (primeira reação): preparar solução de substrato final suficiente para carregamento de 100 μL por poço (preparado não mais que 1 hora antes do uso). Diluir a solução de estoque de 4MU-Gal-6-S (100 mM) para 1 mM no Tampão C. Carregar 100 μL por poço. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 30 min. Adicionar β- Galactosidase (segunda reação): adicionar 50 μL de 12 μg/ml de β- galactosidase no Tampão D a cada poço. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 15 min. Reação de parada: adicionar 100 μL do Tampão E (Tampão de Parada) a cada poço para ionizar a 4MU liberada. Transferir para a fluoroplaca: transferir (8 poços por vez) 200 μL de 250 μL de cada poço da placa de ELISA para uma placa de microtítulo de fundo plano não tratada preta (Fluoroplate, Costar #3915). Ler a fluorescência: ler a placa em um leitor de placa Gemini (Molecular Devices Corporation) usando o programa SOFTmax PRO (366 nm de excitação, 446 nm de emissão, 435 nm de corte).

GALNS ELISA

[00272] O GALNS ELISA mede a concentração da enzima GALNS no meio condicionado à cultura celular ou outras amostras de processo usando um imunoensaio sanduíche.

[00273] Tampões. Tampão A (Tampão de Carbonato): dissolver 3,09 gramas de Na2CO3 e 5,88 gramas de NaHCO3 em 900 mL de H2O deionizada (DI), depois adicionar H2O DI para um volume final de 1000 mL. Verificar que o pH está entre 9,4 e 9,6, depois esterelizar o filtro. Para revestir completamente uma microplaca de 96 poços com 100 μL por poço, diluir 19 μL do anticorpo anti-GALNS em um tubo (12 mL). Tampão B (Tampão Bloqueador de ELISA e Tampão de Diluição em Série): 1x PBS Ácido, 0,05% de Tween-20 e 2% BSA, ajustado para o pH 6,5 com ácido acético. O tampão BW (Tampão de Lavagem): 100 mM de NaOAc e 0,05% de Tween-20, ajustado para o pH 6,5 com ácido acético. Tampão F (Tampão de Parada): 2N de H2SO4: em 600 mL total, adicionar 100 mL de 12N de H2SO4 e 500 mL de água MilliQ.

[00274] Reagentes. Anticorpo IgG anti-GALNS: anticorpos policlonais de coelho são Proteína G purificada a partir do soro. Em D- PBS, proteína total = 3,17 mg/mL (BCA). Alíquotas (19 μL) são armazenadas a -20°C para uso de uma por vez. O anticorpo de detecção conjugada a HRP (RIVAH): o anticorpo conjugado final é diluído 1:100 em D-PBS/1% BSA e armazenado em 120 μL alíquotas a -20°C para uso de um por vez. Kit de Substrato TMB EIA (BioRad #172- 1067).

[00275] Protocolo. Ligar o anticorpo anti-GALNS à placa: uma placa Nunc MaxiSorp ELISA (Nalge/Nunc International, Fisher # 12-565-135) é revestida com anticorpo anti-GALNS a uma concentração final de proteína de 5 μg/mL no Tampão A. Para preparar esta solução, descongelar uma alíquota de 19 μL, girar brevemente (10 seg) em uma microcentrífuga para coletar o líquido. Transferir todos os 19 μL em 12 mL do Tampão A. Misturar vigorosamente por inverção, depois derramar em um reservatório, seguido pelo carregamento da placa (100 μL por poço) usando uma pipeta de multicanal. Cobrir a placa e incubar a 37°C (incubador de convecção) por 2 h. Não usar um bloqueio quente. Remover o anticorpo anti-GALNS não ligado: lavar a placa pela inundação com Tampão BW, três vezes. Bloqueio: bloquear a placa com Tampão B (320 μL por poço), depois cobrir a placa e incubar a 37°C por 1 h. Preparar a série de diluição de GALNS purificada padrão e amostras de teste (desconhecidas) durante a etapa de bloqueio: o padrão é diluído no Tampão B para a extremidade alta da faixa linear do ensaio (40 ng/mL na Fileira A), depois serialmente diluído (2-vezes) nas fileiras B a G em uma placa de 96 poços. A pista H é tampão em branco (i.e., nenhuma enzima GALNS). Primeiro, preparar 500 μL de uma concentração a 40 ng/mL no Tampão B. Depois, diluir em série 2- vezes no Tampão B (250 μL em 250 μL) até chegar a 0,625 ng/mL. Remover o tampão de bloqueio: após a etapa de bloqueio, Tampão B é descartado. Ligar a enzima GALNS padrão e amostras de teste ao anticorpo anti-GALNS: carregar a placa com 100 μL/poço do padrão serialmente diluído e amostras de teste (executar em duplicata). Cobrir a placa e incubar a 37°C por 1 h. Lavagem: lavar a placa pela inundação com Tampão BW, três vezes. Ligar o conjugado do anticorpo de detecção: descongelar uma alíquota (120 μL) do anticorpo RIVAH, girar brevemente (10 seg) em uma microcentrífuga para coletar o líquido. Diluir todos os 120 μL em 11.9 mL do Tampão B e inverter vigorosamente o tubo para misturar. Derramar no reservatório e adicionar 100 μL por poço com a pipeta de multicanal. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 30 min. Lavagem: lavar a placa pela inundação com Tampão BW, três vezes. Substrato TMB: preparar a solução de substrato final pela mistura de 1,2 mL da Solução B com 10,8 mL da Solução A. Derramar no reservatório e adicionar 100 μL por poço com a pipeta de multicanal. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 15 min. Solução de parada: Pipetar 12 mL da solução de parada de 2N H2SO4 no reservatório e adicionar 100 μL por poço com a pipeta de multicanal. Bater gentilmente para misturar. Ler A450: ler a placa no leitor de placa. Ensaio de atividade específica de GALNS

[00276] O ensaio de atividade específica de GALNS mede a atividade enzimática de GALNS na solução usando um substrato específico de GALNS.

[00277] Tampões. MilliQ H2O é usada para todos os tampões. Tampão de Diluição (DB): para 1 L de DB, dissolver 1,74 mL de ácido acético, 0,75 g de Acetato de Sódio, 233,6 mg de NaCl, 2 mL de Tween- 20 a 50% e 10 mL de azida de sódio a 1% em MilliQ H2O, e ajustar o pH para 4,0 +/- 0,5 com 0,1 M de NaOH se o pH for menor que 3,95 e com 0,1 M de ácido acético Se o pH for maior que 4,05. As concentrações finais são: 19,5 mM de ácido acético, 5,5 mM de Acetato de Sódio, 1 mM de NaCl, 0,1% Tween-20 e 0,01 % de azida de sódio. Tampão de Fosfato (PB): para 1L PB, dissolver 13,9 g de NaH2PO4-H2O e 55g de NaHPO4-7H2O em MilliQ H2O, e ajustar o pH para 7,2. A concentração final é 300 mM de NaPi. Tampão de Parada (SB): para 1 L de SB, dissolver 26,2 g de glicina e 46,6 g de carbonato de sódio em MilliQ H2O, e ajustar o pH para 10,6 com NaOH. Tampão de Ensaio (AB): diluir o estoque de 4MU-Gal-6S 1 :50 em DB (2 mM final). Tampão de β-Galactosidase (βGB): 25 μg/mL β-Galactosidase em 300mM de NaPi, pH 7,2.

[00278] Reagentes. 4MU-Gal-6S: 100 mM em H2O(Toronto Research Chemicals Cat. # M334480). β-Galactosidase: Sigma G-4155. 4-metilumbelliferona (4MU padrão): Sigma M-1381 (estoque de 10 mM em DMSO).

[00279] Protocolo. Realizar diluições em série da enzima GALNS. Para GALNS purificada e formulada (~1,5 mg/ml), diluir amostras 1:10.000 em tubos de microcentrífuga de adesão de proteína baixos (USA Scientific Cat#1415-2600) contendo DB, antes de diluições em série de 1:1. Colocar 100 μL de DB em uma placa de 96 poços de ligação de proteína baixa. Na primeira fileira, pipetar 100 μL da amostra GALNS. Agora diluir serialmente (1 : 1) abaixo da placa (A-G em placas de 96 poços). Nenhuma amostra é adicionada ao poço H (branco). A faixa linear deste ensaio é 1 a 75 ng/mL. O uso do mesmo procedimento para preparar a curva padrão 4MU. Diluir 10 mM de estoque 4MU em DMSO 1:100 em DB. Iniciar a curva padrão 4MU pela adição de 50 μL, de 50 μM 4MU no primeiro poço, depois diluir serialmente. Adicionar 50 μL, do substrato diluído em AB (2 mM de 4MU-Galactose- 6S em DB) à uma placa fluorescente de 96 poços. O substrato pré-incubado por 10 min a 37°C. Adicionar 50 μL das 100 μL de diluições em série de GALNS e padrões 4MU para 50 μL, do substrato em AB. Incubar a 37°C por 30 min (esta primeira reação remove o sulfato do substrato), resfriar rapidamente a primeira reação e iniciar a segunda reação pela adição de 50 μL de β-Galactosidase (diluir estoque de β-galactosidase para 25 μg/mL em βGB. Fosfato inibe GALNS e o aumento no pH também para a reação de GALNS. O pH resultante está agora na faixa de pH ideal das β-galactosidases. Incubar esta segunda reação por 15 min a 37°C. Ionizar a 4MU liberada pela adição de 100 μL de SB. Ler Ex355 Em460 no leitor de placa fluorescente de 96 poços. Cálculos de atividade da enzima (a 37°C no tampão de pH 4,0): 1 unidade = μmol 4MU liberada/min; atividade = μmol de 4MU/min/mL; atividade específica = μmol 4MU/min/mg. Cálculo da concentração de proteína: usar o coeficiente de extinção de GALNS (1 mg/mL = 1,708 Unidades de Absorbância a 280nm).

EXEMPLO V PURIFICAÇÃO DA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS)

[00280] O objetivo era obter uma grande quantidade da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS). As células G71 transfectadas de modo estável coexpressando a SUMF1 humana e GALNS humana foram cultivadas sob condições de cultura de biorreator, e a enzima de GALNS ativa foi purificada a partir do meio celular.

[00281] Aparelho de Cromatografia Líquida. Sistema Amersham Pharmacia Biotech AKTA explorer 900, utilizando o software de controle Unicorn.

[00282] Métodos Analíticos de Proteína. Procedimentos padrão foram seguidos pela SDS-PAGE, tintura com azul de Coomassie (B101- 02-COOM), Western blotting e ensaios de proteína de Bradford. As execuções de purificação foram avaliadas pelo rendimento da atividade, e a pureza do produto de GALNS foi avaliada visualmente por SDS- PAGE. A presença das impurezas processadas foi detectada por Western blotting usando um anticorpo anti-GALNS. A concentração da proteína foi medida usando um ensaio de proteína de Bradford. A concentração da proteína de GALNS purificada final foi medida pela medição de A280 usando um coeficiente de extinção de 1,708.

[00283] Resinas de Cromatografia. Blue Sepharose 6 FF (GE Healthcare, lot #306346) e Fractogel SE Hi-Cap (Merck KgaA, FC040894449).

[00284] Determinações da Atividade da Enzima de GALNS. A atividade específica de GALNS foi determinada usando um pequeno substrato fluorescente 4-metilumbelliferil-6-S-GAL (4-MU-6-S- GAL). O ensaio de atividade específica de GALNS envolve uma reação de duas etapas, sendo que a adição de β-galactosidase é necessária após a incubação de GALNS com o substrato por um tempo determinado para liberar o marcador fluorescente. As medidas são feitas usando um leitor de placa de fluorescência.

[00285] Uma coluna de dessalgação de 10DG (Bio-RAD) foi equilibrada com tampão de equilíbrio (EQB, 50 mM NaOAc, 10 mM NaCl, pH 5,8). MilliQ H2O foi usada para todos os tampãos. Três (3) mL da GALNS purificada (0,5 a 2 mg/mL) foram carregados sobre a coluna de dessalgação, eluídos e coletados em alíquotas de 4 mL em tubos de teste separados usando EQB. A concentração da proteína foi calculada usando o coeficiente de extinção de GALNS (1 mg/mL = 1,708 Unidades de Absorbância a 280 nm).

[00286] Amostras de GALNS dessalinizadas foram diluídas em série (1 : 1) em Tampão de Diluição (DB, 50 mM NaOAc, 1 mM NaCl, pH 4,0 + 0,5 mg/mL BSA). O estoque de BSA foi dessalgado antes do uso pelo carregamento de 50 mg/mL de estoque de BSA (não mais do que 5% CV) sobre uma coluna G25 previamente equilibrada com milliQ H2O. 100 μL da amostra de GALNS dessalinizada foram pipetados na primeira fileira de uma placa de 96 poços de ligação de proteína inferior, e as amostras de GALNS diluídas em série foram pipetadas para baixo na placa (fileiras A-G em placas de 96 poços). 100 μL de DB foram pipetados dentro do último poço (H). A extremidade superior da faixa linear deste ensaio é 200 ng/mL, e a faixa linear é 3 a 200 ng/mL. O mesmo procedimento foi realizado para preparar a curva padrão com 4- metilumbelliferona (4MU) (Sigma M-1381, 10 mM de estoque em DMSO). 50 μL das 100 μL de diluições em série de GALNS e 4MU foram transfectados para uma nova placa fluorescente de 96 poços (placa de fundo preto). 50 μL de 2 mM de 4MU-Galactose-6S (em milliQ H2O) foram adicionado às amostras a serem ensaiadas, e incubadas a 37°C por 30 minutos. Esta primeira reação foi resfriada rapidamente, e a segunda reação foi iniciada pela adição de 50 μL de β-Galactosidase (Sigma G- 4155, estoque diluído para 12 μg/mL em 300 mM NaPi, pH 7,2), e incubada a 37°C por 15 minutos. A 4MU liberada foi ionizada pela adição de 100 μL do Tampão de Parada (Glicina/Carbonato, pH 10,6). As placas foram lidas no leitor de placa fluorescente de 96 poços (excitação 355 nm, emissão 460 nm). 1 Unidade é definida como 1 μmol de 4MU liberado/min, a atividade da enzima é dada em μmol de 4MU/min/mL, e a atividade específica é dada em μmol 4MU/min/mg, tudo a 37°C no tampão de pH 4,0.

[00287] Primeiro Processo de Purificação. Um primeiro processo de purificação incluía uma etapa de ultrafiltragem (UF) seguida por um processo de purificação em 2 colunas. 1. Filtragem do Coletado (HF): o material do biorreator foi 0,2 μm filtrado estéril. 2. Ultrafiltragem (UF): o material de biorreator foi concentrado 10 a 20X pela ultrafiltragem através de uma membrana de Sartocon de 30 kD. 3. Ajuste para o pH 4,5: o material de biorreator concentrado (UF (20X)) foi ajustado para o pH 4,5 com tampão de ajuste de pH (1,75 M NaOAc, pH 4,0) a temperatura ambiente e filtrado estéril antes do carregamento sobre uma coluna de Blue Sepharose. 4. Blue Sepharose 6 Fast Flow (FF): a UF ajustada para o pH 4,5 (20X) foi carregada sobre uma coluna de Blue Sepharose e a proteína de GALNS foi eluída como mostrado na Tabela 1 e Figura 9A. Tabela 1: Cromotografia por Blue Sepharose 6 Fast Flow

*CV: volumes de coluna. Vazão = 92 cm h-1 5. Fractogel SE Hi-Cap: o eluato a partir da coluna de Blue Sepharose foi ajustado para o pH 4,3 e carregado sobre uma coluna de Fractogel SE Hi-Cap e a proteína de GALNS foi eluída como mostrado na Tabela 2 e Figura 9B. Tabela 2: Cromatografia em Fractogel SE Hi-Cap

*CV: volumes de coluna. Vazão = 92 cm h-1

[00288] A proteína GALNS no eluato foi coletada por fracionamento, descarga de ombro de pré-eluição e cauda pós-eluição.6. UF/HF Final: o eluato a partir da coluna Fractogel SE Hi- CAP foi concentrado por ultrafiltragem e filtrado estéril como descrito acima.

[00289] Formulação. A proteína GALNS purificada foi formulada em 10 mM NaOAc, 1 mM de NaH2PO4, 0,005% de Tween-80, pH 5,5.

[00290] Estudos de estabilidade. A estabilidade da GALNS purificada final formulada foi monitorada a 4°C e -70°C como uma função do tempo por pequenas alíquotas de armazenamento das amostras de GALNS as respectivas temperaturas. Em determinados pontos de tempo, alíquotas das amostras congeladas foram rapidamente descongeladas em um banho a 37°C antes das medições de atividade. A Figura 8 mostra que a GALNS purificada era estável a 4°C e -70°C durante um período de até pelo menos 79 dias no tampão de formulação.

[00291] Resultados do Primeiro Processo de Purificação. A Tabela 3 mostra os rendimentos de purificação para três preparações da proteína de GALNS produzida a partir do clone G71S 4 em um biorreator de cultura em suspensão. A pureza foi estimada visualmente por SDS- PAGE por ser cerca de 95% em todos os casos.Tabela 3: Rendimentos de purificação da N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS) a partir do clone G71S 4 do reator WAVE

[00292] Figura 9 mostra uma SDS-PAGE de uma proteína GALNS separada por (A) cromatografia de Fluxo Rápido com Blue Sepharose 6 seguida pela (B) cromatografia com Fractogel SE Hi-CAP. Os géis foram tingidos com azul de Coomassie (esquerda) ou anticorpo anti-GALNS (direita). Para as Western blots, o anticorpo de coelho anti-GALNS foi diluído para 1:5000, e o anticorpo secundário foi um anticorpo de coelho de fosfatase anti-alcalina. A proteína GALNS tem um peso molecular aparente de ~55 a 60 kDa em SDS-PAGE, coerente com o tamanho esperado da forma pré-processada secretada (precursor) da enzima sem o peptídeo de sinal de resíduo de 26 aminoácidos, e também sem a clivagem após a posição 325.

[00293] Caracterização N-Terminal. O N-terminal da proteína de GALNS purificada foi determinado por LC/MS. A sequência N-terminal foi APQPPN, que corresponde ao N-terminal previsto da forma secretada de GALNS sem o peptídeo de sinal de resíduo de 26 aminoácidos (comparar as sequências de polipeptídeo de GALNS humana na Figura 4 e Figura 5).

[00294] Segundo Processo de Purificação. Um segundo processo de purificação incluía uma etapa de ultrafiltragem/diafiltragem (UF/DF) seguida por um processo de purificação em 3 colunas. 1. Ultrafiltragem (UF/DF): o material do biorreator foi concentrado 20X por ultrafiltragem/diafiltragem através de uma membrane de Sartocon de 30 kD no pH 5,5. 2. Ajuste do pH 4,5: o material de biorreator concentrado (UF/DF (20X)) foi ajustado para o pH 4,5 com tampão de ajuste de pH (1,75 M de NaOAc, pH 4,0) a temperatura ambiente e filtrado estéril antes do carregamento sobre uma coluna de Fractogel EMD SE Hi-Cap. 3. Fractogel EMD SE Hi-Cap: a UF/DF de pH 4,5 ajustado (20X) foi carregada sobre uma coluna de Fractogel EMD SE Hi-Cap, lavada sequencialmente com 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5 e 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 5,0, e a proteína GALNS foi eluída com 10 mM de acetato/fosfato, 140 mM NaCl, pH 5,0. 5. Sepharose FF Quelante de Zn: o eluato a partir da coluna de Fractogel EMD SE Hi-Cap foi ajustado para 500 mM de NaCl, pH 7,0 e carregado sobre uma coluna de Sepharose FF Quelante de Zn (Zn- IMAC), lavado com 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 7,0, e a proteína GALNS foi eluída com 10 mM de acetato/fosfato, 125 mM de NaCl, 90 mM de imidazol, pH 7,0. 6. Ajuste do pH 3,5: o eluato a partir da coluna de Sepharose FF Quelante de Zn contendo a proteína GALNS foi ajustado para o pH 3,5 para inativação viral de baixo pH e depois ajustado para 10 mM de acetato/fosfato, 2 M de NaCl, pH 5,0. 7. ToyoPearl Butyl 650M: o eluato ajustado de baixo pH a partir da coluna de Sepharose FF Quelante de Zn, foi carregado sobre uma coluna de ToyoPearl Butyl 650M, lavado com 10 mM de acetato/fosfato, 2 M de NaCl, pH 5,0, e a proteína GALNS foi eluída com 10 mM de acetato/fosfato, 0,7 M de NaCl, pH 5,0. 8. UF/HF Final: o eluato a partir do eluato de ToyoPearl Butyl 650M foi ultra-filtrado e dia-filtrado em 20 mM de acetato, 1 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, pH 5,5.

[00295] Formulation. A proteína de GALNS purificada foi formulada em 10 mM de NaOAc/HOAc, 1 mM de NaH2PO4, 150 mM de NaCl, 0,01% de Tween-20, pH 5,5.

[00296] Resultados do Segundo Processo de Purificação. Tabela 4 mostra a recuperação para a proteína de GALNS produzida a partir do clone G71S C2 em um biorreator de cultura em suspensão usando o segundo processo de purificação. A pureza da enzima de GALNS formulada (i.e., formas precursoras e maduras ou processadas juntas) foi cerca de 98% como determinado por C3 RP-HPLC. A porcentagem da forma precursora da enzima GALNS foi cerca de 85% como determinado pela eletroforese em gel capilar SDS.Tabela 4: Recuperação da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS) para o Clone G71S C2

[00297] Figura 10 mostra uma SDS-PAGE da enzima GALNS separada por ultrafiltragem/diafiltragem (UF/DF), cromatografia em Fractogel SE Hi-CAP, cromatografia em Sepharose FF Quelante de Zn e cromatografia de ToyoPearl Butyl 650M. Os géis foram tingidos com azul de Coomassie (esquerda superior), anticorpo anti-GALNS (direita superior), anti-Catepsina L (esquerda inferior) e proteínas anti-CHO (CHOP, direita inferior). Para Western blots, o anticorpo policlonal de coelho anti- GALNS foi diluído para 1:5000, e o anticorpo secundário foi um conjugado de AP anti-coelho; o anticorpo policlonal de cabra anti- Catepsina L foi diluído para 1:1000, e o anticorpo secundário era um conjugado de HRP anti-cabra; e o anticorpo policlonal de coelho antiCHOP foi diluído para 1:1000, e o anticorpo secundário era um conjugado de HRP anti-coelho. A enzima GALNS precursora tem um peso molecular aparente de ~55-60 kDa em SDS-PAGE, e as formas maduras ou processadas da enzima GALNS tem pesos moleculares aparentes de ~39 kDa e ~19 kDa em SDS-PAGE.

[00298] Sumário do Primeiro Processo de Purificação. A enzima GALNS foi purificada usando um trem de purificação que foi modificado a partir de um trem padrão (ver Tabela 5). O material coletado de biorreator foi 0,2 μL filtrado estéril e mantido a 4°C antes do carregamento sobre a coluna de captura de Blue-Sepharose. O material de biorreator filtrado foi ou carregado diretamente ou concentrado até 15X por ultrafiltragem. A modificação do trem de purificação foi necessária por causa das etapas de purificação a jusante, a cromatografia de SP Sepharose seguida pela cromatografia de Fenil Sepharose, não rendeu a GALNS suficientemente pura. O uso da cromatografia de SE Hi-Cap como uma substituição para as duas colunas de purificação a jusante resultou em um processo de purificação de 2 colunas, com a pureza do material final significativamente melhorada, e a recuperação de GALNS geral aumentou significativamente de ~22% a ~80%. A pureza da enzima GALNS (consistindo essencialmente na forma precursora, ver Figura 9), como determinado pela cromatografia de C4-RP, foi grosseiramente estimada em > 95%, e a enzima GALNS purificada permaneceu estável no tampão de formulação for mais de 79 dias tanto em 4°C e a -70°C.Tabela 5: Primeiro Trem de purificação de N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase humana (GALNS)

[00299] Sumário do Segundo Processo de Purificação. A enzima GALNS também foi purificada usando um segundo trem de purificação (ver Tabela 6). A recuperação de GALNS geral foi cerca de 70% e a pureza da enzima GALNS (incluindo ambas as formas precursoras e maduras ou processadas, ver Figura 10), como determinado pela cromatografia de C4-RP, foi grosseiramente estimada por ser cerca de 97%. Tabela 6: Segundo Trem de purificação de N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase humana (GALNS)

[00300] Estes ensaios indicam que os protocolos descritos acima para preparar as enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes fornecem um método eficiente para produção de grandes quantidades da enzima altamente purificada, em particular a forma secretada pré- processada (precursor) da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana (GALNS).

EXEMPLO VI PURIFICAÇÃO DE N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS) COM MINIMAL CLIPPING

[00301] O controle de digestão proteolítica de enzimas recombinantes é uma preocupação na fabricação e na formulação de terapêuticas com base em proteínas. O objetivo foi obter uma grande quantidade de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS) na secretada forma pré-processada (precursor). Um processo de produção foi desenvolvido que iria permitir a produção em grande escala de GALNS humana com recorte mínimo de proteases, em particular, catepsina L.

[00302] Conforme aqui usado, "recorte mínimo" significa que a GALNS está pelo menos 98%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% intata em formulações finais purificadas, tal como avaliado por SDS-PAGE sob condições redutoras seguida por coloração com Azul de Coomassie ou por SDS-eletroforese em gel capilar (SDS-CGE).

[00303] Durante o desenvolvimento de um processo de produção para a fabricação em grande escala de GALNS, verificou-se que ~55 kDa da forma precursora secretada da enzima era susceptível a degradação proteolítica por proteases, em particular, catepsina L, que são ativas no pH ácido. A degradação da protease de GALNS gera uma forma madura cortada de GALNS, o que pode ser visto como duas bandas a ~40 kDa e ~19 kDa em SDS-PAGE sob condições redutoras. Este recorte proteolítico foi exacerbado pelo baixo pH (isto é, 4,5 a 5,0) requerido para a etapa de captura de coluna de troca iônica. Esta faixa de pH forneceu condições que foram favoráveis para a atividade de proteases ácidas, tais como catepsinas, presentes na colheita de cultura celular.

[00304] As alterações foram feitas no processo de recuperação e purificação de GALNS para minimizar a presença e/ou a atividade de proteases que podem cortar a GALNS segregada no meio de cultura de células.

[00305] Fluxogramas que descrevem processos de recuperação e purificação exemplares para a fabricação em grande escala de GALNS são mostrados na Figura 11. O processo da esquerda mostra o processo de recuperação e de purificação usado no processo de Fase I/II, à semelhança do trem de purificação acima descrito no Exemplo V, o que resulta em uma quantidade variável de recorte, que vai desde ~6 a 30% da cadeia peptídica devido à ativação de catepsina L, conforme determinado por SDS-PAGE sob condições redutoras executadas seguida por coloração com Azul de Coomassie (ver Figura 12, pista 3), ou que varia de 65,3% a 93,7% da forma precursora intacta de GALNS, tal como avaliado por SDS-CGE (ver Tabela 8). O método de SDS- PAGE fornece a informação visual, mas mais qualitativa, sobre a degradação da proteína, enquanto que o método de SDS-CGE fornece informações mais quantitativas em relação a % de proteína intacta presente nas formulações finais purificadas.

[00306] O processo na direita na Figura 11 mostra o processo de recuperação e de purificação usado no processo da Fase III, o que resulta em recorte mínima, que varia de 98% a 99,6% da forma precursora intacta de GALNS, tal como avaliado por execução de SDS- PAGE sob condições redutoras seguida por coloração com Azul de Coomassie (ver Figura 12, pista 5) ou por SDS-CGE (ver Tabela 8).

[00307] Visão geral das mudanças no processo. Para reduzir a extensão e variabilidade do recorte de GALNS, dois fatores foram levados em consideração (i) as proteases são significativamente menos ativas no pH neutro, e (ii) tanto as etapas de cromatografia de troca catiônica e cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) separam as proteases de GALNS. O processo da Fase III (ver Figura 11, direita) explora estes fatores e ajuda a reduzir o recorte de GALNS durante o procedimento de purificação. Isto foi conseguido trocando a ordem das duas primeiras etapas de coluna, com a captura na coluna de Zn-IMAC, no pH 6,5 a 7,0. Esta comutação das duas primeiras colunas também feitas conveniente para recolher e armazenar as colheitas de cultura de células em um pH mais elevado (isto é, pH 6,5) em comparação com o pH mais ácido (por exemplo, pH 5,5) que foi usada no processo de fase I/II (ver Figura 11, esquerda). O armazenamento da colheita livre de células a pH 6,5 reduz a possibilidade da ativação de proteases, por exemplo, catepsinas, presentes no líquido de cultura de células, prevenindo assim ou reduzindo o recorte de GALNS.

[00308] Processo de Fase III. Cada uma das etapas de um processo de recuperação e purificação exemplar de Fase III para GALNS está resumida abaixa. 1. Colheita Livre de Células (1X). As células G71 estavelmente transfectadas que co-expressam a SUMF1 humana e GALNS humana foram cultivadas sob condições de cultura de biorreator como descrito no Exemplo III. O material do biorreator (isto é, fluido de cultura de células) que contém a GALNS foi coletado no pH 6,5, e filtrado através de um trem de filtragem de CUNO 30SP02A, seguido por CUNO 90ZA08A, e um filtro CUNO BioAssure de 0,2 μm. 2. UF/DF (20X). O fluido de cultura de células foi ultrafiltrado/diafiltrado (UF/DF) em 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 6,5 a uma condutividade de <7 mS/cm. A etapa de UF/DF foi realizada utilizando os cassetes de Sartocon 30 kDa Hydrosart. O fluido de cultura de células foi concentrado 20X. Para comparação, a etapa de UF/DF do processo de Fase I/II foi realizada a pH 5,5. O pH mais elevado no processo de Fase III reduz a possibilidade de recorte de GALNS por proteases presentes na colheita livre de células. 3. Filtro de Carvão Vegetal. O material de UF/DF (20X) foi filtrado através de um Carbono Ativado Zeta Plus R55 (Z1274) e, em seguida esterilizada por filtragem usando um filtro de 0.2 μm antes do armazenamento a 2 a 8 °C. O filtro de carvão vegetal reduz de forma significativa a pressão após o carregamento da coluna de Zn-IMAC subsequente. 4. Cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC). Uma coluna de cromatografia por afinidade com metal com Zn- imobilizado (Zn-IMAC) foi equilibrada em 10 mM de fosfato/acetato, 500 mM de NaCl, pH 7,0, e carregada a uma condutividade de ~55 ± 5 mS/cm, com o material de UF/DF do carvão vegetal filtrado (20X) no pH 7,0 ± 0,1 por adição de 50 mM de tampão fosfato, pH 9,2 contendo 2,5 M de NaCl. A coluna carregada foi lavada com 10 mM de fosfato/acetato, 500 mM de NaCl, pH 7,0, seguido por 10 mM de fosfato/acetato, 125 mM de NaCl, pH 7,0 (tampão A). A GALNS foi eluída a partir da coluna com uma mistura de 70% do tampão A e 30% do tampão B (10 mM de fosfato/acetato, 125 mM de NaCl, 300 mM de imidazol, pH 7,0). 5. Filtro Mustang Q. O eluato da coluna de Zn-IMAC foi ajustado para uma condutividade de ~6,0 ± 0,5 mS/cm, no pH 7,0, e carregado sobre um filtro Mustang Q de remoção de vírus. 6. Ajuste de pH & Filtragem. O filtrado do Mustang Q foi ajustado para o pH 4,5 ± 0,1, filtrado através de um filtro CUNO 60ZA seguido por um filtro embutido de 0,2 μm, e em seguida carregado em uma coluna de troca catiônica. 7. Cromatografia de troca catiônica. Uma coluna de troca catiônica de Fractogel HiCap SE foi equilibrada em 10 mM de fosfato/acetato, 50 mM de NaCl, pH 4,5, e carregada com o filtrado do Mustang Q ajustado para um pH de 4,5 ± 0,1 a uma condutividade de <7 mS/cm. A coluna carregada foi lavada com 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5, seguido por uma mistura de 80%:20% de 10 mM de fosfato/acetato, pH 5,0 (tampão A) e 10 mM de fosfato/acetato, 250 mM de NaCl, pH 5,0 (tampão B). A GALNS foi eluída a partir da coluna com um gradiente linear de 20 a 75% do tampão B em 80% a 25% do tampão A (ou seja, 50 a 190 mM de NaCl). 8. Suporte de Baixo pH para Inativação Viral. O eluato de Fractogel SE HiCap foi acidificado até um pH de 3,5 ± 0,1 para inativação viral, por adição de 0,2 M de tampão de citrato, pH 3,4, mantido a um pH baixo por ~1 hora, reajustado para o pH 5,0 ± 0,1 por adição de 0,2 M de tampão de citrato, pH 6,0, e depois carregado sobre uma coluna de polimento de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). 9. Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC). Uma coluna de ToyoPearl Butyl 650M HIC foi equilibrada com 10 mM de fosfato/acetato, 2 M de NaCl, pH 5,0, e carregada com o eluato de Fractogel SE HiCap viral inativado de baixo pH ajustado para 2 M de NaCl, pH 5,0. A coluna carregada foi lavada com 10 mM de fosfato/acetato, 2 M de NaCl, pH 5,0 (tampão A). A GALNS foi eluída a partir da coluna com uma mistura de 35% do tampão A e 65% do tampão B (10 mM de fosfato/acetato, pH, 5,0). 10. Troca de tampão e Ajuste de rhGALNS para 3 mg/mL. O eluato de ToyoPearl Butyl 650M HIC foi trocado em tampão em 20 mM de acetato, 50 mM de fosfato, 30 mM de arginina, 2% (v/v) de sorbitol, pH 5,4 e, em seguida ajustado para uma concentração final de GALNS de 3 mg/ml no mesmo tampão. 11. Remoção Viral e de DNA por Filtragem. O eluato de ToyoPearl Butyl 650M com tampão trocado foi filtrado para remover qualquer vírus residual e DNA viral utilizando um filtro (DV20) e um filtro de DNA (Mustang Q). 12. PS20 adicionado a 0,01%. O vírus e DNA filtrados, eluato de ToyoPearl Butyl 650M de tampão trocado foi ajustado a 0,01% (v/v) de polissorbato 20 (PS20 ou Tween-20). 13. Armazenamento de BDS a 2 a 8 °C ou congelado. A formulação final de GALNS purificada, isto é, a substância de droga a granel (BDS), foi armazenada a 2 a 8 °C ou congelada.

[00309] Resultados. Como visto nos resultados de SDS-PAGE (ver Figura 12, pista 5), a massa molecular aparente da banda principal é ~55 kDa, consistente com o valor esperado para o monômero de GALNS. As bandas migram para as massas moleculares aparentes de ~40 kDa e ~19 kDa em lote # AP400802, que foi gerado usando o processo de Fase I/II (pista 3), são os produtos de degradação de GALNS resultantes do corte proteolítico entre Q348 e G349. Este recorte é muito reduzido no lote # BMN110-0110-001, que foi gerado utilizando o processo da Fase III (pista 5). Há uma banda menor de ambas as preparações migrando ligeiramente mais lentas do que o produto de clivagem de ~40 kDa.

[00310] Visão Geral de Mudanças de Processo Adicionais. Um processo de Fase III modificação foi desenvolvido para resolver certos desafios: (i) a formação de um precipitado na colheita concentrada, (ii) a perda de GALNS na etapa de captura de Zn-IMAC, (iii) perda de GALNS na porção de lavagem durante a etapa de ToyoPearl Butyl, e (iv), a presença de níveis elevados de impurezas CHOP no eluato da etapa de Toyopearl Butyl.

[00311] Processo de Fase III Modificado. Cada uma das etapas de um processo exemplar de recuperação e purificação de Fase III para GALNS está resumida abaixo. 1. Colheita livre de células (1X). As células G71 estavelmente transfectadas que co-expressam a SUMF1 humana e GALNS humana foram cultivadas sob condições de cultura de biorreator como descrito no Exemplo III. O material de biorreator {isto é, fluido de cultura de células) que contém a GALNS foi coletado a pH 6,5, e filtrado através de um trem de filtragem de Millipore DOHC, seguido por Millipore XOHC, e um filtro Millipore SHC de 0,2 μm. 2. UF/DF (20X). O fluido de cultura de células foi ultrafiltrado/diafiltrado (UF/DF) em 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 6,5 a uma condutividade de <7 mS/cm. A etapa de UF/DF foi realizada utilizando os cassetes de Sartocon 30 kDa Hydrosart. O fluido de cultura de células foi concentrado 20X. 3. Filtro de Carvão. O material de UF/DF (20X) foi filtrado através de um Carbono Ativado Zeta Plus R55 (Z1274) e, em seguida esterilizado por filtragem usando um filtro de 0,2 μm antes do armazenamento a 2 a 8 °C. 4. Cromatografia por Afinidade com metal imobilizado (IMAC). Uma coluna de cromatografia por afinidade com metal com Zn- imobilizado (Zn-IMAC) foi lavada com 50 mM de tampão de acetato, pH 5,0, carregada com 50 mM de ZnSO4, lavada com 50 mM de tampão de acetato, pH 5,0, e, em seguida, equilibrada com 10 mM de fosfato/acetato de, 500 mM de NaCl, pH 7,0, contendo 5 mM de imidazol. A Zn-IMAC equilibrada foi carregada a uma condutividade de ~50 ± 5 mS/cm, com o material de UF/DF filtrado (20X) de carvão vegetal a pH 7,0 ± 0,1 por mistura em linha com 50 mM de tampão fosfato, pH 9,2 ± 0,1 contendo 2,5 M NaCl em uma razão de 75:25 (v/v) durante a carga da coluna de Zn-IMAC. A coluna carregada foi lavada com 10 mM de fosfato/acetato, 500 mM de NaCl, pH 7,0, seguida por 10 mM de fosfato/acetato, 125 mM de NaCl, pH 7,0 (tampão A). A GALNS foi eluída a partir da coluna com uma mistura de 70% de tampão A e 30% de tampão B (10 mM de fosfato/acetato, 125 mM de NaCl, 300 mM de imidazol, pH 7,0). 5. Ajuste de pH & Filtragem. O eluato da coluna de Zn-IMAC foi ajustado para pH 4,5 ± 0,1 com 1,75 M de acetato, pH 4,0, e, em seguida, filtrado utilizando um filtro Millipore COHC. O material filtrado foi misturado em linha com 10 mM de fosfato/acetato, pH 4,5 em uma proporção de 30:70 (v/v), durante o carregamento da coluna de troca catiônica. 6. Cromatografia de troca catiônica. Uma coluna de troca catiônica Fractogel HiCap SE foi equilibrada em 10 mM de fosfato/acetato, 50 mM de NaCl, pH 4,5, e carregada com o pH ajustado de 4,5 e eluato da coluna de Zn-IMAC filtrou a uma condutividade de <7 mS/cm. A coluna carregada foi lavada com 10 mM de acetato/fosfato, 50 mM de NaCl, pH 4,5, seguido por uma mistura de 80%:20% de 10 mM de fosfato/acetato, pH 5,0 (tampão A) e 10 mM de fosfato/acetato, 250 mM NaCl, pH 5,0 (tampão B). A GALNS foi eluída a partir da coluna com um gradiente linear de 20% a 75% de tampão B em 80% a 25% de tampão A (ou seja, 50 a 190 mM de NaCl). 7. Suporte de Baixo pH para Inativação Viral. O eluato de Fractogel SE HiCap foi acidificado até um pH de 3,5 ± 0,1 para inativação viral, por adição de 0,4 M de tampão de citrato, pH 3,4, mantido a um pH baixo por ~ 1 hora (a uma temperatura de 12 a 23 °C), reajustado para o pH 5,0 ± 0,1 por adição de 0,4 M de tampão de citrato, pH 6,0, misturado com 10 mM de tampão de fosfato/acetato, pH 5, contendo 5 M de NaCl para obter uma concentração final de 2 M de NaCI, e em seguida filtrado através de um filtro de 0,2 μm antes de carregar em uma coluna de polimento de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). 8. Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC). Uma coluna de ToyoPearl Butyl 650M HIC foi equilibrada com 10 mM de fosfato/acetato, 2 M de NaCl, pH 4,4, e carregada com o filtrado, o eluato de Fractogel SE HiCap inativado de baixo pH viral ajustado para 2 M de NaCl, pH 4,3 a 4,4. A coluna carregada foi lavada com 10 mM de fosfato/acetato, 2 M de NaCl, pH 4,4, seguido por 10 mM de fosfato/acetato, 2,5 M de NaCl, pH 5,0 (tampão A). A GALNS foi eluída a partir da coluna com um gradiente linear de 100% a 32% de tampão A em 0 a 68% de tampão B (10 mM de fosfato/acetato, pH 5,0) (ou seja, 2,5 a 0,8 M de NaCl), seguida de uma mistura de tampão A de 32% e 68% de tampão B (ou seja, 0,8 M de NaCl). 9. Troca de Tampão, Remoção de DNA e vírus por Filtragem, e Ajuste de rhGALNS para 3 mg/mL. O eluato de ToyoPearl Butyl 650M HIC teve o tampão trocado para 20 mM de acetato de sódio, 50 mM de fosfato de sódio, 30 mM de arginina-HCl, 2% (p/v) de sorbitol, pH 5,4. O eluato de ToyoPearl Butyl 650M HIC com tampão trocado foi filtrado para remover qualquer DNA residual e os vírus de DNA, utilizando um filtro (Mustang Q) e um filtro viral (DV20). O eluato de ToyoPearl Butilo 650M HIC com tampão trocado filtrado foi então ajustado para uma concentração final de 3 mg/ml de GALNS no mesmo tampão que acima. 10. PS20 Adicionada a 0,01%. O DNA e vírus filtrados, eluato de ToyoPearl Butyl 650M com tampão trocado foi ajustado a 0,01% (v/v) de polissorbato 20 (PS20 ou Tween-20). 11. Armazenamento de BDS a 2 a 8 °C ou congelado. A formulação final de GALNS purificada, isto é, a substância de droga a granel (BDS), foi passada através de um filtro Millipak 200 de 0.2 μm para dentro do recipiente de armazenamento final e armazenada em sacos a 2-8 °C ou congelada.

[00312] Resultados. Na sequência deste processo de Fase III modificado, a ligação de GALNS às colunas de Zn-IMAC e ToyoPearl Butyl é melhorada, e impurezas CHOP no eluato de Butil ToyoPearl são reduzidas. A GALNS purificada por este processo de Fase III modificado é comparável em todas as propriedades testadas (por exemplo, aquelas na Tabela 7 abaixo) para a enzima purificada pelo processo de Fase III descrito acima.

[00313] Caracterização de rhGALNS Feita pelo Processo de Recuperação e purificação de Fase III. A GALNS purificada utilizando o processo da Fase III foi comparada com a enzima purificada pelo processo de Fase I/II. Os resultados da caracterização estão indicados na Tabela 7. Embora ambas as preparações de GALNS pareçam comparáveis em todas as propriedades testadas, a enzima purificada pelo processo de fase III mostra significativamente menos corte comparada com uma purificada pelo processo de fase I/II.Tabela 7: Comparação de GALNS purificada pelos Processos de Fase I/II e Fase III

*CHOP: contaminantes proteicos da célula hospedeira do ovário de hamster chinês ** Dados de SEC-HPLC para outros lotes de rhGALNS purificados a partir de material obtido a partir do mesmo reator de 200L cMFG utilizando o processo da Fase III mostraram> 99% de proteína intacta

[00314] A Tabela 8 compara o percentual de GALNS intacta utilizando o método de SDS-CGE na formulação final purificada em lotes que foram preparados usando o processo de Fase I/II (65,3 a 93,7%), ou o processo de Fase III (98 a 99,6%). Os valores aqui obtidos suportam os resultados obtidos com o método de SDS-PAGE, e mostram que o grau de corte é significativamente reduzido, como resultado das modificações introduzidas no processo de purificação. Tabela 8: Comparação da % de GALNS intacta purificada pelos Processos de fase I/II e fase III (por SDS-CGE)

[00315] Estes ensaios indicam que o protocolo descrito acima para a preparação de enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes com corte mínima fornecem um método eficiente para a produção de grandes quantidades de enzima altamente purificada, em particular, a forma secretada pré-processada (precursor) de N-acetilgalactosamina - 6-sulfatase humana (GALNS).

EXEMPLO VII CARACTERIZAÇÃO DA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE HUMANA (GALNS) PURIFICADA

[00316] As linhagens celulares G71 produzem proteínas (por exemplo, enzimas lisossomais) com maiores níveis de fosforilação de manose elevada do que é observado em uma linhagem celular de mamífero média, e um nível de modo correspondente mais baixo de oligossacarídeos de alta manose não fosforilados. Uma enzima de sulfatase lisossomal (por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante (GALNS)), compreendendo um elevado nível de cloreto de oligossacarídeos de alta manose bis-fosforilados, como aqui definido, é comparada com as moléculas obtidas em Canfield et al., Patente US 6.537.785, que não compreende os oligossacarídeos complexos, e exibem apenas oligossacarídeos de manose elevada.

[00317] Para determinar os níveis de alta manose não fosforilada em uma enzima de sulfatase lisossomal, uma pessoa versada na técnica pode usar o sequenciamento de exoglicosidase de oligossacarídeos liberados ("sequenciamento FACE"), para identificar as percentagens de cadeias de oligossacarídeos de alta manose não fosforiladas. Em um gel de perfilagem FACE de liberação em lote normal, a alta manose não fosforilada co-migra com oligossacarídeos complexos particulares (por exemplo, oligomanose 6 e complexo biantenário totalmente sialilado). Alta manose não fosforilada é então diferenciada dos outros oligossacarídeos por sequenciamento enzimático.

[00318] Para determinar se a enzima de sulfatase lisossomal purificada (por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante (GALNS)), expressa em células G71S exibem fosforilação aumentada, o nível de manose-6-fosfato (M6P) na enzima de sulfatase lisossomal foi determinada, assim como a capacidade da enzima de se ligar ao receptor de M6P (MPR).

[00319] A enzima GALNS recombinante humana, expressa em células G71S e purificado, foi analisada por electroforese de carboidratos assistida por fluorescência (FACE) e pela cromatografia em resina de Sepharose MPR. O sistema FACE utiliza electroforese em gel de poliacrilamida para separar, quantificar e determinar a sequência de oligossacarídeos liberada de glicoproteínas. A intensidade relativa da banda de oligomanose 7 bis-fosfato (O7P) no FACE (Hague et al., Electrophoresis 19 (15): 2612-20, 1998) e a atividade percentual retida na coluna de MPR (Cacia et al., Biochemistry 37 ( 43): 15154-61, 1998) dão medidas confiáveis de nível de fosforilação por mol de proteína.

[00320] Atividade Específica. A atividade especifica da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS) foi determinada utilizando um substrato fluorescente pequeno de 4-metil-6- S-GAL (4MU-Gal-6S), a 37 °C. Utilizando este ensaio, a atividade específica da GALNS purificada foi de 165 μμmol/min/mg (0,165 U/mg).

[00321] Estabilidade do Soro Humano. A estabilidade do soro ex vivo da GALNS foi determinada. O soro humano (Sigma H-4522) foi esterilizado por filtragem através de um filtro PES de 0.2 μm, e 4 mL de soro humano esterilizada por filtro foi pré-incubada em um frasco de cultura de células T-25 durante 1 hora a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 10% (pH neste ponto é de 7,4 ± 0,1). 0,4 mL da GALNS dessalinizada, purificada (2 mg/mL de GALNS purificada foi dessalinizada em PBS utilizando colunas Bio-Rad 10DG) foram adicionados ao soro humano pré-incubado, ou um controle de PBS contendo 0,5 mg/L de BSA. Amostras de 100 μL foram retiradas em pontos de tempo designados (por exemplo, 0, 1, 3,5, 7,5 e 26 horas) e adicionada à 900 mL do tampão resfriado rapidamente (QB, 50 mM de NaOAc, pH 5,6 + 150 mM de NaCl + 0,5 mg/mL de BSA + 0,001% de Tween-80). As amostras foram armazenadas a 4°C até estarem prontas para a medição de atividade enzimática de GALNS.

[00322] A atividade da enzima GALNS foi medida utilizando o ELISA de atividade de captura de enzima. Por extrapolação da curva de decaimento exponencial de % da atividade residual da enzima GALNS, a meia-vida sérica ex vivo da GALNS purificada foi estimada em 217 horas.

[00323] Absorção em Sinoviócitos (Crondrócitos). A capacidade de GALNS ser tomada em sinoviócitos (condrócitos) foi determinada.

[00324] Os condrócitos (Número ATCC CRL-1832) são cultivados em meio de crescimento (Ham 's F12 + 10% FBS) a 37 °C em 5% de CO2 em placas de 12 poços. A análise da utilização de três amostras requer placas de 4 x 12 poços. As amostras de GALNS purificadas e uma referência de GALNS foram diluídas a 1 μM em acPBS/BSA (PBS acídico + 200 μg/mL de BSA). A partir de estoques de 1 μM, curvas de diluição de absorção para amostras de GALNS e referência foram preparados: 50,5 μM (1 μM de rhASB) em 5 mL de diluente de ensaio absorção (UAD, DMEM + 2 mM de L-glutamina + 0,5 mg/mL BSA), resultando em amostras de GALNS de 10 nM e referência, que foram adicionalmente diluídas em série a 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 e 0,16 nM em série por duas diluições em UAD. O meio de crescimento a partir de placas de 12 poços de condrócitos confluentes foi aspirado, 1 mL de uma das diluições UAD (em branco) ou em série de amostras de GALNS ou referências foram adicionados aos poços e incubados durante 4 horas a 37 °C em uma incubadora com CO2 a 10%. O meio de absorção foi aspirado, inclinando cada prato para completar, e cada poço foi lavado uma vez com 1 mL de PBS. O PBS foi aspirado e os condrócitos foram destacados por adição de 0,5 mL de tripsina/EDTA (0,25% de tripsina/EDTA a 0,1% (Mediatech 25-053-CI, lote 25053025)) por poço. Após o desprendimento da placa, os condrócitos foram divididos em separadas em alíquotas em tubos Eppendorf preenchidos com gelo (30 tubos no total). Os condrócitos tripsinizados foram resfriados e em seguida sedimentados a baixa velocidade em uma microcentrífuga (4000 rpm durante 3 minutos). A tripsina foi aspirada completamente, o sedimento celular foi lavado com 1 mL de PBS, repetindo a microcentrífuga e as etapas de aspiração, uma vez. 200 μL de tampão de lise celular (CLB, 50 mM de acetato de sódio, pH 5,6 + 0,1% de Triton X-100) foram adicionados a cada tubo. Os sedimentos celulares foram ressuspensos por agitação em vórtex por pulso três vezes. Depois da ressuspensão, as misturas de lise de células foram armazenadas durante a noite a -80 °C, ou analisadas diretamente.

[00325] Os lisados celulares foram descongelados à temperatura ambiente e transferidos para gelo quando descongelados. Os lisados celulares foram agitadas em vortex para ressuspender qualquer material sólido visível, e, em seguida, girados na microcentrífuga a 14 krpm durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar o material insolúvel. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo conjunto de tubos e o sedimento foi descartado. Então o ensaio de atividade de GALNS foi realizado sobre os sobrenadantes. A curva de diluição de sete pontos (diluições de duas vezes em série a partir de 10 nM e terminando em 0,16 nM) é normalmente realizada entre parêntesis a Kabsorção esperada bastante uniformemente em ambos os lados. A molaridade das amostras de partida é calculada usando o peso molecular da proteína somente.

[00326] A GALNS purificada tinha uma Kd para a absorção em sinoviócitos, com base em um único sítio de ligação do ligante, de 4,9 nM.

[00327] Ensaio de Ligação da Placa do Receptor de Manose-6- fosfato (M6P). A capacidade da GALNS de se ligar ao receptor da manose-6-fosfato (M6P) foi determinada em um ensaio de placa de ligação. Placas de ligação de FluoroNunc elevado foram revestidas com 4 μg/mL do receptor M6P. As placas revestidas foram lavadas duas vezes com 250 μL/poço do tampão de lavagem (WB, TBS + 0,05% Tween 20) e a ligação não específica foi bloqueada com 200 μL/poço de tampão de bloqueio e diluição (BDB, tampão Pierce SuperBlock, lote # CA46485). As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente (RT). Durante esta etapa de bloqueio, amostras de GALNS purificadas (0,5 a 2 mg/ml armazenadas a 4 °C durante 2 semanas) foram diluídas para 10 nM em BDB, e, em seguida, diluídas em série em tampão de diluição (DB, NaOAc 50 mM, 1 mM de NaCl, pH 4,0 + 0,5 mg/mL de BSA) (250 μL + 250 μL.) até 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 e 0,16 nM. As placas bloqueadas foram lavadas com WB como acima, e as amostras de GALNS diluídas foram dispensadas nos poços em duplicata, a 100 μL/poço e incubada 1 hora à RT. Durante esta etapa de incubação, 2 mM do substrato de atividade foi preparada por diluição de 0,1 ml do estoque de 100 mM de galactose-6S-4MU (armazenado em H2O, -20 °C) em 5 mL de DB, e pré-aquecido em um banho de água a 37 °C. Após a incubação, as placas foram lavadas duas vezes com WB como acima, e 100 μL do substrato diluído foram adicionados e a atividade específica de GALNS foi determinada.

[00328] Usando o ensaio, a GALNS purificadas teve uma Kd para a ligação ao receptor M6P, com base no local de ligação único, de 2,4 nM.

[00329] Ligação da Coluna do Receptor de manose-6-fosfato (M6P). A capacidade de GALNS se ligar ao receptor manose-6-fosfato (M6P) foi determinada em um ensaio de ligação de coluna. Uma coluna do receptor de M6P foi preparada segundo as instruções do fabricante. O receptor de M6P foi do Peter Lobel’s Laboratory, a resina da coluna foi resina NHS ativada (Bio-RAD Affi-Gel 15), e o tamanho da coluna foi de 0,7 mL. A coluna do receptor de M6P foi equilibrada com 10 volumes de coluna (CV) do tampão de equilíbrio (EQ, PBS ácido, pH 6,0 contendo 5 mM de β -glicerofosfato, Tween 20 a 0,05%, 5 mM de glucose-1- fosfato e 0,02% de NaN3) a uma vazão de 0,25mL/min. 6 μg da GALNS purificada (por 200 μL) foram carregadas em uma coluna de receptor de M6P a uma vazão de 0,1 mL/min. A GALNS não ligada foi lavada da coluna com 10 CV de EQ com uma vazão de 0,25 mL/min. A GALNS ligada foi eluída da coluna utilizando um tampão de eluição de 0 a 100% (EL, PBS ácido, pH 6,0 contendo 5 mM de β- glicerofosfato, 0,05% de Tween 20, 5 mM de manose-6-fosfato e 0,02% de NaN3) gradiente (10 CV), seguido de 2 CV de 100% de EL. A coluna foi reequilibrada com 3 CV de EQ.

[00330] Usando o ELISA de GALNS, a percentagem da GALNS purificado que se liga ao receptor de M6P foi determinada como sendo 56%.

[00331] Análise de Oligossacarídeos Totais pela Eletroforese Capilar (CE). Para determinar o nível de manose-6-fosforilação na GALNS, o perfil de carboidrato N-ligados os oligossacarídeos totais sobre as GALNS foi determinada por electroforese de capilaridade (CE), tal como descrito em Ma et al., Anal. Chem. 71 (22) :5185-5192, 1999. O método utilizou a PNGase F para clivar os oligossacarídeos N-ligados a asparagina. Os oligossacarídeos clivados foram isolados e derivatizados com corante fluorescente, e aplicados a uma coluna de centrifugação G10 para remover o excesso do corante. Os oligossacarídeos marcados com fluorescência purificados foram separados por electroforese e picos subsequentemente quantificados utilizando o software MDQ-CE (32 Karat Ver. 7.0).

[00332] Usando este ensaio, as quantidade de manose 7 bis- fosforilada (BPM7), manose 6 mono-fosforilada (MPM6) e ácido siálico que contém oligossacarídeos para GALNS purificadas foram 0,58 mol/mol da enzima, 0,08 mol/mol da enzima e não detectável , respectivamente. A percentagem das proteínas GALNS contendo BPM7 foi estimada em 29%.

[00333] Caracterização do Bis7 Oligosacarídeo. A localização dos oligossacarídeos de manose 7 bis-fosforilada (BPM7) na GALNS foi determinada. O resíduo de asparagina (Asn) na posição 178 foi glicosilado N-ligado a BPM7. O resíduo Asn na posição 397 não foi gliosilado N-ligado a BPM7, mas verificou-se ser predominantemente do oligomanose do tipo açúcares.

[00334] Afinidade de hidroxiapatita. Um modelo de osso in vitro foi desenvolvido para determinar se a GALNS tinha a capacidade de atingir o osso. 4 mg/ml de uma suspensão de hidroxiapatita de grau HTP-DNA (Bio-RAD) foram preparadas e equilibradas com DBS + 50 μg/mL de BSA, pH 7,4. A GALNS purificada, após a adição de 50 μg/mL de BSA, foi dessalinizada em DBS, pH 7,4. A GALNS dessalinizada, a uma concentração final de aproximadamente 2 mg/mL, foi diluída em série em DBS + 50 μg/mL de BSA, pH 7,4, em uma placa de 96 poços. 50 μL da GALNS diluídas em série foram transferidos para a placa de 96 poços (Millipore # MSGVN2210, PVDF hidrofílico, baixa ligação de proteína, tamanho de 22 μm dos poros). 50 μL da suspensão de hidroxiapatite foi adicionada aos poços da placa de filtro contendo a GALNS diluída em série e incubada durante 1 hora a 37 °C com agitação suave. A placa foi submetida a filtragem em vácuo.

[00335] Os sobrenadantes do filtro de vácuo foram analisados por HPLC, ou por HPLC ou atividade da enzima GALNS como descrito acima. A GALNS purificadas tinha uma Kd de hidroxiapatite de 3 a 4,0 μM.

[00336] A linhagem celular G71S expressando o fator de modificação da sulfatase humana 1 (SUMF1) produz enzimas de sulfatase lisossomais com valores de ativação mais elevados (isto é, a conversão do resíduo de cisteína do centro ativo de Cα-formilglicina (FGly)).

[00337] Para determinar se a enzima de sulfatase lisossomal recombinante purificada (por exemplo, N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS)) co-expressa com SUMF1 em células G71S exibe ativação aumentada, a quantidade de conversão do resíduo de cisteína do centro ativo de FGly na enzima de sulfatase lisossomal purificada foi determinada.

[00338] Ativação de GALNS. A ativação percentual, isto é, a conversão percentual do local ativo de cisteína (Cys) resíduo de cisteína Cα-formilglicine (FGly), da GALNS foi determinada por LC/MS (TFA). A TIC/1000 para Cys, FGly e Gly foram 39, 1840 e 183, respectivamente, o que indica que cerca de 90% da GALNS purificada está em uma forma ativa (isto é, FGly).

[00339] Resumo. A Tabela 9 mostra um resumo da caracterização da GALNS recombinante expressas em células de clone G71S 4. A Tabela 10 apresenta um resumo da caracterização de GALNS recombinante expressa em células do clone G71S C2.Tabela 9: Caracterização da N-acetilgalactosamina-6-Sulfatase humana (GALNS) produzido a partir do Clone G71S 4

Tabela 10: Caracterização da N-acetilgalactosamina-6-Sulfatase humana (GALNS) Produzida a partir do Clone G71S C2

[00340] Estes resultados demonstram que a GALNS recombinantes humana purificada tem um alto nível de ativação, e elevados níveis de fosforilação de manose-6-fosfato. Assim, as células G71S que co- expressam SUMF1 e uma enzima de sulfatase lisossomal (isto é, GALNS) produz eficientemente enzima de sulfatase lisossomal altamente fosforilada ativa. O aumento do nível de resíduos de manose elevada em tais enzimas de sulfatase lisossomais leva a aumento da captação pelo MPR em células.

EXEMPLO VIII ABSORÇÃO E ATIVIDADE DA N-ACETILGALACTOSAMINA-6- SULFATASE RECOMBINANTE HUMANA (GALNS) EM CONDRÓCITOS DE MORQUIO IN VITRO

[00341] A absorção da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS) por lisossomas dos condrócitos de Morquio e a capacidade de GALNS degradar o sulfato de queratano (KS) in vitro foram avaliadas.

[00342] Condrócitos de pacientes com Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa, Síndrome de Morquio) reduziram a atividade de GALNS e apresentam acúmulo lisossomal de KS. Um modelo in vitro de MPS IVa foi estabelecido utilizando condrócitos isolados a partir de biópsias de crista ilíaca de um doente com MPS IVa. Condrócitos primários, no entanto, se diferenciam e perdem as suas características de condrócitos em cultura. Assim, as condições de cultura foram estabelecidas para induzir a diferenciação de condrócitos in vitro.

[00343] Os condrócitos isolados de um paciente com MPS IVa, designada MQCH, foram cultivados em esferas de alginato na presença de IGF-1, TGF β, transferrina, insulina e ácido ascórbico (Meio de Crescimento de Condrócitos, Lonza # CC-3225). O meio de cultura foi mudado duas vezes por semana durante a duração das experiências, de 6 a 15 semanas. Estas condições de cultura induziram a expressão do fenótipo de condrócitos e diferenciação. Estas células MQCH expressaram os marcadores de condrócito, incluindo região determinante do sexo Y-box 9 (Sox 9), colágeno II, colágeno X, proteína de matriz oligomérica da cartilagem e agregano de mRNA, como medido por análise quantitativa de RT-PCR usando RNA isolado a partir de culturas de células MQCH. Estas células MQCH cultivadas também elaboraram a matriz extracelular.

[00344] A microscopia confocal foi realizada para confirmar que as células MQCH acumularam KS. As células MQCH em uma cultura de 8 semanas foram tratadas com tripsina, cytospun em lâminas de vidro, fixadas em acetona, e congeladas até serem usadas. Após descongelamento, as células foram re-hidratadas e coradas usando, como anticorpo primário e secundário, um anticorpo monoclonal anti-KS (Chemicon) e um anticorpo anti-coelho de cabra conjugado Alexa-488 (green), respectivamente. As células MQ-CH apresentaram coloração intracelular pontual, consistente com o acúmulo de KS lisossomal.

[00345] Para determinar se a GALNS humana recombinante purificada pode ser absorvida pelas células MQCH em lisossomas e degradar KS, uma cultura de células MQCH de 6 semanas foi incubada com 10 nM de GALNS recombinante humana duas vezes por semana durante 9 semanas. A absorção de GALNS e depuração de KS foram medidas por microscopia confocal. Os anticorpos primários foram: (a) um anticorpo policlonal de coelho anti-GALNS e um anticorpo monoclonal da Proteína de Membrana Associada anti-Lisossomal-1 (LAMP-1), ou (b) um anticorpo monoclonal anti-KS e um anticorpo policlonal anti-LAMP-1. Os anticorpos secundários usados aqui foram: anticorpos conjugados Alexa-488 (verde) para detectar anticorpos anti- GALNS ou anti-KS, ou anticorpos conjugados Alexa-555 ou -594 (vermelho) para detectar anticorpos anti-LAMP-1. As preparações de células MQCH foram montadas em montagem contendo DAPI, que mancham os núcleos.

[00346] A colocalização significativa da enzima GALNS e KS com o marcador lisossomal, LAMP-1, foi observada em células MQCH tratadas com GALNS. Após a exposição de MQCH a GALNS recombinante humana, a quantidade de KS intracelulares foi diminuída.

[00347] A absorção de GALNS também foi medida usando um ELISA de captura de enzima GALNS e um ELISA de atividade específica de GALNS, ambos descritos no Exemplo IV acima. Condrócitos humanos normais (NHKC), que expressam GALNS, foram usadas como um controle positivo. Como mostrado nas Tabelas 11 e 12, as células MQCH não tratadas não tiveram nenhuma enzima GALNS detectável ou atividade, enquanto que as células MCQH tratadas durante 9 semanas, com 10 nM de GALNS tiveram enzima GALNS e atividade significativa. Tabela 11: ELISA de Captura de Enzima GALNS Utilizando Células MQCH

aNão detectado; bng de antígeno GALNS /proteína total µg Tabela 12: Ensaio de Atividade Específica de GALNS Usando Células MQCH

aNão detectado; b Atividade de GALNS /ng antígeno

[00348] Estes resultados demonstram que a GALNS recombinante humana purificada é coletada por condrócitos de Morquio em lisossomas e pode degradar KS lisossomais in vitro. Estes condrócitos de Morquio são úteis como um modelo de eficácia in vitro para testar as enzimas de sulfatase lisossomais, tais como GALNS, que degradam KS.

EXEMPLO IX ATIVIDADE DAS ENZIMAS LISOSSOMAL HUMANAS RECOMBINANTES PARA DEGRADAR SUBSTRATOS NATURAIS EM UM ENSAIO BASEADO EM CÉLULAS IN VITRO

[00349] Ensaios in vitro a base de células foram desenvolvidos para medir a atividade das enzimas lisossomais humanos recombinantes, por exemplo, enzimas de sulfatase lisossomais, para degradar substratos naturais.

[00350] A atividade enzimática das enzimas lisossomais recombinantes humanas, por exemplo, enzimas de sulfatase lisossomais, é tipicamente medida por um ensaio in vitro livre de célula utilizando um substrato artificial fluorogênico (ver o Exemplo 4 para GALNS). No entanto, a atividade de enzima medida é dependente do tamanho do substrato artificial, isto é, o número de unidades de monossacarídeos. Além disso, a atividade enzimática é medida em um ambiente que não é um reflexo da situação in vivo. Assim, o ensaio in vitro livre de célula não leva em conta ou a capacidade da enzima lisossomal de clivar substratos naturais ou a sua capacidade para ser tomada pelas células alvo e para localizar os lisossomas.

[00351] O ensaio in vitro a base de célula foi desenvolvido para medir a atividade de duas enzimas lisossomais recombinantes humanas, alfa- L-iduronidase (IDU) e arilsulfatase B (ARSB), para degradar os seus substratos naturais, ou seja, substratos contendo sulfato de dermatano intracelular (DS). DS contém unidades de dissacarídeo de ácido idurônico variavelmente sulfatado β (1-3)-N-acetil-galactosamina β (14).

[00352] As células de fibroblastos humanas GM00519 deficientes em ARSB ou células de fibroblastos humanas GM01391 deficientes em IDU foram cultivadas até à confluência em placas de 12 poços, e as culturas foram mantidas pós-confluência durante 3 a 6 semanas para permitir o acúmulo de DS intracelular.

[00353] As células GM00519 ou GM01391 pós-confluentes foram então expostas a doses saturantes de ARSB recombinante humana (10 nM) ou IDU recombinante humana (25 nM), respectivamente, durante 4 a 5 dias. Células tratadas pela enzima de sulfatase lisossomal e não tratadas foram coletadas, lisadas e centrifugadas.

[00354] A atividade da enzima lisossomal nos lisados de células foi medida através da determinação do teor de DS residual das células através de: (1) lise das células, (2) digerir especificamente os substratos contendo DS em dissacarídeos usando condroitina ABC-liase (EC 4.2.2,4) no lisado celular, (3) marcar dissacarídeos DS com um corante fluorescente (por exemplo, 2-amino-acridona, AMAC), (4) separar os dissacarídeos DS (por exemplo, por electroforese de zona capilar, CZE) e (5) detectar os dissacarídeos DS marcados (por exemplo, por fluorescência induzida por laser, LIF). Tais métodos estão descritos, por exemplo, em Zinellu et al., Electrophoresis 2:2439-2447, 2007, e Lamari et al., J. Chromatogr. B 730: 129-133, 1999 (revisto em Volpi et al., Electrophoresis 29:3095-3106, 2008).

[00355] A Tabela 13 mostra a degradação percentual de DS usando células GM00519 tratadas com ARSB, tal como determinado através da medição da quantidade de dissacarídeo contendo N- acetilgalactosamina-4-sulfato (dissacarídeo 4S), que é o dissacarídeo DS predominante. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando células GM01391 tratadas com IDU.Tabela 13: Depleção de DS por ARSB em uma Ensaio In Vitro a base de célula

a Degradação percentual foi calculada pela medição da area sob a curva do dissacarídeo 4S detectada na análise de CZE-LIF em lisados de ARSB-tratado, em comparação com células não tratadas

[00356] O ensaio acima indicou que as células-alvo ocupam a ARSB e IDU recombinante humana, que são então localizadas em lisossomas, onde elas degradam o seu substrato natural, DS intracelular.

[00357] Um experimento de determinação de dose foi realizado para determinar a concentração na qual IDU se torna limitante neste ensaio a base de célula. As células GM01391 foram cultivadas em placas de 12 poços. Ao fim de 4 semanas pós-confluência, as células foram expostas a várias concentrações de IDU, de 0,8 nM a 25 nM, durante 6 ou 26 horas. Os lisados celulares foram preparados e processados como descrito acima. O IDU foi determinado para não se tornar limitante da taxa abaixo de 1 nM.

[00358] Em uma segunda experiência de determinação de dose, as células GM01391 aos 3 dias pós-confluência foram expostas a várias concentrações de IDU, de 0,01 a 0,2 nM, durante 2 dias. Os lisados celulares foram preparados e processados como descrito acima. Nesta experiência, uma quantidade conhecida de um padrão interno de monossacarídeo, GlcNAc-6S, foi enriquecida nos lisados celulares para controlar a recuperação durante o processamento. Como mostrado na Figura 13, uma diminuição dependente da dose na quantidade de substrato DS foi observada nas células GM01391 tratadas com IDU.

[00359] Em uma experiência de descoberta de dose similar, as células GM00519 a 3 semanas pós-confluência foram expostas a várias concentrações de ARSB, de 0,001 a 0,06 nM, durante 5 dias. Os lisados celulares foram preparados e processados como descrito acima. Nesta experiência, uma quantidade conhecida de um padrão interno de monossacarídeo, GlcNAc-6S, foi enriquecida nos lisados celulares para controlar a recuperação durante o processamento. Como mostrado na Figura 14, uma diminuição dependente da dose na quantidade de substrato DS foi observada nas células GM00519 tratadas com ARSB.

[00360] Um ensaio in vitro a base de célula foi desenvolvido para medir a atividade de uma enzima de sulfatase humana recombinante lisossomal, GALNS, para degradar o seu substrato natural, isto é, sulfato de queratano intracelular (KS) contendo substratos.

[00361] As células MQCH deficientes em GALNS foram cultivadas como descrito no Exemplo 8 acima, e tratadas com GALNS recombinante humana em 1 ou 10 nM. Após o tratamento, os lisados celulares MQCH foram preparados e digeridos com Keratanase II (EC 3.2,1), que quebra oligossacarídeos maiores de KS em dissacarídeos KS. Os dissacarídeos KS foram marcados com AMAC, separados por CZE e detectados por LIF, como descrito acima para dissacarídeos DS. GlcNAc-6S, um monossacarídeo KS, foi enriquecido na lisado celular como padrão interno para controlar a recuperação durante o processamento. Os valores característicos de dois dissacarídeos KS, Gal6S-GlcNAc6S e Gal-GlcNAc6S foram medidos, e os dados obtidos foram corrigidos pela quantidade de GlcNAc6S recuperada. A

[00362] Tabela 14 mostra a degradação percentual de KS usando células MQCH tratadas com GALNS, tal como determinado através da medição da quantidade dos dois dissacarídeos característicos de KS. Tabela 14: Depleção de KS por GALNS em um Ensaio in vitro a base de célula

a,b A degradação percentual foi calculada pela medição da área sob a curva de Ga16S-G1cNAc6S e Gal-G1cNAc6S detectada na varredura CZE-LIF em lisados da GALNS-tratada em comparação às células de MQCH não tratadas, e ajuste para a área sob a curva do controle de pico GIcNAc6S

[00363] O ensaio acima indicou que as células-alvo ocupam GALNS humanas recombinantes, o qual é então localizada para os lisossomas, onde GALNS degradou o seu substrato natural, KS intracelular.

[00364] Em geral, estes resultados demonstraram que a atividade das enzimas lisossomais recombinantes humanas, ARSB, IDU e GALNS, para degradar os seus substratos naturais pode ser medida e quantificada em ensaios in vitro a base de célula. Deve-se notar que este ensaio in vitro a base de célula pode ser prontamente modificado para medir e quantificar a atividade de outras enzimas de sulfatase lisossomais, bem como uma grande variedade de enzimas lisossomais recombinantes.

EXEMPLO X LINERAÇÃO DA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFA-TASE RECOMBINANTE HUMANA (GALNS) A TECIDOS ESPECÍFICOS

[00365] A capacidade da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS), expressa em células G71 e purificada, de ser entregue a tecidos específicos afetados por, ou associada com, a deficiência de GALNS mediante a sua administração em camundongos.

[00366] A distribuição altamente específica de sulfato de queratano dá o fenótipo muito característico da Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVA) ou síndrome de Morquio. O sulfato de queratano é encontrado principalmente na cartilagem (placas de crescimento de ossos de articulações, a válvula do coração, laringe e do septo nasal) e córnea, e é nestes tecidos que apresentam acúmulo de sulfato de queratano em pacientes com MPS IVA. Assim, para N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS), que é deficiente em MPS IVA ou Síndrome de Morquio, é importante demonstrar a entrega da enzima GALNS à placa de crescimento de ossos longos, a válvula cardíaca, córnea, laringe e do nariz. Para olhar para estes tecidos específicos, que são alvos mal vascularizados, a entrega de uma GALNS fluorescente foi investigada em camundongos.

[00367] Dois métodos de coloração imuno-histoquímica foram testados em camundongos: (1) GALNS humano conjugado com Alexa 488 e (2) GALNS humana não conjugada. A conjugação da GALNS humana para Alexa 488 foi realizada utilizando o kit de marcação Molecular Probes Alexa Fluor 488 C5 maleimida (A-10254). A química de conjugação de maleimida resultou em uma razão de 1: 1 de marcação para proteína.

[00368] Para confirmar que a marcação fluorescente não interfere com a absorção de GALNS, um experimento imunocitoquímica foi feito usando sinoviócitos cultivados (ATCC # CRL-1832). Um ensaio de absorção padrão foi usado para comparar a GALNS não conjugada com a GALNS conjugada (GALNS-A488 ou GALNS- A555). As células foram incubadas com a enzima GALNS durante 4 horas com uma perseguição subsequente com α-L-iduronidase (IDU), durante 2 horas. Os resultados mostraram que a conjugação Alexa 488 não interferiu com a incorporação celular. A Figura 15 mostra a Kd estimada para GALNS, GALNS-A488 e GALNS- A555. A absorção foi medida por ELISA de antígeno do lisado celular em vez da atividade da enzima por causa da rotulagem inativada da enzima. A Kd das enzimas GALNS não conjugada e conjugada foi determinada como sendo mais ou menos igual.

[00369] Para determinar a estabilidade do marcador fluorescente quando a enzima GALNS foi incorporada na célula, a imunocoloração na GALNS não conjugada e conjugada foi realizada. O anticorpo primário usado para a coloração era um anticorpo de coelho anti- GALNS G purificada de proteína a uma concentração de 1 μg/mL. Todas as imagens foram tiradas em um microscópio epi-fluorescente de campo amplo Leica IRE2 usando o software MetaMorph. A desconvolução das pilhas de imagens foi necessária para medir a co-localização nestas imagens, devido à presença de luz fora do plano. A desconvolução foi feita usando o software de visualização AutoQuant/AutoDeblur usando uma função de disseminação de ponto teórica (algoritmo cego).

[00370] A imunocoloração mostrou sobreposição bastante boa com sinal que foi amplificado por cima do material de GALNS-A488. O aumento observado na sensibilidade foi devido ao anticorpo primário e secundário sendo ambos policlonais.

[00371] Para determinar se a enzima GALNS foi alvejada para o lisossoma, a imunocoloração dos sinoviócitos cultivados com Lisorastreadores de Sondas Moleculares ou uma outra enzima que se localiza no lisossoma foi realizada. O lisorastreador parece mostrar alguma sobreposição com a enzima GALNS-488, no entanto, a coloração não foi uniforme. Uma perseguição de 2 h com N- acetylgalactose amina-4-sulfatase recombinante humana (rhASB), um enzima lisossomal, mostrou alguma co-localização com GALNS.

[00372] As experiências acima mostraram que a enzima GALNS- A488 é absorvida pelas células e se localiza no lisossoma, e pode ser usada para determinar a biodistribuição in vivo.

[00373] Dois estudos in vivo foram realizados. Um primeiro estudo piloto foi uma injeção em bolus de dose única (10 mg/kg) na veia da cauda de camundongos Balb/c normais, seguido de um segundo estudo, com múltiplas (5) injecções em dias alternados de 10 mg/kg na veia da cauda de camundongos Balb/c normais. As Tabela 15 e Tabela 16 descrevem os planos experimentais para os primeiro e segundo estudos, respectivamente.Tabela 15: Projeto Experimental do Primeiro Estudo Piloto

Tabela 16: Projeto Experimental do Segundo Estudo

[00374] No primeiro estudo piloto, o coração, o fígado e o conjunto tíbia/fémur foram coletados nos pontos de tempo de 2 horas e 24 horas. No segundo estudo, o coração, os rins, o fígado, o osso com quadriceps e soleus foram coletados nos pontos de tempo de 2 horas, 4 horas e 8 horas. Para ambos os estudos, o coração, rim e fígado foram fixados por imersão em paraformaldeído a 4% (PFA), durante 4 dias, embebidos em parafina, seccionados a 7 μm de espessura. O osso, incluindo o músculo no segundo estudo, foi fixado em imersão em PFA a 4% durante 8 dias, descalcificado, embebido em parafina e seccionados a 7 μm espessura.

[00375] As imagens dos camundongos injetados com GALNS-A488 foram adquiridas em um microscópio confocal a laser Zeiss. Para a análise no primeiro estudo piloto, uma pilha confocal por amostra foi adquirida para a válvula do coração e fígado e usada para análise volumétrica. Duas pilhas confocais/amostra foram adquiridas para a placa de crescimento e usadas para análise volumétrica. No segundo estudo, uma pilha confocal/amostra para a válvula do coração, rim e fígado foi adquirida e usada para análise volumétrica; duas pilhas confocais/amostra de placa de crescimento e zona de cartilagem restante (zrc) foram adquiridas e usadas para análise volumétrica.

[00376] As conclusões dos estudos por imagem de microscopia confocal foram: (1) foi possível detectar GALNS fluorescentes in vivo, (2) o sinal era específico (ausência de fundo) e a localização foi lisossomal, (3) a presença de GALNS foi demonstrada na célula sinusoidal no fígado, (5) no coração, a enzima GALNS estava presente no septo e átrio, mas o mais importante era claramente visível ao nível da válvula do coração, em que foi mais profundamente distribuída após injeções múltiplas, (6) na junção fémur/tíbia, a enzima GALNS estava presente na parte do osso mineralizado (epífise), bem como a medula óssea. GALNS estava presente na placa de crescimento. Mais particularmente, GALNS foi abundante nos condrócitos da zona de repouso (ou zona de cartilagem reservada), presente no início da zona proliferativa e reapareceu abundantemente na zona de ossificação na extremidade da placa de crescimento. Embora seja difícil de quantificar o efeito cumulativo de múltiplas injeções, o segundo estudo parece exibir uma distribuição mais ampla. A Tabela 17 mostra um resumo dos estudos de imagem por microscopia confocal.Tabela 17: Biodistribuição de GALNS em camundongos

[00377] Para a coloração secundária, a etapa inicial foi a otimização do anticorpo primário GALNS. Vários tecidos foram tingidos com diluições de 1:100 a 1:400 com a proteína de anticorpo de coelho anti- G-GALNS purificada. Os resultados no primeiro estudo piloto indicaram que a uma diluição de 1:100 era ideal para uma alta razão sinal-ruído. Este resultado foi confirmado no segundo estudo. As lâminas restantes foram processadas com uma diluição de anticorpo primário de 1:100 e uma diluição de anticorpo secundário de 1:1000.

[00378] O sinal para camundongos Balb/c dosados com GALNS tiveram um sinal acima do controle (ou seja, camundongos dosados para PBS-Cys), quando tingidos com o anticorpo anti-GALNS da G purificado da proteína. Para confirmar que a enzima GALNS foi localizada no lisossoma, as seções foram tingidas com um anticorpo anti-LAMP1. LAMP1 é um marcador para os lisossomas. As imagens mostraram sobreposição entre os anticorpos anti-LAMP1 e anti-GALNS, indicando que a enzima GALNS foi localizada no lisossoma.

[00379] Em geral, os dois estudos in vivo indicam que a biodistribuição de GALNS está ligada a vascularização, ou seja, os tecidos mais vascularizados contém mais sinal de fluorescência. Mais importante, os estudos demonstram a presença de GALNS nos locais de acúmulo de sulfato de queratano na Síndrome de Morquio, mesmo se esses locais são mal vascularizados.

EXEMPLO XI Formulações da N-acetilgalactosamina-6-Sulfatase humana (GALNS)

[00380] O objetivo foi o de investigar o efeito de vários excipientes, por exemplo, tampões, agentes de isotonicidade, e estabilizadores, sobre a atividade e a estrutura de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS) nas formulações da invenção.

[00381] A enzima GALNS foi preparada como descrito no Exemplo V.

[00382] A enzima GALNS foi caracterizada como se descreveu no Exemplo VII.

[00383] No EXEMPLO V, a enzima GALNS recombinante humana,purificada foi formulada em 10 mM de NaOAc/HOAc, 1 mM de NaH2PO4, 150 mM de NaCl, e 0,005% ou 0,01% de Tween-20, pH 5,5. Notou-se que quando do seu armazenamento no tampão de fosfato de baixa concentração, a desfosforilação da enzima GALNS ocorreu. Por conseguinte, a concentração do tampão de fosfato foi aumentada para 100 mM de NaH2PO4. Mediante o armazenamento no tampão de fosfato de alta concentração, nenhuma desfosforilação significativo da enzima GALNS foi observada. No entanto, os agregados solúveis de GALNS foram observados durante o armazenamento a 5 °C, 25 °C ou 40 °C, e agregados insolúveis de GALNS foram observados durante o armazenamento a 40 °C.

[00384] Em um primeiro estudo, o efeito da concentração do estabilizador e do pH sobre a estabilidade da GALNS recombinante foi avaliado. A enzima GALNS recombinante purificada foi formulada em 20 mM de NaOAc/HOAc, 50 mM de NaH2PO4, 0,01% de Tween-20 e 4% de sacarose ou 2% de sorbitol. Estabilizadores testados: 15 mM ou 30 mM de cloridrato de arginina (Arginina HCl) e 15 mM ou 30 mM de NaCl. pH testados: 5,0, 5,4 e 5,8. As formulações de pH 5,8 foram determinadas por variar a partir de pH 5,8 a 6,0. Depois de armazenar as formulações de enzima durante 2 meses a 5 °C, 25 °C ou 40 °C, a enzima GALNS foi analisada por meio de vários ensaios descritos no EXEMPLO VI.

[00385] A formação de agregados solúveis nas várias formulações foi determinada pelo perfil da enzima GALNS por cromatografia de exclusão de tamanho-cromatografia líquida de alta performance (SEC- HPLC). A presença de ambos, 15 mM e 30 mM de arginina HCl suprimiu o crescimento de agregados solúveis tal como determinado por SEC- HPLC (Figura 16).

[00386] A estabilidade da atividade da enzima GALNS nas formulações foi medida utilizando o ensaio in vitro da atividade da enzima. A 5 °C, a atividade da enzima GALNS era estável na presença de arginina HCl ou NaCl; a 25 °C, a atividade da enzima GALNS foi ligeiramente reduzida na presença de arginina HCl ou NaCl, e, a 40 °C, a atividade da enzima GALNS nas formulações contendo NaCl apresentou a menor estabilidade (Figura 17).

[00387] A desfosforilação da enzima GALNS nas formulações foi investigada através da medição da percentagem de bis-fosforilado 7 manose (BPM7) por electroforese capilar (CE), após digestão da enzima com PNGase F para clivar os oligossacarídeos N-ligados a asparagina. Depois de 2 meses a 5 °C, 25 °C ou 40 °C, a enzima GALNS em todas as formulações de enzima tinha um perfil de glicosilação, em termos de% BPM7 que era comparável ao perfil de glicosilação de um lote de referência de GALNS que é usado na fase de formulação clínica I (Figura 18).

[00388] A pureza da enzima GALNS nas formulações foi determinada pelo perfil da enzima por cromatografia em fase líquida de alta eficiência (RP-HPLC). Depois de 2 meses a 5 °C ou 25 °C, nenhuma das formulações exibiu nenhuma alteração da área de pico; a 40 °C, as formulações contendo arginina HCl no pH 5,0 e pH 5,4 também não exibem quaisquer alterações da área de pico, mas as formulações contendo NaCl no pH 5,0 e pH 5,4 e todas as formulações no pH 5,8 apresentaram uma diminuição na área do pico (Figura 19). Nos cromatogramas de RP-HPLC, um ombro pós-pico foi observado nas formulações. A formulação de GALNS contendo Arginina HCl 30 mM exibiu o ombro pós-pico menos proeminente.

EXEMPLO XII FORMULAÇÕES EXEMPLARES DA N-ACETILGALACTOSAMINA-6- SULFATASE HUMANA (GALNS)

[00389] O exemplo a seguir fornece orientação para os parâmetros a serem usados para formular composições compreendendo N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS) ou fragmentos, mutantes, variantes ou seus análogos biologicamente ativos, que são úteis para o tratamento da síndrome de Morquio ou MPS IVa. Os parâmetros a serem usados para formular composições de GALNS da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, agentes de tamponamento para manter o pH, isotonicidade, agentes de ajuste, ausência ou a presença de estabilizantes, e ausência ou presença de outros excipientes, veículos, diluentes, e similares.

[00390] No EXEMPLO XI, a GALNS recombinante foi formulada a uma concentração de cerca de 1mg/mL. A GALNS preferida é formulada com uma concentração variando entre cerca de 0,1 a 10 mg/mL, preferencialmente de cerca de 0,5 a 5 mg/mL, e mais preferencialmente desde cerca de 0,5 a 1,5 mg/mL. Em uma modalidade, uma formulação da composição de GALNS da invenção tem uma concentração de enzima GALNS de cerca de 1 +/- 0,5 mg/mL.

[00391] No EXEMPLO XI, a enzima GALNS recombinante foi formulada em 20 mM de NaOAc/HOAc, 50 mM de NaH2PO4, pH 5,0, 5,4 e 5,8. Um agente tampão preferido é NaOAc/HOAc, ou seu equivalente, e NaH2PO4, ou seu equivalente, com a concentração de NaOAc/HOAc variando de cerca de 5 a 100 mM, preferencialmente de cerca de 5 a 50 mM, e mais preferencialmente de aproximadamente 10 a 30 mM, e a concentração de NaH2PO4 variando desde cerca de 5 a 100 mM, preferencialmente de cerca de 25 a 100 mM, e mais preferencialmente desde cerca de 25 a 75 mM. Em uma modalidade exemplar, uma formulação da composição GALNS da invenção tem uma concentração de tampão NaOAc/HOAc de cerca de 20 +/- 10 mM e uma concentração de tampão de NaH2PO4 de cerca de 50 +/- 25 mM.

[00392] Um pH preferido da formulação é de cerca de pH 4,5 a 6,5, preferencialmente cerca de pH 5,0 a 6,0, e mais preferencialmente cerca de pH 5,0 a 5,8. Em uma modalidade, uma formulação da composição de GALNS da presente invenção tem um pH de cerca de pH 5,4 +/- 0,4.

[00393] No EXEMPLO XI, a enzima GALNS recombinante foi formulada em 15 mM ou 30 mM de Arginina HCl ou NaCl. Um agente estabilizador preferido é arginina HCl, ou seu equivalente, com uma concentração na faixa de cerca de 5 a 200 mM, preferencialmente de cerca de 10 a 100 mM, e mais preferencialmente desde cerca de 10 a 50 mM. Em uma modalidade exemplar, uma formulação da composição de GALNS da invenção tem uma concentração de arginina HCl de cerca de 30 +/- 20 mM.

[00394] No EXEMPLO XI, a enzima GALNS recombinante foi formulada em 0,01% Tween-20. Um agente estabilizador preferido é o Tween-20 (também conhecido como polissorbato-20), ou seu equivalente, com uma concentração que varia desde cerca de 0,001 a 1,0% (p/v), preferencialmente de cerca de 0,005 a 0,2% (p/v), e mais preferencialmente desde cerca de 0,005 a 0,015% (p/v). Em uma modalidade, uma formulação da composição de GALNS da invenção tem uma concentração de Tween-20 de cerca de 0,01% +/- 0,005% (p/v).

[00395] No EXEMPLO XI, a enzima de GALNS recombinante foi formulada em sacarose a 4% ou sorbitol a 2%. Um estabilizador/crioprotector/agente de tonicidade preferido é o sorbitol, ou o seu equivalente, com uma concentração na faixa de cerca de 0,1 a 10% (p/v), preferencialmente de cerca de 0,5 a 5% (p/v), e mais preferencialmente de cerca de 1,0 a 3,0% (p/v). Uma formulação exemplar das composições de GALNS da invenção tem uma concentração de sorbitol de cerca de 2,0% +/- 1,0% (p/v).

[00396] Em consequência, uma formulação exemplar das composições enzimáticas de GALNS da invenção é mostrada na Tabela 18.Tabela 18: Formulações exemplares de GALNS recombinantes humanas

* pH é ajustado por meio de titulação com ácido acético glacial (HOAc) ou hidróxido de sódio a 1 N (NaOH)

EXEMPLO XIII EFEITOS DA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE RECOMBINANTE HUMANA (GALNS) E OUTRAS ENZIMAS DE SULFATASE LISOSSOMAIS EM CAMUNDONGOS DEFICIENTES EM ATIVIDADE DA ENZIMA DE SULFATASE LISOSSOMAL

[00397] Os efeitos das enzimas de sulfatase lisossomais fosforiladas altamente ativas humanas da presente invenção, por exemplo, N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS), em camundongos deficientes na atividade da enzima de sulfatase lisossomal são avaliados.

[00398] A proteína de GALNS recombinante humana é expressa em células G71S e purificada. Outras enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes humanas podem ser expressas e purificadas essencialmente de acordo com os métodos aqui descritos ou através de procedimentos conhecidos na técnica.

[00399] Vários modelos de camundongo de deficiência da enzima de sulfatase lisossomal humana foram descritos, incluindo: Leucodistrofia Metacromática (MLD) (deficiência em arilsulfatase A), (Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14821-14826, 1996), Mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI) ou síndrome de Maroteaux-Lamy (deficiência em arilsulfatase B) (Evers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8214-8219, 1996), Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) ou síndrome de Hunter (deficiência em iduronato-2-sulfatase) (Muenzer et al., Acta Paediatr Suppl. 91 (439) :98-99, 2002; Cardone et al., Hum. Mol. Genet 15: 12251236, 2006), Mucopolissacaridose tipo IIIa (MPS IIIa) ou Síndrome de Sanfilippo (deficiência em sulfamidase/heparan-N-sulfatase) (Bhaumik et al., Glycobiology 9 (12): 1389-1396, 1999), Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou Síndrome de Morquio (deficiência em N- acetilgalactosamina-6-sulfatase) (Tomatsu et al., Hum Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003), e Múltipla Deficiência de Sulfatase (MSD)(deficiência do fator de modificação de sulfatase 1) (Settembre et al., Proc. Natl. Acad. SCi. USA 104:4506-4511, 2007). Um modelo do camundongo de Mucopolissacaridose tipo IIId (MPS IIId) ou Síndrome de Sanfilippo D (deficiência em N-acetilglicosamina-6-sulfatase) ainda tem de ser descrito.

[00400] Modelos de camundongo da deficiência da enzima de sulfatase lisossomal humana podem ser usados para avaliar a viabilidade da terapia de substituição enzimática (ERT), como meio para o tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomal. Por exemplo, camundongos nocaute para MPS IVa (camundongos GALNS-/-; Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003) não têm nenhuma atividade enzimática detectável GALNS e exibe glicosaminoglicanos urinários aumentados (GAGs), ou seja, sulfato de queratina e condroitina-6-sulfato, e acúmulo de GAGs em múltiplos tecidos e órgãos, por exemplo, fígado, rim, baço, coração, cérebro, medula óssea e cartilagem. Os camundongos GALNS -/-, no entanto, não apresentam anormalidades esqueléticas associadas com a doença humana. Outro modelo de camundongo de MPS IVa foi desenvolvido que expressa uma GALNS inativa humana e uma mutada, GALNS de camundongo endógena inativa (GALNStm(hC7S.mC76S)slu; Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 14:3321-3335, 2005). Em camundongos de GALNStm(hC79S.mC76S)slu que não tem atividade enzimática GALNS detectável, a excreção urinária de GAG é aumentada, os GAGs se acumulam em vários tecidos, incluindo os órgãos viscerais, cérebro, córnea, ossos, ligamentos e medula óssea, o armazenamento lisossomal é marcado em múltiplos tecidos e armazenamento de osso é evidente. As alterações patológicas em camundongos GALNStm(hC79S.mC76S)slu são diferentes daquelas observadas em camundongos GALNS-/-. No entanto, como os camundongos GALNS-/-, camundongos GALNStm(hC79S.mC76S)slu não apresentam anormalidades esqueléticas associadas com a doença humana. Assim, camundongos GALNS-/- ou GALNStm(hC79S.mC76S)slu podem ser usados para investigar o efeito da administração de GALNS recombinantes humanas em GAGs urinários aumentados e acúmulo de GAGs nos tecidos.

[00401] Aos camundongos GALNS-/-, GALNS tm(hC79S.mC76S)slu de quatro semanas de idade ou camundongos de tipo selvagem são dadas semanalmente injeções intravenosas (n = pelo menos, 6 ou 8 por grupo) de várias doses de GALNS recombinante humana {por exemplo, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 mg/kg) ou de um controle do veículo através de 16 a 20 semanas de idade, e depois sacrificados para análise histológica. A urina é colhida a partir de camundongos e a excreção urinária de GAG é determinada como descrito (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003). O exame patológico dos vários tecidos é efetuado como descrito (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003).

[00402] Pelo uso de camundongos GALNS-/-ou GALNS tm(hC79S.mC76S)slu, espera-se que a GALNS humana recombinantes da invenção demonstre a capacidade para reduzir: (1) a excreção urinária de GAG, (2) acúmulo de GAGs em múltiplos tecidos, por exemplo, vísceras, cérebro, córnea, osso do ligamento, e medula óssea, (3) armazenamento lisossômico em múltiplos tecidos, e (4) armazenamento ósseo.

[00403] O efeito da GALNS recombinantes humana foi investigado em um modelo de camundongo de Deficiência de Sulfatase Múltipla (MSD) (camundongos SUMF1-/-; Settembre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511, 2007). Porque os camundongos SUMF1-/- exibem mortalidade frequente precoce na vida, injeções nestes ratos com GALNS recombinante humana são iniciadas mais cedo do que o descrito acima para camundongos GALNS -/-.

[00404] Seguindo os procedimentos conhecidos na técnica, os efeitos de outras enzimas de sulfatase lisossomais recombinantes humanas, ou seja, arilsulfatase A, arilsulfatse B, iduronato-2-sulfatase, sulfamidase/heparano-N-sulfatase e N-acetilglucosamina-6-sulfatase, são investigados em modelos de camundongo de MLD (camundongos ASA-/-; Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14821-14826, 1996), MPS VI (camundongos Asl-s-/-; Evers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8214-8219, 1996), MPS II (camundongos idsy/-; Cardone et al., Hum. Mol. Genet. 15: 1225-1236, 2006), MPS IIIa (Bhaumik et al., Glycobiology 9 (12): 1389-1396, 1999) e MSD (camundongos SUMF1-/- Settembre et al., Proc.. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511, 2007).

EXEMPLO XIV TRATAMENTO DE PACIENTES HUMANOS COM MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IVA(OU SÍNDROME DE MORQUIO) OU OUTRAS DEFICIÊNCIAS NA ENZIMA DE SULFATASE LISOSSOMAL OM N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE RECOMBINANTE HUMANA (GALNS) E OUTRAS ENZIMAS DE SULFATASE LISOSSOMAIS

[00405] Os pacientes humanos que manifestam um fenótipo clínico de deficiência de enzima de sulfatase lisossomal, tais como em pacientes diagnosticados com Mucopolissacaridose Tipo IVA (MPS IVa ou síndrome de Morquio), são contemplados para a terapia de substituição enzimática com a enzima recombinante, isto é, N- acetilgalactosamina- 6-sulfatase humana (GALNS). Todos os pacientes que sofrem de uma deficiência de enzima de sulfatase lisossomal manifestam alguma evidência clínica de acúmulo excessiva no tecido mole ou prejudicial visceral de material de armazenamento nos seus lisossomas como manifestados por diversos graus de incapacidade funcional ou agravamento do estado de saúde associados com a doença de armazenamento lisossomal especial. Todos os pacientes com MPS IVa manifestam alguma evidência clínica de deformidade óssea, baixa estatura e marcha anormal, e/ou acúmulo de glicosaminoglicano (GAG) no sangue ou na urina, com graus variados de incapacidade funcional.

[00406] Preferencialmente, os níveis das enzimas são monitorados em um paciente que sofre de uma deficiência de enzima de sulfatase lisossomal para confirmar a ausência ou a atividade reduzida da enzima de sulfatase lisossomal nos seus tecidos. Os pacientes com menos de 10%, preferencialmente menos de 5%, mais preferencialmente menos do que 2% e ainda mais preferencialmente menos de 1% da atividade da enzima lisossomal em um indivíduo de outra maneira normal, são candidatos adequados para o tratamento com a enzima de sulfatase lisossomal apropriada. Os dados podem ser coletados para determinar a atividade da enzima de sulfatase lisossomal do paciente antes, durante e após a terapia.

[00407] A eficácia é determinada através da medição da percentagem de redução na excreção urinária do substrato, isto é, glicosaminoglicanos (GAG) da enzima sulfatase lisossomal ao longo do tempo. Os níveis urinários de GAG em pacientes que sofrem de uma deficiência de enzima de sulfatase lisossomal são comparados com os níveis de excreção normais e/ou níveis em pacientes não tratados sofrendo da mesma deficiência da enzima de sulfatase lisossomal e/ou os níveis no mesmo paciente antes da terapia com a enzima de sulfatase lisossomal. Uma redução maior do que 25%, preferencialmente maior do que 50% de redução, na excreção de GAGs não degradadas após o tratamento com a enzima de sulfatase lisossomal é um meio válido para medir a resposta de um indivíduo à terapia.

[00408] A eficácia também pode ser determinada de acordo com os sinais e sintomas reduzidos da patologia associada com a doença de armazenamento lisossomal. A eficácia pode ser determinada por biópsia de tecido e análise de células e/ou lisossomas para determinar a extensão em que os GAGs foram reduzidos nos lisossomas, células ou tecidos. A eficácia pode ser determinada pela avaliação funcional, que pode ser subjetiva ou objetiva (por exemplo, dor reduzida ou dificuldade em função, aumento da força muscular ou resistência, aumento do débito cardíaco, resistência ao exercício, alterações na massa corporal, altura ou aspecto, e semelhantes).

[00409] Uma composição farmacêutica compreendendo GALNS recombinantes humana, expressa em células G71S e purificada, e formulada de acordo com procedimentos conhecidos na técnica. Prefere-se administrar as composições farmacêuticas da presente invenção por via intravenosa.

[00410] O projeto básico de um estudo clínico inicial para investigar o efeito da administração da GALNS recombinante humana para pacientes com MPS IVa envolve um estudo de segurança/eficácia de escalação de dose de marcador aberto no qual várias doses de enzima são administradas por via intravenosa para os pacientes em um intervalo fixo, por exemplo, e não por limitação, injeções semanais de enzimas.

[00411] Para pacientes com MPS IVa, a eficácia é determinada através da medição, por exemplo, diminuição de GAG no sangue ou urina, que é susceptível de ser observada no prazo de semanas de ERT, aumento da resistência em testes da função cardíaca, pulmonar e/ou motora, que é susceptível de ser observado dentro de alguns meses da ERT, e/ou alterações do esqueleto e/ou crescimento do corpo, o que é susceptível de ser observado dentro de anos da ERT.

[00412] Medições de GAG urinárias são úteis para o estabelecimento de um regime de dosagem apropriado, bem como para a determinação da eficácia, medindo a percentagem de redução na excreção urinária de GAG ao longo do tempo.

[00413] Uma variedade de testes de resistência podem ser empregados, incluindo, por exemplo, e não para limitação, testes de caminhada (distância percorrida em 6 ou 12 minutos), subir escadas (degraus por minuto) e função pulmonar/respiratória, incluindo a função cardíaca (ECG, ecocardiograma), função pulmonar (FVC, FEV1, pico de fluxo).

[00414] Em pacientes mais jovens em tratamento por períodos de tempo prolongados, o crescimento (altura) pode ser medido.

[00415] As doenças de armazenamento lisossomal associadas com deficiência na atividade da enzima de sulfatase lisossomal que podem ser tratadas ou prevenidas pelos métodos da presente invenção são: Leucodistrofia Metacromática (MLD), Mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI) ou síndrome de Maroteaux-Lamy, Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) ou síndrome de Hunter, Mucopolissacaridose tipo IlIa (MPS IlIa) ou uma síndrome de Sanfilippo, Mucopolissacaridose tipo IIId (MPS IIId) ou síndrome de Sanfilippo D, Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A, ou Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD). Para cada doença de armazenamento lisossomal, a enzima de sulfatase lisossomal recombinante compreenderia uma enzima de sulfatase lisossomal específica.

[00416] Para os métodos que envolvem MLD, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é arilsulfatase A. Para os métodos que envolvem a MPS VI, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é arilsulfatse B. Para os métodos que envolvem MPS II, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é iduronato-2-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIIA, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é sulfamidase/heparan- N-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIID, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é a N-acetilglucosamina-6-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IVA, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é a N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. Para os métodos que envolvem MSD, a enzima de sulfatase lisossomal preferida é a N- acetilgalactosamina-6-sulfatase.

[00417] Espera-se que numerosas modificações e variações da invenção tal como estabelecido nos exemplos ilustrativos acima ocorram àqueles versados na técnica. Consequentemente apenas tais limitações como aparecem nas reivindicações anexas deverão ser colocadas na invenção.

Claims (12)

1. Método para purificar uma enzima N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS) humana recombinante, a referida enzima GALNS compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida nos aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, em que a referida enzima GALNS: tem uma pureza de 95% ou mais, como determinada por coloração com Azul de Coomassie quando submetida a SDS-PAGE em condições não redutoras, tem 50% ou mais de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGly), e tem entre 0,5 a 0,8 de cadeias de oligomanose bis- fosforiladas por cadeia de proteína monomérica, e em que 98% ou mais da referida enzima GALNS está na forma precursora, como determinada por SDS-CGE, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a) filtrar um meio de cultura contendo a enzima GALNS secretada de uma linhagem de células de mamífero que expressa o fator 1 de modificação de sulfatase humana (SUMF1) e a enzima GALNS humana recombinante, ultrafiltrar/diafiltrar o meio de cultura filtrado, pelo que o meio de cultura ulfiltrado/diafiltrado é concentrado 20X, e filtrar a carvão o meio de cultura ultrafiltrado/diafiltrado concentrado 20X; b) carregar o meio de cultura ultrafiltrado/diafiltrado 20X filtrado a carvão da etapa a) em uma coluna de captura Sepharose FF quelante de Zn, lavar a coluna sob condições tais que a enzima GALNS seja retida na coluna e eluir a enzima GALNS da coluna; c) opcionalmente filtrar o eluato da coluna de captura Sepharose FF quelante de Zn na etapa b) através de um filtro para remover vírus; d) ajustar o pH do eluato da coluna de captura Sepharose FF quelante de Zn da etapa b) ou do filtrado da etapa c) para pH 4,5 ± 0,1 e filtrar o eluato ajustado para pH 4,5 da coluna de captura Sepharose FF quelante de Zn ou filtrado; e) carregar o eluato ajustado para pH 4,5 da coluna de captura FF quelante de Zn ou filtrado da etapa d) em uma coluna de troca catiônica Fractogel EMD SE Hi-Cap, lavar a coluna sob condições tais que a enzima GALNS seja retida na coluna e eluir a enzima GALNS da coluna; f) ajustar o pH do eluato da coluna de troca catiônica Fractogel EMD SE Hi-Cap da etapa e) para pH 3,5 ± 0,1 para inativação viral; g) ajustar o eluato inativado viral de pH 3,5 da etapa f) para pH 5,0, então carregar o eluato inativado viral ajustado para pH 5,0 em uma coluna de polimento ToyoPearl Butyl 650 M, lavar a coluna em condições tais que a enzima GALNS seja retida na coluna e eluir a enzima GALNS da coluna; h) trocar em tampão o eluato da coluna de polimento ToyoPearl Butyl 650M da etapa g) para uma formulação compreendendo NaOAc/HOAc 20 mM, NaH2PO4 50 mM, arginina HCl 30 mM, sorbitol a 2% (p/v), pH 5,4, e ajustar a concentração da enzima GALNS na formulação para 3 mg/mL; i) remover qualquer DNA e/ou vírus residual filtrando a formulação trocada em tampão na etapa h) com um filtro DV20 e um filtro Mustang Q; e j) adicionar polissorbato 20 (PS20) à formulação na etapa i) até uma concentração final de 0,01 (p/v).

2. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana recombinante, purificada de acordo com o método, como definido na reivindicação 1, e (b) um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis compreendendo: (i) uma quantidade de tampão fosfato eficaz para reduzir a desfosforilação da referida enzima GALNS, em que o tampão de fosfato é NaH2PO4 a uma concentração de 25 mM a 75 mM; e (ii) uma quantidade estabilizadora de: um sal ou tampão de arginina, opcionalmente cloridrato de arginina, em que o sal ou tampão de arginina está a uma concentração de 10 mM a 50 mM; um polissorbato, opcionalmente polissorbato 20; e um álcool de açúcar tri- hídrico ou superior, opcionalmente sorbitol; em que a referida formulação está a um pH de 5,0 a 5,8.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a compreende adicionalmente um segundo tampão, opcionalmente tampão de acetato.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que entre 50% a 80% da enzima GALNS se ligam a uma coluna de receptor de manose-6-fosfato.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a enzima GALNS apresenta uma absorção específica (Kabsorção) em fibroblastos que é de 1 a 5 nM, preferivelmente de 1 a 3,5 nM.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a concentração de enzima GALNS é de 0,5 a 1,5 mg/mL.

7. Formulação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os agentes tamponantes são NaOAc/HOAc e NaH2PO4.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a concentração de NaOAc/HOAc é de 10 a 30 mM e a concentração de NaH2PO4 é de 25 a 75 mM.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os estabilizadores são Arginina HCl, Tween-20 e sorbitol.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a concentração de arginina HCl é de 10 a 50 mM, a concentração de Tween-20 é de 0,005% a 0,015% (p/v) e a concentração de sorbitol é de 1,0% a 3,0% (p/v).

11. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana recombinante, purificada através do método, como definido na reivindicação 1, e (b) um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, compreendendo: (i) NaOAc/HOAc e NaH2PO4 como agentes de tamponamento, em que a concentração de NaOAc/HOAc é 20 +/- 10 mM e a concentração de NaH2PO4 é 50 +/- 25 mM; (ii) Arginina HCl, Tween-20 e sorbitol como estabilizadores, em que a concentração de HCl é 30 +/- 20 mM, a concentração de Tween-20 é 0,01% +/- 0,005% (p/v) e a concentração de sorbitol é 2,0% +/- 1,0% (p/v); e (iii) um pH de 5,4 +/- 0,4.

12. Uso de uma formulação que compreende uma enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana recombinante, como definida na reivindicação 2 ou 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo que sofre de Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A.

Images