JP6957738B2 - スルファターゼタンパク質を精製する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、スルファターゼタンパク質を精製する方法に関する。
ムコ多糖症（mucopolysaccharidoses，ＭＰＳ）は、特定のリソソーム酵素の欠損または不在により誘発される希少な遺伝性リソソーム蓄積疾患の一種である。これらの酵素がないと、細胞および組織だけでなく、リソソームと呼ばれる細胞小器官に多糖分子が蓄積される。これらの糖は、正常のリソソーム酵素の存在下で他の物質に変換されて身体に使用される。この多糖は、ムコ多糖類（mucopolysaccharides）又はグリコサミノグリカン（glycosaminoglycans，ＧＡＧ）として知られており、身体の結合組織の構成要素である。
ＭＰＳ ＩＩＩは、ＧＡＧを分解するのに必要な４種類の異なる酵素の欠損により発生する。各酵素の欠損は、サンフィリポ症候群（Sanfilippo syndrome）の異なる形態に分類される：ＩＩＩＡ型（サンフィリポＡ）、ＩＩＩＢ型（サンフィリポＢ）、ＩＩＩＣ型（サンフィリポＣ）およびＩＩＩＤ型（サンフィリポＤ）。
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（Heparan−N−sulfatase（ＨＮＳ））は、ヘパランスルフェートの段階的分解に関与する酵素である。ＨＮＳは、ＧＡＧの一種であるヘパランスルフェートのグルコサミン残基のアミノ基に付着したスルフェート部分を加水分解する。この酵素の欠損は、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ、サンフィリポ症候群Ａ）と関連がある。ＭＰＳ ＩＩＩＡ型によって影響を受ける患者は、ＨＮＳをコードする遺伝子に突然変異を持っており、この酵素の機能障害、欠損または不在を招く。
ＭＰＳ ＩＩＩＡ型（サンフィリポＡ）の症状は、通常２歳〜６歳の間に発現するが、１３歳に診断される場合もある。状態の臨床的症状は、異なる程度の深刻さを示す。中枢神経系は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型の患者で最も深刻な影響を受ける。ＨＮＳ及び他の二次貯蔵化合物は、中枢神経系に主に蓄積される。言語発達、運動能力および知能発達に関する問題は、そのような状態の特徴である。全般的にＭＰＳ ＩＩＩＡ型の一人一人は顕著な発達遅滞があり、長期生存が劣る。この状態は、慢性衰弱を引き起こし、生命を脅かす。
現在のところ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型の承認された治療法はなく、骨髄移植が病気の進行を遅らせるために用いられている。ヘパランスルフェートは、ＨＮＳの天然物質であるため、動物の研究は、ＨＮＳが、ヘパランスルフェートの増加があるＭＰＳ ＩＩＩＡ型などのリポソーム蓄積疾患の治療に有用なことを示した。
金属キレート・アフィニティー・クロマトグラフィー（metal chelate affinity chromatography（ＭＣＡＣ））として知られている固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（Immobilized metal affinity chromatography（ＩＭＡＣ））は、アフィニティー・クロマトグラフィーの特化された側面である。ＩＭＡＣの基本原理は、亜鉛、銅、ニッケル、コバルト及び他の多くの遷移金属が、アミノ酸側鎖の電子供与基を介してヒスチジン、システイン、及びトリプトファンに配位できることにある。クロマトグラフィーを目的でこの相互作用を利用するために、金属イオンは、不溶性支持体に固定されるべきである。これは、クロマトグラフィー・マトリックスにキレート基を付着することにより行うことができる。
この技術に使用される最も一般的なキレート基は、イミノ二酢酸（iminodiacetic acid，ＩＤＡ）である。これは、長い親水性スペーサーアーム（spacer arm）を介してＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６Ｂなどのマトリックスに連結される。スペーサーアームは、キレート金属がタンパク質のすべての利用可能な結合部位に完全にアクセスできるようにする。ＩＭＡＣに適用するための他の一般的なキレート基は、トリス−（カルボキシメチル）−エチレンジアミン（tris−（carboxymethyl）−ethylenediamine（ＴＥＤ））である。この特定のグループは、ＩＤＡとは異なるゲル特性を提供する。ＴＥＤゲルは、ＩＤＡゲルと比較して、金属イオンのより強い保持、およびタンパク質のより弱い保持を示す。ＴＥＤゲルは、ＩＤＡゲルに対する複合体（単一配位部位）ｖｓキレート（多重配位部位）を形成する。ニトリロトリ酢酸（Nitrilo triacetic acid（ＮＴＡ））は、金属固定強度と金属−イオンタンパク質の相互作用の特性をバランスさせるための４分子リガンドである（Hochuli，E.，H．Dobeli，A．Schacher [1987] J．Chromatography 411：177−184）。Porath（1992）、supraには、他のキレートリガンドが報告されている。ＩＭＡＣに最も一般的に使用される金属は、亜鉛と銅である。しかし、ニッケルコバルト及びカルシウムも成功的に使用され、開発段階で実験されるべきである。
精製工程におけるＩＭＡＣの開発は、実験室で分離を行う前に、ＩＭＡＣ樹脂に対する全てのタンパク質のタンパク質親和性を正確に予測することによって非常に変動し得る。ＩＭＡＣ樹脂に対する親和性をそのタンパク質の構造から正確かつ容易に予測できれば、研究者が開発戦略を決定するのに役立たせることができる。例えば、高親和性を持つことが予測されるタンパク質は、比較的厳しい条件下で樹脂に結合することができ、簡単なイソクラティック段階（isocratic step）で溶出し得る。これに対して、ＩＭＡＣは、金属−キレート樹脂に低い親和性を持つことが予測されるタンパク質の１次精製ステップとして考慮されてはいけない。
亜鉛−キレート・クロマトグラフィーは、ヒトインターロイキン−４（h IL−4）、ヒトインターロイキン−１０（h IL−10）、及びヒト組織プラスミノーゲン活性化剤（h tPA）の臨床的生産に用いられてきた。ＩＭＡＣは、ヒスチジン（His）と、固定相に可逆的に結合した金属イオンとの相互作用に主に依存する。固定化されたが、亜鉛は、その選択性のために広範囲に使用され、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｏ２＋のような他の金属イオンはまた、特定のタンパク質に適用される。固定化された金属と、タンパク質のトリプトファン、チロシン、またはシステイン残基との相互作用が報告されたが、これは一般的にさらに弱い相互作用である。さらに、ヒスチジンは、方向性残基または他のヒスチジン（例えば、アルファ螺旋の連続ターンの同じ位置）に近接して置かれたとき、高親和性を導く配位効果が観察される。Ｈｉｓ−Ｔｙｒ、Ｈｉｓ−Ｔｒｐ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｈｉｓを含むタンパク質のリーダー配列は、この現象を用いるように操作されてきたが、この配列は本質的・相対的に希である。このため、自然に発生するタンパク質を使用すれば、通常のＩＭＡＣ樹脂に対するタンパク質の親和性が、Ｈｉｓ側鎖であるイミダゾール（imidazole）の利用可能性によって指示されることを一般化することができる。
薬剤としてのＨＮＳに関する関心が高まるにつれて、コスト削減の方法で大量の高純度物質を製造する必要性が生じている。培養培地からＨＮＳを精製することが様々な報告書に報告されている（Hemsley et al.，Mol．Genet．Metab．90：313−328（2007））。
ＨＮＳの様々な精製方法が試みられたが、それらの方法は、限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）による緩衝液の交換に続く沈殿したタンパク質のろ過（例えば、収穫）、イオン交換クロマトグラフィーの条件でｐＨと伝導度を適切に合わせることの多数のステップを含む。このステップは、通常、フィルタの膜表面でのタンパク質の損失を招くだけでなく、精製期間及び精製の操作コストと資本コストを増加させる。
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼがタグ（例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇなど）を用いることなく、金属キレート・クロマトグラフィーを用いて精製できるかは、まだ報告されていない。
本発明は、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）を精製する簡単で効果的な方法を提供する。これは、ヒト治療用途のためのタンパク質の効率的な生産に好適である。
１．（ａ）一つまたは複数の不純物を含むスルファターゼ含有溶液を提供するステップと、（ｂ）金属アフィニティー・クロマトグラフィー樹脂を用いて、スルファターゼ含有溶液の第１クロマトグラフィー分離を行うステップと、（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、第２クロマトグラフィー分離を行うステップと、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、最終のクロマトグラフィー分離を行い、前記不純物を除去するステップとを含む、スルファターゼを精製する方法。
２．前記項目１において、前記金属アフィニティー・クロマトグラフィー樹脂は、２価の金属陽イオンに荷電される、方法。
３．前記項目２において、前記２価の金属は亜鉛である、方法。
４．前記項目１において、前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂及びマルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からなる群より選択される、方法。
５．前記項目１において、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、第３クロマトグラフィー分離を行うステップをさらに含み、前記第２クロマトグラフィー分離のステップで用いられる樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂であり、前記第３クロマトグラフィー分離のステップで用いられる樹脂は、マルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂である、方法。
６．前記項目１において、前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂および弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂からなる群より選択される、方法。
７．前記項目１において、前記スルファターゼは、活性サイトにカルシウムイオン、鉄イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される金属イオンを有する、方法。
８．前記項目１において、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（heparan−N−sulfatase）、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ、又はヒトリソソームセレブロシド−３−スルフェート３−スルホヒドロラーゼ（human lysosomal cerebroside−3−sulfate 3−sulfohydrolase））、アリールスルファターゼＢ（ＡＳＢ、又はヒトリソソームＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルフェート４−スルホヒドロラーゼ（N−acetylgalactosamine−4−sulfate 4−sulfohydrolase））、ヒトエストロン（oestrone）／デヒドロエピアンドロステロンスルファターゼ（dehydroepiandrosterone sulfatase）、ヒトリソソーム（Ｎ−アセチル）ガラクトサミン−６−スルファターゼ（（N−acetyl）galactosamine−6−sulfatase、ＧＡＬＮＳ）、緑膿菌由来のアリールスルファターゼ（arylsulfatase）、およびＢ．ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ ＰＧ２９５２（ＢｃＰＭＨ）由来のスルファターゼ／ヒドロラーゼ（hydrolase）からなる群より選択される、方法。
９．前記項目１において、低ｐＨウイルス不活性化のステップをさらに含む方法。
１０．前記項目９において、前記低ｐＨウイルス不活性化のステップは、第１クロマトグラフィー分離ステップの後および第２クロマトグラフィー分離ステップの前に行われるか、又は、第２クロマトグラフィー分離ステップの後および最終のクロマトグラフィー分離ステップの前に行われる、方法。
１１．前記項目５において、低ｐＨウイルス不活性化をさらに含む方法。
１２．前記項目１１において、前記低ｐＨウイルス不活性化のステップは、第１クロマトグラフィー分離ステップの後および第２クロマトグラフィー分離ステップの前に行われるか、又は、第２クロマトグラフィー分離ステップの後および第３クロマトグラフィー分離ステップの前に行われる、方法。
１３．前記項目１において、ウイルス濾過ステップをさらに含む、方法。
１４．前記項目１３において、前記ウイルス濾過ステップは、最終のクロマトグラフィー分離ステップの後に行われる、方法。
１５．前記項目１において、前記スルファターゼ含有溶液は、細胞培養収穫物および部分的に精製された中間溶液からなる群より選択される、方法。
一実施形態に係る方法は、希釈、緩衝液の交換、または限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によるｐＨ／伝導度の調整などの特定の処理をすることなく、収穫物を吸着剤にロードできる利点がある。
一実施形態に係る方法は、溶出をｐＨの変化及び／又は溶出剤（eluting agents）により行うことができる利点がある。
一実施形態に係る方法は、膜ろ過および関連装置（即ち、フィルターホルダー、運動ポンプ）のコストを軽減し、緩衝液の体積を減少させ、精製時間を短縮させることができる。
一実施形態に係る方法は、溶媒／界面活性剤の処理（Ｓ／Ｄ）によるウイルス不活性化を、収穫物に必要な化学物質を添加することにより、クロマトグラフィーの前に行うことができる利点がある。ウイルス不活性化にしばしば使用されるトリトン（Triton）Ｘ１００などの界面活性剤は、タンパク質の吸着剤への結合に影響を与えない。
一実施形態に係る方法は、低ｐＨによるウイルス不活性化を、吸着剤から特定のタンパク質を溶出後に行うことができる利点がある。金属キレート・クロマトグラフィーの場合、低ｐＨ溶出は、このステップ（通常ＵＦ／ＤＦであり、沈殿が発生した場合には濾過）の所要時間を最小限に抑えることができる。
一実施形態に係る方法は、必要な物質の量と時間の大幅な削減により精製工程を簡素化する利点がある。また、必要とされるウイルス不活性化のステップは、治療用タンパク質を精製する際に容易に実現できる。
図１は、ＨＮＳタンパク質のＺｎ−ＩＭＡＣ精製のクロマトグラムを示す。 図２は、ＨＮＳタンパク質のＺｎ−ＩＭＡＣ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。 図３は、ＨＮＳタンパク質のＳＰ−セファロース精製のクロマトグラムを示す。 図４は、ＨＮＳタンパク質のＳＰ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。 図５は、ＨＮＳタンパク質のＣａｐｔｏ ＭＭＣ精製のクロマトグラムを示す。 図６は、ＨＮＳタンパク質のＣａｐｔｏ ＭＭＣ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。 図７は、ＨＮＳタンパク質のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）精製のクロマトグラムを示す。 図８は、ＨＮＳタンパク質のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。 図９は、ＨＮＳタンパク質のＤＥＡＥ精製のクロマトグラムを示す。 図１０は、ＨＮＳタンパク質のＤＥＡＥ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。 図１１は、実施例１による精製方法のフローチャートを示す。 図１２は、ＳＰクロマトグラフィーの後、低ｐＨウイルス不活性化を行う実施例１による精製方法のフローチャートを示す。 図１３は、実施例２による精製方法のフローチャートを示す。 図１４は、ＳＰクロマトグラフィーの後、低ｐＨウイルス不活性化を行う実施例２による精製方法のフローチャートを示す。 図１５は、実施例３による精製方法のフローチャートを示す。
以下に詳細に説明するように、本発明者らは、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを含むが、これに限定されないスルファターゼの精製方法を開発した。これはタグ（例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇなど）を用いることなく、金属キレート・クロマトグラフィーを用いて精製される。
一実施形態では、（ａ）一つまたは複数の不純物を含むスルファターゼ含有溶液を提供するステップと、（ｂ）金属アフィニティー・クロマトグラフィー樹脂を用いて、スルファターゼ含有溶液の第１クロマトグラフィー分離を行うステップと、（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、第２クロマトグラフィー分離を行うステップと、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、最終のクロマトグラフィー分離を行い、前記不純物を除去するステップとを含む、スルファターゼを精製する方法を提供する。
一実施形態において、金属アフィニティー・クロマトグラフィー樹脂は、２価の陽イオンに荷電される。一実施形態において、２価の金属は亜鉛である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂およびマルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からなる群より選択される。一実施形態において、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＳＰセファロースである。一実施形態において、マルチモードの陽イオンクロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣである。
一実施形態において、スルファターゼを精製する方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、第３クロマトグラフィー分離を行うステップをさらに含み、前記第２クロマトグラフィー分離のステップで用いられる樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂であり、前記第３クロマトグラフィー分離のステップで用いられる樹脂は、マルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。一実施形態において、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＳＰセファロースである。一実施形態において、マルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣである。
一実施形態において、第１クロマトグラフィー分離ステップの陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂および弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂からなる群より選択される。一実施形態において、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）である。一実施形態において、弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂はＤＥＡＥである。
一実施形態において、精製されるスルファターゼは、活性サイトにカルシウムイオンを有する。一実施形態において、精製されるスルファターゼは、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（heparan−N−sulfatase）、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ、又はヒトリソソームセレブロシド−３−スルフェート３−スルホヒドロラーゼ（human lysosomal cerebroside−3−sulfate 3−sulfohydrolase））、アリールスルファターゼＢ（ＡＳＢ、又はヒトリソソームＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルフェート４−スルホヒドロラーゼ（N−acetylgalactosamine−4−sulfate 4−sulfohydrolase））、ヒトエストロン（oestrone）／デヒドロエピアンドロステロンスルファターゼ（dehydroepiandrosterone sulfatase）、ヒトリソソーム（Ｎ−アセチル）ガラクトサミン−６−スルファターゼ（（N−acetyl）galactosamine−6−sulfatase、ＧＡＬＮＳ）、緑膿菌由来のアリールスルファターゼ（arylsulfatase）、およびＢ．ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ ＰＧ２９５２（ＢｃＰＭＨ）由来のスルファターゼ／ヒドロラーゼ（hydrolase）からなる群より選択される。
一実施形態において、精製されるスルファターゼは、配列番号１と同じ配列を含む。一実施形態において、精製されるスルファターゼは、配列番号１と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、または４０％類似した配列を含む。
一実施形態において、スルファターゼを精製する方法は、低ｐＨウイルス不活性化のステップをさらに含む。一実施形態において、前記第１、第２および最終のクロマトグラフィー分離のステップを行うとき、低ｐＨウイルス不活性化のステップは、第１クロマトグラフィー分離ステップの後および第２クロマトグラフィー分離ステップの前に行うか、又は、第２クロマトグラフィー分離ステップの後および最終のクロマトグラフィー分離ステップの前に行うことができる。一実施形態において、前記第１、第２、第３および最終のクロマトグラフィー分離のステップを行うとき、低ｐＨウイルス不活性化のステップは、第１クロマトグラフィー分離ステップの後および第２クロマトグラフィー分離ステップの前に行うか、第２クロマトグラフィー分離ステップの後および第３クロマトグラフィー分離ステップの前に行うか、又は、第３クロマトグラフィー分離ステップの後および最終のクロマトグラフィー分離ステップの前に行うことができる。
一実施形態において、スルファターゼを精製する方法は、ウイルス濾過ステップをさらに含む。一実施形態において、ウイルス濾過ステップは、最終のクロマトグラフィー分離ステップの後に行われる。
一実施形態において、スルファターゼ含有溶液は、スルファターゼを含む任意の形態の溶液であってもよい。一実施形態において、スルファターゼ含有溶液は、細胞培養収穫物であってもよい。一実施形態において、スルファターゼ含有溶液は、部分的に精製された中間溶液であってもよい。一実施形態において、部分的に精製された中間溶液は、任意の前のクロマトグラフィー分離またはＵＦ／ＤＦによる任意の前の緩衝液の交換から得られた溶液であってもよい。
本明細書に記載の実施形態は、ＭＰＳ ＩＩＩＡの治療に使用するためのリソソーム酵素である、精製されたＨＮＳを製造する方法を提供するものである。本明細書に記載の実施形態は、精製されたＨＮＳ組成物で対象体（例えば、ＭＰＳ ＩＩＩＡを有する対象体）を治療する方法を提供するものである。ＨＮＳを精製する方法は、当業界で公知のものである。たとえば、Hemsley et al.，Mol．Genet．Metab．90：313−328（2007）； 米国公開特許２００９／０１８６０１１のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示する方法によるＨＮＳの製造及び精製は、汚染物の量が減少したＨＮＳを提供する。本明細書に開示する方法により製造されるＨＮＳは、特に治療薬としての使用に好適である（例えば、ＭＰＳ ＩＩＩＡの治療）。
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（配列番号１）は、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（N−sulphoglucosamine sulphohydrolase）；ＳＧＳＨ；ＥＣ ３．１０．１．１；Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（N−sulfoglucosamine sulfohydrolase）；２−デスオキシ（desoxy）−Ｄ−グルコシド（glucoside）−２−スルファメートスルホヒドロラーゼ（sulphamate sulphohydrolase（スルファメートスルホヒドロラーゼ（sulphamate sulphohydrolase））；ヘパリンスルファミダーゼ（heparin sulfamidase）；スルホグルコサミンスルファミダーゼ（sulfoglucosamine sulfamidase）；スルファミダーゼ（sulphamidase）；ＨＮＳ、ｒｈＨＮＳ、スルファミダーゼ（sulfamidase）、ｒｈＮＳ、およびｒｈＳＧＳＨで呼ばれる当業界で公知のリソソーム酵素である。本明細書で使用される用語「ＨＮＳ」は、この酵素の機能的断片及び／又はその誘導体、およびその薬学的に許容される形態を含む。ヘパラン−Ｎ−スルファターゼは、Online Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）の識別番号ＯＭＩＭ ６０５２７０と関連があり、その項目は、オンライン（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/605270）から提供される。このオンライン項目の内容全体、及びここにリンクされたすべてのページは、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語「ＨＮＳ組成物」は、様々な純度のＨＮＳを含む任意の組成物を意味する。
本明細書で使用される用語「実質的に純粋な」とは、タンパク質またはポリペプチドに、意図した用途のために実用的で適切な程度に他の物質が本質的にないことを意味する。特に、タンパク質は十分に純粋であり、例えば、薬学的製剤に有用であるために、宿主細胞及びウイルスの他の生物学的成分が十分に排除されている。本明細書で使用される用語「実質的に純粋なＨＮＳ」は、分離されるか合成されたＨＮＳおよび汚染物が約９０％以上ないＨＮＳの製造である。好ましくは、物質は、汚染物が８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上ないか、さらには９９％以上ないものである。純度は、当業界で公知の方法により評価することができる。
本明細書で使用される用語「治療」及び「治療する」は、対象体で病気の進行を有益に変更するか、又は遮断することをいう。
本明細書および特許請求の範囲に使用される単数の表現は、文脈上明らかに異なる意味にならない限り、複数の表現を含む。したがって、例えば「ドメイン」は、複数のドメインを含み、「タンパク質」は、一つ以上のタンパク質を含む。
ＨＮＳは、自然に発生する酵素であるので、典型的にタンパク質を製造するのに適切な宿主細胞から取得された細胞培養上清液から分離することによって製造される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＮＳを生成するように遺伝子操作されたものである。例えば、ＨＮＳを生成する細胞器官を担当する遺伝子は、バクテリアまたは真菌などの微生物に存在し得る。他の実施形態では、ＨＮＳを生成する細胞器官を担当する遺伝子は、哺乳動物細胞に存在し得る。使用できる哺乳動物の非限定的な例は、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（NSO／l，ECACC No：85110503）；ヒト網膜芽細胞（PER．C6，CruCell，Leiden，The Netherlands）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（COS−7、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎臓系（懸濁培養における増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Grahamら、J．Gen Virol.，36:59，1977）；ヒト繊維肉腫細胞株（HT1080）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（CHO，Urlaub and Chasin，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77：4216、1980）；マウスセルトリ細胞（TM4，Mather，Biol．Reprod.，23：243−251，1980）；サル腎臓細胞（CV1 ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO−76、ATCC CRL−1587）；ヒト頸部癌種細胞（HeLa、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、HB 8065）；マウス乳癌（MMT 060562、ATCC CCL51）；ＴＲＩ細胞（Mather et al.，Annals NY Acad．Sci.，383：44−68，1982）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓細胞株（Hep G2）を含む。
本明細書に示す一側面では、宿主細胞の培地条件は、汚染物を最小限の量で含む多量のＨＮＳを生成するように最適化される。本明細書に示す他の側面では、ＨＮＳを精製する方法は、生物学的物質、特に出発物質のサンプルまたはバルク物質と呼ばれる、ＨＮＳと他の汚染タンパク質を含む粗（crude）混合物と共に使用するためのものである。本明細書に示す一側面によると、ＨＮＳを精製する方法は、特にバルク物質または組換え工程の培養培地の粗製造物からヒト組換えＨＮＳ（ｒｈＨＮＳ）を精製するための方法に関するものである。本発明の方法で得られたｒｈＨＮＳは、高い純度及び高い固有活性度（例えば、少なくとも１０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも１５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも２０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも２５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも３０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも３５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも４０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも４５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも４７ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも５０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも６０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも７０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも７５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも８５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも９０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、少なくとも１００ｕｎｉｔｓ／ｍｇまたはそれ以上の範囲）を有し、培養培地に存在する宿主細胞タンパク質および組換え工程で使用される宿主細胞に含まれる核酸または他の汚染物を含まない。
一実施形態において、ＨＮＳサンプルは、初期に細胞培養上層液を集めて構成される。粗溶液は濾過又は濃縮され、バルク物質を収得するために、細胞培養物由来の汚染物を除去する一つ以上のステップを行うことが考えられる。本明細書に開示する精製工程は、好ましい純度のＨＮＳを収得するために、１以上の後続のクロマトグラフィーステップ（例えば、少なくとも１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上のクロマトグラフィーステップ）を含むことができる。
一実施形態において、半（semi）精製された物質は、まず、メルカプト−エチル−ピリジンに露出することで捕獲される。一実施形態において、メルカプト−エチル−ピリジンは、セルロースマトリックスに連結された４−メルカプト−エチル−ピリジンである。
他の実施形態において、ＨＮＳ物質は追加的に精製される前にウイルス不活性化が行われる。ウイルス不活性化は、例えば、１％Ｔｗｅｅｎ ８０および０．３％ＴｎＢＰを工程中にＨＮＳサンプルまたは培地に添加し、周囲温度で３〜１６時間維持することによって行うことができる。このステップは、精製工程の初期ステップで行うことができる。その後、ＴｎＢＰは、ポリシングステップの間に生成物から除去されるべきである。また、０．２μｍフィルタを用いたＨＮＳ組成物のろ過は、任意のロード（loading）ステップに含まれ得る。
また他の実施形態において、生成されたＨＮＳ物質は、カラムクロマトグラフィー精製の前に選択的に体積が減少する。他の実施形態において、体積はカラムクロマトグラフィーステップの後、濃縮されたＨＮＳ溶出液の回収後に減少する。
一実施形態において、一連のクロマトグラフィーステップによるＨＮＳを精製する方法および工程が含まれる。一実施形態において、開示されるそれぞれのカラムクロマトグラフィー精製ステップは、必ずしも行われる必要はない。同様に、多重カラムクロマトグラフィーステップが開示れた範囲で、そのようなステップは、順次に、又は記載された順序で実行される必要はない。例えば、一実施形態において、ＨＮＳは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回のカラムクロマトグラフィー精製ステップを用いて精製される。同様に、一実施形態において、言及された１以上のカラムクロマトグラフィーステップを複数回行うことができる。一実施形態において、１回以上のクロマトグラフィーステップは、クロマトグラフィー媒質または樹脂のロード、平衡化、洗浄、および溶出を含む。それぞれのクロマトグラフィー精製ステップの順次実行に関する前記の言及にもかかわらず、それぞれのカラムクロマトグラフィー精製ステップを含むそれぞれの構成要素は、記載された順序通りに行うものと理解すべきである。例えば、通常の技術者によって理解されるように、ロード、平衡化、洗浄および溶出のステップは、一般的に各クロマトグラフィー精製ステップを含み、記載された順序で実行される。
例示的な精製技術は、バッチ（batch）クロマトグラフィー及びカラムクロマトグラフィーを含む。一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、精製過程で一連のクロマトグラフィー媒質に接触する。一実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、１つ以上の陰イオン交換樹脂を含む。他の実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、１つ以上の疎水性相互作用樹脂を含む。また他の実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、１つ以上の水酸化燐灰石（hydroxyapatite）樹脂を含む。また他の実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、１つ以上の陽イオン交換樹脂を含む。
一実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、陰イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、水酸化燐灰石樹脂および陽イオン交換樹脂を含む。一実施形態では、抽出物は、Ｑセファロースでパックされたカラムを使用し、次いでフェニルセファロースでパックされたカラムを使用し、次にセラミック水酸化燐灰石Ｉ型でパックされたカラムを使用し、最後にＳＰセファロースでパックされた他のカラムを使用して精製される。抽出物を精製するために、考慮されたステップをすべて実行する必要はない。例えば、一実施形態において、抽出物は、Ｑセファロースでパックされたカラムを使用し、次いでフェニルセファロースでパックされたカラムを使用し、次にセラミック水酸化燐灰石Ｉ型でパックされたカラムを使用して精製される。同様に、抽出物を精製するために、考慮されたステップのすべてを任意の特定の順序で実行する必要はない。例えば、一実施形態において、抽出物は、Ｑセファロースでパックされたカラムを使用し、次いでフェニルセファロースでパックされたカラムを使用し、次にＳＰセファロースでパックされたカラムを使用し、最後にセラミック水酸化燐灰石Ｉ型でパックされた他のカラムを使用して精製される。各々の実施形態において、各々のカラムは、選択的に緩衝液または他の水溶液で洗浄され、水溶液を使用してＨＮＳを溶出させる。一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、各ステップの間にクロマトグラフィー媒質から溶出される。各溶出ステップは、次の精製ステップに進む前に１回以上繰り返すことができる。一実施形態において、抽出物は、ろ過によりさらに精製される。一実施形態において、抽出物は、クロマトグラフィーの前または後にウイルス不活性化され；ウイルス除去はクロマトグラフィーステップでまた行うことができる。
一実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、陰イオン交換樹脂を含む。一実施形態において、ＨＮＳ組成物を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と接触させることは、例えば、第１、第２、第３または第４のクロマトグラフィーステップである。クロマトグラフィー樹脂または媒質は、例えば、GE HealthCare，Tosoh Biosciences，Applied Biosystems，Bio−Rad，and Pallの樹脂を含んで様々に使用することができる。適切な陰イオン交換クロマトグラフィー媒質は、例えば、ジエチルアミノエチル（diethylaminoethyl、ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（quaternary aminoethyl、ＱＡＥ）または第四級アンモニウム（quaternary ammonium、Ｏ）樹脂である。一実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｑセファロースファストフローレジン（Q Sepharose Fast Flow resin）である。
他の実施形態において、ＨＮＳの精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のステップを含む。一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、精製工程の中間ステップとして疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に接触される。他の実施形態において、ＨＮＳ組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に接触させることは、例えば、第１、第２、第３または第４のクロマトグラフィーステップである。適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質は、例えば、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシル、プロピル、ＰＰＧ、またはエーテルを含む。一実施形態において、ＨＮＳ抽出物の精製は、フェニルセファロース６ファストフローカラムを用いて行われる。一実施形態において、ＨＮＳ組成物または疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂との接触による溶出液は、水酸化燐灰石クロマトグラフィー樹脂とさらに接触される。
また他の実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、水酸化燐灰石（ＨＡ）樹脂を含む。他の実施形態において、ＨＮＳ組成物を水酸化燐灰石樹脂と接触させることは、例えば、第１、第２、第３または第４のクロマトグラフィーステップである。一実施形態において、ＨＮＳを含む抽出物は、セラミック水酸化燐灰石Ｉ型でパックされたカラムを用いて精製される。一実施形態において、ＨＮＳを含む抽出物は、セラミック水酸化燐灰石ＩＩ型でパックされたカラムを用いて精製される。他の実施形態において、ＨＮＳ組成物または水酸化燐灰石クロマトグラフィー樹脂との相互作用で得られた溶出液は、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂と接触される。
一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップを用いて精製される。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーステップを用いる精製は、ＨＮＳ精製において中間ステップである。他の実施形態において、ＨＮＳを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂と接触させることは、第１、第２、第３、第４または最終のクロマトグラフィーステップである。一実施形態において、クロマトグラフィー媒質または樹脂は、陽イオン交換樹脂を含む。適切な陽イオン交換クロマトグラフィー媒質は、例えば、カルボキシメチル（carboxymethyl、ＣＭ）、スルホプロピル（sulfopropyl、ＳＰ）又はメチルスルホネート（methyl sulfonate、Ｓ）のようなクロマトグラフィー媒質を含む。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＳＰセファロースファストフローレジンである。
一実施形態において、陽イオン交換ステップの後に取得したＨＮＳは、ろ過がさらに行われる。一実施形態において、ＨＮＳは、例えばダイアフィルトレーション（diafiltration）または限外ろ過（ultrafiltration）により濾過を行うことができる。
一つのステップにおいて、精製は、粗ＨＮＳを含む物質がマトリックス上にロードされ、事前平衡化（pre−equilibrated）される時に起こる。その後、マトリックスは、不純物を除去するために洗浄される。カラムの特性は、様々な勾配による溶出を可能にする孔（bore）のサイズと長さに変更できる。通常の技術者に理解されるように、洗浄及び溶出溶媒は、その環境で使用されるマトリックスおよびＨＮＳの極性によって決定される。
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂によるバルクＨＮＳ組成物からＨＮＳを溶出及び／又は精製することは、ｐＨレベルの調整時に最適化できる。例えば、ｐＨ７．０は、溶出および精製を最適化することが示された。このため、一実施形態において、精製されていないバルクＨＮＳ組成物のｐＨは、ＨＮＳを陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に接触させる前に約７．０のｐＨに調整される。一実施形態において、陰イオン交換カラムにロードされた物質は、酢酸ナトリウムが約５０ｍＭ〜１００ｍＭに調整される。一実施形態において、陰イオン交換樹脂にロードされたＨＮＳ組成物を含む溶液は、約５０〜１００ｍＭの濃度の酢酸ナトリウムを有する。ＨＮＳ組成物の約３〜４ｍＳ／ｃｍの伝導度は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して、高いｐＩ ＨＮＳ種の除去を促進することが示された。このため、一実施形態において、ＨＮＳ組成物の伝導度は、ＨＮＳ組成物を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に接触させる前に、約３〜４ｍＳ／ｃｍの伝導度を得るように調整される。他の実施形態において、伝導度は、ＨＮＳ組成物を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に接触させる前に約３．５ｍＳ／ｃｍに調整される。一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、陰イオン交換カラムにロードされる前にウイルス不活性化される。また他の実施形態において、ＨＮＳ組成物は、陰イオン交換カラムにロードされる前に０．２μｍフィルタを用いてろ過される。
一実施形態において、陰イオン交換カラムは、陰イオン交換カラムから濃縮されたＨＮＳ組成物が溶出される前に、約７．０のｐＨで約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓと約２０ｍＭ ＮａＣｌを含む約５カラム体積の緩衝液で洗浄される。一実施形態において、各クロマトグラフィー樹脂との接触の間に、追加の溶出ステップがある。一実施形態において、ＨＮＳは、約７．０のｐＨで約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓと約１８０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出される。一実施形態において、通過および洗浄ステップで濃縮されたＨＮＳの回収率は、吸光単位、酵素活性またはＥＬＩＳＡによって測定される。一実施形態において、宿主細胞タンパク質の除去率は、このステップの後、約２倍である。一実施形態において、工程は、高いｐＩ ＨＮＳの約１０〜２５％を除去する。また他の実施形態において、高いｐＩ ＨＮＳの除去は、改善された溶解度をもたらす。
一実施形態において、疎水性相互作用樹脂は、ＨＮＳ組成物を疎水性相互作用カラムに接触させる前に、約７．０のｐＨおよび約９０〜１２０ｍＳ／ｃｍの伝導度で約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓと約１．１〜１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを含む緩衝液で平衡化される。この濃度、ｐＨおよび伝導度は、ＨＮＳの疎水性相互作用カラムへの結合を促進し、ＨＮＳ組成物の精製を最適化する。
一実施形態において、濃縮されたＨＮＳを含む陰イオン交換クロマトグラフィーステップからの溶出液は、疎水性相互作用ステップのための出発物質である。一実施形態において、ＨＮＳ組成物のＮａＣｌの濃度は、ＨＮＳ組成物を疎水性相互作用カラムに接触させる前に約１．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度に調整される。他の実施形態において、ＮａＣｌの濃度は、ＨＮＳ組成物を疎水性相互作用カラムに接触させる前に約１．２Ｍに調整される。ＨＮＳ組成物のｐＨは、疎水性相互作用カラムに接触される前に約７．０に調整される。一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、疎水性相互作用カラムに接触させる前に２５℃で約８５〜１２０ｍＳ／ｃｍの伝導度を得るように調整される。一実施形態において、ＨＮＳ組成物は、疎水性相互作用カラムに接触する前に２５℃で約９０〜１１０ｍＳ／ｃｍの伝導度を得るように調整される。
一実施形態において、疎水性相互作用樹脂に吸着されたＨＮＳ組成物は、約７．０のｐＨで、不純物および約１．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを洗い流すために、約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓを含む約４カラム体積の緩衝液で洗浄される。他の実施形態において、ＮａＣｌの濃度は約１．２Ｍである。
一実施形態において、疎水性相互作用カラムは、濃縮されたＨＮＳ組成物を疎水性相互作用カラムから溶出するために、約７．０のｐＨで２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約１８０〜２２０ｍＭ ＮａＣｌを含む約４カラム体積の緩衝液で溶出される。一実施形態において、追加の溶出ステップを含むことができる。
一実施形態において、ＨＮＳは、精製されたＨＮＳの回収を最適化するために、約ｐＨ７．０で約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂から２５℃で約１９〜２３ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導度で溶出される。他の実施形態において、ｐＨの範囲は、約６．９〜７．１である。一実施形態において、通過および洗浄ステップで濃縮されたＨＮＳの回収率は、吸光単位、酵素活性またはＥＬＩＳＡによって測定される。一実施形態において、宿主細胞タンパク質の除去率は、このステップの後、約３５〜４５倍である。
一実施形態において、疎水性相互作用カラムから得られた、濃縮されたＨＮＳの集められた溶出液は、水酸化燐灰石カラムを使用する精製のための出発物質として使用できる。一実施形態において、疎水性相互作用カラムによる溶出後、ＨＮＳ組成物を含む溶液は、精製を最適化するために、約２ｍＭ〜４ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）で調整される。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は、約２ｍＭ、ｐＨは約７．０＋０．１に調整される。一実施形態において、平衡緩衝液は、約ｐＨ７．０で約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓと約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一実施形態において、平衡緩衝液のｐＨは、約７．０〜７．２に調整される。また他の実施形態において、ＨＮＳ組成物は、陰イオン交換カラムにロードされる前に０．２μｍフィルタを用いてろ過される。他の実施形態において、平衡緩衝液は、約７．０のｐＨで約２ｍＭ リン酸ナトリウム、約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
一実施形態において、水酸化燐灰石カラムは、濃縮されたＨＮＳ組成物が水酸化燐灰石カラムから溶出される前に、約７．０〜７．２のｐＨで約２ｍＭ〜４ｍＭのＮａＰＯ４、約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む約４カラム体積の緩衝液で洗浄される。他の実施形態において、洗浄緩衝液は、約７．０のｐＨで約２ｍＭ ＮａＰＯ４、約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
一実施形態において、水酸化燐灰石カラムと接触されたＨＮＳは、約７．４〜７．６のｐＨで２５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む溶液で溶出される。他の実施形態において、水酸化燐灰石カラムにロードされたＨＮＳは、約７．０〜７．６のｐＨで約２ｍＭ〜３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む溶出液で溶出される。一実施形態において、溶出緩衝液は、約７．５＋０．１のｐＨで約２０ｍＭ ＮａＰＯ４、約２０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓを含む。一実施形態において、溶出ステップは、少なくとも一度繰り返すことができる。一実施形態において、通過および洗浄ステップで濃縮されたＨＮＳの回収率は、吸光単位、酵素活性またはＥＬＩＳＡによって測定される。
一実施形態において、水酸化燐灰石カラムから得られた、濃縮されたＨＮＳの集められた溶出液は、陽イオン交換カラムを使用する精製のための出発物質として使用できる。他の実施形態において、出発物質中のＨＮＳ組成物は、ＨＮＳの陽イオン樹脂への結合を最適化するために、陽イオン交換カラムにロードする前に約３〜４ｍＳ／ｃｍの伝導度を得るように調整される。一実施形態において、伝導度は約３ｍＳ／ｃｍに調整され、溶液はＨＮＳの陽イオンカラムへの結合を最適化するために、約ｐＨ５．０で約２０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。また他の実施形態において、陽イオン交換樹脂にロードされるＨＮＳ組成物の伝導度は約４ｍＳ／ｃｍであり、溶液は、ＨＮＳの陽イオンカラムへの結合を最適化するために、約ｐＨ５．０で約４０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。他の実施形態において、陽イオン交換樹脂にロードされるＨＮＳ組成物の伝導度は、約３．５ｍＳ／ｃｍ＋０．５であり、ｐＨは約５．０である。他の実施形態において、ＨＮＳ組成物は、陽イオン交換カラムにロードされる前に０．２μｍフィルタを用いてろ過される。
一実施形態において、平衡緩衝液は、約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２０〜４０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨは約５．０である。一実施形態において、平衡緩衝液のｐＨは、約４．９〜５．１に調整される。他の実施形態において、平衡緩衝液は、約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約５．０、伝導度が約５〜７ｍＳ／ｃｍの範囲である。
一実施形態において、陽イオン交換カラムは、濃縮されたＨＮＳ組成物が陽イオン交換カラムから溶出される前に、約５．０〜７．２のｐＨで約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２０〜４０ｍＭのＮａＣｌを含む約４カラム体積の緩衝液で洗浄される。他の実施形態において、洗浄緩衝液は、約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約５．０、伝導度が約５〜７ｍＳ／ｃｍの範囲である。
一実施形態において、陽イオン交換樹脂からのＨＮＳの溶出は、約４．９〜５．１のｐＨで約５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約９０〜１００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出液で行われる。一実施形態において、陽イオン交換樹脂からのＨＮＳの溶出は、約５．０＋０．１のｐＨで約５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約９０ｍＭのＮａＣｌを含む溶出液で行われる。一実施形態において、溶出液は、約１２〜１４ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導度を有する。一実施形態において、溶出ステップは、少なくとも一度繰り返すことができる。一実施形態において、通過及び洗浄ステップで濃縮されたＨＮＳの回収率は、吸光単位、酵素活性またはＥＬＩＳＡによって測定される。
本明細書に記載の他の実施形態では、前記方法で精製されたＨＮＳは、汚染物が９０％以上ない純度レベルに分離される。好ましくは、物質は、汚染物が８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらには９９％以上ない。純度は、当業界で公知の任意の適切な方法で評価することができる。
本明細書に記載の生成物および方法は、グリコサミノグリカンが病気の発達及び／又は進行に重要なものと知られている対象体で任意の病気／状態を治療及び／又は予防するのに有用であり得る。一実施形態では、ＨＮＳが作用しないか不在の対象体で任意の病気または状態を治療及び／又は予防するのに特に有用である。病気を治療することは、また、病気又は病気の症状から所望の改善をもたらすことを含む。
本明細書に開示される組成物は、対象体においてムコ多糖症またはその後遺症に関連する疾患を治療するために、単独で又は他の治療剤と組み合わせて使用することができる。追加の治療剤は、組成物の投与前に投与されるか、同時または後に投与することができる。対象体は、例えばヒトであってもよく、非ヒト脊椎動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタであってもよい。
一実施形態において、精製されたＨＮＳ組成物のために、製剤緩衝液は、５ｍＭのリン酸ナトリウム、１４５ｍＭのＮａＣｌのようなリン酸緩衝液であってもよく、ｐＨは７．０であってもよい。他の適切な緩衝液は、通常の技術者に公知のものであってもよい。
一実施形態において、最終のＨＮＳ濃度は、リットル当たり５ｇ以上、リットル当たり１０ｇ以上、リットル当たり１５ｇ以上、リットル当たり２０ｇ以上である。
本明細書に記載の精製されたＨＮＳ組成物は、局所（目、膣を含む粘膜、直腸内投与を含む）、肺（例えば、噴霧器によるものを含み、粉末またはエアロゾルの吸入または注入、気管内、鼻腔内）、経口または非経口投与することができる。一実施形態において、非経口投与が好ましく、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、頭蓋内、脊髄腔内または心室内投与を含む。
本明細書に記載の実施形態を以下の実施例により更に説明するが、これは限定的なものと解釈されてはならない。発明の説明および請求の範囲に使用される単数の表現は、文脈上明らかに異なる意味にならない限り、複数の表現を含むと理解すべきである。グループの１つ以上の構成要素間に「または」を含む請求項または記載は、そうではないと示されない限り、または文脈から明らかでない限り、１つ、１つ以上、またはすべてのグループ構成要素が所与の生成物またはプロセスに、存在し、用いられ、または関連することを満たすと見なされる。本発明は、ただ１つのグループ構成要素が、所与の生成物またはプロセスに、存在し、用いられ、または関連する実施形態を含む。本発明は、グループの１つ以上またはすべての構成要素が、所与の生成物またはプロセスに、存在し、用いられ、または関連する実施形態を含む。さらに、他で示さないか、矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本発明が、列挙した１つ以上の請求項由来の１つ以上の制限、要素、節、記述用語などが、同一の基本請求項に依存した別の請求項（または、関連する場合、任意の他の請求項）に導入される全ての変形形態、組み合わせ、および置換を含むと理解すべきである。要素がリスト（例えば、マーカッシュグループまたは類似の形式）として存在する場合、要素の各下位集団も開示され、任意の要素を群から除去することができると理解すべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の一定の実施形態または本発明の態様は、かかる要素、特徴などからなるか本質的になると理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、あらゆる場合に、本明細書中に具体的に正確に引用して記載されていない。特定の排除を明細書中で引用するかどうかと無関係に、本発明の任意の実施形態を特許請求の範囲から明確に排除することができるとも理解すべきである。本明細書に引用される全ての参考文献（文献参照、登録特許、公開特許出願、及びウェブサイトを含む）の全ての内容は、明らかに参照として組み込まれる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。これらの例は、単なる例示を目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは、通常の技術者にとって明らかであろう。
実施例１
すべてのクロマトグラフィーステップは、室温で行われた。図１１は、実施例１による精製方法のフローチャートを示す。クロマトグラフィー装置：Akta Explorer、Akta Purifier 100、またはGE HealthcareのAkta Pilot。
５Ｍ ＮａＣｌを浄化された収穫物に添加し、ＮａＣｌを０．５Ｍの濃度とした。１Ｍ Ｔｒｉｓを添加してｐＨを７．２〜７．６に調整した。
ＩＭＡＣセファロースでパックされたカラム（カラム体積５ｍｌ、３０ｍｌまたは２００ｍｌ、カラムタイプは、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐ、またはＸＫ１６、またはＸＫ５０）は、蒸留水（２ＣＶ）、緩衝液Ａ−２０−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．５−（２ＣＶ）、蒸留水（１．５ＣＶ）で洗浄された。その後、０．１〜０．２Ｍ ＺｎＣｌ２（１ＣＶ）、次いで蒸留水（１．５ＣＶ）を通過させることにより、Ｚｎ２＋に荷電され、緩衝液Ａ（２ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された収穫物は、流量５０〜１５０ｃｍ／ｈの平衡化されたＩＭＡＣカラムにロードされ、緩衝液Ａ（５ＣＶ）、Ｂ−２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１〜２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．５（１０ＣＶ）、Ｃ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０〜１０％ ｉ−ＰｒＯＨ、ｐＨ６．４（１０ＣＶ）、Ｄ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２（５ＣＶ）で洗浄された。ＨＮＳは、流量２５〜７５ｃｍ／ｈで緩衝液Ｅ（２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０〜１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２）によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０〜５０ｍＡＵのとき、溶出液１の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５〜１０％に落ちたとき、収得を停止した。
カラムを０．５Ｍ ＥＤＴＡ（３ＣＶ）、次いで０．５Ｍ ＮａＯＨ（５ＣＶ）および蒸留水（３ＣＶ）で剥離した。そして、２０％エタノールに保存した。
図１は、Ｚｎ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図２は、ＨＮＳタンパク質のＺｎ−ＩＭＡＣ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
溶出液１は、ウイルス不活性化のために室温で１〜３時間、低ｐＨで培養された。その後、溶出液１は、緩衝液Ｇ（２０−５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２）で伝導度が８ｍＳ／ｃｍ未満になるように希釈された。
ＳＰセファロース（GE Healthcare）でパックされたカラム（体積５〜３０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐまたはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｆ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１〜１５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液１は、流量５〜６０ｃｍ／ｈの平衡化されたＳＰカラムにロードされ、緩衝液Ｆ（１０ＣＶ）、Ｇ（５ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｈ−２０−５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０−２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が５０ｍＡＵのとき、溶出液２の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
カラムを１Ｍ ＮａＣｌ（３ＣＶ）、次いで０．５Ｍ ＮａＯＨ（５ＣＶ）および蒸留水（３ＣＶ）で剥離した。そして、２０％エタノールに保存した。
図３は、ＳＰクロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図４は、ＨＮＳタンパク質のＳＰ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
溶出液２は、次の精製ステップの前に、緩衝液Ｇで５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度になるように希釈した。
Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（GE Healthcare）でパックされたカラム（体積１〜１０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐまたはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｇ（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液２は、流量１００〜３００ｃｍ／ｈの平衡化されたＭＭＣカラムにロードされ、緩衝液Ｇ（１０ＣＶ）で洗浄され、ＨＮＳは、緩衝液Ｉ−２０−５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、３００−４００Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０ｍＡＵのとき、溶出液３の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
図５は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣクロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図６は、ＨＮＳタンパク質のＭＭＣ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
溶出液３は、次の精製ステップの前に、緩衝液Ｊ−２０−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度になるように希釈した。
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）（Merk）でパックされたカラム（体積１〜１０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＴｒｉｃｏｒｎ５、またはＴｒｉｃｏｒｎ１０、またはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）、０．１Ｎ ＨＣｌ（３ＣＶ）、蒸留水（２ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｊ（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液３は、流量４０〜３００ｃｍ／ｈの平衡化されたカラムにロードされ、緩衝液Ｊ（１０ＣＶ）で洗浄され、ＨＮＳは、緩衝液Ｋ−２０−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０−２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０ｍＡＵのとき、溶出液４の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
図７は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）クロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図８は、ＨＮＳタンパク質のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
実施例２
すべてのクロマトグラフィーステップは、室温で行われた。図１３は、実施例２による精製方法のフローチャートを示す。クロマトグラフィー装置：Akta Explorer、またはAkta Purifier 100、またはGE HealthcareのAkta Pilot。
５Ｍ ＮａＣｌを浄化された収穫物に添加し、ＮａＣｌを０．５Ｍの濃度とした。１Ｍ Ｔｒｉｓを添加してｐＨを７．２〜７．６に調整した。
ＩＭＡＣセファロースでパックされたカラム（カラム体積５ｍｌ、３０ｍｌまたは２００ｍｌ、カラムタイプはＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐ、またはＸＫ１６、またはＸＫ５０）は、蒸留水（２ＣＶ）、緩衝液Ａ−２０−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．５−（２ＣＶ）、蒸留水（１．５ＣＶ）で洗浄された。その後、０．１〜０．２Ｍ ＺｎＣｌ２（１ＣＶ）、次いで蒸留水（１．５ＣＶ）を通過させることにより、Ｚｎ２＋に荷電され、緩衝液Ａ（２ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された収穫物は、流量５０〜１５０ｃｍ／ｈの平衡化されたＩＭＡＣカラムにロードされ、緩衝液Ａ（５ＣＶ）、Ｂ−２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１〜２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．５（１０ＣＶ）、Ｃ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０〜１０％ ｉ−ＰｒＯＨ、ｐＨ６．４（１０ＣＶ）、Ｄ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２（５ＣＶ）で洗浄された。ＨＮＳは、流量２５〜７５ｃｍ／ｈで緩衝液Ｅ（２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０〜１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２）によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０〜５０ｍＡＵのとき、溶出液１の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５〜１０％に落ちたとき、収得を停止した。
カラムを０．５Ｍ ＥＤＴＡ（３ＣＶ）、次いで０．５Ｍ ＮａＯＨ（５ＣＶ）および蒸留水（３ＣＶ）で剥離した。そして、２０％エタノールに保存した。
図１は、Ｚｎ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図２は、ＨＮＳタンパク質のＺｎ−ＩＭＡＣ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
溶出液１は、ウイルス不活性化のために室温で１〜３時間、低ｐＨで培養された。その後、溶出液１は、緩衝液Ｇ（２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２）で伝導度が８ｍＳ／ｃｍ未満になるように希釈された。
ＳＰセファロース（GE Healthcare）でパックされたカラム（体積５〜３０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐまたはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｆ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１〜１５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液１は、流量５〜６０ｃｍ／ｈの平衡化されたＳＰカラムにロードされ、緩衝液Ｆ（１０ＣＶ）、Ｇ（５ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｈ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が５０ｍＡＵのとき、溶出液２の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
カラムを１Ｍ ＮａＣｌ（３ＣＶ）、次いで０．５Ｍ ＮａＯＨ（５ＣＶ）および蒸留水（３ＣＶ）で剥離した。そして、２０％エタノールに保存した。
図３は、ＳＰクロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図４は、ＨＮＳタンパク質のＳＰ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
溶出液２は、次の精製ステップの前に５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度になるように１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ７．４に調整し、緩衝液Ｊに希釈した。
ＤＥＡＥセファロース（GE Healthcare）でパックされたカラム（体積１〜１０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐまたはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）、０．１Ｎ ＨＣｌ（３ＣＶ）、蒸留水（２ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｊ（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液２は、流量４０〜３００ｃｍ／ｈの平衡化されたカラムにロードされ、緩衝液Ｊ（１０ＣＶ）で洗浄された。ＨＮＳは、緩衝液Ｋ−２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４によって７０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０ｍＡＵのとき、溶出液３の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
図９は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによるＨＮＳタンパク質精製の特徴的なクロマトグラムを示す。
図１０は、ＨＮＳタンパク質のＤＥＡＥ精製の銀染色ゲル及びウエスタンブロットゲルを示す。
実施例３
すべてのクロマトグラフィーステップは、室温で行われた。図１５は、実施例３による精製方法のフローチャートを示す。クロマトグラフィー装置：Akta Explorer、またはAkta Purifier 100、またはGE HealthcareのAkta Pilot。
５Ｍ ＮａＣｌを浄化された収穫物に添加し、ＮａＣｌを０．５Ｍの濃度とした。１Ｍ Ｔｒｉｓを添加してｐＨを７．２〜７．６に調整した。
ＩＭＡＣセファロースでパックされたカラム（カラム体積５ｍｌ、３０ｍｌまたは２００ｍｌ、カラムタイプは、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐ、またはＸＫ１６、またはＸＫ５０）は、蒸留水（２ＣＶ）、緩衝液Ａ−２０−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．５−（２ＣＶ）、蒸留水（１．５ＣＶ）で洗浄された。その後、０．１〜０．２Ｍ ＺｎＣｌ２（１ＣＶ）、次いで蒸留水（１．５ＣＶ）を通過させることにより、Ｚｎ２＋に荷電され、緩衝液Ａ（２ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された収穫物は、流量５０〜１５０ｃｍ／ｈの平衡化されたＩＭＡＣカラムにロードされ、緩衝液Ａ（５ＣＶ）、Ｂ−２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１〜２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．５（１０ＣＶ）、Ｃ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０〜１０％ｉ−ＰｒＯＨ、ｐＨ６．４（１０ＣＶ）、Ｄ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２（５ＣＶ）、Ｅ（２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、０〜２５ｍＭ ＮａＣｌ、１〜２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２）で洗浄された。ＨＮＳは、流量２５〜７５ｃｍ／ｈで緩衝液Ｌ（２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２）によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０〜５０ｍＡＵのとき、溶出液１の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５〜１０％に落ちたとき、収得を停止した。
カラムを０．５Ｍ ＥＤＴＡ（３ＣＶ）、次いで０．５Ｍ ＮａＯＨ（５ＣＶ）および蒸留水（３ＣＶ）で剥離した。そして、２０％エタノールに保存した。
溶出液１は、ウイルス不活性化のために室温で１〜３時間、低ｐＨで培養された。その後、溶出液１は、緩衝液Ｇ（２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２）で伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるように希釈された。
Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（GE Healthcare）でパックされたカラム（体積１〜１０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐまたはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｇ（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液１は、流量１００〜３００ｃｍ／ｈの平衡化されたＭＭＣカラムにロードされ、緩衝液Ｇ（１０ＣＶ）で洗浄された。ＨＮＳは、緩衝液Ｉ−２０〜５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、３００−４００Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４によって８０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０ｍＡＵのとき、溶出液２の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
溶出液２は、次の精製ステップの前に５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度になるように緩衝液Ｊ−２０−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に希釈した。
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（Ｓ）（Merk）でパックされたカラム（体積１〜１０ｍｌ、カラムタイプＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＴｒｉｃｏｒｎ ５、またはＴｒｉｃｏｒｎ １０、またはＸＫ１６）は、蒸留水（３ＣＶ）、０．１Ｎ ＨＣｌ（３ＣＶ）で洗浄され、緩衝液Ｉ（３ＣＶ）で平衡化された。
前述のようにして製造された溶出液２は、流量４０〜３００ｃｍ／ｈの平衡化されたカラムにロードされ、緩衝液Ｉ（１０ＣＶ）で洗浄された。ＨＮＳは、緩衝液Ｋ−２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４によって７０％以上の収率で溶出された。ＵＶ信号が２０ｍＡＵのとき、溶出液３の収得を開始し、ＵＶ信号がピーク最大強度の５％に落ちたとき、収得を停止した。
実施例４
生物学的活性は、株式会社グリーンクロスの社内分析によって決定された。参照標準ＳＧＳＨタンパク質としては、ＣＦ（R＆D systems、Cat.＃ 8380−SU−020）が使用された。
精製されたＨＮＳの測定活性は、標準活性の６０〜１５０％（ｎ＞１５）であることと示された。

Claims (14)

  1. （ａ）一つまたは複数の不純物を含むスルファターゼ含有溶液を提供するステップと、
    （ｂ）金属アフィニティー・クロマトグラフィー樹脂を用いて、スルファターゼ含有溶液の第１クロマトグラフィー分離を行うステップと、
    （ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、第２クロマトグラフィー分離を行うステップと、
    （ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、最終のクロマトグラフィー分離を行い、前記不純物を除去するステップとを含み、
    前記スルファターゼは、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（heparan−N−sulfatase）である、スルファターゼを精製する方法。
  2. 前記金属アフィニティー・クロマトグラフィー樹脂は、２価の金属陽イオンに荷電される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記２価の金属は亜鉛である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂およびマルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、第３クロマトグラフィー分離を行うステップをさらに含み、
    前記第２クロマトグラフィー分離のステップで使用される樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂であり、
    前記第３クロマトグラフィー分離のステップで使用される樹脂は、マルチモードの陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂および弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記スルファターゼは、活性サイトにカルシウムイオン、鉄イオンおよび亜鉛イオンからなる群より選択される金属イオンを有する、請求項１に記載の方法。
  8. 低ｐＨウイルス不活性化のステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記低ｐＨウイルス不活性化のステップは、第１クロマトグラフィー分離ステップの後および第２クロマトグラフィー分離ステップの前に行われるか、又は、
    第２クロマトグラフィー分離ステップの後および最終のクロマトグラフィー分離ステップの前に行われる、請求項８に記載の方法。
  10. 低ｐＨウイルス不活性化をさらに含む、請求項５に記載の方法。
  11. 前記低ｐＨウイルス不活性化のステップは、第１クロマトグラフィー分離ステップの後および第２クロマトグラフィー分離ステップの前に行われるか、又は、
    第２クロマトグラフィー分離ステップの後および第３クロマトグラフィー分離ステップの前に行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. ウイルス濾過ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ウイルス濾過ステップは、最終のクロマトグラフィー分離ステップの後に行われる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記スルファターゼ含有溶液は、細胞培養収穫物および部分的に精製された中間溶液からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
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