ES2895430T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedad neurológica - Google Patents

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Abstract

Un vector donante sin promotor y un vector de expresión para su uso en un método de reducción o prevención del deterioro del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto con mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) o mucopolisacaridosis tipo I (MPS I), en donde el vector donante sin promotor comprende un transgén que codifica iduronato-2-sulfatasa (hIDS) humana o α-L-iduronidasa (hIDUA) humana y el vector de expresión codifica un par de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) dirigidas a un gen de albúmina endógeno, el método comprendiendo administrar al sujeto el vector donante sin promotor y el vector de expresión, en donde el transgén se integra en el gen de la albúmina en una célula hepática después de la escisión del gen de la albúmina de tal manera que la hIDUA o hIDS codificadas se expresan y secretan desde el hígado y además donde la hIDUA o hIDS secretadas por el hígado se encuentran en el sistema nervioso central (SNC) del sujeto de tal manera que se reduzca o prevenga el deterioro del SNC.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedad neurológica
CAMPO TÉCNICO
La presente divulgación está en el campo del tratamiento de enfermedades neurológicas, y especialmente enfermedades lisosomales con afectación del sistema nervioso central, e incluyen mucopolisacaridosis tipo I (MPS I) , y tanto las "formas atenuadas" como el síndrome de Scheie (MPS IS) y el síndrome de Hurler-Scheie (MPS HS), así como la forma más rápidamente progresiva del síndrome de Hurler (MPS IH) y mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) , también conocida como síndrome de Hunter, y terapia génica.
ANTECEDENTES
La terapia genética tiene un enorme potencial para una nueva era de la terapéutica humana. Estas metodologías permitirán el tratamiento de afecciones que hasta ahora no han sido abordadas por la práctica médica estándar. Un área que es especialmente prometedora es la capacidad de añadir un transgén a una célula para hacer que esa célula exprese un producto que no se producía anteriormente en esa célula. Ejemplos de usos de esta tecnología incluyen la inserción de un gen que codifica una proteína terapéutica, la inserción de una secuencia codificante que codifica una proteína que de alguna manera falta en la célula o en el individuo y la inserción de una secuencia que codifica un ácido nucleico estructural como un microARN.
Los transgenes pueden administrarse a una célula de varias maneras, de tal manera que el transgén se integre en el propio genoma de la célula y se mantenga ahí. En los últimos años, se ha desarrollado una estrategia para la integración transgénica que usa la escisión con nucleasas específicas del sitio para la inserción dirigida en un locus genómico elegido (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 7.888.121 de titularidad compartida). Las nucleasas, como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), las nucleasas efectoras de tipo activadoras de la transcripción (TALEN) o los sistemas de nucleasas como el sistema CRISPR/Cas (que utiliza un ARN guía manipulado), son específicas para genes objetivo y pueden utilizarse de tal manera que el constructo transgénico se inserta o mediante reparación dirigida por homología (HDR) o mediante captura de extremos durante procesos impulsados por unión de extremos no homólogos (NHEJ). Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 9.394.531; 9.255.250; 9.200.266; 9.045.763; 9.005.973; 9.150.847; 8.956.828; 8.945.868; 8.703.489; 8.586.526; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130196373; 20150056705 y 20150335708.
Los loci dirigidos incluyen loci de "puerto seguro" como los genes AAVS1, HPRT, Albúmina y CCR5 en células humanas y Rosa 26 en células murinas. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 9.394.545; 9.222.105; 9.150.847; 8.895.264; 8.771.985; 8.110.379; 7,951,925; Publicaciones de Estados Unidos N° 20100218264; 20110265198; 20150056705 y 20150159172). La integración mediada por nucleasas ofrece la posibilidad de una expresión transgénica mejorada, seguridad y la durabilidad expresiva aumentadas, en comparación con los enfoques de integración clásicos que se basan en la integración aleatoria del transgén, ya que permite la colocación exacta del transgén para un riesgo mínimo de silenciamiento génico o activación de oncogenes cercanos, que a su vez permite el aporte de proteínas para el tratamiento y/o prevención de enfermedades.
Aunque la administración del transgén a la célula objetivo es un obstáculo que debe superarse para implementar completamente esta tecnología, otro problema que debe superarse es asegurarse de que después de que se haya insertado en la célula el transgén y se exprese, el producto génico así codificado debe alcanzar la localización necesaria con el organismo, y debe elaborarse en concentraciones locales suficientes para ser eficaz. Para enfermedades caracterizadas por la falta de una proteína o por la presencia de una no funcional aberrante, la administración de una proteína de tipo salvaje codificada por transgén puede ser extremadamente útil.
Las enfermedades de almacenamiento lisosomal (LSD) son un grupo de enfermedades metabólicas monogénicas raras que se caracterizan por la falta de proteínas lisosomales individuales funcionales que normalmente participan en la descomposición de los lípidos de desecho, mucopolisacáridos (es decir, glicosaminoglicanos (GAG)). Estas enfermedades se caracterizan por una acumulación de estos compuestos en la célula, ya que no puede procesarlos para su reciclaje debido al mal funcionamiento de una enzima específica. Inicialmente se pensó que la fisiopatología de las LSD estaba ligada al depósito simple de GAG, pero la investigación actual ha llevado a una apreciación de las complejidades de estas enfermedades. El almacenamiento de GAG parece llevar a la perturbación de la homeostasis celular, tisular y de órganos, y también se ha relacionado con una secreción aumentada de citoquinas y moduladores inflamatorios que llevan a una activación de la respuesta inflamatoria (Muenzer (2014) Mol Gen Metabol 111: 63-72).
Los ejemplos más comunes son la enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa-nombre del gen: GBA), la enfermedad de Fabry (deficiencia de a galactosidasa A: GLA), el síndrome de Hunter (también llamado MPS II, deficiencia de iduronato 2-sulfatasa: IDS), el síndrome de Hurler (también llamado MPS IH, deficiencia de alfa-L iduronidasa: IDUA), la enfermedad de Pompe (alfa-glucosidasa: GAA) y enfermedades de Niemann-Pick tipo A y tipo B (deficiencia de esfingomielina fosfodiesterasa 1-SMPD1). Cuando se agrupan todas juntas, las LSD tienen una incidencia en la población de aproximadamente 1 de cada 7000 nacimientos. Las opciones de tratamiento incluyen terapia de reemplazo enzimático (ERT) en la que se administra al paciente la enzima faltante, habitualmente a través de una inyección intravenosa en grandes dosis. Dicho tratamiento es solo para tratar los síntomas y no es curativo, por tato al paciente se le debe administrar una dosificación repetida de estas proteínas durante el resto de su vida, y potencialmente puede desarrollar anticuerpos neutralizantes a la proteína inyectada.
La MPS I está asociada con la deficiencia de IDUA (alfa-L iduronidasa) y se produce aproximadamente una vez cada 100.000 nacimientos. La deficiencia de la enzima IDUA da como resultado la acumulación de GAG en los lisosomas de varios órganos, incluyendo el cerebro, lo que lleva a manifestaciones clínicas de la enfermedad. El GAG puede detectarse en orina, plasma y tejidos, y puede servir como biomarcadores para la progresión de la enfermedad. Es un trastorno autosómico recesivo, y los sujetos heterocigotos con un gen IDUA normal y una copia mutante producen una cantidad reducida de la enzima, pero probablemente serán asintomáticos porque se produce suficiente enzima a partir del gen de tipo salvaje. Para el paciente, los síntomas del síndrome de Hurler aparecen con mayor frecuencia entre los 3 y los 8 años y pueden incluir huesos anormales en la columna, mano en garra, córneas nubladas, sordera, retraso del crecimiento, problemas de las válvulas cardíacas, enfermedad de las articulaciones, incluyendo rigidez, una discapacidad intelectual que empeora con el tiempo y rasgos faciales gruesos y toscos con puente nasal bajo. Los bebés con síndrome de Hurler incluso grave parecen normales al nacer y los síntomas faciales pueden volverse más notorios durante los primeros 2 años de vida. A medida que los niños crecen, desarrollan una estatura baja (un máximo de aproximadamente cuatro pies) y a menudo mueren antes de los 10 años de edad debido a una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, infecciones respiratorias o complicaciones cardíacas.
Clínicamente, la MPS I se divide en tres categorías: síndrome de Hurler, síndrome de Hurler-Scheie y síndrome de Scheie, llamado así por los médicos que describieron originalmente la afección. El síndrome de Hurler generalmente se considera el más grave y el cerebro se ve afectado; El síndrome de Scheie es el más "leve" [o atenuado]. Muchas personas se encuentran entre los dos y se les hace referencia como Hurler-Scheie.
El síndrome de Hunter (mucopolisacaridosis tipo II, MPS II) es un trastorno lisosomal ligado al cromosoma X poco común provocado por la falta de enzima iduronato 2-sulfatasa (IDS) funcional y la acumulación subsiguiente de glicosaminoglicanos (GAG) en los individuos afectados. El síndrome de Hunter afecta aproximadamente a 1 de cada 100.000 a 150.000 varones nacidos y puede producirse muy raramente en mujeres. La MPS II es un trastorno multisistémico variable, progresivo en el que en la mayoría de los pacientes los síntomas son graves y la muerte se produce a una edad temprana (entre los 10 y los 20 años de edad), aunque en los pacientes con una forma más atenuada del trastorno, se ha informado de la supervivencia hasta los 50 años y los 60 años (Wraith et al (2008) Eur J Pediatr 167: 267-277).
Clínicamente, los pacientes en el extremo grave del espectro parecen normales al nacer, pero a menudo se diagnostican entre los 18 y los 36 meses de edad en base a los síntomas como infecciones respiratorias recurrentes, retrasos en el desarrollo, rigidez de las articulaciones y displasia de cadera, hernias umbilicales e inguinales recurrentes y desarrollo de los rasgos faciales típicos asociados con la MPS II (frente prominente, nariz con un puente aplanado, una lengua agrandada y cabeza agrandada). A medida que avanza la enfermedad, las manifestaciones clínicas se vuelven multisistémicas, afectando a los sistemas pulmonar y cardíaco, así como al sistema musculoesquelético y al SNC. Las diferencias entre las formas graves y atenuadas se deben principalmente a la presencia de neurodegeneración y deterioro mental.
El tratamiento estándar para MPS I y MPS II es la terapia de reemplazo enzimático (ERT), que varía de 100.000 $ a 500.000 $, o el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), que cuesta aproximadamente 200.000 $ por una sola ronda, o una combinación de los dos. Sin embargo, estas opciones de tratamiento tienen importantes inconvenientes. Para la ERT, algunos estudios de tratamiento a largo plazo han demostrado una asociación estadísticamente significativa entre la duración del uso de ERT y el empeoramiento de la calidad de vida (Aronovich y Hackett (2015) Mol Gen Metabol 114: 83-93). Además, la ERT se usa para mejorar la enfermedad somática (sin implicación del SNC) y es ineficaz para el tratamiento de la enfermedad neurológica porque la enzima administrada exógenamente no atraviesa la barrera hematoencefálica (Muenzer ibid). Para HSCT, hay una tasa significativa de mortalidad (por lo menos del 10%) debido al proceso de HSCT (Aronovich y Hackett, ibid). Por tanto, los pacientes con MPS I y MPS II más graves con deterioro del SNC están desatendidos por los tratamientos actualmente disponibles. La US 2015/159172 describe métodos y composiciones para la inserción de secuencias transgénicas que codifican proteínas que se expresan aberrantemente en enfermedades como enfermedades por almacenamiento lisosomal. Cardone et al. (Human Molecular Genetics (2006), 15(7): 1225-1236) divulga la administración de un vector de virus asociado a adenovirus (AAV) que comprende un transgén IDS dirigido por un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG) en un modelo de ratón MPSII. La WO 2014/186579 se refiere a la administración directa al SNC de un vector AAV recombinante que codifica un producto génico asociado con una enfermedad del SNC. Polito et al. (American Journal of Human Genetics (2009), 85(2): 296-301) describe el uso de un vector AAV2 que contiene un transgén hIDS bajo el control del promotor de CMV en estudios relacionados con la corrección de defectos del SNC en ratones MPSII. La US 2014/017212 describe nucleasas y métodos de uso de tales nucleasas para insertar una secuencia que codifica una proteína terapéutica en una célula para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad por almacenamiento lisosomal.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad de métodos y composiciones que puedan usarse para tratar la enfermedad de MPS I y MPS II, incluyendo el tratamiento a través de la edición del genoma, por ejemplo, para administrar un transgén que codifique un producto génico de tal manera que la expresión del transgén sea a un nivel terapéuticamente relevante.
SUMARIO
En la presente se divulgan métodos y composiciones para tratar y/o prevenir la enfermedad de Hurler (o MPS I) y para tratar y/o prevenir el síndrome de Hunter (MPS II). El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona un vector donante sin promotor y un vector de expresión para su uso en un método para reducir o prevenir el deterioro del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto con mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) o mucopolisacaridosis tipo I (MPS I), en donde el vector donante sin promotor comprende un transgén que codifica iduronato-2-sulfatasa humana (hIDS) o a-L-iduronidasa humana (hIDUA) y el vector de expresión codifica un par de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) dirigidas a un gen de albúmina endógena, el método comprendiendo administrar al sujeto el vector donante sin promotor y el vector de expresión, en donde el transgén se integra en el gen de la albúmina en una célula hepática después de la escisión del gen de la albúmina de tal manera que la hIDUA o hIDS codificadas se expresan y secretan desde el hígado y además en donde la hIDUA o hIDS secretadas por el hígado se encuentran en el sistema nervioso central (SNC) (por ejemplo, cruza la barrera hematoencefálica) del sujeto de tal manera que se reduce o previene el deterioro del s Nc .
El transgén codifica una proteína de IDUA de longitud completa o truncada para MPS I o una proteína de IDS de longitud completa o truncada para MPS II que trata la enfermedad, una proteína que carece o es deficiente en MPS I o MPS II, que cuando se administra por el transgén de IDUA o IDS trata y/o previene la MPS I o MPS II, respectivamente. La proteína de IDUA o IDS se excreta de la célula objetivo (hígado) de tal manera que puede afectar o ser absorbida por otras células que no albergan el transgén (efecto espectador o corrección cruzada). La creación de una población de células alteradas en un paciente proporcionará la actividad proteica necesaria para tratar (por ejemplo, reducir o eliminar uno o más síntomas) la enfermedad de MPS I o MPS II.
El deterioro del SNC puede comprender déficits cognitivos (por ejemplo, la pérdida de la capacidad de aprendizaje disminuye en comparación con un individuo no tratado); el transgén o los transgenes pueden modular los niveles de glicosaminoglicanos en el cerebro del sujeto; y/o la vacuolación neuronal o glial en el sujeto puede reducirse o eliminarse en el SNC (cerebro y/o médula espinal). Los métodos pueden comprender además administrar un inmunosupresor al sujeto antes y después de la administración del vector donante y el vector de expresión. El par de ZFN puede comprender proteínas con dedos de zinc como se muestra en la Tabla 1. Los vectores de expresión de ZFN y/o vectores donantes pueden ser vectores adenoasociados (AAV), que pueden administrarse mediante cualquier método, incluyendo mediante inyección intravenosa. En ciertas realizaciones, la proporción ZFN:ZFN:donante administrada al sujeto es de 1:1:8.
En algunas realizaciones, la IDUA expresada activa y/o la IDS expresada alcanza el 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o más por ciento de los niveles endógenos en el sujeto con enfermedad MPSI o MPS II. En algunas realizaciones, la enzima IDUA o IDS activa expresada alcanza el 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o más por ciento de niveles de enzimas encontrados en individuos de tipo salvaje. El transgén de IDUA o IDS corrector se inserta en un sujeto con necesidad de ello de tal manera que la proteína de reemplazo se produce in vivo. La proteína de IDUA o IDS expresada se excreta de la célula (por ejemplo, vía exportación a la sangre) para actuar o ser captada por otras células que carecen del transgén de IDUA o IDS (por ejemplo, mediante endocitosis mediada por receptores a través del receptor de manosa o del receptor de manosa-6-fosfato). Por tanto, las células que expresan el transgén de IDUA o IDS secretan la proteína de IDUA o IDS que luego actúa sobre uno o más tejidos secundarios (por ejemplo, cerebro, músculo, huesos, corazón, pulmón, bazo, etc.). El tejido objetivo (que expresa el transgén de IDUA o IDS) es el hígado.
El gen IDUA o IDS corrector puede comprender la secuencia de tipo salvaje del gen de IDUA o IDS funcional (incluyendo los fragmentos funcionales del gen de tipo salvaje), mientras que en otras realizaciones, la secuencia del transgén de IDUA o IDS corrector se altera de alguna manera, por ejemplo para dar una actividad biológica mejorada (por ejemplo, codones optimizados para aumentar la actividad biológica y/o el truncamiento de la secuencia que codifica IDUA o IDS). En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención producen enzima de IDUA o IDS activa en un sujeto con MPSI o m Ps II con necesidad de ello. Las enzimas de IDUA y/o IDS expresadas son capaces de degradar los glicosoaminoglicanos (GAG). En algunas realizaciones, los GAG se reducen en tejidos específicos del cuerpo, incluyendo el hígado, bazo, riñón, pulmón, corazón, músculo y cerebro. En realizaciones preferidas, los niveles de GAG en cualquier tejido se reducen un 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% o cualquier valor entre ellos en comparación con un sujeto con MPSI o MPS II no tratado.
El transgén de IDUA o IDS se inserta en el genoma de una célula objetivo usando nucleasas con dedos de zinc (ZFN), que incluyen una molécula de unión al ADN que se une a un sitio objetivo en una región de interés en el genoma de la célula y uno o más dominios de nucleasas (por ejemplo, dominio de escisión y/o semidominio de escisión). Los dominios de escisión y los semidominios de escisión pueden obtenerse, por ejemplo, de varias endonucleasas de restricción, proteínas Cas (clase 1 o clase 2) y/o endonucleasas autodirigidas. El dominio con dedo de zinc reconoce un sitio objetivo en un gen de albúmina. Ver, por ejemplo, Publicación de Estados Unidos N° 2014001721, Patentes de Estados Unidos N° 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; 8.586.526; Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130177960 y 20140017212.
La nucleasa (es decir, el sistema de ZFN) se suministra en forma de polinucleótidos, un vector de expresión que comprende un polinucleótido, que codifica el par de ZFN dirigidos a un gen de albúmina endógeno, opcionalmente enlazado operativamente a un promotor. En una realización, el vector de expresión es un vector viral.
La secuencia de IDUA o IDS donante está en un vector separado (por ejemplo, Ad, AAV o vector LV o ARNm). Tal inserción de una secuencia de nucleótidos donante en el locus objetivo da como resultado la expresión del transgén de IDUA o IDS bajo el control de los elementos de control genético endógenos del locus objetivo (albúmina). En algunos aspectos, la inserción del transgén de IDUA o IDS en un gen objetivo (albúmina) da como resultado la expresión de una secuencia de proteína de IDUA o IDS intacta y carece de cualquier aminoácido codificado por el objetivo (albúmina). En otros aspectos, la proteína de IDUA o IDS exógena expresada es una proteína de fusión y comprende aminoácidos codificados por el transgén de IDUA o IDS y por el locus endógeno en el que se inserta el transgén de IDUA o IDS (por ejemplo, del locus objetivo endógeno o, alternativamente, de secuencias en el transgén que codifican secuencias del locus objetivo). El objetivo es un gen de albúmina. En algunos casos, las secuencias endógenas estarán presentes en la porción (N)-terminal amino de la proteína de IDUA exógena, mientras que en otros, las secuencias endógenas estarán presentes en la porción (C)-terminal carboxi de la proteína de IDUA o IDS exógena. En otros casos, las secuencias endógenas estarán presentes en las porciones N- y C-terminales de la proteína exógena de IDUA. Las secuencias endógenas pueden incluir secuencias endógenas mutantes o de tipo salvaje de longitud completa o, alternativamente, pueden incluir secuencias de aminoácidos endógenas parciales. El producto de proteína de IDUA o IDS exógena codificado en el transgén se exporta fuera de la célula para afectar o ser absorbida por las células que carecen del transgén, es decir, la célula es una célula hepática que libera la proteína de IDUA o iDs terapéutica en el torrente sanguíneo para actuar sobre los tejidos distales (por ejemplo, cerebro, corazón, músculo, etc.).
En una realización, el transgén de IDUA o IDS se expresa del promotor de albúmina después de la inserción en el locus de albúmina. El biológico codificado por el transgén de IDUA o IDS puede luego liberarse en el torrente sanguíneo si el transgén se inserta en un hepatocito in vivo. En algunos aspectos, el transgén de IDUA o IDS se administra al hígado in vivo en un vector viral mediante inyección intravenosa o de otro tipo.
En aspectos adicionales, el vector que comprende el donante transgénico se administra a una célula objetivo adecuada in vivo, de tal manera que la proteína terapéutica de IDUA o IDS codificada por el donante transgénico se libera en el torrente sanguíneo si el vector donante transgénico se administra a un hepatocito.
En algunas realizaciones, se usan sistemas de animales transgénicos in vivo. En algunos aspectos, puede usarse el animal transgénico en el desarrollo de modelos en los que el transgén codifica una proteína de IDUA o IDS humana. En algunos casos, el animal transgénico puede ser inactivado en el locus endógeno correspondiente, lo que permite el desarrollo de un sistema in vivo en el que la proteína humana puede estudiarse aisladamente. Tales modelos transgénicos pueden usarse con propósitos de selección para identificar moléculas pequeñas o biomoléculas grandes u otras entidades que pueden interactuar con la proteína humana de interés o modificarla.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, los compuestos de la invención pueden combinarse con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de sujetos con enfermedad MPS I o MPS II. En algunos aspectos, las composiciones se usan en combinación con métodos y composiciones para permitir el paso a través de la barrera hematoencefálica. En otros aspectos, las composiciones se usan en combinación con compuestos que se sabe que suprimen la respuesta inmune del sujeto.
Estos y otros aspectos serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica a la luz de la divulgación en su conjunto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A y 1B representan los resultados después del tratamiento de los grupos de ratones indicados con las ZFN y el donante de IDUA específicos de albúmina de ratón. En la Figura 1A los gráficos indican los niveles de actividad de ZFN (% de indeles) en los hígados de ratones tratados con ZFN sustitutos de ratón rAAV2/8 y donante de hIDUA al mes (panel izquierdo) y 4 meses (panel derecho) después de la dosificación. Se aisló ADN genómico de hígados de ratones individuales y se midió la actividad de ZFN mediante secuenciación profunda del locus de albúmina de ratón en el sitio objetivo de ZFN. Se enumeran los números de los grupos de estudio y cada símbolo individual representa datos de un ratón individual en el punto temporal indicado (en la necropsia). Las líneas horizontales representan la media ± desviación estándar de cada grupo. En la Figura 1B, la expresión de IDUA se midió mediante análisis de transferencia Western. Las ZFN de ratón sustitutas y el donante de hIDUA se empaquetaron como rAAV2/8 y se inyectaron IV en ratones. Los ratones se sacrificaron al de 1 mes (panel i) o a los 4 meses (panel ii) después de la dosificación y se extrajo la proteína del hígado. La expresión de HIDUA en hígados de ratón se determinó usando un anticuerpo IDUA específico para humanos. GAPDH se muestra como un control de carga.
Las Figuras 2A a 2C representan la actividad enzimática de IDUA detectable. La Figura 2A es un gráfico que muestra la actividad enzimática en el plasma. Las ZFN de ratón sustitutas y el donante de hIDUA se empaquetaron como rAAV2/8 y se inyectaron IV en ratones. El plasma se recogió en los días indicados y la actividad de la enzima IDUA se determinó mediante un ensayo fluorimétrico. Los datos muestran la media ± SD de 4-8 animales/grupo, dependiendo del punto temporal. El ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett reveló que los grupos de ZFN+donantes de MPS I eran significativamente diferentes del grupo de tipo salvaje desde el día 14-120 para los animales macho y desde el día 28-120 para los animales hembra. La Figura 2B muestra la actividad de IDUA medida hasta el día 60 en el hígado (panel izquierdo), el plasma (panel central), el bazo (panel derecho), el riñón (panel derecho) y el pulmón (panel derecho). En los gráficos que representan los datos de hígado, bazo, riñón y pulmón, la barra más a la izquierda (1) representa ratones heterocigotos para MPS I, la siguiente barra a la derecha (2) representa ratones homocigotos para MPS I no tratados, la siguiente barra a la derecha (3) representa ratones MPS I tratados con el AAV del donante de IDUA solamente, y la barra más a la derecha (4) representa los datos de los ratones MPS I tratados con el AAV del donante y el aAv que comprende la ZFN específica de albúmina. La Figura 2C tiene dos histogramas que representan la cantidad de actividad de IDUA en varios tejidos en ratones que fueron sacrificados al de 1 mes (panel (i)) o al de 4 meses (panel (ii)). Los grupos mostrados son: (1 - barras más a la izquierda) ratones de tipo salvaje, dosificados con tampón de formulación; (2 - segundas barras desde la izquierda) machos con MPS I, tampón de formulación; (3 - terceras barras desde la izquierda) hembras con MPS I, tampón de formulación; (4 - terceras barras desde la derecha) machos con MPS I, ZFN donante; (5 -segundas barras desde la derecha) hembras MPS I, ZFN donante; (6 - barras más a la derecha) MPS I, solo donante.
Las Figuras 3A a 3C son gráficos que representan una reducción significativa en los niveles de GAG en ratones tratados después del tratamiento. Las ZFN de ratón sustitutas y donante de hIDUA se empaquetaron como rAAV2/8 y se inyectaron IV en ratones. Se recogió orina en los días indicados y se determinaron los niveles de GAG mediante el ensayo Blyscan GAG. La Figura 3A muestra los resultados de GAG en la orina después del tratamiento. La barra más a la izquierda de cada grupo muestra machos con MPS I no tratados; la segunda barra desde la izquierda muestra hembras con MPS I no tratadas; la segunda barra desde la derecha muestra los machos con MPS I tratados y la barra más a la derecha muestra las hembras con MPS I tratadas. Los datos muestran la media ± SD de 1-8 animales/grupo, dependiendo del punto temporal. La Figura 3B muestra la cantidad de GAG detectada en los distintos órganos 1 mes después del tratamiento (Figura 3B (i)) o 4 meses después del tratamiento (Figura 3B (ii)). Los grupos mostrados son los mismos que los anteriores en la Figura 2B y 2C. La Figura 3C es un gráfico que muestra la cantidad de GAG detectada en la orina de los varios grupos durante 120 días después del tratamiento. Los grupos de tratamiento son los mismos que los de la Figura 3B. Las Figuras 4A a 4F muestran una serie de gráficos que representan la cantidad de actividad enzimática de IDUA detectada en diferentes tejidos de ratones tratados. Las ZFN de ratón sustitutas y el donante de hIDUA se empaquetaron como rAAV2/8 y se inyectaron IV en ratones. Los ratones se sacrificaron 4 meses después de la dosificación y se extrajo la proteína del hígado y otros tejidos. La actividad de la enzima de IDUA se determinó mediante ensayo fluorimétrico. Los datos muestran la media ± SD de 8 animales/grupo. *p<0,05 frente al grupo de control respectivo (ratones con MPS I tratados con formulación) (prueba de Mann-Whitney). La Figura 4a muestra actividad de IDUA en el hígado en los grupos indicados. La Figura 4B muestra la actividad de IDUA en el bazo en los grupos indicados. La Figura 4C muestra la actividad de IDUA en el pulmón en los grupos indicados. La Figura 4D muestra la actividad de IDUA en el músculo. La Figura 4E muestra la actividad de IDUA en el cerebro en los grupos indicados y la Figura 4F muestra la actividad de IDUA en el corazón en los grupos indicados.
Las Figuras 5A a 5F son gráficos que representan reducciones significativas en los niveles de GAG en ratones tratados después del tratamiento. Las ZFN de ratón sustitutas y el donante de hIDUA se empaquetaron como rAAV2/8 y se inyectaron IV en ratones. Los ratones se sacrificaron 1 y 4 meses después de la dosificación y se extrajo la proteína del hígado y otros tejidos. La actividad de la enzima de IDUA se determinó mediante ensayo fluorimétrico. Los datos muestran una media ± SD de 8 animales/grupo. *p<0,05 frente al grupo de control respectivo (ratones con MPS I tratados con formulación) (prueba de Mann-Whitney). La Figura 5A muestra los niveles de GAG en hígado en los grupos indicados. La Figura 5B muestra los niveles de GAG en el bazo en los grupos indicados. La Figura 5C muestra los niveles de GAG en el pulmón en los grupos indicados. La Figura 5D muestra los niveles de GAG en el músculo. La Figura 5E muestra los niveles de GAG en el cerebro en los grupos indicados y la Figura 5F muestra los niveles de GAG en el corazón en los grupos indicados.
Las Figuras 6A a 6D son una serie de reproducciones de fotografías que muestran un laberinto de Barnes que midió el rendimiento cognitivo a los 4 meses después de la dosis. El Laberinto de Barnes incluye una plataforma con 40 agujeros (Figura 6A). Los ratones se colocaron en la plataforma y se filmaron desde arriba con una iluminación brillante (Figura 6B). Todos los agujeros estaban bloqueados (Figura 6C) excepto uno, que es el agujero de escape (Figura 6D) que los ratones buscan para evitar la luz.
Las Figuras 7A y 7B son gráficos que representan los resultados del rendimiento cognitivo usando la prueba del laberinto de Barnes a los ~4 meses después de la dosis. Los datos representan la media ± SEM del tiempo que les llevó a los animales encontrar el agujero de escape objetivo (media de 4 pruebas cada día) durante 6 días de pruebas. La Figura 7A muestra los resultados para machos con MPS I, no tratados, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 frente a tipo salvaje; #p<0,05, ###p<0,001 frente a macho con MPS I, ZFN donante; y la Figura 7B muestra los resultados para hembras con MPS I, ZFN Donante *p<0,05 frente a tipo salvaje; #p<0,05 frente a MPS I, solo donante (ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey).
Las Figuras 8A a 8C representan la expresión de IDS en un modelo de ratón de MPS II. La Figura 8A es una transferencia Western que muestra la expresión de IDS humana en hígados de ratón al de 1 mes (panel superior) o 4 meses (panel inferior) después del tratamiento. Se generaron anticuerpos contra IDS contra la proteína humana (AF2449 de R&D Systems), con un control de carga que detecta GAPDH de ratón (A00191 de Genscript). La Figura 8B es un gráfico que muestra la actividad enzimática de IDS en plasma detectada hasta 120 días después del tratamiento, y la Figura 8C es un histograma que muestra la actividad enzimática de IDS en varios tejidos 4 meses después de la administración. La Figura 8C es un gráfico que muestra agrupaciones de los grupos de tratamiento para cada tejido de la siguiente manera: (1 - barras más a la izquierda) Tipo salvaje, ratones no tratados; (2 - segundas barras desde la izquierda) ratones con MPS II, sin tratamiento; (3 - terceras barras desde la izquierda) ratones con MPS II, tratamiento de ZFN donante, dosis baja; (4 - terceras barras desde la derecha) ratones con MPS II, tratamiento de ZFN donante, dosis media; (5 - segunda barras desde la derecha) ratones con MPS II, tratamiento de ZFN donante, dosis alta; (6 - barras más a la derecha) ratones con MPS II, solo tratamiento de donante. El orden de las muestras en los grupos es de izquierda a derecha, 1-6. Se indica la importancia de los datos.
Las Figuras 9A y 9B son histogramas que muestran los niveles de GAG en los órganos indicados de los ratones con MPS II 4 meses después del tratamiento. La Figura 9A representa los niveles en el hígado, bazo, riñón y pulmón mientras que la Figura 9B representa los niveles en el corazón, los músculos y el cerebro. Los asteriscos indican la importancia de los datos en comparación con los ratones no tratados con MPS II. Los grupos probados y el orden mostrado es el mismo que para la Figura 8C.
La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de rendimiento cognitivo usando la prueba del laberinto de Barnes 4 meses después del tratamiento. Los datos representan la media ± SEM del tiempo que les llevó a los animales encontrar el agujero de escape objetivo (media de 4 pruebas cada día) durante 6 días de pruebas. Los asteriscos indican la importancia de los datos en comparación entre los ratones no tratados con MPS II y los ratones ZFN donantes, y las almohadillas indican la importancia en comparación entre los ratones no tratados con MPS II y los ratones no tratados de tipo salvaje.
Las Figuras 11A a 11D son gráficos que representan la actividad de IDS o IDUA en células HepG2 transducidas con ZFN y el donante de IDS o IDUA específicas de albúmina. Se analizaron cuatro subclones derivados de células HepG2 transducidas con SBS#47171, SBS#47931 y donante SB-IDS (IDS), o SBS#47171 y SBS#47931 solos (solo ZFN) mediante ensayo ELISA de hIDS (mostrado en la Figura 11A) y la actividad de la enzima de IDS (mostrada en la Figura 11B) después de 72 h de acumulación de sobrenadante. Se analizaron tres subclones derivados de células HepG2 transducidas con SBS#47171, SBS#47931 y donante SB-IDUA (IDUA), o SBS#47171 y SBS#47931 solos (solo ZFN) mediante ensayo ELISA de hIDUA (mostrado en la Figura 11C) y actividad enzimática de IDUA (mostrado en la Figura 11D) después de 72 horas de acumulación de sobrenadante. Los datos representan medias ± SD de tres sobrenadantes independientes.
Las Figura 12A a Figura 12I indican los tipos de integración del donante de iDs ("SB-IDS") o IDUA ("SB-IDUA") que pueden producirse en el locus de albúmina y los resultados observados en los cuatro subclones de IDS y tres de IDUA. Los eventos de integración de SB-IDS en el locus de albúmina humana por NHEJ (Figura 12A) o HDR (Figura 12B) se muestran con los respectivos reactivos específicos (cebadores y sondas) y sitios de unión. La Figura 12C es una tabla resumen de los datos de Taqman® para todos los subclones. Los números entre paréntesis indican el número de veces que un clon obtuvo una puntuación positiva o negativa para el modo de integración indicado en el ensayo Taqman® de un total de 3 repeticiones de ensayo. La Figura 12D es una tabla resumen de los datos de secuenciación de Sanger para todos los subclones, que indica el modo de integración predominante. N.A. = no aplicable. Los eventos de integración de SB-IDUA en el locus de albúmina humana ya sea por NHEJ (Figuras 12E y 12H) o por HDR (Figura 12F) y también indican el tamaño de las bandas esperadas. La Figura 12G es una tabla resumen de los datos de Taqman® para los subclones indicados. La Figura 12I es una reproducción de un gel que confirma la integración de HDR de IDUA para el clon 21, NHEJ para el clon 25 y NHEJ para el clon 30.
La Figura 13 es un esquema que muestra el proceso en el que el IDS se produce en el hígado transducido y luego se absorbe y posteriormente se procesa en la proteína madura final.
Las Figuras 14A y 14B muestran la captación de los IDS secretados de los subclones HepG2 en los hepatocitos primarios. La Figura 14A muestra las diferentes formas de proteína a medida que madura la proteína de IDS y muestra el proceso para añadir el sobrenadante de HepG2 a los cultivos de hepatocitos primarios. La Figura 14B muestra una transferencia Western que representa las formas de IDS detectadas en los clones de HepG2 ("Mezcla" y 55) sobrenadante y sedimentos, y las formas detectadas en el sedimento de hepatocitos primario, que ilustra el procesamiento del polipéptido de longitud completa (90 kDa) durante la producción de la forma madura (45 kDa). También se muestra un control de carga de una proteína interna (a-GAPDH), así como la actividad de IDS relativa a los sedimentos de hepatocitos primarios después de la actualización de IDS del sobrenadante.
Las Figuras 15A a 15D ilustran la investigación sobre los patrones de glicosilación en el IDS o IDUA producidos en los subclones de HepG2. La Figura 15A muestra los diferentes tipos de patrones de glicosilación y las especificidades de sustrato de las glicosidasas usadas en la desglicosilación (modificado de Lee et al (2009) Nat Protoc. 4(4):592-604). Las Figuras 15B y 15C son transferencias de Western que usan un anticuerpo anti-IDS que investiga la proteína de IDS producida en los clones de HepG2 donde la Figura 15B muestra la proteína que se encuentra en el sobrenadante celular mientras que la Figura 15C muestra la proteína en los sedimentos celulares después del tratamiento con las glicosidasas PNGasaF y Endo H. El tratamiento con PNGasa F eliminó todas las cadenas de oligosacáridos, lo que da como resultado "HIDS no glicosilados" como se indica. Para la transferencia de Western en sedimentos de HepG2, HSP90 se muestra como un control de carga 'Mezcla' = una población de IDS de HepG2 mixta que consiste de 2 subclones de IDS diferentes. 'Clon 55' = subclon#55 de HepG2 IDS. 'Control' = un subclon de HepG2 con IDUA, en lugar de IDS, integrado en el locus de albúmina como control negativo. 'kDa' = kilodaltons (marcador de peso molecular). La Figura 15D muestra transferencias Western (el panel superior muestra una exposición oscura y el panel inferior muestra una exposición a la luz) usando un anticuerpo anti-IDUA para investigar los patrones de glicosilación del hIDUA producido en comparación con el hIDUA disponible comercialmente (Alsurazyme® e IDUA de R&D Systems). Como antes, las enzimas se trataron con PNGasa F, Endo H o se dejaron sin digerir.
Las Figura 16A a 16D representan el efecto de la manosa 6-fosfase (M6P) añadida sobre la captación de IDS o por las células HepG2 (Figura 16A) o por las células K562 (Figura 16B) y un gráfico de la captación de IDUA producida por células K562 (Figura 16C). La Figura 16D es un esquema que muestra el efecto sobre la captación del tratamiento de una célula objetivo con manosa-6-fosfato. Los datos representados ilustran células tratadas con M6P o sin tratar. En las Figuras 16A y 16B, cada grupo de tres miembros, las muestras mostradas, de izquierda a derecha, son las siguientes: barra más a la izquierda - control que comprende el tratamiento con medio acondicionado de células HepG2 no tratadas; barra media - células tratadas con medio acondicionado del clon 8 de HepG2-IDS; barra derecha - células tratadas con medio acondicionado del clon 15 de HepG2-IDS. En cada punto temporal, se indican las células tratadas con M6P. Después del período de tiempo indicado, las células se sedimentaron y luego se probaron para determinar la actividad de IDS. La comparación de las dos condiciones ilustra que M6P inhibió la captación de la proteína IDS glicosilada. La Figura 16C es una representación de la captación de IDUA por células K562 cultivadas en medio acondicionado obtenido a partir de células HepG2 no tratadas o células HepG2 con el donante IDUA (clon de IDUA número 25). La Figura 16D es un esquema que muestra el efecto del tratamiento de las células con manosa-6-fosfato (M6P), que ilustra cómo el tratamiento con M6P en las Figuras 16A-16C bloquea la captación de enzimas, disminuyendo la cantidad de IDUA detectable en las células.
Las Figuras 17A y 17B representan el análisis de los niveles de dermatán sulfato (paneles de la izquierda) y heparán sulfato (paneles de la derecha) en los cerebros de ratones de tipo salvaje tratados y no tratados y con MPS I y II. La Figura 17A corresponde a los ratones analizados en la Figura 3B(ii), conjunto de columnas más a la izquierda. La Figura 17B corresponde a los ratones analizados en la Figura 9B, conjunto de columnas más a la derecha.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la presente se divulgan métodos y composiciones para tratar y/o prevenir la enfermedad MPS I o MPS II, en particular, métodos y composiciones para la inserción de un gen que codifica una proteína que carece o se expresa insuficientemente en el sujeto con enfermedad de MPS I o MPS II de tal manera que el gen se expresa in vivo en una o más células y/o tejidos del sujeto. El gen de IDUA o IDS se expresa de una célula hepática y se secreta desde el hígado donde es funcional en células y tejidos secundarios (por ejemplo, bazo, pulmón, corazón, músculo, cerebro, etc.).
Por tanto, las composiciones de la invención pueden usarse para expresar a partir de un transgén proteínas de MPS I y/o MPS II terapéuticamente beneficiosas (IDUA o IDS) del locus de albúmina altamente expresado para reemplazar la enzima que es defectuosa en la enfermedad MPS I o MPS II. Además, la invención proporciona composiciones para el tratamiento (incluyendo el alivio de uno o más síntomas) de la enfermedad de MPS I y/o MPS II mediante la inserción de las secuencias transgénicas en un locus de albúmina altamente expresado en células hepáticas.
General
La puesta en práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones divulgadas en la presente emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados que se encuentran dentro de la capacidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definiciones
Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma de cadena sencilla o doble. Para los propósitos de la presente divulgación, estos términos no deben interpretarse como limitativos con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en las fracciones de base, azúcar y/o fosfato (por ejemplo, estructuras principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará en base con T.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de los aminoácidos de origen natural correspondientes.
"Unión" se refiere a una interacción no covalente, específica de secuencia, entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de la secuencia (por ejemplo, contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su conjunto sea específica de la secuencia. Estas interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o menor. "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión: una mayor afinidad de unión se correlaciona con una menor Kd.
Una "proteína de unión" es una proteína que puede unirse de manera no covalente a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a proteínas, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas con dedos de zinc tienen actividad de unión a ADN, unión a ARN y de unión a proteínas.
Una "proteína de unión al ADN con dedos de zinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro de la dominio de unión cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion de zinc. El término proteína de unión al ADN con dedos de zinc a menudo se abrevia como proteína con dedos de zinc o ZFP.
Un "dominio de unión a ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición de TALE. Los dominios de repetición están implicados en la unión del TALE a su secuencia de ADN objetivo cognado. Una única "unidad de repetición" (también denominada una "repetición") tiene típicamente 33-35 aminoácidos de longitud y muestra por lo menos alguna homología de secuencia con otras secuencias de repetición de TALE dentro de una proteína de TALE de origen natural. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 8.586.526.
Los dominios de unión con dedos de zinc y TALE pueden "manipularse" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo mediante manipulación (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de un dedo de zinc o proteína TALE de origen natural. Por lo tanto, las proteínas de unión al ADN manipuladas (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no se producen de manera natural. Los ejemplos no limitativos de métodos para manipular proteínas de unión a ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN diseñada es una proteína que no se encuentra en la naturaleza y cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños existentes de ZFP y/o TALE y datos de unión. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 8.568.526; 6.140.081; 6.453.242; y 6.534.261; ver también WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
Una proteína o TALE con dedos de zinc "seleccionada" es una proteína que no se encuentra en la naturaleza, cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico como la presentación de fagos, la trampa de interacción o la selección de híbridos. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 8.586.526; 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; y WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 y WO 02/099084.
"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Para los propósitos de esta divulgación, "recombinación homóloga (HR)" se refiere a la forma especializada de tal intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de cadena doble en células mediante mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, usa una molécula "donante" para reparar la plantilla de una molécula "objetivo" (es decir, la que experimentó la ruptura de la cadena doble), y se conoce diversamente como "conversión de genes no cruzada" o "conversión de genes de tracto corto", porque lleva a la transferencia de información genética del donante al objetivo. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de malapareamientos del ADN heterodúplex que se forma entre el objetivo roto y el donante, y/o "apareamiento de cadena dependiente de síntesis", en el que el donante se usa para volver a sintetizar información genética que se convertirá en parte del objetivo y/o procesos relacionados. Tal HR especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula objetivo de tal manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido objetivo.
Una o más nucleasas dirigidas, como se describe en la presente, crean una ruptura de doble cadena en la secuencia objetivo (por ejemplo, cromatina celular) en un sitio predeterminado, y puede introducirse en la célula un polinucleótido "donante", que tiene homología con la secuencia de nucleótidos en la región de la ruptura. Se ha demostrado que la presencia de la rotura de cadena doble facilita la integración de la secuencia donante. La secuencia donante puede integrarse físicamente o, alternativamente, el polinucleótido donante se usa como plantilla para reparar la ruptura mediante recombinación homóloga, dando como resultado la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el donante en la cromatina celular. Por tanto, puede alterarse una primera secuencia en la cromatina celular y, en ciertas realizaciones, puede convertirse en una secuencia presente en un polinucleótido donante. Por tanto, puede entenderse que el uso de los términos "reemplazar" o "reemplazo" representa el reemplazo de una secuencia de nucleótidos por otra, es decir, el reemplazo de una secuencia en el sentido informativo), y no requiere necesariamente el reemplazo físico o químico de un polinucleótido por otro.
Pueden usarse parejas adicionales de proteínas TALEN o dedos de zinc para la escisión de cadena doble adicional de sitios objetivo adicionales dentro de la célula.
Para la recombinación y/o el reemplazo y/o la alteración dirigidos de una secuencia en una región de interés en la cromatina celular, se altera una secuencia cromosómica mediante recombinación homóloga con una secuencia de nucleótidos "donante" exógena. Tal recombinación homóloga es estimulada por la presencia de una ruptura de cadena doble en la cromatina celular, si están presentes secuencias homólogas a la región de la ruptura.
La primera secuencia de nucleótidos (la "secuencia donante") puede contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a secuencias genómicas en la región de interés, estimulando de este modo la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Por tanto, en ciertas realizaciones, las porciones de la secuencia donante que son homólogas a las secuencias en la región de interés muestran entre aproximadamente un 80 y un 99% (o cualquier número entero entre ellos) de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se reemplaza. En otras realizaciones, la homología entre el donante y la secuencia genómica es superior al 99%, por ejemplo, si solo 1 nucleótido difiere entre el donante y las secuencias genómicas de más de 100 pares de bases contiguas. En ciertos casos, una porción no homóloga de la secuencia donante puede contener secuencias que no están presentes en la región de interés, de tal manera que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga está generalmente flanqueada por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor integral entre ellos) o cualquier número de pares de bases superior a 1.000, que son homólogas o idénticas a secuencias en la región de interés. En otras realizaciones, la secuencia donante no es homóloga a la primera secuencia y se inserta en el genoma mediante mecanismos de recombinación no homólogos.
Además, la integración dirigida como se describe en la presente también puede usarse para integrar una o más secuencias exógenas. La secuencia de ácido nucleico exógena puede comprender, por ejemplo, uno o más genes o moléculas de ADNc, o cualquier tipo de secuencia codificante o no codificante, así como uno o más elementos de control. Además, la secuencia de ácidos nucleicos exógena puede producir una o más moléculas de ARN (por ejemplo, ARN de horquilla corta (ARHhc), ARN inhibidor (ARNi), microARN (ARNmi), etc.).
"Escisión" se refiere a la ruptura de la estructura principal covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Son posibles tanto la escisión de cadena sencilla como la escisión de cadena doble, y la escisión de cadena doble puede producirse como resultado de dos eventos de escisión de cadena sencilla distintos. La escisión del ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En ciertas realizaciones, se usan polipéptidos de fusión para la escisión de ADN de doble cadena dirigida.
Un "semidominio de escisión" es una secuencia de polipéptidos que, junto con un segundo polipéptido (idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferiblemente actividad de escisión de doble cadena). Los términos "semisominios de escisión primero y segundo"; y "semidominios de escisión y -" y los "semisominios de escisión derecho e izquierdo" se usan indistintamente para referirse a parejas de semidominios de escisión que dimerizan.
Un "semidominio de escisión manipulado" es un semidominio de escisión que se ha modificado para formar heterodímeros obligados con otro semidominio de escisión (por ejemplo, otro semidominio de escisión manipulado). Ver, Patentes de Estados Unidos N° 7.888.121; 7.914.796; 8.034.598 y 8.823.618.
El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificada y puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. El término "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede tener cualquier longitud, por ejemplo entre 2 y 10.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos o por encima de ellos), preferiblemente entre aproximadamente 100 y 1.000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero entre ellos), más preferiblemente entre aproximadamente 200 y 500 nucleótidos de longitud.
Un "gen asociado a una enfermedad" es uno que es defectuoso de alguna manera en una enfermedad monogénica. Los ejemplos no limitativos de enfermedades monogénicas incluyen inmunodeficiencia combinada grave, fibrosis quística, enfermedades de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, enfermedad de Gaucher, de Hunter de Hurler, de Fabry, de Neimann-Pick, de Tay-Sach, etc.), anemia de células falciformes y talasemia.
La "barrera hematoencefálica" es una barrera de permeabilidad altamente selectiva que separa la sangre circulante del cerebro en el sistema nervioso central. La barrera hematoencefálica está formada por células endoteliales cerebrales que están conectadas por uniones estrechas en los vasos del SNC que restringen el paso de los solutos sanguíneos. Durante mucho tiempo se ha pensado que la barrera hematoencefálica previene la captación de agentes terapéuticos de moléculas grandes y previene la captación de la mayoría de los agentes terapéuticos de moléculas pequeñas (Pardridge (2005) NeuroRx 2(1): 3-14).
"Cromatina" es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteínas, incluyendo histonas y proteínas cromosómicas que no son histonas. La mayor parte de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados con un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN conector (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre los núcleos de los nucleosomas. Una molécula de histona HI generalmente está asociada con el ADN conector. Para los propósitos de la presente divulgación, se pretende que el término "cromatina" abarque todos los tipos de nucleoproteínas celulares, tanto procariotas como eucariotas. La cromatina celular incluye cromatina tanto cromosómica como episomal.
Un "cromosoma" es un complejo de cromatina que comprende todo o una parte del genoma de una célula. El genoma de una célula se caracteriza a menudo por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que componen el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.
Un "episoma" es un ácido nucleico de replicación, un complejo de nucleoproteínas u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas virales.
Un "sitio objetivo" o "secuencia objetivo" es una secuencia de ácidos nucleicos que define una porción de un ácido nucleico a la que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión.
Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que puede introducirse en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto a la etapa de desarrollo particular y las condiciones ambientales de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula sin choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.
Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, como la que se genera mediante un proceso de química combinatoria, o una macromolécula como una proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, glicoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de la moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los que pueden formar dúplex, así como los ácidos nucleicos que forman tríplex. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metilado, polimerasas, metilasas, demetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.
Una molécula exógena puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma viral infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Los expertos en la técnica conocen métodos para la introducción de moléculas exógenas en las células e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato cálcico, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales. Una molécula exógena también puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena pero derivada de una especie diferente de la que se deriva la célula. Por ejemplo, puede introducirse una secuencia de ácidos nucleicos humana en una línea celular derivada originalmente de un ratón o un hámster.
Por el contrario, una molécula "endógena" es una que normalmente está presente en una célula particular en una etapa de desarrollo particular bajo condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episomal de origen natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.
Una molécula de "fusión" es una molécula en la que dos o más moléculas de subunidades están enlazadas, preferiblemente de manera covalente. Las moléculas de subunidades pueden ser del mismo tipo químico de molécula o pueden ser diferentes tipos químicos de moléculas. Los ejemplos de moléculas de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN de proteína y un dominio de escisión), fusiones entre un dominio de unión a ADN polinucleotídico (por ejemplo, ARNsg) asociado operativamente con un dominio de escisión y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión).
La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar de la administración de la proteína de fusión a la célula o de la administración de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde el polinucleótido se transcribe y la transcripción se traduce, para generar la proteína de fusión. El corte y empalme trans, la escisión de polipéptidos y la ligación de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para la administración de polinucleótidos y polipéptidos a las células se presentan en otra parte de esta divulgación.
Un "gen", para los propósitos de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (ver más abajo), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, ya sea que tales secuencias reguladoras sean adyacentes a secuencias codificantes y/o transcritas o no. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de traducción como sitios de unión a ribosomas y sitios de entrada de ribosomas internos, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos de límite, orígenes de replicación, sitios de unión a matriz y regiones de control de locus.
"Expresión genética" se refiere a la conversión de la información contenida en un gen en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican mediante procesos como taponamiento, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas mediante, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación y glicosilación.
"Modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, activación génica y represión génica. La edición del genoma (por ejemplo, escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) puede usarse para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye una ZFP o TALEN como se describe en la presente. Por tanto, la inactivación génica puede ser parcial o completa.
Una "región de interés" es cualquier región de la cromatina celular, como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro o adyacente a un gen, en la que es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser con el propósito de escisión de ADN dirigida y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma organular (por ejemplo, mitocondrial, cloroplasto), o un genoma viral infeccioso, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias finales o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea en sentido ascendente o en sentido descendente de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o tener hasta 2000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor integral de pares de nucleótidos.
Las células "eucariotas" incluyen, pero no se limitan a, células fúngicas (como levadura), células vegetales, células animales, células de mamíferos y células humanas (por ejemplo, células T).
Los "glóbulos rojos" (RBC) o eritrocitos son células diferenciadas terminalmente derivadas de células madre hematopoyéticas. Carecen de nucleasa y de la mayoría de orgánulos celulares. Los RBC contienen hemoglobina para transportar oxígeno desde los pulmones a los tejidos periféricos. De hecho, el 33% de un RBC individual es hemoglobina. También transportan el CO2 producido por las células durante el metabolismo fuera de los tejidos y de regreso a los pulmones para su liberación durante la exhalación. Los RBC se producen en la médula ósea en respuesta a la hipoxia sanguínea mediada por la liberación de eritropoyetina (EPO) por el riñón. La EPO provoca un aumento en el número de proeritroblastos y acorta el tiempo requerido para la maduración completa de los RBC. Después de aproximadamente 120 días, como los glóbulos rojos no contienen un núcleo ni ninguna otra capacidad regenerativa, las células se eliminan de la circulación o por las actividades fagocíticas de los macrófagos en el hígado, el bazo y los ganglios linfáticos (~90%) o por hemólisis en el plasma (~10%). Después de la engullición por los macrófagos, los componentes químicos de los RBC se descomponen dentro de las vacuolas de los macrófagos debido a la acción de las enzimas lisosomales.
Los "tejidos secretores" son aquellos tejidos en un animal que secretan productos de la célula individual a una luz de algún tipo que se deriva típicamente del epitelio. Ejemplos de tejidos secretores que se localizan en el tracto gastrointestinal incluyen las células que recubren el intestino, el páncreas y la vesícula biliar. Otros tejidos secretores incluyen el hígado, tejidos asociados con el ojo y membranas mucosas como glándulas salivales, glándulas mamarias, glándula prostática, glándula pituitaria y otros miembros del sistema endocrino. Además, los tejidos secretores incluyen células individuales de un tipo de tejido que son capaces de secretar.
Los términos "enlace operativo" y "enlazado operativamente" se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (como elementos de secuencia), en los que los componentes están dispuestos de tal manera que ambos componentes funcionen normalmente y permitan la posibilidad de que por lo menos uno de los componentes pueda mediar en una función que se ejerce sobre por lo menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora transcripcional, como un promotor, está enlazada operativamente a una secuencia codificante si la secuencia reguladora transcripcional controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores transcripcionales. Una secuencia reguladora transcripcional está generalmente enlazada operativamente en cis con una secuencia codificante, pero no es necesario que esté directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora transcripcional que está enlazada operativamente a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.
Con respecto a los polipéptidos de fusión, el término "enlazado operativamente" puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en el enlazamiento con el otro componente como lo haría si no estuviera enlazado de esa manera. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN ZFP o TALE se fusiona con un dominio de activación, el dominio de unión a ADN ZFP o TALE y el dominio de activación están en enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP o TALE puede unirse a su sitio objetivo y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación puede regular por incremento la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP o TALE se fusiona con un dominio de escisión, el dominio de unión a ADN de ZFP o TALE y el dominio de escisión están en enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP o TALE puede unirse a su sitio objetivo y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación puede escindir el ADN en las cercanías del sitio objetivo.
Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, pero que todavía conserva la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos o el mismo número de residuos que la molécula nativa correspondiente y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función codificante, capacidad para hibridar con otro ácido nucleico) son bien conocidas en la técnica. De manera similar, los métodos para determinar la función de las proteínas son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido puede determinarse, por ejemplo, mediante ensayos de unión a filtro, desplazamiento de movilidad electroforética o inmunoprecipitación. La escisión del ADN puede evaluarse mediante electroforesis en gel. Ver Ausubel et al., Supra. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante coinmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genética como bioquímica. Ver, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; Patente de Estados Unidos N° 5.585.245 y PCT WO 98/44350.
Un "vector" es capaz de transferir secuencias génicas a células objetivo. Típicamente, "constructo de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" significan cualquier constructo de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias génicas a células objetivo. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.
Un "gen informador" o "secuencia informadora" se refiere a cualquier secuencia que produce un producto proteico que se mide fácilmente, preferiblemente aunque no necesariamente en un ensayo de rutina. Los genes informadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína verde fluorescente, proteína fluorescente verde mejorada, proteína fluorescente roja, luciferasa) y proteínas que median el crecimiento celular mejorado y/o la amplificación de genes (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las etiquetas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable. Las "etiquetas de expresión" incluyen secuencias que codifican informadores que pueden enlazarse operativamente a una secuencia genética deseada para monitorizar la expresión del gen de interés.
Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a mamíferos como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. Por consiguiente, el término "sujeto" o "paciente" como se usa en la presente significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que pueden administrarse las células y/o proteínas alteradas producidas por las células alteradas. Los sujetos de la presente invención incluyen aquellos que tienen un trastorno de LSD (MPS I) y/o MPSII.
Nucleasas
Se usan una o más nucleasas, es decir, un par de ZFN, para la introducción dirigida del transgén de IDUA o IDS. Las nucleasas son de origen no natural, es decir, manipuladas en la molécula de unión al ADN (también referido como dominio de unión al ADN) y/o dominio de escisión. Las nucleasas con dedos de zinc pueden comprender dominios heterólogos de unión y escisión de ADN.
A. Dominios de unión al ADN
El dominio de unión al ADN de una o más de las nucleasas usadas para la escisión in vivo y/o la escisión dirigida del genoma de una célula comprende una proteína con dedos de zinc. La proteína con dedos de zinc no se produce de manera natural porque está manipulada para unirse a un sitio objetivo de elección. Ver, por ejemplo, Ver, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:3l3-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patentes de Estados Unidos N° 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
Un dominio de unión con dedos de zinc manipulado puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con una proteína con dedos de zinc de origen natural. Los métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos con dedos de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos de tripletes o cuadrupletes está asociada con una o más secuencias de aminoácidos con dedos de zinc que se unen a la secuencia de tripletes o cuadrupletes particular. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos 6.453.242 y 6.534.261 de propiedad compartida.
Los métodos de selección ejemplares, que incluyen la presentación de fagos y los sistemas de dos híbridos, se divulgan en las Patentes de Estados Unidos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en las WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; y WO 01/88197. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en la WO 02/077227 de titularidad compartida.
Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios con dedos de zinc y/o proteínas con dedos de zinc con múltiples dedos pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver también, Patentes de Estados Unidos N° 8.772.453; 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.
Selección de sitios objetivo; las ZFP y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con detalle en las Patentes de Estados Unidos N° 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios con dedos de zinc y/o proteínas con dedos de zinc con múltiples dedos pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver también, las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.
B. Dominios de escisión
Los dominios de unión a ADN de ZFP se fusionan con dominios de nucleasa para crear ZFN, una entidad funcional que es capaz de reconocer su objetivo de ácido nucleico pretendido a través de su dominio de unión a ADN manipulado (ZFP) y hacer que el ADN se corte cerca del sitio de unión a ZFP a través del actividad de nucleasa. Ver, por ejemplo, Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3): 1156-1160. Más recientemente, se han usado ZFN para la modificación del genoma en una variedad de organismos. Ver, por ejemplo, Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la Publicación Internacional WO 07/014275.
El dominio de escisión puede ser heterólogo al dominio de unión al ADN del dedo de zinc, por ejemplo, un dominio de escisión de una nucleasa. Los dominios de escisión heterólogos pueden obtenerse a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que puede derivarse un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas autodirigidas. Ver, por ejemplo, el catálogo 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (por ejemplo, Nucleasa S1; nucleasa de frijol mungo; ADNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa hO de levadura; ver también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Pueden usarse una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.
De manera similar, un semidominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se ha expuesto anteriormente, que requiera dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Alternativamente, puede usarse una única proteína que comprenda dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden derivarse de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión puede derivarse de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios objetivo para las dos proteínas de fusión están preferiblemente dispuestos, uno con respecto al otro, de tal manera que la unión de las dos proteínas de fusión con sus sitios objetivo respectivos coloque los semidominios de escisión que permita que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por tanto, en ciertas realizaciones, los bordes cercanos de los sitios objetivo están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios objetivo (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.
Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse de forma específica de secuencia al ADN (en un sitio de reconocimiento) y escindir el ADN en o cerca del sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, Tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima de tipo IIS Fok I cataliza la escisión de cadena doble del ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Por tanto, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de por lo menos una enzima de restricción de Tipo IIS y uno o más dominios de unión con dedos de zinc, que pueden o no pueden estar manipulados.
Una enzima de restricción de Tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particular es activa como dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Por consiguiente, para los propósitos de la presente divulgación, la porción de la enzima Fok I usada en las proteínas de fusión divulgadas se considera un semidominio de escisión. Por tanto, para la escisión de doble cadena dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones con dedos de zinc-Fok I, pueden usarse dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un semidominio de escisión Fok I, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también puede usarse una única molécula de polipéptido que contiene un dominio de unión con dedos de zinc y dos semidominios de escisión de Fok I. Los parámetros para la escisión dirigida y la alteración de la secuencia dirigida usando fusiones con dedos de zinc-Fok I se proporcionan en otra parte de esta divulgación.
Un dominio de escisión o semidominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que retenga la actividad de escisión, o que conserve la capacidad de multimerizar (por ejemplo, dimerizar) para formar un dominio de escisión funcional.
Las enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares se describen en Patente de Estados Unidos 7,888,121. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos se contemplan en la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res 31: 418-420.
En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión manipulados (a los que también se hace referencia como mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 8.772.453; 8.623.618; 8.409.861; 8.034.598; 7.914.796; y 7.888.121. Los residuos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de Fok I son todos objetivos para influir en la dimerización de los semidominios de escisión Fok I.
Los semidominios de escisión manipulados ejemplares de Fok I que forman heterodímeros obligados incluyen un par en el que un primer semidominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de Fok I y un segundo semidominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos 486 y 499.
Por tanto, en una realización, una mutación en 490 reemplaza Glu (E) con Lys (K); la mutación en 538 reemplaza Iso (I) con Lys (K); la mutación en 486 reemplaza a Gln (Q) con Glu (E); y la mutación en la posición 499 reemplaza Iso (I) con Lys (K). Específicamente, los semidominios de escisión manipulados descritos en la presente se prepararon mutando las posiciones 490 (E^-K) y 538 (I^K ) en un semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión manipulado designado "E490K: I538K" y mutando las posiciones 486 (Q^E) y 499 (I^L ) en otro semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión manipulado designado "Q486E: I499L". Los semidominios de escisión manipulados descritos en la presente son mutantes heterodímeros obligados en los que la escisión aberrante se minimiza o anula. Patentes de Estados Unidos N° 7.914.796 y 8.034.598. En ciertas realizaciones, el semidominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 486, 499 y 496 (numeradas con respecto a FokI de tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el residuo Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 con un residuo Glu (E), el residuo de tipo salvaje Iso (I) en la posición 499 con un residuo de Leu (L) y el residuo de Asn (N) de tipo salvaje en la posición 496 con un residuo de Asp (D) o Glu (E) (a los que también se hace referencia como dominios "ELD" y "ELE", respectivamente). En otras realizaciones, el semidominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numeradas con respecto a FokI de tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 con un residuo de Lys (K), el residuo de Iso (I) de tipo salvaje en la posición 538 con un residuo de Lys (K), y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 con un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (a los que también se hace referencia como dominios "KKK" y "KKR", respectivamente). En otras realizaciones, el semidominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numeradas con respecto a FokI de tipo salvaje), por ejemplo, mutaciones que reemplazan el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 con un residuo de Lys (K. y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 con un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (a los que también se hace referencia como dominios "KIK" y "KIR", respectivamente). Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.772.453. En otras realizaciones, el semidominio de escisión manipulado comprende las mutaciones "Sharkey" y/o "Sharkey" (ver Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).
Los semidominios de escisión manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio de semidominios de escisión de tipo salvaje (Fok I) como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 7.888.121; 7.914.796; 8.034.598; y 8.623.618.
Alternativamente, las nucleasas pueden ensamblarse in vivo en el sitio objetivo del ácido nucleico usando la tecnología denominada "enzima dividida" (ver, por ejemplo la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20090068164). Los componentes de tales enzimas divididas pueden expresarse en constructos de expresión separados o pueden unirse en un marco de lectura abierto en el que los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A autoescindible o una secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión con dedos de zinc individuales o dominios de un dominio de unión de ácido nucleico de meganucleasa.
Las nucleasas pueden seleccionarse para determinar su actividad antes de su uso, por ejemplo, en un sistema cromosómico basado en levadura como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 8.563.314. La expresión de la nucleasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible, por ejemplo el promotor de galactoquinasa que se activa (des-reprime) en presencia de rafinosa y/o galactosa y se reprime en presencia de glucosa.
La o las nucleasas como se describe en la presente pueden hacer uno o más cortes de cadena doble y/o de cadena sencilla en el sitio objetivo. En ciertas realizaciones, la nucleasa comprende un dominio de escisión catalíticamente inactivo (por ejemplo, Fokl). Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 9.200.266; 8.703.489 y Guillinger et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582. El dominio de escisión catalíticamente inactivo puede, en combinación con un dominio catalíticamente activo, actuar como una nickasa para hacer un corte de cadena sencilla. Por lo tanto, pueden usarse dos nickasas en combinación para hacer un corte de doble cadena en una región específica. También se conocen en la técnica nickasas adicionales, por ejemplo, McCaffery et al. (2016) Ácidos nucleicos Res. 44(2):e11.doi:10.1093/nar/gkv878. Epub 19 de octubre de 2015.
Sitios objetivo
Como se ha descrito con detalle anteriormente, los dominios de ADN pueden manipularse para unirse a cualquier secuencia de elección en un locus, por ejemplo, una albúmina u otro gen de puerto seguro. Un dominio de unión a ADN manipulado puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con un dominio de unión a ADN de origen natural. Los métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos individuales (por ejemplo, dedos de zinc), en las que cada secuencia de nucleótidos de tripletes o cuadrupletes está asociada con una o más secuencias de aminoácidos del dominio de unión a ADN que se une a la secuencia particular de triplete o cuadruplete. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 6.453.242 y 6.534.261 de titularidad compartida. También puede realizarse el diseño racional de dominios efectores de TAL. Ver, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N° 20110301073.
Métodos de selección ejemplares aplicables a métodos de unión a ADN, incluyendo presentación en fagos y sistemas dos híbridos, se divulgan en las Patentes de Estados Unidos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en las WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2,338,237.
Selección de sitios objetivo; las nucleasas y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con detalle en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 20050064474 y 20060188987.
Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de unión al ADN (por ejemplo, proteínas con dedos de zinc de múltiples dedos) pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia de conector adecuada, incluyendo por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dominios individuales de unión al ADN de la proteína. Ver también la Patente de Estados Unidos N° 8.586.526.
Donantes
Como se ha indicado anteriormente, se proporciona la inserción de una secuencia exógena (también denominada "secuencia donante" o "donante"), por ejemplo, para la corrección de un gen mutante o para una expresión aumentada de un gen que codifica una proteína que carece o es deficiente en la enfermedad de MPS I y/o MPS II (IDUA o IDS). Resultará fácilmente evidente que la secuencia donante no es típicamente idéntica a la secuencia genómica en la que se coloca. Una secuencia donante puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir una HDR eficiente en la localización de interés. Además, las secuencias donantes pueden comprender una molécula de vector que contiene secuencias que no son homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula donante puede contener varias regiones discontinuas de homología con la cromatina celular. Por ejemplo, para la inserción dirigida de secuencias que no están normalmente presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico donante y flanqueadas por regiones de homología con la secuencia en la región de interés.
En la presente se describen métodos de inserción dirigida de un transgén que codifica una proteína de IDUA o IDS para su inserción en una localización elegida. A los polinucleótidos para la inserción también puede hacerse referencia como polinucleótidos "exógenos", polinucleótidos o moléculas "donantes" o "transgenes". El polinucleótido donante puede ser ADN o ARN, de cadena sencilla y/o de cadena doble y puede introducirse en una célula en forma lineal o circular. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 8.703.489 y 9,005,973. La secuencia o secuencias donantes también pueden estar contenidas dentro de un ADN MC, que puede introducirse en la célula en forma circular o lineal. Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20140335063. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (por ejemplo, de la degradación exonucleolítica) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótidos al extremo terminal 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Ver, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272: 886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de grupos amino terminales y el uso de enlaces internucleotídicos modificados como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa.
Puede introducirse un polinucleótido en una célula como parte de una molécula de vector que tiene secuencias adicionales como, por ejemplo, orígenes de replicación y genes que codifican resistencia a antibióticos. Además, los polinucleótidos donante pueden introducirse como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente como un liposoma o poloxámero, o pueden ser administrados por virus (por ejemplo, adenovirus, AAV, herpesvirus, retrovirus, lentivirus y lentivirus defectuosos en integrasa (IDLV)).
El donante generalmente se inserta de tal manera que su expresión sea impulsada por el promotor endógeno en el sitio de integración, concretamente el promotor que impulsa la expresión del gen endógeno en el que se inserta el donante (albúmina).
El transgén puede insertarse en un locus de albúmina de tal manera que se expresen algunas (N-terminal y/o C-terminal del transgén que codifica la enzima lisosomal) o ninguna de las secuencias de albúmina endógena, por ejemplo, como una fusión con el transgén que codifica la o las proteínas de IDUA o IDS.
Cuando las secuencias endógenas (endógenas o parte del transgén) se expresan con el transgén, las secuencias endógenas (albúmina) pueden ser secuencias de longitud completa (de tipo salvaje o mutante) o secuencias parciales. Preferiblemente, las secuencias endógenas son funcionales. Los ejemplos no limitativos de la función de estas secuencias de longitud completa o parcial (albúmina) incluyen aumentar la vida media en suero del polipéptido expresado por el transgén (por ejemplo, gen terapéutico) y/o actuar como un portador.
Además, aunque no se requieren para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras de la transcripción o la traducción, por ejemplo, potenciadores, aislantes, sitios de entrada de ribosomas internos, secuencias que codifican péptidos 2Ay/o señales de poliadenilación.
En algunos casos, el donante puede ser un gen endógeno (IDUA o IDS) que ha sido modificado. Por ejemplo, puede realizarse optimización con codones en el gen endógeno para producir un donante. Además, aunque la respuesta de anticuerpos a la terapia de reemplazo enzimático varía con respecto a la enzima terapéutica específica en cuestión y con el paciente individual, se ha observado una respuesta inmune significativa en muchos pacientes con enfermedad de MPS I o MPS II que están siendo tratados con reemplazo enzimático con IDUA o IDS de tipo salvaje. Además, la relevancia de estos anticuerpos para la eficacia del tratamiento también es variable (ver Katherine Ponder, (2008) J Clin Invest 118(8) 2686). Por tanto, las composiciones de la presente invención pueden comprender la generación de un donante con secuencias modificadas en comparación con IDUA o IDS de tipo salvaje, incluyendo, pero no limitadas a, modificaciones que producen cambios de aminoácidos funcionalmente silenciosos en sitios que se sabe que ceban epítopos para respuestas inmunes endógenas y/o truncamientos de tal manera que el polipéptido producido por dicho donante sea menos inmunogénico.
Los pacientes con enfermedades MPS I y MPS II a menudo tienen secuelas neurológicas debido a la falta de la enzima IDUA o IDS que falta en el cerebro. Desafortunadamente, a menudo es difícil administrar agentes terapéuticos al cerebro a través de la sangre debido a la impermeabilidad de la barrera hematoencefálica. Por tanto, las composiciones de la invención pueden usarse junto con métodos para aumentar la administración del agente terapéutico al cerebro, incluyendo pero no limitados a, métodos que provocan una apertura transitoria de las uniones estrechas entre las células de los capilares cerebrales, como la alteración osmótica transitoria mediante el uso de una administración intracarotídea de una solución de manitol hipertónica, el uso de ultrasonido focalizado y la administración de un análogo de bradicinina. Alternativamente, pueden diseñarse agentes terapéuticos para utilizar receptores o mecanismos de transporte para el transporte específico hacia el cerebro. Los ejemplos de receptores específicos que pueden usarse incluyen el receptor de transferrina, el receptor de insulina o las proteínas 1 y 2 relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP-1 y LRP-2). Se sabe que la LRP interactúa con una variedad de proteínas secretadas como apoE, tPA, PAI-1, etc., por lo que fusionar una secuencia de reconocimiento de una de estas proteínas para LRP puede facilitar el transporte de la enzima al cerebro, después de la expresión en el hígado de la proteína terapéutica y su secreción en el torrente sanguíneo (ver Gabathuler, (2010) ibíd).
Células
El transgén de IDUA y/o IDS se integra de manera dirigida en el genoma de las células hepáticas usando un par de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) dirigidas a un gen de albúmina endógena. A diferencia de la integración aleatoria, la integración dirigida mediada por nucleasas asegura que el transgén se integre en un gen específico. El transgén puede integrarse en cualquier parte del gen objetivo. En ciertas realizaciones, el transgén se integra en o cerca del sitio de unión y/o escisión de nucleasas, por ejemplo, en el intervalo de 1-300 (o cualquier número de pares de bases entre ellos) pares de bases en sentido ascendente o en sentido descendente del sitio de escisión y/o sitio de unión, más preferiblemente en el intervalo de 1-100 pares de bases (o cualquier número de pares de bases entre ellos) de cualquier lado del sitio de escisión y/o unión, incluso más preferiblemente en el intervalo de 1 a 50 pares de bases (o cualquier número de pares de bases entre ellos) de cualquier lado del sitio de escisión y/o unión. En ciertas realizaciones, la secuencia integrada no incluye ninguna secuencia de vector (por ejemplo, secuencias de vectores virales).
Administración
Las nucleasas, polinucleótidos que codifican estas nucleasas, polinucleótidos donantes y composiciones que comprenden las proteínas y/o polinucleótidos descritos en la presente pueden administrarse in vivo o ex vivo mediante cualquier medio adecuado.
Los métodos de administración de nucleasas como se describe en la presente se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.
Puede usarse cualquier sistema de vectores, incluyendo pero no limitados a, vectores plásmidos, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales, vectores de virus de la viruela; vectores de virus de herpes y vectores de virus adenoasociados, etc. Ver, también, las Patentes de Estados Unidos N° 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.
Pueden usarse métodos de transferencia de genes basados en virus y no virales convencionales para introducir ácidos nucleicos que codifican nucleasas y constructos de donantes en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos objetivo. Los sistemas de administración de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de administración como un liposoma o poloxámero. Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, ver Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993);Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
Los métodos de administración no viral de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por agentes. También puede usarse la sonoporación usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) para la administración de ácidos nucleicos.
Ejemplos adicionales de sistemas de administración de ácidos nucleicos incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (ver por ejemplo la US6008336). La lipofección se describe en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos de reconocimiento de receptor eficaz incluyen los de Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024.
La preparación de complejos lípido:ácido nucleico, que incluyen liposomas dirigidos como complejos inmunolípidos, es bien conocida por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995), Ahmad et al., Cancer Res.
52:4817-4820 (1992); Patentes de Estados Unidos N° 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787).
Los métodos de administración adicionales incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos para su administración en vehículos de administración EnGeneIC (VDE). Estos VED se administran específicamente a tejidos objetivo usando anticuerpos biespecíficos donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido objetivo y el otro tiene especificidad por el VED. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula objetivo y luego el EDV se introduce en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, se libera el contenido (ver MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos que codifican ZFP modificadas aprovecha los procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas del cuerpo y transportar la carga útil viral al núcleo. Los vectores virales pueden administrarse directamente a sujetos (in vivo) o pueden usarse para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a sujetos (ex vivo).Los sistemas basados en virus convencionales para la administración de ZFP incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus retrovirales, lentivirus, adenovirales, adenoasociados, vaccinia y herpes simplex para la transferencia de genes. La integración en el genoma del huésped es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, lo que a menudo da como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos objetivo diferentes.
El tropismo de un retrovirus puede alterarse incorporando proteínas de envoltura extrañas, expandiendo la población objetivo potencial de células objetivo. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que pueden transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen títulos virales altos. La selección de un sistema de transferencia de genes retrovirales depende del tejido objetivo. Los vectores retrovirales se componen de repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR que actúan en cis mínimas son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que luego se usan para integrar el gen terapéutico en la célula objetivo para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (ver, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol.
176:58-59 (1990); Wilson et al.., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, pueden usarse sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores se han obtenido títulos elevados y niveles de expresión altos. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se usan los vectores de virus adenoasociados ("AAV") para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (ver, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47(1987); Patente de Estados Unidos N° 4.797.368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invertir. 94:1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en una serie de publicaciones, que incluyen la Patente de Estados Unidos N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol.
4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
Actualmente se encuentran disponibles por lo menos seis enfoques de vectores virales para la transferencia de genes en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos con genes insertados en líneas de células auxiliares para generar el agente transductor.
El pLASN y el MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han usado en ensayos clínicos (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:2212133-12138 (1997)). El PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50% o más para los vectores empaquetados en MfG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther.
1:111-2 (1997).
Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) son sistemas alternativos prometedores de administración de genes basados en el virus tipo 2 adenoasociado por parvovirus defectuoso y no patogénico. Todos los vectores se derivan de un plásmido que retiene solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb del AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. La transferencia de genes eficiente y la administración de transgenes estable debidas a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave para este sistema de vector. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996))). También pueden usarse de acuerdo con la presente invención otros serotipos de AAV, incluyendo como ejemplos no limitativo, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9 y AAV rh10 y AAV pseudotipados como AAV2/8, AAV2/5 y AAV2/6.
Los vectores adenovirales recombinantes deficientes en replicación (Ad) pueden producirse con un título alto e infectar fácilmente varios tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus se manipulan de manera que un transgén sustituya a los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector de replicación defectuosa se propaga en células 293 humanas que suministran la función génica delecionada en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo células diferenciadas que no se dividen, como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther.
7:1083-9 (1998))). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7, 1083­ 1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Álvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).
Las células de empaquetamiento se usan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Tales células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales usados en la terapia génica generalmente se generan mediante una línea de células productoras que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas necesarias para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped (si procede), siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones virales que faltan se suministran en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV usados en terapia génica típicamente solo poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que son necesarias para el empaquetamiento e integración en el genoma del huésped. El ADN viral se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, concretamente rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también está infectada con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector de AAV y la expresión de genes de AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias de ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse, por ejemplo, mediante tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.
En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica se administre con un alto grado de especificidad para un tipo de tejido particular. Por consiguiente, puede modificarse un vector viral para que tenga especificidad para un tipo de célula dado expresando un ligando como una proteína de fusión con una proteína de la cubierta viral en la superficie exterior del virus. El ligando se elige para que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), informó que el virus de la leucemia murina de Moloney puede modificarse para expresar herregulina humana fusionada con gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede extenderse a otros pares de virus-célula objetivo, en los que la célula objetivo expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, pueden manipularse fagos filamentosos para mostrar fragmentos de anticuerpos (por ejemplo., FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a los vectores virales, pueden aplicarse los mismos principios a vectores no virales. Tales vectores pueden manipularse para que contengan secuencias de captación específicas que favorezcan la captación por células objetivo específicas.
Los vectores de terapia génica pueden administrarse in vivo mediante administración a un paciente individual, típicamente mediante administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica, como se describe a continuación. Alternativamente, los vectores pueden administrarse a células ex vivo, como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, Linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de un donante universal, seguido de la reimplantación de las células en un paciente, habitualmente después de selección de células que han incorporado el vector.
Los vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen nucleasas y/o constructos de donantes también pueden administrarse directamente a un organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, puede administrarse ADN desnudo. La administración se realiza mediante cualquiera de las vías normalmente usadas para introducir una molécula en contacto final con células sanguíneas o tisulares, incluyendo pero no limitadas a, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar tales ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica y, aunque puede usarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra vía.
Los vectores adecuados para la introducción de polinucleótidos descritos en la presente incluyen vectores de lentivirus no integrantes (IDLV). Ver, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2009/054985.
Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se está administrando, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, como se describe a continuación (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).
Resultará evidente que las secuencias que codifican nucleasas y los constructos donantes pueden administrarse usando el mismo sistema o uno diferente. Por ejemplo, un polinucleótido donante puede ser transportado por un plásmido, mientras que una o más nucleasas pueden ser transportadas por un vector de AAV. Además, los diferentes vectores pueden administrarse por la misma vía por una diferente (inyección intramuscular, inyección en la vena de la cola, otra inyección intravenosa, administración intraperitoneal y/o inyección intramuscular. Los vectores pueden administrarse simultáneamente o en cualquier orden secuencial.
Las formulaciones para administraciones tanto ex vivo como in vivo incluyen suspensiones en líquidos o líquidos emulsionados. Los ingredientes activos a menudo se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón del pH, agentes estabilizantes u otros reactivos que mejoran la eficacia de la composición farmacéutica. Aplicaciones
La invención se refiere al tratamiento y/o prevención de la enfermedad por MPS I (por ejemplo, una enfermedad por almacenamiento lisosomal) y/o una enfermedad por MPS I. El tratamiento comprende la inserción de uno o más genes correctores asociados a la enfermedad (IDUa o IDS) en un locus de albúmina en una célula hepática para la expresión de la enzima o enzimas necesarias y su liberación al torrente sanguíneo. El transgén puede codificar una proteína que comprende un transgén de IDUA o IDS optimizado con codones; y/o un transgén en el que pueden eliminarse los epítopos sin alterar funcionalmente la proteína.
La invención es particularmente útil para corregir o restaurar la funcionalidad en sujetos con enfermedad de MPS I.
A modo de ejemplos no limitativos, la producción de las proteínas defectuosas o faltantes se logró y se usó para tratar la enfermedad de MPS I y/o MPS II. Los donantes de ácido nucleico que codifican la proteína faltante se insertan en un locus de puerto seguro (albúmina) y se expresan usando el promotor presente en el puerto seguro.
En algunas aplicaciones, puede anularse un gen endógeno mediante el uso de las composiciones de la invención, por ejemplo, anular un regulador génico aberrante o un gen asociado a una enfermedad aberrante. En algunas aplicaciones, un gen endógeno aberrante puede reemplazarse, o funcionalmente o in situ, con una versión de tipo salvaje del gen. También puede alterarse el gen insertado para mejorar la expresión de la proteína terapéutica de IDUA o IDS o para reducir su inmunogenicidad. En algunas aplicaciones, el transgén que codifica IDUA o IDS insertado es una proteína de fusión para aumentar su transporte a un tejido seleccionado como el cerebro.
Los siguientes ejemplos se refieren a realizaciones ejemplares de la presente divulgación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Diseño y construcción de reactivos de ZFN de ratón y plantilla de donante de IDUA
Como las secuencias objetivo para las ZFN candidatas clínicas y los brazos de homología de donante de albúmina humana no se conservan en el locus de albúmina de ratón, se desarrollaron reactivos sustitutos de ratón para su uso en estos estudios en ratones. Los reactivos sustitutos de ratón incluían un par de vectores de rAAV de ZFN (SB-48641, SB-31523, que se muestran a continuación en la Tabla I y la Tabla II, ver Solicitud de Patente de Estados Unidos 14/872,537) dirigidos a un sitio homólogo en el intrón 1 del gen de la albúmina de ratón así como a un donante que codifica un transgén de IDUA humano sin promotor (hIDUA) flanqueado por brazos con homología con el locus del ratón (SB-mu-IDUA). La proporción de ZFN: ZFN: donante usada en este estudio fue 1:1:8. Para este estudio en ratones, los reactivos sustitutos se empaquetaron y administraron usando el serotipo rAAV2/8, ya que confiere una transducción superior y una expresión transgénica más rápida que los vectores rAAV2/6 en ratones in vivo. Los vectores rAAV2/8 se diluyeron en el tampón de formulación, solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con NaCl 35 mM y glicerol al 5%, pH 7,1.
Tabla 1: Diseños de albúmina de ratón
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T l 2: i i iv zin ífi l min r n
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El par de ZFN específico de albúmina de ratón estaba completamente activo.
Ejemplo 2: Tratamiento de MPS I (knockout de IDUA o Idua -/-) en un modelo de ratón
A. Materiales y métodos
El modelo de ratón MPS I (inactivación de IDUA o Idua -/-) usado en este estudio fue generado por la Dra. Elizabeth Neufeld (UCLA, Los Ángeles, CA) mediante la alteración del gen de IDUA, en el que se insertó un casete de resistencia a neomicina en el exón 6 (Ohmi et al. (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):1902-1907). Luego, los ratones se criaron en un fondo genético C57BL/6, y se seleccionaron heterocigotos para producir ratones Idua-/-. Esta mutación homocigótica lleva a cambios morfológicos, bioquímicos y neurológicos importantes a lo largo de la vida del animal y ha demostrado ser un modelo adecuado para el estudio de la fisiopatología lisosomal. En particular, se ha demostrado que estos ratones con MPS I muestran características fenotípicas típicas de MPS I, como anomalías craneofaciales, déficits neurológicos y niveles aumentados de GAG en tejidos y orina (Hartung et al. (2004). Mol Ther. 9(6):866-75; Ou et al. (2014). Mol Genet Metab. 111 (2): 116-22). Los ratones Idua-/- comienzan a desarrollar estos síntomas después de aproximadamente 3-5 semanas y a las 12-16 semanas de edad es evidente una extensa acumulación lisosomal de GAG en el hígado y el sistema nervioso central (SNC, es decir, cerebro, médula espinal y meninges). Además, estos ratones con m Ps I muestran déficits/deterioros cognitivos (Hartung et al. Ibid; Ou et al. Ibid).
Se aleatorizaron cohortes de ratones y se les administraron dosis entre las 4 y 10 semanas de edad a medida que se disponía de camadas. Se dosificaron por lo menos 2 ratones por grupo el mismo día.
A los animales se les administró ciclofosfamida para suprimir una posible respuesta de inmunogenicidad a la proteína de hIDUA. Todos los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (IP) de 200 pl de ciclofosfamida (120 mg/kg) el día antes de la dosificación y luego semanalmente hasta la semana 12. Después de la semana 12, los ratones recibieron 120 mg/kg una vez cada dos semanas hasta la necropsia. La razón del cambio en la frecuencia de administración de ciclofosfamida después de la semana 12 se debió a las observaciones en algunos ratones de alopecia leve cerca del lugar de la inyección y bradicinesia aguda leve, que son efectos secundarios conocidos de la ciclofosfamida. Estudios anteriores han demostrado una inmunosupresión eficaz para atenuar la pérdida de actividad de IDUA humana en ratones con MPS I usando un programa de inyección bimensual (Aronovich et al. (2007). J. Gene Med. 9:403-15), o según sea necesario (ver Ou et al (2014) Mol Genet Metabol 111 (2): 116).
Los animales se asignaron al azar en función de la edad y el peso corporal de cada género. Se administró una única dosis de artículo de prueba o vehículo el Día 1. Se sacrificaron tres ratones de cada grupo 1 mes después de la inyección de AAV. Los 5 ratones restantes de cada grupo se sacrificaron 4 meses después de la inyección de AAV. El nivel de dosis total de rAAV2/8 para los grupos de ZFN Donante fue de 1,5e l 2 vg/ratón, y para el grupo de solo donante fue de 1,2e 12 vg/ratón. Los grupos y las dosis recibidas se muestran a continuación en la Tabla 3.
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Recolecciones y mediciones: Se recogieron muestras de sangre para hematología y análisis de química clínica de todos los animales antes de la necropsia (Día 120) mediante sangrado submandibular. Los animales se mantuvieron en ayunas durante por lo menos 8 horas antes de las recolecciones de química del suero. Se recogieron muestras de sangre para análisis hematológico (volumen objetivo 100-150 jl) en tubos que contenían EDTA de potasio (K3) como anticoagulante. Se recogieron muestras de sangre para análisis de química clínica (volumen objetivo 100-150 jl) en tubos sin anticoagulante y se procesaron hasta suero.
Para la evaluación de la actividad de IDUA, se recogieron muestras de sangre (volumen objetivo 200 jl) mediante sangrado submandibular de todos los ratones los Días 7, 14, 28, 60, 90, 104 y 120 en tubos que contenían heparina como anticoagulante y se procesaron en plasma.
Para la evaluación de los niveles de glicosaminoglicano en orina (GAG), se recogieron muestras de orina (aproximadamente 10-100 jl) de todos los ratones aplicando presión suavemente en la vejiga urinaria los Días 7, 14, 21, 28, 42, 60, 74, 90, 104 y 120.
Aislamiento de ADN genómico de tejido de ratón: Se colocaron aproximadamente 5 mg de tejido congelado en un tubo Lysis Matrix D (MP Biomedicals, Burlingame, CA) y se añadieron 400 j l de Solución de lisis tisular y celular (Epicenter, Madison, WI). La homogeneización se realizó en un instrumento FastPrep®-24 (MP Biomedicals) mediante tres rondas, 40 segundos/pulso de 4 m/s. Los lisados brutos se centrifugaron brevemente y luego se incubaron durante 30 minutos a 65° C seguido de una breve centrifugación para aclarar el lisado. El lisado parcialmente aclarado se colocó en hielo durante 5 minutos y se transfirió a tubos de microcentrífuga, seguido de la adición de 400 j l de reactivo de precipitación de proteínas de MPC (epicentro). La mezcla se agitó brevemente en vórtex y luego se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4° C. Después de la centrifugación, el lisado clarificado se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga y se añadió 1 ml de isopropanol enfriado en hielo, se mezcló invirtiendo 30-50 veces y se incubó a -20° C durante 20 minutos. La mezcla se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4° C y se eliminó el sobrenadante. El sedimento resultante se lavó dos veces con etanol al 75% y se dejó secar al aire. El sedimento de ADN se volvió a suspender en 100 j l de tampón TE y se determinó la concentración de ADN (ng/jl) usando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
Análisis de modificación genética: Secuenciación profunda con MiSeq: para evaluar la actividad de los constructos de ZFN sustitutos de ratón en hepatocitos objetivo, se aisló ADN genómico del hígado de cada ratón. El sitio objetivo de ZFN se sometió a análisis de secuencia usando el sistema MiSeq (Illumina, San Diego CA). Se diseñó un par de cebadores de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento de 169 pares de bases (pb) que abarca el sitio objetivo de ZFN en el locus de albúmina de ratón (Tabla 4) y para introducir secuencias de unión para una segunda ronda de amplificación (en negrita). Los productos de esta amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se purificaron y se sometieron a una segunda ronda de PCR con oligonucleótidos diseñados para introducir una secuencia identificadora específica de amplicón ("código de barras"), así como regiones terminales diseñadas para unir cebadores oligonucleotídicos de secuenciación. La población mixta de amplicones con código de barras se sometió luego al análisis MiSeq, un procedimiento de secuenciación en fase sólida que permite el análisis paralelo de miles de muestras en un único chip de ensayo. El protocolo MiSeq realiza secuencialmente reacciones de secuenciación directa e inversa para cada oligonucleótido de entrada. Las secuencias emparejadas se alinean y fusionan y se compararon con la secuencia de tipo salvaje para mapear inserciones y/o deleciones ("indeles"). La actividad de ZFN se informa como "% de indeles", la fracción de amplicones secuenciados que difieren del tipo salvaje debido a inserciones o deleciones.
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Transferencia Western de hIDUA: Para examinar la expresión de hIDUA en hepatocitos de ratón, se realizaron transferencias Western en extractos de proteínas hepáticas. Se colocaron aproximadamente 50 mg de tejido congelado en un tubo Lysis Matrix D (MP Biomedicals, Burlingame, CA) y se añadieron 500 j l de tampón RIPA suplementado con inhibidor de proteasa HALT (Thermo Fisher Scientific). La homogeneización se realizó en un instrumento FastPrep®-24 (MP Biomedicals) durante cinco rondas, 45 segundos/pulso de 4,5 m/s. Los tubos se colocaron en hielo entre rondas de homogeneización. A continuación, los lisados brutos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4° C. Después de la centrifugación, el lisado aclarado se transfirió a un tubo de microcentrífuga preenfriado. Luego, se determinó la concentración de proteínas mediante el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) Pierce™ (Thermo Fisher Scientific). En condiciones de desnaturalización, se separaron 35 jg de proteína total en geles NuPAGE Novex Bis-Tris al 4-12% (Life Technologies, Grand Island, NY) y se inmovilizaron en una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE) durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se sondaron con anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo Odyssey durante la noche a 4° C. Las membranas se lavaron 5 veces durante 5 min cada una en solución salina tamponada con Tris solución de Tween-20 al 0,05% (TBST), y luego se sondaron con anticuerpo secundario en tampón de bloqueo Odyssey durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del marcado secundario, las membranas se lavaron 5 veces durante 5 min en TBST. Finalmente, para determinar la carga de proteína uniforme, se sondaron las membranas con anticuerpo marcado con GAPDH-800 durante 1 hora a temperatura ambiente. Los lavados se repitieron como anteriormente y se tomaron imágenes de las membranas usando un escáner LI-COR Odyssey.
Ensayo de actividad enzimática de IDUA: La actividad enzimática de IDUA en extractos de proteínas plasmáticas y tisulares se evaluó en un ensayo fluorimétrico usando el sustrato sintético 4-metilumbeliferil alfa-L-iduronida (4-MU-iduronida; Glycosynth, Warrington, Cheshire, Inglaterra). Se prepararon extractos de proteínas tisulares mezclando muestras de tejido de ratón con 1 ml de PBS (pH 7,4). Las muestras se almacenaron en hielo y se homogeneizaron con un homogeneizador Polytron® (Kinematica, Lucerne, Suiza) a un nivel de velocidad de 5 durante 5 segundos. La homogeneización se repitió 3 veces, o hasta que no había visibles partículas sólidas de tejido. Después de la homogeneización, se añadieron 11 j l de Triton X-100 al 10% a cada muestra. Luego, los homogeneizados se incubaron en hielo durante 10 minutos, después de lo cual los homogeneizados brutos se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos para aclarar el lisado antes del análisis. Las concentraciones de proteína en los extractos de tejido se determinaron usando el reactivo de ensayo de proteínas PierceTM 660 nm (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En el ensayo de actividad enzimática de IDUA, se mezclaron 25 j l de extracto de proteína de tejido de ratón o muestra de plasma de ratón con 25 j l de sustrato sintético 360 jM (4-MU-iduronida) disuelto en tampón de formiato (formiato de sodio 0,4 M, pH 3,5, Triton X-100 al 0,2%). Las reacciones se incubaron a 37° C durante 30 minutos y se terminaron mediante la adición de 200 j l de tampón de carbonato de glicina (glicina 84 mM, carbonato de sodio anhidro 85 mM). La liberación de 4-MU se determinó midiendo la fluorescencia (Ex365/Em450) usando un lector de microplacas BioTek (BioTek, Winooski, VT). Se generó una curva estándar usando diluciones de 4-MU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los datos resultantes se ajustaron con una curva lineal y se calculó la concentración de 4-MU en las muestras de prueba usando esta curva de mejor ajuste. La actividad enzimática se expresa como nmol 4-MU liberados por hora de tiempo de incubación de ensayo, por ml de plasma o mg de extracto de tejido (nmol/hr/ml) o (nmol/hr/mg).
Evaluación de los niveles de GAG en orina y tejidos de ratón: los niveles de GAG en tejidos y orina se determinaron usando el kit de ensayo de glucosaminoglicanos BlyscanTM (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes del ensayo de GAG, se mezclaron homogeneizados de tejido de ratón, preparados como se ha descrito anteriormente, con proteinasa K (20 mg/ml) a una proporción de 1:3 y se digirieron a 55° C durante 24 horas, seguido de la inactivación por calor de la proteinasa K hirviendo durante 10 minutos. Luego, los homogeneizados de tejido se digirieron con 200 unidades de DNasa y 2 jg de RNasa a temperatura ambiente durante 24 horas mientras se agitaba. Después, la ADNasa y la ARNasa se inactivaron por calor hirviéndolas durante 10 minutos y los homogeneizados de tejido resultantes se usaron para el ensayo de GAG.
Análisis histopatológico: Se recogieron los pesos de los órganos y cuerpos terminales (glándulas suprarrenales, cerebro, corazón, riñón, hígado, bazo, testículos u ovarios) en la necropsia del día 120 para los machos (grupo 1 [n=5], grupo 2 [n=4 ], Grupo 4 [n=4] y Grupo 6 [n=2]) y hembras (Grupo 3 [n=4], Grupo 5 [n=5] y Grupo 6 [n=2]) y as medias y las desviaciones estándar de los grupos se calcularon de forma rutinaria en Excel. Los animales de los Grupos 1 a 6 se sometieron a necropsia y los tejidos recogidos se colocaron en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% para la fijación. Se recortaron los siguientes tejidos para producir secciones histológicas: glándulas suprarrenales, aorta, cerebro, ciego, cuello uterino, colon, duodeno, epidídimo, esófago, ojos, articulación femoral-tibial, vesícula biliar, glándula de Harder, corazón, íleon, sitio de inyección, yeyuno, riñón, laringe, hígado, pulmones con bronquios, ganglio linfático (mesentérico), nervio óptico, ovarios, páncreas, glándula paratiroidea, glándula pituitaria, próstata, recto, glándula salival, nervio ciático, vesículas seminales, músculo esquelético (cuádriceps femoral), piel, médula espinal (cervical, lumbar, torácica), bazo, esternón con médula ósea, estómago, testículos, glándula timo, glándula tiroides, lengua, tráquea, vejiga urinaria, útero y vagina. Los tejidos enumerados anteriormente, de animales en todos los grupos de dosis, se procesaron de manera rutinaria y se incluyeron en bloques de parafina. Los bloques se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Los portaobjetos fueron evaluados microscópicamente por un patólogo veterinario certificado por la junta.
B. Resultados
Análisis de modificación genética: Porcentaje de indeles en el lugar de la albúmina: para evaluar la actividad de los constructos de ZFN en hepatocitos objetivo in vivo, se aisló ADN genómico de hígados de todos los ratones en la necropsia. El sitio objetivo de ZFN en el locus del intrón 1 de albúmina de ratón se sometió a análisis de secuencia usando el sistema MiSeq (Illumina, San Diego CA). La actividad de ZFN se determinó luego por la presencia de pequeñas inserciones y/o deleciones (indeles), que son las características distintivas de la actividad de ZFN. Se detectó actividad de ZFN en todos los grupos de ratones que recibieron ZFN de ratón sustitutos SB-mu-IDUA (Grupos 4 y 5). Los niveles de modificación del gen de la albúmina (% de indeles) en el tejido hepático al de 1 mes fueron de 46,67 ± 5,74% y 34,05 ± 2,06% (media ± SD) para machos y hembras, respectivamente. Los niveles de modificación genética a los 4 meses fueron de 55,65 ± 4,08% y 45,69 ± 2,26% para machos y hembras, respectivamente. No hubo niveles de corte de ZFN por encima del fondo en los grupos de control de tampón de formulación o los grupos de solo donante en cualquier punto temporal.
Para confirmar la especificidad del promotor específico del hígado, también se realizaron análisis de MiSeq en el ADN genómico del bazo, el corazón y el músculo. Estos órganos fueron elegidos porque mostraban los niveles más altos de actividad de IDUA fuera del hígado en ratones tratados con ZFN Donante (ver Figura 1A). Estos análisis se realizaron en ratones del Grupo 4 y del Grupo 5, porque mostraron el nivel más alto de actividad de ZFN en el tejido objetivo. Los correspondientes ratones macho no tratados (Grupo 2) se incluyeron como control negativo. No se observó ninguna modificación génica en el bazo y el corazón (tejidos no objetivo) de los Grupos 2 y 4 a los 4 meses, confirmando la especificidad del promotor específico del hígado y demostrando que la actividad de IDUA y la reducción de GAG encontrada en estos tejidos no se deriva de la actividad de ZFN e integración del donante fuera del hígado.
Transferencia Western de hIDUA. Después de la confirmación de la modificación génica apropiada del locus de albúmina de ratón en los hepatocitos, se examinaron luego los extractos de proteínas del hígado para determinar la expresión de hIDUA del locus de albúmina. Para evitar la señal de fondo potencial de la IDUA de ratón endógena, se realizaron análisis de transferencia Western usando un anticuerpo de detección generado contra la IDUA humana.
Como se muestra en la Figura 1B, hIDUA fue detectable al de 1 y 4 meses en los hígados de todos los ratones macho y hembra que recibieron ZFN sustituto donante de hIDUA de ratón. La expresión pareció aumentar a los 4 meses. Los ratones de control de tipo salvaje inyectados con tampón de formulación solo no mostraron señal de hIDUA, lo que demuestra la especificidad de la especie del anticuerpo usado. La expresión de hIDUA dependía de la presencia tanto de ZFN como del donante de hIDUA, ya que no se observó señal de hIDUA en ausencia de ZFN (grupo solo donante).
Actividad enzimática de IDUA. Para determinar si el transgén de hIDUA que se expresó a partir del locus de albúmina hepática producía proteína funcionalmente activa, se realizó un ensayo de actividad enzimática basado en fluorescencia para IDUA. Este ensayo se realizó en 1) extractos de proteínas del hígado (para asegurar que la enzima expresada estuviera activa); 2) plasma (para determinar si los hepatocitos secretaban la enzima expresada); y 3) extractos de proteínas del cerebro, corazón, pulmón, músculo y bazo (para determinar si la enzima se expresa en una forma que sea capaz de ser absorbida por los tejidos secundarios).
Al de 1 mes, la actividad de IDUA en el hígado de ratones tratados con ZFN donante (65,26 ± 24,68 y 40,54 ± 14,54 nmol/h/mg para machos y hembras, respectivamente) fue de 9 a 10 veces mayor que los niveles de actividad encontrados en ratones de tipo salvaje (4,09 ± 0,99 nmol/h/mg). La actividad de IDUA en ratones tratados con ZFN donante también aumentó considerablemente en comparación con la actividad en ratones con MPS I tanto controles (0,11 ± 0,02 [macho] y 0,16 ± 0,04 [hembra] nmol/h/mg) como solo donante (0,18 ± 0,05 nmol/h/mg). Los bajos niveles de actividad encontrados en ratones con MPS I que recibieron el donante SB-mu-IDUA en ausencia de ZFN (solo donante) demuestran que tanto el donante de ZFN como el donante de SB-mu-IDUA son necesarios para la integración y expresión de hIDUA en hepatocitos de ratón.
La actividad de IDUA hepática aumentó aún más en los ratones tratados con ZFN donante a los 4 meses (147,32 ± 65,86 y 63,59 ± 43,42 nmol/h/mg para animales machos y hembras, respectivamente), en comparación con la actividad en animales de tipo salvaje (8,05 ± 1,55 nmol/h/mg).
Como se muestra en la Figura 2A, la actividad enzimática de IDUA en plasma en ratones tratados con ZFN donante también aumentó en comparación con los niveles observados en ratones de control y solo donante, comenzando el Día 14 y durante todo el estudio. La actividad media de IDUA permaneció elevada ~1,5-10 veces por encima de los niveles fisiológicos endógenos observados en ratones de control de tipo salvaje desde el día 14 hasta el final del estudio. La actividad de IDUA se comparó al de 1 mes y a los 4 meses en el cerebro, corazón, hígado, pulmón, músculo y bazo (Figura 2C) y la actividad de IDUA a los 4 meses en los grupos de ZFN donante mostró una actividad significativamente mayor que los ratones con MPS I no tratados y del mismo género en el corazón, hígado, pulmón y bazo (machos y hembras) y músculo (solo machos).
En ratones con MPS I que recibieron tanto ZFN donante de hIDUA de ratón sustitutos, la actividad de IDUA en todos los tejidos no objetivo, excepto el cerebro al de 1 mes, se aproximó a los niveles de actividad en los ratones de tipo salvaje, lo que demuestra que la IDUA producida en el locus de albúmina en los hepatocitos fue secretada al plasma, del cual fue absorbido por tejidos secundarios en forma activa (ver, Figura 4). En el cerebro se detectó un aumento en la actividad de IDUA, correspondiente a aproximadamente el 5% de la actividad de IDUA encontrada en los cerebros de ratones de tipo salvaje (ver, Figura 4E).
Evaluación de los niveles de GAG en orina y tejidos de ratón: para determinar si la corrección observada en la deficiencia de la enzima de IDUA en los ratones con MPS I tratados con ZFN donante se asociaba con la prevención de niveles aumentados o reducciones con el tiempo del biomarcador de la enfermedad glucosaminoglicano (GAG), se determinaron los niveles de GAG en orina y extractos de tejido de todos los animales.
Los resultados indicaron que los niveles de GAG en orina aumentaron a lo largo del estudio a medida que avanzaba la enfermedad, en los ratones con MPS I que recibieron tampón de formulación, en comparación con los niveles en ratones de tipo salvaje. Como se muestra en la Figura 3C, el tratamiento tanto con ZFN de ratón sustituto como con donante de hIDUA en ratones MPS I machos y hembras evitó el aumento de los niveles de GAG en orina observados en los ratones con MPS I no tratados el día 14 después de la dosificación. Los niveles de GAG también aumentaron considerablemente en todos los tejidos (excepto el cerebro) de los ratones con MPS I machos y hembras tratados con tampón de formulación en comparación con los ratones de tipo salvaje (ver, Figura 5). Estos niveles se normalizaron completamente en animales con MPS I tratados con ZFN donante. La normalización se produjo tanto en el hígado (donde se produjo IDUA a partir del locus de la albúmina) como en los tejidos secundarios (que deben haber absorbido IDUA del plasma). En el cerebro, los niveles de GAG fueron más bajos en los animales tratados en comparación con los animales no tratados (ver, Figura 5E).
Estos datos mostraron que la hIDUA producida por el hígado se introdujo en la circulación (plasma) y fue absorbida por el bazo, el corazón, el hígado, los pulmones y el músculo esquelético, y llevó a una reducción de los niveles de GAG en los tejidos secundarios en ratones con MPS I tratados con ZFN donante.
Evaluación histopatológica
Necropsias provisionales y terminales, Días de estudio 28 y 120
Se evaluó un subconjunto de tejidos (cerebro, pulmón, corazón, hígado, músculo esquelético y bazo) a partir de la necropsia del día 28.
Los animales de control C57BL/6 de tipo salvaje no mostraron descubrimientos patológicos relacionados con el artículo de prueba. Los ratones de control con MPS I machos y hembras desarrollaron vacuolación de varios tipos de células en todo el cuerpo, y esto se interpretó como una acumulación lisosomal de glicoaminoglicanos (GAG). La vacuolación es una apariencia microscópica característica de los lisosomas ingurgitados con glicoaminoglicanos (Ohmi et al (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(4):1902-1906). En comparación con los ratones de control con MPS I machos y hembras en el día 28, los animales en el día 120 tenían una incidencia y/o gravedad aumentadas de la vacuolación típica de varios tipos de células en todo el cuerpo que se consideró una acumulación lisosomal de GAG. Los animales de control C57BL/6 de tipo salvaje no mostraron efectos patológicos relacionados con el artículo de prueba en los días 28 o 120.
Evaluación del tejido del SNC. En comparación con los controles de MPS I, los animales tratados con ZFN donante de hIDUA o solo donante de hIDUA tuvieron una incidencia y/o gravedad similares de vacuolación de neuronas grandes o glial en el cerebro. Sin embargo, en la médula espinal, los varones que recibieron ZFN donante de hIDUA tuvieron una menor incidencia y/o gravedad de vacuolación neuronal o glial. De igual manera, las mujeres que recibieron ZFN donante hIDUA tuvieron una menor incidencia y/o gravedad de vacuolación neuronal o glial, a excepción de la vacuolación glial en la médula espinal lumbar de las mujeres.
Evaluación de tejidos no relacionados con el SNC. La gravedad de la vacuolación aórtica (túnica media) disminuyó en los animales que recibieron ZFN donante hIDUA en comparación con los controles de MPS I o solo hIDUA (mínima a leve y moderada, respectivamente). En comparación con los controles de MPS I, hubo una incidencia y/o gravedad disminuidas de la vacuolación en los pulmones, la válvula cardíaca o el intersticio, la túnica media aórtica, el epitelio tubular renal, la vejiga urinaria (urotelio e intersticio), las células intersticiales del músculo esquelético, los macrófagos/histiocitos esplénicos, macrófagos/histiocitos de los ganglios linfáticos mesentéricos, células intersticiales tímicas, células de Kupffer, nervio ciático, células paratiroideas, células estromales/endoteliales corneales (membrana de Descemet), tracto gastrointestinal (tunica muscular e intersticio [prácticamente ausente en las hembras]), p pituitaria ars distalis, y sitio de inyección de los animales que recibieron ZFN donante hIDUA (Grupos 4 y 5). En las hembras que recibieron ZFN donante hIDUA (Grupo 5), hubo una incidencia de vacuolación disminuida de condrocitos/osteocitos/células periósticas de la articulación esternal o femorotibial, sinovial de la articulación femorotibial y vacuolación en los ovarios, útero, cuello uterino y vagina. En los machos a los que se les administró ZFN donante de hIDUA, se observó una disminución en la incidencia de vacuolización de las células epididimarias del epitelio o del intersticio.
Evaluación neuroconductual: Laberinto de Barnes. El rendimiento cognitivo de los ratones se probó durante la última semana antes de la necropsia usando la prueba de laberinto de Barnes. Los ratones con MPS I han mostrado anteriormente déficits de inclinación tanto en el laberinto de Barnes (Belur et al (2015). Presentado en la American Society of Gene and Cell Therapy ASGCT del 13 al 16 de mayo; Nueva Orleans, LA) y otras pruebas de capacidad cognitiva, como el laberinto en T de agua (Ou et al. ibid).
Las pruebas de Laberinto de Barnes se realizan en una plataforma circular con cuarenta agujeros en anillos alrededor del centro de la plataforma. Ver, Figura 6. Todos los agujeros están bloqueados excepto uno que tiene una "caja de escape" a la que el ratón puede acceder desde el agujero. La iluminación del techo brillante crea un estímulo aversivo que anima al animal a buscar el agujero de escape del objetivo y evitar la luz. Las señales visuales a la vista se colocan en las paredes alrededor del laberinto y actúan como pistas espaciales para orientar a los ratones (ver la Figura 6). Los ratones fueron entrenados en el laberinto de Barnes durante 6 días, en 4 pruebas al día, con un límite de tiempo máximo de 3 minutos por prueba. Los intervalos fueron de 12-15 minutos entre pruebas consecutivas para cada animal.
Como se muestra en la Figura 7A y 7B para los animales macho y hembra, respectivamente, los ratones machos de tipo salvaje mejoraron con el tiempo, como lo indica la disminución de la latencia para encontrar el agujero de escape objetivo durante los 6 días de la prueba, mientras que las latencias de escape no mejoraron en los ratones macho con MPS I no tratados a lo largo del tiempo (p<0,05 frente a tipo salvaje en los días 4-6). Por el contrario, los ratones macho con MPS I que recibieron ZFN donante hIDUA de ratón sustitutos mostraron una mejora en el rendimiento del laberinto a lo largo del tiempo en comparación con el grupo de MPS I tratado con tampón de formulación (p<0,05 en los días 4-6), y se desempeñaron igual de bien que el animales de tipo salvaje. Para el día 4 de la prueba, los ratones con MPS I macho tratados con ZFN donante mostraron una diferencia estadísticamente significativa en el comportamiento de aprendizaje con una media en el día 6 de 53 ± 26 (media ± SEM) segundos para encontrar el agujero objetivo, mientras que los ratones con MPS I macho no tratados tardaron 149 ± 17 segundos en encontrar el objetivo. Los ratones macho de tipo salvaje alcanzaron el objetivo en 51 ± 15 segundos el Día 6.
Los ratones con MPS I hembra que recibieron tampón de formulación no mostraron una diferencia significativa en el rendimiento durante los 6 días de prueba, en comparación con los ratones de tipo salvaje. Sin embargo, los ratones con MPS I hembra tratados con ZFN Donante mostraron una tendencia hacia un mejor rendimiento en el laberinto durante el curso del estudio. El día 6, los ratones con MPS I hembra tratados tardaron 38 ± 23 segundos en encontrar el agujero objetivo, y los ratones hembra con MPS I tratados con tampón de formulación tardaron 96 ± 33 segundos en encontrar la objetivo. Estos resultados sugieren que hIDUA puede estar obteniendo acceso al SNC en ratones con MPS I y producir efectos neuroconductuales positivos sin modificaciones en la proteína de hIDUA para facilitar el cruce de la barrera hematoencefálica. (ver, por ejemplo, Ou et al. ibid). Por lo tanto, los niveles en plasma consistentemente altos de IDUA logrados en la presente (debido a la secreción constante del hígado) dieron como resultado que la IDUA no modificada cruzara la barrera hematoencefálica.
Es importante destacar que los datos de GAG indicaron que la actividad de IDUA expresada en ratones con MPS I tratados con ZFN donante se asoció con una normalización de los niveles de GAG en orina, así como con la reducción de los niveles de GAG en el hígado y tejidos secundarios. Además, el tratamiento se asoció con tendencias en una disminución de la vacuolación en el SNC y otros tejidos objetivo, así como una mejora en el rendimiento cognitivo (memoria espacial mejorada) en la prueba de Laberinto de Barnes.
En resumen, los datos presentados aquí demuestran que el reemplazo génico mediado por ZFN en el locus de la albúmina para el sujeto con MPS I trata la enfermedad. Este estudio farmacológico/toxicológico de 4 meses demostró que: la coadministración de ZFN de ratón sustituto con un donante transgénico de hIDUA a través de vectores rAAV2/8 con tropismo hepático lleva a 1) modificación eficiente del locus de albúmina en hepatocitos de ratón con MPS I in vivo; 2) niveles altos de expresión y actividad de la enzima hIDUA en el hígado; 3) secreción de enzima funcional al plasma; y 4) captación de IDUA del plasma por tejidos secundarios incluyendo el bazo, pulmón, corazón, músculo y cerebro. Además, los resultados también demuestran que los niveles de actividad de IDUA alcanzados son suficientes para por lo menos una corrección parcial del defecto metabólico (acumulación de GAG) en tejidos no objetivo, lo que da como resultado una función conductual mejorada.
Ejemplo 3: Tratamiento de MPS II (inactivación de IDS o Ids Y/-) en un modelo de ratón
De manera similar al trabajo realizado anteriormente para el tratamiento de MPS I usando un transgén de IDUA, los experimentos se repitieron en un sistema modelo de ratón con MPS II usando un transgén de IDS humano corrector. Se elaboraron virus AAV2/8 que comprenden el transgén de IDS y se usaron para tratar los ratones con MPS II junto con los vectores de ratón de rAAV de ZFN (SB-48641, SB-31523, mostrado en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 14/872,537) dirigido a un sitio homólogo en el intrón 1 del gen de la albúmina de ratón así como a un donante que codifica un transgén de IDS humano sin promotor (hIDS) flanqueado por brazos con homología con el locus del ratón (SB-mu-IDS). La proporción de ZFN: z FN: donante usada en este estudio fue de 1:1:8. Para este estudio en ratones, los reactivos sustitutos se empaquetaron y administraron usando el serotipo rAAV2/8, ya que confiere una transducción superior y una expresión transgénica más rápida que los vectores rAAV2/6 en ratones in vivo. Los vectores rAAV2/8 se diluyeron en el tampón de formulación, solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con NaCl 35 mM y glicerol al 5%, pH 7,1.
El diseño del estudio se muestra a continuación en la Tabla 5 que enumera los 6 grupos de ratones y la cantidad de virus AAV2/8 de cada tipo usado.
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Este estudio se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente para el tratamiento de MPS I. Se realizaron transferencias Western como se ha descrito anteriormente y la proteína de IDS humana expresada se detectó usando un anticuerpo generado contra la proteína de IDS humana para evitar la detección de la proteína de ratón (AF2449 de R&D Systems). Los resultados mostraron que la proteína de IDS humana era detectable en los grupos tratados que recibieron tanto las ZFN como el donante (grupos 3, 4 y 5 anteriores) al de 1 mes y a los 4 meses.
La actividad de IDS se detectó mediante la lisis del tejido a analizar seguido de la detección de la actividad de IDS. La metodología seguida es la siguiente:
Lisis de tejido: se prepararon extractos de proteína de tejido mezclando muestras de tejido de ratón con solución salina (cloruro de sodio al 0,9%). Las muestras se almacenaron en hielo y se homogeneizaron usando un homogeneizador Bullet Blender® (Next Advance, Averill Park, NY). La homogeneización se realizó hasta que no había visibles partículas sólidas de tejido. Después de la homogeneización, los homogeneizados brutos se centrifugaron a velocidad máxima durante 15 minutos a 4° C para aclarar el lisado antes del análisis. Las concentraciones de proteínas en los extractos de tejido se determinaron usando el reactivo de ensayo de proteínas PierceTM 660 nm (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de actividad de IDS: La actividad de la enzima IDS se evaluó en un ensayo fluorométrico usando el sustrato sintético sulfato de ácido 4 metilumbeliferil a L 2 idiranosidurónico (4 MU IDS; Santa Cruz Biotechnology).
Este es un ensayo de dos pasos, descrito por Voznyi et al. ((2001), J. Inherit Metab Dis 24(6): 675-80). En el primer paso, se incuban 4 MU IDS con muestras de prueba; si está presente IDS, cataliza la eliminación del grupo sulfato del sustrato. El compuesto resultante, 4 metil umbeliferil a L iduronida (4 MU iduronida), es un sustrato para una segunda enzima, a L iduronidasa (IDUA). Después de que se haya incubado el primer paso durante un tiempo fijo, la actividad de IDS se neutraliza y se añade un exceso de IDUA recombinante, para impulsar la escisión de 4 Mu iduronida, produciendo el compuesto fluorescente 4 metilumbeliferona (4 MU). Brevemente, se mezclaron 10 pl de muestra diluida con 20 pl de 4 MU IDS 1,25 mM disueltos en tampón de sustrato (acetato de Na 0,1 M, pH 5,0, acetato de Pb(II) 10 mM). Las reacciones se incubaron luego a 37° C.
Para detener la actividad de IDS y convertir cualquier sustrato desulfatado en 4 MU, se añadieron a cada muestra 20 |jl de tampón Mcllvaine concentrado 2x (citrato 0,2 M, fosfato 0,4 M, pH 4,5), seguido de 10 |jl de 1 |jg/ml de IDUA recombinante. Las reacciones de IDUA se incubaron durante la noche a 37° C y luego se terminaron mediante la adición de 200 j l de solución de parada (NaHCO3/Na2CO3 0,5 M, pH 10,7, Triton X 100 al 0,2%). La liberación de 4 MU se determinó midiendo la fluorescencia (Ex365/Em450) en un lector de microplacas SynergyTM MX (BioTek, Winooski, VT).
Se generó una curva estándar usando 4 MU (Sigma Aldrich, St. Louis MO). Se representaron los datos resultantes, se ajustó una curva logarítmica a los datos y se calculó la concentración de 4 MU en las muestras de prueba usando esta curva de mejor ajuste. La actividad enzimática se expresó como nmol 4 MU liberados por hora de tiempo de incubación del ensayo (solo el primer paso de reacción), por ml de plasma o mg de lisado de proteína (nmol/h/ml o nmol/h/mg).
La proteína de IDS se midió en los hígados de los animales al de 1 mes y a los 4 meses después del tratamiento (Figura 8A). Los datos demostraron que la proteína era detectable en todos los grupos que recibieron tanto el donante como las ZFN. Además, se midió la actividad en el plasma de los grupos de tratamiento a lo largo del tiempo y se detectó actividad en todas las muestras de los grupos que recibieron z Fn y el donante. La actividad más alta se detectó en los grupos de dosis alta (Figura 8B). En el punto temporal de sacrificio a los 4 meses, también se detectó actividad de IDS en todos los tejidos de los animales que recibieron ZFN y donante. También se midió la actividad en varios órganos de los animales del estudio (Figura 8C), y el grupo de tratamiento de dosis alta muestra significativamente más actividad de IDS en comparación con los ratones con MPS II no tratados en todos los tejidos probados, incluyendo el cerebro.
Los niveles de GAG en tejido se midieron como se describe en el Ejemplo 2 y los resultados mostraron una reducción significativa de GAG en todos los tejidos analizados de los animales de dosis alta excepto en el cerebro (Figuras 9A y 9B).
El rendimiento cognitivo de los grupos de tratamiento se probó usando la prueba del laberinto de Barnes 4 meses después del tratamiento (Figura 10). Los datos representan la media ± SEM del tiempo que tardaron los animales en encontrar el objetivo (media de 4 ensayos cada día) durante 6 días de pruebas. Los datos para cada ratón individual se presentan a continuación en la Tabla 6 (expresados como tiempo en segundos para llegar al agujero para cada ratón en cada día de prueba). Los datos de cada ratón individual se muestran en la tabla en una dirección horizontal (donde cada ratón está numerado del 1 al 10, y cada punto de datos es la media de las cuatro series realizadas por día de prueba) y cada prueba (días de prueba 1-6) se muestra verticalmente. A la dosis de tratamiento alta, hubo una diferencia significativa entre los animales que recibieron el tratamiento y los animales con MPS II no tratados.
Tabla 6: Rendimiento cognitivo de los grupos de tratamiento MPS II en el laberinto de Barnes
se undos
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continuación
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Como se muestra, a la dosis de tratamiento alta, hubo una diferencia significativa entre los animales que recibieron el tratamiento y los animales con MPS II.
Ejemplo 4: Caracterización de la proteína de IDS e IDUA producida en células humanas
A. Generación y caracterización de células HepG2 (agrupación) y subclones de HepG2
Se evaluaron células HepG2 transducidas con hALB ZFN SBS#47171 y SBS#47931 esencialmente como se describe en la WO 2015/089077 y la integración del donante de IDS o IDUA se evaluó mediante análisis MiSeq 3 días después de la transducción y mostró un 59,27% de indeles (hIDS) y un 62,27% de indeles (hIDUA) en el locus de albúmina. En base a este alto nivel de modificación, estas células se seleccionaron para subclonación y luego se sembraron cuatro subclones de hIDS (números 4, 8, 15 y 55) y tres subclones de hIDUA (números 21, 25 y 30) en placas de 24 pocillos y se analizaron los sobrenadantes para determinar la secreción de hIDS o hIDUA mediante el ensayo de actividad enzimática de IDS o IDUA y ELISA (Figura 11). Las células HepG2 transducidas con los vectores SB 47171 y SB 47931 ZFN solos se usaron como control negativo ("solo ZFN" en la Figura 11).
Los cuatro subclones de IDS mostraron secreción de IDS funcional, con niveles de actividad en el sobrenadante de estos subclones que variaban entre 408 y 1855 nmol/h/ml. Todos los subclones mostraron una actividad de HIDS varias veces mayor que el grupo original de HepG2 ('grupo IDS' en las Figuras 11A y 11B).
Los tres subclones de IDUA mostraron secreción de IDUA funcional, con niveles de actividad en el sobrenadante de estos subclones que varían entre 92-475 nmol/h/ml (Figuras 11C y 11D).
Estos resultados fueron corroborados por un ELISA de hIDS o hIDUA. Para hIDS, los cuatro subclones también mostraron secreción de hIDS en el sobrenadante del cultivo celular a niveles que variaban entre 156 y 438 ng/ml, varias veces más altos que el grupo original de HepG2. En ambos ensayos, no se observaron fondos en el grupo de HepG2 transducido con ZFN solamente, lo que indica que las células HepG2 no secretan hIDS endógenas a un nivel detectable por estos ensayos. De manera similar, para hIDUA, los tres subclones también mostraron secreción de hIDUA en el sobrenadante del cultivo celular a niveles que variaban entre 40,6-209,8 ng/ml. En ambos ensayos, no se observó fondo en las células HepG2 no tratadas o en los subclones de HepG2 transducidos con ZFN solamente, lo que indica que las células HepG2 no secretan hIDUA endógena a un nivel detectable por estos ensayos.
B. Caracterización de la integración de IDS de SB en el locus de albúmina en subclones de HepG2 porTaqman® Los subclones 4, 815 y 55 de HepG2 se caracterizaron adicionalmente con respecto a la modificación en el locus genómico de albúmina. Primero, para determinar el modo de integración del donante de IDS ("SB-IDS") ya sea por NHEJ o por HDR, se desarrolló un ensayo Taqman® con cebadores y sondas específicos para cada método de integración en el extremo 5' del transgén (Figura 12). Después de la integración por NHEJ, los ITR de AAV (y los brazos de homología) todavía están presentes y son reconocidos por una sonda específica de NHEJ, lo que lleva a una señal positiva en el ensayo Taqman® (Figura 12A). Por el contrario, si el donante de SB-IDS está integrado por HDR, faltan los ITR, lo que lleva a una señal negativa con estos reactivos. Los reactivos que detectan el donante de SB-IDS integrados por HDR consisten de cebadores de PCR optimizados para un producto de 429 pb y una sonda que se une al exón 1 de la albúmina (Figura 12B). Si se usan estos reactivos de HDR en un donante de SB-IDS integrado por NHEJ, el producto de PCR de 979 pb resultante se amplificaría ineficazmente debido al tamaño adicional, lo que provocaría una señal negativa.
Los resultados mostraron que los cuatro subclones tratados con ZFN Donante analizados mostraron señal por reactivos específicos de NHEJ o HDR, confirmando los eventos de integración 5' del transgén de SB-IDS en el locus de albúmina en estos subclones. Los resultados de los subclones 15 y 55 indicaron claramente a HDR como el mecanismo para la integración de SB-IDS (Figura 12C). Los subclones 4 y 8 obtuvieron una puntuación positiva constante para un evento de integración de NHEJ en los tres ensayos Taqman®. Sin embargo, los subclones 4 y 8 también obtuvieron una puntuación positiva para la integración por HDR en 1 de las 3 repeticiones del ensayo Taqman®. En las otras dos repeticiones, estos subclones fueron o negativos para la integración de HDR o hubo una gran cantidad de variación entre los replicados en el ensayo, lo que dificultaba la determinación del método de integración. Por tanto, estas muestras se consideraron negativas para HDR. En base al análisis de indeles del segundo alelo de la albúmina, llegamos a la conclusión de que los subclones 4 y 8 son un 88% y un 83% clonales, respectivamente, lo que sugiere que la señal HDR baja e inconsistente puede ser el resultado de la presencia de una población menor de HepG2 con una integración basada en HDR de SB-IDS en estos subclones. C. Caracterización de la integración de SB-IDUA en el locus de albúmina en subclones de HepG2 por Taqman® Los subclones 21, 25 y 30 de IDUA de HepG2 se caracterizaron adicionalmente con respecto a la modificación en el locus genómico de albúmina. Primero, para determinar el modo de integración del donante de IDUA ("SB-IDUA") ya sea por NHEJ o por HDR, se desarrolló un ensayo Taqman® con cebadores y sondas específicos para cada método de integración en el extremo 5' del transgén (Figura 12). Después de la integración por NHEJ, los ITR de AAV (y los brazos de homología) todavía están presentes y son reconocidos por una sonda específica de NHEJ, lo que lleva a una señal positiva en el ensayo Taqman (Figura 12E). Por el contrario, si el donante de SB-IDUA está integrado por HDR, faltan los ITR, lo que lleva a una señal negativa con estos reactivos. Los reactivos que detectan el donante SB-IDUA integrados por HDR consisten de cebadores de PCR optimizados para un producto de 429 pb y una sonda que se une al exón 1 de la albúmina (Figura 12F). Si estos reactivos HDR se usan en un donante SB-IDUA integrado por NHEJ, el producto de PCR de 979 pb resultante se amplificaría ineficazmente debido al tamaño adicional, lo que provocaría una señal negativa.
Los resultados mostraron que los tres subclones tratados con ZFN Donante analizados mostraron señal por reactivos específicos de NHEJ o HDR, confirmando los eventos de integración 5' del transgén SB-IDUA en el locus de albúmina en estos subclones. Aunque los resultados para el subclón 21 indicaban claramente la integración de hIDUA por HDR, el mecanismo de integración para los subclones 25 y 30 no estaba claro. Por lo tanto, se llevó a cabo un método de genotipado alternativo para los tres subclones. Para esta genotipificación, el ADN genómico de los subclones 21, 25 y 30 se sometió a un ensayo de PCR radiomarcado para evaluar la presencia de eventos de integración del transgén 5' en el sitio objetivo de ZFN dentro del locus de albúmina (Figura 12H). El gel resultante confirmó la integración de HDR para el clon 21, NHEJ para el clon 25 y NHEJ para el clon 30 (Figura 12I). Las flechas apuntan a las regiones de banda características de la inserción a través de NHEJ (flecha superior) o HDR (flecha inferior).
D. Caracterización de polipéptidos de hIDS producidos a partir del locus de albúmina en subclones de IDS de HepG2 La expresión in vivo del IDS en el hígado y luego la captación subsecuente por el tejido objetivo depende del patrón de glicosilación en la proteína de IDS (Figura 13). Para caracterizar adicionalmente la proteína de hIDS producida a partir del locus de albúmina, se realizó transferencia Western en sobrenadantes generados a partir de los clones de HepG2 de IDS y de control de HepG2. Para este análisis se usaron dos conjuntos de células HepG2 que expresan hIDS. El primero es un clon mixto de alta expresión de IDS, generado de la misma manera que los clones de IDS de HepG2 analizados anteriormente. El análisis MiSeq en el locus de la albúmina mostró que este 'clon mixto' consistía de un 69,9% de células HepG2 sin modificar, un 21,4% de un subclon de IDS de HepG2 que contenía una deleción de 5 pb en el alelo de albúmina del inserto no IDS y otros tres subclones que contenían pequeñas deleciones que en conjunto representaron el 6,8% de la población total (marcada como "Mezcla" en la Figura 14).
El segundo clon de IDS de HepG2 usado fue el clon N° 55, un clon de IDS de menor expresión caracterizado anteriormente. Se usó un clon de IDUA de HepG2 como control negativo, ya que se había generado de la misma manera que estos clones de IDS de HepG2, pero con IDUA (el gen deficiente en MPS I) integrado en la albúmina en lugar de IDS ('Ctrl' en la Figura 14).
La IDS humana se expresa endógenamente inicialmente como una forma precursora inmadura de 550 aminoácidos, que contiene tanto un péptido señal como un propéptido. Tanto el péptido señal de 25 aminoácidos como el propéptido de 8 aminoácidos se escinden durante la modificación postraduccional y la maduración de la proteína de hIDS (Wilson et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA. 87(21) 8531 5). El polipéptido resultante de 73-78 kDa se fosforila y glicosila en el aparato de Golgi en un precursor de 90 kDa, que posteriormente se escinde en el lisosoma en un producto intermedio de 55 kDa, y finalmente en una proteína de hIDS madura de 45 kDa, con la liberación de un polipéptido de 18 kDa (Froissart et al., (1995) Biochem. J. 309(Pt 2): 425-30).
Para determinar cuáles de estas formas de HIDS se produjeron a partir del locus de albúmina después de la integración de HIDS, se realizaron transferencias Western en sedimentos de células HepG2, sobrenadantes de cultivos de células HepG2 (después de la secreción de HIDS de la célula) y en sedimentos de hepatocitos primarios no modificados después de la incubación con este sobrenadante de cultivo de células HepG2 (imitando la captación por un tejido secundario).
Como se muestra en la Figura 14, tanto IDS de longitud completa como todas las formas polipeptídicas intermedias y maduras se encontraron en los sedimentos de HepG2 que producen hIDS a partir de albúmina ('Sedimento de HepG2'). La forma de longitud completa de IDS se vio como una banda manchada, probablemente debido a la modificación postraduccional en curso (glicosilación) de IDS recién sintetizado en estas células productoras. Esto demostró que la proteína de HIDS producida a partir del locus de la albúmina en las células del HepG2 de hepatoma fue modificada post-traduccionalmente y secretada de manera similar al polipéptido natural. La migración de la enzima producida de alrededor de 90 kDa fue consistente con la de IDS recombinantes producidos en fibroblastos (Froissart et al., Ibid) y células CHO (Elaprase® e IDS recombinantes GREEN CROSS; ver Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20130236442).
En segundo lugar, el análisis del sobrenadante acondicionado de estos subclones de HepG2 indicó que la HIDS de longitud completa era la forma primaria de IDS secretada por la célula, con sólo una banda muy débil para la banda de 18 kDa también detectada ("Sobrenadante de HepG2"). Cuando este sobrenadante de cultivo celular acondicionado se incubó con hepatocitos primarios no modificados sin tratamiento previo, estos hepatocitos absorbieron eficazmente las hIDS del sobrenadante ("Sedimento de hepatocitos primarios"). Aunque HIDS de longitud completa era detectable en estos sedimentos, estaba claro que HIDS también podía procesarse fácilmente en las formas maduras de la proteína, ya que los polipéptidos de 55, 45 y 18 kDa estaban todos presentes en estos sedimentos. Finalmente, la hIDS absorbida del sobrenadante está activa, ya que había un aumento de 6,5 10,3 veces en la actividad de hIDS en hepatocitos primarios incubados con sobrenadamente de células HepG2 secretoras de hIDS.
Combinados, estos datos demuestran que las hIDS producidas a partir de la albúmina se procesaban normalmente a sus formas maduras en la célula de origen, la forma de longitud completa se secretaba de la célula y las células secundarias absorbían hIDS de longitud completa y la procesaban de manera eficiente en sus formas maduras y activas.
E. Caracterización de la glicosilación de hIDS e hIDUA producidas a partir del locus de albúmina en subclones de HepG2
Se ha sugerido/demostrado que la modificación de mañosa 6 fosfato en las enzimas de IDS o IDUA es necesaria para la captación celular eficiente y la focalización adecuada del lisosoma en varios tipos de células como hepatocitos, neuronas y células gliales (Daniele et al., (2002) Biochim Biophys Acta 1588(3):203-9). Por lo tanto, para caracterizar el patrón de glicosilación de hIDS e hIDUA producidas y secretadas a partir del locus de albúmina, se realizó transferencia de Western en sobrenadantes de subclones de iDs o IDUA de HepG2. IDS contiene 8 sitios potenciales de N glicosilación, que están ocupados por una combinación de cadenas de oligosacáridos complejos, híbridos y con alto contenido de manosa (Froissart et al., Ibid.). Estos tipos de glicosilaciones pueden distinguirse usando glicosidasas específicas: la péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F) es capaz de escindir los 3 tipos de oligosacáridos de las glicoproteínas, mientras que la endoglicosidasa H (Endo H) solo es capaz de escindir manosa alta y algunos oligosacáridos híbridos, pero no oligosacáridos complejos, de glicoproteínas N-enlazadas (Figura 15A).
Para determinar qué especies de glicosilaciones estaban presentes en las hIDS producidas y secretadas a del locus de albúmina, se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular de dos poblaciones de IDS de HepG2 diferentes (Mezcla y Clon 55; descritas anteriormente) y en el sobrenadante de control recogido de un subclon de HepG2 con IDUA integrada en albúmina (Control). Los sobrenadantes se dejaron sin digerir (U) o se sometieron a digestión con PNGasa F (P) o Endo H (E). La Figura 15B muestra que la digestión con PNGasa F (P) del sobrenadante de cualquiera de las poblaciones de IDS de HepG2 dio como resultado un cambio completo a una sola banda a aproximadamente 60 kDa, indicando la eliminación de todas las cadenas de oligosacáridos de la proteína (= hIDS no glicosiladas). Por el contrario, la digestión con Endo H (E) dio como resultado una banda manchada de movilidad intermedia. Los sobrenadantes de control no mostraron ninguna expresión de hIDS, lo que indica que las células no tratadas secretaron poco o nada de hIDS.
De manera similar, cuando se realizó el mismo conjunto de digestiones con glicosidasa en lisados de proteínas de sedimentos de HepG2 (Figura 15C), las tres formas principales de IDS grandes observadas (longitud completa ~73-78 kDa; intermedia ~55 kDa; y madura ~45 kDa) mostraron todas los mismos cambios en el peso molecular aparente. Tanto la banda de longitud completa como la intermedia mostraron un cambio completo con la digestión con PNGasa F (P) y un cambio parcial con la digestión con Endo H (E). La banda de 45 kDa madura mostró este mismo conjunto de cambios, pero fue más claramente visible como un doblete después de la digestión con PNGasa F, de acuerdo con la bibliografía publicada (Froissart et al., Ibid).
Los clones de HepG2-IDUA se usaron de manera similar para analizar el patrón de glicosilación de la IDUA producida. La Figura 15D muestra que PNGasa F y EndoH producen patrones similares en el sobrenadante celular HepG2-IDUA como las enzimas IDUA disponibles comercialmente Aldurazyme® y R&D Systems rIDUA.
Combinados, estos datos demuestran que las proteínas de hIDS e IDUA producidas y secretadas del locus de albúmina contenían una mezcla de glicosilaciones con alto contenido de manosa/híbridas (sensible a Endo-H) y glicosilaciones complejas (insensibles a Endo-H/sensibles a PNGasa F).
F. Competencia de la captación celular de IDS por manosa-6 fosfato
El medio acondicionado se elaboró cultivando células de control HepG2/C3A (ATCC, CRL-10741; 'HepG2') o clones N° 8 y N° 15 de HepG2-IDS en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) (Corning) suplementado con 10% de FBS y IX Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (Thermo Fisher Scientific). Las células se cultivaron durante 72 h para permitir que las IDS se acumularan en el sobrenadante del cultivo celular, y luego se recogió el sobrenadante, se filtró a 0,2 pm y se congeló a -80° C hasta su uso.
Se sembraron 100.000 células HepG2 o K562 no modificadas por pocillo en una placa de 24 pocillos y se cultivaron durante 24 horas en una incubadora de CO2 al 5% a 37° C. Luego se cambió el medio por medio acondicionado con HepG2 o HepG2-IDS (generado como se ha descrito anteriormente) en presencia o ausencia de manosa-6-fosfato 5 mM (M6P; Sigma-Aldrich). Las células se incubaron en medio acondicionado ± 5 mM de M6P durante 6 o 24 h. Las células incubadas en medio acondicionado durante 6 h se cambiaron de nuevo a medio de crecimiento celular normal durante 18 h, y se recogieron los sedimentos celulares de todas las condiciones al final de este período de 24 h. Después de la eliminación del sobrenadante del cultivo celular, los sedimentos celulares se lavaron una vez con 1 ml de PBS para eliminar cualquier medio acondicionado residual antes de analizar la actividad de IDS. Los sedimentos celulares se lisaron mediante sonicación en 150 pl de TBS Triton X-100 al 0,1% (Sigma-Aldrich) e inhibidor de proteasa Halt 1x (Thermo Fisher Scientific) y se probó para la actividad de IDS
Los resultados (Figura 16A y 16B) demuestran que en presencia de M6P 5 mM, la captación de IDS se redujo tanto en las células HepG2 como en las K562.
G. La IDUA producida a partir del locus de albúmina in vitro, fue captada por células secundarias de una manera dependiente de manosa-6-fosfato. La Figura 16D es un esquema que ilustra cómo el tratamiento de las células K562 con manosa-6-fosfato (M6P) evita la captación de la enzima IDUA.
El medio se generó cultivando células de control HepG2/C3A (ATCC, CRL-10741; 'HepG2') o clones HepG2-IDUA N° 25 en medio esencial mínimo de Eagle (Me M) (Corning) suplementado con FBS al 10% y IX penicilina-estreptomicina-glutamina (Thermo Fisher Scientific). Las células se cultivaron durante 72 h para permitir que IDUA se acumulara en el sobrenadante del cultivo celular, y luego se recogió el sobrenadante, se filtró a 0,2 pm y se congeló a -80° C hasta su uso.
La captación de IDUA se determinó como sigue. Se sembraron 100.000 células K562 sin modificar por pocillo en una placa de 24 pocillos en el medio acondicionado con HepG2 (generado como se ha descrito anteriormente) en presencia o ausencia de manosa-6-fosfato 5 mM (M6P; Sigma-Aldrich). Las células se incubaron en medio acondicionado ± 5 mM de M6P durante 24 h. Después de la eliminación del sobrenadante del cultivo celular, los sedimentos celulares se lavaron dos veces con 1 ml de PBS para eliminar cualquier medio acondicionado residual antes de analizar la actividad de IDUA usando el sustrato fluorescente 4-Metilumbelliferil a-L-iduronida (Santa Cruz Biotechnology).
Como se muestra en la Figura 16C, el producido a partir del locus de albúmina in vitro es captado por células secundarias de una manera dependiente de manosa-6-fosfato.
Ejemplo 5: Captación del donante en el cerebro
La espectrometría de masas de homogeneizados de tejido cerebral para los niveles de dermatán y heparán sulfato, que son los glicosaminoglicanos que son los sustratos de las enzimas IDUA e IDS, se realizó en Pacific BioLabs (Hercules, CA). Brevemente, se homogeneizaron tejidos de ratones con MPSI como se describe en el Ejemplo 2 (no tratados y tratados con ZFN y donantes de IDUA) en acetato de amonio 200 mM, acetato de calcio 20 mM, DTT 4 mM, pH 7,0. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific) y las muestras se normalizaron a 1 mg/ml. Las muestras de sulfato de heparano se digirieron con heparinasa I y III, produciendo dos disacáridos principales (A-UA-GlcNAc [IV-A] y A-UA-GlcNS [IV-S]). Las muestras de sulfato de dermatán se digirieron con condroitinasa B, produciendo 3 disacáridos principales (AUA-GalNAc (4S) [di-4S], AUA-GalNAc (6S) [Adi-6S] y AUA-GalNAc (4S, 6S) [Adi-4S, 6S]). Después de la digestión, se añadió un patrón interno, se eliminaron las moléculas grandes mediante centrifugación a través de un filtro de rotación de 10.000 NMWL o una placa de filtro, y las muestras se sometieron a HPLC de fase inversa. Los analitos y los estándares internos se detectaron mediante ESI-MS/MS usando un método específico de monitorización de reacciones múltiples en modo negativo. Las áreas de los picos de cada analito e IS se integraron en sus respectivos cromatogramas de MS y se usaron las proporciones de las áreas de los picos para la cuantificación. Las concentraciones de los disacáridos respectivos en muestras desconocidas se interpolaron a partir de una curva de calibración de estándares de concentración conocida y se informan en pg/ml, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 0,005 pg/ml para cada disacárido. Las concentraciones de disacáridos se sumaron para cada muestra y se representaron gráficamente con respecto a la entrada de homogeneizado.
Como se muestra en la Figura 17A, cuando los homogeneizados de tejido cerebral de ratones con MPS I se midieron específicamente para los niveles de sulfato de dermatán y heparán por espectrometría de masas, hubo una reducción significativa de los niveles de sulfato de dermatán en ratones macho tratados con ZFN Donante en comparación con sus controles emparejados por género 4 meses después de la inyección. Los ratones hembra tratados también mostraron una tendencia hacia niveles de sulfato de dermatán disminuidos. De igual manera, los ratones con MPS II tratados con ZFN Donante también mostraron una tendencia a la disminución de los niveles de sulfato de dermatán en el cerebro que alcanzaron significancia estadística a la dosis más alta de ZFN Donante (Figura 17B). Sin embargo, no se observaron disminuciones para el sulfato de heparán en los modelos de ratón con MPS I o MPS II.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un vector donante sin promotor y un vector de expresión para su uso en un método de reducción o prevención del deterioro del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto con mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) o mucopolisacaridosis tipo I (MPS I), en donde el vector donante sin promotor comprende un transgén que codifica iduronato-2-sulfatasa (hIDS) humana o a-L-iduronidasa (hIDUA) humana y el vector de expresión codifica un par de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) dirigidas a un gen de albúmina endógeno, el método comprendiendo administrar al sujeto el vector donante sin promotor y el vector de expresión,
en donde el transgén se integra en el gen de la albúmina en una célula hepática después de la escisión del gen de la albúmina de tal manera que la hIDUA o hIDS codificadas se expresan y secretan desde el hígado y además donde la hIDUA o hIDS secretadas por el hígado se encuentran en el sistema nervioso central (SNC) del sujeto de tal manera que se reduzca o prevenga el deterioro del SNC.
2. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el deterioro del SNC comprende déficits cognitivos.
3. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el método comprende además administrar un inmunosupresor al sujeto antes y después de la administración del vector donante y el vector de expresión.
4. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la expresión del transgén modula los niveles de glicosoaminoglicanos en el cerebro del sujeto.
5. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde se reduce o elimina la vacuolación neuronal o glial en el sujeto.
6. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la vacuolación neuronal o glial en el sujeto reduce o elimina la actividad celular en la médula espinal del sujeto.
7. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde disminuye la pérdida de capacidad de aprendizaje en comparación con un individuo no tratado.
8. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el par de ZFN comprende las proteínas con dedos de zinc mostradas en la Tabla 1.
9. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el vector de expresión de ZFN y el vector donante comprenden vectores adenoasociados (AAV).
10. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vector de expresión de ZFN y el AAV del vector donante se administran mediante inyección intravenosa.
11. El vector donante sin promotor y el vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la proporción de ZFN: ZFN: Donante administrada al sujeto es 1:1:8.
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