JP2023551903A - 組織特異的標的化モチーフを有する新規組成物及びそれを含有する組成物 - Google Patents

組織特異的標的化モチーフを有する新規組成物及びそれを含有する組成物 Download PDF

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Abstract

Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの外因性ペプチドを有する組換えベクターの標的化タンパク質に結合しているか又は挿入されている標的化ペプチドを含む組成物が、本明細書に提供される。変異体カプシド又はエンベロープタンパク質を有するかかるコンジュゲート、標的化ペプチド、又は組換えベクターを提供する組成物が、その使用として提供される。【選択図】なし

Description

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、現在、最適な遺伝子療法ベクターである。これは、ＡＡＶが、非組み込みゲノムから数十年間安定して発現される導入遺伝子を送達することができるため、及びＡＡＶが著しく安全で非免疫原性であるためである。しかしながら、ＡＡＶ遺伝子療法は、現在、送達及びトロピズムにおける課題のために、少数の疾患に限定されている。これは特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の障害に当てはまる。ベクターを脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接注射することによって、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの直接送達が可能であるが、この方法は、典型的には、１％以下の脳細胞を形質導入する。更に、その形質導入のほとんどは、ＣＳＦと直接接触する細胞に集中している。「深部脳」における細胞は、めったに形質導入されない。これは遺伝子療法によって治療可能なＣＮＳ障害の数を制限している。
ＣＳＦネットワークとは対照的に、脳の脈管系は、ＣＮＳにおけるほぼ全ての細胞に到達する。これは、これらの組織がグルコース、酸素、及び他の栄養素について有する高い需要のためである。しかしながら、脳及び脊髄における細胞は、特殊化された脈管単位、血液脳関門（ＢＢＢ）によって循環系から保護される。ＢＢＢは、ウイルスベクター及びタンパク質のような大きな分子、並びに脳及び脊髄の血管を取り囲む強く結合した細胞の複雑なネットワークを通した多くの小分子薬物までもの拡散を制限する。よって、ＣＮＳへの遺伝子療法送達における大きな課題は、高効率でＢＢＢを通過し、深部脳において細胞を形質導入することができるＡＡＶバリアントの操作であった。
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣａｌＴｅｃｈ）で開発された１つのＡＡＶカプシドは、いくつかのマウス株の脳脈管構造上のＧＰＩアンカー受容体であるＬｙ６ａとの相互作用を媒介すると報告されているＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂと呼ばれるｒＡＡＶを生成するために、ＡＡＶ９カプシド上の超可変ループ８（ＨＶＲ８）に挿入された７つのアミノ酸ペプチドを有する。米国特許公開出願第２０１７／０１６６９２６Ａ１号。この相互作用は、ＢＢＢを横切るＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂの輸送を駆動し、ＡＡＶ９よりも約５０倍高い脳細胞の形質導入をもたらす。しかしながら、この発見は、より大きな動物又はヒトには翻訳されていない。
選択された組織及び細胞型を特異的に標的化することができるベクターの必要性が残る。
特定の実施形態では、モチーフＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）を含むアミノ酸配列を含むカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される。好適には、アミノ酸配列は、カプシド中の少なくともＡＡＶ ｖｐ３タンパク質の一部であり、その発現を指示する配列の制御下で遺伝子産物をコードする核酸配列を含むカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムであるが、カプシドは、ＮＤＶＲＡＶＳ（配列番号４８）配列を含む変異体ＡＡＶ２カプシドではない。特定の実施形態では、任意にモチーフのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で２つのアミノ酸～７つのアミノ酸に隣接したＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフを含むアミノ酸配列は、ＡＡＶカプシドｖｐ３領域に挿入される。特定の実施形態では、カプシドに挿入される配列は、（ａ）ＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨ（配列番号４０）、（ｂ）ＥＦＳＳＮＴＶＫＬＴＳ（配列番号３８）、（ｃ）ＧＧＶＬＴＮＩＡＲＧＥＹＭＲＧＧ（配列番号４６）、（ｄ）ＧＧＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬＧＧ（配列番号４３）、（ｅ）ＧＧＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨＧＧ（配列番号３９）、（ｆ）ＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬ（配列番号４２
）、又は（ｇ）ＳＡＮＦＩＫＰＴＳＹ（配列番号４１）を含む。特定の実施形態では、モチーフのアミノ酸配列は、ＮＴＶＫであり、これは任意にそのカルボキシ末端及び／又はアミノ末端で２～７つのアミノ酸に隣接し、アミノ酸配列：配列番号４４のナンバリングに基づいて、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に挿入される。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、そのカプシド中のＮＴＶＫの挿入された配列を有し、この配列は、任意にそのカルボキシ末端及び／又はアミノ末端で２～７つのアミノ酸に隣接し、アミノ酸配列：配列番号４４のナンバリングに基づいて、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に挿入される。
特定の実施形態では、組成物は、挿入されたモチーフ及び任意の隣接する配列を有するｒＡＡＶと、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上と、を含む。
特定の実施形態では、内皮細胞標的化ペプチドが提供され、ペプチドは、任意にモチーフのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で２つのアミノ酸～７つのアミノ酸に隣接し、任意にナノ粒子、第２の分子、又はウイルスカプシドタンパク質に更にコンジュゲートした、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、内皮細胞標的化ペプチドは、（ａ）ＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨ（配列番号４０）、（ｂ）ＥＦＳＳＮＴＶＫＬＴＳ（配列番号３８）、（ｃ）ＧＧＶＬＴＮＩＡＲＧＥＹＭＲＧＧ（配列番号４６）、（ｄ）ＧＧＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬＧＧ（配列番号４３）、（ｅ）ＧＧＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨＧＧ（配列番号３９）、（ｆ）ＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬ（配列番号４２）、又は（ｇ）ＳＡＮＦＩＫＰＴＳＹ（配列番号４１）を含む。特定の実施形態では、モチーフのアミノ酸配列は、ＮＴＶＫである。特定の実施形態では、内皮細胞標的化ペプチドと、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上と、を含む、組成物が提供される。
特定の実施形態では、脳内皮細胞標的化ペプチドと、少なくとも１つのポリペプチド又はタンパク質を含む融合パートナーと、を含む、融合ポリペプチド又はタンパク質が本明細書において提供される。特定の実施形態では、請求項１１に記載の融合ポリペプチド又はタンパク質と、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上と、を含む、組成物。
本明細書では、ｒＡＡＶ、内皮細胞標的化ペプチド、融合ポリペプチド若しくはタンパク質、及び／又は本明細書に記載される組成物を、治療薬をそれを必要とする患者に送達するために使用するための組成物及び方法が提供される。特定の実施形態では、治療薬は、脳内皮細胞に標的化される。
特定の実施形態では、コードされた遺伝子産物が、ＭＣＴ８タンパク質である、治療を必要とする対象に本明細書に記載されるｒＡＡＶを送達することによって、アラン－ハーンドン－ダドリー病を治療するための組成物及び方法が提供される。
特定の実施形態では、標的化を必要とする患者に本明細書に記載されるｒＡＡＶを投与することを含む、療法を肺に標的化するための方法が提供される。
特定の実施形態では、治療を必要する対象に、挿入された標的化ペプチドとともにカプシドを有するｒＡＡＶを送達し、治療遺伝子産物をコードすることによって、肺の疾患を治療するための方法であって、コードされた遺伝子産物が、可溶性Ａｃｅ２タンパク質、抗ＳＡＲＳ抗体、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体、抗インフルエンザ抗体、又は嚢胞性線維症
膜貫通タンパク質である、方法が提供される。
特定の実施形態では、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフをＡＡＶカプシドに挿入することを含む、インビトロでのＡＡＶ産生細胞の形質導入を増加させるための方法が提供される。特定の実施形態では、産生細胞は、２９３細胞である。
本発明のこれらの及び他の実施形態及び利点は、限定なしに、本発明の詳細な説明を含む、明細書から明らかとなるであろう。
スクリーニングにおけるマウス脳での最高性能のペプチドヒットの濃縮スコアを、参照ペプチドとともに示す。図１Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの濃縮スコアを示す。図１Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの濃縮スコアを示す。 スクリーニングにおけるＮＨＰ組織での最高性能の濃縮スコアを示す。図２Ａは、ＮＨＰ脳の濃縮スコアを示す。図２Ｂは、ＮＨＰ脊髄組織の濃縮スコアを示す。 ＧＦＰレポーター導入遺伝子を含むＡＡＶカプシドにおける最高性能のペプチドヒットの形質導入レベルの二次妥当性確認を示す。結果は、ＡＡＶ９形質導入に対してプロットされる。図３Ａは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける脳組織の選択されたペプチド標的化の二次妥当性確認スクリーニングを示す。図３Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける脳組織の選択されたペプチド標的化の二次妥当性確認スクリーニングを示す。図３Ｃは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける肝臓組織の選択されたペプチド標的化の二次妥当性確認スクリーニングを示す。図３Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓組織の選択されたペプチド標的化の二次妥当性確認スクリーニングを示す。 （構造分析に基づいて）標的化ペプチドが挿入され得る領域ＨＶＲＶＩＩＩに焦点を当てた、ＡＡ９、ＡＡＶ８、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ５、ＡＡＶ４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ１の様々なＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントの領域を示す。 「ＮｘＴＫ」モチーフが、ＳＡＮ挿入物における脳生体内分布のための重要なモチーフであり、置換の平均的な影響（元の配列からの倍率変化）を示すことを示す。 「ＮｘＴＫ」モチーフが、ＳＡＮペプチド挿入物におけるプラスミドからＡＡＶへの変換を制御し、置換の平均的な影響（元の配列からの倍率変化）を示すことを示す。 「ＮｘＴＫ」モチーフが細胞株にわたって広範な形質導入利点を付与することを示す。図７Ａは、２９３細胞におけるＡＡＶ９カプシドと比較されるときの相対的形質導入レベルを示す。図７Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＡＡＶ９カプシドと比較されるときの相対的形質導入レベルを示す。図７Ｃは、ＨＵＨ７細胞におけるＡＡＶ９カプシドと比較されるときの相対的形質導入レベルを示す。図７Ｄは、マカク初代気道細胞における形質導入後３日目（３ＤＰＴ）及び形質導入後７日目（７ＤＰＴ）での形質導入レベルを示す。 担体（すなわち、ベクターなし）で処理された対照試料中のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。 ＡＡＶ９－ＧＦＰベクターでの形質導入後のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。 ＥＦＳペプチド挿入を含むＡＡＶ９－ＧＦＰベクターでの形質導入後のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。 ＳＡＮペプチド挿入を含むＡＡＶ９－ＧＦＰでの形質導入後のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。 マイクログラム総ｍＲＮＡに対するｍＲＮＡコピー数の比としてプロットされた培養されたヒト細胞（鼻、気管支、及び気管）におけるＧＦＰベクターでの予備形質導入試験を示す。
標的化ペプチド配列が本明細書に提供される。Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）の外因性標的化ペプチドモチーフに作動可能に結合した融合タンパク質、修飾タンパク質、変異体ウイルスカプシド、及び他の部分も本明細書に提供される。特定の実施形態では、この外因性モチーフは、これらの組成物に、ソース（親）タンパク質、ウイルスベクター、又は他の部分の天然組織特異性の修飾を付与する。特定の実施形態では、このモチーフにおける標的化ペプチドは、増強又は改変された内皮細胞標的化を提供する。特定の実施形態では、このモチーフにおける標的化ペプチドは、増強又は改変された肺、気管支、気管、及び／又は鼻上皮標的化を提供する。特定の実施形態では、このモチーフを有する修飾カプシドを有するウイルスベクターは、インビトロでのＡＡＶ産生細胞の増加した形質導入を示す。
標的化ペプチドは、組換えタンパク質（例えば、酵素置換療法用）又はポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）に結合して、所望の組織（例えば、ＣＮＳ又は肺）に標的化して、融合タンパク質又はコンジュゲートを形成し得る。加えて、標的化ペプチドは、ペプチドでコーティングされたリポソーム及び／又はＬＮＰを形成するリポソーム及び／又はナノ粒子（脂質ナノ粒子、ＬＮＰ）に結合して、所望の組織に標的化し得る。標的化ペプチドの少なくとも１つのコピーをコードする配列及び任意の結合配列は、組換えタンパク質のコード配列とインフレームで融合し、タンパク質又はポリペプチドと共発現して、融合タンパク質又はコンジュゲートを提供し得る。あるいは、他の合成方法を使用して、タンパク質、ポリペプチド、又は別の部分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは小分子）とのコンジュゲートを形成し得る。特定の実施形態では、標的化ペプチドの複数のコピーは、融合タンパク質／コンジュゲート中にある。標的化ペプチドを組換えタンパク質にコンジュゲートするための好適な方法は、第１の架橋剤を使用して組換えヒトタンパク質（例えば、酵素）上のアミノ（Ｎ）末端及び１つ以上の残基を修飾して、第１の架橋剤修飾組換えヒトタンパク質を生じさせることと、第２の架橋剤を使用して標的化ペプチドの前の短い伸長リンカー領域のアミノ（Ｎ）末端を修飾して、第２の架橋剤修飾バリアント標的ペプチドを生じさせることと、次いで、第１の架橋剤修飾組換えヒトタンパク質を、短い伸長リンカーを含有する第２の架橋剤修飾バリアント標的化ペプチドにコンジュゲートすることと、を含む。標的化ペプチドを組換えタンパク質にコンジュゲートする他の好適な方法は、第１の架橋剤修飾組換えヒトタンパク質を１つ以上の第２の架橋剤修飾バリアント標的化ペプチドにコンジュゲートすることを含み、第１の架橋剤修飾組換えタンパク質は、化学修飾Ｎ末端及び１つ以上の修飾リジン残基を有するとして特徴付けられる組換えタンパク質を含み、１つ以上の第２の架橋剤修飾バリアント標的化ペプチドは、標的化ペプチドの前の短い伸長リンカーの修飾Ｎ末端アミノ酸を含む１つ以上のバリアント標的化ペプチドを含む。標的化ペプチドをタンパク質、ポリペプチド、ナノ粒子、又は別の生物学的に有用な化学部分にコンジュゲートするための更に他の好適な方法が選択され得る。例えば、米国特許第９，５４５，４５０Ｂ２（ＮＨＳ－ホスフィン架橋剤、ＮＨＳ－アジド架橋剤）、米国公開特許出願第２０１８／０１８５５０３Ａ１（アルデヒド－ヒドラジド架橋）を参照されたい。
特定の実施形態では、標的化ペプチドは、タンパク質又はポリペプチド（例えば、ウイルスカプシドタンパク質）内の好適な部位に挿入され得る。特定のこれらの実施形態では及び特定の他の実施形態では、標的化ペプチドは、そのカルボキシ（ＣＯＯ－）及び／又はアミノ（Ｎ）末端で短い伸長リンカーに隣接し得る。かかるリンカーは、１～２０アミノ酸残基長、又は約２～２０アミノ酸残基、若しくは約１～１５アミノ酸残基、若しくは約２～１２アミノ酸残基、若しくは２～７アミノ酸残基長であり得る。短い伸長リンカーはまた、約１０アミノ酸長であり得る。Ｎ末端のリンカーの存在及び長さは、カルボキシ
末端のリンカーから独立して選択され、並びにカルボキシ末端のリンカーの存在及び長さは、Ｎ末端のリンカーから独立して選択される。好適な短い伸長リンカーは、５アミノ酸柔軟ＧＳ伸長リンカー（グリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリン）、２つの柔軟ＧＳリンカーを含む１０アミノ酸伸長リンカー、３つの柔軟ＧＳリンカーを含む１５アミノ酸伸長リンカー、４つの柔軟ＧＳリンカーを含む２０アミノ酸伸長リンカー、又はそれらの任意の組み合わせを使用して提供することができる。
特定の実施形態では、内皮細胞を標的化するのに有用な組成物が提供される。組成物は、変異体カプシド、融合タンパク質、又は少なくとも１つの外因性標的化ペプチドを含む別のコンジュゲートであり、任意に、モチーフのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で、２つのアミノ酸～７つのアミノ酸に隣接し、任意に、ナノ粒子、第２の分子、又はウイルスカプシドタンパク質に更にコンジュゲートした、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む。任意の結合配列を有する以下の配列を含む標的化ペプチド：
（ａ）ＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨ（配列番号４０）、
（ｂ）ＥＦＳＳＮＴＶＫＬＴＳ（配列番号３８）、
（ｃ）ＧＧＶＬＴＮＩＡＲＧＥＹＭＲＧＧ（配列番号４６）、
（ｄ）ＧＧＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬＧＧ（配列番号４３）、
（ｅ）ＧＧＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨＧＧ（配列番号３９）、
（ｆ）ＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬ（配列番号４２）、又は
（ｇ）ＳＡＮＦＩＫＰＴＳＹ（配列番号４１）。
特定の実施形態では、標的化ペプチドモチーフは、
（ａ）ａｇｃａｇｃａａｃａｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇａｃａｃ（配列番号５４）、
（ｂ）ｇａｇｔｔｃａｇｃａｇｃａａｃａｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇａｃｃａｇｃ（配列番号５０）、
（ｃ）ｇｇａｇｇａｇｔｇｃｔｇａｃｃａａｃａｔｃｇｃｔａｇａｇｇａｇａｇｔａｃａｔｇａｇａｇｇａｇｇａ（配列番号５６）、
（ｄ）ｇｇａｇｇａａｔｃｇａｇａｔｃａａｃｇｃｔａｃｃａｇａｇｃｔｇｇａａｃｃａａｃｃｔｇｇｇａｇｇａ（配列番号５２）、
（ｅ）ｇｇａｇｇａａｇｃａｇｃａａｃａｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇａｃａｃｇｇａｇｇａ（配列番号５５）、
（ｆ）ａｔｃｇａｇａｔｃａａｃｇｃｔａｃｃａｇａｇｃｔｇｇａａｃｃａａｃｃｔｇ（配列番号５１）、又は
（ｇ）ａｇｃｇｃｔａａｃｔｔｃａｔｃａａｇｃｃｔａｃｃａｇｃｔａｃ（配列番号５３）から選択される核酸配列によってコードされる。
特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５０の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５１の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５２の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５３の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５４の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５５の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号５６の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、標的化ペプチドモチーフをコードする核酸配列は、任意にモチーフの核酸配列の５’及び
／又は３’末端で６～２１ヌクレオチドの伸長リンカーに隣接している。
特定の実施形態では、標的化ペプチドは、ＮＴＶＫである。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、ＮＴＶＲである。特定の実施形態では、このモチーフ内の標的化ペプチドの２つ以上のコピーが、コンジュゲート又は修飾タンパク質（例えば、パルボウイルスカプシド）において提供される。特定の実施形態では、２つ以上の異なる標的化ペプチドが存在する。
特定の実施形態では、鼻上皮及び／又は肺上皮細胞を標的化するのに有用な組成物が提供される。組成物は、変異体カプシド、融合タンパク質、又は少なくとも１つの外因性標的化ペプチドを含む別のコンジュゲートであり、任意に、モチーフのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で、２つのアミノ酸～７つのアミノ酸に隣接し、任意に、ナノ粒子、第２の分子、又はウイルスカプシドタンパク質に更にコンジュゲートした、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む。標的化ペプチドは、（ａ）ＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨ（配列番号４０）、（ｂ）ＥＦＳＳＮＴＶＫＬＴＳ（配列番号３８）、（ｃ）ＧＧＶＬＴＮＩＡＲＧＥＹＭＲＧＧ（配列番号４６）、（ｄ）ＧＧＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬＧＧ（配列番号４３）、（ｅ）ＧＧＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨＧＧ（配列番号３９）、（ｆ）ＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬ（配列番号４２）、又は（ｇ）ＳＡＮＦＩＫＰＴＳＹ（配列番号４１）を含む。
特定の実施形態では、標的化ペプチドは、ＮＴＶＫである。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、ＮＴＶＲであり、任意に本明細書に記載されるスペーサーアミノ酸に隣接する。特定の実施形態では、このモチーフ内の標的化ペプチドの２つ以上のコピーが、コンジュゲート又は修飾タンパク質（例えば、パルボウイルスカプシド）において提供される。特定の実施形態では、２つ以上の異なる標的化ペプチドが存在する。
標的化のための酵素、免疫グロブリン、治療用タンパク質、免疫原性ポリペプチド、ナノ粒子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び他の部分（例えば、小分子など）を含む、好適なタンパク質の例は、以下でより詳細に記載される。これら並びに他の生物学的及び化学的部分は、本明細書に提供される標的化ペプチドとの使用に好適である。
特定の実施形態では、組成物は、核酸配列分子であり、核酸配列は、核酸分子に結合した標的化ペプチド配列モチーフを含有する、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、例えば、裸のＤＮＡ、裸のプラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載されるような他の構築物を含む、様々な組成物及びナノ粒子と更に結合している。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化ペプチドモチーフは、ナノ粒子表面に化学的に結合し、ナノ粒子は、核酸分子をカプセル化する。いくつかの実施形態では、表面に結合した標的化ペプチドを含むナノ粒子は、標的化された組織特異的送達のために設計される。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる標的化ペプチドは、ナノ粒子の表面に結合している。好適な化学的結合又は架橋は、当業者に既知のものを含む。
カプシド
特定の実施形態では、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）標的化モチーフ由来の少なくとも外因性ペプチドを有する修飾パルボウイルスカプシドを有する組換えパルボウイルスが提供される。かかる組換えパルボウイルスは、ハイブリッドボカウイルス／ＡＡＶ又は組換えＡＡＶベクターであり得る。他の実施形態では、親ベクターと比較して、ウイルスベクターの標的化特異性を調節及び／又は改変するために、曝露されたカプシドタンパク質中にＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフ（同じでも異なっても、又はそれらの組み合わせであってもよい）からの１つ以上の外因性標的化ペプチドを有する、他のウイルスベクターが生成され得る。
標的化ペプチドは、任意の好適な位置で超可変ループ（ＨＶＲ）ＶＩＩＩに挿入され得る。例えば、ＡＡＶ９カプシドのナンバリングに基づいて、ペプチドは、ＡＡＶ９ ＶＰ１アミノ酸配列：配列番号４４のナンバリングに基づいて、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９（Ｑ－Ａ）の間に様々な長さのリンカーが挿入される。また、ＡＡＶ９の脱アミドパターンを提供する表Ｇを含む、２０１９年９月６日に公開された、ＷＯ２０１９／１６８９６１、及び２０１８年９月７日に出願された、ＷＯ２０２０／１６０５８２を参照されたい。アミノ酸残基位置は、ＡＡＶｈｕ６８（配列番号４５）において同一である。しかしながら、ＨＶＲＶＩＩＩ内の別の部位が選択され得る。あるいは、別の曝露されたループＨＶＲ（例えば、ＨＶＲＩＶ）が挿入のために選択され得る。同等のＨＶＲ領域が、他のカプシドにおいて選択され得る。特定の実施形態では、ＨＶＲＶＩＩＩ及びＨＶＲＩＶの位置は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７３７，６１８Ｂ２（列１５、行３～２３）、及び米国特許第１０，３０８，９５８Ｂ２（列１５、行４６～列１６、行６）に記載されるアルゴリズム及び／又はアラインメント技法を使用して決定される。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドタンパク質は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、ｖｐ１ナンバリングに基づいて、アミノ酸５８２～５８５のＨＶＲＶＩＩＩ領域、又はアミノ酸４５６～４５９のＨＶＲＩＶ領域の好適な位置に挿入される（Ｇｕｒｄａ，ＢＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｐｓｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｂｉｎｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｅｇｉｏｎｓ，２０１２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ
１２，２０１３，８７（１６）：９１１１－９１１１４を参照されたい）。特定の実施形態では、ＡＡＶ８は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、ＶＰ１ナンバリングに基づいて、アミノ酸５８６～５９１（例えば、５９０～５９１（Ｎ－Ｔ））のＨＶＲＶＩＩＩ領域、又はアミノ酸４５６～４６０のＨＶＲＩＶ領域の好適な位置に挿入される（Ｇｕｒｄａ，ＢＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ
ａ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎｔｏ ｔｈｅ Ｃａｐｓｉｄ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８，２０１２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ １６，２０１２，８６（１５）：７７３９－７７５１を参照されたい）。特定の実施形態では、ＡＡＶ７は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５８９～５９０（Ｎ－Ｔ）の好適な位置において挿入される。特定の実施形態では、ＡＡＶ６は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５８８～５８９（Ｓ－Ｔ）の好適な位置において挿入される。特定の実施形態では、ＡＡＶ５は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５７７～５７８（Ｔ－Ｔ）の好適な位置において挿入される。特定の実施形態では、ＡＡＶ４は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５８６～５８７（Ｓ－Ｎ）の好適な位置において挿入される。特定の実施形態では、ＡＡＶ３Ｂは、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５８８～５８９（Ｎ－Ｔ）の好適な位置において挿入される。特定の実施形態では、ＡＡＶ２は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５８７～５８８（Ｎ－Ｒ）の好適な位置において挿入
される。特定の実施形態では、ＡＡＶ１は、親カプシドとして選択され、様々な長さのリンカーを有する標的化ペプチドは、アミノ酸５８９～５８９（Ｓ－Ｔ）の好適な位置において挿入される。また、図４を参照されたい。
特定の実施形態では、任意の隣接する配列を有する、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフを含有するように修飾された親カプシドは、ＣＮＳ標的化された細胞の発現を増強する及び／又はそうでなければそのタイプを調節するために、ＣＮＳ（例えば、クレードＦ ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ９）、クレードＥ（例えば、ＡＡＶ８）、又は特定のクレードＡ ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ９１））カプシド、又は非パルボウイルスカプシド（例えば、単純ヘルペスウイルスなど）を天然に標的化するパルボウイルスから選択される。他の実施形態では、カプシドは、ＣＮＳ（例えば、クレードＦ ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶｈｕ６８若しくはＡＡＶ９、又は特定のクレードＡ ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ９１）カプシド、又は非パルボウイルスカプシド（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）など）を天然に標的化しないパルボウイルスから選択される。例えば、２０２０年１１月５日に公開された、ＷＯ２０２０／２２３２３１（ｒｈ９１、脱アミドパターンを有する表を含む）、２０２０年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された、米国仮特許出願第６３／１０９７３４号を参照されたい。特定の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶクレードＦ ＡＡＶｈｕ９５及びＡＡＶｈｕ９６カプシドから選択される。例えば、２２０１年１０月２日に出願された、米国仮出願第６３／２５１，５９９号を参照されたい。
特定の実施形態では、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフを含有するように修飾された親カプシドは、親ＡＡＶ（例えば、クレードＡ ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６、ＡＡＶｒｈ９１）、又はＡＡＶ５、又は特定のクレードＦ ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶｈｕ６８若しくはＡＡＶ９、カプシド、又は非パルボウイルスカプシド（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ、ＲＳＶなど）と比較して、標的化を増強するために、鼻上皮細胞、鼻咽頭細胞、及び／又は肺細胞を天然に標的化するウイルス（例えば、ＡＡＶ）から選択される。例えば、２０２０年１１月５日に公開された、ＷＯ２０２０／２２３２３１（ｒｈ９１、脱アミドパターンを有する表を含む）、２０２０年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された、米国仮特許出願第６３／１０９７３４号を参照されたい。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＮＤＶＲＡＶＳ（配列番号４８）配列を含む変異体ＡＡＶ２カプシドではない。
例えば、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ９などのクレードＦのＡＡＶからのカプシドが選択され得る。ＡＡＶ９カプシド若しくはＡＡＶｈｕ６８カプシド、及び／又はＡＡＶ９に由来するキメラカプシドを有するベクターを生成する方法が記載されている。例えば、ＵＳ７，９０６，１１１を参照されたく、これは本明細書に参照によって組み込まれる。鼻細胞又は別の好適な標的（例えば、筋肉又は肺）を形質導入する他のＡＡＶ血清型は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ＡＡＶｒｈ３２．３３を含む、ＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として選択され得る（例えば、米国公開特許出願第２００７－００３６７６０－Ａ１号、米国公開特許出願第２００９－０１９７３３８－Ａ１号、及びＥＰ１３１０５７１を参照されたい）。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９を参照されたく、又はまだ発見
されていないもの、若しくはそれらに基づく組換えＡＡＶは、ＡＡＶカプシドの供給源として使用され得る。例えば、２０２１年８月１３日に出願された、ＷＯ２０２０／２２３２３２Ａ１（ＡＡＶ ｒｈ９０）、ＷＯ２０２０／２２３２３１Ａ１、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４５９４５号（ＡＡＶ ｒｈ９１）、並びにＷＯ２０２０／２２３２３６Ａ１（ＡＡＶ ｒｈ９２、ＡＡＶ ｒｈ９３、ＡＡＶ ｒｈ９１９３）を参照されたく、これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載し、参照により援用される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターにおける使用のためのＡＡＶカプシド（ｃａｐ）は、前述のＡＡＶカプシド又はそのコード核酸のうちの１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失、又は置換によって）生成することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、前述のＡＡＶカプシドタンパク質のうちの２つ又は３つ又は４つ又は更に多くのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つ又は３つの異なるＡＡＶ又は組換えＡＡＶ由来のＶｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３モノマーのモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、前述のｃａｐのうちの２つ以上を含む。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「クレード（ｃｌａｄｅ）」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００複製のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用して決定される、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、並びにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別のクレードに含まれるか、又はこれらのクレード外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１２）：６３８１－６３８８を参照されたく、これはクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦを特定し、新規ＡＡＶ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９の核酸配列を提供する。また、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質から構成される自己集合ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＡＡＳ９９２６４のｖｐ１アミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる代替スプライスバリアントとして発現される。これらのスプライスバリアントは、異なる長さのタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一又はそれと９９％同一のアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。また、ＡＡＶ９の脱アミドパターンを提供する表Ｇを含む、２０１９年９月６日に公開された、ＷＯ２０１９／１６８９６１を参照されたい。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９バリアント」は、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されるものを含む。
ｒＡＡＶｈｕ６８は、ＡＡＶｈｕ６８のカプシド及びベクターゲノムで構成される。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団、及びｖｐ３タンパク質
の異種集団の集合体である。本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を指すために使用されるとき、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる改変アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。また、「Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１９９９２、ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたく、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
他の組換えウイルスベクターについて、標的化特異性に関与するウイルスカプシド又はエンベロープタンパク質の好適な曝露された部分は、標的化ペプチドの挿入のために選択される。例えば、アデノウイルスでは、ヘキソンタンパク質を修飾することが望ましい場合がある。レンチウイルスでは、エンベロープ融合タンパク質は、標的化モチーフの１つ以上のコピーを含むように修飾され得る。ワクシニアウイルスについて、主要糖タンパク質は、標的化モチーフの１つ以上のコピーを含むように修飾され得る。好適には、これらの組換えウイルスベクターは、安全目的のための複製欠陥である。
発現カセット及びベクター
ＡＡＶカプシド中にパッケージングされ、宿主細胞に送達されるベクターゲノム配列は、典型的には、最低でも、導入遺伝子及びその調節配列、並びにＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）で構成される。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に結合している。
ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に完全な配列が分子中で使用されるが、これらの配列のある程度の最小限の修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０
５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で使用されるかかる分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節要素は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。特定の実施形態では、ベクターゲノム（例えば、プラスミドの）は、外部Ａ要素が欠失している、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。短縮されたＩＴＲは、ウイルス粒子を形成するために、内部Ａ要素をテンプレートとして使用し、カプシドにパッケージングして、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻され得る。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。
組換えＡＡＶベクターについて上述した主要要素に加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、又は本発明により産生されたウイルスに感染した細胞中でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にするような様式で導入遺伝子と作動可能に結合した必要な従来の制御要素も含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に結合した」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
調節制御要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する、プロモーター配列を含む。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、又は生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに使用され得る。
治療用産物の発現を制御するのに好適な構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ニワトリβ－アクチン（ＣＢ）プロモーター、ＣＢ７プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）の初期及び後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦｌαプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４６２６－４６３０（１９９１））、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーターホスホグリセロールムターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１０００６－１００１０（１９８９））、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、並びに当業者に既知の他の構成的プロモーターが挙げられる。本発明における使用に適した組織特異的又は細胞特異的プロモーターの例としては、内皮細胞、ＦｏｘＪ１（繊毛細胞を標的とする）に特異的な、エンドセリン－Ｉ（ＥＴ－Ｉ）及びＦｌｔ－Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用に適した組織特異的プロモーターの他の例としては、肝臓特異的プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。肝臓特異的プロモーターの例としては、例えば、甲状腺ホルモン結合グロブリン（ＴＢＧ）、アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９、又はヒトアルファ１－アンチトリプシン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＣＫ）、又はアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３ １４が挙げられ得る。好ましくは、かかるプロモーターは、ヒト由来である。
治療用産物の発現を制御するのに適した誘導性プロモーターとしては、外因性薬剤（例えば、薬理学的薬剤）に又は生理学的キューに応答するプロモーターが挙げられる。これらの応答要素としては、これらに限定されないが、ＨＩＦ－Ｉα及びβに結合する低酸素症応答要素（ＨＲＥ）、Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．（１９８２，Ｃｅｌｌ２９：９９－１０８）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９－４２）、及びＳｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０－１４８９）によって記載されるような金属－イオン応答要素、又はＮｏｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｄ．Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐｐＩ６７－２２０，１９９１）によって記載されるようなヒートショック応答要素が挙げられる。
一実施形態では、遺伝子産物の発現は、遺伝子産物、例えば、薬理学的薬剤、又は薬理学的製剤若しくは代替の実施形態では、生理学的キューによって活性化される転写因子をコードする配列の転写に対する厳密な制御を提供する調節性プロモーターによって制御される。漏れがなく、厳密に制御することができるプロモーターシステムが好ましい。
本発明で使用され得るリガンド依存的転写因子複合体である調節性プロモーターの例としては、限定なしに、それらのそれぞれのリガンドによって活性化される核受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジゾン、並びにその類似体及び模倣体）、並びにテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが挙げられる。本発明の一態様では、遺伝子スイッチは、ＥｃＲベースの遺伝子スイッチである。かかるシステムの例としては、限定なしに、米国特許第６，２５８，６０３号、同第７，０４５，３１５号、米国公開特許出願第２００６／００１４７１１号、同第２００７／０１６１０８６号、及び国際公開出願第０１／７０８１６号に記載されるシステムが挙げられる。キメラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号、米国公開特許出願第２００２／０１１０８６１号、同第２００４／００３３６００号、同第２００４／００９６９４２号、同第２００５／０２６６４５７号、及び同第２００６／０１００４１６号、並びに国際公開出願第０１／７０８１６号、同第０２／０６６６１２号、同第０２／０６６６１３号、同第０２／０６６６１４号、同第０２／０６６６１５号、同第０２／２９０７５号、及び同第２００５／１０８６１７号に記載され、これらの各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非ステロイド性エクジゾンアゴニスト調節システムの例は、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）である。
また他のプロモーターシステムは、これらに限定されないが、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答要素（Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７－５５１）によって記載されるものなど）、又はＬｅｅ
ｅｔ ａｌ．（１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９４：２２８－２３２）、Ｈｙｎｅｓ ｅｔ
ａｌ．（１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０３８－２０４２）、Ｋｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２９：７３４－７３６）、及びＩｓｒａｅｌ＆Ｋａｕｆｍａｎ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５８９－２６０４）によって記載されるものなどのホルモン応答要素、並びに当該技術分野で既知の他の誘導性プロモーターを含み得る。かかるプロモーターを使用して、可溶性ｈＡＣＥ２構築物の発現は、例えば、Ｔｅｔ－ｏｎ／ｏｆｆシステム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：１７６６－９、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９（１２）：５５４７－５１）、ＴｅｔＲ－ＫＲＡＢシステム（Ｕｒｒｕｔｉａ Ｒ．，２００３，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，４（１０）：２３１、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ Ｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（４）：１９０７－１４）、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）調節性システム（Ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ、Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１（１７）：８１８０－４、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．１０２（３９）：１３７８９－９４）、及びヒト化タモキシフェン－ｄｅｐ調節性システム（Ｒｏｓｃｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（５）：６５３－６３）によって制御することができる。
別の態様では、遺伝子スイッチは、ＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）によるＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）のヘテロ二量体化に基づいており、ラパマイシン又はその非免疫抑制性類似体を通して調節される。かかるシステムの例としては、
限定なしに、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、並びに米国特許第６，０１５，７０９号、同第６，１１７，６８０号、同第６，４７９，６５３号、同第６，１８７，７５７号、及び同第６，６４９，５９５号、米国出願第２００２／０１７３４７４号、米国出願第２００９１０１００５３５号、米国特許第５，８３４，２６６号、米国特許第７，１０９，３１７号、米国特許第７，４８５，４４１号、米国特許第５，８３０，４６２号、米国特許第５，８６９，３３７号、米国特許第５，８７１，７５３号、米国特許第６，０１１，０１８号、米国特許第６，０４３，０８２号、米国特許第６，０４６，０４７号、米国特許第６，０６３，６２５号、米国特許第６，１４０，１２０号、米国特許第６，１６５，７８７号、米国特許第６，９７２，１９３号、米国特許第６，３２６，１６６号、米国特許第７，００８，７８０号、米国特許第６，１３３，４５６号、米国特許第６，１５０，５２７号、米国特許第６，５０６，３７９号、米国特許第６，２５８，８２３号、米国特許第６，６９３，１８９号、米国特許第６，１２７，５２１号、米国特許第６，１５０，１３７号、米国特許第６，４６４，９７４号、米国特許第６，５０９，１５２号、米国特許第６，０１５，７０９号、米国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号、米国特許第６，６４９，５９５号、米国特許第６，９８４，６３５号、米国特許第７，０６７，５２６号、米国特許第７，１９６，１９２号、米国特許第６，４７６，２００号、米国特許第６，４９２，１０６号、ＷＯ９４／１８３４７、ＷＯ９６／２０９５１、ＷＯ９６／０６０９７、ＷＯ９７／３１８９８、ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９８／０２４４１、ＷＯ９５／３３０５２、ＷＯ９９１１０５０８、ＷＯ９９１１０５１０、ＷＯ９９／３６５５３、ＷＯ９９／４１２５８、ＷＯ０１１１４３８７に記載されるシステム、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋｉｔ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（９１０９１０２）、並びにＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（９１０９／０２）が挙げられ、これらの各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Ａｒｉａｄシステムは、ラパマイシン及び「ラパログ」と称されるその類似体によって誘導されるように設計される。好適なラパマイシンの例は、ＡＲＧＥＮＴ（商標）システムの記載に関連して上記に列挙される文献において提供される。一実施形態では、分子は、ラパマイシン［例えば、ＰｆｉｚｅｒによってＲａｐａｍｕｎｅ（商標）として市販される］である。別の実施形態では、ＡＰ２１９６７［ＡＲＩＡＤ］として知られるラパログが使用される。本発明で使用することができるこれらの二量化剤分子の例は、ラパマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ１０１２（ＦＫ５０６のホモ二量体）、内因性ＦＫＢＰ及び／又はＦＲＡＰについての親和性を低減又は排除する「バンプ」を付加する天然産物の化学修飾によって容易に調製されるラパマイシン類似体（「ラパログ」）を含むが、これらに限定されない。ラパログの例としては、これらに限定されないが、内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限に抑える設計された「バンプ」を有する、ＡＰ２６１１３（Ａｒｉａｄ）、ＡＰ１５１０（Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２０）：１０６１８－２３）ＡＰ２２６６０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２１３７０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２３０５４、ＡＰ１８５５、ＡＰ１８５６、ＡＰ１７０１、ＡＰ１８６１、ＡＰ１６９２、及びＡＰ１８８９などが挙げられる。また他のラパログ、例えば、ＡＰ２３５７３［Ｍｅｒｃｋ］が選択され得る。特定の実施形態では、ラパマイシン又は好適な類似体は、鼻咽頭のＡＡＶトランスフェクトされた細胞に局所的に送達され得る。この局所送達は、ボーラス、クリーム、又はゲルを介して細胞に局所的に、鼻腔内注射によって行われ得る。米国特許出願ＵＳ２０１９／０２１６８４１Ａ１を参照されたく、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現
カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであってもよく、又は互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される。更に別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータ－アクチンイントロンを更に含有する。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されるものなどが含まれる。好適なポリアデニル化（ポリＡ）配列の例には、例えば、ウサギ結合グロブリン（ウサギベータグロブリン、又はｒＢＧとも称される）、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。任意に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これはポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。
ＡＡＶウイルスベクターは、複数の導入遺伝子を含み得る。特定の状況では、異なる導入遺伝子は、タンパク質の各サブユニット（例えば、免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖）をコードするために使用され得る。一実施形態では、細胞は、異なるサブユニットの各々を含有するウイルスを細胞で感染／トランスフェクション後、マルチサブユニットタンパク質を産生する。別の実施形態では、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によってコードされ得る。ＩＲＥＳは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい、例えば、サブユニットをコードするＤＮＡ及びＩＲＥＳの総サイズが５キロベース未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳの代替として、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によってＤＮＡが分離されていてもよい。例えば、ＭＬ Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ，（Ｊａｎ １９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ１）：１３－２１、Ｓ．Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ
ｅｔ ａｌ，（Ｊｕｎｅ ２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３、Ｈ．Ｋｌｕｍｐ，ｅｔ ａｌ．，（Ｍａｙ ２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１－８１７を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、スペースが制限因子である場合の使用に非常に好適である。より多くの場合、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、又は２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子又はサブユニットを有するｒＡＡＶを同時投与することで、インビボでそれらをコンカテマー化して、単一のベクターゲノムを形成することが可能になる。かかる実施形態では、宿主細胞での同時発現のために、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得、第２のＡＡＶは、異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得る。しかし、選択される導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物又は他の産物（例えば、研究に望ましい産物）をコードすることができる。
発現カセットについて上記で特定された要素に加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、又は本発明によって産生されたウイルスに感染した細胞におけるコードされた産物（例えば、可溶性ｈＡＣＥ２構築物、抗インフルエンザ抗体、抗ＣＯＶＩＤ１９抗体）の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式でコード配列に作動可能に結合している従来の制御要素も含む。他の好適な導入遺伝子の例は、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「作動可能に結合した」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
発現制御配列は、適切なエンハンサー、転写因子、転写ターミネーター、プロモーター、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列、例えば、ウッドチャック肺炎ウイルス
（ＷＨＰ）転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、並びに必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。
一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが、約２．０～約５．５キロ塩基のサイズであるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、天然ＡＡＶゲノムのサイズに近似することが望ましい。したがって、一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが約４．７ｋｂのサイズであるように選択される。別の実施形態では、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、約５．２ｋｂ未満のサイズである。ベクターゲノムのサイズは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡなどを含む調節配列のサイズに基づいて操作され得る。Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，Ｊａｎ
２０１０ １８（１）：８０－６を参照されたく、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
よって、一実施形態では、イントロンは、ベクターに含まれる。好適なイントロンとしては、ニワトリベータ－アクチンイントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２（Ｋｅｌｌｙ
ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（９）：４７２１－３２（２０１５））、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン（Ａｌｍｏｎｄ，Ｂ．ａｎｄ Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ，Ｅ．Ｔ．Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐＣＩ－ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ Ｖｅｃｔｏｒ）、及びｈＦＩＸイントロンが挙げられる。本明細書において好適な様々なイントロンは、当該技術分野において既知であり、限定なしに、ｂｐｇ．ｕｔｏｌｅｄｏ．ｅｄｕ／～ａｆｅｄｏｒｏｖ／ｌａｂ／ｅｉｄ．ｈｔｍｌで見られるものを含み、これは参照によって本明細書に組み込まれる。また、Ｓｈｅｐｅｌｅｖ Ｖ．，Ｆｅｄｏｒｏｖ Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｏｎ－Ｉｎｔｒｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２００６，７：１７８－１８５を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの異なるウイルスゲノムを、本明細書に記載される研究において生成した。しかしながら、当業者によって、プロモーター、エンハンサー、及び他のコード配列に置換され得る他の調節配列を含む、他のゲノム構成が選択され得ることが理解されるであろう。
ｒＡＡＶベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明に有用なプラスミドは、特に、インビトロで原核細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞に複製及びパッケージングするのに好適であるように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。
特定の実施形態では、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフの少なくとも１つのコピーのＡＡＶカプシドへの包含は、ＡＡＶカプシドにおけるモチーフの少なくとも１つのコピーの包含なしでの方法と比較して、産生における利点を提供し、産生細胞は、２９３細胞である。
ＡＡＶベースのベクター（例えば、ＡＡＶ９又は別のＡＡＶカプシドを有する）を調製する方法が知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国公開特許出願第２００７／００３６７６０号（２００７年２月１５日）を参照されたい。本発明は、ＡＡＶ９又は他のクレードＦ ＡＡＶアミノ酸配列の使用に限定されないが、例えば、化学合成による、他の合成技法による、又は他の方法によるものを含む、当該技術分野で既
知の他の方法によって生成される末端β－ガラクトース結合を含むペプチド及び／又はタンパク質を包含する。本明細書に提供されるＡＡＶカプシドのいずれかの配列は、様々な技法を使用して容易に生成することができる。適切な産生技法は、当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。あるいは、ペプチドはまた、周知の固相ペプチド合成方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）ｐｐ．２７－６２）によって合成することができる。これらの方法は、例えば、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でも、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子で構成されるミニ遺伝子、並びにミニ遺伝子のＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含み得る。これらの及び他の好適な産生方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明の限定ではない。
ＡＡＶカプシドにＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングするために宿主細胞内で培養する必要がある構成要素は、トランスで宿主細胞に提供され得る。あるいは、必要な構成要素のうちのいずれか１つ以上（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／又はヘルパー機能）は、当業者に既知の方法を使用して、必要な構成要素のうちの１つ以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要な成分を含むであろう。しかしながら、必要な成分は、構成的プロモーターの制御下にあり得る。好適な誘導性及び構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に好適な調節要素の考察において、本明細書で提供される。更に別の代替として、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分とを含み得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質を含む、安定な宿主細胞が生成され得る。更に他の安定な宿主細胞は、当業者によって生成され得る。
これらのｒＡＡＶは、特に、治療目的及び乾癬を予防するための遺伝子送達に十分に適している。更に、本発明の組成物は、インビトロで所望の遺伝子産物を産生するために使用され得る。インビトロ産生のために、所望の産物（例えば、タンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含むｒＡＡＶで宿主細胞をトランスフェクションし、発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養した後、所望の培養物から得ることができる。次いで、発現した産物は、所望される場合、精製及び単離され得る。トランスフェクション、細胞培養、精製、及び単離に好適な技術は、当業者に既知である。ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成し、単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に運ばれる免疫グロブリン構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。好適なＡＡＶパッケージング細胞も作製され得る。代替的には、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、又はインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、それにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらはまた、「空の」カプシドと称され得る。かかるカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を含んでいなくてもよく、又は遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージングされたゲノム配列のみを含んでいてもよい。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。
本明細書に記載される組換えＡＡＶは、既知の技法を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子で構成される発現カセット、並びに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能、を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシド、したがってコーディング配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が報告されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）、及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法には、遺伝子療法ベクターの産生に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの、当該技術分野で周知の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、カプシドにパッケージングするためのＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、並びにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクター含有細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。更に別のシステムでは、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関する概説については、一般的に、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２
０：９２２－９２９を参照されたく、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。これら及び他のＡＡＶ産生システムを作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。特定の実施形態では、ＡＡＶ産生システムを作製及び使用する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２８日に出願された米国特許出願第６３／０１６，８９４号に記載される仮性狂犬病ウイルス（ｒＰＲＶ）を使用するものを含む。
粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物のダイアフィルトレーション、ベクター回収物の微小流動化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、微小流動化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過によるバッファー交換、並びに／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過などの、方法ステップに供され得る。
高塩濃度での２ステップの親和性クロマトグラフィー精製、続いてアニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、ベクター薬物産物を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、参照によって組み込まれる、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題する、２０１６年１２月９日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号により詳細に記載されている。ＡＡＶ８の精製方法、２０１６年１２月９日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、及びｒｈ１０の精製方法、２０１５年１２月１１日にも出願された、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題する、２０１６年１２月９日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号、並びにＡＡＶ１の精製方法、２０１５年１２月１１日に出願された、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」の２０１６年１２月９日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号は、全て本明細書に参照によって組み込まれる。
空及び充填粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ＧＣの数＝粒子の数）についてのｖｐ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードされた２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛け算し、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子のパーセンテージを得る。
一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、及びＳｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。次いで、抗ＡＡＶカプシド抗体は、変性カプシドタンパク質、好ましくは、抗
ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、カラム断片からの試料を採取し、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱してもよく、カプシドタンパク質を、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で解像させた。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って使用して、銀染色を実施してもよく、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。
加えて、空対完全粒子比を測定する別の例も、当該技術分野で既知である。分析用超遠心分離機（ＡＵＣ）で測定される、沈降速度は、凝集体、他のマイナー成分を検出し、それらの異なる沈降係数に基づいて異なる粒子種の相対量の良好な定量化を提供することができる。これは、長さ及び時間の基本的な単位に基づく絶対的な方法であり、参照として標準分子を必要としない。ベクター試料を、１２ｍｍの光路長を有する２チャネルのチャコール－エポンセンターピースを有する細胞にロードする。供給された希釈緩衝液を、各細胞の参照チャネルにロードする。次いで、ロードされた細胞を、ＡＮ－６０Ｔｉ分析ローターに配置し、吸光度及びＲＩ検出器の両方を備えたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ
ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析超遠心分離機にロードする。２０℃で完全温度平衡化後、ローターを、１２，０００ｒｐｍの最終実行速度にする。Ａ２８０スキャンは、おおよそ３分毎に約５．５時間記録される（各試料について１１０回の総スキャン）。生データを、ｃ（ｓ）メソッドを使用して分析し、分析プログラムＳＥＤＦＩＴに実装する。得られたサイズ分布をグラフ化し、ピークを統合する。各ピークに関連付けられたパーセンテージ値は、全てのピーク下の総面積のピーク面積分率を表し、２８０ｎｍで生成された生データに基づき、多くの研究室は、これらの値を使用して空：完全粒子比を算出する。しかしながら、空の粒子と完全粒子は、この波長で異なる吸光係数を有するため、それに応じて生データを調整することができる。消光係数調整の前後の両方の空粒子及び完全モノマーピーク値の比を使用して、空－完全粒子比を決定する。
一態様では、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より特定的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、標準アッセイと同様であるが、但し、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希
釈し、プロテイナーゼＫで処理した後、熱不活性化させる。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。定量化は、ＶｉｒｏＣｙｔ又はフローサイトメトリーを使用して行うこともできる。
追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用され得る。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
治療用タンパク質及び送達システム
本明細書で提供される標的化モチーフ、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフを含有する融合パートナー、コンジュゲートパートナー、及び組換えベクターは、様々な異なる治療用タンパク質、ポリペプチド、ナノ粒子、及び送達システムで有用である。本明細書で提供される組成物及び標的化された送達に有用なタンパク質及び化合物の例としては、以下が挙げられる。ウイルスベクター、ナノ粒子、及び他の送達システムは、インビボでの発現のための選択されたタンパク質（又はコンジュゲート）をコードする配列を含有することが理解されるであろう。
特定の実施形態では、タンパク質は、ＭＣＴ８タンパク質（ＳＬＣ１６Ａ２遺伝子）並びにアラン－ハーンドン－ダドリー病及びその症状を治療するための他の化合物である。
特定の実施形態では、タンパク質は、例えば、中でも、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節因子）、アルファ－１－アンチトリプシン（遺伝性気腫）、ＦＥ（遺伝性ヘモクロマトーシス）、チロシナーゼ（眼皮膚白皮症）、プロテインＣ（プロテインＣ欠乏症）、補体Ｃ阻害剤（Ｉ型遺伝性血管性浮腫）、アルファ－Ｄ－ガラクトシダーゼ（ファブリー病）、ベータヘキソサミニダーゼ（テイサックス）、スクラーゼ－イソマルターゼ（先天性スクラーゼ－イソマルターゼ欠乏症）、ＵＤＰ－グルコロノシル－トランスフェラーゼ（クリグラー・ナジャーＩＩ型）、インシュリン受容体（糖尿病）、成長ホルモン受容体（ラロン症候群）などの、輸送欠陥に関連する疾患から選択される。他の遺伝子及びタンパク質の例としては、中でも、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ＳＭＮ１）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、脊髄小脳失調症関連ＡＴＸＮ２ ２型（ＳＣＡ２）／ＡＬＳ、ＡＬＳ関連ＴＤＰ－４３、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、及び意味性認知症を含む、非アルツハイマー型脳変性に関連するもの）が挙げられる。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。ｒＡＡＶを介して送達され得る更なる例示的な遺伝子にとし
ては、限定されないが、グリコーゲン蓄積症又は１Ａ型欠乏症（ＧＳＤ１）に関連するグルコース－６－ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ欠乏症に関連するホスホエノールピルビン酸－カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、発作及び重度神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られるサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＧＯ／ＨＡＯ１）及びＡＧＸＴを含む原発性高シュウ酸尿症１型に関連する遺伝子産物、メープルシロップ尿症に関連する分枝鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ、ＢＣＫＤＨ－Ｅ２、ＢＡＫＤＨ－Ｅ１ａ、及びＢＡＫＤＨ－Ｅ１ｂを含む）、チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニルＣｏＡムターゼ、中鎖アセチルＣｏＡ欠乏症に関連する中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症、アメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病（Ｃ１型）に関連するＮＰＣ１、プロピオンアカデミア（ＰＡ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連遺伝性アミロイドーシスに関連するＴＴＲ、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質、ＷＯ２０１５／１６４７７８に記載のＬＤＬＲバリアント、ＰＣＳＫ９、認知症に関連するＡｐｏＥ及びＡｐｏＣタンパク質、クリグラー・ナジャー病に関連するＵＤＰ－グルコウロノシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼ、痛風及びレッシュ・ナイアン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ欠損症に関連するビオチミダーゼ、ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼＡ（ａ－ＧａｌＡ））、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連するβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ、ゴーシェ病２型及び３型に関連するβ－グルコセレブロシダーゼ、ツェルウェーガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、異染性白質ジストロフィーに関連するアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ニーマン・ピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子、成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノコハク酸シンターゼ、尿素サイクル障害に関連するカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、脊髄性筋萎縮症に関連する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、ファーバー脂肪肉芽腫症に関連するセラミダーゼ、ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイサックス病及びサンドホフ病に関連するＢ－ヘキソサミニダーゼ、アスパルチル－グルコサミン尿症に関連するアスパルチルグルコサミニダーゼ、フコシドーシスに関連するα－フコシダーゼ、α－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、α－１アンチトリプシン欠損症（気腫）の治療のためのα－１アンチトリプシン、サラセミア又は腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、及び線維芽細胞増殖因子、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症に見られる閉塞した血管の治療のためのトロンボモジュリン及び組織因子の経路の阻害剤、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）が挙げられる。
本明細書で提供される組成物及び標的化された送達において有用なタンパク質及び化合物の例としては、治療用タンパク質及び他の化合物、並びに以下の呼吸器関連感染性疾患のワクチンタンパク質誘導体、並びにこれらの感染性疾患に対する直接的な受動免疫グロブリンが挙げられる。好適な治療用タンパク質の例には、例えば、アルファ－１－アンチトリプシン、嚢胞性線維症膜貫通タンパク質、及びそれらのバリアント、界面活性剤－Ｂ
、骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（肺動脈高血圧症に関連する）、並びに様々ながん治療薬が含まれる。
好適なワクチン又は受動免疫化の例としては、ヒト呼吸器コロナウイルスを含む、空中病原体に由来し、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１）、風邪、及び非Ａ、Ｂ、又はＣ型肝炎と関連しているタンパク質が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、ＣＯＶＩＤ－１９の原因物質であり、このウイルスに特異的な抗体が記載されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のヒトＡＣＥ２のスパイクタンパク質の結合に有用であり、中和活性を有すると記載されているＩｇＧ抗体の例としては、例えば、ＬＹ－ＣｏＶ５５５（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＴＹ０２７（Ｔｙｃｈｏｎ）、ＳＴＩ－１４９９及びＳＴＩ－２０２０（ＣＯＶＩ－ＧＵＡＲＤ、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）、８０Ｒ、ＡＤＩ０５５６８９／５６０４６（Ａｄｉｍａｂ）（Ｒｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０２０）、ＢＤ－２１７、ＢＤ－２１８、ＢＤ－２３６（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２，７３－８４（２０２０））が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２のヒトＡＣＥ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合するのに有用であり、中和活性を有すると記載されているＩｇＧ抗体の例としては、例えば、ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０、ＣＯＶ２－２１６５（Ｚｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８４，４４３－４６５（２０２０））、ＢＤ－３６１、ＢＤ－３６８、ＢＤ－３６８－２（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２，７３－８４（２０２０））、Ｂ３８、Ｈ４（Ｙ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｃ２２４１（２０２０）、Ｊａｈａｎｓｈａｈｌｕ ａｎｄ Ｒｅｚａｅｉ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ１２９（２０２０））、Ｓ３０９、Ｓ３１５、Ｓ３０４（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８３，２９０－３１１（２０２０））、ＣＣ６．２９、ＣＣ６．３０、ＣＣ６．３３、ＣＣ１２．１、ＣＣ１２．３（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３６９，９５６－９６３（２０２０））、ＪＳ０１６（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＣＡ１、ＣＢ６－ＬＡＬＡ、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１／Ｐ２Ｂ－２Ｆ６／Ｐ２Ａ－１Ａ３、３１１ｍａｂ－３１Ｂ５３１１／３２Ｄ４、ＣＯＶＡ２－１５、４１４－１、（Ｒｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０２０）が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ１のヒトＡＣＥ２のスパイクタンパク質に結合するのに有用であり、中和活性を有すると記載されているＩｇＧ抗体の例としては、例えば、ｍ３９６及びＣＲ３１０４（Ｐｒａｂａｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８１，１５８２９－１５８３６（２００６）、ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ，３，７（２００６））が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の両方のヒトＡＣＥ２のＲＢＤ又はスパイクタンパク質のいずれかに結合するのに有用であり、中和活性を有すると記載されているＩｇＧ抗体の例としては、例えば、ＣＲ３０２２及び４７Ｄ１１（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１，ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０２０））が挙げられる。
他の標的ウイルスの例としては、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びインフルエンザＣを含む、オルトミクソウイルス科ファミリー由来のインフルエンザウイルスが挙げられる。Ａ型ウイルスは、最も悪性のヒト病原体である。パンデミックに関連しているインフルエンザＡの血清型としては、１９１８年にスペインインフルエンザを引き起こしたＨ１Ｎ１、２００９年のブタインフルエンザ、１９５７年にアジアインフルエンザを引き起こしたＨ２Ｎ２、１９６８年に香港インフルエンザを引き起こしたＨ３Ｎ２、２００４年にトリインフルエンザを引き起こしたＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、及びＨ１０Ｎ７が含まれる。インフルエンザＡに対する広範囲中和抗体が記載されている。本明細書で使用される場合、「広範囲中和抗体」は、複数の亜型からの複数の株を中和することができる中和抗体を指す。例えば、ＣＲ６２６１［Ｔｈｅ
Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｃｒｕｃｅｌｌ］は、１９１８年「スペイン風邪」（ＳＣ１９１８／Ｈ１）を含む広範囲のインフルエンザウイルスに及び２００４年にベトナムでニワトリからヒトに飛び移ったトリインフルエンザのＨ５Ｎ１クラスのウイルス（Ｖｉｅｔ０４／Ｈ５）に結合するモノクローナル抗体として記載されている。ＣＲ６２６１は、インフルエンザウイルスの表面上の優勢なタンパク質であるヘマグルチニンの膜近位ステムにおける高度に保存されたヘリカル領域を認識する。この抗体は、本明細書に参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１０／１３０６３６に記載されている。別の中和抗体、Ｆ１０［ＸＯＭＡ Ｌｔｄ］は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１に対して有用であると記載されている。［Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．２００９，１６（３）：２６５－７３）］インフルエンザに対する他の抗体、例えば、Ｆａｂ２８及びＦａｂ４９が選択され得る。例えば、ＷＯ２０１０／１４０１１４及びＷＯ２００９／１１５９７２を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。更に他の抗体、例えば、ＷＯ２０１０／０１０４６６、米国公開特許公表２０１１／０７６２６５、及びＷＯ２００８／１５６７６３に記載されるものは、容易に選択され得る。
他の標的病原性ウイルスとしては、アレナウイルス（フニン、マチュポ、及びラッサを含む）、フィロウイルス（マールブルグ及びエボラを含む）、ハンタウイルス、ピコルナウイルス科（ライノウイルス、エコーウイルスを含む）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、トガウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスＢ１９、パラインフルエンザ、アデノウイルス、レオウイルス、ポックスウイルスファミリー由来の痘瘡（大痘瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘）、並びに水痘帯状疱疹（仮性狂犬病）が含まれる。ウイルス性出血熱は、アレナウイルスファミリー（ラッサ熱）（リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）にも関連するファミリー）、フィロウイルス（エボラウイルス）、及びハンタウイルス（プレマーラ）のメンバーによって引き起こされる。ピコルナウイルス（ライノウイルスの亜科）のメンバーは、ヒトの一般的な風邪に関連している。コロナウイルスファミリーは、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集素脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）などの複数の非ヒトウイルスを含む。パラミクソウイルスファミリーには、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルベラウイルス（ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルス、麻疹及びイヌジステンパーを含むモルビリウイルス、並びに呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含むニューモウイルスが含まれる。パルボウイルスファミリーには、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスが含まれる。アデノウイルスファミリーは、呼吸器疾患を引き起こすウイルス（例えば、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。
細菌性病原体に対する中和抗体構築物もまた、本発明で使用するために選択され得る。一実施形態では、中和抗体構築物は、細菌自体に対して指向される。別の実施形態では、中和抗体構築物は、細菌によって産生される毒素に対して指向される。空中浮遊細菌性病原体の例としては、例えば、髄膜炎菌（髄膜炎）、肺炎桿菌（肺炎）、緑膿菌（肺炎）、類鼻疽菌（肺炎）、鼻疽菌（肺炎）、アシネトバクター（肺炎）、カタル球菌、モラクセララクナータ、アルカリゲネス、カルジオバクテリウム、インフルエンザ菌（インフルエンザ）、パラインフルエンザ菌、百日咳菌（百日咳）、野兎病菌（肺炎・発熱）、レジオネラ肺炎（レジオナイレス病）、オウム病クラミジア（肺炎）、肺炎クラミジア（肺炎）、結核菌（結核（ＴＢ））、マイコバクテリウム・カンサシ（ＴＢ）、マイコバクテリウム・アビウム（肺炎）、ノカルジア・アステロイデス（肺炎）、炭疽菌（炭疽菌）、黄色ブドウ球菌（肺炎）、化膿性連鎖球菌（猩紅熱）、肺炎球菌（肺炎）、コリネバクテリウ
ムジフテリア（ジフテリア）、肺炎マイコプラズマ（肺炎）が含まれる。炭疽病の原因物質は、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓによって産生される毒素である。トキソイドを形成する３つのペプチドの１つである保護剤（ＰＡ）に対する中和抗体が記載されている。他の２つのポリペプチドは、致死因子（ＬＦ）及び浮腫因子（ＥＦ）からなる。抗ＰＡ中和抗体は、炭疽菌に対する受動免疫に有効であると記載されている。例えば、米国特許第７，４４２，３７３号、Ｒ．Ｓａｗａｄａ－Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：５．（オンライン２００４ Ｍａｙ １２）を参照されたい。更に他の抗炭疽毒素中和抗体が記載されており、かつ／又は生成され得る。同様に、他の細菌及び／又は細菌毒素に対する中和抗体を使用して、本明細書に記載される非ＩｇＧ抗体を生成し得る。
他の感染性疾患は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ｒｈｉｘｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ、Ｍｕｃｏｒ ｐｌｕｍｂｅａｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｆａｅｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種を含む、空中真菌によって引き起こされ得る。
その多くが上述されている、ヒトに影響を与える空気感染性疾患に加えて、本発明による受動免疫化は、鼻腔の直接接種に関連する状態、例えば、指と鼻腔との直接接触によって伝染し得る状態を予防するために使用され得る。これらの状態は、真菌感染症（例えば、水虫）、白癬、又はウイルス、細菌、寄生虫、真菌、及び直接接触によって伝染し得る他の病原体を含み得る。加えて、様々な状態が家庭用ペット、ウシ及び他の家畜、並びに他の動物に影響を与える。例えば、イヌでは、イヌ副鼻腔アスペルギルス症による上気道の感染が重大な疾患を引き起こす。ネコでは、鼻において発生する上気道疾患又はネコ呼吸器複合病は、未治療のまま放置すると罹患及び死亡の原因となる。ウシは、ウシの急性、伝染性ウイルス疾患である、感染性ウシ鼻気管炎（一般にＩＢＲ又は赤鼻病と呼ばれる）による感染症に罹りやすい。加えて、ウシは、軽度～重度呼吸器疾患を引き起こし、他の疾患に対する抵抗性を損なう可能性があるウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）に罹りやすい。更に他の病原体及び疾患は、当業者には明らかであろう。
本明細書で具体的に特定されるもの（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、抗インフルエンザ、抗エボラ、抗ＲＳＶ）などの病原体に対する、抗体、特に中和抗体は、クラススイッチ抗体又は非ＩｇＧ抗体を生成するために使用され得る。広範な中和能力を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗体ファージディスプレイを使用して特定し、季節性インフルエンザワクチンで最近ワクチン接種を受けたドナーから、非免疫ヒトから、又は自然感染症の生存者からのライブラリをスクリーニングすることができる。インフルエンザの場合、宿主細胞とのウイルス融合をブロックすることによって２つ以上のインフルエンザ亜型を中和する抗体が特定されている。この技法は、中和モノクローナル抗体を得るために、他の感染症とともに利用され得る。例えば、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）中和抗体の生成を記載するＵＳ５，８１１，５２４号を参照されたい。その中に記載される技法は、他の病原体に適用可能である。かかる抗体は、人工又は組換え中和抗体構築物を生成するために無傷で使用され得るか、又はその配列（足場）が修飾され得る。かかる方法は、記載されている［例えば、ＷＯ２０１０／１３０３６、ＷＯ２００９／１１５９７２、ＷＯ２０１０／１４０１１４を参照されたい］。一実施形態では、マウス、ラット、ハムスター、又は他の宿主動物を、免疫化剤で免疫化して、免疫化抗原への結合特異性を有する抗体を産生するリンパ球を生成する。代替アプローチでは、リ
ンパ球は、インビトロで免疫化され得る。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリなどの技法を使用して産生することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９１，２２７：３８１，Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２２：５８１）。
組成物及び使用
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶストック（例えば、ｒＡＡＶ９又はｒＡＡＶｈｕ６８変異体ストック）と、任意の担体、賦形剤、及び／又は防腐剤と、を含有する組成物が提供される。ｒＡＡＶストックは、同じである、例えば、濃度及び投与量単位の考察において以下に記載される量などである、複数のｒＡＡＶベクターを指す。
特定の実施形態では、組成物は、少なくとも第２の、異なるｒＡＡＶストックを含有し得る。この第２のベクターストックは、異なるＡＡＶカプシド及び／又は異なるベクターゲノムを有することによって、第１のベクターストックとは異なり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、本明細書に記載される発現カセットを発現する異なるベクター、又は別の活性成分（例えば、抗体構築物、別のバイオ医薬品、及び／又は小分子薬物）を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などのような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などにカプセル化された送達のいずれかのために製剤化され得る。
一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理学的に適合性のｐＨ及び塩濃度に緩衝された水性液体懸濁液である。任意に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築され得る。
好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、８４００の平均分子量を有する、ポロキサマー１８８としても知られている、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、第一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０
．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。
一実施形態では、製剤緩衝液は、２００ｍＭの総塩濃度、０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ６８を有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である（最終製剤緩衝液、ＦＦＢ）。
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。特定の実施形態では、ベクターは、鼻及び／又は鼻咽頭上皮細胞への標的化された送達のための鼻腔内送達デバイスを介した送達のために製剤化される。特定の実施形態では、ベクターは、例えば、ネブライザーを介した、又は他の好適なデバイスを通した、エアロゾル送達デバイス用に製剤化される。他の従来及び薬学的に許容される投与経路には、所望の臓器（例えば、肺）への直接送達、経口吸入、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、及び他の非経口投与経路が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、鼻腔内粘膜噴霧デバイス（ＬＭＡ（登録商標）ＭＡＤ Ｎａｓａｌ（商標）－ＭＡＤ１１０）を使用して鼻腔内投与される。別の実施形態では、ベクターは、Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ Ｍｅｓｈ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ａｅｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｓｏｌｏ）又はＭＡＤｇｉｃ（商標）Ｌａｒｙｎｇｅａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｔｏｍｉｚｅｒを使用して、霧化形態で肺内投与される。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。投与経路及びｒＡＡＶベクターを送達するためのその利用は、以下の公開された米国特許出願にも記載されており、この各々の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：ＵＳ２０１８／０１５５４１２Ａ１、ＵＳ２０１８／０２４３４１６Ａ１、ＵＳ２０１４／００３１４１８Ａ１、及びＵＳ２０１９／０２１６８４１Ａ１。
ウイルスベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効ヒト投与量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約５ｍＬの、約１０９～４×１０１４ＧＣのＡＡＶベクターの用量を含有する水性懸濁液の範囲である。投薬量を調整して、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとり、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意に、治療目的で記載されているものと同様の投与レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫化に利用され得る。
複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は小数を含む、（体重７０ｋｇの平均対象を治療する）約１０９ＧＣ～約１０１６ＧＣの範囲、好ましくは１０１２ＧＣ～１０１４ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含有する投与量単位で製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、又は９×１０９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９×１０１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含有するように製剤化さ
れる。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含有するように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり１０１０～約１０１２ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり１０９～約７×１０１３ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、６．２５×１０１２ＧＣ～５．００×１０１３ＧＣの範囲である。更なる実施形態では、用量は、約６．２５×１０１２ＧＣ、約１．２５×１０１３ＧＣ、約２．５０×１０１３ＧＣ、又は約５．００×１０１３ＧＣである。特定の実施形態では、用量は、等しくその半分に分割され、各鼻孔に投与される。特定の実施形態では、ヒト適用のために、用量は、０．８ｍｌの各対象において送達される総体積について鼻孔当たり０．２ｍｌの２アリコートとして投与される６．２５×１０１２ＧＣ～５．００×１０１３ＧＣの範囲である。
これらの上述の用量は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲、又はそれより大きな体積、又はその範囲内の全ての数を含む様々な体積の担体、賦形剤、若しくは緩衝液製剤で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤又は緩衝液の体積は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、体積は、約５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約７５μＬである。別の実施形態では、体積は、約１００μＬである。別の実施形態では、体積は、約１２５μＬである。別の実施形態では、体積は、約１５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約１７５μＬである。更に別の実施形態では、体積は、約２００μＬである。別の実施形態では、体積は、約２２５μＬである。更に別の実施形態では、体積は、約２５０μＬである。更に別の実施形態では、体積は、約２７５μＬである。更に別の実施形態では、体積は、約３００μＬである。更に別の実施形態では、体積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、体積は、約３５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約３７５μＬである。別の実施形態では、体積は、約４００μＬである。別の実施形態では、体積は、約４５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約５００μＬである。別の実施形態では、体積は、約５５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約６００μＬである。別の実施形態では、体積は、約６５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約７００μＬである。別の実施形態では、体積は、約７００～１０００μＬである。
特定の実施形態では、組換えベクターは、各鼻孔に２つのスプレーを使用することによって鼻腔内投与され得る。一実施形態では、２つのスプレーは、各鼻孔に交互に、例えば、左鼻孔スプレー、右鼻孔スプレー、次いで左鼻孔スプレー、右鼻孔スプレーで投与される。特定の実施形態では、交互スプレー間には遅延があり得る。例えば、各鼻孔は、約１０～６０秒、又は２０～４０秒、又は約３０秒～数分、又はそれ以上の間隔で離れた複数のスプレーを受け得る。かかるスプレーは、例えば、各スプレーで約１５０μＬ～３００μＬ、又は約２５０μＬを送達して、約２００μＬ～約６００μＬ、４００μＬ～７００μＬ、又は４５０μＬ～１０００μＬの投与される総体積を達成し得る。
特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、投与後、例えば、ベクターの投与の１週間～４週間後、又は約２週間後に鼻腔洗浄溶液中で測定される５～２０ｎｇ／ｍｌの導
入遺伝子の発現産物の濃度を達成するように鼻腔内投与され得る。対象における鼻腔洗浄溶液を取得する方法、及び導入遺伝子の発現産物の定量化方法は、従来のものである。
他の投与経路、例えば、静脈内又は筋肉内について、用量レベルは、鼻腔内送達よりも高いであろう。例えば、かかる懸濁液は、最大約２．５×１０１５ＧＣの用量で、約１ｍＬ～約２５ｍＬの体積用量であり得る。
特定の実施形態では、鼻腔内送達デバイスは、約３０ミクロン～約１００ミクロンのサイズの平均サイズ範囲を有する粒子のミストを送達するスプレーアトマイザーを提供する。特定の実施形態では、平均サイズ範囲は、約１０ミクロン～約５０ミクロンである。好適なデバイスが文献に記載されており、いくつか、例えば、ＬＭＡ ＭＡＤ ＮＡＳＡＬ（商標）（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｔｅｌｅｆｌｅｘ ＶａｘＩＮａｔｏｒ（商標）（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｋｕｒｖｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ
Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ（登録商標）（ＣＰＤ）が市販されている。また、ＰＧ Ｄｊｕｐｅｓｌａｎｄ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ（２０１３）３：４２－６２を参照されたい。特定の実施形態では、送達の粒子サイズ及び体積は、鼻上皮細胞を優先的に標的化し、肺への標的化を最小限に抑えるために、制御される。他の実施形態では、粒子のミストは、肺細胞に送達するために、約０．１ミクロン～約２０ミクロン、又はそれ未満である。かかるより小さい粒子サイズは、鼻上皮における保持を最小限に抑え得る。
１つのデバイスは、粒子を約１６ミクロン～約２２ミクロンの平均直径でミスト化する。ミストは、３．５ｍｍの柔軟な光ファイバー気管支鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）の吸引チャネルを通して挿入された気管気管支樹に直接送達され得る。他の好適な送達デバイスは、声帯を通過する上気道にわたる投与を提供する、喉頭気管粘膜アトマイザーを含み得る。声帯を通り抜けて喉頭マスクを下るか、又は鼻腔に入る。液滴は、約３０ミクロン～約１００ミクロンの平均直径で噴霧化する。標準デバイスは、約０．１８インチ（４．６ｍｍ）の先端径、約４．５～８．５インチの長さを有し、吸引チャネルを通して挿入され、スコープの遠位先端を約３ｍｍ超えて前進する。用量は、左右の主気管支に生理食塩水又はｒＡＡＶがスプレーされた１０アリコート（各約１５０μｌ）の対照で投与され得る。
一実施形態では、本明細書に記載される緩衝溶液中にｒＡＡＶを含有する凍結された組成物が、凍結された形態で提供される。任意に、１つ以上の界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、安定化剤、又は防腐剤が、この組成物中に存在する。好適には、使用のために、組成物は解凍され、好適な希釈剤、例えば、滅菌食塩水又は緩衝化食塩水を用いて所望の用量に滴定される。
一実施形態では、モチーフ：Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）からの１つ以上の外因性内皮細胞標的化ペプチドと、任意の隣接リンカー配列と、を、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上とともに含む、組成物が提供される。更に、それをコードする核酸配列を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号４０を有し、配列番号５４の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号３８を有し、配列番号５０の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号４６を有し、配列番号５６の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号４３を有し、配列番号５２の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコ
ードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号３９を有し、配列番号５５の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号４２を有し、配列番号５１の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号４１を有し、配列番号５３の核酸配列、又はそれと少なくとも約７０％同一の配列によってコードされる。
別の実施形態では、モチーフ：Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）からの１つ以上の外因性脳内皮細胞標的化ペプチドを含む、融合ポリペプチド又はタンパク質が提供され、その融合パートナーは、少なくとも１つのポリペプチド又はタンパク質を含む。更に、それをコードする核酸配列が提供される。
特定の実施形態では、融合ポリペプチド若しくはタンパク質、又は融合ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする核酸配列、又はそれを含有するナノ粒子を含む組成物が提供される。組成物は、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上を更に含み得る。
特定の実施形態では、融合ポリペプチドタンパク質をコードする核酸配列は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」又は「ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む移送ビヒクルを指す。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上の核酸配列を１つ以上の標的細胞（例えば、肝臓及び／又は筋肉）に送達するように製剤化される。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が含まれる。また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせての、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、及びポリエチレンイミンが含まれ得る。一実施形態では、移送ビヒクルは、その中にカプセル化された核酸配列の標的細胞へのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。核酸配列に有用な脂質ナノ粒子は、かかる核酸配列をタンパク質産生のためのデポーとして機能する標的細胞へのカプセル化及び／又はその送達を増強するために、カチオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、選択されたｐＨ、例えば、生理的ｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を用いる変動する比の多成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤化は、コレステロール、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ－脂質、及びカプセル化された核酸配列の周囲に脂質二重層を形成するポリマーを含む慣例的な手順を使用して実施される（Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７（４）：７１０－７２８）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質ＤＯＰＥを有するカチオン性脂質（すなわち、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ））を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化性脂質Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡイオン化性脂質、又はジケトピペラジン系イオン化性脂質（ｃＫＫ－Ｅ１２）を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレ
ンイミン（ＰＥＩ）又はポリ（β－アミノ）エステル（ＰＢＡＥ）を含む。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、組成物、例えば、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）ペプチド及び任意のリンカー配列を有する修飾カプシド、融合ポリペプチド若しくはタンパク質、又はナノ粒子若しくは化学部分を含むコンジュゲートを有するｒＡＡＶは、治療薬を、それを必要とする患者に送達するのに有用である。特定の実施形態では、方法は、療法を脳内皮細胞に標的化するためのものである。特定の実施形態では、方法は、ＭＣＴ８タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ．：Ｐ３６０２１）又はインビボでＭＣＴ８を発現する遺伝子を送達することによって、アラン－ハーンドン－ダドリー病を治療するためのものである。他の実施形態では、方法は、療法を肺に標的化するためのものである。特定の実施形態では、送達された産物は、可溶性Ａｃｅ２タンパク質（例えば、ｈＡｃｅ２デコイ又はｈＡｃｅ２デコイ融合）、抗ＳＡＲＳ抗体、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体、抗インフルエンザ抗体、又は嚢胞性線維症膜貫通タンパク質である。また、ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／３００５２３を参照されたく、この内容は参照によって本明細書に組み込まれる。また、２０２１年１月２９日に出願された、米国仮出願第６３／１４３，６１４号、２０２１年３月１２日に出願された、米国仮出願第６３／１６５０，５１１号、及び２０２１年３月２６日に出願された、米国特許出願第６３／１６６，６８６号、２０２１年６月２５日に出願された、米国仮特許出願第６３／２１５，１５９号、２０２１年１０月８日に出願された、米国仮出願第６３／２５３，６５４号を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾カプシドを有するｒＡＡＶは、１つ以上の他の活性成分を更に含む共治療レジメンで送達され得る。特定の実施形態では、レジメンは、免疫調節成分の共投与を含み得る。かかる免疫調節レジメンとしては、これらに限定されないが、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン又はラパログ）、及びアルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、又はイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む、細胞増殖抑制剤が挙げられ得る。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子治療投与の前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬剤、（例えば、プレドネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を含み得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間、約１５日間、約３０日間、約４５日間、６０日間、又はそれ以上であり得る。更に他の共治療薬は、例えば、抗ＡＡＶ抗体を枯渇させるのに有用であると記載されている（したがって、選択されたＡＡＶカプシドに対する抗体の閾値レベルを上回ると検査される患者への投与が可能となり得る）、抗ＩｇＧ酵素、並びに／又は、例えば、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐａｔｉｅｎｔｓ」と題する、２０２０年６月１７日に出願された、米国仮特許出願第６３／０４０，３８１号に記載される抗ＦｃＲＮ抗体の送達、並びに／又は（ａ）ステロイド若しくはステロイドの組み合わせ、及び／若しくは（ｂ）ＩｇＧ切断酵素、（ｃ）Ｆｃ－ＩｇＥ結合の阻害剤、（ｄ）Ｆｃ－ＩｇＭ結合の阻害剤、（ｅ）Ｆｃ－ＩｇＡ結合の阻害剤、及び／若しくは（ｆ）ガンマ
インターフェロンのうちの１つ以上を含み得る。
抗体「Ｆｃ領域」は、細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）と相互作用する抗体の領域である結晶性断片を指す。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、操作されたＦｃ断片である。例えば、Ｌｏｂｎｅｒ，Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＩｇＧ１－Ｆｃ－ｏｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｏ ｂｉｎｄ ｔｈｅｍ ａｌｌ．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ２７０．１（２０１６）：１１３－１３１、Ｓａｘｅｎａ，Ａｂｈｉｓｈｅｋ，ａｎｄ Ｄｏｎｇｈｕｉ Ｗｕ．“Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ＩｇＧ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７（２０１６）、Ｉｒａｎｉ，Ｖａｓｈｔｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６７．２（２０１５）：１７１－１８２、Ｒａｔｈ，Ｔｉｍｏ，ｅｔ ａｌ．“Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ＦｃＲｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｏｒ ｌｏｎｇｅｒ－ｌａｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３５．２（２０１５）：２３５－２５４、及びＩｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＩｇＧ－Ｆｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ，ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／Ｉｎｓｉｇｈｔ２００６０５．ｐｄｆ，Ａｐｒｉｌ ２００６を参照されたく、これらの各々は、本明細書に参照によって組み込まれる。
抗体「ヒンジ領域」は、ＩｇＧ及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスの重鎖の柔軟なアミノ酸部分であり、これはジスルフィド結合によってこれら２つの鎖を結合する。
「免疫グロブリン分子」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に組み合わせることができる免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含むタンパク質である。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスである。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
「免疫グロブリン重鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部分及び免疫グロブリン重鎖の可変領域の少なくとも一部分又は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来重鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸配列相同性の有意な領域を有する。例えば、Ｆａｂ断片中の重鎖は、免疫グロブリン由来重鎖である。
「免疫グロブリン軽鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部分及び免疫グロブリン軽鎖の可変領域の少なくとも一部分又は定常領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来軽鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸相同性の有意な領域を有する。
「中和抗体力価」（ＮＡｂ力価）は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ ＮＡｂ）がどれだけ産生される
かの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９，１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されるように測定され得、これは本明細書に参照によって組み込まれる。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーまでからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、全てのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質の更なる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照されたアミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９７％、９９％、最大約１００％の脱アミド化を指す。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、又は他の好適な技術を使用して決定され得る。
本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生システムに特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生システムから産生されてもよく、又は産生システムの複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生システムが選択され得る。例えば、ＡＡＶ９の脱アミドパターンを提供する表Ｇを含む、２０１９年９月６日に公開された、ＷＯ２０１９／１６８９６１、及び２０１８年９月７日に出願された、ＷＯ２０２０／１６０５８２を参照されたい。また、例えば、２０２０年１１月５日に公開された、ＷＯ２０２０／２２３２３１（ｒｈ９１、脱アミドパターンを有する表を含む）、２０２０年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された、米国仮特許出願第６３／１０９，７３４号、並びに２０２１年８月１３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４５９４５号を参照されたく、これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の片割れが会合して、即時の複製及び転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するであろう。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（
ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ８，Ｎｕｍｂｅｒ１６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書で使用される場合、「作動可能に結合した」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及びトランスで又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。
タンパク質又は核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質又は核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない、２つ以上の配列又は部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置された、ある遺伝子由来のプロモーターを有する。したがって、コード配列に関して、プロモーターは、異種性である。
「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作することができる）、これらの遺伝子は、産生の際に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特定の実施形態では、カプシドは、カプシドを形成するために自己集合する、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質で構成される約６０個のタンパク質を含有する。別途指定されない限り、「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、「ｒＡＡＶベクター」という語句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶキャップ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠陥ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。
「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に導入遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するように設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップの間の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するパルボウ
イルス（例えば、ｒＡＡＶ）カプシドの内側にパッケージングされた核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、コード配列（すなわち、導入遺伝子）、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲ、例えば、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）ＩＴＲが使用され得る。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に結合している。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。一例では、「ベクターゲノム」は、最低限でも５’から３’に、ベクター特異的配列と、（標的配列においてそれらの発現を指示する）調節制御配列に作動可能に結合した目的のタンパク質をコードする核酸と、を含有し、ベクター特異的配列は、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシド又はエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ及び特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージングするために利用される。
本明細書で使用される場合、「作動可能に結合した」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶの製造に使用される非ウイルス遺伝子要素は、ベクター（例えば、産生ベクター）と称される。特定の実施形態では、これらのベクターは、プラスミドであるが、他の好適な遺伝的要素の使用が企図される。かかる産生プラスミドは、ｒＡＡＶ産生中に発現される配列、例えば、ｒＡＡＶにパッケージングされていない、ｒＡＡＶの産生に必要なＡＡＶカプシド又はｒｅｐタンパク質をコードし得る。あるいは、かかる産生プラスミドは、ｒＡＡＶにパッケージングされるベクターゲノムを担持し得る。
本明細書で使用される場合、「親カプシド」は、パルボウイルス又は他のウイルス（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、ＨＳＶ、ＲＳＶなど）から選択される非変異又は非修飾カプシドを指す。特定の実施形態では、親カプシドは、カプシドタンパク質（すなわち、ｖｐタンパク質）をコードする野生型ゲノムを含む、任意の天然に存在するＡＡＶカプシドを含み、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ形質導入及び／又は組織特異的トロピズムを指示する。いくつかの実施形態では、親カプシドは、ＣＮＳを天然に標的化するＡＡＶから選択される。他の実施形態では、親カプシドは、ＣＮＳを天然に標的化しないＡＡＶから選択される。
本明細書で使用される場合、「バリアントカプシド」又は「バリアントＡＡＶ」又は「バリアントＡＡＶカプシド」は、修飾されたカプシド又は変異されたカプシドを指し、カプシドタンパク質は、組織特異的標的化ペプチドの挿入を含む。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指向又は調節する、それと作動可能に結合した制御性配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「作動可能に結合した」配列は、核酸配列と連続又は非連続である制御性配列及びトランス又はシス核酸配列で作用する制御性配列の両方を含む。かかる調
節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の要素の中でも、遺伝子配列の上流（５’～）の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのうちの１つ以上と、エンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’～）の調節配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含有し得る。特定の実施形態では、制御性配列は、遺伝子産物の核酸配列と作動可能に結合し、制御性配列は、介在する核酸配列、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）によって、遺伝子産物の核酸配列から分離される。特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の遺伝子産物の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、モノシストロン性又はバイシストロン性発現カセットであり得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。
本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質又はペプチドを生成する。
「発現」という用語は、その最も広い意味で本明細書で使用され、ＲＮＡの産物、又はＲＮＡ及びタンパク質の産物を含む。発現は、一過性のものであってもよく、又は安定したものであってもよい。
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも１５ヌクレオチド長である別の適切な断片にわたる相同性である。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、又は「同一パーセント」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列又はその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なアミノ酸挿入又は欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のアミノ酸配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのタンパク質、例えば、免疫グロブリン領域若しくはドメイン、ＡＡＶカプシド、又は少なくとも８アミノ酸、若しくはより望ましくは、少なくとも１５アミノ酸長であるそれらの断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当業者によって知られているアルゴリズム及びコンピュータプログラムに頼ることによって、当業者によって容易に決定される。
一般的に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」又は「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」又は「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列又は「アラインメント」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。アラインメントは、公的又は商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。代替的に、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書に参考として組み込まれる、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１で提供される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどのアミノ酸配列のための複数の配列アラインメントプログラムも利用可能である。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又はアラインメントを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
有効量は、ヒト患者ではなく、むしろ動物モデルに基づいて決定され得る。
上述されるように、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から±１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、又はそれらの間の値）の変動を意味する。
特定の例では、「Ｅ＋＃」という用語又は「ｅ＋＃」という用語は、指数を指すために使用される。例えば、「５Ｅ１０」又は「５ｅ１０」は、５×１０１０である。これらの用語は、同義的に使用され得る。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、並びに他の変形の中で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」を含むその変形は、他の成分、要素、整数、ステップなどを含む。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」」という用語は、他の成分、要素、整数、ステップなどを除外する。
「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「エンハンサー（ａｎ
ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、１つ以上のエンハンサーを表すことに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
これらの発明の説明に関して、本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、本発明の方法で有用であることが意図される。加えて、本方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用されている多くの用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
以下の実施例は単に説明的なものであり、本明細書に記載の発明を限定するものではない。
実施例１．一次スクリーニング
ＡＡＶカプシドの表面上の柔軟なループへの小さなペプチド挿入物は、新しい細胞受容体との相互作用を媒介することができることが示されている。ＣａｌＴｅｃｈ（ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ）で発見された一事例では、ＡＡＶ９上のＨＶＲ８ループに挿入された７つのアミノ酸ペプチドは、いくつかのマウス株の脳脈管構造上のＧＰＩアンカー受容体であるＬｙ６ａとの相互作用を媒介する。この相互作用は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切るＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂの輸送を駆動し、ＡＡＶ９よりも約５０倍高い脳細胞の形質導入をもたらす。この研究では、我々は、ＢＢＢ上の細胞膜標的に結合することができ、よってＢＢＢを横切ってＡＡＶ９カプシドを駆動する潜在性を有するペプチド挿入物を探索する。
我々は、まず脳における血管細胞と相互作用する潜在性を有し得るペプチド配列について入手可能な学術及び特許文献を調査することによって、ＡＡＶ－ＢＢＢの問題を解決しようとした。我々は、これらのペプチドの以下の供給源を見出した：
・ファージディスプレイライブラリが初代脳内皮細胞に対してパニングされたファージディスプレイ実験の公表された結果、
・既知のＢＢＢ常在膜タンパク質への天然リガンドペプチド、
・ＢＢＢ常在膜タンパク質に標的化された抗体のＣＤＲ、
・脳炎を引き起こすフラビウイルスのウイルスコートタンパク質、及び
・ＧＰＩ係留を対象とした細胞結合活性を有する細菌毒素。
我々は、全てＨＶＲ８遺伝子座（配列番号４４のＡＡＶ９カプシドのアミノ酸配列のナンバリングに基づいて、５８８位と５８９位との間）で個別に挿入された、これらの供給源からの何百ものペプチドを含有するＡＡＶ９挿入変異体のライブラリを生成した。各ペプチドは、典型的には、１）挿入されたペプチドの長さ２）ペプチドの両側の柔軟なＧＳＧ又はＧＧリンカー配列の存在によって異なる複数の形態でライブラリ中に存在した。ペプチドはまた、複数の同義コドンを使用してコードされ、したがって我々は、スクリーニングにおいて複製活性を独立して観察することができた。
加えて、我々は、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体（配列番号４５のＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列のナンバリングに基づいて、５８８位と５８９位との間）を標的とする既知の又は疑わしいリガンドペプチドのいずれかを有するＡＡＶｈｕ６８カプシドのＨＶ
Ｒ８における挿入バリアントのライブラリを生成した。かかるものは：
●哺乳動物脳内皮に結合するペプチド（公開されたファージディスプレイデータ）、
●古典的ＲＭＴ受容体リガンド（例えば、Ｔｆ）、
●ＲＭＴ受容体（例えば、抗ＴｆＲ）に対するｍＡｂのＣＤＲ、及び
●脳炎を引き起こすフラビウイルスのコートタンパク質であった。
対照として、ＰＨＰ．Ｂペプチドも含めた（Ｃ５７／ＢＬ６の陽性対照及びＢａｌｂ／ｃ＆ＮＨＰの陰性対照）。各ペプチドを、複数の方法で（リンカーあり及びなしで、並びにいくつかの同義ＤＮＡ配列において）コードした。
我々は、このライブラリを高用量で２つのマウス株及び１つの非ヒト霊長類に静脈内（ＩＶ）注射した。２～３週間の生存期間後、動物を剖検し、組織を収集した。我々は、ＣＮＳ及び他の組織からＡＡＶベクターのＤＮＡゲノムを抽出し、これらを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。ベクターバリアントは、それらの独自のカプシド遺伝子バリアントをカプシド化し、我々が目的の組織におけるカプシド遺伝子バリアントの相対的な存在量を通してカプシド活性を追跡することを可能にする。我々は、注射されたライブラリ混合物中のその存在量に対して正規化されたＣＮＳ中のその存在量を計算することによって、ライブラリ中の各バリアントのＢＢＢ活性（「濃縮スコア」）をスコア付けした。
マウス研究では、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける最高の脳濃縮ＨＶＲ８挿入物は、ＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号４９）（ＰＨＰ．Ｂ）であり、陽性対照ＰＨＰ．Ｂは、最も濃縮されたヒットとして独立して３回出現する。同義コドンを有するＰＨＰ．Ｂペプチドのうちの３つは、独立して濃縮される。いくつかの他のペプチドも脳において濃縮される。図１Ａ及び１Ｂは、スクリーニングにおける最良のマウス脳ヒットの濃縮スコアを、参照ペプチドとともに示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスについて図１Ａ、Ｂａｌｂ／ｃマウスについて図１Ｂ）。図２Ａ及び２Ｂは、最高性能のＮＨＰ脳（図２Ａ）及び脊髄（図２Ｂ）組織の濃縮スコアを示す。
Figure 2023551903000001
実施例２．二次妥当性確認
我々は、ヒットカプシドのいくつかについてＧＦＰレポーターベクターを生成することによって、マウスにおける一次スクリーニングを追跡した。ベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高用量ＩＶで注射した。２週間後、我々は、マウスを剖検し、脳切片のＧＦＰ画像を収集した（データは示さず）。ＧＦＰ研究において試験されたヒットベクターの全てを、肝臓ＧＦＰ染色から明らかなように、肝臓から非局在化した（データは示さず）。
より高い倍率のイメージングは、カプシドＳＳＮ及びＳＡＮが有意に脳局在化されるが、内皮に制限されることが明らかにした。ＲＣＡ－レクチンは、これらの切片における脳内皮細胞の共染色マーカーである（データは示さず）。これらの結果は、スクリーニングにおける特定されたＡＡＶカプシドがＢＢＢ受容体結合であるが、ＢＢＢを通過しないことを示す。変異体シリーズは、Ｌｙ６ａ受容体について一連の親和性を示した。脳形質導入レベルは、Ｌｙ６ａ受容体へのペプチドの観察されたより強い親和性結合と相関して低下した。観察された強い結合は、内皮において固着している可能性が高いゲノムのため、形質導入を低減した。
この内皮局在化は、特定の疾患に有用であり得る。また、この活性は、これらを脳局在化からＢＢＢ通過ベクターに変換するために最適化され得る。
我々は、バーコード化ベクター研究においてこれらのＢＢＢ通過及び脳局在化活性を確認した。簡潔には、各カプシドを使用して、独自のＤＮＡバーコードが含まれたＧＦＰレポーター遺伝子を含有するベクターを個別に産生した。バーコード化カプシド調製物を、等しい割合で混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢａｌｂ／ｃマウスに注射した（図３Ａ～３Ｄ）。生存の最後に、マウス組織をＮＧＳシーケンシングに供して、組織から抽出されたベクターゲノム中の各バーコードの存在量を計数した。結果は、一次スクリーニングにおいて特定された全てのヒットカプシドについてベクターゲノムの脳局在化を確認する。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、二次妥当性確認スクリーニングは、一次スクリーニングにおいて発見された全てのヒット配列について脳標的化を示した（図３Ａ）。Ｃ５７６ＢＬ／６マウスにおいて、二次妥当性確認スクリーニングは、一次スクリーニングにおいて発見された全てのヒット配列について脳標的化を示した（図３Ｂ）。両方の、Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、全てのヒット配列の肝臓脱標的化は、ＡＶＡ９と比較して、脳脈管構造の親和性と一致していた（図３Ｃ及び３Ｄ）。
実施例３．内皮標的化配列。
ＮＨＰ二次妥当性確認について、バーコード研究を実施した。研究は、生後２１日後、４．５×１０１３ＧＣ／ｋｇでＡＡＶ９を含む、２７のバーコード化ベクターの注射混合物を用いて２つのＮＨＰにおいて実施した。全脳組織ホモジネートの分析を実施した。いくつかのベクターは控えめに改善されたベクター生体分布を示したが、改善された全脳形質導入を示すベクターはなかった。脳（ＤＮＡ）におけるベクターゲノムの蓄積及びベクター由来転写物（ｍＲＮＡ）の発現は、不十分に相関していた（表２）。我々は、内皮標的化ベクターについて不十分なｍＲＮＡ対ＤＮＡ相関を観察した。
Figure 2023551903000002
以下の表３は、ＡＡＶ９（１に等しい）に対して正規化されるが、バーコード研究におけるＮＨＰの両方について平均相対局在化スコアを示す。脳に焦点を当てたライブラリ設計に沿って、ほとんどのベクターは、非脳組織において目立たない局在化を有する。これの例外は、ＡＡＶ９と比較して両方のＮＨＰの脾臓に有意に再局在化した、ベクターＰＭＫである。
Figure 2023551903000003
以下の表４は、脳内皮ヒットが、共通のインビトロ形質導入プロファイル（２９３形質導入において測定される）及び共通の産生プロファイルを有することを示す。重要なことに、内皮標的化活性を有するベクターは全て、ＮＧＳによって測定されるＡＡＶ対プラスミドライブラリにおいて相対的存在量が劇的に増加したことを示す。
Figure 2023551903000004
ＳＡＮペプチドの変異ライブラリは、脳標的化における「ＮｘＴＫ」モチーフの役割を確認する。この研究では、ＳＡＮ挿入物への全ての可能な単一アミノ酸変更が行われ、最適化されたライブラリバリアントがマウスに注射され、各バリアントについての生体内分
布及び収率のスコアが測定された。「ＮｘＴＫ」モチーフは、ＳＡＮ挿入物における脳の生体内分布のための重要なモチーフである（表５及び図５）。「ＮｘＴＫ」モチーフは、ＳＡＮペプチド挿入物におけるプラスミドからＡＡＶへの変換を制御する（表６及び図６）。更に、「ＮｘＴＫ」モチーフは、「ＮｘＴＫ」クラスにおけるこれらの内皮ベクターの３つの特性：内皮細胞形質導入、改善された２９３細胞形質導入、及びライブラリ産生中に増殖する能力に関連付けた。図７Ａ～７Ｄは、「ＮｘＴＫ」モチーフが、細胞株にわたる広範な形質導入の利点を付与することを示す。相対的形質導入レベルは、２９３細胞（図７Ａ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（図７Ｂ）、及びＨＵＨ７細胞（図７Ｃ）におけるＡＡＶ９カプシドと比較されるとき改善された。図７Ｄは、形質導入後３日目での形質導入の有意な早期改善（３ＤＰＴ）及び形質導入後７日目までに約１０倍の改善（７ＤＰＴ）を示す。ＥＦＳ及びＳＡＮペプチド挿入物を有するＡＡＶ－ＧＦＰベクターは、初代マカク気道上皮細胞を形質導入したとき改善された形質導入を示した（図７Ｅ～７Ｈ）。
Figure 2023551903000005
Figure 2023551903000006
要約では、表７に列挙される、選択されたアミノ酸配列は、全て機能的モチーフＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフ（配列番号４７）を含有する。表７に示される選択された配列を超えて、スクリーニング中に他を特定した。我々は、これらの挿入配列に対する多くの置換が、内皮標的化活性も支持するか、又は改善さえすることを支持するデータを有する。加えて、我々は、大きくランダムな挿入ライブラリからこのモチーフに適合する約数千の配列を発見した－これらの配列は、全て改善された形質導入特性を共有する可能性が高い。
Figure 2023551903000007
我々は、ＮＨＰにおける一次スクリーニングヒットのバーコード評価を完了した。脳局在化は、このライブラリからのヒットの最も顕著な特徴であるが、ＡＡＶ９－ＰＭＫによる脾臓標的化を可能な例外として、末梢組織への標的化における有意な増強はなかった。我々は、脳内皮標的化活性を有する全てのペプチド挿入物に共通する配列モチーフを定義した。我々は、脳内皮標的化及び広範なインビトロ形質導入利点を付与する際におけるこのモチーフの活性を確認した。単一配列モチーフ「ＮｘＴＫ」は、３つの特性を共有する４つの無関係な供給源からの挿入物を定義する：
（１）２９３及び他の細胞株上の劇的に改善されたインビトロ形質導入、
（２）ライブラリ産生中の寄生性増殖－「拡散」表現型、並びに
（３）マウス及びＮＨＰにおけるインビボでの内皮生体内分布。
「ＮｘＴＫ」モチーフを、ＳＡＮ及びＥＦＳベクター挿入物の全身変異スクリーニングにおいてマッピングした。全身変異スクリーニングにおいて、「ＮｘＴＫ」モチーフは、脳内皮生体内分布にとって及びライブラリ産生における存在量にとって重要であることが示されている。ライブラリ産生中のカプシド収率を意味する、プラスミドからＡＡＶへの変換は、２つの因子：寄生性拡散モチーフの存在（メジャー因子）及び内在性カプシド収率（マイナー因子）によって制御される。拡散モチーフのうちの１つは、「ＮｘＴＫ」であることが特定され、２９３細胞表面受容体と相互作用し、形質導入利点を付与する可能性が高かった。２９３における形質導入利点は、ライブラリ産生がＣａｐを制限することで行われるため、産生期間中にベクターゲノム（Ｃａｐ）の隣接細胞への伝播につながり得、よってほとんどの細胞は、初期にＣａｐ遺伝子を除く全てを有する。マイナー因子は、寄生性拡散モチーフを有するベクターからデジタルフィルタリングした後にのみ明らかであった。
実施例４．気道送達のためのＡＡＶカプシド開発のための操作戦略
現在のＡＡＶベクターは、鼻腔及び上気道の細胞を不十分に形質導入し、インフルエンザ又はＣＯＶＩＤ－１９のような上気道感染性疾患に対して保護するための予防的ＡＡＶ戦略の有効性を限定する。このプロジェクトは、これらの組織の改善された形質導入のためにＡＡＶカプシドを操作することを目的としており、具体的には、指向性進化及び受容体標的化戦略が追求されている。ＡＡＶ気道特異的カプシド選択のために追求される操作戦略は、これらに限定されないが、挿入物（１０３～１０９の初期多様性）を有する構築物の多様なライブラリを生成すること、初代霊長類又はヒト気道細胞におけるスクリーニング及び選択、選択された構築物のゲノム同一性（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を特定すること、ヒットに収束し、ＮＨＰにおける改善されたカプシドのヒットの妥当性を確認する追加のスクリーニングを実施することを含む、ステップで構成される。気道送達のためのカプシド多様性の供給源は、２つのアプローチ：偏りのないアプローチ及び偏りのあるアプロー
チを追求することで構成される。偏りのないアプローチでは、ランダムペプチドをＡＡＶカプシド表面に挿入して、１０７バリアント多様性を超える大きなライブラリを生成する。偏りのないアプローチでは、既知又は疑いのある気道細胞結合活性を有するペプチドを、ＡＡＶカプシドに挿入して、約１０３バリアント多様性を有する小さなライブラリを生成する。かかる既知又は疑わしい気道細胞結合ペプチドの供給源：公開されたファージディスプレイ結果、ウイルス受容体結合ドメインからのペプチド、気道受容体への既知のリガンド、及び以前のインビトロライブラリスクリーニングにおいて生成されたペプチド。インビトロでの生成されたカプシドのライブラリのスクリーニングのために、気液界面（ＡＬＩ）培養物中の初代気道細胞でのアッセイが使用される。使用される細胞は、ヒト及びマカク由来であり、鼻、気管、及び気管支細胞由来で構成される。マカク初代気道上皮細胞培養物におけるＧＦＰベクターでの予備形質導入試験は、ＥＦＳ及びＳＡＮ挿入ペプチドのＡＡＶカプシドへの形質導入において有意な早期改善を示した（図７Ｄ及び７Ｅ～７Ｈ）。図７Ｅは、担体（すなわち、ベクターなし）で処理された対照試料中のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。図７Ｆは、ＡＡＶ９－ＧＦＰベクターでの形質導入後のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。図７Ｇは、ＥＦＳペプチド挿入を含むＡＡＶ９－ＧＦＰベクターでの形質導入後のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。図７Ｈは、ＳＡＮペプチド挿入を含むＡＡＶ９－ＧＦＰでの形質導入後のマカク初代気道上皮細胞の顕微鏡分析を示す。培養ヒト細胞におけるＧＦＰベクターでの予備形質導入試験は、全体的なより低い形質導入を示し、７日目に、マイクログラム総ｍＲＮＡに対するｍＲＮＡコピー数の割当量は、培養ヒト細胞では１×１０４（図８）、培養マカク初代気道上皮細胞では１×１０６（図７Ｄ）であった。ＳＡＮモチーフは、ＡＡＶ９形質導入との比較のとき、７日目に形質導入における利点を示した（図８）。ＥＦＳモチーフは、気管支及び気管培養ヒト細胞におけるより不十分な形質導入を示した（図８）。
更に、我々は、劇的に改善された細胞結合及び形質導入活性を付与する他のプロジェクトに対するインビトロ選択スキームを通して多数の挿入配列を開発した。生成されたＡＡＶ挿入ベクターを、ＡＬＩ培養物に対してバーコード化プールにおいて試験する。結果は、全てのインビトロ選択ＡＡＶ９挿入ベクターが、ＡＡＶ９ベクターよりも良好であったことを示す（結果は示さず）。具体的には、Ｓｐｒ３Ｌ（ＮｘＴＫ）のＡＡＶ９挿入ベクターは、比較において最良であり、後者は、ＡＡＶ９カプシドよりも約５０倍良好な形質導入を示した。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
Figure 2023551903000008
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Figure 2023551903000018
本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月１日に出願された、米国仮出願第６３／１１９，８６３号は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。「２０－９４０９ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という名前で本明細書とともに提出された配列表、並びにその中の配列及びテキストは、参照によって組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (19)

  1. モチーフＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）を含むアミノ酸配列を含むカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）であって、前記アミノ酸配列が、前記カプシド中の少なくともＡＡＶ ｖｐ３タンパク質の一部であり、前記カプシド中にパッケージングされたベクターゲノムが、その発現を指示する配列の制御下で遺伝子産物をコードする核酸配列を含み、但し、前記カプシドが、ＮＤＶＲＡＶＳ（配列番号４８）配列を含む変異体ＡＡＶ２カプシドではない、組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）。
  2. 任意に前記モチーフのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で２つのアミノ酸～７つのアミノ酸に隣接したＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）モチーフを含むことを含む前記アミノ酸配列が、前記ＡＡＶカプシドｖｐ３領域に挿入される、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  3. 前記カプシドに挿入された前記配列が、
    （ａ）ＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨ（配列番号４０）、
    （ｂ）ＥＦＳＳＮＴＶＫＬＴＳ（配列番号３８）、
    （ｃ）ＧＧＶＬＴＮＩＡＲＧＥＹＭＲＧＧ（配列番号４６）、
    （ｄ）ＧＧＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬＧＧ（配列番号４３）、
    （ｅ）ＧＧＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨＧＧ（配列番号３９）、
    （ｆ）ＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬ（配列番号４２）、又は
    （ｇ）ＳＡＮＦＩＫＰＴＳＹ（配列番号４１）を含む、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
  4. 前記モチーフのアミノ酸配列が、ＮＴＶＫである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  5. 前記モチーフＮ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）が、任意にそのカルボキシ末端及び／又はアミノ末端で２～７つのアミノ酸に隣接し、アミノ酸配列：配列番号４４のナンバリングに基づいて、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に挿入される、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックと、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上と、を含む、組成物。
  7. 内皮細胞標的化ペプチドであって、前記内皮細胞標的化ペプチドが、任意に前記モチーフの前記アミノ末端及び／又は前記カルボキシ末端で２つのアミノ酸～７つのアミノ酸に隣接し、任意にナノ粒子、第２の分子、又はウイルスカプシドタンパク質に更にコンジュゲートした、Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）のアミノ酸配列を含むモチーフを含む、内皮細胞標的化ペプチド。
  8. 前記内皮細胞標的化ペプチドが、
    （ａ）ＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨ（配列番号４０）、
    （ｂ）ＥＦＳＳＮＴＶＫＬＴＳ（配列番号３８）、
    （ｃ）ＧＧＶＬＴＮＩＡＲＧＥＹＭＲＧＧ（配列番号４６）、
    （ｄ）ＧＧＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬＧＧ（配列番号４３）、
    （ｅ）ＧＧＳＳＮＴＶＫＬＴＳＧＨＧＧ（配列番号３９）、
    （ｆ）ＩＥＩＮＡＴＲＡＧＴＮＬ（配列番号４２）、又は
    （ｇ）ＳＡＮＦＩＫＰＴＳＹ（配列番号４１）を含む、請求項７に記載の内皮細胞標的
    化ペプチド。
  9. 前記モチーフのアミノ酸配列が、ＮＴＶＫである、請求項７又は８に記載の内皮細胞標的化ペプチド。
  10. 請求項７～９のいずれか一項に記載の内皮細胞標的化ペプチドと、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上と、を含む、組成物。
  11. 請求項７～９のいずれか一項に記載の脳内皮細胞標的化ペプチドと、少なくとも１つのポリペプチド又はタンパク質を含む融合パートナーと、を含む、融合ポリペプチド又はタンパク質。
  12. 請求項１１に記載の融合ポリペプチド又はタンパク質と、生理学的に適合性の担体、賦形剤、及び／又は水性懸濁液ベースのうちの１つ以上と、を含む、組成物。
  13. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストック、請求項７～９のいずれか一項に記載の内皮細胞標的化ペプチド、又は請求項１１に記載の融合ポリペプチド若しくはタンパク質、又は請求項６、１０、若しくは１２のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、それを必要とする患者に治療を送達するための、使用。
  14. 脳の内皮細胞に対する標的療法のための方法であって、前記方法が、それを必要とする患者に、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックを投与することを含む、方法。
  15. アラン・ハーンドン・ダドリー疾患を治療することを必要とする対象に、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックを送達することにより、それを実施する方法であって、コードされる遺伝子産物が、ＭＣＴ８タンパク質である、方法。
  16. 肺に対する標的療法のための方法であって、それを必要とする患者に、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックを投与することを含む、方法。
  17. 肺の疾患を治療することを必要とする対象に、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックを送達することにより、それを実施する方法であって、コードされる遺伝子産物が、可溶性Ａｃｅ２タンパク質、抗ＳＡＲＳ抗体、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体、抗インフルエンザ抗体、又は嚢胞性線維症膜貫通タンパク質である、方法。
  18. Ｎ－ｘ－（Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ａ）－（Ｋ／Ｒ）（配列番号４７）モチーフをＡＡＶカプシドに挿入することを含む、インビトロでのＡＡＶ産生細胞の形質導入を増加させるための方法。
  19. 前記産生細胞が、２９３細胞である、請求項１６に記載の方法。
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