ES2876409T3 - Variantes del RLBD y su uso en composiciones para reducir los niveles de colesterol - Google Patents
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Abstract
Un vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr) que presenta un casete de expresión que comprende un gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad humano (RLBDh) modificado, en el cual dicho gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que es resistente a la degradación de RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, en el cual el RLBDh presenta una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7, y en el cual dicho RLBDh modificado comprende: (a) una o más sustituciones de un aminoácido seleccionados entre: N295D, H306G, V307D, N309A, D310N, L318H o L318D, sobre la base de la numeración de SEQ ID NO: 1; y (b) una sustitución de aminoácidos de al menos una de L769R, K809R o C818A, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1.
Description
DESCRIPCIÓN
Variantes del RLBD y su uso en composiciones para reducir los niveles de colesterol
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O EL DESARROLLO SUBVENCIONADO FEDERALMENTE
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del Instituto del Corazón, el Pulmón y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud, P01-HL0594p07-15. El gobierno de los Estados Unidos puede tener determinados derechos sobre la presente invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La Hipercolesterolemia Familiar (HF) es un trastorno codominante autosómico caracterizado por la ausencia del Receptor de Lipoproteínas de Baja Densidad (RLBD); una glicoproteína monocatenaria que contiene 839 aminoácidos en su forma madura. Hussain M. M., et al., Annu Rev Nutr. 1999; 19:141-172. Los pacientes con HF heterocigota (HFHe), de un alelo anormal, presentan elevaciones moderadas de las LBD en plasma y padecen Arteriopatía Coronaria (AC) prematura, mientras que los pacientes con HF homocigota (HFHo) tienen un colesterol en suero alto (LBD-C > 24 mmol/l) que a menudo suele dar lugar a la aparición temprana de una Enfermedad CardioVascular (ECV) potencialmente mortal. Marais AD., Clin Biochem Rev. 2004;25:49-68. Las opciones de tratamiento actuales para reducir el exceso de colesterol en suero incluyen la aféresis de LBD [McGowan MP J Clin Lipidol. 2013;7:S21-26] y el tratamiento con fármacos hipocolesterolemiantes. Hovingh GK, et al., Eur Heart J. 2013;34:962-971. El trasplante ortotópico de hígado puede conducir a una corrección a largo plazo [Raal FJ, 2012; 223:262-268], aunque es asociado con una importante morbilidad y mortalidad relacionada con el tratamiento. Se ha demostrado en modelos preclínicos que la terapia génica dirigida al hígado utilizando vectores de Virus AdenoAsociados (VAA) corrige de forma estable varios trastornos metabólicos, y actualmente se está aplicando en ensayos clínicos para el tratamiento de la hemofilia A y B, la deficiencia de Ornitina TransCarbamilasa (OTC) y la deficiencia de Alfa1-AntiTripsina (A1AT). Wang L., et al., Mol Genet Metab.
2012;105:203-211; Brantly ML, et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU. 2009;106:16363-16368; Nathwani AC, et al., N. Engl. J. Med. 2011;365:2357-2365; Ward NJ, et al., Blood. 2011; 117:798-807]. Recientemente, se ha demostrado la eficacia de la terapia génica mediada por VAA para corregir los niveles de colesterol en suero en modelos de ratón humanizados de HF. Kassim SH, et al., PLoS One. 2010;5:e13424. En estos ratones, la administración sistémica de VAA8 que expresa RLBD humano (VAA8.RLBDh) condujo a una reducción del colesterol a niveles normales el día 7, lo cual se mantuvo durante más de un año y condujo a la regresión de la aterosclerosis preexistente. Sin embargo, la transducción de VAA8.RLBD dependía de la dosis y solo se logró una corrección estadísticamente significativa a una dosis de vector de 1,5 x 1011 CG/kg o superior. Para la terapia génica clínica, la reducción al mínimo de la dosis de vector es fundamental por muchas razones, incluyendo el volumen de inyección de vector, la toxicidad, la respuesta inmunitaria, y las limitaciones de fabricación y de coste de bienes.
Al-Allaf et al. [Int. Arch. Med. 2010; 3; 36] proporcionan una revisión del progreso durante los 18 años previos en la terapia génica para la HF, con énfasis en el desarrollo, el diseño, el rendimiento y las limitaciones de los vectores de transferencia de genes a base de virus utilizados en estudios para mejorar los efectos de la deficiencia de RLBD.
La expresión de RLBD hepático está modulada por múltiples vías dentro de la célula: la transcripción de RLBD está regulada por las proteínas de unión al elemento de respuesta a los esteroles (SREBP, Sterol Response Element Binding Proteins), y los inhibidores de la HMGcoA reductasa (estatinas) activan las SREBP al inhibir la síntesis de colesterol dentro de los hepatocitos [Blumenthal R. S., Am Heart J. 2000; 139:577-583].
Se descubrió una segunda vía de regulación de RLBD, en la que participa la Pro-proteína Convertasa Subtilisina Kexina 9 (PCSK9), basándose en mutaciones genéticas de ganancia de función humanas que provocaban niveles altos de LBD-C [Abifadel M., et al., Nat Genet. 2003;34:154-156] y mutaciones de pérdida de función que provocaban niveles bajos de LBD-C [Cohen J., et al., Nat Genet. 2005;37:161-1653]. La pérdida de la función de PCSK9 se asoció con una reducción del 88 % en la enfermedad cardiovascular y ha conducido al desarrollo de una nueva clase de fármacos hipocolesterolemiantes basados en la inhibición de PCSK9 [Fitzgerald K., et al., Lancet. 2014;383:60-68; Giugliano R. P., et al., Lancet. 2012; 380:2007-2017]. Los pacientes con HF presentan niveles en plasma de PCSK9 significativamente superiores [Raal F., et al., J Am Heart Assoc. 2013;2:e000028]. Gu et al., [J. Lipid Res. 2013; 54; 3345-3357] demostraron la importancia del dominio A precursor del Factor de Crecimiento Epidérmico (FCE-A) del RLBD en la unión de PCSK9, y mostraron que las mutaciones G293H, D299V, L318D y L318H reducían la unión de PCSK9 al RLBD de una manera dependiente del pH.
Zelcher et al. descubrieron una tercera vía de regulación del RLBD, [Zelcher N., et al., Science. 2009; 325:100-104], demostrando la degradación del RLBD por el DIRL (Degradador Inducible del RLBD). Se indujo una E3 ubiquitina ligasa DIRL tras la activación de los Receptores X de1Hígado (RXH) y
posteriormente interactuó con la cola citoplásmica del RLBD en la mediación de la ubiquitinación y la degradación del receptor. Además, el cribado de sujetos con LBD-C bajo identificó mutaciones con pérdida de función en el DIRL que impedían la degradación del RLBD [Sorrentino V., et al., Eur Heart J.
2013;34:1292-1297].
Se necesitan composiciones útiles para reducir eficazmente el colesterol en sujetos, particularmente en aquellos que presentan hipercolesterolemia familiar.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En el presente documento, se desvelan nuevas variantes del receptor de lipoproteínas de baja densidad humano (RLBDh) modificadas genéticamente, que tienen una mayor eficacia en comparación con el RLBD "de tipo silvestre" de la técnica anterior, debido a la resistencia a PCSK9 y/o DIRL. Estas variantes modificadas genéticamente de RLBDh se caracterizan adecuadamente por una afinidad reducida por PCSK9 y/o DIRL, una semivida sistémica aumentada y por ser útiles para reducir el colesterol en comparación con el RLBDh nativo. Estas variantes pueden ser suministradas a sujetos que lo necesiten a través de una serie de vías, y particularmente mediante la expresión in vivo mediada por un vector recombinante tal como un vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr).
La presente invención proporciona, en un aspecto, un vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr) que tiene un casete de expresión que comprende un gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad humano (RLBDh) modificado, en donde dicho gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que es resistente a la degradación de RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, en donde el RLBDh tiene una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7, y en donde dicho RLBDh modificado comprende: (a) una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre: N295D, H306G, V307D, N309A, D310N, L318H o L318D, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1; y (b) una sustitución de aminoácidos de al menos una de L769R, K809R o C818A, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1.
En un aspecto alternativo, la invención proporciona un vector de VAAr que tiene un casete de expresión que comprende un gen RLBDh modificado, en donde dicho gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que es resistente a la degradación de RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y que es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, comprendiendo dicho RLBDh modificado una sustitución de aminoácidos L318D y una sustitución de aminoácidos K809R y/o C818A, basada en la numeración de SEQ ID NO: 1, y en donde el RLBDh tiene una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7.
En otro aspecto alternativo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un RLBDh sintético o recombinante que comprende: (a) una sustitución de aminoácidos en una o más de N295D, H306G, V307D, N309A, D310N, L318H o L318D, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1; y (b) una sustitución de aminoácidos de al menos una de L769R, K809R o C818A, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1, en donde el RLBDh es resistente a la degradación del RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, y en donde el RLBDh tiene una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7.
En algunos ejemplos, los vectores recombinantes desvelados en el presente documento tienen un casete de expresión que comprende el RLBDh modificado. En algunos ejemplos, el casete de expresión comprende un promotor que dirige específicamente la expresión del RLBDh modificado en células hepáticas.
En algunos ejemplos, el VAAr tiene una cápside seleccionada entre VAA8, rh64R1, VAA9 o rh 10. En un ejemplo particular, se proporciona un vector de VAAr que tiene un casete de expresión que comprende un gen RLBDh modificado, en donde dicho gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que comprende una sustitución de aminoácidos L318D. En un ejemplo específico, el RLBDh modificado además comprende una sustitución de aminoácidos K809R y/o C818A. En un ejemplo específico, el vector de VAAr comprende un casete de expresión que comprende un promotor que dirige específicamente la expresión del RLBDh modificado en células hepáticas.
En determinados ejemplos, el gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que tiene tres sustituciones: L318D/K809R/C818a (numeración basada en SEQ ID NO: 1). Pueden seleccionarse otras combinaciones de sustituciones.
En algunos ejemplos, se desvela una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un vector recombinante tal como se describe en el presente documento. También se desvelan métodos para reducir los niveles de colesterol circulante mediante la administración a un sujeto que lo necesite de un vector recombinante descrito en el presente documento que tiene un casete de expresión, en donde dicho casete de expresión además comprende secuencias de control reguladoras las cuales dirigen la expresión de RLBDh modificado en el sujeto.
En otros ejemplos más, se desvelan métodos para aumentar la semivida circulante de un RLBDh, que comprenden modificar el RLBDh en una o más posiciones de aminoácidos (números de posición
basados en SEQ ID NO: 1) seleccionadas entre: N295, H306, V307, N309, D310, L318, L769, K809 y/o C818.
Los vectores recombinantes descritos anteriormente se pueden utilizar en una pauta para tratar la hipercolesterolemia familiar.
Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las FIG. 1A y 1B proporcionan los resultados de la evaluación in vitro de variantes del RLBD que escapan a la regulación de PCSK9h. Se transfectaron plásmidos que expresaban el RLBDh de tipo silvestre o una de las variantes del RLBD simultáneamente con PCSK9h en células HEK293. 24 horas (h) después de la transfección, se pulsaron las células con LBD marcadas con BODIPY™ [Molecular Probes] durante 2 horas y luego se evaluaron mediante citometría de flujo para detectar células positivas en LBD fluorescentes. La FIG. 1A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células positivas en LBD marcadas con BODIPY™ cuando se transfectan simultáneamente con RLBDh o con RLBDh junto con PCSK9h. El experimento fue controlado transfectando células con un plásmido irrelevante (Simulación). La FIG. 1B es un gráfico de barras que muestra el factor de cambio en células positivas para LBD marcadas con BODIPY en las células transfectadas simultáneamente con RLBDh más PCSK9h en relación con las células transfectadas solo con RLBDh. La FIG. 1C es un gráfico de barras que muestra resultados in vivo de un modelo de ratón que expresa RLBDm. Los resultados indican algún nivel de interacción entre PCSK9h y RLBDm.
Las FIG. 2A-2C proporcionan los resultados de un estudio que muestra que la sobreexpresión in vivo de PCSK9h conduce a un aumento del colesterol en suero en animales que recibieron dosis de RLBDh de tipo silvestre. Se administraron a ratones doblemente nuligénicos (DKO, Double Knock-Out) r Lb D^, APOBEC-1^ (APOlipoprotein B mRNA Editing enzyme, Catalytic polypeptide-like, enzima editora de la apolipoproteína B mediante ARNm semejante al polipéptido catalítico) (n = 4/grupo) por vía intravenosa una dosis de 5 x 1010 CG de vector VAA8.TBG.RLBDh o VAA8.TBG.RLBDh junto con 5 x 1010 CG de vector VAA9.PCSK9h. Se analizó el suero de los animales antes y 30 días después de la administración del vector para determinar el colesterol total en suero y el colesterol de LAD. Los niveles de colesterol no LAD se determinaron restando el componente LAD del colesterol total. La FIG. 2A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de cambio en el día 30 de colesterol en suero no LAD en relación con los niveles basales en animales que recibieron RLBDh con o sin PCSK9h. La FIG.
2B es un gráfico lineal que muestra el curso temporal de la expresión de PCSK9h en suero de ratones que recibieron RLBDh o RLBDh más PCSK9h. La expresión de PCSK9h se evaluó utilizando un ELISA de tipo sándwich. También se muestran en el gráfico los niveles medios de PCSK9h de referencia informados en seres humanos. La FIG. 2C es una inmunotransferencia de la expresión de RLBDh en ratones tratados con RLBDh o RLBDh con PCSK9h. Se sometieron a electroforesis lisados hepáticos totales de dos animales representativos por grupo en un gel de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, dodecilsulfato de sodio) en gradiente del 4-12 % y se sondaron con un anticuerpo policlonal de cabra anti-RLBDh policlonal. Se utilizó la expresión de tubulina de ratón como control de carga. Todos los valores se expresan como la media ± ETM. ***p < 0,001.
Las FIG. 3A y 3B ilustran que los ratones transducidos con RLBDh-L318D son resistentes a la regulación mediada por PCSK9h. Se transdujeron ratones DKO (n = 4/grupo) con 5 x 1010 CG de VAA8.RLBDh o RLBDh-L318D junto con 5 x 1010 CG de AA9.PCSK9h. Se evaluó el colesterol total y el colesterol de LAD en suero de animales antes y 30 días después de la administración del vector. La FIG. 3A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de cambio en los niveles de colesterol en suero no LAD del día 30 en relación con la administración previa al vector en ratones DKO que recibieron RLBDh o RLBDh-L318D, junto con PCSK9h. La FIG. 3B muestran lisados hepáticos totales de dos animales por grupo los cuales se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida) al 4-12 % y se sondaron para la expresión de RLBDh. Se utilizó la expresión de tubulina de ratón como control de carga. Todos los valores son expresados como la media ± ETM. ***p < 0,001. ns p > 0,05.
Las FIG. 4A-4D ilustran que VAA8.RLBDh-K809R\C818A escapa a la regulación in vivo mediada por DIRLh. Se transfectaron células HEK293 transitoriamente con plásmidos que expresaban RLBDh o RLBDh-K809R\C818A junto con DIRLh. 24 h más tarde, se pulsaron las células con LBD marcadas con BODIPY durante 2 horas y luego se evaluó la captación de LBD fluorescentes utilizando un citómetro de flujo. La FIG. 4A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células positivas en LBD marcadas con BODIPY™ transfectadas con RLBDh
o RLBDh-K809R\C818A junto con DIRLh. La FIG. 4B es un gráfico lineal que muestra datos de ratones con HF heterocigota (HFHe) Tg-hApoB100 (LAHB) RLBD+/-, Apobec-/-, (n = 4) que recibieron sistémicamente 1 x 1011 CG del vector VAA9hPCSK9. Evolución temporal de los niveles de colesterol no LAD tras la administración del vector. La FIG. 4C es un gráfico de barras que muestra ratones DKO con HF homocigota (HFHo) (n = 4\grupo) que recibieron sistémicamente 3 x 109 CG VAA8.RLBDh o VAA8.RLBDh-K809R\C818A, junto con 5 x 1010 CG de VAA9.DIRLh. Se evaluó el suero de animales antes y 30 días después de la administración del vector para detectar el colesterol total en suero. Porcentaje de cambio en los niveles de no LAD en suero a los 30 días en relación con los niveles basales antes de la administración. Todos los valores se expresan como la media ± ETM. ***p < 0,0001. *p < 0,05. ns p > 0,05. La FIG. 4D proporciona los lisados celulares totales de las células transfectadas (FIG. 4A) sometidas a electroforesis en un gel de SDS al 4-12 % y sondadas utilizando un anticuerpo anti-RLBDh. Se muestra la ubicación de las formas maduras (M) y procesadas (P) de RLBd junto con el control de carga de tubulina.
Las FIG. 5A-5B ilustran la variante VAA8.RLBDh-L318D\K809R\C818A que codifica tres sustituciones de aminoácidos, que escapa a la regulación mediada tanto por PCSK9 como por DIRL. La FIG. 5A ilustra los resultados de un estudio en el que se inyectaron a ratones DKO (n = 4) por vía intravenosa 3 x 109 CG de RLBDh o RLBDh-L318D\K809R\C818A. Grupos adicionales de ratones también recibieron una administración simultánea de VAA9.DIRLh. Los niveles de colesterol total en suero se evaluaron antes y 30 días después de la administración del vector. Porcentaje de reducción del colesterol no LAD en relación con el valor basal. Se sometieron a electroforesis lisadoshepáticos totales de 2 animales representativos por grupo en un gel de SDS-PAGE y se sondaron utilizando un anticuerpo anti-RLBDh junto con tubulina como control de carga. La FIG. 5B ilustra los resultados tras la administración de VAA8.RLBDh (5 x 1010 CG) o RLBDh-L318D\K809R\C818A junto con VAA9.PCSK9h (5 x 1010 CG). Se muestra el porcentaje de reducción del colesterol no LAD en el día 30 con respecto al valor basal junto con una inmunotransferencia de la expresión de RLBDh en hígados. n ***p <0,001. La FIG. 6 es un gráfico de barras que ilustra la actividad de RLBDh de variantes que escapan a la regulación de PCSK9 en ratones DKO. Se inyectaron a ratones DKO (n = 4/grupo) 3 x 1010 CG de vectores VAA8.TBG.RLBDh o VAA8 que expresaban una de las nueve variantes de escape de PCSK9h. El suero de los animales fue analizado antes y 30 días después de la administración del vector, y se muestra el porcentaje de reducción del colesterol no LAD el día 30 en comparación con el valor basal junto con la DT.
La FIG. 7 es un gráfico de barras que ilustra que VAA.RLBDh supera la inhibición mediada por DIRLh cuando se administra a dosis superiores. Se administraron a ratones DKO (n = 4/grupo) 5 x 1010 CG de VAA8.TBG.RLBDh o VAA8.TBG.RLBDh-K809R\C818A. Grupos adicionales de ratones recibieron RLBDh junto con 5 x 1010 CG de VAA9.TBG.DIRLh. Se muestra el porcentaje de los niveles de colesterol no LAD en el día 30 en comparación con el valor basal junto con la DT.
La FIG. 8 es un gráfico de barras que ilustra la actividad de RLBDh de variantes que escapan a la regulación de PCSK9 en un modelo de ratón doblemente nuligénico RLBD-/-, ApoBec-/-. Se inyectaron a ratones DKO (n = 5/grupo) (vena de la cola) 5 x 1010 CG de vectores VAA8.TBG.RLBDh o VAA8 que expresaban una de las nueve variantes de escape de PCSK9h junto con 5 x 1010 CG de vectores VAA9.TBG.PCSK9h. El suero de los animales se analizó antes y 30 días después de la administración de los vectores. Se muestra el porcentaje de reducción del colesterol no LAD al día 30 en comparación con el valor basal junto con la DT. Los ratones de control solo recibieron el vector d E RLBD sin la administración simultánea de PCSK9 (barras a la izquierda en cada par).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las nuevas variantes del receptor de lipoproteínas de baja densidad humano (RLBDh) diseñadas en el presente documento se caracterizan por una mayor semivida y una mayor eficacia en la reducción de los niveles de colesterol en comparación con el RLBDh nativo debido, al menos en parte, a su capacidad para evitar sustancialmente la degradación por la pro-proteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) y/o evitar sustancialmente la degradación por el degradador inducible de RLBD (DIRL).
Se escriben el suministro de estas variantes a sujetos que lo necesiten a través de varias vías, y particularmente mediante la expresión in vivo mediada por un vector recombinante tal como un vector de VAAr. También se proporcionan métodos para utilizar estas variantes en regímenes de reducción de los niveles de colesterol en sujetos que lo necesitan, tratamiento de la hipercolesterolemia familiar, tratamiento de la aterosclerosis, reducción del riesgo de arteriopatía coronaria prematura y/o reducción de la aparición temprana de la enfermedad cardiovascular. Ventajosamente, las composiciones proporcionadas en el presente documento son útiles para dirigirse simultáneamente a múltiples vías de estos tratamientos y pautas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión hipercolesterolemia familiar (HF) se refiere a un trastorno genético del metabolismo de los lípidos. Salvo que se indique lo contrario en el presente documento, tanto los sujetos con HF homocigota (HFHo) como los sujetos con HF heterocigota (HFHe) están comprendidos dentro del término HF.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "reducción de los niveles de colesterol" puede abarcar la reducción de los niveles de colesterol en suero y/o la reducción de los niveles de lipoproteínas de baja densidad (p. ej., en plasma). El tratamiento de la aterosclerosis puede incluir la reducción del número y/o el volumen de placas y/o la prevención de la acumulación adicional de placas ateroscleróticas.
La secuencia de aminoácidos del RLBDh de tipo silvestre maduro (isoforma 1) es reproducido en el presente documento como SEQ ID NO: 1 por conveniencia, y proporciona una referencia para la numeración de las variantes de aminoácidos proporcionadas en el presente documento. Mientras que la numeración de secuencia proporcionada en el presente documento se refiere a la proteína RLBDh madura (una glicoproteína monocatenaria de 839 aminoácidos), se entenderá que se puede utilizar la secuencia líder de RLBDh de tipo silvestre (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 2) o se puede seleccionar una secuencia líder heteróloga para usar en las construcciones descritas en el presente documento. Además, u opcionalmente, una o más de las otras isoformas 2, 3, 4, 5 y 6 de RLBDh, cuyas secuencias están disponibles, p. ej., en http://www.uniprot.org/uniprot/P01130, y las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento pueden incorporarse a estas isoformas (véanse también, SEQ ID NO: 3-7, donde las secuencias de estas isoformas son reproducidas por conveniencia). En las siguientes descripciones, las sustituciones se pueden escribir como (primer aminoácido identificado por un código de una sola letra)-posición del resto n.°-(segundo aminoácido identificado por un código de una sola letra), en donde el primer aminoácido es el aminoácido sustituido y el segundo aminoácido es el aminoácido de sustitución en la posición especificada con referencia a la isoforma 1; sin embargo, mediante etapas de alineación convencionales, los restos de aminoácidos correspondientes identificados en el presente documento con respecto a la numeración de la isoforma 1 pueden ubicarse en las otras isoformas o proteínas RLBDh identificadas en el presente documento.
La expresión "sustitución de aminoácidos" y sus sinónimos descritos anteriormente pretenden abarcar la modificación de una secuencia de aminoácidos mediante la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido de sustitución. La sustitución puede ser una sustitución conservativa. También puede ser una sustitución no conservativa. El término "conservativa", al referirse a dos aminoácidos, pretende significar que los aminoácidos comparten una propiedad común reconocida por un experto en la materia. Por ejemplo, aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas no ácidas, aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas ácidas, aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófilas no ácidas, aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófilas ácidas y aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófilas básicas. Las propiedades comunes también pueden ser los aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas, aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas alifáticas, aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas aromáticas, aminoácidos con cadenas laterales polares neutras, aminoácidos con cadenas laterales cargadas eléctricamente, aminoácidos con cadenas laterales ácidas cargadas eléctricamente y aminoácidos con cadenas laterales básicas cargadas eléctricamente. En la técnica, se conocen tanto los aminoácidos de origen natural como los de origen no natural, y se pueden utilizar como aminoácidos de sustitución en realizaciones. Los métodos para reemplazar un aminoácido son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, pero sin limitación, mutaciones de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos. La referencia a "uno/a o más" en el presente documento pretende abarcar las realizaciones individuales de, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 o más.
Como se describe en el presente documento, las variantes de RLBDh proporcionadas en el presente documento están modificadas genéticamente para reducir la característica de degradación por parte de la PCSK9 del RLBD de tipo silvestre. En un ejemplo, la variante es un RLBD humano que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 318, en la cual se modifica la leucina (Leu) nativa. En un ejemplo, la L318 se modifica a histidina (His, H). Sin embargo, se pueden realizar otras sustituciones (p. ej., una L318D) en esta posición. Como alternativa o adicionalmente, se pueden seleccionar otras variantes de RLBDh resistentes a la degradación de PCSK9 entre las identificadas en el presente documento. Estas pueden incluir, p. ej., sustituciones de N295, H306, V307, N309 y/o D310 (números de posición basados en SEQ ID NO: 1). Son conocidos en la técnica métodos para determinar la resistencia a la degradación por PCSK9 y/o determinar el aumento de la semivida circulante en comparación con el RLBDh de tipo silvestre y, en los ejemplos siguientes, se ilustra al menos uno de estos ensayos.
Adicionalmente, las variantes de RLBD resistentes a PCSK9 descritas en el presente documento se pueden modificar genéticamente adicionalmente para que incluyan resistencia a la degradación por DIRL. Las sustituciones adecuadas para conferir esta característica incluyen sustituciones en la posición K796 (abreviado K6 en la lista de secuencias), K809 y C818. Las sustituciones ilustradas en el presente
documento son K809R y C818A. Sin embargo, se pueden seleccionar otras sustituciones resistentes a DIRL. Se conocen en la técnica métodos para determinar la resistencia a la degradación por DIRL y/o determinar el aumento de la semivida circulante en comparación con el RLBDh de tipo silvestre y, en los ejemplos siguientes, se ilustra al menos uno de estos ensayos.
Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de RLBDh, las cuales tienen incorporadas una o más de las variantes anteriores, se abarcan dentro de la divulgación. Por ejemplo, se puede utilizar la modificación correspondiente a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las isoformas 2 (SEQ ID NO: 3), isoforma 3 (SEQ ID NO: 4), isoforma 4 (SEQ ID NO: 5), isoforma 5 (SEQ ID NO: 6) e isoforma 7 (SEQ ID NO: 7). Estas isoformas están reproducidas en el listado de secuencias del presente documento. En otro ejemplo, la variante de RLBDh descrita en el presente documento se puede modificar genéticamente para que contenga la secuencia líder de RLBDh. Como alternativa, se puede modificar genéticamente una secuencia líder heteróloga en el extremo N-terminal de la variante de RLBDh. Como alternativa, se pueden seleccionar otras variaciones más que pueden incluir hasta aproximadamente el 5 % de variación (de aproximadamente el 95 % de identidad a aproximadamente el 99,9 % de identidad con la secuencia de la variante, o de aproximadamente el 97 % a aproximadamente el 98 % de identidad) en las variantes de RLBDh proporcionadas en el presente documento (excluyendo la secuencia líder) que conserven una o más de las funciones terapéuticas de las variantes de RLBDh descritas en el presente documento, y que se caracterizan por resistencia a PCSK9 y/o la resistencia a DIRL.
En el apartado de ejemplos de esta descripción, aunque varias construcciones escaparon a la regulación de PCSK9 en el cribado in vitro inicial, los estudios se centraron en la sustitución de aminoácido L318D. Entre las variantes proporcionadas en el presente documento, se ha demostrado que la modificación L318D confiere protección frente a PCSK9 tanto in vitro como in vivo. En los ejemplos proporcionados en el presente documento, L318D (número de posición basado en SEQ ID NO: 1, construcción ilustrativa con secuencia líder en SEQ ID NO: 26) confirió protección tras la expresión hepática en ratones que sobreexpresaban PCSK9 y condujo a una reducción significativa del colesterol en suero; mientras que el RLBD de tipo silvestre fue menos eficiente y más fácilmente degradado por PCSK9.
Como se ilustra en los ejemplos siguientes, el RLBDh con doble mutación K809R/C818A (números de posición basados en SEQ ID NO: 1, construcción ilustrativa con secuencia líder en SEQ ID NO: 36] confirió protección tras la expresión hepática en ratones que expresaban DIRLh y condujo a una reducción significativa del colesterol en suero; mientras que el RLBD de tipo silvestre fue menos eficiente y más fácilmente degradado por DIRL. Por tanto, estos datos establecen que las modificaciones de aminoácidos en el RLBD también pueden superar la supresión in vivo mediada por DIRL. Se espera que los factores que conducen a la degradación de RLBD sean superiores en los sujetos que carecen de expresión del receptor endógeno debido a la falta de un sustrato para eliminar los inhibidores. En el presente documento, se demuestra la utilidad de las variantes de RLBD para superar las vías reguladoras celulares negativas, que se sabe que existe en sujetos con HF. Los hallazgos presentados en el presente documento demuestran por primera vez el uso exitoso de un transgén de "ganancia de función" codificado por VAA en la reducción del colesterol en modelos de ratón humanizados que expresan altos niveles de factores inhibidores lo cual es útil en productos de terapia génica para la HF. Además de las variantes de la proteína RLBDh proporcionadas en el presente documento, se proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican estas variantes de la proteína RLBDh. Las secuencias codificantes para estas variantes pueden generarse utilizando mutagénesis dirigida de la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre. Como alternativa o adicionalmente, se pueden utilizar programas informáticos basados en la web o disponibles en el mercado, así como empresas basadas en servicios para retrotraducir las secuencias de aminoácidos a secuencias codificantes de ácidos nucleicos, incluyendo tanto ARN como/o ADNc. Véase, p. ej., backtranseq de EMBOSS, http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity (http://www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy (http://www.expasy.org/tools/). En un ejemplo, las secuencias codificantes de ARN y/o ADNc están diseñadas para una expresión óptima en células humanas. Las regiones codificantes optimizadas para codones pueden diseñarse mediante varios métodos diferentes. Esta optimización se puede realizar utilizando métodos que están disponibles en línea, métodos publicados o una empresa que proporcione servicios de optimización de codones. Se describe un método de optimización de codones, p. ej., en la solicitud de patente de EE.UU. n.° 61/817.110. Resumiendo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el producto se modifica con secuencias de codones sinónimos. De manera adecuada, se modifica toda la longitud del marco de lectura abierto (ORF, Open Reading Frame) del producto. Sin embargo, en algunos ejemplos, solo se puede alterar un fragmento del ORF. Al utilizar uno de estos métodos, se pueden aplicar las frecuencias a cualquier secuencia polipeptídica dada y producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificante con optimización de codones codificante del polipéptido.
Las expresiones "porcentaje (%) de identidad", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje idéntico" en el contexto de las secuencias de ácido nucleico se refiere a las
bases en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencias puede abarcar la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia que codifica un gen o un fragmento de al menos aproximadamente 500 a 5000 nucleótidos, o lo que se desee. Sin embargo, también se puede desear la identidad entre fragmentos menores, p. ej., de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, generalmente de al menos aproximadamente 20 a 24 nucleótidos, al menos aproximadamente 28 a 32 nucleótidos, al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. También están disponibles múltiples programas de alineación de secuencias para secuencias de ácidos nucleicos. Los ejemplos de dichos programas incluyen, "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP" y "MEME", a los que se puede acceder a través de servidores web en Internet. Los expertos en la materia conocen otras fuentes para dichos programas. Alternativamente, también se utilizan las utilidades Vector NTI. También hay varios algoritmos conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos, incluyendo los contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, se pueden comparar secuencias de polinucleótidos utilizando Fasta™, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta™ proporciona alineaciones y un porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar utilizando Fasta™ con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) como se proporciona en GCG Versión 6.1.
Las expresiones "porcentaje (%) de identidad", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje idéntico" en el contexto de las secuencias de aminoácidos se refiere a los restos de las dos secuencias las cuales son iguales cuando se alinean por correspondencia. El porcentaje de identidad puede ser determinado fácilmente para las secuencias de aminoácidos sobre la longitud completa de una proteína, un polipéptido, aproximadamente 32 aminoácidos, aproximadamente 330 aminoácidos o un fragmento peptídico de los mismos, o las correspondientes secuencias codificantes de secuencias de ácido nucleico. Un fragmento de aminoácidos adecuado puede tener al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud y puede tener hasta aproximadamente 700 aminoácidos. Generalmente, cuando se hace referencia a la "identidad", "homología" o "similitud" entre dos diferentes secuencias, la "identidad", "homología" o "similitud" es determinada con referencia a secuencias "alineadas". Las secuencias "alineadas" o "alineaciones" se refieren a múltiples secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de proteínas (aminoácidos), que contienen con frecuencia correcciones para bases o aminoácidos ausentes o adicionales en comparación con una secuencia de referencia. Las alineaciones se realizan utilizando cualquiera de diversos programas de alineación de múltiples secuencias disponibles pública o comercialmente. Están disponibles programas de alineación de secuencias para secuencias de aminoácidos, p. ej., los programas "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAK-ER", "MEME" y "Match-Box". Generalmente, cualquiera de estos programas es utilizado con la configuración predeterminada, aunque un experto en la materia puede modificar esta configuración según sea necesario. Como alternativa, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione al menos el nivel de identidad o alineación que proporcionan los algoritmos y programas a los que se ha hecho referencia. Véase, p. ej., J. D. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999).
En un ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las variantes de RLBDh (p. ej., gen variante de RLBD) descritas en el presente documento se modifican genéticamente a cualquier elemento genético adecuado, p. ej., ADN desnudo, fago, transposón, cósmido, moléculas de ARN (p. ej., ARNm), episoma, etc., que transfiere las secuencias de RLBDh transportadas encima a una célula hospedadora, p. ej., para generar nanopartículas que transporten ADN o ARN, vectores víricos en una célula hospedadora de empaquetamiento y/o para el suministro a células hospedadoras en un sujeto. En un ejemplo, el elemento genético es un plásmido. El elemento genético seleccionado puede suministrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, suministro en liposomas, técnicas de fusión de membranas, microgránulos recubiertos con ADN de alta velocidad, infección vírica o fusión de protoplastos. Los métodos utilizados para crear dichas construcciones son conocidos por los expertos en la manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véanse, p. ej., Green y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). Como se utiliza en el presente documento, un "casete de expresión" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias codificantes de variantes del RLBDh, promotor y puede incluir otras secuencias reguladoras para el mismo, casete que se puede modificar genéticamente en un elemento genético y/o empaquetar en la cápside de un vector vírico (p. ej., una partícula vírica). Normalmente, dicho casete de expresión para generar un vector vírico contiene las secuencias de RLBDh descritas en el presente documento flanqueadas por señales de empaquetamiento del genoma vírico y otras secuencias de control de la expresión tales como las descritas en el presente documento.
El casete de expresión normalmente contiene una secuencia promotora como parte de las secuencias de control de la expresión. El plásmido y el vector ilustrativos descritos en el presente documento utilizan la globulina de unión a la tiroxina (TBG, Thyroxin Binding Globulin) promotora específica del hígado. Como alternativa, se pueden utilizar otros promotores específicos del hígado [véase, p. ej., la base de datos de promotores de genes específicos del hígado, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD. alfa 1 anti-tripsina (A1AT); albúmina humana, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997), humAlb; y promotor central del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996)]. Se pueden utilizar potenciador/promotor mínimo de TTR, promotor de alfa-antitripsina, LSP (845 nt)25 (requiere VAAac con menos intrones). Aunque son menos deseables, otros promotores, tales como promotores víricos, promotores constitutivos, promotores regulables [véase, p. ej., documentos WO 2011/126808 y WO 2013/04943] o un promotor sensible a señales fisiológicas en los vectores descritos en el presente documento.
Además de un promotor, un casete de expresión y/o un vector puede/n contener otras secuencias adecuadas de inicio, terminación y potenciadoras de la transcripción, señales de procesamiento del ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que mejoran la secreción del producto codificado. Los ejemplos de secuencias de poliA adecuadas incluyen, p. ej., SV40, hormona del crecimiento bovino (HCb) y TK poliA. Los ejemplos de potenciadores adecuados incluyen, p. ej., el potenciador de alfa fetoproteína, el promotor/potenciador mínimo de TTR, LSP (promotor de globulina de unión a TH/alfa1-microglobulina/potenciador de bikunina), entre otros.
Estas secuencias de control están "unidas operativamente" a las secuencias de genes de RLBDh. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "unidas operativamente" se refiere tanto a las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés como a las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.
El casete de expresión se puede modificar genéticamente sobre un plásmido el cual se utiliza para la producción de un vector vírico. Las secuencias mínimas necesarias para empaquetar el casete de expresión en una partícula vírica de VAA son las ITR (Inverted Terminal Repeats, repeticiones terminales invertidas) 5' y 3' de VAA, que pueden ser del mismo origen de VAA que la cápside o de un origen de VAA diferente (para producir un pseudotipo de VAA). En un ejemplo, se utilizan las secuencias de ITR de VAA2 o la versión delecionada de las mismas (AITR), por conveniencia y para acelerar la aprobación reguladora. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otras fuentes de VAA adecuadas. Cuando la fuente de las ITR sea de VAA2 y la cápside de VAA sea de otra fuente de VAA, el vector resultante puede denominarse pseudotipificado. Normalmente, un casete de expresión para un vector de VAA comprende una 5' ITR de VAA, las secuencias codificantes de RLBDh y cualquier secuencia reguladora, y una 3' ITR de VAA. Sin embargo, pueden ser adecuadas otras configuraciones de estos elementos. Se ha descrito una versión abreviada de 5' ITR, denominada AITR, en la cual se delecionan la secuencia D y el sitio de resolución terminal (trs, terminal resolution site). En otras realizaciones, se utilizan las 5' ITR y 3' de VAA de longitud completa.
La abreviatura "ac" en este contexto se refiere a autocomplementario. "VAA autocomplementario" se refiere a un plásmido o vector que tiene un casete de expresión en el que se ha diseñado una región codificante portada por una secuencia de ácido nucleico de VAA recombinante para formar un molde de ADN bicatenario intramolecular. Tras la infección, en lugar de esperar a la síntesis mediada por células de la segunda cadena, las dos mitades complementarias de VAAac se asociarán para formar una unidad de ADN bicatenario (ADNbc) que está lista para la replicación y transcripción inmediatas. Véanse, p. ej., DM McCarty et al., "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (agosto de 2001), Vol 8, Número 16, páginas 1248-1254. Se describen VAA autocomplementarios en, p. ej., las patentes de EE.UU. n.° 6.596.535; 7125717; y 7.456.683.
Un vector vírico de virus adenoasociado (VAA) es una partícula de VAA resistente a ADNasa que tiene una cápside de proteína VAA en la cual se empaquetan secuencias de ácido nucleico para su suministro a las células diana. Una cápside de VAA se compone de 60 subunidades proteicas de la cápside, VP1, VP2 y VP3, que están dispuestas en una simetría icosaédrica en una proporción de aproximadamente 1:1:10 a 1:1:20, dependiendo del VAA seleccionado. Los serotipos de v Aa pueden ser seleccionados como fuentes para las cápsides de los vectores víricos de VAA (partículas víricas resistentes a DNasa) que incluyen, p. ej., VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA6.2, VAA7, VAA8, VAA9, rh10, VAArh64R1, VAArh64R2, rh8 [véase, p. ej., la solicitud de patente publicada de EE.UU. n.° 2007-0036760-A1; la solicitud de patente publicada de EE.UU. n.° 2009-0197338-A1; EP 1310571]. Véanse también el documento WO 2003/042397 (VAA7 y otros VAA de simio), la patente de EE. UU. n.° 7790449 y la patente de EE. UU. n.° 7282199 (VAA8), los documentos WO 2005/033321 y US 7.906.111 (VAA9), y WO 2006/110689] y rh10 [documento WO 2003/042397] o aún por descubrir, o un VAA
recombinante basado en los mismos, puede utilizarse como fuente de la cápside de VAA. Estos documentos también describen otros VAA que pueden seleccionarse para generar VAA. En algunos ejemplos, se puede generar una tapa de VAA para usar en el vector vírico mediante mutagénesis (es decir, mediante inserciones, deleciones o sustituciones) de una de las cápsulas de VAA anteriormente mencionadas o su ácido nucleico codificante. En algunos ejemplos, la cápside de VAA es quimérica, comprendiendo dominios de dos o tres o cuatro o más de las proteínas de la cápside de VAA mencionadas anteriormente. En algunos ejemplos, la cápside de VAA es un mosaico de monómeros Vp1, Vp2 y Vp3 de dos o tres VAA diferentes o VAA recombinantes. En algunos ejemplos, una composición de VAAr comprende más de una de las cápsides mencionadas anteriormente.
Para empaquetar un casete de expresión en viriones, las ITR son los únicos componentes del VAA requeridos en cis en la misma construcción que el gen. En un ejemplo, se eliminan las secuencias codificantes para la replicación (rep) y/o la cápside (cap) del genoma de VAA y se suministran en trans o mediante una estirpe celular de empaquetamiento para generar el vector de VAA. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, un VAA pseudotipado puede contener ITR de una fuente que difiera de la fuente de la cápside de VAA. Adicionalmente o como alternativa, se puede utilizar una cápside quimérica de VAA. Pueden seleccionarse otros componentes más de VAA. Las fuentes de tales secuencias de VAA se describen en el presente documento y también pueden aislarse u obtenerse de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la colección americana de cultivos tipo, Manassas, VA). Como alternativa, las secuencias de VAA pueden obtenerse a través de medios sintéticos u otros adecuados por referencia a secuencias publicadas tales como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, p. ej., GenBank®, PubMed® o similares.
Se conocen en la técnica métodos para generar y aislar vectores víricos de VAA adecuados para su suministro a un sujeto. [Véase, p. ej., patente de EE.UU. n.° 7790449; patente de EE.UU. n.° 7282199; la patente WO 2003/042397; las patentes WO 2005/033321, WO 2006/110689; y US 7588772 B2]. En un sistema, se transfecta de forma transitoria una estirpe celular productora con una construcción que codifica el transgén flanqueado por ITR y una construcción o construcciones que codifican rep y cap. En un segundo sistema, se transfecta de forma transitoria una estirpe celular de empaquetamiento que proporciona de forma estable rep y cap con una construcción que codifica el transgén flanqueado por las ITR. En cada uno de estos sistemas, se producen viriones de VAA en respuesta a la infección por adenovirus auxiliar o herpesvirus, lo que requiere la separación de los VAAr del virus contaminante. Más recientemente, se han desarrollado sistemas que no requieren infección con virus auxiliares para recuperar el VAA, las funciones auxiliares necesarias (es decir, adenovirus E1, E2a, VA y E4 o herpesvirus UL5, UL8, UL52 y UL29 y polimerasa de herpesvirus) también son suministradas, en trans, por el sistema. En estos sistemas más nuevos, las funciones auxiliares se pueden suministrar mediante transfección transitoria de las células con construcciones que codifican las funciones auxiliares necesarias o las células se pueden modificar genéticamente para que contengan de manera estable genes codificantes de las funciones auxiliares, cuya expresión se puede controlar a nivel transcripcional o postranscripcional. En otro sistema más, el transgén flanqueado por ITR y los genes rep/cap son introducidos en células de insecto mediante infección con vectores basados en baculovirus. Para revisiones de estos sistemas de producción, véase, en general, p. ej., Zhang et al., 2009, "Adenovirusadeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production", Human Gene Therapy 20:922-929. También se describen métodos de fabricación y uso de estos y otros sistemas de producción de VAA en las siguientes patentes de EE.UU. n.°: 5139941; 5741683; 6057152; 6204059; 6268213; 6491907; 6660514; 6951753; 7094604; 7172893; 7201898; 7229823; y 7.439.065. Véase, en general, p. ej., Grieger y Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications", Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology", J. Gene Med.
10:717-733; y las referencias citadas a continuación. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por aquellos expertos en la manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véanse, p. ej., Green y Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). De manera similar, son bien conocidos los métodos para generar viriones de VAAr, y la selección de un método adecuado no es una limitación de la presente invención. Véase, p. ej., K. Fisher et al., (1993) J. Virol., 70:520-532 y la patente de EE.UU. n.° 5.478.745.
Opcionalmente, los genes de RLBDh descritos en el presente documento se pueden suministrar mediante vectores víricos distintos de VAAr. Dichos otros vectores víricos pueden incluir el uso de cualquier virus adecuado para terapia génica, incluyendo, pero sin limitación, adenovirus; virus del herpes; lentivirus; retrovirus; etc. De manera adecuada, cuando se genera uno de estos otros vectores, se produce como un vector vírico de replicación defectuosa.
Un "virus de replicación defectuosa" o "vector vírico" se refiere a una partícula vírica sintética o artificial en la que un casete de expresión que contiene un gen de interés está empaquetado en una cápside o envoltura vírica, donde cualquier secuencia genómica vírica empaquetada también dentro de la cápside
o envoltura vírica es deficiente en replicación; es decir, no puede generar viriones descendientes, pero conservan la capacidad de infectar células diana. En un ejemplo, el genoma del vector vírico no incluye genes que codifican las enzimas necesarias para la replicación (el genoma puede modificarse para que sea "dependiente de auxiliar", que contiene solo el transgén de interés flanqueado por las señales necesarias para la amplificación y el empaquetamiento del genoma artificial), pero estos genes pueden suministrarse durante la producción. Por lo tanto, se considera seguro para su uso en terapia génica, ya que la replicación y la infección por viriones descendientes no pueden ocurrir excepto en presencia de la enzima vírica necesaria para la replicación.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento están diseñadas para su administración a sujetos que lo necesiten mediante cualquier vía adecuada o una combinación de diferentes vías. El suministro directo al hígado (opcionalmente por vía intravenosa, a través de la arteria hepática o por trasplante), vía oral, inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y otras vías de administración parenteral. Los vectores víricos descritos en el presente documento pueden suministrarse en una sola composición o en múltiples composiciones. Opcionalmente, se pueden suministrar dos o más VAA diferentes, o múltiples virus [véanse, p. ej., los documentos WO 2011/126808 y WO 2013/049493]. En otro ejemplo, múltiples virus pueden contener diferentes virus de replicación defectuosa (por ejemplo, VAA y adenovirus).
Los virus de replicación defectuosa pueden ser formulados con un vehículo fisiológicamente aceptable para usar en aplicaciones de transferencia génica y terapia génica. En el caso de los vectores víricos de VAA, se puede utilizar la cuantificación de las copias del genoma ("CG") como la medida de la dosis contenida en la formulación. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para determinar el número de copias del genoma (CG) de las composiciones de virus de replicación defectuosa descritas en el presente documento. Un método para realizar la valoración numérica de CG del VAA es el siguiente: Primero se tratan las muestras de vector de VAA purificadas con DNasa para eliminar el ADN del genoma de VAA no encapsulado o el ADN plasmídico contaminante del proceso de producción. Las partículas resistentes a la DNasa se someten después a un tratamiento térmico para liberar el genoma de la cápside. Después, los genomas liberados se cuantifican mediante PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real utilizando conjuntos de cebadores/sondas que se dirigen a una región específica del genoma vírico (habitualmente señal de poli A).
Asimismo, las composiciones de virus de replicación defectuosa se pueden formular en unidades de dosificación para contener una cantidad de virus de replicación defectuosa que se encuentre en el intervalo de aproximadamente 1,0 x 109 CG a aproximadamente 1,0 x 1015 CG (para tratar a un sujeto medio de 70 kg de peso corporal) y, preferentemente, de 1,0 x 1012 CG a 1,0 x 1014 CG para un paciente humano. En otro ejemplo, la dosis es inferior a aproximadamente 1,5 x 1011 CG/kg. Por ejemplo, la dosis de virus VAA puede ser de aproximadamente 1 x 109 CG, aproximadamente 5 x 109 CG, aproximadamente 1 x 1010 CG, aproximadamente 5 x 1010 CG o aproximadamente 1 x 1011 CG. En otro ejemplo, las variantes se pueden suministrar en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 10 mg/kg.
Los vectores recombinantes descritos anteriormente se pueden suministrar a células hospedadoras de acuerdo con métodos publicados. El VAAr, preferentemente suspendido en un vehículo fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto mamífero humano o no humano. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente vehículos adecuados a la vista de la indicación para la que se dirija el virus de transferencia. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye solución salina, que puede formularse con diversas soluciones tamponantes (p. ej., solución salina tamponada con fosfato). Otros vehículos ilustrativos incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del vehículo no es una limitación de la presente invención.
Opcionalmente, las composiciones descritas en el presente documento pueden contener, además del VAAr y/o variantes y uno o más vehículos, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizantes químicos. Los conservantes a modo de ejemplo adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
Los vectores víricos y otras construcciones descritas en el presente documento se pueden utilizar en la preparación de un medicamento para suministrar una variante de RLBD a un sujeto que lo necesite, para suministrar una variante de RLBD que tiene una semivida aumentada a un sujeto y/o para tratar niveles elevados de colesterol, lipoproteínas de alta densidad (LAD) elevadas, triglicéridos elevados, hipercolesterolemia familiar, aterosclerosis, arteriopatía coronaria, enfermedad cardiovascular y/u otro trastorno metabólico de lipoproteínas.
Un ciclo de tratamiento puede implicar opcionalmente la administración repetida del mismo vector vírico (p. ej., un vector de v AA8) o un vector vírico diferente (p. ej., un VAA8 y un VAArh10). Se pueden seleccionar otras combinaciones más utilizando los vectores víricos descritos en el presente documento. Opcionalmente, la composición descrita en el presente documento se puede combinar en una pauta que implique otros fármacos anti-lípidos (p. ej., estatinas, anticuerpos monoclonales, etc.) o terapias a base de proteínas (que incluyen, p. ej., el suministro de una composición que contiene una o más variantes de RLBD como se describe en el presente documento).
Cabe señalar que el término "un" o "uno/a" se refiere a uno/a o más. Así pues, las expresiones "un" (o "uno/a"), "uno/a o más" y "al menos uno/a" se usan indistintamente en el presente documento.
Las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" deben interpretarse de manera inclusiva en lugar de excluyente. Las palabras "consistir", "que consiste" y sus variantes, deben interpretarse de manera excluyente, en lugar de inclusiva. Aunque se presentan diferentes ejemplos en la memoria descriptiva que utilizan la expresión "que comprende", en otras circunstancias, también se pretende que una realización relacionada también sea interpretada y descrita usando la expresión "que consiste en" o "que consiste esencialmente en".
Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" significa una variabilidad del 10 % con respecto a la referencia dada, a menos que se especifique lo contrario.
El término "regulación" o las variaciones del mismo, como se usan en el presente documento, se refieren a la capacidad de una composición para inhibir uno o más componentes de una vía biológica.
Un "sujeto" es un mamífero, p. ej., un ser humano, ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo o primate no humano, tal como un mono, chimpancé, babuino o gorila.
Como se utiliza en el presente documento, "enfermedad", "trastorno" y "afección" se usan indistintamente, para indicar un estado anómalo en un sujeto.
A menos que se definan de otro modo en la presente memoria descriptiva, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la materia y por referencia a textos publicados, que proporcionan a un experto en la materia una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.
Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención.
EJEMPLOS -Ejemplo 1 - Los vectores de VAA que expresan variantes de ganancia de función de RLBD demuestran una mayor eficacia en modelos de ratón de hipercolesterolemia familiar
A. Animales experimentales
Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC) de la Universidad de Pensilvania. Se mantuvieron ratones doblemente nuligénicos (DKO) RLBD^, APOBEC-1'/_ y transgénicos con ApoB100 humana (LAHB) RLBD^, APOBEC-1'A se mantuvieron en la Universidad de Pensilvania. Estos ratones sobreexpresan PCSK9h. La ausencia de expresión de RLBD de ratón endógena en este modelo animal permite la evaluación de la expresión del transgén de RLBDh sin interferencia de RLBD de ratón. La sobreexpresión de PCSK9h se logra administrando simultáneamente un vector de VAA que expresa PCSK9h (VAA9.TBG.PCSK9h), cuya preparación se describe en la Parte C de este Ejemplo.
Se inyectó por vía intravenosa (vena de la cola) a ratones macho de 6-8 semanas de vida vector diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Phosphate Buffered Saline) en un volumen total de 100 pl. Se extrajo suero antes y después de la administración del vector mediante hemorragias retroorbitales. Al final del estudio, se sacrificaron todos los animales y se recogieron los hígados para el análisis de los genomas del vector y la expresión del transgén. Se analizaron muestras de suero de animales para determinar el colesterol total (cT), LBD, LAD y triglicéridos totales (Tg) utilizando un analizador MIRA (Roche). El colesterol no LAD se obtuvo restando los Tg del cT. Se recogieron los hígados de los animales y se homogeneizaron utilizando tampón RIPA. Se sometieron a electroforesis 25 pg de lisado hepático total en un gel de PAGE al 4-12 % y sondas con un anticuerpo policlonal anti-RLBDh.
B. Variantes de RLBD
Los restos de aminoácidos (números de posición basados en SEQ ID NO: 1) dirigidos para mutagénesis fueron los siguientes:
Tabla 1. Sustituciones de aminoácidos e interacción de RLBD-PCSK9 afectada
continuación
Adicionalmente, se seleccionaron sustituciones de aminoácidos, K809R y C818A, en el dominio citoplásmico C-terminal de RLBD que previenen la degradación mediada por DIRL.
C. Vector
El vector AAV8 que expresa ADNc de RLBDh de tipo silvestre a partir de un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG) específico del hígado se ha descrito previamente y se obtuvo del Núcleo de vectores de la Universidad de Pensilvania. Resumiendo, se sometieron células HEK293 a una transfección triple utilizando los plásmidos cis y trans de VAA junto con los plásmidos auxiliares Ad. Se purificaron las partículas de VAA del sobrenadante del cultivo y se cuantificaron utilizando cebadores para la secuencia de poliadenilación de HCb. Se analizaron las preparaciones de vector para determinar la estructura del ADN mediante digestiones de restricción y contaminación por endotoxinas (<20 UE/ml) antes de la inyección en los animales. El ADNc de RLBDh de tipo silvestre fue utilizado como molde para la mutagénesis dirigida para introducir sustituciones de aminoácidos utilizando el kit Quickchange XL (Stratagene) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.
Las secuencias de plásmidos utilizadas para la producción de vectores de VAA como se describe en el presente documento se proporcionan en el listado de secuencias adjunto. Las construcciones de plásmido que tenían el promotor TBG se utilizaron en los estudios con animales (ratones); las que tenían el promotor CB se utilizaron para el cribado in vitro.
Se adquirieron las secuencias de ADNc codificantes de PCSK9h e DIRLh (Origene, MD), se clonaron y se vectorizaron para expresarse a partir de un vector VAA9 detrás de un promotor TBG y una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (HCb). En los estudios que requerían un transgén irrelevante, se utilizó un vector VAA9 que expresaba alfa1-antitripsina humana (A1AT) también expresada a partir de un promotor TBG como control.
Tabla 2.
D. Ensayo de RLBD in vitro
Se transfectaron células HEK 293 que crecían en placas de 6 pocillos durante una noche con plásmidos que expresaban RLBDh junto con PCSK9h o DIRLh. Todos los ADNc se clonaron detrás de un promotor de citomegalovirus (CMV) para obtener la expresión en células HEK293. Las células de control se transfectaron con RLBDh más un plásmido que expresaba un transgén irrelevante (A1AT). En los estudios en los que la dosis de un vector se valoró más baja, se añadió un plásmido irrelevante para garantizar que la cantidad total de plásmido no variara de un pocillo experimental a otro. Al día siguiente, las células se pulsaron con LBD marcadas con BODIPY (Invitrogen) a una concentración de 4 pg/ml. Se extrajeron las células después de 2 horas y se evaluó la captación de LBD fluorescente utilizando un citómetro de flujo (FC500, Beckman Coulter).
E. Ensayos inmunológicos de inmunotransferencia y ligados a enzimas
Se sometieron a electroforesis 50 pg de lisados celulares totales preparados a partir de células o hígados de ratón que expresaban RLBD humano en un mini gel prefabricado con gradiente de 4-12 % (Invitrogen) antes de transferirlos a una membrana de PVDF (Invitrogen). Se utilizó un anticuerpo policlonal de cabra anti-RLBDh (Invitrogen) para sondar la membrana (dilución 1/1000) seguido de un anticuerpo secundario anti-cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Invitrogen). Los niveles de expresión
de PCSK9h en suero de ratón se analizaron utilizando un kit ELISA (R&D) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
F. Análisis estadístico
Todos los experimentos se analizaron utilizando modelos de análisis de varianza unidireccionales con diferencias entre grupos por pares en el nivel medio de colesterol evaluado mediante las pruebas posthoc de Tukey. Sin embargo, para los experimentos de evaluación del efecto de PCSK9 en ratones C57BL/6, se utilizó un modelo lineal de efectos mixtos para evaluar las diferencias entre grupos en el nivel de colesterol teniendo en cuenta la correlación entre las mediciones repetidas en el mismo ratón. De manera similar, el análisis de PCSK9 en RLBDh transducido por VAA se basó en la modelización del análisis de covarianza, con el nivel de colesterol posterior retrocedido al grupo y nivel de colesterol previo. La significancia estadística se tomó al nivel de 0,05 para todos los experimentos.
Resultados
G. Las sustituciones de aminoácidos en RLBDh confieren resistencia a PCSK9
Nueve variantes de RLBD con unión potencialmente disminuida a PCSK9 (N295D, D299N, H306G, V307D, N309A, D310N, L311T, L318D y L318H, véase la Tabla 1, números de posición basados en la numeración de SEQ ID NO: 1) se cribaron inicialmente en células HEK293 utilizando un ensayo in vitro para la captación de LBD marcadas con fluorescencia (LBD marcadas con BODPIY™), en presencia o ausencia de PCSK9h.
Se realizaron estudios en células HEK293 que tenían niveles bajos de expresión endógena de RLBDh y PCSK9h. Como fuente de PCSK9h exógena, las células se transfectaron simultáneamente con un plásmido que expresaba PCSK9h junto con las construcciones de RLBDh. Las células transfectadas simuladas expresaron niveles bajos de RLBD basados en inmunotransferencia que no pudieron detectar la proteína RLBD (datos no mostrados); es más, las células transfectadas simuladas no pudieron demostrar la captación de LBD marcadas con BODIPY™ (FIG. 1A). En cambio, la transfección transitoria de RLBDh de tipo silvestre en células HEK293 condujo a la internalización de LBD marcadas con BODIPY™ en el 30 % de las células, lo cual fue reducido al 18 % cuando se transfectaron simultáneamente con PCSK9h (FIG. 1A). Entre las construcciones mutantes expresadas simultáneamente con PCSK9h, solo las sustituciones de aminoácidos D299N y L311T no proporcionaron ninguna protección a la degradación mediada por PCSK9 en el sentido de que la captación de LBD marcadas con BODIPY™ se redujo en un grado similar al del RLBD de tipo silvestre. Todas las demás sustituciones de aminoácidos ofrecieron diversos grados de protección frente a PCSK9, aunque algunas construcciones fueron menos eficaces en la captación de LBD marcadas con BODIPY™ en ausencia de PCSK9 en comparación con el RLBDh de tipo silvestre. Como ejemplo, aunque las sustituciones L318D y L318H fueron resistentes a la degradación de PCSK9h, solo L318D mostró una captación normal de LBD marcadas con BODIPY™ en ausencia de PCSK9 (FIG. 1B). En cambio, la sustitución de L318H condujo a una actividad del receptor reducida y la captación de LBD marcadas con BODIPY™ fue menor en comparación con el RLBDh de tipo silvestre en ausencia de PCSK9h (30 % frente al 6 %; RLBDh frente a RLBDh-L318H). Por esta razón, se seleccionó el vector RLBDh-L318D para una evaluación adicional in vivo en ratones.
H. La sobreexpresión de PCSK9h en ratones regula negativamente el RLBDh expresado por VAA La evaluación de la actividad de las formas de tipo silvestre y L318D de RLBDh en ratones fue complicada debido a la posible reducción de las interacciones entre la proteína RLBDh exógena y la proteína PCSK9 endógena de ratón. Un modelo de ratón completamente humanizado con el fenotipo HFHo (carente de RLBD y APOBEC-1 en virtud de la interrupción de la línea germinal) y que sobreexpresaba PCSK9h [tras la inyección i.v. de un vector VAA9 que expresa PCSK9h a través del promotor específico del hígado TBG (VAA9.PCSK9h)] (los ratones doblemente nuligénicos (DKO) LDLR-/-, ApoBec-/- descritos en la Parte A de este ejemplo. La expresión del vector VAA9.PCSK9h se evaluó por primera vez en ratones C57BL/6 que recibieron dosis crecientes de PCSK9h. Con vector a dosis alta (es decir, 5 x 1010 CG), el colesterol en suero no LAD aumentó aproximadamente 2,5 veces (p = 0,0015), lo que indica algún nivel de interacción entre PCSK9h y RLBDm. Véase, la FIG. 1C.
Antes de evaluar los efectos de PCSK9h sobre RLBDh derivado del transgén, los ratones DKO HFHo recibieron por inyección VAA8.RLBDh solo. En estos animales, los niveles basales de no LAD en una dieta de pienso fueron de 417 ± 23 mg/dl; que disminuyeron el día 7 tras la administración de 5 x 1010 CG de VAA8.RLBDh. Los niveles de no LAD se estabilizaron y fueron de solo 37 ± 7 mg/dl el día 30, que fue el 9 % de los niveles basales (p = 0,037, FIG. 2A). A continuación, se evaluó el rendimiento de este vector en ratones DKO que expresaban PCSK9h administrando simultáneamente (i.v.) una dosis igual (5 x 1010 CG) de VAA9.PCSK9h junto con VAA8.RLBDh. Tras la administración del vector, los niveles de PCSK9h en suero aumentaron de manera constante y alcanzaron niveles máximos (7500 ± 3000 ng/ml) el día 30 (FIG. 2B). Al mismo tiempo, los niveles de no LAD en ratones transducidos simultáneamente con PCSK9h fueron significativamente más altos (p = 0,0008) en comparación con los animales que solo recibieron RLBDh (FIG. 2A). VAA8.RLBDh redujo el no LAD 10 veces en ausencia de PCSK9h; sin embargo, esta reducción fue solo de 2,5 veces en presencia de PCSK9h. La
inmunotransferencia de lisados hepáticos totales confirmó que la transducción simultánea con PCSK9 dio lugar a una proteína RLBDh reducida en el hígado (FIG. 2C); mientras que los niveles de ARN mensajero de RLBDh permanecieron sin cambios entre los grupos experimentales (datos no mostrados). Estos hallazgos coinciden con el modo de acción informado de PCSK9 para unirse y secuestrar RLBD en un compartimento intracelular que aumenta la degradación del receptor [Wang, et al., J Lipid Res, 2012; 53: 1932-1943]. No se observó reducción en la expresión de RLBDh en animales transducidos simultáneamente con un vector VAA9 que expresaba un transgén irrelevante.
I. La sustitución de aminoácidos RLBD-L318D confiere resistencia humana a la degradación mediada por PCSK9h
Se utilizó una estrategia similar para evaluar la actividad de RLBDh-L318D en ratones DKO con sobreexpresión de PCSK9h y se compararon los resultados con ratones transducidos con RLBDh de tipo silvestre. Como se esperaba, la transducción con RLBDh produjo una reducción drástica del colesterol en suero el día 30 (10 % del valor basal); mientras que la transducción simultánea con PCSK9h produjo una reducción de la actividad de RLBDh con niveles de colesterol no LAD solo del 23 % del valor basal (p <0,0001, FIG. 3 A). En cambio, la sustitución de L318D aparentemente previno la degradación del receptor en el sentido de que las diferencias en los niveles de no LAD entre animales que recibieron RLBDh-L318D o RLBDh-L318D junto con PCSK9h no fueron estadísticamente significativas (10 % frente al 14 %; p = 0,1337). Es más, la inmunotransferencia de hígados recogidos al final del estudio (día 30) reveló que los niveles de proteína RLBDh disminuyeron significativamente solo en animales que recibieron RLBDh de tipo silvestre junto con PCSK9h, pero no en aquellos que recibieron RLBDh solo (FIG. 3B). Sin embargo, los niveles hepáticos de RLBDh-L318D no se vieron afectados por la expresión simultánea con PCSK9h y al igual que lo observado con RLBDh de tipo silvestre en ausencia de PCSK9h (FIG. 3B). Para confirmar que las diferencias observadas no surgieron de cambios en la expresión del ARNm, se analizaron las transcripciones de RLBDh en hígados utilizando un ensayo de PCR cuantitativo. Estos estudios indicaron solo una reducción moderada en los ratones tratados con RLBDh de tipo silvestre que fue sustancialmente menor que la reducción en la proteína RLBDh (FIG. 3B).
J. RLBDh-K809R\C818A escapa a la regulación de DIRLh
La expresión de RLBD también está sujeta a regulación por DIRL; una ubiquitina ligasa E3 regulada transcripcionalmente al alza por los receptores X del hígado (RXH) después de un aumento en las concentraciones intracelulares de oxiesteroles. El DIRL activado interactúa con la región de la cola citoplásmica de RLBD, lo que conduce a la degradación del receptor [Zhang L, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:2541-2546]. Se construyó un vector VAA8 que expresaba RLBDh que contenía las sustituciones de aminoácidos K809R y c 818A (VAA8.RLBDh-K808R\C818A). Esta construcción se evaluó primero en células HEK293 en presencia o ausencia de DIRLh; como fuente de DIRL humano, se expresaron simultáneamente plásmidos que expresaban DIRLh con RLBDh. Como se esperaba, la transfección de RLBDh de tipo silvestre produjo la captación de LBD en el 28 % de las células; sin embargo, la transfección simultánea de DIRLh junto con RLBDh redujo drásticamente las células positivas en LBD a solo un 2 % (FIG. 4A). Las sustituciones de aminoácidos K808R\C818A no afectaron a la actividad del receptor y la construcción RLBD-K809R\C818A fue tan eficaz como el RLBDh de tipo silvestre en la internalización de LBD, en ausencia de DIRL (RLBD frente a RLBD-K809R\C818A, 28 % frente al 22 %). Sin embargo, las diferencias entre las dos construcciones aparecieron cuando se transfectaron simultáneamente con DIRLh. La construcción RLBDh-K809R\C818A fue más resistente a los efectos de DIRLh, lo que produjo que aproximadamente el 14 % de las células captaran LBD fluorescentes en contraposición al 2 % con RLBD de tipo silvestre. La inmunotransferencia de lisados de células completas confirmó además que las diferencias observadas en la captación de LBD se correlacionó con niveles reducidos de proteína RLBDh, y no con RLBDh-K809R\C818A, en presencia de DIRLh (FIG. 4A).
A continuación, se evaluó la actividad de la construcción RLBDh-K809R\C818A en ratones DKO que sobreexpresan DIRL humano. Se creó un fenotipo de ratones que sobreexpresaban DIRL humano en el hígado mediante la administración de un vector VAA9 que expresaba DIRL humano bajo el control de un promotor específico del hígado. En estudios piloto, se evaluó la eficacia de DIRL humano en la regulación de la expresión de RLBD endógeno en ratones administrando (i.v.) 5 x 1010 CG de VAA9.DIRLh a ratones con HF heterocigota para la expresión de RLBD (HFHe). Esta cepa de ratones (ratones LAHB) es deficiente en APOBEC-1, heterocigota para RLBD+/- de ratón y transgénica para ApoB100 humana, conduciendo a un colesterol en suero más alto. Después de la administración de VAA9.DIRLh, los niveles de no LAD aumentaron el día 7 y alcanzaron niveles estables el día 30 (p < 0,0001, FIG. 4B). Estos resultados confirmaron que el DIRLh expresado por VAA era activo en los hígados de ratón y que podía provocar la pérdida de RLBDm endógeno. A continuación, se expresó el efecto de la sobreexpresión de DIRLh sobre RLBDh codificado por vector en ratones DKO. En estudios piloto, solo las administraciones de vector de RLBDh a dosis baja se vieron afectadas significativamente por el DIRL humano; por consiguiente, se administraron simultáneamente a ratones 3 x 109 CG de
VAA8.RLBDh y 5 x 1010 CG de VAA9.DIRLh. A esta dosis baja, los vectores de RLBDh y RLBDh-K809\C818A fueron funcionalmente similares (p = 0,9) e indujeron una reducción moderada (20 % del valor basal) en el colesterol en suero en ausencia de DIRLh (FIG. 4C). Sin embargo, la administración simultánea de DIRLh anuló la actividad de RLBDh de tipo silvestre y no se observó corrección en los niveles de colesterol no LAD los cuales permanecieron en los niveles basales previos al tratamiento (p = 0,0248, FIG. 4C). En cambio, los niveles de colesterol no LAD en ratones que recibieron RLBDh-K809R\C818A en presencia o ausencia de DIRLh fueron similares (p> 0,05), demostrando la resistencia in vivo de las construcciones modificadas a DIRLh (FIG. 4C).
Ejemplo 2: RLBDh-L318D\K809R\C818A evita la regulación tanto por PCSK9 como por DIRL Se clonaron las sustituciones de aminoácidos L318D, K809R y C818A en un solo vector para crear una construcción que fuera resistente a la regulación por ambas vías. Se administró el vector a ratones DKO a dosis baja (3 x 109 CG), al evaluar las mutaciones de escape de DIRL; o a una dosis más alta (5 x 1010 CG), al evaluar la mutación de escape de PCSK9. Cuando se administró en dosis bajas, RLBDh-L318D\K809R\C818A fue comparable al RLBDh de tipo silvestre (p > 0,05) en el sentido de que solo se consiguió una reducción moderada del colesterol en suero tras la administración de cualquiera de los vectores (FIG. 5A). Sin embargo, cuando se administró en presencia de DIRLh, solo el vector mutante mostró alguna resistencia a DIRLh en tanto en cuanto los niveles de colesterol en suero permanecieron significativamente más bajos que los observados en el RLBDh de tipo silvestre más DIRLh (p = 0,0002). La inmunotransferencia de muestras de hígado confirmó que el vector mutante fue más resistente a la degradación mediada por DIRLh (FIG. 5A). En el estudio paralelo en donde se administraron vectores a una dosis más alta junto con PCSK9h, la proteína variante funcionó significativamente mejor en la reducción del colesterol en suero que el RLBD de tipo silvestre de control en ratones que sobreexpresan PCSK9h (p = 0,0007, FIG. 5B). El análisis de inmunotransferencia de hígados demostró una ausencia casi completa de RLBDh de tipo silvestre en presencia de PCSK9h; en cambio, el vector mutante estuvo protegido y fue menos degradado por PCSK9h.
Ejemplo 3 - Comparación de variantes de RLBDh en un modelo de ratón de hipercolesterolemia familiar. Se cribó el panel de RLBDh portadores de sustituciones de un solo aminoácido que se esperaba que evitaran la regulación de PCSK9 mediante la administración a ratones doblemente nuligénicos (DKO) RLBD'A, APOBEC'/_. Los animales recibieron mediante inyección por vía intravenosa (vena de la cola i.v.) 3 x 1010 CG de VAA8.TBG.RLBDh o una de las variantes de RLBDh que se esperaba que evitara la regulación de PCSK9h. La reducción de los niveles en suero de colesterol no LAD se utilizó como sustituto para comparar la actividad del receptor de las diferentes construcciones. Se recogió suero de animales mediante sangrías retroorbitales antes y 30 días después de la administración del vector y se analizaron los niveles de colesterol usando un analizador MIRA (Roche). Los niveles de colesterol no LAD se determinaron restando el componente LAD del colesterol total. La FIG. 6 muestra el porcentaje de reducción de los niveles de no LAD con respecto al valor basal en animales tras la administración del vector.
Este estudio se repitió en las mismas condiciones, a excepción de que el vector se administró a una dosis más alta, es decir, 5 x 1010 CG de VAA8.TBGF.RLBDh para cada una de las variantes (L318D, N295D, H306G, V307D, N309A, D310N, L311T, L318H). La administración de 5 x 1010 CG de RLBDh de tipo silvestre por sí mismo condujo a una reducción del 90 % en los niveles de colesterol no LAD basales (FIG. 8). A excepción de D299N, todas las demás variantes de RLBDh también lograron una reducción similar en el colesterol no LAD. Como se esperaba, la administración simultánea de PCSK9h redujo significativamente la eficacia del vector RLBDh. La sobreexpresión de PCSK9h solo tuvo un efecto mínimo en las variantes, L318D, N295D, H306G, V307D y N309A. Además, la inmunotransferencia de hígados del día 30 confirmó que, a excepción de H306G, estas variantes estaban significativamente protegidas de la degradación (no se muestra). Ejemplo 4 - La administración de altas dosis de VAA.RLBDh evita la inhibición de DIRL in vivo.
Se inyectó a ratones doblemente nuligénicos RLBD'A APOBEC'/_ VAA8.TBG.RLBDh o VAA8.TBG.K809R\C818A a una dosis de 5 x 1010 CG. Adicionalmente, algunos grupos de ratones recibieron simultáneamente una dosis igual de un vector VAA9 que expresaba DIRL humano (VAA9.TBG.DIRLh) para evaluar la actividad de RLBDh en presencia de DIRLh. Los niveles de colesterol no LAD se analizaron antes y 30 días después de la administración del vector. El porcentaje de colesterol no LAD el día 30 en comparación con el valor basal tras la administración del vector se muestra en la FIG. 7.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, se apreciará que se pueden realizar modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
(Texto independiente del listado de secuencias)
La siguiente información es proporcionada para secuencias que contienen texto independiente con el identificador numérico <223>.
Claims (13)
1. Un vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr) que presenta un casete de expresión que comprende un gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad humano (RLBDh) modificado, en el cual dicho gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que es resistente a la degradación de RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, en el cual el RLBDh presenta una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7, y en el cual dicho RLBDh modificado comprende:
(a) una o más sustituciones de un aminoácido seleccionados entre: N295D, H306G, V307D, n 309A, D310N, L318H o L318D, sobre la base de la numeración de SEQ ID NO: 1; y
(b) una sustitución de aminoácidos de al menos una de L769R, K809R o C818A, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1.
2. El vector de VAAr de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una cápside seleccionada entre VAA8, rh64R1, VAA9 o rh10.
3. El vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el cual el casete de expresión comprende un promotor que dirige específicamente la expresión del RLBDh modificado en las células hepáticas.
4. Un vector de VAAr que posee un casete de expresión que comprende un gen RLBDh modificado, en el cual dicho gen RLBDh codifica un RLBDh modificado el cual es resistente a la degradación de RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y que es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, comprendiendo dicho RLBDh modificado una sustitución de un aminoácido L318D y una sustitución de un aminoácido K809R y/o C818A, basada en la numeración de SEQ ID NO: 1, y en el cual el RLBDh tiene una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7.
5. Un vector de VAAr de la reivindicación 4, en el cual el vector comprende una cápside seleccionada entre VAA8, rh64R1, VAA9 o rh10.
6. El vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en el cual el casete de expresión comprende un promotor que dirige específicamente la expresión del RLBDh modificado en las células hepáticas.
7. El vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el cual el gen RLBDh codifica un RLBDh modificado que comprende una sustitución de aminoácidos L318D, K809R y C818A.
8. El vector de VAAr de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual el RLBDh modificado presenta una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.
9. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar en la reducción de los niveles de colesterol circulante en un sujeto que lo necesita, en el cual dicho casete de expresión además comprende unas secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión de RLBDh modificado en el sujeto.
11. Un vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar en el aumento de la semivida circulante de un RLBDh en un sujeto que lo necesita, en el cual dicho casete de expresión además comprende unas secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión de RLBDh modificado en el sujeto.
12. Un vector de VAAr de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar en una pauta para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar.
13. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un RLBDh sintético o recombinante que comprende:
(a) una sustitución de aminoácidos en una o más de N295D, H306G, V307D, N309A, D310N, L318H o L318D, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1; o
(b) una sustitución de aminoácidos de al menos una de L769R, K809R o C818A, basadas en la numeración de SEQ ID NO: 1,
en donde el RLBDh es resistente a la degradación del RLBDh al interferir con la vía PCSK9 y la vía DIRL, y es capaz de reducir el colesterol tras la expresión en un sujeto, y en el cual el RLBDh tiene una identidad del 95 % a una identidad del 99,9 % con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1 y 3-7.
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