ES2970293T3 - Variantes de alfa-glucosidasa ácida y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a variantes de alfa glucosidasa ácida y sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de alfa-glucosidasa ácida y usos de las mismas
La presente invención se refiere a variantes de alfa-glucosidasa ácida (GAA) y usos de las mismas. Dichas variantes están unidas a péptidos señalizadores heterogéneos.
La enfermedad de Pompe, también conocida como enfermedad por almacenamiento de glucógeno (GSD) tipo II y deficiencia de maltasa ácida, es una miopatía metabólica autosómica recesiva causada por una deficiencia de la enzima lisosómica alfa-glucosidasa ácida (GAA). La GAA es una exo-1,4 y 1,6-a-glucosidasa que hidroliza el glucógeno a glucosa en el lisosoma. La deficiencia de GAA conduce a la acumulación de glucógeno en los lisosomas y causa daños progresivos en el músculo respiratorio, cardíaco y esquelético. La enfermedad varía desde un curso infantil rápidamente progresivo que suele ser mortal a los 1-2 años de edad a un curso más lentamente progresivo y heterogéneo que causa una morbilidad significativa y una mortalidad temprana en niños y adultos. Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill); Van der Ploeg y Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008).
La terapia humana actual para tratar la enfermedad de Pompe implica la administración de GAA humana recombinante, también denominada terapia de reemplazo enzimático (TRE). La TRE ha demostrado eficacia en la GSDII infantil grave. Sin embargo, el beneficio de la terapia enzimática está limitado por la necesidad de infusiones frecuentes y el desarrollo de anticuerpos inhibidores contra la hGAA recombinante (Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138). Además, la TRE no corrige eficazmente todo el organismo, probablemente debido a una combinación de mala biodistribución de la proteína tras la administración en vena periférica, falta de captación por varios tejidos y alta inmunogenicidad.
Como alternativa o complemento a la TRE, se ha investigado la viabilidad de los enfoques de terapia génica para tratar GSD-II (Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866, Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther.
5:436-446, Fraites, T. J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578, Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616). Sin embargo, la transferencia génica dirigida al músculo para corregir el defecto genético tiene que enfrentarse a la limitación de la naturaleza sistémica de la enfermedad y al hecho de que la expresión muscular de un transgén tiende a ser más inmunogénica en comparación con otros tejidos.
Doerfler et al., 2016 describen la administración combinada de dos construcciones que codifican una GAA humana de codón optimizado, una bajo el control de un promotor específico del hígado y la otra bajo el control de un promotor específico del músculo. La expresión de GAA controlada por un promotor específico del hígado se emplea para promover la tolerancia inmunitaria a GAA en un modelo de ratón Gaa-/-, mientras que la expresión de GAA controlada por un promotor específico del músculo proporciona la expresión de la proteína terapéutica en parte de los tejidos objeto de la terapia. Sin embargo, esta estrategia no es del todo satisfactoria, ya que requiere el uso de múltiples construcciones y no da lugar a la expresión de GAA en todo el organismo.
En el pasado se han propuesto proteínas GAA modificadas para mejorar el tratamiento de la enfermedad por almacenamiento lisosómico. En particular, la solicitud WO2004064750 y Sun et al. 2006, divulgan un polipéptido de GAA quimérica que comprende un péptido señalizador unido operativamente a GAA como forma de mejorar la orientación de la proteína a la vía secretora.
Sin embargo, las terapias disponibles para el paciente no son totalmente satisfactorias y la mejora de los polipéptidos de GAA y de la producción de GAA sigue siendo una necesidad en la técnica. En particular, sigue existiendo la necesidad de una eficacia a largo plazo del tratamiento con GAA, de una producción de GAA de alto nivel, de una tolerancia inmunológica mejorada al polipéptido de GAA producido, y de una captación mejorada de GAA por las células y tejidos que lo necesiten. Además, en el documento de patente WO2004064750 y Sun et al., 2006, la distribución tisular del polipéptido de GAA quimérica divulgado en ellos no es totalmente satisfactoria. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un polipéptido de GAA que sea totalmente terapéutico, al permitir una corrección de la acumulación de glucógeno en la mayoría, si no en todos, los tejidos de interés.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a variantes de GAA que se expresan y secretan a niveles más altos en comparación con la proteína GAA natural y que provocan una mejor corrección de la acumulación patológica de glucógeno en todo el cuerpo y da lugar a la inducción de tolerancia inmunológica a GAA.
Según un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GAA quimérica funcional, que comprende un resto de péptido señalizador y un resto de GAA funcional. En el polipéptido de GAA quimérica codificado, el péptido señalizador endógeno (o natural) de un polipéptido de GAA se sustituye por el péptido señalizador de otra proteína. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de GAA quimérica que comprende un péptido señalizador de otra proteína distinta de una GAA, unido operativamente a un polipéptido de GAA. El polipéptido quimérico codificado es una proteína GAA funcional en donde la secuencia de aminoácidos correspondiente al péptido señalizador natural de GAA (como la correspondiente a los nucleótidos 1 a 81 de SEQ ID NO: 1 que es un ácido nucleico natural que codifica GAA humana) se sustituye por la secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. En una realización preferida, el péptido señalizador codificado tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4. En una realización particular, el resto de GAA es una forma aminoterminal truncada de un polipéptido de GAA parental.
En una realización particular, el resto de GAA tiene 1 a 75 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental, en donde el polipéptido parental corresponde a una forma precursora de un polipéptido de GAA desprovisto de su péptido señalizador. En una realización particular, dicho polipéptido de GAA truncado tiene al menos 2, en particular al menos 2, en particular al menos 3, en particular al menos 4, en particular al menos 5, en particular al menos 6, en particular al menos 7, en particular al menos 8 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización, dicho polipéptido de GAA truncado tiene como máximo 75, en particular como máximo 70, en particular como máximo 60, en particular como máximo 55, en particular como máximo 50, en particular como máximo 47, en particular como máximo 46, en particular como máximo 45, en particular como máximo 44, en particular como máximo 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización particular, dicho polipéptido de GAA truncado tiene como máximo 47, en particular como máximo 46, en particular como máximo 45, en particular como máximo 44, en particular como máximo 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización particular, dicho polipéptido de GAA truncado tiene de 1 a 75, en particular de 1 a 47, en particular de 1 a 46, en particular de 1 a 45, en particular de 1 a 44, en particular de 1 a 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización, dicho polipéptido de GAA truncado tiene de 2 a 43, en particular de 3 a 43, en particular de 4 a 43, en particular de 5 a 43, en particular de 6 a 43, en particular de 7 a 43, en particular de 8 a 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En una realización más particular, dicho polipéptido de GAA truncado tiene 6, 7, 8, 9, 10, 27, 28, 29, 30, 31,40, 41,42, 43, 44, 45, 46 o 47 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental, en particular 7, 8, 9, 28, 29, 30, 41,42, 43 o 44, más particularmente 8, 29, 42 o 43 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental. Un polipéptido de GAA parental ilustrativo está representado por el polipéptido de GAA humano mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36.
En otra realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención es una secuencia de nucleótidos optimizada para mejorar la expresión de y/o mejorar la tolerancia inmunitaria al GAA quiméricain vivo.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido de GAA quimérica que comprende las moléculas mostradas en la siguiente Tabla 1, Tabla 1' o Tabla 1", en particular Tabla 1' o Tabla 1":
Tabla 1
Tabla 1
Tabla 1
Por ejemplo, dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser el resultado de las siguientes combinaciones mostradas en la Tabla 2, Tabla 2' o Tabla 2":
Tabla 2
Tabla 2’
Tabla 2"
En otro aspecto más, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico, que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención unida operativamente a una o más secuencias reguladoras, tales como un promotor, un intrón, una señal de poliadenilación y/o un potenciador (por ejemplo, un módulo regulador cis, o CRM). En una realización particular, el promotor es un promotor específico del hígado seleccionado preferentemente del grupo que consiste en el promotor de la alfa-1 antitripsina (hAAT), el promotor de la transtiretina, el promotor de la albúmina y el promotor de la globulina fijadora de tiroxina (TBG). En otra realización particular, el promotor es un promotor específico del músculo, tales como los promotores Spc5-12, MCK y desmina. En otra realización, el promotor es un promotor ubicuo, tales como los promotores CMV, CAG y PGK. La construcción de ácido nucleico puede comprender además opcionalmente un intrón, en particular un intrón seleccionado del grupo que consiste en un intrón de beta-globina b2 humana (o HBB2), un intrón de FIX, un intrón de beta-globina de pollo y un intrón de SV40, en donde dicho intrón es opcionalmente un intrón modificado, tal como un intrón de HBB2 modificado de SEQ ID NO:7, un intrón de FIX modificado de SEQ ID NO:9, o un intrón de beta-globina de pollo modificado de SEQ ID NO: 11.
En otra realización particular, la construcción de ácido nucleico comprende, preferentemente en este orden: un potenciador; un intrón; un promotor, en particular un promotor específico del hígado; la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de GAA quimérica; y una señal de poliadenilación, comprendiendo la construcción preferentemente, en este orden: una región de control ApoE; un intrón de HBB2, en particular un intrón de HBB2 modificado; un promotor hAAT; la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de GAA quimérica; y una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. En una realización específica, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las combinaciones de secuencias mostradas en la Tabla 2, Tabla 2' o Tabla 2", en particular en la Tabla 2' o 2", más particularmente la<secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:17 (correspondiente a la fusión de SEQ ID NO:26 y s>E<q ID NO:32), 18 (correspondiente a la fusión de SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:32) o 19 (correspondiente a la fusión de SEQ ID n>O:28 y SEQ ID NO:32).
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula transformada con la molécula de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico de la invención. En una realización particular, la célula es una célula hepática o una célula muscular.
Según otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido de GAA quimérica, que comprende un resto de péptido señalizador y un resto de GAA funcional. El resto de péptido señalizador se selecciona en el grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4, preferentemente SEQ ID NO:2. Además, el resto de GAA puede ser una forma truncada de un polipéptido de GAA parental, tal como un resto de GAA que tiene de 1 a 75 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental, en particular 6, 7, 8, 9, 10, 20, 41,42 43 o 44 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental, tal como 8 o 42 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental, en donde el resto de GAA es en particular una forma truncada de la proteína GAA humana de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular de SEQ ID NO:5. En una realización particular, el resto de GAA tiene 8 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA parental (más particularmente el polipéptido de GAA parental de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular de SEQ ID NO:5). En una realización particular de la invención, el polipéptido de GAA quimérica de la invención se selecciona del grupo que consiste en las combinaciones de secuencias de aminoácidos mostradas en la Tabla 1, Tabla 1' o Tabla 1", en particular en la Tabla 1' o Tabla 1". En la siguiente descripción detallada se dan a conocer otras realizaciones particulares del polipéptido de GAA quimérica que comprende una forma truncada de un polipéptido de GAA parental.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende, en un portador farmacéuticamente aceptable, la secuencia de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, la célula o el polipéptido quimérico divulgados en el presente documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, la célula o el polipéptido quimérico de la invención, para su uso como medicamento.
En otro aspecto, la invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, la célula o el polipéptido quimérico de la invención, para su uso en un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno. En una realización particular, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno es GSDI, GSDII, GSDIII, GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII o enfermedad congénita letal de almacenamiento de glucógeno del corazón. En una realización más particular, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno se selecciona del grupo que consiste en GSDI, GSDII y GSDIII, más particularmente del grupo que consiste en GSDII y GSDIII. En una realización aún más particular, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno es GSDII.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1. Los péptidos señalizadores potencian la secreción de hGAA en un grado variablein vitroein vivo.Panel A. Se transfectaron células de hepatoma humano (Huh7) mediante Lipofectamine™ con un plásmido de control (GFP), un plásmido que expresaba hGAA natural bajo el control transcripcional de un promotor específico del hígado (señalado como sp1), o plásmidos que expresaban hGAA de secuencia optimizada (hGAAco) fusionados con péptidos señalizadores 1-8 (sp2 (sp1-8) de origen sintético o derivados de otras proteínas altamente secretadas. 48 horas después de la transfección se midió la actividad de la hGAA en los medios de cultivo mediante un ensayo enzimático fluorogénico y se evaluó la actividad de la GAA frente a una curva patrón de 4-metilumbeliferona. El histograma muestra el promedio ± EE de los niveles de hGAA secretada derivada de tres experimentos diferentes. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA (* = p<0,05 frente a células transfectadas simuladas). Panel B. El histograma muestra el promedio ± EE de la actividad de hGAA en suero de ratones C57B16J de 3 meses de edad (n=5 ratones/grupo) 1 mes después de la inyección de PBS (PBS) o 1E12 gv/kg de vectores AAV8 que expresan hGAA de secuencia optimizada (hGAAco) bajo el control transcripcional del promotor de la alfa-1-antytripsina humana y fusionados con los péptidos señalizadores 1 a 3 y 7-8 (sp1-3, 7-8). La actividad de hGAA en suero se ha cuantificado mediante un ensayo enzimático fluorogénico y la actividad de GAA se ha evaluado frente a una curva patrón de proteína hGAA recombinante. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA (* = p<0,05 frente a PBS inyectado, § = p<0,05 frente a sp2).
Figura 2. El péptido señalizador sp7 aumenta los niveles de hGAA circulante y rescata la insuficiencia respiratoria en un modelo de ratón con enfermedad de Pompe. Ratones de 4 meses de edad naturales (WT) y GAA-/- (n=6-9 ratones/grupo) fueron inyectados por vía intravenosa con PBS o 2E12 gv/kg de vectores AAV8 que expresan hGAA de secuencia optimizada (hGAAco) bajo el control transcripcional del promotor humano alfa-1-antitripsina y fusionado con péptidos señalizadores 1, 2, 7 y 8 (sp1, 2, 7, 8). Panel A. El histograma muestra la actividad hGAA medida mediante ensayo fluorogénico en sangre tres meses después de la inyección de los vectores. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA (* = p<0,05 según lo indicado, § = p<0,05 frente a los ratones tratados con sp1). Panel B. Curva de supervivencia de Kaplan-Mayer medida en ratones tratados como se ha descrito anteriormente y seguidos durante 6 meses. El análisis estadístico se ha realizado mediante la prueba de rangos logarítmicos (* = p<0,05). Panel C. Evaluación de la función respiratoria. Los histogramas muestran el volumen corriente, en mililitros (ml) medido tres (barras grises) y seis (barras negras) meses después del tratamiento con los vectores indicados. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA, en el histograma se informan valores depobtenidos frente a los animales GAA-/- tratados con sp1 (* = p<0,05).
Figura 3. Corrección bioquímica del contenido de glucógeno en el cuádriceps. A ratones GAA-/- de 4 meses de edad se les inyectó por vía intravenosa PBS o 2E12 gv/kg de vectores AAV8 que expresaban hGAA de secuencia optimizada (hGAAco) bajo el control transcripcional del promotor de la alfa-1-antitripsina humana y fusionado con los péptidos señalizadores 1, 7 y 8 (sp1, 7, 8). Panel A. Actividad de hGAA medida por ensayo fluorogénico en cuádriceps. Panel B. En el histograma se muestra el contenido de glucógeno expresado como glucosa liberada tras la digestión enzimática del glucógeno, medido en el cuádriceps. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA (*=p<0,05 frente a ratones GAA-/- inyectados con PBS).
Figura 4. Corrección bioquímica del contenido de glucógeno en corazón, diafragma y cuádriceps. Ratones de 4 meses de edad naturales (WT) y GAA-/- (n=4-5 ratones/grupo) fueron inyectados por vía intravenosa con PBS 6E11 gv/kg de vectores AAV8 que expresan hGAA de secuencia optimizada (hGAAco) bajo el control transcripcional del promotor humano alfa-1 -antitripsina y fusionado con péptidos señalizadores 1,7 y 8 (sp1, 7, 8). Panel A. El histograma muestra la actividad de hGAA medida mediante ensayo fluorogénico en sangre tres meses después de la inyección del vector. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA, en el histograma se informan los valores depobtenidos frente a los animales GAA-/- tratados con PBS (* = p<0,05). Panel B-D. Los histogramas muestran el contenido de glucógeno expresado como glucosa liberada tras la digestión enzimática del glucógeno, medido en el corazón (panel B), diafragma (panel C) y cuádriceps (panel D). El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA (* = p<0,05 frente a ratones GAA-/-inyectados con PBS, § = p<0,05 frente a ratones tratados con sp1).
Figura 5. El hGAA altamente secretado reduce las respuestas humorales dirigidas contra el transgén en un modelo de ratón de la enfermedad de Pompe. Ratones GAA-/- de 4 meses de edad fueron inyectados por vía intravenosa con PBS o con dos dosis diferentes (5E11 o 2E12 gv/kg) de vectores AAV8 que comprendían una secuencia optimizada bajo el control transcripcional del promotor de la alfa-1-antitripsina humana, que codifica A8 de hGAA, fusionada con el péptido señalizador 1 (co), el péptido señalizador 2 (sp2-A8-co), el péptido señalizador 7 (sp7-A8-co) o el péptido señalizador 8 (sp8-A8-co). 1 mes después de las inyecciones, se analizaron los sueros para detectar la presencia de anticuerpos anti-hGAA mediante ELISA. La cuantificación se ha realizado usando IgG purificada de ratón como patrón. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA con la prueba de Dunnett a posteriori (* = p<0,01).
Figura 6. La inyección de AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1 conduce a la secreción eficaz de hGAA en la sangre y a la captación en NHP. Dos monosMacaca fascicularisfueron inyectados en el día 0 con 2E12 gv/kg de AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1. Panel A Transferencia Western de hGAA realizada en suero de los dos monos obtenidos doce días antes y 30 días después de la administración del vector. A la izquierda se indican las posiciones de las bandas del marcador de peso molecular (st) que corren paralelas a las muestras. Panel B Tres meses después de la inyección del vector se sacrificó a los monos y se recogieron tejidos para la evaluación bioquímica de la captación de hGAA. Se realizó una transferencia Western de hGAA en extractos de tejido obtenidos de bíceps y diafragma. Se usó un anticuerpo anti-tubulina como control de carga. A la izquierda se indican las posiciones de las bandas del marcador de peso molecular paralelas a las muestras.
Figura 7. Aumento de la actividad de GAA en los medios de células transfectadas con plásmidos que codifican variantes de GAA combinadas con el péptido señalizador heterólogo sp7 o sp8. Actividad de GAA medida en los medios (paneles A) y lisados (paneles B) de células HuH748 horas después de la transfección de plásmidos que comprenden secuencias optimizadas que codifican GAA nativa combinada con el péptido señalizador sp1 de GAA nativo (co) o que codifican GAA manipulada que incluye GAA nativa combinada con el péptido señalizador heterólogo sp7 o sp8 (sp7-co o sp8-co). Como control negativo se usó un plásmido que codificaba eGFP. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con Tukey a posteriori. Los datos son promedio ± DE de dos experimentos independientes. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.
Figura 8. Corrección bioquímica del contenido de glucógeno en el hígado de animales GDE-/- inyectados con vector que expresa hGAA. A ratones de 3 meses de edad naturales (WT) o GDE-/- se les inyectó por vía intravenosa PBS o vectores AAV8 que expresaban hGAA de codón optimizado bajo el control transcripcional del promotor de la alfa-1 -antitripsina humana y fusionado con el péptido señalizador 7 (AAV8-hAAT-sp7--A8-hGAAco1) a dosis de 1E11 o 1E12 vg/ratón. El histograma muestra el contenido de glucógeno expresado como glucosa liberada tras la digestión enzimática del glucógeno, medida en el hígado. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA (*=p<0,05 frente a ratones GDE-/- inyectados con PBS, §=p<0,05 frente a animales WT inyectados con PBS).
Figura 9. Actividad de GAA en medio de células transfectadas con plásmidos que codifican diferentes variantes de GAA. La actividad de GAA se midió en el medio de células HuH724 (panel A) y 48 horas (panel B) después de la transfección de plásmidos que comprendían secuencias optimizadas que codificaban GAA nativa combinada con el péptido señalizador sp1 GAA nativo (co) o que codificaban GAA modificada incluyendo GAA nativa combinada con el péptido señalizador heterólogo sp7 (sp7-co). Se evaluó el efecto de diferentes deleciones en la secuencia codificante de GAA tras el péptido señalizador sp7 (sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co, sp7-A47-co, sp7-A62-co). Como control negativo se usó un plásmido que codificaba eGFP. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con Tukey a posteriori. La almohadilla (#) en las barras muestran diferencias estadísticamente significativas frente a co; los símbolos tau (r) muestran diferencias estadísticamente significativas frente a sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co. Los datos son el promedio ± DE de dos experimentos independientes. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001 excepto cuando se usan símbolos diferentes.
Figura 10. Actividad intracelular de GAA de diferentes variantes de GAA. La actividad de GAA se midió en los lisados de células HuH748 horas después de la transfección de plásmidos que comprendían secuencias optimizadas que codificaban GAA nativa combinada con el péptido señalizador sp 1 de GAA nativa (co) o que codificaban GAA modificada incluyendo GAA nativa combinada con el péptido señalizador heterólogo sp7 (sp7-co). Se evaluó el efecto de diferentes deleciones en la secuencia codificante de GAA después del péptido señalizador (sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co, sp7-A47-co, sp7-A62-co). Como control negativo se usó un plásmido que codificaba eGFP. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA<unidireccional con Tukey a posteriori. Los símbolos Tau>(<t>)<muestran diferencias estadísticamente>significativas frente a sp7-co, sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co. Los datos son el promedio ± DE de dos experimentos independientes. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, excepto cuando se usan símbolos diferentes.
Figura 11. Aumento de la actividad de GAA en medio celular usando la deleción A8 combinada con los péptidos señalizadores sp6 o sp8. La actividad de GAA se midió en el medio (panel A) y los lisados (panel B) de células HuH748 horas después de la transfección de plásmidos que comprendían secuencias optimizadas que codificaban GAA nativo combinado con el péptido señalizador sp 1 de GAA nativa (co) o que codificaban GAA manipulada incluyendo GAA nativa combinada con el péptido señalizador heterólogo sp6 o sp8 (sp6-co o sp8-co). Se evalúa el efecto de la deleción de 8 aminoácidos en la secuencia codificante de GAA después del péptido señalizador (sp6-A8-co, sp8-A8-co). Como control negativo se usó un plásmido que codificaba eGFP. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con Tukey a posteriori. Los asteriscos en las barras muestran diferencias estadísticamente significativas frente a co. Los datos son el promedio ± DE de dos experimentos independientes. * p<0,05,** p<0,01,*** p<0,001,**** p<0,0001, excepto cuando se usan símbolos diferentes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GAA quimérica. Este polipéptido de GAA quimérica comprende un resto de péptido señalizador y un resto de GAA funcional, en donde el resto de péptido señalizador se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4. Los inventores han mostrado sorprendentemente que la fusión de uno de estos péptidos señalizadores con una proteína GAA mejora en gran medida la secreción de GAA a la vez que reduce su inmunogenicidad.
La a-glucosidasa ácida lisosómica o "GAA" (C.E. 3.2.1.20) (1,4-a-D-glucano glucohidrolasa) es una exo-1,4-a-D-glucosidasa que hidroliza tanto los enlaces a-1,4 como a-1,6 de los oligosacáridos para liberar glucosa. Una deficiencia de GAA provoca la enfermedad por almacenamiento de glucógeno de tipo II (GSDII), también conocida como enfermedad de Pompe (aunque este término se refiere formalmente a la forma infantil de la enfermedad). Cataliza la degradación completa del glucógeno con ralentización en los puntos de ramificación. El gen de la a-glucosidasa ácida humana de 28 kb del cromosoma 17 codifica un ARNm de 3,6 kb que produce un polipéptido de 952 aminoácidos<(Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697; Martiniuk et al., (1990)>D<n>A<and Cell Biology 9: 85). La enzima recibe>glicosilación cotraduccional ligada a N en el retículo endoplásmico. Se sintetiza como una forma precursora de 110 kDa, que madura mediante una extensa modificación de la glucosilación, fosforilación y mediante procesamiento proteolítico a través de un producto intermedio endosómico de aproximadamente 90 kDa en las formas lisosómicas finales de 76 y 67 kDa (Hoefsloot, (1988) EMBO J. 7: 1697; Hoefsloot et al., (1990) Biochem. J. 272: 485; Wisselaar et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2223; Hermans et al., (1993) Biochem. J. 289: 681).
En los pacientes con GSD II, una deficiencia de a-glucosidasa ácida provoca una acumulación masiva de glucógeno en los lisosomas, lo que altera la función celular (Hirschhorn, R. y Reuser, A. J. (2001), en The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease, (eds, Scriver, C. R. et al.) páginas 3389-3419 (McGraw-Hill, Nueva York). En la forma infantil más común, los pacientes presentan degeneración muscular progresiva y cardiomiopatía y mueren antes de los dos años de edad. En las formas juvenil y adulta se produce un debilitamiento grave.
Además, los pacientes que tienen otras GSD pueden beneficiarse de la administración de una forma optimizada de GAA. Por ejemplo, se ha mostrado (Sun et al. (2013) Mol Genet Metab 108(2): 145; documento de patente WO2010/005565) que la administración de GAA reduce el glucógeno en mioblastos primarios de pacientes con enfermedad por almacenamiento de glucógeno de tipo III (GSD III).
El término "GAA" o "polipéptido de GAA", como se usa en el presente documento, engloba GAA maduras (~76 o ~67 kDa) y precursoras (por ejemplo, ~110 kDa) GAA, en particular la forma precursora, así como proteínas GAA modificadas o mutadas por inserción (inserciones), deleción (deleciones) y/o sustitución (sustituciones)) o fragmentos de las mismas que son derivados funcionales de GAA, es decir, que conservan la función biológica de GAA (es decir, tienen al menos una actividad biológica de la proteína GAA nativa, por ejemplo, puede hidrolizar el glucógeno, como se ha definido anteriormente) y variantes de GAA (por ejemplo, GAA II como se describe por Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269; los polimorfismos GAA y los SNP se describen en Hirschhorn, R. y Reuser, A. J. (2001) In The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease (Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. & Valle, D. Eds. ), pp. 3389- 3419. McGraw-Hill, Nueva York, véanse las páginas 3403-3405). Puede usarse cualquier secuencia codificante de GAA conocida en la técnica, por ejemplo, véase SEQ ID NO:1; número de acceso GenBank NM_00152 y Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697 y Van Hove et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 65 (humano), número de acceso de GenBank NM_008064 (ratón) y Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269 (codorniz).
En el contexto de la presente invención, una "forma precursora de GAA" es una forma del polipéptido de GAA que comprende su péptido señalizador natural. Por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO:37 son las formas precursoras de las variantes de GAA humana (hGAA). Dentro de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO:37, los residuos de aminoácidos 1-27 corresponden al péptido señalizador del polipéptido de hGAA.
En el contexto de la presente invención, un polipéptido de GAA truncado de la invención deriva de un polipéptido de GAA parental. Según la presente invención, un "polipéptido de GAA parental" puede ser una secuencia GAA precursora funcional, como se ha definido anteriormente, pero desprovista de su péptido señalizador. Por ejemplo, con referencia al polipéptido de GAA humano natural, un polipéptido de GAA natural completo (es decir, la forma precursora de GAA) se representa en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 37 y tiene un péptido señalizador (correspondiente a los aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 37), mientras que el polipéptido de GAA parental que sirve de base para las formas GAA truncadas de estos polipéptidos de GAA humanos naturales se representa en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:36 y no tiene péptido señalizador. En este ejemplo, este último, que corresponde a los aminoácidos 28-952 de SEQ ID NO: 12 y a los aminoácidos 28-952 de SEQ ID NO:37, se denomina polipéptido de GAA parental.
La secuencia codificante del polipéptido de GAA puede proceder de cualquier fuente, incluidas especies aviares y mamíferas. El término "aviar", como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El término "mamífero", como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, seres humanos, simios y otros primates no humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. En realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos de la invención codifican un polipéptido de GAA humano, de ratón o de codorniz, en particular humano. En otra realización particular, el polipéptido de GAA codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:5 o en SEQ ID NO:36, que corresponde a hGAA sin su péptido señalizador (cabe señalar que el péptido señalizador natural de hGAA corresponde al aminoácido 1 -27 en SEQ ID NO: 12 o en SEQ ID NO:37, que corresponde a hGAA incluyendo su péptido señalizador natural).
En otra realización de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención tiene al menos 75 por ciento (tal como al menos 77%), al menos un 80 por ciento o al menos un 82 por ciento (tal como al menos 83%) de identidad con los nucleótidos 82-2859 de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1, que es la secuencia que codifica el hGAA natural de SEQ ID NO:37 (siendo los nucleótidos 1-81 de SEQ ID NO: 1 la parte que codifica el péptido señalizador natural del hGAA).
El resto de GAA de la molécula de ácido nucleico de la invención tiene preferiblemente al menos un 85 por ciento, más preferiblemente al menos un 90 por ciento, y aún más preferiblemente al menos un 92 por ciento de identidad, en particular al menos 95 por ciento de identidad, por ejemplo, al menos un 98, 99 o 100 por ciento de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o 14, que son secuencias optimizadas para la expresión de transgenesin vivo.
Además, el resto de péptido señalizador de la proteína GAA quimérica codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender de 1 a 5, en particular de 1 a 4, en particular de 1 a 3, más particularmente de 1 a 2, en particular 1 deleción (deleciones), inserción (inserciones) o sustitución (sustituciones) de aminoácidos en comparación con las secuencias mostradas en SEQ ID NO:2 a 4, siempre que la secuencia resultante corresponda a un péptido señalizador funcional, es decir, un péptido señalizador que permita la secreción de la proteína GAA. En una realización particular, la secuencia del péptido señalizador consiste en una secuencia seleccionada el grupo que consiste en SeQ ID NO:2 a 4.
El término "idéntico" y declinaciones del mismo se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones de dos secuencias coinciden, entonces las dos secuencias son idénticas en un 60 %. En general, la comparación se realiza cuando se alinean dos secuencias para obtener la máxima identidad. Para alinear secuencias de ácidos nucleicos pueden usarse diversas herramientas bioinformáticas conocidas por los expertos en la técnica, tales como BLAST o FASTA.
En una realización particular, el resto de GAA de la molécula de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.
La molécula de ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido de GAA funcional, es decir, codifica un polipéptido de GAA humano que, cuando se expresa, tiene la funcionalidad de la proteína GAA natural. Como se ha definido anteriormente, la funcionalidad de la GAA natural es para hidrolizar los enlaces a-1,4 y a-1,6 de los oligosacáridos y polisacáridos, más particularmente del glucógeno, para liberar glucosa. El polipéptido de GAA funcional codificado por el ácido nucleico de la invención puede tener una actividad hidrolizante sobre el glucógeno de al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o al menos el 100 % en comparación con el polipéptido de GAA natural codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 o SEQ iD n O: 14 (es decir, el polipéptido de GAA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5). La actividad de la proteína GAA codificada por el ácido nucleico de la invención puede ser incluso de más del 100 %, tal como de más del 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, o incluso más del 150 % de la actividad del polipéptido de GAA natural codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID SEQ ID NO: 1, NO: 13 o SEQ ID NO: 14 (es decir, el polipéptido de GAA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5).
Un experto puede determinar fácilmente si un ácido nucleico según la invención expresa una proteína GAA funcional. Los métodos adecuados serían evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, un métodoin vitroadecuado implica insertar el ácido nucleico en un vector, tal como un plásmido o vector vírico, transfectar o transducir células hospedadoras, tales como células 293T o HeLa, u otras células tales como Huh7, con el vector, y ensayar la actividad de GAA. Alternativamente, un métodoin vivoadecuado implica la transducción de un vector que contiene el ácido nucleico en un modelo de ratón de la enfermedad de Pompe u otro trastorno de almacenamiento de glucógeno y el ensayo de GAA funcional en el plasma del ratón y la presencia de GAA en los tejidos. Los métodos adecuados se describen con más detalle en la parte experimental más adelante.
Los inventores han descubierto que la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente provoca niveles sorprendentemente altos de expresión de proteína GAA funcional tantoin vitrocomoin vivoen comparación con el ADNc de GAA natural. Además, como también han mostrado los inventores, el polipéptido de GAA quimérica producido a partir de células hepáticas y musculares que expresan la molécula de ácido nucleico de la invención no induce ninguna respuesta inmunitaria humoral contra el transgén. Esto significa que esta molécula de ácido nucleico puede usarse para producir altos niveles de polipéptido de GAA, y proporciona beneficios terapéuticos, tales como evitar recurrir a tratamientos inmunosupresores, permitir un tratamiento inmunosupresor a dosis bajas, y permitir la administración repetida de la molécula de ácido nucleico de la invención a un sujeto que la necesite. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico de la invención es de especial interés en contextos en los que la expresión y/o actividad de GAA es deficiente o en los que altos niveles de expresión de GAA pueden mejorar una enfermedad, tal como en el caso de una enfermedad por almacenamiento de glucógeno. En particular, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno puede ser GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDllI (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII o enfermedad congénita letal de almacenamiento de glucógeno del corazón. Más particularmente, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno se selecciona del grupo que consiste en GSDI, GSDII y GSDllI, aún más particularmente del grupo que consiste en GSDII y GSDllI. En una realización aún más particular, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno es GSDII. En particular, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser útiles en terapia génica para tratar afecciones deficientes en GAA, u otras afecciones asociadas por acumulación de glucógeno como GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDllI (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII y enfermedad por almacenamiento de glucógeno congénita letal del corazón, más particularmente GSDI, GSDII o GSDllI, aún más particularmente GSDII y GSDllI. En una realización aún más particular, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser útiles en terapia génica para tratar GSDII.
La secuencia de la molécula de ácido nucleico de la invención, que codifica una GAA funcional, está optimizada para la expresión del polipéptido de GAAin vivo.La optimización de la secuencia puede incluir una serie de cambios en una secuencia de ácido nucleico, incluida la optimización de codones, el aumento del contenido de GC, la disminución del número de islas CpG, la disminución del número de marcos de lectura abiertos alternativos (ARF) y la disminución del número de sitios donantes y aceptores de corte y empalme. Debido a la degeneración del código genético, diferentes moléculas de ácido nucleico pueden codificar la misma proteína. También es bien sabido que los códigos genéticos de diferentes organismos suelen estar sesgados hacia el uso de uno de los varios codones que codifican el mismo aminoácido frente a los demás. Mediante la optimización de codones, se introducen cambios en una secuencia de nucleótidos que aprovechan el sesgo de codones existente en un contexto celular dado, de modo que es más probable que la secuencia de nucleótidos optimizada mediante codones resultante se exprese en dicho contexto celular dado a un nivel relativamente alto en comparación con la secuencia de codón no optimizado. En una realización preferida de la invención, dicha secuencia de nucleótidos de codón optimizado que codifica una GAA truncada está optimizada en codones para mejorar su expresión en células humanas en comparación con las secuencias de nucleótidos de codón no optimizado que codifican la misma proteína GAA truncada, por ejemplo, aprovechando el sesgo de uso de codones específico humano.
La Tabla 3 proporciona una descripción de los parámetros relevantes con respecto a la optimización de secuencias realizada por los inventores:
Tabla 3. Descripción de las secuencias optimizadas. Tabla que ilustra las características de las dos secuencias optimizadas de hGAA en comparación con la natural. a) índice de adaptación de codones y b) contenido de GC calculado mediante una herramienta de análisis de codones raros (http://www.genscript.com). c) y d) son, respectivamente, los marcos de lectura abiertos alternativos calculados en las cadenas 5' a 3' (aORF 5 '^3 ') y 3' a 5' (aORF 3 '^5 '). e) y f) son, respectivamente, los sitios de corte y empalme aceptores (SA) y donantes (SD) calculados usando una herramienta de predicción en línea de sitios de corte y empalme (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). g) y h) son, respectivamente, la identidad porcentual calculada frente a la secuencia natural (wt) y la secuencia co1 optimizada. i) Islas CpG calculadas mediante la herramienta en línea MethDB (http://www.methdb.de/links.html). Las islas CpG son secuencias de más de 100 pb, con un contenido de GC >60 % y una relación observada/esperada >0,6.
En una realización particular, la secuencia codificante de GAA optimizada está optimizada en codones, y/o tiene un contenido de GC aumentado y/o tiene un número disminuido de marcos de lectura abiertos alternativos, y/o tiene un número disminuido de sitios donantes y/o aceptores de corte y empalme, en comparación con los nucleótidos 82-2859 de la secuencia codificante de hGAA natural de SEQ ID NO:1. La secuencia de ácido nucleico de la invención resulta en un aumento de al menos el 2, 3, 4, 5 o 10 % del contenido de GC en la secuencia de GAA en comparación con la secuencia de GAA natural. En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico de la invención da como resultado un aumento de 2, 3, 4 o, más particularmente, 5 % o 10 % (particularmente 5 %) del contenido de GC en la secuencia de GAA en comparación con la secuencia de nucleótidos de GAA natural. En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido de GAA funcional es "sustancialmente idéntica", es decir, aproximadamente el 70 % idéntica, más preferiblemente aproximadamente el 80 % idéntica, aún más preferiblemente aproximadamente el 90 % idéntica, aún más preferiblemente aproximadamente el 95 % idéntica, aún más preferiblemente aproximadamente el 97 %, 98 % o incluso 99 % idéntica a los nucleótidos 82-2859 de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. Como se ha mencionado anteriormente, además del contenido de GC y/o el número de ARF, la optimización de la secuencia también puede comprender una disminución del número de islas CpG en la secuencia y/o una disminución del número de sitios donantes y aceptores de corte y empalme. Por supuesto, como es bien sabido por los expertos en la materia, la optimización de la secuencia es un equilibrio entre todos estos parámetros, lo que significa que una secuencia puede considerarse optimizada si se mejora al menos uno de los parámetros anteriores mientras que uno o más de los otros parámetros no lo está, siempre que la secuencia optimizada conduzca a una mejora del transgén, como una expresión mejorada y/o una respuesta inmunitaria disminuida al transgénin vivo.
Además, la capacidad de adaptación de una secuencia de nucleótidos que codifica una GAA funcional al uso de codones de las células humanas puede expresarse como índice de adaptación de codones (CAI). Un índice de adaptación de codones se define en el presente documento como una medida de la capacidad de adaptación relativa del uso de codones de un gen hacia el uso de codones de genes humanos altamente expresados. La capacidad de adaptación relativa (w) de cada codón es la relación entre el uso de cada codón y el del codón más abundante para el mismo aminoácido. El CAI se define como la media geométrica de estos valores de capacidad de adaptación relativa. Se excluyen los codones no sinónimos y los codones de terminación (dependientes del código genético). Los valores CAI oscilan entre 0 y 1, indicando los valores más altos una mayor proporción de los codones más abundantes (véase Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; véase también: Kim et al, Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede et al, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635). Preferentemente, una molécula de ácido nucleico que codifica una GAA tiene un CAI de al menos 0,75 (en particular 0,77), 0,8, 0,85, 0,90, 0,92 o 0,94.
En una realización, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una proteína que tiene entre 0 y 50, entre 0 y 30, entre 0 y 20, entre 0 y 15, entre 0 y 10, o entre 0 y 5 cambios de aminoácidos a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. Además, la proteína GAA codificada por el ácido nucleico de la invención puede ser una variante de una proteína GAA funcional conocida en la técnica, en donde la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una proteína que tiene entre 0 y 50, entre 0 y 30, entre 0 y 20, entre 0 y 15, entre 0 y 10, o entre 0 y 5 cambios de aminoácidos con respecto a la proteína GAA conocida en la técnica. Dicha proteína GAA conocida en la técnica que puede servir de base para el diseño de la variante funcional puede encontrarse en particular en la entrada Uniprot de GAA (número de acceso P10253; correspondiente a BenBank CAA68763.1; SEQ ID NO:37). En otra realización particular, el resto de GAA de la secuencia de ácido nucleico de la invención codifica polipéptidos de GAA variantes, o variantes funcionales de dichos péptidos como se define en el presente documento, tales como los seleccionados en el grupo que consiste en los polipéptidos identificados como números de acceso de Genbank AAA52506.1 (SEQ ID NO:38), EAW89583.1 (SEQ ID NO:39) y ABI53718.1 (SEQ ID NO:40). Otros polipéptidos de GAA variantes incluyen los descritos en el documento de patente WO2012/145644, WO00/34451 y US6.858.425. En una realización particular, el polipéptido de GAA parental deriva de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO:37.
En una realización particular, el polipéptido de GAA codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención es una GAA funcional y tiene una identidad de secuencia con la proteína hGAA mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, opcionalmente teniendo en cuenta el truncamiento realizado si se considera una forma truncada como referencia a la identidad de secuencia, de al menos 80 %, en particular al menos 85 %, 90 %, 95 %, más particularmente al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. En una realización particular, la proteína GAA codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
El término "idéntico" y sus declinaciones cuando se refiere a un polipéptido significa que cuando una posición en dos secuencias polipeptídicas comparadas está ocupada por el mismo aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada uno de dos polipéptidos está ocupada por una leucina), entonces los polipéptidos son idénticos en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos polipéptidos es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos polipéptidos coinciden, entonces las dos secuencias son idénticas en un 60 %. En general, la comparación se realiza cuando se alinean dos secuencias para obtener la máxima identidad. Para alinear secuencias de ácidos nucleicos pueden usarse diversas herramientas bioinformáticas conocidas por los expertos en la materia, tales como BLAST o FASTA.
El término "secuencia de ácido nucleico" (o molécula de ácido nucleico) se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma monocatenaria o bicatenaria, particularmente un ADN que codifica una proteína GAA según la invención.
La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GAA funcional quimérico que comprende un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En particular, los inventores han mostrado además sorprendentemente que la sustitución del péptido señalizador da lugar a la producción de mayores niveles de expresión y mayor secreción del polipéptido de GAA funcional en comparación con otro polipéptido de GAA quimérica anteriormente informado que comprende GAA fusionada al péptido señalizador de alfa-1 -antitripsina humana (hAAT, proteína GAA quimérica descrita en el documento de patente WO2004064750 y Sun et al. 2006). En la molécula de ácido nucleico de la invención, el resto de péptido señalizador corresponde a una secuencia que codifica un péptido señalizador que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4 (denominado en el presente documento "péptido señalizador alternativo"). La molécula de ácido nucleico de la invención puede ser además una secuencia optimizada que codifica un polipéptido de GAA quimérica que comprende un péptido señalizador alternativo unido de forma operable a un polipéptido de GAA funcional.
En comparación con un polipéptido de GAA natural, el péptido señalizador endógeno de la GAA natural se sustituye por un péptido señalizador exógeno, es decir, un péptido señalizador derivado de una proteína distinta de la GAA. El péptido señalizador exógeno fusionado al resto de la proteína GAA aumenta la secreción del polipéptido de GAA quimérica resultante en comparación con el polipéptido de GAA correspondiente que comprende su péptido señalizador natural. Además, según una realización particular de la invención, la secuencia de nucleótidos correspondiente al péptido señalizador alternativo puede ser una secuencia optimizada como la proporcionada anteriormente.
Los péptidos señalizadores que pueden usarse en la presente invención incluyen los aminoácidos 1 -25 de la iduronato-2-sulfatasa (SEQ ID NO:3), los aminoácidos 1-20 del quimotripsinógeno B2 (SEQ ID NO:2) y los aminoácidos 1-23 del inhibidor de la proteasa C1 (SEQ ID NO:4). Los péptidos señalizadores de SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:4 permiten una mayor secreción de la proteína GAA quimérica tantoin vitrocomoin vivoen comparación con la GAA que comprende su péptido señalizador natural, o con una proteína GAA quimérica que comprende el péptido señalizador de hAAT.
La proporción relativa de GAA de nueva síntesis que se secreta de la célula puede determinarse rutinariamente por métodos conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos. Las proteínas secretadas pueden detectarse midiendo directamente la propia proteína (por ejemplo, mediante transferencia Western) o mediante ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos enzimáticos) en medio de cultivo celular, suero, leche, etc.
Los expertos en la materia entenderán además que el polipéptido de GAA quimérica puede contener aminoácidos adicionales, por ejemplo, como resultado de manipulaciones de la construcción de ácido nucleico, tales como la adición de un sitio de restricción, siempre que estos aminoácidos adicionales no hagan que el péptido señalizador o el polipéptido de GAA no sean funcionales. Los aminoácidos adicionales pueden ser escindidos o retenidos por el polipéptido maduro, siempre que la retención no dé lugar a un polipéptido no funcional.
Además, el polipéptido de GAA quimérica codificado por la molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento puede comprender un resto de GAA que es una forma funcional truncada de GAA. Por "forma truncada" se entiende un polipéptido de GAA que comprende uno o varios aminoácidos consecutivos delecionados de la parte aminoterminal de un polipéptido de GAA parental. Por lo tanto, el resto de GAA en el polipéptido de GAA quimérica de la invención puede ser una forma aminoterminal truncada de un polipéptido de GAA parental. Según la presente invención, un "polipéptido de GAA parental" es un polipéptido de GAA desprovisto de un péptido señalizador, tal como una forma precursora de una GAA desprovisto de un péptido señalizador, en particular el polipéptido de hGAA<mostrado en SEQ ID NO:5, o SEQ ID n>O:36,<en particular en SEQ ID NO5, y puede ser cualquiera de las variantes>que se ha divulgado anteriormente. Por ejemplo, con referencia a los polipéptidos de GAA humanos naturales típicos, el polipéptido de GAA natural completo se representa en SEQ ID NO: 12 o en SEQ ID NO:37, y tiene un péptido señalizador, mientras que el polipéptido de GAA parental que sirve de base para la forma GAA truncada de este polipéptido de GAA humano natural se representa en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, respectivamente, y no tiene péptido señalizador. En este ejemplo, estos últimos se denominan polipéptido de GAA parental. En una variante de esta realización particular, se deleciona al menos un aminoácido del extremo aminoterminal de la proteína GAA parental. En una realización particular, el resto de GAA puede tener al menos 1, en particular al menos 2, en particular al menos 3, en particular al menos 4, en particular al menos 5, en particular al menos 6, en particular al menos 7, en particular al menos 8 aminoácidos consecutivos delecionados de su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. Por ejemplo, el resto de GAA puede tener 1 a 75 aminoácidos consecutivos o más de 75 aminoácidos consecutivos delecionados de su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización, dicho resto de GAA tiene como máximo 75, en particular como máximo 70, en particular como máximo 60, en particular como máximo 55, en particular como máximo 50, en particular como máximo 47, en particular como máximo 46, en particular como máximo 45, en particular como máximo 44, en particular como máximo 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización particular, dicho resto de GAA tiene como máximo 47, en particular como máximo 46, en particular como máximo 45, en particular como máximo 44, en particular como máximo 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. Específicamente, el resto de GAA truncado puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 o 75 aminoácidos consecutivos delecionados de su extremo aminoterminal en comparación con la proteína GAA parental (en particular una forma truncada del<polipéptido de hGAA parental mostrado en SEQ ID>N<o>:5<o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5). En otra>realización particular, dicho resto de GAA tiene 1 a 75, en particular 1 a 47, en particular 1 a 46, en particular 1 a 45, en particular 1 a 44, en particular 1 a 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental. En otra realización, dicho resto de GAA tiene 2 a 43, en particular 3 a 43, en particular 4 a 43, en particular 5 a 43, en particular 6 a 43, en particular 7 a 43, en particular 8 a 43 aminoácidos consecutivos delecionados en su extremo aminoterminal en comparación con el polipéptido de GAA parental (en<particular una forma truncada del polipéptido de hGAA parental mostrado en SEQ i>D<NO:5 o SEQ ID NO:36, en>particular en SEQ ID NO:5). Usando una nomenclatura alternativa, el polipéptido de GAA resultante del truncamiento de 1 aminoácido en el polipéptido de GAA parental se denomina forma truncada A1 de GAA, el polipéptido de GAA resultante del truncamiento de 2 aminoácidos consecutivos desde el extremo aminoterminal se denomina forma truncada A2 de GAA, el polipéptido de GAA resultante del truncamiento de 3 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de GAA parental se denomina forma truncada A3 de GAA), etc. En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46, A47, A48, A49, A50, A51, A52, A53, A54, A55, A56, A57, A58, A59, A60, A61, A62, A63, A64, A65, A66, A67, A68, A69, A70, A71, A72, A73, A74 o A75 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46 o A47 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45 o A46 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44 o A45 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que<consiste en SEQ i>D<NO:2 a 4.>
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43 o A44 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma<truncada de la proteína hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5),>fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A4,
A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27,
A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A5,
A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28,
A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A6,
A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada<de la proteína hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado>en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A7,
A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30,
A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada de la<proteína hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su>extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, la proteína GAA quimérica de la invención comprende un resto de la forma truncada A8,
A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30,
A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42 o A43 de GAA (en particular una forma truncada de la<proteína hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su>extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A6, A7, A8, A9 o
A10 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en
SEQ ID NO:5), en particular una forma truncada A7, A8 o A9 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental<mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID n>O:5),<en particular una forma truncada A8 de>
GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ
ID NO:5).
En una realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A27, A28, A29,
A30 o A31 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma truncada A28, A29 o A30 de GAA (en particular de la proteína<hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma>truncada A29 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A40, A41, A42,
A43 o A44 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma truncada A41, A42 o A43 de GAA (en particular de la proteína<hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma>truncada A42 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A41, A42, A43,
A44 o A45 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma truncada A42, A43 o A44 de GAA (en particular de la proteína<hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma>truncada A43 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una A6, A7, A8, A9, A10, A27, A28,
A29, A30, A31, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46 o A47 forma truncada de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma A7, A8, A9, A28, A29, A30,
<A41, A42, A43 o A44 truncada de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID n>O:<5 o SEQ>
ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A6, A7, A8, A9,
<A10, A40, A41, A42, A43 o a>44<de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ>
ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A8, A29, A42, A43 o A47 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A8, A29, A42 o
A43 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en
SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A8 o A42 de GAA
(en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En una realización particular de la invención, el polipéptido de GAA quimérica de la invención comprende un resto de
GAA truncado derivado de un polipéptido de GAA humano parental funcional. En otra realización particular, el polipéptido de hGAA parental es el polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en
SEQ ID NO:5. En una variante de esta realización, el resto de GAA en el polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20,
A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42,
A43, A44, A45, A46, A47, A48, A49, A50, A51, A52, A53, A54, A55, A56, A57, A58, A59, A60, A61, A62, A63, A64,
A65, A66, A67, A68, A69, A70, A71, A72, A73, A74 o A75 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente<del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID>N<o>:5,<o de una variante>funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ
<ID NO:36, en particular en s>E<q ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o s>E<q ID NO:36, en particular con SEQ ID NO:5. En otra realización particular,>el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7,
A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A2 A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46 o A47, en particular A6, A7, A8,
A9, A10, A40, A41, A42, A43 o A44, en particular A8, A29, A42 o A43, en particular una forma truncada A8 o A42 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75,
80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad (por ejemplo 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad) con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular con SEQ ID NO:5.
En una variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23,
A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45 o
A46 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ
<ID NO:36, en particular>S<e>Q<ID NO:5.>
En una variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23,
A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44 o A45 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ
ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ
<ID NO:36, en particular>S<e>Q<ID NO:5.>
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23,
A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ
ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5,
y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ
<ID NO:36, en particular>S<e>Q<ID NO:5.>
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al<menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en>particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al<menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en>particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al<menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en>particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80,
<85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular>S<e>Q
ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada a A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA de un polipéptido hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80,
<85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular>S<e>Q
ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80,
<85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular>S<e>Q
ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27,
A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92,
<93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en particular>S<e>Q<ID NO:5.>
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28,
A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41 o A42 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en
SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia<mostrada en>S<e>Q<ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92,>
<93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en particular>S<e>Q<ID NO:5.>
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23,
A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA
de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene<al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ i>D<NO:36,>en particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24,
A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al<menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en>particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25,
A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al<menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5>S<e>Q<ID NO:36, en>particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26,
A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80,
<85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular>S<e>Q
ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26,
A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80,
<85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular>S<e>Q
ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27,
A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos
en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, o A43 de GAA de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, aún más particularmente en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:36, en particular SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9 o A10, en particular una A7, A8 o A9, más particularmente A8, de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada<en s>E<q ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID n>O:5<o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.>
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma<truncada A27, A28, A29, A30 o A31, en particular una A28, a>29<o A30, más particularmente A29, de un polipéptido de>hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma<truncada A40, A41, A42, A43 o A44, en particular una A41, a>42<o A43, más particularmente A42, de un polipéptido de>hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma<truncada A41, A42, A43, A44 o A45, en particular una A42, a>43<o A44, más particularmente A43, de un polipéptido de>hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9, A10, A27, A28, A29, A30, A31, A40, A41, A42, A43, A44 o A45, en particular un A7, A8, A9, A28, A29, A30, A41, A42, A43 o A44, en particular A8, A29, A42 o A43, de un polipéptido de hGAA, y más<particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID n>O:5<o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5,>o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9, A10, A40, A41, A42, A43 o A44, en particular A8 o A42, de un polipéptido de hGAA, y más<particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID n>O:36,<en particular en SEQ i>D<NO:5,>o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A8, A29, A42, A43 o A47 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ iD NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A8, A29, A42 o A43 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5.
En otra variante de esta realización, el resto de GAA del polipéptido de GAA quimérica de la invención es una forma truncada A8 o A42 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID<NO:5, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID n>O:5<o SEQ ID NO:36,>en particular en SEQ ID NO:5.
En una realización específica, el resto de GAA en el polipéptido de GAA quimérica de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:43, en particular una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO:42, en particular una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:30.
La invención también se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. La construcción de ácido nucleico puede corresponder a un casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención, unida operativamente a una o más secuencias de control de expresión y/u otras secuencias que mejoran la expresión de un transgén y/o secuencias que mejoran la secreción de la proteína codificada y/o secuencias que mejoran la captación de la proteína codificada. Como se usa en el presente documento, el término "unido operativamente" se refiere a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico se "une operativamente" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, u otra secuencia reguladora de la transcripción, está unida operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Dichas secuencias de control de la expresión son conocidas en la técnica, tales como los promotores, potenciadores (como los módulos cis-reguladores (CRM)), intrones, señales de poliA, etc.
En particular, el casete de expresión puede incluir un promotor. El promotor puede ser un promotor ubicuo o específico de tejido, en particular un promotor capaz de promover la expresión en células o tejidos en los que la expresión de GAA es deseable, tal como en células o tejidos en los que la expresión de GAA es deseable en pacientes con deficiencia de GAA. En una realización particular, el promotor es un promotor específico del hígado, tal como el promotor de alfa-1 antitripsina (hAAT) (SEQ ID NO: 15), el promotor de transtiretina, el promotor de albúmina, el promotor de globulina fijadora de tiroxina (TBG), el promotor de LSP (que comprende una secuencia promotora de globulina fijadora de hormona tiroidea, dos copias de una secuencia potenciadora de alfa1 -microglobulina/bikunina, y una secuencia conductora - 34.Ill, C. R., et al. (1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30.), etc. Se conocen en la técnica otros promotores útiles específicos del hígado, por ejemplo, los enumerados en la Liver Specific Gene Promoter Database compilada por el Cold Spring Harbor Laboratory (http://rulai.cshl.edu/LSPD/). Un promotor preferido en el contexto de la invención es el promotor hAAT. En otra realización, el promotor es un promotor que dirige la expresión en un tejido o célula de interés (como en células musculares), y en células hepáticas. Por ejemplo, en cierta medida, los promotores específicos de las células musculares, tales como los promotores de desmina, Spc5-12 y MCK, pueden presentar cierta fuga de expresión a las células hepáticas, lo que puede ser ventajoso para inducir la tolerancia inmunitaria del sujeto a la proteína GAA expresada a partir del ácido nucleico de la invención.
Otros promotores específicos de tejido o no específicos de tejido pueden ser útiles en la práctica de la invención. Por ejemplo, el casete de expresión puede incluir un promotor específico de tejido que sea un promotor diferente de un promotor específico de hígado. Por ejemplo, el promotor puede ser específico de músculo, como el promotor de desmina (y una variante del promotor de desmina, tal como un promotor de desmina que incluya potenciadores naturales o artificiales), el promotor SPc5-12 o el promotor MCK. En otra realización, el promotor es un promotor específico de otro linaje celular, tal como el promotor de la eritropoyetina, para la expresión del polipéptido de GAA a partir de células del linaje eritroide.
En otra realización, el promotor es un promotor ubicuo. Promotores ubicuos representativos incluyen el potenciador del citomegalovirus/promotor de beta actina de pollo (CAG), el potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor PGK, el promotor temprano SV40, etc.
Además, el promotor también puede ser un promotor endógeno, tal como el promotor de la albúmina o el promotor GAA.
En una realización particular, el promotor está asociado a una secuencia potenciadora, tal como los módulos cisreguladores (CRM) o una secuencia potenciadora artificial. Por ejemplo, el promotor puede asociarse a una secuencia potenciadora, tal como la región de control de ApoE humana (o locus del gen de la apolipoproteína E/C-I humana, región de control hepático HCR-1 - n.° de acceso de Genbank U32510, mostrada en SEQ ID NO:16). En una realización particular, una secuencia potenciadora, tal como la secuencia ApoE, se asocia a un promotor específico del hígado, tal como los enumerados anteriormente, y en particular tal como el promotor de hAAT. Otros CRM útiles en la práctica de la presente invención incluyen los descritos en Rincón et al., Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52, Chuah et al., Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13 o Nair et al., Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9.
En otra realización particular, la construcción de ácido nucleico comprende un intrón, en particular un intrón situado entre el promotor y la secuencia codificante de GAA. Puede introducirse un intrón para aumentar la estabilidad del ARNm y la producción de la proteína. En otra realización, la construcción de ácido nucleico comprende un intrón de beta-globina humana b2 (o HBB2), un intrón de factor de coagulación IX (FIX), un intrón de SV40 o un intrón de betaglobina de pollo. En otra realización adicional, la construcción de ácido nucleico de la invención contiene un intrón modificado (en particular un intrón de HBB2 o FIX modificado) diseñado para disminuir el número de, o incluso eliminar totalmente, marcos de lectura abiertos alternativos (ARF) encontrados en dicho intrón. Preferiblemente, se eliminan los ARF cuya longitud supere los 50 pb y que tengan un codón de parada en marco con un codón de inicio. Los ARF pueden eliminarse modificando la secuencia del intrón. Por ejemplo, la modificación puede llevarse a cabo mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, preferiblemente mediante sustitución de nucleótidos. A título ilustrativo, uno o más nucleótidos, en particular un nucleótido, en un codón de inicio ATG o GTG presente en la secuencia del intrón de interés puede sustituirse dando lugar a un codón no de inicio. Por ejemplo, un ATG o un GTG puede sustituirse por un CTG, que no es un codón de inicio, dentro de la secuencia del intrón de interés.
El intrón de HBB2 clásico usado en las construcciones de ácido nucleico se muestra en SEQ ID NO:6. Por ejemplo, este intrón de HBB2 puede modificarse eliminando los codones de inicio (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón de HBB2 modificado comprendido en la construcción tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:7. El intrón clásico de FIX usado en las construcciones de ácido nucleico deriva del primer intrón de FIX humano y se muestra en SEQ ID NO:8. El intrón de FIX puede modificarse eliminando los codones de inicio (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón de FIX modificado incluido en la construcción de la invención tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:9. El intrón clásico de beta-globina de pollo usado en construcciones de ácido nucleico se muestra en SEQ ID NO: 10. El intrón de globina beta de pollo puede modificarse eliminando los codones de inicio (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón modificado de beta-globina de pollo comprendido en la construcción de la invención tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:11.
Los inventores han mostrado previamente en el documento de patente WO2015/162302 que dicho intrón modificado, en particular un intrón de HBB2 o FIX modificado, tiene propiedades ventajosas y puede mejorar significativamente la expresión de un transgén.
En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención es un casete de expresión que comprende, en la orientación 5' a 3', un promotor opcionalmente precedido por un potenciador, la secuencia codificante de la invención (es decir, la secuencia codificante GAA optimizada de la invención, la secuencia codificante GAA quimérica de la invención, o la secuencia codificante GAA quimérica y optimizada de la invención), y una señal de poliadenilación (tal como la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, la señal de poliadenilación SV40, u otra señal de poliadenilación natural o artificial). En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención es un casete de expresión que comprende, en la orientación 5' a 3', un promotor opcionalmente precedido por un potenciador (tal como la región de control de ApoE), un intrón (en particular un intrón como se ha definido anteriormente), la secuencia codificante de la invención, y una señal de poliadenilación. En otra realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención es un casete de expresión que comprende, en la orientación 5' a 3', un potenciador, tal como la región de control de ApoE, un promotor, un intrón (en particular un intrón como se ha definido anteriormente), la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación. En otra realización particular de la invención, el casete de expresión que comprende, en la orientación 5' a 3', una región de control de ApoE, el promotor específico de hAAT-hígado, un intrón de HBB2 (en particular un intrón de HBB2 modificado como se ha definido anteriormente), la secuencia codificante de la invención y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, tal como la construcción de ácido nucleico mostrada en cualquiera de SEQ ID NO:20 a SEQ ID NO:22, que incluye la molécula de ácido nucleico GAA de secuencia optimizada de SEQ ID NO: 13 combinada con cada una de las secuencias codificantes de péptido señalizador mostradas en SEQ ID NO:2 a 4. En otras realizaciones, el casete de expresión contiene la secuencia codificante resultante de una de las combinaciones de secuencias mostradas en la Tabla 2, Tabla 2" o Tabla 2" anteriores, en particular en la Tabla 2' o Tabla 2".
En una realización particular, el casete de expresión comprende la región de control ApoE, el promotor específico del hAAT-hígado, un intrón de HBB2 optimizado para codón, la secuencia codificante de la invención y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
Al diseñar la construcción de ácido nucleico de la invención, un experto en la materia tendrá cuidado de respetar el límite de tamaño del vector usado para suministrar dicha construcción a una célula u órgano. En particular, un experto en la materia sabe que una limitación importante del vector AAV es su capacidad de carga, que puede variar de un serotipo AAV a otro, pero se cree que está limitada a aproximadamente el tamaño del genoma vírico parental. Por ejemplo, 5 kb es el tamaño máximo que se cree que puede encapsidarse en una cápside de AAV8 (Wu Z. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 80-86; Lai Y. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 75-79; Wang Y. et al., Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): 225-33). En consecuencia, los expertos en la materia tendrán cuidado al practicar la presente invención para seleccionar los componentes de la construcción de ácido nucleico de la invención de modo que la secuencia de ácido nucleico resultante, incluyendo secuencias que codifican 5'- y 3'-ITR de AAV, no excedan preferiblemente el 110 % de la capacidad de carga del vector AAV implementado, en particular no excedan preferiblemente 5,5 kb.
También se divulga en el presente documento un vector que comprende una molécula o construcción de ácido nucleico como se divulga en el presente documento. En particular, el vector es un vector adecuado para la expresión de proteínas, preferentemente para su uso en terapia génica. En una realización, el vector es un vector plasmídico. En otra realización, el vector es una nanopartícula que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, en particular un ARN mensajero que codifica el polipéptido de GAA de la invención. En otra realización, el vector es un sistema basado en transposones, que permite la integración de la molécula de ácido nucleico o construcción de la invención en el genoma de la célula diana, tal como el sistema de transposón hiperactivo Sleeping Beauty (SB100X) (Mates et al. 2009). En otra realización, el vector es un vector vírico adecuado para terapia génica, dirigido a cualquier célula de interés, tal como tejido o células hepáticas, células musculares, células del SNC (tales como células cerebrales) o células madre hematopoyéticas, tal como células del linaje eritroide (tales como eritrocitos). En este caso, la construcción de ácido nucleico de la invención también contiene secuencias adecuadas para producir un vector vírico eficiente, como es bien conocido en la técnica. En una realización particular, el vector vírico deriva de un virus integrador. En particular, el vector vírico puede derivar de un retrovirus o un lentivirus. En otra realización particular, el vector vírico es un vector AAV, tal como un vector AAV adecuado para transducir tejidos o células hepáticas, más particularmente una variante AAV-1, -2 y AAV-2 (tal como AAV-2 optimizado de cápside cuádruple mutante que comprende una cápside manipulada con cambios Y44+500+730F+T491V, divulgada en Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods. [publicación electrónica antes de impresión]), -3 y variantes de AAV-3 (tales como la variante AAV3-ST que comprende una cápside de AAV3 manipulada con dos cambios de aminoácidos, S663V+T492V, divulgada en Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042), -3B y variantes de AAV-3B, -4, -5, -6 y variantes de AAV-6 (tales como la variante AAV6 que comprende la forma de cápside AAV6 triplemente mutada Y731F/Y705F/T492V divulgada en Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p. 16026), -7, -8, -9, -10 tales como -cy10 y -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, serotipos porcinos de AAV tales como AAVpo4 y AAVpo6, etc., vector o un vector retrovírico tal como un vector lentivírico y un alfa-retrovirus. Como es conocido en la técnica, dependiendo del vector vírico específico considerado para su uso, se introducirán secuencias adicionales adecuadas en la construcción de ácido nucleico de la invención para obtener un vector vírico funcional. Las secuencias adecuadas incluyen ITR de AAV para un vector AAV, o LTR para vectores lentivíricos. Como tal, la invención también se refiere a un casete de expresión como el descrito anteriormente, flanqueado por una ITR o una LTR a cada lado.
Las ventajas de los vectores víricos se discuten en la siguiente parte de esta divulgación. Se prefieren los vectores víricos para administrar la molécula o construcción de ácido nucleico de la invención, tal como un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentivírico, o un parvovirus no patógeno, más preferiblemente un vector AAV. El parvovirus humano el virus adenoasociado (AAV) es un dependovirus que es naturalmente defectuoso para la replicación que es capaz de integrarse en el genoma de la célula infectada para establecer una infección latente. Esta última propiedad parece ser única entre los virus de mamíferos porque la integración se produce en un sitio específico del genoma humano, denominado AAVS1, situado en el cromosoma 19 (19q13.3-qter). Por ello, los vectores AAV han suscitado un interés considerable como posibles vectores para la terapia génica humana. Entre las propiedades favorables del virus se encuentran su falta de asociación con cualquier enfermedad humana, su capacidad para infectar tanto células en división como en no división, y la amplia gama de líneas celulares derivadas de diferentes tejidos que pueden infectarse.
Entre los serotipos de AAV aislados de humanos o primates no humanos (NHP) y bien caracterizados, el serotipo humano 2 es el primer AAV que se desarrolló como vector de transferencia de genes. Otros serotipos de AAV usados actualmente incluyen AAV-1, variantes de AAV-2 (tales como el AAV-2 de cápside cuádruple mutante optimizada que comprende una cápside manipulada con cambios Y44+500+730F+T491V, divulgada en Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods. [publicación electrónica antes de impresión]), -3 y variantes de AAV-3 (tales como la variante AAV3-ST que comprende una cápside de AAV3 diseñada con dos cambios de aminoácidos, S663V+T492V, divulgada en Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042), -3B y variantes de AAV-3B, -4, -5, -6 y variantes de AAV-6 (tales como la variante AAV6 que comprende la forma de cápside AAV6 triplemente mutada Y731F/Y705F/T492V divulgada en Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p. 16026), -7, -8, -9, -10 tales como cy10 y -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, serotipos de AAV porcinos, tales como AAVpo4 y AAVpo6, y mutantes de la cápside de tirosina, lisina y serina de los serotipos de AAV, etcétera. Además, también pueden ser útiles otras variantes manipuladas no naturales y AAV quiméricos.
Los virus AAV pueden manipularse mediante técnicas convencionales de biología molecular, lo que permite optimizar estas partículas para la administración de secuencias de ácido nucleico a células específicas, para minimizar la inmunogenicidad, para ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, para una degradación eficaz, para una administración precisa al núcleo.
Los fragmentos de AAV deseables para ensamblar en vectores incluyen las proteínas cap, que incluyen las regiones vp1, vp2, vp3 e hipervariable, las proteínas rep, que incluyen rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteínas. Estos fragmentos pueden usarse fácilmente en una variedad de sistemas de vectores y células hospedadoras.
Los vectores recombinantes basados en AAV que carecen de la proteína Rep se integran con baja eficacia en el genoma del huésped y se presentan principalmente como episomas circulares estables que pueden persistir durante años en las células diana. Como alternativa al uso de serotipos naturales de AAV, pueden usarse serotipos artificiales de AAV en el contexto de la presente divulgación, incluyendo, sin limitación, AAV con una proteína de cápside no natural. Dicha cápside artificial puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, usando una secuencia de AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse de un serotipo de AAV seleccionado diferente, de porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente vírica que no sea de AAV o de una fuente no vírica. Un serotipo de AAV artificial puede ser, sin limitación, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV "humanizada". En consecuencia, se divulga en el presente documento un vector AAV que comprende la molécula o construcción de ácido nucleico de la invención. En el contexto de la presente divulgación, el vector AAV comprende una cápside de AAV capaz de transducir las células diana de interés, en particular hepatocitos. Según una realización particular, el vector AAV es de las variantes de AAV-1, -2, AAV-2 (tal como el AAV-2 de cápside cuádruple mutante optimizada que comprende una cápside manipulada con cambios Y44+500+730F+T491V, divulgada en Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods. [publicación electrónica antes de impresión]), -3 y variantes de AAV-3 (tales como la variante AAV3-ST que comprende una cápside de AAV3 diseñada con dos cambios de aminoácidos, S663V+T492V, divulgada en Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042), -3B y variantes de AAV-3B, -4, -5, -6 y variantes de AAV-6 (tales como la variante AAV6 que comprende la forma de cápside AAV6 triplemente mutada Y731F/Y705F/T492V divulgada en Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p. 16026), -7, -8, -9, -10 tales como -cy10 y -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, AAV porcinos, tales como AAVpo4 y AAVpo6, y mutantes de la cápside de tirosina, lisina y serina de un serotipo AAV, etc., serotipo. En una realización particular, el vector AAV es del serotipo AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8 (es decir, el vector AAV tiene una cápside del serotipo AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8). En otra realización particular, el vector AAV es un vector pseudotipado, es decir, su genoma y cápside derivan de AAV de serotipos diferentes. Por ejemplo, el vector AAV pseudotipado puede ser un vector cuyo genoma derive de uno de los serotipos de AAV mencionados anteriormente, y cuya cápside derive de otro serotipo. Por ejemplo, el genoma del vector pseudotipado puede tener una cápside derivada del serotipo AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8, y su genoma puede derivar de un serotipo diferente. En una realización particular, el vector AAV tiene una cápside del serotipo AAV8, AAV9 o AAVrh74, en particular del serotipo AAV8 o AAV9, más particularmente del serotipo AAV8.
En una realización específica, en donde el vector se usa para suministrar el transgén en células musculares, el vector AAV puede seleccionarse, entre otros, del grupo formado por AAV8, AAV9 y AAVrh74. En otra realización específica, en la que el vector se usa para liberar el transgén en células hepáticas, el vector AAV puede seleccionarse, entre otros, del grupo formado por AAV5, AAV8, AAV9, AAV-LK03, AAV-Anc80 y AAV3B.
En otra realización, la cápside es una cápside modificada. En el contexto de la presente divulgación, una "cápside modificada" puede ser una cápside quimérica o una cápside que comprende una o más proteínas de cápside VP variantes derivadas de una o más proteínas de cápside VP de AAV natural.
En una realización particular, el vector AAV es un vector quimérico, es decir, su cápside comprende proteínas de cápside VP derivadas de al menos dos serotipos AAV diferentes, o comprende al menos una proteína VP quimérica que combina regiones o dominios de proteína VP derivados de al menos dos serotipos AAV. Ejemplos de tales vectores AAV quiméricos útiles para transducir células hepáticas se describen en Shen et al., Molecular Therapy, 2007 y en Tenney et al., Virology, 2014. Por ejemplo, un vector AAV quimérico puede derivar de la combinación de una secuencia de cápside de AAV8 con una secuencia de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV8, como cualquiera de los específicamente mencionados anteriormente. En otra realización, la cápside del vector AAV comprende una o más variantes de proteínas de cápside VP como las descritas en el documento de patente WO2015013313, en particular las variantes de cápside RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6, que presentan un alto tropismo hepático.
En otra realización, la cápside modificada puede derivar también de modificaciones de la cápside insertadas por PCR propensa a errores y/o inserción de péptidos (por ejemplo, como se describe en Bartel et al., 2011). Además, las variantes de la cápside pueden incluir cambios de un solo aminoácido, tales como mutantes de tirosina (por ejemplo, como se describe en Zhong et al., 2008)
Además, el genoma del vector AAV puede ser genoma monocatenario o bicatenario autocomplementario (McCarty et al., Gene Therapy, 2003). Los vectores AAV bicatenarios autocomplementarios se generan eliminando el sitio de resolución terminal (trs) de una de las repeticiones terminales del AAV. Estos vectores modificados, cuyo genoma replicante tiene la mitad de longitud que el genoma AAV natural, tienen la tendencia a encapsidar dímeros de ADN. En una realización preferida, el vector AAV implementado en la práctica de la presente divulgación tiene un genoma monocatenario, y además comprende preferiblemente una cápside de AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8, en particular una cápside de AAV8, AAV9 o AAVrh74, tal como una cápside de AAV8 o AAV9, más particularmente una cápside de AAV8.
En una realización particularmente preferida, se divulga en el presente documento un vector AAV que comprende, en un genoma autocomplementario monocatenario o bicatenario (por ejemplo, un genoma monocatenario), la construcción de ácido nucleico de la invención. En una realización, el vector AAV comprende una cápside de AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2Í8, en particular una cápside de AAV8, AAV9 o AAVrh74, tal como una cápside de AAV8 o AAV9, más particularmente una cápside de AAV8. En otra realización particular, dicho ácido nucleico se une operativamente a un promotor, especialmente un promotor ubicuo o específico del hígado. Según una realización de variante específica, el promotor es un promotor ubicuo, tal como el potenciador de citomegalovirus/promotor de beta actina de pollo (CAG), el potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor PGK y el promotor temprano SV40. En una variante específica, el promotor ubicuo es el promotor CAG. Según otra variante, el promotor es un promotor específico del hígado, tal como el promotor de la alfa-1 antitripsina (hAAT), el promotor de la transtiretina, el promotor de la albúmina y el promotor de la globulina fijadora de tiroxina (TBG). En una variante específica, el promotor específico del hígado es el promotor específico del hígado hAAT de SEQ ID NO: 15. En otra realización particular, la construcción de ácido nucleico comprendida en el genoma del vector AAV de la presente divulgación comprende además un intrón como se ha descrito anteriormente, tal como un intrón situado entre el promotor y la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia codificante de GAA (es decir, la secuencia codificante de GAA optimizada de la invención, la secuencia codificante de GAA quimérica de la invención, o la secuencia codificante de GAA quimérica y optimizada de la invención). Los intrones representativos que pueden incluirse dentro de la construcción de ácido nucleico introducida dentro del genoma del vector AAV incluyen, sin limitación, el intrón de beta-globina b2 humana (o HBB2), el intrón de FIX y el intrón de beta-globina de pollo. Dicho intrón dentro del genoma del vector AAV puede ser un intrón clásico (o no modificado) o un intrón modificado diseñado para disminuir el número de, o incluso eliminar totalmente, marcos de lectura abiertos alternativos (ARF) dentro de dicho intrón. Los intrones modificados y no modificados que pueden usarse en la práctica de esta realización en la que el ácido nucleico de la invención se introduce dentro de un vector AAV se describen detalladamente más arriba. En una realización particular, el vector AAV, en particular un vector AAV que comprende una cápside de AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8, en particular una cápside de AAV8, AAV9 o AAVrh74, tal como una cápside de AAV8 o AAV9, más particularmente una cápside de AAV8, de la presente divulgación incluye dentro de su genoma un intrón modificado (u optimizado), tal como el intrón de HBB2 modificado de SEQ ID NO:7, el intrón de FIX modificado de SEQ ID NO:9 y el intrón de beta-globina de pollo modificado de SEQ ID NO:11. En otra realización particular, el vector de la presente divulgación es un vector AAV que comprende una cápside de AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8, en particular una cápside de AAV8, AAV9 o AAVrh74, tal como una cápside AAV8 o AAV9, más particularmente una cápside AAV8, que comprende un genoma que contiene, en la orientación de 5' a 3’: una 5'-ITR de AAV (tal como un 5'-ITR de AAV2); una región de control ApoE; el promotor específico de hígado hAAT; un intrón de HBB2 (en particular un intrón de HBB2 modificado como se ha definido anteriormente); la secuencia codificante de GAA de la invención; la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina; y una 3'-ITR de AAV (tal como una 3'-ITR de AAV2), tal como un genoma que comprende un ácido nucleico mostrado en SEQ ID NO:20, 21 o 22 (que incluye la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO:17, 18 y 19, respectivamente, correspondiente a una secuencia optimizada que codifica una forma truncada A8 de GAA derivada de la hGAA parental de SEQ ID NO:5) flanqueada por una 5'-ITR de AAV (tal como una 5'-ITR de AAV2) y una 3'-ITR de AAV (tal como una 3'-ITR de AAV2). Otros casetes de expresión útiles en la práctica de la presente divulgación comprenden ese resto de péptido señalizador y resto de GAA en cualquiera de las combinaciones de secuencia mostradas en la Tabla 2, Tabla 2' o Tabla 2", en particular en la Tabla 2' o Tabla 2" anteriores.
En una realización particular de la invención, la construcción de ácido nucleico de la invención comprende un promotor específico de hígado como se ha descrito anteriormente, y el vector es un vector vírico capaz de transducir tejido o células hepáticas como se ha descrito anteriormente. Los inventores presentan a continuación datos que muestran que las propiedades protolerogénicas y metabólicas del hígado se implementan ventajosamente gracias a esta realización para desarrollar vectores altamente eficientes y optimizados para expresar formas secretables de GAA en hepatocitos y para inducir tolerancia inmunitaria a la proteína.
Además, en otra realización particular, la presente divulgación proporciona la combinación de dos vectores, tales como dos vectores víricos, en particular dos vectores AAV, para mejorar la administración de genes y la eficacia del tratamiento en las células de interés. Por ejemplo, los dos vectores pueden llevar la molécula de ácido nucleico de la invención que codifica la proteína GAA de la invención, bajo el control de un promotor diferente en cada uno de estos dos vectores. En una realización particular, un vector comprende un promotor que es un promotor específico de hígado (como uno de los descritos anteriormente), y el otro vector comprende un promotor que es específico de otro tejido de interés para el tratamiento de un trastorno de almacenamiento de glucógeno, tal como un promotor específico de músculo, por ejemplo, el promotor de desmina. En una variante particular de esta realización, esta combinación de vectores corresponde a múltiples vectores AAV coencapsidados producidos como se describe en el documento de patente WO2015196179.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido de GAA quimérica, que comprende un resto de péptido señalizador y un resto de GAA, en donde el péptido señalizador de GAA natural se sustituye por un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4. En una realización particular, el polipéptido de GAA quimérica de la invención puede ser un polipéptido derivado de una forma truncada de GAA, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la proteína GAA quimérica de la invención puede ser un resto de la forma truncada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46, A47, A48, A49, A50, A51, A52, A53, A54, A55, A56, A57, A58, A59, A60, A61, A62, A63, A64, A65, A66, A67, A68, A69, A70, A71, A72, A73, A74 o A75 de GAA (en particular una forma truncada de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), fusionado en su extremo aminoterminal a un péptido señalizador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
En una realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A6, A7, A8, A9 o A10 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma truncada A7, A8 o A9 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental<mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID n>O:5),<en particular una forma truncada A8 de>GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra realización particular, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A27, A28, A29, A30 o A31, en particular A28, A29 o A30, más particularmente A29, de un polipéptido de hGAA, y más particularmente<del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID n>O:<1, o de una variante>funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ<ID NO:33, en particular en s>E<q ID NO: 1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad>con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1.
En otra realización particular, el resto de GAA de la proteína GAA quimérica es una forma truncada A40, A41, A42, A43 o A44 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma truncada A41, A42 o A43 de GAA (en particular de la proteína<hGAA parental mostrada en>S<e>Q<ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5), en particular una forma>truncada A42 de GAA (en particular de la proteína hGAA parental mostrada en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:36, en particular en SEQ ID NO:5).
En otra variante de esta realización, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A41, A42, A43, A44 o A45, en particular A42, A43 o A44, más particularmente A43, de un polipéptido de hGAA, y más<particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en>S<e>Q<ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ i>D<NO: 1,>o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO: 1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1.
En otra variante de esta realización, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9, A10, A27, A28, A29, A30, A31, A40, A41, A42, A43, A44 o A45, en particular A7, A8, A9, A28, A29, A30, A41, A42, A43 o A44, en particular A8, A29, A42 o A43, de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido<de hGAA mostrado en SEQ ID n>O:<1 o SEQ ID n>O:33,<en particular en SEQ ID NO: 1, o de una variante funcional del>mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO: 1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1.
En otra variante de esta realización, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A6, A7, A8, A9, A10, A40, A41, A42, A43 o A44, en particular A8 o A42, de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ<ID NO:33, en particular en s>E<q ID NO:1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad>con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1.
En otra variante de esta realización, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A8, A29, A42, A43 o A47 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO: 1.
En otra variante de esta realización, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A8, A29, A42 o A43 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO: 1.
En otra variante de esta realización, el polipéptido de GAA truncado de la invención es una forma truncada A8 o A42 de un polipéptido de hGAA, y más particularmente del polipéptido de hGAA mostrado en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO:1, o de una variante funcional del mismo que comprende sustituciones de aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO: 1, y que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:33, en particular en SEQ ID NO: 1.
En una realización específica, el polipéptido de hGAA truncado de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:43, o una variante funcional de la misma que comprende de 1 a 5 aminoácidos, en particular de 1 a 4, en particular de 1 a 3, más particularmente de 1 a 2, en particular 1 sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29, SEQ ID N<o>:30, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 o SEQ ID N<o>:43. En otra realización específica, el polipéptido de hGAA truncado de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42, o una variante funcional de la misma que comprende de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42. En una realización específica, el polipéptido de hGAA truncado de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:30, o una variante funcional de la misma que comprende de 1 a 5 aminoácidos, en particular de 1 a 4, en particular de 1 a 3, más particularmente de 1 a 2, en particular 1 sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:30.
En una realización particular, el polipéptido de GAA quimérica tiene la secuencia resultante de una de las combinaciones mostradas en la Tabla 1, Tabla 1' o Tabla 1" anteriores, en particular en la Tabla 1' o Tabla 1", o es un derivado funcional del mismo que tiene al menos 90 % de identidad, en particular al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad con la combinación de secuencias resultante.
La invención también se refiere a una célula, por ejemplo, una célula hepática, que se transforma con una molécula o construcción de ácido nucleico de la invención, como es el caso de la terapia génicaex vivo.Las células de la invención pueden administrarse al sujeto que las necesite, como un paciente con deficiencia de GAA, por cualquier vía de administración adecuada, como una inyección en el hígado o en el torrente sanguíneo de dicho sujeto. En una realización particular, la invención consiste en introducir el ácido nucleico de la invención en células hepáticas, en particular en células hepáticas del sujeto a tratar, y administrar dichas células hepáticas transformadas en las que se ha introducido el ácido nucleico al sujeto. Ventajosamente, esta realización es útil para secretar GAA de células dichas. En una realización particular, las células hepáticas son células hepáticas del paciente a tratar, o son células madre hepáticas que se transforman y diferencianin vitroen células hepáticas, para su posterior administración al paciente.
La presente invención se refiere además a un animal no humano transgénico que comprende en su genoma la molécula o construcción de ácido nucleico que codifica una proteína GAA según la invención. En una realización particular, el animal es un ratón.
Aparte de los sistemas de administración específicos plasmados a continuación en los ejemplos, se conocen diversos sistemas de administración que pueden usarse para administrar la molécula o construcción de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la secuencia codificante de la invención, endocitosis mediada por receptor, construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retrovírico u otro vector, etc.
Según una realización, puede ser deseable introducir el polipéptido de GAA quimérica, la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico o la célula de la invención en el hígado del sujeto por cualquier vía adecuada. Además, puede usarse ADN desnudo, tales como minicírculos y transposones, o vectores lentivíricos. Además, las tecnologías de edición de genes, tales como las nucleasas de dedos de zinc, meganucleasas, TALEN y CRISPR, también pueden usarse para administrar la secuencia codificante de la invención.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención. La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector divulgado en el presente documento. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del terapéutico (la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, o el vector de la presente divulgación), y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluido en la farmacopea estadounidense o europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.
La composición, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La formulación oral puede incluir portadores habituales, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del terapéutico, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador a fin de proporcionar la forma para la administración adecuada al sujeto. En una realización particular, el ácido nucleico o célula de la invención, o el vector divulgado en el presente documento, se formula en una composición que comprende solución salina tamponada con fosfato y suplementada con 0,25 % de seroalbúmina humana. En otra realización particular, el ácido nucleico, o la célula de la invención, o el vector divulgado en el presente documento, se formula en una composición que comprende lactato de ringer y un tensioactivo no iónico, tal como plurónico F68 a una concentración final de 0,01-0,0001 %, tal como a una concentración de 0,001 %, en peso de la composición total. La formulación puede comprender además seroalbúmina, en particular seroalbúmina humana, por ejemplo, seroalbúmina humana al 0,25 %. Se conocen en la técnica otras formulaciones apropiadas para el almacenamiento o la administración, en particular a partir del documento de patente WO 2005/118792 o Allay et al., 2011.
En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como la lignocaína, para aliviar el dolor en el lugar de la inyección.
En una realización, la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, o el vector divulgado en el presente documento, pueden administrarse en una vesícula, en particular un liposoma. En otra realización, la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, o el vector en el presente documento divulgado, pueden administrarse en un sistema de liberación controlada.
Los métodos de administración de la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, o el vector divulgado en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. En una realización particular, la administración se realiza por vía intravenosa o intramuscular. La molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, o el vector divulgado en el presente documento, vectorizado o no, puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente a la zona que necesita tratamiento, por ejemplo, el hígado. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras.
La cantidad del terapéutico (es decir, la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención) de la invención, o la cantidad del vector divulgado en el presente documento, que será eficaz en el tratamiento de una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, puede determinarse mediante técnicas clínicas habituales. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayosin vivoy/oin vitropara ayudar a predecir los intervalos de dosis óptimos. La dosis exacta que se emplee en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad, y deberá decidirse según el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. La dosis de la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, o del vector divulgado en el presente documento, administrada al sujeto que la necesite variará en función de varios factores, incluyendo, sin limitación, la vía de administración, la enfermedad específica tratada, la edad del sujeto o el nivel de expresión necesario para obtener el efecto terapéutico. Un experto en la materia puede determinar fácilmente, basándose en sus conocimientos en este campo, el intervalo de dosis necesario en función de estos factores y otros. En el caso de un tratamiento que comprende la administración al sujeto de un vector vírico, como un vector AAV, las dosis típicas del vector son de al menos 1 x108 genomas del vector por kilogramo de peso corporal (gv/kg), como al menos 1x109 gv/kg, al menos 1x1010 gv/kg, al menos 1x10” gv/kg, al menos 1x1012 gv/kg al menos 1x1013 gv/kg, o al menos 1x1014 gv/kg.
También se divulga en el presente documento un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, que comprende una etapa de suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico, el polipéptido quimérico, la composición farmacéutica o la célula de la invención, o del vector divulgado en el presente documento, a un sujeto que lo necesite.
También se divulga en el presente documento un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, dicho método no induce respuesta inmunitaria al transgén (es decir, al polipéptido de GAA quimérica de la invención), o induce una respuesta inmunitaria reducida al transgén, que comprende un paso de administración de una cantidad terapéutica eficaz de la molécula de ácido nucleico, construcción de ácido nucleico, composición farmacéutica o célula de la invención, o del vector divulgado en el presente documento, a un sujeto que lo necesita. También se divulga en el presente documento un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, que comprende la administración repetida de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de ácido nucleico, construcción de ácido nucleico, composición farmacéutica o célula de la invención, o del vector divulgado en el presente documento, a un sujeto que lo necesite. En este aspecto, la molécula de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico de la invención comprende un promotor que es funcional en células hepáticas, permitiendo así tolerancia inmunitaria al polipéptido de GAA quimérica expresado producido a partir del mismo. Asimismo, en este aspecto, la composición farmacéutica usada en este aspecto comprende una molécula de ácido nucleico o construcción de ácido nucleico que comprende un promotor que es funcional en células hepáticas. En caso de administración de células hepáticas, dichas células pueden ser células recogidas previamente del sujeto que necesita el tratamiento y que se modificaron introduciendo en ellas la molécula de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico de la invención para hacerlas capaces de producir el polipéptido de GAA quimérica de la invención. Según una realización, en el aspecto que comprende una administración repetida, dicha administración puede repetirse al menos una vez o más, e incluso puede considerarse que se realiza según un programa periódico, tal como una vez por semana, por mes o por año. El programa periódico también puede comprender una administración una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años, o más de 10 años. En otra realización particular, la administración de cada administración de un vector vírico en el presente documento divulgado se realiza usando un virus diferente para cada administración sucesiva, evitando así una reducción de la eficacia debido a una posible respuesta inmunitaria contra un vector vírico administrado previamente. Por ejemplo, puede realizarse una primera administración de un vector vírico que comprende una cápside de AAV8, seguida de la administración de un vector que comprende una cápside de AAV9, o incluso de la administración de un virus no relacionado con los AAV, tal como un vector retrovírico o lentivírico.
Según la presente invención, un tratamiento puede incluir efectos curativos, paliativos o profilácticos. En consecuencia, el tratamiento terapéutico y profiláctico incluye la mejora de los síntomas de una enfermedad particular de almacenamiento de glucógeno o la prevención o reducción de otro modo del riesgo de desarrollar una enfermedad particular de almacenamiento de glucógeno. El término "profiláctico" puede considerarse como la reducción de la gravedad o la aparición de una enfermedad concreta. El término "profiláctico" también incluye la prevención de la reaparición de una enfermedad concreta en un paciente al que se le haya diagnosticado previamente dicha enfermedad. "Terapéutico" también puede reducir la gravedad de una afección existente. El término "tratamiento" se usa en el presente documento para referirse a cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal, en particular a un mamífero, más concretamente a un sujeto humano.
También se divulga un método de terapia génicaex vivopara el tratamiento de una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico de la invención en una célula aislada de un paciente que lo necesite, por ejemplo, una célula madre hematopoyética aislada, e introducir dicha célula en dicho paciente que lo necesite. En una realización particular de este aspecto, la molécula o construcción de ácido nucleico se introduce en la célula con un vector como se ha definido anteriormente. En una realización particular, el vector es un vector vírico integrador. En otra realización particular, el vector vírico es un vector retrovírico, tal como un vector lentivírico. Por ejemplo, un vector lentivírico como el divulgado en van Til et al., 2010, Blood, 115(26), p. 5329, puede usarse en la práctica en el método de la presente divulgación.
La invención también se refiere a la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención para su uso como medicamento. La presente divulgación también proporciona el vector divulgado en el presente documento, para su uso como medicamento.
La invención también se refiere a la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, para su uso en un método para tratar una enfermedad causada por una mutación en el gen GAA, en particular en un método para tratar la enfermedad de Pompe. También se proporciona en el presente documento el vector como se ha descrito anteriormente, para su uso en un método para tratar una enfermedad causada por una mutación en el gen GAA, en particular en un método para tratar la enfermedad de Pompe. La invención se refiere además a la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, para su uso en un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, tal como GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDIII (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII y enfermedad congénita letal por almacenamiento de glucógeno del corazón, más particularmente GSDI, GSDII o GSDIII, aún más particularmente GSDII y GSDIII, y más particularmente GSDII. También se proporciona un vector como se divulga en el presente documento para su uso en un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, tal como GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDIII (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII y enfermedad congénita letal por almacenamiento de glucógeno del corazón, más particularmente GSDI, GSDII o GSDIII, incluso más particularmente GSDII y GSDIII, y más particularmente GSDII. El polipéptido de GAA quimérica de la invención puede administrarse a un paciente que lo necesite, para su uso en terapia de reemplazo enzimático (TRE), tal como para su uso en terapia de reemplazo enzimático de una de las enfermedades por almacenamiento de glucógeno, tal como GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDIII (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII y enfermedad por almacenamiento de glucógeno congénita letal del corazón, más particularmente GSDI, GSDII o GSDIII, aún más particularmente GSDII y GSDIII, y más particularmente GSDII.
También se divulga el uso de la molécula de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico, el vector, el polipéptido de GAA quimérica o la célula de la invención, en la fabricación de un medicamento útil para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, tal como GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDIII (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII y enfermedad congénita letal por almacenamiento de glucógeno del corazón, más particularmente GSDI, GSDII o GSDIII, aún más particularmente GSDII y GSDIII, y más particularmente GSDII .
EJEMPLOS
La invención se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales y a las figuras adjuntas. Estos ejemplos se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no pretenden ser limitativos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Actividad de GAA
La actividad de GAA se midió tras la homogeneización de muestras de tejido congeladas en agua destilada. Se pesaron 50-100 mg de tejido y se homogeneizaron, después se centrifugaron durante 20 minutos a 10000 x g. La reacción se preparó con 10 gl de sobrenadante y 20 gl de sustrato - 4MUa-D-glucósido, en una placa de 96 pocillos. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante una hora, y después se detuvo añadiendo 150 gl de tampón carbonato sódico pH 10,5. Se usó una curva patrón (0-2500 pmol/gl de 4MU) para medir 4MU fluorescente liberado de la mezcla de reacción individual, usando el lector de placas EnSpire alpha (Perkin-Elmer) a 449 nm (emisión) y 360 nm (excitación). La concentración de proteínas del sobrenadante clarificado se cuantificó mediante BCA (Thermo Fisher Scientific). Para calcular la actividad de GAA, se dividió la concentración de 4MU liberado por la concentración de proteína de la muestra y se informó de la actividad como nmol/hora/mg de proteína.
Contenido de glucógeno
El contenido de glucógeno se midió indirectamente como la glucosa liberada tras la digestión total por amiloglucosidasa deAspergillus nigerde los homogeneizados de tejido obtenidos como se ha descrito anteriormente. La reacción se preparó en una placa de 96 pocillos con 20 gl de homogeneizado tisular y 55 gl de agua destilada. Las muestras se incubaron durante 5 min a 95 °C y luego se enfriaron a 4 °C. Se añadieron 25 gl de amiloglucosidasa (diluida 1:50 en acetato de potasio 0,1 M pH 5,5) a cada muestra. También se preparó una reacción de control sin amiloglucosidasa para cada muestra. Tanto la muestra como la reacción de control se incubaron a 37 °C durante 90 minutos. La reacción se detuvo incubando las muestras durante 5 minutos a 95 °C. La glucosa liberada se determinó usando el kit de ensayo de glucosa (Sigma-Aldrich) midiendo la absorbancia usando el lector de placas EnSpire alpha (Perkin-Elmer) a 540 nm.
Pletismografía
Se usó un pletismógrafo de flujo (0,5 l/min) (EMKA technologies) para medir el patrón de respiración en ratones de control y Gaa-/-. Se calibró una cámara de plexiglás transparente con señales de flujo de aire y presión conocidas antes de la recogida de datos. Las señales se analizaron usando el software IOX2 (EMKA technologies). Se midieron las siguientes variables: frecuencia respiratoria, volumen corriente y ventilación minuto. Los datos de ventilación se recogieron en intervalos de 5 minutos. Se dejaron cinco minutos para la aclimatación a la cámara. Durante la aclimatación y la adquisición de datos, los ratones respiraron aire normóxico (21 % de O2, 79 % de N2).
Estudios con ratones
El ratón Gaa -/- se generó por disrupción dirigida del exón 6 y se mantiene en el fondo C57BL/6J/129X1/SvJ (Raben N. et al 1998). Los vectores se administraron a través de la vena de la cola en un volumen de 0,2 ml. Se recogieron muestras de suero mensualmente para monitorizar los niveles de hGAA secretada. Se usaron como controles animales afectados inyectados con PBS y compañeros de camada naturales.
Determinación de anticuerpos anti-hGAA
Las placas Maxisorp de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con la proteína Myozime® en tampón carbonato a 4 °C durante la noche. Se recubrió los pocillos con una curva estándar de IgG recombinante de rata (Sigma Aldrich) en siete diluciones dobles a partir de 1 gg/ml. Tras el bloqueo, las muestras de plasma se añadieron a las placas y se incubaron 1 hora a 37 °C. La detección se realizó añadiendo a los pocillos sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BD Biosciences), y el desarrollo del color se midió a 450 y 570 nm (para sustracción de fondo) en un lector de placas Enspire (Perkin Elmer) después de bloquear la reacción con H2SO4.
Estudio de NHP
Se alojaron macacos cangrejeros en jaulas de acero inoxidable y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Todos los macacos tenían títulos de anticuerpos neutralizantes <1:5 antes del inicio del estudio. Se infundió una dosis de 2E12 gv/kg de AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1 a través de la vena safena. Se tomaron muestras de sangre 12 días antes y 30 días después de la inyección a través de la vena femoral. La sangre total se recogió en tubos que contenían EDTA y se centrifugó para separar el suero. Tres meses después de la administración del vector se practicó la eutanasia a todos los macacos. Primero se anestesió a los animales con una mezcla de ketamina/dexmedetomidina y luego se les aplicó la eutanasia usando pentobarbital sódico inyectado IV. Los tejidos se recogieron inmediatamente y se congelaron en nitrógeno líquido.
Análisis de transferencia Western
Se obtuvieron homogeneizados totales a partir de músculos congelados. Se determinó la concentración de proteínas en los extractos mediante el ensayo de proteínas de Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. La transferencia Western se realizó con un anticuerpo anti-hGAA (Abeam). Como controles de carga se usó un anticuerpo anti-tubulina (Sigma Aldrich).
RESULTADOS
En un esfuerzo por mejorar las terapias actuales de reemplazo génico para la enfermedad de Pompe, los presentes inventores diseñaron la secuencia hGAA para aumentar su secreción intercambiando el péptido señalizador natural (indicado en el presente documento como sp1) con diferentes péptidos señalizadores (sp2 a 8, descritos en la Tabla 4) en la secuencia optimizada para secuencia de hGAA (SEQ ID NO: 13).
Tabla 4
Los presentes inventores han transfectado las células de hepatoma (Huh-7) con plásmidos que expresan GFP o hGAA natural (hGAA; SEQ ID NO:37) en paralelo con plásmidos que expresan hGAA de codón optimizado (hGAAco) fusionada con los péptidos señalizadores 1 a 8.48 horas después de la transfección se analizó el medio de crecimiento para detectar la presencia de hGAA. Cabe destacar que solo cuatro de las construcciones que portaban un péptido señalizador eficaz condujeron a la secreción de niveles de hGAA significativamente superiores a los observados en el control negativo representado por las células transfectadas con GFP (Figura 1A). Las construcciones que expresaban la proteína quimérica hGAA portadora de los péptidos señalizadores sp2, sp6, sp7 y sp8 secretaban mayores niveles de hGAA en el medio (p<0,05 frente a GFP).
A continuación, se encapsidó estas construcciones en vectores AAV8 producidos mediante transfección triple y purificación con cloruro de cesio y los inyectamos en ratones C57BL/6J naturales. A continuación, se comparó los niveles séricos de GAA in vivo entre las construcciones en las que se usaron los péptidos señalizadores sp 1, 2, 3, 7 y 8 (figura 1B). Un mes después de la inyección de 1E12 gv/kg de vectores AAV8 que expresaban hGAAco se observó un nivel significativamente mayor de hGAA circulante en comparación con los ratones inyectados con PBS. Curiosamente, el nivel de hGAA circulante fue significativamente mayor en los ratones tratados con vectores que expresaban hGAAco fusionado con sp2, 7 y 8. Sorprendentemente, los niveles de secreción alcanzados con la construcción sp2in vivofueron significativamente inferiores a los medidos con hGAA diseñada con sp7 y sp8 (Figura 1B). En conjunto, estos datos indican que la sustitución del péptido señalizador natural con péptidos señalizadores derivados de una proteína secretada eficazmente en el hígado es una estrategia eficaz para aumentar el nivel circulante de hGAAin vivo.Además, los resultados inesperados obtenidosin vivocon los péptidos señalizadores sp7 y 8 indican que no todos los péptidos señalizadores son igualmente eficaces in vivo, y que los péptidos señalizadores sp7 y sp8 impulsan una eficacia superior de secreción in vivo en comparación con sp1 y sp2.
Estos hallazgos se confirmaron posteriormente en un modelo animal de la enfermedad, los ratones GAA-/-. Este modelo de ratón no presenta actividad residual de la enzima en el músculo, junto con una acumulación de glucógeno en distintos órganos, lo que provoca un deterioro de la fuerza muscular y una reducción de la esperanza de vida.
Para comparar la eficacia de los diferentes vectores en el rescate del fenotipo de la enfermedad de Pompe en ratones GAA-/-, se siguió a largo plazo los efectos de la inyección de 2E12 gv/kg de vectores que expresaban hGAAco y la versión manipulada fusionada con los péptidos señalizadores sp2, 7 y 8. Tres meses después de las inyecciones, se observó un aumento significativo de hGAA circulante tras la inyección con AAV8 que expresaba hGAAco con los péptidos señalizadores sp2, 7 y 8 de alta eficacia (Figura 2A). En particular, el hGAAco fusionado con el péptido señalizador sp7 condujo a niveles de hGAA en circulación significativamente superiores a los observados para las otras dos construcciones. El seguimiento a largo plazo en este experimento permitió estimar la supervivencia de los ratones GAA -/-. Los ratones fueron inyectados a los 4 meses de edad y seguidos durante seis meses. Durante este periodo, 8/10 ratones GAA-/- murieron en el grupo inyectado con PBS, mientras que solo 1 /45 murieron en los animales GAA-/- tratados con construcciones que expresaban hGAAco y en los animales naturales. La significación estadística de este hallazgo (figura 2B) indica que el tratamiento con todos los vectores que expresan hGAAco, independientemente del nivel de secreción, rescata el fenotipo letal observado en los ratones GAA -/-. Otro fenotipo observado en este modelo de ratón es una disminución de la función respiratoria. En particular, se ha informado de una disminución del volumen corriente (DeRuisseau et al PNAS 2008) y se ha demostrado que la disminución se debe a la acumulación de glucógeno en el sistema nervioso. El rescate del nivel de glucógeno en el sistema nervioso depende de la capacidad del hGAA para cruzar la barrera hematoencefálica y se ha demostrado en otros trastornos por almacenamiento lisosómico (Polito et al Hum. Mol. Genet. 2010, Cho et al Orph. J. of Rare Dis. 2015) que esto depende directamente de los niveles circulantes de la proteína. Por lo tanto, se evaluó el efecto del alto nivel circulante de hGAA a largo plazo en el volumen corriente de los ratones GAA-/-. Tres meses después de las inyecciones, los ratones GAA-/- mostraron una disminución, aunque no significativa (p = 0,104), del volumen corriente, mientras que los ratones tratados con sp7 mostraron un volumen corriente muy similar al observado en los ratones WT (p = 0,974) (figura 2C, izquierda). Seis meses después de las inyecciones, solo sobrevivieron dos ratones GAA -/-, que parecen presentar un fenotipo respiratorio menos grave. De nuevo, los ratones tratados con hGAAco sp7 tenían un volumen corriente similar al observado en los animales WT (p= 0,969) (figura 2C, derecha). Es importante destacar que se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el volumen corriente medido en los ratones tratados con hGAAco sp1 y sp7 (p = 0,041), mostrando una mejora más marcada en los ratones tratados con sp7-GAA. En conjunto, estos datos indican que la transducción hepática con un AAV8 que expresa hGAAco fusionado con el péptido señalizador sp7 da lugar a un nivel superior de hGAA en la sangre con una corrección fenotípica completa concomitante de la función respiratoria en ratones GAA-/-.
A continuación, se verificó si el alto nivel de hGAA circulante rescataba la acumulación de glucógeno en el músculo esquelético. Medimos la actividad de hGAA en el cuádriceps de ratones inyectados como se ha descrito anteriormente. La inyección de vectores que expresan hGAA provocó un aumento de la actividad hGAA en el cuádriceps hasta niveles comparables a los observados en animales WT (figura 3A). La medición del glucógeno en el cuádriceps indica que los ratones GAA-/- acumulan ~ 20 veces más glucógeno que los animales WT (p = 3,5E-6). Esta acumulación se invierte con el tratamiento con el vector que expresa hGAA (p<0,05 frente a GAA-/-), siendo sp7 el que muestra los niveles más bajos de glucógeno, indistinguibles de los niveles de animales naturales (p = 0,898 frente a WT) (figura 3B).
Para verificar que la fusión de hGAA con un péptido señalizador eficiente mejora su secreción y aumenta la corrección fenotípica de la enfermedadin vivo,se inyectó a ratones GAA-/- con una dosis baja de vector, y se evaluó la corrección bioquímica del fenotipo. Tres meses después de la inyección de 6E11 gv/kg de vectores que expresaban hGAAco fusionada con el péptido señalizador 1, 7 y 8, medimos la hGAA circulante. Notablemente, los sp 7 y 8 condujeron a un aumento tres veces mayor de la hGAA secretada detectable en suero en comparación con los ratones tratados con PBS (Figura 4A). Además, se investigó los efectos terapéuticos de los vectores AAV8 que expresan hGAAco realizando análisis bioquímicos de los tejidos de los animales tratados y de los controles. Se evaluó el contenido de glucógeno en corazón, diafragma y cuádriceps de ratones GAA-/- tratados como se ha descrito anteriormente. En particular, se observó altos niveles de hGAA en los tejidos tras el tratamiento con vectores que expresaban hGAAco (datos no mostrados) que se correlacionaban con una reducción significativa del contenido de glucógeno en todos los tejidos considerados (figura 4B-D). En particular, en el corazón (figura 4B) el nivel de glucógeno medido tras el tratamiento con vectores portadores de los péptidos señalizadores de alta eficacia sp7 y 8 no se distinguía de los observados en animales naturales no afectados (p = 0,983 y 0,996 frente a WT respectivamente). Es importante destacar que el nivel observado tras el tratamiento con los vectores sp7 y sp8 se redujo significativamente en comparación con los animales GAA-/- inyectados con PBS o tratados con el vector que expresa hGAAco natural (señalado como sp1).
También se comprobó si la transducción hepática con nuestros vectores inducía una respuesta humoral contra el transgén. Se inyectaron ratones por vía intravenosa con vectores AAV8 que expresaban hGAAco1 con el péptido señalizador sp1 nativo (co) o A8-hGAAco1 fusionado con sp2, sp7 o sp8 bajo el control transcripcional de un promotor específico hepático. Los resultados se presentan en la Figura 5. Gaa-/- inyectados intramuscularmente con un AAV que expresaba A8-hGAAco1 bajo el control transcripcional de un promotor constitutivo mostró un nivel muy alto de IgG total (~150 pg/ml), mientras que en general el vector que expresaba la misma proteína en el hígado mostró un nivel más bajo de respuesta humoral. Curiosamente, los ratones inyectados con el vector sp1 que expresa hGAAco1 (co) mostraron un nivel detectable de anticuerpos en ambas dosis, mientras que los ratones inyectados con los vectores de ingeniería de alta secreción tenían niveles indetectables de IgG. Estos datos indican que la expresión de un transgén en el hígado es fundamental para la inducción de tolerancia periférica, también proporcionan indicios de que altos niveles circulantes de un hGAA, conseguidos por la fusión con un péptido señalizador eficaz, inducen una reducción de la respuesta humoral contra la propia proteína.
El vector de mejor rendimiento seleccionado del estudio con ratones se inyectó en dos primates no humanos (NHP,Macaca fascicularissp.) para verificar la eficacia de la secreción del vector de los presentes inventores y la captación en los músculos. Se inyectó a dos monos com 2E12 gv/kg de AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1. Un mes después de la inyección se midieron los niveles de hGAA en el suero de los dos animales mediante transferencia Western usando un anticuerpo específico anti-hGAA. Se observó una banda clara con un tamaño compatible con el del hGAA en los dos monos. Esta banda no estaba presente en las muestras de suero obtenidas 12 días antes de la inyección del vector, confirmando así la especificidad del método de detección de los presentes inventores (Figura 6A). Tres meses después de la inyección se sacrificó a los animales y se obtuvieron tejidos para verificar si la hGAA secretada desde el hígado en el torrente sanguíneo eran captada eficientemente por el músculo. Se realizó una transferencia Western usando un anticuerpo específico para hGAA en lisados totales obtenidos de bíceps y diafragma de los dos monos. Curiosamente, se pudo observar una banda clara en el animal número 2, que también mostró los niveles más altos de hGAA en el torrente sanguíneo (Figura 6B). Además, en el animal número 1 se pudo observar una banda más tenue con un peso molecular consistente con el de hGAA en ambos músculos analizados. Estos datos indican que el vector AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1 transduce eficientemente el hígado en NHP. También demuestran que la proteína secretada en el torrente sanguíneo se capta eficazmente en el músculo y que esta captación está correlacionada con el nivel de hGAA medido en sangre.
Además, se realizó el análisis de actividad de GAA en medios y lisados de células HuH7 transfectadas con diferentes versiones de GAA (todas de codón optimizado): 1. GAA nativa que incluye el péptido señalizador sp1 GAA nativo (co), 2. GAA modificada que contiene el péptido señalizador heterólogo sp7 o sp8 (sp7-co, sp8-co). El análisis mostró (figura 7) una actividad de GAA significativamente mayor en los medios de las células transfectadas con versiones manipuladas en comparación con GAA nativa (co). Curiosamente, la actividad intracelular de GAA fue significativamente mayor cuando se usó GAA nativa (co) en comparación con las versiones manipuladas, lo que indica que GAA nativa se retiene principalmente en las células.
También se determinó el efecto del vector de mejor rendimiento seleccionado del estudio de ratones (AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1) en un modelo de ratón de GSDIII. Se desarrolló un modelo de ratón inactivado para la enzima de desramificación del glucógeno (GDE). Este modelo recapitula el fenotipo de la enfermedad observado en humanos afectados por la enfermedad por almacenamiento de glucógeno de tipo III (GSDIII). En particular, los ratones GDE-/-, que carecen por completo de la actividad de la GDE, presentan un deterioro de la fuerza muscular y acumulan glucógeno en diferentes tejidos. Curiosamente, también acumulan glucógeno en el hígado, lo que también se observa en humanos. En el presente documento se probó si la sobreexpresión de sp7-A8-hGAA en el hígado rescataba la acumulación de glucógeno observada en los ratones GDE-/-. Se inyectó a ratones GDE-/- con 1E11 o 1E12 vg/ratón de AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1. Como controles, se inyectó en paralelo a ratones naturales (WT) y GDE-/- con PBS. Tres meses después de la administración del vector, los ratones fueron sacrificados y se cuantificó el nivel de glucógeno en el hígado. Los resultados se muestran en la Figura 8. Como ya se informó (Pagliarani et al. y el modelo de los presentes inventores), los ratones GDE -/- mostraron un aumento significativo en la acumulación de glucógeno en el hígado (p=1,3E-7) con 5 veces más glucógeno en comparación con los animales naturales. Sorprendentemente, el tratamiento con 1E11 y 1E12 vg/ratón del vector AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1 indujo una disminución estadísticamente significativa del contenido de glucógeno (p=4,5E-5 y 1,4E-6 respectivamente). Es importante destacar que los niveles de glucógeno medidos en el hígado de los ratones inyectados con el vector AAV8-hAAT-sp7-A8-hGAAco1 no se distinguían de los medidos en animales naturales, en particular a la dosis más alta (p= 0,053 para la cohorte de dosis de 1E11 y 0,244 para la cohorte de dosis de 1E12).
Se realizó el análisis de la actividad de GAA en medios y lisados de células HuH7 transfectadas con diferentes versiones de GAA (todas de codón optimizado): 1. GAA nativa que incluye el péptido señalizador sp1 GAA nativo (co), 2. GAA modificada que contiene el péptido señalizador sp7 heterólogo (sp7-co), y 3. GAA modificada que contiene el péptido señalizador sp7 heterólogo. GAA modificada que contiene el péptido señalizador heterólogo sp7 seguido de la supresión de un número variable de aminoácidos (sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co, sp7-A47-co y sp7-A62-co, en los que se suprimen los 8, 29, 42, 47 y 62 primeros aminoácidos aminoterminales de SEQ ID NO:5, respectivamente). El análisis mostró (figura 9) una actividad de GAA significativamente mayor en los medios de células transfectadas con las versiones A8, A29, A42 y A43 de GAA en comparación tanto con la GAA no delecionada (sp7-co) como con la GAA nativa (co). En cambio, se observó una actividad de GAA significativamente menor en los medios de células transfectadas con las versiones GAA A47 y A62 en comparación con las otras versiones GAA modificadas [delecionadas (sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co) y no delecionadas (sp7-co)]. Curiosamente, (figura 10) la actividad intracelular de GAA no fue diferente entre las deleciones productivas (sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co) y la versión no delecionada (sp7-co), lo que indica que todas se producen y procesan eficientemente dentro de la célula. En cambio, la actividad intracelular de GAA fue muy baja en las versiones sp7-A47-co y sp7-A62-co, y significativamente menor en comparación con todas las demás versiones modificadas [delecionada (sp7-A8-co, sp7-A29-co, sp7-A42-co, sp7-A43-co) y no delecionada (sp7-co)].
También se realizó el análisis de la actividad de GAA en medios y lisados de células HuH7 transfectadas con diferentes versiones de GAA (todas de codón optimizado): 1. GAA nativa que incluye el péptido señalizador sp1 GAA nativo (co), 2. GAA modificada que contiene el péptido señalizador heterólogo sp6 o sp8 (sp6-co, sp8-co), y 3. GAA modificada que contiene el péptido señalizador heterólogo sp6 o sp8 seguido de la supresión de 8 aminoácidos (sp6-A8-co, sp8-A8-co). El análisis mostró (figura 11) una actividad de GAA significativamente mayor en los medios de células transfectadas con versiones A8 en comparación con: i. sus respectivas versiones GAA no delecionadas (sp6-co o sp8-co); y ii. GAA nativa (co). Curiosamente, la actividad intracelular de GAA no fue diferente entre todas las versiones de GAA modificadas (tanto delecionadas como no delecionadas), lo que indica que todas se producen y procesan eficazmente dentro de la célula (panel de lisados celulares). En cambio, la actividad intracelular de GAA fue significativamente mayor cuando se usó GAA nativa (co) en comparación con las versiones modificadas, lo que indica que GAA nativa se retiene principalmente en la célula.

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína alfa-glucosidasa ácida (GAA) quimérica funcional, que comprende un resto de péptido señalizador y un resto de GAA humana funcional, en donde dicho resto de péptido señalizador tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4, 0 en donde dicho resto de péptido señalizador es un resto de péptido señalizador funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de 1 a 5 deleción (deleciones), inserción (inserciones) o sustitución (sustituciones) de aminoácidos en comparación con la secuencia de SEQ ID NO:2 a 4.
  2. 2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde dicho resto de péptido señalizador tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 2.
  3. 3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho resto de GAA humana funcional tiene 1 a 75 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA humano parental funcional.
  4. 4. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho resto de GAA humana funcional tiene 6, 7, 8, 9, 10, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o 46 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA humano parental funcional.
  5. 5. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho resto de GAA humana funcional tiene 8, 42 o 43 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA humano parental funcional.
  6. 6. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho resto de GAA humana funcional tiene 8 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con una GAA humana parental funcional.
  7. 7. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde dicha GAA humana parental funcional es el polipéptido de GAA humano mostrado en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:36.
  8. 8. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en donde dicha GAA humana parental funcional es el polipéptido de GAA humano mostrado en SEQ ID NO:5.
  9. 9. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es una secuencia de nucleótidos optimizada para mejorar la expresión de y/o mejorar la tolerancia inmunitaria a dicha proteína GAA quimérica funcionalin vivo.
  10. 10. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, que es la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:13 o 14.
  11. 11. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende una secuencia de nucleótidos resultante de la combinación de las siguientes secuencias:
  12. 12. Una construcción de ácido nucleico, que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un casete de expresión que comprende dicha molécula de ácido nucleico unida operativamente a un promotor específico de hígado seleccionado del grupo que consiste en el promotor de alfa-1 antitripsina (hAAT), el promotor de transtiretina, el promotor de la albúmina y el promotor de la globulina fijadora de tiroxina (TBG), en donde dicha construcción de ácido nucleico comprende además opcionalmente un intrón seleccionado del grupo que consiste en un intrón de beta-globina humana b2 (HBB2), un intrón de factor IX (FIX), un intrón de beta-globina de pollo y un intrón de SV40, en donde dicho intrón es opcionalmente un intrón de HBB2 modificado de SEQ ID NO:7, un intrón de FIX modificado de SEQ ID NO:9, o un intrón de beta-globina de pollo modificado de SEQ ID NO:11.
  13. 13. La construcción de ácido nucleico según la reivindicación 12, que comprende en este orden: un potenciador; un intrón; un promotor específico de hígado; codificando dicha molécula de ácido nucleico dicha proteína GAA quimérica funcional; y una señal de poliadenilación, comprendiendo dicha construcción en este orden: una región de control ApoE; un intrón de HBB2 modificado; un promotor hAAT; codificando dicha molécula de ácido nucleico dicha proteína GAA quimérica funcional; y una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
  14. 14. La construcción de ácido nucleico según la reivindicación 13, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:20, 21 o 22 o una secuencia de nucleótidos resultante de cualquiera de las combinaciones mostradas en la reivindicación 11.
  15. 15. Una célula transformada con la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 , en donde dicha célula es una célula hepática o una célula muscular.
  16. 16. Un polipéptido de GAA quimérica, que comprende un resto de péptido señalizador y un resto de GAA humana funcional, en donde dicho resto de péptido señalizador se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 a 4.
  17. 17. El polipéptido de GAA quimérica según la reivindicación 16, en donde dicho resto de péptido señalizador tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 2.
  18. 18. El polipéptido de GAA quimérica según la reivindicación 16 o 17, en donde dicho resto de GAA humana funcional tiene 8, 29, 42 o 43 aminoácidos consecutivos truncados en su extremo aminoterminal en comparación con un polipéptido de GAA humano parental funcional.
  19. 19. El polipéptido de GAA quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de la combinación de las siguientes secuencias:
  20. 20. Una composición farmacéutica, que comprende, en un portador farmacéuticamente aceptable, la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, la célula según la reivindicación 15, o el polipéptido de GAA quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.
  21. 21. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, la célula según la reivindicación 15, o el polipéptido de GAA quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para su uso como medicamento.
  22. 22. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, la célula según la reivindicación 15, o el polipéptido de GAA quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para su uso en un método para tratar una enfermedad por almacenamiento de glucógeno seleccionada del grupo que consiste en GSDI (enfermedad de von Gierke), GSDII (enfermedad de Pompe), GSDIII (enfermedad de Cori), GSDIV, GSDV, GSdV i, GSDVII, GSDVIII y enfermedad congénita letal por almacenamiento de glucógeno del corazón.
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