KR20190056388A - 산-알파 글루코시다제 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

산-알파 글루코시다제 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산-알파 글루코시다제의 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

산-알파 글루코시다제 변이체 및 이의 용도
본 발명은 산-알파 글루코시다제 (GAA)의 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 변이체는 이종성 신호 펩티드에 연결된다.
제II형 당원 축적병 (GSD) 및 산 말타제 결핍증이라고도 알려진 폼페 병은 리소솜 효소 산 알파-글루코시다제 (GAA)의 결핍으로 초래되는 상염색체 열성 물질대사성 근육병증이다. GAA는 리소솜 내에서 글리코겐을 포도당으로 가수분해하는 엑소-1,4 및 1,6-α-글루코시다제이다. GAA의 결핍은 리소솜 내에 글리코겐 축적을 야기시켜서 호흡기, 심장 및 골격 근육에 대한 점진적인 손상을 초래한다. 이 질환은 그 범위가 일반적으로 1세 내지 2세까지 치명적인 급속 진행성 유아 과정부터 아동과 성인에서 상당한 이환율 및 조기 사망률을 초래하는 보다 느리게 진행되는 이종성 과정에 이른다. [Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill); Van der Ploeg and Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008)].
폼페 병을 치료하기 위한 현행 인간 요법은 달리 효소-대체 요법 (ERT)라고 하는 재조합 인간 GAA의 투여를 포함한다. ERT는 중증, 유아 GSD II에 대한 효능이 입증되었다. 그러나, 효소 요법의 이득은 빈번한 주입 필요성 및 재조합 hGAA에 대한 억제제 항체의 발생으로 인해 제한적이다 (Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138). 더 나아가서, ERT는 전신을 효율적으로 교정하지 않는데, 아마도 말초 정맥 전달 이후 단백질의 불충분한 생체분포, 몇몇 조직으로부터의 흡수 결여 및 높은 면역원성의 조합때문인 듯 하다.
ERT에 대한 대안 또는 부가물로서, GSD-II를 치료하기 위한 유전자 요법 접근법의 실현가능성이 조사되었다 (Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866, Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446, Fraites, T. J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578, Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616). 그러나, 유전자 결함을 교정하기 위한 근육-지정 유전자 전달은 이식유전자의 근육 발현이 다른 조직과 비교하여 더 면역원성이 되는 경향이 있다는 사실 및 이 질환의 전신 성질의 한계에 직면해야 한다.
문헌 [Doerfler et al., 2016]은 하나는 간 특이적 프로모터의 제어 하에 있고 나머지 하나는 근육-특이적 프로모터의 제어 하에 있는, 인간 코돈-최적화된 GAA를 코딩하는 2개 구성체의 병용 투여를 기술한다. 간-특이적 프로모터 구동된 GAA의 발현은 Gaa-/- 마우스 모델에서 GAA에 대한 면역 관용을 촉진시키도록 적용되는 반면, 근육-특이적 프로모터 구동된 GAA의 발현은 요법의 표적이 되는 조직의 일부분에서 치료적 단백질의 발현을 제공한다. 그러나, 이러한 전략은 다수 구성체의 사용을 필요로 하고 GAA의 신체 전반적 발현이 일어나지 않는다는 점에서 전체적으로 만족스럽지 않다.
변형된 GAA 단백질은 과거에 리소솜 축적병의 치료를 개선시키기 위해 제안되었었다. 특히, 국제 공개 특허 출원 WO2004064750 및 문헌 [Sun et al., 2006]은 분비 경로로 단백질의 표적화를 증강시키기 위한 방법으로서 GAA에 작동적으로 연결된 신호 펩티드를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드를 개시한다.
그러나, 환자에게 이용가능한 요법들이 전체적으로 만족스럽지 않고 개선된 GAA 폴리펩티드 및 GAA 생산이 여전히 당분야에서 요구된다. 특히, GAA 치료의 장기간 효능, 고수준의 GAA 생산, 생산된 GAA 폴리펩티드에 대한 개선된 면역학적 관용, 및 이를 필요로 하는 세포 및 조직에 의한 GAA의 개선된 흡수에 대한 요구가 여전히 존재한다. 또한, WO2004064750 및 문헌 [Sun et al., 2006]에서, 여기에 개시된 키메라 GAA 폴리펩티드의 조직 분포는 전체적으로 만족스럽지 않다. 그러므로, 모든 관심 조직은 아니더라도 대부분에서 글리코겐 축적의 교정을 가능하게 함으로써, 완전하게 치료적일 수 있는 GAA 폴리펩티드에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 야생형 GAA 단백질과 비교하여 더 높은 수준으로 발현되고 분비되며, 전신 글리코겐의 병리학적 축적의 개선된 교정을 유발시키고 그 결과로 GAA에 대한 면역학적 관용을 유도하는 GAA 변이체에 관한 것이다.
일 양상에 따라서, 본 발명은 신호 펩티드 모이어티 및 기능성 GAA 모이어티를 포함하는 기능성 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 코딩된 키메라 GAA 폴리펩티드에서, GAA 폴리펩티드의 내생성 (또는 천연) 신호 펩티드는 다른 단백질의 신호 펩티드로 교체된다. 그러므로, 핵산 분자는 GAA 폴리펩티드에 작동적으로 연결된, GAA 이외의 다른 단백질 유래 신호 펩티드를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩한다. 코딩된 키메라 폴리펩티드는 기능성 GAA 단백질로서, GAA의 천연 신호 펩티드 (예컨대 인간 GAA를 코딩하는 야생형 핵산인 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1 내지 81에 상응하는 것)에 상응하는 아미노산 서열은 상이한 단백질의 아미노산 서열로 교체된다. 바람직한 구체예에서, 코딩된 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드의 N-말단 절두 형태이다.
특정 구체예에서, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 1 내지 75개의 연속되는 아미노산이 결실되고, 부모 폴리펩티드는 이의 신호 펩티드가 없는 GAA 폴리펩티드의 전구체 형태에 상응한다. 특정 구체예에서, 상기 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 적어도 2개, 특히 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 특히 적어도 4개, 특히 적어도 5개, 특히 적어도 6개, 특히 적어도 7개, 특히 적어도 8개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 다른 구체예에서, 상기 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 최대로 75개, 특히 최대로 70개, 특히 최대로 60개, 특히 최대로 55개, 특히 최대로 50개, 특히 최대로 47개, 특히 최대로 46개, 특히 최대로 45개, 특히 최대로 44개, 특히 최대로 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 보다 특정한 구체예에서, 상기 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 최대로 47개, 특히 최대로 46개, 특히 최대로 45개, 특히 최대로 44개, 특히 최대로 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 다른 특정 구체예에서, 상기 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 1 내지 75개, 특히 1 내지 47개, 특히 1 내지 46개, 특히 1 내지 45개, 특히 1 내지 44개, 특히 1 내지 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 다른 구체예에서, 상기 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 2 내지 43개, 특히 3 내지 43개, 특히 4 내지 43개, 특히 5 내지 43개, 특히 6 내지 43개, 특히 7 내지 43개, 특히 8 내지 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 보다 특정한 구체예에서, 상기 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 6, 7, 8, 9, 10, 27, 28, 29, 30, 31, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47개의 연속되는 아미노산이 결실되고, 특히 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 7, 8, 9, 28, 29, 30, 41, 42, 43 또는 44, 보다 특히 8, 29, 42 또는 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 예시적인 부모 GAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36으로 표시된 인간 GAA 폴리펩티드로 대표된다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 생체 내에서 키메라 GAA의 발현을 개선시키고/시키거나 이에 대한 면역 관용을 개선시키도록 최적화된 뉴클레오티드 서열이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 하기 표 1, 표 1' 또는 표 1", 특히 표 1' 또는 표 1"에 표시된 모이어티를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩한다:
표 1
Figure pct00001
표 1'
Figure pct00002
표 1"
Figure pct00003
예를 들어, 이러한 핵산 분자는 하기 표 2, 표 2' 또는 표 2"에 표시된 조합의 결과일 수 있다:
표 2
Figure pct00004
Figure pct00005
표 2'
Figure pct00006
Figure pct00007
표 2"
Figure pct00008
또 다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 조절성 서열 예컨대 프로모터, 인트론, 폴리아데닐화 신호 및/또는 인핸서 (예를 들어, 시스-조절성 모듈, 또는 CRM)에 작동적으로 연결된 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 핵산 구성체에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 바람직하게 알파-1 항트립신 프로모터 (hAAT), 트랜스타이레틴 프로모터, 알부민 프로모터 및 타이록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 간-특이적 프로모터이다. 다른 특정 구체예에서, 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 Spc5-12, MCK 및 데스민 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 편재성 프로모터 예컨대 CMV, CAG 및 PGK 프로모터이다. 핵산 구성체는 임의로 인트론, 특히 인간 베타 글로빈 b2 (또는 HBB2) 인트론, FIX 인트론, 닭 베타-글로빈 인트론 및 SV40 인트론으로 이루어진 군에서 선택되는 인트론을 더 포함할 수 있고, 상기 인트론은 임의로 변형된 인트론 예컨대 SEQ ID NO: 7의 변형된 HBB2 인트론, SEQ ID NO: 9의 변형된 FIX 인트론, 또는 SEQ ID NO: 11의 변형된 닭 베타-글로빈 인트론이다.
다른 특정 구체예에서, 핵산 구성체는 바람직하게 이 순서대로, 인핸서; 인트론; 프로모터, 특히 간-특이적 프로모터; 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및 폴리아데닐화 신호를 포함하고, 구성체는 바람직하게, 이 순서대로, ApoE 제어 영역; HBB2 인트론, 특히 변형된 HBB2 인트론; hAAT 프로모터; 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 특별한 구체예에서, 핵산 구성체는 표 2, 표 2' 또는 표 2", 특히 표 2' 또는 2"에 표시된 서열의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 SEQ ID NO: 17 (SEQ ID NO: 26 및 SEQ ID NO: 32의 융합체에 상응), 18 (SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 32의 융합체에 상응) 또는 19 (SEQ ID NO: 28 및 SEQ ID NO: 32의 융합체에 상응)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양상에 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 바람직하게 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터, 또는 AAV 벡터이다.
다른 구체예에 따라서, 바이러스 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥 자기-상보성 AAV 벡터, 바람직하게 AAV-유래 캡시드, 예컨대 AAV1, AAV2, 변이체 AAV2, AAV3, 변이체 AAV3, AAV3B, 변이체 AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, 변이체 AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 예컨대 AAVcy10 및 AAVrh10, AAVrh74, AAVdj, AAV-Anc80, AAV-LK03, AAV2i8 및 돼지 AAV, 예컨대 AAVpo4 및 AAVpo6 캡시드를 갖거나 또는 키메라 캡시드를 갖는 AAV 벡터이다.
추가의 특정한 구체예에 따라서, AAV 벡터는 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 캡시드, 특히 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 캡시드, 보다 특히 AAV8 캡시드를 갖는다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체 또는 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 세포는 간 세포 또는 근육 세포이다.
다른 양상에 따라서, 본 발명은 신호 펩티드 모이어티 및 기능성 GAA 모이어티를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드에 관한 것이다. 신호 펩티드 모이어티는 SEQ ID NO: 2 내지 4, 바람직하게 SEQ ID NO: 2로 이루어진 군에서 선택된다. 더 나아가서, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드의 절두된 형태, 예컨대 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 1 내지 75개의 연속되는 아미노산이 절두되고, 특히 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 6, 7, 8, 9, 10, 20, 41, 42, 43 또는 44개의 연속되는 아미노산이 절두되고, 예컨대 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 8 또는 42개의 연속되는 아미노산이 절두된 GAA 모이어티일 수 있고, 여기서 GAA 모이어티는 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5의 인간 GAA 단백질의 절두된 형태이다. 특정 구체예에서, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드 (보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5의 부모 GAA 폴리펩티드)와 비교하여 이의 N-말단부에서 8개의 연속되는 아미노산이 절두된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드는 표 1, 표 1' 또는 표 1", 특히 표 1' 또는 표 1"에 표시된 아미노산 서열의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 부모 GAA 폴리펩티드의 절두형을 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드의 추가의 특정 구체예가 하기 구체적인 내용에서 개시된다.
다른 양상에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체에, 본 명세서에 개시된 핵산 서열, 핵산 구성체, 벡터, 세포 또는 키메라 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 약물로서 사용을 위한, 본 발명의 핵산 서열, 핵산 구성체, 벡터, 세포 또는 키메라 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 당원 축적병을 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 본 발명의 핵산 서열, 핵산 구성체, 벡터, 세포 또는 키메라 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 당원 축적병은 GSDI, GSDII, GSDIII, GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 또는 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병이다. 보다 특정한 구체예에서, 당원 축적병은 GSDI, GSDII 및 GSDIII으로 이루어진 군, 보다 특히 GSDII 및 GSDIII으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 더 특정한 구체예에서, 당원 축적병은 GSDII이다.
도 1. 신호 펩티드가 시험관 내 및 생체 내에서 다양한 정도로 hGAA의 분비를 증강시킨다. 패널 A. 인간 간세포암 세포 (Huh7)는 Lipofectamine™에 의해서 대조군 플라스미드 (GFP), 간 특이적 프로모터의 전사 제어 하에서 야생형 hGAA를 발현하는 플라스미드 (sp1로 표시), 또는 합성 기원 또는 다른 고도의 분비성 단백질로부터 유래된 신호 펩티드 1-8 (sp2 (sp1-8)이 융합된 서열 최적화된 hGAA (hGAAco)를 발현하는 플라스미드로 형질감염되었다. 형질감염 후 48시간에, 배양 배지 중 hGAA의 활성은 형광원성 효소 어세이를 통해 측정하였고 4-메틸엄벨리페론의 표준 곡선에 대해서 GAA 활성을 평가하였다. 히스토그램 그래프는 3회의 상이한 실험으로부터 유래된 분비형 hGAA의 수준의 평균 ± SE를 도시한다. 통계 분석은 ANOVA로 수행하였다 (* = 모의 형질감염 세포 대비 p < 0.05). 패널 B. 히스토그램 그래프는 PBS (PBS) 또는 1E12 vg/kg의 인간 알파-1-항트립신 프로모터의 전사 제어 하에 있고 신호 펩티드 1 내지 3 및 7-8 (sp1-3, 7-8)이 융합된 서열 최적화된 hGAA (hGAAco)를 발현하는 AAV8 벡터의 주사 후 1개월에 3개월령 C57Bl6J 마우스 (n=5 마우스/그룹)의 혈청 중 hGAA의 활성의 평균 ± SE를 도시한다. 혈청 중 hGAA의 활성은 형광원성 효소 어세이를 통해 정량하였고 GAA 활성은 재조합 hGAA 단백질의 표준 그래프에 대해 평가하였다. 통계 분석은 ANOVA로 수행하였다 (* = PBS 주사 대비 p < 0.05, § = sp2 대비 p < 0.05).
도 2. sp7 신호 펩티드는 폼페 병 마우스 모델에서 순환성 hGAA의 수준을 증가시키고 호흡기 손상을 구제한다. 4개월령 야생형 (WT) 및 GAA-/- 마우스 (n=6-9 마우스/그룹)는 PBS 또는 2E12 vg/kg의 인간 알파-1-항트립신 프로모터의 전사 제어 하에 있고 신호 펩티드 1, 2, 7 및 8 (sp1, 2, 7, 8)이 융합된 서열 최적화된 hGAA (hGAAco)를 발현하는 AAV8이 정맥내로 주사되었다. 패널 A. 히스토그램 그래프는 벡터 주사 후 3개월에 혈액 중 형광원성 어세이를 통해서 측정된 hGAA 활성을 보여준다. 통계 분석은 ANOVA로 수행하였다 (* = 표시된 대로 p < 0.05, § = sp1 처치 마우스 대비 p < 0.05). 패널 B. 카플란-마이어 생존 그래프는 상기 기술된 바와 같이 처치된 마우스에서 측정하였고 6개월 동안 추적하였다. 통계 분석은 log-순위 검정으로 수행하였다 (* = p < 0.05). 패널 C. 호흡 기능 평가. 히스토그램은 표시된 벡터로 처치 후 3개월 (회색 막대) 및 6개월 (검은색 막대)에 측정된 밀리리터 (mL) 단위의 1회 호흡량을 도시한다. 통계 분석은 ANOVA로 수행되었고, 히스토그램에서 sp1 처치된 GAA -/- 동물 대비 수득된 p-값이 기록되어 있다 (* = p < 0.05).
도 3. 사두근 내 글리코겐 함량의 생물학적 교정. 4개월령 GAA-/- 마우스는 PBS 또는 2E12 vg/kg의 인간 알파-1-항트립신 프로모터의 전사 제어 하에 있고 신호 펩티드 1, 7 및 8 (sp1, 7, 8)이 융합된 서열 최적화된 hGAA (hGAAco)를 발현하는 AAV8 벡터가 정맥내 주사되었다. 패널 A. 사두근에서 형광원성 어세이로 측정된 hGAA 활성. 패널 B. 히스토그램에서는 사두근에서 측정된 글리코겐의 효소 분해 이후에 방출된 포도당으로서 표시된 글리코겐 함량을 도시한다. 통계 분석은 ANOVA로 수행되었다 (* = PBS 주사된 GAA -/- 마우스 대비 p < 0.05).
도 4. 심장, 횡격막 및 사두근 내 글리코겐 함량의 생화학적 교정. 4개월령 야생형 (WT) 및 GAA-/- 마우스 (n=4-5 마우스/그룹)는 PBS 및 6E11 vg/kg의 인간 알파-1-항트립신 프로모터의 전사 제어 하에 있고 신호 펩티드 1, 7 및 8 (sp1, 7, 8)이 융합된 서열 최적화된 hGAA (hGAAco)를 발현하는 AAV8 벡터가 정맥내 주사되었다. 패널 A. 히스토그램 그래프는 벡터 주사 이후 3개월에 혈액 중 형광원성 어세이를 통해 측정된 hGAA 활성을 도시한다. 통계 분석은 ANOVA로 수행되었고, 히스토그램에서는 PBS 처치된 GAA -/- 동물 대비 수득된 p-값으로 기록되어 있다 (* = p < 0.05). 패널 B-D. 히스토그램 그래프는 심장 (패널 B), 횡격막 (패널 C) 및 사두근 (패널 D)에서 측정된 글리코겐의 효소 분해 후 방출된 포도당으로서 표시된 글리코겐 함량을 도시한다. 통계 분석은 ANOVA로 수행되었다 (* = PBS 주사된 GAA -/- 마우스 대비 p < 0.05, § = sp1-처치된 마우스 대비 p < 0,05).
도 5. 고도로 분비된 hGAA는 폼페 병 마우스 모델의 이식유전자에 대하여 유도된 체액성 반응을 감소시킨다. 4개월령 GAA-/- 마우스는 PBS 또는 신호 펩티드 1 (co), 신호 펩티드 2 (sp2-Δ8-co), 신호 펩티드 7 (sp7-Δ8-co) 또는 신호 펩티드 8 (sp8-Δ8-co)이 융합되는, Δ8 hGAA를 코딩하는, 인간 알파-1-항트립신 프로모터의 전사 제어 하의 최적화된 서열을 포함하는 AAV8 벡터의 2가지 상이한 용량 (5E11 또는 2E12 vg/kg)이 정맥내로 주사되었다. 주사 후 1개월에, 혈청은 ELISA를 통해 항-hGAA 항체의 존재에 대해 분석되었다. 정량은 표준물로서 정제된 마우스 IgG를 사용하여 수행되었다. 통계 분석은 두네트 (Dunnett)의 사후 검정과 ANOVA를 통해 수행되었다 (* = p < 0.01).
도 6. AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 주사는 NHP에서 혈중 hGAA의 효율적인 분비 및 근육 내 흡수를 야기시킨다. 2마리의 마카카 파시쿨라리스 (Macaca Fascicularis) 원숭이는 0일에 2E12 vg/kg의 AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1이 주사되었다. 패널 A. hGAA 웨스턴 블롯은 벡터 투여 전 12일 및 투여 후 30일에 수득된 2마리 원숭이로부터의 혈청에서 수행되었다. 좌측은 샘플과 함께 흘려준 분자량 마커 (st)의 밴드 위치가 표시되어 있다. 패널 B. 벡터 주사 후 3개월에 원숭이를 희생시켰고 hGAA 흡수의 생화학적 평가를 위해 조직을 수집하였다. hGAA 웨스턴 블롯은 이두근 및 횡격막으로부터 수득된 조직 추출물에서 수행되었다. 항-튜불린 항체가 로딩 대조군으로서 사용되었다. 샘플과 동시에 흘려준 분자량 마커의 밴드 위치가 표시되어 있다.
도 7. 이종성 sp7 또는 sp8 신호 펩티드와 조합된 GAA 변이체를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 배지 중 증가된 GAA 활성. 천연 GAA sp1 신호 펩티드 (co)와 조합된 천연 GAA를 코딩하거나 또는 이종성 sp7 또는 sp8 신호 펩티드 (sp7-co 또는 sp8-co)와 조합된 천연 GAA를 포함하는 조작된 GAA를 코딩하는 최적화된 서열을 포함하는 플라스미드의 형질감염 이후 48시간에 HuH7 세포의 배지 (패널 A) 및 용해물 (패널 B)에서 측정된 GAA 활성. eGFP를 코딩하는 플라스미드가 음성 대조군으로서 사용되었다. 통계 분석은 터키 사후 검정과 단측 ANOVA로 수행되었다. 데이타는 2회의 독립 실험의 평균 ± SD이다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
도 8. hGAA 발현 벡터가 주사된 GDE -/- 동물의 간 중 글리코겐 함량의 생화학적 교정. 3개월령 야생형 (WT) 또는 GDE -/- 마우스는 PBS 또는 인간 알파-1-항트립신 프로모터의 전사 제어 하에 있고 신호 펩티드 7 (AAV8-hAAT-sp7--Δ8-hGAAco1)이 융합된 코돈 최적화된 hGAA를 발현하는 AAV8 벡터가 1E11 또는 1E12 vg/마우스의 용량으로 정맥내 주사되었다. 히스토그램 그래프는 간에서 측정된, 글리코겐의 효소 분해 후 방출된 포도당으로 표시된 글리코겐 함량을 도시한다. 통계 분석은 ANOVA로 수행되었다 (* = PBS 주사된 GDE -/- 마우스 대비 p < 0.05, §= PBS 주사 WT 동물 대비 p < 0.05).
도 9. 상이한 GAA 변이체를 코딩하는 플라스미드가 형질감염된 세포의 배지 중 GAA 활성. GAA 활성은 천연 GAA sp1 신호 펩티드 (co)와 조합된 천연 GAA를 코딩하거나 또는 이종성 sp7 신호 펩티드 (sp7-co)와 조합된 천연 GAA를 포함하는 조작된 GAA를 코딩하는 최적화된 서열을 포함하는 플라스미드의 형질감염 후 24시간 (패널 A) 및 48시간 (패널 B)에 HuH7 세포의 배지 중에서 측정되었다. sp7 신호 펩티드 이후에 GAA 코딩 서열 내 상이한 결실의 효과를 평가하였다 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co, sp7-Δ47-co, sp7-Δ62-co). eGFP를 코딩하는 플라스미드가 음성 대조군으로서 사용되었다. 통계 분석은 터키 사후 검정과 단측 ANOVA로 수행되었다. 막대에서 해쉬 마크 (#)는 co 대비 통계적으로 유의한 편차를 보여주고; tau 기호 (τ)는 sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co 대비 통계적으로 유의한 편차를 보여준다. 데이타는 2회의 독립 실험의 평균 ± SD이다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001이고 상이한 기호를 사용한 경우는 예외이다.
도 10. 상이한 GAA 변이체의 세포내 GAA 활성. GAA 활성은 천연 GAA sp1 신호 펩티드 (co)와 조합된 천연 GAA를 코딩하거나 또는 이종성 sp7 신호 펩티드 (sp7-co)와 조합된 천연 GAA를 포함하는 조작된 GAA를 코딩하는 최적화된 서열을 포함하는 플라스미드의 형질감염 후 48시간에 HuH7 세포의 용해물에서 측정되었다. 신호 펩티드 이후에 GAA 코딩 서열 내 상이한 결실의 효과가 평가되었다 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co, sp7-Δ47-co, sp7-Δ62-co). eGFP를 코딩하는 플라스미드는 음성 대조군으로서 사용되었다. 통계 분석은 터키 사후 검정과 단측 ANOVA로 수행되었다. tau 기호 (τ)는 sp7-co, sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co 대비 통계적으로 유의한 편차를 보여준다. 데이타는 2회의 독립 실험의 평균 ± SD를 보여준다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001이고 상이한 기호를 사용한 경우는 예외이다.
도 11. sp6 또는 sp8 신호 펩티드와 조합된 Δ8 결실을 사용한 세포 배지 중 증가된 GAA 활성. GAA 활성은 천연 GAA sp1 신호 펩티드 (co)와 조합된 천연 GAA를 코딩하거나 또는 이종성 sp6 또는 sp8 신호 펩티드 (sp6-co 또는 sp8-co)와 조합된 천연 GAA를 포함하는 조작된 GAA를 코딩하는 최적화된 서열을 포함하는 플라스미드의 형질감염 후 48시간에 HuH7 세포의 배지 (패널 A) 및 용해물 (패널 B)에서 측정되었다. 신호 펩티드 이후에 GAA 코딩 서열 내 8개 아미노산의 결실의 효과가 평가되었다 (sp6-Δ8-co, sp8-Δ8-co). eGFP를 코딩하는 플라스미드가 음성 대조군으로서 사용되었다. 통계 분석은 터키 사후 검정과 단측 ANOVA로 수행되었다. 막대의 별표는 co 대비 통계적으로 유의한 편차를 보여준다. 데이타는 2회의 독립 실험의 평균 ± SD이다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001이고 상이한 기호가 사용된 경우는 예외이다.
본 발명은 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 키메라 GAA 폴리펩티드는 신호 펩티드 모이어티 및 기능성 GAA 모이어티를 포함하고, 여기서 신호 펩티드 모이어티는 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된다. 발명자는 놀랍게도 GAA 단백질과 이들 신호 펩티드 중 하나의 융합이 이의 면역원성은 감소시키면서 GAA 분비는 상당히 개선시킨다는 것을 확인하였다.
리소솜 산 α-글루코시다제 또는 "GAA" (E.C. 3.2. 1.20) (1,4-α-D-글루칸 글루코하이드롤라제)는 올리고사카라이드의 α-1,4 및 α-1,6 연결 둘 모두를 가수분해하여 포도당을 유리시키는 엑소-1,4-α-D-글루코시다제이다. GAA의 결핍으로 인해 제II형 당원 축적병 (GSDII)이 발생되고, 이를 또한 폼페 병이라고도 한다 (그러나 이 용어는 공식적으로 질환의 유아기 개시 형태를 의미함). 이 효소는 분지 지점에서 둔화되는 글리코겐의 완전한 분해를 촉매한다. 17번 염색체 상의 28 kb 인간 산 α-글루코시다제 유전자는 3.6 kb mRNA를 코딩하여 952개 아미노산 폴리펩티드를 생산한다 (Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697; Martiniuk et al., (1990) DNA and Cell Biology 9: 85). 효소는 세포질 망상구조 내에서 공번역 N-연결 글리코실화를 수용한다. 이것은 110-kDa 전구체 형태로서 합성되어서, 광범위한 글리코실화 변형, 인산화 및 대략 90-kDa 엔도솜 중간체에서 최종 리소솜 76 및 67 kDa 형태로 단백질가수분해 프로세싱을 통해 성숙된다 (Hoefsloot, (1988) EMBO J. 7: 1697; Hoefsloot et al., (1990) Biochem. J. 272: 485; Wisselaar et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2223; Hermans et al., (1993) Biochem. J. 289: 681).
GSD II가 있는 환자에서, α-글루코시다제의 결핍은 리소솜 내 글리코겐의 대량 축적을 초래하여, 세포 기능을 파괴한다 (Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001), in The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease, (eds, Scriver, C. R. et al.) pages 3389-3419 (McGraw-Hill, New York)). 가장 일반적인 유아기 형태에서, 환자는 진행성 근육 변성 및 심근병증을 나타내고 2세 이전에 사망한다. 중증 쇠약증이 청소년 및 성인 개시 형태에 존재한다.
더 나아가서, 다른 GSD를 갖는 환자는 GAA의 최적화된 형태의 투여를 통해서 이득을 얻을 수 있다. 예를 들어, GAA의 투여는 제III형 당원 축적병 (GSD III) 환자 유래의 초대 근아세포 중에서 글리코겐을 감소시키는 것으로 확인되었다 (Sun et al. (2013) Mol Genet Metab 108(2): 145; WO2010/005565).
본 명세서에서 사용되는 용어 "GAA" 또는 "GAA 폴리펩티드"는 성숙 (∼76 또는 ∼67 kDa) 및 전구체 (예, ∼110 kDa) GAA, 특히 전구체 형태를 비롯하여, GAA의 기능성 유도체, 즉 GAA (즉, 천연 GAA 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지며, 예를 들어 상기에 정의된 바와 같이 글리코겐을 가수분해할 수 있음) 및 GAA 변이체 (예를 들어, 문헌 [Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269]에 기술된 GAA II; 문헌 [Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001) In The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease (Scriver, C. R. , Beaudet, A. L., Sly, W. S. & Valle, D. Eds.), pp. 3389- 3419. McGraw-Hill, New York, 페이지 3403-3405 참조]에 기재된 GAA 다형체 및 SNP)의 생물학적 기능을 보유하는 삽입(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)에 의해 변형되거나 또는 돌연변이된 GAA 단백질 또는 이의 단편을 포괄한다. 당분야에 공지된 임의의 GAA 코딩 서열이 사용될 수 있고, 예를 들어, SEQ ID NO: 1; GenBank 수탁 번호 NM_00152 및 문헌 [Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697] 및 [Van Hove et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 65 (인간)], GenBank 수탁 번호 NM_008064 (마우스), 및 문헌 [Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269 (메추라기)]을 참조한다.
본 발명의 문맥에서, "GAA의 전구체 형태"는 이의 천연 신호 펩티드를 포함하는 GAA 폴리펩티드의 형태이다. 예를 들어, SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 37의 서열은 인간 GAA (hGAA) 변이체의 전구체 형태이다. SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 37 내에서, 아미노산 잔기 1-27은 hGAA 폴리펩티드의 신호 펩티드에 상응한다.
본 발명의 문맥에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 부모 GAA 폴리펩티드로부터 유래된다. 본 발명에 따라서, "부모 GAA 폴리펩티드"는 상기에 정의된 바와 같이 기능성, 전구체 GAA 서열일 수 있지만, 이의 신호 펩티드는 없을 수 있다. 예를 들어, 야생형 인간 GAA 폴리펩티드를 참조하면, 완전한 야생형 GAA 폴리펩티드 (즉, GAA의 전구체 형태)는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 37로 표시되고 신호 펩티드 (SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 37의 아미노산 1-27에 상응)를 갖지만, 이들 야생형 인간 GAA 폴리펩티드의 절두된 GAA 형태의 기초로서 제공되는 부모 GAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 36으로 표시되고 신호 펩티드를 갖지 않는다. 이러한 예에서, 후자가 SEQ ID NO: 12의 아미노산 28-952 및 SEQ ID NO: 37의 아미노산 28-952에 상응하고, 부모 GAA 폴리펩티드를 의미한다.
GAA 폴리펩티드의 코딩 서열은 조류 및 포유동물 종을 포함한 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "조류"는 제한없이 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포유동물"은 제한없이 인간, 유인원 및 다른 인간이외의 영장류, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼목 등을 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 인간, 마우스 또는 메추라기, 특히 인간, GAA 폴리펩티드를 코딩한다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 GAA 폴리펩티드는 이의 신호 펩티드가 없는 hGAA에 상응하는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다 (특히, hGAA의 천연 신호 펩티드는 이의 천연 신호 펩티드를 포함하는 hGAA에 상응하는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 37의 아미노산 1-27에 상응함).
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 37의 야생형 hGAA를 코딩하는 서열인, SEQ ID NO: 1로 표시된 서열의 뉴클레오티드 82-2859와 적어도 75% (예컨대 적어도 77%), 적어도 80% 또는 적어도 82% (예컨대 적어도 83%) 동일성을 갖는다 (SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1-81은 hGAA의 천연 신호 펩티드를 코딩하는 일부분임).
본 발명의 핵산 분자의 GAA 모이어티는 바람직하게 생체 내 이식유전자 발현을 위해 최적화된 서열인, SEQ ID NO: 13 또는 14의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 및 보다 더 바람직하게 적어도 92% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성, 예를 들어 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.
또한, 본 발명의 핵산 분자가 코딩하는 키메라 GAA 단백질의 신호 펩티드 모이어티는 최종 서열이 기능성 신호 펩티드, 즉 GAA 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드에 해당하는 한, SEQ ID NO: 2 내지 4에 표시된 서열과 비교하여 1 내지 5개, 특히 1 내지 4개, 특히 1 내지 3개, 보다 특히 1 내지 2개, 특히 1개의 아미노산 결실(들), 삽입(들) 또는 치환(들)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 신호 펩티드 모이어티 서열은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 이루어진다.
용어 "동일한" 및 이의 편차는 2개 핵산 분자 간 서열 동일성을 의미한다. 2개의 비교되는 서열 둘 모두에서 한 위치가 동일한 염기로 점유된 경우, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각의 위치를 아데닌이 점유하고 있으면, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 간 동일성의 %는 2개 서열이 공유하는 일치된 위치의 개수를 비교된 위치의 개수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 2개 서열에서 10개 위치 중 6개가 일치되면 그 2개 서열은 60%가 동일하다. 일반적으로, 2개 서열을 정렬하여 최대 동일성이 제공될 때 비교한다. 당업자에게 공지된 다양한 생물정보학 도구 예컨대 BLAST 또는 FASTA를 사용하여 핵산 서열을 정렬할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자의 GAA 모이어티는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14로 표시된 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 기능성 GAA 폴리펩티드를 코딩하며, 다시 말해서, 발현될 때, 야생형 GAA 단백질의 기능성을 갖는 인간 GAA 폴리펩티드를 코딩한다. 상기에 정의된 바와 같이, 야생형 GAA의 기능성은 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드, 보다 특히 글리코겐의 α-1,4 및 α-1,6 연결부 둘 모두를 가수분해하여 포도당을 유리시키는 것이다. 본 발명의 핵산이 코딩하는 기능성 GAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열에 의해 코딩되는 야생형 GAA 폴리펩티드 (즉, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 GAA 폴리펩티드)와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 적어도 100%의 글리코겐에 대한 가수분해 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산에 의해 코딩되는 GAA 단백질의 활성은 SEQ ID SEQ ID NO: 1, NO:13 또는 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열에 의해 코딩되는 야생형 GAA 폴리펩티드 (즉, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 GAA 폴리펩티드)의 활성의 100% 초과, 예컨대 110%, 120%, 130%, 140%를 초과하거나, 또는 심지어 150%를 초과할 수 있다.
당업자는 본 발명에 따른 핵산이 기능성 GAA 단백질을 발현하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 적합한 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 시험관 내 방법으로 적합한 것에는 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 핵산을 삽입시키는 단계, 숙주 세포, 예컨대 293T 또는 HeLa 세포 또는 다른 세포 예컨대 Huh7을 벡터로 형질감염 또는 형질도입시키는 단계, 및 GAA 활성에 대해 어세이하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 적합한 생체 내 방법은 폼페 병 또는 다른 당원 축적 질병의 마우스 모델에 핵산을 함유하는 벡터를 형질도입시키는 단계 및 마우스의 혈장 내 기능성 GAA 및 조직 내 GAA의 존재에 대해 어세이하는 단계를 포함한다. 적합한 방법은 하기 실험 부분에서 보다 상세하게 설명된다.
본 발명자는 상기 기술된 핵산 분자가 야생형 GAA cDNA와 비교하여 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 기능성 GAA 단백질의 높은 수준의 발현을 야기시킨다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 더 나아가서, 또한 본 발명자가 확인한 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자를 발현하는 간 및 근육 세포로부터 생산된 키메라 GAA 폴리펩티드는 이식유전자에 대해서 체액성 면역 반응을 유도시키지 않는다. 이것은 이 핵산 분자가 GAA 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산하는데 사용될 수 있고, 치료적 이득을 제공할 수 있는데, 예컨대 면역억제성 치료에 대한 도움을 제거하고, 저용량 면역억제성 치료를 가능하게 하고, 본 발명의 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 반복 투여할 수 있게 한다는 것을 의미한다. 그러므로, 본 발명의 핵산 분자는 GAA 발현 및/또는 활성이 결핍된 상황 또는 GAA의 고수준 발현이 질환, 예컨대 당원 축적병을 경감시킬 수 있는 상황에서 특별히 관심이 있다. 특히, 당원 축적병은 GSDI (폰 기에르케병), GSDII (폼페 병), GSDIII (코리병), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 또는 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병일 수 있다. 보다 특히, 당원 축적병은 GSDI, GSDII 및 GSDIII으로 이루어진 군, 보다 더 특히 GSDII 및 GSDIII으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 더 특정한 구체예에서, 당원 축적병은 GSDII이다. 특히, 본 발명의 핵산 분자는 GAA-결핍 병태, 또는 글리코겐의 축적과 연관된 다른 병태 예컨대 GSDI (폰 기에르케병), GSDII (폼페 병), GSDIII (코리병), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 및 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병, 보다 특히 GSDI, GSDII 또는 GSDIII, 보다 더 특히 GSDII 및 GSDIII를 치료하기 위한 유전자 요법에서 유용할 수 있다. 보다 더 특정한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 GSDII를 치료하기 위한 유전자 요법에서 유용할 수 있다.
기능성 GAA를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 서열은 생체 내에서 GAA 폴리펩티드의 발현을 위해 최적화된다. 서열 최적화는 코돈 최적화, GC 함량의 증가, CpG 아일랜드의 수 감소, 선택적 오픈 리딩 프레임 (alternative open reading frame) (ARF)의 수 감소 및 스플라이스 도너 및 스플라이스 억셉터 부위의 수 감소를 비롯해 핵산 서열 내 많은 변화를 포함할 수 있다. 유전자 코드의 축퇴성때문에, 상이한 핵산 분자가 동일한 단백질을 코딩할 수 있다. 상이한 유기체의 유전자 코드는 종종 다른 것들에 비해 동일한 아미노산을 코딩하는 몇몇 코돈 중 하나를 사용하는 쪽으로 편향된다는 것도 역시 충분히 공지되어 있다. 코돈 최적화를 통해서, 소정 세포 상황에서 존재하는 코돈 편향성을 이용하는 변화를 뉴클레오티드 서열에 도입시켜서 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열이 코돈 비최적화된 서열과 비교하여 비교적 높은 수준으로 이러한 소정 세포 상황에서 더 발현될 수 있도록 할 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 절두형 GAA를 코딩하는 이러한 서열 최적화된 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 인간 특이적 코돈 용법 편향성을 이용함으로써, 동일한 절두형 GAA 단백질을 코딩하는 코돈 비최적화된 뉴클레오티드 서열과 비교하여 인간 세포에서 이의 발현을 개선시키도록 코돈 최적화된다.
표 3은 본 발명자가 수행한 서열 최적화와 관련된 관련 매개변수의 설명을 제공한다:
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표 3. 최적화된 서열의 설명. 표는 야생형 서열과 비교하여 2종의 hGAA 최적화된 서열의 특징을 예시한다. a) 코돈 적합도 지수 및 b) 희귀 코돈 분석 도구 (http://www.genscript.com)를 사용해 계산된 GC 함량. c) 및 d) 는 각각 5'에서 3' (aORF 5'→3') 및 3'에서 5' (aORF 3'→5') 가닥 상에서 계산된 선택적 오픈 리딩 프레임이다. e) 및 f) 는 각각 스플라이싱 부위 온라인 예측 도구 (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)를 사용해 계산된 억셉터 (SA) 및 도너 (SD) 스플라이싱 부위이다. g) 및 h) 는 각각 야생형 (wt) 및 최적화된 co1 서열에 대해서 계산된 %동일성이다. i) MethDB 온라인 도구 (http://www.methdb.de/links.html)를 사용해 계산된 CpG 아일랜드. CpG 아일랜드는 GC 함량 > 60%이고 관찰/기대 비율 > 0.6인, 100 bp보다 긴 서열이다.
특정 구체예에서, 최적화된 GAA 코딩 서열은 SEQ ID NO: 1의 야생형 hGAA 코딩 서열의 뉴클레오티드 82-2859와 비교하여, 코돈 최적화되고/되거나, 증가된 GC 함량을 갖고/갖거나, 감소된 수의 선택적 오픈 리딩 프레임을 갖고/갖거나, 감소된 수의 스플라이스 도너 및/또는 스플라이스 억셉터 부위를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 서열은 그 결과로 야생형 GAA 서열의 서열과 비교하여 GAA 서열의 GC 함량의 적어도 2, 3, 4, 5 또는 10% 증가가 일어난다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 야생형 GAA 뉴클레오티드 서열의 서열과 비교하여 GAA 서열의 GC 함량의 2, 3, 4 또는 보다 특히, 5% 또는 10% (특히 5%) 증가가 일어난다. 특정 구체예에서, 기능성 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 서열의 뉴클레오티드 82-2859와 "실질적으로 동일하고", 다시 말해서 약 70%가 동일하거나, 더 바람직하게 약 80%가 동일하거나, 보다 더 바람직하게 약 90%가 동일하거나, 보다 더 바람직하게 약 95%가 동일하거나, 보다 더 바람직하게 약 97%, 98% 또는 심지어 99%가 동일하다. 상기에 언급된 바와 같이, GC 함량 및/또는 ARF의 수 이외에도, 서열 최적화는 또한 서열의 CpG 아일랜드의 수 감소 및/또는 스플라이스 도너 및 억셉터 부위의 수 감소를 포함할 수 있다. 물론, 당업자에게 충분히 공지된 바와 같이, 서열 최적화는 모든 이들 매개변수 간의 균형인데, 최적화된 서열이 이식유전자의 개선, 예컨대 생체 내에서 이식유전자에 대한 면역 반응 감소 및/또는 개선된 발현을 유도시키는 한, 상기 매개변수 중 적어도 하나가 개선되지만 나머지 매개변수 중 하나 이상은 그렇지 않다면 서열이 최적화된 것으로 간주될 수 있다는 의미이다.
또한, 인간 세포의 코돈 용법으로 기능성 GAA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적합화는 코돈 적합도 지수 (codon adaptation index) (CAI)로서 표시될 수 있다. 본 명세서에서 코돈 적합도 지수는 고도로 발현되는 인간 유전자의 코돈 용법쪽으로 유전자의 코돈 용법의 상대적 적합도의 척도로서 정의된다. 각 코돈의 상대적 적합도 (w)는 동일한 아미노산에 대해 가장 풍부한 코돈에 대한 각 코돈의 용법의 비율이다. CAI는 이들 상대적 적합도 값의 기하 평균으로서 정의된다. 비동의 코돈 및 종결 코돈 (유전자 코드에 의존적)은 배제된다. CAI 값은 0 내지 1의 범위이고, 더 높은 값은 가장 풍부한 코돈이 더 높은 비율이라는 것을 의미한다 (문헌 [Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295] 참조; 또한 문헌 [Kim et al, Gene. 1997, 199:293-301]; [zur Megede et al, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635] 참조). 바람직하게, GAA를 코딩하는 핵산 분자는 적어도 0.75 (특히 0.77), 0.8, 0.85, 0.90, 0.92 또는 0.94의 CAI를 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 대해서 0 내지 50개, 0 내지 30개, 0 내지 20개, 0 내지 15개, 0 내지 10개, 또는 0 내지 5개의 아미노산 변화를 갖는 단백질을 코딩한다. 더 나아가서, 본 발명의 핵산에 의해 코딩되는 GAA 단백질은 당분야에 공지된 기능성 GAA 단백질의 변이체일 수 있고, 여기서 본 발명의 핵산 분자는 당분야에 공지된 GAA 단백질에 대해서 0 내지 50개, 0 내지 30개, 0 내지 20개, 0 내지 15개, 0 내지 10개, 또는 0 내지 5개 아미노산 변화를 갖는 단백질을 코딩한다. 기능성 변이체를 디자인하기 위한 기초로서 제공될 수 있는 당분야에 공지된 이러한 GAA 단백질은 GAA의 Uniprot 등재 (수탁 번호 P10253; GenBank CAA68763.1에 상응; SEQ ID NO: 37)에서 확인할 수 있다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열의 GAA 모이어티는 변이체 GAA 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 이러한 펩티드의 기능성 변이체, 예컨대 GenBank 수탁 번호 AAA52506.1 (SEQ ID NO: 38), EAW89583.1 (SEQ ID NO: 39) 및 ABI53718.1 (SEQ ID NO: 40)로서 식별되는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 것들을 코딩한다. 다른 변이체 GAA 폴리펩티드는 WO2012/145644, WO00/34451 및 US6,858,425에 기술된 것들을 포함한다. 특정 구체예에서, 부모 GAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 37로 표시되는 아미노산 서열로부터 유래된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 GAA 폴리펩티드는 기능성 GAA이고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5에 표시된 hGAA 단백질과 서열 동일성을 가지며, 임의로 절두 형태가 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 90%, 95%, 보다 특히 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성에 대한 기준으로서 고려되면 절두의 수행을 고려한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시된 서열을 갖는다.
폴리펩티드를 언급시 용어 "동일한" 및 이의 편차는 2개의 비교되는 폴리펩티드 서열 내 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되어 있을 때 (예를 들어, 2개 폴리펩티드 각각의 위치가 류신으로 점유되어 있으면), 그 폴리펩티드들은 그 위치가 동일하다는 것을 의미한다. 2개 폴리펩티드 간 동일성의 백분율은 2개 서열이 공유하는 일치된 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 2개 폴리펩티드의 10개 위치 중 6개가 일치되면 그 2개 서열은 60%가 동일하다. 일반적으로, 2개의 서열이 최대 동일성을 제공하도록 정렬될 때 비교된다. 당업자에게 공지된 다양한 생물정보학 도구, 예컨대 BLAST 또는 FASTA가 핵산 서열을 정렬시키는데 사용될 수 있다.
용어 "핵산 서열" (또는 핵산 분자)은 단일 또는 이중 가닥 형태의 DNA 또는 RNA 분자, 특히 본 발명에 따른 GAA 단백질을 코딩하는 DNA를 의미한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드를 포함하는 키메라 기능성 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
특히, 본 발명자는 신호 펩티드 교체가 인간 알파-1-항트립신 (hAAT, WO2004064750 및 문헌 [Sun et al. 2006]에 기재된 키메라 GAA 단백질)의 신호 펩티드에 융합된 GAA를 포함하는 이전에 보고된 다른 키메라 GAA 폴리펩티드와 비교하여 기능성 GAA 폴리펩티드를 더 높은 발현 수준 및 더 높은 분비성으로 생산하게 된다는 것을 놀랍게도 더욱 확인하였다. 본 발명의 핵산 분자에서, 신호 펩티드 모이어티는 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드를 코딩하는 서열에 상응한다 (달리 본 명세서에서 "대안적 신호 펩티드"라고 함). 본 발명의 핵산 분자는 또한 기능성 GAA 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 대안적 신호 펩티드를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 서열일 수 있다.
야생형 GAA 폴리펩티드와 비교하여, 야생형 GAA의 내생성 신호 펩티드는 외생성 신호 펩티드, 즉, GAA와 상이한 단백질로부터 유래된 신호 펩티드로 교체된다. GAA 단백질의 나머지에 융합된 외생성 신호 펩티드는 이의 천연 신호 펩티드를 포함하는 상응하는 GAA 폴리펩티드와 비교하여 최종 키메라 GAA 폴리펩티드의 분비성을 증가시킨다. 더 나아가서, 본 발명의 특정한 구체예에 따라서, 대안적 신호 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 상기 제공된 바와 같은 최적화된 서열일 수 있다.
본 발명에서 활용가능한 신호 펩티드는 이두로네이트-2-술파타제 유래의 아미노산 1-25 (SEQ ID NO: 3), 키모트립시노겐 B2 유래 아미노산 1-20 (SEQ ID NO: 2) 및 프로테아제 C1 억제제 유래 아미노산 1-23 (SEQ ID NO: 4)을 포함한다. SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드는 이의 천연 펩티드를 포함하는 GAA, 또는 hAAT의 신호 펩티드를 포함하는 키메라 GAA 단백질과 비교했을 때 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 키메라 GAA 단백질의 더 높은 분비를 가능하게 한다.
세포로부터 분비되는 새롭게 합성된 GAA의 상대적인 비율은 당분야에 공지되고 실시예에 기술된 방법을 통해서 통상적으로 결정할 수 있다. 분비되는 단백질은 세포 배양 배지, 혈청, 유액 등에서 단백질 활성 어세이 (예를 들어, 효소 어세이)를 통해서 또는 단백질 자체를 직접 측정 (예를 들어, 웨스턴 블롯)하여 검출될 수 있다.
당업자는 키메라 GAA 폴리펩티드가 예를 들어 핵산 구성체의 조작 결과로서, 예컨대 제한효소 부위의 첨가로 인해, 추가적인 아미노산을, 이들 추가적인 아미노산이 신호 펩티드 또는 GAA 폴리펩티드를 비기능성으로 만들지 않는 한, 함유할 수 있다는 것을 더욱 이해하게 될 것이다. 추가적인 아미노산은 보유가 비기능성 폴리펩티드를 야기시키지 않는다면 성숙한 폴리펩티드에 의해 보유될 수 있거나 또는 절단될 수 있다.
더 나아가서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 분자에 의해 코딩되는 키메라 GAA 폴리펩티드는 GAA의 기능성, 절두 형태인 GAA 모이어티를 포함할 수 있다. "절두 형태"란, 부모 GAA 폴리펩티드의 N-말단부로부터 결실된 하나 또는 몇개의 연속되는 아미노산을 포함하는 GAA 폴리펩티드를 의미한다. 그러므로, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드의 N-말단 절두 형태일 수 있다. 본 발명에 따라서, "부모 GAA 폴리펩티드"는 신호 펩티드가 없는 GAA 폴리펩티드, 예컨대 신호 펩티드가 없는 GAA의 전구체 형태, 특히 SEQ ID NO: 5, 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시된 hGAA 폴리펩티드이고, 상기 개시된 바와 같은 임의의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 전형적인 야생형 인간 GAA 폴리펩티드를 참조하여, 완전한 야생형 GAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 37로 대표되고, 신호 펩티드를 갖는 반면, 이러한 야생형 인간 GAA 폴리펩티드의 절두된 GAA 형태를 위한 기초로서 제공되는 부모 GAA 폴리펩티드는 각각 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36으로 대표되고, 신호 펩티드를 갖지 않는다. 이러한 예에서, 후자를 부모 GAA 폴리펩티드라고 한다. 이러한 특정한 구체예의 변이체에서, 적어도 하나의 아미노산은 부모 GAA 단백질의 N-말단부로부터 결실된다. 특정 구체예에서, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부로부터 적어도 1개, 특히 적어도 2개, 특히 적어도 3개, 특히 적어도 4개, 특히 적어도 5개, 특히 적어도 6개, 특히 적어도 7개, 특히 적어도 8개의 연속되는 아미노산이 결실될 수 있다. 예를 들어, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부로부터 1 내지 75개의 연속되는 아미노산 또는 75개를 초과하는 연속되는 아미노산이 결실될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 최대로 75개, 특히 최대로 70개, 특히 최대로 60개, 특히 최대로 55개, 특히 최대로 50개, 특히 최대로 47개, 특히 최대로 46개, 특히 최대로 45개, 특히 최대로 44개, 특히 최대로 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 추가의 특정 구체예에서, 상기 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 최대로 47개, 특히 최대로 46개, 특히 최대로 45개, 특히 최대로 44개, 특히 최대로 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 특히, 절두된 GAA 모이어티는 부모 GAA 단백질과 비교하여 이의 N-말단부로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75개의 연속되는 아미노산이 결실될 수 있다 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 폴리펩티드의 절두 형태). 다른 특정 구체예에서, 상기 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 1 내지 75개, 특히 1 내지 47개, 특히 1 내지 46개, 특히 1 내지 45개, 특히 1 내지 44개, 특히 1 내지 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다. 다른 구체예에서, 상기 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 2 내지 43개, 특히 3 내지 43개, 특히 4 내지 43개, 특히 5 내지 43개, 특히 6 내지 43개, 특히 7 내지 43개, 특히 8 내지 43개의 연속되는 아미노산이 결실된다 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 폴리펩티드의 절두 형태). 대안적인 명명법을 사용하여, 부모 GAA 폴리펩티드에서 1개 아미노산의 절두로 생성된 GAA 폴리펩티드는 Δ1 GAA 절두 형태라고 하고, N-말단부로부터 2개의 연속되는 아미노산의 절두로 생성된 GAA 폴리펩티드는 Δ2 GAA 절두 형태라고 하며, 부모 GAA 폴리펩티드에서 3개의 연속되는 아미노산의 절두로 생성된 GAA 폴리펩티드는 Δ3 GAA 절두 형태 등이라고 한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46, Δ47, Δ48, Δ49, Δ50, Δ51, Δ52, Δ53, Δ54, Δ55, Δ56, Δ57, Δ58, Δ59, Δ60, Δ61, Δ62, Δ63, Δ64, Δ65, Δ66, Δ67, Δ68, Δ69, Δ70, Δ71, Δ72, Δ73, Δ74 또는 Δ75의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46 또는 Δ47의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45 또는 Δ46의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 또는 Δ43의 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)를 포함한다.
특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9 또는 Δ10 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ7, Δ8 또는 Δ9 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ8 절두 형태이다.
특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ27, Δ28, Δ29, Δ30 또는 Δ31 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ28, Δ29 또는 Δ30 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ29 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ41, Δ42 또는 Δ43 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ42 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ42, Δ43 또는 Δ44 절두 형태이고, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ43 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46 또는 Δ47 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ7, Δ8, Δ9, Δ28, Δ29, Δ30, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ8, Δ29, Δ42, Δ43 또는 Δ47 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ8, Δ29, Δ42 또는 Δ43 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ8 또는 Δ42 절두 형태이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드는 기능성 부모 인간 GAA 폴리펩티드로부터 유래된 절두형 GAA 모이어티를 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 부모 hGAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드이다. 이러한 구체예의 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46, Δ47, Δ48, Δ49, Δ50, Δ51, Δ52, Δ53, Δ54, Δ55, Δ56, Δ57, Δ58, Δ59, Δ60, Δ61, Δ62, Δ63, Δ64, Δ65, Δ66, Δ67, Δ68, Δ69, Δ70, Δ71, Δ72, Δ73, Δ74 또는 Δ75 GAA 절두 형태이다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성 (예를 들어 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성)을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46 또는 Δ47, 특히 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44, 특히 Δ8, Δ29, Δ42 또는 Δ43, 특히 Δ8 또는 Δ42 절두 형태이다.
이러한 구체예의 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45 또는 Δ46 GAA 절두 형태이다.
이러한 구체예의 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 서열을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 또는 Δ42 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 보다 더 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, 또는 Δ43 GAA 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9 또는 Δ10, 특히 Δ7, Δ8 또는 Δ9, 보다 특히 Δ8 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ27, Δ28, Δ29, Δ30 또는 Δ31, 특히 Δ28, Δ29 또는 Δ30, 보다 특히 Δ29 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44, 특히 Δ41, Δ42 또는 Δ43, 보다 특히 Δ42 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45, 특히 Δ42, Δ43 또는 Δ44, 보다 특히 Δ43 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45, 특히 Δ7, Δ8, Δ9, Δ28, Δ29, Δ30, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44, 특히 Δ8, Δ29, Δ42 또는 Δ43 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44, 특히 Δ8 또는 Δ42 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8, Δ29, Δ42, Δ43 또는 Δ47 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8, Δ29, Δ42 또는 Δ43 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8 또는 Δ42 절두 형태이다.
특별한 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드의 GAA 모이어티는 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 서열로 이루어진 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 42로 표시되는 서열로 이루어진 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 서열로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 핵산 구성체에 관한 것이다. 핵산 구성체는 하나 이상의 발현 제어 서열 및/또는 이식유전자의 발현을 개선시키는 다른 서열 및/또는 코딩된 단백질의 분비를 증강시키는 서열 및/또는 코딩된 단백질의 흡수를 증강시키는 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트에 해당될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 기능적 관련성의 폴리뉴클레오티드 엘리먼트의 연결을 의미한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관련성으로 위치될 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 프로모터, 또는 다른 전사 조절성 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 것이다. 이러한 발현 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서 (예컨대 시스-조절성 모듈 (CRM)), 인트론, 폴리A 신호 등이 당분야에 공지되어 있다.
특히, 발현 카세트는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 편재성 또는 조직-특이적 프로모터, 특히 GAA의 발현이 바람직한 세포 또는 조직 예컨대 GAA 발현이 GAA-결핍 환자에서 바람직한 세포 또는 조직에서 발현을 촉진할 수 있는 프로모터일 수 있다. 특정 구체예에서, 프로모터는 간-특이적 프로모터 예컨대 알파-1 항트립신 프로모터 (hAAT) (SEQ ID NO: 15), 트랜스타이레틴 프로모터, 알부민 프로모터, 타이록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터, LSP 프로모터 (갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 서열, 2개 카피의 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서 서열, 및 리더 서열을 포함함 - 34.Ill, C. R., et al. (1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30.) 등이다. 다른 유용한 간-특이적 프로모터, 예를 들어 Cold Spring Harbor Laboratory 에서 편집한 간 특이적 유전자 프로모터 데이타베이스 (http://rulai.cshl.edu/LSPD/)에 열거된 것들이 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 상황에서 바람직한 프로모터는 hAAT 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 하나의 관심 조직 또는 세포 (예컨대 근육 세포), 및 간 세포에서 발현을 유도하는 프로모터이다. 예를 들어, 어느 정도로, 근육 세포에 특이적인 프로모터 예컨대 데스민, Spc5-12 및 MCK 프로모터는 간 세포로 약간의 발현 누수가 존재할 수 있는데, 이것은 본 발명의 핵산으로부터 발현되는 GAA 단백질에 대해 대상체의 면역 관용을 유도시키기 위해 유리할 수 있다.
다른 조직-특이적 또는 조직-비특이적 프로모터가 본 발명의 실시에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 간 특이적 프로모터와 상이한 프로모터인 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어 프로모터는 근육-특이적일 수 있고, 예컨대 데스민 프로모터 (및 데스민 프로모터 변이체 예컨대 천연 또는 인공 인핸서를 포함하는 데스민 프로모터), SPc5-12 프로모터 또는 MCK 프로모터일 수 있다. 다른 구체예에서, 프로모터는 다른 세포 계통에 특이적인 프로모터, 예컨대 적혈구 계통의 세포로부터 GAA 폴리펩티드의 발현을 위한, 에리쓰로포이어틴 프로모터이다.
다른 구체예에서, 프로모터는 편재성 프로모터이다. 대표적인 편재성 프로모터는 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/프로모터 (CMV), PGK 프로모터, SV40 초기 프로모터 등을 포함한다.
또한, 프로모터는 또한 내생성 프로모터 예컨대 알부민 프로모터 또는 GAA 프로모터일 수 있다.
특정 구체예에서, 프로모터는 인핸서 서열, 예컨대 시스-조절성 모듈 (CRM) 또는 인공 인핸서 서열과 연관된다. 예를 들어, 프로모터는 인핸서 서열 예컨대 인간 ApoE 제어 영역 (또는 인간 아포리포단백질 E/C-I 유전자의 유전자좌, 간 제어 영역 HCR-1 - GenBank 수탁 번호 U32510, SEQ ID NO: 16으로 표시됨)과 연관될 수 있다. 특정 구체예에서, 인핸서 서열 예컨대 ApoE 서열은 간-특이적 프로모터 예컨대 상기 열거된 것들, 및 특히 예컨대 hAAT 프로모터와 연관된다. 본 발명의 실시에서 유용한 다른 CRM은 문헌 [Rincon et al., Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52], [Chuah et al., Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13] 또는 [Nair et al., Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9]에 기술된 것들을 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 핵산 구성체는 인트론, 특히 프로모터 및 GAA 코딩 서열 사이에 위치된 인트론을 포함한다. 인트론은 mRNA 안정성 및 단백질 생산을 증가시키기 위해 도입될 수 있다. 추가 구체예에서, 핵산 구성체는 인간 베타 글로빈 b2 (또는 HBB2) 인트론, 응고 인자 IX (FIX) 인트론, SV40 인트론 또는 닭 베타-글로빈 인트론을 포함한다. 다른 추가의 구체예에서, 본 발명의 핵산 구성체는 상기 인트론에 존재하는 선택적 오픈 리딩 프레임 (ARF)의 수를 감소시키거나, 또는 심지어 완전히 제거시키도록 디자인된 변형된 인트론 (특히 변형된 HBB2 또는 FIX 인트론)을 함유한다. 바람직하게, ARF는 50 bp에 걸쳐 포괄된 그 길이가 제거되고 출발 코돈과 인 프레임으로 중지 코돈을 갖는다. ARF는 인트론의 서열을 변형시켜 제거될 수 있다. 예를 들어, 변형은 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결실에 의해서, 바람직하게 뉴클레오티드 치환에 의해서 수행될 수 있다. 예시로서, 관심 인트론의 서열에 존재하는 ATG 또는 GTG 출발 코돈에서 하나 이상의 뉴클레오티드, 특히 하나의 뉴클레오티드는 비출발 코돈이 생성되도록 교체될 수 있다. 예를 들어, ATG 또는 GTG는 관심 인트론의 서열 내에서, 출발 코돈이 아닌 CTG에 의해 교체될 수 있다.
핵산 구성체에서 사용되는 고전적인 HBB2 인트론은 SEQ ID NO: 6으로 표시된다. 예를 들어, 이러한 HBB2 인트론은 상기 인트론 내에서 출발 코돈 (ATG 및 GTG 코돈)을 제거하여 변형될 수 있다. 특정 구체예에서, 구성체에 포함된 변형된 HBB2 인트론은 SEQ ID NO: 7로 표시된 서열을 갖는다. 핵산 구성체에서 사용되는 고전적인 FIX 인트론은 인간 FIX의 제1 인트론으로부터 유래되고 SEQ ID NO: 8로 표시된다. FIX 인트론은 상기 인트론 내에서 출발 코돈 (ATG 및 GTG 코돈)을 제거하여 변형될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 구성체에 포함된 변형된 FIX 인트론은 SEQ ID NO: 9로 표시된 서열을 갖는다. 핵산 구성체에서 사용되는 고전적인 닭-베타 글로빈 인트론은 SEQ ID NO: 10으로 표시된다. 닭-베타 글로빈 인트론은 상기 인트론 내에서 출발 코돈 (ATG 및 GTG 코돈)을 제거하여 변형될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 구성체에 포함된 변형된 닭-베타 글로빈 인트론은 SEQ ID NO: 11로 표시된 서열을 갖는다.
본 발명자는 이러한 변형된 인트론, 특히 변형된 HBB2 또는 FIX 인트론이 유리한 특성을 가지며 이식유전자의 발현을 상당히 개선시킬 수 있다는 것을 이전에 WO2015/162302에서 확인하였다.
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 구성체는 5'에서 3'의 배향으로, 임의로 인핸서가 선행되는 프로모터, 본 발명의 코딩 서열 (즉, 본 발명의 최적화된 GAA 코딩 서열, 본 발명의 키메라 GAA 코딩 서열, 또는 본 발명의 키메라 및 최적화된 GAA 코딩 서열), 및 폴리아데닐화 신호 (예컨대 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 다른 천연 발생 또는 인공 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 발현 카세트이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 구성체는 5'에서 3'의 배향으로, 임의로 인핸서가 선행된 프로모터, (예컨대 ApoE 제어 영역), 인트론 (특히 상기에 정의된 바와 같은 인트론), 본 발명의 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 발현 카세트이다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 구성체는 5'에서 3'의 배향으로, 인핸서 예컨대 ApoE 제어 영역, 프로모터, 인트론 (특히 상기에 정의된 바와 같은 인트론), 본 발명의 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 발현 카세트이다. 본 발명의 추가의 특정한 구체예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 배향으로, ApoE 제어 영역, hAAT-간 특이적 프로모터, HBB2 인트론 (특히 상기에 정의된 바와 같은 변형된 HBB2 인트론), 본 발명의 코딩 서열, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함하는 발현 카세트, 예컨대 SEQ ID NO: 2 내지 4로 표시된 신호 펩티드-코딩 서열 각각과 조합된 SEQ ID NO: 13의 서열-최적화된 GAA 핵산 분자를 포함하는, SEQ ID NO: 20 내지 SEQ ID NO: 22 중 어느 하나로 표시된 핵산 구성체를 포함한다. 다른 구체예에서, 발현 카세트는 상기 표 2, 표 2" 또는 표 2", 특히 표 2' 또는 표 2"에 표시된 서열의 조합 중 어느 하나로부터 생성된 코딩 서열을 함유한다.
특정 구체예에서, 발현 카세트는 ApoE 제어 영역, hAAT-간 특이적 프로모터, 코돈-최적화된 HBB2 인트론, 본 발명의 코딩 서열 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
본 발명의 핵산 구성체를 디자인하는 경우에, 당업자는 세포 또는 장기로 상기 구성체를 전달하기 위해 사용되는 벡터의 크기 제약에 대해 주의하게 될 것이다. 특히, 당업자는 AAV 벡터의 주요한 한계가 AAV 혈청형마다 다양할 수 있지만 대략 부모 바이러스 게놈의 크기로 제한된다고 여겨지는 이의 카고 수용능이라는 것을 알고 있다. 예를 들어, 5 kb가 일반적으로 AAV8 캡시드에 패키징되는 것으로 여겨지는 최대 크기이다 (Wu Z. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 80-86; Lai Y. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 75-79; Wang Y. et al., Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): 225-33). 따라서, 당업자는 AAV 5'-ITR 및 3'-ITR을 코딩하는 서열을 포함하는 최종 핵산 서열이, 바람직하게 시행되는 AAV 벡터의 카고 수용능의 110%를 넘지않도록, 특히 바람직하게 5.5 kb를 넘지 않도록 본 발명의 핵산 구성체의 성분을 선택하도록 본 발명을 실시하는데 주의하게 될 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 분자 또는 구성체를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 벡터는 단백질 발현, 바람직하게 유전자 요법에서 사용에 적합한 벡터이다. 일 구체예에서, 벡터는 플라스미드 벡터이다. 다른 구체예에서, 벡터는 본 발명의 핵산 분자, 특히 본 발명의 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 메신저 RNA를 함유하는 나노입자이다. 다른 구체예에서, 벡터는 표적 세포의 게놈으로 본 발명의 핵산 분자 또는 구성체의 통합을 가능하게 하는, 트랜스포존을 기반으로 하는 시스템, 예컨대 초활성 슬리핑 뷰티 (SB100X) 트랜스포존 시스템이다 (Mates et al. 2009). 다른 구체예에서, 벡터는 임의의 관심 세포, 예컨대 간 조직 또는 세포, 근육 세포, CNS 세포 (예컨대 뇌 세포), 또는 조혈 줄기 세포 예컨대 적혈구 계통의 세포 (예컨대 적혈구)를 표적으로 하는 유전자 요법에 적합한 바이러스 벡터이다. 이 경우에서, 본 발명의 핵산 구성체는 당분야에서 충분히 공지된 바와 같이, 효율적인 바이러스 벡터를 생산하는데 적합한 서열을 함유한다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 통합된 바이러스로부터 유래된다. 특히, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 추가의 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 예컨대 간 조직 또는 세포를 형질도입시키는데 적합한 AAV 벡터, 보다 특히 AAV-1, AAV-2 및 AAV-2 변이체 (예컨대 문헌 [Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods. [Epub ahead of print]]에 개시된, Y44+500+730F+T491V 변화를 갖는 조작된 캡시드를 포함하는 사중-돌연변이체 캡시드 최적화된 AAV-2), AAV-3 및 AAV-3 변이체 (예컨대 문헌 [Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042]에 개시된 2개 아미노산 변화, S663V+T492V를 갖는 조작된 AAV3 캡시드를 포함하는 AAV3-ST 변이체), AAV-3B 및 AAV-3B 변이체, AAV-4, AAV-5, AAV-6 및 AAV-6 변이체 (예컨대 문헌 [Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026]에 개시된 삼중 돌연변이된 AAV6 캡시드 Y731F/Y705F/T492V를 포함하는 AAV6 변이체), AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 예컨대 AAV-cy10 및 AAV-rh10, AAV-rh74, AAV-dj, Anc80, LK03, AAV2i8, 돼지 AAV 혈청형 예컨대 AAVpo4 및 AAVpo6 등의 벡터 또는 레트로바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터 및 알파-레트로바이러스이다. 당분야에 공지된 바와 같이, 사용에 고려되는 특이적 바이러스 벡터에 따라서, 추가적인 적합한 서열이 기능성 바이러스 벡터를 수득하기 위해 본 발명의 핵산 구성체에 도입될 것이다. 적합한 서열은 AAV 벡터의 경우 AAV ITR, 또는 렌티바이러스 벡터의 경우 LTR을 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 또한 각 측면 상에 ITR 또는 LTR이 측접된 상기에 정의된 바와 같은 발현 카세트에 관한 것이다.
바이러스 벡터의 장점은 하기 본 개시 내용의 일부에서 기술한다. 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 또는 비병원성 파보바이러스, 더 바람직하게 AAV 벡터는 본 발명의 핵산 분자 또는 구성체를 전달하는데 바람직하다. 인간 파보바이러스 아데노-연합 바이러스 (AAV)는 잠복 감염을 확고히 하기 위해서 감염된 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 천연적으로 복제가 결핍된 디펜도바이러스이다. 마지막 특성은 통합이 염색체 19 (19q13.3-qter) 상에 위치된 AAVS1이라고 불리는 인간 게놈 내 특별한 위치에서 발생되기 때문에 포유동물 바이러스 사이에서 고유한 것으로 보인다.
그러므로, AAV 벡터는 인간 유전자 요법을 위한 잠재적인 벡터로서 상당한 관심이 유발되었다. 바이러스의 바람직한 특성 중에는 임의의 인간 질환과 이의 연관성의 결여, 분열 및 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 이의 능력, 및 감염시킬 수 있는 상이한 조직으로부터 유래된 광범위 세포주가 있다.
충분히 특징규명되고 인간 또는 인간이외의 영장류 (NHP)로부터 단리된 AAV의 혈청형 중에서, 인간 혈청형 2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 최초의 AAV이다. 다른 현재 사용되는 AAV 혈청형은 AAV-1, AAV-2 변이체 (예컨대 문헌 [Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods. [Epub ahead of print]]에 개시된, Y44+500+730F+T491V 변화를 갖는 조작된 캡시드를 포함하는 사중-돌연변이체 캡시드 최적화된 AAV-2), AAV-3 및 AAV-3 변이체 (예컨대 문헌 [Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042]에 개시된, 2개 아미노산 변화, S663V+T492V를 갖는 조작된 AAV3 캡시드를 포함하는 AAV3-ST 변이체), AAV-3B 및 AAV-3B 변이체, AAV-4, AAV-5, AAV-6 및 AAV-6 변이체 (예컨대 문헌 [Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026]에 개시된 삼중 돌연변이된 AAV6 캡시드 Y731F/Y705F/T492V를 포함하는 AAV6 변이체), AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 예컨대 cy10 및 AAV-rh10, AAV-rh74, AAV-dj, Anc80, LK03, AAV2i8, 돼지 AAV 혈청형 예컨대 AAVpo4 및 AAVpo6, 및 AAV 혈청형의 티로신, 리신 및 세린 캡시드 돌연변이체 등을 포함한다. 또한, 다른 비천연의 조작된 변이체 및 키메라 AAV가 또한 유용할 수 있다.
AAV 바이러스는 핵산 서열의 세포 특이적 전달, 면역원성의 최소화, 안정성 및 입자 수명의 조율, 효율적인 분해, 핵으로 정확한 전달을 위해 이들 입자들을 최적화하는 것을 가능하게 만드는 통상의 분자 생물학 기술을 사용해 조작될 수 있다.
벡터로 조립을 위한 바람직한 AAV 단편은 vp1, vp2, vp3 및 초가변 영역을 포함하는 cap 단백질, rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40을 포함하는 rep 단백질, 및 이들 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 이들 단편은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 쉽게 이용될 수 있다.
Rep 단백질이 결여된 AAV-기반 재조합 벡터는 낮은 효율성으로 숙주의 게놈으로 통합되고 표적 세포에서 수년 동안 지속될 수 있는 안정한 원형 에피솜으로서 주로 존재한다.
AAV 천연 혈청형을 사용하는 대안으로서, 제한없이, 비천연 발생 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 포함하여, 인공 AAV 혈청형이 본 발명의 상황에서 사용될 수 있다. 이러한 인공 캡시드는 상이한 선택된 AAV 혈청형, 동일한 AAV 혈청형의 비인접 부분, 비-AAV 바이러스 공급원, 또는 비바이러스 공급원으로부터 수득될 수 있는 이종성 서열과 조합된 선택된 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하여, 임의의 적합한 기술을 통해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 제한없이, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화" AAV 캡시드일 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 구성체를 포함하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 상황에서, AAV 벡터는 관심 표적 세포, 특히 간세포를 형질도입시킬 수 있는 AAV 캡시드를 포함한다. 특정한 구체예에 따라서, AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-2 변이체 (예컨대 문헌 [Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods. [Epub ahead of print]]에 개시된, Y44+500+730F+T491V 변화를 갖는 조작된 캡시드를 포함하는 사중-돌연변이체 캡시드 최적화된 AAV-2), AAV-3 및 AAV-3 변이체 (예컨대 문헌 [Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042]에 개시된 2개 아미노산 변화, S663V+T492V를 갖는 조작된 AAV3 캡시드를 포함하는 AAV3-ST 변이체), AAV-3B 및 AAV-3B 변이체, AAV-4, AAV-5, AAV-6 및 AAV-6 변이체 (예컨대 문헌 [Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026]에 개시된 삼중 돌연변이된 AAV6 캡시드 Y731F/Y705F/T492V 형태를 포함하는 AAV6 변이체), AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 예컨대 AAV-cy10 및 AAV-rh10, AAV-rh74, AAV-dj, Anc80, LK03, AAV2i8, 돼지 AAV 예컨대 AAVpo4 및 AAVpo6, 및 AAV 혈청형의 티로신, 리신 및 세린 캡시드 돌연변이체 등의 혈청형의 것이다. 특정 구체예에서, AAV 벡터는 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 혈청형의 것이다 (즉, AAV 벡터는 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 혈청형의 캡시드를 가짐). 추가의 특정 구체예에서, AAV 벡터는 위형화된 벡터로서, 다시 말해서 이의 게놈 및 캡시드는 상이한 혈청형의 AAV로부터 유래된다. 예를 들어, 위형화된 AAV 벡터는 그 게놈이 상기에 언급된 AAV 혈청형 중 하나로부터 유래되고, 그의 캡시드가 다른 혈청형으로부터 유래된 벡터일 수 있다. 예를 들어, 위형화된 벡터의 게놈은 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 혈청형으로부터 유래된 캡시드를 가질 수 있고, 이의 게놈은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, AAV 벡터는 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 혈청형의 캡시드, 특히 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드, 보다 특히 AAV8 혈청형의 캡시드를 갖는다.
특별한 구체예에서, 벡터가 근육 세포로 이식유전자를 전달하는데 사용을 위한 경우에, AAV 벡터는 특히 AAV8, AAV9 및 AAVrh74로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
다른 특별한 구체예에서, 벡터가 간 세포로 이식유전자를 전달하는데 사용을 위한 경우에, AAV 벡터는 다른 것들 중에서, AAV5, AAV8, AAV9, AAV-LK03, AAV-Anc80 및 AAV3B로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 캡시드는 변형된 캡시드이다. 본 발명의 상황에서, "변형된 캡시드"는 하나 이상의 야생형 AAV VP 캡시드 단백질로부터 유래된 하나 이상의 변이체 VP 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 또는 키메라 캡시드일 수 있다.
특정 구체예에서, AAV 벡터는 키메라 벡터이고, 다시 말해서, 이의 캡시드는 적어도 2종의 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 VP 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 적어도 2종의 AAV 혈청형으로부터 유래된 VP 단백질 영역 또는 도메인이 조합된 적어도 하나의 키메라 VP 단백질을 포함한다. 간 세포를 형질도입시키는데 유용한 이러한 키메라 AAV 벡터의 예는 문헌 [Shen et al., Molecular Therapy, 2007] 및 [Tenney et al., Virology, 2014]에 기술되어 있다. 예를 들어 키메라 AAV 벡터는 상기에 특별히 언급된 임의의 것들과 같은, AAV8 혈청형과 상이한 AAV 혈청형의 서열과 AAV8 캡시드 서열의 조합으로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 캡시드는 하나 이상의 변이체 VP 캡시드 단백질 예컨대 WO2015013313에 기술된 것들, 특히 높은 간 향성이 존재하는 RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 및 RHM15-6 캡시드 변이체를 포함한다.
다른 구체예에서, 변형된 캡시드는 에러 프론 PCR 및/또는 펩티드 삽입으로 삽입된 캡시드 변형으로부터 또한 유래될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bartel et al., 2011]에 기술된 바와 같음). 또한, 캡시드 변이체는 단일 아미노산 변화 예컨대 티로신 돌연변이체를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zhong et al., 2008]에 기술된 바와 같음).
또한, AAV 벡터의 게놈은 단일 가닥 또는 자기-상보성 이중-가닥 게놈일 수 있다 (McCarty et al., Gene Therapy, 2003). 자기-상보성 이중-가닥 AAV 벡터는 AAV 말단 반복부 중 하나로부터 말단 분해 부위 (trs)를 결실시켜 생성될 수 있다. 그 복제 게놈이 야생형 AAV 게놈의 절반 길이인 이들 변형된 벡터는 DNA 이량체를 패키징시키는 경향을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 실시에서 실행되는 AAV 벡터는 단일 가닥 게놈을 가지며, 더욱 바람직하게는 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 캡시드, 특히 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 캡시드, 예컨대 AAV8 또는 AAV9 캡시드, 보다 특히 AAV8 캡시드를 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 단일-가닥 또는 이중-가닥, 자기-상보성 게놈 (예를 들어, 단일-가닥 게놈)에, 본 발명의 핵산 구성체를 포함하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 일 구체예에서, AAV 벡터는 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 캡시드, 특히 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 캡시드, 예컨대 AAV8 또는 AAV9 캡시드, 보다 특히 AAV8 캡시드를 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 상기 핵산은 프로모터, 특히 편재성 또는 간-특이적 프로모터에 작동적으로 연결된다. 특별한 변이체 구체예에 따라서, 프로모터는 편재성 프로모터 예컨대 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타 액틴(CAG) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/프로모터 (CMV), PGK 프로모터 및 SV40 초기 프로모터이다. 특별한 변이체에서, 편재성 프로모터는 CAG 프로모터이다. 다른 변이체에 따라서, 프로모터는 간-특이적 프로모터 예컨대 알파-1 항트립신 프로모터 (hAAT), 트랜스타이레틴 프로모터, 알부민 프로모터 및 타이록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터이다. 특별한 변이체에서, 간-특이적 프로모터는 SEQ ID NO: 15의 hAAT 간-특이적 프로모터이다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터의 게놈에 포함된 핵산 구성체는 프로모터 및 GAA 코딩 서열을 코딩하는 핵산 서열 (즉, 본 발명의 최적화된 GAA 코딩 서열, 본 발명의 키메라 GAA 코딩 서열, 또는 본 발명의 키메라 및 최적화된 GAA 코딩 서열) 사이에 위치하는 인트론을 더 포함한다. AAV 벡터 게놈 내에 도입된 핵산 구성체 내에 포함될 수 있는 대표적인 인트론은 제한없이, 인간 베타 글로빈 b2 (또는 HBB2) 인트론, FIX 인트론 및 닭 베타-글로빈 인트론을 포함한다. AAV 벡터의 게놈 내 상기 인트론은 상기 인트론 내 선택적인 오픈 리딩 프레임 (ARF)의 수를 감소시키거나, 또는 심지어 전체로 제거되도록 디자인된 변형된 인트론일 수 있거나 또는 고전적인 (또는 비변형된) 인트론일 수 있다. 본 발명의 핵산이 AAV 벡터 내에 도입되는 이러한 구체예의 실시에서 사용될 수 있는 변형 및 미변형 인트론은 완전히 상기에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 특히 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 캡시드, 특히 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 캡시드, 예컨대 AAV8 또는 AAV9 캡시드, 보다 특히 AAV8 캡시드를 포함하는 AAV 벡터는 이의 게놈 내에 변형된 (또는 최적화된) 인트론 예컨대 SEQ ID NO: 7의 변형된 HBB2 인트론, SEQ ID NO: 9의 변형된 FIX 인트론 및 SEQ ID NO: 11의 변형된 닭 베타-글로빈 인트론을 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 벡터는 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 캡시드, 특히 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 캡시드, 예컨대 AAV8 또는 AAV9 캡시드, 보다 특히 AAV8 캡시드를 포함하고, 5'에서 3'의 배향으로: AAV 5'-ITR (예컨대 AAV2 5'-ITR); ApoE 제어 영역; hAAT-간 특이적 프로모터; HBB2 인트론 (특히 상기 정의된 바와 같은 변형된 HBB2 인트론); 본 발명의 GAA 코딩 서열; 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호; 및 AAV 3'-ITR (예컨대 AAV2 3'-ITR)을 함유하는 게놈, 예컨대 AAV 5'-ITR (예컨대 AAV2 5'-ITR) 및 AAV 3'-ITR (예컨대 AAV2 3'-ITR)이 측접된 SEQ ID NO: 20, 21 또는 22 (각각이 SEQ ID NO: 5의 부모 hGAA로부터 유래된 GAA의 Δ8 절두 형태를 코딩하는 최적화된 서열에 상응하는 SEQ ID NO: 17, 18 및 19로 표시되는 핵산 서열을 포함함)로 표시되는 핵산을 포함하는 게놈을 포함하는 AAV 벡터이다. 본 발명의 실시에서 유용한 다른 발현 카세트는 상기 표 2, 표 2' 또는 표 2", 특히 표 2' 또는 표 2"에 표시된 서열 조합 중 어느 하나의 신호 펩티드 모이어티 및 GAA 모이어티를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 구성체는 상기에 기술된 바와 같은 간-특이적 프로모터를 포함하고, 벡터는 상기 기술된 바와 같이 간 조직 또는 세포를 형질도입시킬 수 있는 바이러스 벡터이다. 본 발명자들은 간의 프로관용원성 및 물질대사 특성이 간세포에서 GAA의 분비가능한 형태를 발현시키고 그 단백질에 대한 면역 관용을 유도시키도록 고도로 효율적이고 최적화된 벡터를 개발하기 위한 이러한 구체예 덕분에 유리하게 실행된다는 것을 확인한 데이타를 하기에 제시한다.
또한, 추가의 특정 구체예에서, 본 발명은 관심 세포에서 유전자 전달 및 치료 효능을 개선시키기 위해 2종의 벡터, 예컨대 2종의 바이러스 벡터, 특히 2종의 AAV 벡터의 조합을 제공한다. 예를 들어, 2종의 벡터는 이들 2종 벡터 각각에서 하나의 상이한 프로모터의 제어 하에, 본 발명의 GAA 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 운반할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나의 벡터는 간-특이적 프로모터 (상기 기술된 것 중 하나)인 프로모터를 포함하고, 나머지 벡터는 당원 축적 질병의 치료를 위해 다른 관심 조직에 특이적인 프로모터, 예컨대 근육-특이적 프로모터, 예를 들어 데스민 프로모터를 포함한다. 이러한 구체예의 특정 변이체에서, 벡터의 이러한 조합은 WO2015196179에 기술된 바와 같이 생산된 다수의 공동-패키징된 AAV 벡터에 상응한다.
다른 양상에서, 본 발명은 신호 펩티드 모이어티 및 GAA 모이어티를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 천연 발생 GAA 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드로 교체된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같이, GAA의 절두 형태로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 GAA 단백질은 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 신호 펩티드와 이의 N-말단부에서 융합되는, Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46, Δ47, Δ48, Δ49, Δ50, Δ51, Δ52, Δ53, Δ54, Δ55, Δ56, Δ57, Δ58, Δ59, Δ60, Δ61, Δ62, Δ63, Δ64, Δ65, Δ66, Δ67, Δ68, Δ69, Δ70, Δ71, Δ72, Δ73, Δ74 또는 Δ75 GAA 절두 형태 모이어티 (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질의 절두 형태)일 수 있다.
특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9 또는 Δ10 절두 형태, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ7, Δ8 또는 Δ9 절두 형태, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ8 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ27, Δ28, Δ29, Δ30 또는 Δ31, 특히 Δ28, Δ29 또는 Δ30, 보다 특히 Δ29 절두 형태이다.
다른 특정 구체예에서, 키메라 GAA 단백질의 GAA 모이어티는 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44 절두 형태, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ41, Δ42 또는 Δ43 절두 형태, 특히 GAA (특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시되는 부모 hGAA 단백질)의 Δ42 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45, 특히 Δ42, Δ43 또는 Δ44, 보다 특히 Δ43 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 또는 Δ45, 특히 Δ7, Δ8, Δ9, Δ28, Δ29, Δ30, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44, 특히 Δ8, Δ29, Δ42 또는 Δ43 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 또는 Δ44, 특히 Δ8 또는 Δ42 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8, Δ29, Δ42, Δ43 또는 Δ47 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8, Δ29, Δ42 또는 Δ43 절두 형태이다.
이 구체예의 다른 변이체에서, 본 발명의 절두형 GAA 폴리펩티드는 hGAA 폴리펩티드, 및 보다 특히 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 hGAA 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 아미노산 치환을 포함하고 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 33, 특히 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체의 Δ8 또는 Δ42 절두 형태이다.
특별한 구체예에서, 본 발명의 절두된 hGAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43로 표시되는 서열, 또는 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43으로 표시된 서열과 비교하여 1 내지 5개 아미노, 특히 1 내지 4개, 특히 1 내지 3개, 보다 특히 1 내지 2개, 특히 1개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 기능성 변이체로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 절두된 hGAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 42로 표시되는 서열, 또는 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 42로 표시되는 서열과 비교하여 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 기능성 변이체로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 절두된 hGAA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30로 표시된 서열, 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30으로 표시된 서열과 비교하여 1 내지 5개 아미노, 특히 1 내지 4개, 특히 1 내지 3개, 보다 특히 1 내지 2개, 특히 1개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 기능성 변이체로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다 .
특정 구체예에서, 키메라 GAA 폴리펩티드는 상기 표 1, 표 1' 또는 표 1", 특히 표 1' 또는 표 1"에 표시된 조합 중 하나에 의해 생성된 서열을 갖거나, 또는 생성된 서열 조합과 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
본 발명은 또한 생체외 유전자 요법의 경우에서 처럼 본 발명의 핵산 분자 또는 구성체로 형질전환되는 세포, 예를 들어 간 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포는 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 GAA-결핍 환자에게, 임의의 적절한 투여 경로 예컨대 상기 대상체의 혈류 또는 간으로의 주사를 통해서 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 간 세포, 특히 치료하려는 대상체의 간 세포에 도입시키는 단계, 및 상기 핵산이 도입된 형질전환된 간 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 유리하게, 이러한 구체예는 상기 세포로부터 GAA를 분비시키는데 유용하다. 특정 구체예에서, 간 세포는 치료하려는 환자 유래의 간 세포이거나, 또는 환자에게 후속 투여를 위해서 더욱 형질전환시켜, 시험관 내에서 간 세포로 분화시킨 간 줄기 세포이다.
본 발명은 또한 그 게놈에 본 발명에 따른 GAA 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 구성체를 포함하는 유전자이식된, 인간이외의 동물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 동물은 마우스이다.
하기 실시예에서 구체화되는 특별한 전달 시스템 이외에도, 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 본 발명의 코딩 서열을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 치료적 핵산의 구축 등이 본 발명의 핵산 분자 또는 구성체를 투여하는데 사용될 수 있다.
구체예에 따라서, 임의의 적합한 경로를 통해서 대상체의 간으로 본 발명의키메라 GAA 폴리펩티드, 핵산 분자, 핵산 구성체 또는 세포를 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한 나형 DNA 예컨대 미니서클 및 트랜스포존이 전달 또는 렌티바이러스 벡터로 사용될 수 있다. 추가적으로, 유전자 편집 기술 예컨대 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TALEN 및 CRISPR가 또한 본 발명의 코딩 서열을 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드, 또는 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료제 (본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포)의 치료적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특별한 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 U.S. 또는 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 동물 및 인간에서 사용에 대해 인정되는 약전에 열거되거나 또는 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관이 승인한 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학 담체는 멸균된 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유 등일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 또한 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액을 위한 액상 담체로서 적용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 포도당, 락토스, 수크로스, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
바람직하다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 용액제, 현탁제, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제제는 표준 담체 예컨대 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 대상체에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게 정제된 형태의 치료제의 치료적 유효량을 함유하게 될 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산, 벡터 또는 세포는 포스페이트-완충 염수를 포함하고 0.25% 인간 혈청 알부민이 보충된 조성물로 제제화된다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산, 벡터 또는 세포는 링거 락테이트 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 총 조성물의 중량 기준으로 0.01 내지 0.0001%의 최종 농도, 예컨대 0.001%의 농도로 pluronic F68을 포함하는 조성물로 제제화된다. 제제는 혈청 알부민, 특히 인간 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민을 0.25%로 더 포함할 수 있다. 저장 또는 투여를 위해 적절한 다른 제제는 당분야, 특히 WO 2005/118792 또는 문헌 [Allay et al., 2011]에 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여를 위해 적합화된 약학 조성물로서 통상의 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균된 등장성 수성 완충액의 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 주사 부위의 통능을 완화시키기 위해서 가용화제 및 국소 마취제 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포는 소포체 특히 리포솜으로 전달될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다
본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포의 투여 방법은 제한없이 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함한다. 특정 구체예에서, 투여는 정맥내 또는 근육내 경로를 통한다. 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포는 벡터화되거나 또는 그렇지 않건 무관하게, 임의의 편리한 경로를 통해서, 예를 들어 주입 또는 볼러스 주사를 통해서, 상피 또는 점막피부 내층 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신이거나 또는 국소일 수 있다.
특별한 구체예에서, 치료를 필요로 하는 영역, 예를 들어 간에 국소적으로 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어, 임플란트를 통해 수행될 수 있고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막, 또는 섬유를 포함하는, 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 재료이다.
당원 축적병의 치료에 효율적이게 되는 본 발명의 치료제 (즉, 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포)의 양은 표준 임상 기술을 통해 결정할 수 있다. 또한, 생체 내 및/또는 시험관 내 어세이는 임의로 최적 용량 범위를 예측하는데 도움이 되도록 적용될 수 있다. 제제에 적용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 심각도에 따라 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포의 용량은 제한없이, 투여 경로, 치료되는 특별한 질환, 대상체의 연령 또는 치료적 효과를 수득하는데 필요한 발현 수준을 포함한 몇몇 인자들을 기반으로 다양하게 될 것이다. 당업자는 당분야에서 이의 지식을 기반으로 하여, 이들 인자 및 다른 것들을 기반으로 요구되는 용량 범위를 쉽게 결정할 수 있다. 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료의 경우에서, 벡터의 전형적인 용량은 체중 킬로그램 당 적어도 1x108 벡터 게놈 (vg/kg), 예컨대 적어도 1x109 vg/kg, 적어도 1x1010 vg/kg, 적어도 1x1011 vg/kg, 적어도 1x1012 vg/kg 적어도 1x1013 vg/kg, 또는 적어도 1x1014 vg/kg이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 핵산, 벡터, 키메라 폴리펩티드, 약학 조성물 또는 세포의 치료 유효량을 전달하는 단계를 포함하는, 당원 축적병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 약학 조성물 또는 세포의 치료적 유효량을 전달하는 단계를 포함하는,당원 축적병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 이식유전자 (즉, 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드)에 대해 면역 반응을 유도하지 않거나, 또는 이식유전자에 대한 감소된 면역 반응을 유도시킨다. 본 발명은 또한 당원 축적병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 약학 조성물 또는 세포의 치료적 유효량을 반복 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 양상에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 구성체는 간 세포에서 기능성이어서, 이로부터 생산된 발현된 키메라 GAA 폴리펩티드에 대한 면역 관용을 가능하게 하는 프로모터를 포함한다. 역시, 이러한 양상에서, 이 양상에서 사용되는 약학 조성물은 간 세포에서 기능성인 프로모터를 포함하는 핵산 분자 또는 핵산 구성체를 포함한다. 간 세포의 전달의 경우에서, 상기 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 이전에 수집되고, 그들에게 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 구성체를 도입하여 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드를 생산할 수 있게 조작된 세포일 수 있다. 구체예에 따라서, 반복 투여를 포함하는 양상에서, 상기 투여는 적어도 1회 또는 그 이상이 반복될 수 있고, 심지어 주기적인 스케줄에 따라서, 예컨대 1주, 1개월 또는 1년에 1회 수행되는 것이 고려될 수도 있다. 주기적 스케줄은 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 마다 1회, 또는 10년을 초과하여 1회 투여를 포함할 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 바이러스 벡터의 각 투여의 투여는 각각의 연속 투여에 대해 상이한 바이러스를 사용하여 수행되고, 그리하여 이전에 투여된 바이러스 벡터에 대한 가능한 면역 반응으로 인한 효능의 감소를 피한다. 예를 들어, AAV8 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터의 제1 투여를 수행할 수 있고, 이후에 AAV9 캡시드를 포함하는 벡터의 투여를 후속할 수 있거나, AAV와 비관련된 바이러스, 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 투여가 후속될 수도 있다.
본 발명에 따라서, 치료는 치유, 완화 또는 예방 효과를 포함할 수 있다. 따라서, 치료적 및 예방적 치료는 특정 당원 축적병의 증상의 경감 또는 특정한 당원 축적병의 발생 위험성의 예방 또는 아니면 감소를 포함한다. 용어 "예방적"은 특정 병태의 개시 또는 중증도의 감소로서 간주될 수 있다. "예방적"은 또한 이전에 병태로 진단된 환자에서 특정한 병태의 재발 예방을 포함한다. "치료적"은 또한 존재하는 병태의 중증도를 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 용어 '치료'는 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간 대상체에게 이득이 될 수 있는 임의의 양생법을 의미하고자 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 구성체를 이를 필요로 하는 환자의 단리된 세포, 예를 들어 단리된 조혈 줄기 세포에 도입시키는 단계, 및 이를 필요로 하는 상기 환자에게 상기 세포를 도입시키는 단계를 포함하는, 당원 축적병의 치료를 위한 생체외 유전자 요법 방법에 관한 것이다. 이러한 양상의 특정한 구체예에서, 핵산 분자 또는 구성체는 상기 정의된 바와 같은 벡터에 의해 세포에 도입된다. 특정 구체예에서, 벡터는 통합성 바이러스 벡터이다. 추가의 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌바이러스 벡터이다. 예를 들어, 문헌 [van Til et al., 2010, Blood, 115(26), p. 5329]에 개시된 바와 같은 렌티바이러스 벡터가 본 발명의 방법의 실시에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 약물로서 사용을 위한 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GAA 유전자의 돌연변이에 의해 초래되는 질환을 치료하기 위한 방법, 특히, 폼페 병을 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가서 당원 축적병, 예컨대 GSDI (폰 기에르케병), GSDII (폼페 병), GSDIII (코리병), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 및 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병, 보다 특히 GSDI, GSDII 또는 GSDIII, 보다 더 특히 GSDII 및 GSDIII, 및 가장 특히 GSDII를 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 키메라 GAA 폴리펩티드는 효소 대체 요법 (ERT)에서 사용을 위해, 예컨대 당원 축적병, 예컨대 GSDI (폰 기에르케병), GSDII (폼페 병), GSDIII (코리병), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 및 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병, 보다 특히 GSDI, GSDII 또는 GSDIII, 보다 더 특히 GSDII 및 GSDIII 및 가장 특히 GSDII 중 하나의 효소 대체 요법에서 사용을 위해, 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 당원 축적병, 예컨대 GSDI (폰 기에르케병), GSDII (폼페 병), GSDIII (코리병), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 및 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병, 보다 특히 GSDI, GSDII 또는 GSDIII, 보다 더 특히 GSDII 및 GSDIII, 및 가장 특히 GSDII를 치료하는데 유용한 약물의 제조에서, 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구성체, 벡터, 키메라 GAA 폴리펩티드 또는 세포의 용도에 관한 것이다.
실시예
본 발명은 하기 실험 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 제한하려는 의도가 아니다.
재료 및 방법
GAA 활성
GAA 활성은 증류수 중 냉동 조직 샘플의 균질화 후에 측정하였다. 50-100 mg의 조직을 칭량하고 균질화시키고 나서, 20분 동안 10000 x g에서 원심분리하였다. 반응물은 96웰 플레이트에서 10 μl의 상청액 및 20 μl의 기질 - 4MUα-D-글루코시드를 사용해 설정하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 150 μl의 소듐 카보네이트 완충액 pH 10.5을 첨가하여 중단시켰다. 449 nm (발광) 및 360 nm (여기)에서 EnSpire 알파 플레이트 판독기 (Perkin-Elmer)를 사용하여, 개별 반응 혼합물로부터 방출된 형광발광성 4MU를 측정하기 위해 표준 곡선 (0-2500 pmol/μl의 4MU)이 사용되었다. 청징된 상청액의 단백질 함량은 BCA (Thermo Fisher Scientific)를 통해 정량하였다. GAA 활성을 계산하기 위해서, 방출된 4MU 농도를 샘플 단백질 농도로 나누었고 활성은 nmol/hour/mg 단백질로서 기록하였다.
글리코겐 함량
글리코겐 ?량은 상기에 기술된 바와 같이 수득된 조직 균질물의 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus Niger) 아밀로글루코시다제에 의한 전체 분해 후 방출된 포도당으로서 간접적으로 측정되었다. 반응물은 20 μl의 조직 균질물 및 55 μl의 증류수로 96웰 플레이트에서 설정되었다. 샘플은 5분 동안 95℃에서 인큐베이션시킨 후 4℃에서 냉각시켰다. 25 μl의 아밀로글루코시다제 (0.1 M 포타슘 아세테이트 pH5.5에 1:50으로 희석)가 각 샘플에 첨가되었다. 아밀로글루코시다제가 없는 대조군 반응물도 역시 각 샘플에 대해 설정되었다. 샘플 및 대조군 반응물 둘 모두는 37℃에서 90분 동안 인큐베이션되었다. 반응은 샘플을 5분 동안 95℃에서 인큐베이션시켜서 중단되었다. 방출된 포도당은 포도당 어세이 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 540 nm에서 EnSpire 알파 플레이트 판독기 (Perkin-Elmer)를 사용하여 흡광도를 측정하여 결정되었다.
체적변동기록법 (Plethysmography)
플로우-쓰로우 (0.5 L/분) 체적변동기록법 (EMKA technologies)을 사용하여 대조군 및 Gaa-/- 마우스에서 호흡 패턴을 측정하였다. 투명한 플렉시글라스 챔버를 데이타 수집 전에 기지의 기류 및 압력 신호로 보정하였다. 신호는 IOX2 소프트웨어 (EMKA technologies)를 사용하여 분석하였다. 다음의 변수들을 측정하였다: 호흡 빈도, 1회 호흡량 및 분간 환기량. 환기량 데이타는 5-분 빈으로 수집하였다. 5분은 챔버에 대한 순응을 가능하게 한다. 순응 및 데이타 획득 둘 모두의 경우에, 마우스는 정상 산소 호흡하였다 (21% O2, 79% N2).
마우스 실험
Gaa -/- 마우스는 엑손 6의 표적화 파괴에 의해 생성시켰고 C57BL/6J/129X1/SvJ 백그라운드로 유지되었다 (Raben N. et al 1998). 벡터는 0.2 mL의 부피로 꼬리 정맥을 통해서 전달되었다. 혈청 샘플은 분비된 hGAA의 수준을 모니터링하기 위해 매월 수집되었다. PBS-주사된 영향받은 동물 및 야생형 한배새끼가 대조군으로서 사용되었다.
항-hGAA 항체 결정
Maxisorp 96 웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific)는 카보네이트 완충액 중 Myozime® 단백질로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 래트 재조합 IgG의 표준 곡선 (Sigma Aldrich)은 1 μg/mL로부터 시작하여 7회 2배 희석으로 웰에 코딩하였다. 차단 후, 혈장 샘플을 플레이트에 첨가하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 검출은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질 (BD Biosciences)을 웰에 첨가하여 수행하였고, H2SO4로 반응을 차단시킨 후 Enspire 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 상에 450 및 570 nm (백그라운드 감산용)에서 발색을 측정하였다.
NHP 실험
수컷 사이노몰거스 마카크를 스테인레스강 케이지에 수용하였고 12시간 명암 주기로 유지시켰다. 모든 마카크는 실험 시작 전에 < 1:5의 중화 항체 역가를 가졌다. 2E12 vg/kg 용량의 AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1을 대복재 정맥을 통해서 주입하였다. 혈액 샘플은 대퇴정맥을 통한 주사 전 12일 및 주사 후 30일에 채혈하였다. 전혈은 EDTA 함유 튜브에 채혈하였고 원심분리하여 혈청을 분리시켰다. 벡터 투여 후 3개월에 모든 마카크를 안락사시켰다. 동물들은 먼저 케타민/덱스메데토미딘의 혼합물로 마취시키고 나서 IV 주사되는 소듐 펜토바비탈을 사용해 안락사시켰다. 조직을 즉시 수집하였고 액체 질소에서 동결시켰다.
웨스턴 블롯 분석
전체 균질물을 동결된 근육으로부터 수득하였다. 단백질 농도는 제조사의 지시서에 따라서, Pierce BCA 단백질 어세이 (Thermo Fisher Scientific)를 통해 추출물에서 결정하였다. 웨스턴 블롯은 항 hGAA 항체 (Abcam)를 사용해 수행하였다. 항-튜불린 항체 (Sigma Aldrich)를 로딩 대조군으로서 사용하였다.
결과
폼페 병에 대한 현행 유전자 대체 요법을 개선시키고자 하는 노력으로, 우리는 야생형 신호 펩티드 (본 명세서에서 sp1로 표시됨)를 hGAA의 서열 최적화된 서열 (SEQ ID NO: 13)의 상이한 신호 펩티드 (sp2 내지 8, 표 4에 기술됨)로 교체시켜 이의 분비성이 증가되도록 hGAA 서열을 조작하였다.
표 4
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우리는 간세포암 세포 (Huh-7)를 신호 펩티드 1 내지 8과 융합된 코돈 최적화된 hGAA (hGAAco)를 발현하는 플라스미드와 함께 GFP 또는 야생형 hGAA (hGAA; SEQ ID NO: 37)를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에, 성장 배지를 hGAA의 존재에 대해서 분석하였다. 특히 효율적인 신호 펩티드를 보유한 구성체 중 오직 4개만이 GFP-형질감염된 세포를 통해서 나타나는 음성 대조군에서 관찰된 것보다 유의하게 더 높은 hGAA의 분비 수준을 야기시켰다 (도 1A). 신호 펩티드 sp2, sp6, sp7 및 sp8을 보유하는 hGAA 키메라 단백질을 발현하는 구성체는 배지에서 더 높은 수준의 hGAA를 분비하였다 (GFP 대비 p < 0.05).
다음으로 우리는 삼중 형질감염 및 세슘 클로라이드 정제를 통해서 제조된 AAV8 벡터에 이들 구성체를 패키징하였고 그들을 야생형 C57BL/6J 마우스에게 주사하였다. 이어서 우리는 신호 펩티드 sp1, 2, 3, 7 및 8 (도 1B)이 사용된 구성체에 대해 생체 내 GAA 혈청 수준을 비교하였다. hGAAco를 발현하는 AAV8 벡터 1E12 vg/kg의 주사 후 1개월에 우리는 PBS 주사된 마우스와 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 순환형 hGAA를 관찰하였다. 흥미롭게도, 순환형 hGAA의 수준은 sp2, 7 및 8과 융합된 hGAAco를 발현하는 벡터로 처치된 마우스에서 유의하게 더 높았다. 놀랍게도, 생체 내에서 sp2 구성체에 의해 획득된 분비 수준은 sp7- 및 sp8- 조작된 hGAA에서 측정된 것보다 유의하게 낮았다 (도 1B). 이들 데이타를 함께 취합하면 간에서 효율적으로 분비된 단백질로부터 유래된 신호 펩티드로 야생형 신호 펩티드의 치환이 생체 내에서 hGAA의 순환 수준을 증가시키는 효과적인 전략이라는 것을 의미한다. 게다가, sp7 및 8 신호 펩티드로 생체 내에서 수득된 예상치 않은 결과들은 모든 신호 펩티드가 생체 내에서 균등하게 효율적이지는 않고, 신호 펩티드 sp7 및 sp8이 sp1 및 sp2와 비교하여 생체 내에서 우수한 분비 효능을 유발시킨다는 것을 의미한다.
다음으로 질환의 동물 모델, GAA -/- 마우스에서 이러한 발견들을 확증하였다. 이 마우스 모델은 근력 손상 및 수명 감소를 초래하는, 상이한 장기 내 글리코겐 축적과 함께, 근육 내 효소의 잔류 활성이 존재하지 않았다.
GAA-/- 마우스에서 폼페 병 표현형의 구제에서 상이한 벡터의 유효성을 비교하기 위해서, 우리는 2E12 vg/kg의 hGAAco를 발현하는 벡터 및 신호 펩티드 sp2, 7 및 8과 융합된 조작된 형태의 주사의 효과를 장기간 동안 추적하였다. 주사 후 3개월에, 우리는 고도로 효율적인 신호 펩티드 sp2, 7 및 8을 보유하는 hGAAco를 발현하는 AAV8을 주사한 후 유의하게 증가된 순환형 hGAA를 관찰하였다 (도 2A). 특히, sp7 신호 펩티드가 융합된 hGAAco는 다른 2종의 구성체에서 관찰된 것보다 유의하게 더 높은 순환 hGAA의 수준을 야기시켰다. 이 실험에서 장기간의 추적조사는 GAA -/- 마우스의 생존을 추정할 수 있게 하였다. 마우스는 4개월령에 주사되었고 이후에 6개월 동안 추적조사되었다. 이 기간 동안 PBS 주사된 그룹에서 8/10 GAA-/- 마우스가 폐사된 반면 hGAAco 발현 구성체가 처치된 GAA-/- 동물 및 야생형 동물에서 단지 1/45 폐사가 기록되었다. 이러한 결과의 통계적 유의성 (도 2B)은 분비 수준과 독립적으로 모든 hGAAco 발현 벡터의 처치가 GAA -/- 마우스에서 관찰된 치명적인 표현형을 구제한다는 것을 의미한다. 이 마우스 모델에서 보고된 다른 표현형은 호흡 기능의 감소이다. 특히, 감소된 1회 호흡량이 보고되었고 (DeRuisseau et al PNAS 2008) 이러한 감소는 신경계에서 글리코겐의 축적에 기인한다는 것이 입증되었다. 신경계에서 글리코겐 수준의 구제는 혈관-뇌 장벽을 관통하는 hGAA의 능력에 의존적이고 이 단백질의 순환 수준에 직접적으로 의존한다는 것이 다른 리소솜 축적 질병에서 입증되었다 (Polito et al Hum. Mol. Genet. 2010, Cho et al Orph. J. of Rare Dis. 2015). 그러므로, 우리는 GAA -/- 마우스의 1회 호흡량에 대한 hGAA의 장기간, 높은 순환 수준의 효과를 평가하였다. 주사 후 3개월에, 유의하지는 않지만 (p = 0.104), GAA -/- 마우스는 감소된 1회 호흡량을 보인데 반해 sp7이 처치된 마우스는 WT 마우스에서 관찰된 것과 매우 유사한 1회 호흡량을 보였다 (p = 0.974) (도 2C, 좌측). 주사 후 6개월에, 오직 2마리의 GAA -/- 마우스가 생존하였고 그들은 덜 심각한 호흡 표현형을 갖는 것으로 나타났다. 역시, sp7 hGAAco로 처치된 마우스는 WT 동물에서 관찰된 것과 유사한 1회 호흡량을 가졌다 (p= 0.969) (도 2C, 우측). 중요하게, sp1 및 sp7 hGAAco가 처치된 마우스에서 측정된 1회 호흡량 간 통계적으로 유의한 편차 (p = 0.041)가 확인되어, sp7-GAA 처치된 마우스에서 보다 두드러진 개선이 확인되었다. 이들 데이타를 취합하면, sp7 신호 펩티드가 융합된 hGAAco를 발현하는 AAV8이 형질도입된 간은 GAA-/- 마우스에서 호흡기 기능의 완전한 표현형 교정을 수반하는 혈중 hGAA의 우수한 수준을 야기한다는 것을 의미한다.
다음으로 높은 수준의 순환형 hGAA가 골격근에서 글리코겐 축적을 구제하는지 여부를 검증하였다. 우리는 상기 기술된 바와 같이 주사된 마우스의 사두근에서 hGAA 활성을 측정하였다. hGAA 발현 벡터의 주사는 WT 동물에서 관찰된 것과 비슷한 수준으로 사두근 내 hGAA 활성의 증가를 야기시켰다 (도 3A). 사두근에서 글리코겐의 측정은 GAA -/- 마우스가 WT 동물보다 ∼20배 더 많이 글리코겐을 축적시킨다는 것을 의미한다 (p = 3.5E-6). 이러한 축적은 hGAA 발현 벡터의 처치로 반전되며 (GAA-/- 대비 p < 0.05), sp7가 있는 경우에 야생형 동물의 수준과 구별되지 않는, 최저 글리코겐 수준을 보였다 (WT 대비 p = 0.898) (도 3B).
효율적인 신호 펩티드와 hGAA의 융합이 생체 내에서 이의 분비를 개선시키고 질환의 표현형 보정을 증가시키는 것을 검증하기 위해서, 우리는 GAA -/- 마우스에게 저용량의 벡터를 주사하였고, 표현형의 생화학적 교정을 평가하였다. 신호 펩티드 1, 7 및 8과 융합된 hGAAco를 발현하는 벡터 6E11 vg/kg의 주사 후 3개월에, 우리는 순환형 hGAA를 측정하였다. 특히 sp 7 및 8은 PBS-처치 마우스와 비교하여 혈청에서 검출가능한 분비된 hGAA의 3배 증가를 야기하였다 (도 4A). 우리는 처치된 동물 및 대조군 유래 조직의 생화학적 분석을 수행하여 hGAAco를 발현하는 AAV8 벡터의 치료적 효과를 더욱 조사하였다. 우리는 상기에 기술된 바와 같이 처치된 GAA -/- 마우스의 심장, 횡격막 및 사두근에서 글리코겐 함량을 평가하였다. 특히, 우리는 hGAAco 발현 벡터로 처치 후 조직 내에서 hGAA의 고수준을 관찰하였고 (데이타는 도시하지 않음) 이것은 고려된 모든 조직에서 글리코겐 함량의 유의한 감소와 관련되었다 (도 4B-D). 특히, 심장 (도 4B)에서 고도로 효율적인 신호 펩티드 sp7 및 8을 보유하는 벡터로 처치 후 측정된 글리코겐의 수준은 영향받지 않은 야생형 동물에서 관찰된 것과 구별되지 않았다 (야생형 대비 각각 p = 0.983 및 0.996). 중요하게, sp7 및 sp8 벡터 둘 모두를 처치 후 관찰된 수준은 PBS-주사되거나 또는 야생형 hGAaco 발현 벡터 (sp1로 표시)로 처치된 GAA -/- 동물과 비교하여 유의하게 감소되었다.
우리는 우리의 벡터가 형질도입된 간이 이식유전자에 대해서 체액성 반응을 유도하였는지 여부를 검사하였다. 마우스는 간 특이적 프로모터의 전사 제어 하에서 sp2, sp7 또는 sp8과 융합된 Δ8-hGAAco1 또는 천연 sp1 신호 펩티드 (co)를 갖는 hGAAco1을 발현하는 AAV8 벡터가 정맥내 주사되었다. 결과는 도 5에 나타내었다. 항상성 프로모터의 전사 제어 하에서 Δ8-hGAAco1을 발현하는 AAV가 근육내로 주사된 Gaa-/-는 매우 높은 수준의 전체 IgG (∼150 μg/mL)를 보인데 반해서, 일반적으로 간에서 동일한 단백질을 발현하는 벡터는 더 낮은 수준의 체액성 반응을 보였다. 흥미롭게도, sp1 hGAAco1 (co) 발현 벡터가 주사된 마우스는 양쪽 용량에서 검출가능한 수준의 항체를 보였는데 반해서, 조작된 높은 분비 벡터가 주사된 마우스는 검출불가한 IgG 수준을 가졌다. 이들 데이타는 간에서 이식유전자의 발현이 말초 관용의 유도에 필수적이라는 것을 의미하고, 또한 그들은 효율적인 신호 펩티드와의 융합으로 획득된 hGAA의 높은 순환 수준이 단백질 그 자체에 대한 체액성 반응의 감소를 유도한다는 지표를 제공한다.
마우스 실험에서 선택된 최고 수행 벡터를 2마리의 인간외 영장류 (NHP, 마카카 파시쿨라리스 (Macaca Fascicularis) 종)에게 주사하여 근육에서 우리 벡터의 분비 및 흡수 효능을 검증하였다. 우리는 2마리 원숭이에게 2E12 vg/kg의 AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1을 주사하였다. 주사 후 1개월에 우리는 특이적 항-hGAA 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해서 2마리 동물의 혈청에서 hGAA의 수준을 측정하였다. 우리는 2마리 원숭이에서 hGAA의 것과 호환되는 크기의 분명한 밴드를 관찰하였다. 이 밴드는 벡터 주사 전 12일에 수득된 혈청 샘플에서는 존재하지 않았고, 따라서 우리의 검출 방법의 특이도가 확증되었다 (도 6A). 주사 후 3개월에 우리는 동물들을 희생시켰고 조직을 수득하여 혈류 중 간에서 분비된 hGAA가 근육에 의해 효율적으로 흡수되었는지를 검증하였다. 우리는 2마리 원숭이의 이두근 및 횡격막으로부터 수득된 전체 용해물 상에서 hGAA에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴을 수행하였다. 흥미롭게 우리는 역시 혈류에서 최고 수준의 hGAA를 보여준 2번 동물에서 분명한 밴드를 관찰할 수 있었다 (도 6B). 또한, 1번 동물에서 우리는 분석된 양쪽 근육의 hGAA의 것과 일관된 분자량의 보다 희미한 밴드를 관찰할 수 있었다. 이들 데이타는 AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 벡터가 NHP의 간에서 효율적으로 형질도입된다는 것을 의미한다. 또한 그들은 혈류에서 분비된 단백질이 근육에서 효율적으로 흡수되고 이러한 흡수는 혈액에서 측정된 hGAA의 수준과 관련된다는 것을 입증한다.
우리는 상이한 GAA 형태 (모두 코돈 최적화됨): 1. 천연 sp1 GAA 신호 펩티드를 포함하는 천연 GAA (co), 2. 이종성 sp7 또는 sp8 신호 펩티드를 함유하는 조작된 GAA (sp7-co, sp8-co)가 형질감염된 HuH7 세포의 용해물 및 배지에서 GAA 활성의 분석을 더욱 수행하였다. 이 분석은 천연 GAA (co)와 비교하여 조작된 형태가 형질감염된 세포의 배지에서 유의하게 더 높은 GAA 활성을 보여주었다 (도 7). 흥미롭게, 대신 세포내 GAA 활성이 조작된 형태와 비교하여 천연 GAA (co)를 사용시 유의하게 더 높았고, 이것은 천연 GAA가 주로 세포 내에서 유지된다는 것을 의미한다.
우리는 또한 GSDIII의 마우스 모델에서 마우스 실험에서 선택된 최고 수행 벡터 (AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1)의 효과를 결정하였다. 우리는 글리코겐 탈분지 효소 (GDE)에 대한 넉아웃 마우스 모델을 개발하였다. 이러한 모델은 제III형 당원 축적병 (GSDIII)이 걸린 인간에서 관찰된 질병의 표현형을 요약한다. 특히 GDE 활성이 완전하게 결여된 GDE -/- 마우스는 근력 손상을 가지며 상이한 조직에서 글리코겐이 축적된다. 흥미롭게 그들은 또한 간에서 글리코겐이 축적되는데 이것은 역시 인간에서도 확인된다. 여기서 우리는 간에서 sp7-Δ8-hGAA의 과발현이 GDE -/- 마우스에서 관찰된 글리코겐 축적을 구제하는지 여부를 검사하였다. 우리는 GDE-/- 마우스에게 1E11 또는 1E12 vg/마우스의 AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1을 주사하였다. 대조군으로서 야생형 (WT) 및 GDE -/- 마우스에게 PBS를 동시에 주사하였다. 벡터 투여 후 3개월에, 마우스를 희생시켰고 간에서 글리코겐의 수준을 정량하였다. 그 결과는 도 8에 기록되어 있다. 이미 보고된 바와 같이 (Pagliarani 등 및 우리의 모델), GDE -/- 마우스는 야생형 동물과 비교시 글리코겐이 5배 더 많게 간에서 글리코겐 축적의 유의한 증가를 보였다 (p=1.3E-7). 놀랍게도, 1E11 및 1E12 vg/마우스의 AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 벡터 처치는 글리코겐 함량의 통계적으로 유의한 감소를 유도하였다 (각각 p=4.5E-5 및 1.4E-6). 중요하게, AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 벡터가 주사된 마우스의 간에서 측정된 글리코겐의 수준은 특히 최고 용량에서 야생형 동물에서 측정된 것과 구별되지 않았다 (1E11 용량 코호트의 경우 p = 0.053 및 1E12 용량 코호트의 경우 0.244).
우리는 상이한 GAA 형태 (모두 코돈-최적화됨): 1. 천연 sp1 GAA 신호 펩티드 (co)를 포함하는 천연 GAA, 2. 이종성 sp7 신호 펩티드 (sp7-co)를 함유하는 조작된 GAA, 및 3. 다양한 수의 아미노산의 결실 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co, sp7-Δ47-co 및 sp7-Δ62-co로서, 여기서 SEQ ID NO: 5의 처음 N-말단 아미노산의 8, 29, 42, 47 및 62가 각각 결실됨)이 후속되는 이종성 sp7 신호 펩티드를 함유하는 조작된 GAA가 형질감염된 HuH7 세포의 용해물 및 배지에서 GAA 활성의 분석을 수행하였다. 분석은 양쪽의 조작된 비결실 GAA (sp7-co) 및 천연 GAA (co)와 비교하여 Δ8, Δ29, Δ42 및 Δ43 GAA 형태가 형질감염된 세포의 배지에서 유의하게 더 높은 GAA 활성을 보여주었다 (도 9). 대신에 유의하게 더 낮은 GAA 활성이 다른 조작된 GAA 형태 [결실된 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co) 및 비결실된 (sp7-co)]와 비교하여 Δ47 및 Δ62 GAA 형태로 형질감염된 세포의 배지에서 관찰되었다. 흥미롭게, (도 10) 세포내 GAA 활성은 생산적 결실 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co) 및 비결실 형태 (sp7-co) 간에 차이가 없어서 그들이 모두 세포내에서 효율적으로 생산되어 프로세싱된다는 것을 의미한다. 대신 세포내 GAA 활성은 sp7-Δ47-co 및 sp7-Δ62-co 형태의 경우에 매우 낮았고 모든 다른 조작된 형태 [결실된 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co) 및 비결실된 (sp7-co)]와 비교시 유의하게 낮았다.
우리는 또한 상이한 GAA 형태 (모두 코돈 최적화됨): 1. 천연 sp1 GAA 신호 펩티드 (co)를 포함하는 천연 GAA, 2. 이종성 sp6 또는 sp8 신호 펩티드 (sp6-co, sp8-co)를 함유하는 조작된 GAA, 및 3. 8 아미노산 (sp6-Δ8-co, sp8-Δ8-co)의 결실이 후속되는 이종성 sp6 또는 sp8 신호 펩티드를 함유하는 조작된 GAA로 형질감염된 HuH7 세포의 용해물 및 배지에서 GAA 활성의 분석을 수행하였다. 분석은 (도 11) i. 그들의 개별적인 조작된 비결실된 GAA 형태 (sp6-co 또는 sp8-co); 및 ii. 천연 GAA (co)와 비교하여 Δ8 형태가 형질감염된 세포의 배지에서 유의하게 더 높은 GAA 활성을 보였다. 흥미롭게, 세포내 GAA 활성은 모든 조작된 GAA 형태 (결실 및 비결실 둘 모두) 간에 차이가 없어서 그들이 모두 세포내에서 효율적으로 생산되어 프로세싱된다는 것을 의미한다 (세포 용해물 패널). 대신에 세포내 GAA 활성은 조작된 형태와 비교하여 천연 GAA (co)를 사용하여 유의하게 더 높았고, 천연 GAA가 주로 세포 내에서 유지된다는 것을 의미한다.
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ctgcgtgtca ctgctgatgg gagagcagtt tctggtgtcc 2640 tggtgctga 2649 <210> 51 <211> 2649 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAAco2-delta-43 <400> 51 catcctggta gaccaagagc tgtgcctacc caatgcgacg tgccacccaa ctcccgattc 60 gactgcgcgc cagataaggc tattacccaa gagcagtgtg aagccagagg ttgctgctac 120 atcccagcga agcaaggatt gcaaggcgcc caaatgggac aaccttggtg tttcttcccc 180 ccttcgtacc catcatataa actcgaaaac ctgtcctctt cggaaatggg ttatactgcc 240 accctcacca gaactactcc tactttcttc ccgaaagaca tcttgacctt gaggctggac 300 gtgatgatgg agactgaaaa ccggctgcat ttcactatca aagatcctgc caatcggcga 360 tacgaggtcc ctctggaaac ccctcacgtg cactcacggg ctccttctcc gctttactcc 420 gtcgaattct ctgaggaacc cttcggagtg atcgttagac gccagctgga tggtagagtg 480 ctgttgaaca ctactgtggc cccacttttc ttcgctgacc agtttctgca actgtccact 540 tccctgccat cccagtacat tactggactc gccgaacacc tgtcgccact gatgctctcg 600 acctcttgga ctagaatcac tttgtggaac agagacttgg cccctactcc gggagcaaat 660 ctgtacggaa gccacccttt ttacctggcg ctcgaagatg gcggatccgc tcacggagtg 720 ttcctgctga atagcaacgc aatggacgtg gtgctgcaac cttcccctgc actcagttgg 780 agaagtaccg ggggtattct ggacgtgtac atcttcctcg gaccagaacc caagagcgtg 840 gtgcagcaat atctggacgt ggtcggatac ccttttatgc ctccttactg gggactggga 900 ttccaccttt gccgttgggg ctactcatcc accgccatta ccagacaggt ggtggagaat 960 atgaccagag cccacttccc tctcgacgtg cagtggaacg atctggacta tatggactcc 1020 cggagagatt tcaccttcaa caaggacggg ttccgcgatt ttcccgcgat ggttcaagag 1080 ctccaccagg gtggtcgaag atatatgatg atcgtcgacc cagccatttc gagcagcgga 1140 cccgctggat cttatagacc ttacgacgaa ggccttagga gaggagtgtt catcacaaac 1200 gagactggac agcctttgat cggtaaagtg tggcctggat caaccgcctt tcctgacttt 1260 accaatccca ctgccttggc ttggtgggag gacatggtgg ccgaattcca cgaccaagtc 1320 ccctttgatg gaatgtggat cgatatgaac gaaccaagca attttatcag aggttccgaa 1380 gacggttgcc ccaacaacga actggaaaac cctccttatg tgcccggagt cgtgggcgga 1440 acattacagg ccgcgactat ttgcgccagc agccaccaat tcctgtccac tcactacaac 1500 ctccacaacc tttatggatt aaccgaagct attgcaagtc acagggctct ggtgaaggct 1560 agagggacta ggccctttgt gatctcccga tccacctttg ccggacacgg gagatacgcc 1620 ggtcactgga ctggtgacgt gtggagctca tgggaacaac tggcctcctc cgtgccggaa 1680 atcttacagt tcaaccttct gggtgtccct cttgtcggag cagacgtgtg tgggtttctt 1740 ggtaacacct ccgaggaact gtgtgtgcgc tggactcaac tgggtgcatt ctacccattc 1800 atgagaaacc acaactcctt gctgtccctg ccacaagagc cctactcgtt cagcgagcct 1860 gcacaacagg ctatgcggaa ggcactgacc ctgagatacg ccctgcttcc acacttatac 1920 actctcttcc atcaagcgca tgtggcagga gaaaccgttg caaggcctct tttccttgaa 1980 ttccccaagg attcctcgac ttggacggtg gatcatcagc tgctgtgggg agaagctctg 2040 ctgattactc cagtgttgca agccggaaaa gctgaggtga ccggatactt tccgctggga 2100 acctggtacg acctccagac tgtccctgtt gaagcccttg gatcactgcc tccgcctccg 2160 gcagctccac gcgaaccagc tatacattcc gagggacagt gggttacatt accagctcct 2220 ctggacacaa tcaacgtcca cttaagagct ggctacatta tccctctgca aggaccagga 2280 ctgactacga ccgagagcag acagcagcca atggcactgg ctgtggctct gaccaaggga 2340 ggggaagcta gaggagaact cttctgggat gatggggagt cccttgaagt gctggaaaga 2400 ggcgcttaca ctcaagtcat tttccttgca cggaacaaca ccattgtgaa cgaattggtg 2460 cgagtgacca gcgaaggagc tggacttcaa ctgcagaagg tcactgtgct cggagtggct 2520 accgctcctc agcaagtgct gtcgaatgga gtccccgtgt caaactttac ctactcccct 2580 gacactaagg tgctcgacat ttgcgtgtcc ctcctgatgg gagagcagtt ccttgtgtcc 2640 tggtgttga 2649 <210> 52 <211> 2637 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAAwt-delta-47 <400> 52 ccgcgagcag tgcccacaca gtgcgacgtc ccccccaaca gccgcttcga ttgcgcccct 60 gacaaggcca tcacccagga acagtgcgag gcccgcggct gttgctacat ccctgcaaag 120 caggggctgc agggagccca gatggggcag ccctggtgct tcttcccacc cagctacccc 180 agctacaagc tggagaacct gagctcctct gaaatgggct acacggccac cctgacccgt 240 accaccccca ccttcttccc caaggacatc ctgaccctgc ggctggacgt gatgatggag 300 actgagaacc gcctccactt cacgatcaaa gatccagcta acaggcgcta cgaggtgccc 360 ttggagaccc cgcatgtcca cagccgggca ccgtccccac tctacagcgt ggagttctcc 420 gaggagccct tcggggtgat cgtgcgccgg cagctggacg gccgcgtgct gctgaacacg 480 acggtggcgc ccctgttctt tgcggaccag ttccttcagc tgtccacctc gctgccctcg 540 cagtatatca caggcctcgc cgagcacctc agtcccctga tgctcagcac cagctggacc 600 aggatcaccc tgtggaaccg ggaccttgcg cccacgcccg gtgcgaacct ctacgggtct 660 caccctttct acctggcgct ggaggacggc gggtcggcac acggggtgtt cctgctaaac 720 agcaatgcca tggatgtggt cctgcagccg agccctgccc ttagctggag gtcgacaggt 780 gggatcctgg atgtctacat cttcctgggc ccagagccca agagcgtggt gcagcagtac 840 ctggacgttg tgggataccc gttcatgccg ccatactggg gcctgggctt ccacctgtgc 900 cgctggggct actcctccac cgctatcacc cgccaggtgg tggagaacat gaccagggcc 960 cacttccccc tggacgtcca gtggaacgac ctggactaca tggactcccg gagggacttc 1020 acgttcaaca aggatggctt ccgggacttc ccggccatgg tgcaggagct gcaccagggc 1080 ggccggcgct acatgatgat cgtggatcct gccatcagca gctcgggccc tgccgggagc 1140 tacaggccct acgacgaggg tctgcggagg ggggttttca tcaccaacga gaccggccag 1200 ccgctgattg ggaaggtatg gcccgggtcc actgccttcc ccgacttcac caaccccaca 1260 gccctggcct ggtgggagga catggtggct gagttccatg accaggtgcc cttcgacggc 1320 atgtggattg acatgaacga gccttccaac ttcatcaggg gctctgagga cggctgcccc 1380 aacaatgagc tggagaaccc accctacgtg cctggggtgg ttggggggac cctccaggcg 1440 gccaccatct gtgcctccag ccaccagttt ctctccacac actacaacct gcacaacctc 1500 tacggcctga ccgaagccat cgcctcccac agggcgctgg tgaaggctcg ggggacacgc 1560 ccatttgtga tctcccgctc gacctttgct ggccacggcc gatacgccgg ccactggacg 1620 ggggacgtgt ggagctcctg ggagcagctc gcctcctccg tgccagaaat cctgcagttt 1680 aacctgctgg gggtgcctct ggtcggggcc gacgtctgcg gcttcctggg caacacctca 1740 gaggagctgt gtgtgcgctg gacccagctg ggggccttct accccttcat gcggaaccac 1800 aacagcctgc tcagtctgcc ccaggagccg tacagcttca gcgagccggc ccagcaggcc 1860 atgaggaagg ccctcaccct gcgctacgca ctcctccccc acctctacac actgttccac 1920 caggcccacg tcgcggggga gaccgtggcc cggcccctct tcctggagtt ccccaaggac 1980 tctagcacct ggactgtgga ccaccagctc ctgtgggggg aggccctgct catcacccca 2040 gtgctccagg ccgggaaggc cgaagtgact ggctacttcc ccttgggcac atggtacgac 2100 ctgcagacgg tgccagtaga ggcccttggc agcctcccac ccccacctgc agctccccgt 2160 gagccagcca tccacagcga ggggcagtgg gtgacgctgc cggcccccct ggacaccatc 2220 aacgtccacc tccgggctgg gtacatcatc cccctgcagg gccctggcct cacaaccaca 2280 gagtcccgcc agcagcccat ggccctggct gtggccctga ccaagggtgg ggaggcccga 2340 ggggagctgt tctgggacga tggagagagc ctggaagtgc tggagcgagg ggcctacaca 2400 caggtcatct tcctggccag gaataacacg atcgtgaatg agctggtacg tgtgaccagt 2460 gagggagctg gcctgcagct gcagaaggtg actgtcctgg gcgtggccac ggcgccccag 2520 caggtcctct ccaacggtgt ccctgtctcc aacttcacct acagccccga caccaaggtc 2580 ctggacatct gtgtctcgct gttgatggga gagcagtttc tcgtcagctg gtgttag 2637 <210> 53 <211> 2637 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAAco1-delta-47 <400> 53 cctagagctg tgcctaccca gtgtgacgtg ccccccaaca gcagattcga ctgcgcccct 60 gacaaggcca tcacccagga acagtgcgag gccagaggct gctgctacat ccctgccaag 120 cagggactgc agggcgctca gatgggacag ccctggtgct tcttcccacc ctcctacccc 180 agctacaagc tggaaaacct gagcagcagc gagatgggct acaccgccac cctgaccaga 240 accaccccca cattcttccc aaaggacatc ctgaccctgc ggctggacgt gatgatggaa 300 accgagaacc ggctgcactt caccatcaag gaccccgcca atcggagata cgaggtgccc 360 ctggaaaccc cccacgtgca ctctagagcc cccagccctc tgtacagcgt ggaattcagc 420 gaggaaccct tcggcgtgat cgtgcggaga cagctggatg gcagagtgct gctgaacacc 480 accgtggccc ctctgttctt cgccgaccag ttcctgcagc tgagcaccag cctgcccagc 540 cagtacatca caggactggc cgagcacctg agccccctga tgctgagcac atcctggacc 600 cggatcaccc tgtggaacag ggatctggcc cctacccctg gcgccaatct gtacggcagc 660 caccctttct acctggccct ggaagatggc ggatctgccc acggagtgtt tctgctgaac 720 tccaacgcca tggacgtggt gctgcagcct agccctgccc tgtcttggag aagcacaggc 780 ggcatcctgg atgtgtacat ctttctgggc cccgagccca agagcgtggt gcagcagtat 840 ctggatgtcg tgggctaccc cttcatgccc ccttactggg gcctgggatt ccacctgtgc 900 agatggggct actccagcac cgccatcacc agacaggtgg tggaaaacat gaccagagcc 960 cacttcccac tggatgtgca gtggaacgac ctggactaca tggacagcag acgggacttc 1020 accttcaaca aggacggctt ccgggacttc cccgccatgg tgcaggaact gcatcagggc 1080 ggcagacggt acatgatgat cgtggatccc gccatcagct cctctggccc tgccggctct 1140 tacagaccct acgacgaggg cctgcggaga ggcgtgttca tcaccaacga gacaggccag 1200 cccctgatcg gcaaagtgtg gcctggcagc acagccttcc ccgacttcac caatcctacc 1260 gccctggctt ggtgggagga catggtggcc gagttccacg accaggtgcc cttcgacggc 1320 atgtggatcg acatgaacga gcccagcaac ttcatccggg gcagcgagga tggctgcccc 1380 aacaacgaac tggaaaatcc cccttacgtg cccggcgtcg tgggcggaac actgcaggcc 1440 gctacaatct gtgccagcag ccaccagttt ctgagcaccc actacaacct gcacaacctg 1500 tacggcctga ccgaggccat tgccagccac cgcgctctcg tgaaagccag aggcacacgg 1560 cccttcgtga tcagcagaag cacctttgcc ggccacggca gatacgccgg acattggact 1620 ggcgacgtgt ggtcctcttg ggagcagctg gcctctagcg tgcccgagat cctgcagttc 1680 aatctgctgg gcgtgccact cgtgggcgcc gatgtgtgtg gcttcctggg caacacctcc 1740 gaggaactgt gtgtgcggtg gacacagctg ggcgccttct accctttcat gagaaaccac 1800 aacagcctgc tgagcctgcc ccaggaaccc tacagcttta gcgagcctgc acagcaggcc 1860 atgcggaagg ccctgacact gagatacgct ctgctgcccc acctgtacac cctgtttcac 1920 caggcccatg tggccggcga gacagtggcc agacctctgt ttctggaatt ccccaaggac 1980 agcagcacct ggaccgtgga ccatcagctg ctgtggggag aggctctgct gattacccca 2040 gtgctgcagg caggcaaggc cgaagtgacc ggctactttc ccctgggcac ttggtacgac 2100 ctgcagaccg tgcctgtgga agccctggga tctctgcctc cacctcctgc cgctcctaga 2160 gagcctgcca ttcactctga gggccagtgg gtcacactgc ctgcccccct ggataccatc 2220 aacgtgcacc tgagggccgg ctacatcata ccactgcagg gacctggcct gaccaccacc 2280 gagtctagac agcagccaat ggccctggcc gtggccctga ccaaaggcgg agaagctagg 2340 ggcgagctgt tctgggacga tggcgagagc ctggaagtgc tggaaagagg cgcctatacc 2400 caagtgatct tcctggcccg gaacaacacc atcgtgaacg agctggtgcg cgtgacctct 2460 gaaggcgctg gactgcagct gcagaaagtg accgtgctgg gagtggccac agcccctcag 2520 caggtgctgt ctaatggcgt gcccgtgtcc aacttcacct acagccccga caccaaggtg 2580 ctggacatct gcgtgtcact gctgatggga gagcagtttc tggtgtcctg gtgctga 2637 <210> 54 <211> 2637 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAAco2-delta-47 <400> 54 ccaagagctg tgcctaccca atgcgacgtg ccacccaact cccgattcga ctgcgcgcca 60 gataaggcta ttacccaaga gcagtgtgaa gccagaggtt gctgctacat cccagcgaag 120 caaggattgc aaggcgccca aatgggacaa ccttggtgtt tcttcccccc ttcgtaccca 180 tcatataaac tcgaaaacct gtcctcttcg gaaatgggtt atactgccac cctcaccaga 240 actactccta ctttcttccc gaaagacatc ttgaccttga ggctggacgt gatgatggag 300 actgaaaacc ggctgcattt cactatcaaa gatcctgcca atcggcgata cgaggtccct 360 ctggaaaccc ctcacgtgca ctcacgggct ccttctccgc tttactccgt cgaattctct 420 gaggaaccct tcggagtgat cgttagacgc cagctggatg gtagagtgct gttgaacact 480 actgtggccc cacttttctt cgctgaccag tttctgcaac tgtccacttc cctgccatcc 540 cagtacatta ctggactcgc cgaacacctg tcgccactga tgctctcgac ctcttggact 600 agaatcactt tgtggaacag agacttggcc cctactccgg gagcaaatct gtacggaagc 660 cacccttttt acctggcgct cgaagatggc ggatccgctc acggagtgtt cctgctgaat 720 agcaacgcaa tggacgtggt gctgcaacct tcccctgcac tcagttggag aagtaccggg 780 ggtattctgg acgtgtacat cttcctcgga ccagaaccca agagcgtggt gcagcaatat 840 ctggacgtgg tcggataccc ttttatgcct ccttactggg gactgggatt ccacctttgc 900 cgttggggct actcatccac cgccattacc agacaggtgg tggagaatat gaccagagcc 960 cacttccctc tcgacgtgca gtggaacgat ctggactata tggactcccg gagagatttc 1020 accttcaaca aggacgggtt ccgcgatttt cccgcgatgg ttcaagagct ccaccagggt 1080 ggtcgaagat atatgatgat cgtcgaccca gccatttcga gcagcggacc cgctggatct 1140 tatagacctt acgacgaagg ccttaggaga ggagtgttca tcacaaacga gactggacag 1200 cctttgatcg gtaaagtgtg gcctggatca accgcctttc ctgactttac caatcccact 1260 gccttggctt ggtgggagga catggtggcc gaattccacg accaagtccc ctttgatgga 1320 atgtggatcg atatgaacga accaagcaat tttatcagag gttccgaaga cggttgcccc 1380 aacaacgaac tggaaaaccc tccttatgtg cccggagtcg tgggcggaac attacaggcc 1440 gcgactattt gcgccagcag ccaccaattc ctgtccactc actacaacct ccacaacctt 1500 tatggattaa ccgaagctat tgcaagtcac agggctctgg tgaaggctag agggactagg 1560 ccctttgtga tctcccgatc cacctttgcc ggacacggga gatacgccgg tcactggact 1620 ggtgacgtgt ggagctcatg ggaacaactg gcctcctccg tgccggaaat cttacagttc 1680 aaccttctgg gtgtccctct tgtcggagca gacgtgtgtg ggtttcttgg taacacctcc 1740 gaggaactgt gtgtgcgctg gactcaactg ggtgcattct acccattcat gagaaaccac 1800 aactccttgc tgtccctgcc acaagagccc tactcgttca gcgagcctgc acaacaggct 1860 atgcggaagg cactgaccct gagatacgcc ctgcttccac acttatacac tctcttccat 1920 caagcgcatg tggcaggaga aaccgttgca aggcctcttt tccttgaatt ccccaaggat 1980 tcctcgactt ggacggtgga tcatcagctg ctgtggggag aagctctgct gattactcca 2040 gtgttgcaag ccggaaaagc tgaggtgacc ggatactttc cgctgggaac ctggtacgac 2100 ctccagactg tccctgttga agcccttgga tcactgcctc cgcctccggc agctccacgc 2160 gaaccagcta tacattccga gggacagtgg gttacattac cagctcctct ggacacaatc 2220 aacgtccact taagagctgg ctacattatc cctctgcaag gaccaggact gactacgacc 2280 gagagcagac agcagccaat ggcactggct gtggctctga ccaagggagg ggaagctaga 2340 ggagaactct tctgggatga tggggagtcc cttgaagtgc tggaaagagg cgcttacact 2400 caagtcattt tccttgcacg gaacaacacc attgtgaacg aattggtgcg agtgaccagc 2460 gaaggagctg gacttcaact gcagaaggtc actgtgctcg gagtggctac cgctcctcag 2520 caagtgctgt cgaatggagt ccccgtgtca aactttacct actcccctga cactaaggtg 2580 ctcgacattt gcgtgtccct cctgatggga gagcagttcc ttgtgtcctg gtgttga 2637

Claims (16)

  1. 신호 펩티드 모이어티 및 기능성 GAA 모이어티, 특히 부모 GAA의 절두 형태에 상응하는 GAA 모이어티를 포함하는, 기능성 키메라 GAA 단백질을 코딩하는 핵산 분자로서, 신호 펩티드 모이어티는 SEQ ID NO: 2 내지 4, 바람직하게 SEQ ID NO: 2로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 1 내지 75개의 연속되는 아미노산이 절두되고, 상기 GAA 모이어티는 특히 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 6, 7, 8, 9, 10, 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 46개의 연속되는 아미노산이 절두되고, 특히 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 8, 42 또는 43개의 연속되는 아미노산이 절두된 것인 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GAA 모이어티는 부모 GAA와 비교하여 이의 N-말단부에서 8개의 연속되는 아미노산이 절두된 것인 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부모 GAA는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5로 표시된 인간 GAA 폴리펩티드인 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 내에서 키메라 GAA의 발현을 개선시키고/시키거나 이에 대한 면역 관용을 개선시키도록 최적화된 뉴클레오티드 서열, 특히 SEQ ID NO: 13 또는 14로 표시된 뉴클레오티드 서열인 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열의 조합으로 생성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자:
    Figure pct00011

    Figure pct00012
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 구성체로서, 프로모터, 예컨대 바람직하게 알파-1 항트립신 프로모터 (hAAT), 트랜스타이레틴 프로모터, 알부민 프로모터 및 타이록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 간-특이적 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트이고, 상기 핵산 구성체는 임의로 인트론, 특히 인간 베타 글로빈 b2 (또는 HBB2) 인트론, FIX 인트론, 닭 베타-글로빈 인트론 및 SV40 인트론으로 이루어진 군에서 선택되는 인트론을 더 포함하고, 상기 인트론은 임의로 변형된 인트론 예컨대 SEQ ID NO: 7의 변형된 HBB2 인트론, SEQ ID NO: 9의 변형된 FIX 인트론, 또는 SEQ ID NO: 11의 변형된 닭 베타-글로빈 인트론인 핵산 구성체.
  8. 제7항에 있어서, 바람직하게 순서대로, 인핸서; 인트론; 프로모터, 특히 간-특이적 프로모터; 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 구성체로서, 구성체는 바람직하게, 순서대로, ApoE 제어 영역; HBB2 인트론, 특히 변형된 HBB2 인트론; hAAT 프로모터; 키메라 GAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함하고, 상기 핵산 구성체는 보다 특히 SEQ ID NO: 20, 21 또는 22의 뉴클레오티드 서열 또는 제6항에 표시된 조합 중 어느 하나로부터 생성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 구성체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터로서, 바이러스 벡터, 바람직하게 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터, 또는 AAV 벡터, 예컨대 단일-가닥 또는 이중-가닥 자기-상보성 AAV 벡터, 바람직하게 AAV-유래 캡시드, 예컨대 AAV1, AAV2, 변이체 AAV2, AAV3, 변이체 AAV3, AAV3B, 변이체 AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, 변이체 AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 예컨대 AAVcy10 및 AAVrh10, AAVrh74, AAVdj, AAV-Anc80, AAV-LK03, AAV2i8, 및 돼지 AAV, 예컨대 AAVpo4 및 AAVpo6 캡시드를 갖거나 또는 키메라 캡시드를 갖는 AAV 벡터이고, AAV 벡터는 보다 특히 AAV8, AAV9, AAVrh74 또는 AAV2i8 캡시드, 특히 AAV8, AAV9 또는 AAVrh74 캡시드, 보다 특히 AAV8 캡시드를 갖는 것인 벡터.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제7항 또는 제8항의 핵산 구성체 또는 제9항의 벡터로 형질전환된 세포로서, 세포는 특히 간 세포 또는 근육 세포인 세포.
  11. 신호 펩티드 모이어티 및 기능성 GAA 모이어티를 포함하는 키메라 GAA 폴리펩티드로서, 신호 펩티드 모이어티는 SEQ ID NO: 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되고, 특히 GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드의 절두 형태, 예컨대 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 1 내지 75개의 연속되는 아미노산이 결실되고, 특히 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 6, 7, 8, 9, 10, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 41, 42, 43, 44, 45 또는 45개, 보다 특히 6, 7, 8, 9, 10, 20, 41, 42, 43 또는 44개의 연속되는 아미노산이 결실된 GAA 모이어티이고, GAA 모이어티는 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5의 인간 GAA 단백질의 절두 형태인 키메라 GAA 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, GAA 모이어티는 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여 이의 N-말단부에서 8, 29, 42 또는 43개의 연속되는 아미노산이 절두되고, 보다 특히 부모 GAA 폴리펩티드와 비교하여, 특히 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 36, 특히 SEQ ID NO: 5의 인간 GAA 단백질과 비교하여, 이의 N-말단부에서 8개 또는 42개, 특히 8개의 연속되는 아미노산이 절두된 것인 키메라 GAA 폴리펩티드.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 하기 서열의 조합으로부터 생성되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 GAA 폴리펩티드:
    Figure pct00013

    Figure pct00014
  14. 약학적으로 허용가능한 담체에, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 서열, 제7항 또는 제8항의 핵산 구성체, 제9항의 벡터, 제10항에 따른 세포, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
  15. 약물로서 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 서열, 제7항 또는 제8항의 핵산 구성체, 제9항의 벡터, 제10항에 따른 세포, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드.
  16. 당원 축적병, 예컨대 GSDI (폰 기에르케병), GSDII (폼페 병), GSDIII (코리병), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII 및 심장의 치명적인 선천성 당원 축적병, 보다 특히 GSDI, GSDII 또는 GSDIII, 보다 더 특히 GSDII 및 GSDIII, 및 가장 특히 GSDII를 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 서열, 제7항 또는 제8항의 핵산 구성체, 제9항의 벡터, 제10항에 따른 세포, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드.
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