BR112020023393A2 - cassetes de expressão de a-glicosidase ácida otimizados por códon e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

A invenção fornece ácidos nucleicos que codificam a-glicosidase ácida (GAA). Em determinadas modalidades, os ácidos nucleicos têm mais do que cerca de 86% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-5. Em determinadas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam a-glicosidase ácida (GAA) contêm menos do que 127 dinucleotídeos CpG. Os cassetes de expressão, vetores, células e linhagens celulares e métodos de uso de tais ácidos nucleicos que codificam a-glicosidase ácida (GAA) também são fornecidos.

Description

“CASSETES DE EXPRESSÃO DE α-GLICOSIDASE ÁCIDA OTIMIZADOS POR CÓDON E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS”
PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório nº US 62/672.419, depositado em 16 de maio de 2018, e para o Pedido de Patente Provisório nº US 62/734.454, depositado em 21 de setembro de 2018. Todo o conteúdo dos pedidos anteriores está incorporado neste documento a título de referência, incluindo todos os textos, tabelas, listagem de sequências e desenhos.
INTRODUÇÃO
[002] A doença de armazenamento de glicogênio tipo II, também chamada de doença de Pompe, é um distúrbio autossômico recessiva causado por mutações no gene que codifica a enzima lisossomal α-glicosidase ácida (GAA), que catalisa a degradação do glicogênio. A deficiência enzimática resultante leva ao acúmulo patológico de glicogênio e alterações lisossomais em todos os tecidos do corpo, resultando em disfunção muscular cardíaca, respiratória e esquelética (van der Ploeg & Reuser, 2008 Lancet, 372:1.342 a 1.353). Tradicionalmente, a doença de Pompe foi separada em dois fenótipos principais - doença de Pompe de início na infância (IOPD) (também conhecida como doença de Pompe infantil (IPD) ou doença de Pompe de início precoce) e doença de Pompe de início tardio (LOPD) - com base na atividade da enzima GAA residual, idade de início, envolvimento de órgãos (isto é, presença de cardiomiopatia), gravidade e taxa de progressão. A terapia de reposição enzimática (TRE) está disponível para a doença de Pompe; no entanto, tem várias limitações (ou seja, biodistribuição limitada e alta imunogenicidade) levando a falhas no tratamento e eficácia limitada em longo prazo (van der Ploeg & Reuser, 2008).
SUMÁRIO
[003] São divulgados aqui cassetes otimizados para expressão dirigida ao fígado de uma versão secretável de GAA humano. Essas otimizações nos cassetes levam a um aumento na secreção de GAA do fígado e permitem a transferência de genes hepáticos para atingir níveis circulantes de GAA suficientes para corrigir a deficiência de GAA sistemicamente em indivíduos. Esses cassetes alcançam expressão aumentada do transgene, características de segurança aprimoradas e imunogenicidade potencialmente reduzida. Esses cassetes serão úteis como um tratamento de terapia genética de indivíduos com doença de Pompe e outras doenças e distúrbios tratáveis com GAA.
[004] A otimização de códons de cassete de expressão de GAA foi realizada para melhorar a expressão de GAA. Em uma modalidade, as sequências de ácidos nucleicos que codificam GAA foram modificadas para eliminar os dinucleotídeos CpG. No total, foram criadas 20 novas sequências de transgenes com códon otimizado (GAA1-GAA20). Com base na comparação in vitro da atividade de GAA, 5 sequências com códon otimizado foram selecionadas (GAA 2, 5, 7, 8 e 13) para otimização posterior. A sequência GAA13 foi usada para analisar as diferenças na expressão de GAA após a adição de uma sequência polinucleotídica de 29 pares de bases à região 5’ não traduzida (UTR). Duas sequências de poliadenilação diferentes derivadas do hormônio de crescimento bovino (bGH ou BGH) (tipo selvagem e CpG reduzido) também foram avaliadas para GAA7, 8 e 13. Os 9 cassetes de expressão resultantes (Tabela 1) foram empacotados dentro do capsídeo das SEQ ID NOs:30-32; um também foi empacotado no capsídeo AAV6.
[005] De acordo com a invenção, são fornecidos ácidos nucleicos que codificam uma α-glicosidase ácida (GAA), cassetes de expressão que compreendem os ácidos nucleicos que codificam uma α-glicosidase ácida (GAA) e vetores virais que compreendem os ácidos nucleicos que codificam uma α-glicosidase ácida (GAA).
[006] Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 86% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-5. Em aspectos adicionais, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 87% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-5.
[007] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 87% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15. Em aspectos particulares, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 88% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15. Em aspectos particulares adicionais, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 89% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15. Em outros aspectos particulares, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 90% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15. Ainda em aspectos particulares adicionais, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 91% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15.
[008] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 91% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:16-24.
[009] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 92% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[010] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 93% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[011] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 94% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[012] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 95% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[013] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 96% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[014] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 97% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[015] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 98% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[016] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 99% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[017] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem mais do que 99,5% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[018] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA tem 100% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
[019] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém menos do que 127 dinucleotídeos CpG.
[020] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém menos do que 126 dinucleotídeos CpG.
[021] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 126 - 120 dinucleotídeos CpG.
[022] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 120 - 110 dinucleotídeos CpG.
[023] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 110 - 100 dinucleotídeos CpG.
[024] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 100 - 90 dinucleotídeos CpG.
[025] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 90 - 80 dinucleotídeos CpG.
[026] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 80 - 70 dinucleotídeos CpG.
[027] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 70 - 60 dinucleotídeos CpG.
[028] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 60 - 50 dinucleotídeos CpG.
[029] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 50 - 40 dinucleotídeos CpG.
[030] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 40 - 30 dinucleotídeos CpG.
[031] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 30 - 20 dinucleotídeos CpG.
[032] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém menos do que 20 dinucleotídeos CpG.
[033] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 20 - 10 dinucleotídeos CpG.
[034] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém menos do que 10 dinucleotídeos CpG.
[035] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém cerca de 10 - 5 dinucleotídeos CpG.
[036] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém 5 dinucleotídeos CpG.
[037] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém 4 dinucleotídeos CpG.
[038] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém 3 dinucleotídeos CpG.
[039] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém 2 dinucleotídeos CpG.
[040] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém 1 dinucleotídeo CpG.
[041] Em outra modalidade, um ácido nucleico que codifica uma GAA contém 0 dinucleotídeo CpG.
[042] A invenção também fornece cassetes de expressão compreendendo os ácidos nucleicos que codificam GAA, como aqui estabelecido, operacionalmente ligados a um elemento de controle de expressão.
[043] Em uma modalidade, um cassete de expressão compreende um ácido nucleico que codifica uma GAA com mais de 86% de identidade de sequência (por exemplo, 87% a 100% de identidade) em relação a qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-5.
[044] Em outra modalidade, um cassete de expressão compreende um ácido nucleico que codifica uma GAA com mais de 87% de identidade de sequência (por exemplo, 88% a 100% de identidade) para qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15.
[045] Em outra modalidade, um cassete de expressão compreende um ácido nucleico que codifica uma GAA com menos de 127 dinucleotídeos CpG, menos de 127 dinucleotídeos CpG, menos de 127 dinucleotídeos CpG, menos de 126 dinucleotídeos CpG, menos de 125 dinucleotídeos CpG, menos de 124 dinucleotídeos CpG, menos de 123 dinucleotídeos CpG, menos de 122 dinucleotídeos CpG, menos de 121 dinucleotídeos CpG, menos de 120 dinucleotídeos CpG, menos de 119 dinucleotídeos CpG, menos de 118 dinucleotídeos CpG, menos de 117 dinucleotídeos CpG, menos de 116 dinucleotídeos CpG, menos de 115 dinucleotídeos CpG, menos de 114 dinucleotídeos CpG, menos de 113 dinucleotídeos CpG, menos de 112 dinucleotídeos CpG, menos de 111 dinucleotídeos CpG, menos de 110 dinucleotídeos CpG, menos de 109 dinucleotídeos CpG, menos de 108 dinucleotídeos CpG, menos de 107 dinucleotídeos CpG, menos de 106 dinucleotídeos CpG, menos de 105 dinucleotídeos CpG, menos de 104 dinucleotídeos s CpG, menos de 103 dinucleotídeos CpG, menos de 102 dinucleotídeos CpG, menos de 101 dinucleotídeos CpG, menos de 101 dinucleotídeos CpG, e assim por diante até zero (0) dinucleotídeo CpG.
[046] Em uma modalidade, um elemento de controle de expressão está posicionado a 5’ de um ácido nucleico que codifica uma GAA.
[047] Em outra modalidade, um cassete de expressão inclui uma sequência de poliadenilação (poliA) posicionada a 3' de um ácido nucleico que codifica uma GAA.
[048] Em outra modalidade, um elemento de controle de expressão ou sequência de poliadenilação é CpG reduzido em comparação com o elemento de controle de expressão ou sequência de poliadenilação de tipo selvagem.
[049] Em outra modalidade, um elemento de controle de expressão compreende uma sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT.
[050] Em outra modalidade, a sequência de poliadenilação compreende uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGH).
[051] Em outra modalidade, uma sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT ou sequência de poliadenilação do bGH é o CpG reduzido em comparação com a sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT do tipo selvagem ou sequência de poliadenilação do bGH.
[052] Em um aspecto, uma sequência de poliadenilação do bGH de tipo selvagem compreende a sequência de SEQ ID NO:27.
[053] Em outro aspecto, uma sequência melhoradora/promotora do de ApoE/hAAT de tipo selvagem compreende a sequência de SEQ ID NO:28 ou 29.
[054] Em outro aspecto, uma sequência de poliadenilação de bGH reduzida a CpG compreende a sequência de SEQ ID NO:26.
[055] Em outra modalidade, um cassete de expressão compreende ainda um íntron posicionado entre a extremidade 3' do elemento de controle de expressão e a extremidade 5' do ácido nucleico que codifica uma GAA.
[056] Em outra modalidade, uma GAA compreende ou consiste na sequência apresentada como SEQ ID NO:25.
[057] A invenção fornece ainda vetores virais, tais como vírus associado ao adenovírus (AAV), vetores que compreendem os ácidos nucleicos que codificam GAA, como aqui estabelecido.
[058] Em uma modalidade, um vetor viral, tal como um vetor de vírus associado a adenovírus (AAV), compreende qualquer um dos ácidos nucleicos que codificam GAA como estabelecido aqui operacionalmente ligada a um elemento de controle de expressão.
[059] Em outra modalidade, um vetor viral, tal como um vírus associado ao adenovírus (AAV) compreende qualquer um dos cassetes de expressão que compreendem os ácidos nucleicos que codificam GAA, como aqui estabelecido.
[060] Em outra modalidade, um vetor AAV compreende: um ou mais de um capsídeo AAV; e uma ou mais repetições terminais invertidas de AAV (ITRs), em que a (s) ITR (s) do AAV flanqueiam o terminal 5’ ou 3' do ácido nucleico ou do cassete de expressão.
[061] Em modalidades adicionais, um vetor AAV compreende ainda um íntron posicionado a 5’ ou 3' de uma ou mais ITRs.
[062] Em modalidades adicionais, um vetor AAV que compreende pelo menos uma ou mais ITRs ou um íntron tem uma ou mais ITRs ou íntrons modificados para ter CpGs reduzidas.
[063] Em modalidades adicionais, um vetor AAV tem um sorotipo do capsídeo que compreende um capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV modificado com 90% ou mais de identidade de sequência em relação a sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 ou SEQ ID NO:30, 31 ou 32, ou um capsídeo com 95% ou mais identidade de sequência em relação a sequências de VP1, VP2 e/ou sequências VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, ou SEQ ID NO:30, 31 ou 32, ou um capsídeo com 100% de identidade de sequência em relação a sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, ou SEQ ID NO:30, 31 ou 32.
[064] Em modalidades adicionais, um vetor AAV que compreende uma ou mais ITRs como uma ou mais ITRs de qualquer um de: sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV3B AAV, ou uma combinação dos mesmos.
[065] A invenção fornece adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos que codificam GAA, cassetes de expressão que compreendem ácidos nucleicos codificadores de GAA ou vetores virais tais como vetores de AAV que compreendem ácidos nucleicos que codificam GAA ou cassetes de expressão compreendendo os ácidos nucleicos que codificam GAA como estabelecido no presente documento.
[066] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende uma pluralidade de vetores de AAV como aqui estabelecido em um carreador ou excipiente biologicamente compatível.
[067] Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos vetores de AAV conforme estabelecido neste documento, compreende ainda capsídeos de AAV vazios.
[068] Em modalidades particulares, em uma composição farmacêutica compreendendo vetores AAV e capsídeos AAV vazios, a razão dos capsídeos AAV vazios para o vetor AAV está dentro ou entre cerca de 100:1-50:1, de cerca de 50:1- 25:1, de cerca de 25:1-10:1, de cerca de 10:1-1:1, de cerca de 1:1-1:10, de cerca de 1:10-1:25, de cerca de 1:25-1:50, ou de cerca de 1:50-1:100.
[069] Em aspectos particulares, em uma composição farmacêutica compreendendo os vetores de AAV e capsídeos AAV vazios, a razão entre a dos capsídeos AAV vazios para o vetor de AAV é cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
[070] Em outra modalidade, uma composição farmacêutica inclui um tensoativo.
[071] A invenção ainda fornece métodos de tratamento de um ser humano em necessidade de α-glicosidase ácida (GAA) por administração ou entrega de qualquer um dos ácidos nucleicos que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos que codificam GAA, ou vetores virais, tais como vetores AAV compreendendo os ácidos nucleicos que codificam GAA ou cassetes de expressão compreendendo os ácidos nucleicos que codificam GAA para o ser humano.
[072] Em uma modalidade, um método de tratamento de um ser humano em necessidade de α-glicosidase ácida (GAA) inclui:(a) fornecer um ácido nucleico, cassete de expressão ou vetor viral, tal como vetor AAV conforme estabelecido neste documento, ou qualquer composição farmacêutica conforme estabelecido neste documento; e (b) administrar uma quantidade do ácido nucleico, cassete de expressão, vetor viral (por exemplo, AAV) ou composição farmacêutica para reestabelecer humanos, onde a GAA é expressa no ser humano.
[073] Em modalidades particulares, um ser humano tem a doença de Pompe, como a doença de Pompe com início na infância ou doença de Pompe com início tardio.
[074] Em outra modalidade, um humano tem uma doença de armazenamento de glicogênio (GSD).
[075] Em aspectos particulares, uma GSD é qualquer uma de: GSD tipo I (doença de von Gierke), GSD tipo III (doença de Forbes-Cori), GSD tipo IV (doença de Anderson, amilopectinose), GSD tipo V (doença de McArdle), GSD tipo VI (doença dela), GSD tipo VII (doença de Tarui), ou uma GSD congênita do coração (por exemplo, GSD congênita letal do coração).
[076] Em modalidades particulares, um ácido nucleico que codifica uma GAA, um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica uma GAA ou um vetor AAV é administrado a um humano por via intravenosa, intra- arterial, intracavitária, intracavitária, intramucosa ou por cateter.
[077] Em modalidades particulares, em um método, GAA é expressa em níveis aumentados, opcionalmente maiores do que 1% dos níveis de GAA encontrados em um ser humano que não precisa de GAA.
[078] Em modalidades particulares, um vetor AAV é administrado em uma faixa de cerca de 1X108 a cerca de 1X1014 genomas de vetor por quilograma
(vg/kg) do peso do humano.
[079] Em modalidades particulares, um método reduz, diminui ou inibe um ou mais sintomas da necessidade de GAA ou da doença; ou previne ou reduz a progressão ou agravamento de um ou mais sintomas da necessidade de GAA ou da doença; ou estabiliza um ou mais sintomas da necessidade de GAA ou da doença; ou melhora um ou mais sintomas da necessidade de GAA ou da doença.
[080] Em aspectos particulares, um sintoma tratável de acordo com a invenção pode ser um ou mais dos seguintes: dificuldade em comer e/ou não ganhar peso; controle deficiente de cabeça e/ou pescoço; problemas respiratórios e/ou infecções pulmonares; coração dilatado e/ou espessado; defeitos cardíacos; língua aumentada; dificuldade em engolir; fígado aumentado; força muscular fraca; tônus muscular fraco; fraqueza nas pernas, cintura e/ou braços; falta de ar; dificuldade de exercício; dificuldade em respirar durante o sono; curvatura da coluna; e/ou juntas rígidas.
[081] A invenção ainda proporciona adicionalmente células que compreendem ácidos nucleicos que codificam GAA, células que compreendem cassetes de expressão compreendendo os ácidos nucleicos que codificam GAA e células que compreendem vetores virais tais como vetores de AAV que compreendem ácidos nucleicos que codificam GAA ou cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos que codificam GAA.
[082] Em uma modalidade, uma célula produz um vetor viral.
[083] Em outra modalidade, uma célula produz um vetor AAV conforme estabelecido neste documento.
[084] Ainda adicionalmente, a invenção também fornece métodos de produção de vetores virais, tais como vetores de AAV como aqui estabelecido.
[085] Em uma modalidade, um método de produção de vetores AAV inclui: introduzir um genoma de vetor AAV compreendendo um ácido nucleico que codifica GAA ou cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica GAA conforme estabelecido neste documento em uma célula auxiliar empacotadora; e cultivar a célula auxiliar sob condições para produzir os vetores
AAV.
[086] Em outra modalidade, um método de produção de erros de vetor AAV inclui: introduzir um ácido nucleico que codifica GAA ou cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica GAA como estabelecido neste documento em uma célula auxiliar empacotadora; e cultivar as células auxiliares sob condições para produzir o vetor AAV.
[087] Em modalidades adicionais, as células são células de mamíferos.
[088] Em modalidades adicionais, as células para a produção de vetor de fornecer funções auxiliares, tais como funções auxiliares de AAV, que empacota o vetor em uma partícula viral. Em um aspecto particular, as funções auxiliares são proteínas Rep e/ou Cap para empacotamento de vetor AAV.
[089] Em modalidades adicionais, as células para a produção de vetor podem ser transfectadas de forma estável ou transiente com polinucleotídeo (s) que codifica sequência (s) de proteína Rep e/ou Cap.
[090] Em modalidades adicionais, as células para produção de vetor fornecem proteínas Rep78 e/ou Rep68. Em tais células, as células podem ser transfectadas de forma estável ou transiente com sequência (s) de codificação de polinucleotídeo (s) de proteínas Rep78 e/ou Rep68.
[091] Em modalidades particulares, as células para a produção de vetores são células renais embrionárias humanas. Em um aspecto particular, as células para produção de vetor são células HEK-293.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[092] A Figura 1 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH (SEQ ID NO:16).
[093] A Figura 2 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA13.BGH (SEQ ID NO:17).
[094] A Figura 3 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA7.BGH (SEQ ID NO:18).
[095] A Figura 4 mostra um esquema de pAAV-
ApoE/hAAT.GAA8.BGH (SEQ ID NO:19).
[096] A Figura 5 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA2.wtBGH (SEQ ID NO:20).
[097] A Figura 6 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH (SEQ ID NO:21).
[098] A Figura 7 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH (SEQ ID NO:22).
[099] A Figura 8 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH (SEQ ID NO:23).
[100] A Figura 9 mostra um esquema de pAAV- ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH. (SEQ ID NO:24)
[101] A Figura 10 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA em sobrenadantes de células Huh7 por ensaio de atividade de GAA.
[102] A Figura 11 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA no plasma de camundongo por ensaio de atividade de GAA.
[103] A Figura 12 mostra a avaliação dos níveis de GAA no plasma de camundongo por Western blot de GAA.
[104] A Figura 13 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA no plasma de camundongo por ensaio de atividade de GAA.
[105] A Figura 14 mostra a avaliação dos níveis de GAA no plasma de camundongo por Western blot de GAA.
[106] A Figura 15 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA no plasma de camundongo por ensaio de atividade de GAA.
[107] A Figura 16 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA em plasma de camundongo e camundongo por ensaio de atividade de GAA.
[108] A Figura 17 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA no plasma de primatas não humanos (macaco rhesus macho) por ensaio de atividade de GAA.
[109] A Figura 18 mostra a avaliação dos níveis de atividade de GAA no plasma de primatas não humanos (macaco verde africano) por ensaio de atividade de GAA. O eixo geométrico X representa os dias após a injeção.
[110] A Figura 19 mostra a avaliação dos níveis de GAA no plasma de primatas não humanos (macaco verde africano) por Western blot, com apresentação gráfica de certos dados.
[111] A Figura 20 mostra a avaliação da atividade de GAA em sobrenadantes de células Huh7 transduzidas com SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 ou um controle negativo (rAAV com transgene não GAA empacotado no vetor AAV de SEQ ID NOs:30-32).
[112] A Figura 21 mostra a avaliação da atividade de GAA no plasma de macacos rhesus após uma única administração intravenosa de SPK-AAV-02 em doses de 2x1012, 6x1012, 2x1013 vg/kg.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[113] A invenção fornece ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, genomas de vetor de AAV compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, e vetores de AAV recombinantes e as partículas que compreendem os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA. A invenção modificou os ácidos nucleicos que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, genomas de vetores AAV compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e vetores AAV recombinantes e partículas são úteis para o tratamento da doença de Pompe, bem como outras doenças de glicogênio (GSDs).
[114] Conforme usado neste documento, os termos “modificar” e variações gramaticais dos mesmos significam que um ácido nucleico ou proteína se desvia de uma referência ou sequência parental. Um ácido nucleico modificado que codifica GAA foi alterado em comparação com a referência (por exemplo, tipo selvagem) ou ácido nucleico parental. Os ácidos nucleicos modificados podem, portanto, ter substancialmente a atividade ou função igual, maior ou menor do que um ácido nucleico de referência ou parental, mas pelo menos reter a atividade, função e/ou identidade de sequência parcial para o ácido nucleico de referência ou parental. O ácido nucleico modificado pode ser geneticamente modificado para codificar uma GAA modificada ou variante.
[115] Um “ácido nucleico modificado que codifica GAA” significa que o ácido nucleico de GAA tem alteração em comparação com o ácido nucleico parental não modificado que codifica GAA. Um exemplo particular de uma modificação é uma substituição de nucleotídeo. Os termos “modificação” no presente documento não precisam aparecer em cada caso de uma referência feita a um ácido nucleico que codifica GAA.
[116] Em modalidades particulares, para um ácido nucleico modificado que codifica GAA, a proteína GAA retém pelo menos parte de uma função ou atividade da proteína GAA de tipo selvagem. A função ou atividade da proteína GAA inclui a atividade da alfa glicosidase ácida, uma hidrolase lisossomal que degrada o glicogênio, a maltose e a isomaltose. Por conseguinte, os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA incluem formas modificadas, desde que a GAA codificada retenha algum grau ou aspecto da atividade de hidrolase lisossomal de GAA.
[117] Conforme estabelecido neste documento, os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA podem exibir diferentes recursos ou características em comparação com um ácido nucleico de referência ou parental. Por exemplo, os ácidos nucleicos modificados incluem sequências com 100% de identidade em relação a um ácido nucleico de referência que codifica GAA conforme estabelecido neste documento, bem como sequências com menos de 100% de identidade em relação a um ácido nucleico de referência que codifica GAA.
[118] O termo “identidade”, “homologia” e variações gramaticais dos mesmos, significa que duas ou mais entidades referenciadas são as mesmas, quando elas são sequências “alinhadas”. Assim, a título de exemplo, quando dois ácidos nucleicos são idênticos, eles têm a mesma sequência, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. A identidade pode ser sobre uma área definida (região ou domínio) da sequência.
[119] Uma “área” ou “região” de identidade se refere a uma parte de duas ou mais entidades referenciadas que são iguais. Assim, quando duas proteínas ou sequências de ácido nucleico são idênticas em uma ou mais áreas ou regiões de sequência, elas compartilham identidade dentro dessa região. Uma sequência “alinhada” refere-se a várias proteínas (aminoácidos) ou sequências de ácidos nucleicos, muitas vezes contendo correções para bases ou aminoácidos (lacunas) ausentes ou adicionais em comparação com uma sequência de referência.
[120] A identidade pode estender-se por todo o comprimento ou uma porção da sequência. Em determinadas modalidades, o comprimento da sequência que compartilha a identidade percentual é 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos ou ácidos nucleicos contíguos, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em modalidades adicionais, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 21 ou mais aminoácidos ou ácidos nucleicos contíguos, por exemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, etc., aminoácidos ou ácidos nucleicos contíguos. Em outras modalidades, o comprimento da sequência de compartilhamento de identidade é de 41 ou mais aminoácidos contíguos ou ácidos nucleicos, por exemplo, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50, etc., aminoácidos contíguos ou nucleicos ácidos. Em ainda outras modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 50 ou mais aminoácidos ou ácidos nucleicos contíguos, por exemplo, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80 -85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-
1.000, etc., aminoácidos contíguos ou ácidos nucleicos.
[121] Como aqui estabelecido, os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA podem ser distintos ou exibir 100% de identidade ou menos do que 100% de identidade em relação a um ácido nucleico que codifica GAA.
[122] Em modalidades particulares, os ácidos nucleicos da invenção que codificam GAA podem ser mais de 86% idênticos em relação a qualquer ácido nucleico estabelecido em SEQ ID NOs:1-5.
[123] Em modalidades particulares, os ácidos nucleicos da invenção que codificam GAA podem ser mais de 87% idênticos em relação a qualquer ácido nucleico estabelecido em SEQ ID NOs:6-14.
[124] Em modalidades particulares, os ácidos nucleicos da invenção que codificam GAA podem ser mais de 91% idênticos em relação a qualquer ácido nucleico estabelecido em SEQ ID NOs:16-24.
[125] Esses ácidos nucleicos modificados que codificam GAA podem até exibir maior identidade, por exemplo, mais de 87% de identidade; mais de 88% de identidade, mais de 89% de identidade, mais de 90% de identidade, mais de 91% de identidade, mais de 92% de identidade, mais de 93% de identidade, mais de 94% de identidade, mais de 95% de identidade, mais de 96% de identidade, mais de 97% de identidade, mais de 98% de identidade, mais de 99% de identidade ou 100% de identidade em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-24.
[126] A extensão da identidade (homologia) ou “porcentagem de identidade” entre duas sequências pode ser determinada usando um programa de computador e/ou algoritmo matemático. Para os fins desta invenção, as comparações de sequências de ácido nucleico são realizadas usando o GCG Wisconsin Package versão 9.1, disponível no Genetics Computer Group em Madison, Wisconsin. Por conveniência, os parâmetros padrão (penalidade de criação de lacuna = 12, penalidade de extensão de lacuna = 4) especificados por esse programa destinam-se ao uso aqui para comparar a identidade de sequência. Alternativamente, o programa Blastn 2.0 fornecido pelo National Centre for Biotechnology Information (encontrado na world wide web em ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403 a 410) usando um alinhamento com lacunas com parâmetros padrão, pode ser usado para determinar o nível de identidade e similaridade entre sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácidos. Para comparações de sequência polipeptídica, um algoritmo BLASTP é normalmente usado em combinação com uma matriz de pontuação, como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e programas de comparação de sequência SSEARCH também são usados para quantificar a extensão de identidade (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); e Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Programas para quantificar a similaridade estrutural da proteína usando mapeamento topológico baseado em Delaunay também foram desenvolvidos (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
[127] Os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, que exibem diferentes recursos ou características, em comparação com uma referência ou ácido nucleico parental incluem substituições de nucleotídeos. Por exemplo, ácidos nucleicos modificados que codificam GAA incluem ácidos nucleicos com um número reduzido de dinucleotídeos CpG em comparação com um ácido nucleico de referência que codifica GAA.
[128] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 127 dinucleotídeos CpG.
[129] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 126 dinucleotídeos CpG.
[130] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 125 dinucleotídeos CpG.
[131] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 124 dinucleotídeos CpG.
[132] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 123 dinucleotídeos CpG.
[133] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 122 dinucleotídeos CpG.
[134] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 121 dinucleotídeos CpG.
[135] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 120 dinucleotídeos CpG.
[136] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 119 dinucleotídeos CpG.
[137] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 118 dinucleotídeos CpG.
[138] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 117 dinucleotídeos CpG.
[139] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 116 dinucleotídeos CpG.
[140] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 115 dinucleotídeos CpG.
[141] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 114 dinucleotídeos CpG.
[142] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 113 dinucleotídeos CpG.
[143] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 112 dinucleotídeos CpG.
[144] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 111 dinucleotídeos CpG.
[145] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 110 dinucleotídeos CpG.
[146] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 109 dinucleotídeos CpG.
[147] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 108 dinucleotídeos CpG.
[148] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 107 dinucleotídeos CpG.
[149] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 106 dinucleotídeos CpG.
[150] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 105 dinucleotídeos CpG.
[151] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 104 dinucleotídeos CpG.
[152] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 103 dinucleotídeos CpG.
[153] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 102 dinucleotídeos CpG.
[154] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 101 dinucleotídeos CpG.
[155] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 100 dinucleotídeos CpG.
[156] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 99 dinucleotídeos CpG.
[157] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 98 dinucleotídeos CpG.
[158] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 97 dinucleotídeos CpG.
[159] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 96 dinucleotídeos CpG.
[160] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 95 dinucleotídeos CpG.
[161] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 94 dinucleotídeos CpG.
[162] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 93 dinucleotídeos CpG.
[163] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 92 dinucleotídeos CpG.
[164] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 91 dinucleotídeos CpG.
[165] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 90 dinucleotídeos CpG.
[166] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 89 dinucleotídeos CpG.
[167] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 88 dinucleotídeos CpG.
[168] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 87 dinucleotídeos CpG.
[169] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 86 dinucleotídeos CpG.
[170] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 85 dinucleotídeos CpG.
[171] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 84 dinucleotídeos CpG.
[172] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 83 dinucleotídeos CpG.
[173] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 82 dinucleotídeos CpG.
[174] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 81 dinucleotídeos CpG.
[175] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 80 dinucleotídeos CpG.
[176] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 79 dinucleotídeos CpG.
[177] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 78 dinucleotídeos CpG.
[178] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 77 dinucleotídeos CpG.
[179] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 76 dinucleotídeos CpG.
[180] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 75 dinucleotídeos CpG.
[181] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 74 dinucleotídeos CpG.
[182] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 73 dinucleotídeos CpG.
[183] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 72 dinucleotídeos CpG.
[184] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 71 dinucleotídeos CpG.
[185] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 70 dinucleotídeos CpG.
[186] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 69 dinucleotídeos CpG.
[187] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 68 dinucleotídeos CpG.
[188] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 67 dinucleotídeos CpG.
[189] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 66 dinucleotídeos CpG.
[190] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 65 dinucleotídeos CpG.
[191] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 64 dinucleotídeos CpG.
[192] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 63 dinucleotídeos CpG.
[193] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 62 dinucleotídeos CpG.
[194] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 61 dinucleotídeos CpG.
[195] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 60 dinucleotídeos CpG.
[196] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 59 dinucleotídeos CpG.
[197] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 58 dinucleotídeos CpG.
[198] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 57 dinucleotídeos CpG.
[199] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 56 dinucleotídeos CpG.
[200] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 55 dinucleotídeos CpG.
[201] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 54 dinucleotídeos CpG.
[202] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 53 dinucleotídeos CpG.
[203] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 52 dinucleotídeos CpG.
[204] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 51 dinucleotídeos CpG.
[205] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 50 dinucleotídeos CpG.
[206] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 49 dinucleotídeos CpG.
[207] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 48 dinucleotídeos CpG.
[208] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 47 dinucleotídeos CpG.
[209] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 46 dinucleotídeos CpG.
[210] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 45 dinucleotídeos CpG.
[211] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 44 dinucleotídeos CpG.
[212] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 43 dinucleotídeos CpG.
[213] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 42 dinucleotídeos CpG.
[214] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 41 dinucleotídeos CpG.
[215] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 40 dinucleotídeos CpG.
[216] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 39 dinucleotídeos CpG.
[217] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 38 dinucleotídeos CpG.
[218] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 37 dinucleotídeos CpG.
[219] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 36 dinucleotídeos CpG.
[220] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 35 dinucleotídeos CpG.
[221] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 34 dinucleotídeos CpG.
[222] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 33 dinucleotídeos CpG.
[223] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 32 dinucleotídeos CpG.
[224] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 31 dinucleotídeos CpG.
[225] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 30 dinucleotídeos CpG.
[226] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 29 dinucleotídeos CpG.
[227] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 28 dinucleotídeos CpG.
[228] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 27 dinucleotídeos CpG.
[229] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 26 dinucleotídeos CpG.
[230] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 25 dinucleotídeos CpG.
[231] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 24 dinucleotídeos CpG.
[232] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 23 dinucleotídeos CpG.
[233] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 22 dinucleotídeos CpG.
[234] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 21 dinucleotídeos CpG.
[235] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 20 dinucleotídeos CpG.
[236] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 19 dinucleotídeos CpG.
[237] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 18 dinucleotídeos CpG.
[238] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 17 dinucleotídeos CpG.
[239] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 16 dinucleotídeos CpG.
[240] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 15 dinucleotídeos CpG.
[241] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 14 dinucleotídeos CpG.
[242] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 13 dinucleotídeos CpG.
[243] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 12 dinucleotídeos CpG.
[244] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 11 dinucleotídeos CpG.
[245] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 10 dinucleotídeos CpG.
[246] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 9 dinucleotídeos CpG.
[247] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 8 dinucleotídeos CpG.
[248] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 7 dinucleotídeos CpG.
[249] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 6 dinucleotídeos CpG.
[250] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 5 dinucleotídeos CpG.
[251] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 4 dinucleotídeos CpG.
[252] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 3 dinucleotídeos CpG.
[253] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 2 dinucleotídeos CpG.
[254] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico que codifica GAA contém menos de 1 dinucleotídeo CpG.
[255] O termo “vetor” refere-se a uma pequena molécula transportadora de ácido nucleico, um plasmídeo, vírus (por exemplo, vetor de AAV), ou outro veículo que pode ser manipulado por inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Esses vetores podem ser usados para manipulação genética (ou seja, “vetores de clonagem”), para introduzir/transferir polinucleotídeos nas células e para transcrever ou traduzir o polinucleotídeo inserido nas células. Um “vetor de expressão” é um vetor especializado que contém um gene ou sequência de ácidos nucleicos com as regiões regulatórias necessárias para a expressão em uma célula hospedeira.
[256] Uma sequência de ácido nucleico de vetor geralmente contém pelo menos uma origem de replicação para propagação em uma célula e, opcionalmente, elementos adicionais, como uma sequência polinucleotídica heteróloga, elemento de controle de expressão (por exemplo, um promotor, intensificador), íntron, uma repetição terminal invertida (ITR), marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos), sinal de poliadenilação.
[257] Um vetor viral é derivado a partir de ou com base em um ou mais elementos de ácidos nucleicos que compreendem um genoma viral. Os vetores virais particulares incluem vetores de vírus lentivirais e adenoassociados (AAV).
[258] O termo “recombinante”, como um modificador de vetor, como o vetor AAV recombinante (rAAV), bem como um modificador de sequências, como polinucleotídeos e polipeptídeos recombinantes, significa que as composições foram manipuladas (ou seja, manipuladas) de uma forma que geralmente não ocorre na natureza. Um exemplo particular de um vetor de AAV recombinante seria onde uma sequência de ácido de clique que não está normalmente presente no genoma de AAV de tipo selvagem é inserida dentro do genoma de AAV. Embora o termo “recombinante” nem sempre seja usado aqui em referência aos vetores AAV, bem como sequências, tais como polinucleotídeos, formas recombinantes incluindo polinucleotídeos, são expressamente incluídas apesar de qualquer omissão.
[259] Um “vetor de AAV recombinante” ou “rAAV” é derivado do genoma de tipo selvagem de AAV usando métodos moleculares para remover o genoma de tipo selvagem do genoma de AAV e substituindo por uma sequência de ácido nucleico não nativa, referida como um ácido nucleico heterólogo. Normalmente, para AAV, uma ou ambas as sequências de repetição terminal invertida (ITR) do genoma de AAV são retidas no vetor AAV. O rAAV é distinto de um genoma de AAV, uma vez que todo ou parte do genoma de AAV foi substituído por uma sequência não nativa em relação ao ácido nucleico genômico de AAV. A incorporação de uma sequência não nativa, portanto, define o vetor AAV como um vetor “recombinante”, que pode ser referido como um “vetor rAAV”.
[260] Uma sequência de rAAV pode ser empacotada - aqui referida como uma “partícula” - para infecção subsequente (transdução) de uma célula, ex vivo, in vitro ou in vivo. Quando uma sequência de vetor AAV recombinante é encapsidada ou empacotada em uma partícula AAV, a partícula também pode ser referida como um “vetor rAAV” ou “partícula rAAV”. Essas partículas de rAAV incluem proteínas que encapsidam ou empacotam o genoma do vetor e, no caso de AAV, são referidas como proteínas da capsídeo.
[261] Um vetor “genoma” refere-se à porção da sequência do plasmídeo recombinante que é finalmente empacotada ou encapsidada para formar uma partícula viral (por exemplo, rAAV). Nos casos em que plasmídeos recombinantes são usados para construir ou fabricar vetores recombinantes, o genoma do vetor não inclui a porção do “plasmídeo” que não corresponde à sequência do genoma do vetor do plasmídeo recombinante. Esta porção do genoma não vetorial do plasmídeo recombinante pode ser referida como a “estrutura do plasmídeo”, que é importante para a clonagem e amplificação do plasmídeo, um processo que é necessário para a propagação e produção do vírus recombinante, mas não é empacotado ou encapsidado em partículas de vírus (por exemplo, AAV). Assim, um vetor “genoma” se refere ao ácido nucleico que é empacotado ou encapsidado por vírus (por exemplo, AAV).
[262] As células hospedeiras para a produção de partículas de AAV recombinantes incluem, mas não estão limitadas a microrganismos, células de levedura, células de inseto e células de mamíferos que podem ser ou foram utilizadas como receptores de vetores de rAAV heterólogos. Podem ser utilizadas células da linha celular humana estável, HEK293 (prontamente disponível através, por exemplo, da American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC CRL1573). Em determinadas modalidades, uma linha celular de rim embrionário humano modificado (por exemplo, HEK293), que é transformada com fragmentos de DNA de adenovírus tipo 5 e expressa os genes adenovirais E1a e E1b, é usada para gerar partículas AAV recombinantes. A linha de células HEK293 modificada é prontamente transfectada e fornece uma plataforma particularmente conveniente para produzir partículas de rAAV. Outras linhas de células hospedeiras apropriadas para a produção de AAV recombinante são descritas no Pedido Internacional PCT/2017/024951.
[263] As modalidades, funções auxiliares de AAV são introduzidas na célula hospedeira por transfecção da célula hospedeira com um construto auxiliar de AAV antes ou simultaneamente à transfecção de um vetor de expressão de AAV. Uma célula hospedeira com funções auxiliares de AAV pode ser referida como uma “célula auxiliar” ou “ célula auxiliar empacotadora”. Os construtos auxiliares de AAV são, portanto, às vezes, usados para fornecer pelo menos expressão transitória de genes rep e/ou cap de AAV para complementar as funções AAV ausentes necessárias para a transdução produtiva de AAV. Os construtos auxiliares de AAV geralmente carecem de ITRs de AAV e não podem se replicar nem empacotar. Esses construtos podem estar na forma de um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou virião. Uma série de construtos auxiliares AAV foi descrita, tais como os plasmídeos comumente usados pAAV/Ad e pIM29+45 que codificam produtos de expressão Rep e Cap. Vários outros vetores são conhecidos que codificam produtos de expressão Rep e/ou Cap.
[264] Os métodos para a geração de partículas de AAV recombinantes capazes de transdução de células de mamíferos são conhecidos na técnica. Por exemplo, partículas de AAV recombinantes podem ser produzidas como descrito na Patente US 9.408.904; e pedidos internacionais PCT/US2017/025396 e PCT/US2016/064414.
[265] Os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados de forma intercambiável neste documento para se referir a todas as formas de ácido nucleico, oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Os ácidos nucleicos incluem DNA genômico, cDNA e DNA antisense, e mRNA spliced ou não, tRNA rRNA e DNA ou RNA inibitório (RNAi, por exemplo, pequeno ou curto hairpin (sh) RNA, microRNA (miRNA), pequeno ou curto interferente (si) RNA, RNA de trans-splicing ou RNA antisense). Os ácidos nucleicos incluem polinucleotídeos de ocorrência natural, sintéticos e intencionalmente modificados ou alterados (por exemplo, ácido nucleico variante). Os ácidos nucleicos, tais como cDNA, DNA genômico, RNA e seus fragmentos, que podem ser de cadeia simples ou dupla.
[266] Os polinucleotídeos podem ser simples, duplos ou triplos, lineares ou circulares e podem ser de qualquer comprimento. Ao discutir os polinucleotídeos, uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo particular pode ser descrita neste documento de acordo com a convenção de fornecer a sequência na direção 5’ para 3'.
[267] Um “transgene” é usado neste documento para se referir convenientemente a um ácido nucleico heterólogo que se destina ou foi introduzido em uma célula ou organismo. Os transgenes incluem qualquer ácido nucleico heterólogo, tal como um ácido nucleico modificado que codifica GAA.
[268] O termo “transduzir” e suas variações gramaticais referem-se à introdução de uma molécula, como um vetor rAAV, em uma célula ou organismo hospedeiro. O ácido nucleico/transgene heterólogo pode ou não ser integrado ao ácido nucleico genômico da célula receptora. O ácido nucleico heterólogo introduzido também pode existir na célula receptora ou organismo hospedeiro extracromossomicamente, ou apenas transitoriamente.
[269] Uma “célula transduzida” é uma célula na qual o transgene foi introduzido. Consequentemente, uma célula “transduzida” (por exemplo, em um mamífero, como uma célula ou tecido ou célula de órgão), significa uma mudança genética em uma célula após a incorporação, por exemplo, de um ácido nucleico (por exemplo, um transgene) na célula. Assim, uma célula “transduzida” é uma célula na qual, ou uma descendência desta, na qual um ácido nucleico exógeno foi introduzido. A (s) célula (s) pode ser propagada e a proteína introduzida expressa. Para usos e métodos de terapia gênica, uma célula transduzida pode estar em um indivíduo.
[270] Um “elemento de controle de expressão “ refere-se a sequência
(s) de ácido nucleico que influenciam a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado. Os elementos de controle de expressão, conforme estabelecido neste documento, incluem promotores e potencializadores. Sequências de vetor, incluindo vetores AAV, podem incluir um ou mais “elementos de controle de expressão”. Normalmente, tais elementos são incluídos para facilitar a transcrição de polinucleotídeo heterólogo adequada e, conforme a tradução apropriada (por exemplo, um promotor, intensificador, sinal de splicing para íntrons, manutenção da estrutura de leitura correta do gene para permitir a tradução in-frame de mRNA e, códons de parada, etc.). Esses elementos normalmente agem em cis, referido como um elemento de “ação cis”, mas também podem agir em trans.
[271] O controle de expressão pode ser efetuado no nível de transcrição, tradução, splicing, estabilidade de mensagem, etc. Normalmente, um elemento de controle de expressão que modula a transcrição é justaposto próximo à extremidade 5’ (ou seja, “a montante”) de um ácido nucleico transcrito. Os elementos de controle de expressão também podem estar localizados na extremidade 3' (ou seja, “a jusante”) da sequência transcrita ou dentro da transcrição (por exemplo, em um íntron). Os elementos de controle de expressão podem estar localizados adjacentes ou a uma distância da sequência transcrita (por exemplo, 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100 a 500 ou mais nucleotídeos do polinucleotídeo), mesmo em distâncias consideráveis. No entanto, devido às limitações de comprimento dos vetores AAV, o elemento de controle de expressão s estará tipicamente dentro de 1 a 1.000 nucleotídeos do local de início da transcrição do ácido nucleico heterólogo.
[272] Funcionalmente, a expressão de ácido nucleico operativamente ligado é pelo menos em parte regulado pelo elemento (por exemplo, promotor) de tal modo que o elemento modula a transcrição do ácido nucleico e, sempre que adequado, a tradução da transcrição. Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor, que geralmente está localizado 5’da sequência de ácido nucleico transcrita. Um promotor normalmente aumenta uma quantidade expressa a partir de ácido nucleico operacionalmente ligado em comparação com uma quantidade expressa quando não existe promotor.
[273] Um “intensificador”, conforme usado neste documento, pode se referir a uma sequência que está localizada adjacente ao ácido nucleico heterólogo. Os elementos intensificadores estão tipicamente localizados a montante de um elemento promotor, mas também funcionam e podem estar localizados a jusante ou dentro de uma sequência. Assim, um elemento potenciador pode estar localizado em 10-50 pares de bases, 50-100 pares de bases, 100-200 pares de bases ou 200- 300 pares de bases ou mais pares de bases a montante ou a jusante de uma sequência de ácido nucleico heteróloga. Elementos estimuladores tipicamente aumentam expressos de um ácido nucleico operacionalmente ligado acima da expressão proporcionada por um elemento promotor.
[274] Um construto de expressão pode compreender elementos reguladores que servem para dirigir a expressão em uma célula ou tipo de tecido particular. Os elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores) incluem aqueles ativos em um determinado tecido ou tipo de célula, aqui referido como um “elemento de controle de expressão/promotores específicos de tecido”. Os elementos de controle de expressão específicos de tecido são normalmente ativos em células ou tecidos específicos (por exemplo, o fígado). Os elementos de controle de expressão são tipicamente ativos em células, tecidos ou órgãos específicos, porque são reconhecidos por proteínas ativadoras da transcrição, ou outros reguladores da transcrição, que são exclusivos de uma célula, tecido ou tipo de órgão específico. Esses elementos reguladores são conhecidos dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1992)).
[275] A incorporação de elementos reguladores específicos de tecido nos construtos de expressão fornece, pelo menos, tropismo de tecidos parcial para a expressão de um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína ou ARN inibitório. Exemplos de promotores que são ativos no fígado são o promotor do gene da transtirretina (TTR); promotor da alfa 1-antitripsina humana (hAAT); albumina, Miyatake, et al., J. Virol., 71:5.124 a 5.132 (1997); promotor do núcleo do vírus da hepatite B, Sandig, et al., Gene Ther. 3:1.002 a 1.009 (1996); alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1.503 a 1.514 (1996), entre outros. Um exemplo de um intensificador ativo no fígado é a apolipoproteína E (apoE) HCR-1 e HCR-2 (Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29.113 a 29.119 (1997)).
[276] Os elementos de controle de expressão incluem promotores/intensificadores ubíquos ou indiscriminados que são capazes de dirigir a expressão de um polinucleotídeo em muitos tipos de células diferentes. Tais elementos incluem, mas não estão limitados às sequências promotoras/potencializadoras imediatas do citomegalovírus (CMV), as sequências promotoras/potencializadoras do vírus do sarcoma de Rous (RSV) e os outros promotores/potencializadores virais ativos em uma variedade de tipos de células de mamíferos ou sintéticos elementos que não estão presentes na natureza (ver, por exemplo, Boshart et al., Cell, 41:521 a 530 (1985)), o promotor SV40, o promotor di- hidrofolato redutase, o promotor citoplasmático β-actina e o promotor fosfoglicerol quinase (PGK).
[277] Os elementos de controle de expressão também podem conferir expressão de uma forma que é regulável, isto é, um sinal ou estímulos aumenta ou diminui a expressão do polinucleotídeo heterólogo operacionalmente ligado. Um elemento regulável que aumenta a expressão do polinucleotídeo operacionalmente ligado em resposta a um sinal ou estímulo também é referido como um “elemento indutível” (ou seja, é induzido por um sinal). Exemplos particulares incluem, mas não estão limitados a, um promotor induzível por hormônio (por exemplo, esteroide). Normalmente, a quantidade de aumento ou diminuição conferida por tais elementos é proporcional à quantidade de sinal ou estímulo presente; quanto maior a quantidade de sinal ou estímulo, maior o aumento ou diminuição na expressão. Exemplos particulares não limitativos incluem promotor de metalotionina de ovelha induzível por zinco (MT); o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo indutível por hormônio esteroide (MMTV); o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o sistema reprimível com tetraciclina (Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:5.547 a 5.551 (1992)); o sistema indutível por tetraciclina (Gossen, et al., Science. 268:1.766 a 1.769 (1995); ver também Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512 a 518 (1998)); o sistema indutível por RU486 (Wang, et al., Nat. Biotech.
15:239 a 243 (1997) e Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; e o sistema indutível por rapamicina (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2.865 a 2.872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1.028 a 1.032 (1996)). Outros elementos de controle reguláveis que podem ser úteis neste contexto, são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, desenvolvimento.
[278] Os elementos de controle de expressão incluem elementos nativos para o polinucleotídeo heterólogo. Um elemento de controle nativo (por exemplo, promotor) pode ser usado quando se deseja que a expressão do polinucleotídeo heterólogo imite a expressão nativa. O elemento nativo pode ser usado quando a expressão do polinucleotídeo heterólogo deve ser regulada temporalmente ou no desenvolvimento, ou de uma maneira específica de tecido, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Outros elementos de controle de expressão nativos, como íntrons, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso Kozak também podem ser usados.
[279] O termo “operacionalmente ligado” significa que as sequências reguladoras necessárias para a expressão de uma sequência de ácido nucleico são colocadas nas posições apropriadas em relação à sequência, de modo a expressão do efeito da sequência de ácido nucleico. Essa mesma definição é algumas vezes aplicada ao arranjo de sequências de ácido nucleico e elementos de controle de transcrição (por exemplo, promotores, intensificadores e elementos de terminação) em um vetor de expressão, por exemplo, vetor rAAV.
[280] No exemplo de um elemento de controle de expressão em ligação operacional com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão do ácido nucleico. Mais especificamente, por exemplo, duas sequências de DNA operacionalmente ligadas significam que os dois DNAs estão dispostos (cis ou trans) em tal relação de modo que pelo menos uma das sequências de DNA seja capaz de exercer um efeito fisiológico sobre a outra sequência.
[281] Por conseguinte, elementos adicionais de vetores incluem, sem limitação, um elemento de controle de expressão (por exemplo, promotor/potenciador), um sinal de terminação da transcrição ou códon de paragem, regiões 5' ou 3' não traduzidas (por exemplo, sequências de poliadenilação (poliA)) que flanqueiam uma sequência, como uma ou mais cópias de uma sequência AAV ITR, ou um íntron.
[282] Elementos adicionais incluem, por exemplo, sequências, de enchimento ou de polinucleotídeos de enchimento, por exemplo, para melhorar a embalagem e reduzir a presença de contaminantes de ácido nucleico. Os vetores AAV tipicamente aceitam inserções de DNA tendo uma faixa de tamanho que é geralmente de cerca de 4 kb a cerca de 5,2 kb, ou ligeiramente mais. Assim, para sequências mais curtas, inclusão de um stuffer ou enchimento a fim de ajustar o comprimento para próximo ou no tamanho normal da sequência genômica do vírus aceitável para o empacotamento do vetor AAV na partícula do vírus. Em várias modalidades, uma sequência de ácido nucleico de preenchimento/stuffer é um segmento de ácido nucleico não traduzido (não codificado por proteína). Para uma sequência de ácido nucleico inferior a 4,7 kb, a sequência polinucleotídica de enchimento ou stuffer tem um comprimento que quando combinado (por exemplo, inserido em um vetor) com a sequência tem um comprimento total entre cerca de 3,0-5,5 kb, ou entre cerca de 4,0-5,0 kb, ou entre cerca de 4,3-4,8 kb.
[283] O termo “isolado”, quando usado como um modificador de uma composição, significa que as composições são feitas pela mão do homem ou são separadas, completamente ou pelo menos em parte, de seu ambiente in vivo de ocorrência natural. Geralmente, as composições isoladas são substancialmente isentas de um ou mais materiais com os quais normalmente se associam na natureza, por exemplo, uma ou mais proteínas, ácidos nucleicos, lipídios, carboidratos, membrana celular.
[284] O termo “isolado” não exclui combinações produzidas pela mão do homem, por exemplo, uma sequência de rAAV ou partícula de rAAV que empacota ou encapsula um genoma de vetor de AAV e uma formulação farmacêutica. O termo “isolado” também não exclui formas físicas alternativas da composição, tais como híbridos/quimeras, multímeros/oligômeros, modificações (por exemplo, fosforilação, glicosilação, lipidação) ou formas derivadas ou formas expressas em células hospedeiras produzidas manualmente do homem.
[285] O termo “substancialmente puro” refere-se a uma preparação compreendendo, pelo menos, 50-60%, em peso, o composto de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína, etc). A preparação pode compreender pelo menos 75% em peso, ou pelo menos 85% em peso, ou cerca de 90-99% em peso, do composto de interesse. A pureza é medida por métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, análise por HPLC e semelhantes).
[286] A expressão “consistindo essencialmente em” quando se refere a uma sequência de nucleotídeos particular ou sequência de aminoácidos, uma sequência que tem as propriedades de uma dada SEQ ID NO. Por exemplo, quando usada em referência a uma sequência de aminoácidos, a frase inclui a sequência per se e modificações moleculares que não afetariam as características básicas e novas da sequência.
[287] Os ácidos nucleicos, vetores de expressão (por exemplo, os genomas de vetor de AAV), plasmídeos, incluindo ácidos nucleicos modificados codificadores de GAA da invenção podem ser preparados usando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A disponibilidade da informação da sequência de nucleotídeos permite a preparação de moléculas de ácido nucleico isoladas da invenção por uma variedade de meios. Os ácidos nucleicos que codificam GAA podem ser feitos usando várias técnicas de clonagem padrão, tecnologia de DNA recombinante, via expressão celular ou tradução in vitro e técnicas de síntese química. A pureza dos polinucleotídeos pode ser determinada por meio de sequenciamento, eletroforese em gel e semelhantes. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser isolados usando hibridização ou técnicas de triagem de banco de dados baseadas em computador. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a:(1) hibridização de DNA genômico ou bibliotecas de cDNA com sondas para detectar sequências de nucleotídeos homólogas; (2) pesquisa de anticorpos para detectar polipeptídeos com características estruturais compartilhadas, por exemplo, usando uma biblioteca de expressão; (3) reação em cadeia da polimerase (PCR) em DNA genômico ou cDNA usando iniciadores capazes de emparelhar com uma sequência de ácido nucleico de interesse; (4) pesquisas de computador em bancos de dados de sequência para sequências relacionadas; e (5) rastreio diferencial de uma biblioteca de ácido nucleico subtraída.
[288] Os ácidos nucleicos podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalidade, os clones são mantidos em um vetor de clonagem/expressão de plasmídeo, tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), que é propagado em uma célula hospedeira de E. coli adequada. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser mantidos em vetores adequados para expressão em células de mamíferos, por exemplo, um vetor AAV. Nos casos em que a modificação pós-tradução afeta a função da proteína, a molécula de ácido nucleico pode ser expressa em células de mamíferos.
[289] Como aqui descrito, os vetores de rAAV podem compreender, opcionalmente, elementos de regulação necessários para a expressão do ácido nucleico heterólogo em uma célula posicionada de tal modo que permita a expressão da proteína codificada na célula hospedeira. Tais elementos reguladores requeridos para a expressão incluem, mas não estão limitados a, sequências promotoras, sequências potenciadoras e sequências de iniciação da transcrição conforme estabelecido aqui e conhecido do especialista na técnica.
[290] Os métodos e utilizações da invenção incluem a entrega (transdução) de ácido nucleico (transgene) em células hospedeiras, incluindo células em divisão e/ou não divisão. Os ácidos nucleicos, vetor de rAAV, métodos, usos e formulações farmacêuticas da invenção são adicionalmente úteis em um método de entrega, administração ou fornecimento de sequência codificada por ácido nucleico heterólogo a um indivíduo em necessidade, como um método de tratamento. Desta forma, o ácido nucleico é transcrito e uma proteína produzida in vivo em um indivíduo. O indivíduo pode se beneficiar ou precisar da proteína porque o indivíduo tem uma deficiência da proteína ou porque a produção da proteína no indivíduo pode conferir algum efeito terapêutico, como método de tratamento ou de outra forma.
[291] A invenção é útil em animais, incluindo aplicações médicas humanas e veterinárias. Os indivíduos adequados incluem, portanto, mamíferos, como humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo “indivíduo” refere-se a um animal, geralmente um mamífero, como humanos, primatas não humanos (macacos, gibões, gorilas, chimpanzés, orangotangos, macacos), um animal doméstico (cães e gatos), um animal de fazenda (aves domésticas como galinhas e patos, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais experimentais (camundongo, camundongo, coelho, porquinho da índia). Os indivíduos humanos incluem indivíduos fetais, neonatais, infantis, juvenis e adultos. Os indivíduos incluem modelos de doenças animais, por exemplo, camundongos e outros modelos animais de deficiências de proteína/enzima, como doença de Pompe e doenças de armazenamento de glicogênio (GSDs) e outros conhecidos pelos versados na técnica.
[292] Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a invenção incluem aqueles que têm ou estão em risco de produzir uma quantidade insuficiente de GAA, ou produzir uma GAA aberrante, parcialmente funcional ou não funcional. Os indivíduos podem ser testados quanto à atividade de GAA para determinar se tais indivíduos são apropriados para o tratamento de acordo com um método da invenção. Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a invenção também incluem aqueles indivíduos que se beneficiariam da GAA. Os indivíduos que podem se beneficiar da GAA incluem aqueles que têm doença de armazenamento de glicogênio (GSD). Os indivíduos tratados podem ser monitorados após o tratamento periodicamente, por exemplo, a cada 1-4 semanas, 1-6 meses, 6-12 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos.
[293] Os indivíduos podem ser testados para uma resposta imune, por exemplo, anticorpos contra AAV. Os candidatos podem, portanto, ser rastreados antes do tratamento de acordo com um método da invenção. Os indivíduos também podem ser testados para anticorpos contra AAV após o tratamento e,
opcionalmente, monitorados por um período de tempo após o tratamento. Indivíduos com anticorpos AAV preexistentes ou em desenvolvimento podem ser tratados com um agente imunossupressor ou outro regime conforme estabelecido neste documento.
[294] Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a invenção também incluem aqueles que têm ou estão em risco de produzir anticorpos contra AAV. Os vetores rAAV podem ser administrados ou entregues a tais indivíduos usando várias técnicas. Por exemplo, o capsídeo vazio de AAV (isto é, AAV sem um ácido nucleico modificado que codifica GAA) pode ser entregue para se ligar aos anticorpos de AAV no indivíduo, permitindo assim que o vetor rAAV compreendendo o ácido nucleico heterólogo transduza células do indivíduo.
[295] Os ácidos nucleicos modificados, cassetes de expressão e vetores de rAAV da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento de uma deficiência em GAA. Consequentemente, em várias modalidades, os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassete de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e vetores de rAAV da invenção podem ser usados como um agente terapêutico e/ou profilático.
[296] Em modalidades particulares, os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e vetores rAAV da invenção podem ser usados para o tratamento da doença de Pompe, bem como outras doenças de armazenamento de glicogênio. A administração de ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e os vetores de rAAV da invenção a um paciente com Pompe ou outra doença de armazenamento de glicogênio leva à expressão da proteína GAA que serve para suprimir, inibir ou reduzir o acúmulo de glicogênio, prevenir o acúmulo de glicogênio ou degradar o glicogênio, o que por sua vez pode reduzir ou diminuir um ou mais efeitos adversos ou sintomas da doença de Pompe.
[297] Os indivíduos, animais ou pacientes administrados com ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e vetores rAAV da invenção podem ser avaliados por uma variedade de testes, ensaios e avaliações funcionais para demonstrar, medir e/ou avaliar a eficácia dos ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e vetores de rAAV da invenção como agentes terapêuticos e/ou profiláticos.
Esses testes e ensaios incluem, mas não estão limitados a, medição da atividade de GAA (como pelo uso de ensaios de atividade de GAA padrão) e/ou quantidade GAA (como por Western blot com anticorpo anti- GAA) em uma amostra biológica, como sangue ou plasma; medição do teor de glicogênio em tecidos, como amostras de músculos; avaliação histológica do músculo (como músculo do tríceps braquial, quadríceps femoral, diafragma e coração), medula espinhal (incluindo exame e contagem de neurônios motores positivos para ChAT no corno ventral dos segmentos cervicais torácicos e lombares da medula espinhal, e avaliação de reação astroglial e ativação microglial); avaliação da função respiratória durante a respiração tranquila; teste de suspensão com fio dos membros anteriores; medição da força de preensão; teste de rotarod de coordenação motora (como por protocolo de rotarod); radiografia de tórax que pode mostrar cardiomegalia; eletrocardiograma (ECG) para examinar a função cardíaca; eletromiograma (EMG) que pode mostrar miopatia; medição da atividade de GAA em fibroblastos de pele; ensaios de atividade de GAA em amostras de sangue seco; exames de sangue/soro para creatina quinase sérica, que quando elevada é um marcador inespecífico da doença de Pompe; exames de sangue/soro para ou aminotransferase, alanina aminotransferase ou lactato desidrogenase, que podem estar elevados como indicador de liberação de músculo na doença de Pompe; teste para tetrassacarídeo de glicose na urina (um marcador sensível e não específico para a doença de Pompe; análise dos níveis de pico e de estado estacionário da enzima GAA derivada do vetor avaliados pela proteína GAA total e atividade no plasma; teste da função pulmonar; teste da função muscular; biópsia muscular e coloração para presença de glicogênio em vacúolos celulares; biomarcadores da saúde do fígado; exame da saúde lisossomal; teste para respostas imunes contra o capsídeo AAV; teste para respostas imunológicas contra o produto de proteína transgene GAA; teste de caminhada de seis minutos (TC6); teste de capacidade vital forçada; níveis de pico e de estado estacionário da enzima GAA derivada do vetor AAV (avaliada pela proteína GAA total e atividade medida no plasma; teste de marcha, escada, gower e cadeira (GSGC); teste de força muscular usando Rasch- built Medical Escala de classificação do Conselho de Pesquisa (MRC); atividade de vida relatada pelo paciente/participação social; medidas quantitativas de sono e respiração do sono a partir da polissonografia (PSG); medidas relatadas pelo paciente de fadiga, sonolência diurna e qualidade do sono; Pontuação de Walton e Gardner-Medwin (WGM); testes de função respiratória, incluindo, mas não se limitando à pressão nasal inspiratória durante o fungar (SNIP) e as pressões máxima inspiratória e expiratória (PImáx e PEmáx, respectivamente); biomarcadores hepáticos; Teste de βhexosaminidase (βHexo); medições de resultados de saúde, incluindo, mas não se limitando a pesquisa de saúde de formulário curto-36 (SF-36); Escala de atividade específica de Pompe construída por Rasch (R-PAct); pontuação de gravidade da fadiga (FSS); e bancos de itens do sistema de informação de medição de resultados relatados pelo paciente (PROMIS).
[298] Além disso, os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, Cassete de Expressão que compreendem ácidos nucleicos que codificam modificados s vetores de GAA e rAAV do presente invento pode ser utilizado para o tratamento de uma Doença de armazenamento de glicogénio (GSD). As doenças de armazenamento de glicogênio incluem, por exemplo, GSD tipo I (doença de von Gierke), GSD tipo II (doença de Pompe), GSD tipo III (doença de Forbes-Cori), GSD tipo IV (doença de Anderson, amilopectinose), GSD tipo V (doença de McArdle), GSD tipo VI (doença dela), GSD tipo VII (doença de Tarui) ou doença congênita letal de armazenamento de glicogênio do coração.
[299] Como aqui estabelecido, de rAAV são úteis como vetores de terapia de genes, tal como eles podem penetrar nas células e introduzir material de ácido nucleico/genético nas células. Como os AAV não estão associados a doenças patogênicas em humanos, os vetores de rAAV são capazes de fornecer sequências polinucleotídicas heterólogas (por exemplo, proteínas e agentes terapêuticos) a pacientes humanos sem causar patogênese ou doença substancial de AAV.
[300] Os vetores rAAV possuem uma série de características desejáveis para tais aplicações, incluindo tropismo para células em divisão e não divisão. A experiência clínica inicial com esses vetores também não demonstrou toxicidade sustentada e as respostas imunes são tipicamente mínimas ou indetectáveis. Os AAV são conhecidos por infectar uma ampla variedade de tipos de células in vivo por endocitose mediada por receptor ou por transcitose. Esses sistemas de vetores foram testados em humanos visando muitos tecidos, como epitélio retinal, fígado, músculo esquelético, vias aéreas, cérebro, articulações e células-tronco hematopoiéticas.
[301] Pode ser desejável introduzir um vetor rAAV que pode fornecer, por exemplo, múltiplas cópias de GAA e, portanto, maiores quantidades de proteína GAA. Os vetores e métodos de rAAV melhorados para a produção desses vetores foram descritos em detalhes em várias referências, patentes e pedidos de patentes, incluindo: Wright JF (Hum. Gene Ther., 20:698 a 706, 2009).
[302] A entrega direta de vetores de rAAV ou transdução ex vivo de células humanas, seguida por infusão no corpo irá resultar na expressão do ácido nucleico heterólogo exercendo assim um efeito terapêutico benéfico sobre a hemostasia. No contexto de ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, a administração suprime, inibe ou reduz a quantidade ou o acúmulo de glicogênio, evita o acúmulo de glicogênio ou degrada o glicogênio. Isso, por sua vez, pode suprimir, inibir, reduzir ou diminuir um ou mais efeitos adversos da doença de Pompe, como promover ou melhorar o tônus muscular e/ou a força muscular e/ou reduzir ou diminuir o aumento do fígado.
[303] O vetor recombinante de AAV, bem como métodos e usos dos mesmos, incluem qualquer cepa viral ou sorotipo. Como um exemplo não limitativo, um vetor AAV recombinante pode ser baseado em qualquer genoma AAV, tal como AAV (SEQ ID NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO:33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B ou AAV-
2i8, por exemplo. Esses vetores podem ser baseados na mesma cepa ou sorotipo (ou subgrupo ou variante), ou ser diferentes uns dos outros. Como um exemplo não limitativo, um vetor AAV recombinante com base em um genoma de sorotipo particular pode ser idêntico ao sorotipo das proteínas do capsídeo que empacotam o vetor. Além disso, um genoma de vetor de AAV recombinante pode ser baseado em um genoma de sorotipo de AAV distinto do sorotipo das proteínas da cápside de AAV que empacotam o vetor. Por exemplo, o genoma do vetor AAV pode ser baseado em AAV2, enquanto pelo menos uma das três proteínas do capsídeo poderia ser um AAV (SEQ ID NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO:33), AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B ou AAV-2i8 ou variante dos mesmos, por exemplo.
[304] Em modalidades particulares, os vetores de vírus adenoassociados (AAV) incluem AAV (SEQ ID NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO:33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B e AAV-2i8, bem como variantes (por exemplo, variantes do capsídeo, tais como inserções, adições, substituições e deleções de aminoácidos), por exemplo, conforme estabelecido em WO 2013/158879 (Pedido Internacional PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (Pedido Internacional PCT/US2014/047670) e US 2013/0059732 (Patente nº US 9.169.299, divulga LK01, LK02, LK03, etc.).
[305] Conforme usado neste documento, o termo “sorotipo” é uma distinção usada para se referir a um AAV tendo um capsídeo que é sorologicamente distinto de outros sorotipos de AAV. A distinção sorológica é determinada com base na falta de reatividade cruzada entre os anticorpos para um AAV em comparação com outro AAV. Essas diferenças de reatividade cruzada são geralmente devido a diferenças nas sequências da proteína do capsídeo/determinantes antigênicos (por exemplo, devido às diferenças de sequência de VP1, VP2 e/ou VP3 dos sorotipos de AAV). Apesar da possibilidade de que as variantes de AAV incluindo variantes de capsídeo possam não ser sorologicamente distintas de um AAV de referência ou outro sorotipo de AAV, elas diferem em pelo menos um nucleotídeo ou resíduo de aminoácido em comparação com a referência ou outro sorotipo de AAV.
[306] De acordo com a definição tradicional, um meio de sorotipo que o vírus de interesse foi testado contra soro específico para todos os sorotipos existentes e bem caracterizados para a atividade neutralizante e não há anticorpos têm sido encontrados que neutralizam o vírus de interesse. À medida que mais isolados de vírus de ocorrência natural são revelados e/ou mutantes de capsídeo são gerados, pode haver ou não diferenças sorológicas com qualquer um dos sorotipos atualmente existentes. Assim, nos casos em que o novo vírus (por exemplo, AAV) não tem diferença sorológica, esse novo vírus (por exemplo, AAV) seria um subgrupo ou variante do sorotipo correspondente. Em muitos casos, o teste de sorologia para atividade neutralizante ainda precisa ser realizado em vírus mutantes com modificações na sequência do capsídeo para determinar se eles são de outro sorotipo de acordo com a definição tradicional de sorotipo. Consequentemente, por uma questão de conveniência e para evitar a repetição, o termo “sorotipo” se refere amplamente a vírus sorologicamente distintos (por exemplo, AAV), bem como vírus (por exemplo, AAV) que não são sorologicamente distintos que podem estar dentro de um subgrupo ou uma variante de um determinado sorotipo.
[307] Como aqui estabelecido, as proteínas da cápside de AAV pode apresentar menos do que 100% de identidade de sequência em relação a um sorotipo de AAV de referência ou parental como AAV (SEQ ID NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO:33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B ou AAV-2i8, mas são distintos e não idênticos aos genes ou proteínas AAV conhecidos, tais como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B ou AAV-2i8. Em uma modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV modificada/variante inclui ou consiste em uma sequência de pelo menos 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, etc., até 99,9% de identidade em relação a uma proteína do capsídeo AAV de referência ou parental, tal como AAV (SEQ ID
NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO:33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B ou AAV-2i8.
[308] Os vetores de rAAV podem ser administrados a um paciente por meio de infusão em um transportador biologicamente compatível, por exemplo, por meio de injeção intravenosa. Os vetores de rAAV podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outras moléculas. Por conseguinte, os vetores rAAV e outras composições, agentes, drogas, produtos biológicos (proteínas) podem ser incorporados em composições farmacêuticas. Essas composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e entrega a um indivíduo in vivo ou ex vivo.
[309] Em modalidades particulares, as composições farmacêuticas também contêm um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Esses excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que por si só não induz uma resposta imune prejudicial ao indivíduo que recebe a composição e que pode ser administrado sem toxicidade indevida.
[310] Conforme usado neste documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” e “fisiologicamente aceitável” significa uma formulação biologicamente aceitável, gasosa, líquida ou sólida, ou uma mistura dos mesmos, que é adequada para uma ou mais vias de administração, entrega in vivo ou contato. Uma composição “farmaceuticamente aceitável” ou “fisiologicamente aceitável” é um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis substanciais. Assim, tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, na administração de um ácido nucleico, vetor, partícula viral ou proteína a um indivíduo.
[311] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, líquidos, tais como água, solução salina, glicerol, etanol e açúcares. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser incluídos no mesmo, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e semelhantes; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos,
propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. Os excipientes também incluem proteínas como a albumina. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tampão de pH e semelhantes, podem estar presentes em tais veículos.
[312] A composição farmacêutica pode ser proporcionada como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo, mas não limitados a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em meio aquoso ou outros solventes protônicos que não sejam as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, uma preparação pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos os seguintes:1-50 mM de histidina, 0,1% -2% de sacarose e 2-7% de manitol, em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinado com o tampão antes do uso.
[313] As composições farmacêuticas incluem solventes (aquosos ou não aquosas), soluções (aquosas ou não aquosas), emulsões (por exemplo, óleo- em-água ou água-em-óleo), suspensões, xaropes, elixires, meios de dispersão e suspensão, revestimentos, agentes isotônicos e promotores ou retardadores da absorção, compatíveis com a administração farmacêutica ou contato ou entrega in vivo. Solventes aquosos e não aquosos, soluções e suspensões podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem comprimidos (revestidos ou não revestidos), cápsulas (duras ou moles), microesferas, pó, grânulos e cristais. Compostos ativos suplementares (por exemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados às composições.
[314] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para ser compatível com uma via particular de administração ou entrega, como estabelecido aqui ou conhecidos de um perito na técnica. Assim, as composições farmacêuticas incluem veículos, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias.
[315] As composições adequadas para administração parentérica compreendem soluções aquosas e não aquosas, suspensões ou emulsões do composto ativo, cujas preparações são tipicamente estéreis e podem ser isotônicas com o sangue do receptor pretendido. Exemplos ilustrativos não limitativos incluem água, solução salina tamponada, solução de Hanks, solução de Ringer, dextrose, frutose, etanol, óleos animais, vegetais ou sintéticos. As suspensões aquosas para injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano.
[316] Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção de óleo apropriados. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[317] Os cossolventes e adjuvantes podem ser adicionados à formulação. Exemplos não limitativos de cossolventes contêm grupos hidroxila ou outros grupos polares, por exemplo, álcoois, como álcool isopropílico; glicóis, tais como propilenoglicol, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, éter de glicol; glicerol; álcoois de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno. Os adjuvantes incluem, por exemplo, surfactantes, tais como lecitina de soja e ácido oleico; ésteres de sorbitano, tais como trioleato de sorbitano; e polivinilpirrolidona.
[318] Após as composições farmacêuticas terem sido preparadas, essas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento. Essa marcação pode incluir quantidade, frequência e método de administração.
[319] As composições farmacêuticas e sistemas de entrega apropriados para as composições, métodos e utilizações da presente invenção são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA;. The Merck Index (1996) 12a edição, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ;
Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel e Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11a edição, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; e Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., páginas 253 a 315).
[320] Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade suficiente” refere-se a uma quantidade que fornece, em doses únicas ou múltiplas, sozinhas ou em combinação, com uma ou mais outras composições (agentes terapêuticos ou imunossupressores, como um fármaco), tratamentos, protocolos, ou agentes de regimes terapêuticos, uma resposta detectável de qualquer duração de tempo (longo ou curto prazo), um resultado esperado ou desejado ou um benefício para um indivíduo de qualquer grau mensurável ou detectável ou por qualquer período de tempo (por exemplo, por minutos, horas, dias, meses, anos ou curado).
[321] As doses podem variar e dependem do tipo, início, progressão, gravidade, frequência, duração ou probabilidade da doença para a qual o tratamento é direcionado, o desfecho clínico desejado, tratamentos anteriores ou simultâneos, saúde geral, idade, sexo, raça ou competência imunológica do indivíduo e outros fatores que serão apreciados pelo versado na técnica. A quantidade, número, frequência ou duração da dose pode ser proporcionalmente aumentada ou reduzida, conforme indicado por quaisquer efeitos colaterais adversos, complicações ou outros fatores de risco do tratamento ou terapia e o estado do indivíduo. O versado na técnica apreciará os fatores que podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para fornecer uma quantidade suficiente para fornecer um benefício terapêutico ou profilático.
[322] A dose para atingir um efeito terapêutico, por exemplo, a dose nos genomas do vetor/por quilograma de peso corporal (vg/kg), irá variar com base em vários fatores, incluindo, mas não se limitando a:via de administração, o nível de expressão de polinucleotídeo heterólogo necessária para atingir um efeito terapêutico, a doença específica tratada, qualquer resposta imune do hospedeiro ao vetor viral, uma resposta imune do hospedeiro ao polinucleotídeo heterólogo ou produto de expressão (proteína) e a estabilidade da proteína expressa. Um versado na técnica pode determinar uma faixa de dose de rAAV/genoma de vetor para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio particular com base nos fatores acima mencionados, bem como outros fatores.
[323] Geralmente, as doses variarão de pelo menos 1x108 genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do indivíduo, ou mais, por exemplo, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013 ou 1x1014, ou mais, genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do indivíduo, para atingir um efeito terapêutico. Uma dose de rAAV na faixa de 1x1010 -1x1011 vg/kg em camundongos e 1x1012 -1x1013 vg/kg em cães foi eficaz. As doses podem ser inferiores, por exemplo, uma dose inferior a 6x1012 vg/kg. Mais particularmente, uma dose de 5x1011 vg/kg ou 1x1012 vg/kg.
[324] As doses do vetor rAAV podem estar em um nível, tipicamente na extremidade inferior do espectro de dose, de modo que não haja uma resposta imune substancial contra a sequência de ácido nucleico heteróloga, a proteína codificada ou ácido nucleico inibitório, ou vetor rAAV. Mais particularmente, uma dose de até, mas inferior a 6x1012 vg/kg, tal como cerca de 5x1011 a cerca de 5x1012 vg/kg, ou mais particularmente, cerca de 5x1011 vg/kg ou cerca de 1x1012 vg/kg.
[325] Uma “forma de dosagem unitária”, tal como aqui utilizada, refere- se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada opcionalmente em associação com um transportador farmacêutico (excipiente, diluente, veículo ou agente de enchimento) que, quando administrado em uma ou mais doses, é calculado para produzir um efeito desejado (por exemplo, efeito profilático ou terapêutico). As formas de dosagem unitária podem estar dentro, por exemplo, de ampolas e frascos, que podem incluir uma composição líquida, ou uma composição em um estado seco por congelamento ou liofilizado; um veículo líquido estéril, por exemplo, pode ser adicionado antes da administração ou entrega in vivo. As formas de dosagem unitária individual podem ser incluídas em kits ou recipientes de múltiplas doses. As partículas de rAAV e suas composições farmacêuticas podem ser embaladas em formas de dosagem unitária única ou múltipla para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.
[326] As doses de uma “quantidade eficaz” ou “quantidade suficiente” para o tratamento (por exemplo, para melhorar ou fornecer um benefício terapêutico ou melhoria) normalmente são eficazes para fornecer uma resposta a um, vários ou todos os sintomas adversos, consequências ou complicações da doença, um ou mais sintomas adversos, distúrbios, doenças, patologias ou complicações, por exemplo, causadas por ou associadas à doença, em uma extensão mensurável, embora diminuindo, reduzindo, inibindo, suprimindo, limitando ou controlando a progressão ou o agravamento da doença é um desfecho satisfatório.
[327] Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente pode, mas não precisa ser fornecida em uma única administração, pode exigir várias administrações e, pode mas não precisa ser, administrada sozinha ou em combinação com outra composição (por exemplo, agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico. Por exemplo, a quantidade pode ser aumentada proporcionalmente conforme indicado pela necessidade do indivíduo, tipo, estado e gravidade da doença tratada ou efeitos colaterais (se houver) do tratamento. Além disso, uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente não precisa ser eficaz ou suficiente se dada em doses únicas ou múltiplas sem uma segunda composição (por exemplo, outro medicamento ou agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico, uma vez que doses, quantidades ou duração adicionais acima e além dessas doses, ou composições adicionais (por exemplo, drogas ou agentes), tratamentos, protocolos ou regimes terapêuticos podem ser incluídos a fim de serem considerados eficazes ou suficientes em um determinado indivíduo. As quantidades consideradas eficazes também incluem quantidades que resultam em uma redução do uso de outro tratamento, regime terapêutico ou protocolo, como a administração de ácido nucleico modificado codificando GAA para o tratamento de uma deficiência de GAA (por exemplo, doença de Pompe) ou outra doença de armazenamento de glicogênio.
[328] Por conseguinte, os métodos e usos da invenção também incluem, entre outras coisas, métodos e usos que resultam em uma necessidade reduzida ou uso de outro composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo ou remédio. Por exemplo, para deficiência de GAA, um método ou uso da invenção tem um benefício terapêutico se em um determinado indivíduo uma dose menos frequente ou reduzida ou eliminação da administração de uma GAA recombinante para suplementar o GAA deficiente ou defeituoso no indivíduo. Assim, de acordo com a invenção, métodos e usos para reduzir a necessidade ou uso de outro tratamento ou terapia são fornecidos.
[329] Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente não precisa ser eficaz em cada um dos indivíduos tratados, nem na maioria dos indivíduos tratados em um determinado grupo ou população. Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente significa eficácia ou suficiência em um determinado assunto, não um grupo ou a população em geral. Como é típico para tais métodos, alguns indivíduos exibirão uma resposta maior, ou menos ou nenhuma resposta a um determinado método de tratamento ou uso.
[330] A administração ou entrega in vivo a um indivíduo pode ser realizada antes do desenvolvimento de um sintoma adverso, condição, complicação, etc., causado por ou associado à doença. Por exemplo, uma tela (por exemplo, genética) pode ser usada para identificar tais indivíduos como candidatos para composições, métodos e usos da invenção. Tais indivíduos, portanto, incluem aqueles selecionados como positivos para uma quantidade insuficiente ou uma deficiência em um produto gênico funcional (por exemplo, GAA ou uma deficiência de proteína que leva a uma GSD), ou que produzem um produto gênico aberrante, parcialmente funcional ou não funcional (por exemplo, GAA ou uma proteína implicada em uma GSD).
[331] A administração ou entrega in vivo a um indivíduo de acordo com os métodos e usos da invenção, conforme divulgado neste documento, pode ser praticada em 1 - 2, 2 - 4, 4 - 12, 12 - 24 ou 24 - 72 horas após um indivíduo foi identificado como tendo a doença direcionada para tratamento, tem um ou mais sintomas da doença ou foi rastreado e é identificado como positivo conforme estabelecido neste documento, embora o indivíduo não tenha um ou mais sintomas da doença. Logicamente, os métodos e usos da invenção podem ser praticados 1 -
7, 7 - 14, 14 - 24, 24 - 48, 48 - 64 ou mais dias, meses ou anos após um indivíduo ter sido identificado como tendo a doença direcionada para tratamento, tem um ou mais sintomas da doença, ou foi rastreado e é identificado como positivo conforme estabelecido neste documento.
[332] O termo “melhorar” significa uma melhoria detectável ou mensurável na doença de um indivíduo ou sintoma da mesma, ou uma resposta celular subjacente. Uma melhora detectável ou mensurável inclui uma diminuição subjetiva ou objetiva, redução, inibição, supressão, limite ou controle na ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração da doença, ou complicação causada por ou associada à doença, ou uma melhora em um sintoma ou uma causa subjacente ou consequência da doença, ou uma reversão da doença.
[333] Para a Doença de Pompe, uma quantidade eficaz seria uma quantidade que inibe ou reduz a produção de glicogénio ou acumulação, intensifica ou aumenta a degradação de glicogénio ou a remoção, por exemplo. Uma quantidade eficaz também seria uma quantidade que melhora ou ameniza a dificuldade em comer e/ou não ganhar peso; controle deficiente de cabeça e/ou pescoço; problemas respiratórios e/ou infecções pulmonares; coração dilatado e/ou espessado; defeitos cardíacos; língua aumentada; dificuldade em engolir; fígado aumentado; força muscular fraca; tônus muscular fraco; fraqueza nas pernas, cintura e/ou braços; falta de ar; dificuldade de exercício; dificuldade em respirar durante o sono; curvatura da coluna; e/ou juntas rígidas; tônus muscular fraco e/ou falta de força muscular. Uma quantidade eficaz também seria uma quantidade que diminui ou inibe um ou mais sintomas, ou previne ou reduz a progressão ou piora de um ou mais sintomas, ou estabiliza um ou mais sintomas, ou melhora um ou mais sintomas em um paciente ou indivíduo em necessidade de GAA ou com doença de Pompe.
[334] As doses terapêuticas irão depender, entre outros fatores, da idade e condição geral do indivíduo, da gravidade da doença ou distúrbio. Uma quantidade terapeuticamente eficaz em humanos cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada por um médico com base na resposta de um paciente individual.
[335] As composições, tais como as composições farmacêuticas, podem ser entregues a um indivíduo, de modo a permitir a produção da proteína codificada. Em uma modalidade particular, as composições farmacêuticas compreendem material genético suficiente para permitir que um receptor produza uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína no indivíduo.
[336] As composições podem ser formuladas e/ou administradas em qualquer veículo farmacêutico biocompatível estéril, incluindo, mas não se limitando a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser formuladas e/ou administradas a um paciente sozinhas ou em combinação com outros agentes (por exemplo, cofatores) que influenciam a hemostasia.
[337] Os métodos e usos da invenção incluem entrega e administração sistemicamente, regionalmente ou localmente, ou por qualquer via, por exemplo, por injeção ou infusão. A entrega das composições farmacêuticas in vivo pode geralmente ser realizada por meio de injeção usando uma seringa convencional, embora outros métodos de entrega, como a entrega intensificada por convecção, sejam previstos (ver, por exemplo, Patente US No. 5.720.720). Por exemplo, as composições podem ser distribuídas por via subcutânea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intraorbital, intramucosa, intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intrapleural, intra-arterial, intracavitária, oral, intra-hepática, por meio da veia porta ou intramuscular. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas. Um clínico especializado no tratamento de pacientes com Pompe ou outra doença de armazenamento de glicogênio pode determinar a rota ideal para a administração dos vetores associados a adenovirais com base em vários critérios, incluindo, mas não se limitando a: a condição do paciente e a finalidade do tratamento (por exemplo, níveis aumentados ou reduzidos de GAA).
[338] As composições podem ser administradas isoladamente. Em determinadas modalidades, uma partícula de rAAV fornece um efeito terapêutico sem um agente imunossupressor. O efeito terapêutico é opcionalmente sustentado por um período de tempo, por exemplo, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25- 30 ou 30- 50 dias ou mais, por exemplo, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 dias ou mais sem administração de um agente imunossupressor. Consequentemente, um efeito terapêutico é fornecido por um período de tempo.
[339] Os vetores, métodos e usos do rAAV da invenção podem ser combinados com qualquer composto, agente, fármaco, tratamento ou outro regime ou protocolo terapêutico tendo uma atividade ou efeito terapêutico, benéfico, aditivo, sinérgico ou complementar desejado. Composições e tratamentos de combinação exemplificativos incluem segundos ativos, tais como, biológicos (proteínas), agentes (por exemplo, agentes imunossupressores) e drogas. Esses produtos biológicos (proteínas), agentes, drogas, tratamentos e terapias podem ser administrados ou realizados antes de, substancialmente ao mesmo tempo ou após qualquer outro método ou uso da invenção.
[340] O composto, agente, fármaco, tratamento ou outro regime ou protocolo terapêutico pode ser administrado como uma composição de combinação ou administrado separadamente, tal como simultaneamente ou em série ou sequencialmente (antes ou após) entrega ou administração de um ácido nucleico, vetor ou partícula de rAAV. A invenção, portanto, fornece combinações em que um método ou uso da invenção está em uma combinação com qualquer composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição, aqui estabelecido ou conhecido por um versado na técnica. O composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição pode ser administrado ou realizado antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um ácido nucleico, vetor ou partícula de rAAV da invenção, a um indivíduo.
[341] Em determinadas modalidades, ácido nucleico, vetor ou partícula de rAAV da invenção é administrado a um paciente em combinação com um agente imunossupressor ou regime em que o paciente tem ou está em risco de desenvolver uma resposta imune contra a partícula de rAAV e/ou a proteína GAA. Tal agente imunossupressor ou regime pode ser administrado antes,
substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um ácido nucleico, vetor ou vetor de rAAV da invenção
[342] Em algumas modalidades, um indivíduo ou paciente, tal como um paciente humano, com doença de Pompe desenvolveu inibidores para a proteína GAA (incluindo anticorpos anti-GAA e/ou células T anti-GAA), que podem ocorrer após tratamento com terapia de reposição enzimática tradicional (por exemplo, após administração de proteína GAA produzida de forma recombinante). O desenvolvimento de tais inibidores de GAA pode ocorrer em pacientes que recebem terapia de reposição enzimática, particularmente quando o paciente tem níveis indetectáveis de GAA (como pode ser o caso na doença de Pompe infantil), levando o sistema imunológico do paciente a ver a proteína GAA de reposição como “estrangeiro”. Em determinadas modalidades, um paciente Pompe com inibidores de GAA é administrado a um ou mais regimes destinados a atingir tolerância imunológica ou mitigar a resposta imunológica à proteína GAA no paciente, antes de, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um vetor rAAV da invenção. Tais regimes para alcançar tolerância imunológica ou mitigar a resposta imunológica à proteína GAA podem incluir a administração de um ou mais agentes imunossupressores, incluindo, mas não se limitando a metotrexato, rituximabe, gamaglobulina intravenosa (IVIG), omalizumabe e partícula de vacina
TM sintética (SVP )-rapamicina (rapamicina encapsulada em uma nanopartícula biodegradável) e/ou administração de um ou mais protocolos ou procedimentos imunossupressores, como depleção de células B, imunoadsorção e plasmaférese.
[343] Em determinadas modalidades, o vetor rAAV é administrado em conjunto com um ou mais agentes imunossupressores antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um vetor rAAV. Em determinadas modalidades, por exemplo, 1-12, 12-24 ou 24-48 horas, ou 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25 -30, 30-50, ou mais de 50 dias após a administração do vetor rAAV. Tal administração de agentes imunossupressores após um período de tempo após a administração do vetor rAAV se houver uma diminuição na proteína codificada ou ácido nucleico inibitório após os níveis de expressão iniciais por um período de tempo, por exemplo, 20-25, 25-30, 30 -50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 ou mais de 200 dias após o vetor rAAV.
[344] Em determinadas modalidades, um agente imunossupressor é um agente anti-inflamatório. Em determinadas modalidades, um agente imunossupressor é um esteroide, por exemplo, um corticosteroide. Em determinadas modalidades, um agente imunossupressor é prednisona, prednisolona, ciclosporina (por exemplo, ciclosporina A), micofenolato, um anticorpo direcionado a células B, por exemplo, rituximabe; um inibidor de proteassoma, por exemplo, bortezomibe; um inibidor de rapamicina-alvo de mamífero (mTOR), por exemplo, rapamicina; um inibidor da tirosina quinase, por exemplo, ibrutinibe; um inibidor do fator de ativação de células B (BAFF); ou um inibidor de um ligante indutor de proliferação (APRIL) ou um derivado do mesmo. Em determinadas modalidades, o agente imunossupressor é um agente anti-IL-1 β (por exemplo, anticorpo monoclonal anti-IL-1β canacinumabe (Ilaris®)) ou um agente anti-IL-6 (por exemplo, anticorpo anti-IL-6 sirukumabe ou anticorpo receptor anti-IL-6 tocilizumabe (Actemra®)), ou uma combinação dos mesmos.
[345] Os protocolos de imunossupressão, incluindo o uso de rapamicina, sozinha ou em combinação com IL-10, pode ser utilizada para diminuir, reduzir, inibir, impedir ou bloquear as respostas imunitárias humorais e celulares contra a proteína GAA. A transferência de genes hepáticos com vetores AAV da invenção pode ser usada para induzir tolerância imunológica à proteína GAA através da indução de células T reguladoras (Tregs) e outros mecanismos. As estratégias para reduzir (superar) ou evitar a imunidade humoral ao AAV na transferência sistêmica de genes incluem a administração de altas doses de vetor, o uso de cápsides vazias de AAV como iscas para adsorver anticorpos anti-AAV, a administração de drogas imunossupressoras para diminuir, reduzir, inibir, prevenir ou erradicar a resposta imune humoral ao AAV, alterando o sorotipo do capsídeo do AAV ou projetando o capsídeo do AAV para ser menos suscetível a anticorpos neutralizantes, uso de ciclos de troca de plasma para adsorver imunoglobulinas anti- AAV, reduzindo assim o título de anticorpos anti-AAV, e uso de técnicas de entrega,
como cateteres de balão seguidos de lavagem com solução salina. Tais estratégias são descritas em Mingozzi et al., 2013, Blood, 122:23 a 36. Procedimentos e abordagens para induzir tolerância ao GAA em pacientes com Pompe, a fim de melhorar o tratamento terapêutico, são revisados em Doerfler et al., 2016, Mol. Ther., 3:15053.
[346] A razão de capsídeos vazios de AAV para o vetor rAAV pode estar dentro ou entre cerca de 100:1-50:1, de cerca de 50:1-25:1, de cerca de 25:1- 10:1, de cerca de 10:1-1:1, de cerca de 1:1-1:10, de cerca de 1:10-1:25, de cerca de 1:25-1:50 ou de cerca de 1:50-1:100. As razões também podem ser cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
[347] As quantidades de capsídeos vazios de AAV para administrar podem ser calibradas com base na quantidade (título) de anticorpos de AAV produzidos em um determinado indivíduo. Os capsídeos vazios de AAV podem ser de qualquer sorotipo, por exemplo, AAV (SEQ ID NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO:33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B ou AAV-2i8.
[348] Em alternativa, ou em adição a, vetor de rAAV pode ser administrado por injeção intramuscular direta (por exemplo, uma ou mais fibras musculares de contração lenta de). Em outra alternativa, um cateter introduzido na artéria femoral pode ser usado para entregar vetores rAAV ao fígado através da artéria hepática. Meios não cirúrgicos também podem ser empregados, tais como colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE), para entregar vetores rAAV diretamente ao fígado, desviando assim a corrente sanguínea e os anticorpos AAV. Outros sistemas ductais, como os dutos da glândula submandibular, também podem ser usados como portais para a entrega de vetores rAAV em um indivíduo que desenvolve ou tem anticorpos anti-AAV preexistentes.
[349] Estratégias adicionais para reduzir a imunidade humoral a AAV incluem métodos para remover, esgotar, capturar e/ou inativar anticorpos AAV, comumente referidos como aférese e mais particularmente, plasmaférese onde produtos sanguíneos estão envolvidos. Aférese ou plasmaférese, é um processo no qual o plasma de um indivíduo humano é circulado ex vivo (extracorporal) por meio de um dispositivo que modifica o plasma por meio da adição, remoção e/ou substituição de componentes antes de seu retorno ao paciente. A plasmaférese pode ser usada para remover imunoglobulinas humanas (por exemplo, IgG, IgE, IgA, IgD) de um produto sanguíneo (por exemplo, plasma). Esse procedimento esgota, captura, inativa, reduz ou remove imunoglobulinas (anticorpos) que se ligam a AAV, reduzindo assim o título de anticorpos AAV no indivíduo tratado que pode contribuir para a neutralização do vetor AAV. Um exemplo é um dispositivo composto de uma coluna de matriz de afinidade de capsídeo de AAV. A passagem do produto sanguíneo (por exemplo, plasma) através de uma matriz de afinidade do capsídeo AAV resultaria na ligação apenas de anticorpos AAV e de todos os isotipos (incluindo IgG, IgM, etc.).
[350] Prevê-se que uma quantidade suficiente de plasmaférese usando uma matriz de afinidade do capsídeo de AAV remova substancialmente os anticorpos do capsídeo de AAV e reduza o título (carga) de anticorpos do capsídeo de AAV no ser humano. Em determinadas modalidades, o título em um indivíduo tratado é reduzido substancialmente para níveis baixos (para <1:5, ou menos, como <1:4, ou <1:3, ou <1:2, ou <1:1). Uma redução no título de anticorpos será temporária porque os linfócitos B que produzem os anticorpos da cápside de AAV deveriam fazer com que o título de anticorpos do capsídeo de AAV gradativamente retornasse ao nível de estado estacionário antes da plasmaférese.
[351] No caso em que um título de anticorpo de AAV preexistente foi reduzido de 1:100 a 1:1, o título de anticorpo de AAV repercute de aproximadamente 0,15% (correspondendo a um título de 1:1,2) 0,43% (1:1,4), 0,9% (1:1,9), 1,7% (1:2,7) e 3,4% (1:4,4), ocorre em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas, respectivamente, após a conclusão do método de plasmaférese. A remoção temporária de anticorpos AAV de tal indivíduo corresponderia a uma janela de tempo (por exemplo, de cerca de 24 horas ou menos, tal como 12 horas ou menos, ou 6 horas ou menos, ou 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos, ou 1 hora ou menos) durante a qual um vetor AAV poderia ser administrado ao indivíduo e previsto para transduzir eficientemente os tecidos-alvo sem neutralização substancial do vetor AAV com os anticorpos AAV.
[352] No caso em que um título de anticorpo de AAV preexistente foi reduzido de 1:1.000 a 1:1, o título de anticorpo de AAV repercute de aproximadamente 0,15% (correspondendo a um título de 1:2,5) 0,4% (1:5,3), 0,9% (1:9,7), 1,7% (1:18) e 3,4% (1:35), ocorre em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas, respectivamente, após a conclusão do método de plasmaférese. Assim, uma janela para administração do vetor AAV será comparativamente mais curta.
[353] Os anticorpos AAV podem ser preexistentes e podem estar presentes em níveis que reduzem ou bloqueiam a transdução de vetor de transferência de gene GAA terapêutico de células-alvo. Alternativamente, os anticorpos AAV podem se desenvolver após exposição a AAV ou administração de um vetor AAV. Se tais anticorpos se desenvolverem após a administração de um vetor AAV, esses indivíduos também podem ser tratados por aférese, mais particularmente, plasmaférese.
[354] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, cassetes de expressão e vetores AAV da invenção podem ser usados em combinação com terapias sintomáticas e de suporte, incluindo, por exemplo, suporte respiratório (incluindo ventilação mecânica), fisioterapia para fortalecer os músculos, fisioterapia para melhorar a força e capacidade física, terapia ocupacional, incluindo o uso de bengalas, andadores e cadeiras de rodas, terapia da fala para melhorar a articulação e a fala, uso de dispositivos ortopédicos, incluindo suspensórios, e terapia dietética e tubos de alimentação para garantir nutrição adequada e ganho de peso.
[355] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, cassetes de expressão e vetores AAV da invenção podem ser usados em combinação com terapia farmacológica de acompanhantes (também conhecida como terapia de intensificação de enzima), onde uma ou mais chaperonas farmacológicas são administradas antes, concomitantemente com, ou após a administração do ácido nucleico, cassete de expressão ou vetores AAV da invenção, para o tratamento de uma GSD, tal como doença de Pompe.
[356] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, cassetes de expressão de vetores de AAV e da invenção podem ser utilizados em combinação com um ou mais farmacológico acompanhante, que podem estabilizar a proteína GAA. As chaperonas farmacológicas que podem ser usadas em combinação com os ácidos nucleicos, cassete de expressão e vetores AAV da invenção incluem 1- desoxinojirimicina (1-DNJ, também conhecido como duvoglustat), N-butil-1- desoxinojirimicina (também conhecido como miglustat), N-metil-DNJ, N-etil-DNJ, N- propil-DNJ, N-pentil-DNJ, N-hexil-DNJ, N-heptil-DNJ, N-octil-DNJ, N-nonil-DNJ, N- metilciclopropil-DNJ, N-metilciclopentil-DNJ, N-2-hidroxietil-DNJ, 5-N-carboxipentil- DNJ e acompanhantes farmacológicos descritos nas patentes US 6.599.919 e
9.181.184, e na publicação do pedido de patente internacional WO/2013/182652.
[357] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, cassete de expressão e vetores AAV da invenção podem ser usados em combinação com terapia adjuvante, com um ou mais agonistas β2, incluindo, por exemplo, clenbuterol, albuterol, formoterol e salmeterol, e conforme descrito na publicação do pedido de patente internacional WO/2017/049161.
[358] Em modalidades particulares, os ácidos nucleicos, e cassetes de expressão da invenção são entregues ou administrados por meio de partículas de vetor de AAV. Em outras modalidades, os ácidos nucleicos e cassete de expressão da invenção podem ser entregues ou administrados por meio de outros tipos de partículas virais, incluindo retroviral, adenoviral, adenoviral dependente de auxiliar, adenoviral híbrido, vírus herpes simplex, lentiviral, poxvírus, vírus Epstein-Barr, vírus vaccinia e partículas de citomegalovírus humano.
[359] Em outras modalidades, os ácidos nucleicos e cassetes de expressão da invenção são entregues ou administrados com um sistema de entrega n viral. Os sistemas de entrega não viral incluem, por exemplo, métodos químicos, tais como lipossomas, nanopartículas, nanopartículas de lipídios, polímeros, micropartículas, microcápsulas, micelas ou vesículas extracelulares e métodos físicos, como arma de genes, eletroporação, bombardeio de partículas, utilização de ultrassom e magnetofecção.
[360] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos e cassetes de expressão da invenção são apresentadas como DNA nu, minicírculos, transpósons, de DNA duplex linear de extremidade fechada.
[361] Em outras modalidades, os ácidos nucleicos, e cassetes de expressão da invenção são entregues ou administrados em partículas de vetor de AAV, ou de outras partículas virais, que são adicionalmente encapsuladas ou complexados com lipossomas, nanopartículas, nanopartículas de lipídios, polímeros, micropartículas, microcápsulas, micelas ou vesículas extracelulares.
[362] Uma “nanopartícula de lipídio” ou “LNP” refere-se a uma vesícula à base de lipídio útil para a entrega de AAV e tendo dimensões na escala nano, isto é, de cerca de 10 nm a cerca de 1000 nm, ou de cerca de 50 a cerca de 500 nm, ou de cerca de 75 a cerca de 127 nm. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que o LNP forneça o ácido nucleico, cassete de expressão ou vetor AAV com proteção parcial ou completa do sistema imunológico. A blindagem permite a entrega do ácido nucleico, cassete de expressão ou vetor AAV a um tecido ou célula, evitando a indução de uma resposta imune substancial contra o ácido nucleico, cassete de expressão ou vetor AAV in vivo. A blindagem também pode permitir a administração repetida sem induzir uma resposta imune substancial contra o ácido nucleico, vetor de expressão ou vetor AAV in vivo (por exemplo, em um indivíduo como um ser humano). A blindagem também pode melhorar ou aumentar a eficiência de entrega de ácido nucleico, cassete de expressão ou vetor AAV in vivo.
[363] O pI (ponto isoelétrico) de AAV está em uma faixa de cerca de 6 a cerca de 6,5. Portanto, a superfície do AAV carrega uma leve carga negativa. Como tal, pode ser benéfico para o LNP compreender um lipídio catiônico tal como, por exemplo, um amino lipídio. Os amino lipídios exemplificativos foram descritos nas patentes nos US 9.352.042, 9.220.683, 9.186.325, 9.139.554, 9.126.966
9.018.187, 8.999.351, 8.722.082, 8.642.076, 8.569.256, 8.466.122 e 7.745.651 e nas Publicações das Patentes US 2016/0785 0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411 e 2010/0117125.
[364] Os termos “lipídio catiônico” e “amino lipídio” são usados indistintamente aqui para incluir aqueles lipídios e seus sais tendo um, dois, três ou mais ácidos graxos ou cadeias de alquil graxo e um grupo amino titulável por pH (por exemplo, um grupo alquilamino ou dialquilamino). O lipídio catiônico é tipicamente protonado (isto é, carregado positivamente) a um pH abaixo do pKa do lipídio catiônico e é substancialmente neutro a um pH acima do pKa. Os lipídios catiônicos também podem ser lipídios catiônicos tituláveis. Em algumas modalidades, os lipídios catiônicos compreendem: um grupo amina terciária protonável (por exemplo, titulável por pH); cadeias C18 alquila, em que cada cadeia alquila independente tem 0 a 3 (por exemplo, 0, 1, 2 ou 3) ligações duplas; e ligações éter, éster ou cetal entre o grupo principal e as cadeias alquil.
[365] Os lipídios catiônicos podem incluir, sem limitação, 1,2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N- dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-di-γ-linoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (γ- DLenDMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA, também conhecido como DLin-C2K-DMA, XTC2 e C2K), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), dilinoleilmetil-3- dimetilaminopropionato (DLin-M-C2-DMA, também conhecido como MC2), (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato (DLin-M- C3-DMA, também conhecido como MC3), sais dos mesmos e suas misturas. Outros lipídios catiônicos também incluem, mas não estão limitados a, 1,2-disteariloxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminobutil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA), DLen-C2K- DMA, γ-DLen-C2K-DMA e (DLin-MP-DMA) (também conhecido como 1-B11).
[366] Ainda outros lipídios catiônicos podem incluir, sem limitação, 2,2- dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N- metilpepiazino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3- dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleoxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleoxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-
DMA), 1-linoleoil-2linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto de 1,2- dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N- dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), cloreto de N,N-dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), cloreto de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), brometo de N,N-distearil-N,N-dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3- dioleoiloxi)propil)-N,N,N-amônio (DOTAP), 3-(N-(N′,N′-dimetilaminoetano)- carbamoil)colesterol (DC-Chol), brometo de amônio de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)- N,N-dimetil-N-hidroxietila (DMRIE), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina- carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanamínio (DOSPA), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis- 9,12-octadecadienoxi) propano (CLinDMA), 2- [5′-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3′- oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis, cis-9′, 1-2′-octadecadienoxi) propano (CpLinDMA), N,N- dimetil-3,4-dioleiloxibenzilamina (DMOBA), 1,2-N, N′-dioleilcarbamil-3- dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1,2-N, N′-dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano (DLincarbDAP), dexametasona-esperimina (DS) e espermina dissubstituída (D2S) ou suas misturas.
[367] Uma série de preparações comerciais de lipídios catiônicos podem ser usadas, tais como, LIPOFECTIN® (incluindo DOTMA e DOPE, disponível na GIBCO/BRL) e LIPOFECTAMINE® (compreendendo DOSPA e DOPE, disponível na GIBCO/BRL).
[368] Em determinadas modalidades, os lipídios catiônicos podem estar presentes em uma quantidade de cerca de 10% em peso do LNP a cerca de 85% em peso da nanopartícula de lipídio, ou de cerca de 50% em peso do LNP a cerca de 75% em peso do LNP.
[369] Os esteróis podem conferir fluidez ao LNP. Tal como aqui utilizado, “esterol” refere-se a qualquer esterol natural de origem vegetal (fitosteróis) ou animal (zoosteróis), bem como esteróis sintéticos não naturais, todos caracterizados pela presença de um grupo hidroxila na posição 3 do anel A de esteroide. O esterol pode ser qualquer esterol convencionalmente usado no campo da preparação de lipossomas, vesículas lipídicas ou partículas lipídicas, mais comumente colesterol. Os fitoesteróis podem incluir campesterol, sitosterol e estigmasterol. Os esteróis também incluem lipídios modificados com esterol, tais como os descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0177156. Em algumas modalidades, um esterol pode estar presente em uma quantidade de cerca de 5% em peso do LNP a cerca de 50% em peso da nanopartícula de lipídio ou de cerca de 10% em peso do LNP a cerca de 25% em peso do LNP.
[370] LNP pode compreender um lípido neutro. Os lipídios neutros podem compreender qualquer espécie de lípido que exista em uma forma zwitteriônica neutra ou não carregada em pH fisiológico. Esses lipídios incluem, sem limitação, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, di-hidroesfingomielina, cefalina e cerebrosídeos. A seleção de lipídios neutros é geralmente guiada, entre outros, pela consideração do tamanho da partícula e da estabilidade necessária. Em algumas modalidades, o componente lipídico neutro pode ser um lipídio com dois grupos acila (por exemplo, diacilfosfatidilcolina e diacilfosfatidiletanolamina).
[371] Os lipídios com uma variedade de grupos de cadeia de acila de comprimento de cadeia e grau de saturação variáveis estão disponíveis ou podem ser isolados ou sintetizados por técnicas bem conhecidas. Em algumas modalidades, podem ser usados lipídios contendo ácidos graxos saturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C14 a C22. Em outro grupo de modalidades, são usados lipídios com ácidos graxos mono ou diinsaturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C14 a C22. Além disso, podem ser usados lipídios com misturas de cadeias de ácidos graxos saturadas e insaturadas. Os lipídios neutros exemplificadores incluem, sem limitação, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidil-etanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1- palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) ou qualquer fosfatidilcolina relacionada. Os lipídios neutros também podem ser compostos de esfingomielina,
diidroesfingomielina ou fosfolipídios com outros grupos de cabeça, como serina e inositol.
[372] Em algumas modalidades, o lipídio neutro pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,1% em peso da nanopartícula de lipídio a cerca de 75% em peso do LNP, ou de cerca de 5% em peso do LNP a cerca de 15% por peso do LNP.
[373] Os ácidos nucleicos encapsulados em LNP, cassetes de expressão e vetor AAV podem ser incorporados em composições farmacêuticas, por exemplo, um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Essas composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e entrega de ácidos encapsulados em LNP, cassetes de expressão e vetor AAV a um indivíduo in vivo ou ex vivo.
[374] As preparações de LNP podem ser combinadas com componentes adicionais. Exemplos não limitativos incluem polietilenoglicol (PEG) e esteróis.
[375] O termo “PEG” refere-se a um polietilenoglicol, um polímero linear solúvel em água de unidades de repetição de etileno PEG com dois grupos hidroxila terminais. Os PEGs são classificados por seus pesos moleculares; por exemplo, PEG 2.000 tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons e PEG 5.000 tem um peso molecular médio de cerca de 5.000 daltons. Os PEGs estão comercialmente disponíveis na Sigma Chemical Co. e outras empresas e incluem, por exemplo, os seguintes PEGs funcionais: monometoxipolietilenoglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenoglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenoglicol-succinimidil succinato (MePEG-S -NHS), monometoxipolietilenoglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenoglicol- tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietilenoglicol-imidazolil-carbonil (MePEG- IM).
[376] Em algumas modalidades, o PEG pode ser um polietileno glicol com um peso molecular médio de cerca de 550 a cerca de 10.000 dalton e é opcionalmente substituído por alquila, alcóxi, acila ou arila. Em algumas modalidades, o PEG pode ser substituído por metila na posição hidroxila terminal. Em outra modalidade preferencial, o PEG pode ter um peso molecular médio de cerca de 750 a cerca de 5.000 daltons, ou de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 daltons, ou de cerca de 1.500 a cerca de 3.000 daltons ou de cerca de 2.000 daltons ou de cerca de 750 daltons. O PEG pode ser opcionalmente substituído por alquila, alcóxi, acila ou arila. Em algumas modalidades, o grupo hidroxila terminal pode ser substituído por um grupo metóxi ou metila.
[377] Os lipídios modificados com PEG incluem os conjugados de PEG-dialquiloxipropila (PEG-DAA) descritos nas Patentes nos US 8.936.942 e
7.803.397. Os lipídios modificados por PEG (ou conjugados de lipídio-polioxietileno) que são úteis podem ter uma variedade de porções de lipídios de “ancoragem” para fixar a porção de PEG à superfície da vesícula lipídica. Exemplos de lipídios modificados por PEG adequados incluem fosfatidiletanolamina modificada por PEG e ácido fosfatídico, conjugados de PEG-ceramida (por exemplo, PEG-CerC14 ou PEG-CerC20) que são descritos na Patente nº US 5.820.873, dialquilaminas modificadas por PEG e modificados por PEG 1,2-diaciloxipropan-3-aminas. Em algumas modalidades, o lipídio modificado por PEG pode ser diacilglicerois e dialquilglicerois modificados por PEG. Em algumas modalidades, o PEG pode estar em uma quantidade de cerca de 0,5% em peso do LNP a cerca de 20% em peso do LNP, ou de cerca de 5% em peso do LNP a cerca de 15% em peso do LNP.
[378] Além disso, LNP pode ser um PEG-modificado e um LNP modificado por esterol. Os LNPs, combinados com componentes adicionais, podem ser os mesmos ou LNPs separados. Em outras palavras, o mesmo LNP pode ser modificado com PEG e modificado com esterol ou, alternativamente, um primeiro LNP pode ser modificado com PEG e um segundo LNP pode ser modificado com esterol. Opcionalmente, o primeiro e o segundo LNPs modificados podem ser combinados.
[379] Em algumas modalidades, antes do encapsulamento, os LNPs podem ter um tamanho na faixa de cerca de 10 nm a 500 nm, ou de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm, ou de 75 nm a cerca de 125 nm. Em algumas modalidades, o ácido nucleico encapsulado em LNP, vetor de expressão ou vetor AAV pode ter um tamanho em uma faixa de cerca de 10 nm a 500 nm.
[380] As células recombinantes capazes de expressar as sequências de GAA da invenção podem ser utilizadas para a entrega ou administração.
[381] O DNA nu tal como minicírculos e transpósons pode ser utilizado para a administração ou entrega ou vetores lentivirais. Além disso, tecnologias de edição de genes, como nucleases de dedo de zinco, meganucleases, TALENs e CRISPR também podem ser usadas para entregar a sequência de codificação da invenção.
[382] A doença de armazenamento de glicogênio (GSD) resulta da ausência de uma enzima que converte os compostos de glicogênio em glicose. A deficiência enzimática resulta no acúmulo de glicogênio nos tecidos. Em muitos casos, o defeito tem consequências sistêmicas, mas, em alguns casos, o defeito é limitado a tecidos específicos. A maioria dos pacientes apresenta sintomas musculares, como fraqueza e cãibras, embora certas GSDs se manifestem como síndromes específicas, como convulsões hipoglicêmicas ou cardiomegalia.
[383] Os seguintes são exemplos não limitativos de GSDs: 0 - Deficiência de glicogênio sintase; Ia - Deficiência de glicose-6-fosfatase (doença de von Gierke); II - deficiência de maltase ácida (doença de Pompe); III - deficiência da enzima de desramificação (doença de Forbes-Cori); IV - deficiência de transglicosidase (doença de Andersen, amilopectinose); V - deficiência de miofosforilase (doença de McArdle); VI - Deficiência de Fosforilase (Doença de Hers); e VII - deficiência de fosfofrutocinase (doença de Tarui).
[384] Várias formas de GSD afetam as vias metabólicas dos carboidratos. Embora pelo menos 14 GSDs únicas sejam discutidas na literatura, as 4 que causam fraqueza muscular clinicamente significativa são doença de Pompe (GSD tipo II, deficiência de maltase ácida), doença de Cori (GSD tipo IIIa, deficiência de enzima de desramificação), doença de McArdle (GSD tipo V, deficiência de miofosforilase) e doença de Tarui (GSD tipo VII, deficiência de fosfofrutocinase). Uma forma, a doença de Von Gierke (GSD tipo Ia, deficiência de glicose-6-
fosfatase), causa doença de órgão-alvo clinicamente significativa com morbidade significativa.
[385] Em geral, GSDs são herdadas como condições autossômicas recessivas. Esses defeitos enzimáticos hereditários geralmente se apresentam na infância, embora alguns, como a doença de McArdle e a doença de Pompe, tenham formas separadas de início na idade adulta.
[386] As GSDs podem ser tratadas por terapia de substituição enzimática (ERT), por exemplo, com GAA produzida de forma recombinante. A terapia de reposição enzimática é um tratamento aprovado para todos os pacientes com a doença de Pompe. Ela envolve a administração intravenosa de α-glicosidase ácida humana recombinante. Esse tratamento, fabricado pela Genzyme, Sanofi Corporation, é Lumizyme (comercializado como Myozyme fora dos Estados Unidos) e foi aprovado pela primeira vez pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA em 2006. Foi aprovado para todos os pacientes com doença de Pompe. Os benefícios da ERT podem ser atenuados pela formação de anticorpos, portanto, a ERT também pode ser combinada com a expressão imune.
[387] As GSDs podem ser tratadas por terapia de dieta, que envolve a aderência meticulosa para um regime dietético, pode reduzir o tamanho do fígado, prevenir a hipoglicemia, permitir a redução nos sintomas e permitir o crescimento e desenvolvimento.
[388] O tratamento adicional de Doença de Pompe é sintomático e de suporte. Pode ser necessário suporte respiratório, pois a maioria dos pacientes apresenta algum grau de comprometimento respiratório e/ou insuficiência respiratória. A fisioterapia pode ser útil para fortalecer os músculos respiratórios. Alguns pacientes podem precisar de assistência respiratória por meio de ventilação mecânica (isto é, ventiladores bipap ou de volume) durante a noite e/ou períodos do dia. Além disso, pode ser necessário suporte adicional durante infecções do trato respiratório. O suporte da ventilação mecânica pode ser por meio de técnicas não invasivas ou invasivas. A decisão sobre a duração do suporte respiratório é melhor tomada pela família em consulta cuidadosa com os médicos do paciente e outros membros da equipe de saúde, com base nas especificações do paciente. Uma dieta rica em proteínas pode ser benéfica na forma não infantil de Pompe.
[389] A fisioterapia é recomendada para melhorar a força e capacidade física. A terapia ocupacional, incluindo o uso de bengalas ou andadores, pode ser necessária. Eventualmente, alguns indivíduos podem exigir o uso de uma cadeira de rodas. A terapia da fala pode ser benéfica para melhorar a articulação e a fala de alguns pacientes.
[390] Os dispositivos ortopédicos incluindo aparelho ortopédico podem ser recomendados para alguns pacientes. A cirurgia pode ser necessária para certos sintomas ortopédicos, como contraturas ou deformidade da coluna vertebral.
[391] Visto que a doença de Pompe pode enfraquecer músculos usados para mastigar e engolir, podem ser necessárias medidas para garantir nutrição adequada e ganho de peso. Alguns pacientes podem precisar de dietas especializadas de alto teor calórico e aprender técnicas para alterar o tamanho e a textura dos alimentos para diminuir o risco de aspiração. Alguns bebês podem exigir a inserção de um tubo de alimentação que passa pelo nariz, desce pelo esôfago e chega ao estômago (tubo nasogástrico). Em algumas crianças, pode ser necessário inserir um tubo de alimentação diretamente no estômago por meio de uma pequena abertura cirúrgica na parede abdominal. Alguns indivíduos com a doença de Pompe com início tardio podem requerer uma dieta leve, mas poucos requerem tubos de alimentação.
[392] Os indivíduos podem ser testados para uma ou mais enzimas hepáticas para uma resposta adversa ao tratamento ou para determinar se tais indivíduos, pré-tratamento, são apropriados para o tratamento de acordo com um método da invenção. Os indivíduos candidatos podem, portanto, ser rastreados para quantidades de uma ou mais enzimas hepáticas antes ou após o tratamento de acordo com um método da invenção. Os indivíduos tratados podem ser monitorados após o tratamento para enzimas hepáticas elevadas, periodicamente, por exemplo, a cada 1-4 semanas, 1-6 meses, 6-12 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos.
[393] As enzimas hepáticas exemplificadoras incluem alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e lactato desidrogenase (LDH), mas outras enzimas indicativas de dano hepático também podem ser monitoradas. Um nível normal dessas enzimas na circulação é normalmente definido como uma faixa que tem um nível superior, acima do qual o nível da enzima é considerado elevado e, portanto, indicativo de lesão hepática. Um intervalo normal depende em parte dos padrões usados pelo laboratório clínico que realiza o ensaio.
[394] A invenção fornece kits com material de embalagem e um ou mais componentes nele. Um kit inclui tipicamente um rótulo ou folheto informativo incluindo uma descrição dos componentes ou instruções para uso in vitro, in vivo ou ex vivo dos componentes nele contidos. Um kit pode conter uma coleção de tais componentes, por exemplo, uma partícula de rAAV e, opcionalmente, um segundo ativo, como outro composto, agente, fármaco ou composição.
[395] Um kit se refere a uma estrutura física que aloja um ou mais componentes do kit. O material de embalagem pode manter os componentes esterilizados e pode ser feito de material comumente usado para tais fins (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, papel alumínio, ampolas, frascos, tubos, etc.).
[396] As etiquetas ou encartes podem incluir informações de identificação de um ou mais componentes neles, quantidades de dose, farmacologia clínica do (s) ingrediente (s) ativo (s), incluindo mecanismo de ação, farmacocinética e farmacodinâmica. As etiquetas ou encartes podem incluir informações que identificam o fabricante, números de lote, local e data de fabricação, datas de validade. As etiquetas ou encartes podem incluir informações que identificam informações do fabricante, números de lote, localização e data do fabricante. As etiquetas ou encartes podem incluir informações sobre uma doença para a qual um componente do kit pode ser usado. As etiquetas ou encartes podem incluir instruções para o clínico ou indivíduo para usar um ou mais dos componentes do kit em um método, uso ou protocolo de tratamento ou regime terapêutico. As instruções podem incluir quantidades de dosagem, frequência ou duração e instruções para a prática de qualquer um dos métodos, usos, protocolos de tratamento ou regimes profiláticos ou terapêuticos aqui descritos.
[397] As etiquetas ou encartes podem incluir informações sobre qualquer benefício que um componente pode fornecer, como um benefício profilático ou terapêutico. Etiquetas ou encartes podem incluir informações sobre potenciais efeitos colaterais adversos, complicações ou reações, como advertências ao indivíduo ou ao médico sobre situações em que não seria apropriado usar uma determinada composição. Efeitos colaterais adversos ou complicações também podem ocorrer quando o indivíduo tem, estará ou está tomando atualmente um ou mais outros medicamentos que podem ser incompatíveis com a composição, ou o indivíduo tem, estará ou está atualmente passando por outro protocolo de tratamento ou regime terapêutico que seria incompatível com a composição e, portanto, as instruções poderiam incluir informações sobre tais incompatibilidades.
[398] As etiquetas ou encartes incluem “material impresso”, por exemplo, papel ou papelão, ou separado ou afixado a um componente, um kit ou material de embalagem (por exemplo, uma caixa), ou anexado a uma ampola, tubo ou frasco contendo um kit componente. As etiquetas ou encartes podem incluir adicionalmente um meio legível por computador, como uma etiqueta impressa com código de barras, um disco, disco óptico, como CD ou DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética ou uma mídia de armazenamento elétrico, como RAM e ROM ou híbridos desses, como mídia de armazenamento magnético/óptico, mídia FLASH ou cartões de tipo de memória.
[399] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos neste documento.
[400] Todas as patentes, pedidos de patentes, publicações e outras referências, citações do GenBank e citações da ATCC aqui citadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá.
[401] Todas as características divulgadas neste documento podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica divulgada na especificação pode ser substituída por uma característica alternativa servindo a um mesmo propósito equivalente ou semelhante. Assim, a menos que expressamente indicado de outra forma, as características divulgadas (por exemplo, ácidos nucleicos modificados que codificam GAA, cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos modificados que codificam GAA e partículas de rAAV compreendendo os ácidos nucleicos modificados que codificam GAA) são um exemplo de um gênero de equivalente ou semelhante características.
[402] Conforme usado neste documento, as formas singulares “um/uma”, “e” e “o/a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um ácido nucleico” inclui uma pluralidade de tais ácidos nucleicos, a referência a “um vetor” inclui uma pluralidade de tais vetores e a referência a “um vírus” ou “partícula” inclui uma pluralidade de tais vírus/partículas.
[403] Conforme usado neste documento, todos os valores numéricos ou intervalos numéricos incluem inteiros dentro de tais intervalos e frações dos valores ou os inteiros dentro de intervalos, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a 86% ou mais identidade inclui 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% etc., bem como 86,1%, 86,2%, 86,3%, 86,4%, 86,5%, etc., 87,1%, 88,2%, 88,3%, 88,4%, 88,5%, etc., e assim por diante.
[404] Referência a um número inteiro com mais (maior) ou menor que inclui qualquer número maior ou menor que o número de referência, respectivamente. Assim, por exemplo, uma referência a menos de 127 inclui 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111, 110, etc., até zero (0); e menos de 10, inclui 9, 8, 7, etc., até zero (0).
[405] Tal como aqui utilizado, todos os valores ou intervalos numéricos incluem subfaixas e frações dos valores e números inteiros dentro de tais faixas e subfaixas e o 1 errado, bem como o arquivo ok, graças às frações dos inteiros dentro de tais faixas, a menos que o contexto claramente indique o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a um intervalo numérico, como 1-10 inclui 1 - 2, 1 - 3, 1 - 4, 1 - 5, 1 - 6, 1 - 7, 1 - 8, 1 - 9, 2 - 3, 2 - 4, 2 - 5, 2 - 6, 2 - 7, 2 - 8, 2 - 9, 2 - 10, 3 - 4, 3 - 5, 3 - 6, 3 - 7, 3 - 8, 3 - 9, 3 - 10, etc.; e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc. e assim por diante. A referência a um intervalo de 1-50, portanto, inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., até e incluindo 50, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, etc., e assim por diante.
[406] A referência a uma série de intervalos inclui intervalos que combinam os valores dos limites de diferentes intervalos dentro da série. Assim, para ilustrar a referência a uma série de intervalos, por exemplo, de 1-10, 10-20, 20- 30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300- 400, 400-500, 500-750, 750-850, inclui intervalos de 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1- 60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50- 150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100- 400, 100-500, 150-250, 150- 300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500, etc.
[407] A invenção é geralmente divulgada neste documento usando linguagem afirmativa para descrever as inúmeras modalidades e aspectos. A invenção também inclui especificamente modalidades nas quais um determinado assunto é excluído, no todo ou em parte, como substâncias ou materiais, etapas e condições do método, protocolos ou procedimentos. Por exemplo, em certas modalidades ou aspectos da invenção, materiais e/ou etapas do método são excluídos. Assim, embora a invenção geralmente não seja expressa neste documento em termos do que a invenção não inclui aspectos que não estão expressamente excluídos na invenção, são divulgados neste documento.
[408] Uma série de modalidades da invenção foram descritas. No entanto, um especialista na técnica, sem se afastar do espírito e escopo da invenção, pode fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Consequentemente, os seguintes exemplos pretendem ilustrar, mas não limitar o âmbito da invenção reivindicada de qualquer forma. EXEMPLO 1 Tabela 1 - Visão geral do Cassete de expressão de GAA Empacotado Variante Cassete de expressão (SEQ ID SEQ ID Sinal BGH em vetor otimizada NOs:16-24) NO PoliA (SEQ ID de códon NOs:30-32) pAAV- CpG 16 GAA13 SPK-AAV-01 ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH reduzido CpG pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH 17 GAA13 SPK-AAV-02 reduzido CpG pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH 18 GAA7 SPK-AAV-03 reduzido CpG pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH 19 GAA8 SPK-AAV-04 reduzido pAAV-ApoE/hAAT.GAA2.wtBGH 20 GAA2 wtBGH SPK-AAV-05 pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH 21 GAA5 wtBGH SPK-AAV-06 pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH 22 GAA7 wtBGH SPK-AAV-07 pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH 23 GAA8 wtBGH SPK-AAV-08 pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH 24 GAA13 wtBGH SPK-AAV-09 CpG pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH 17 GAA13 SPK-AAV-10 * reduzido *SPK-AAV-10 é empacotado no capsídeo AAV6 e todos os outros são empacotados na variante do capsídeo AAV-4-1, descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional WO 2016/210170.
[409] Os cassetes de expressão de GAA são mostrados nas Figuras 1 a 9. Todos contêm repetições terminais de invertidas (ITRs) de AAV de flanqueamento de 5' e 3', uma sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT específica do fígado operacionalmente ligada a uma sequência de codificação GAA otimizada, incluindo um íntron de subunidade beta de hemoglobina humana (HBB2), seguido por uma sequência de poliadenilação (poli A) do hormônio de crescimento bovino reduzido a CpG (bGH) ou do tipo selvagem. SEQ ID NO:1: sequência de ácido nucleico para GAA2
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCA CCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAG GAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCC CCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGT GTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGC CCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACT GGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTA CTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGG AGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATG AAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATT CTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGAT GGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTT CCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGC ATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATA GGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACC TGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAAT GCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGG GGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCC AGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTG GGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGT GGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACC TGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGG ACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATG ATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTA TGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCC TGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCA CTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCT TTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCT GAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGT GGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCC TGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCA GCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGA AGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTG GAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACC TGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACAC CTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCA TGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTG AGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTG CCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGC CAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACC ACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGG CAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGA CTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAG GGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTG GACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCT GGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCT GACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAG CCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGG AACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCT GCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTG CTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGT GCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGT
GCTGA SEQ ID NO:2: sequência de ácido nucleico para GAA5
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTAC CTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGG AGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGC CCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCC CCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGT GAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTC AGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTAC AAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAG GACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGAT GATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGA GGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCC CTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCA GCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTG ATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGG CTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGT GGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCC CTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGA ATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGG AGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTC TGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACT GGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACC AGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTG GAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGG CTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGT ACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACA GGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGG CAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCAC CAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACC AGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCA GGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTG CCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCA CCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGC CATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGA TTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGG GATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCA GTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGG GCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTAC CCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAG CTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATG CCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAG ACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACT GTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCA GGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACC TGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGC CCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCC CCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAG GGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGT GGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGG GAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGG CCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCT GGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGC AGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCA AGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGC
TGGTGCTGA SEQ ID NO:3: sequência de ácido nucleico para GAA7
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCAC CTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAG GAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCC CCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTG TGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCC CAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTG GAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCAC TCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGA GACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGA GGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTC TGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATG GCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTC CTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCAT CTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAG GGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCT GGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATG CTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGG GGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAG CAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGG GTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGG TGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTG GACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGAC TTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGAT TGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGA TGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGA TTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTG CCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTT GATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAG GATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGT GGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGA GCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCC ATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGC ACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAG CAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGC TGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCT GAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAG GAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCC TGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCC ACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGG CCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCA GCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAG GCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGT GCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAG CCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACAC CATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGC TGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACC AAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGG AGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAAC ACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCT GCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGC AATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGA
CATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA SEQ ID NO:4: sequência de ácido nucleico para GAA8
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCA CCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTC CTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCA GGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGA TGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGG AGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAG GGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTAT AAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAG GACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGAT GATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAG GTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCC TGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAG CTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGAC CAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGC TGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGT GGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCC TTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAA CAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGT CTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCT GTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGG GGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAG ACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGA ATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCT TTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTAC ATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAG GCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCC AGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCA ACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAG GTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGG GGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCC TGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCAC CAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCC ATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGAT CTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGG ATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAG TTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGG CAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATC CCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGC TTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGC CCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGA CTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACT GTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCA GGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACC TGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCC CCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCC TCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGG GCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGT GGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGG GAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGC CAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTG GCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCA GGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAA GGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCT
GGTGCTGA SEQ ID NO:5: sequência de ácido nucleico para GAA13
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCA CCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGA GGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGAT GCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGC CACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGT GTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGC CCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGC TGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACC ACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATG GAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTAT GAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTA TTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGG ATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGT TCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAG CATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAA CAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCT ACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGC AATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCAC TGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGG TGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGC CTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCA GGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATG ACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAG GGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATG ATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCT TATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCC CCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACC CCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTG CCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGG TCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGG GGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGT TTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTG CCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAG CAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATG TGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCA ACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAAC ACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTT CATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTC TGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGC TGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTG GCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGAC CACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTG GCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAG ACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCA GGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTG GACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCC TGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCT CTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGT CTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGG AACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCT GCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTC CTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAG GTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTG
GTGCTGA SEQ ID NO:6: sequência de ácido nucleico para GAA2 mais poliA BHG
WT ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCA CCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAG GAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCC CCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGT GTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGC CCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACT GGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTA CTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGG AGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATG AAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATT CTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGAT GGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTT CCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGC ATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATA GGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACC TGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAAT GCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGG GGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCC AGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTG GGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGT GGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACC TGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGG ACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATG ATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTA TGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCC TGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCA CTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCT TTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCT GAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGT GGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCC TGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCA GCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGA AGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTG GAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACC TGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACAC CTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCA TGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTG AGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTG CCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGC CAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACC ACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGG CAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGA CTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAG GGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTG GACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCT GGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCT GACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAG CCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGG AACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCT GCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTG CTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGT GCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGT GCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCT AGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAA GGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC
TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA SEQ ID NO:7: sequência de ácido nucleico para GAA5 mais poli A BHG
WT ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTAC CTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGG AGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGC CCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCC CCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGT GAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGG GGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTAC AAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAG GACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGAT GATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGA GGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCC CTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCA GCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTG ATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGG CTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGT GGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCC CTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGA ATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGG AGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTC TGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACT GGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACC AGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTG GAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGG CTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGT ACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACA GGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGG CAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCAC CAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACC AGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCA GGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTG CCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCA CCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGC CATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGA TTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGG GATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCA GTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGG GCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTAC CCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAG CTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATG CCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAG ACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACT GTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCA GGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACC TGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGC CCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCC CCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAG GGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGT GGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGG GAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGG CCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCT GGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGC AGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCA AGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGC TGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCC TTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCT GGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTA
GA SEQ ID NO:8: sequência de ácido nucleico para GAA7 mais poli A BHG
WT ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCAC CTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAG GAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCC CCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTG TGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCC CAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTG GAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCAC TCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGA GACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGA GGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTC TGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATG GCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTC CTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCAT CTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAG GGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCT GGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATG CTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGG GGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAG CAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGG GTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGG TGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTG GACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGAC TTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGAT TGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGA TGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGA TTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTG CCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTT GATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAG GATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGT GGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGA GCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCC ATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGC ACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAG CAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGC TGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCT GAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAG GAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCC TGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCC ACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGG CCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCA GCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAG GCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGT GCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAG CCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACAC CATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGC TGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACC AAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGG AGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAAC ACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCT GCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGT GCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGG TGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGG TGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTC TAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGA AGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGT
CTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA SEQ ID NO:9: sequência de ácido nucleico para GAA8 mais poli A BHG
WT ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCA CCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAG GAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCC TCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGT GTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGC TCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCT GGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCA CCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGG AGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATG AGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTAC TCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGA TGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTT CCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGC ACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAAC AGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTAC CTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAA TGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTG GGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTG CAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTG GGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGT GGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACC TGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGG ACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATG ATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTA TGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCC TGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCA CTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCC TTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCT GAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGT GGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCC TGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCA GCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGG AGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTG GAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACC TGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACC TCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATG AGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGA GCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGC CCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCC AGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCA TCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCA AGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACT GTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGG AGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGAC ACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGG GCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTG ACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCC TGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAAC AACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCA GCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTG AGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTG GATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTG ACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTG CCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAG
TAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA SEQ ID NO:10: sequência de ácido nucleico para GAA13 mais poli A
BHG WT ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCA CCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGA GGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGGCCAGCAGCGC AGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTG ATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGG AGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAG GGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTA CAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCA GGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCA TGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGA GGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCC CTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAG CTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGAC CAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGC TGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGT GGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCC TTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAA CAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGA GCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCT GTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTG GGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCA GGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGG AATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCT TCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTA CATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAG GCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCC AGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACC AACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCA GGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAG GGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGC CTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCAC CAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCC ATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGAT CAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGG ATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAG TTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGG CAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACC CCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTT TCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCC CTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACT GTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTG GACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGG CTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTG CAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCC CCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCT CTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGG CCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTG GCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGG AGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCC AGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGG CCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAG GTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAG GTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTG GTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTT CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGG AAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTG
TCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA SEQ ID NO:11: sequência de ácido nucleico para GAA2 mais poli A BGH reduzido a CpG
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCA CCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAG GAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCC CCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGT GTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGC CCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACT GGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTA CTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGG AGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATG AAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATT CTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGAT GGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTT CCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGC ATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATA GGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACC TGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAAT GCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGG GGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCC AGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTG GGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGT GGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACC TGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGG ACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATG ATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTA TGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCC TGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCA CTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCT TTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCT GAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGT GGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCC TGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCA GCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGA AGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTG GAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACC TGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACAC CTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCA TGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTG AGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTG CCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGC CAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACC ACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGG CAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGA CTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAG GGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTG GACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCT GGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCT GACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAG CCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGG CCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCT GGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGC AGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACC AAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAG CTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTA CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTT GACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGC ATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGG ACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGT
GGGCTCTATGG SEQ ID NO:12: sequência de ácido nucleico para GAA5 mais poli A BHG reduzida de CpG
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTAC CTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGG AGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGC CCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCC CCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGT GAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTC AGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGG AGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACT CCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGA GACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGA GGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACT CTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGAT GGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTC CTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCAC CTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAG GGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATC TGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAAT GCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGG GGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGC AGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTG GGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGT GGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACC TGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAG ACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATG ATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTAT GATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCC TGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTA CTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCC TTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCT GAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGT GGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCC TGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCA GCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGG AGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTG GTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCT GCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTT CTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATG AGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGA GCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTG CCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGC TAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCA CCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGG AAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGAC TGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGG GAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGA TACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTG GCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTG ACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCC TGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAAC AATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCA GCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTG AGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTG GATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTG AAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTC TAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGA AGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGT CTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTG
GGCTCTATGG SEQ ID NO:13: sequência de ácido nucleico para GAA7 mais poli A BHG reduzida de CpG
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCAC CTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAG GAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCC CCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTG TGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCC CAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTG GAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCAC TCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGA GACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGA GGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTC TGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATG GCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTC CTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCAT CTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAG GGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCT GGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATG CTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGG GGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAG CAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGG GTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGG TGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTG GACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGAC TTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGAT TGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGA TGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGA TTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTG CCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTT GATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAG GATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGT GGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGA GCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCC ATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGC ACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAG CAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGC TGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCT GAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAG GAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCC TGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCC ACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGG CCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCA GCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAG GCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGT GCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAG CCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACAC CATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGC TGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACC AAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGG AGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAAC ACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCT GCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGC AATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGA CATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAA GATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTA GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAG GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCT GAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGG
GAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG SEQ ID NO:14: sequência de ácido nucleico para GAA8 mais poli A BHG reduzida de CpG
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCA CCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAG GAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATG CCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCC TCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGG AGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAG GGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTAT AAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAG GACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGAT GATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAG GTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCC TGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAG CTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGAC CAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGC TGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGT GGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCC TTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAA CAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGT CTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCT GTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGG GGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAG ACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGA ATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCT TTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTAC ATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAG GCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCC AGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCA ACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAG GTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGG GGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCC TGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCAC CAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCC ATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGAT CTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGG ATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAG TTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGG CAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATC CCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGC TTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGC CCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGA CTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACT GTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCA GGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACC TGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCC CCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCC TCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGG GCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGT GGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGG GAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGC CAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTG GCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCA GGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAA GGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCT GGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACT GTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTG ACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCA TCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTG
GGCTCTATGG SEQ ID NO:15: sequência de ácido nucleico para GAA13 mais poli A BHG reduzida de CpG
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCA CCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGA GGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGAT GCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGC CACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGT GTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGC CCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGC TGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACC ACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATG GAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTAT GAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTA TTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGG ATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGT TCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAG CATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAA CAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCT ACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGC AATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCAC TGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGG TGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGC CTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCA GGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATG ACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAG GGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATG ATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCT TATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCC CCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACC CCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTG CCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGG TCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGG GGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGT TTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTG CCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAG CAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATG TGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCA ACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAAC ACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTT CATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTC TGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGC TGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTG GCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGAC CACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTG GCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAG ACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCA GGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTG GACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCC TGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCT CTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGT CTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCC AGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGG CCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAG GTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAG GTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTG GTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGT GCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGAC CCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATC ACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACA GCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGG
CTCTATGG > pAAV-ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH (SEQ ID NO:16)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTA GTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACC CCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACT GAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCA AACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGG TCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAA TTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAG GGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTG AGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCC ACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGA CTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGG GCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGC TCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTT GCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTC AGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATACCACTTTCACAATCTGC TAGCGTTTAAACGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGT TTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTA ACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAA TGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATC TCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAA AGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAAT ATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCT ACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATT CTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCC CACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAG CACGCGTGCCACCATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGG GGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGT GCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCT AGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTG ATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGG AGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAG GGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTA CAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCA GGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCA TGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGA GGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCC CTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAG CTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGAC CAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGC TGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGT GGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCC TTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAA CAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGA GCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCT GTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTG GGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCA GGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGG AATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCT TCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTA CATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAG GCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCC AGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACC AACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCA GGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAG GGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGC CTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCAC CAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCC ATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGAT CAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGG ATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAG TTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGG CAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACC CCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTT TCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCC CTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACT GTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTG GACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGG CTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTG CAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCC CCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCT CTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGG CCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTG GCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGG AGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCC AGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGG CCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAG GTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAG GTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTG GTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGT GCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGAC CCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATC ACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACA GCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGG CTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGG CCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTC GCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGG
GCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG > pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH (SEQ ID NO:17)
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GCGCGCAGCTGCCTGCAGG > pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH (SEQ ID NO:18)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTA GTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACC CCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACT GAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCA AACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGG TCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAA TTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAG GGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTG AGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCC ACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGA CTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGG GCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGC TCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTT GCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTC AGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAG GGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGT TCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGG TAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTT ATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAAT GTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAA GGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGT AAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATT TTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTA ATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCT CTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCTTTCCTGTG GCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCA GGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAG CAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGAC CCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGT GCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTA CATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGC TTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAG ATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGAT ATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTC ACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCAT GTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCC TTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCAC TGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCC CAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCA CCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGG GCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCT GCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCC CTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTT CCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCT ACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGC TACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCA TTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGG ATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGC TGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGC TCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGT GTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTC TACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACAT GGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAA TGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCT GGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCC ACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAAC CTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAG GGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGT ATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAG CTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGG CTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGG ACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAG CCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGA AGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCAC CAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCC CAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCC CTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTT CCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCA GCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGG CCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGG CTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGA CAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGG GGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGC CTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGT GAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTG GGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCA ACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGA TGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTG CAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTT TGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTT TCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTC TGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAG CAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCA GCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGG CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCA AAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAG
CGCGCAGCTGCCTGCAGG >pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH (SEQ ID NO:19)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTA GTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACC CCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACT GAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCA AACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGG TCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAA TTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAG GGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTG AGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCC ACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGA CTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGG GCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGC TCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTT GCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTC AGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAG GGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGT TCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGG TAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTT ATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAAT GTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAA GGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGT AAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATT TTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTA ATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCT CTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTCCTGT GGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCC AGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCA GCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAG GCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACT GTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTG CTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGT GCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTG AGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAG GACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCA CTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCC CCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAG GAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAA CACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAG CCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGC TGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACC CCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGG GGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGC TGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTG TACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTG GTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAG GTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCA GGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGC AGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTG CAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCAT CAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGA GGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGG CCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTG GGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGAT TGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCA ACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTG CAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAAC CTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGT GAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCC ATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAG CTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCT GGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTG TGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGC CTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGC TATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCC TGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTG GAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGG GGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTG GGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCT CTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTC TGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACC TGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAG AGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGG CCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAG AGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGA GCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACT GTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTG TGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCC TGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAA TTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCT GTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACT GTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATT CTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGA CAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAA GAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGA GTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAA AGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC
GCGCAGCTGCCTGCAGG >pAAV-ApoE/hAAT.GAA2. wtBGH (SEQ ID NO:20)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCC TCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGA ACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAA CAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTC AGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATT TCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGG GTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAG AGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCAC CCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTC CTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCA GCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCC TCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCC CCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCT TCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGT GAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCAT GTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAAT TTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCT TATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTAT CATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCA ATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGA GGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCT GGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCT TGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCT GCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCTTTCCTGTGGCT GCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGG AGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAGGAGACTCACCCTGCCCATCAGCAG GGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCA GGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCC CCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACAT TCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTC TTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATG GGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTACTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCC TGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACT ATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTG CACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTT GGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGT GGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCA GCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACC TCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATAGGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGC TAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGC CCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCT CTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTC CTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTA CCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGT ATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACT TCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATT TCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGC ATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCT GGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGT TTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTA CTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATG GTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAAT GAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCT GGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCC ACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAACCTGCACAAT CTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAG GGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGAAGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGT ATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAG CTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGG CTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGG ACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAG CCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGA AGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCAC CAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCC TAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCC CTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTT CCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCA GCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGG CCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTGGACACCATTAATGTGCATCTGAGGG CTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCTGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGG CAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGG GGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGC CTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGT GAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTG GGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCA ACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGA TGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAA TTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT TTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCT TTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATT CTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCA GGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCA CTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGG
CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG >pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH (SEQ ID NO:21)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCC TCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGA ACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAA CAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTC AGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATT TCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGG GTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAG AGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCAC CCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTC CTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCA GCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCC TCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCC CCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCT TCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGT GAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCAT GTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAAT TTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCT TATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTAT CATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCA ATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGA GGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCT GGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCT TGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCT GCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCTTTCCTGTGGCT GCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGG AACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAG GGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAA GGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCC CTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATC CCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTT CCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGG GCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCC TGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACC ATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGT GCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTT TGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTG TGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTA GCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACC TCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGC CAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTG CCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCC AGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTT CCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCT ACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGC TACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCA CTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGG ACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGC TGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCT TCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGT GTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCT CTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACA TGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGA ATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGC TGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGC CACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAA CCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTA GGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGG TATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTC TTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGG CTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGG ACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAG CCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGA AGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCAC CAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCC CAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCC CTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTT CCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGG AGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGG GCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGG GCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAG GCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGG GGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGG CCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGG TGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCT GGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGC AACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTG ATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGA ATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCC CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGG GGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAAC CCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAG GCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAG
TGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG >pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH (SEQ ID NO:22)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCC TCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGA ACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAA CAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTC AGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATT TCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGG GTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTG GTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTT GCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTT CCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCT GGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGG AACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACT GAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCC
TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG >pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH (SEQ ID NO:23)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCC TCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGA ACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAA CAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTC AGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATT TCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGG GTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAG AGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCAC CCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTC CTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCA GCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCC TCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCC CCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCT TCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGT GAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCAT GTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAAT TTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCT TATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTAT CATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCA ATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGA GGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCT GGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCT TGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCT GCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTCCTGTGGCT GCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGG AGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAG GGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCA GGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCC CCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATAT CCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTC TTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATG GGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATC CTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACT ATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGT GCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCT TTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACT GTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCC AGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCAC CAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGG CCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCT GCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCC CAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCT TTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGC TATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGG CTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCC ACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGG GACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAG CTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAG CTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGG GTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGG GAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGG ATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACA TGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAAT GAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGG CTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGC ATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAG GCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGG CAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGG CCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTG GGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAG GTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGC TGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGA GGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTC CACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTT TCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAG GCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTA CTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGG GCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAG GGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAG GGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCA GGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAG GGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGG GCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTG GTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCT GGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCT AACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTG ATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGA ATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCC CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGG GGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAAC CCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAG GCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAG
TGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG >pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH (SEQ ID NO:24)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCC TCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGA ACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAA CAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTC AGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATT TCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGT TGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACC GGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT TTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCT TTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATT CTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCA GGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCA CTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGG
CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO:25: sequência de aminoácidos para uma proteína GAA secretável
MAFLWLLSCWALLGTTFGLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGASRPGP RDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETE NRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLN TTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANL YGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEP KSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQ WNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSY RPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQV PFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLS THYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSW EQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSL LSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKD SSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPP AAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALT KGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKV
TVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC SEQ ID NO:26: sequência de ácido nucleico de poli A BGH reduzida de CpG
AGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGT GCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGAC CCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATC ACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCA GGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCA
GTGGGCTCTATGG SEQ ID NO:27: sequência de ácido nucleico poli A BGH wt
AGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTG CCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAG
TAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA SEQ ID NO:28: sequência ApoE/hAAT limitada por locais de restrição ApaI (sublinhado).
GGGCCC ATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAG AGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGC TACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAA GTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACAC AGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTG GAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTC AGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGAC CTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTT
AAATACGGACGAGGACA GGGCCC SEQ ID NO:29: sequência ApoE/hAAT.
ATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAG GAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGG ATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGC CAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCT TGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAG TGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGG GCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTG GGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCC
ACTGCTTAAATACGGACGAGGACA Capsídeos do vetor AAV:
VP1 (SEQ ID NO:30)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVL PGYKYLGPFNGLD KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDT SFGGNLGRAVFQ AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAK KRLNFGQTGDS ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSG NWHCDSTWLGDRV ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNR FHCHFSPRDWQ RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEY QLPYVLGSA HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRT GNNFEFSYNFED VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAG PNNMSAQAKNW LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMA THKDDEERFFPSS GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQ QNAAPIVGAVNS QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPP QILIKNTPVPADP PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKS TNVDFAVNTE
GTYSEPRPIGTRYLTRNL VP2 (SEQ ID NO:31)
TAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPD PQPIGEPPAGPS GLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITT STRTWALPTYNNHL YKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFK LFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPF PADVFMIPQ YGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHS SYAHSQSLDRLM NPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPC YRQQRVSTTLSQ NNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMF GKQGAGKDNVDY SSVMLTSEEEIKTTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALP GMVWQNRDVYLQ GPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQA KLASFITQYS TGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEP RPIGTRYLTRN
L VP3 (SEQ ID NO:32)
MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWA LPTYNNHLYKQISN GTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFR PKRLNFKLFNIQV KEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVF MIPQYGYLTL NNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQ SLDRLMNPLIDQ YLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQR VSTTLSQNNNSNF AWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGA GKDNVDYSSVMLT SEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQN RDVYLQGPIWAK IPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFIT QYSTGQVSV EIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTR
YLTRNL LK03-AAV VP1 (SEQ ID NO:33)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVL PGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQE RLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSS GVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPM ADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSG ASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKL SFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPAD VFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSS YAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNW LPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEE KFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNT APTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPP PQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYT
SNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL EXEMPLO 2 Projeto do estudo - Potência in vitro (células Huh7)
[410] Para avaliar a potência dos cassetes de expressão de GAA, 200 ng de DNA plasmídeo correspondente a cada um dos cassetes foram transfectados para uma linha celular de carcinoma hepatocelular humano (Huh7) usando Lipofectamine® 2000 (ThermoFisher). Após 48 horas de incubação, amostras de meio de cultura de células transfectadas com plasmídeos contendo cada cassete de expressão foram avaliadas quanto aos níveis de GAA por ensaio de atividade de
GAA e normalizadas para o teor de proteína intracelular. Resultados
[411] A Figura 10 mostra a avaliação de diferentes plasmídeos de expressão GAA in vitro em células Huh7 através do ensaio de atividade de GAA. Os resultados são a média das repetições biológicas n = 3. As barras de erro representam o desvio padrão.
[412] Com a exceção de GAA5.wtBGH, todos os plasmídeos demonstraram aumento dos níveis de expressão de GAA secretada em comparação com um plasmídeo de controle de proteína fluorescente verde (GFP), o que indica que esses plasmídeos resultaram na expressão do produto proteico de GAA (Figura 10). Em geral, os plasmídeos “BGH” (abrigando uma sequência de poli A reduzida de CpG) superaram os plasmídeos “wtBGH” (com uma poli A bGH de tipo selvagem). Além disso, as sequências com códon otimizado GAA2, GAA7, GAA 8 e GAA13 pareceram ser relativamente semelhantes, com uma tendência para maior expressão de plasmídeos GAA13. Uma diminuição geral nos níveis de expressão foi observada quando comparada com o plasmídeo parental spΔGAApar. EXEMPLO 3 Projeto de estudo - Potência do cassete por injeção hidrodinâmica em camundongos
[413] Para avaliar a potência de diferentes cassetes de expressão de GAA em mamíferos, 25 microgramas de DNA de plasmídeo correspondente para cada cassete foram introduzidas em camundongos macho C57BL/6 (com aproximadamente 8 semanas de idade) por via intravenosa na veia lateral da cauda através de injeção hidrodinâmica. O plasma foi coletado 72 horas após a injeção e avaliado quanto à presença da enzima GAA circulante por ensaio de atividade de GAA e Western blot. Resultados
[414] As Figuras 11 e 12 mostram a avaliação de diferentes cassetes de expressão de GAA por injeção hidrodinâmica em camundongos macho C57BL/6 por ensaio de atividade de GAA e Western blot, respectivamente, no plasma. Para a
Figura 11, os níveis plasmáticos de GAA são normalizados para o construto parental (spΔGAApar). Os resultados são a média das repetições biológicas n = 4-5. As barras de erro representam o desvio padrão. NS, não significativo. *p <0,05, **p <0,01.
[415] Para a Figura 12, a análise de plasma por western blot de GAA, o gráfico de barras representa a quantificação da banda superior normalizada para a banda inferior não específica. Cada uma das réplicas biológicas (n = 4-5 por grupo) é mostrada.
[416] A avaliação de cassetes de expressão de GAA otimizados por códons em camundongos por injeção hidrodinâmica revelou que esses cassetes eram capazes de expressão e secreção do produto transgene GAA do fígado de camundongo, com níveis semelhantes aos observados com o construto GAA parental, spΔGAApar (Figura 11). Como nos estudos in vitro em células Huh7 (Exemplo 2), o cassete de expressão de GAA abrigando a sequência de poli A BHG reduzida de CpG superou aqueles com uma poli A BGH de tipo selvagem. Inesperadamente, em comparação com os resultados do Exemplo 2, alguns dos construtos de GAA com códon otimizado tiveram um desempenho tão bom ou melhor do que o plasmídeo parental spΔGAApar. EXEMPLO 4 Projeto de estudo - Potência vetorial em camundongos
[417] Para avaliar a potência dos cassetes GAA com códons otimizados da invenção em comparação com a cassete parental spΔGAApar, spΔGAApar e 9 cassetes com códons otimizados foram empacotados em um vetor AAV compreendendo capsídeos de SEQ ID NOs:30-32 (Tabela 1). Cinco camundongos machos C57BL/6 por grupo foram injetados por via intravenosa através da veia da cauda com 1 de 2 doses de vetor (5x1011 vg/kg ou 2x1012 vg/kg). A atividade circulante de GAA foi medida longitudinalmente após a administração do vetor AAV aos camundongos. O plasma foi testado duas vezes por semana para a atividade de GAA. No dia 70, 7 dos 10 grupos de animais de teste foram sacrificados e os três grupos restantes (SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 e o vetor parental) foram sacrificados no dia 147. Resultados
[418] A Figura 13 mostra a avaliação de diferentes cassetes de expressão de GAA otimizados para códons empacotados no vetor AAV (SEQ ID NOs:30-32) em camundongos C57BL/6 machos por ensaio de atividade de GAA no plasma 70 dias após a infusão do vetor. Os resultados são a média das repetições biológicas n = 4-5. As barras de erro representam o desvio padrão. NS, não significativo. * p <0,05, ** p <0,01.
[419] Dois vetores, SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02, mostraram consistentemente uma atividade de GAA significativamente maior no plasma (aproximadamente 2 a 3 vezes maior na dose alta) quando comparados ao vetor parental (designado aqui como SPK-AAV-11).
[420] A Figura 14 mostra a avaliação de diferentes cassetes de expressão de GAA otimizados por códons empacotados no vetor AAV (SEQ ID NOs:30-32) em camundongos C57BL/6 machos por Western blot GAA no plasma 7 dias após a infusão do vetor. Os resultados são a média das repetições biológicas n = 4-5. As barras de erro representam o desvio padrão. NS, não é significativo. * p <0,05, ** p <0,01.
[421] A Figura 15 mostra os níveis de atividade de GAA medidos no plasma após a administração de cassete de expressão de GAA com códon otimizado empacotado no vetor AAV (SEQ ID NOs:30-32) para camundongos. Camundongos machos C57BL/6 foram injetados com uma dose de 5x1011 (painel superior) ou 2x1012 vg/kg (painel inferior) de qualquer um dos dois vetores AAV (SEQ ID NOs:30-32) expressando GAA de melhor desempenho (n = 5 animais/grupo). A atividade de GAA medida no plasma de camundongos que receberam o vetor SPK-AAV-11 (construto spΔGAApar parental) é mostrada para comparação. Começando no dia 42, a atividade de GAA no plasma foi significativamente maior para os vetores SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02 do que para o vetor SPK-AAV-11 (***p = <0,001, ****p = < 0,0001 Teste de comparações múltiplas de Tukey).
EXEMPLO 5 Projeto do Estudo - Potência em camundongos
[422] O objetivo deste estudo foi avaliar a potência de SPK-AAV-02 em duas linhagens de camundongos diferentes. A atividade de GAA circulante foi medida no plasma após a administração do vetor a camundongos Wistar Hanover (n = 4) e Sprague Dawley (n = 5). Camundongos machos foram injetados por via intravenosa através da veia da cauda com 2x1013 vg/kg de vetor. Resultados
[423] A Figura 16 mostra a avaliação do vetor SPK-AAV-02 (pAAV- ApoE/hAAT.GAA13.BGH empacotado em AAV (SEQ ID NOs:30-32)) vetor em camundongos machos Wistar Hanover e Sprague Dawley em comparação com camundongos C57BL/6 por ensaio de atividade de GAA no plasma. Os resultados são a média das repetições biológicas n = 4-5. As barras de erro representam o desvio padrão.
[424] Os níveis de atividade de GAA iniciados ao patamar ao dia 28, com atividade de GAA medido em torno de 15.000 nmol/h/ml. Os camundongos foram injetados com SPK-AAV-02 em uma dose 10 vezes menor (2x1012 vg/kg de vetor) do que os camundongos. EXEMPLO 6 Projeto do estudo - Potência em primatas não humanos (NHPs), parte 1
[425] Para avaliar os efeitos de longo prazo da expressão de GAA secretável, uma única dose de vetor SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 ou SPK-AAV-10 foi administrada a uma espécie filogeneticamente próxima ao humano, macacos rhesus (Macaca mulatta), e os animais foram avaliados quanto aos níveis de atividade de GAA no plasma.
[426] Macacos rhesus machos (n = 3/coorte de dose) receberam uma infusão IV de 30 minutos na veia safena de uma dose única de 6x1012 vg/kg de SPK- AAV-01, SPK-AAV-02 ou SPK- Vetor AAV-10. Após a administração do vetor AAV, os animais foram monitorados diariamente para observações clínicas e o sangue foi coletado semanalmente.
Resultados 12
[427] Os macacos rhesus foram injetados com uma dose de 6x10 vg/kg de vetores AAV expressando GAA (SEQ ID NOs:30-32) (n = 3 animais/grupo). A Figura 17 mostra os níveis de atividade de GAA medidos no plasma após a administração de cassete de expressão GAA empacotada no vetor AAV (SEQ ID NOs:30-32) para macacos rhesus machos. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os níveis de atividade de GAA no plasma de NHPs injetados com vetor SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 e SPK-AAV-10.
[428] Os dados preliminares do estudo confirmam NHP os resultados observados nos estudos com ratos, e mostram que os níveis de atividade de GAA no plasma resultantes da administração de SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02 são semelhantes (Figura 17). EXEMPLO 7 Projeto do estudo - Potência em primatas não humanos, parte 2
[429] O principal objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de transdução de AAV-SPK-01 e SPK-AAV-02 em macacos verdes africanos (AGM; Chlorocebus sabaeus). AGM masculino (n = 4/coorte de dose) recebeu uma infusão IV de 30 minutos na veia safena de uma dose única de 6x1012 vg/kg de SPK-AAV-01 ou vetor SPK-AAV-02. Após a administração do vetor AAV, os animais foram monitorados diariamente para observações clínicas e o sangue foi coletado semanalmente. Resultados
[430] Os dados preliminares em macacos verdes africanos confirmam os resultados observados em estudos com camundongos que os níveis de atividade de GAA no plasma resultantes da administração de SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02 são semelhantes (Figura 18). EXEMPLO 8 Conclusões
[431] Os cassetes de GAA com códons otimizados que expressam GAA humano secretável representam uma melhoria significativa sobre o construto spΔGAApar parental. Em particular, SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02 exibem excelente potência e expressão de GAA humano secretável em cultura de células, roedores e dois modelos de primatas não humanos. EXEMPLO 9 Projeto do Estudo - Variação de Dose em NHPs
[432] Para avaliar a resposta à dose da expressão de GAA secretável, três doses de vetor SPK-AAV-02 foram administradas a uma espécie de primata filogeneticamente próxima a humanos, macacos rhesus (Macaca mulatta) e animais foram avaliados quanto aos níveis de atividade de GAA durante o curso de um mês.
[433] Os macacos rhesus machos (n = 4/coorte de dose) receberam uma infusão intravenosa de 30 minutos (IV) na veia safena de uma dose de 2x1012, 6x1012, 2x10 13 vg/kg de vetor SPK-AAV-02. Macacos rhesus fêmeas (n = 4/coorte de dose) receberam uma infusão IV de 30 minutos na veia safena de uma dose de 2x1013 vg/kg de vetor SPK-AAV-02. Após a administração do vetor AAV, os animais foram monitorados diariamente para observações clínicas. O sangue foi coletado semanalmente durante 4 semanas para medir a atividade de GAA, níveis de antígeno GAA, formação de IgG anti-GAA, hematologia e química clínica, incluindo níveis de glicose para monitorar alterações potenciais da glicemia. Resultados
[434] A Figura 21 mostra os níveis de atividade de GAA medidos no plasma após a administração do vetor SPK-AAV-02 a macacos rhesus machos e fêmeas. Os resultados da atividade de GAA medida no plasma 7, 14, 21 e 28 dias após a injeção do vetor mostram uma correlação entre a dose do vetor e o nível de atividade do GAA no plasma. Os níveis de atividade de GAA no plasma de mulheres NHPs injetadas em uma dose de 2x1013 vg/kg foram cerca de 0,5 vez mais baixo (49,6%) do que aqueles medidos em homens NHPs injetados em uma dose igual.
[435] Os dados neste estudo de NHP confirmam os resultados observados nos estudos de camundongo, ou seja, que os níveis de atividade de GAA derivada do plasma a partir de vetores de AAV para a expressão de GAA secretável resultam em uma atividade de GAA dependente da dose no plasma após administração do vetor (Figura 21). Uma única infusão de SPK-AAV-02 em NHPs em três doses ascendentes demonstrou expressão dependente da dose de GAA no plasma NHP. EXEMPLO 10 Estudo de NHP de nove meses
[436] Cada um dos SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 e SPK-AAV-10 foram administrados a uma dose única (6x1012 vg/kg) através de infusão intravenosa a macacos rhesus machos (Macaca mulatta). Durante o curso do estudo, uma diminuição na proteína GAA ativa no plasma e aumento concomitante nos níveis de anticorpos IgG anti-GAA foi observada em uma porção de animais dosados com vetores que expressam GAA secretáveis. A perda da atividade de GAA e do nível de antígeno no plasma foi provavelmente devido ao desenvolvimento de uma depuração imune humoral mediada por IgG do produto de proteína transgene humana. Em um esforço para reduzir a resposta imune humoral e possivelmente recuperar os níveis de enzima GAA circulantes detectáveis, a partir do dia 183, certos animais receberam um regime de imunossupressão de rituximabe mensal em combinação com ciclosporina A diária. Resultados
[437] Os níveis de GAA secretado e ativo no plasma foram detectados em todos os animais, exibindo níveis de atividade média de pico no dia 15 de 482,07 ± 47,90, 664,43 ± 417,55 e 427,833 ± 307,94 nmol/ml/h para SPK-AAV-01, SPK - AAV-02 e SPK-AAV-10, respectivamente. Níveis detectáveis de antígeno GAA circulante foram observados com níveis médios de pico de 14,84 ± 2,21, 19,11 ± 23,23, 14,64 ± 16,96 ng/ml para animais administrados com SPK-AAV-01, SPK- AAV-02 e SPK-AAV-10, respectivamente. Concomitante com a diminuição observada no GAA circulante, a partir do dia 15, foi observado um aumento nos níveis de IgG anti-GAA circulante. A análise dos genomas do vetor, por qPCR do tecido hepático, confirmou a presença do vetor no fígado, exibindo cópias médias do genoma do vetor de 6,39 ± 2,72, 11,43 ± 4,23 e 19,01 ± 13,93 por genoma haploide, para animais administrados com SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 e SPK-AAV-10,
respectivamente.
[438] As amostras de fígado foram analisadas para os níveis de proteína GAA de comprimento total e GAA clivado (forma lisossomal). As amostras do estudo foram comparadas com amostras de fígado de Rhesus virgens de vetor servindo como controle negativo, que não exibiu níveis detectáveis de GAA clivado ou intacto nos níveis de proteína carregada (n=3). A quantidade de proteína de comprimento total no fígado do animal de estudo foi 4,0 ± 7,0, 5,4 ± 9,1, 11,0 ± 11,3 ng de GAA/mg de proteína total em animais administrados com SPK-AAV-01, SPK- AAV-02 e SPK-AAV- 10, respectivamente. Cada coorte continha níveis mais elevados de GAA clivado do que GAA de comprimento total, exibindo níveis de 41,6 ± 57,6, 44,4 ± 74,5, 49,0 ± 40,3 ng de GAA/mg de proteína total em animais administrados com SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 e SPK-AAV-10, respectivamente. Independentemente do processamento de GAA, as diferenças entre os grupos não foram significativas (P = 0,72 para a forma completa (intacta); P = 0,83 para a forma lisossomal (clivada) por Kruskal-Wallis). No final, todos os grupos administrados com vetores AAV da invenção exibiram níveis detectáveis médios de GAA acima da linha de base no fígado. Conclusão
[439] A administração de cada um de SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 e SPK-AAV-10 resultou em níveis plasmáticos detectáveis e crescentes de antígeno GAA, com pico ao longo das semanas 2-3 e correlacionando linearmente com a atividade de GAA, exibindo semelhantes cinética independentemente do genoma do vetor. Tanto a atividade de GAA quanto os níveis de antígeno de GAA no plasma diminuíram consecutivamente ao longo dos seguintes pontos de tempo em todos os animais, exceto um. Como observado anteriormente em NHPs tratados com vetores AAV, uma resposta humoral ao produto do transgene humano foi observada começando no dia 43, que se correlacionou inversamente com os níveis de antígeno GAA no plasma em todos os animais que desenvolveram uma resposta IgG específica para GAA. A supressão dos níveis de IgG anti-GAA, via administração de um agente imunossupressor direcionado à resposta IgG mediada por células B
(rituximabe), resultou em uma restauração dos níveis detectáveis de GAA no plasma em um subconjunto de animais. Para todos os grupos, as cópias do genoma do vetor foram detectáveis no fígado no final do estudo, mesmo na ausência de níveis plasmáticos circulantes mensuráveis de GAA. Correspondentemente, a proteína GAA foi detectada em todos os tecidos hepáticos tratados com vetor no final do estudo, enquanto o antígeno GAA estava abaixo do limite de detecção em tecido hepático não tratado. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que os vetores AAV da invenção são capazes de mediar a expressão durável de GAA humano secretável no fígado ao longo de 9 meses, independentemente do desenvolvimento de uma resposta de anticorpo ao produto transgene humano. EXEMPLO 11 Estudo de imunossupressão de roedores de nove semanas
[440] Os níveis de expressão do produto GAA transgene foram medidos por nove semanas após a administração intravenosa de uma dose única de 2x1012 vg/kg de SPK-AAV-02 partículas, na presença ou ausência de rapamicina e/ou prednisolona, em camundongos machos e fêmeas C57BL/6. Os camundongos foram testados em 5 grupos, conforme mostrado na Tabela 2. Tabela 2 - Designações de grupo e níveis de dose No. de animais SPK-AAV-02 Rapamicina Prednisolona Grupo Masculino Fêmea (vg/kg) (2-3 mg/kg) * (1-0,25 mg/kg) ** 1 5 5 Veículo 2 10 10 3 10 10 X 2x10 12 4 10 10 X 5 10 10 X X vg = genomas vetoriais, X = tratamento administrado *A rapamicina foi entregue diariamente na dose de 2 mg/kg do dia (-) 7 ao dia 5. A partir do dia 6, a entrega foi alterada para 3 mg/kg em dias alternados. **Prednisolona foi entregue a uma concentração de 1 mg/kg do dia (-) 1 ao dia 15, 0,5 mg/kg do dia 16 ao dia 22 e 0,25 mg/kg do dia 23 ao dia 28.
[441] Nos grupos que receberam agente (s) imunossupressor (es), agente (s) foram administrados antes da dosagem de AAV de partícula, e para as primeiras 5 semanas do estudo. Após a conclusão da dosagem de AAV, os animais foram monitorados para observações clínicas e peso corporal durante 9 semanas. No final do estudo, a química e a hematologia clínicas foram realizadas em amostras de sangue e a histopatologia foi realizada em tecidos selecionados. Os anticorpos IgG contra o capsídeo do rAAV e a atividade do GAA no plasma foram avaliados semanalmente ao longo do estudo. Resultados
[442] Os níveis de atividade de GAA no plasma foram detectados acima do fundo em todos os animais administrados com vetor. Os machos administrados com veículo no Grupo 1 mostraram níveis de fundo aproximadamente entre 300 a 400 nmol/ml/h. Os níveis circulantes de atividade de GAA aumentaram após a administração do vetor com cinética ligeiramente diferente dependendo do grupo de tratamento imunossupressor, mas exibiu níveis médios de pico equivalentes de atividade de GAA. Em particular, os níveis médios de pico de atividade de GAA foram 16114 ± 5411, 14875 ± 6882, 14890 ± 6882 e 21480 ± 6340 nmol/ml/h para homens no Grupo 2 (SPK-AAV-02 sozinho), Grupo 3 (SPK -AAV-02, 2-3 mg/kg de rapamicina), Grupo 4 (SPK-AAV-02, 1-0,25 mg/kg de prednisolona) e Grupo 5 (SPK-AAV-02, 2-3 mg/kg de rapamicina, 1-0,25 mg/kg de prednisolona), respectivamente. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos níveis de atividade de GAA EAK entre qualquer dos grupos de tratamento de AAV.
[443] Em camundongos fêmeas, os níveis médios de pico de atividade de GAA foram 7380 ± 4034, 5912 ± 3259, 6096 ± 3249 e 9955 ± 3104 nmol/ml/h para o Grupo 2, Grupo 3, Grupo 4 e Grupo 5, respectivamente. Estes níveis de atividade de GAA estavam significativamente acima do fundo detectado em fêmeas administradas com veículo. Como visto com os camundongos machos, os níveis de pico de atividade de GAA em camundongos fêmeas não foram estatisticamente significativamente diferentes entre qualquer um dos grupos de tratamento de AAV.
As diferenças observadas nos níveis plasmáticos de atividade de GAA entre machos e fêmeas são consistentes com o fenômeno bem documentado de transdução AAV diminuída de hepatócitos em camundongos fêmeas (Davidoff et al., 2003, Blood, 102:480-488; DOI:10.1182/blood-2002-09-2889).
[444] O capsídeo IgG anti-rAAV no plasma foi detectado em todos os animais administrados com SPK-AAV-02, exibindo níveis médios de pico de 86527 ± 92140, 6695 ± 3555, 64368 ± 29635 e 11374 ± 6053 ng/ml para machos no Grupo 2, Grupo 3, Grupo 4 e Grupo 5, respectivamente, e níveis médios de pico de 182009 ± 148148, 66141 ± 77925, 182654 ± 90161 e 57752 ± 59192 ng/ml para mulheres nos Grupos 2, 3, 4 e 5, respectivamente. Grupo 1 (veículo) para homens e mulheres tinha níveis de IgG de capsídeo anti-rAAV que estavam abaixo do limite quantitativo do ensaio para todos os pontos de tempo. Conclusão
[445] A administração de SPK-AAV-02 resultou em níveis de atividade de GAA detectáveis em todos os animais. O tratamento combinado com rapamicina e prednisolona fez com que os níveis de atividade de GAA aumentassem estatisticamente (versus vetor rAAV sozinho) nos dias 22, 36 e 42 em camundongos machos e no dia 43 em animais fêmeas. Digno de nota, a diferença nos níveis de pico de atividade de GAA, independentemente de quando a expressão máxima foi atingida, não foi estatisticamente significativa entre qualquer um dos grupos de tratamento de AAV dentro dos sexos.
[446] A resposta de uma IgG humoral induzida contra o capsídeo de rAAV foi observada em todos os grupos administrados SPK-AAV-02. Em ambos os sexos, a presença de rapamicina (Grupos 3 e 5) reduziu significativamente a formação de IgG anticapsídeo quando comparada ao vetor sozinho. O tratamento com prednisolona teve efeitos mais modestos na formação de IgG anticapsídeo, com redução significativa nos dias 15, 43 e 60 em homens e nos dias 43 e 60 em mulheres no Grupo 4.
[447] A imunossupressão com rapamicina e/ou prednisolona em camundongos resultou na diminuição das respostas humorais ao capsídeo do rAAV e não afetou significativamente os níveis de pico de atividade de GAA no plasma. EXEMPLO 12 Dose única de 4 semanas coadministrada com rapamicina no NHP
[448] Este estudo avaliou a atividade de GAA circulante (níveis de atividade de GAA no plasma) durante um período de quatro semanas após a administração de uma dose única de SPK-AAV-02 a 5,5x1013 vg/kg, na presença de rapamicina, em três macacos verdes africanos machos (Chlorocebus sabaeus).
[449] Os animais foram administrados com rapamicina (2 mg/kg por dia) começando 5 dias antes da dosagem de AAV, e continuando ao longo do estudo de quatro semanas. Uma dose única de 5,5x1013 vg/kg de SPK-AAV-02 foi administrada por via intravenosa pela veia safena. Após a conclusão da dosagem de AAV, os animais foram monitorados para observações clínicas e peso corporal durante 4 semanas. Na conclusão do estudo, a química clínica e a hematologia foram realizadas em amostras de sangue e a histopatologia foi realizada em tecidos selecionados. A atividade plasmática de GAA foi medida semanalmente ao longo do estudo. Resultados
[450] Os níveis de atividade de GAA no plasma estavam acima do fundo em todos os animais após a administração de SPK-AAV-02, com os níveis de atividade de pico para cada um dos três animais atingindo 1158,1, 711,9 e 623,8 nmol/ml/h, no ponto final medido (Tabela 3). Tabela 3 - Atividade de GAA no plasma para NHPs individuais administrados com rapamicina. Atividade de GAA no Plasma (nmol/ml/h) Número NHP Individual 1 2 3 Média ± SD Linha de 3,6 ± 1,4 2,1 4,9 3,7 base Dia 7 777,2 331,3 187,4 432,0 ± 307,5 Dia 14 924,0 349,9 368,0 547,3 ± 326,4
Dia 21 973,2 289,6 490,0 584,3 ± 351,4 Dia 28 1158,1 711,9 623,8 831,3 ± 286,5 Conclusão
[451] A administração de SPK-AAV-02 resultou em atividade detectável de GAA no plasma em todos os três NHPs. A combinação de SPK-AAV- 02 e rapamicina foi bem tolerada e teve um perfil de segurança favorável em todos os testes medidos. EXEMPLO 13 Eficácia terapêutica no modelo Pompe de camundongo Gaa-/-
[452] Um estudo de seguimento de 10 meses de camundongos Gaa-/- de 4 meses de idade (um modelo de camundongo estabelecido de doença de Pompe) administrou SPK-AAV-02 em três doses (1,25x1011, 5x1011 e 2x10 12 vg/kg). O estudo demonstrou: (1) aumento dependente da dose na atividade da enzima GAA circulante, (2) melhora significativa da força muscular e (3) nenhuma resposta imune humoral anti-GAA significativa. EXEMPLO 14 Métodos Ensaio baseado em células para medir a eficiência da expressão de proteínas de plasmídeos que codificam transgenes GAA humanos secretáveis
[453] As células Huh7 foram plaqueadas em placas de 48 poços a 5x104 células por poço durante a noite em DMEM+10% de FBS+penicilina/estreptomicina/L-glutamina. Os plasmídeos preparados usando Plasmid Giga Kit (Qiagen) foram transfectados em células a 250 ng por poço usando Lipofectamine® 2000. As células foram mantidas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 48-72 horas e os sobrenadantes foram colhidos e armazenados em microtitulação de baixa retenção placas a -80 graus Celsius até serem testadas quanto à atividade de GAA. Os sobrenadantes foram diluídos 1:10 e incubados com 3 mM de substrato fluorescente 4-metilumbeliferila α-D-glicopiranosídeo durante 1 hora a 37 graus
Celsius. A reação foi interrompida após 1 hora com tampão de carbonato (pH 10,5) e comparada a uma curva padrão gerada pela diluição de 4-metilumbeliferona (4-MU) no tampão de parada, criando uma curva padrão de 12 pontos começando em 250 pmol/µl e terminando em 0 pmol/µl. A placa foi lida a λex 360 nm; λem 449 nm. Injeção hidrodinâmica de DNA de plasmídeo para avaliar a potência de plasmídeos que codificam transgenes GAA humanos secretáveis
[454] Os plasmídeos preparados utilizando plasmídeo Giga Kit (Qiagen), foram diluídas em PBS180 +0,001% de Pluronic. 25 microgramas de DNA de plasmídeo correspondente a cada cassete a ser testado foram introduzidos em camundongos C57BL/6 machos de aproximadamente 8 semanas de idade por via intravenosa na veia lateral da cauda por injeção hidrodinâmica. 72 horas após a injeção, o sangue total foi coletado em tubos de citrato de sódio por meio de punção na veia submandibular. A primeira gota de sangue foi descartada e 200 µl de sangue coletados em citrato de sódio, sendo o tubo invertido para evitar hemólise e coagulação. A amostra foi centrifugada a 10.000 RMP por 10 minutos a 4 graus Celsius. O plasma foi aliquotado em tubos e armazenado em um freezer -80 graus Celsius até ser analisado quanto à atividade de GAA. As amostras de plasma foram diluídas em vários graus e incubadas com 3 mM de substrato fluorescente 4- metilumbeliferil α-D-glicopiranosídeo durante 1 hora a 37 graus Celsius. A reação foi interrompida após 1 hora com tampão carbonato (pH 10,5) e comparada a uma curva padrão gerada diluindo 4-MU no tampão de parada, criando uma curva padrão de 12 pontos começando em 250 pmol/µl e terminando em 0 pmol/µl. A placa foi lida a λex 360 nm; λem 449 nm. Ensaio baseado em células para medir a potência de vetores AAV que codificam transgenes GAA humanos secretáveis
[455] As células Huh7 foram plaqueadas em placas de 48 poços a 5x104 células por poço durante a noite. SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02 do vetor de estoque foram preparados em uma curva de dose (multiplicidade de infecção, MOI, faixa de 2x106-1x104) em Opti-MEMTM ou DMEM+10% FBS+penicilina/estreptomicina/L-glutamina. O meio existente foi removido das células Huh7 e substituído por meio contendo partículas de vírus. As células foram mantidas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 durante 72 horas, e os sobrenadantes foram colhidos e armazenados em placas de microtitulação de baixa retenção a -80 graus Celsius até ao ensaio para a atividade de GAA. Os sobrenadantes foram diluídos 1:10 e incubados com 3 mM de substrato fluorescente 4-metilumbeliferil α- D-glicopiranosídeo durante 1 hora a 37 graus Celsius. A reação foi interrompida após 1 hora com tampão carbonato (pH 10,5) e comparada a uma curva padrão gerada diluindo 4-MU no tampão de parada, criando uma curva padrão de 12 pontos começando em 250 pmol/µl e terminando em 0 pmol/µl. A placa foi lida a λex 360 nm; λem 449 nm. Ensaio de atividade de GAA em plasma de camundongo/rato
[456] O sangue total foi coletado em tubos de citrato de sódio por meio de punção da veia submandibular. A primeira gota de sangue foi descartada e 200 µl de sangue foram coletados em citrato de sódio; o tubo foi invertido para evitar hemólise e coagulação. A amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos a 4 graus Celsius. O plasma foi aliquotado em tubos e armazenado em um freezer -80 graus Celsius até ser analisado quanto à atividade de GAA. As amostras de plasma foram diluídas em vários graus e incubadas com 3 mM de substrato fluorescente 4- metilumbeliferil α-D-glicopiranosídeo durante 1 hora a 37 graus Celsius. A reação é interrompida após 1 hora com tampão de carbonato (pH 10,5) e comparada a uma curva padrão gerada pela diluição de 4-MU no tampão de parada, criando uma curva padrão de 12 pontos começando em 250 pmol/µl e terminando em 0 pmol/µl. A placa foi lida a Xex 360 nm; λem 449 nm. Ensaio de atividade de GAA em plasma NHP (rhesus/AGM)
[457] Os macacos rhesus/macacos verdes africanos machos foram injetados por via intravenosa através da veia safena, e sangue inteiro foi recolhido em tubos de citrato de sódio, que foram invertidos para evitar hemólise e de coagulação. A amostra foi centrifugada a 10.000 RMP por 10 minutos a 4 graus Celsius. O plasma foi aliquotado em tubos e armazenado em um freezer -80 graus Celsius até ser analisado quanto à atividade de GAA. As amostras de plasma foram diluídas em vários graus e incubadas com 3 mM de substrato fluorescente 4- metilumbeliferil α-D-glicopiranosídeo durante 1 hora a 37 graus Celsius. A reação foi interrompida após 1 hora com tampão carbonato (pH 10,5) e comparada a uma curva padrão gerada diluindo 4-MU no tampão de parada, criando uma curva padrão de 12 pontos começando em 250 pmol/µl e terminando em 0 pmol/µl, ou uma curva padrão de 11 pontos (5 µM/ml - 0,49 nM/ml). A placa é lida a λex 360 nm; λem 449 nm. A atividade de GAA para as amostras testadas foi interpolada a partir da curva padrão 4-MU e expressa como velocidade (nanomol/mililitro/hora (nmol/ml/h)). Avaliação do nível de proteína de GAA em sobrenadantes Huh7 por Western blot
[458] As células Huh7 foram plaqueadas em placas de 48 poços a 5x104 células por poço durante a noite. SPK-AAV-01 e SPK-AAV-02 do vetor de estoque foram preparados em uma curva de dose (multiplicidade de infecção, MOI, faixa de 2x106-1x104) em Opti-MEMTM ou DMEM+10%FBS+penicilina/estreptomicina/L-glutamina. O meio existente foi removido das células Huh7 e substituído por meio contendo partículas de vírus. As células foram mantidas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 72 horas, e os sobrenadantes foram colhidos e armazenados em placas de microtitulação de baixa retenção a -80 graus Celsius até serem testados quanto ao nível de proteína GAA. Os sobrenadantes foram diluídos 1:20 com tampão RIPA incubado a 95 graus Celsius por 5 minutos e executados em um gel de 4-12% Bis-Tris NuPage com tampão MOPS em execução. A proteína foi transferida para membrana de difluoreto de polivinilideno (pvdf) usando o sistema iBlot® (ThermoFisher), e bloqueada por 1 hora à temperatura ambiente em tampão Odyssey® TBS. A membrana foi incubada durante a noite a 4 graus Celsius com o anticorpo primário, GAA de coelho anti- humano (Abcam) diluído 1:1.000. A membrana foi lavada e incubada à temperatura ambiente durante 2 horas com o anticorpo anticoelho fluorescente secundário diluído 1:10.000. A membrana foi lavada e fotografada usando o sistema de imagem Li- Core®. As bandas foram comparadas com 10 ng de Myozyme® e ao marcador. A análise densitométrica foi realizada com o software Li-Core® e as bandas foram normalizadas para o controle Myozyme®. Avaliação do nível de proteína de GAA em plasma de camundongo por Western blot
[459] Os camundongos C57BL/6 machos e fêmeas foram injetados por via intravenosa através da veia da cauda, e o sangue total foi coletado em tubos de citrato de sódio por punção da veia submandibular. A primeira gota de sangue foi descartada e 200 µl de sangue foram coletados em citrato de sódio; o tubo foi invertido para evitar hemólise e coagulação. A amostra foi centrifugada a 10.000 RMP por 10 minutos a 4 graus Celsius. O plasma foi aliquotado em tubos e armazenado em um freezer de -80 graus Celsius até ser analisado para o nível de proteína GAA. O plasma foi diluído 1:20 com tampão RIPA, incubado a 95 graus Celsius durante 5 minutos e executado em um gel Bis-Tris NuPage a 4-12% com tampão MOPS em execução. A proteína foi transferida para membrana de pvdf usando o sistema iBlot® (ThermoFisher), e bloqueada por 1 hora em temperatura ambiente em tampão Odyssey® TBS. A membrana foi incubada durante a noite a 4 graus Celsius com o anticorpo primário, GAA de coelho anti-humano (Abcam) diluído 1:1000. A membrana foi lavada e incubada à temperatura ambiente durante 2 horas com o anticorpo anticoelho fluorescente secundário diluído 1:10.000. A membrana foi lavada e fotografada usando o sistema de imageamento Li-Core®. As bandas foram comparadas com 10 ng de Myozyme® e o marcador. A análise densitométrica foi realizada com o software Li-Core® e as bandas foram normalizadas para o controle Myozyme®. Avaliação do nível de proteína de GAA em plasma NHP por WES
[460] Os macacos rhesus/macacos verdes africanos machos foram injetados por via intravenosa através da veia safena, e sangue inteiro foi recolhido em tubos de citrato de sódio, que foram invertidos para evitar hemólise e de coagulação. A amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos a 4 graus Celsius. O plasma foi aliquotado em tubos e armazenado em um freezer -80 graus Celsius até ser analisado para os níveis de proteína GAA. As amostras de plasma foram diluídas 1:6000 em diluente de amostra. Uma curva padrão dupla de 8 pontos
® foi adicionada a cada chip com Myozyme começando em uma concentração de 50 ng/ml. As amostras foram diluídas no tampão, desnaturadas a 95 graus Celsius por 5 minutos e carregadas no chip WESTM (Protein Simple). O anticorpo primário foi adicionado a uma diluição de 1:1000 e o anticorpo secundário foi carregado na diluição de trabalho. O chip foi executado de acordo com o software WESTM Protein Simple e as bandas resultantes são analisadas e comparadas com a curva padrão do Myozyme® e normalizadas para a segunda banda não específica. Anticorpos IgG de capsídeo anti-AAV
[461] A formação de IgG total do capsídeo anti-AAV foi medida com um ensaio de captura ELISA. Os poços da placa de ELISA foram revestidos com 50 µl de uma solução contendo 1 µg/ml de partículas de rAAV. IgG humano total (Southern Biotech, 0150-01) foi diluído para gerar uma curva padrão de 10 pontos variando de 10.000 ng/ml a 0,5 ng/ml e adicionado à placa. O limite de quantificação do ensaio foi de 460 ng/ml após cálculo retroativo. Três níveis de amostras de controle de qualidade foram preparados e incluídos em cada placa para avaliar o desempenho do ensaio. Partículas de capsídeo, padrões e controles de qualidade foram incubados durante a noite a 4 graus Celsius. Após a lavagem, os poços foram bloqueados com BSA a 2%, Tween-20 a 0,05% em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. Diluições em série de amostras em tampão de bloqueio foram carregadas na placa e incubadas em temperatura ambiente por 2 horas. Um anticorpo IgG anti-humano de ovelha conjugado com HRP (GE Healthcare, NA933V) diluído 1:5.000 em tampão de bloqueio foi usado como anticorpo de detecção e incubado na placa por 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem, a atividade da peroxidase foi desenvolvida durante uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente com substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi interrompida com ácido sulfúrico 1M, e a placa foi lida por um leitor de placa de absorbância para densidade óptica (OD) a 450 nm. A concentração de IgG foi determinada contra uma curva padrão feita com diluição em série de IgG total humano purificado.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ácido nucleico que codifica uma α-glicosidase ácida (GAA) caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 86% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-5.
    2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 87% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-
    5.
    3. Ácido nucleico que codifica uma GAA caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 87% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-15.
    4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 88% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-
    15.
    5. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 89% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-
    15.
    6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-
    15.
    7. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 91% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:6-
    15.
    8. Ácido nucleico que codifica uma GAA caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 91% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:16-24.
    9. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém menos do que 127 dinucleotídeos CpG.
    10. Ácido nucleico que codifica uma GAA caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém menos do que 127 dinucleotídeos CpG.
    11. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém menos do que 126 dinucleotídeos CpG.
    12. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 126 a 120 dinucleotídeos CpG.
    13. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 120 a 110 dinucleotídeos CpG.
    14. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 110 a 100 dinucleotídeos CpG.
    15. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 100 a 90 dinucleotídeos CpG.
    16. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 90 a 80 dinucleotídeos CpG.
    17. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 80 a 70 dinucleotídeos CpG.
    18. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 70 a 60 dinucleotídeos CpG.
    19. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 60 a 50 dinucleotídeos CpG.
    20. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 50 a 40 dinucleotídeos CpG.
    21. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 40 a 30 dinucleotídeos CpG.
    22. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 30 a 20 dinucleotídeos CpG.
    23. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém menos do que 20 dinucleotídeos CpG.
    24. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 20 a 10 dinucleotídeos CpG.
    25. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém menos do que 10 dinucleotídeos CpG.
    26. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém cerca de 10 a 5 dinucleotídeos CpG.
    27. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém 5 dinucleotídeos CpG.
    28. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém 4 dinucleotídeos CpG.
    29. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém 3 dinucleotídeos CpG.
    30. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém 2 dinucleotídeos CpG.
    31. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém 1 dinucleotídeo CpG.
    32. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico contém 0 dinucleotídeos CpG.
    33. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 92% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    34. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 93% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    35. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 94% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    36. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 95% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    37. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 96% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    38. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 97% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    39. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 98% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    40. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 99% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    41. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem mais do que 99,5% de identidade de sequência em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas como SEQ ID NOs:1-24.
    42. Ácido nucleico que codifica uma GAA caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-24.
    43. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 42, ligado de modo operacional a um elemento de controle de expressão.
    44. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de controle de expressão está posicionado em 5’ do dito ácido nucleico.
    45. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência de poliadenilação posicionada em 3’ do dito ácido nucleico.
    46. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de controle de expressão ou sequência de poliadenilação é reduzida a CpG em comparação com elemento de controle de expressão ou sequência de poliadenilação do tipo selvagem.
    47. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de controle de expressão compreende uma sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT.
    48. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de poliadenilação compreende uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGH).
    49. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 47 ou 48,
    caracterizado pelo fato de que a dita sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT ou sequência de poliadenilação do bGH é reduzida a CpG em comparação com a sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT ou sequência de poliadenilação do bGH do tipo selvagem.
    50. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de poliadenilação do bGH do tipo selvagem compreende a sequência de SEQ ID NO:27.
    51. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a dita sequência melhoradora/promotora de ApoE/hAAT do tipo selvagem compreende a sequência de SEQ ID NO:28 ou
    29.
    52. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de poliadenilação do bGH reduzida a CpG compreende a sequência de SEQ ID NO:26.
    53. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 52, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um íntron posicionado entre a extremidade 3’ do dito elemento de controle de expressão e a extremidade 5’ do dito ácido nucleico.
    54. Sequência de ácidos nucleicos ou cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato de que a dita GAA compreende a sequência estabelecida como SEQ ID NO:25.
    55. Vetor de vírus associado a adenovírus (AAV) caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico ou cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 54.
    56. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de AAV compreende: a) um ou mais de um capsídeo de AAV, e b) uma ou mais repetições terminais invertidas de AAV (ITRs), em que a (s) dita (s) ITR (s) de AAV flanqueia o terminal 5’ ou 3’ do dito ácido nucleico ou do dito cassete de expressão.
    57. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um íntron posicionado em 5’ ou 3’ da dita uma ou mais ITRs.
    58. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ou mais das ditas ITRs ou do dito íntron é modificado para ter CpGs reduzidas.
    59. Vetor de AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, em que o dito vetor de AAV é caracterizado pelo fato de que tem um sorotipo do capsídeo que compreende um capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV modificado ou variante com 90% ou mais de identidade de sequência em relação a sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV- 2i8 ou SEQ ID NO:30, 31 ou 32, ou um capsídeo com 95% ou mais de identidade de sequência em relação a sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 ou SEQ ID NO:30, 31 ou 32, ou um capsídeo com 100% de identidade de sequência em relação a sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 ou SEQ ID NO:30, 31 ou
    32.
    60. Vetor de AAV, de acordo com qualquer umas das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que as ditas ITRs compreendem uma ou mais ITRs de qualquer um de: sorotipos AAV de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV3B, ou uma combinação dos mesmos.
    61. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de vetores de AAV conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 55 a 60, em um carreador ou excipiente biologicamente compatível.
    62. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 61,
    caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente capsídeos de AAV vazios.
    63. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos de AAV vazios e o dito vetor de AAV está dentro ou entre cerca de 100:1 a 50:1, cerca de 50:1 a 25:1, cerca de 25:1 a 10:1, cerca de 10:1 a 1:1, cerca de 1:1 a 1:10, cerca de 1:10 a 1:25, cerca de 1:25 a 1:50 ou cerca de 1:50 a 1:100.
    64. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos de AAV vazios e o dito vetor de AAV é cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
    65. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um tensoativo.
    66. Método para tratamento de um humano em necessidade de α- glicosidase ácida (GAA) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer o ácido nucleico ou cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 54, ou o vetor de AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 55 a 60, ou a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 61 a 65; e (b) administrar uma quantidade do dito ácido nucleico, cassete de expressão, vetor de AAV ou composição farmacêutica ao dito humano, em que a dita GAA é expressa no dito humano.
    67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o dito humano tem doença de Pompe.
    68. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o dito humano tem doença de Pompe com início na infância.
    69. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o dito humano tem doença de Pompe com início tardio.
    70. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o dito humano tem uma doença de armazenamento de glicogênio (GSD).
    71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a dita GSD é selecionada a partir de: GSD tipo I (doença de von Gierke), GSD tipo III (doença de Forbes-Cori), GSD tipo IV (doença de Anderson, amilopectinose), GSD tipo V (doença de McArdle), GSD tipo VI (doença de Hers), GSD tipo VII (doença de Tarui) e uma GSD congênita letal do coração.
    72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 71, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de AAV é administrado ao dito humano de modo intravenal, intra-arterial, intracavitária, intramucoso ou por meio de cateter.
    73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 72, caracterizado pelo fato de que a dita GAA é expressa em níveis aumentados, opcionalmente maior do que 1% dos níveis, de GAA encontrada em um humano sem necessidade de GAA.
    74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 73, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de AAV é administrado em uma faixa de cerca de 1X108 a cerca de 1X1014 genomas vetoriais por quilograma (vg/kg) do peso do dito humano.
    75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 74, caracterizado pelo fato de que o dito método reduz, diminui ou inibe um ou mais sintomas da dita necessidade de GAA ou da dita doença; ou evita ou reduz a progressão ou a piora de um ou mais sintomas da dita necessidade de GAA ou da dita doença; ou estabiliza um ou mais sintomas da dita necessidade de GAA ou da dita doença; ou melhora um ou mais sintomas da dita necessidade de GAA ou da dita doença.
    76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais sintomas é selecionado a partir do grupo que consiste em: dificuldade em comer; não ganhar peso; controle deficiente da cabeça; controle deficiente do pescoço; problemas respiratórios; infecções pulmonares; coração dilatado; espessamento do coração; defeitos cardíacos; língua aumentada; dificuldade em engolir; fígado aumentado; força muscular fraca; tônus muscular fraco; fraqueza nas pernas; fraqueza na cintura; fraqueza nos braços; falta de ar; dificuldade de exercício; dificuldade em respirar durante o sono; curvatura da coluna; e juntas rígidas.
    77. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico ou cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 54.
    78. Célula caracterizada pelo fato de que produz o vetor de AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 55 a 60.
    79. Método para produzir o vetor de AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 55 a 60, caracterizado pelo fato de que compreende a. introduzir um genoma do vetor de AAV que compreende o dito ácido nucleico ou cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, em uma célula auxiliar empacotadora; e b. cultivar a dita célula auxiliar sob condições para produzir o dito vetor de AAV.
    80. Método para produzir o vetor de AAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 55 a 60, caracterizado pelo fato de que compreende a. introduzir o dito ácido nucleico ou cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 54, em uma célula auxiliar empacotadora; e b. cultivar as ditas células auxiliares sob condições para produzir o dito vetor de AAV.
    81. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula compreende células de mamíferos.
    82. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula fornece funções auxiliares que empacotam o dito vetor em uma partícula viral.
    83. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula fornece funções auxiliares de AAV.
    84. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula fornece proteínas Rep e/ou Cap de AAV.
    85. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula é transfectada de modo estável ou transitório com polinucleotídeo (s) que codifica a (s) sequência (s) de proteínas Rep e/ou Cap.
    86. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula fornece proteínas Rep78 e/ou Rep68.
    87. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula é transfectada de modo estável ou transitório com sequência (s) de codificação de polinucleotídeo de proteínas Rep78 e/ou Rep68.
    88. Célula ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a dita célula compreende células HEK-293.
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