WO2023022631A1 - Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса - Google Patents

Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса Download PDF

Info

Publication number
WO2023022631A1
WO2023022631A1 PCT/RU2022/050255 RU2022050255W WO2023022631A1 WO 2023022631 A1 WO2023022631 A1 WO 2023022631A1 RU 2022050255 W RU2022050255 W RU 2022050255W WO 2023022631 A1 WO2023022631 A1 WO 2023022631A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
capsid
modified
protein
aav5
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/050255
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Анна Николаевна СТРЕЛКОВА
Сергей Александрович ЛЕГОЦКИЙ
Татьяна Евгеньевна ШУГАЕВА
Павел Михайлович ГЕРШОВИЧ
Александр Анатольевич НАДОЛИНСКИЙ
Павел Андреевич ЯКОВЛЕВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Original Assignee
Акционерное общество "БИОКАД"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное общество "БИОКАД" filed Critical Акционерное общество "БИОКАД"
Priority to IL310949A priority Critical patent/IL310949A/en
Priority to AU2022328531A priority patent/AU2022328531A1/en
Priority to CA3229580A priority patent/CA3229580A1/en
Publication of WO2023022631A1 publication Critical patent/WO2023022631A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • This application relates to the field of gene therapy and molecular biology. More specifically, the present invention relates to a method for producing a modified adeno-associated virus (AAV) capsid and a modified AAV capsid obtained by this method, as well as an isolated nucleic acid encoding this modified capsid, and a vector based on a recombinant adeno-associated virus for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject. acid, which includes this modified capsid.
  • AAV adeno-associated virus
  • Adeno-associated virus is a small (25 nm), incapable of self-replication, non-enveloped virus. Many different AAV serotypes have been described in humans and primates.
  • the genome of the adeno-associated virus contains (+ or -) single-stranded DNA (ssDNA) with a length of about 4.7 thousand nucleotides. At the ends of the genomic DNA molecule are inverted terminal repeats (ITRs).
  • ITRs inverted terminal repeats
  • the genome contains two open reading frames (ORFs): Rep and Cap, which contain several alternative reading frames encoding various protein products. Rep products are essential for AAV replication, with the Cap gene encoding 3 capsid proteins (VP1, VP2, and VP3) among other alternative products.
  • Proteins VP1, VP2 and VP3 are in a ratio of 1:1:10, forming an icosahedral capsid (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99: 10405-10410).
  • AAV-2 adeno-associated virus
  • rAAV recombinant AAV vector
  • an expression cassette flanked by ITR is packaged into an AAV capsid.
  • the genes required for AAV replication are not included in the cassette.
  • Recombinant AAV is considered the safest and one of the most widely used viral vectors for in vivo gene transfer.
  • the vectors can infect cells of a variety of tissue types, allowing efficient and stable expression of the transgene. They are also non-pathogenic and have a low immunogenicity profile (High KA et al., "rAAV human trial experience” Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57).
  • One of the urgent goals of research in the development of effective gene therapy is the optimization of vectors to improve certain properties of these vectors.
  • AAV2 AAV2 binds to heparan sulfate proteoglycans and sialic acid.
  • AAV4 and AAV5 bind to N- and O-linked sialic acids, respectively.
  • AAV5 activates the platelet growth factor receptor.
  • AAV adeno-associated virus
  • WO2013158879 describes an adeno-associated virus (AAV) vector for delivering to a subject a heterologous nucleic acid sequence containing a VP1 capsid protein that contains one or more lysine substitutions, where one lysine substitution is K137R, where said lysine substitution is effective to inhibit ubiquitinylation said capsid protein, thereby increasing the transduction of said AAV vector in the target cell.
  • AAV adeno-associated virus
  • AAVs with improved properties compared to wild-type AAVs which have increased transducing capacity, greater specificity to transduce target organ and tissue cells, increased capsid capacity, increased packaging efficiency of AAV viral genomes, as well as increased efficiency developments due to highly efficient production (assembly) of encapsidated viral vectors based on recombinant adeno-associated virus (rAAV).
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • AAV adeno-associated virus
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the present invention relates to a method for producing a modified AAV capsid, which includes: a) determining the amino acids of the capsomer protein of the modified AAV located in the interface region of the interaction of neighboring pentamer subunits of the capsid; b) structural alignment of the modified AAV capsid with the template capsid to determine the pairwise correspondence between each amino acid of the modified AAV from the interaction interface between neighboring pentameric subunits and the closest amino acid of the template capsid, as a structural analogue of the original amino acid, which is considered as a potential replacement, where under the template capsid understand the capsid of a virus, similar in structure, selected from the family of parvoviruses (Parvoviridae), which is not AAV; c) pairwise comparison of the amino acid residues of the AAV capsid and the template capsid determined in step b) to identify structural differences between the modified AAV capsid and the template capsid at the interface between adjacent pentamer
  • the method for producing a modified AAV capsid further comprises testing the modified AAV capsids obtained in step e) with one or more amino acid substitutions for one or more improved properties compared to an AAV capsid without these modifications, where one or more improved properties are selected from the group:
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the method for producing a modified AAV capsid further comprises testing the modified AAV capsids obtained in step e) for one or more improved properties compared to an AAV capsid without these modifications and selecting modified AAV capsids that have one or more improved properties according to compared to the AAV capsid without these modifications, where one or more improved properties are selected from the group:
  • the modified AAV capsid is selected from the group consisting of: human AAV, simian AAV, or avian AAV.
  • the modified AAV capsid is selected from the group consisting of the following AAV serotypes: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, or AAV16 .
  • the template similar in structure to the capsid is selected from the group that includes: parvovirus B19, human bocavirus 1 (HBoVl), bovine parvovirus (BVP).
  • the present invention relates to a modified AAV capsid for obtaining viral vectors based on recombinant adeno-associated virus, which is obtained by a method including: a) determining the amino acids of the modified AAV capsomere protein located in the region of the interaction interface of neighboring pentamer subunits of the capsid; b) structural alignment of the modified AAV capsid with the template capsid to determine the pairwise correspondence between each amino acid of the modified AAV from the interaction interface between neighboring pentameric subunits and the closest amino acid of the template capsid, as a structural analogue of the original amino acid, which is considered as a potential replacement, where under the template capsid understand the capsid of a virus, similar in structure, selected from the family of parvoviruses (Parvoviridae), which is not AAV; c) pairwise comparison of the amino acid residues of the AAV capsid and the template capsid determined in step b) to identify structural differences between the modified
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the capsid of the modified AAV is selected from the group consisting of: human AAV, simian AAV, or avian AAV.
  • the modified AAV capsid is selected from the group consisting of the following AAV serotypes: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, or AAV16.
  • the present invention relates to a modified AAV capsid for obtaining viral vectors based on recombinant adeno-associated virus, which includes a modified AAV capsid protein VP1, which has an amino acid sequence selected from the group: SEQ III No: 14, 20, 26, 32 , 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 , 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332 , 338, 344, 350, 356, 362 or 368.
  • a modified AAV capsid protein VP1 which has an amino acid sequence selected from the group: SEQ III No: 14, 20, 26, 32 , 38
  • the modified AAV capsid comprises: a) a modified AAV capsid VP1 protein that has an amino acid sequence selected from the group: SEQ III No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218 224 230 236 242 248 254 260 266 272 278 284 290 296 302 308 314 320 326 332 338 344 350 356 362 or 368; b) a modified AAV capsid VP2 protein corresponding to its VP1 protein, which has an amino acid sequence selected from the group: SEQ III No: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100,
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid that encodes any of the above modified capsids.
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the recombinant adeno-associated virus vector has an expression product of a heterologous nucleic acid sequence that is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • Figure 1 is a circular diagram of the pAAV-linker plasmid, which is designed to clone libraries of random variants of the AAV capsid gene.
  • T2A - a sequence encoding a peptide capable of self-cutting from a polypeptide chain obtained from thosea asigna virus
  • AmpR - beta-lactamase gene sequence providing resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin - high-copy origin of bacterial replication,
  • Figure 2 is a circular diagram of the plasmid pAAV-Rep, which is designed to generate recombinant AAV wild-type viral preparations from a library of random variants.
  • AmpR - beta-lactamase gene sequence providing resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin - high-copy origin of bacterial replication,
  • Figure 3 is a ring diagram of the plasmid pHelper, which is designed to generate recombinant AAV wild-type viral preparations from a library of random variants.
  • AmpR is a beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin
  • Ori is the origin of replication in bacteria.
  • Adeno VARNA is a helper adenovirus gene sequence responsible for stimulating the translation of both early and late viral genes.
  • Figure 4 is a circular diagram of the plasmid pAAV-RC5, which is intended for the production of recombinant AAV 5 serotype viral preparations.
  • AmpR - beta-lactamase gene sequence providing resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin - high-copy origin of prokaryotic replication,
  • Figure 5 is a circular diagram of the plasmid pAAV-RC9, which is intended for the production of recombinant viral preparations of AAV serotype 9.
  • AmpR - beta-lactamase gene sequence providing resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin - high-copy origin of prokaryotic replication,
  • Figure 6 is a graph that shows the production efficiency of vectors based on the modified adeno-associated virus 5 serotype (rAAV5).
  • Vg/ml kzh denotes the number of viral genomes per milliliter of culture fluid.
  • AAV5-NullMut-GFP denotes a vector based on rAAV5 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV5-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-02Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, G226A and T711S mutations.
  • AAV5-03Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, D286E and T711S mutations.
  • AAV5-04Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, L341Y H T71 1 S mutations.
  • AAV5-05Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, C387V and T711S mutations.
  • AAV5-06Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, Q421H and T711S mutations.
  • AAV5-07Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, P466T and T711S mutations.
  • AAV5-08Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S594Q and T711S mutations.
  • AAV5-09Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, T614L H T71 1 S mutations.
  • AAV5-10Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, N679K and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-1 IMut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, P723V and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-12Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, V431Y and T711S mutations.
  • AAV5-13Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, A616D and T711S mutations.
  • AAV5-14Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, W683R and T711S mutations.
  • AAV5-15Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S222A and T711S mutations.
  • AAV5-16Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, R285L and T711S mutations.
  • AAV5-17Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, Q340A and T711S mutations.
  • AAV5-18Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S420F and T711S mutations.
  • AAV5-19Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S680A and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-20Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, T721V and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • Figure 7 is a graph that shows the production efficiency of vectors based on the modified adeno-associated virus 5 serotype (rAAV5).
  • Vg/ml kzh denotes the number of viral genomes per milliliter of culture fluid.
  • AAV5-NullMut-GFP denotes a vector based on rAAV5 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV5-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-21Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the G226A mutation.
  • AAV5-22Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the D286E mutation.
  • AAV5-23Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the L341 Y mutation.
  • AAV5-24Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the C387V mutation.
  • AAV5-25Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the Q421H mutation.
  • AAV5-26Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with a P466T mutation.
  • AAV5-27Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S594Q mutation.
  • AAV5-28Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the T614L mutation.
  • AAV5-29Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the N679K mutation.
  • AAV5-30Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with a P723V mutation.
  • AAV5-31Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the V431Y mutation.
  • AAV5-32Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the A616D mutation.
  • AAV5-33Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the W683R mutation.
  • AAV5-34Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S222A mutation.
  • AAV5-35Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the R285L mutation.
  • AAV5-36Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the Q340A mutation.
  • AAV5-37Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S420F mutation.
  • AAV5-38Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S680A mutation.
  • AAV5-39Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the T721V mutation.
  • Figure 8 is a graph that shows the production efficiency of vectors based on modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9).
  • Vg/ml kzh denotes the number of viral genomes per milliliter of culture fluid.
  • AAV9-NullMut-GFP denotes a vector based on rAAV9 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV9-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the S232T mutation.
  • AAV9-02Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the D297E mutation.
  • AAV9-03Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351K mutation.
  • AAV9-04Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a Q351R mutation.
  • AAV9-05Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the C396V mutation.
  • AAV9-06Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a D433Y mutation.
  • AAV9-07Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the L444R mutation.
  • AAV9-08Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Y478F mutation.
  • AAV9-09Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the G604N mutation.
  • AAV9-10Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the G627K mutation.
  • AAV9-1 IMut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T625L mutation
  • AAV9-12Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T625V mutation.
  • AAV9-13Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the S692T mutation.
  • AAV9-14Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T733V mutation.
  • AAV9-15Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the A427R mutation.
  • AAV9-16Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the M635D mutation.
  • AAV9-17Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the W695R mutation.
  • AAV9-18Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the R296L mutation.
  • AAV9-19Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351A mutation.
  • AAV9-20Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Y395F mutation.
  • AAV9-21Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the R434L mutation.
  • AAV9-22Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the N691 A mutation.
  • Figure 9 is a graph that shows the transduction efficiency of cells with rAAV5-based preparations containing point mutations in the wild-type rAAV5 capsid VP1 protein or in the rAAV5 capsid VP1 protein that already contains S2A and T711S mutations.
  • AAV5-NullMut-GFP designates rAAV5-based vector with wild-type capsid protein VP1
  • AAV5-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-02Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, G226A and T711S mutations.
  • AAV5-03Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, D286E and T711S mutations.
  • AAV5-04Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, L341Y H T71 1 S mutations.
  • AAV5-05Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, C387V and T711S mutations.
  • AAV5-06Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, Q421H and T711S mutations.
  • AAV5-07Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, P466T and T711S mutations.
  • AAV5-08Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S594Q and T711S mutations.
  • AAV5-09Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, T614L H T71 1 S mutations.
  • AAV5-10Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, N679K and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-1 IMut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, P723V and T711S mutations.
  • AAV5-12Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, V431Y and T711S mutations.
  • AAV5-13Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, A616D and T711S mutations.
  • AAV5-14Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, W683R and T711S mutations.
  • AAV5-15Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S222A and T711S mutations.
  • AAV5-16Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, R285L and T711S mutations.
  • AAV5-17Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, Q340A and T711S mutations.
  • AAV5-18Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S420F and T711S mutations.
  • AAV5-19Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S680A and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-20Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, T721V and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • Figure 10 is a graph that shows the transduction efficiency of cells with rAAV5-based drugs containing point mutations in the wild-type rAAV5 capsid VP1 protein.
  • AAV5-NullMut-GFP denotes a vector based on rAAV5 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV5-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-21Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the G226A mutation.
  • AAV5-22Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the D286E mutation.
  • AAV5-23Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the L341 Y mutation.
  • AAV5-24Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the C387V mutation
  • AAV5-25Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the Q421H mutation.
  • AAV5-26Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with a P466T mutation.
  • AAV5-27Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S594Q mutation.
  • AAV5-28Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the T614L mutation.
  • AAV5-29Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the N679K mutation.
  • AAV5-30Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with a P723V mutation.
  • AAV5-31Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the V431Y mutation.
  • AAV5-32Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the A616D mutation.
  • AAV5-33Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the W683R mutation.
  • AAV5-34Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S222A mutation.
  • AAV5-35Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the R285L mutation.
  • AAV5-36Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the Q340A mutation.
  • AAV5-37Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S420F mutation.
  • AAV5-38Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S680A mutation.
  • AAV5-39Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the T721V mutation.
  • Figure 11 is a graph that shows the transduction efficiency of cells with rAAV9-based preparations containing point mutations in the VP1 protein of the wild-type rAAV9 capsid.
  • AAV9-NullMut-GFP denotes a vector based on rAAV9 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV9-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the S232T mutation.
  • AAV9-02Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the D297E mutation.
  • AAV9-03Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351K mutation.
  • AAV9-04Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a Q351R mutation.
  • AAV9-05Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the C396V mutation.
  • AAV9-06Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a D433Y mutation.
  • AAV9-07Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the L444R mutation.
  • AAV9-08Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Y478F mutation.
  • AAV9-09Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the G604N mutation.
  • AAV9-10Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the G627K mutation.
  • AAV9-1 IMut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T625L mutation.
  • AAV9-12Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T625V mutation.
  • AAV9-13Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the S692T mutation.
  • AAV9-14Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T733V mutation.
  • AAV9-15Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the A427R mutation.
  • AAV9-16Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the M635D mutation.
  • AAV9-17Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the W695R mutation.
  • AAV9-18Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the R296L mutation.
  • AAV9-19Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351A mutation.
  • AAV9-20Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Y395F mutation.
  • AAV9-21Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the R434L mutation.
  • AAV9-22Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the N691 A mutation.
  • Figure 12 is a graph that shows the production efficiency of the target protein encoded by the transgene after cell transduction with rAAV5-based preparations containing single mutations in the wild-type rAAV5 capsid VP1 protein or in the rAAV5 capsid VP1 protein that already contains S2A H T711 S mutations.
  • AAV5-NullMut-FIX denotes a vector based on rAAV5 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV5-01Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-02Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, G226A and T711S mutations.
  • AAV5-03Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, D286E and T711S mutations.
  • AAV5-04Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, L341Y H T71 1 S mutations.
  • AAV5-05Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with mutations S2A, C387V and T711S
  • AAV5-06Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, Q421H and T711S mutations.
  • AAV5-07Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, P466T and T711S mutations.
  • AAV5-08Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S594Q and T711S mutations.
  • AAV5-09Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, T614L H T71 1 S mutations.
  • AAV5-10Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, N679K and T711S mutations.
  • AAV5-1 IMut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, P723V and T711S mutations.
  • AAV5-12Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, V431Y and T711S mutations.
  • AAV5-13Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, A616D and T711S mutations.
  • AAV5-14Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, W683R and T711S mutations.
  • AAV5-15Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S222A and T711S mutations.
  • AAV5-16Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, R285L and T711S mutations.
  • AAV5-17Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, Q340A and T711S mutations.
  • AAV5-18Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with mutations S2A, S420F and T711S
  • AAV5-19Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, S680A and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-20Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A, T721V and T711S mutations.
  • Figure 13 is a graph that shows the production efficiency of the target protein encoded by the transgene after cell transduction with rAAV5-based preparations containing single mutations in the VP1 protein of the rAAV5 capsid wild-type.
  • AAV5-NullMut-FIX denotes a vector based on rAAV5 with wild-type capsid protein VP1.
  • AAV5-01Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-21Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the G226A mutation.
  • AAV5-22Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the D286E mutation.
  • AAV5-23Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the L341 Y mutation.
  • AAV5-24Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the C387V mutation.
  • AAV5-25Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the Q421H mutation.
  • AAV5-26Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with a P466T mutation.
  • AAV5-27Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S594Q mutation.
  • AAV5-28Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the T614L mutation.
  • AAV5-29Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the N679K mutation.
  • AAV5-30Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the P723V mutation.
  • AAV5-31Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the V431Y mutation.
  • AAV5-32Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the A616D mutation.
  • AAV5-33Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the W683R mutation.
  • AAV5-34Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S222A mutation.
  • AAV5-35Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the R285L mutation.
  • AAV5-36Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the Q340A mutation.
  • AAV5-37Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S420F mutation.
  • AAV5-38Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the S680A mutation.
  • AAV5-39Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with the T721V mutation.
  • Figure 14 is a graph that shows the production efficiency of the target protein encoded by the transgene after cell transduction with rAAV9-based preparations containing mutations in the wild-type rAAV9 capsid VP1 protein.
  • AAV9-NullMut-FIX designates rAAV9-based vector with wild-type capsid protein VP1
  • AAV9-01Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the S232T mutation.
  • AAV9-02Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the D297E mutation.
  • AAV9-03Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351K mutation.
  • AAV9-04Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351R mutation.
  • AAV9-05Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the C396V mutation.
  • AAV9-06Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a D433Y mutation.
  • AAV9-07Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the L444R mutation.
  • AAV9-08Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a Y478F mutation.
  • AAV9-09Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the G604N mutation.
  • AAV9-10Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the G627K mutation.
  • AAV9-1 IMut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T625L mutation
  • AAV9-12Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T625V mutation.
  • AAV9-13Mut-FIX denotes a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the S692T mutation
  • AAV9-14Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the T733V mutation.
  • AAV9-15Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the A427R mutation.
  • AAV9-16Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the M635D mutation.
  • AAV9-17Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the W695R mutation.
  • AAV9-18Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the R296L mutation.
  • AAV9-19Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the Q351A mutation.
  • AAV9-20Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with a Y395F mutation.
  • AAV9-21Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the R434L mutation.
  • AAV9-22Mut-FIX refers to a modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) vector containing a modified AAV9 capsid VP1 protein with the N691 A mutation.
  • Naturally occurring is used to describe an object that can be found in nature as being different from that produced artificially.
  • a protein or nucleotide sequence present in an organism that can be isolated from a source in nature, and that is not intentionally modified by a person skilled in the laboratory, is naturally occurring.
  • AAV Adeno-associated virus
  • Viruses of the Parvoviridae family are small DNA-containing animal viruses.
  • the family Parvoviridae can be divided into two subfamilies: Parvovirinae, whose members infect vertebrates, and Densovirinae, whose members infect insects.
  • Parvovirinae whose members infect vertebrates
  • Densovirinae whose members infect insects.
  • 11 adeno-associated virus serotypes had been described (Mori, S. ET AL., 2004, "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein", Virology, T. 330 (2): 375-83 ).
  • Adeno-associated virus serotype 12 was described (Michael Schmidt ET AL., Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity, J Virol. 2008 Feb;82 (3): 1399-406 doi: 10.1128/JVI.02012-07). All known serotypes can infect cells of many types of tissues. Tissue specificity is determined by the serotype of the capsid proteins; therefore, adeno-associated virus vectors are constructed by specifying the desired serotype. Additional information on parvoviruses and other members of the Parvoviridae is described in the literature (Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
  • the genomic organization of all known AAV serotypes is very similar.
  • the AAV genome is a linear single stranded DNA molecule that is less than about 5000 nucleotides (nt) in length.
  • Inverted terminal repeats (ITRs) flank the unique coding nucleotide sequences of proteins (Rep) necessary for the life cycle of the virus, as well as sequences of overlapping capsid proteins (Cap).
  • the Cap gene encodes VP proteins (VP1, VP2 and VP3) that form the capsid, as well as AAP proteins (Protein that activates the assembly of adeno-associated virus (AAV) Research F, Kother K, Schmidt K, et al.
  • the assemblyactivating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes J Virol 2011;85(23): 12686-12697 doi:10.1128/JVI.05359-l l) and MAAP (Membrane Binding Accessory Protein Ogden PJ, Kelsic ED, Yale S, Church GM Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design Science 2019;366(6469): 1139-1143 doi: 10.1126/science.aaw2900).
  • the flanking sequences of the AAV genome are self-complementary and arranged in such a way that an energetically stable intramolecular duplex can be formed, forming a T-shaped hairpin structure.
  • Such hairpin structures function as origins of viral DNA replication, serving as primers for the cellular DNA polymerase complex.
  • Rep genes eg, Rep78 and Rep52
  • Rep proteins are expressed by the P5 promoter and P19 promoter, respectively, and both Rep proteins have a specific function in viral genome replication.
  • Splicing in the Rep open reading frame results in the expression of actually four Rep proteins (eg, Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40).
  • Rep78 and Rep52 proteins has been shown to be sufficient for AAV vector production in mammalian cells.
  • Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked.
  • vector in this present document means a viral particle capable of transporting a nucleic acid.
  • expression is defined as the transcription and/or translation of a particular nucleotide sequence driven by its promoter.
  • “Delivery to a subject of a heterologous nucleic acid sequence” is the insertion of genes into cells and/or tissues of a subject.
  • subject refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient is a human.
  • the above subject may be male or female of any age.
  • the present invention relates to a method for producing a modified AAV capsid, which includes: a) determining the amino acids of the capsomer protein of the modified AAV located in the interface region of the interaction of neighboring pentamer subunits of the capsid; b) structural alignment of the modified AAV capsid with the template capsid to determine the pairwise correspondence between each amino acid of the modified AAV from the interaction interface between neighboring pentameric subunits and the closest amino acid of the template capsid, as a structural analogue of the original amino acid, which is considered as a potential replacement, where under the template capsid understand the capsid of a virus, similar in structure, selected from the family of parvoviruses (Parvoviridae), which is not AAV; c) pairwise comparison of the amino acid residues of the AAV capsid and the template capsid determined in step b) to identify structural differences between the modified AAV capsid and the template capsid at the interface between adjacent pentamer
  • the interface (or surface) of interaction is understood as a set of fragments of the polypeptide chain of the capsomere protein interacting with the amino acids of the neighboring pentameric subunit, where the pentameric subunit is understood as a structural element of the capsid in the form of a regular pentagon, consisting of 5 capsomere proteins located around the central pore (L. M. Drouin and M. Agbandje- McKenna, Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development, Future Virol., vol. 8, no. 12, pp. 1183-1199, 2013).
  • the following ranges of residues of the VP1 protein of the AAV5 capsid belong to the interaction interface between neighboring AAV5 pentameric subunits: , 611-626, 677-685, 721-724.
  • the following ranges of residues of the VP1 protein of the AAV9 capsid belong to the interface of interaction between neighboring AAV9 pentameric subunits: 230–236, 294–304, 350–353, 394–401, 421–444, 476–480, 601–609 , 622 - 637, 689 - 697, 733 - 736.
  • amino acid substitutions By “one or more amino acid substitutions” is meant one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten amino acid substitutions. For example, 1 to 10 amino acid substitutions, 1 to 9 amino acid substitutions, 1 to 8 amino acid substitutions, 1 to 7 amino acid substitutions, 1 to 6 amino acid substitutions, 1 to 5 amino acid substitutions, 1 to 4 amino acid substitutions, 1 to 3 amino acid substitutions, or 1 to 2 amino acid substitutions.
  • the method for producing a modified AAV capsid further comprises testing the modified AAV capsids obtained in step e) with one or more amino acid substitutions for one or more improved properties compared to an AAV capsid without these modifications, where one or more improved properties are selected from the group:
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the method for producing a modified AAV capsid further comprises testing the modified AAV capsids obtained in step e) for one or more improved properties compared to an AAV capsid without these modifications and selecting modified AAV capsids that have one or more improved properties according to compared to the AAV capsid without these modifications, where one or more improved properties are selected from the group:
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the modified AAV capsid is selected from the group consisting of: human AAV, simian AAV, or avian AAV.
  • the modified AAV capsid is selected from the group consisting of the following AAV serotypes: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16 , rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-l, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2 .5, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC
  • the capsid of the modified AAV may be a wild-type AAV capsid or an AAV capsid that includes one or more amino acid substitutions in the VP1, VP2, and/or VP3 proteins.
  • the capsid of the modified AAV may be a wild-type AAV5 capsid or an AAV5 capsid that includes one or more amino acid substitutions in the VP1, VP2, and/or VP3 proteins.
  • the modified AAV capsid may be an AAV5 capsid that includes the S2A and T711S amino acid substitutions in the VP1 protein.
  • the capsid of the modified AAV may be a wild-type AAV9 capsid or an AAV9 capsid that includes one or more amino acid substitutions in the VP1, VP2, and/or VP3 proteins.
  • the template similar in structure to the capsid is selected from the group that includes: parvovirus B19, human bocavirus 1 (HBoVl), bovine parvovirus (BVP).
  • the present invention relates to a modified AAV capsid for obtaining viral vectors based on recombinant adeno-associated virus, which is obtained by a method including: a) determining the amino acids of the modified AAV capsomere protein located in the interface region of the interaction of neighboring pentameric subunits of the capsid; b) structural alignment of the modified AAV capsid with the template capsid to determine the pairwise correspondence between each amino acid of the modified AAV from the interaction interface between neighboring pentameric subunits and the closest amino acid of the template capsid, as a structural analog of the original amino acid, which is considered as a potential replacement, where under the template capsid understand the capsid of a virus, similar in structure, selected from the family of parvoviruses (Parvoviridae), which is not AAV; c) pairwise comparison of the amino acid residues of the AAV capsid and the template capsid determined in step b) to identify structural differences between the modified AAV
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the capsid of the modified AAV is selected from the group consisting of: human AAV, simian AAV, or avian AAV.
  • the modified AAV capsid is selected from the group consisting of the following AAV serotypes: AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-l, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2
  • the modified AAV capsid may be a wild-type AAV capsid or an AAV capsid that includes one or more amino acid substitutions in the VP1, VP2, and/or VP3 proteins.
  • the modified AAV capsid may be a wild-type AAV5 capsid or an AAV5 capsid that includes one or more amino acid substitutions in the VP1, VP2, and/or VP3 proteins.
  • the modified AAV capsid may be an AAV5 capsid that includes the S2A and T711S amino acid substitutions in the VP1 protein.
  • the modified AAV capsid may be a wild-type AAV9 capsid or an AAV9 capsid that includes one or more amino acid substitutions in the VP1, VP2, and/or VP3 proteins.
  • the “right side” of the (+)-strand of the adeno-associated virus genomic DNA contains overlapping sequences encoding three capsid proteins, VP 1 , VP2, and VP3. Transcription of these genes begins with a single promoter, p40. The molecular weight of the corresponding proteins is 87, 72 and 62 kDa, respectively. All three proteins are translated from the same mRNA. After transcription, the pre-mRNA can be spliced in two different ways, whereby a longer or shorter intron is excised and mRNAs of 2300 or 2600 nucleotides in length are formed.
  • the introduction of mutations in the Cap gene will affect not only the VP1 protein of the AAV capsid, but also the proteins VP2 and VP3 of the AAV capsid.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV capsid VP1 protein that has an amino acid sequence selected from the group: 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 or 368.
  • an amino acid sequence selected from the group: 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 28
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV capsid VP2 protein that has an amino acid sequence selected from the group: SEQ ID Nos: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76 , 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226 , 232, 238, 244, 250, 256, 262, 268, 274, 280, 286, 292, 298, 304, 310, 316, 322, 328, 334, 340, 346, 352, 358, 364 or 370.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV capsid VP3 protein that has an amino acid sequence selected from the group: SEQ ID Nos: 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78 , 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228 , 234, 240, 246, 252, 258, 264, 270, 276, 282, 288, 294, 300, 306, 312, 318, 324, 330, 336, 342, 348, 354, 360, 366 or 372.
  • the modified AAV capsid comprises: a) a modified AAV capsid VP1 protein that has an amino acid sequence selected from the group: SEQ III No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218 224 230 236 242 248 254 260 266 272 278 284 290 296 302 308 314 320 326 332 338 344 350 356 362 or 368; b) a modified AAV capsid VP2 protein corresponding to its VP1 protein, which has an amino acid sequence selected from the group: SEQ W No: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100,
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a G226A substitution (AAV5 Capsid VP1 G226A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 14.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a G90A substitution (AAV5 Capsid VP2 G90A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 16.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a G34A substitution (AAV5 Capsid VP3 G34A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 18
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the S2A, G226A, and T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A, G226A, and T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 20.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes the G90A and T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 G90A and T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 22.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes G34A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 G34A T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 24.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a D286E substitution (AAV5 Capsid VP1 D286E) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 26.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a D150E substitution (AAV5 Capsid VP2 D150E) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 28.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a D94E substitution (AAV5 Capsid VP3 D94E) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 30.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the S2A, D286E, and T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A, D286E, and T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 32.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes D150E and T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 D150E and T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 34
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes D94E and T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 D94E and T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 36.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an L341Y substitution (AAV5 Capsid VP1 L341Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 38.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an L205Y substitution (AAV5 Capsid VP2 L205Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 40.
  • the modified capsid is a modified capsid
  • AAV includes a modified AAV5 capsid protein VP3 that includes a substitution L149Y (AAV5 Capsid VP3 L149Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 42.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the substitutions S2A, L341Y, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, L341Y, T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 44.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes substitutions L205Y, T575S (AAV5 Capsid VP2 L205Y, T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 46.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions L149Y, T519S (AAV5 Capsid VP3 L149Y, T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 48.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a C387V substitution (AAV5 Capsid VP1 C387V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 50.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a C251V substitution (AAV5 Capsid VP2 C251V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 52.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a C195V substitution (AAV5 Capsid VP3 C195V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 54.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the substitutions S2A, C387V, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, C387V, T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 56.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes C251V, T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 C251V, T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 58.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes C195V, T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 C195V, T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 60.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a Q421H substitution (AAV5 Capsid VP1 Q421H) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 62.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a Q285H substitution (AAV5 Capsid VP2 Q285H) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 64.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a Q229H substitution (AAV5 Capsid VP3 Q229H) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 66.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A Q421H T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A Q421H T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 68.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes Q285H T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 Q285H T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 70.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes Q229H T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 Q229H T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 72.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a P466T substitution (AAV5 Capsid VP1 P466T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 74.
  • the modified capsid is a modified capsid
  • AAV includes a modified AAV5 capsid protein VP2 that includes a substitution P330T (AAV5 Capsid VP2 P33OT) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 76.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a P274T substitution (AAV5 Capsid VP3 P274T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 78.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A P466T T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A P466T T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 80.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes P33OT T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 P33OT T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 82.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes P274T T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 P274T T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 84.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the S594Q substitution (AAV5 Capsid VP1 S594Q) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 86.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S458Q substitution (AAV5 Capsid VP2 S458Q) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 88.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes the S402Q substitution (AAV5 Capsid VP3 S402Q) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 90.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S594Q T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S594Q T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 92.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S458Q T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S458Q T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 94.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S402Q T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S402Q T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 96.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes T614L substitutions (AAV5 Capsid VP1 T614L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 98.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes T478L substitutions (AAV5 Capsid VP2 T478L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 100.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes T422L substitutions (AAV5 Capsid VP3 T422L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 102.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A T614L T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A T614L T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 104.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes T478L T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 T478L T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 106.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions (AAV5 Capsid VP3 T422L T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 108.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP1 that includes a substitution N679K (AAV5 Capsid VP1 N679K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 110.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an N543K substitution (AAV5 Capsid VP2 N543K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 112.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an N487K substitution (AAV5 Capsid VP3 N487K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 114.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A N679K T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A N679K T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 116.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes N543K T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 N543K T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 118.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes N487K T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 N487K T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 120.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a P723 V substitution (AAV5 Capsid VP1 P723 V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 122.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a P587V substitution (AAV5 Capsid VP2 P587V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 124.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a P53 IV substitution (AAV5 Capsid VP3 P53 IV) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 126.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes P723V T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A P723V T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 128.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes P587V T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 P587V T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 130.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes P531V T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 P531V T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 132.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a V431Y substitution (AAV5 Capsid VP1 V431Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 134.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a V295Y substitution (AAV5 Capsid VP2 V295Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 136.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a V239Y substitution (AAV5 Capsid VP3 V239Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 138.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A V431Y T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A V431Y T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 140.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes V295Y T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 V295Y T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 142.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that includes substitutions V239Y T519S (AAV5 Capsid VP3 V239Y T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 144.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an A616D substitution (AAV5 Capsid VP1 A616D) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 146.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an A480D substitution (AAV5 Capsid VP2 A480D) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 148.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an A424D substitution (AAV5 Capsid VP3 A424D) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 150.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A A616D T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A A616D T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 152.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes A480D T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 A480D T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 154.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes A424D T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 A424D T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 156.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a W683R substitution (AAV5 Capsid VP1 W683R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 158.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a W547R substitution (AAV5 Capsid VP2 W547R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 160.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a W491R substitution (AAV5 Capsid VP3 W491R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 162.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A W683R T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A W683R T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 164.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes W547R T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 W547R T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 166.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes W491R T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 W491R T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 168.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an S222A substitution (AAV5 Capsid VP1 S222A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 170.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S86A substitution (AAV5 Capsid VP2 S86A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 172.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S30A substitution (AAV5 Capsid VP3 S30A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 174.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S222A T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S222A T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 176.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes substitutions S86A T575S (AAV5 Capsid VP2 S86A T575S) and has the amino acid sequence of SEQ ID No: 178.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S30A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S30A T519S) and has the amino acid sequence of SEQ ID No: 180.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an R285L substitution (AAV5 Capsid VP1 R285L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 182.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an R149L substitution (AAV5 Capsid VP2 R149L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 184.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an R93L substitution (AAV5 Capsid VP3 R93L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 186.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A R285L T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A R285L T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 188.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes R149L T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 R149L T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 190.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes R93L T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 R93L T519S) and has the amino acid sequence of SEQ ID No: 192.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a Q340A substitution (AAV5 Capsid VP1 Q340A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 194.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a substitution (AAV5 Capsid VP2 Q204A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 196.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a Q148A substitution (AAV5 Capsid VP3 Q148A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 198.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A Q340A T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A Q340A T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 200.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes Q204A T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 Q204A T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 202.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes Q148A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 Q148A T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 204.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an S420F substitution (AAV5 Capsid VP1 S420F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 206.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S284F substitution (AAV5 Capsid VP2 S284F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 208.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S228F substitution (AAV5 Capsid VP3 S228F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 210.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S420F T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S420F T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 212.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S284F T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S284F T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 214.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S228F T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S228F T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 216.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the S680A substitution (AAV5 Capsid VP1 S680A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 218.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S544A substitution (AAV5 Capsid VP2 S544A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 220.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S488A substitution (AAV5 Capsid VP3 S488A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 222.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S680A T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S680A T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 224.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S544A T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S544A T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 226.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S488A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S488A T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 228.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP1 that includes the substitution T721V (AAV5 Capsid VP1 T721V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 230.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a T585V substitution (AAV5 Capsid VP2 T585V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 232.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a T529V substitution (AAV5 Capsid VP3 T529V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 234.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A T721V T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A T721V T711S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 236.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes T585V T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 T585V T575S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 238.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes T529V T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 T529V T519S) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 240.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Q351K substitution (AAV9 Capsid VP1 Q351K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 242.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Q214K substitution (AAV9 Capsid VP2 Q214K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 244.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Q149K substitution (AAV9 Capsid VP3 Q149K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 246.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Q351R substitution (AAV9 Capsid VP1 Q351R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 248.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Q214R substitution (AAV9 Capsid VP2 Q214R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 250.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Q149R substitution (AAV9 Capsid VP3 Q149R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 252.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an S232T substitution (AAV9 Capsid VP1 S232T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 254.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an S95T substitution (AAV9 Capsid VP2 S95T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 256.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an S30T substitution (AAV9 Capsid VP3 S30T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 258.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a D297E substitution (AAV9 Capsid VP1 D297E) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 260.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a D160E substitution (AAV9 Capsid VP2 D160E) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 262.
  • the modified capsid is a modified capsid
  • AAV includes a modified AAV9 capsid protein VP3 that includes a substitution D95E (AAV9 Capsid VP3 D95E) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 264.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes the S692T substitution (AAV9 Capsid VP1 S692T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 266.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an S555T substitution (AAV9 Capsid VP2 S555T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 268.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an S490T substitution (AAV9 Capsid VP3 S490T) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 270.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a D433Y substitution (AAV9 Capsid VP1 D433Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 272.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a D296Y substitution (AAV9 Capsid VP2 D296Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 274.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a D231Y substitution (AAV9 Capsid VP3 D231Y) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 276.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a T625L substitution (AAV9 Capsid VP1 T625L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 278.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a T488L substitution (AAV9 Capsid VP2 T488L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 280.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a T423L substitution (AAV9 Capsid VP3 T423L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 282.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a T625V substitution (AAV9 Capsid VP1 T625V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 284.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a T488V substitution (AAV9 Capsid VP2 T488V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 286.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a T423V substitution (AAV9 Capsid VP3 T423V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 288.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an N691A substitution (AAV9 Capsid VP1 N691A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 290.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an N554A substitution (AAV9 Capsid VP2 N554A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 292.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an N489A substitution (AAV9 Capsid VP3 N489A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 294.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a C396V substitution (AAV9 Capsid VP1 C396V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 296.
  • the modified capsid is a modified capsid
  • AAV includes a modified AAV9 capsid protein VP2 that includes a substitution C259V (AAV9 Capsid VP2 C259V) and has the amino acid sequence SEQ III No: 298.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a C194V substitution (AAV9 Capsid VP3 C194V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 300.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Y478F substitution (AAV9 Capsid VP1 Y478F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 302.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Y341F substitution (AAV9 Capsid VP2 Y341F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 304.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Y276F substitution (AAV9 Capsid VP3 Y276F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 306.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an R296L substitution (AAV9 Capsid VP1 R296L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 308.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an R159L substitution (AAV9 Capsid VP2 R159L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 310.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an R94L substitution (AAV9 Capsid VP3 R94L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 312.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a T733V substitution (AAV9 Capsid VP1 T733V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 314.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a T596V substitution (AAV9 Capsid VP2 T596V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 316.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a T531V substitution (AAV9 Capsid VP3 T531V) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 318.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an A427R substitution (AAV9 Capsid VP1 A427R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 320.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an A290R substitution (AAV9 Capsid VP2 A290R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 322.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an A225R substitution (AAV9 Capsid VP3 A225R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 324.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an M635D substitution (AAV9 Capsid VP1 M635D) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 326.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an M498D substitution (AAV9 Capsid VP2 M498D) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 328.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an M433D substitution (AAV9 Capsid VP3 M433D) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 330.
  • the modified capsid is a modified capsid
  • AAV includes a modified AAV9 capsid protein VP1 that includes a substitution L444R (AAV9 Capsid VP1 L444R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 332.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an L307R substitution (AAV9 Capsid VP2 L307R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 334.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an L242R substitution (AAV9 Capsid VP3 L242R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 336.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a G604N substitution (AAV9 Capsid VP1 G604N) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 338.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a G467N substitution (AAV9 Capsid VP2 G467N) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 340.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a G402N substitution (AAV9 Capsid VP3 G402N) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 342.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a G627K substitution (AAV9 Capsid VP1 G627K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 344.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a G490K substitution (AAV9 Capsid VP2 G490K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 346.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a G425K substitution (AAV9 Capsid VP3 G425K) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 348.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a W695R substitution (AAV9 Capsid VP1 W695R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 350.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a W558R substitution (AAV9 Capsid VP2 W558R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 352.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a W493R substitution (AAV9 Capsid VP3 W493R) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 354.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Q351A substitution (AAV9 Capsid VP1 Q351A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 356.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Q214A substitution (AAV9 Capsid VP2 Q214A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 358.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Q149A substitution (AAV9 Capsid VP3 Q149A) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 360.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Y395F substitution (AAV9 Capsid VP1 Y395F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 362.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Y258F substitution (AAV9 Capsid VP2 Y258F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 364.
  • the modified capsid is a modified capsid
  • AAV includes a modified AAV9 capsid protein VP3 that includes a substitution Y193F (AAV9 Capsid VP3 Y193F) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 366.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an R434L substitution (AAV9 Capsid VP1 R434L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 368.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an R297L substitution (AAV9 Capsid VP2 R297L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 370.
  • the modified AAV capsid comprises a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a substitution (AAV9 Capsid VP3 R232L) and has the amino acid sequence of SEQ III No: 372.
  • the natural sequence of the wild-type AAV5 capsid VP1 protein is represented by the amino acid sequence of SEQ ID No: 2
  • the natural sequence of the wild-type AAV5 capsid VP2 protein is represented by the amino acid sequence of SEQ III No: 4
  • the natural sequence of the VP3 protein the wild-type AAV5 capsid is represented by the amino acid sequence of SEQ III No: 6.
  • the natural sequence of the wild-type AAV9 capsid VP1 protein (AAV9 Capsid VP1 WT) is represented by the amino acid sequence of SEQ III No: 373
  • the natural sequence of the wild-type AAV9 capsid protein VP2 (AAV9 Capsid VP2 WT) is represented by the amino acid sequence of SEQ III No: 375
  • the natural sequence of the VP3 protein the wild-type AAV9 capsid is represented by the amino acid sequence of SEQ III No: 377.
  • the inventors have found that the above modified AAV capsids have one or more improved properties compared to the AAV capsid without these modifications (wild type), which are selected from the group:
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the present invention relates to a nucleic acid that encodes any of the above modified capsids.
  • the nucleic acid molecule may be isolated.
  • nucleic acid refers to a distinct sequence of nucleotides, whether or not modified. modified, defining a fragment or region of a nucleic acid, containing or not containing non-natural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of these DNA.
  • polynucleotides include, but are not limited to, all nucleic acid sequences obtained by any means available in the art, including, but not limited to, recombinant methods, i. cloning nucleic acid sequences from a recombinant library or cell genome, using conventional cloning technology and TTPR, and the like, and synthetic methods.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment i.e. in a natural state.
  • the sequences of the present invention have been isolated and/or purified, i. were taken directly or indirectly, for example, by copying.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination for example by means of host cells, or obtained by chemical synthesis, are also to be understood here.
  • nucleic acid having a particular sequence is to be understood as encompassing its complementary strand with its complementary sequence .
  • An "isolated" nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is normally associated in the natural source of an antibody nucleic acid.
  • An isolated nucleic acid molecule is different from the form or set in which it occurs naturally.
  • an isolated nucleic acid molecule is different from a nucleic acid molecule that exists naturally in cells.
  • the isolated nucleic acid is DNA.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a G226A (AAV5 Capsid VP1 G226A) substitution that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 13 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a G90A substitution (AAV5 Capsid VP2 G90A) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 15 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a G34A substitution (AAV5 Capsid VP3 G34A) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 17 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes the S2A, G226A, and T71 IS substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A, G226A, and T711S) that has the nucleotide sequence SEQ III No: 19 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes G90A and T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 G90A and T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 21 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes G34A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 G34A T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 23, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a D286E substitution (AAV5 Capsid VP1 D286E) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 25 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a D150E substitution (AAV5 Capsid VP2 D150E) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 27 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a D94E substitution (AAV5 Capsid VP3 D94E) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 29 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid protein VP1 that includes substitutions S2A, D286E, and T711 S (AAV5 Capsid VP1 S2A, D286E, and T711 S) that has a nucleotide the sequence of SEQ III No: 31 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of this modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes substitutions D150E and T575S (AAV5 Capsid VP2 D150E and T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 33 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes D94E and T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 D94E and T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 35 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an L341Y substitution (AAV5 Capsid VP1 L341Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 37 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an L205Y substitution (AAV5 Capsid VP2 L205Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 39 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an L149Y substitution (AAV5 Capsid VP3 L149Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 41 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes substitutions S2A, L341Y, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, L341Y, T711S) that has the nucleotide sequence SEQ ⁇ No: 43 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of this modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes substitutions L205Y, T575S (AAV5 Capsid VP2 L205Y, T575S), which has the nucleotide sequence of SEQ III No: 45 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions L149Y, T519S (AAV5 Capsid VP3 L149Y, T519S), which has the nucleotide sequence of SEQ III No: 47 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a C387V substitution (AAV5 Capsid VP1 C387V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 49 or any other nucleotide sequence. sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a C251V substitution (AAV5 Capsid VP2 C251V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 51 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a C195V substitution (AAV5 Capsid VP3 C195V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 53 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • the isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes substitutions S2A, C387V, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, C387V, T711S) that has the nucleotide sequence SEQ ⁇ No: 55 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of this modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes substitutions C251V, T575S (AAV5 Capsid VP2 C251V, T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 57 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions C195V, T519S (AAV5 Capsid VP3 C195V, T519S), which has the nucleotide sequence of SEQ III No: 59 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a Q421H substitution (AAV5 Capsid VP1 Q421H) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 61 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a Q285H substitution (AAV5 Capsid VP2 Q285H) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 63 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a Q229H substitution (AAV5 Capsid VP3 Q229H) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 65 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A Q421H T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A Q421H T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 67 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes Q285H T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 Q285H T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 69 or any another nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes Q229H T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 Q229H T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 71 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a P466T substitution (AAV5 Capsid VP1 P466T) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 73 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a P33OT substitution (AAV5 Capsid VP2 P33OT) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 75 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a P274T substitution (AAV5 Capsid VP3 P274T) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 77 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A P466T T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A P466T T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 79 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes P33OT T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 P33OT T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 81 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes P274T T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 P274T T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 83 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an S594Q substitution (AAV5 Capsid VP1 S594Q) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 85 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S458Q substitution (AAV5 Capsid VP2 S458Q) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 87 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S402Q substitution (AAV5 Capsid VP3 S402Q) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 89 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S594Q T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S594Q T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 91 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S458Q T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S458Q T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 93, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S402Q T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S402Q T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 95, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes T614L substitutions (AAV5 Capsid VP1 T614L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 97 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes T478L substitutions (AAV5 Capsid VP2 T478L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 99 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes T422L substitutions (AAV5 Capsid VP3 T422L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 101 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A T614L T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A T614L T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 103 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes T478L T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 T478L T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 105, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions (AAV5 Capsid VP3 T422L T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 107 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid protein VP1 that includes the N679K substitution (AAV5 Capsid VP1 N679K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 109 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an N543K substitution (AAV5 Capsid VP2 N543K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 111 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an N487K substitution (AAV5 Capsid VP3 N487K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: IZ or any other nucleotide sequence a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes substitutions S2A N679K T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A N679K T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 115 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes N543K T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 N543K T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 117 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes N487K T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 N487K T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 119 or any another nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a P723V substitution (AAV5 Capsid VP1 P723V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 121 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a P587V substitution (AAV5 Capsid VP2 P587V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 123 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a P531V substitution (AAV5 Capsid VP3 P531V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 125 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes P723V T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A P723V T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 127 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes P587V T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 P587V T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 129 or any another nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes P531V T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 P531V T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 131 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a V431Y substitution (AAV5 Capsid VP1 V431Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 133 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a V295Y substitution (AAV5 Capsid VP2 V295Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 135 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a V239Y substitution (AAV5 Capsid VP3 V239Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 137 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A V431Y T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A V431Y T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 139 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes V295Y T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 V295Y T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 141 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes V239Y T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 V239Y T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 143 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an A616D substitution (AAV5 Capsid VP1 A616D) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 145 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an A480D substitution (AAV5 Capsid VP2 A480D) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 147 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV5 Capsid VP2 A480D AAV5 Capsid VP2 A480D
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an A424D substitution (AAV5 Capsid VP3 A424D) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 149 or any other nucleotide sequence. sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A A616D T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A A616D T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 151 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes A480D T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 A480D T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 153, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes A424D T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 A424D T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 155, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a W683R substitution (AAV5 Capsid VP1 W683R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 157 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a W547R substitution (AAV5 Capsid VP2 W547R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 159 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a W491R substitution (AAV5 Capsid VP3 W491R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 161 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes substitutions S2A W683R T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A W683R T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 163 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes W547R T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 W547R T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 165 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions W491R T519S (AAV5 Capsid VP3 W491R T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 167 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid protein VP1 that includes an S222A substitution (AAV5 Capsid VP1 S222A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 169 or any other nucleotide sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S86A substitution (AAV5 Capsid VP2 S86A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 171 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S30 A substitution (AAV5 Capsid VP3 S30A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 173 or any other a nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV5 Capsid VP3 S30A S30 A substitution
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S222A T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S222A T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 175 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S86A T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S86A T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 177, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S30A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S30A T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 179 or any another nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an R285L substitution (AAV5 Capsid VP1 R285L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 181 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an R149L substitution (AAV5 Capsid VP2 R149L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 183 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an R93L substitution (AAV5 Capsid VP3 R93L) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 185 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A R285L T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A R285L T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 187 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes R149L T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 R149L T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 189 or any another nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes R93L T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 R93L T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 191 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a Q340A substitution (AAV5 Capsid VP1 Q340A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 193 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a substitution (AAV5 Capsid VP2 Q204A) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 195 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a Q148A substitution (AAV5 Capsid VP3 Q148A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 197 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV5 Capsid VP3 Q148A AAV5 Capsid VP3 Q148A
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A Q340A T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A Q340A T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 199 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes substitutions Q204A T575S (AAV5 Capsid VP2 Q204A T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 201 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes substitutions Q148A T519S (AAV5 Capsid VP3 Q148A T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 203 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an S420F substitution (AAV5 Capsid VP1 S420F) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 205 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S284F substitution (AAV5 Capsid VP2 S284F) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 207 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S228F substitution (AAV5 Capsid VP3 S228F) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 209 or any other nucleotide sequence. sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes S2A S420F T711S substitutions (AAV5 Capsid VP1 S2A S420F T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 211 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S284F T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S284F T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 213, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S228F T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S228F T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 215, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes an S680A substitution (AAV5 Capsid VP1 S680A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 217 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes an S544A substitution (AAV5 Capsid VP2 S544A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 219 or any other nucleotide sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes an S488A substitution (AAV5 Capsid VP3 S488A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 221 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes substitutions S2A S680A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S680A T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 223 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes S544A T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 S544A T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 225, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes S488A T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 S488A T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 227, or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes a T721V substitution (AAV5 Capsid VP1 T721V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 229 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes a T585V substitution (AAV5 Capsid VP2 T585V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 231 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes a T529V substitution (AAV5 Capsid VP3 T529V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 233 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP1 protein that includes substitutions S2A T721V T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A T721V T711S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 235 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP2 protein that includes T585V T575S substitutions (AAV5 Capsid VP2 T585V T575S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 237 or any another nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV5 capsid VP3 protein that includes T529V T519S substitutions (AAV5 Capsid VP3 T529V T519S) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 239 or any another nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Q351K substitution (AAV9 Capsid VP1 Q351K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 241 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Q214K substitution (AAV9 Capsid VP2 Q214K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 243 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Q149K substitution (AAV9 Capsid VP3 Q149K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 245 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Q351R substitution (AAV9 Capsid VP1 Q351R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 247 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Q214R substitution (AAV9 Capsid VP2 Q214R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 249 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Q149R substitution (AAV9 Capsid VP3 Q149R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 251 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an S232T substitution (AAV9 Capsid VP1 S232T) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 253 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an S95T substitution (AAV9 Capsid VP2 S95T) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 255 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an S30T substitution (AAV9 Capsid VP3 S30T) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 257 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a D297E substitution (AAV9 Capsid VP1 D297E) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 259 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a D160E substitution (AAV9 Capsid VP2 D160E) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 261 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV9 Capsid VP2 D160E D160E substitution
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a D95E substitution (AAV9 Capsid VP3 D95E) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 263 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an S692T substitution (AAV9 Capsid VP1 S692T) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 265 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an S555T substitution (AAV9 Capsid VP2 S555T) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 267 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an S490T substitution (AAV9 Capsid VP3 S490T) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 269 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a D433Y substitution (AAV9 Capsid VP1 D433Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 271 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a D296Y substitution (AAV9 Capsid VP2 D296Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 273 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a D231Y substitution (AAV9 Capsid VP3 D231Y) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 275 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a T625L substitution (AAV9 Capsid VP1 T625L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 277 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a T488L substitution (AAV9 Capsid VP2 T488L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 279 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a T423L substitution (AAV9 Capsid VP3 T423L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 281 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a T625V substitution (AAV9 Capsid VP1 T625V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 283 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a T488V substitution (AAV9 Capsid VP2 T488V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 285 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a T423V substitution (AAV9 Capsid VP3 T423V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 287 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an N691A substitution (AAV9 Capsid VP1 N691A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 289 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an N554A substitution (AAV9 Capsid VP2 N554A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 291 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an N489A substitution (AAV9 Capsid VP3 N489A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 293 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a C396V substitution (AAV9 Capsid VP1 C396V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 295 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a C259V substitution (AAV9 Capsid VP2 C259V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 297 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a C194V substitution (AAV9 Capsid VP3 C194V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 299 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Y478F substitution (AAV9 Capsid VP1 Y478F) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 301 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Y341F substitution (AAV9 Capsid VP2 Y341F) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 303 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Y276F substitution (AAV9 Capsid VP3 Y276F) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 305 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an R296L substitution (AAV9 Capsid VP1 R296L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 307 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV9 Capsid VP1 R296L R296L substitution
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an R159L substitution (AAV9 Capsid VP2 R159L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 309 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an R94L substitution (AAV9 Capsid VP3 R94L) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 311 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a T733V substitution (AAV9 Capsid VP1 T733V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 313 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a T596V substitution (AAV9 Capsid VP2 T596V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 315 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a T531V substitution (AAV9 Capsid VP3 T531V) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 317 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an A427R substitution (AAV9 Capsid VP1 A427R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 319 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV9 Capsid VP1 A427R A427R substitution
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an A290R substitution (AAV9 Capsid VP2 A290R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 321 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an A225R substitution (AAV9 Capsid VP3 A225R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 323 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an M635D substitution (AAV9 Capsid VP1 M635D) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 325 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an M498D substitution (AAV9 Capsid VP2 M498D) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 327 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV9 Capsid VP2 M498D M498D substitution
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an M433D substitution (AAV9 Capsid VP3 M433D) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 329 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an L444R substitution (AAV9 Capsid VP1 L444R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 331 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an L307R substitution (AAV9 Capsid VP2 L307R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 333 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes an L242R substitution (AAV9 Capsid VP3 L242R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 335 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid protein VP1 that includes a G604N substitution (AAV9 Capsid VP1 G604N) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 337 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a G467N substitution (AAV9 Capsid VP2 G467N) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 339 or any other nucleotide sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a G402N substitution (AAV9 Capsid VP3 G402N) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 341 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a G627K substitution (AAV9 Capsid VP1 G627K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 343 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a G490K substitution (AAV9 Capsid VP2 G490K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 345, or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV9 Capsid VP2 G490K AAV9 Capsid VP2 G490K
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a G425K substitution (AAV9 Capsid VP3 G425K) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 347 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a W695R substitution (AAV9 Capsid VP1 W695R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 349 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a W558R substitution (AAV9 Capsid VP2 W558R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 351 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a W493R substitution (AAV9 Capsid VP3 W493R) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 353 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Q351A substitution (AAV9 Capsid VP1 Q351A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 355 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Q214A substitution (AAV9 Capsid VP2 Q214A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 357 or any other nucleotide a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • AAV9 Capsid VP2 Q214A AAV9 Capsid VP2 Q214A
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Q149A substitution (AAV9 Capsid VP3 Q149A) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 359 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes a Y395F substitution (AAV9 Capsid VP1 Y395F) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 361 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes a Y258F substitution (AAV9 Capsid VP2 Y258F) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 363 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a Y193F substitution (AAV9 Capsid VP3 Y193F) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 365 or any other nucleotide sequence. a sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP1 protein that includes an R434L substitution (AAV9 Capsid VP1 R434L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: SEQ III No: 367 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP2 protein that includes an R297L substitution (AAV9 Capsid VP2 R297L) that has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 369 or any other nucleotide sequence. sequence that encodes the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • an isolated nucleic acid that encodes a modified capsid comprises a nucleic acid encoding a modified AAV9 capsid VP3 protein that includes a substitution (AAV9 Capsid VP3 R232L) that has the nucleotide sequence of SEQ III No: 371 or any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified protein.
  • any other nucleotide sequence encoding the corresponding amino acid sequence of this modified protein is meant a nucleic sequence that is alternative to the specified nucleic sequence, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different DNA sequences can encode the same amino acid sequence. Those skilled in the art are well aware of the generation of such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • an isolated nucleic acid that encodes any of the above modified capsids comprises any of the above nucleic acid sequences, or combinations thereof.
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the rAAV-based vector comprises a heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product, wherein the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the rAAV-based vector of the invention does not contain the nucleotide sequences of the genes encoding the protein sequences (Rep) necessary to ensure the life cycle of the virus, as well as the sequences of overlapping capsid proteins (Cap).
  • regulatory sequences that allow expression of the product encoded by a heterologous nucleic acid sequence in target cells is meant within the scope of this invention polynucleotide sequences that are necessary to influence the expression and processing of the coding sequences to which they are cloned.
  • Expression control sequences include the appropriate transcription initiation, termination, promoter and enhancer sequences; efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (ie Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, optionally, sequences that enhance protein secretion.
  • regulatory sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences typically include promoters and transcription termination sequences.
  • the term "regulatory sequences" includes, at a minimum, all components whose presence is essential for expression and processing, and may also include additional components whose presence is beneficial, such as leader peptide sequences.
  • promoter refers to a nucleic acid fragment that controls the transcription of one or more coding sequences, and which is also structurally identified by the presence of a binding site for DNA-dependent RNA polymerase, transcription initiation sites, and other DNA sequences, including, but not limited to, transcription factor binding sites, protein repressor and activator binding sites, and any other nucleotide sequences known to those skilled in the art that directly or indirectly regulate the level of transcription with this promoter.
  • a “constitutive” promoter is one that is active in most tissues under normal physiological and developmental conditions.
  • An “inducible” promoter is a promoter that is subject to physiological or developmental regulation, such as when exposed to a chemical inducer.
  • a "tissue-specific” promoter is only active in specific tissue or cell types.
  • CMV cytomegalovirus
  • a promoter or promoter/enhancer derived from the immediate early (IE) region of human cytomegalovirus (hCMV) is particularly suitable as a promoter for the rAAV5 vector of the present invention.
  • hCMV human cytomegalovirus
  • IE immediate early region
  • functional expression triggering and/or functional expression enhancing fragments derived therefrom are, for example, described in EP0173177 and EP0323997 and are well known in the art.
  • fragments of the hCMV immediate early (IE) region can be used as a promoter and/or a promoter/enhancer.
  • Enhancer elements may refer to a DNA sequence that is located adjacent to a DNA sequence encoding a recombinant product.
  • Enhancer elements are typically located 5' from the promoter element, or may be located downstream or within the DNA coding sequence (eg, the DNA sequence transcribed or translated into the recombinant product or products).
  • the enhancer element can be located 100 base pairs, 200 base pairs, or 300 or more base pairs before or after the DNA sequence that encodes the recombinant product. sequences. Enhancer elements can increase the amount of expressed recombinant product from a DNA sequence, exceeding the expression due to a single promoter element. Many enhancer elements are available to those skilled in the art.
  • a heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells may include the following elements in the direction from the 5'end to the 3'end: left (first) ITR (inverted terminal repeats);
  • CMV cytomegalovirus
  • CMV cytomegalovirus
  • hBGl gene intron hemoglobin gamma-1 subunit gene
  • a nucleic acid encoding a product hGHl polyadenylation signal (human growth hormone gene polyadenylation signal); right (second) ITR.
  • the nucleic acid encoding the product is at least one gene encoding a protein.
  • the transgene encodes at least one small inhibitor nucleic acid.
  • the transgene encodes at least one reporter molecule.
  • the small inhibitory nucleic acid is miRNA.
  • the small inhibitory nucleic acid is a sponge miRNA or TuD-RNA that inhibits the activity of at least one miRNA in an animal.
  • the miRNA is expressed in a cell of the target tissue.
  • the target tissue is liver, central nervous system (CNS), eye, gastrointestinal, respiratory, breast, pancreatic, urinary tract, or uterine tissue.
  • the rAAV vector has an expression product of a heterologous nucleic acid sequence that is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the rAAV-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that represents is a therapeutic polypeptide, where the therapeutic polypeptide is a blood coagulation factor selected from the group consisting of factor VIII, factor IX, or a functional variant thereof.
  • the rAAV-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a factor VIII product or a functional variant thereof.
  • the rAAV-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a factor IX product or a functional variant thereof.
  • the rAAV-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is an SMN 1 protein (motor neuron survival protein)
  • the rAAV-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is an RBD-S (recombinant glycoprotein S receptor-binding domain) polypeptide of the SARS-cov2 virus (type 2 coronavirus that causes severe acute respiratory syndrome).
  • RBD-S recombinant glycoprotein S receptor-binding domain
  • Gene synthesis The desired gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments from 300 to 4000 bp in length, which are flanked by unique restriction sites, were assembled by annealing and oligonucleotide ligation, including PCR amplification and subsequent cloning through the indicated restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • DNA sequences were determined by Sanger sequencing.
  • Infomax's Vector NTI Advance suite version 8.0 and SnapGene version 5.1.4.1 were used to create, map, analyze, annotate and illustrate sequences.
  • Results are presented as mean ⁇ standard deviation (SD), analysis of variance (ANOVA) was used to compare test and control results and were determined to be statistically significant.
  • the AAV5 capsid mutation design is based on the high degree of structural similarity between the capsid proteins within the parvovirus (Parvoviridae) family, including non-AAV viruses.
  • the selection of a replacement consists of three stages and includes:
  • template capsid structural alignment of the modified AAV5 capsid with the capsid of one of the non-AAV parvoviruses
  • the structures of the AAV5 3D models and the template capsid are preliminarily prepared, which consists in completing the construction of the missing atoms in the structure using the Prepwizard utility from the Schrodinger Suite package.
  • the interaction interface is understood as a set of fragments of the polypeptide chain of the capsomere protein interacting with the amino acids of the neighboring pentameric subunit, where the pentameric subunit is understood as a structural element of the capsid in the form of a regular pentagon, consisting of 5 capsomer proteins, located around the central pore (L. M. Drouin and M. Agbandje-McKenna. Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development. Future Virol., vol. 8, no. 12, pp. 1183-1199, 2013. ).
  • the AAV5 capsid and the template capsid are structurally aligned using the Structure Alignment utility of the Schrodinger Suite. Based on the results of alignment, for each AAV5 amino acid from the interaction interface of neighboring pentameric subunits, the closest amino acid of the template capsid (structural analog of the original amino acid) is determined, which is considered as a potential replacement. There is no structural analogue of the original amino acid if another AAV5 amino acid is located in the vicinity of the template capsid amino acid closest to it, the distance to which is less than to the original amino acid. It is understood here that the distance between amino acids is estimated from the distance between alpha carbons.
  • Example 2 Design of mutations based on the principle of increasing the volume of an amino acid residue
  • the volume of the side substituent of the amino acid from the template capsid is greater than the volume of the side substituent of the original amino acid
  • the amino acid from the template capsid is not a cysteine or methionine.
  • cysteine and methionine from among the amino acids for potential replacement is due to their significant reactivity, in particular, the ability to oxidize.
  • HBoVl (PDBid 5urf), B19 (PDBid ls58), BPV (PDBid 4qc8) are shown in Table 2.
  • the first column shows the amino acids from the interaction interface of neighboring pentameric capsid subunits AAV5, the remaining columns show amino acids obtained by pairwise structural alignment of AAV5 for each of the HBoV1, B19, and BPV capsids.
  • An asterisk indicates amino acids suitable for substitution in accordance with the criterion of the size of the lateral substituent and the prohibition of substitution for cysteine and methionine.
  • the following ranges of VP1 protein residues belong to the interaction interface between neighboring AAV5 pentameric subunits AAV5 capsid: 220 - 226, 283 - 293, 339 - 342, 385 - 392, 412 - 435, 462 - 466, 590 - 598, 611 - 626, 677 - 685, 721-724.
  • Example 3 Design of mutations based on the principle of increasing the number of polar contacts between capsomeres.
  • Example 1 following the results of the structural alignment of the AAV5 capsid and the template capsid, we have a pairwise structural correspondence between their amino acid residues.
  • the decision to replace the original amino acid with the corresponding amino acid of the template capsid is made on the basis of an analysis of the microenvironment for both the original amino acid and its structural analogue.
  • a positive decision on substitution is made if the pair of corresponding amino acids in the template capsid contains an amino acid with a polar side substituent, and AAV5 has a nonpolar one, and both amino acids have at least one polar contact with the neighboring pentamer subunit of the capsid.
  • HBoVl (PDBid 5urf), B19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) are shown in Table 4.
  • the first column shows amino acids from the interaction interface of neighboring pentamer subunits of the AAV5 capsid , for which suitable replacements were found in one of the three capsids HBoVl, B 19 and BPV.
  • the rest of the columns show amino acids obtained as a result of pairwise structural alignment of AAV5 for each of the capsids.
  • An asterisk indicates amino acids suitable for replacement in accordance with the criterion of increasing the number of polar contacts and the prohibition of substitution for cysteine and methionine.
  • Example 1 following the results of the structural alignment of the AAV5 capsid and the template capsid, we have a pairwise structural correspondence between their amino acid residues.
  • the decision to replace the original amino acid with the corresponding amino acid of the template capsid is made on the basis of an analysis of the microenvironment for both the original amino acid and its structural analogue.
  • a positive decision on substitution is made if the pair of corresponding amino acids in the AAV5 capsid contains a polar amino acid residue that forms at least one polar contact with the neighboring pentameric subunit, while the template capsid contains a nonpolar amino acid residue.
  • cysteine or methionine residues are not considered as replacements.
  • HBoVl (PDBid 5urf), B19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) are shown in Table 5.
  • the first column shows the amino acids from the interaction interface of neighboring pentamer subunits of the AAV5 capsid , for which suitable substitution options in one of the three capsids HBoV1, B19 and BPV.
  • the remaining columns show the amino acids obtained from the pairwise structural alignment of AAV5 for each of the template capsids.
  • An asterisk indicates amino acids suitable for substitution in accordance with the criterion of increasing the number of polar contacts and the prohibition of substitution for cysteine and methionine.
  • the AAV9 capsid mutation design is based on the high degree of structural similarity between the capsid proteins within the parvovirus (Parvoviridae) family, including non-AAV viruses.
  • the selection of a replacement consists of three stages and includes:
  • template capsid structural alignment of the modified AAV9 capsid with the capsid of one of the non-AAV parvoviruses
  • the structures of the AAV9 3D models and the template capsid are preliminarily prepared, which consists in completing the construction of the missing atoms in the structure using the Prepwizard utility from the Schrodinger Suite package.
  • the interaction interface is understood as a set of fragments of the polypeptide chain of the capsomere protein interacting with the amino acids of the neighboring pentameric subunit, where the pentameric subunit is understood as a structural element of the capsid in the form of a regular pentagon, consisting of 5 capsomer proteins located around the central pore (L. M. Drouin and M. Agbandje-McKenna. Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development Future Virol., vol. 8, no. 12, pp. 1183-1199, 2013).
  • the AAV9 capsid and the template capsid are structurally aligned using the Strucutre Alignment utility of the Schrodinger Suite. Based on the results of alignment, for each AAV9 amino acid from the interaction interface of neighboring pentameric subunits, the closest amino acid of the template capsid (structural analog of the original amino acid) is determined, which is considered as a potential replacement. There is no structural analog of the original amino acid if another AAV9 amino acid is located in the vicinity of the template capsid amino acid closest to it, the distance to which is less than to the original amino acid. It is understood here that the distance between amino acids is estimated from the distance between alpha carbons.
  • Example 6 Design of mutations based on the principle of increasing the volume of an amino acid residue
  • the volume of the side substituent of the amino acid from the template capsid is greater than the volume of the side substituent of the original amino acid
  • the amino acid from the template capsid is not a cysteine or methionine.
  • cysteine and methionine from among the amino acids for potential replacement is due to their significant reactivity, in particular, the ability to oxidize.
  • HBoVl (PDBid 5urf), B19 (PDBid ls58), BPV (PDBid 4qc8) are shown in Table 6.
  • the first column shows amino acids from interface of interaction between neighboring pentameric subunits of the AAV9 capsid, the remaining columns show amino acids obtained by pairwise structural alignment of AAV9 for each of the HBoVl, B19, and BPV capsids.
  • An asterisk indicates amino acids suitable for substitution in accordance with the criterion of the size of the side substituent and the prohibition of substitution for cysteine and methionine.
  • the following ranges of residues of the VP1 protein of the AAV9 capsid belong to the interface of interaction between neighboring AAV9 pentameric subunits: 230–236, 294–304, 350–353, 394–401, 421–444, 476–480, 601–609 , 622 - 637, 689 - 697, 733 - 736.
  • Example 7 Design of mutations based on the principle of increasing the number of polar contacts between capsomeres.
  • Example 5 following the results of the structural alignment of the AAV9 capsid and the template capsid, we have a pairwise structural correspondence between their amino acid residues.
  • the decision to replace the original amino acid with the corresponding amino acid of the template capsid is made on the basis of an analysis of the microenvironment for both the original amino acid and its structural analogue.
  • a positive decision on substitution is made if the pair of corresponding amino acids in the template capsid contains an amino acid with a polar lateral substituent, and AAV9 has a non-polar one, and both amino acids have at least one polar contact with the neighboring pentamer subunit of the capsid.
  • the results of applying the described method for designing mutations in the AAV9 capsid using three template capsids: HBoVl (PDBid 5urf), B19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) are shown in Table 7.
  • the first column shows amino acids from the interaction interface of neighboring pentamer subunits of the AAV9 capsid , for which suitable substitution options in one of the three capsids HBoVl, B19 and BPV.
  • the remaining columns show amino acids obtained from the results of pairwise structural alignment of AAV9 for each of the capsids.
  • An asterisk indicates amino acids suitable for substitution in accordance with the criterion of increasing the number of polar contacts and the prohibition of substitution for cysteine and methionine.
  • Example 8 Mutation design based on the principle of decreasing the number of polar contacts between capsomeres
  • Example 5 following the results of the structural alignment of the AAV9 capsid and the template capsid, we have a pairwise structural correspondence between their amino acid residues.
  • the decision to replace the original amino acid with the corresponding amino acid of the template capsid is made on the basis of an analysis of the microenvironment for both the original amino acid and its structural analogue.
  • a positive decision on substitution is made if the pair of corresponding amino acids in the AAV9 capsid contains a polar amino acid residue that forms at least one polar contact with the neighboring pentameric subunit, while the template capsid contains a nonpolar amino acid residue.
  • cysteine or methionine residues are not considered as replacements.
  • AAV5 capsid variants were obtained by random mutagenesis of the Cap gene sequence (Davidsson M. et al., 2016). Briefly, the wild-type sequence of the serotype 5 Cap gene (GenBank ID AF085716.1) was assembled de novo, after which the synthesized wild-type AAV5 capsid genome was fragmented using uracil-DNA glycosylase, the resulting fragments were assembled into a full-length Cap gene using DNA polymerase , which does not have corrective activity (as a result, random mutations occurred in the sequence).
  • the predominant combinations of mutations were S2A, T711S in VP1 AAV5 and capsid variants containing S2A, T711S, S651A in VP1 AAV5 - about 20% of clones.
  • Capsid variants containing the S651A mutation in VP1 AAV5 were also selected. These capsid variants were cloned into vectors for the production of viral particles and subsequently used to visualize and compare transduction profiles against wild-type AAV5.
  • plasmids For the production and subsequent selection of recombinant viral particles from the obtained sequence library, a series of plasmids was developed: a carrier plasmid, a plasmid containing the Rep gene sequence, and a construct containing adenoviral genes necessary for the replication of viral particles.
  • the carrier plasmid pAAV-linker ( Figure 1), intended for cloning libraries of random variants of the AAV capsid gene of the fifth serotype in the same reading frame with the reporter protein, was obtained by replacing the modified green fluorescent protein sequence in the original pAAV-GFP construct, using restriction enzyme ligase cloning method at the Hindll/EcoRI sites, on the T2A-GFP sequence synthesized de novo with the addition of EcoRI restriction sites from the 5'-end and Hindll from the 3'-end.
  • Plasmid p A AV-Rep containing the Rep gene sequence ( Figure 2) obtained by de novo cloning of the synthesized AAV Rep gene sequence of the second serotype (GenBank III AF043303.1) with the addition of a Pcil restriction site at the 5' end and a Psil restriction site at 3 ' at the end, into the plasmid pGem-T Easy (Promega, USA) also treated with Pcil/Psil restrictases (New England Biolabs, USA).
  • the pHelper construct ( Figure 3) was used, containing AmpR - the beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin, Oporigin of replication in bacteria, Adeno E2A - the sequence of the helper adenovirus gene, involved in viral DNA replication, Adeno E4 - helper adenovirus gene sequence involved in viral DNA replication, Adeno VARNA helper adenovirus gene sequence responsible for stimulating the translation of both early and late viral genes.
  • AAV wild-type capsid serotype five (GenBank III AF085716.1) and AAV wild-type capsid serotype nine (GenBank ID AY530579.1) were synthesized de novo with a Swal site at the 5' end and a Notl site at the 3' end in each.
  • Mutations were introduced into the wild-type AAV capsid sequence using a commercial QuikChange II Site-directed mutagenesis kit (Agilent, USA) according to the manufacturer's instructions. Primers for PCR were designed using QuikChange Primer Design (Agilent, USA) (Table 9, Table 10). Briefly, the procedure based on site-directed mutagenesis was carried out using as a template plasmid pAAV-RC5 or pAAV-RC9, respectively. To introduce mutations, at the first stage, the PNR reaction was carried out in separate test tubes for each mutant and control sample with the addition of the corresponding oligonucleotides.
  • the restriction enzyme Dpnl was treated according to the manufacturer's protocol to remove template plasmid DNA, and the resulting mixture was used to transform competent E. coli XL-lBlue cells. The obtained clones were analyzed using PCR for specific regions of the target plasmid, the selected mutants were subjected to sequencing before use.
  • Example 11 Efficiency of production of vectors based on modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5)
  • HEK293 producing cells were transfected with polyethyleneimine (PEI, linear, MW 25000, Polyscinces, Inc.) simultaneously with 3 plasmids:
  • PEI polyethyleneimine
  • a plasmid containing the nucleotide sequences of adenovirus encoding proteins and RNA necessary for the assembly of rAAV particles (helper plasmid);
  • VP2 can have any of the amino acid sequences of SEQ III No: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124 , 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232 or 238; a VP3 may have any of the amino acid sequences of SEQ III No: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234 or 240; 3) A plasmid containing the heterologous genome of the rAAV
  • This set of genes ensures the assembly of rAAV viral particles and encapsidation of the target genome in them within 72 hours.
  • 72 hours after transfection the producer cells were lysed (TAKARA BIO INC, Japan) to release rAAV particles, the resulting vectors were treated with DNase I (Invitrogen, USA) for 2 hours at 37°C, then another 2 hours with proteinase K (Invitrogen, USA) at 56°C.
  • the titer of the obtained rAAV particles was checked by quantitative PCR (TaqMan, Applied Biosystems, USA) using an oligonucleotide set consisting of forward primer 5'-ACCACATGAAGCAGCACGAC-3', reverse primer 5'-TCAGTCGATGCGGTTCAC-3', and a 5'-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1-3' probe specific for the GFP sequence.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, P466T, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F , S680A, T721V in the wild-type VP1 protein of the rAAV5 capsid or in the VP1 protein of the rAAV5 capsid, which already contains the S2A and T711S mutations, led to a statistically significant increase in the efficiency of transgene packaging by rAAV-based vectors with the above mutations. For example, using the quantitative PCR method, it was possible to detect a change in the number of copies of the packaged heterologous genome of the rAAV particle encoding the target GFP gene ( Figure 6, Figure 7).
  • V431Y AAV5-31Mut-GFP
  • the number of packaged viral genomes increased by 2.4 times from 2.74E+09 vg/ml to 6.58E+09 vg/ml compared to the control AAV5 with capsid VP1 protein wild type (AAV5-NullMut-GFP).
  • A616D AAV5-32Mut-GFP
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.6 times from 2.74E+09 vg/ml to 4.39E+09 vg/ml compared to the control AAV5 with capsid VP1 protein wild type (AAV5-NullMut-GFP).
  • W683R AAV5-33Mut-GFP
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.3 times from 2.74E+09 vg/ml to 3.56E+09 vg/ml compared to the control AAV5 with capsid VP1 protein wild type (AAV5-NullMut-GFP).
  • Example 12 Efficiency of production of vectors based on modified adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9)
  • HEK293 producing cells were transfected with polyethyleneimine (PEI, linear, MW 25000, Polyscinces, Inc.) simultaneously with 3 plasmids:
  • PEI polyethyleneimine
  • a plasmid containing the nucleotide sequences of adenovirus encoding proteins and RNA necessary for the assembly of rAAV particles (helper plasmid);
  • This set of genes ensures the assembly of rAAV viral particles and encapsidation of the target genome in them within 72 hours.
  • 72 hours after transfection the producer cells were lysed (TAKARA BIO INC, Japanese) to release rAAV particles, the resulting vectors were treated with DNase I (Invitrogen, USA) for 2 hours at 37°C, then another 2 hours with proteinase K (Invitrogen, USA) at 56°C.
  • the titer of the obtained rAAV particles was checked by quantitative PCR (TaqMan, Applied Biosystems, USA) using an oligonucleotide set consisting of forward primer 5'-ACCACATGAAGCAGCACGAC-3', reverse primer 5'-TCAGTCGATGCGGTTCAC-3', and a 5'-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1-3' probe specific for the GFP sequence.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group that is selected from the group S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R , M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 A in wild-type rAAV9 capsid VP1 protein resulted in a significant increase in the efficiency of transgene packaging by rAAV-based vectors with the above mutations. For example, using the quantitative NDP method, it was possible to detect a change in the number of copies of the packaged heterologous genome of the rAAV particle encoding the target GFP gene ( Figure 8).
  • the number of packaged viral genomes increased 1.9-fold from 6.32E+09 vg/ml to 1D9E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 ( AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased 2.5-fold from 6.32E+09 vg/ml to 1.60E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.9 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.17E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 2.9 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.85E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.9 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.23E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 5.0 times from 6.32E+09 vg/ml to 3.14E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased 2.5-fold from 6.32E+09 vg/ml to 1.61E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.8 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.14E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 4.6 times from 6.32E+09 vg/ml to 2.91E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with capsid VP1 protein wild type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 5.7 times from 6.32E+09 vg/ml to 3.62E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • A427R AAV9-15Mut-GFP
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.6 times from 6.32E+09 vg/ml to 9.86E+09 vg/ml compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.9 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.21E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.5 times from 6.32E+09 vg/ml to 9.41E+09 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 3.0 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.93E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased 2.0 times from 6.32E+09 vg/ml to 1.29E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 4.6 times from 6.32E+09 vg/ml to 2.91E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 4.0 times from 6.32E+09 vg/ml to 2.50E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 4.5 times from 6.32E+09 vg/ml to 2.85E+10 vg/ml compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1. type (AAV9-NullMut-GFP).
  • Example 13 Increased efficiency of cell transduction with rAAV5-based drugs containing point mutations in the wild-type rAAV5 capsid VP1 protein or in the rAAV5 capsid VP1 protein, which already contains S2A and T711S mutations.
  • the wells of 12-well plates were seeded with SK-Hepl cells. Sowing was carried out in a growth medium: EMEM with glutamine, 10% bovine serum. The cell density was 10,000 cells/cm 2 . When setting up the transduction, pre-prepared cells were transduced at an MOI of 1250 vg/cell. All samples were delivered in triplicates. Intact cells were used as a negative control.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, P466T, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F , S680A, T721V in the wild-type VP1 protein of the rAAV5 capsid or in the VP1 protein of the rAAV5 capsid, which already contains the S2A and T711S mutations, led to a statistically significant increase in the efficiency of transgene delivery by rAAV-based vectors with the above mutations.
  • the number of cells expressing GFP increased by 2.36 times from 20.11% to 47.50% compared with the control AAV5 with wild-type capsid protein VP1 ( AAV5-NullMut-GFP).
  • G226A AAV5-21Mut-GFP
  • D286E AAV5-22Mut-GFP
  • the number of cells expressing GFP increased by 1.27 times from 20.11% to 33.57% compared with the control AAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut- GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.52-fold from 20.11% to 40.05% compared with the control AAV5 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut- GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased by 1.24 times from 20.11% to 32.78% compared with the control AAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut- GFP).
  • V431Y AAV5-31Mut-GFP
  • the number of cells expressing GFP increased 1.27-fold from 20.11% to 33.46% compared to the control AAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut- GFP).
  • A616D AAV5-32Mut-GFP
  • W683R AAV5-33Mut-GFP
  • the number of cells expressing GFP increased by 1.52 times from 20.11% to 40.05% compared with the control AAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut- GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased 2.06-fold from 20.11% to 54.40% compared with the control AAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut- GFP).
  • Example 14 Increased cell transduction efficiency with rAAV9-based preparations containing point mutations in the VP1 protein of the wild-type rAAV9 capsid.
  • HeLa cells were seeded in the wells of 12-well overnight plates. Sowing was carried out in a growth medium: EMEM with glutamine, 10% bovine serum. The cell density was 10,000 cells/cm 2 . When setting up the transduction, pre-prepared cells were transduced at an MOI of 100,000 vg/cell. All samples were delivered in triplicates. Intact cells were used as a negative control.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 A in the VP1 protein of the wild-type rAAV9 capsid, led to a significant increase in the efficiency of transgene delivery based on rAAV with the above mutations.
  • the number of cells expressing GFP increased 1.21-fold from 27.53% to 33.31% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.25-fold from 27.53% to 34.41% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.30-fold from 27.53% to 35.87% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.16-fold from 27.53% to 31.93% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.37-fold from 27.53% to 37.74% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.10-fold from 27.53% to 30.28% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.40-fold from 27.53% to 38.45% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.56-fold from 27.53% to 42.95% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.25-fold from 27.53% to 34.32% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.24-fold from 27.53% to 34.14% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.45-fold from 27.53% to 39.92% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut- GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.49-fold from 27.53% to 41.02% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.38-fold from 27.53% to 37.99% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.44-fold from 27.53% to 39.73% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.23-fold from 27.53% to 33.86% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.22-fold from 27.53% to 33.59% compared to the control AAV9 with wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.47-fold from 27.53% to 40.47% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.26-fold from 27.53% to 34.69% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.35-fold from 27.53% to 37.17% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.48-fold from 27.53% to 40.74% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • the number of cells expressing GFP increased 1.67-fold from 27.53% to 45.91% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut-GFP ).
  • N691 A AAV9-22Mut-GFP
  • the number of cells expressing GFP increased 1.72-fold from 27.53% to 47.47% compared to the control AAV9 with the wild-type capsid protein VP1 (AAV9-NullMut- GFP).
  • Example 15 Increased production of the target protein encoded by the transgene after cell transduction with rAAV5-based preparations containing single mutations in the wild-type rAAV5 capsid VP1 protein or in the rAAV5 capsid VP1 protein, which already contains S2A and T711S mutations.
  • the wells of 12-well plates were seeded with SK-Hepl cells. Sowing was carried out in a growth medium: EMEM with glutamine, 10% bovine serum. The cell density was 10,000 cells/cm 2 . When setting up the transduction, pre-prepared cells were transduced at an MOI of 10,000 vg/cell. All samples were delivered in triplicates. Intact cells were used as a negative control.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group: G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, P466T, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V in the wild-type VP1 protein of the rAAV5 capsid or in the VP1 protein of the rAAV5 capsid, which already contains the S2A and T711S mutations, led to a significant increase in the production of the FIX protein after transduction of the SK-Hepl cell line with rAAV5-based vectors with the above mutations.
  • enzyme-linked immunosorbent assay revealed an increase in the amount of FIX protein in the culture medium 7 days after transduction of SK-Hep 1 cells with rAAV-based preparations with wild-type AAV5 capsid VP1 protein or wild-type AAV5 capsid VP1 protein carrying one or several mutations that are selected from the group: G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, P466T, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V in the rAAV5 capsid rAVP1 protein, rVP5 wild-type already contains S2A and T711S mutations (Figure 12, Figure 13).
  • V431Y AAV5-31Mut-FIX
  • the amount of protein produced increased 1.34-fold from 653.19 ng/mL to 875.27 ng/mL compared to control AAV5 with wild-type capsid VP1 protein (AAV5-NullMut - FIX).
  • AAV5-32Mut-FIX In the presence of a single A616D mutation (AAV5-32Mut-FIX), the amount of protein produced increased 1.11-fold from 653.19 ng/mL to 727.75 ng/mL compared to the control AAV5 with wild-type capsid VP1 protein (AAV5-NullMut - FIX).
  • Example 16 Increased production of the target protein encoded by the transgene after transduction of cells with rAAV9-based preparations containing mutations in the VP1 protein of the wild-type rAAV9 capsid.
  • Cells of the CHO-K1-S line were seeded in the wells of 12-well overnight plates. Sowing was carried out in a growth medium: DMEM/P12 with glutamine, glucose content 4.5 g/l, 5% bovine serum. The planting density of cells was 10,000 cells/cm2. When setting up the transduction, pre-prepared cells were transduced at an MOI of 200,000 vg/cell. All samples were delivered in triplicates. Intact cells were used as a negative control.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group: S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D , W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 A in wild-type rAAV9 capsid VP1 protein resulted in a significant increase in FIX protein production after transduction of CHO-K1-S cell line with rAAV-based vectors with the above mutations.
  • enzyme-linked immunosorbent assay revealed an increase in the amount of FIX protein in the culture medium 7 days after transduction of CHO-K1-S cells with rAAV-based drugs with wild-type AAV9 capsid VP1 protein carrying one or more mutations selected from groups: S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L .
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the amount of protein produced increased 1.22-fold from 947.5 ng/mL to 1157.17 ng/mL compared to control AAV9 with the wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut- FIX).
  • the amount of protein produced increased 1.17-fold from 947.5 ng/mL to 1110.50 ng/mL compared to control AAV9 with the wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut - FIX).
  • the amount of protein produced increased 1.77-fold from 947.5 ng/mL to 1677.50 ng/mL compared to control AAV9 with wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut - FIX).
  • the amount of protein produced increased 1.83-fold from 947.5 ng/mL to 1736.67 ng/mL compared to the control AAV9 with wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut- FIX).
  • AAV9-15Mut-FIX In the presence of the A427R mutation (AAV9-15Mut-FIX), the amount of protein produced increased 1.65-fold from 947.5 ng/mL to 1563.38 ng/mL compared to control AAV9 with wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut- FIX).
  • the amount of protein produced increased 1.23-fold from 947.5 ng/mL to 1161.83 ng/mL compared to the control AAV9 with the wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut- FIX).
  • the amount of protein produced increased 1.48-fold from 947.5 ng/mL to 1402.30 ng/mL compared to the control AAV9 with wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut - FIX).
  • the amount of protein produced increased 1.21-fold from 947.5 ng/mL to 1145.00 ng/mL compared to the control AAV9 with wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut- FIX).
  • the amount of protein produced increased 2.33-fold from 947.5 ng/mL to 2203.33 ng/mL compared to the control AAV9 with wild-type capsid VP1 protein (AAV9-NullMut - FIX).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса (AAV) и модифицированному капсиду AAV, полученному данным способом, а также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей данный модифицированный капсид, и вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает данный модифицированный капсид.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО КАПСИДА АДЕНО АССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса (AAV) и модифицированному капсиду AAV, полученному данным способом, а также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей данный модифицированный капсид, и вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает данный модифицированный капсид.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой (25 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ, inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащие в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1 : 1 :10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99: 10405-10410). При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ITR, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Рекомбинантный AAV считается самым безопасным и одним из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Векторы могут инфицировать клетки множества типов тканей, обеспечивая эффективную и устойчивую экспрессию трансгена. Они также являются непатогенными и имеют низкий профиль иммуногенности (High КА et al., «rAAV human trial experience» Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57). Одной из насущных целей исследований в области разработки эффективной генотерапии является оптимизация векторов для улучшения тех или иных свойств данных векторов.
Известно, что различные серотипы AAV характеризуются сродством к различным рецепторам на поверхности клеток-хозяев, к которым они обладают тропизмом. Так основным известным рецептором для AAV2 является гепарансульфат- протеогликан, корецепторами выступают интегриновый гетеродимер aVp5, рецептор фактора роста фибробластов первого типа и рецептор фактора роста гепатоцитов, с- Met. AAV12 связывается с гепарансульфат-протеогликанами и сиаловой кислотой. AAV4 и AAV5 связываются с N- и О-связанными сиаловыми кислотами соответственно. AAV5 задействует рецептор фактора роста тромбоцитов. При этом установлена связь между аминокислотной последовательностью белков капсида AAV с процессом его сборки, инкапсидирования генома и сродством к различным типам рецепторов, репрезентированных на поверхности клеток-хозяев (Govindasamy L. et. al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 2013 Oct;87(20): 11187- 99).
В международной заявке W02012145601 описаны вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальных клеток, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа.
В международной заявке WO2013158879 описан вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей капсидный белок VP1, который содержит одну или несколько замен лизина, где одна замена лизина представляет K137R, где упомянутая замена лизина является эффективной для ингибирования убиквитинилирования упомянутого капсидного белка, и тем самым увеличивается трансдукция упомянутого вектора AAV в клетке-мишени.
На данный момент существует потребность в AAV с улучшенными свойствами по сравнению с AAV дикого типа, например, которые обладают увеличенной трансдуцирующей способностью, большей специфичной способностью трансдуцировать клетки целевых органов и тканей, увеличенной емкостью капсида, увеличенной эффективностью упаковки вирусных геномов AAV, а также увеличенной эффективностью наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторами изобретения было установлено, что способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса (AAV) по изобретению позволяет неожиданно получить модифицированный капсид AAV, который обладает одним или несколькими улучшенными свойствами по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций (дикого типа), которые выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного капсида AAV, который включает: а) определение аминокислот белка-капсомера модифицируемого AAV, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; б) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV с капсидом- шаблоном для определения попарного соответствия между каждой аминокислотой модифицируемого AAV из области интерфейса взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами и ближайшей к ней аминокислотой капсида-шаблона, как структурного аналога исходной аминокислоты, которая рассматривается в качестве потенциальной замены, где под капсидом-шаблоном понимают схожий по строению капсид вируса, выбранного из семейства парвовирусов (Parvoviridae), который не является AAV; в) попарное сравнение определенных на стадии б) остатков аминокислот капсида AAV и капсида-шаблона для выявления структурных различий капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; г) выбор позиций для мутагенеза, при этом аминокислотные остатки для мутагенеза находятся в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV и имеют структурное различие между капсидом модифицируемого AAV и капсидом-шаблоном в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; д) выбор аминокислотного остатка для мутагенеза в позиции, выбранной на стадии г), с использованием одного из следующих принципов:
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет больший объем, за исключением цистеина и метионина;
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет увеличенное или уменьшенное число полярных контактов между капсомерами, за исключением цистеина и метионина; е) введение одной или нескольких аминокислотных замен, выбранных на стадиях г)- д), в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способ получения модифицированного капсида AAV дополнительно включает проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV с одной или несколькими аминокислотными заменами на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
В некоторых вариантах осуществления изобретения способ получения модифицированного капсида AAV дополнительно включает проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций и отбор модифицированных капсидов AAV, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей: AAV человека, AAV обезьян или AAV птиц.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 или AAV16.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV схожий по строению капсид-шаблон, выбирают из группы, которая включает: парвовирус В 19, человеческий бокавирус 1 (HBoVl), парвовирус крупного рогатого скота (BVP).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к модифицированному капсиду AAV для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, который получен способом, включающим: а) определение аминокислот белка-капсомера модифицируемого AAV, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; б) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV с капсидом- шаблоном для определения попарного соответствия между каждой аминокислотой модифицируемого AAV из области интерфейса взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами и ближайшей к ней аминокислотой капсида-шаблона, как структурного аналога исходной аминокислоты, которая рассматривается в качестве потенциальной замены, где под капсидом-шаблоном понимают схожий по строению капсид вируса, выбранного из семейства парвовирусов (Parvoviridae), который не является AAV; в) попарное сравнение определенных на стадии б) остатков аминокислот капсида AAV и капсида-шаблона для выявления структурных различий капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; г) выбор позиций для мутагенеза, при этом аминокислотные остатки для мутагенеза находятся в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV и имеют структурное различие между капсидом модифицируемого AAV и капсидом-шаблоном в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; д) выбор аминокислотного остатка для мутагенеза в позиции, выбранной на стадии г), с использованием одного из следующих принципов: -замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет больший объем, за исключением цистеина и метионина;
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет увеличенное или уменьшенное число полярных контактов между капсомерами, за исключением цистеина и метионина; е) введение одной или нескольких аминокислотных замен, выбранных на стадиях г)- д), в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV; а также, при необходимости, дополнительно включает ж) проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций и отбор модифицированных капсидов AAV, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей: AAV человека, AAV обезьян или AAV птиц.
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 или AAV16.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к модифицированному капсиду AAV для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, который включает модифицированный белок VP1 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает: а) модифицированный белок VP1 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368; б) соответствующий своему белку VP1 модифицированный белок VP2 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262, 268, 274, 280, 286, 292, 298, 304, 310, 316, 322, 328, 334, 340, 346, 352, 358, 364 или 370; в) соответствующий своему белку VP1 модифицированный белок VP3 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, 264, 270, 276, 282, 288, 294, 300, 306, 312, 318, 324, 330, 336, 342, 348, 354, 360, 366 или 372.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных капсидов.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса имеет продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
Краткое описание чертежей Фигура 1 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-linker, которая предназначена для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV.
GFP- последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок,
Poly А - сигнал полиаденилирования,
ITR - инвертированный концевой повтор аденоассоциированного вируса,
Т2А - последовательность, кодирующая пептид способный к самовырезанию из полипептидной цепи получен от вируса thosea asigna,
HBG intron - интрон бета-глобина человека,
CMVpromoter - промотор цитомегаловируса человека,
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий,
EcoRI - сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции EcoRI,
Asci - сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции Asci.
Фигура 2 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-Rep, которая предназначена для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий,
AAV Rep genes - последовательность, кодирующая белки Rep, необходимые для жизненного цикла вируса,
Swal - сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции Swal,
Notl - сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции Notl.
Фигура 3 представляет собой кольцевую схему плазмиды pHelper, которая предназначена для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV из библиотеки случайных вариантов.
AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину,
Ori- ориджин репликации в бактериях,
Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса, отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов. Фигура 4 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-RC5, которая предназначена для наработки рекомбинантных вирусных препаратов AAV 5 серотипа.
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации прокариот,
AAV Rep genes - последовательность, кодирующая белки Rep, необходимые для жизненного цикла аденоассоциированного вируса,
AAV5 Cap genes -последовательность, кодирующая перекрывающиеся нуклеотидные последовательности белков капсида аденоассоциированного вируса пятого серотипа: VP1, VP2 и VP3.
Фигура 5 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-RC9, которая предназначена для наработки рекомбинантных вирусных препаратов AAV 9 серотипа.
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации прокариот,
AAV Rep genes - последовательность, кодирующая белки Rep, необходимые для жизненного цикла аденоассоциированного вируса,
AAV9 Cap genes -последовательность, кодирующая перекрывающиеся нуклеотидные последовательности белков капсида аденоассоциированного вируса девятого серотипа: VP1, VP2 и VP3.
Фигура 6 представляет собой график, который показывает эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5).
Vg/ml кж обозначает количество вирусных геномов на миллилитр культуральной жидкости.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа.
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S.
AAV5-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, G226A и Т711S. AAV5-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, D286E и Т711S.
AAV5-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, L341Y H T71 1 S.
AAV5-05Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, C387V и Т711S.
AAV5-06Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Q421H и Т711S.
AAV5-07Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Р466Т и Т711S.
AAV5-08Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S594Q и Т711S.
AAV5-09Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, T614L H T71 1 S.
AAV5-10Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, N679K и Т711S.
AAV5-1 IMut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, P723V и Т711S.
AAV5-12Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, V431Y и T711S.
AAV5-13Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, A616D и Т711S. AAV5-14Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, W683R и Т711S.
AAV5-15Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S222A и Т711S.
AAV5-16Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, R285L и Т711S.
AAV5-17Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Q340A и Т711S.
AAV5-18Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S420F и Т711S.
AAV5-19Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S680A и Т711S.
AAV5-20Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, T721V и Т711S.
Фигура 7 представляет собой график, который показывает эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5).
Vg/ml кж обозначает количество вирусных геномов на миллилитр культуральной жидкости.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа.
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S.
AAV5-21Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией G226A. AAV5-22Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией D286E.
AAV5-23Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией L341 Y.
AAV5-24Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией C387V.
AAV5-25Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Q421H.
AAV5-26Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Р466Т.
AAV5-27Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S594Q.
AAV5-28Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией T614L.
AAV5-29Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией N679K.
AAV5-30Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией P723V.
AAV5-31Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией V431Y.
AAV5-32Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией A616D. AAV5-33Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией W683R.
AAV5-34Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S222A.
AAV5-35Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией R285L.
AAV5-36Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Q340A.
AAV5-37Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S420F.
AAV5-38Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S680A.
AAV5-39Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией T721V.
Фигура 8 представляет собой график, который показывает эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9).
Vg/ml кж обозначает количество вирусных геномов на миллилитр культуральной жидкости.
AAV9-NullMut-GFP обозначает вектор на основе rAAV9 с белком VP1 капсида дикого типа.
AAV9-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией S232T.
AAV9-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией D297E. AAV9-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351K.
AAV9-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351R.
AAV9-05Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией C396V.
AAV9-06Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией D433Y.
AAV9-07Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией L444R.
AAV9-08Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Y478F.
AAV9-09Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией G604N.
AAV9-10Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией G627K.
AAV9-1 IMut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T625L
AAV9-12Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T625V.
AAV9-13Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией S692T. AAV9-14Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T733V.
AAV9-15Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией A427R.
AAV9-16Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией M635D.
AAV9-17Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией W695R.
AAV9-18Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией R296L.
AAV9-19Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351A.
AAV9-20Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Y395F.
AAV9-21Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией R434L.
AAV9-22Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией N691 А.
Фигура 9 представляет собой график, который показывает эффективность трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5, содержащими точечные мутации в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и Т711S.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S.
AAV5-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, G226A и Т711S.
AAV5-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, D286E и Т711S.
AAV5-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, L341Y H T71 1 S.
AAV5-05Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, C387V и Т711S.
AAV5-06Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Q421H и Т711S.
AAV5-07Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Р466Т и Т711S.
AAV5-08Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S594Q и Т711S.
AAV5-09Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, T614L H T71 1 S.
AAV5-10Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, N679K и Т711S.
AAV5-1 IMut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, P723V и Т711S. AAV5-12Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, V431Y и T711S.
AAV5-13Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, A616D и Т711S.
AAV5-14Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, W683R и Т711S.
AAV5-15Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S222A и Т711S.
AAV5-16Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, R285L и Т711S.
AAV5-17Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Q340A и Т711S.
AAV5-18Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S420F и Т711S.
AAV5-19Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S680A и Т711S.
AAV5-20Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, T721V и Т711S.
Фигура 10 представляет собой график, который показывает эффективность трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5, содержащими точечные мутации в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа.
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S. AAV5-21Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией G226A.
AAV5-22Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией D286E.
AAV5-23Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией L341 Y.
AAV5-24Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией C387V
AAV5-25Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Q421H.
AAV5-26Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Р466Т.
AAV5-27Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S594Q.
AAV5-28Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией T614L.
AAV5-29Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией N679K.
AAV5-30Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией P723V.
AAV5-31Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией V431Y. AAV5-32Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией A616D.
AAV5-33Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией W683R.
AAV5-34Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S222A.
AAV5-35Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией R285L.
AAV5-36Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Q340A.
AAV5-37Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S420F.
AAV5-38Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S680A.
AAV5-39Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией T721V.
Фигура 11 представляет собой график, который показывает эффективность трансдукции клеток препаратами на основе rAAV9, содержащими точечные мутации в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа.
AAV9-NullMut-GFP обозначает вектор на основе rAAV9 с белком VP1 капсида дикого типа.
AAV9-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией S232T.
AAV9-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией D297E. AAV9-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351K.
AAV9-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351R.
AAV9-05Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией C396V.
AAV9-06Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией D433Y.
AAV9-07Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией L444R.
AAV9-08Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Y478F.
AAV9-09Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией G604N.
AAV9-10Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией G627K.
AAV9-1 IMut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T625L.
AAV9-12Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T625V.
AAV9-13Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией S692T. AAV9-14Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T733V.
AAV9-15Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией A427R.
AAV9-16Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией M635D.
AAV9-17Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией W695R.
AAV9-18Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией R296L.
AAV9-19Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351A.
AAV9-20Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Y395F.
AAV9-21Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией R434L.
AAV9-22Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией N691 А.
Фигура 12 представляет собой график, который показывает эффективность продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5, содержащими единичные мутации в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A H T711 S.
AAV5-NullMut-FIX обозначает вектор на основе rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа. AAV5-01Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S.
AAV5-02Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, G226A и Т711S.
AAV5-03Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, D286E и Т711S.
AAV5-04Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, L341Y H T71 1 S.
AAV5-05Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, C387V и Т711S
AAV5-06Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Q421H и Т711S.
AAV5-07Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Р466Т и Т711S.
AAV5-08Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S594Q и Т711S.
AAV5-09Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, T614L H T71 1 S.
AAV5-10Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, N679K и Т711S.
AAV5-1 IMut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, P723V и Т711S. AAV5-12Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, V431Y и T711S.
AAV5-13Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, A616D и Т711S.
AAV5-14Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, W683R и Т711S.
AAV5-15Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S222A и Т711S.
AAV5-16Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, R285L и Т711S.
AAV5-17Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, Q340A и Т711S.
AAV5-18Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S420F и Т711S
AAV5-19Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, S680A и Т711S.
AAV5-20Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A, T721V и Т711S.
Фигура 13 представляет собой график, который показывает эффективность продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5, содержащими единичные мутации в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа.
AAV5-NullMut-FIX обозначает вектор на основе rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа. AAV5-01Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S.
AAV5-21Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией G226A.
AAV5-22Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией D286E.
AAV5-23Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией L341 Y.
AAV5-24Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией C387V.
AAV5-25Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Q421H.
AAV5-26Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Р466Т.
AAV5-27Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S594Q.
AAV5-28Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией T614L.
AAV5-29Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией N679K.
AAV5-30Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией P723V. AAV5-31Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией V431Y.
AAV5-32Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией A616D.
AAV5-33Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией W683R.
AAV5-34Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S222A.
AAV5-35Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией R285L.
AAV5-36Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией Q340A.
AAV5-37Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S420F.
AAV5-38Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией S680A.
AAV5-39Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутацией T721V.
Фигура 14 представляет собой график, который показывает эффективность продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV9, содержащими мутации в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа
AAV9-NullMut-FIX обозначает вектор на основе rAAV9 с белком VP1 капсида дикого типа AAV9-01Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией S232T.
AAV9-02Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией D297E.
AAV9-03Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351K.
AAV9-04Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351R.
AAV9-05Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией C396V.
AAV9-06Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией D433Y.
AAV9-07Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией L444R.
AAV9-08Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Y478F.
AAV9-09Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией G604N.
AAV9-10Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией G627K.
AAV9-1 IMut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T625L AAV9-12Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T625V.
AAV9-13Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией S692T
AAV9-14Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией T733V.
AAV9-15Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией A427R.
AAV9-16Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией M635D.
AAV9-17Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией W695R.
AAV9-18Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией R296L.
AAV9-19Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Q351A.
AAV9-20Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией Y395F.
AAV9-21Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией R434L.
AAV9-22Mut-FIX обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV9 с мутацией N691 А.
Определения и общие методы Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Аденоассоциированный вирус (AAV)
Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных, и Densovirinae, представители которого инфицируют насекомых. К 2006 году были описаны 11 серотипов аденоассоциированного вируса (Mori, S. ЕТ AL., 2004, «Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein», Virology, T. 330 (2): 375-83). В 2008 году был описан 12 серотип аденоассоциированного вируса (Michael Schmidt ЕТ AL., Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity, J Virol. 2008 Feb;82(3): 1399-406. doi: 10.1128/JVI.02012-07). Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированного вируса конструируют, задавая необходимый серотип. Дополнительная информация по парвовирусам и другим представителям Parvoviridae описана в литературе (Kenneth I. Berns, «Parvoviridae: The Viruses and Their Replication», Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, которая содержит менее чем примерно 5000 нуклеотидов (нт) в длину. Инвертированные концевые повторы (ITR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности белков (Rep), необходимых для обеспечения жизненного цикла вируса, а также последовательности перекрывающихся белков капсида (Сар). Ген Сар кодирует белки VP (VP1, VP2 и VP3), которые образуют капсид, а также белки ААР (белок, активирующий сборку аденоассоциированного вируса (AAV) Sonntag F, Kother К, Schmidt К, et al. The assemblyactivating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2011;85(23): 12686-12697. doi:10.1128/JVI.05359-l l) и МААР (вспомогательный белок связывания с мембраной Ogden PJ, Kelsic ED, Sinai S, Church GM. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 2019;366(6469): 1139-1143. doi: 10.1126/science.aaw2900). Фланкирующие последовательности генома AAV длиной в 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть сформирован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпилечную структуру. Такие шпилечные структуры функционируют как точки начала репликации ДНК вируса, являясь праймерами для клеточного ДНК-полимеразного комплекса. После инфекции клеток млекопитающих AAV дикого типа (wtAAV) гены Rep (например, Rep78 и Rep52) экспрессируются с помощью Р5 промотора и Р19 промотора, соответственно, и оба белка Rep выполняют определенную функцию в репликации генома вируса. Сплайсинг в открытой рамке считывания Rep (Rep ORF) приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (например, Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep78 и Rep52, является достаточной для продукции вектора AAV в клетках млекопитающих.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV)
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту. Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.
Применение
«Доставка субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты» представляет собой вставку генов в клетки и/или ткани субъекта.
Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Подробное описание изобретения
Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного капсида AAV, который включает: а) определение аминокислот белка-капсомера модифицируемого AAV, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; б) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV с капсидом- шаблоном для определения попарного соответствия между каждой аминокислотой модифицируемого AAV из области интерфейса взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами и ближайшей к ней аминокислотой капсида-шаблона, как структурного аналога исходной аминокислоты, которая рассматривается в качестве потенциальной замены, где под капсидом-шаблоном понимают схожий по строению капсид вируса, выбранного из семейства парвовирусов (Parvoviridae), который не является AAV; в) попарное сравнение определенных на стадии б) остатков аминокислот капсида AAV и капсида-шаблона для выявления структурных различий капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; г) выбор позиций для мутагенеза, при этом аминокислотные остатки для мутагенеза находятся в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV и имеют структурное различие между капсидом модифицируемого AAV и капсидом-шаблоном в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; д) выбор аминокислотного остатка для мутагенеза в позиции, выбранной на стадии г), с использованием одного из следующих принципов:
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет больший объем, за исключением цистеина и метионина;
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет увеличенное или уменьшенное число полярных контактов между капсомерами, за исключением цистеина и метионина; е) введение одной или нескольких аминокислотных замен, выбранных на стадиях г)- д), в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV.
Под интерфейсом (или поверхностью) взаимодействия понимается набор фрагментов полипептидной цепи белка-капсомера, взаимодействующих с аминокислотами соседней пентамерной субъединицы, где под пентамерной субъединицей понимается структурный элемент капсида в форме правильного пятиугольника, состоящий из 5 белков- капсомеров, расположенных вокруг центральной поры (L. М. Drouin and М. Agbandje- McKenna. Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development. Future Virol., vol. 8, no. 12, pp. 1183-1199, 2013).
Под интерфейсом взаимодействия для данной субъединицы мы понимаем все аминокислоты, хотя бы один атом которых находится на расстоянии, не превышающем 5 А от какого-либо атома из соседних пентамерных субъединиц.
Для AAV5 мы производили расчет по структуре капсида PDB Ш: 6JCT.
В ней, согласно расчету, к интерфейсу взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами AAV5 относятся следующие диапазоны остатков белка VP1 капсида AAV5: 220 - 226, 283 - 293, 339 - 342, 385 - 392, 412 - 435, 462 - 466, 590 - 598, 611 - 626, 677 - 685, 721-724.
Для AAV9 аналогичный расчет был сделан по структуре PDB Ш: 3UX1.
В ней, согласно расчету, к интерфейсу взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами AAV9 относятся следующие диапазоны остатков белка VP1 капсида AAV9: 230 - 236, 294 - 304, 350 - 353, 394 - 401, 421 - 444, 476 - 480, 601 - 609, 622 - 637, 689 - 697, 733 - 736.
Под «одной или несколькими аминокислотными заменами» подразумеваются одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен. Например, от 1 до 10 аминокислотных замен, от 1 до 9 аминокислотных замен, от 1 до 8 аминокислотных замен, от 1 до 7 аминокислотных замен, от 1 до 6 аминокислотных замен, от 1 до 5 аминокислотных замен, от 1 до 4 аминокислотных замен, от 1 до 3 аминокислотных замен или от 1 до 2 аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способ получения модифицированного капсида AAV дополнительно включает проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV с одной или несколькими аминокислотными заменами на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
В некоторых вариантах осуществления изобретения способ получения модифицированного капсида AAV дополнительно включает проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций и отбор модифицированных капсидов AAV, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей: AAV человека, AAV обезьян или AAV птиц.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-l, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 или AAV.HSC16.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV дикого типа или капсид AAV, который включает одну или несколько аминокислотных замен в белках VP1, VP2 и/или VP3.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV5 дикого типа или капсид AAV5, который включает одну или несколько аминокислотных замен в белках VP1, VP2 и/или VP3.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV5, который включает аминокислотные замены S2 А и Т711 S в белке VP 1.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV9 дикого типа или капсид AAV9, который включает одну или несколько аминокислотных замен в белках VP1, VP2 и/или VP3.
В некоторых вариантах осуществления способа получения капсида AAV схожий по строению капсид-шаблон, выбирают из группы, которая включает: парвовирус В 19, человеческий бокавирус 1 (HBoVl), парвовирус крупного рогатого скота (BVP).
Модифицированный капсид AAV по изобретению
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к модифицированному капсиду AAV для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, который получен способом, включающим: а) определение аминокислот белка-капсомера модифицируемого AAV, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; б) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV с капсидом- шаблоном для определения попарного соответствия между каждой аминокислотой модифицируемого AAV из области интерфейса взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами и ближайшей к ней аминокислотой капсида-шаблона, как структурного аналога исходной аминокислоты, которая рассматривается в качестве потенциальной замены, где под капсидом-шаблоном понимают схожий по строению капсид вируса, выбранного из семейства парвовирусов (Parvoviridae), который не является AAV; в) попарное сравнение определенных на стадии б) остатков аминокислот капсида AAV и капсида-шаблона для выявления структурных различий капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; г) выбор позиций для мутагенеза, при этом аминокислотные остатки для мутагенеза находятся в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV и имеют структурное различие между капсидом модифицируемого AAV и капсидом-шаблоном в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; д) выбор аминокислотного остатка для мутагенеза в позиции, выбранной на стадии г), с использованием одного из следующих принципов:
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет больший объем, за исключением цистеина и метионина;
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет увеличенное или уменьшенное число полярных контактов между капсомерами, за исключением цистеина и метионина; е) введение одной или нескольких аминокислотных замен, выбранных на стадиях г)- д), в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV; а также, при необходимости, дополнительно включает ж) проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций и отбор модифицированных капсидов AAV, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей: AAV человека, AAV обезьян или AAV птиц. В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-l, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 или AAV.HSC16.
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV дикого типа или капсид AAV, который включает одну или несколько аминокислотных замен в белках VP1, VP2 и/или VP3.
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV5 дикого типа или капсид AAV5, который включает одну или несколько аминокислотных замен в белках VP1, VP2 и/или VP3.
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV5, который включает аминокислотные замены S2 А и Т711 S в белке VP 1.
В некоторых вариантах осуществления модифицированного капсида AAV капсид модифицируемого AAV может представлять капсид AAV9 дикого типа или капсид AAV9, который включает одну или несколько аминокислотных замен в белках VP1, VP2 и/или VP3.
«Правая часть» (+)-цепи геномной ДНК аденоассоциированного вируса содержит перекрывающиеся последовательности, кодирующие три белка капсида — VP 1 , VP2 и VP3. Транскрипция этих генов начинается с одного промотора, р40. Молекулярная масса соответствующих белков составляет 87, 72 и 62 кДа, соответственно. Все три белка транслируются с одной мРНК. После транскрипции пре-мРНК может подвергаться сплайсингу двумя разными способами, при этом вырезается более длинный или более короткий интрон и образуются мРНК длиной 2300 или 2600 нуклеотидов.
Таким образом, введение мутаций в ген Сар будет влиять не только на белок VP1 капсида AAV, но и на белки VP2 и VP3 капсида AAV.
Ниже приведены положения структурных белков капсида AAV5 в последовательности гена Cap AAV5: 1-725 ак - VP1,
137-725 ак - VP2,
193-725 ак - VP3.
Ниже приведены положения структурных белков капсида AAV9 в последовательности гена Cap AAV9:
1-737 ак - VPl,
138-737 ак - VP2,
203-737 ак - VP3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ IDNo: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ ID No: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262, 268, 274, 280, 286, 292, 298, 304, 310, 316, 322, 328, 334, 340, 346, 352, 358, 364 или 370.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ ID No: 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, 264, 270, 276, 282, 288, 294, 300, 306, 312, 318, 324, 330, 336, 342, 348, 354, 360, 366 или 372.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает: а) модифицированный белок VP1 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368; б) соответствующий своему белку VP1 модифицированный белок VP2 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262, 268, 274, 280, 286, 292, 298, 304, 310, 316, 322, 328, 334, 340, 346, 352, 358, 364 или 370; в) соответствующий своему белку VP1 модифицированный белок VP3 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, 264, 270, 276, 282, 288, 294, 300, 306, 312, 318, 324, 330, 336, 342, 348, 354, 360, 366 или 372.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену G226A (AAV5 Capsid VP1 G226A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 14.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену G90A (AAV5 Capsid VP2 G90A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 16.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену G34A (AAV5 Capsid VP3 G34A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 18
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, G226A и T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, G226A и T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены G90A и T575S (AAV5 Capsid VP2 G90A и T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены G34A T519S (AAV5 Capsid VP3 G34A T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 24. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену D286E (AAV5 Capsid VP1 D286E) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену D150E (AAV5 Capsid VP2 D150E) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 28.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену D94E (AAV5 Capsid VP3 D94E) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 30.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, D286E и T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, D286E и T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 32.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены D150E и T575S (AAV5 Capsid VP2 D150E и T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 34
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены D94E и T519S (AAV5 Capsid VP3 D94E и T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену L341Y (AAV5 Capsid VP1 L341Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 38.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену L205Y (AAV5 Capsid VP2 L205Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 40.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид
AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену L149Y (AAV5 Capsid VP3 L149Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 42.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, L341Y, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, L341Y, T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 44.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены L205Y, T575S (AAV5 Capsid VP2 L205Y, T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 46.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены L149Y, T519S (AAV5 Capsid VP3 L149Y, T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 48.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену C387V (AAV5 Capsid VP1 C387V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 50.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену C251V (AAV5 Capsid VP2 C251V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 52.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену C195V (AAV5 Capsid VP3 C195V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 54.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, C387V, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, C387V, T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 56.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены C251V, T575S (AAV5 Capsid VP2 C251V, T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 58. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены C195V, T519S (AAV5 Capsid VP3 C195V, T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 60.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Q421H (AAV5 Capsid VP1 Q421H) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 62.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену Q285H (AAV5 Capsid VP2 Q285H) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 64.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Q229H (AAV5 Capsid VP3 Q229H) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 66.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A Q421H T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A Q421H T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 68.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены Q285H T575S (AAV5 Capsid VP2 Q285H T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 70.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены Q229H T519S (AAV5 Capsid VP3 Q229H T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 72.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Р466Т (AAV5 Capsid VP1 Р466Т) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 74.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид
AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену P330T (AAV5 Capsid VP2 РЗЗОТ) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 76.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Р274Т (AAV5 Capsid VP3 Р274Т) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 78.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A Р466Т T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A Р466Т T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 80.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены РЗЗОТ T575S (AAV5 Capsid VP2 РЗЗОТ T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 82.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены Р274Т T519S (AAV5 Capsid VP3 Р274Т T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 84.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S594Q (AAV5 Capsid VP1 S594Q) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 86.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S458Q (AAV5 Capsid VP2 S458Q) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 88.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S402Q (AAV5 Capsid VP3 S402Q) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 90.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S594Q T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S594Q T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 92. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S458Q T575S (AAV5 Capsid VP2 S458Q T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 94.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S402Q T519S (AAV5 Capsid VP3 S402Q T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 96.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены T614L (AAV5 Capsid VP1 T614L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 98.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены T478L (AAV5 Capsid VP2 T478L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 100.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены T422L (AAV5 Capsid VP3 T422L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 102.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A T614L T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A T614L T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 104.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены T478L T575S (AAV5 Capsid VP2 T478L T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 106.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены (AAV5 Capsid VP3 T422L T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 108.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену N679K (AAV5 Capsid VP1 N679K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 110.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену N543K (AAV5 Capsid VP2 N543K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 112.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену N487K (AAV5 Capsid VP3 N487K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 114.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A N679K T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A N679K T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 116.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены N543K T575S (AAV5 Capsid VP2 N543K T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 118.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены N487K T519S (AAV5 Capsid VP3 N487K T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 120.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Р723 V (AAV5 Capsid VP1 Р723 V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 122.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену P587V (AAV5 Capsid VP2 P587V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 124.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Р53 IV (AAV5 Capsid VP3 Р53 IV) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 126. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены P723V T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A P723V T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 128.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены P587V T575S (AAV5 Capsid VP2 P587V T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 130.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены P531V T519S (AAV5 Capsid VP3 P531V T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 132.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену V431Y (AAV5 Capsid VP1 V431Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 134.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену V295Y (AAV5 Capsid VP2 V295Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 136.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену V239Y (AAV5 Capsid VP3 V239Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 138.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A V431Y T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A V431Y T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 140.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены V295Y T575S (AAV5 Capsid VP2 V295Y T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 142.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены V239Y T519S (AAV5 Capsid VP3 V239Y T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 144.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену A616D (AAV5 Capsid VP1 A616D) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 146.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену A480D (AAV5 Capsid VP2 A480D) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 148.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену A424D (AAV5 Capsid VP3 A424D) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 150.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A A616D T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A A616D T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 152.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены A480D T575S (AAV5 Capsid VP2 A480D T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 154.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены A424D T519S (AAV5 Capsid VP3 A424D T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 156.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену W683R (AAV5 Capsid VP1 W683R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 158.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену W547R (AAV5 Capsid VP2 W547R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 160. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену W491R (AAV5 Capsid VP3 W491R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 162.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A W683R T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A W683R T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 164.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены W547R T575S (AAV5 Capsid VP2 W547R T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 166.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены W491R T519S (AAV5 Capsid VP3 W491R T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 168.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S222A (AAV5 Capsid VP1 S222A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 170.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S86A (AAV5 Capsid VP2 S86A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 172.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S30A (AAV5 Capsid VP3 S30A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 174.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S222A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S222A T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 176.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S86A T575S (AAV5 Capsid VP2 S86A T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No: 178.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S30A T519S (AAV5 Capsid VP3 S30A T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No: 180.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену R285L (AAV5 Capsid VP1 R285L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 182.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену R149L (AAV5 Capsid VP2 R149L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 184.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену R93L (AAV5 Capsid VP3 R93L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 186.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A R285L T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A R285L T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 188.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены R149L T575S (AAV5 Capsid VP2 R149L T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 190.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены R93L T519S (AAV5 Capsid VP3 R93L T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No: 192.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Q340A (AAV5 Capsid VP1 Q340A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 194. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену (AAV5 Capsid VP2 Q204A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 196.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Q148A (AAV5 Capsid VP3 Q148A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 198.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A Q340A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A Q340A T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 200.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены Q204A T575S (AAV5 Capsid VP2 Q204A T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 202.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены Q148A T519S (AAV5 Capsid VP3 Q148A T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 204.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S420F (AAV5 Capsid VP1 S420F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 206.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S284F (AAV5 Capsid VP2 S284F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 208.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S228F (AAV5 Capsid VP3 S228F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 210.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S420F T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S420F T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 212. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S284F T575S (AAV5 Capsid VP2 S284F T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 214.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S228F T519S (AAV5 Capsid VP3 S228F T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 216.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S680A (AAV5 Capsid VP1 S680A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 218.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S544A (AAV5 Capsid VP2 S544A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 220.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S488A (AAV5 Capsid VP3 S488A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 222.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S680A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S680A T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 224.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S544A T575S (AAV5 Capsid VP2 S544A T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 226.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S488A T519S (AAV5 Capsid VP3 S488A T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 228.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену T721V (AAV5 Capsid VP1 T721V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 230.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену T585V (AAV5 Capsid VP2 T585V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 232.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену T529V (AAV5 Capsid VP3 T529V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 234.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A T721V T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A T721V T711S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 236.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены T585V T575S (AAV5 Capsid VP2 T585V T575S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 238.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены T529V T519S (AAV5 Capsid VP3 T529V T519S) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 240.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Q351K (AAV9 Capsid VP1 Q351K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 242.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Q214K (AAV9 Capsid VP2 Q214K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 244.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Q149K (AAV9 Capsid VP3 Q149K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 246. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Q351R (AAV9 Capsid VP1 Q351R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 248.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Q214R (AAV9 Capsid VP2 Q214R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 250.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Q149R (AAV9 Capsid VP3 Q149R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 252.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену S232T (AAV9 Capsid VP1 S232T) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 254.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену S95T (AAV9 Capsid VP2 S95T) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 256.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену S30T (AAV9 Capsid VP3 S30T) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 258.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену D297E (AAV9 Capsid VP1 D297E) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 260.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену D160E (AAV9 Capsid VP2 D160E) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 262.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид
AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену D95E (AAV9 Capsid VP3 D95E) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 264.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену S692T (AAV9 Capsid VP1 S692T) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 266.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену S555T (AAV9 Capsid VP2 S555T) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 268.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену S490T (AAV9 Capsid VP3 S490T) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 270.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену D433Y (AAV9 Capsid VP1 D433Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 272.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену D296Y (AAV9 Capsid VP2 D296Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 274.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену D231Y (AAV9 Capsid VP3 D231Y) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 276.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену T625L (AAV9 Capsid VP1 T625L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 278.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену T488L (AAV9 Capsid VP2 T488L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 280. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену T423L (AAV9 Capsid VP3 T423L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 282.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену T625V (AAV9 Capsid VP1 T625V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 284.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену T488V (AAV9 Capsid VP2 T488V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 286.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену T423V (AAV9 Capsid VP3 T423V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 288.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену N691A (AAV9 Capsid VP1 N691A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 290.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену N554A (AAV9 Capsid VP2 N554A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 292.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену N489A (AAV9 Capsid VP3 N489A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 294.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену C396V (AAV9 Capsid VP1 C396V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 296.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид
AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену C259V (AAV9 Capsid VP2 C259V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 298.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену C194V (AAV9 Capsid VP3 C194V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 300.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Y478F (AAV9 Capsid VP1 Y478F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 302.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Y341F (AAV9 Capsid VP2 Y341F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 304.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Y276F (AAV9 Capsid VP3 Y276F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 306.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену R296L (AAV9 Capsid VP1 R296L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 308.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену R159L (AAV9 Capsid VP2 R159L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 310.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену R94L (AAV9 Capsid VP3 R94L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 312.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену T733V (AAV9 Capsid VP1 T733V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 314. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену T596V (AAV9 Capsid VP2 T596V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 316.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену T531V (AAV9 Capsid VP3 T531V) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 318.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену A427R (AAV9 Capsid VP1 A427R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену A290R (AAV9 Capsid VP2 A290R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 322.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену A225R (AAV9 Capsid VP3 A225R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 324.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену M635D (AAV9 Capsid VP1 M635D) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 326.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену M498D (AAV9 Capsid VP2 M498D) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 328.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену M433D (AAV9 Capsid VP3 M433D) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 330.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид
AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену L444R (AAV9 Capsid VP1 L444R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 332.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену L307R (AAV9 Capsid VP2 L307R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 334.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену L242R (AAV9 Capsid VP3 L242R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 336.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену G604N (AAV9 Capsid VP1 G604N) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 338.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену G467N (AAV9 Capsid VP2 G467N) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 340.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену G402N (AAV9 Capsid VP3 G402N) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 342.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену G627K (AAV9 Capsid VP1 G627K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 344.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену G490K (AAV9 Capsid VP2 G490K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 346.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену G425K (AAV9 Capsid VP3 G425K) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 348. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену W695R (AAV9 Capsid VP1 W695R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 350.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену W558R (AAV9 Capsid VP2 W558R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 352.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену W493R (AAV9 Capsid VP3 W493R) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 354.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Q351A (AAV9 Capsid VP1 Q351A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 356.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Q214A (AAV9 Capsid VP2 Q214A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 358.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Q149A (AAV9 Capsid VP3 Q149A) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 360.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Y395F (AAV9 Capsid VP1 Y395F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 362.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Y258F (AAV9 Capsid VP2 Y258F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 364.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид
AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Y193F (AAV9 Capsid VP3 Y193F) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 366.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену R434L (AAV9 Capsid VP1 R434L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 368.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену R297L (AAV9 Capsid VP2 R297L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 370.
В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный капсид AAV включает модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену (AAV9 Capsid VP3 R232L) и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш No: 372.
Все вышеуказанные одна или несколько замен модифицированном капсиде AAV рассчитываются относительно соответствующего капсида дикого типа.
Природная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа (AAV5 Capsid VP1 WT) представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, природная последовательность белка VP2 капсида AAV5 дикого типа (AAV5 Capsid VP2 WT) представлена аминокислотной последовательностью SEQ Ш No: 4, природная последовательность белка VP3 капсида AAV5 дикого типа (AAV5 Capsid VP3 WT) представлена аминокислотной последовательностью SEQ Ш No: 6.
Природная последовательность белка VP1 капсида AAV9 дикого типа (AAV9 Capsid VP1 WT) представлена аминокислотной последовательностью SEQ Ш No: 373, природная последовательность белка VP2 капсида AAV9 дикого типа (AAV9 Capsid VP2 WT) представлена аминокислотной последовательностью SEQ Ш No: 375, природная последовательность белка VP3 капсида AAV9 дикого типа (AAV9 Capsid VP3 WT) представлена аминокислотной последовательностью SEQ Ш No: 377.
Авторами изобретения было установлено, что вышеуказанные модифицированные капсиды AAV обладают одним или несколькими улучшенными свойствами по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций (дикого типа), которые выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка, -увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный капсид по изобретению
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных капсидов.
В любом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может быть выделенной.
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», « полину клеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ТТПР и т.п., и способами синтеза.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.
Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью . «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену G226A (AAV5 Capsid VP1 G226A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 13 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену G90A (AAV5 Capsid VP2 G90A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 15 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену G34A (AAV5 Capsid VP3 G34A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 17 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, G226A и Т71 IS (AAV5 Capsid VP1 S2A, G226A и Т711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 19 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены G90A и T575S (AAV5 Capsid VP2 G90A и T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 21 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены G34A T519S (AAV5 Capsid VP3 G34A T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 23 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену D286E (AAV5 Capsid VP1 D286E), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 25 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену D150E (AAV5 Capsid VP2 D150E), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 27 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену D94E (AAV5 Capsid VP3 D94E), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 29 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, D286E и Т711 S (AAV5 Capsid VP1 S2A, D286E и Т711 S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 31 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены D150E и T575S (AAV5 Capsid VP2 D150E и T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 33 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены D94E и T519S (AAV5 Capsid VP3 D94E и T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 35 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену L341Y (AAV5 Capsid VP1 L341Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 37 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену L205Y (AAV5 Capsid VP2 L205Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 39 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену L149Y (AAV5 Capsid VP3 L149Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 41 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, L341Y, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, L341Y, T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 43 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены L205Y, T575S (AAV5 Capsid VP2 L205Y, T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 45 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены L149Y, T519S (AAV5 Capsid VP3 L149Y, T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 47 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену C387V (AAV5 Capsid VP1 C387V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 49 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену C251V (AAV5 Capsid VP2 C251V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 51 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену C195V (AAV5 Capsid VP3 C195V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 53 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A, C387V, T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A, C387V, T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 55 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены C251V, T575S (AAV5 Capsid VP2 C251V, T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 57 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены C195V, T519S (AAV5 Capsid VP3 C195V, T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 59 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Q421H (AAV5 Capsid VP1 Q421H), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 61 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену Q285H (AAV5 Capsid VP2 Q285H), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 63 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Q229H (AAV5 Capsid VP3 Q229H), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 65 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A Q421H T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A Q421H T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 67 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены Q285H T575S (AAV5 Capsid VP2 Q285H T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 69 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены Q229H T519S (AAV5 Capsid VP3 Q229H T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 71 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Р466Т (AAV5 Capsid VP1 Р466Т), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 73 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену РЗЗОТ (AAV5 Capsid VP2 РЗЗОТ), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 75 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Р274Т (AAV5 Capsid VP3 Р274Т), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 77 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A Р466Т T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A Р466Т T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 79 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены РЗЗОТ T575S (AAV5 Capsid VP2 РЗЗОТ T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 81 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены Р274Т T519S (AAV5 Capsid VP3 Р274Т T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 83 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S594Q (AAV5 Capsid VP1 S594Q), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 85 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S458Q (AAV5 Capsid VP2 S458Q), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 87 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S402Q (AAV5 Capsid VP3 S402Q), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 89 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S594Q T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S594Q T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 91 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S458Q T575S (AAV5 Capsid VP2 S458Q T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 93 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S402Q T519S (AAV5 Capsid VP3 S402Q T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 95 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены T614L (AAV5 Capsid VP1 T614L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 97 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены T478L (AAV5 Capsid VP2 T478L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 99 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены T422L (AAV5 Capsid VP3 T422L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 101 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A T614L T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A T614L T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 103 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены T478L T575S (AAV5 Capsid VP2 T478L T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 105 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены (AAV5 Capsid VP3 T422L T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 107 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замен N679K (AAV5 Capsid VP1 N679K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 109 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену N543K (AAV5 Capsid VP2 N543K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 111 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену N487K (AAV5 Capsid VP3 N487K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: ИЗ или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A N679K T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A N679K T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 115 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены N543K T575S (AAV5 Capsid VP2 N543K T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 117 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены N487K T519S (AAV5 Capsid VP3 N487K T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 119 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену P723V (AAV5 Capsid VP1 P723V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 121 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену P587V (AAV5 Capsid VP2 P587V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 123 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену P531V (AAV5 Capsid VP3 P531V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 125 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены P723V T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A P723V T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 127 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены P587V T575S (AAV5 Capsid VP2 P587V T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 129 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены P531V T519S (AAV5 Capsid VP3 P531V T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 131 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену V431Y (AAV5 Capsid VP1 V431Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 133 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену V295Y (AAV5 Capsid VP2 V295Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 135 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену V239Y (AAV5 Capsid VP3 V239Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 137 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A V431Y T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A V431Y T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 139 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены V295Y T575S (AAV5 Capsid VP2 V295Y T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 141 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены V239Y T519S (AAV5 Capsid VP3 V239Y T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 143 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену A616D (AAV5 Capsid VP1 A616D), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 145 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену A480D (AAV5 Capsid VP2 A480D), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 147 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену A424D (AAV5 Capsid VP3 A424D), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 149 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A A616D T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A A616D T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 151 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены A480D T575S (AAV5 Capsid VP2 A480D T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 153 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены A424D T519S (AAV5 Capsid VP3 A424D T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 155 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену W683R (AAV5 Capsid VP1 W683R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 157 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену W547R (AAV5 Capsid VP2 W547R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 159 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену W491R (AAV5 Capsid VP3 W491R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 161 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A W683R T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A W683R T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 163 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены W547R T575S (AAV5 Capsid VP2 W547R T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 165 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены W491R T519S (AAV5 Capsid VP3 W491R T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 167 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S222A (AAV5 Capsid VP1 S222A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 169 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S86A (AAV5 Capsid VP2 S86A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 171 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S30 A (AAV5 Capsid VP3 S30A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 173 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S222A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S222A T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 175 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S86A T575S (AAV5 Capsid VP2 S86A T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 177 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S30A T519S (AAV5 Capsid VP3 S30A T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 179 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену R285L (AAV5 Capsid VP1 R285L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 181 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену R149L (AAV5 Capsid VP2 R149L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 183 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену R93L (AAV5 Capsid VP3 R93L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 185 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A R285L T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A R285L T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 187 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены R149L T575S (AAV5 Capsid VP2 R149L T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 189 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены R93L T519S (AAV5 Capsid VP3 R93L T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 191 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену Q340A (AAV5 Capsid VP1 Q340A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 193 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену (AAV5 Capsid VP2 Q204A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 195 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену Q148A (AAV5 Capsid VP3 Q148A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 197 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A Q340A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A Q340A T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 199 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены Q204A T575S (AAV5 Capsid VP2 Q204A T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 201 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены Q148A T519S (AAV5 Capsid VP3 Q148A T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 203 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S420F (AAV5 Capsid VP1 S420F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 205 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S284F (AAV5 Capsid VP2 S284F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 207 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S228F (AAV5 Capsid VP3 S228F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 209 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S420F T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S420F T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 211 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S284F T575S (AAV5 Capsid VP2 S284F T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 213 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S228F T519S (AAV5 Capsid VP3 S228F T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 215 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену S680A (AAV5 Capsid VP1 S680A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 217 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену S544A (AAV5 Capsid VP2 S544A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 219 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену S488A (AAV5 Capsid VP3 S488A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 221 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A S680A T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A S680A T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 223 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены S544A T575S (AAV5 Capsid VP2 S544A T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 225 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены S488A T519S (AAV5 Capsid VP3 S488A T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 227 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замену T721V (AAV5 Capsid VP1 T721V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 229 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замену T585V (AAV5 Capsid VP2 T585V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 231 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замену T529V (AAV5 Capsid VP3 T529V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 233 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV5, который включает замены S2A T721V T711S (AAV5 Capsid VP1 S2A T721V T711S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 235 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который включает замены T585V T575S (AAV5 Capsid VP2 T585V T575S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 237 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который включает замены T529V T519S (AAV5 Capsid VP3 T529V T519S), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 239 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Q351K (AAV9 Capsid VP1 Q351K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 241 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Q214K (AAV9 Capsid VP2 Q214K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 243 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Q149K (AAV9 Capsid VP3 Q149K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 245 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Q351R (AAV9 Capsid VP1 Q351R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 247 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Q214R (AAV9 Capsid VP2 Q214R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 249 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Q149R (AAV9 Capsid VP3 Q149R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 251 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену S232T (AAV9 Capsid VP1 S232T), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 253 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену S95T (AAV9 Capsid VP2 S95T), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 255 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену S30T (AAV9 Capsid VP3 S30T), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 257 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену D297E (AAV9 Capsid VP1 D297E), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 259 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену D160E (AAV9 Capsid VP2 D160E), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 261 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену D95E (AAV9 Capsid VP3 D95E), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 263 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену S692T (AAV9 Capsid VP1 S692T), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 265 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену S555T (AAV9 Capsid VP2 S555T), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 267 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену S490T (AAV9 Capsid VP3 S490T), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 269 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену D433Y (AAV9 Capsid VP1 D433Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 271 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену D296Y (AAV9 Capsid VP2 D296Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 273 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену D231Y (AAV9 Capsid VP3 D231Y), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 275 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену T625L (AAV9 Capsid VP1 T625L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 277 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену T488L (AAV9 Capsid VP2 T488L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 279 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену T423L (AAV9 Capsid VP3 T423L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 281 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену T625V (AAV9 Capsid VP1 T625V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 283 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену T488V (AAV9 Capsid VP2 T488V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 285 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену T423V (AAV9 Capsid VP3 T423V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 287 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену N691A (AAV9 Capsid VP1 N691A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 289 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену N554A (AAV9 Capsid VP2 N554A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 291 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену N489A (AAV9 Capsid VP3 N489A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 293 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену C396V (AAV9 Capsid VP1 C396V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 295 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену C259V (AAV9 Capsid VP2 C259V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 297 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену C194V (AAV9 Capsid VP3 C194V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 299 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Y478F (AAV9 Capsid VP1 Y478F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 301 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Y341F (AAV9 Capsid VP2 Y341F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 303 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Y276F (AAV9 Capsid VP3 Y276F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 305 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену R296L (AAV9 Capsid VP1 R296L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 307 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену R159L (AAV9 Capsid VP2 R159L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 309 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену R94L (AAV9 Capsid VP3 R94L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 311 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену T733V (AAV9 Capsid VP1 T733V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 313 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену T596V (AAV9 Capsid VP2 T596V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 315 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену T531V (AAV9 Capsid VP3 T531V), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 317 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену A427R (AAV9 Capsid VP1 A427R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 319 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену A290R (AAV9 Capsid VP2 A290R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 321 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену A225R (AAV9 Capsid VP3 A225R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 323 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену M635D (AAV9 Capsid VP1 M635D), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 325 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену M498D (AAV9 Capsid VP2 M498D), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 327 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену M433D (AAV9 Capsid VP3 M433D), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 329 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену L444R (AAV9 Capsid VP1 L444R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 331 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену L307R (AAV9 Capsid VP2 L307R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 333 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену L242R (AAV9 Capsid VP3 L242R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 335 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену G604N (AAV9 Capsid VP1 G604N), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 337 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену G467N (AAV9 Capsid VP2 G467N), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 339 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену G402N (AAV9 Capsid VP3 G402N), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 341 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену G627K (AAV9 Capsid VP1 G627K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 343 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену G490K (AAV9 Capsid VP2 G490K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 345 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену G425K (AAV9 Capsid VP3 G425K), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 347 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену W695R (AAV9 Capsid VP1 W695R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 349 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену W558R (AAV9 Capsid VP2 W558R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 351 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену W493R (AAV9 Capsid VP3 W493R), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 353 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Q351A (AAV9 Capsid VP1 Q351A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 355 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Q214A (AAV9 Capsid VP2 Q214A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 357 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Q149A (AAV9 Capsid VP3 Q149A), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 359 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену Y395F (AAV9 Capsid VP1 Y395F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 361 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену Y258F (AAV9 Capsid VP2 Y258F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 363 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену Y193F (AAV9 Capsid VP3 Y193F), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 365 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида AAV9, который включает замену R434L (AAV9 Capsid VP1 R434L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: SEQ Ш No: 367 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP2 капсида AAV9, который включает замену R297L (AAV9 Capsid VP2 R297L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 369 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует модифицированный капсид, включает нуклеиновую, кислоту, кодирующую модифицированный белок VP3 капсида AAV9, который включает замену (AAV9 Capsid VP3 R232L), которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш No: 371 или любую другую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка.
Под «любой другой нуклеотидной последовательность, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность данного модифицированного белка» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна указанного нуклеиновой последовательности, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать одну и ту же аминокислотную последовательность. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК- последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных капсидов, включает любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот или их комбинации.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
Термины «вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса», «рекомбинантный вирус на основе AAV», «вирусоподобная частица на основе AAV», «рекомбинантный вирусный штамм AAV», «рекомбинантный вектор AAV» или «вектор на основе гААУ» в контексте настоящего описания имеют одинаковое значение. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор на основе rAAV включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
Вектор на основе rAAV по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих последовательности белков (Rep), необходимых для обеспечения жизненного цикла вируса, а также последовательности перекрывающихся белков капсида (Сар).
Характеристика капсида подробно описана в вышеуказанном разделе описания.
Под «регуляторными последовательностями, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках» подразумевается в рамках данного изобретения полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они клонированы. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких регулирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «регуляторные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, последовательности лидерных пептидов.
В контексте настоящего описания термин «промотор» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который контролирует транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, а также который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и других последовательностей ДНК, включающих, без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания репрессора и активатора белка, а также любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалистам в данной области, которые непосредственно или опосредованно регулируют уровень транскрипции с данным промотором. «Конститутивный» промотор представляет собой такой промотор, который активен в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который подвергается физиологической регуляции или регуляции в ходе развития, например, при воздействии химического индуктора. «Тканеспецифичный» промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток.
Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе. В соответствии с идеей настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор цитомегаловируса (CMV). Промотор или промотор/энхансер, полученные из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека, в особенности подходят в качестве промотора для вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению. Немедленная ранняя (IE) область цитомегаловируса (hCMV) человека и полученные из нее функциональные запускающие экспрессию фрагменты и/или функциональные усиливающие экспрессию фрагменты, например, описаны в ЕР0173177 и ЕР0323997, а также хорошо известны в данной области. Таким образом, несколько фрагментов немедленной ранней (IE) области hCMV могут использоваться в качестве промотора и/или промотора/энхансера.
Термины «энхансеры» или «энхансер», используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например, последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК, превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках может включать следующие элементы в направлении от 5'-конца к З'-концу: левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);
CMV (цитомегаловирусный) энхансер;
CMV (цитомегаловирусный) промотер; интрон гена hBGl (ген субъединицы гемоглобина гамма- 1); нуклеиновая кислота, кодирующая продукт; сигнал полиаденилирования hGHl (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека); правый (второй) ITR.
В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая продукт (трансген) представляет собой по меньшей мере один ген, кодирующий белок. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну небольшую нуклеиновую кислоту-ингибитор. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну репортерную молекулу. В некоторых вариантах реализации малая ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой miRNA. В некоторых вариантах реализации малая ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой sponge miRNA или TuD-RNA, которая ингибирует активность по меньшей мере одной miRNA у животного. В некоторых вариантах реализации miRNA экспрессируется в клетке ткани- мишени. В некоторых вариантах реализации ткань-мишень представляет собой ткань печени, центральной нервной системы (ЦНС), глаз, желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, молочной железы, поджелудочной железы, мочевыводящих путей или ткани матки.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV имеет продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой белок SMN 1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов)
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой полипептид RBD-S (рекомбинантный рецептор-связывающий домен гликопротеина S) вируса SARS-cov2 (коронавирус 2 типа, вызывающий тяжёлый острый респираторный синдром).
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях
Применяли пакет программ Infomax's Vector NTI Advance suite, версия 8.0 и SnapGene версии 5.1.4.1 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Статистический анализ данных
Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), для сравнения результатов теста и контроля использовали дисперсионный анализ (ANOVA), и они были определены как статистически значимые.
Пример 1.
Выбор вариантов мутаций в капсиде AAV5 на основе структурного сходства капсидов семейства парвовирусов
Дизайн мутаций капсида AAV5 основан на высокой степени структурного сходства белков капсида внутри семейства парвовирусов (Parvoviridae), в том числе вирусов, не относящихся к AAV. Подбор замены состоит из трёх этапов и включает в себя:
1) Определение аминокислот белка-капсомера AAV5, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида;
2) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV5 с капсидом одного из парвовирусов, не являющихся AAV (далее «капсид-шаблон»);
3) попарное сравнение остатков аминокислот капсида AAV5 и капсида-шаблона.
Предварительно проводится преподготовка структур трехмерных моделей AAV5 и капсида-шаблона, которая заключается в достраивании отсутствующих атомов в структуре с помощью утилиты Prepwizard из пакета Schrodinger Suite.
В пункте 1 под интерфейсом взаимодействия понимается набор фрагментов полипептидной цепи белка-капсомера, взаимодействующих с аминокислотами соседней пентамерной субъединицы, где под пентамерной субъединицей понимается структурный элемент капсида в форме правильного пятиугольника, состоящий из 5 белков-капсомеров, расположенных вокруг центральной поры (L. М. Drouin and М. Agbandje-McKenna. Adeno- associated virus structural biology as a tool in vector development. Future Virol., vol. 8, no. 12, pp. 1183-1199, 2013.).
На втором этапе проводится структурное выравнивание капсида AAV5 и капсида- шаблона с помощью утилиты Structure Alignment пакета Schrodinger Suite. По итогам выравнивания для каждой аминокислоты AAV5 из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц определяется ближайшая к ней аминокислота капсида-шаблона (структурный аналог исходной аминокислоты), которая рассматривается в качестве потенциальной замены. Структурный аналог исходной аминокислоты отсутствует, если в окрестности ближайшей к ней аминокислоты капсида-шаблона расположена другая аминокислота AAV5, расстояние до которой меньше, чем до исходной аминокислоты. Здесь подразумевается, что расстояние между аминокислотами оценивается по расстоянию между альфа-атомами углерода.
После того, как для всех аминокислот интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц определены структурные аналоги, решение о замене принимается в соответствии с Примерами 2, 3 и 4.
Пример 2. Дизайн мутаций по принципу увеличения объема остатка аминокислоты
По итогам структурного выравнивания капсида AAV5 и капсида-шаблона имеем попарное структурное соответствие между их аминокислотными остатками. В одном из случаев решение о замене исходной аминокислоты на соответствующую аминокислоту капсида-шаблона принимается по итогам сравнения объемов Ван-дер-Ваальса боковых заместителей аминокислот (N. J. Darby, S. S. N. J. Darby, and Т. Е. Creighton, Protein Structure. IRL Press at Oxford University Press, 1993; таблица 1). Мутация вносится при соблюдении следующих условий:
1. Объем бокового заместителя аминокислоты из капсида-шаблона больше, чем объем бокового заместителя исходной аминокислоты
2. Аминокислота из капсида шаблона не является цистеином или метионином.
Исключение цистеина и метионина из числа аминокислот для потенциальной замены обусловлено их значительной реакционной способностью, в частности способностью к окислению.
Таблица 1. Объем Ван-дер-Ваальса для боковых заместителей аминокислот (N. J. Darby, S. S. N. J. Darby, and Т. Е. Creighton, Protein Structure. IRL Press at Oxford University Press, 1993.)
Figure imgf000104_0001
Figure imgf000105_0001
Результаты применения описываемого способа дизайна мутаций в капсиде AAV5 с использованием трёх капсидов-шаблонов: HBoVl (PDBid 5urf), В19 (PDBid ls58), BPV (PDBid 4qc8) приведены в таблице 2. В первой колонке указаны аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV5, в остальных колонках приведены аминокислоты, полученные по итогам попарного структурного выравнивания AAV5 на каждый из капсидов HBoVl, В 19 и BPV. Звездочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием размера бокового заместителя и запретом замены на цистеин и метионин.
Под интерфейсом взаимодействия для данной субъединицы мы понимаем все аминокислоты, хотя бы один атом которых находится на расстоянии, не превышающем 5 А от какого-либо атома из соседних пентамерных субъединиц.
Для AAV5 мы производили расчет по структуре капсида PDB Ш: 6JCT.
В ней, согласно расчету, к интерфейсу взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами AAV5 относятся следующие диапазоны остатков белка VP1 капсида AAV5: 220 - 226, 283 - 293, 339 - 342, 385 - 392, 412 - 435, 462 - 466, 590 - 598, 611 - 626, 677 - 685, 721-724.
Таблица 2. Аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV5 и структурно соответствующие им аминокислоты капсомеров В 19, HBoVl и BPV. Звездочкой отмечены аминокислоты, боковой заместитель которых больше, чем у исходной аминокислоты капсомера AAV5. Прочерком отмечен факт отсутствия структурно аналогичной аминокислоты в капсиде шаблона.
Figure imgf000106_0001
Figure imgf000107_0001
Figure imgf000108_0001
Figure imgf000109_0001
Пример 3. Дизайн мутаций по принципу увеличения числа полярных контактов между капсомерами.
В соответствие с Примером 1 по итогам структурного выравнивания капсида AAV5 и капсида-шаблона имеем попарное структурное соответствие между их аминокислотными остатками. В одном из случаев решение о замене исходной аминокислоты на соответствующую аминокислоту капсида-шаблона принимается на основе анализа микроокружениия и для исходной аминокислоты, и для ее структурного аналога. В частности, положительное решение о замене принимается, если в паре соответствующих аминокислот в капсиде-шаблоне расположена аминокислота с полярным боковым заместителем, а в AAV5 - с неполярным, при этом обе аминокислоты имеют хотя бы один полярный контакт с соседней пентамерной субъединицей капсида. Считаем, что произвольная аминокислота имеет полярный контакт, если на расстоянии не более 5 А от любого атома бокового заместителя отличного от водорода расположен хотя бы один атом полярной группы бокового заместителя другой аминокислоты другого капсомера (таблица 3). По аналогии с Примером 2 замены на цистеин и метионин также не допускаются.
Таблица 3. Перечень аминокислот с полярными боковыми заместителями и атомы их полярных групп (наименование по спецификации PDB) за исключением атомов водорода.
Figure imgf000109_0002
Figure imgf000110_0001
Результаты применения описываемого способа дизайна мутаций в капсиде AAV5 с использованием трёх капсидов-шаблонов: HBoVl (PDBid 5urf), В19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) приведены в таблице 4. В первой колонке указаны аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV5, для которых найдены подходящие варианты замены в одном из трёх капсидов HBoVl, В 19 и BPV. В остальных колонках приведены аминокислоты, полученные по итогам попарного структурного выравнивания AAV5 на каждый из капсидов. Звездочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием увеличения числа полярных контактов и запретом замены на цистеин и метионин.
Таблица 4. Позиции капсомера AAV5, для которых выявлены подходящие замены и соответствующие им аминокислоты капсидов HBoVl, В 19 и BPV. Звёздочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием увеличения числа полярных контактов между капсомерами.
Figure imgf000110_0002
Пример 4. Дизайн мутаций по принципу уменьшения числа полярных контактов между капсомерами
В соответствие с Примером 1 по итогам структурного выравнивания капсида AAV5 и капсида-шаблона имеем попарное структурное соответствие между их аминокислотными остатками. В одном из случаев решение о замене исходной аминокислоты на соответствующую аминокислоту капсида-шаблона принимается на основе анализа микроокружениия и для исходной аминокислоты, и для ее структурного аналога. В частности, положительное решение о замене принимается, если в паре соответствующих аминокислот в капсиде AAV5 находится остаток полярной аминокислоты, образующий хотя бы один полярный контакт с соседней пентамерной субъединицей, в то время как в капсиде-шаблоне расположен остаток неполярной аминокислоты. При этом по аналогии с Примером 2 в качестве замены не рассматриваются остатки цистеина или метионина.
Результаты применения описываемого способа дизайна мутаций в капсиде AAV5 с использованием трёх капсидов-шаблонов: HBoVl (PDBid 5urf), В19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) приведены в таблице 5. В первой колонке указаны аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV5, для которых найдены подходящие варианты замены в одном из трёх капсидов HBoVl, В 19 и BPV. В остальных колонках приведены аминокислоты, полученные по итогам попарного структурного выравнивания AAV5 на каждый из капсидов-шаблонов. Звездочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием увеличения числа полярных контактов и запретом замены на цистеин и метионин.
Таблица 5. Позиции капсомера AAV5, для которых выявлены подходящие замены и соответствующие им аминокислоты капсидов HBoVl, В 19 и BPV. Звёздочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием уменьшения числа полярных контактов между капсомерами.
Figure imgf000111_0001
Пример 5.
Выбор вариантов мутаций в капсиде AAV9 на основе структурного сходства капсидов семейства парвовирусов
Дизайн мутаций капсида AAV9 основан на высокой степени структурного сходства белков капсида внутри семейства парвовирусов (Parvoviridae), в том числе вирусов, не относящихся к AAV. Подбор замены состоит из трёх этапов и включает в себя:
1) определение аминокислот белка-капсомера AAV9, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида;
2) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV9 с капсидом одного из парвовирусов, не являющихся AAV (далее “капсид-шаблон”);
3) попарное сравнение остатков аминокислот капсида AAV9 и капсида-шаблона.
Предварительно проводится преподготовка структур трехмерных моделей AAV9 и капсида-шаблона, которая заключается в достраивании отсутствующих атомов в структуре с помощью утилиты Prepwizard из пакета Schrodinger Suite.
В пункте 1 под интерфейсом взаимодействия понимается набор фрагментов полипептидной цепи белка-капсомера, взаимодействующих с аминокислотами соседней пентамерной субъединицы, где под пентамерной субъединицей понимается структурный элемент капсида в форме правильного пятиугольника, состоящий из 5 белков-капсомеров, расположенных вокруг центральной поры (L. М. Drouin and М. Agbandje-McKenna. Adeno- associated virus structural biology as a tool in vector development. Future Virol., vol. 8, no. 12, pp. 1183-1199, 2013.).
На втором этапе проводится структурное выравнивание капсида AAV9 и капсида- шаблона с помощью утилиты Strucutre Alignment пакета Schrodinger Suite. По итогам выравнивания для каждой аминокислоты AAV9 из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц определяется ближайшая к ней аминокислота капсида-шаблона (структурный аналог исходной аминокислоты), которая рассматривается в качестве потенциальной замены. Структурный аналог исходной аминокислоты отсутствует, если в окрестности ближайшей к ней аминокислоты капсида-шаблона расположена другая аминокислота AAV9, расстояние до которой меньше, чем до исходной аминокислоты. Здесь подразумевается, что расстояние между аминокислотами оценивается по расстоянию между альфа-атомами углерода.
После того, как для всех аминокислот интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц определены структурные аналоги, решение о замене принимается в соответствии с Примерами 6, 7 и 8.
Пример 6. Дизайн мутаций по принципу увеличения объема остатка аминокислоты
По итогам структурного выравнивания капсида AAV9 и капсида-шаблона имеем попарное структурное соответствие между их аминокислотными остатками. В одном из случаев решение о замене исходной аминокислоты на соответствующую аминокислоту капсида-шаблона принимается по итогам сравнения объемов Ван-дер-Ваальса боковых заместителей аминокислот (N. J. Darby, S. S. N. J. Darby, and Т. Е. Creighton, Protein Structure. IRL Press at Oxford University Press, 1993; таблица 1). Мутация вносится при соблюдении следующих условий:
1. Объем бокового заместителя аминокислоты из капсида-шаблона больше, чем объем бокового заместителя исходной аминокислоты
2. Аминокислота из капсида шаблона не является цистеином или метионином.
Исключение цистеина и метионина из числа аминокислот для потенциальной замены обусловлено их значительной реакционной способностью, в частности способностью к окислению.
Результаты применения описываемого способа дизайна мутаций в каписде AAV9 с использованием трёх капсидов-шаблонов: HBoVl (PDBid 5urf), В19 (PDBid ls58), BPV (PDBid 4qc8) приведены в таблице 6. В первой колонке указаны аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV9, в остальных колонках приведены аминокислоты, полученные по итогам попарного структурного выравнивания AAV9 на каждый из капсидов HBoVl, В19 и BPV. Звездочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием размера бокового заместителя и запретом замены на цистеин и метионин.
Под интерфейсом взаимодействия для данной субъединицы мы понимаем все аминокислоты, хотя бы один атом которых находится на расстоянии, не превышающем 5 А от какого-либо атома из соседних пентамерных субъединиц.
Для AAV9 расчет был сделан по структуре PDB Ш: 3UX1.
В ней, согласно расчету, к интерфейсу взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами AAV9 относятся следующие диапазоны остатков белка VP1 капсида AAV9: 230 - 236, 294 - 304, 350 - 353, 394 - 401, 421 - 444, 476 - 480, 601 - 609, 622 - 637, 689 - 697, 733 - 736.
Таблица 6. Аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV9 и структурно соответствующие им аминокислоты капсомеров В 19, HBoVl и BPV. Звездочкой отмечены аминокислоты, боковой заместитель которых больше, чем у исходной аминокислоты капсомера AAV9. Прочерком отмечен факт отсутствия структурно аналогичной аминокислоты в капсиде шаблона.
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
Пример 7. Дизайн мутаций по принципу увеличения числа полярных контактов между капсомерами.
В соответствие с Примером 5 по итогам структурного выравнивания капсида AAV9 и капсида-шаблона имеем попарное структурное соответствие между их аминокислотными остатками. В одном из случаев решение о замене исходной аминокислоты на соответствующую аминокислоту капсида-шаблона принимается на основе анализа микроокружениия и для исходной аминокислоты, и для ее структурного аналога. В частности, положительное решение о замене принимается, если в паре соответствующих аминокислот в капсиде-шаблоне расположена аминокислота с полярным боковым заместителем, а в AAV9 - с неполярным, при этом обе аминокислоты имеют хотя бы один полярный контакт с соседней пентамерной субъединицей капсида. Считаем, что произвольная аминокислота имеет полярный контакт, если на расстоянии не более 5 А от любого атома бокового заместителя отличного от водорода расположен хотя бы один атом полярной группы бокового заместителя другой аминокислоты другого капсомера (таблица 3). По аналогии с Примером 6 замены на цистеин и метионин также не допускаются.
Результаты применения описываемого способа дизайна мутаций в каписде AAV9 с использованием трёх капсидов-шаблонов: HBoVl (PDBid 5urf), В19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) приведены в таблице 7. В первой колонке указаны аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV9, для которых найдены подходящие варианты замены в одном из трёх капсидов HBoVl, В 19 и BPV. В остальных колонках приведены аминокислоты, полученные по итогам попарного структурного выравнивания AAV9 на каждый из капсидов. Звездочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием увеличения числа полярных контактов и запретом замены на цистеин и метионин.
Таблица 7. Позиции капсомера AAV9, для которых выявлены подходящие замены и соответствующие им аминокислоты капсидов HBoVl, В 19 и BPV. Звёздочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием увеличения числа полярных контактов между капсомерами.
Figure imgf000117_0001
Пример 8. Дизайн мутаций по принципу уменьшения числа полярных контактов между капсомерами
В соответствие с Примером 5 по итогам структурного выравнивания капсида AAV9 и капсида-шаблона имеем попарное структурное соответствие между их аминокислотными остатками. В одном из случаев решение о замене исходной аминокислоты на соответствующую аминокислоту капсида-шаблона принимается на основе анализа микроокружениия и для исходной аминокислоты, и для ее структурного аналога. В частности, положительное решение о замене принимается, если в паре соответствующих аминокислот в капсиде AAV9 находится остаток полярной аминокислоты, образующий хотя бы один полярный контакт с соседней пентамерной субъединицей, в то время как в капсиде-шаблоне расположен остаток неполярной аминокислоты. При этом по аналогии с Примером 6 в качестве замены не рассматриваются остатки цистеина или метионина.
Результаты применения описываемого способа дизайна мутаций в каписде AAV9 с использованием трёх капсидов-шаблонов: HBoVl (PDBid 5urf), В19 (PDBid ls58), BPV (4qc8) приведены в таблице 8. В первой колонке указаны аминокислоты из интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида AAV9, для которых найдены подходящие варианты замены в одном из трёх капсидов HBoVl, В 19 и BPV. В остальных колонках приведены аминокислоты, полученные по итогам попарного структурного выравнивания AAV9 на каждый из капсидов-шаблонов. Звездочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием увеличения числа полярных контактов и запретом замены на цистеин и метионин.
Таблица 8. Позиции капсомера AAV9, для которых выявлены подходящие замены и соответствующие им аминокислоты капсидов HBoVl, В 19 и BPV. Звёздочкой отмечены аминокислоты, пригодные для замены в соответствии с критерием уменьшения числа полярных контактов между капсомерами.
Figure imgf000118_0001
Пример 9. Получение библиотек вариантов капсидов AAV5
Получение библиотек вариантов капсидов AAV5 производили методом случайного мутагенеза последовательности гена Cap (Davidsson М. et al., 2016). Вкратце, последовательность дикого типа гена Сар пятого серотипа (GenBank ID AF085716.1) была собрана de novo, после чего синтезированный геном капсида AAV5 дикого типа фрагментировали с использованием урацил-ДНК-гликозилазы, полученные фрагменты собирали в полноразмерный ген Сар с помощью ДНК-полимеразы, не обладающей корректирующей активностью (в результате в последовательности возникали случайные мутации). Полноразмерные мутантные варианты клонировали в плазмиду-носитель pAAV- linker (Фигура 1) по сайтам рестрикции AscI/EcoRI в общую рамку считывания с зеленым флуоресцентным белком (GFP), продуцируя многообразную случайную библиотеку капсидов AAV5, которую затем использовали для отбора вариантов капсидов с повышенной трансдуцирующей активностью.
Положительный отбор вирусных частиц с повышенной трансдуцирующей активностью проводили in vitro на клетках линии CHO-K1-S. При этом для трансдукции использовали частицы, очищенные с помощью УЦФ в градиенте йодиксанола. Спустя 48 часов клетки собирали и выделяли геномную ДНК для последующей амплификации последовательностей геномов вирусов, способных к эффективной трансдукции. Полученные последовательности затем переклонировали и повторно нарабатывали для последующих итераций отбора с целью обогащения библиотеки вариантами с наибольшей эффективностью трансдукции. После 5 раундов отбора капсидные гены 30 клонов просеквенировали для определения наиболее успешных мутаций и их сочетаний. По результатам секвенирования преобладающими сочетаниями мутаций оказались S2A, Т711S в VP1 AAV5 и варианты капсидов содержащие S2A, T711S, S651A в VP1 AAV5 - порядка 20% клонов. Также были отобраны варианты капсидов, содержащие мутацию S651A в VP1 AAV5. Данные варианты капсидов клонировали в вектора для наработки вирусных частиц и в дальнейшем использовали для визуализации и сравнения профилей трансдукции относительно AAV5 дикого типа.
Пример 10. Наработка и последующий отбор рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей
Для наработки и последующего отбора рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей была разработана серия плазмид: плазмида- носитель, плазмида, содержащая последовательность гена Rep, а также конструкция, содержащая аденовирусные гены, необходимые для репликации вирусных частиц.
Плазмида-носитель pAAV-linker (Фигура 1), предназначенная для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа в одну рамку считывания с репортерным белком, была получена путем замены последовательности модифицированного зеленого флуоресцентного белка в исходной конструкции pAAV-GFP , с помощью рестриктазно-лигазного метода клонирования по сайтам Hindlll/EcoRI, на последовательность T2A-GFP, синтезированную de novo с добавлением сайтов рестрикции EcoRI с 5 ’-конца и Hindlll с 3’ -конца.
Плазмида р A AV-Rep, содержащая последовательность гена Rep (Фигура 2), полученную путем клонирования de novo синтезированной последовательности гена Rep AAV второго серотипа (GenBank Ш AF043303.1) с добавлением сайта рестрикции Pcil на 5’ конец и сайта рестикции Psil на 3’ конце, в плазмиду pGem-T Easy (Promega, США) так же обработанную рестриктазами Pcil/Psil (New England Biolabs, США).
В качестве источника аденовирусных генов для наработки рекомбинантных вирусных частиц была использована конструкция pHelper (Фигура 3) , содержащая AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Оп- ориджин репликации в бактериях, Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno VARNA последовательность гена хелперного аденовируса отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Пример 11. Получение мутантных вариантов капсидов AAV5 и AAV9
Последовательности генов капсида дикого типа AAV пятого серотипа (GenBank Ш AF085716.1) и капсида дикого типа AAV девятого серотипа (GenBank ID AY530579.1) были синтезированы de novo с включением сайта Swal с 5’ конца и сайта Notl с 3’ конца в каждую из синтезированных последовательностей соответственно, после обработки эндонуклеазами рестрикции Swal/Notl (New England Biolabs, США) каждая из последовательностей была клонирована в плазмидный вектор pAAV-Rep (Фигура 2) так же предварительно обработанный рестриктазами Swal/Notl (New England Biolabs, США), в результате чего были получены плазмиды: pAAV-RC5 (Фигура 4), содержащая последовательность капсида AAV пятого серотипа дикого типа, а также содержащая последовательность гена Rep AAV, и pAAV-RC9 (Фигура 5), содержащая последовательность капсида AAV девятого серотипа дикого типа, а также содержащая последовательность гена Rep AAV.
Внесение мутаций в последовательность капсида AAV дикого типа производили с использованием коммерческого набора QuikChange II Site-directed mutagenesis kit (Agilent, USA) согласно инструкции производителя. Праймеры для ПНР были разработаны с помощью программы QuikChange Primer Design (Agilent, USA) (Таблица 9, таблица 10). Вкратце, процедуру, основанную на сайт-направленном мутагенезе, проводили с использованием в качестве матрицы плазмиды pAAV-RC5 или pAAV-RC9 соответственно. Для внесения мутаций, на первом этапе проводили реакцию ПНР в отдельных пробирках для каждого мутанта и контрольного образца с добавлением соответствующих олигонуклеотидов. На втором этапе проводили обработку рестриктазой Dpnl согласно протоколу производителя для удаления матричной плазмидной ДНК, полученной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli XL-lBlue. Полученные клоны анализировали с использованием ПЦР на специфичные участки целевой плазмиды, отобранные мутанты подвергались секвенированию перед использованием.
Таблица 9. Нуклеотидные последовательности праймеров используемые для сайт- направленного мутагенеза последовательности гена капсида AAV пятого серотипа.
Figure imgf000120_0001
Figure imgf000121_0001
Кодоны, несущие замену, выделены жирным шрифтом.
Аналогичным способом мутации были внесены в лидерный вариант капсида AAV пятого серотипа одновременно содержащий мутации S2A и T711S, полученный способом направленной эволюции описанном в Примерах 9 и 10.
Таблица 10. Нуклеотидные последовательности праймеров используемые для сайт- направленного мутагенеза последовательности гена капсида AAV девятого серотипа.
Figure imgf000121_0002
Figure imgf000122_0001
Кодоны, несущие замену, выделены жирным шрифтом.
Пример 11. Эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки- продуценты НЕК293 трансфецировали с использованием полиэтиленимина (PEI, linear, MW 25000, Polyscinces, Inc.) одновременно 3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ Ш NO: 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 163, 169, 175, 181, 187, 193, 199, 205, 211, 217, 223, 229, 235 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотными последовательностями SEQ ID No: 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230 или 236 и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ Ш No: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232 или 238; a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ Ш No: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234 или 240; 3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки- продуценты подвергали лизису (TAKARA BIO INC, Japan) с высвобождением частиц rAAV, полученные вектора обрабатывали ДНКазой I (Invitrogen, USA) в течение 2 часов при 37 ° С, затем еще 2 часа протеиназой К (Invitrogen, USA) при 56 ° С. Титр полученных частиц rAAV проверяли с помощью количественной ПЦР (TaqMan, Applied Biosystems, USA) с использованием сета олигонуклеотидов состоящего из прямого праймера 5’- ACCACATGAAGCAGCACGAC -3’, обратного праймера 5’ - TCAGCTCGATGCGGTTCAC -3’, и зонда 5’- HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3’ специфичного к последовательности GFP.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, Р466Т, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и T711S, приводило к статистически достоверному увеличению эффективности упаковки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, при помощи метода количественной ПЦР удалось выявить изменение количества копий упакованного гетерологичного генома частицы rAAV, кодирующего целевой ген GFP (Фигура 6, Фигура 7).
При одновременном наличии мутаций S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 7,1 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,78Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, G226A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,4 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,36Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, D286E и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,5 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 8,79Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, L341Y и T711S (AAV5-04Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,8 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,46Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, C387V и T711S (AAV5-05Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,8 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,21Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, Q421H и T711S (AAV5-06Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,1 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 5,27Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, Р466Т и T711S (AAV5-07Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 6,2 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,56Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S594Q и T711S (AAV5-08Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,9 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,48Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, T614L и T711S (AAV5-09Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 6,8 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,71Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, N679K и T711S (AAV5-10Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,3 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 8,28Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, P723V и T711S (AAV5-1 IMut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,0 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,26Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, V431Y и T711S (AAV5-12Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,4 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 6,03Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При одновременном наличии мутаций S2A, A616D и T711S (AAV5-13Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,6 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 9,04Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, W683R и T711S (AAV5-14Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,6 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1, 15Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S222A и T711S (AAV5-15Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,5 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 3,77Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, R285L и T711S (AAV5-16Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,5 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 6,28Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, Q340A и T711S (AAV5-17Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,8 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 4,52Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S420F и T711S (AAV5-18Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,4 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1, 10Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S680A и T711S (AAV5-19Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,0 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 7,53Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, T721V и T711S (AAV5-20Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,2 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,31Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации G226A (AAV5-21Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,9 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 1,07Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При наличии единичной мутации D286E (AAV5-22Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,4 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 6,58Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации L341Y (AAV5-23Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,7 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 7,40Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации C387V (AAV5-24Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,8 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 1,32Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации Q421H (AAV5-25Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,2 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 8,77Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации Р466Т (AAV5-26Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,7 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 4,66Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S594Q (AAV5-27Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,1 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 8,50Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации T614L (AAV5-28Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,5 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 4,11Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации N679K (AAV5-29Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,5 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 6,85Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации P723V (AAV5-30Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,2 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 8,77Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации V431Y (AAV5-31Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,4 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 6,58Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации A616D (AAV5-32Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,6 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 4,39Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При наличии единичной мутации W683R (AAV5-33Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,3 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 3,56Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S222A (AAV5-34Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,8 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 4,93Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации R285L (AAV5-35Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,1 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 5,76Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации Q340A (AAV5-36Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,4 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 3,84Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S420F (AAV5-37Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,5 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 9,59Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S680A (AAV5-38Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,2 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 6,03Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации T721V (AAV5-39Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,1 раза с 2,74Е+09 вг/мл до 1,40Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
Пример 12. Эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 9 серотипа (rAAV9)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 9 серотипа, клетки- продуценты НЕК293 трансфецировали с использованием полиэтиленимина (PEI, linear, MW 25000, Polyscinces, Inc.) одновременно 3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ Ш NO: 241, 247, 253, 259, 265, 271, 277, 283, 289, 295, 301, 307, 313, 319, 325, 331, 337, 343, 349, 355, 361 или 367 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотными последовательностями SEQ Ш No: 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368 и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ Ш No: 244, 250, 256, 262, 268, 274, 280, 286, 292, 298, 304, 310, 316, 322, 328, 334, 340, 346, 352, 358, 364 или 370; a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ Ш No: 246, 252, 258, 264, 270, 276, 282, 288, 294, 300, 306, 312, 318, 324, 330, 336, 342, 348, 354, 360, 366 или 372;
3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки- продуценты подвергали лизису (TAKARA BIO INC, Japanese) с высвобождением частиц rAAV, полученные вектора обрабатывали ДНКазой I (Invitrogen, USA) в течение 2 часов при 37 ° С, затем еще 2 часа протеиназой К (Invitrogen, USA) при 56 ° С. Титр полученных частиц rAAV проверяли с помощью количественной ПЦР (TaqMan, Applied Biosystems, USA) с использованием сета олигонуклеотидов состоящего из прямого праймера 5’- ACCACATGAAGCAGCACGAC -3’, обратного праймера 5’ - TCAGCTCGATGCGGTTCAC -3’, и зонда 5’- HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3’ специфичного к последовательности GFP.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы которые выбраны из группы S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 А в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа, приводило к существенному увеличению эффективности упаковки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, при помощи метода количественной ПНР удалось выявить изменение количества копий упакованного гетерологичного генома частицы rAAV, кодирующего целевой ген GFP (Фигура 8).
При наличии мутации S232T (AAV9-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,9 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1Д9Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации D297E (AAV9-02Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,2 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 2,03Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP). При наличии мутации Q351K (AAV9-03Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,5 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 9,30Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Q351R (AAV9-04Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,5 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,60Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации C396V (AAV9-05Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,9 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,17Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации D433Y (AAV9-06Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,9 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,85Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации L444R (AAV9-07Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,9 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,23Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Y478F (AAV9-08Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,0 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 3,14Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации G604N (AAV9-09Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,5 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,61Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации G627K (AAV9-10Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,8 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,14Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации T625L (AAV9-1 IMut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,6 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 2,91Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации T625V (AAV9-12Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 5,7 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 3,62Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации S692T (AAV9-13Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,1 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,32Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP). При наличии мутации T733V (AAV9-14Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,0 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,89Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации A427R (AAV9-15Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,6 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 9,86Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации M635D (AAV9-16Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,9 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,21Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации W695R (AAV9-17Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,5 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 9,41Е+09 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации R296L (AAV9-18Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 3,0 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,93Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Q351A (AAV9-19Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 2,0 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 1,29Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Y395F (AAV9-20Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,6 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 2,91Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации R434L (AAV9-21Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,0 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 2,50Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации N691A (AAV9-22Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,5 раза с 6,32Е+09 вг/мл до 2,85Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
Пример 13. Увеличение эффективности трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5, содержащими точечные мутации в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и Т711S.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии SK-Hepl. Посев проводили в ростовую среду: ЕМЕМ с глутамином, 10% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 1250 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ эффективности трансдукции проводили по интенсивности сигнала репортерного белка GFP с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte и программного обеспечения GuavaSoft.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, Р466Т, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и T711S, приводило к статистически значимому увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, при помощи метода проточной цитометрии удалось выявить изменение количества GFP позитивных клеток спустя 48 часов после трансдукции линии SK-Hepl препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа или белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, Р466Т, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и Т711S (Фигура 9, Фигура 10).
При одновременном наличии мутаций S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,16 раза с 20,11% до 43,44% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, G226A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,02 раза с 20,11% до 40,69% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, D286E и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,90 раза с 20,11% до 38,17% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, L341Y и T711S (AAV5-04Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,75 раза с 20,11% до 35,27% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP). При одновременном наличии мутаций S2A, C387V и T711S (AAV5-05Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,10 раза с 20,11% до 42,22% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, Q421H и T711S (AAV5-06Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,64 раза с 20,11% до 32,97% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, Р466Т и T711S (AAV5-07Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,41 раза с 20,11% до 28,35% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S594Q и T711S (AAV5-08Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,08 раза с 20,11% до 41,82% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, T614L и T711S (AAV5-09Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,36 раза с 20,11% до 47,50% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, N679K и T711S (AAV5-10Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,67 раза с 20,11% до 33,55% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, P723V и T711S (AAV5-1 IMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,87 раза с 20,11% до 37,60% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, V431Y и T711S (AAV5-12Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,27 раза с 20,11% до 25,54% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, A616D и T711S (AAV5-13Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,12 раза с 20,11% до 42,63% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, W683R и T711S (AAV5-14Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,26 раза с 20,11% до 25,33% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S222A и T711S (AAV5-15Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,57 раза с 20,11% до 31,57% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, R285L и T711S (AAV5-16Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,38 раза с 20,11% до 27,75% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, Q340A и T711S (AAV5-17Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,45 раза с 20,11% до 29,15% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S420F и T711S (AAV5-18Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,57 раза с 20,11% до 31,57% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S680A и T711S (AAV5-19Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,68 раза с 20,11% до 33,78% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, T721V и T711S (AAV5-20Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,01 раза с 20,11% до 40,41% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
При наличии единичной мутации G226A (AAV5-21Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,29 раза с 20,11% до 34,10% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При наличии единичной мутации D286E (AAV5-22Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,27 раза с 20,11% до 33,57% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации L341Y (AAV5-23Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,41 раза с 20,11% до 37,08% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации C387V (AAV5-24Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,85 раза с 20,11% до 48,62% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации Q421H (AAV5-25Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,52 раза с 20,11% до 40,05% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации Р466Т (AAV5-26Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,33 раза с 20,11% до 34,94% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S594Q (AAV5-27Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,60 раза с 20,11% до 42,26% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации T614L (AAV5-28Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,26 раза с 20,11% до 33,16% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации N679K (AAV5-29Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,24 раза с 20,11% до 32,78% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации P723V (AAV5-30Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,58 раза с 20,11% до 41,67% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации V431Y (AAV5-31Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,27 раза с 20,11% до 33,46% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации A616D (AAV5-32Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,46 раза с 20,11% до 38,47% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При наличии единичной мутации W683R (AAV5-33Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,52 раза с 20,11% до 40,05% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S222A (AAV5-34Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,34 раза с 20,11% до 35,31% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации R285L (AAV5-35Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,55 раза с 20,11% до 40,84% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации Q340A (AAV5-36Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,44 раза с 20,11% до 37,94% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S420F (AAV5-37Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,63 раза с 20,11% до 42,95% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации S680A (AAV5-38Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,71 раза с 20,11% до 45,06% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При наличии единичной мутации T721V (AAV5-39Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,06 раза с 20,11% до 54,40% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
Пример 14. Увеличение эффективности трансдукции клеток препаратами на основе rAAV9, содержащими точечные мутации в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-лу ночных планшетов были посеяны клетки линии HeLa. Посев проводили в ростовую среду: ЕМЕМ с глутамином, 10% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 100000 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ эффективности трансдукции проводили по интенсивности сигнала репортерного белка GFP с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte и программного обеспечения GuavaSoft.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 А в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа, приводило к существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, при помощи метода проточной цитометрии удалось выявить изменение количества GFP позитивных клеток спустя 48 часов после трансдукции линии HeLa препаратами на основе rAAV с белком VP 1 капсида AAV9 дикого типа или белком VP1 капсида AAV9 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 А в белке VP1 капсида rAAV9 дикого (Фигура И).
При наличии мутации S232T (AAV9-01Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,21 раза с 27,53% до 33,31% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации D297E (AAV9-02Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,25 раза с 27,53% до 34,41% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Q351K (AAV9-03Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,30 раза с 27,53% до 35,87% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Q351R (AAV9-04Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,16 раза с 27,53% до 31,93% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации C396V (AAV9-05Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,37 раза с 27,53% до 37,74% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации D433Y (AAV9-06Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,10 раза с 27,53% до 30,28% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации L444R (AAV9-07Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,40 раза с 27,53% до 38,45% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Y478F (AAV9-08Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,56 раза с 27,53% до 42,95% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP). При наличии мутации G604N (AAV9-09Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,25 раза с 27,53% до 34,32% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации G627K (AAV9-10Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,24 раза с 27,53% до 34,14% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации T625L (AAV9-1 IMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,45 раза с 27,53% до 39,92% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации T625V (AAV9-12Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,49 раза с 27,53% до 41,02% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации S692T (AAV9-13Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,38 раза с 27,53% до 37,99% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации T733V (AAV9-14Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,44 раза с 27,53% до 39,73% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации A427R (AAV9-15Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,23 раза с 27,53% до 33,86% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации M635D (AAV9-16Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,22 раза с 27,53% до 33,59% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации W695R (AAV9-17Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,47 раза с 27,53% до 40,47% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации R296L (AAV9-18Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,26 раза с 27,53% до 34,69% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации Q351A (AAV9-19Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,35 раза с 27,53% до 37,17% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP). При наличии мутации Y395F (AAV9-20Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,48 раза с 27,53% до 40,74% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации R434L (AAV9-21Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,67 раза с 27,53% до 45,91% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
При наличии мутации N691 A (AAV9-22Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,72 раза с 27,53% до 47,47% по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut-GFP).
Пример 15. Увеличение продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5, содержащими единичные мутации в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и Т711S.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии SK-Hepl. Посев проводили в ростовую среду: ЕМЕМ с глутамином, 10% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 10000 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ количества белка FIX в культуральной жидкости 7 дней спустя после трансдукции оценивался при помощи набора ПФ A Human Factor IX ELISA Kit. Использованное разведение образцов - 1 :50. Процедура была проведена согласно инструкции производителя.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы: G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, Р466Т, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и T711S, приводило к существенному увеличению продукции белка FIX после трансдукции клеток линии SK-Hepl векторами на основе rAAV5 с указанными выше мутациями. К примеру, метод иммуноферментного анализа (ИФА) позволил выявить повышение количества белка FIX в среде культивирования спустя 7 дней после трансдукции клеток линии SK-Hep 1 препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа или белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: G226A, D286E, L341Y, C387V, Q421H, P466T, S594Q, T614L, N679K, P723V, V431Y, A616D, W683R, S222A, R285L, Q340A, S420F, S680A, T721V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, который уже содержит мутации S2A и Т711S (Фигура 12, Фигура 13).
При одновременном наличии мутаций S2A, T711S (AAV5-01Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,76 раза с 628,67 нг/мл до 1736,67 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, G226A и T711S (AAV5-02Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,85 раза с 628,67 нг/мл до 1161,83 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, D286E и T711S (AAV5-03Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,71 раза с 628,67 нг/мл до 1075,02 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, L341Y и T711S (AAV5-04Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,65 раза с 628,67 нг/мл до 1037,30 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, C387V и T711S (AAV5-05Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,28 раза с 628,67 нг/мл до 1433,36 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, Q421H и T711S (AAV5-06Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,67 раза с 628,67 нг/мл до 1049,87 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, Р466Т и T711S (AAV5-07Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,21 раза с 628,67 нг/мл до 763,33 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, S594Q и T711S (AAV5-08Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,26 раза с 628,67 нг/мл до 792,12 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX). При одновременном наличии мутаций S2A, T614L и T711S (AAV5-09Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,17 раза с 628,67 нг/мл до 1362,67 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, N679K и T711S (AAV5-10Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,98 раза с 628,67 нг/мл до 1244,76 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, P723V и T711S (AAV5-1 IMut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,69 раза с 628,67 нг/мл до 1062,45 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, V431Y и T711S (AAV5-12Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,12 раза с 628,67 нг/мл до 704,11 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, A616D и T711S (AAV5-13Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,15 раза с 628,67 нг/мл до 1351,63 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, W683R и T711S (AAV5-14Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,08 раза с 628,67 нг/мл до 678,96 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, S222A и T711S (AAV5-15Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,30 раза с 628,67 нг/мл до 817,27 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, R285L и T711S (AAV5-16Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,16 раза с 628,67 нг/мл до 729,25 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, Q340A и T711S (AAV5-17Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,36 раза с 628,67 нг/мл до 854,99 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, S420F и T711S (AAV5-18Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,19 раза с 628,67 нг/мл до 745,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, S680A и T711S (AAV5-19Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,52 раза с 628,67 нг/мл до 955,57 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При одновременном наличии мутаций S2A, T721V и T711S (AAV5-20Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,79 раза с 628,67 нг/мл до 1125,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5- NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации G226A (AAV5-21Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,56 раза с 653,19 нг/мл до 1020,59 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации D286E (AAV5-22Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,63 раза с 653,19 нг/мл до 1063,78 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации L341Y (AAV5-23Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,95 раза с 653,19 нг/мл до 1271,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации C387V (AAV5-24Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,81 раза с 653,19 нг/мл до 1184,04 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации Q421H (AAV5-25Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,92 раза с 653,19 нг/мл до 1254,12 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации Р466Т (AAV5-26Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,73 раза с 653,19 нг/мл до 1130,02 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации S594Q (AAV5-27Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,88 раза с 653,19 нг/мл до 1228,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (A AV5 -NullMut- FIX). При наличии единичной мутации T614L (AAV5-28Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,40 раза с 653,19 нг/мл до 915,81 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации N679K (AAV5-29Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,21 раза с 653,19 нг/мл до 790,36 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации P723V (AAV5-30Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,35 раза с 653,19 нг/мл до 881,81 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации V431Y (AAV5-31Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,34 раза с 653,19 нг/мл до 875,27 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации A616D (AAV5-32Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,11 раза с 653,19 нг/мл до 727,75 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации W683R (AAV5-33Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,57 раза с 653,19 нг/мл до 1025,51 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации S222A (AAV5-34Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,78 раза с 653,19 нг/мл до 1162,68 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации R285L (AAV5-35Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,47 раза с 653,19 нг/мл до 960,19 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации Q340A (AAV5-36Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,64 раза с 653,19 нг/мл до 1071,23 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации S420F (AAV5-37Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,24 раза с 653,19 нг/мл до 809,96 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
При наличии единичной мутации S680A (AAV5-38Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,37 раза с 653,19 нг/мл до 894,87 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX). При наличии единичной мутации T721V (AAV5-39Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,96 раза с 653,19 нг/мл до 1280,25 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- FIX).
Пример 16. Увеличение продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV9, содержащими мутации в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-лу ночных планшетов были посеяны клетки линии CHO-K1-S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМ/Р12 с глутамином, содержание глюкозы 4,5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10 000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 200000 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ количества белка FIX в культуральной жидкости 7 дней спустя после трансдукции оценивался при помощи набора ПФ A Human Factor IX ELISA Kit. Использованное разведение образцов - 1:25. Процедура была проведена согласно инструкции производителя.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы: группы S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 А в белке VP1 капсида rAAV9 дикого типа, приводило к существенному увеличению продукции белка FIX после трансдукции клеток линии CHO-K1-S векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, метод иммуноферментного анализа (ИФА) позволил выявить повышение количества белка FIX в среде культивирования спустя 7 дней после трансдукции клеток линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV9 дикого типа несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: S232T, D297E, Q351K, Q351R, C396V, D433Y, L444R, Y478F, G604N, G627K, T625L, T625V, S692T, T733V, A427R, M635D, W695R, R296L, Q351A, Y395F, R434L, N691 А (Фигура 14).
При наличии мутации S232T (AAV9-01Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,18 раза с 947,5 нг/мл до 1118,05 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации D297E (AAV9-02Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,20 раза с 947,5 нг/мл до 1137,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX). При наличии мутации Q35 IK (AAV9-03Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,26 раза с 947,5 нг/мл до 1195,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации Q351R (AAV9-04Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,22 раза с 947,5 нг/мл до 1157,17 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации C396V (AAV9-05Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,64 раза с 947,5 нг/мл до 1554,17 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации D433 Y (AAV9-06Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,17 раза с 947,5 нг/мл до 1110,50 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации L444R (AAV9-07Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,20 раза с 947,5 нг/мл до 1141,50 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации Y478F (AAV9-08Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,01 раза с 947,5 нг/мл до 1908,50 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации G604N (AAV9-09Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,26 раза с 947,5 нг/мл до 1197,67 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации G627K (AAV9-10Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,23 раза с 947,5 нг/мл до 1166,67 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации T625L (AAV9-1 IMut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,77 раза с 947,5 нг/мл до 1677,50 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации T625V (AAV9-12Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,83 раза с 947,5 нг/мл до 1736,67 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации S692T (AAV9-13Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,55 раза с 947,5 нг/мл до 1464,83 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX). При наличии мутации Т733 V (AAV9-14Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,55 раза с 947,5 нг/мл до 1469,50 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации A427R (AAV9-15Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,65 раза с 947,5 нг/мл до 1563,38 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации M635D (AAV9-16Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,70 раза с 947,5 нг/мл до 1607,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации W695R (AAV9-17Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,32 раза с 947,5 нг/мл до 2201,67 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации R296L (AAV9-18Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,23 раза с 947,5 нг/мл до 1161,83 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации Q351 A (AAV9-19Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,48 раза с 947,5 нг/мл до 1402,30 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации Y395F (AAV9-20Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,21 раза с 947,5 нг/мл до 1145,00 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации R434L (AAV9-21Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 1,54 раза с 947,5 нг/мл до 1456,83 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).
При наличии мутации N691 A (AAV9-22Mut- FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 2,33 раза с 947,5 нг/мл до 2203,33 нг/мл по сравнению с контрольным AAV9 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV9-NullMut- FIX).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения модифицированного капсида AAV, который включает: а) определение аминокислот белка-капсомера модифицируемого AAV, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; б) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV с капсидом- шаблоном для определения попарного соответствия между каждой аминокислотой модифицируемого AAV из области интерфейса взаимодействия между соседними пентамерными субъединицами и ближайшей к ней аминокислотой капсида-шаблона, как структурного аналога исходной аминокислоты, которая рассматривается в качестве потенциальной замены, где под капсидом-шаблоном понимают схожий по строению капсид вируса, выбранного из семейства парвовирусов (Parvoviridae), который не является AAV; в) попарное сравнение определенных на стадии б) остатков аминокислот капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона для выявления структурных различий капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; г) выбор позиций для мутагенеза, при этом аминокислотные остатки для мутагенеза находятся в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV и имеют структурное различие между капсидом модифицируемого AAV и капсидом-шаблоном в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; д) выбор аминокислотного остатка для мутагенеза в позиции, выбранной на стадии г), с использованием одного из следующих принципов:
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет больший объем, за исключением цистеина и метионина;
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет увеличенное или уменьшенное число полярных контактов между капсомерами, за исключением цистеина и метионина; е) введение одной или нескольких аминокислотных замен, выбранных на стадиях г)- д), в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV.
2. Способ получения модифицированного капсида AAV по п.1, который дополнительно включает проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV с одной или несколькими аминокислотными заменами на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
3. Способ получения модифицированного капсида AAV по п.1, который дополнительно включает проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV с одной или несколькими аминокислотными заменами на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций и отбор модифицированных капсидов AAV, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
-увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
4. Способ получения капсида AAV по и.1, где капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей: AAV человека, AAV обезьян или AAV птиц.
5. Способ получения капсида AAV по и.1, где капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 или AAV16.
6. Способ получения капсида AAV по и.1, где схожий по строению капсид-шаблон, выбирают из группы, которая включает: парвовирус В 19, человеческий бокавирус 1 (HBoVl), парвовирус крупного рогатого скота (BVP).
7. Модифицированный капсид AAV для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, который получен способом, включающим: а) определение аминокислот белка-капсомера модифицируемого AAV, расположенных в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; б) структурное выравнивание модифицируемого капсида AAV с капсидом- шаблоном для определения попарного соответствия между каждой аминокислотой модифицируемого AAV из области интерфейса взаимодейстия между соседними пентамерными субъединицами и ближайшей к ней аминокислотой капсида-шаблона, как структурного аналога исходной аминокислоты, которая рассматривается в качестве потенциальной замены, где под капсидом-шаблоном понимают схожий по строению капсид вируса, выбранного из семейства парвовирусов (Parvoviridae), который не является AAV; в) попарное сравнение определенных на стадии б) остатков аминокислот капсида AAV и капсида-шаблона для выявления структурных различий капсида модифицируемого AAV и капсида-шаблона в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; г) выбор позиций для мутагенеза, при этом аминокислотные остатки для мутагенеза находятся в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV и имеют структурное различие между капсидом модифицируемого AAV и капсидом-шаблоном в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида; д) выбор аминокислотного остатка для мутагенеза в позиции, выбранной на стадии г), с использованием одного из следующих принципов:
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет больший объем, за исключением цистеина и метионина;
-замена исходной аминокислоты в белке-капсомере модифицируемого AAV на аминокислоту, которая имеет увеличенное или уменьшенное число полярных контактов между капсомерами, за исключением цистеина и метионина; е) введение одной или нескольких аминокислотных замен, выбранных на стадиях г)- д), в области интерфейса взаимодействия соседних пентамерных субъединиц капсида модифицируемого AAV; а также, при необходимости, дополнительно включает ж) проверку полученных на стадии е) модифицированных капсидов AAV на наличие одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций и отбор модифицированных капсидов AAV, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с капсидом AAV без данных модификаций, где одно или несколько улучшенных свойств выбирают из группы:
-увеличение эффективности трансдукции клеток,
-увеличение продукции целевого белка,
146 -увеличение эффективности наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
8. Модифицированный капсид AAV по п.7, где капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей: AAV человека, AAV обезьян или AAV птиц.
9. Модифицированный капсид AAV по п.7, где капсид модифицируемого AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 или AAV16.
10. Модифицированный капсид AAV для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, который включает модифицированный белок VP1 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368.
11. Модифицированный капсид AAV по и. 10, который включает: а) модифицированный белок VP1 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260, 266, 272, 278, 284, 290, 296, 302, 308, 314, 320, 326, 332, 338, 344, 350, 356, 362 или 368; б) соответствующий своему белку VP1 модифицированный белок VP2 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262, 268, 274, 280, 286, 292, 298, 304, 310, 316, 322, 328, 334, 340, 346, 352, 358, 364 или 370; в) соответствующий своему белку VP1 модифицированный белок VP3 капсида AAV, который имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы: SEQ Ш No: 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, 264, 270, 276, 282, 288, 294, 300, 306, 312, 318, 324, 330, 336, 342, 348, 354, 360, 366 или 372.
12. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный капсид по пи. 7-11.
13. Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) модифицированный капсид AAV по любому из пи. 7-11, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
14. Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса по п. 13, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
PCT/RU2022/050255 2021-08-20 2022-08-18 Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса WO2023022631A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL310949A IL310949A (en) 2021-08-20 2022-08-18 A method for preparing an adapted adeno-associated virus envelope
AU2022328531A AU2022328531A1 (en) 2021-08-20 2022-08-18 Method of obtaining a modified adeno-associated virus capsid
CA3229580A CA3229580A1 (en) 2021-08-20 2022-08-18 Method for producing modified adeno-associated virus capsid

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021124731 2021-08-20
RU2021124731 2021-08-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023022631A1 true WO2023022631A1 (ru) 2023-02-23

Family

ID=85240917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/050255 WO2023022631A1 (ru) 2021-08-20 2022-08-18 Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса

Country Status (6)

Country Link
AR (1) AR126841A1 (ru)
AU (1) AU2022328531A1 (ru)
CA (1) CA3229580A1 (ru)
IL (1) IL310949A (ru)
TW (1) TW202317770A (ru)
WO (1) WO2023022631A1 (ru)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173177A1 (de) 1984-08-24 1986-03-05 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Enhancer für eukaryotische Expressionssysteme
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013158879A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
WO2019222411A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Spark Therapeutics, Inc. Codon-optimized acid αlpha-glucosidase expression cassettes and methods of using same
RU2019107207A (ru) * 2016-08-15 2020-09-15 Джензим Корпорейшн Cпособы выявления aav
RU2738265C2 (ru) * 2016-01-26 2020-12-11 Дефенсин Терапьютикс Апс Способы модуляции кишечной микробиоты

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173177A1 (de) 1984-08-24 1986-03-05 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Enhancer für eukaryotische Expressionssysteme
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013158879A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
RU2738265C2 (ru) * 2016-01-26 2020-12-11 Дефенсин Терапьютикс Апс Способы модуляции кишечной микробиоты
RU2019107207A (ru) * 2016-08-15 2020-09-15 Джензим Корпорейшн Cпособы выявления aav
WO2019222411A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Spark Therapeutics, Inc. Codon-optimized acid αlpha-glucosidase expression cassettes and methods of using same

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Properties of amino acids and proteins", XP093038079, Retrieved from the Internet <URL:http://molbiol.ru/appendix/02_01.html> [retrieved on 20230406] *
DAN WANG, PHILLIP W. L. TAI, GUANGPING GAO: "Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery", NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, 1 February 2019 (2019-02-01), pages 358 - 378, XP055735836, [retrieved on 20201001], DOI: 10.1038/s41573-019-0012-9 *
DATABASE Protein ANONYMOUS : "Sequence 20 from patent US 10842885 ", XP093038076, retrieved from NCBI *
DATABASE Protein ANONYMOUS : "Sequence 4 from patent US 6855314 ", XP093038075, retrieved from NCBI *
DATABASE Protein ANONYMOUS : "Sequence 5 from patent US 7588772 ", XP093038070, retrieved from NCBI *
GOVINDASAMY L.: "Structural insights into adeno-associated virus serotype 5", J VIROL., vol. 87, no. 20, October 2013 (2013-10-01), pages 11187 - 99, XP055865805, DOI: 10.1128/JVI.00867-13
HIGH KA ET AL.: "rAAV human trial experience", METHODS MOL BIOL., vol. 807, 2011, pages 429 - 57
KENNETH I. BERNS: "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", FIELDS VIROLOGY, 1996
L. M. DROUINM. AGBANDJE-MCKENNA: "Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development", FUTURE VIROL., vol. 8, no. 12, 2013, pages 1183 - 1199, XP055272409, DOI: 10.2217/fvl.13.112
MICHAEL SCHMIDT ET AL.: "Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity", J VIROL., vol. 82, no. 3, February 2008 (2008-02-01), pages 1399 - 406
MORI, S. ET AL.: "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein", VIROLOGY, T., vol. 330, no. 2, 2004, pages 375 - 83, XP004676906, DOI: 10.1016/j.virol.2004.10.012
N. J. DARBYS. S. N. J. DARBYT. E. CREIGHTON: "Protein Structure", 1993, IRL PRESS
OGDEN PJKELSIC EDSINAI SCHURCH GM.: "Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design", SCIENCE, vol. 366, no. 6469, 2019, pages 1139 - 1143, XP093141725, DOI: 10.1126/science.aaw2900
SAMBROOK ET AL.: "Molecular cloning: A laboratory manual", 2012, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, COLD SPRING HARBOR
SONNTAG FKOTHER KSCHMIDT K ET AL.: "The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes", J VIROL., vol. 85, no. 23, 2011, pages 12686 - 12697, XP055187887, DOI: 10.1128/JVI.05359-11
XIE Q. ET AL.: "The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 99, 2002, pages 10405 - 10410, XP002255705, DOI: 10.1073/pnas.162250899

Also Published As

Publication number Publication date
IL310949A (en) 2024-04-01
AR126841A1 (es) 2023-11-22
AU2022328531A1 (en) 2024-03-14
TW202317770A (zh) 2023-05-01
CA3229580A1 (en) 2023-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6619454B2 (ja) キャプシド
Grimm Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes
WO2011088081A1 (en) Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
CN106884014B (zh) 腺相关病毒反向末端重复序列突变体及其应用
US20230159953A1 (en) Closed-ended, linear, duplex adenoassociated virus dna, and uses thereof
JP2023138527A (ja) スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
JP2022545121A (ja) Ａａｖ５の単離修飾ｖｐ１カプシドタンパク質
WO2021246909A1 (ru) Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1
WO2001049829A1 (en) Compositions and methods for efficient aav vector production
WO2023022631A1 (ru) Способ получения модифицированного капсида аденоассоциированного вируса
Schön et al. Design and development of aav-based gene supplementation therapies for achromatopsia and retinitis pigmentosa
CN118139974A (zh) 获得修饰的腺相关病毒衣壳的方法
WO2023022633A1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5
WO2023022634A1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav9
OA21075A (en) Codon-optimized nucleic acid that encodes SMN1 protein, and use thereof
EA045749B1 (ru) Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1, и ее применение
EA045824B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5
Grimm Cellular Characteristics (Viral Life Cycles)
Frederick 516. Analysis of AAV Serotype 8 Vector Integration in Normal and DNA-PKcs-Deficient Scid Mice by a Novel Strategy

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22858841

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 310949

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3229580

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112024003302

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 808664

Country of ref document: NZ

Ref document number: 2022328531

Country of ref document: AU

Ref document number: AU2022328531

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022328531

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220818

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202490530

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022858841

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022858841

Country of ref document: EP

Effective date: 20240320

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112024003302

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20240220