CN112334489A - 密码子优化的酸性α-葡萄糖苷酶表达盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了编码酸性α‑葡萄糖苷酶(GAA)的核酸。在一些实施方案中,核酸与选自由如SEQ ID NO:1‑5所示的任何序列组成的组的序列具有大于约86%的序列同一性。在一些实施方案中,编码酸性α‑葡萄糖苷酶(GAA)的核酸包含少于127个CpG二核苷酸。还提供了使用这种编码酸性α‑葡萄糖苷酶(GAA)的核酸的表达盒、载体、细胞和细胞系以及方法。
Description
相关申请
本申请要求于2018年5月16日提交的美国临时专利申请No.62/672,419和于2018年9月21日提交的美国临时专利申请No.62/734,454的优先权。前述专利申请的包括所有文本、表格、序列表和附图的全部内容通过引用方式并入本文。
背景技术
II型糖原贮积病,也称为庞贝氏病,是一种常染色体隐性遗传疾病,其由编码溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因突变引起,该酶催化糖原降解。所产生的酶缺乏导致人体所有组织中糖原的病理性积累和溶酶体改变,从而导致心脏、呼吸和骨骼肌功能障碍(van der Ploeg&Reuser,2008 Lancet,372:1342-1353)。传统上,庞贝氏病已分为两种主要的表型-婴儿发作性庞贝氏病(IOPD)(也称为婴儿型庞贝氏病(IPD)或早发型庞贝氏病)和晚发型庞贝氏病(LOPD)–基于残留的GAA酶活性,发病年龄,器官受累(即存在心肌病),严重程度和进展速度。庞贝氏病可使用酶替代疗法(ERT);然而,它有一些局限性(即有限的生物分布和高免疫原性),导致治疗失败和长期疗效有限(van der Ploeg&Reuser,2008)。
发明内容
本文公开了用于肝脏定向表达人GAA的可分泌形式的优化的盒。对盒的这些优化导致肝脏中GAA分泌的增加,并使肝脏基因转移达到GAA的循环水平,足以在受试者中系统交叉纠正GAA缺乏症。这些盒可提高转基因表达,改善安全性并可能降低免疫原性。这些盒将用作庞贝氏病和其他可通过GAA治疗的疾病和障碍的受试者的基因疗法。
进行GAA表达盒的密码子优化以改善GAA的表达。在一实施方案中,修饰编码GAA的核酸序列以消除CpG二核苷酸。总共创建了20个新的密码子优化的转基因序列(GAA1-GAA20)。基于GAA活性的体外比较,选择了5个密码子优化的序列(GAA 2、5、7、8和13)用于进一步优化。在将29个碱基对的多核苷酸序列添加到5'非翻译区(UTR)后,GAA13序列用于分析GAA表达的差异。还针对GAA7、8和13对来源于牛生长激素(bGH或BGH)的两种不同的聚腺苷酸化序列(野生型和CpG减少型)进行了评估。将所得到的9个表达盒(表1)包装在SEQ IDNO:30-32衣壳中;一个也被包装到AAV6衣壳中。
根据本发明,提供了编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸,包含编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸的表达盒,和包含编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸的病毒载体。
在一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-5所示的任何序列具有大于86%的序列同一性。在另外的方面,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-5所示的任何序列具有大于87%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:6-15所示的任何序列具有大于87%的序列同一性。在特定方面,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:6-15所示的任何序列具有大于88%的序列同一性。在另外的特定方面,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:6-15所示的任何序列具有大于89%的序列同一性。在另外的特定方面,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:6-15所示的任何序列具有大于90%的序列同一性。在另外的特定方面,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:6-15所示的任何序列具有大于91%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:16-24所示的任何序列具有大于91%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于92%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于93%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于94%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于95%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于96%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于97%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于98%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于99%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有大于99.5%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-24所示的任何序列具有100%的序列同一性。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含少于127个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含少于126个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约126-120个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约120-110个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约110-100个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约100-90个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约90-80个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约80-70个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约70-60个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约60-50个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约50-40个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约40-30个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约30-20个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含少于20个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约20-10个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含少于10个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含约10-5个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含5个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含4个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含3个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含2个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含1个CpG二核苷酸。
在另一实施方案中,编码GAA的核酸包含0个CpG二核苷酸。
本发明还提供了表达盒,其包含可操作地连接至表达控制元件的如本文所述的编码GAA的核酸。
在一实施方案中,表达盒包含编码GAA的核酸,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:1-5所示的任何序列具有大于86%的序列同一性(例如87%-100%的同一性)。
在另一实施方案中,表达盒包含编码GAA的核酸,编码GAA的核酸与如SEQ ID NO:6-15所示的任何序列具有大于87%的序列同一性(例如88%-100%的同一性)。
在另一实施方案中,表达盒包含编码GAA的核酸,编码GAA的核酸具有少于127个CpG二核苷酸、少于127个CpG二核苷酸、少于127个CpG二核苷酸、少于126个CpG二核苷酸、少于125个CpG二核苷酸、少于124个CpG二核苷酸、少于123个CpG二核苷酸、少于122个CpG二核苷酸、少于121个CpG二核苷酸、少于120个CpG二核苷酸、少于119个CpG二核苷酸、少于118个CpG二核苷酸、少于117个CpG二核苷酸、少于116个CpG二核苷酸、少于115个CpG二核苷酸、少于114个CpG二核苷酸、少于113个CpG二核苷酸、少于112个CpG二核苷酸、少于111个CpG二核苷酸、少于110个CpG二核苷酸、少于109个CpG二核苷酸、少于108个CpG二核苷酸、少于107个CpG二核苷酸、少于106个CpG二核苷酸、少于105个CpG二核苷酸、少于104个CpG二核苷酸、少于103个CpG二核苷酸、少于102个CpG二核苷酸、少于101个CpG二核苷酸、少于101个CpG二核苷酸,依此类推,一直下降到零(0)个CpG二核苷酸。
在一实施方案中,表达控制元件位于编码GAA的核酸的5'末端。
在另一实施方案中,表达盒包括位于编码GAA的核酸的3'末端的聚腺苷酸化(polyA)序列。
在另一实施方案中,与野生型表达控制元件或聚腺苷酸化序列相比,表达控制元件或聚腺苷酸化序列的CpG减少。
在另一实施方案中,表达控制元件包含ApoE/hAAT增强子/启动子序列。
在另一实施方案中,聚腺苷酸化序列包括牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
在另一实施方案中,与野生型ApoE/hAAT增强子/启动子序列或bGH聚腺苷酸化序列相比,ApoE/hAAT增强子/启动子序列或bGH聚腺苷酸化序列的CpG减少。
一方面,野生型bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:27的序列。
另一方面,野生型ApoE/hAAT增强子/启动子序列包含SEQ ID NO:28或29的序列。
另一方面,CpG减少的bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:26的序列。
在另一实施方案中,表达盒还包含位于在表达控制元件的3'末端与编码GAA的核酸的5'末端之间的内含子。
在另一实施方案中,GAA包含如SEQ ID NO:25所示的序列或由如SEQ ID NO:25所示的序列组成。
本发明进一步提供了病毒载体,例如腺病毒相关病毒(AAV)载体,其包含如本文所述的编码GAA的核酸。
在一实施方案中,病毒载体例如腺病毒相关病毒(AAV)载体包含可操作地连接至表达控制元件的如本文所述的编码GAA的任何核酸。
在另一实施方案中,病毒载体例如腺病毒相关病毒(AAV)载体包含任何表达盒,表达盒包含如本文所述的编码GAA的核酸。
在另一实施方案中,AAV载体包含:一个或多个AAV衣壳;和一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR),其中AAV ITR位于核酸或表达盒的5'或3'末端侧翼。
在另外的实施方案中,AAV载体还包含位于一个或多个ITR的5'或3'末端的内含子。
在另外的实施方案中,包含至少一个或多个ITR或内含子的AAV载体具有被修饰为具有减少的CpG的一个或多个ITR或内含子。
在另外的实施方案中,AAV载体具有衣壳血清型,其包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,Rh10,Rh74,AAV3B,AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32VP1、VP2和/或VP3序列具有90%或更高的序列同一性的修饰或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳,或者包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B,AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32VP1、VP2和/或VP3序列具有95%或更高的序列同一性的衣壳,或者包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,Rh10,Rh74,AAV3B,AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32VP1、VP2和/或VP3序列具有100%序列同一性的衣壳。
在另外的实施方案中,AAV载体包含一个或多个ITR,一个或多个ITR作为以下的任一个的一个或多个ITR:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV3B AAV血清型或其组合。
本发明另外提供了药物组合物,其包含编码GAA的核酸、包含编码GAA的核酸的表达盒或包含编码GAA的核酸的病毒载体(例如AAV载体)中的任何一个,或包含如本文所述的编码GAA的核酸的表达盒。
在一实施方案中,药物组合物包含在生物相容性载体或赋形剂中的多个如本文所述的AAV载体。
在另一实施方案中,包含如本文所述的任何AAV载体的药物组合物还包含空的AAV衣壳。
在特定实施方案中,在包含AAV载体和空AAV衣壳的药物组合物中,空AAV衣壳与AAV载体的比例在约100:1-50:1之内或之间,或为约50:1-25:1,大约25:1-10:1,大约10:1-1:1,大约1:1-1:10,大约1:10-1:25,大约1:25-1:50,或大约1:50-1:100。
在特定方面,在包含AAV载体和空AAV衣壳的药物组合物中,空AAV衣壳与AAV载体的比例为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在另一实施方案中,药物组合物包含表面活性剂。
本发明还进一步提供了治疗需要酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的人的方法,其通过向人施用或递送编码GAA的核酸、包含编码GAA的核酸的表达盒或包含编码GAA的核酸的病毒载体(如AAV载体)中的任一个或包含编码GAA的核酸的表达盒。
在一实施方案中,治疗需要酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的人的方法包括:(a)提供如本文所述的核酸、表达盒或病毒载体(例如AAV载体),或如本文所述的任何药物组合物;和
(b)施用一定量的核酸、表达盒、病毒(例如AAV)载体或药物组合物以使人恢复,其中GAA在人体内表达。
在一特定实施方案中,人患有庞贝氏病,例如婴儿发作性庞贝氏病或晚发型庞贝氏病。
在另一实施方案中,人患有糖原贮积病(GSD)。
在特定方面,GSD是以下中的任何一种:I型GSD(冯·吉尔克氏病(von Gierke'sdisease))、III型GSD(福布斯-科里病(Forbes-Cori disease))、IV型GSD(安德森病(Anderson disease),支链淀粉病)、V型GSD(麦卡德尔病(McArdle disease))、VI型GSD(赫尔氏病(Hers disease))、VII型GSD(塔瑞氏病(Tarui disease))和先天性心脏GSD(例如致命的先天性心脏GSD)。
在特定实施方案中,将编码GAA的核酸、包含编码GAA的核酸的表达盒或AAV载体通过静脉内,动脉内,内腔式,腔内,粘膜内或通过导管施用于人。
在特定实施方案中,在一种方法中,GAA以高于在不需要GAA的人中发现的GAA水平的水平表达,任选地所述GAA以比在不需要GAA的人中发现的GAA水平高1%的水平表达。
在特定实施方案中,以约1×108至约1×1014个载体基因组/千克该人体重(vg/kg)施用所述AAV载体。
在特定实施方式中,一种方法减少、降低或抑制需要GAA的人的或疾病的一种或多种症状;或预防或减少需要GAA的人的或疾病的一种或多种症状的进展或恶化;或稳定需要GAA的人的或疾病的一种或多种症状;或改善需要GAA的人的或疾病的一种或多种症状。
在特定方面,根据本发明的可治疗的症状可以是以下中的一种或多种:进食困难和/或体重不增加,头部控制不佳和/或颈部控制不佳,呼吸困难和/或肺部感染,心脏扩大和/或心脏增厚,心脏缺陷,舌头增大,吞咽困难,肝脏肿大,肌肉力量差,肌张力弱,腿无力和/或腰部无力和/或手臂无力,气促,运动困难,睡觉时呼吸困难,脊柱弯曲和/或关节僵硬。
本发明还另外提供了包含编码GAA的核酸的细胞,包含包含编码GAA的核酸的表达盒的细胞,和包含包含编码GAA的核酸的病毒载体(例如AAV载体)的细胞或包含包含编码GAA的核酸的表达盒的细胞。
在一实施方案中,细胞产生病毒载体。
在另一实施方案中,细胞产生如本文所述的AAV载体。
此外,本发明还提供了产生如本文所述的病毒载体(例如AAV载体)的方法。
在一实施方案中,产生AAV载体的方法包括:将如本文所述的包含编码GAA的核酸的AAV载体基因组或包含编码GAA的核酸的表达盒引入包装辅助细胞中;和在产生AAV载体的条件下培养辅助细胞。
在另一实施方案中,产生AAV载体的方法包括:将如本文所述的编码GAA的核酸或包含编码GAA的核酸的表达盒引入包装辅助细胞中;和在产生AAV载体的条件下培养辅助细胞。
在另外的实施方案中,细胞是哺乳动物细胞。
在另外的实施方案中,用于产生载体的细胞提供了将载体包装到病毒颗粒中的辅助功能,例如AAV辅助功能。在一特定方面,辅助功能是用于AAV载体包装的Rep和/或Cap蛋白。
在另外的实施方案中,可以用编码Rep和/或Cap蛋白序列的多核苷酸稳定或瞬时转染用于产生载体的细胞。
在另外的实施方案中,用于产生载体的细胞提供Rep78和/或Rep68蛋白。在此类细胞中,可用Rep78和/或Rep68蛋白多核苷酸编码序列稳定或瞬时转染细胞。
在特定实施方案中,用于产生载体的细胞是人胚胎肾细胞。在一特定的方面,用于产生载体的细胞是HEK-293细胞。
附图简要说明
图1显示了pAAV-ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH(SEQ IDNO:16)的示意图。
图2显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH(SEQ ID NO:17)的示意图。
图3显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH(SEQ ID NO:18)的示意图。
图4显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH(SEQ ID NO:19)的示意图。
图5显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA2.wtBGH(SEQ ID NO:20)的示意图。
图6显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH(SEQ ID NO:21)的示意图。
图7显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH(SEQ ID NO:22)的示意图。
图8显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH(SEQ ID NO:23)的示意图。
图9显示了pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH(SEQ ID NO:24)的示意图。
图10显示了通过GAA活性测定法评估Huh7细胞上清液中的GAA活性水平。
图11显示了通过GAA活性测定法评估小鼠血浆中的GAA活性水平。
图12显示了通过GAA蛋白质免疫印迹法评估小鼠血浆中的GAA水平。
图13显示了通过GAA活性测定法评估小鼠血浆中的GAA活性水平。
图14显示了通过GAA蛋白质免疫印迹法评估小鼠血浆中的GAA水平。
图15显示了通过GAA活性测定法评估小鼠血浆中的GAA活性水平。
图16显示了通过GAA活性测定法评估大鼠和小鼠血浆中的GAA活性水平。
图17显示了通过GAA活性测定法评估非人灵长类(恒河猕猴)血浆中的GAA活性水平。
图18显示了通过GAA活性测定法评估非人灵长类(非洲绿猴)血浆中的GAA活性水平。X轴是注射后的天数。
图19显示了通过蛋白质免疫印迹法评估非人类灵长类动物(非洲绿猴)血浆中的GAA水平,并以图形方式显示了某些数据。
图20显示了用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02或阴性对照(具有包装入AAV SEQ ID NO:30-32载体中的非GAA转基因的rAAV)转导的Huh7细胞上清液中GAA活性的评估。
图21显示在以2×1012、6×1012、2×1013vg/kg的剂量单次静脉内施用SPK-AAV-02后,对恒河猕猴的血浆中的GAA活性的评估。
具体实施方式
本发明提供了编码GAA的修饰核酸、包含编码GAA的修饰核酸的表达盒、包含编码GAA的修饰核酸的AAV载体基因组、以及包含编码GAA的修饰核酸的重组AAV载体和颗粒。本发明的编码GAA的修饰核酸、包含编码GAA的修饰核酸的表达盒、包含编码GAA的修饰核酸的AAV载体基因组、以及重组AAV载体和颗粒可用于治疗庞贝氏病以及其他糖原贮积病(GSD)。
如本文所用,术语“修饰”及其语法变化是指核酸或蛋白质与参考序列或亲本序列不同。与参考(例如,野生型)核酸或亲本核酸相比,编码GAA的修饰核酸已被改变。因此,修饰核酸可以具有与参考核酸或亲本核酸基本上相同、或比其更大或更小的活性或功能,但是至少保留参考核酸或亲本核酸的部分活性、功能和/或与参考核酸或亲本核酸的序列同一性。修饰核酸可以被遗传修饰以编码修饰的或变体的GAA。
“编码GAA的修饰核酸”是指与编码GAA的亲本未修饰核酸相比,GAA核酸具有改变。修饰的特定实例是核苷替代。本文中的术语“修饰”不必在涉及编码GAA的核酸的每种情况下出现。
在特定实施方案中,对于编码GAA的修饰核酸,GAA蛋白保留了野生型GAA蛋白的至少一部分功能或活性。GAA蛋白的功能或活性包括酸性α葡萄糖苷酶活性,一种降解糖原、麦芽糖和异麦芽糖的溶酶体水解酶。因此,编码GAA的修饰核酸包括修饰形式,只要编码的GAA保留了GAA的溶酶体水解酶活性的一定程度或一些方面。
如本文所述,与参考核酸或亲本核酸相比,编码GAA的修饰核酸可表现出不同的特征或特性。例如,修饰核酸包括如本文所述的与编码GAA的参考核酸具有100%同一性的序列,以及与编码GAA的参考核酸具有小于100%同一性的序列。
术语“同一性”、“同源性”及其语法变化形式是指当两个或多个所引用的实体是“比对”序列时它们是相同的。因此,举例来说,当两个核酸相同时,它们至少在参考区域或部分内具有相同的序列。同一性可以在序列的定义区域(区或结构域)内。
同一性的“区域”或“区”是指两个或更多个引用实体的相同的部分。因此,当两个蛋白质或核酸序列在一个或多个序列区域或区内是相同时,它们在该区内共享同一性。“比对”序列是指多种蛋白质(氨基酸)或核酸序列,与参考序列相比,通常包含缺失或额外碱基或氨基酸(空位(gap))的校正。
同一性可以在序列的整个长度或一部分上延伸。在某些实施方案中,共享同一性百分比的序列的长度是2、3、4、5或更多个连续的氨基酸或核酸,例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等连续的核酸或氨基酸。在其他实施方案中,共享同一性的序列的长度是21个或更多个连续的氨基酸或核酸,例如是21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个等连续的氨基酸或核酸。在进一步的实施方案中,共享同一性的序列的长度是41个或更多个连续氨基酸或核酸,例如是42、43、44、45、45、47、48、49、50个等连续氨基酸或核酸酸。在其他实施方案中,共享同一性的序列的长度是50个或更多个连续氨基酸或核酸,例如是50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-500、500-1000个等连续氨基酸或核酸。
如本文所述,编码GAA的修饰核酸可以与编码GAA的参考核酸不同或表现出与编码GAA的参考核酸具有100%的同一性或小于100%的同一性。
在特定实施方案中,本发明的编码GAA的核酸可以与如SEQ ID NO:1-5中所示的任何核酸具有大于86%的同一性。
在特定实施方案中,本发明的编码GAA的核酸可以与如SEQ ID NO:6-14中所示的任何核酸具有大于87%的同一性。
在特定实施方案中,本发明的编码GAA的核酸可以与如SEQ ID NO:16-24中所示的任何核酸具有大于91%的同一性。
这样的编码GAA的修饰核酸甚至可以表现出与如SEQ ID NO:1-24中所示的任何核酸具有更大的同一性,例如,大于87%的同一性,大于88%的同一性,大于89%的同一性,大于90%的同一性,大于91%的同一性,大于92%的同一性,大于93%的同一性,大于94%的同一性,大于95%的同一性,大于96%的同一性,大于97%的同一性,大于98%的同一性,大于99%的同一性或100%的同一性。
两个序列之间的同一性程度(同源性)或“同一性百分比”可以使用计算机程序和/或数学算法来确定。为了本发明的目的,使用可从威斯康星州麦迪逊市的GeneticsComputer Group获得的GCG Wisconsin Package 9.1版进行核酸序列的比较。为方便起见,该程序指定的缺省参数(空位创建罚分=12,空位延伸罚分=4)旨在用于比较序列同一性。或者,由National center for Biotechnology Information提供的使用利用缺省参数的空位比对的Blastn2.0程序(可在ncbi.nlm.nih.gov/blast/的万维网上找到;Altschul等人,1990,J Mol Biol 215:403-410)可用于确定核酸序列和氨基酸序列之间的同一性和相似性水平。对于多肽序列比较,通常将BLASTP算法与评分矩阵(例如PAM100,PAM 250,BLOSUM 62或BLOSUM 50)结合使用。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比较程序也用于量化同一性程度(Pearson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988);Pearson,Methods Mol Biol.132:185(2000);和Smith等人,J.Mol.Biol.147:195(1981))。还已经开发了使用基于Delaunay的拓扑图定量蛋白质结构相似性的程序(Bostick等人,Biochem Biophys Res Commun.304:320(2003))。
与参考核酸或亲本核酸相比表现出不同特征或特性的编码GAA的修饰核酸包括核苷酸的替代。例如,与编码GAA的参考核酸相比,编码GAA的修饰核酸包括具有减少数量的CpG二核苷酸的核酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于127个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于126个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于125个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于124个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于123个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于122个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于121个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于120个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于119个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于118个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于117个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于116个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于115个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于114个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于113个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于112个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于111个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于110个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于109个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于108个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于107个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于106个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于105个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于104个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于103个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于102个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于101个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于100个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于99个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于98个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于97个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于96个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于95个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于94个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于93个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于92个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于91个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于90个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于89个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于88个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于87个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于86个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于85个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于84个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于83个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于82个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于81个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于80个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于79个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于78个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于77个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于76个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于75个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于74个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于73个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于72个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于71个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于70个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于69个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于68个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于67个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于66个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于65个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于64个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于63个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于62个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于61个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于60个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于59个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于58个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于57个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于56个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于55个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于54个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于53个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于52个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于51个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于50个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于49个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于48个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于47个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于46个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于45个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于44个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于43个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于42个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于41个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于40个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于39个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于38个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于37个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于36个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于35个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于34个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于33个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于32个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于31个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于30个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于29个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于28个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于27个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于26个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于25个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于24个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于23个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于22个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于21个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于20个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于19个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于18个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于17个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于16个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于15个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于14个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于13个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于12个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于11个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于10个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于9个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于8个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于7个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于6个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于5个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于4个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于3个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于2个CpG二核苷酸。
在某些实施方案中,编码GAA的核酸包含少于1个CpG二核苷酸。
术语“载体”是指小载体核酸分子,质粒,病毒(例如,AAV载体)或可以通过插入或掺入核酸来操纵的其他载体。这样的载体可以用于遗传操纵(即“克隆载体”),以将多核苷酸引入/转移到细胞中,以及在细胞中转录或翻译插入的多核苷酸。“表达载体”是专门的载体,其包含具有在宿主细胞中表达所需的必需调控区的基因或核酸序列。
载体核酸序列通常至少包含用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的其他元件,例如异源多核苷酸序列,表达控制元件(例如,启动子,增强子),内含子,反向末端重复序列(ITR),选择标记(例如抗生素抗性),聚腺苷酸化信号。
病毒载体衍生自或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。特定的病毒载体包括慢病毒和腺相关病毒(AAV)载体。
术语“重组”,作为载体的修饰语(例如重组AAV(rAAV)载体)以及作为序列的修饰语(例如重组多核苷酸和重组多肽),是指该组合物已经被以自然界中通常不会出现的方式操纵(即,工程化)。重组AAV载体的一具体例子是将野生型AAV基因组中通常不存在的点击酸序列插入AAV基因组中。尽管术语“重组”在本文中并不总是指AAV载体以及诸如多核苷酸之类的序列,但是尽管有任何这样的省略,仍明确包括了包括多核苷酸的重组形式。
“重组AAV载体”或“rAAV”是通过使用分子方法从AAV基因组中去除野生型基因组,并替代成非天然核酸序列而衍生自AAV的野生型基因组,被称为异源核酸。通常,对于AAV,AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。rAAV与AAV基因组有所区别,因为相对于AAV基因组核酸,AAV基因组的全部或部分已被非天然序列替代。因此,非天然序列的掺入将AAV载体定义为“重组”载体,其可以称为“rAAV载体”。
rAAV序列可以被包装(在本文中称为“颗粒”),用于随后的间接体内(ex vivo)、体外或体内感染(转导)细胞。当重组AAV载体序列被衣壳化(encapsidated)或被包装到AAV颗粒中时,该颗粒也可以被称为“rAAV载体”或“rAAV颗粒”。此类rAAV颗粒包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白质,在AAV的情况下,它们被称为衣壳蛋白。
载体“基因组”是指重组质粒序列的最终被包装或衣壳化以形成病毒(例如,rAAV)颗粒的部分。在重组质粒用于构建或制备重组载体的情况下,载体基因组不包括“质粒”中与重组质粒的载体基因组序列不对应的部分。重组质粒的该非载体基因组部分可以称为“质粒骨架”,它对于克隆和扩增质粒(繁殖和重组病毒生产所必需的过程)很重要,但本身并没有被包装或衣壳化成病毒(例如AAV)颗粒。因此,载体“基因组”是指被病毒(例如,AAV)包装或衣壳化的核酸。
用于生产重组AAV颗粒的宿主细胞包括但不限于可以或已经用作异源rAAV载体的接受者(recipient)的微生物,酵母细胞,昆虫细胞和哺乳动物细胞。可以使用来自稳定的人细胞系HEK293(可通过例如美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC CRL1573购得)的细胞。在某些实施方案中,用5型腺病毒DNA片段转化并表达腺病毒E1a和E1b基因的修饰的人胚胎肾细胞系(例如HEK293)用于生产重组AAV颗粒。修饰的HEK293细胞系易于转染,并提供了在其中生产rAAV颗粒的特别方便的平台。在国际申请PCT/2017/024951中描述了适于重组AAV生产的其他宿主细胞系。
在某些实施方案中,通过在AAV表达载体的转染之前或同时,用AAV辅助构建体转染宿主细胞,将AAV辅助功能引入宿主细胞。具有AAV辅助功能的宿主细胞可以称为“辅助细胞”或“包装辅助细胞”。因此,有时将AAV辅助构建体用于提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达,以补充生产性AAV转导所必需的AAV功能缺失。AAV辅助构建体通常缺少AAV ITR,并且既不能复制也不能包装其本身。这些构建体可以是质粒,噬菌体,转座子,粘粒,病毒或病毒体(virion)的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体,例如编码Rep和Cap表达产物的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。已知许多其他许多编码Rep和/或Cap表达产物的载体。
产生能够转导哺乳动物细胞的重组AAV颗粒的方法是本领域已知的。例如,重组AAV颗粒可以如美国专利9,408,904、国际申请PCT/US2017/025396和PCT/US2016/064414中所描述的制备。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用,是指所有形式的核酸,寡核苷酸,包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA,cDNA和反义DNA,以及剪接或未剪接的mRNA,rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi,例如小或短发夹(sh)RNA,微小RNA(miRNA),小或短干扰(si)RNA,反式拼接RNA或反义RNA)。核酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如,变体核酸)。可以是单链或双链的核酸,例如cDNA,基因组DNA,RNA及其片段。
多核苷酸可以是单、双或三链,线性或环状,并且可以具有任何长度。在讨论多核苷酸时,本文中可以根据提供在5'至3'方向上的序列的惯例描述特定多核苷酸的序列或结构。
本文使用“转基因”来方便地指旨在或已经引入细胞或生物体的异源核酸。转基因包括任何异源核酸,例如编码GAA的修饰核酸。
术语“转导”及其语法变化是指将诸如rAAV载体之类的分子引入细胞或宿主生物体。异源核酸/转基因可以整合入或可以不整合入接受者细胞的基因组核酸中。引入的异源核酸还可以存在于接受者细胞或宿主生物体染色体外(extrachromosomally)或仅瞬时存在于接受者细胞或宿主生物体中。
“转导的细胞”是转基因已被引入其中的细胞。因此,“转导的”细胞(例如,在哺乳动物中,例如细胞、组织或器官细胞中)是指在将例如核酸(例如,转基因)掺入到细胞中后该细胞中的遗传变化。因此,“转导的”细胞是其中已引入外源核酸的细胞或其后代。细胞可以繁殖并表达引入的蛋白质。对于基因疗法的用途和方法,转导的细胞可以在受试者体内。
“表达控制元件”是指影响可操作连接的核酸表达的核酸序列。如本文所述的表达控制元件包括启动子和增强子。包括AAV载体的载体序列可以包含一个或多个“表达控制元件”。通常,包括这样的元件以促进适当的异源多核苷酸转录和适当的翻译(例如,启动子,增强子,内含子的剪接信号,维持基因的正确阅读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。这样的元件通常以顺式作用,称为“顺式作用”元件,但是也可以以反式作用。
可以在转录,翻译,剪接,信息稳定性等水平上实现表达控制。通常,将调节转录的表达控制元件并置在转录的核酸的5'末端附近(即“上游”)。表达控制元件也可以位于转录序列的3'末端(即“下游”)或在转录本之内(例如在内含子中)。表达控制元件可以定位邻近于转录的序列附近或与其相距一定距离(例如,与多核苷酸相距1-10、10-25、25-50、50-100、100-500或更多个核苷酸),甚至相距相当长的距离。然而,由于AAV载体的长度限制,表达控制元件通常将与异源核酸的转录起始位点相距1至1000个核苷酸。
在功能上,可操作连接的核酸的表达至少部分地可被元件(例如,启动子)控制,使得该元件调节核酸的转录并适当地调节转录本的翻译。表达控制元件的一具体例子是启动子,通常位于转录的核酸序列的5'端。与不存在启动子时表达的量相比,启动子通常增加从可操作连接的核酸表达的量。
如本文所用的“增强子”可以指定位邻近于异源核酸的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游,但是也起作用,并且可以位于该序列的下游或之内。因此,增强子元件可位于异源核酸序列上游或下游的10-50个碱基对,50-100个碱基对,100-200个碱基对或200-300个碱基对,或更多个碱基对。增强子元件通常增加可操作连接的核酸的表达,使其高于由启动子元件提供的表达。
表达构建体可包含用于驱动特定细胞或组织类型中的表达的调节元件。表达控制元件(例如,启动子)包括在特定组织或细胞类型中有活性的那些,在本文中称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。组织特异性表达控制元件通常在特异性细胞或组织(例如,肝脏)中具有活性。表达控制元件通常在特定的细胞、组织或器官中具有活性,因为它们被特定细胞、组织或器官类型所特有的转录激活蛋白或其他转录调节子所识别。这样的调节元件是本领域技术人员已知的(参见,例如,Sambrook等人(1989)和Ausubel等人(1992))。
在表达构建体中掺入组织特异性调节元件为编码蛋白质的异源核酸的表达或抑制性RNA提供了至少部分组织嗜性。在肝脏中有活性的启动子的例子是运甲状腺素蛋白(TTR)基因启动子;人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子;白蛋白,Miyatake,等人,J.Virol.,71:5124-32(1997);和乙型肝炎病毒核心启动子,Sandig,等人,Gene Ther.3:1002-9(1996);α-甲胎蛋白(AFP),Arbuthnot,等人,Hum.Gene.Ther.,7:1503-14(1996),等等。在肝中具有活性的增强子的例子是载脂蛋白E(apoE)HCR-1和HCR-2(Allan等人,J.Biol.Chem.,272:29113-19(1997))。
表达控制元件还包括能够在许多不同细胞类型中驱动多核苷酸表达的普遍存在的或混杂的(promiscuous)启动子/增强子。此类元件包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子序列,劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列以及在多种哺乳动物细胞类型中具有活性的其他病毒启动子/增强子,或自然界中不存在的合成的元件(参见,例如,Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)),SV40启动子,二氢叶酸还原酶启动子,细胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
表达控制元件还可以以可调节的方式赋予表达,即信号或刺激增加或减少可操作连接的异源多核苷酸的表达。响应于信号或刺激而增加可操作连接的多核苷酸的表达的可调节元件也被称为“可诱导元件”(即,由信号诱导)。具体实例包括但不限于激素(例如,类固醇)诱导型启动子。通常,这些元件赋予的增加或减少的数量与存在的信号或刺激的数量成正比;信号或刺激的数量越大,表达的增加或减少越大。特别的非限制性实例包括锌诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子;类固醇激素诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子;T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088);四环素可抑制系统(Gossen,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992));四环素诱导系统(Gossen,等人,Science.268:1766-1769(1995);还参见Harvey,等人,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518(1998));RU486-诱导型系统(Wang,等人,Nat.Biotech.15:239-243(1997)和Wang,等人,Gene Ther.4:432-441(1997));和雷帕霉素诱导型系统(Magari,等人,J.Clin.Invest.100:2865-2872(1997);Rivera,等人,Nat.Medicine.2:1028-1032(1996))。在这种情况下可能有用的其他可调节的控制元件是通过特定的生理状态(例如温度,急性期,发育)来调节的那些可调节的控制元件。
表达控制元件还包括异源多核苷酸的天然元件。当希望异源多核苷酸的表达应模仿天然表达时,可以使用天然控制元件(例如启动子)。当异源多核苷酸的表达将在时间或发育上、或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激而被调节时,可以使用天然元件。也可以使用其他天然表达控制元件,例如内含子、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列。
术语“可操作地连接”是指核酸序列表达所必需的调节序列相对于序列位于适当的位置,以实现核酸序列的表达。有时将该相同定义应用于表达载体(例如rAAV载体)中核酸序列和转录控制元件(例如启动子,增强子和终止元件)的排列。
在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中,该关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地说,例如,两个DNA序列可操作地连接是指两个DNA以这样的关系排列(顺式或反式),使得至少一个DNA序列能够对另一序列发挥生理作用。
因此,载体的其他元件包括但不限于表达控制(例如,启动子/增强子)元件,转录终止信号或终止密码子,位于序列侧翼的5'或3'非翻译区(例如,聚腺苷酸化(polyA)序列),例如一个或多个拷贝的AAV ITR序列,或内含子。
其他元件包括例如填充物或填充多核苷酸序列,例如以改善包装并减少污染性核酸的存在。AAV载体通常接受DNA插入物,该DNA插入物的大小范围通常为约4kb至约5.2kb,或稍大。因此,对于较短的序列,包括填充序列或填充物,以将长度调节至接近或处于AAV载体包装到病毒颗粒中可接受的病毒基因组序列的正常大小。在各种实施方案中,填充物/填充核酸序列是核酸的非翻译(非蛋白质编码)区段。对于小于4.7kb的核酸序列,填充物或填充多核苷酸序列的长度是当与序列组合(例如插入载体中)时与该序列的总长度为约3.0-5.5kb,或约4.0-5.0kb,或约4.3-4.8kb。
术语“分离的”当用作组合物的修饰语时,是指所述组合物是由人工制备的,或者从它们的天然存在的体内环境中完全或至少部分地分离。通常,分离的组合物基本上不含它们通常天然相关联的一种或多种物质,例如一种或多种蛋白质,核酸,脂质,碳水化合物,细胞膜。
术语“分离的”不排除人工生产的制品(combination),例如,rAAV序列、或包装或衣壳化AAV载体基因组的rAAV颗粒,和药物制剂。术语“分离的”也不排除组合物的替代物理形式,例如杂合体/嵌合体,多聚体/低聚物,修饰(例如磷酸化,糖基化,脂化)或衍生化形式,或在人工生产的宿主细胞中表达的形式。
术语“基本上纯的”是指包含按重量计至少50-60重量%的目标化合物(例如,核酸,寡核苷酸,蛋白质等)的制剂。该制剂可包含至少75重量%,或至少85重量%,或约90-99重量%的目标化合物。通过适用于目标化合物的方法(例如,色谱法,琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,HPLC分析等)来测量纯度。
当提及特定核苷酸序列或氨基酸序列时,短语“基本上由…组成”是指具有给定SEQ ID NO的特性的序列。例如,当用于氨基酸序列时,该短语包括该序列本身和不会影响该序列的基本和新颖特征的分子修饰。
核酸,表达载体(例如,AAV载体基因组),质粒,包括本发明的编码GAA的修饰核酸,可以通过使用重组DNA技术方法来制备。核苷酸序列信息的可获得性使得能够通过多种手段制备本发明的分离的核酸分子。可以使用各种标准克隆,重组DNA技术,通过细胞表达或体外翻译和化学合成技术来制备编码GAA的核酸。多核苷酸的纯度可以通过测序,凝胶电泳等来确定。例如,可以使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术分离核酸。这些技术包括但不限于:(1)基因组DNA或cDNA文库与探针的杂交以检测同源核苷酸序列;(2)例如使用表达文库筛选抗体以检测具有共同结构特征的多肽;(3)使用能够退火至目的核酸序列的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链反应(PCR);(4)计算机在序列数据库中搜索相关序列;和(5)差异筛选差减核酸文库。
核酸可以作为DNA保持在任何方便的克隆载体中。在一实施方案中,将克隆保持在质粒克隆/表达载体中,例如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA),其在合适的大肠杆菌宿主细胞中繁殖。或者,可以将核酸保持在适于在哺乳动物细胞中表达的载体中,例如AAV载体。在翻译后修饰影响蛋白质功能的情况下,核酸分子可以在哺乳动物细胞中表达。
如本文所公开的,rAAV载体可任选地包含对于异源核酸在细胞中表达所必需的调节元件,其定位方式允许编码的蛋白质在宿主细胞中表达。表达所需的此类调节元件包括但不限于如本文所述且为本领域技术人员已知的启动子序列,增强子序列和转录起始序列。
本发明的方法和用途包括将核酸(转基因)递送(转导)到宿主细胞中,所述宿主细胞包括分裂和/或非分裂细胞。本发明的核酸、rAAV载体、方法、用途和药物制剂另外可用于将异源核酸编码的序列递送、施用于或提供给需要其的受试者的方法,作为治疗方法。以这种方式,在受试者体内转录核酸并产生蛋白质。受试者可以受益于该蛋白质或需要该蛋白质,因为受试者缺乏该蛋白质,或者因为受试者中该蛋白质的产生可以赋予某种治疗效果,作为治疗方法或其他方法。
本发明可用于包括人的动物和兽医医学应用。因此,合适的受试者包括哺乳动物,例如人类,以及非人类哺乳动物。术语“受试者”是指动物,通常是哺乳动物,例如人,非人灵长类动物(猿,长臂猿,大猩猩,黑猩猩,猩猩,猕猴),家畜(狗和猫),农场动物(家禽,例如鸡和鸭,马,牛,山羊,绵羊,猪)和实验动物(小鼠,大鼠,兔子,豚鼠)。人类受试者包括胎儿,新生儿,婴儿,少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型,例如蛋白质/酶缺乏症(例如庞贝氏病和糖原贮积病(GSD))的小鼠和其他动物模型,以及本领域技术人员已知的其他动物模型。
适合根据本发明治疗的受试者包括具有或处于产生不足量的GAA或产生异常的、部分功能或非功能GAA的风险的受试者。可以测试受试者的GAA活性,以确定这些受试者是否适合根据本发明的方法进行治疗。适用于根据本发明治疗的受试者还包括将从GAA中受益的那些受试者。可能受益于GAA的这类受试者包括患有糖原贮积病(GSD)的那些受试者。治疗后可以定期(例如,每1-4周,每1-6个月,每6-12个月或每1、2、3、4、5或更多年)对接受治疗的受试者进行监测。
可以测试受试者的免疫应答,例如抗AAV的抗体。因此,可以根据本发明的方法在治疗之前筛选候选受试者。还可以在治疗后测试受试者的抗AAV抗体,并任选地在治疗后一段时间内对其进行监测。具有预先存在或正在发展的AAV抗体的受试者可以用免疫抑制剂或本文所述的其他方案治疗。
适用于根据本发明治疗的受试者还包括那些具有或处于产生抗AAV抗体的风险的受试者。可以使用若干种技术将rAAV载体施用或递送给此类受试者。例如,可以递送AAV空衣壳(即,缺失编码GAA的修饰核酸的AAV)以与受试者中的AAV抗体结合,从而允许包含异源核酸的rAAV载体转导受试者的细胞。
本发明的修饰核酸,表达盒和rAAV载体可以用于治疗GAA缺乏症。因此,在各种实施方案中,可以将本发明的编码GAA的修饰核酸,包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和rAAV载体用作治疗剂和/或预防剂。
在一特定实施方案中,本发明的编码GAA的修饰核酸,包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和rAAV载体可以用于治疗庞贝氏病以及其他糖原贮积病。将本发明的编码GAA的修饰核酸,包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和rAAV载体施用至患有庞贝氏病或另一种糖原贮积病的患者,可导致GAA蛋白表达,该蛋白可抑制、阻止或减少糖原的积累,预防糖原的积累或降解糖原,继而可以减少或减轻庞贝氏病的一种或多种不良作用或症状。
施用了本发明的编码GAA的修饰核酸、包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和rAAV载体的受试者、动物或患者,可以通过多种测试、测定和功能评估来评估,以证明、测量和/或评估本发明的编码GAA的修饰核酸、包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和rAAV载体作为治疗剂和/或预防剂的功效。此类测试和测定包括但不限于测量生物学样品(例如血液或血浆)中的GAA活性(例如通过使用标准GAA活性测定)和/或GAA数量(例如通过利用抗GAA抗体的蛋白质免疫印迹);测量组织(例如肌肉样品)中糖原含量;组织学评估肌肉(例如来源于肱三头肌、股四头肌、横隔膜和心脏的肌肉)、脊髓(包括检查和计数颈胸椎和腰脊髓节段腹角中的ChAT阳性运动神经元,以及评估星形胶质细胞反应和小胶质细胞活化);评估平静呼吸期间的呼吸功能;前肢吊绳试验(forelimbs wire-hanging test);测量握力;运动协调性的转棒测试(例如通过转棒实验方法);可以显示心脏肥大的胸部X光摄影;心电图(ECG)检查心脏功能;可显示肌病的肌电图(EMG);测量皮肤成纤维细胞中GAA活性;干血样品中GAA活性的测定;血液/血清检测血清肌酸激酶,血清肌酸激酶升高是庞贝氏病的一种非特异性标志物;血液/血清检测转氨酶、丙氨酸转氨酶或乳酸脱氢酶,转氨酶、丙氨酸转氨酶或乳酸脱氢酶水平可能会升高,作为庞贝氏病从肌肉中释放的指标;检测尿液中的葡萄糖四糖(庞贝氏病的敏感、非特异性标志物;通过总GAA蛋白和血浆活性评估的峰值和稳态载体来源的GAA酶水平分析;肺功能测试;肌肉功能测试;肌肉活组织检查和细胞液泡中糖原存在的染色;肝脏健康的生物标志物;溶酶体健康检查;针对AAV衣壳的免疫应答测试;针对GAA转基因蛋白产物的免疫应答测试;六分钟步行测试(6MWT);强制肺活量测试;峰值和稳态AAV载体来源的GAA酶水平(由血浆中测得的GAA总蛋白和活性评估);步态、楼梯、gower和椅子(GSGC)测试;使用Rasch-built Medical Research Council(MRC)分级量表进行的肌肉力量测试;患者报告的生活活动/社会参与;多导睡眠图(PSG)的定量睡眠和睡眠呼吸测量;患者报告的疲劳、白天嗜睡和睡眠质量测量;Walton和Gardner-Medwin(WGM)评分;呼吸功能测试,包括但不限于经鼻吸气压力(SNIP)和最大吸气压力和最大呼气压力(分别为MIP和MEP);肝脏生物标志物;β氨基已糖苷酶(βHexo)检测;健康结果测量,包括但不限于简明36项健康状况调查表(SF-36);Rasch-built Pompe-specific activity(R-PAct)评分量表;疲劳严重程度评分(FSS);和患者报告结局测量信息系统(PROMIS)项目库。
另外,本发明的编码GAA的修饰核酸、包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和rAAV载体可以用于治疗糖原贮积病(GSD)。糖原贮积病包括,例如,I型GSD(冯·吉尔克氏病)、II型GSD(庞贝氏病)、III型GSD(福布斯-科里病)、IV型GSD(安德森病,支链淀粉病)、V型GSD(麦卡德尔病)、VI型GSD(赫尔氏病)、VII型GSD(塔瑞氏病)或致命性先天性心脏糖原贮积病。
如本文所述,rAAV可用作基因治疗载体,因为它们可以穿透细胞并将核酸/遗传物质引入细胞。由于AAV与人类的致病性疾病无关,因此rAAV载体能够将异源多核苷酸序列(例如治疗性蛋白质和治疗剂)递送给人类患者,而不会引起严重的AAV致病或疾病。
rAAV载体具有用于此类应用的许多期望特征,包括用于分裂细胞和非分裂细胞的向性(tropism)。这些载体的早期临床经验也表明没有持续的毒性,免疫应答通常很少或无法检测到。已知AAV通过受体介导的内吞作用或通过转胞吞作用在体内感染多种细胞类型。这些载体系统已经在人类中针对许多组织进行了测试,这些组织是例如视网膜上皮,肝脏,骨骼肌,气道,大脑,关节和造血干细胞。
可能期望引入可以提供例如多个拷贝的GAA并因此提供更大量的GAA蛋白的rAAV载体。改进的rAAV载体和产生这些载体的方法已经在许多参考文献、专利和专利申请中详细描述,包括:Wright J.F.(Hum.Gene Ther.,20:698-706,2009)。
直接递送rAAV载体或间接体内转导(exvivo transduction)人细胞,然后输注到体内,将导致异源核酸的表达,从而对止血产生有益的治疗作用。在编码GAA的修饰核酸的情况下,施用抑制、阻止或减少糖原的量或糖原积累,防止糖原的积累或降解糖原。继而,这可以抑制、阻止、减少或降低庞贝氏病的一种或多种不良反应,例如促进或改善肌张力和/或肌肉力量和/或减少或减小肝脏肿大。
重组AAV载体及其方法和用途包括任何病毒株或血清型。作为非限制性实例,重组AAV载体可以基于任何AAV基因组,例如AAV(SEQ ID NO:30-32),LK03(SEQ ID NO:33),AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B或AAV-2i8。这样的载体可以基于相同的病毒株或血清型(或亚组或变体),或彼此不同。作为非限制性实例,基于特定血清型基因组的重组AAV载体可以与包装该载体的衣壳蛋白的血清型相同。另外,重组AAV载体基因组可以基于与包装载体的AAV衣壳蛋白的血清型不同的AAV血清型基因组。例如,AAV载体基因组可以基于AAV2,而三个衣壳蛋白中的至少一个可以是例如AAV(SEQ ID NO:30-32),LK03(SEQ ID NO:33),AAV1,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B或AAV-2i8或其变体。
在一特定实施方案中,腺相关病毒(AAV)载体包括AAV(SEQ ID NO:30-32),LK03(SEQ ID NO:33),AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B和AAV-2i8及其变体(例如衣壳变体,例如氨基酸插入,添加,替代和缺失),例如,如在WO 2013/158879(国际申请PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313(国际申请PCT/US2014/047670)和US 2013/0059732(美国专利号9,169,299中公开了LK01,LK02,LK03等)中所描述的。
如本文所用,术语“血清型”是一种区分,其用于指一种AAV的衣壳在血清学上不同于其他AAV血清型。血清学独特性(serologic distinctiveness)是基于一种AAV的抗体与另一种AAV之间缺乏交叉反应性来确定的。这样的交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如,由于AAV血清型的VP1,VP2和/或VP3序列差异)。尽管AAV变体包括衣壳变体的可能性可能在血清学上与参考AAV或其他AAV血清型没有区别,但与参考或其他AAV血清型相比,它们至少相差一个核苷酸或氨基酸残基。
在传统定义下,血清型是指已对目标病毒针对所有现有和特征性血清型具有特异性的血清进行了中和活性测试,并且未发现可中和目标病毒的抗体。由于发现了更自然的病毒分离株和/或产生了衣壳突变体,因此与任何现有的血清型可能存在血清学差异,也可能没有血清学差异。因此,在新病毒(例如,AAV)没有血清学差异的情况下,该新病毒(例如,AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下,尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试,以根据传统的血清型定义确定它们是否属于另一种血清型。因此,为方便起见并避免重复,术语“血清型”广义上既指血清学上独特的病毒(例如AAV),也指可能在给定血清型的亚组或变体内的血清学上独特的病毒(例如AAV)。
如本文所述,AAV衣壳蛋白与参考AAV血清型或亲本AAV血清型(例如AAV(SEQ IDNO:30-32),LK03(SEQ ID NO:33),AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B或AAV-2i8)具有小于100%序列同一性,但与已知的AAV基因或蛋白质(例如AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B或AAV-2i8)有区别且不相同。在一实施方案中,修饰AAV衣壳蛋白/变体AAV衣壳蛋白包括与参考AAV衣壳蛋白或亲本AAV衣壳蛋白(例如AAV(SEQ ID NO:30-32),LK03(SEQ ID NO:33),AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B或AAV-2i8)具有至少80%,85%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.1%,99.2%,99.3%,99.4%,99.5%等,最高99.9%同一性的序列或由其组成。
可以通过在生物相容性载体中输注(例如通过静脉内注射)将rAAV载体施用于患者。rAAV载体可以单独施用或与其他分子组合施用。因此,可以将rAAV载体和其他组合物,药剂,药物,生物制剂(蛋白质)掺入药物组合物中。此类药物组合物尤其可用于体内或间接体内给药和递送至受试者。
在特定实施方案中,药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。这样的赋形剂包括任何本身不会诱导对接收该组合物的个体有害的免疫应答的药物,并且可以在没有过度毒性的情况下给药。
如本文所用,术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指适合于一种或多种给药途径、体内递送或接触的生物学上可接受的制剂,气态,液体或固体或其混合物。“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不期望的物质,例如,可以将该物质施用于受试者而不会引起实质的不期望的生物学作用。因此,这样的药物组合物可以用于例如向受试者施用核酸,载体,病毒颗粒或蛋白质。
药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体,例如水,盐水,甘油,糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包含在其中,例如,无机酸盐,例如盐酸盐,氢溴酸盐,磷酸盐,硫酸盐等;以及有机酸的盐,例如乙酸盐,丙酸盐,丙二酸盐,苯甲酸盐等。赋形剂还包括蛋白质,例如白蛋白。另外,在这类载体中可以存在辅助物质,例如润湿剂或乳化剂,pH缓冲物质等。
药物组合物可以盐的形式提供,并且可以与许多酸形成,包括但不限于盐酸,硫酸,乙酸,乳酸,酒石酸,苹果酸,琥珀酸等。盐相比于相应的游离碱形式倾向于更易溶于水或其他质子溶剂。在其他情况下,制剂可以是冻干粉末,其可以包含以下任意一种或全部:1-50mM组氨酸、0.1%-2%蔗糖和2-7%甘露醇,pH范围为4.5至5.5,在使用前将其与缓冲液结合使用。
药物组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性),溶液(水性或非水性),乳剂(例如水包油或油包水),混悬剂,糖浆剂,酏剂(elixir),分散介质和混悬介质,包衣,等渗和吸收促进或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和混悬剂可包括助悬剂和增稠剂。这样的药学上可接受的载体包括片剂(包衣的或未包衣的),胶囊(硬或软的),微珠,粉末,颗粒和晶体。补充的活性化合物(例如防腐剂,抗菌剂,抗病毒剂和抗真菌剂)也可以掺入组合物中。
可以将药物组合物配制成与如本文所述或本领域技术人员已知的特定给药或递送途径相容。因此,药物组合物包括适合通过各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
适用于肠胃外给药的组合物包括活性化合物的水溶液和非水溶液、混悬剂或乳剂,这些制剂通常是无菌的,并且可以与预期接受者的血液等渗。非限制性说明性实例包括水,缓冲盐水,汉克斯溶液,林格氏溶液,右旋糖,果糖,乙醇,动物,植物油或合成油。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂粘度的物质,例如羧甲基纤维素钠,山梨糖醇或葡聚糖。
另外,可以将活性化合物的混悬剂制备为合适的油注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油,例如芝麻油,或合成脂肪酸酯,例如油酸乙酯或甘油三酸酯,或脂质体。任选地,混悬剂还可包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
助溶剂和助剂可以添加到制剂中。助溶剂的非限制性实例包含羟基或其他极性基团,例如,醇,例如异丙醇;二醇,例如丙二醇,聚乙二醇,聚丙二醇,乙二醇醚;甘油;聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。助剂包括,例如,表面活性剂,例如大豆卵磷脂和油酸;脱水山梨糖醇酯,例如脱水山梨糖醇三油酸酯;和聚乙烯吡咯烷酮。
在制备药物组合物之后,可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签以进行治疗。这种标记可以包括给药量,频率和方法。
适用于本发明的组合物、方法和用途的药物组合物和递送系统是本领域已知的(参见,例如,Remington:The Science and Practice ofPharmacy(2003)20th ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA;Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA;The Merck Index(1996)12th ed.,Merck PublishingGroup,Whitehouse,NJ;Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993),Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.;Ansel and Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)11th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD;和Poznansky等人,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.,pp.253-315)。
“有效量”或“足够量”是指一种量,其以单剂量或多剂量单独或组合在任何可测量或可检测的程度或任何持续时间(例如,持续数分钟,数小时,数天,数月,数年或已治愈)内向受试者提供一种或多种其他组合物(治疗或免疫抑制剂,例如药物),治疗,治疗方案,或治疗方案药剂,任何持续时间(长期或短期)的可检测响应,有益的预期或期望结果或益处。
剂量可以变化,并且取决于治疗所针对的疾病的类型,发作,进展,严重程度,频率,持续时间或可能性,所需的临床终点,既往或同时治疗,受试者的总体健康状况、年龄、性别、种族或免疫能力以及本领域技术人员应理解的其他因素。剂量、数量、频率或持续时间可按比例增加或减少,如治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其他风险因素以及受试者的状况所指示的。本领域技术人员将理解可以影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
实现治疗效果的剂量,例如载体基因组/千克体重(vg/kg)中的剂量,将基于若干个因素而变化,这些因素包括但不限于:给药途径,达到治疗效果所需的异源多核苷酸表达水平,治疗的特定疾病,对病毒载体的任何宿主免疫应答,对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质)的宿主免疫应答以及表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素来确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV/载体基因组剂量范围。
通常,剂量范围为至少1×108个载体基因组/千克受试者体重或更大,例如1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014或更多个载体基因组/千克受试者体重(vg/kg),以实现治疗效果。在小鼠中rAAV剂量在1×1010-1×1011vg/kg范围内有效,在狗中rAAV剂量则在1×1012-1×1013vg/kg范围内有效。剂量可以更少,例如小于6×1012vg/kg的剂量。更特别地,剂量为5×1011vg/kg或1×1012vg/kg。
rAAV载体的剂量可以处于一定水平,通常在剂量范围的较低端,使得对异源核酸序列、编码的蛋白质或抑制性核酸或rAAV载体没有实质性的免疫应答。更特别地,剂量高达但小于6×1012vg/kg,例如约5×1011至约5×1012vg/kg,或更特别地,约5×1011vg/kg或约1×1012vg/kg。
如本文所用,“单位剂型”(unit dosage form)是指适合作为待治疗受试者用的单一剂量(unitary dosage)的物理上离散的单位;每单位含有(以一剂或多剂给药时)计算好的产生所期望的治疗效果(例如预防或治疗作用)的预定量,其任选与药物载体(赋形剂,稀释剂,溶媒或填充剂)组合。单位剂型可以在例如安瓿和小瓶中,其可以包括液体组合物,或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物;无菌液体载体,例如,可以在体内施用或递送之前添加。个体单位剂型可包含在多剂量药盒或容器中。可以将rAAV颗粒及其药物组合物包装成单个或多个单位剂型,以便于给药和剂量均匀。
用于治疗(例如,减轻(ameliorate)或提供治疗益处或改善)的“有效量”或“足够量”的剂量通常有效地提供对疾病的一种、多种或全部不良症状,后果或并发症,(例如由疾病引起或与之相关的)一种或多种不良症状、病症、病、病状或并发症的可测量程度的应答,尽管可以减少、降低、抑制、抑止、限制或控制疾病进展或恶化是令人满意的结果。
有效量或足够量可以但不必在单次给药中提供,可以需要多次给药,并且可以但不必单独或与另一种组合物(例如,药剂)、治疗、治疗方案或用药方案组合给药。例如,该量可以根据受试者的需要、所治疗疾病的类型、状态和严重程度或治疗的副作用(如果有的话)所表明的来按比例增加。另外,如果以单剂量或多剂量给予而没有第二种组合物(例如另一种药物或药剂)、治疗、治疗方案或用药方案,则有效量或足够量就不需要有效或足够,因为可以包括在这种剂量之上和更高的其他剂量、数量或持续时间,或其他组合物(例如药物或药剂)、治疗、治疗方案或用药方案,以便被认为对给定的受试者有效或足够。被认为有效的量还包括导致减少使用另一种治疗、用药方案或治疗方案的量,例如施用编码GAA的修饰核酸用于治疗GAA缺乏症(例如庞贝氏病)或另一种糖原贮积病。
因此,本发明的方法和用途还包括导致减少对另一种化合物、药剂、药物、用药方案、治疗方案、方法或疗法的需要或使用的方法和用途。例如,对于GAA缺乏症,如果在给定受试者中较低频率或降低剂量或消除重组GAA的施用以补充受试者中缺乏或缺陷的GAA,则本发明的方法或用途具有治疗益处。因此,根据本发明,提供了减少需求或使用另一种治疗或疗法的方法和用途。
有效量或足够量不必对每个治疗的受试者有效,也不必在给定的组或人群中对大多数治疗的受试者有效。有效量或足够量是指在特定受试者而非组或普通人群中有效或充分。如此类方法的典型情况,一些受试者对给定的治疗方法或用途表现出更大的应答,或更少或没有应答。
可以在由疾病引起或与之相关的不良症状、病状、并发症等发生之前,进行对受试者的给药或体内递送。例如,可以使用筛选(例如遗传)来将这样的受试者识别为发明组合物、方法和用途的候选者。因此,这些受试者包括那些针对功能基因产物的量不足或功能基因产物缺乏(例如,GAA或导致GSD的蛋白质缺乏症)而筛查阳性的受试者,或产生异常、部分功能或非功能基因产物(例如,GAA或GSD中涉及的蛋白质)的受试者。
根据如本文公开的本发明的方法和用途,可以在已鉴定受试者患有治疗的目标疾病、患有疾病的一种或多种症状或即使受试者没有疾病的一种或多种症状但如本文所述已被筛查并鉴定为阳性后的1-2、2-4、4-12、12-24或24-72小时内进行向受试者的给药或体内递送。当然,可在受试者已被鉴定为患有治疗的目标疾病、患有疾病的一种或多种症状或如本文所述已被筛查并鉴定为阳性后的1-7、7-14、14-24、24-48、48-64或更多天、数月或数年进行本发明的方法和用途。
术语“减轻”(ameliorate)是指受试者的疾病或其症状或潜在的细胞应答的可检测或可测量的改善。可检测或可测量的改善包括主观或客观上减少,降低,抑制,抑止,限制或控制疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间,或由疾病引起或与之相关的并发症,或改善疾病的症状、根本原因或后果,或疾病的逆转。
对于庞贝氏病,有效量将是一种量,其例如抑制或减少糖原产生或积累,增强或增加糖原的降解或去除。有效量也将是改善或减轻以下的量:进食困难和/或不增加体重;头部和/或颈部控制不佳;呼吸困难和/或肺部感染;心脏扩大和/或心脏增厚;心脏缺陷;舌头增大;吞咽困难;肝脏肿大;肌肉力量差;肌张力弱;腿无力,腰无力和/或手臂无力;气促;运动困难;睡觉时呼吸困难;脊柱弯曲和/或关节僵硬;肌张力弱和/或肌肉力量不足。有效量也将是一种量,其在需要GAA或患有庞贝氏病的患者或受试者中减少或抑制一种或多种症状,或预防或减少一种或多种症状的进展或恶化,或稳定一种或多种症状,或改善一种或多种症状。
治疗剂量将取决于受试者的年龄和一般状况,疾病或病症的严重性等因素。对人体的治疗有效量将落在可以由医师根据个体患者的应答确定的相对较宽的范围内。
可以将诸如药物组合物之类的组合物递送至受试者,以允许产生编码的蛋白质。在一特定的实施方案中,药物组合物包含足够的遗传物质,以使接受者能够在受试者中产生治疗有效量的蛋白质。
可以在任何无菌的、生物相容的药物载体中配制和/或施用组合物,载体包括但不限于盐水,缓冲盐水,右旋糖和水。可以将组合物单独或与影响止血的其他药剂(例如辅因子)组合配制和/或施用于患者。
本发明的方法和用途包括全身性地、区域性地或局部地或通过任何途径,例如通过注射或输注,进行递送和给药。药物组合物在体内的递送通常可以通过使用常规注射器的注射来完成,尽管设想了其他递送方法,例如对流增强递送(参见例如美国专利号5,720,720)。例如,组合物可以通过皮下,表皮,皮内,鞘内,眶内(intraorbitally),粘膜内,鼻内,腹膜内,静脉内,胸膜内,动脉内,腔内,口服,肝内,通过门静脉,或肌内递送。其他给药方式包括口服和肺部给药,栓剂和透皮给药。专门治疗庞贝氏病或其他糖原贮积病患者的临床医生可以根据许多标准,包括但不限于:患者的状况和治疗目的(例如,增加或降低GAA水平),确定与腺病毒相关载体给药的最佳途径。
组合物可以单独施用。在某些实施方案中,rAAV颗粒在没有免疫抑制剂的情况下提供治疗效果。任选地将治疗效果维持一段时间,例如2-4天、4-6天、6-8天、8-10天、10-14天、14-20天、20-25天、25-30天或30-50天或更多天,例如50-75、75-100、100-150、150-200天或更多天,而无需施用免疫抑制剂。因此,在一段时间内提供治疗效果。
本发明的rAAV载体、方法和用途可以与具有期望的治疗、有益的、叠加的、协同的或互补的活性或效果的任何化合物,药剂,药物,治疗或其他用药方案或治疗方案组合。示例性组合的组合物和治疗包括第二活性物质,例如生物制剂(蛋白质)、药剂(例如免疫抑制剂)和药物。这样的生物制剂(蛋白质)、药剂、药物、治疗和疗法可以在本发明的任何其他方法或用途之前,基本上同时或之后施用或进行。
化合物、药剂、药物、治疗或其他用药方案或治疗方案可作为组合的组合物施用,或分开地施用,例如同时或与核酸、载体或rAAV颗粒的递送或施用连续或顺序地(早于或晚于)施用。因此,本发明提供了组合,其中本发明的方法或用途与本文所述或本领域技术人员已知的任何化合物、药剂、药物、用药方案、治疗方案、方法、疗法或组合物组合。可以在向受试者施用本发明的核酸、载体或rAAV颗粒之前,基本上同时或之后,施用或进行该化合物、药剂、药物、用药方案、治疗方案、方法、疗法或组合物。
在某些实施方案中,将本发明的核酸、载体或rAAV颗粒与免疫抑制剂或方案联合施用于患者,其中患者具有或处于发展针对rAAV颗粒和/或GAA蛋白的免疫应答的风险。这样的免疫抑制剂或方案可以在施用本发明的核酸、载体或rAAV载体之前,基本上同时或之后施用。
在一些实施方案中,患有庞贝氏病的受试者或患者(例如人类患者),已经发展出针对GAA蛋白的抑制剂(包括抗GAA抗体和/或抗GAAT细胞),其可以在传统的酶替代疗法治疗之后(例如,在施用重组产生的GAA蛋白之后)发生。这类GAA抑制剂的发展可能发生在接受酶替代疗法的患者中,尤其是在患者的GAA水平无法检测到的情况下(例如婴儿庞贝氏病),从而导致患者的免疫系统将替代GAA蛋白视为“异源”。在某些实施方案中,在施用本发明的rAAV载体之前、基本上同时或之后,向具有GAA抑制剂的庞贝氏病患者施用一种或多种旨在实现免疫耐受或减轻患者对GAA蛋白的免疫应答的方案。实现免疫耐受或减轻对GAA蛋白的免疫应答的此类方案可包括施用一种或多种免疫抑制剂,包括但不限于甲氨蝶呤,利妥昔单抗,静脉内丙种球蛋白(IVIG),奥马珠单抗和合成疫苗颗粒(SVPTM)-雷帕霉素(雷帕霉素封装在可生物降解的纳米颗粒中)和/或施用一种或多种免疫抑制方案或程序,例如B细胞耗竭,免疫吸附和单采血浆术。
在某些实施方案中,在施用rAAV载体之前、基本上同时或之后,将rAAV载体与一种或多种免疫抑制剂联合施用。在某些实施例中,施用rAAV载体后例如1-12小时、12-24小时或24-48小时,或2-4天、4-6天、6-8天、8-10天、10-14天、14-20天、20-25天、25-30天、30-50天或超过50天。如果在rAAV载体后初始表达水平持续一段时间(例如20-25天、25-30天、30-50天、50-75天、75-100天、100-150天、150-200天或超过200天)后编码的蛋白或抑制性核酸含量降低,则在施用rAAV载体后的一段时间后进行这种免疫抑制剂的施用。
在某些实施方案中,免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中,免疫抑制剂是类固醇,例如皮质类固醇。在某些实施方案中,免疫抑制剂是泼尼松,泼尼松龙,环孢素(例如环孢素A),霉酚酸酯,B细胞靶向抗体(例如利妥昔单抗);蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米);哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂(例如雷帕霉素);酪氨酸激酶抑制剂(例如依鲁替尼);B细胞活化因子(BAFF)抑制剂;或增殖诱导配体(APRIL)抑制剂或其衍生物。在某些实施方案中,该免疫抑制剂是抗IL-1β剂(例如,抗IL-1β单克隆抗体卡那津单抗)或抗IL-6剂(例如,抗IL-6抗体西鲁库单抗(sirukumab))或抗IL-6受体抗体托珠单抗或其组合。
单独或与IL-10组合使用的免疫抑制方案,包括使用雷帕霉素,可用于减少,降低,抑制,预防或阻断对GAA蛋白的体液和细胞免疫应答。用本发明的AAV载体进行肝基因转移可用于通过诱导调节性T细胞(Tregs)和其他机制来诱导对GAA蛋白的免疫耐受。在全身基因转移中减少(克服)或避免对AAV的体液免疫的策略包括:施用高剂量的载体,使用AAV空衣壳作为诱饵来吸附抗AAV抗体,施用免疫抑制药物以减少、降低抑制、预防或消除对AAV的体液免疫应答,改变AAV衣壳血清型或将AAV衣壳改造为对中和抗体较不敏感,利用血浆交换循环来吸附抗AAV免疫球蛋白,从而降低抗AAV抗体滴度和使用递送技术,例如气囊导管,然后用盐水(saline)冲洗。这样的策略在Mingozzi等人,2013,Blood,122:23-36中描述。在Doerfler等人,2016,Mol.Ther.,3:15053中综述了诱导庞贝氏病患者对GAA耐受以改善治疗效果的程序和方法。
AAV空衣壳与rAAV载体的比例可以为约100:1-50:1,约50:1-25:1,约25:1-10:1,约10:1-1:1,约1:1-1:10,约1:10-1:25,约1:25-1:50,或约1:50-1:100。比例也可以是大约2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1,或10:1。
可以基于在特定受试者中产生的AAV抗体的量(滴度)来校准要施用的AAV空衣壳的量。AAV空衣壳可以是任何血清型,例如AAV(SEQ ID NO:30-32),LK03(SEQ ID NO:33),AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B或AAV-2i8。
替代地或附加地,可以通过直接肌内注射(例如,肌肉的一或多条慢收缩肌纤维)递送rAAV载体。在另一替代方案中,引入股动脉的导管可用于将rAAV载体通过肝动脉递送至肝脏。还可以采用非手术方法,例如内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP),将rAAV载体直接递送至肝脏,从而绕过血流和AAV抗体。其他导管系统,例如下颌下腺的导管,也可以用作将rAAV载体递送至已发展或已存在抗AAV抗体的受试者的门户(portal)。
降低对AAV的体液免疫力的其他策略包括去除、消耗、捕获和/或失活AAV抗体的方法,通常被称为单采血液成分术(apheresis),尤其是涉及血液制品的单采血浆术。单采血液成分术或单采血浆术是一种过程,在该过程中,人类受试者的血浆通过设备进行离体循环(体外),该设备通过添加、去除和/或替换成分来修改血浆,然后血浆返回患者。单采血浆术可以用于从血液产品(例如血浆)中去除人免疫球蛋白(例如IgG,IgE,IgA,IgD)。该程序消耗,捕获,失活,减少或去除结合AAV的免疫球蛋白(抗体),从而降低治疗受试者中AAV抗体的滴度,这可能有助于AAV载体的中和。一个示例是由AAV衣壳亲和基质柱组成的设备。使血液产物(例如血浆)通过AAV衣壳亲和基质将仅导致AAV抗体和所有同种型(包括IgG,IgM等)的结合。
预计使用AAV衣壳亲和基质进行的足够数量的单采血浆术将基本去除AAV衣壳抗体,并降低人中AAV衣壳抗体的滴度(负载量)。在某些实施方案中,在治疗的受试者中的滴度基本上降低至低水平(至<1:5或更低,例如<1:4,或<1:3,或<1:2,或<1:1)。抗体滴度的降低将是暂时的,因为产生AAV衣壳抗体的B淋巴细胞有望逐渐引起AAV衣壳抗体的滴度反弹至单采血浆术前的稳态水平。
在将预先存在的AAV抗体滴度从1:100降低至1:1的情况下,在完成单采血浆术后1小时、3小时、6小时、12小时和24小时分别出现AAV抗体滴度反弹约0.15%(对应于1:1.2的滴度),0.43%(1:1.4),0.9%(1:1.9),1.7%(1:2.7)和3.4%(1:4.4)。从这样的受试者中暂时去除AAV抗体将对应于时间窗口(例如,约24小时或更短的时间,例如12小时或更短的时间,或6小时或更短的时间,或3小时或更短的时间,或2小时或更短的时间,或1小时或更短的时间),在此期间可以将AAV载体施用于受试者并预测有效转导靶组织,而不会有AAV抗体大量中和AAV载体。
在将预先存在的AAV抗体滴度从1:1000降低至1:1的情况下,在完成单采血浆术后1小时、3小时、6小时、12小时和24小时分别出现AAV抗体滴度反弹约0.15%(对应于1:2.5的滴度),0.4%(1:5.3),0.9%(1:9.7),1.7%(1:18)和3.4%(1:35)。因此,用于施用AAV载体的窗口将相对较短。
AAV抗体可以预先存在,并且可以以降低或阻断靶细胞的治疗性GAA基因转移载体转导的水平存在。替代地,AAV抗体可以在暴露于AAV或施用AAV载体后产生。如果在施用AAV载体后产生了此类抗体,则还可以通过单采血液成分术(更具体地,单采血浆术)来治疗这些受试者。
在一些实施方案中,本发明的核酸、表达盒和AAV载体可以与对症疗法和支持疗法结合使用,所述对症疗法和支持疗法包括例如呼吸支持(包括机械通气),物理疗法以增强肌肉,物理疗法为提高强度和身体能力,职业疗法包括使用拐杖、助行器和轮椅,言语疗法以改善发音和言语,骨科用器械(包括矫正器)的使用,饮食治疗和饲管以确保适当的营养和体重增加。
在一些实施方案中,本发明的核酸、表达盒和AAV载体可以与药理伴侣蛋白疗法(也称为酶增强疗法)组合使用,其中在施用本发明的核酸、表达盒或AAV载体用于治疗GSD(例如庞贝氏病)之前,同时,或之后,施用一种或多种药理伴侣蛋白。
在一些实施方案中,本发明的核酸、表达盒和AAV载体可以与可以稳定GAA蛋白的一种或多种药理伴侣蛋白结合使用。可以与本发明的核酸、表达盒和AAV载体结合使用的药理伴侣蛋白包括1-脱氧野尻霉素(1-DNJ,也称为duvoglustat),N-丁基-1-脱氧野尻霉素(也称为美格鲁特(miglustat)),N-甲基-DNJ,N-乙基-DNJ,N-丙基-DNJ,N-戊基-DNJ,N-己基-DNJ,N-庚基-DNJ,N-辛基-DNJ,N-壬基-DNJ,N-甲基环丙基-DNJ,N-甲基环戊基-DNJ,N-2-羟乙基-DNJ,5-N-羧基戊基DNJ,和在美国专利6,599,919和9,181,184和国际专利申请公开号WO/2013/182652中描述的药理伴侣蛋白。
在一些实施方案中,本发明的核酸、表达盒和AAV载体可以与以下组合使用:辅助疗法,一种或多种β2激动剂,包括例如克伦特罗、沙丁胺醇、福莫特罗和沙美特罗,和如在国际专利申请公开号WO/2017/049161中描述的。
在特定实施方案中,本发明的核酸和表达盒通过AAV载体颗粒递送或施用。在其他实施方案中,本发明的核酸和表达盒可以通过其他类型的病毒颗粒来递送或施用,所述其他类型的病毒颗粒包括逆转录病毒、腺病毒、辅助病毒依赖型腺病毒,杂合腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、牛痘病毒和人类巨细胞病毒颗粒。
在其他实施方案中,本发明的核酸和表达盒与非病毒递送系统一起递送或施用。非病毒递送系统包括例如化学方法(例如脂质体,纳米颗粒,脂质纳米颗粒,聚合物,微粒,微胶囊,胶束或细胞外囊泡),以及物理方法(例如基因枪,电穿孔,粒子轰击,超声利用和磁转染)。
在一些实施方案中,本发明的核酸和表达盒作为裸露DNA,小环,转座子,或封闭末端线性双链DNA递送。
在其他实施方案中,本发明的核酸和表达盒在AAV载体颗粒或其他病毒颗粒中递送或施用,所述AAV载体颗粒或其他病毒颗粒进一步用脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微胶囊、胶束或细胞外囊泡包封或与其复合。
“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指基于脂质的囊泡,其可用于递送AAV并且具有纳米级的尺寸,即约10nm至约1000nm,或约50nm至约500nm,或约75nm至约127nm。不受理论的束缚,据信LNP为核酸、表达盒或AAV载体提供了对免疫系统的部分或完全屏蔽。屏蔽允许将核酸、表达盒或AAV载体递送至组织或细胞,同时避免在体内诱导针对核酸,表达盒或AAV载体的实质性免疫应答。屏蔽也可以允许重复施用而不会在体内(例如,在诸如人之类的受试者中)诱导针对核酸、表达载体或AAV载体的实质性免疫应答。屏蔽还可以改善或增加核酸、表达盒或AAV载体的体内递送效率。
AAV的pI(等电点)在约6至约6.5的范围内。因此,AAV表面带有轻微的负电荷。因此,LNP包含阳离子脂质(例如氨基脂质)可能是有益的。示例性氨基脂质已在美国专利号9,352,042、9,220,683、9,186,325、9,139,554、9,126,966、9,018,187、8,999,351、8,722,082、8,642,076、8,569,256、8,466,122和7,745,651和美国专利公开号2016/0213785、2016/0199485、2015/0265708、2014/0288146、2013/0123338、2013/0116307、2013/0064894、2012/0172411和2010/0117125中有描述。
术语“阳离子脂质”和“氨基脂质”在本文可互换使用,以包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定的氨基(例如,烷基氨基或二烷基氨基)的脂质和其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下被质子化(即带正电),并且在高于pKa的pH下基本上是中性的。阳离子脂质也可以是可滴定的阳离子脂质。在一些实施方案中,阳离子脂质包含:可质子化的叔胺(例如pH可滴定的)基团;C18烷基链,其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如0、1、2或3个)双键;和在头基和烷基链之间的醚,酯或缩酮键。
阳离子脂质可包括但不限于1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA),1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA),1,2-二-γ-亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA),2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA,也称为DLin-C2K-DMA,XTC2和C2K),2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA),二亚油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA,也称为MC2),(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA,也称为MC3),它们的盐及其混合物。其他阳离子脂质还包括但不限于1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA),1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA),2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C3-DMA),2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C4-DMA),DLen-C2K-DMA,γ-DLen-C2K-DMA和(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)。
进一步的阳离子脂质可以包括但不限于2,2-二亚油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧六环(DLin-K6-DMA),2,2-二亚油基-4-N-甲基哌嗪-1-基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-MPZ)(2,2-dilinoleyl-4-N-methylpepiazino-[l,3]-dioxolane),1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP),1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC),1,2-二亚油基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA),1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP),1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA),1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP),1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl),1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl),1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪-1-基)丙烷(DLin-MPZ),3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP),3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙烷(DOAP),1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA),N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC),N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA),N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB),N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP),3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol),N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE),2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-羧酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA),双十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS),3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA),2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA),N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(DMOBA),1,2-N,N′-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP),1,2-N,N′-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP),地塞米松-亚精胺(dexamethasone-sperimine)(DS)和二取代的精胺(D2S)或它们的混合物。
在某些实施方案中,阳离子脂质的存在量可以为LNP的约10重量%至脂质纳米颗粒的约85重量%,或LNP的约50重量%至LNP的约75重量%。
固醇可以赋予LNP流动性。如本文所用,“固醇”是指植物(植物固醇)或动物(动物固醇)来源的任何天然存在的固醇以及非天然存在的合成固醇,所有这些都以在类固醇A环的3-位上存在羟基为特征。固醇可以是脂质体、脂质囊泡或脂质颗粒制剂领域中常规使用的任何固醇,最通常为胆固醇。植物固醇可以包括菜油甾醇,谷固醇和豆甾醇。固醇还包括固醇修饰的脂质,例如在美国专利申请公开号2011/0177156中描述的那些。在一些实施方案中,固醇的存在量可以为LNP的约5重量%至脂质纳米颗粒的约50重量%,或LNP的约10重量%至LNP的约25重量%。
LNP可以包含中性脂质。中性脂质可以包含在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的任何脂质种类。此类脂质包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱,二酰基磷脂酰乙醇胺,神经酰胺,鞘磷脂,二氢鞘磷脂,脑磷脂和脑苷脂。中性脂质的选择通常通过尤其考虑颗粒大小和所需的稳定性来指导。在一些实施方案中,中性脂质组分可以是具有两个酰基的脂质(例如,二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。
具有各种不同的链长和饱和度的酰基链基的脂质是可获得的,或者可以通过众所周知的技术分离或合成。在一些实施方案中,可以使用包含具有在C14至C22范围内的碳链长度的饱和脂肪酸的脂质。在另一组实施方案中,使用具有碳链长度在C14至C22范围内的单或二不饱和脂肪酸的脂质。另外,可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。示例性中性脂质包括但不限于1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-乙醇胺(DOPE),1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC),1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或任何相关的磷脂酰胆碱。中性脂质也可以由鞘磷脂,二氢鞘磷脂或具有其他头部基团(如丝氨酸和肌醇)的磷脂组成。
在一些实施方案中,中性脂质的存在量可以为脂质纳米颗粒的约0.1重量%至LNP的约75重量%,或LNP的约5重量%至LNP的约15重量%。
LNP包封的核酸、表达盒和AAV载体可以掺入药物组合物中,例如药学上可接受的载体或赋形剂。这样的药物组合物尤其可用于体内或间接体内向受试者施用和递送LNP包封的核酸、表达盒和AAV载体。
LNP的制剂可以与其他组分组合。非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)和固醇。
术语“PEG”是指聚乙二醇,是具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的线性水溶性聚合物。PEG按其分子量分类。例如,PEG 2000的平均分子量为约2,000道尔顿,而PEG 5000的平均分子量为约5,000道尔顿。PEG可从Sigma Chemical Co.和其他公司商购获得,例如包括以下功能性PEG:单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH),单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(MePEG-S),单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS),单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2),单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(monomethoxypolyethylene glycol-tresylate)(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
在一些实施方案中,PEG可以是平均分子量为约550至约10,000道尔顿的聚乙二醇,并且任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在一些实施方案中,PEG可以在末端羟基位置被甲基取代。在另一个优选的实施方案中,PEG的平均分子量可以是约750至约5,000道尔顿,或约1,000至约5,000道尔顿,或约1,500至约3,000道尔顿,或约2,000道尔顿或约750道尔顿。PEG可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在一些实施方案中,末端羟基可以被甲氧基或甲基取代。
PEG-修饰的脂质包括在美国专利号8,936,942和7,803,397中描述的PEG-二烷氧基丙基缀合物(PEG-DAA)。有用的PEG-修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)可具有多种“锚定”脂质部分以将PEG部分固定至脂质囊泡的表面。合适的PEG修饰的脂质的实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸,PEG-神经酰胺缀合物(例如,PEG-CerC14或PEG-CerC20)(其在美国专利号5,820,873中描述),PEG-修饰的二烷基胺和PEG-修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺。在一些实施方案中,PEG修饰的脂质可以是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在一些实施方案中,PEG的量可为LNP的约0.5重量%至LNP的约20重量%,或LNP的约5重量%至LNP的约15重量%。
此外,LNP可以是PEG修饰的和固醇修饰的LNP。与其他组分组合的LNP可以是相同或单独的LNP。换句话说,相同的LNP可以是PEG修饰的和固醇修饰的,或者,第一LNP可以是PEG修饰的,第二LNP可以是固醇修饰的。任选地,可以将第一和第二修饰的LNP结合。
在一些实施方案中,在包封之前,LNP的大小可以为约10nm至500nm,或约50nm至约200nm,或75nm至约125nm。在一些实施方案中,LNP包封的核酸、表达载体或AAV载体的大小可以为约10nm至500nm。
本发明的能够表达GAA序列的重组细胞可以用于递送或施用。
诸如小环和转座子之类的裸露DNA可用于施用或递送慢病毒载体。另外,基因编辑技术例如锌指核酸酶,大范围核酸酶,TALEN和CRISPR也可以用于递送本发明的编码序列。
糖原贮积病(GSD)是由于缺乏最终将糖原化合物转化为葡萄糖的酶所致。酶缺乏会导致组织中糖原的积累。在许多情况下,该缺陷会导致全身性后果,但在某些情况下,该缺陷仅限于特定组织。尽管某些GSD表现为特定的综合征,例如低血糖症的癫痫发作(hypoglycemic seizures)或心脏肥大,但大多数患者都会出现肌肉症状,例如无力和抽筋。
以下是GSD的非限制性示例:
0-糖原合成酶缺乏症;Ia-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏症(冯·吉尔克氏病(von Gierke'sdisease));II-酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病);III-脱支酶缺乏症(福布斯-科里病);IV-转葡萄糖苷酶缺乏症(安德森病,支链淀粉病);V-肌磷酸化酶缺乏症(麦卡德尔病(McArdledisease));VI-磷酸化酶缺乏症(赫尔氏病);VII-磷酸果糖激酶缺乏症(塔瑞氏病(Taruidisease))。
GSD的各种形式影响碳水化合物代谢途径。尽管在文献中讨论了至少14种独特的GSD,但引起临床上明显的肌肉无力的4种是庞贝氏病(II型GSD,酸性麦芽糖酶缺乏症),科里病(Cori disease)(IIIa型GSD,脱支酶缺乏症),麦卡德尔病(V型GSD),肌磷酸化酶缺乏症)和塔瑞氏病(VII型GSD,磷酸果糖激酶缺乏症)。一种形式是冯·吉尔克氏病(Ia型GSD,葡萄糖-6-磷酸酶缺乏症),引起临床上显著的终末器官疾病,发病率很高。
通常,GSD是常染色体隐性遗传病。这些遗传的酶缺陷通常存在于儿童期,尽管有些缺陷(例如麦卡德尔病和庞贝氏病)有单独的成年发作形式。
可以通过酶替代疗法(ERT),例如用重组产生的GAA来治疗GSD。酶替代疗法是针对所有庞贝氏病患者的公认疗法。它涉及静脉内施用重组人酸性α-葡萄糖苷酶。这种治疗方法由赛诺菲公司Genzyme生产,是Lumizyme(在美国以外的市场以商品名Myozyme销售),并于2006年首次获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准。已被批准用于所有患有庞贝氏病的患者。ERT的优势可能会因抗体的形成而减弱,因此ERT也可以与免疫表达结合。
可以通过饮食疗法来治疗GSD,其包括严格遵守饮食方案,可以减小肝脏大小,防止低血糖症,允许症状减少以及允许生长和发育。
庞贝氏病的其他治疗是对症的和支持性的。可能需要呼吸支持,因为大多数患者都有一定程度的呼吸困难和/或呼吸衰竭。物理疗法可能有助于增强呼吸肌。一些患者可能需要在夜间和/或白天通过机械通气(即双水平气道正压通气呼吸机或容量呼吸机)进行呼吸辅助。此外,在呼吸道感染期间可能需要额外的支持。机械通气支持可以通过非侵入性或侵入性技术进行。家庭最好根据患者的具体情况,与患者的医生和医疗团队的其他成员仔细协商,以决定呼吸支持的持续时间。高蛋白饮食对庞贝氏病的非婴儿形式可能有益。
建议物理疗法以提高强度和身体能力。可能需要进行职业疗法,包括使用拐杖或助行器。最终,某些人可能需要使用轮椅。言语疗法可能有助于改善某些患者的发音和言语。
对于一些患者,可以推荐包括矫正器的骨科用器械。对于某些骨科症状,例如挛缩或脊柱畸形,可能需要手术。
由于庞贝氏病会削弱用于咀嚼和吞咽的肌肉,因此可能需要采取措施以确保适当的营养和体重增加。一些患者可能需要专门的高热量饮食,并且可能需要学习改变食物大小和质地以降低误吸风险的技术。一些婴儿可能需要插入一条穿过鼻子、沿食道向下并进入胃的饲管(鼻胃管)。在某些儿童中,可能需要通过在腹壁的小手术开口将饲管直接插入胃中。一些晚发型庞贝氏病患者可能需要软食,但很少有人需要饲管。
可以测试受试者的一种或多种肝酶对治疗的不良反应,或确定这种受试者(预处理)是否适合根据本发明的方法进行治疗。因此,可以根据本发明的方法在治疗之前或之后针对候选受试者筛选一种或多种肝酶的量。可以在治疗后定期(例如,每1-4周,1-6个月,6-12个月或1、2、3、4、5或更多年)对被治疗的受试者的升高的肝酶水平进行监测。
示例性的肝酶包括丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH),但是也可以监测其他指示肝损伤的酶。这些酶在循环中的正常水平通常被定义为具有较高水平的范围,高于该水平则认为该酶水平升高,因此指示肝损伤。正常范围部分取决于进行检测的临床实验室使用的标准。
本发明提供了在其中具有包装材料和一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页,该标签或包装插页包括组分的描述或其中的组分在体外、体内或间接体内使用的说明。试剂盒可包含此类组分的集合,例如rAAV颗粒和任选的第二活性物质,例如另一种化合物、药剂、药物或组合物。
试剂盒是指容纳试剂盒的一或多个组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分,并且可以由通常用于这种目的的材料(例如,纸,波纹纤维,玻璃,塑料,箔,安瓿,小瓶,管等)制成。
标签或插页可包括在其中的一种或多种组分的识别信息,剂量,有效成分的临床药理,包括作用机理、药代动力学和药效学。标签或插页可以包含标识制造商,批号,制造地点和日期,有效期的信息。标签或插页可包含标识制造商信息,批号,制造商位置和日期的信息。标签或插页可包含有关可能使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插页可包括针对临床医生或受试者在方法、用途或治疗方案或用药方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明。说明可以包括剂量,频率或持续时间,以及用于实施本文所述的任何方法、用途、治疗方案或预防或用药方案的说明。
标签或插页可包括有关组分可提供的任何益处(例如预防或治疗益处)的信息。标签或插页可以包括有关潜在的不良副作用,并发症或反应的信息,例如警告受试者或临床医生不适合使用特定组合物的情况。当受试者已经、将要或正在服用一种或多种可能与组合物不相容的其他药物时,或者受试者已经、将要或正在接受另一种与组合物不相容的治疗方案或用药方案时,也可能发生不良副作用或并发症,因此,说明中可能包含有关此类不相容的信息。
标签或插页包括“印刷品”,例如纸或纸板,或单独或附着于部件,试剂盒或包装材料(例如盒子),或附于包含试剂盒组分的安瓿、管或小瓶。标签或插页可以另外包括计算机可读介质,例如条形码打印的标签,磁盘,光盘(例如CD-或DVD-ROM/RAM),DVD,MP3,磁带或电存储介质,例如RAM和ROM,或它们的混合体,例如磁/光存储介质,FLASH介质或存储类型卡。
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中,但是本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有专利,专利申请,出版物和其他参考文献,GenBank引用和ATCC引用均通过引用整体并入本文。如有冲突,以说明书(包括定义)为准。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此,除非另有明确说明,否则公开的特征(例如,编码GAA的修饰核酸,包含编码GAA的修饰核酸的表达盒和包含编码GAA的修饰核酸的rAAV颗粒)是等同或相似特征的属的实例。
如本文所使用的,单数形式的“一个”,“和”和“该”包括复数对象,除非上下文另外明确指出。因此,例如,提及“一种核酸”包括多种这样的核酸,提及“一种载体”包括多种这样的载体,并且提及“一种病毒”或“颗粒”包括多种这样的病毒/颗粒。
如本文所使用的,除非上下文另外明确指出,否则所有数值或数值范围包括在这样的范围内的整数和范围内的数值或整数的小数。因此,举例来说,提及86%或更高的同一性包括86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%等,以及86.1%、86.2%、86.3%、86.4%、86.5%等,87.1%、88.2%、88.3%、88.4%、88.5%等等。
对大于(高于)或小于一整数的引用分别包括大于或小于该参考数字的任何数字。因此,例如,对小于127的引用包括126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110等,一直减小到零(0);以及小于10,包括9、8、7等,一直减小到零(0)。
如本文所使用的,除非上下文另有明确指示,否则所有数值或范围都包括子范围以及在该范围和子范围内的数值和整数的分数以及这些范围内的整数的小数。因此,举例而言,引用的数字范围,例如1-10,包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10等;和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等,依此类推。因此,提及1-50的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等,最高且包括50,以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等,2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等,依此类推。
对一系列范围的引用包括组合该系列内不同范围的边界的值的范围。因此,为了说明对一系列范围的引用,例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850,包括范围1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等。
本文一般使用肯定性语言来描述众多实施方案和方面以公开本发明。本发明还具体包括其中全部或部分地排除特定主题的实施方案,例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。例如,在本发明的某些实施方案或方面中,不包括材料和/或方法步骤。因此,即使本发明在本文中通常并未就本发明不包括的内容进行表述,但是本文中仍公开了本发明中未明确排除的方面。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此,以下实施例旨在以任何方式说明而非限制所要求保护的本发明的范围。
实施例1
表1-GAA表达盒概述
*SPK-AAV-10包装在AAV6衣壳中,所有其他的包装在AAV-4-1衣壳变体中,如国际专利申请公布号WO 2016/210170中所述。
GAA表达盒如图1至9所示。它们均包含5'和3'侧翼AAV反向末端重复序列(ITR),可操作地连接至优化的GAA编码序列的肝脏特异性ApoE/hAAT增强子/启动子序列,包括人类血红蛋白亚基β(HBB2)内含子,然后是野生型或CpG减少的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化(poly A)序列。
SEQ ID NO:1:GAA2的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAGGAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTACTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATAGGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGAAGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTGGACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCTGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
SEQ ID NO:2:GAA5的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
SEQ ID NO:3:GAA7的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
SEQ ID NO:4:GAA8的核酸序列
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGA
SEQ ID NO:5:GAA13的核酸序列
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
SEQ ID NO:6:GAA2+WT BGH poly A的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAGGAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTACTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATAGGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGAAGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTGGACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCTGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
SEQ ID NO:7:GAA5+WT BGH poly A的核酸序列
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SEQ ID NO:8:GAA7+WT BGH poly A的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
SEQ ID NO:9:GAA8+WT BGH poly A的核酸序列
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
SEQ ID NO:10:GAA13+WT BGH poly A的核酸序列
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
SEQ ID NO:11:GAA2+CpG-减少的BGH poly A的核酸序列
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SEQ ID NO:12:GAA5+CpG-减少的BGH poly A的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:13:GAA7+CpG-减少的BGH poly A的核酸序列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:14:GAA8+CpG-减少的BGH poly A的核酸序列
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:15:GAA13+CpG-减少的BGH poly A的核酸序列
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CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
>pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH(SEQ ID NO:23)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
>pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH(SEQ ID NO:24)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO:25:可分泌GAA蛋白的氨基酸序列
MAFLWLLSCWALLGTTFGLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
SEQ ID NO:26:CpG减少的BGH poly A核酸序列
AGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:27:wtBGH poly A核酸序列
AGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
SEQ ID NO:28:ApoE/hAAT序列,以ApaI限制性酶切位点为边界(带下划线).
GGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCC
SEQ ID NO:29:ApoE/hAAT序列.
ATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACA
AAV载体衣壳:
VP1(SEQ ID NO:30)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
VP2(SEQ ID NO:31)
TAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
VP3(SEQ ID NO:32)
MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
LK03-AAV VP1(SEQ ID NO:33)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
实施例2
研究设计–体外效力(Huh7细胞)
为了评估GAA表达盒的效力,使用2000(ThermoFisher)将对应于每个盒的200ng质粒DNA转染到人肝癌细胞系(Huh7)中。孵育48小时后,通过GAA活性测定法评估来自用带有每个表达盒的质粒转染的细胞的培养基样品的GAA水平,并相对于细胞内蛋白质含量标准化。
结果
图10显示了通过GAA活性测定法在Huh7细胞中体外评估不同GAA表达质粒。结果是生物学重复(n=3)的平均值。误差棒代表标准偏差。
除了GAA5.wtBGH以外,与绿色荧光蛋白(GFP)对照质粒相比,所有质粒均显示分泌的GAA的表达水平增加,表明这些质粒导致GAA蛋白产物的表达(图10)。通常,“BGH”质粒(带有CpG减少的poly A序列)优于“wtBGH”质粒(带有野生型bGH poly A)。另外,密码子优化的序列GAA2,GAA7,GAA 8和GAA13似乎相对相似,具有从GAA13质粒表达更高的趋势。与亲本spΔGAApar质粒相比,观察到表达水平总体下降。
实施例3
研究设计–小鼠流体动力学注射(Hydrodynamic injection)的盒效力
为了评估不同的GAA表达盒在哺乳动物中的效力,通过流体动力学注射将25微克与每个盒相对应的质粒DNA静脉注射引入雄性C57BL/6小鼠(约8周龄)侧尾静脉内。注射后72小时收集血浆,并通过GAA活性测定和蛋白质印迹法评估循环中GAA酶的存在。
结果
图11和图12分别显示了通过血浆中的GAA活性测定和蛋白质印迹法通过在雄性C57BL/6小鼠中流体动力学注射来评价不同的GAA表达盒。对于图11,将GAA的血浆水平标准化到亲本构建体(spΔGAApar)。结果是生物学重复(n=4-5)的平均值。误差棒代表标准偏差。NS,不显著。*p<0.05,**p<0.01。
对于图12,血浆的GAA蛋白质免疫印迹分析,条形图表示标准化至底部非特异性条带的上部条带的量化。显示了每个生物学重复(每组n=4-5)。
对通过流体动力学注射的小鼠中密码子优化的GAA表达盒的评价,揭示这些盒能够从小鼠肝脏表达和分泌GAA转基因产物,其水平与亲本GAA构建体spΔGAApar观察到的水平相似(图11)。与在Huh7细胞中进行的体外研究一样(实施例2),带有CpG减少的BGH polyA序列的GAA表达盒优于野生型BGH poly A的表达盒。出乎意料的是,与实施例2的结果相比,一些密码子优化的GAA构建体的性能与亲本spΔGAApar质粒相同或比其更好。
实施例4
研究设计–小鼠中的载体效力
为了评估相比于亲本盒spΔGAApar,本发明的密码子优化的GAA盒的效力,将spΔGAApar和9个密码子优化的盒包装到包含SEQ ID NO:30-32衣壳的AAV载体中(表1)。每组五只雄性C57BL/6小鼠以2种载体剂量(5×1011vg/kg或2×1012vg/kg)之一经尾静脉静脉注射。在向小鼠施用AAV载体后,纵向测量了循环GAA活性。每两周检测一次血浆的GAA活性。在第70天,处死10组测试动物组中的7组,在第147天处死剩余三组(SPK-AAV-01,SPK-AAV-02和亲本载体)。
结果
图13显示了在载体输注后70天通过血浆中的GAA活性测定对雄性C57BL/6小鼠中包装入AAV(SEQ ID NO:30-32)载体中的不同密码子优化的GAA表达盒的评估。结果是生物学重复(n=4-5)的平均值。误差棒代表标准偏差。NS,不显著。*p<0.05,**p<0.01。
与亲本载体(本文指定为SPK-AAV-11)相比,两种载体SPK-AAV-01和SPK-AAV-02始终显示出血浆中GAA活性显著较高(高剂量时约高2至3倍)。
图14显示了在载体输注后7天通过GAA蛋白质印迹法对雄性C57BL/6小鼠中包装入AAV(SEQ ID NO:30-32)载体中的不同密码子优化的GAA表达盒的评估。结果是生物学重复(n=4-5)的平均值。误差棒代表标准偏差。NS,不显著。*p<0.05,**p<0.01。
图15显示了对小鼠施用包装入AAV(SEQ ID NO:30-32)载体中的密码子优化的GAA表达盒后在血浆中测量的GAA活性水平。雄性C57BL/6小鼠注射了5×1011(上图)或2×1012vg/kg(下图)剂量的两种表现最佳的表达GAA的AAV(SEQ ID NO:30-32)载体之一(n=5只动物/组)。为了比较,显示了在接受SPK-AAV-11载体(亲本spΔGAApar构建体)的小鼠的血浆中测量的GAA活性。从第42天开始,SPK-AAV-01和SPK-AAV-02载体的血浆GAA活性显著高于SPK-AAV-11载体(***p=<0.001,****p=<0.0001Tukey多重比较检验)。
实施例5
研究设计–大鼠中的效力
这项研究的目的是评估SPK-AAV-02在两种不同大鼠品系中的效力。在向WistarHanover大鼠(n=4)和Sprague Dawley大鼠(n=5)施用载体后,测定血浆中的循环GAA活性。通过尾静脉向雄性大鼠静脉内注射2×1013vg/kg的载体。
结果
图16显示了与C57BL/6小鼠相比,通过血浆GAA活性测定在雄性Wistar Hanover大鼠和Sprague Dawley大鼠中对SPK-AAV-02(pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH包装到AAV(SEQ IDNO:30-32)中)载体的评估。结果是生物学重复(n=4-5)的平均值。误差棒代表标准偏差。
GAA活性水平在第28天开始达到平稳,GAA活性测量为约15,000nmol/hr/mL。用为大鼠的剂量的十分之一(2×1012vg/kg载体)的SPK-AAV-02注射小鼠。
实施例6
研究设计–非人类灵长类动物(NHP)中的效力,第1部分
为了评估可分泌GAA表达的长期影响,将单剂量的SPK-AAV-01、SPK-AAV-02或SPK-AAV-10载体施用给在系统发育上接近人类的物种,恒河猕猴(Macaca mulatta),且评估了动物的血浆中GAA活性水平。
向雄性恒河猕猴(n=3/剂量组)隐静脉静脉输注30分钟单剂量6×1012vg/kg的SPK-AAV-01、SPK-AAV-02或SPK-AAV-10载体。施用AAV载体后,每天对动物进行监测以进行临床观察,并每周采集血液。
结果
向恒河猕猴注射了剂量为6×1012vg/kg的表达GAA的AAV(SEQ ID NO:30-32)载体(n=3只动物/组)。图17显示了将包装入AAV(SEQ ID NO:30-32)载体中的GAA表达盒施用于雄性恒河猕猴后在血浆中测得的GAA活性水平。SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10载体注射的NHP的血浆GAA活性水平之间未观察到显著差异。
NHP研究中的初步数据证实了在小鼠研究中观察到的结果,并且表明由施用SPK-AAV-01和SPK-AAV-02产生的血浆GAA活性水平是相似的(图17)。
实施例7
研究设计–非人类灵长类动物中的效力,第2部分
这项研究的主要目的是评估SPK-AAV-01和SPK-AAV-02在非洲绿猴(AGM;Chlorocebus sabaeus)中的转导特性。向雄性AGM(n=4/剂量组)隐静脉静脉输注30分钟单剂量6×1012vg/kg的SPK-AAV-01或SPK-AAV-02载体。施用AAV载体后,每天对动物进行监测以进行临床观察,并每周采集血液。
结果
非洲绿猴中的初步数据证实了在小鼠研究中观察到的结果,即施用SPK-AAV-01和SPK-AAV-02导致的血浆GAA活性水平是相似的(图18)。
实施例8
结论
表达可分泌的人GAA的密码子优化的GAA盒代表相对于亲本spΔGAApar构建体的显著改善。特别是,SPK-AAV-01和SPK-AAV-02在细胞培养、啮齿动物和两种非人灵长类动物模型中均表现出可分泌人GAA的出色的效力和表达。
实施例9
研究设计–NHP中的剂量范围
为了评估可分泌的GAA表达的剂量反应,对系统发育接近人类的灵长类动物,恒河猕猴(Macaca mulatta),施用了三剂量SPK-AAV-02载体,并在一个月的时间内评估动物的GAA活性水平。
向雄性恒河猕猴(n=4/剂量组)隐静脉静脉内(IV)输注30分钟剂量为2×1012、6×1012、2×1013vg/kg中的任一个的SPK-AAV-02载体。向雌性恒河猕猴(n=4/剂量组)隐静脉静脉输注30分钟的剂量为2×1013vg/kg的SPK-AAV-02载体。施用AAV载体后,每天对动物进行监测以进行临床观察。每周采集血液,持续4周,以测量GAA活性,GAA抗原水平,抗GAA IgG的形成,血液学和临床化学,包括葡萄糖水平以监测血糖的潜在变化。
结果
图21显示了在向雄性和雌性恒河猕猴施用SPK-AAV-02载体后,血浆中测得的GAA活性水平。载体注射后第7、14、21和28天在血浆中测得的GAA活性结果表明,载体剂量与血浆GAA活性水平之间存在相关性。以2×1013vg/kg剂量注射的雌性NHP血浆中GAA活性水平是以相同剂量注射的雄性NHP中所测量的水平的约二分之一(49.6%)。
该NHP研究中的数据证实了在小鼠研究中观察到的结果,即,从AAV载体获得的可分泌GAA表达的血浆GAA活性水平导致了载体给药后血浆中的剂量依赖性GAA活性(图21)。在NHP中以三个递增剂量单次输注SPK-AAV-02证明了NHP血浆中GAA的剂量依赖性表达。
实施例10
九个月NHP研究
SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10中的每一种以单剂量(6×1012vg/kg)通过静脉内输注给雄性恒河猕猴(Macaca mulatta)。在研究过程中,在部分使用可分泌GAA表达载体给药的动物中观察到血浆中活性GAA蛋白降低,抗GAA IgG抗体水平随之升高。血浆中GAA活性和抗原水平的损失可能是由于人转基因蛋白产品的IgG介导的体液免疫清除的发展所致。为了降低体液免疫应答并可能恢复到可检测的循环GAA酶水平,从第183天开始,一些动物接受了每月一次利妥昔单抗联合每日环孢素A的免疫抑制方案。
结果
在所有动物中检测到血浆中分泌的和活性的GAA水平,对于SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10,在第15天显示峰值平均活性水平分别为482.07±47.90、664.43±417.55和427.833±307.94nmol/mL/hr。对于施用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10的动物,分别观察到可检测水平的循环GAA抗原的平均峰值水平为14.84±2.21、19.11±23.23、14.64±16.96ng/mL。从第15天开始,与观察到的循环GAA减少同时,观察到循环抗GAA IgG水平增加。通过肝组织定量PCR对载体基因组进行分析,证实了肝脏中存在载体,对于施用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10的动物,展示了每个单倍体基因组的平均载体基因组拷贝数分别为6.39±2.72、11.43±4.23和19.01±13.93。
分析了肝脏样品的全长GAA和裂解的GAA(溶酶体形式)蛋白水平。将研究样品与作为阴性对照的未使用载体的恒河猕猴肝样品进行比较,在所加载的蛋白质的水平下,均未显示出可检测水平的裂解或完整的GAA(n=3)。在分别施用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10的动物中,受试动物肝脏中全长蛋白的量分别为4.0±7.0、5.4±9.1、11.0±11.3ngGAA/mg总蛋白。在分别施用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10的动物中,每组的裂解GAA含量均高于全长GAA,分别为41.6±57.6、44.4±74.5、49.0±40.3ng GAA/mg总蛋白。不管GAA加工如何,组之间的差异均不显著(全长(完整)形式的P=0.72;溶酶体(裂解的)形式的P=0.83(通过Kruskal-Wallis))。在终点,所有施用本发明的AAV载体的组在肝脏中显示出高于基线的平均可检测水平的GAA。
结论
分别施用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02和SPK-AAV-10导致可检测和增加的血浆GAA抗原水平,在2-3周达到峰值,并与GAA活性线性相关,表现出相似的动力学,而与载体基因组无关。在以下时间点上,除一只动物外,所有动物的血浆GAA活性和GAA抗原水平都连续下降。如先前在用AAV载体处理的NHP中观察到的,从第43天开始观察到对人转基因产物的体液反应,这与所有产生GAA特异性IgG反应的动物的血浆中的GAA抗原水平呈负相关。通过给予靶向B细胞介导的IgG应答的免疫抑制剂(利妥昔单抗),抗GAA IgG水平的降低导致了一部分动物的血浆中可检测GAA水平的恢复。对于所有组,即使在没有可测量的GAA循环血浆水平的情况下,在研究结束时在肝脏中均可检测到载体基因组拷贝。相应地,在研究结束时,在用载体处理的所有肝组织中均检测到GAA蛋白,而未处理过的肝组织中的GAA抗原低于检测限。综上所述,这些结果表明,本发明的AAV载体能够在9个月内介导肝脏中可分泌的人GAA的持久表达,而不管对人转基因产物的抗体应答的发展如何。
实施例11
九周啮齿动物免疫抑制研究
在存在或不存在雷帕霉素和/或泼尼松龙的情况下,在雄性和雌性C57BL/6小鼠中静脉内施用单剂量的2×1012vg/kg SPK-AAV-02颗粒后九周内,测量GAA转基因产物的表达水平。如表2所示,将小鼠分为5组测试。
表2–组名称和剂量水平
vg=载体基因组,X=所施用的处理
*雷帕霉素从第(-)7天到第5天每天以2mg/kg的剂量递送,从第6天开始,更改为每隔一天3mg/kg。
**泼尼松龙从第(-)1天到第15天以1mg/kg浓度递送,从第16天到第22天为0.5mg/kg,从第23天到第28天为0.25mg/kg。
在接受免疫抑制剂的组中,在给予AAV颗粒之前以及该研究的前5周中,施用免疫抑制剂。在完成AAV给药后,对动物进行9周的临床观察和体重监测。在研究结束时,对血液样本进行临床化学和血液学检查,并对选定的组织进行组织病理学检查。在整个研究过程中,每周评估针对rAAV衣壳的IgG抗体和血浆GAA活性。
结果
在所有施用载体的动物中,检测到血浆中GAA活性水平在背景以上。第1组中施用溶媒的雄性动物的背景水平约为300-400nmol/mL/hr。施用载体后,GAA活性的循环水平升高,取决于免疫抑制处理组的动力学略有不同,但显示出等效的GAA活性的平均峰值水平。特别是,在第2组(仅SPK-AAV-02)、第3组(SPK-AAV-02,2-3mg/kg雷帕霉素)、第4组(SPK-AAV-02,1-0.25mg/kg泼尼松龙)和第5组(SPK-AAV-02,2-3mg/kg雷帕霉素,1-0.25mg/kg泼尼松龙)中雄性的GAA活性的峰值平均水平分别为16114±5411、14875±6882、14890±6882和21480±6340nmol/mL/hr。在任何AAV处理组之间,GAA活性峰值水平未观察到统计学上的显著差异。
在雌性小鼠中,第2组、第3组、第4组和第5组的GAA活性峰值平均水平分别为7380±4034、5912±3259、6096±3249和9955±3104nmol/mL/hr。这些GAA活性的水平显著高于在施用溶媒的雌性动物中检测到的背景水平。如雄性小鼠中所见,雌性小鼠中GAA活性的峰值水平在任何AAV处理组之间均无统计学显著差异。在雄性和雌性之间观察到的血浆GAA活性水平的差异与雌性小鼠肝细胞AAV转导减少的有据可查的现象是一致的(Davidoff等人,2003,Blood,102:480-488;DOI:10.1182/blood-2002-09-2889)。
在所有施用SPK-AAV-02的动物中均检测到血浆中的抗rAAV衣壳IgG,表现为在第2组、第3组、第4组和第5组雄性动物中的平均峰值水平分别为86527±92140、6695±3555、64368±29635和11374±6053ng/mL,在第2组、第3组、第4组和第5组雌性动物中的平均峰值水平分别为182009±148148、66141±77925、182654±90161和57752±59192ng/ml。第1组(溶媒)的雄性和雌性的抗rAAV衣壳IgG水平均低于所有时间点测定的定量界限。
结论
SPK-AAV-02的施用导致在所有动物中可检测到的GAA活性水平。与雷帕霉素和泼尼松龙的联合治疗在雄性小鼠中在第22、36和42天以及在雌性动物中在第43天导致GAA活性水平在统计学上增加(相比于单独的rAAV载体)。值得注意的是,无论何时达到最大表达,GAA活性峰值水平的差异在不同性别的任何AAV处理组之间均无统计学意义。
在所有施用SPK-AAV-02的组中观察到针对rAAV衣壳的体液IgG应答。与单独的载体相比,在雄性和雌性中,雷帕霉素的存在(第3组和第5组)均显著降低了抗衣壳IgG的形成。泼尼松龙的处理对抗衣壳IgG的形成影响较温和,在第4组中,雄性在第15、43和60天显著降低,雌性在第43和60天显著降低。
在小鼠中用雷帕霉素和/或泼尼松龙的免疫抑制导致对rAAV衣壳的体液应答降低,并且不显著影响血浆中GAA活性的峰值水平。
实施例12
与NHP中与雷帕霉素联合施用的4周单剂量
该研究评估了在三只雄性非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)中,在雷帕霉素存在下施用5.5×1013vg/kg的单剂量SPK-AAV-02后四周内的循环GAA活性(血浆中GAA活性水平)。
在AAV给药前5天开始给动物施用雷帕霉素(每天2mg/kg),并在整个四周的研究中持续进行。通过隐静脉静脉内施用单剂量5.5×1013vg/kg SPK-AAV-02。完成AAV给药后,对动物进行4周的临床观察和体重监测。在研究结束时,对血液样本进行了临床化学和血液学检查,并对选定的组织进行了组织病理学检查。在整个研究过程中每周测量血浆GAA活性。
结果
施用SPK-AAV-02后,所有动物的血浆GAA活性水平均高于背景,在测量的最终点,三只动物中的每只的峰值活性水平分别达到1158.1、711.9和623.8nmol/mL/hr(表3)。
表3–施用雷帕霉素的个体NHP的血浆GAA活性。
结论
SPK-AAV-02的施用导致在所有三只NHP中可检测的血浆GAA活性。SPK-AAV-02和雷帕霉素的组合具有良好的耐受性,并且在所有测试测量中均具有良好的安全性。
实施例13
Gaa-/-小鼠庞贝氏病模型中的治疗功效
对以三个剂量(1.25×1011、5×1011和2×1012vg/kg)施用SPK-AAV-02的4个月龄的Gaa-/-小鼠(已建立的庞贝氏病小鼠模型)进行10个月跟踪研究。该研究证明了:(1)循环GAA酶活性呈剂量依赖性增加;(2)肌肉力量显著改善;和(3)无明显的抗GAA体液免疫反应。
实施例14
方法
基于细胞的分析法测量编码可分泌的人GAA转基因的质粒的蛋白质表达效率
将Huh7细胞以每孔5×104个细胞在DMEM+10%FBS+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺中接种于48孔培养皿中过夜。使用2000将使用Plasmid Giga Kit(Qiagen)制备的质粒以每孔250ng转染到细胞中。将细胞在37摄氏度和5%CO2下保持48-72小时,收集上清液并在-80摄氏度下保存在低滞留的微量滴定板中,直到分析GAA活性为止。将上清液以1:10的比例稀释,并与3mM的荧光底物4-甲基伞形酮α-D-吡喃葡萄糖苷在37摄氏度下孵育1小时。1小时后用碳酸盐缓冲液(pH 10.5)终止反应,并与标准曲线进行比较。标准曲线是通过在终止缓冲液中稀释4-甲基伞形酮(4-MU)、创建一条从250pmol/μL开始并终止于0pmol/μL的12点标准曲线而生成的。在λex360nm;λem449nm处读取板。
流体动力学注射质粒DNA以评估编码可分泌的人GAA转基因的质粒的效力
使用质粒Giga试剂盒(Qiagen)制备的质粒在PBS180+0.001%Pluronic中稀释。通过流体动力学注射,将25微克对应于每个待测盒的质粒DNA静脉内引入大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠侧尾静脉中。注射后72小时,通过切开颌下静脉将全血收集到柠檬酸钠管中。丢弃第一滴血液,将200μL血液收集到柠檬酸钠中,倒置试管以避免溶血和凝结。将样品在10,000RMP的转速下于4摄氏度离心10分钟。将血浆等分到试管中,并保存在-80摄氏度的冰箱中,直到分析GAA活性为止。将血浆样品稀释至不同程度,并与3mM荧光底物4-甲基伞形酮α-D-吡喃葡萄糖苷在37摄氏度下孵育1小时。1小时后用碳酸盐缓冲液(pH 10.5)终止反应,并将其与标准曲线进行比较。标准曲线是通过在终止缓冲液中稀释4-MU、创建一条起始于250pmol/μL并终止于0pmol/μL的12点标准曲线而生成的。在λex360nm;λem449nm处读取板。
基于细胞的分析法测量编码可分泌的人类GAA转基因的AAV载体的效力
将Huh7细胞以每孔5×104个细胞接种于48孔培养皿中过夜。在Opti-MEMTM或DMEM+10%FBS+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺中以剂量曲线(感染复数,MOI,范围为2×106-1×104)制备来自储备载体的SPK-AAV-01和SPK-AAV-02。从Huh7细胞中除去现有的培养基,并用含病毒颗粒的培养基代替。将细胞在37摄氏度和5%CO2下保持72小时,并收集上清液,并在-80摄氏度的低滞留的微量滴定板中保存,直到分析GAA活性为止。将上清液以1:10的比例稀释,并与3mM的荧光底物4-甲基伞形酮α-D-吡喃葡萄糖苷在37摄氏度下孵育1小时。1小时后用碳酸盐缓冲液(pH 10.5)终止反应,并将其与标准曲线进行比较。标准曲线是通过在终止缓冲液中稀释4-MU、创建一条起始于250pmol/μL并终止于0pmol/μL的12点标准曲线而生成的。在λex360nm;λem449nm处读取板。
小鼠/大鼠血浆中的GAA活性测定
通过切开颌下静脉将全血收集到柠檬酸钠管中。丢弃第一滴血液,将200μL血液收集到柠檬酸钠中;试管倒置以避免溶血和凝结。将样品在4摄氏度以10,000rpm的转速离心10分钟。将血浆等分到试管中,并保存在-80摄氏度的冰箱中,直到分析GAA活性为止。将血浆样品稀释至不同程度,并与3mM荧光底物4-甲基伞形酮α-D-吡喃葡萄糖苷在37摄氏度下孵育1小时。1小时后用碳酸盐缓冲液(pH 10.5)终止反应,并与标准曲线进行比较。标准曲线是通过在终止缓冲液中稀释4-MU、创建一条起始于250pmol/μL并终止于0pmol/μL的12点标准曲线而生成的。在λex360nm;λem449nm处读取板。
NHP(恒河猕猴/AGM)血浆中的GAA活性测定
通过隐静脉静脉内注射雄性恒河猕猴/非洲绿猴,并将全血收集到柠檬酸钠管中,将管倒置以避免溶血和凝结。将样品在10,000RMP下于4摄氏度离心10分钟。将血浆等分到试管中,并保存在-80摄氏度的冰箱中,直到分析GAA活性为止。将血浆样品稀释至不同程度,并与3mM荧光底物4-甲基伞形酮α-D-吡喃葡萄糖苷在37摄氏度下孵育1小时。1小时后用碳酸盐缓冲液(pH 10.5)终止反应,并将其与标准曲线进行比较。标准曲线是通过在终止缓冲液中稀释4-MU、创建一条起始于250pmol/μL并终止于0pmol/μL的12点标准曲线或11点标准曲线(5μM/mL-0.49nM/mL)而生成的。在λex360nm;λem449nm处读取该板。从4-MU标准曲线内插(interpolated)测试样品的GAA活性,并表示为速度(纳摩尔/毫升/小时(nmol/mL/hr))。
蛋白质免疫印迹法评估Huh7上清液中GAA的蛋白水平
将Huh7细胞以每孔5×104个细胞接种于48孔培养皿中过夜。在Opti-MEMTM或DMEM+10%FBS+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺中以剂量曲线(感染复数,MOI,范围为2×106-1×104)制备来自储备载体的SPK-AAV-01和SPK-AAV-02。从Huh7细胞中除去现有的培养基,并用含病毒颗粒的培养基代替。将细胞在37摄氏度和5%CO2下保持72小时,并收集上清液,并在-80摄氏度下保存在低滞留的微量滴定板中,直到测定GAA蛋白水平为止。将上清液按1:20的比例用RIPA缓冲液稀释,在95摄氏度下孵育5分钟,然后在4-12%Bis-Tris NuPage凝胶上用MOPS电泳缓冲液运行。使用系统(ThermoFisher)将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上,并在室温下在TBS缓冲液中封闭1小时。将膜与一抗(以1:1000稀释的兔抗人GAA(Abcam))在4摄氏度孵育过夜。洗涤膜,并在室温下与以1:10000稀释的荧光二抗兔抗体孵育2小时。洗涤膜并使用Li-成像系统成像。将条带与10ng和标记物进行比较。使用Li-软件进行光密度分析,并将条带标准化为对照。
蛋白质免疫印迹法评估小鼠血浆中GAA的蛋白水平
雄性和雌性C57BL/6小鼠通过尾静脉静脉注射,并通过切开颌下静脉将全血收集到柠檬酸钠管中。丢弃第一滴血液,将200μL血液收集到柠檬酸钠中;试管倒置以避免溶血和凝结。将样品在10000RMP下于4摄氏度离心10分钟。将血浆等分到试管中,并保存在-80摄氏度的冰箱中,直到分析GAA蛋白水平。将血浆按1:20的比例用RIPA缓冲液稀释,在95摄氏度下孵育5分钟,然后在4-12%Bis-Tris NuPage凝胶上使用MOPS电泳缓冲液运行。使用系统(ThermoFisher)将蛋白转移到pvdf膜上,并在室温下在TBS缓冲液中封闭1小时。将膜与一抗(以1:1000稀释的兔抗人GAA(Abcam))在4摄氏度孵育过夜。洗涤膜,并在室温下与以1:10000稀释的荧光二抗兔抗体孵育2小时。洗涤膜并使用Li-成像系统成像。将条带与10ng和标记物进行比较。使用Li-软件进行光密度分析,并将条带标准化为对照。
WES评估NHP血浆中GAA的蛋白水平
通过隐静脉静脉内注射雄性恒河猕猴/非洲绿猴,并将全血收集到柠檬酸钠管中,将管倒置以避免溶血和凝结。将样品在4摄氏度以10000rpm的转速离心10分钟。将血浆等分到试管中,并保存在-80摄氏度的冰箱中,直到分析GAA蛋白水平。将血浆样品在样品稀释液中以1:6000的比例稀释。将8个点、两倍的标准曲线添加到具有起始浓度为50ng/mL的的每个芯片中。将样品在缓冲液中稀释,在95摄氏度下变性5分钟,然后加载到WESTM芯片(Protein Simple)中。以1:1000的稀释度添加一抗,并以工作稀释度加载二抗。芯片根据WESTM Protein Simple软件运行,分析所得条带,并将其与标准曲线进行比较,并标准化为非特异性第二条带。
抗AAV衣壳IgG抗体
用ELISA捕获测定法测量了抗AAV衣壳总IgG的形成。ELISA板孔用50μL的含有1μg/mL rAAV颗粒的溶液包被。稀释总人IgG(Southern Biotech,0150-01)以生成10点标准曲线,范围从10000ng/mL到0.5ng/mL,并添加到板中。反算后,测定的定量限为460ng/mL。制备了三个水平的质量控制样品,并将其包括在每个板上以评估测定性能。衣壳颗粒,标准品和质控品在4摄氏度下孵育过夜。洗涤后,在室温下用在PBS中的2%BSA、0.05%Tween-20封闭孔2小时。将样品在封闭缓冲液中的系列稀释液加载到板上,并在室温下孵育2小时。将以1:5000在封闭缓冲液中稀释的HRP偶联的绵羊抗人IgG抗体(GE Healthcare,NA933V)用作检测抗体,并在板上于室温下孵育1小时。洗涤后,在室温下与3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(TMB)孵育10分钟,过氧化物酶活性得以增强。用1M硫酸终止反应,并通过吸光度板读数器读取板在450nm处的光密度(OD)。对照由纯化的人总IgG的连续稀释液制成的标准曲线确定IgG浓度。
Claims (88)
1.编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸,其中所述核酸与选自由如SEQ ID NO:1-5所示的任何序列组成的组的序列具有大于86%的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的核酸,其中所述核酸与选自由如SEQ ID NO:1-5所示的任何序列组成的组的序列具有大于87%的序列同一性。
3.编码GAA的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于87%的序列同一性。
4.根据权利要求3所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于88%的序列同一性。
5.根据权利要求3所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于89%的序列同一性。
6.根据权利要求3所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于90%的序列同一性。
7.根据权利要求3所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于91%的序列同一性。
8.编码GAA的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:16-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于91%的序列同一性。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含少于127个CpG二核苷酸。
10.编码GAA的核酸,其中所述核酸包含少于127个CpG二核苷酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含少于126个CpG二核苷酸。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约126-120个CpG二核苷酸。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约120-110个CpG二核苷酸。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约110-100CpG二核苷酸。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约100-90个CpG二核苷酸。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约90-80个CpG二核苷酸。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约80-70个CpG二核苷酸。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约70-60个CpG二核苷酸。
19.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约60-50个CpG二核苷酸。
20.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约50-40个CpG二核苷酸。
21.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约40-30CpG二核苷酸。
22.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约30-20个CpG二核苷酸。
23.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含少于20个CpG二核苷酸。
24.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中,所述核酸包含约20-10个CpG二核苷酸。
25.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含少于10个CpG二核苷酸。
26.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含约10-5个CpG二核苷酸。
27.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含5个CpG二核苷酸。
28.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含4个CpG二核苷酸。
29.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含3个CpG二核苷酸。
30.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含2个CpG二核苷酸。
31.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含1个CpG二核苷酸。
32.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸,其中所述核酸包含0个CpG二核苷酸。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于92%的序列同一性。
34.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于93%的序列同一性。
35.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于94%的序列同一性。
36.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于95%的序列同一性。
37.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于96%的序列同一性。
38.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于97%的序列同一性。
39.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于98%的序列同一性。
40.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于99%的序列同一性。
41.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸,其中所述核酸与选自由SEQ ID NO:1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于99.5%的序列同一性。
42.编码GAA的核酸,其选自由SEQ ID NO:1-24组成的组。
43.表达盒,其包含与表达控制元件可操作连接的根据权利要求1-7和9-42中任一项所述的核酸。
44.根据权利要求43所述的表达盒,其中所述表达控制元件位于所述核酸的5'末端。
45.根据权利要求44所述的表达盒,其进一步包含位于所述核酸的3'末端的聚腺苷酸化序列。
46.根据权利要求44或45所述的表达盒,其中,与野生型表达控制元件或聚腺苷酸化序列相比,所述表达控制元件或聚腺苷酸化序列的CpG减少。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的表达盒,其中,所述表达控制元件包含ApoE/hAAT增强子/启动子序列。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的表达盒,其中,所述聚腺苷酸化序列包括牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
49.根据权利要求47或48所述的表达盒,其中与野生型ApoE/hAAT增强子/启动子序列或bGH聚腺苷酸化序列相比,所述ApoE/hAAT增强子/启动子序列或bGH聚腺苷酸化序列的CpG减少。
50.根据权利要求49所述的表达盒,其中所述野生型bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ IDNO:27的序列。
51.根据权利要求49所述的表达盒,其中所述野生型ApoE/hAAT增强子/启动子序列包含SEQ ID NO:28或29的序列。
52.根据权利要求49所述的表达盒,其中所述CpG减少的bGH聚腺苷酸化序列包含SEQID NO:26的序列。
53.根据权利要求43-52中任一项所述的表达盒,其进一步包括位于在所述表达控制元件的3'端与所述核酸的5'端之间的内含子。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的核酸序列或表达盒,其中所述GAA包含如SEQ IDNO:25所示的序列。
55.腺病毒相关病毒(AAV)载体,其包含根据权利要求1至54中任一项所述的核酸或表达盒。
56.根据权利要求55所述的AAV载体,其中,所述AAV载体包括:
a)一个或多个AAV衣壳,和
b)一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR),其中所述AAV ITR位于所述核酸或所述表达盒的5'或3'末端侧翼。
57.根据权利要求56所述的AAV载体,还包括位于所述一个或多个ITR的5'或3'末端的内含子。
58.根据权利要求56或57所述的AAV载体,其中所述ITR中的至少一个或多个或所述内含子被修饰为具有减少的CpG。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的AAV载体,其中所述AAV载体具有衣壳血清型,其包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,Rh10,Rh74,AAV3B,AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32VP1、VP2和/或VP3序列具有90%或更高的序列同一性的修饰或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳,或者包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,Rh10,Rh74,AAV3B,AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32VP1、VP2和/或VP3序列具有95%或更高的序列同一性的衣壳,或者包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,Rh10,Rh74,AAV3B,AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32VP1、VP2和/或VP3序列具有100%序列同一性的衣壳。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的AAV载体,其中,所述ITR包括以下任一个的一个或多个ITR:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV3B、AAV血清型或其组合。
61.药物组合物,其包含在生物相容性载体或赋形剂中的多个根据权利要求55-60中任一项所述的AAV载体。
62.根据权利要求61所述的药物组合物,其进一步包含空的AAV衣壳。
63.根据权利要求62所述的药物组合物,其中所述空AAV衣壳与所述AAV载体的比例为约100:1-50:1、约50:1-25:1、约25:1-10:1、约10:1-1:1、约1:1-1:10、约1:10-1:25、约1:25-1:50或约1:50-1:100。
64.根据权利要求62所述的药物组合物,其中所述空AAV衣壳与所述AAV载体的比例为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
65.根据权利要求62-64中任一项所述的药物组合物,其还包含表面活性剂。
66.治疗需要酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的人的方法,包括:
(a)提供根据权利要求1-54中任一项所述的核酸或表达盒,或根据权利要求55-60中任一项所述的AAV载体,或根据权利要求61-65中任一项所述的药物组合物;和
(b)向所述人施用一定量的所述核酸、表达盒、AAV载体或药物组合物,其中所述GAA在所述人中表达。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述人患有庞贝氏病。
68.根据权利要求66所述的方法,其中所述人患有婴儿发作性庞贝氏病。
69.根据权利要求66所述的方法,其中所述人患有晚发型庞贝氏病。
70.根据权利要求66所述的方法,其中所述人患有糖原贮积病(GSD)。
71.根据权利要求70所述的方法,其中所述GSD选自:I型GSD(冯·吉尔克氏病)、III型GSD(福布斯-科里病)、IV型GSD(安德森病,支链淀粉病)、V型GSD(麦卡德尔病)、VI型GSD(赫尔氏病)、VII型GSD(塔瑞氏病)和致命性先天性心脏GSD。
72.根据权利要求66-71中任一项所述的方法,其中所述AAV载体通过静脉内、动脉内、腔内、粘膜内或通过导管施用于所述人。
73.根据权利要求66-72中任一项所述的方法,其中所述GAA以高于在不需要GAA的人中发现的GAA水平的水平表达,任选地所述GAA以比在不需要GAA的人中发现的GAA水平高1%的水平表达。
74.根据权利要求66-73中任一项所述的方法,其中以约1×108至约1×1014个载体基因组/千克所述人体重(vg/kg)施用所述AAV载体。
75.根据权利要求66-74中任一项所述的方法,其中,所述方法减少、降低或抑制所述需要GAA的人的或所述疾病的一种或多种症状;或预防或减少所述需要GAA的人的或所述疾病的一种或多种症状的进展或恶化;或稳定了所述需要GAA的人的或所述疾病的一种或多种症状;或改善了所述需要GAA的人的或所述疾病的一种或多种症状。
76.根据权利要求75所述的方法,其中,所述一种或多种症状选自:进食困难、体重不增加、头部控制不佳、颈部控制不佳、呼吸困难、肺部感染、心脏扩大、心脏增厚、心脏缺陷、舌头增大、吞咽困难、肝脏肿大、肌肉力量差、肌张力弱、腿无力、腰部无力、手臂无力、气促、运动困难、睡觉时呼吸困难、脊柱弯曲和关节僵硬。
77.一种细胞,其包含根据权利要求1-54中任一项所述的核酸或表达盒。
78.一种细胞,其产生根据权利要求55-60中任一项所述的AAV载体。
79.一种产生根据权利要求55-60中任一项所述的AAV载体的方法,包括
a.将包含根据权利要求1-54中任一项所述的核酸或表达盒的AAV载体基因组引入包装辅助细胞中;和
b.在产生所述AAV载体的条件下培养所述辅助细胞。
80.一种产生根据权利要求55-60中任一项所述的AAV载体的方法,包括
a.将根据权利要求1-54所述的核酸或表达盒引入包装辅助细胞中;和
b.在产生所述AAV载体的条件下培养所述辅助细胞。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中,所述细胞包括哺乳动物细胞。
82.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中所述细胞提供将所述载体包装成病毒颗粒的辅助功能。
83.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中,所述细胞提供AAV辅助功能。
84.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中所述细胞提供AAV Rep和/或Cap蛋白。
85.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中所述细胞被编码Rep和/或Cap蛋白序列的多核苷酸稳定或瞬时转染。
86.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中所述细胞提供Rep78和/或Rep68蛋白。
87.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中所述细胞用Rep78和/或Rep68蛋白多核苷酸编码序列稳定或瞬时转染。
88.根据权利要求77-80中任一项所述的细胞或方法,其中,所述细胞包括HEK-293细胞。
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