JP2003523180A

JP2003523180A - 多重のパッケージングシグナルを用いる組み換えアデノウイルスのパッケージングおよび収量を増加するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2003523180A
Application number: JP2001542523A
Authority: JP
Inventors: ガオ，グアング−ピング; ウイルソン，ジエイムズ・エム
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2003-08-05
Also published as: EP1234048A2; CA2392537A1; AU1796801A; WO2001040455A2; WO2001040455A3

Abstract

(57)【要約】多重アデノウイルスパッケージングドメインを有する組み換えアデノウイルスベクターが提供される。このベクターは、アデノウイルスキャプシド中へのプラスミドベクターのパッケージングにおいて慣用のアデノウイルスベクター以上の利点を有する。このベクターの作成および使用方法が記述される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、国立保健研究所（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＨｅａｌｔｈ）の補助金Ｎｏ．Ｐ０１ＨＤ３２６４９からの資金援助
により作成された。米国政府は本発明におけるある種の権利を有する。

【０００２】発明の背景本発明は、一般に、遺伝子送達において有用なアデノウイルスベクターの分野
および同ベクターの作成方法に関する。

【０００３】アデノウイルスは、選ばれた宿主細胞中への治療遺伝子の送達のために有用な
ウイルスベクターとして記述されてきた。送達媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）として
のアデノウイルスへの関心により、数グループは、ウイルスキャプシド中へのア
デノウイルス（Ａｄ）ゲノムの選択的パッケージングを可能にするメカニズムを
研究してきた。

【０００４】Ａｄゲノムの左端内において、シス作用パッケージングドメインが同定された
［Ｍ．ＧｒａｂｌｅａｎｄＰ．Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２
０４７−２０５６（Ｍａｙ１９９０）］。この領域を欠如しているＡｄ血清型
５（Ａｄ５）の変異株は生存不能であるが、ウイルスゲノムの右端における左末
端３５５ｎｔの挿入によってレスキューすることができる。Ａｄ５パッケージン
グドメインは、逆方向において機能することが見い出され、そしてウイルス収量
を低下することなくその本来の場所から数百塩基対内に移動することができる［
Ｐ．Ｈｅａｒｉｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２５５５−２５５
８（Ａｕｇ．１９８７）］。

【０００５】Ａｄ５パッケージングドメインは、機能的に重複している少なくとも７個の要
素からなる。最初の５要素のうち４個は、Ａリピートと呼ばれるＡＴリッチの反
復する配列モチーフを含有する。第５の要素は、それがＡＴリッチであるという
事実以外はＡリピートに対するいかなる明白な１次配列相同性も含まない。Ａｄ
５の公表された配列によれば、ＡリピートＩはｎｔ２４０−２４８内に位置し；
ＡリピートＩＩはｎｔ２６０−２６８内に位置し；ＡリピートＩＩＩはｎｔ３０
２−３１１内に位置し；ＡリピートＩＶはｎｔ３１３−３２１内に位置し；Ａリ
ピートＶはｎｔ３３７−３４６内に位置し；ＡリピートＶＩはＡｄ５のｎｔ３６
３−３６８内に位置し；ＡリピートＶＩＩはＡｄ５のｎｔ３７０−３７５内に位
置する［Ｍ．ＧｒａｂｌｅａｎｄＰ．Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（２）：７２３−７３１（Ｆｅｂ．１９９２）］。文献は、ビリオン中へのア
デノウイルスＤＮＡをパッケージするのに要求されるパッケージングドメインの
最小部分を決定する試みを報告している。このアプローチは、ベクターの安全性
を最大にし、同時にアデノウイルスベクターによって送達される異種遺伝子配列
のためにウイルスゲノムにおいて十分な空間を提供するための進展中の作業と合
致する。

【０００６】研究は、アデノウイルスベクターの生産および収量を最適化する方法を探求す
べく継続している。

【０００７】発明の概要本発明は、組み換えアデノウイルスを効率よくパッケージし、そしてその高い
収量を生産するために有用な組成物および方法を提供する。本発明は、多重の機
能性アデノウイルスパッケージングドメインを含有するよう組み換えアデノウイ
ルスを工作することを含む。適当には、これらのベクターは、重複して、アデノ
ウイルスパッケージングドメインの「Ａ」反復要素を少なくとも５個含有する。
もっとも好ましくは、ベクターは、少なくとも１個の元のままのアデノウイルス
パッケージングドメインおよび少なくとも５個の「Ａ」反復要素を含有する第２
のアデノウイルスパッケージングドメインを含有する。

【０００８】かくして、１つの態様では、本発明は、（ａ）アデノウイルス５’逆方向末端
反復、（ｂ）第１のアデノウイルスパッケージングドメイン、（ｃ）第２のアデ
ノウイルスパッケージングドメイン；（ｄ）トランスジーンの発現を導く調節配
列の制御下の選ばれたトランスジーン、および（ｅ）３’逆方向末端反復を提供
する。適当には、第２のパッケージングドメインは、本来のＥ１領域および選ば
れたトランスジーンに対して５’に位置する。

【０００９】その他の態様では、本発明は、本発明の組み換えアデノウイルスおよび生理的
に適合しうるキャリヤーを含んでなる製薬組成物を提供する。

【００１０】なおその他の態様では、本発明は、本発明の組み換えアデノウイルスを選ばれ
た宿主細胞に感染させることによって該細胞にトランスジーンを送達する方法を
提供する。

【００１１】さらなる態様では、本発明は、選ばれた組み換えアデノウイルスのパッケージ
ングおよび収量を増加する方法を提供する。方法は、少なくとも２個のアデノウ
イルスパッケージングドメインを含有するよう選ばれた組み換えアデノウイルス
ベクターを工作することを含む。

【００１２】なおさらなる態様では、本発明は、機能性アデノウイルスの初期、中期および
後期遺伝子を欠如している組み換えアデノウイルスを作成する方法を提供する。
方法は、（ａ）多重のアデノウイルスパッケージングドメインおよび選ばれたト
ランスジーンを含有する組み換えアデノウイルスプラスミドであって、機能性ア
デノウイルスの初期、中期および後期遺伝子を欠如している該プラスミド；およ
び（ｂ）ヘルパーウイルスを、宿主細胞において同時培養することを含む。宿主
細胞とももにｒＡｄプラスミドおよびヘルパーウイルスは、アデノウイルスキャ
プシド中への組み換えアデノウイルスプラスミドのパッケージングを可能にする
のに十分なアデノウイルス遺伝子機能を提供する。

【００１３】本発明の他の態様および利点は、次の本発明の詳細な記述を考慮して容易に明
らかになるであろう。

【００１４】発明の詳細な記述本発明は、本明細書で定義されるように、少なくとも２個のアデノウイルスパ
ッケージングドメインを含有するアデノウイルスベクターを提供する。これらの
ベクターは、本来のパッケージングシグナルを含有するウイルスベクターに比較
して、増強したパッケージング能および収量を特徴とする。かくして、本発明は
、組み換えアデノウイルスベクターの作成において有意な利点を有する組成物お
よび方法を提供する。

【００１５】Ｉ．組み換えアデノウイルスベクター本発明の組み換えアデノウイルスベクターは、最少でも、アデノウイルス５’
逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、第１のアデノウイルスパッケージングドメイン
、第２のアデノウイルスパッケージングドメイン、選ばれたトランスジーン、お
よびアデノウイルス３’ＩＴＲからなる。本明細書で使用されるように、用語ベ
クターは、限定されることなく、すべての遺伝要素、例えばプラスミド、ファー
ジ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含む。

【００１６】本発明において有用なアデノウイルスの要素を備え、そしてアデノウイルス遺
伝子をコードしているＤＮＡ配列は、現在同定されている４１種のヒト型を含む
、いかなる既知のアデノウイルス型の中から選ばれてもよい［参照、例えば先に
引用されたＨｏｒｗｉｔｚ］。同様に、他の動物に感染することが知られている
アデノウイルスが遺伝子配列を供給してもよい。各アデノウイルスの要素または
遺伝子配列のためのアデノウイルス型の選択は本発明を限定しない。アデノウイ
ルス血清型５の配列を含む多くのアデノウイルス（Ａｄ）血清型についての配列
はＧｅｎＢａｎｋデータベースから利用できる［参照、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
，受理番号ＮＣ−００１４０６（ヒトＡｄ５、完全ゲノム）；ＮＣ−００１４６
０．１（完全ゲノムヒトＡｄ１２）；ＮＣ−００１４０５（完全ゲノムヒトＡｄ
２）；ＡＦ０８６５６７０（完全ｃｄｓ、ヒトＡｄ１５）；ＡＦ０８６５７１．
１（完全ｃｄｓ、ヒトＡｄ９）；ＡＦ０８６５７０（完全ｃｄｓ、ヒトＡｄ８）
；ＡＦ０８６５６９（完全ｃｄｓ、ヒトＡｄ３７）；ＡＦ０８６５６８（完全ｃ
ｄｓ、ヒトＡｄ１９）、その他］。様々なアデノウイルス株がアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアから入手できるし、あ
るいは様々な市販および研究起源から請求によって入手できる。本発明のベクタ
ーにおいて使用されるアデノウイルス配列は、１種以上の野生型アデノウイルス
または変異アデノウイルスから得られてもよい。

【００１７】Ａ．アデノウイルスＩＴＲ５’および３’アデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、それぞれアデノ
ウイルスゲノムの５’および３’最末端に位置している。５’および３’ＩＴＲ
は、本発明の組み換えアデノウイルスベクターの最末端またはその近辺に同様に
位置している。これらのＩＴＲは、前記いずれのアデノウイルス血清型から得ら
れてもよいし、あるいは人工配列、例えば本来のＩＴＲと同様または等しいパッ
ケージング機能を有する合成または変異配列であってもよい。

【００１８】Ｂ．アデノウイルスパッケージングドメイン本明細書に使用されるように、用語「アデノウイルスパッケージングドメイン
」は、キャプシドタンパク質中にアデノウイルスベクターをパッケージするため
に要求されるアデノウイルスの反復要素の核酸配列を指す。Ａｄ５のパッケージ
ングドメインは、もっとも研究されているヒト血清型に属する［参照、先に引用
されたＧｒａｂｌｅａｎｄＨｅａｒｉｎｇ（１９９２）］が、本発明はその
ように限定されるものではない。他のアデノウイルス血清型の反復配列は、本発
明において容易に置き換えられる。さらに、当業者は１種以上のＡ反復配列の機
能性フラグメントを置換することができる。さらに、反復要素および／またはそ
れらの機能性フラグメントは慣用の方法を用いて合成により作成されてもよい。

【００１９】さらに、同定された特定のＡリピートに加えて、さらなる配列が、本発明のベ
クターにおいて使用されるアデノウイルスパッケージングドメイン中に含まれて
もよい。便利には、Ａ反復要素を含有することに加えて、さらにアデノウイルス
Ｅ１ａエンハンサー配列を含有する、元のままか、または一部本来のアデノウイ
ルスパッケージングドメインを利用することができる。かくして、パッケージン
グドメインのアデノウイルス配列は、機能性反復要素を越えて３’および／また
は５’に広がってもよい。例えば、１つの適当なアデノウイルスパッケージング
ドメインは、リピートＩ−Ｖを包含するＡｄ５のｎｔ２１８−３５４を含有して
もよい。その他の例では、適当なアデノウイルスパッケージングドメインは、リ
ピートＩ−ＶＩを包含し、そして部分的なリピートＶＩＩを含有するｎｔ１８６
−３７１を含有してもよい。あるいはまた、アデノウイルスパッケージングドメ
インは、アデノウイルスパッケージングドメインのリピートから個々の反復要素
および／またはの５’ＩＴＲを分離するのに役立ち、そして／または多重のアデ
ノウイルスパッケージングドメインを分離するのに役立つ他の配列をさらに含有
してもよい。例えば、個々の反復要素を分離するために使用される場合は、その
ような配列は、長さ５ｂｐ〜２００ｂｐ、１０ｂｐ〜１００ｂｐ、２０ｂｐ〜６
０ｂｐ、または３０ｂｐ〜５０ｂｐであってもよい。しかしながら、これらの配
列の長さは、便宜上必要に応じて容易に調節できる。これらの配列は、自然にお
けるウイルス性でもよいし、または他の組み換えもしくは合成手段より得られて
もよく、そしてアデノウイルスパッケージングドメインのパッケージング機能を
有意には損なわない。

【００２０】本発明のアデノウイルスベクターは、多重のパッケージングドメインを含有す
る（すなわち、少なくとも２個のパッケージングドメイン、および場合によって
は３、４、５、６もしくはそれ以上）。適当には、アデノウイルスベクターは、
Ａ反復要素Ｉ〜Ｖを含有する第１アデノウイルスパッケージングドメインおよび
第２アデノウイルスパッケージングドメインを含有する。好ましくは、第２のア
デノウイルスパッケージングドメインは、少なくとも５個のＡ反復要素、そして
もっとも好ましくは、Ａ反復要素Ｉ〜Ｖを含有する。しかしながら、第２パッケ
ージングドメインはそのように限定されず、そして当業者は、第２アデノウイル
スパッケージングドメインがＩ〜ＶＩＩから選ばれるＡ反復要素２、３もしくは
４個くらい少なく含有するように、アデノウイルスベクターを容易に設計できる
。１つの好適な態様では、第１アデノウイルスパッケージングドメインはＡ反復
要素Ｉ〜ＶＩＩを含有し、そして第２アデノウイルスパッケージングドメインは
、少なくともＡ反復要素Ｉ〜Ｖを含有する。例えば、そのようなベクターがＡｄ
５パッケージングドメインを用いて作成される場合、ベクターは、他のベクター
要素とともにｎｔ２４０−３４６の２個のパッケージングドメインを含有する。
あるいはまた、アデノウイルスベクターは、ｎｔ２４０−３７５（リピートＩ−
ＶＩＩ）の第１パッケージングドメインおよび他のベクター要素とともにｎｔ２
４０−３４６（リピートＩ−Ｖ）の第２のパッケージングドメインを含有する。

【００２１】本発明のアデノウイルスベクターは、互いの後に直接位置するが、１つの完全
なアデノウイルスパッケージングドメイン内に位置する、選ばれた反復要素の多
重コピーを含有してもよい。例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、リピ
ートＩ−Ｖを包含する配列、リピートＩ−Ｖを包含する第２パッケージングドメ
イン、続いてリピートＶＩとＶＩＩを包含する配列を含有してもよい。その他の
例として、本発明のアデノウイルスベクターは、リピートＩ−ＶＩを包含する配
列、リピートＩ−ＶＩを包含する第２パッケージングドメイン、続いてリピート
ＶＩＩを包含する配列を含有してもよい。あるいはまた、本発明のアデノウイル
スベクターは、縦に並んで位置する多重のパッケージングドメインを含有しても
よい。例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、リピートＩ−ＶＩＩを包含
する配列、続いてリピートＩ−Ｖを包含する配列を含有してもよい。

【００２２】本発明によれば、両第１および第２アデノウイルスパッケージングドメインは
、アデノウイルスベクターの左端から１００ｂｐ〜４００ｂｐ内で、そしてＥ１
配列が元のまま存在する場合、Ｅ１配列に対して５’に位置している。かくして
、第１および第２アデノウイルスパッケージングドメインは、好ましくは、アデ
ノウイルスゲノムのマップ単位０−１内に位置している。さらに、第１および第
２アデノウイルスパッケージングドメインは、トランスジーン配列に対して５’
に位置している。好ましくは、少なくとも１個のアデノウイルスパッケージング
ドメインは、その本来の場所に、すなわち、アデノウイルス５’ＩＴＲ配列に対
して３’で、そしてアデノウイルスベクターの左端から３７５ｂｐ内に位置して
いる。１つの好適な実施態様では、５’ＩＴＲおよび第１アデノウイルスパッケ
ージングドメインは、両方それらの本来の場所に存在し、そして第２アデノウイ
ルスパッケージングドメインが、第１アデノウイルスパッケージングドメインか
ら２０〜２００ｂｐ３’内に存在するよう工作される。場合によっては、アデノ
ウイルスパッケージングドメインは、正方向または逆方向のいずれにおいても本
発明の構築物中に存在できる。好ましくは、少なくとも２個の多重アデノウイル
スパッケージングドメインは同方向において存在する。

【００２３】本発明のアデノウイルスベクターおよびウイルスは、両治療およびワクチン用
途を含む種々の目的で宿主細胞に遺伝子を送達するために有用である。アデノウ
イルスパッケージングドメインは、比較的小さく（すなわち、約１００−１９０
ｂｐの範囲）、そして組み換えアデノウイルスのキャプシドは、本来のアデノウ
イルスゲノムの大きさの１０５％までのベクター（〜３６ｋｂ）をパッケージで
きるので、第２のアデノウイルスパッケージングドメインを適応させるいかなる
アデノウイルスの遺伝子も欠失する必要はない。その結果、第２アデノウイルス
パッケージングドメインは、Ｅ１遺伝子がベクター中に存在する場合でさえ、Ｅ
１領域に対して５’に工作されてもよい。

【００２４】Ｃ．任意のアデノウイルスの要素本発明は、ベクター中に存在するアデノウイルス遺伝子によって制約されず、
そして最小の欠失（例えば、宿主細胞において発現される生産物をコードしてい
る配列の挿入に必要であるそれらのアデノウイルス配列が不在である場合）を含
有してもよく、あるいは１個または全アデノウイルス遺伝子の機能的欠失を含有
してもよい。かくして、当業者は、多重のアデノウイルスパッケージングドメイ
ン、および必要または所望される他の適当なアデノウイルス要素を含有する本発
明の組み換えアデノウイルスベクターを作成することができる。

【００２５】本明細書で定義されるように、「機能性フラグメント」は、必要または所望さ
れる機能を提供するために要求されるコーディング配列または遺伝子産物の領域
である。そのような改変物は、ある方法で遺伝子産物の機能を増強するために慣
用の遺伝子技術または変異形成技術にしたがって計画的に導入されてもよい。核
酸配列（例えば遺伝子）またはその機能的な部分のいかなる天然に存在する対立
遺伝子変異体または改変体も、同様に含まれる。しかしながら、アデノウイルス
配列の機能的欠失の包含に加えて、本発明は、さらに、所望の遺伝子機能を消滅
しないアデノウイルス配列の欠失を包含する。例えば、適当な「非機能的」欠失
は、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子産物をコードしているそれらの配列以外の全Ｅ４配列
の欠失を包含してもよい。

【００２６】例えば、宿主細胞への遺伝子の送達で使用するために、組み換えアデノウイル
スを複製欠陥にすることがしばしば所望される。かくして、１つの適当な実施態
様では、本発明のアデノウイルスベクターは、機能性Ｅ１遺伝子の不在によって
複製欠陥にされる（そのようなウイルスは、必要なＥ１遺伝子産物、Ｅ１ａおよ
びＥ１ｂの外部起源の不在下では複製することができない）。場合によっては、
１種以上のＥ１遺伝子（Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ）、Ｅ２遺伝子（Ｅ２ａ，Ｅ２ｂ）、Ｅ
３，Ｅ４，中期遺伝子ＩＸ，ＩＸａ，および後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５において機能
的欠失を含有する本発明の組み換えアデノウイルスが作成されてもよい。

【００２７】最小のアデノウイルス配列のみを含有する代表的ベクターは△Ａｄベクターと
呼ばれる。このベクターは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３，Ｅ４，中期遺伝子ＩＸ，ＩＸａ
、および後期遺伝子Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４およびＬ５を含む全機能性アデノウ
イルス遺伝子を欠く。しかしながら、好適な実施態様では、アデノウイルスベク
ターは、前記多重パッケージングドメインおよび最小アデノウイルス配列に加え
て、機能的なアデノウイルスＥ２，Ｅ４およびＩＸ遺伝子を含有している。その
他の適当な実施態様では、アデノウイルスベクター中のアデノウイルスの配列は
、５’および３’シス要素、多重パッケージングドメイン、機能性Ｅ２およびＥ
４遺伝子、中期遺伝子ＩＸおよびＩＸａ、および後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５を含む。
しかしながら、アデノウイルスベクターは、必要な最小配列を考慮して、当業者
によって容易に工作でき、そしてこれらの代表的実施態様には限定されない。適
当には、アデノウイルスベクターが全アデノウイルスの機能性遺伝子を欠く場合
は、ＩＸ配列がヘルパーウイルスによってトランスで与えられる。トランスジー
ンは、トランスジーンの転写を可能にする方式でベクターの調節構成分に操作可
能に結合される。

【００２８】Ｄ．トランスジーントランスジーン配列は、Ａｄ配列にとって異種の核酸配列であって、関心のあ
るポリペプチドまたはタンパク質をコードしている。トランスジーン配列は、ア
デノウイルス配列にとって異種の核酸配列であって、関心のあるポリペプチド、
タンパク質または他の生産物をコードしている。トランスジーン配列の組成は、
得られる本発明のｒＡｄの意図する用途により異なる。例えば、トランスジーン
配列の１つのタイプは、発現に応じて、検出しうるシグナルを生じるレポーター
またはマーカー配列を含有する。そのようなレポーターまたはマーカー配列は、
限定されることなく、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、
アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ
、例えばＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、およびインフルエン
ザ血球凝集素タンパク質、ならびに他の当該技術分野において既知のものを含む
。有利には、中でも血球凝集素またはＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適当に融
合された膜結合タンパク質を含有する融合タンパク質のように、そのようなタン
パク質に対する高い親和力の抗体が存在しているし、またはルーチンに作成する
ことができる。これらの配列は、それらの発現を導く調節要素と組み合わせた場
合、慣用の方法によって検出できるシグナルを提供する。そのような慣用の手段
は、酵素的、放射能的、比色的、蛍光的または他の分光的アッセイ、蛍光活性化
細胞ソーティングアッセイ、およびＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび免疫組織化学を含
む免疫的アッセイを含む。例えば、トランスジーンがＬａｃＺ遺伝子である場合
、ｒＡｄの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。
同様に、トランスジーンがルシフェラーゼである場合、ｒＡｄは、ルミノメータ
ーにおける発光によって測定できる。

【００２９】しかしながら、望ましくは、トランスジーンは、本発明のｒＡｄを介して細胞
または動物に送達することができる非マーカー遺伝子である。トランスジーンは
、生物学および薬学において有用な広範な遺伝子産物、例えばタンパク質、アン
チセンス核酸（例えばＲＮＡ）または触媒的ＲＮＡから選ばれてもよい。本発明のｒＡｄは、免疫応答を誘発する遺伝子産物の送達のため、例えばワクチ
ン用途のために有用である。適当な遺伝子産物は、ウイルス、ならびに単細胞お
よび多細胞寄生虫を含む原核および真核生物由来の免疫原性タンパク質およびポ
リペプチドの中から当業者によって容易に選ぶことができる。

【００３０】その他では、本発明のｒＡｄは、研究のために望ましいいかなる生産物をもコ
ードしているトランスジーンの送達に有用である。トランスジーン配列の選択は
本発明の限定とはならない。トランスジーン配列の選択は、本出願の技術にした
がえば当該技術の熟達者には容易である。

【００３１】１つの特に望ましい実施態様では、本発明のｒＡｄベクターは、正常な遺伝子
が正常なレベル未満でしか発現されない遺伝子欠失を矯正または改善するために
有用である。また、ｒＡｄベクターは、機能性遺伝子産物が発現されない遺伝子
欠陥を矯正または改善するために使用されてもよい。トランスジーン配列の好適
な種類は、宿主細胞において所望の遺伝子産物が発現される治療遺伝子である。
これらの治療核酸配列は、典型的には、発現に応じて、遺伝性または非遺伝性遺
伝子欠陥を矯正または補足するか、あるいは後成の障害または疾病を治療するこ
とができる。

【００３２】かくして、本発明は、多サブユニットタンパク質によって惹起される遺伝子欠
陥を矯正または改善するために使用できるｒＡｄベクターの作成方法を含む。あ
る場合には、異なるトランスジーンが、タンパク質の各サブユニットをコードす
るために使用されてもよい。このことは、タンパク質サブユニットをコードして
いるＤＮＡのサイズが大きい場合、例えば、免疫グロブリンまたは血小板由来増
殖因子レセプターには望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を生産するた
めに、細胞は、種々のサブユニットの各々を含有するｒＡｄにより感染される。
あるいはまた、タンパク質の種々のサブユニットが同じトランスジーンによって
コードされてもよい。この場合、単一トランスジーンは、内部リボソーム侵入部
位(internal ribosome entry site)（ＩＲＥＳ）によって分けられる各サブユニ
ットのためのＤＮＡとともに、サブユニットの各々をコードしているＤＮＡを含
む。これは、サブユニットおよびＩＲＥＳをコードしているすべてのＤＮＡが５
キロベース未満であるような、サブユニットの各々をコードしているＤＮＡのサ
イズが小さい場合に望ましい。

【００３３】有用な遺伝子産物は、限定されることなく、次のものを含むホルモンならびに
成長および分化因子を含む：インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）
、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒトコリオゴナンドトロピン（
ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン、アンギオスタ
チン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、
結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性
繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミ
ング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン
様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチ
ビン、インヒビンを含むトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）サブファ
ミリーのいずれか１つ、または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１−１５
のいずれか、成長因子のヘレグリン／ノイレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子
（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄
養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、繊毛神
経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュー
ルツリン、アグリン、セマホリン／コラプシン、ネトリン−１およびネトリン−
２のファミリーのいずれか１つ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン
、ソニックヘッジホグ（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｈｏｇ）およびチロシンヒドロキ
シラーゼ。

【００３４】他の有用な遺伝子産物は、限定されることなく、次のものを含む免疫系を調節
するタンパク質を含む：サイトカインおよびリンホカイン、例えばトロンボポイ
エチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−
２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９
、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５
、ＩＬ−１６およびＩＬ−１７、単球化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎ
ｔ）タンパク質（ＭＣＰ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球−マクロフ
ァージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αお
よびβ（ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、インターフェロン（ＩＦＮ）ＩＦＮ−α、
ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド。ま
た、免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明によって包含される。これら
は、限定されることなく、次のものを含む：免疫グロブリンＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉ
ｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、
Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラ
スＩＩＭＨＣ分子、ならびに一本鎖ＭＨＣ分子を含む工作されたＭＨＣ分子。
また、有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、例えばメンブランコファクタ
ータンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１，ＣＲ２およびＣＤ
５９。

【００３５】なおその他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リン
ホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質のための受容体のいずれか１
つを含む。本発明は、ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ受容体、ＶＬＤＬ受容体およびスカ
ベンジャー受容体を含むコレステロール調節のための受容体を包含する。また、
本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体を含むステロイ
ドホルモン受容体スーパーファミリー、ビタミンＤ受容体および他の核受容体の
ような遺伝子産物も包含する。さらに、有用な遺伝子産物は、転写因子、例えば
ｊｕｎ，ｆｏｓ，ｍａｘ，ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１，ＡＰ−
２，ｍｙｂ，ＭＲＧ１，ＣＲＥＭ，Ａｌｘ４，ＦＲＥＡＣ１，ＮＦ−κＢ、ロイ
シンジッパーファミリーのメンバー、Ｚｉｆ２６８，ＥＧＲ１，ＥＧＲ２を含む
Ｃ２Ｈ４ジンクフィンガータンパク質、グルココルチコイドおよびエストロゲン
受容体を含むＣ６ジンクフィンガータンパク質、Ｐｉｔ１に代表されるＰＯＵド
メインタンパク質、ＨＯＸ−１を含むホメオドメインタンパク質、ｍｙｃ，Ｍｙ
ｏＤおよびミオゲニンを含む塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質
、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３，Ｅ２Ｆ，ＡＴＦ１，ＡＴＦ２，
ＡＴＦ３，ＡＴＦ４，ＺＦ５，ＮＦＡＴ，ＣＲＥＢ，ＨＮＦ−４，Ｃ／ＥＢＰ，
ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（Ｉ
ＲＦ−１）、Ｗｉｌｍｓ腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ，Ｇ
ＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、およびウイングヘリッ
クスタンパク質のフォークヘッドファミリーを含む。

【００３６】他の有用な遺伝子産物は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランス
カルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、
アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシ
ラーゼ、α−１抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、低密度リポタ
ンパク質受容体、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、
シスタチオンβ−シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、
イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ
、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシ
ュリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ
、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ（またＰ−タンパク質
と呼ばれる）、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、Ｍｅｎｋｅｓ病タンパク質、
腫瘍サプレッサー（例えば、ｐ５３）、嚢胞性繊維症トランスメンブランレギュ
レーター（ＣＦＴＲ）およびＷｉｌｓｏｎ病遺伝子ＰＷＤを含む。

【００３７】他の有用なトランスジーンは、天然に存在しないポリペプチド、例えばキメラ
またはハイブリッドポリペプチド、または挿入、欠失もしくはアミノ酸置換を含
有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えば、一
本鎖に工作された免疫グロブリンは、ある種の免疫妥協（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐ
ｒｏｍｉｓｅｄ）患者において有用である。他の種類の天然に存在しない遺伝子
配列は、アンチセンス分子および触媒核酸、例えばリボザイムを含み、これらは
遺伝子の過剰発現を低下させるために使用できる。

【００３８】Ｅ．他のベクター要素哺乳動物細胞および宿主における発現のためのトランスジーンの設計は、その
発現を促進するために関心のある遺伝子に操作可能に結合される適当な配列を含
むべきである。「操作可能に結合される」配列は、関心のある遺伝子に接してい
る発現調節配列ならびに関心のある遺伝子を制御するためにイン・トランスか、
一定距離において作用する発現調節配列の両方を含む。そのような発現調節配列
が、トランスジーンと併せてより詳細に議論される。

【００３９】発現調節配列は、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配
列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増進する配列（すなわち、Ｋ
ｏｚａｋ共通配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望されれば、
タンパク質分泌を増進する配列を含む。大多数の発現調節配列−−本来の、構成
的、誘導的および／または組織特異的−−は、当該技術分野において既知であり
、そして所望される発現形式に応じて、トランスジーンの発現を導くために利用
されてもよい。真核細胞では、発現調節配列は、典型的には、プロモーター、エ
ンハンサー、例えば免疫グロブリン遺伝子由来のもの、ＳＶ４０、サイトメガロ
ウイルスなど、ならびにスプライスドナーおよびアクセプター部位を含んでもよ
いポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化配列は、一般に、トランスジーン
配列に続いて、そして３’ＡｄＩＴＲ配列の前に挿入される。また、本発明の
ｒＡｄベクターは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列とトランスジ
ーン間に位置するイントロンを含有してもよい。また、１つの可能なイントロン
配列は、ＳＶ−４０から得られ、そしてＳＶ−４０Ｔイントロン配列と呼ばれ
る。使用できるその他のベクター要素は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
である。ＩＲＥＳ配列は、単一遺伝子転写物からポリペプチドを１個以上生産す
るために使用される。ＩＲＥＳ配列は、ポリペプチド鎖１個以上を含有するタン
パク質を生産するために使用できる。これらおよび他の共通のベクター要素の選
択は慣例的であり、そして多くのそのような配列が利用できる［例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋｅｔａｌ，および本明細書に引用される文献、例えば３．１８−
３．２６および１６．１７−１６．２７ページ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌｅｔ
ａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏａｋ，１
９８９、参照］。

【００４０】１つの実施態様では、高レベルの構成的発現が望まれるであろう。そのような
プロモーターの例は、限定されることなく、レトロウイルス・ラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーとともに
）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエン
ハンサーとともに）［参照、例えば、Ｂｏｒｓｈａｒｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）］、ＳＶ−４０プロモーター、ジヒドロ
葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロー
ルキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ］を含む。誘導プロモーターは、亜鉛誘導ヒツジメタロチオニン（Ｍ
Ｔ）、デキサメタソン（Ｄｅｘ）誘導マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモ
ーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］；エクジ
ソン昆虫プロモーター［Ｎｏｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑
制系［Ｇｏｓｓｅｎｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン−誘導系［
Ｇｏｓｓｅｎｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１
９９５）、また参照、Ｈａｒｖｅｙｅｔａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）］、ＲＵ４８６−誘導系［Ｗ
ａｎｇｅｔａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９
９７）およびＷａｎｇｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，４：４３２−４４
１（１９９７）］およびラパマイシン−誘導系［Ｍａｇａｒｉｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を含
む外因的に供給される化合物によって調節される。本文脈上有用である他のタイ
プの誘導プロモーターは、特定の生理的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特
定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて調節されるプロモーターで
ある。

【００４１】その他の実施態様では、トランスジーンの本来のプロモーターが使用できる。
本来のプロモーターは、トランスジーンの発現が本来の発現を模倣することが望
まれる場合に好適であろう。本来のトランスジーンは、トランスジーンの発現が
、一過性または発生的に、または組織特異的方式で、または特異的転写刺激への
応答において調節されねばならない場合に使用されてもよい。さらなる実施態様
では、他の本来の発現調節要素、例えばエンハンサー要素、ポリアデニル化部位
またはＫｏｚａｋ共通配列が、また、本来の発現を模倣するために使用されても
よい。

【００４２】トランスジーンのその他の実施態様は、組織特異的プロモーターに操作可能に
結合されたトランスジーンを含む。例えば、骨格筋における発現が望まれる場合
には、筋肉において活性のあるプロモーターが使用されるべきである。これらは
、骨格のα−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキ
ナーゼをコードしている遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプ
ロモーター以上の活性をもつ合成筋肉プロモーター［参照、Ｌｉｅｔａｌ．
，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９）］を含む。組
織特異的であるプロモーターの例は、肝臓［アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅｅ
ｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウ
イルス・コアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕ
ｔｈｎｏｔｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，７：１５０３−１
４（１９９６）］、骨［オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７）；骨シアロプロテイン
、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５
４−６４（１９９６）］、リンパ球［ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖
；Ｔ細胞受容体α鎖］、ニューロン［ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プ
ロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３）；神経フィラメント軽鎖遺伝子、
Ｐｉｃｃｉｏｌｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１）；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉ
ｃｃｉｏｌｉｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５）
］；その他について知られている。

【００４３】もちろん、すべてのベクターおよび発現調節配列が、本発明のトランスジーン
のすべてを発現するのに等しく良好に機能できるわけではない。しかしながら、
当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくこれらの発現調節配列の中から選
択をすることができる。適当なプロモーター／エンハンサー配列は、本出願によ
って提供されるガイダンスを用いて当業者によって選択されるであろう。そのよ
うな選択は日常的方法であり、そして分子または構築物の制約にはならない。例
えば、１種以上の発現調節配列を選択し、配列を関心のあるトランスジーンに操
作可能に結合させ、そして発現調節配列およびトランスジーンを含有する「ミニ
ジーン」をＡｄベクター中に挿入することができる。本明細書において教示され
るかまたは当該技術分野において教示されるように、ｒＡｄをパッケージする方
法の１つにしたがった後、適当な細胞をイン・ビトロまたはイン・ビボで感染す
ることができる。細胞におけるトランスジーンの多数のコピーは、サザンブロッ
ティングまたは定量的ＰＣＲによってモニターされてもよい。ＲＮＡ発現のレベ
ルは、ノザンブロッティングまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲによってモニターされて
もよい。タンパク質の発現レベルは、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学
、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはトランスジーンの遺伝子産物の生物活性の試験に
よってモニターされてもよい。かくして、容易に、特定の発現調節配列が特定の
トランスジーンに適当であるか否かをアッセイし、そして所望のトランスジーン
の発現についてもっとも適当である発現調節配列を選択することができる。

【００４４】ＩＩ．組み換えアデノウイルスベクターの作成慣用の技術が、本発明のアデノウイルスベクターおよび他の核酸分子の構築の
ために利用できる。参照、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ。所望のアデノウイルスベクター（
例えばプラスミド）が構築されると、それは、いずれか適当な方法によってウイ
ルスキャプシド中へのパッキングのために宿主細胞に導入できる。そのような方
法は、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送
達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト
融合を含む。その後、細胞が標準方法にしたがって培養される。

【００４５】哺乳動物宿主細胞自体は、例えば限定されることなく、ＣＨＯ，ＢＫＨ，ＭＤ
ＣＫのような細胞、ならびにマウス細胞、例えば１０Ｔ１／２およびＷＥＨＩ細
胞、アフリカミドリサル細胞、例えば種々のＶＥＲＯ，ＣＯＳ１，ＣＯＳ７，Ｂ
ＳＣ１，ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０、およびヒト細胞、例えばＷ１３８，ＭＲ
Ｃ５，Ａ５４９，ヒト胎児性網膜芽細胞（ＨＥＲ）、ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）、
ヒト胎児性肺（ＨＥＬ）およびＴＨ１０８０細胞を含む、いずれかの哺乳動物種
、例えばヒト細胞タイプから選ばれてもよい。好適な実施態様では、適当な細胞
は、２９３細胞（アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂタンパク質を発現するヒト
胎児性腎細胞）、９１１、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（アデノウイルスＥ１を発現するヒ
ト胎児性網膜芽細胞；参照ＷＯ９７／１９４６３）、ＧＨ３２９細胞（アデノ
ウイルスＥ１を発現する細胞系）；２７−１８細胞、８４−３１細胞（アデノウ
イルスＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ４を発現する２９３に基づく細胞［Ｇ，Ｇａｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（１２）：８９３４−８９４３（１９９６）］）、１０
−３細胞（アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ４ＯＲＦ６を発現する２９３
に基づく細胞［Ｇ，Ｇａｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）］）、３Ｔ３細胞（
マウス胎児性繊維芽細胞系）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３細胞のサブライン）、
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝がん細胞系）、Ｓａｏｓ−２細胞（ヒト骨原発性がん腫
細胞系）、ＨｕＨ７細胞またはＨｅＬａ細胞（ヒトがん腫細胞系）を含む。細胞
を提供する哺乳動物種の選択または哺乳動物細胞のタイプは、いずれも本発明の
限定とはならない。

【００４６】適当には、選ばれた組み換えベクターが機能性Ｅ１欠失を含む場合、ベクター
は、慣用の技術、例えば当該技術分野において既知のトランスフェクション技術
を用いてＥ１補足細胞に導入され、そして培養される［参照、Ｋ．Ｋｏｚａｒｓ
ｋｙｅｔａｌ，Ｓｏｍ．ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１９（５）：４４９−４５８（１９９３）］。その後、トランスフェクション後に
、組み換えアデノウイルスが単離され、そして精製される。選ばれた組み換えベ
クターが、アデノウイルス遺伝子における機能的欠失を含有する場合、これらの
アデノウイルス遺伝子（またはその機能性フラグメント）は、ヘルパーウイルス
、パッケージング細胞またはそれらの組み合わせ物によって補足される。例えば
、本発明の組み換えベクター構築物がＥ１およびＥ４遺伝子における機能的欠失
を含む場合、ベクターは、Ｅ１／Ｅ４補足細胞系（例えば８４−３１、２７−１
８または１０−３細胞）における細胞を培養することによってウイルスキャプシ
ド中にパッケージされてもよい。あるいはまた、ベクターは、Ｅ４機能を供給す
るヘルパーウイルスの存在下でＥ１補足細胞系における細胞を培養することによ
ってパッケージされてもよい。同様に、アデノウイルス遺伝子において機能的欠
失を含有している本発明の他の組み換えベクターは、宿主細胞がすべての必要な
アデノウイルス遺伝子機能を供給しない場合、場合によってはヘルパーウイルス
の存在下で、選ばれた宿主細胞においてパッケージできる。宿主細胞およびいず
れかのヘルパーウイルスの選択は、当業者の能力で十分可能である。

【００４７】これらの宿主細胞およびヘルパーウイルスは当該技術分野において既知である
が、本発明の構築物は、そのような系において有意な利点を提供する。そのよう
な利点は、ヘルパーウイルスが生産のために要求される場合に多分もっとも容易
に認識される。また、ヘルパーウイルスを含有している培養物から所望のパッケ
ージされた組み換えアデノウイルスを分離することは、長い間、当該技術分野に
おいて示された問題であった。例えば、本発明の組み換えベクターが、すべてア
デノウイルス遺伝子の機能的欠失を含む場合、ヘルパーウイルスは、アデノウイ
ルス遺伝子ＩＸ機能を補足するために必要であり、そしていかなるアデノウイル
ス遺伝子の機能も宿主細胞によっては提供されない。１つの実施態様では、宿主
細胞系はＥ１補足細胞系（例えば２９３細胞）であり、そしてヘルパーウイルス
は、Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４、中期遺伝子ＩＸａおよび後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５を提供す
る。本発明の組成物は、そのような欠陥アデノウイルスの生産において先行技術
の方法以上の有意な利点を提供する。特に、本発明の組み換えアデノウイルスは
、他の組み換えアデノウイルス以上にパッケージングおよび増殖における利点を
有する。かくして、本発明の組み換えアデノウイルスは、この生産方法において
使用されるヘルパーウイルスを有意に凌ぐ（ｏｕｔｇｒｏｗ）。

【００４８】本発明の組み換えアデノウイルスベクターは、当業者には周知の方法を用いて
培養物から容易に精製することができる。ヘルパーウイルスは、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ
系［参照、ＷＯ９８／１００８６］、制限酵素系［”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓＵｓｅｆｕｌｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＶｉｒｕｓｅｓＷｈｉｃｈＲｅｑｕｉｒｅ
ＨｅｌｐｅｒＶｉｒｕｓｅｓ”について、２０００年１月７日出願の国際特
許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００４１５］を含む種々の既知の系のいずれかを用い
て培養物から除去されてもよい。ウイルスは、プラーク精製にかけられ、そして
溶解物が塩化セシウム遠心分離にかけられて精製ウイルスを得てもよい。細胞は
２〜３回凍結−融解にかけられる。得られる溶解物が回収のために遠心分離にか
けられ、そして上澄液が回収される。慣用の精製技術、例えば塩化物濃度勾配遠
心またはカラムクロマトグラフィーが、溶解物中の細胞タンパク質からｒＡｄを
濃縮するために使用される。

【００４９】ＩＩＩ．トランスジーンを宿主細胞に送達する方法本発明によるアデノウイルスは、イン・ビトロ、エクス・ビボおよびイン・ビ
ボの種々の使用に適している。

【００５０】本発明の組み換えアデノウイルスベクターは、いずれか適当な手段によって宿
主細胞に、選ばれたトランスジーンを送達するために使用されてもよい。１つの
実施態様では、ベクターおよび細胞がイン・ビトロで混合され、そして感染され
た細胞が慣用の方法を用いて培養される。

【００５１】あるいはまた、組み換えアデノウイルスベクターは、好ましくは生理学的に適
合しうるキャリヤー中に懸濁されて、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され
る。適当なキャリヤーは、例えば治療的かまたは予防接種かいずれか、ベクター
が向けられる徴候に鑑みて当業者によって容易に選択することができる。例えば
、１つの適当なキャリヤーは食塩水を含み、これは種々のバッファー溶液ととも
に製剤化されてもよい（例えば、リン酸バッファー食塩水）。他の代表的キャリ
ヤーは、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、
デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油および水を含む。キャリヤ
ーの選択は、本発明の制約にはならない。

【００５２】場合によっては、本発明の組成物は、組み換えアデノウイルスベクターおよび
キャリヤーに加えて、他の慣用の製薬成分、例えば保存剤、化学安定剤、または
ワクチン用途ではアジュバントを含有してもよい。適当な代表的保存剤は、クロ
ロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピ
ル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェ
ノールを含む。適当な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。適当な
代表的アジュバントは、中でも、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、３−Ｏ−デ
アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍＲｅｓｅ
ａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）を含むＬＰＳ類似体、鉱油およ
び水、水酸化アルミニウム、Ａｍｐｈｉｇｅｎ，Ａｖｉｒｄｉｎｅ，Ｌ１２１／
スクアレン、ムラミルペプチド、およびサポニン、例えばＱｕｉｌＡを含む。
標的器官、組織または部位への直接送達、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、皮内お
よび経口投与を含む、いかなる適当な投与経路が使用されてもよい。投与経路は
、反復治療または免疫化の経過内で組み合わされてもよい。

【００５３】１つの実施態様では、アデノウイルスは、一過性トランスジーン発現が治療的
である適用（例えば、がんにおけるｐ５３遺伝子移入および心疾患におけるＶＥ
ＧＦ遺伝子移入）のために適するとみなされてきた。しかしながら、アデノウイ
ルスは、一過性トランスジーン発現が望まれる場合の使用に限定されるものでは
ない。アデノウイルスは、選ばれたトランスジーンの送達および発現が望まれる
種々の状況のために有用である。

【００５４】Ｅ１欠失アデノウイルスの適当な用量は、治療されている症状、家畜およびヒ
ト患者の健康、年令および体重、および他の関連するファクターに依存して、当
業者によって容易に決定することができる。しかしながら、一般に、適当な用量
は、体重約８０ｋｇを有する成人では、１用量当たり１０¹⁰〜１０¹⁸、好ましく
は約１０¹³〜１０¹⁶ウイルス粒子の範囲内であってもよい。この用量は、生理的
に適合しうるキャリヤー約０．０１ｍｌ〜約１ｍｌに懸濁され、そしていずれか
適当な手段によって送達される。用量は、必要または所望により、毎日、毎週、
毎月、または他の選ばれた間隔で繰り返されてもよい。

【００５５】かくして、多重アデノウイルスパッケージングドメインを含有する本発明の組
み換えアデノウイルスベクターは、慣用のアデノウイルスベクターについて当該
技術分野において既知であるいずれの種々の遺伝子送達適用にも有用である。し
かしながら、これらの本発明の組み換えアデノウイルスは、本発明の構築物が、
慣用のアデノウイルスベクターに較べて、パッケージングを改善し、そしてより
高い収量の組み換えアデノウイルスを生成する点で有意な利点を提供する。

【００５６】次の実施例は、本発明の組み換えアデノウイルスベクターの作成およびその使
用を具体的に説明するために提供される。これらの実施例は本発明の範囲を限定
するものではない。当業者は、特定の構築物、試薬および条件が、次の実施例に
おいて略記されるが、本発明の精神および範囲によって包含されると考えられる
改変物が作成されることを理解できる。

【００５７】実施例１− 多重パッケージング部位を含む組み換えＥ１欠失アデノウイルスのためのクローニングベクターの作成組み換えアデノウイルスは、プラスミドシャトルベクターおよびＥ１領域に欠
失をもつＡｄ５ウイルス骨格間の相同組み換えをとおしてＥ１補足細胞において
生成される。

【００５８】重複のアデノウイルスパッケージングドメインを生成するために、慣用のポリ
メラーゼ連鎖反応技術が使用され、続いて挿入が正しいことを配列決定によって
確認できる。あるいはまた、重複アデノウイルスパッケージングドメインは、分
子クローニング技術を用いる生成されてもよい。

【００５９】次の実施例は、いずれか（ａ）Ａｄ５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−Ｖを含む本来の
Ａｄパッケージング／エンハンサー配列（ｎｔ２１８−３５４）、Ａｄ５配列２
１８−３５４のリピート、および元のままの反復要素ＶＩとＶＩＩを含む残りの
本来のＡｄパッケージング／エンハンサー配列を有するか、あるいは（ｂ）Ａｄ
５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−ＶＩ＋を含む本来のＡｄ５パッケージング／エンハン
サー配列（ｎｔ１８６−３７１）、Ａｄ５配列１８６−３７１のリピート、およ
び元のままの反復要素ＶＩＩを含む残りの本来のＡｄパッケージング／エンハン
サー配列を有する、ウイルス分離株Ｈ５．００１ＣＢｈＯＴＣからクローニング
ベクターを生成する。

【００６０】Ａ．第２パッケージングドメインとして反復要素Ｉ−Ｖを含む組み換えＡｄクローニングベクター前記のように５’ＩＴＲおよび重複する本来のＡｄ５パッケージングドメイン
要素Ｉ−Ｖを含有するアデノウイルス分離株が得られた。ＩＴＲおよび重複パッ
ケージングドメインを含有するフラグメントは、アデノウイルス分離株からＢａ
ｍＨＩ消化後の約１ｋｂフラグメントとして得られ、そしてフラグメントがＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化された
。続いて、Ａｄ５マップ単位（ｍ．ｕ．）０−１に対応する領域（重複Ａｄパッ
ケージングドメインを含む）が、ＰｓｔＩ−ＨｉｎｃＩＩ消化においてこの新ク
ローンから除去され、そしてクローンがポリメラーゼで埋められた。多重パッケ
ージングドメインを含むクローニングＡｄベクターのための改変ｐＡｄＬｉｎｋ
［ＧｉｌＨｏｎｇＰａｒｌｅｔａｌ，ＫｏｒｅａｎＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：９１−９７（１９９５）］を生成するために、ｐＡｄＬｉｎｋ（本
来のＡｄ５ｍｕ０−１、ポリクローニング部位およびＡｄ５ｍ．ｕ．９−１６を
含有する）が、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶにより消化されて本来のＡｄ５ｍ．ｕ
．０−１が除去され、そしてポリメラーゼで埋められた。続いて、重複パッケー
ジングドメインを含むＡｄ５ｍ．ｕ．０−１を含有するクローンが、ＮｈｅＩお
よびＥｃｏＲＶ部位中に挿入されて改変ｐＡｄＬｉｎｋが生成された。この改変
ｐＡｄＬｉｎｋ（Ｉ−Ｖ）は、ここに、（ａ）Ａｄ５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−Ｖを含む本来のＡｄパッケージング／エン
ハンサー配列（ｎｔ２１８−３５４）、Ａｄ５配列（ｎｔ２１８−３５４）のリ
ピート、および元のままの反復要素ＶＩとＶＩＩを含む残りの本来のＡｄパッケ
ージング／エンハンサー配列を含む、Ａｄ５ｍ．ｕ．０−１；（ｂ）ポリクローニング部位；および（ｃ）Ａｄ５ｍ．ｕ．９−１６：を含有する。１〜９間のＡｄ５ｍ．ｕ．の欠失
はＥ１領域における欠失に対応する。

【００６１】組み換えＡｄベクターを作成するためには、所望のプロモーターを含有するミ
ニカセット、トランスジーン配列およびポリＡ部位が、改変ｐＡｄＬｉｎｋ（Ｉ
−Ｖ）ベクターのポリクローニング部位中にサブクローン化された。

【００６２】Ｂ．第２パッケージングドメインとして反復要素Ｉ−ＶＩＩを含む組み換えＡｄクローニングベクター改変ｐＡｄＬｉｎｋは、ウイルス分離株Ｈ５．００１ＣＢｈＯＴＣから得られ
たＡｄ５マップ単位０−１が、前記のように重複する本来のＡｄ５パッケージン
グドメイン要素Ｉ−ＶＩ＋を含有する以外は、本質的には上記パートＡに記述さ
れるように構築された。改変ｐＡｄＬｉｎｋ（Ｉ−ＶＩ＋）は、ここに、（ａ）Ａｄ５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−ＶＩ＋を含む本来のＡｄパッケージング／
エンハンサー配列（ｎｔ１８６−３７１）、Ａｄ５配列（ｎｔ１８６−３７１）
のリピート、および元のままの反復要素ＶＩＩを含む残りの本来のＡｄパッケー
ジング／エンハンサー配列を含む、Ａｄ５ｍ．ｕ．０−１；（ｂ）ポリクローニング部位；および（ｃ）Ａｄ５ｍ．ｕ．９−１６：を含有する。１〜９間のＡｄ５ｍ．ｕ．の欠失
はＥ１領域における欠失に対応する。

【００６３】組み換えＡｄベクターを作成するためには、所望のプロモーターを含有するミ
ニカセット、トランスジーン配列およびポリＡ部位が、改変ｐＡｄＬｉｎｋ（Ｉ
−ＶＩ）ベクターのポリクローニング部位中にサブクローン化された。

【００６４】実施例２− 多重パッケージングドメインを含む組み換えＥ１欠失アデノウイルスの生産Ａ．重複アデノウイルスパッケージングドメイン要素Ｉ−Ｖを含む組み換えＡｄプラスミドシャトルベクターが、前記改変ｐＡｄＬｉｎｋ（Ｉ−Ｖ）から得ら
れる。ＳａｌＩ部位は、プラスミド、ｐＣＭＶβ［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ］中にこのプラスミドのフラグメントの単離を可能にする技術
を用いて導入されたが、このプラスミドは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー
、ＬａｃＺ遺伝子およびポリＡ部位を含有するミニジーン含んでいて、ミニジー
ンは既に一端においてＳａｌＩ部位と接している。その後、ミニジーンが，Ｓａ
ｌＩ消化によって改変ｐＣＭＶβプラスミドから得られ、そしてｐＡｄＬｉｎｋ
（Ｉ−Ｖ）中にクローン化されて、組み換えアデノウイルスの作成に有用なプラ
スミドシャトルベクターが生成された。プラスミドシャトルベクターは、５’か
ら３’まで：（ａ）Ａｄ５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−Ｖを含む本来のＡｄパッケージング／エン
ハンサー配列（ｎｔ２１８−３５４）、Ａｄ５配列（ｎｔ２１８−３５４）のリ
ピート、および元のままの反復要素ＶＩおよびＶＩＩを含む残りの本来のＡｄパ
ッケージング／エンハンサー配列を含む、Ａｄ５ｍ．ｕ．０−１；（ｂ）ＬａｃＺトランスジーンの発現を制御するＣＭＶプロモーター／エンハン
サー、およびポリＡ配列を含有する、レポーターミニジーン；および（ｃ）Ａｄ５ｍ．ｕ．９−１６：を含有する。１〜９間のＡｄ５ｍ．ｕ．の欠失
はＥ１領域における欠失に対応する。

【００６５】このプラスミドシャトルベクターが、ＣｌａＩ制限Ａｄ５骨格［ＡＴＣＣ］と
ともに、慣用のリン酸カルシウム技術［Ｂ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６８４−７０４（１９８７）］を用いて２９３細胞（アデノ
ウイルスタンパク質Ｅ１ａおよびＥ１ｂを発現する）中にトランスフェクション
される。相同組み換えをとおして、ベクターは、Ａｄ５キャプシド中にパッケー
ジされて、Ｅ１領域に欠失を含むシャトルベクターから要素（ａ）〜（ｃ）を含
有する組み換えアデノウイルスが生産される。

【００６６】組み換えＥ１欠失アデノウイルスは、慣用の技術、例えば音波処理および凍結
融解技術を用いて細胞ペレットから得られ、場合によっては続いてセシウム−塩
化物段階勾配によって精製される。多重パッケージングドメインの存在によって
提供される利点のために、Ａｄ５骨格を与えるウイルスに較べて、本発明の組み
換えアデノウイルスの有意に高い収量が得られる。

【００６７】Ｂ．重複の反復要素Ｉ−ＶＩＩを含む組み換えＡｄその他の組み換えアデノウイルスが、ｐＣＭＶＬｉｎｋ（Ｉ−ＶＩ＋）プラス
ミドが使用される以外は、類似の操作を用いて構築された。得られる組み換えア
デノウイルスは、５’から３’まで：（ａ）Ａｄ５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−ＶＩ＋を含む本来のＡｄパッケージング／
エンハンサー配列（ｎｔ１８６−３７１）、Ａｄ５配列（ｎｔ１８６−３７１）
のリピート、および元のままの反復要素ＶＩＩを含む残りの本来のＡｄパッケー
ジング／エンハンサー配列を含む、Ａｄ５ｍ．ｕ．０−１；（ｂ）ＬａｃＺトランスジーンの発現を制御するＣＭＶプロモーター／エンハン
サー、およびポリＡ配列を含有する、レポーターミニジーン；および（ｃ）Ａｄ５ｍ．ｕ．９−１６：を含有し、これらがＡｄ５キャプシド中にパッ
ケージされる。

【００６８】実施例３− 多重パッケージング部位を含む組み換えＥ１／Ｅ４欠失アデノウイルスの生産組み換えアデノウイルスは、プラスミドシャトルベクターと、Ｅ４領域に１．
９ｋｂの欠失を含むＣｌａＩ制限Ａｄ５変異ウイルス骨格、ｄｌ１００４［Ｂｒ
ｉｄｇｅａｎｄＧ．Ｋａｔｎｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：６０３１−６
０３８（１９８９）］との間の相同組み換えをとおしてＥ１／Ｅ４補足細胞にお
いて生成される。重複反復要素Ｉ−Ｖを含むプラスミドシャトルベクターは、５
’から３’まで：（ａ）Ａｄ５’ＩＴＲ、反復要素Ｉ−Ｖを含む本来のＡｄパッケージング／エン
ハンサー配列（ｎｔ２１８−３５４）、Ａｄ５配列（ｎｔ２１８−３５４）のリ
ピート、および元のままの反復要素ＶＩおよびＶＩＩを含む残りの本来のＡｄパ
ッケージング／エンハンサー配列を含む、Ａｄ５ｍ．ｕ．０−１；（ｂ）ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーター配列の制御
下で発現するヒト・オルニチントランスカルバミラーゼ、およびポリＡ配列を含
有する、レポーターミニジーン；および（ｃ）Ａｄ５ｍ．ｕ．９−１６：を含有する。

【００６９】プラスミドシャトルベクターは、ｄｌ１００４とともに、リン酸カルシウム技
術によって８４−３１細胞（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ４タンパク質を発現する）
中に導入される。相同組み換えをとおして、プラスミドシャトルベクターは、Ａ
ｄ５キャプシド中にパッケージされて、Ｅ１領域（△ｍ．ｕ．１−９）およびＥ
４領域（△ｍ．ｕ．〜９１．９−９７．１）に欠失を含むシャトルベクターから
要素（ａ）〜（ｃ）を含有する組み換えアデノウイルスが生産される。

【００７０】予備研究（データ未掲載）は、重複するパッケージングシグナルを有する組み
換えアデノウイルスでは、パッケージングおよび増殖の利点が存在することを示
した。この初期の研究は、ウイルスパッケージング配列の重複をとおして、Ｅ１
／Ｅ４欠失アデノウイルスベクター（重複アデノウイルスパッケージングドメイ
ンを含む）が、Ｅ１欠失ベクターのレベルに類似するレベルまで、Ｅ１／Ｅ４補
足細胞系において複製できることを示した。かくして、多重パッケージングドメ
インを含むこれらのＥ１／Ｅ４欠失ベクターは、先行技術の構築物を超えるベク
ター収量における２−３倍の増大を有する。類似の結果が、上記組成物により期
待される。

【００７１】実施例４− 多重パッケージング部位を含む組み換えＥ３欠失アデノウイルスの生産組み換えアデノウイルスは、２種のプラスミドシャトルベクター間の相同組み
換えをとおしてＥ１補足細胞において生成される。

【００７２】第１のプラスミドシャトルベクターは、本来の５’ＩＴＲおよび本来のＡｄ５
パッケージング／エンハンサードメイン、およびＡｄのｎｔ２４０−３４６［反
復要素Ｉ−Ｖを含有する］にわたる第２のパッケージングドメインを含む、アデ
ノウイルスマップ単位０−１６に対応するアデノウイルス配列を含有する。これ
らの配列は、本来のＡｄ５反復要素Ｉ−Ｖの増幅から得られたＰＣＲフラグメン
トとして元のままのＥ１領域を含有するプラスミド中にクローン化された。

【００７３】第２のプラスミドシャトルベクターは、機能がパッケージング細胞によって与
えられるＥ１領域（ｍ．ｕ．１−９）を除いては、パッケージングを可能にする
べく残りの必要なアデノウイルス配列を含有する。したがって、この第２のプラ
スミドシャトルベクターは、Ｅ３欠失の部位（ｍ．ｕ．７８．３−ｍ．ｕ．８５
．８）に挿入されたミニジーン（Ａｄｍ．ｕ．９−７８．３、ＣＭＶプロモータ
ー／エンハンサー配列の制御下で発現するレポーター遺伝子、ＬａｃＺ、および
ポリＡ配列を含む）を含有する。

【００７４】２種のプラスミドシャトルベクターが、２９３細胞（Ｅ１ａおよびＥ１ｂを発
現する）中にトランスフェクションされ、標準条件下で培養される。相同組み換
えをとおして、重複ＡｄパッケージングドメインおよびＥ３領域における欠失部
位（ｍ．ｕ．７８．３−ｍ．ｕ．８５．８）に位置するレポーターミニジーンを
含む、Ａｄ５ｍ．ｕ．０−３６を含有する組み換えアデノウイルスが得られた。
Ｅ１が元のままのアデノウイルスは、慣用の凍結融解技術を用いて培養物から得
られ、そしてセシウム−塩化物勾配による精製にかけられる。

【００７５】場合によっては、本発明の組み換えアデノウイルスは、他の２重シャトルプラ
スミドベクター系を用いて生産されてもよい。１つのそのような系では、第１の
プラスミドシャトルベクターは、５’ＩＴＲ、多重パッケージングドメイン、お
よび３’ＩＴＲを除く実質的にすべてのアデノウイルス遺伝子を含有する。第２
のプラスミドシャトルベクターは、元のままの３’ＩＴＲおよび効率的な相同組
み換えを可能にするのに十分なアデノウイルス配列を備え、そして５’ＩＴＲ、
パッケージング／エンハンサー領域および元のままのＥ１領域を欠如している。
当業者によって容易に設計できるこれと他の２種プラスミド系は、本明細書に記
述される方法、および当業者に周知の方法を用いて本発明による組み換えアデノ
ウイルスを生産するために有用である。

【００７６】本明細書に引用される全公表物は、引用によって本明細書に組み入れられてい
る。本発明は、特定の好適な実施態様に関して記述されているけれども、本発明
の精神から逸脱することなく、改変物が作成されることは理解されるであろう。
そのような改変物は付随する請求項の範囲内にはいることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウイルソン，ジエイムズ・エムアメリカ合衆国ペンシルベニア州19035グラドウイン・ノースアビニヨンドライブ 1350 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 DA02 EA02 FA15 GA11 HA17 4B065 AA95X AA95Y AA99Y AB01 BA02 CA44 4C084 AA13 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA13 NA14 4C087 AA01 BC83 NA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多重のアデノウイルスパッケージングドメインを含んでなる
組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】該ベクターがプラスミドである、請求項１記載のアデノウイ
ルスベクター。
【請求項３】該ベクターがウイルスである、請求項１記載のアデノウイル
スベクター。
【請求項４】該ベクターが、（ａ）アデノウイルス５’逆方向末端反復配
列（ＩＴＲ）、（ｂ）第１のアデノウイルスパッケージングドメイン、（ｃ）第
２のアデノウイルスパッケージングドメイン；（ｄ）トランスジーンの発現を導
く調節配列の制御下の選ばれたトランスジーン、および（ｅ）アデノウイルス３
’ＩＴＲを含んでなる、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】該パッケージングドメインが、５’逆方向末端反復に対して
３’に直接位置する、請求項４記載の組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】組み換えベクターが、アデノウイルスパッケージングドメイ
ンのリピートＩ−Ｖにわたるアデノウイルス領域の２コピーを含有する、請求項
４記載の組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】組み換えアデノウイルスベクターが、Ａｄ５の塩基対２１８
−３５４にわたるアデノウイルス領域の２コピーを含有する、請求項４記載の組
み換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】組み換えアデノウイルスベクターが、Ａｄ５の塩基対１８６
−３７１にわたるアデノウイルス領域の２コピーを含有する、請求項４記載の組
み換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】組み換えアデノウイルスベクターが、アデノウイルス初期遺
伝子Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ，Ｅ２ｂ、Ｅ３，Ｅ４，中期遺伝子ＩＸ，中期遺伝
子ＩＸａ，および後期遺伝子Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４およびＬ５のうちの１以上
において機能的欠失を含有する、請求項１記載の組み換えアデノウイルスベクタ
ー。
【請求項１０】組み換えアデノウイルスベクターが、本来のアデノウイル
スＥ１領域において欠失を含有する、請求項１記載の組み換えアデノウイルスベ
クター。
【請求項１１】組み換えアデノウイルスベクターが、Ｅ４領域において機
能的欠失をさらに含有する、請求項１０記載の組み換えアデノウイルスベクター
。
【請求項１２】組み換えアデノウイルスベクターが、Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ、Ｅ
２ａ，Ｅ２ｂ、Ｅ３およびＥ４から選ばれる遺伝子において変異を含有する、請
求項１０記載の組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項１３】組み換えアデノウイルスベクターが、（ａ）本質的に、（ｉ）アデノウイルス５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、（
ｉｉ）ＡリピートＩ−Ｖを含んでなる第１のアデノウイルスパッケージングドメ
イン、（ｉｉｉ）ＡリピートＩ−Ｖを含んでなる第２のアデノウイルスパッケー
ジングドメイン；（ｉｖ）３’アデノウイルスＩＴＲ；およびアデノウイルス遺
伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、中期遺伝子ＩＸ、中期遺伝子ＩＸａ、および後期
遺伝子Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３およびＬ５の各々における機能的欠失；からなるアデノ
ウイルス配列、ならびに（ｂ）トランスジーンの発現を導く調節配列の制御下の選ばれたトランスジーン
：を含有する、請求項１記載の組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項１４】（ａ）多重パッケージングドメインおよびトランスジーン
の発現を導く調節配列の制御下の選ばれたトランスジーン；ならびに（ｂ）生理的に適合しうるキャリヤー：を含んでなる製薬組成物。
【請求項１５】多重パッケージングドメインおよびトランスジーンの発現
を導く調節配列の制御下の選ばれたトランスジーンを含んでなる組み換えアデノ
ウイルスを宿主細胞に感染させる段階を含んでなる、該宿主細胞に選ばれたトラ
ンスジーンを送達する方法。
【請求項１６】少なくとも２個のアデノウイルスパッケージングドメイン
を含んでなる組み換えアデノウイルスベクターを宿主細胞に提供し、そしてウイ
ルスキャプシド中への該ベクターのパッケージングを可能にする条件下で該宿主
細胞を培養する段階を含む、選ばれた組み換えアデノウイルスのパッケージング
および収量を増進する方法。
【請求項１７】該組み換えアデノウイルスがＥ１領域において欠失を含有
する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】（ａ）２個のアデノウイルスパッケージングドメインおよ
び選ばれたトランスジーンを含有する組み換えアデノウイルスプラスミドであっ
て、機能性アデノウイルスの初期、中期および後期遺伝子を欠如している該プラ
スミド；および（ｂ）宿主細胞とともに、アデノウイルスキャプシド中への該組
み換えアデノウイルスプラスミドのパッケージングを可能にするのに十分なアデ
ノウイルス遺伝子機能を提供するヘルパーウイルスを；選ばれた宿主細胞において同時培養する段階を含む、機能性アデノウイルスの初
期、中期および後期遺伝子を欠如している組み換えアデノウイルスを作成する方
法。
【請求項１９】該２個のアデノウイルスパッケージングドメインの少なく
とも１個が、Ａ反復要素Ｉ−ＶＩＩからなる少なくとも１個の元のままの本来の
アデノウイルスパッケージングドメインを含有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】該２個のアデノウイルスパッケージングドメインの少なく
とも１個が、アデノウイルス配列のＡ反復要素Ｉ−Ｖを含有する、請求項１９記
載の方法。