JP2003501042A

JP2003501042A - 非哺乳動物ウイルス由来のキャリアベクターを使用する、組換えウイルスの産生のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2003501042A
Application number: JP2001500792A
Authority: JP
Inventors: シヤマクレイスティ，; マシューエイ．ゴンダ，; ハイフェンチェン，
Original assignee: ジェノボ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2003-01-14
Also published as: WO2000073480A1; AU5164700A; AU783672B2; EP1180158A1; CA2375119A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、外来ＤＮＡ挿入物を含み得るか、または点変異されたかもしくは欠失されたウイルスであり得る、組換えウイルスの高力価の産生において有用である、新規非哺乳動物キャリアベクターおよびウイルス、ならびにそれらのウイルスを産生する方法に関する。本発明は、工業的生産のために容易に大規模化され得るプロセスを用いて汚染ヘルパーウイルスの非存在下で本質的に均質な組換えウイルス調製物を製造するために、非哺乳動物および哺乳動物のウイルスが新規キメラベクターおよびウイルスを作製する特性を利用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、外来ＤＮＡ挿入物を含み得るか、または点変異されたかもしくは欠
失されたウイルスであり得る、組換えウイルスの高力価の産生において有用であ
る、新規非哺乳動物キャリアベクターおよびウイルス、ならびにそれらのウイル
スを産生する方法に関する。非哺乳動物キャリアベクター（「キャリアベクター
」）は、非哺乳動物宿主細胞における複製を可能にする非哺乳動物ウイルス骨格
のそれらの部分を含むキメラベクターである。このキャリアベクターは、種々の
核酸カセットを含み、このカセットは、所望の導入遺伝子を含む包埋された組換
えウイルスゲノムを含み得る。、その導入遺伝子を含む複製欠損組換えウイルス
の産生のために必要な成分、ならびに哺乳動物細胞にキャリアベクターが結合す
ることを可能にするドメインを含み得る。本発明はまた、実質的に均質な調製物
としての高い濃度の組換えウイルスの産生方法、その組換えウイルスを産生する
ための組成物、および新規組換えウイルスを提供する。

【０００２】（発明の背景）外来ＤＮＡ挿入物を有する組換えウイルスを使用して、細胞へ遺伝子が送達さ
れ得る。ここで、その遺伝子は、所望の場合発現されて、インビトロまたはイン
ビボでの組換えタンパク質の産生、ヒト哺乳動物および非ヒト哺乳動物のワクチ
ン接種、またはヒトもしくは非ヒト哺乳動物における疾患または遺伝子血管の処
置または改善を可能にする。疾患または遺伝子欠損は、正常な遺伝子産物、増加
した遺伝子産物のレベルを提供することによるか、または遺伝子（その遺伝子の
発現は、その細胞または生物にとって有害である）の内因性産生をブロックする
ことによって疾患もしくは遺伝子欠損の処置もしくは改善を可能にし得る。

【０００３】外因性遺伝子を哺乳動物細胞へと送達するための方法は、哺乳動物ウイルスベ
クターの使用を包含する（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス
ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、ハイブ
リッドウイルス（例えば、ハイブリッドアデノウイルスＡＡＶ、米国特許第５，
８５６，１５２号を参照のこと）など）由来のウイルスベクター。他の方法とし
ては、ＤＮＡの直接注入、遺伝子銃でのＤＮＡ投与、エレクトロポレーション、
リン酸カルシウム沈降、およびリガンドＤＮＡ結合体、ＤＮＡのリポソーム結合
体、ポリカチオンＤＮＡ複合体またはアデノウイルスリガンドＤＮＡ結合体を利
用する投与の方法が挙げられる。

【０００４】導入遺伝子は、目的のタンパク質をコードする核酸である。それは、遺伝子選
択または薬物選択を可能にする（例えば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝
子、または検出を可能にするレポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質の
使用の場合における呈色による）遺伝子である。あるいは、導入遺伝子は、矯正
の適用のために有用であるものであり得る。例えば、導入遺伝子は、患者の欠損
遺伝子の機能を置換または増強する正常遺伝子であり得る。導入遺伝子は、疾患
の効果と対抗するものであり得る（例えば、それが置換または増強するものとは
異なるが。欠損遺伝子の機能と同じ機能を有するかまたは補償する遺伝子の導入
および発現）。導入遺伝子は、患者における機能不全、変異またはウイルス遺伝
子の発現をブロックまたは抑制し、それにより矯正効果を生じる遺伝子であり得
る。導入遺伝子はまた、種々の因子に対する免疫のために用いられ得る。これは
、動物における免疫応答を惹起することによる。従って治療的導入遺伝子の患者
への送達は、欠損の矯正または疾患の予防をもたらす。導入遺伝子はまた、イン
ビトロでタンパク質の産生のために有用であるものであり得る（例えば、治療タ
ンパク質の大規模産生）。

【０００５】細胞における発現のために適切な遺伝子としては以下が挙げられるがそれらに
限定されない：細胞において正常に発現するが、その産物は、不十分な量で産生
される遺伝子。あるいは、発現に適切な遺伝子は、欠損遺伝子産物を置換する正
常遺伝子産物を発現し、変異された遺伝子から発現される細胞の変異体ＲＮＡを
修復もしくは破壊するリボザイムもしくはアンチセンス分子をコードし、または
ウイルスＲＮＡを改変もしくは破壊する、遺伝子である。インビトロでタンパク
質の産生のために用いられる導入遺伝子としては、分泌される因子（ホルモン、
増殖因子および酵素を含む）のようなタンパク質が挙げられる。

【０００６】多くの遺伝子治療方法は、患者において遺伝子の発現における欠損を克服する
外因性遺伝子を供給することを包含する。これらの欠損のいくつかは、先天性で
あり、そしてその患者のすべての細胞における特定の遺伝子における変異に起因
する。例えば、嚢胞性線維症において、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギ
ュレーター（ＣＦＴＲ）タンパク質が適切に機能することを妨げる、ＣＦＴＲを
コードする遺伝子において１つ以上の変異が存在する。他の場合において、遺伝
子発現における欠損は、患者の生活の間に生じる、事故または疾患に起因する。
例えば、Ｉ型糖尿病において、インスリンを生産するβ膵島細胞が破壊されてい
る。その結果、この疾患に罹患する患者はもはやインスリンを合成し得ない。他
の症例において、内因性遺伝子は、構造的に正常であり得るが、疾患、医学的処
置もしくは環境的条件、または内因性遺伝子の調節エレメントにおける変異に起
因して充分高い量で産生されない。赤血球細胞が充分産生されない、例えば、多
数の血液障害（例えば、貧血）が存在する。この障害は、エリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）またはＥＰＯをコードする導入遺伝子を用いて処置され得る。導入遺伝子
はまた、遺伝的免疫のため（すなわち、動物（ヒトを含む）における病原体に対
する免疫応答を惹起するため）に用いられ得る。例えば、導入遺伝子は、ウイル
ス、細菌または真菌の病原体（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）、またはヒト結核菌）由来の配列を包含し得る。

【０００７】特定の方法は、特定の組織（例えば、肝臓組織）へ外因性遺伝子を標的化して
送達することを受け入れる。特定の細胞へ遺伝子を送達する１つの方法は、細胞
特異的なレセプターの機能に依存する。アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳ
ＧＰ−Ｒ）（これは、肝細胞表面に存在する（Ｓｐｉｅｓｓｅｔａｌ．，１
９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：１０００９−１００１８））は、糖タンパク質
の末端ガラクトース残基に対する親和性を有するレクチンであり、そして肝臓の
肝細胞へと遺伝子送達を標的化するために用いられてきた。例えば、ＤＮＡ複合
体が細胞表面上のＡＳＧＰ−Ｒに結合され、肝臓の肝細胞による続いてのエンド
サイトーシスを可能にする。

【０００８】遺伝子送達適用において通常用いられるウイルスは、ウイルス核酸を所望の導
入遺伝子に置き換えることによって改変される。しばしば、ウイルスから除去さ
れるＤＮＡは、ウイルス複製またはキャプシド形成のために必要なタンパク質を
コードする。この場合、導入遺伝子を含む組換えウイルスは、複製欠損であり、
そして宿主内では複製もキャプシド形成もしない。複製およびキャプシド形成を
可能にするために、現在の方法は、欠失したＤＮＡのその部分が野生型または改
変されたウイルスによってあるいは要求される遺伝子産物をコードするＤＮＡを
含むプラスミドによって、供給されねばらないことを認識する。野生型または改
変されたウイルスの供給は、野生型または改変されたウイルスで汚染された組換
えウイルスストックを生じ得る。要求される遺伝子産物をコードするプラスミド
を同時トランスフェクションによって供給すると、組換えウイルス産生の効率の
低下が起こり、そして野生型ウイルスの汚染を生じる組換え事象も起こる。

【０００９】多数の異なるウイルスが哺乳動物細胞へ導入遺伝子を送達するために用いられ
てきている。これらのウイルスとしては、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（
ＨＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびヘルペスウ
イルスが挙げられる。ＡＡＶは、外来ＤＮＡ（すなわち、導入遺伝子）を細胞へ
送達するためのベクターとして魅力的である特有の特性を有し、そして種々の群
が疾患状態の処置におけるＡＡＶの可能な使用について研究されている。

【００１０】ＡＡＶはパルボウイルスであり、このゲノムは、長さがおよそ４．７ｋｂであ
り、１４５ヌクレオチドの反転末端反復（ＩＴＲ）を含む。このＡＡＶゲノムは
、２つの遺伝子ｒｅｐおよびｃａｐをコードする。これらの各々は、別個のオー
プンリーディングフレームから関連するタンパク質のファミリーを発現し、そし
て選択的ｍＲＮＡスプライシングの結果として生じた。Ｒｅｐポリペプチド（ｒ
ｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）は、ＡＡＶゲノムの複製
、レスキューおよび組込みに関与する。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およ
びＶＰ３）は、ビリオンキャプシドを形成する。ＡＡＶゲノムの、ｒｅｐおよび
ｃａｐのオープンリーディングフレームの５’および３’末端に隣接して、１４
５ＩＴＲが存在する。その最初の１２５ｂｐは、ＹまたはＴの形状の二重鎖構
造を形成し得る。ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸全体が切り出され得、そ
して導入遺伝子に置き換えられ得る（Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ「Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，Ｃ
ＲＣＰｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５−１６８（１９９０））。ＩＴＲは、ＡＡＶゲ
ノムの複製、レスキュー、パッケージングおよび組込みのための最小限に必要と
される配列を示す。この非病原性ヒトウイルスがヒト細胞に感染するとき、ウイルスゲノムは、第
１９染色体へと組み込まれ、細胞の潜在的感染を生じる。感染性ウイルスの産生
およびウイルスの複製は、溶解ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス（Ａ
ｄ）またはヘルペスウイルス）と同時感染されない限り生じない。ヘルパーウイ
ルスでの感染の際に、ＡＡＶプロウイルスは、レスキューおよび増幅され、そし
てＡＡＶウイルスおよびヘルパーウイルスの両方が産生される。感染する親のｓ
ｓＤＮＡは、二重鎖複製形態（ＲＦ）ＤＮＡへと、ｒｅｐ依存性の様式で変換さ
れる。レスキューされたＡＡＶゲノムは、予備形成されたタンパク質キャプシド
（直径約２０ｎｍの二十面体対称性）へとパッケージングされ、そして細胞溶解
後に、＋または−のいずれかのパッケージングされたｓｓＤＮＡゲノムを有する
、感染ビリオンとして放出される。しかし、所望の導入遺伝子の形態でＤＮＡを
送達するための形質導入ベクターとしてＡＡＶを樹立するための進歩は種々の理
由から遅々として進んでいない。

【００１１】ｒｅｐおよびｃａｐの配列を所望の導入遺伝子に置き換えることで、導入遺伝
子を送達して宿主細胞へと標的化し得る組換えウイルスが生じる。しかし、ＡＡ
Ｖが特定のゲノムパッケージングサイズを要求することから、導入遺伝子の追加
により、ｒｅｐおよびｃａｐに必要な遺伝子機能の欠損が生じる。現在の方法に
おいて、導入遺伝子によって置換される必要な遺伝子機能は、ウイルスまたはさ
らなるプラスミドによって供給される。さらに、ヘルパーウイルス機能について
ＡＡＶが要求することはまた、ヘルパーウイルス（野生型またはクリップルウイ
ルスのいずれか）またはそのヘルパーウイルス機能を含むプラスミドの使用を要
求する。

【００１２】組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するために用いられる１つの方法は
、ｒＡＡＶを含むプラスミド（シスプラスミド）およびｒｅｐおよびｃａｐを含
むプラスミド（トランスプラスミド）で真核生物細胞を同時トランスフェクトす
ること、およびヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイ
ルス）に細胞を感染させることを包含する。以下を参照のこと：米国特許第５，
７５３，５００号。この方法の欠点は、ｒＡＡＶベクターストックがヘルパーウ
イルスに汚染されていることである。これは、労働集約的であり、かつ、そのヘ
ルパーウイルスから分離することが困難であり、そしてヘルパーウイルスによる
感染と一緒に２つのプラスミドの同時トランスフェクトすることでは不十分であ
り、そしてｒＡＡＶの工業的生産のために容易にスケールアップすることはでき
ない。

【００１３】ｒＡＡＶを産生するために用いられた第二の方法は、真核生物細胞の三連のプ
ラスミドトランスフェクションを含む。この方法において、１つのプラスミドは
、導入遺伝子およびＩＴＲ（シスプラスミド）を有し、第二のプラスミドは、ｒ
ｅｐおよびｃａｐの遺伝子（ｔｒａｎｓプラスミド）をコードし、そして第三の
プラスミドは、ヘルパーウイルス機能（すなわち、アデノウイルス遺伝子（例え
ば、Ｅｌａ、Ｅｌｂ、Ｅ２ａおよびＥ４（ヘルパープラスミド））をコードする
。この方法の欠点は、三連のトランスフェクションがまた不十分であり、そして
スケールアップが困難であることである。

【００１４】第三の方法は、パッケージング細胞株（例えば、ＡＡＶ機能ｒｅｐおよびｃａ
ｐを含むもの）の使用を包含する。以下を参照のこと：米国特許第５，６５８，
７８５号および米国出願ＰＣＴＵＳ９８／１９４６３。このパッケージング細
胞株は、導入遺伝子およびＩＴＲを含むシスプラスミドでトランスフェクトされ
得、そして野生型アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパーに感染させられ得る。以下を
参照のこと：米国特許第５，６５８，７８５。あるいは、パッケージング細胞株
は、ハイブリッドＡｄ／ＡＡＶ（このハイブリッドＡｄベクターは、Ｅ１遺伝子
にシスプラスミドを有し（以下を参照のこと：米国特許第５，８５６，１５２号
））、およびＥ１を供給する野生型または変異体Ａｄによって同時感染され得る
。この方法の欠点は、野生型Ａｄが産生され得ることである。これは、患者にお
ける使用の前にｒＡＡＶベクターから分離されねばならない。

【００１５】従って、組換えＡＡＶを産生する現在の方法は、容易に大規模化して工業的生
産して、多数の患者の処置のために必要な薬学的組成物に必須の均質のウイルス
を多量に得ることができない。

【００１６】非哺乳動物ウイルスを使用して、哺乳動物または非哺乳動物のいずれかの細胞
において特定の個々の外因性タンパク質を一過的に発現させてきた。例えば、Ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスすなわちバキュロウイルスのウイルス（
これは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目のメンバーに通常感染する）が、昆虫細胞に
おいて外因性遺伝子を発現するために用いられてきている。バキュロウイルスは
また、哺乳動物細胞に侵入することが報告されており、そしてバキュロウイルス
ＤＮＡは、哺乳動物細胞の核抽出物において検出されている（Ｖｏｌｋｍａｎ
ｅｔａｌ．，１９８３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４
５：１０８５−１０９３）。哺乳動物細胞におけるバキュロウイルス媒介性遺伝
子発現の１つの報告が出現しているが、この著者は、後のその細胞のそのウイル
スとの長期のインキュベーションの後にその細胞において有されるレポーター遺
伝子産物に、見かけのレポーター遺伝子活性を帰させた（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ
ｅｔａｌ．，１９８７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５
３：１４１２−１４１７）。これらの著者は、バキュロウイルスゲノムの部分と
してその外因性遺伝子がその細胞へのアクセスを得ると、その外因性遺伝子は、
デノボで発現されないことを報告した。続いての研究によって、哺乳動物細胞に
おいて特定のタンパク質のバキュロウイルス媒介遺伝子発現が実証された（Ｂｏ
ｙｃｅｅｔａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，９３：２３４８−２３５２）。

【００１７】バキュロウイルスが哺乳動物細胞における特定のタンパク質を発現するために
用いられている（以下を参照のこと：米国特許第５，７３１，１８２号）が、バ
キュロウイルスは、容易に大規模化される工業化プロセスを用いて複製欠損組換
えウイルスの薬学的組成物を産生するために用いられていない。米国特許第５，
７３１，１８２号において開示されているように、バキュロウイルスのゲノムは
、リガンドＤＮＡの挿入によって改変され得る。このリガンドＤＮＡは、バキュ
ロウイルスが哺乳動物細胞に結合および侵入することを可能にする哺乳動物レセ
プター特異的タンパク質をコードする遺伝子を含有する。哺乳動物細胞に感染す
る非哺乳動物ウイルスは、哺乳動物細胞内の導入遺伝子の一過的発現のみを可能
にする。さらに、米国特許第５，７３１，１８２号において開示される方法は、
高力価で、すべて異なるが本質的に均質な組換えウイルスの産生を生じない。

【００１８】ヘルパーウイルスの非存在下および大規模工業生産に適用可能な効率的な方法
によって産生される組換え複製欠損ウイルスを生成する課題は、本発明までは解
決されていなかった。現在のウイルス産生方法は、費用がかかりかつ時間がかか
る精製および濃縮の工程を包含し、そして薬学的な適用に十分な組換えウイルス
を産生し得ない。例えば、ＡＡＶの場合、現在の方法は、１プロデューサー細胞
あたり、最大で１０⁴〜１０⁵の桁のゲノムコピー（ｇｃ）の組換えウイルスを産
生する。同様に、現在の方法は、１プロデューサー細胞あたり１０⁴の桁の粒子
量で組換えアデノウイルス、および１プロデューサー細胞あたり１０²〜１０⁴の
桁のコロニー形成単位（ｃｆｕ）のレトロウイルスを産生するために適切である
。現在の産生方法は、薬学的適用の前に、不活化されねばならないか、そして／
または最終産物から除去されねばならないヘルパーウイルスの汚染を生じる。従
って、哺乳動物細胞に所望の導入遺伝子を送達し得るか、またはそのような組換
えウイルスの使用によりウイルスもしくは細菌の感染に対して細胞を免疫し得る
組換えウイルスを安定な様式で産生するために、他の汚染ウイルスを含まずに高
力価で組換え哺乳動物ウイルスを製造する方法に対する成就されていない必要性
が存在する。

【００１９】（発明の要旨）本発明は、工業的生産のために容易に大規模化され得るプロセスを用いて汚染
ヘルパーウイルスの非存在下で本質的に均質な組換えウイルス調製物を製造する
ために、非哺乳動物および哺乳動物のウイルスが新規キメラベクターおよびウイ
ルスを作製する特性を利用する。本質的に均質な組換えウイルスは、種々の目的
で使用され得る。これには、薬学的適用のために、所望の導入遺伝子を哺乳動物
細胞に送達することが含まれる。この薬学的適用には、免疫および遺伝子欠損の
矯正；インビボ、インビトロおよびエキソビボでの一過的および安定な遺伝子移
入；インビボまたはインビトロでのタンパク質の生産；および例えば、化合物を
スクリーニングするための発現ライブラリーの生産において、または容易にトラ
ンスフェクトされない細胞中に遺伝子を導入するために、細胞への高レベルの遺
伝子形質導入が必要とされる他の方法が含まれる。

【００２０】本発明のキャリアベクターは、非哺乳動物ウイルスの核酸に由来するキメラベ
クター骨格であり、そして以下のエレメントのうち１つ以上を含む：１）包埋さ
れた組換えウイルスゲノム；２）組換えウイルスゲノムの複製およびキャプシド
形成のために必要とされるタンパク質をコードする核酸配列；３）ヘルパー機能
をコードする核酸配列（産生されるべき組換えウイルスがヘルパー依存性である
場合（例えば、ＡＡＶ））；４）哺乳動物細胞と相互作用し得るリガンドをコー
ドする核酸配列；ならびに５）非哺乳動物ウイルス骨格において、または複製欠
損部分またはその改変において核酸配列を調節する調節制御配列。このキャリア
ベクターはまた、複製欠損組換えウイルスを産生するために必要である他の任意
の核酸配列を含み得る。

【００２１】本発明の１つの実施形態において、１つ以上のキャリアベクターは、特定の宿
主細胞または細胞株において複製欠損組換えベクターを産生するに必要とされる
エレメントのすべてを含み得る。必要とされるエレメントの数および型は、使用
される特定の宿主細胞および産生される組換えベクターの型に依存する。例えば
、組換えＡＡＶベクターが所望され、そしてその宿主細胞株が、そのゲノムにお
いてｒｅｐおよびｃａｐを安定に組み込んだ細胞株である場合、そのキャリアベ
クター（単数または複数）は、以下を含む：１）ＡＡＶＩＴＲおよび導入遺伝
子を含む包埋された組換えウイルスゲノム、および２）ｒＡＡＶの複製およびキ
ャプシド形成のために必要である任意の核酸配列を含み得る。例えば、これらの
ヘルパー機能は、アデノウイルス（Ａｄ）からのＥ１、Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲＦ６
およびＶＡＩのいずれか１つまたは組合せを含み得る。組換えＡＡＶベクターが
ｒｅｐおよびｃａｐを発現しない宿主細胞株で産生されるべきである場合、その
キャリアベクターまたはベクター（単数または複数）はまた、ｒｅｐおよびｃａ
ｐをコードするＤＮＡ配列を含み得る。

【００２２】あるいは、組換えレトロウイルスが所望される場合、そのキャリアベクターま
たはベクターは以下を含む：１）レトロウイルスＬＴＲまたは異種プロモーター
から駆動される、レトロウイルスＬＴＲおよび目的の導入遺伝子を含む、包埋さ
れた組換えウイルスゲノム、および２）宿主細胞において供給されない、レトロ
ウイルスの複製およびキャプシド形成の機能のためのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎ
ｖの任意の１つまたは組合せをコードするＤＮＡ配列。好ましい実施形態におい
て、特定の宿主細胞において組換えウイルスを産生する必要なエレメントのすべ
ては、単一のキャリアベクターにおいて含まれる。なぜなら、宿主細胞によって
供給されないすべての機能を有する、単一のキャリアベクターの使用は、形質導
入の効率を増大させ、そして包埋された組換えウイルスの工業的生産のためによ
り容易に大規模化され得るからである。

【００２３】代替の実施形態において、そのキャリアベクターは、包埋された組換えウイル
スゲノムを含み、そして任意の必要な複製、キャプシド形成および／またはヘル
パーの機能は、ヘルパーウイルスまたはプラスミドによって提供される。

【００２４】包埋される組換えウイルスゲノムは、哺乳動物ウイルスの複製に必要な導入遺
伝子およびＤＮＡエレメントを含み得る。この導入遺伝子は、目的の遺伝子、発
現を調節する調節エレメント、および任意のＤＮＡスペーサ−を含む。この導入
遺伝子には、ＡＡＶのＩＴＲ、レトロウイルスのＬＴＲ、またはアデノウイルス
のＩＴＲのような、哺乳動物ウイルスの複製のために必要な、ＤＮＡエレメント
が隣接する。この組換えウイルスゲノムは、非哺乳動物ウイルス骨格内に包埋さ
れ、必要に応じて、上記に列挙される他のＤＮＡ配列の１つ以上が伴い、本発明
のキメラキャリアベクターが生じる。

【００２５】代替の実施形態において、包埋される組換えウイルスゲノムは、導入遺伝子を
含まないが、その組換えウイルスゲノム自体は、点変異または欠失を含む。この
実施形態において、点変異または欠失は、続いて産生される組換えウイルスの複
製を減弱するように機能する。この減弱化される組換えウイルスは、ワクチン摂
取のために有用であり得る任意のウイルスであり得る。これには、以下が挙げら
れるがそれらに限定されない：ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス）；
肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎のウイルス）；風邪適合される
（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）ＲＳウイルス（ＲＳＶ）；風邪適合されるインフ
ルエンザウイルス；パラインフルエンザウイルス１型、２型および３型；ならび
にロタウイルス。

【００２６】そのキャリアベクターは、そのネイティブ宿主細胞において複製能を有する。
例えば、バキュロウイルス骨格を使用することで、昆虫細胞において複製能を有
するキメラキャリアベクターを生じる。対照的に、包埋される組換えウイルスゲ
ノム（必要に応じて導入遺伝子を含む）は、切り出され得ず、複製され得ずおよ
びビリオンへとパッケージングされ得ない。なぜなら、そのプロモーターは、昆
虫細胞において不活性であるからである。しかし、一旦そのキメラキャリアベク
ターが、哺乳動物細胞に感染すると、その許容性のネイティブ細胞においてその
キャリアベクターの複製およびパッケージングに必要な、その必須の遺伝子産物
はもはや発現されない。従って、そのキャリアベクターは、哺乳動物細胞におい
て複製されず、そしてその代わりにその哺乳動物細胞内に一過的に存在する。

【００２７】対照的に、一旦そのキャリアベクターが哺乳動物細胞に感染すると、その包埋
される組換えウイルスゲノムおよび他の哺乳動物ＤＮＡ配列を制御するキャリア
ベクター内のその哺乳動物調節配列が活性化され、その結果、その組換えウイル
スゲノムは、そのキャリアベクターから切除され得、そして複製され得る。その
組換えウイルスのキャプシドを形成するキャプシドタンパク質が発現され、その
結果、その組換えウイルスゲノムがキャプシド形成される。このことにより、感
染性組換えウイルスが生じる。この組換えウイルスは、本質的に、キャリアベク
ターを含まない。なぜなら、そのキャリアベクターは、哺乳動物細胞において複
製されないからである。

【００２８】好ましい実施形態において、その組換えウイルスは、複製欠損である。なぜな
ら、その新たに形成されたビリオンには複製機能もヘルパー機能も存在しないか
らである。すなわち、その組換えウイルスは、ネイティブウイルスゲノムのコー
ド領域の部分またはすべてを欠く。組換えウイルスがヘルパー依存性である本発
明の実施形態（例えば、ｒＡＡＶ）において、その組換えウイルスは、機能的な
複製およびキャプシド形成機能の両方を欠く。その組換えウイルスがヘルパー依
存性ではない本発明の実施形態において、その組換えウイルスは、機能的複製を
コードする領域または他の必須の遺伝子を欠く。

【００２９】ヘルパー機能が組換えウイルス産生に必要である場合、キャリアベクターが必
要なヘルパー機能を含むときに、ヘルパーウイルスの同時感染および続いての産
生を必要とすることなく組換えウイルスが産生され得る。従って、本発明は、ヘ
ルパーウイルスの非存在下で目的の特定の組換えウイルスの実質的に純粋かつ本
質的に均質の調製物の溶解物を得る。

【００３０】従って、本発明は、組換えウイルスを製造するための現在の方法よりも多くの
利点を有する。これらの利点としては以下が挙げられる：（１）非哺乳動物ウイ
ルス骨格は、組換えウイルス産生の効率を犠牲にすることなく大きなＤＮＡ配列
の挿入を可能にする；（２）哺乳動物細胞にとって通常毒性である配列（例えば
、ＡＡＶｒｅｐ、ＶＳＶ−Ｇ、レトロウイルスエンベロープタンパク質、真核
生物調節タンパク質など）は、非哺乳動物キャリアベクターの非哺乳動物宿主細
胞においてそれらの哺乳動物調節配列から実質的な量で発現されず、そして従っ
て、非哺乳動物宿主細胞においてその複製の経過の間非哺乳動物キャリアベクタ
ーによって寛容され得る；（３）非哺乳動物ウイルスは、哺乳動物細胞において
複製せず、最終の真核生物ベクターストックに非哺乳動物キャリアベクターが汚
染することを除外する；（４）いくつかの実施形態において、ヘルパーウイルス
は必要ではなく、その結果、最終組換えウイルス調製物は、ヘルパーウイルスを
本質的に有しない；（５）相同または非相同の組換えに起因して野生型ウイルス
産生の頻度が最小限化される；そして（６）本発明の方法は、それら自身が複製
欠損である組換えウイルスの大規模産生に特に適切である。さらに、非哺乳動物
ウイルスは、哺乳動物細胞に対して通常病原性でなく、無血清培地において増殖
し得、そして高力価へと増殖し得る。本発明の他の特徴および利点は、以下の図
面、本明細書において記載される本発明の説明およびその好ましい実施形態、お
よび実施例から明らかである。

【００３１】１つの実施形態において、本発明は、複製欠損組換えウイルスベクターを産生
することが必要であるエレメントを含有する非哺乳動物キャリアベクターを含む
。好ましい実施形態において、非哺乳動物キャリアベクターは、複製欠損組換え
ウイルスベクターを産生することが必要であるエレメントを全て含む。さらによ
り好ましい実施形態において、単一の哺乳動物キャリアベクターは、複製欠損組
換えウイルスベクターを産生するのに必要なエレメントを全て含む。別の好まし
い実施形態において、その非哺乳動物キャリアベクターはバキュロウイルスであ
る。

【００３２】別の実施形態において、本発明は、ヘルパーウイルスも他の汚染ウイルスも含
まない、複製欠損組換えウイルスベクター溶解物およびストックを産生する方法
を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、組換えウイルスベクター
の工業的生産のために容易に大規模化される方法である。別の好ましい実施形態
において、この方法は、高力価の組換えウイルスベクターの溶解物およびストッ
クが得られる方法である。

【００３３】別の実施形態において、本発明は、減弱化された複製適合組換えウイルスおよ
びヘルパーウイルスも他の汚染ウイルスも含まないそのようなウイルスを産生す
る方法を包含する。好ましい実施形態において、これらの減弱化され、複製適合
のウイルスは、免疫のために使用され得る。

【００３４】（発明の詳細な説明）（定義および一般的な技術）そうでないと定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術お
よび科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと
同じ意味を有する。本発明の実施では、そうでないと示されない限り、化学、分
子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、ウイルス学および免疫学の通常の
技術が使用される。以下を参照のこと：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ
．，１９８９，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９２，Ｈａｒｌｏｗｅｔ
ａｌ．１９８９（これらは、本明細書において参考として援用される）。

【００３５】「組換えウイルスゲノム」は、ウイルスゲノムのすべてまたは部分を含む。こ
こで、そのウイルスゲノムは、野生型であってもよく、点変異もしくは欠失を含
んでいてもよく、そして必要に応じて、発現制御配列に作動可能に連結される導
入遺伝子を含む。１つの実施形態において、この導入遺伝子には、隣接エレメン
トが隣接する。本発明の組換えウイルスゲノムは、そのキャリアベクターのゲノ
ム内に包埋され、そしてそれは最終的に組換えウイルスへとパッケージングされ
る。

【００３６】「組換えウイルス」とは、上記の組換えウイルスゲノムに由来するウイルスで
ある。組換えウイルスは、導入遺伝子を含み得、導入遺伝子を含まない、減弱化
され、複製適合のウイルスを含み得、１つ以上の点変異を含む複製適合ウイルス
であり得、あるいは１つ以上の点変異もしくはゲノム欠失またはそれらの組合せ
を有する複製欠失ウイルスであり得る。導入遺伝子を含む組換えウイルスは、哺
乳動物細胞を形質導入し得、そしてその導入遺伝子をそれに送達し得る。

【００３７】「隣接エレメント（ｆｌａｎｋｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）」または「隣接核酸
」とは、導入遺伝子が隣接する位置に配置される場合、組換えウイルスへのその
導入遺伝子のパッケージングを可能にする、一般に哺乳動物ウイルスに由来する
核酸配列である。隣接エレメントは、組換えウイルスのパッケージングを容易に
する哺乳動物ウイルスに由来する天然に存在する隣接エレメントであり得るか、
または同じもしくは類似のパッケージング機能を有する、人工の核酸エレメント
（例えば、隣接エレメントの変異された配列）であり得る。隣接エレメントとし
ては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＡＡＶまたはＡｄの反転末端反
復（ＩＴＲ）、レトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）の「α」またはパッケージング配列、ならびに当該分野において公知
の他のウイルスに由来するパッケージングのために必要な他の任意の配列。

【００３８】「導入遺伝子」とは、哺乳動物細胞に送達または移入されるべき核酸配列であ
る。導入遺伝子は、マーカー、レポーターまたは治療分子として有用である、タ
ンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。導入遺伝子はまた、タ
ンパク質産生、診断アッセイのため、あるいはインビトロまたはインビボで一過
性もしくは安定な任意の遺伝子移入のために有用である、タンパク質、ポリペプ
チドまたはペプチドをコードし得る。あるいは、導入遺伝子は、タンパク質をコ
ードしなくてもよいが、むしろそれと相補的な核酸の複製、転写もしくは翻訳を
阻害するため、または分解について相補的なｍＲＮＡを標的化するための、アン
チセンス分子、リボザイムまたは他の調節核酸として使用され得る。

【００３９】「発現制御配列」とは、目的の遺伝子に作動可能に連結されることによって遺
伝子の発現を調節する核酸配列である。「作動可能に連結される（た）」配列と
は、目的の遺伝子と連続的である発現制御配列、およびトランスまたはある距離
で目的の遺伝子を制御するように作用する発現制御配列の両方を包含する。発現
制御配列は、以下を含む：適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列お
よびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプラ
イシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化す
る配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；
タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望の場合、タンパク質分泌を増強
する配列。

【００４０】本明細書において使用される「キャリアベクター」とは、非哺乳動物ウイルス
核酸骨格、ならびに哺乳動物供給源、哺乳動物ウイルス供給源、非哺乳動物供給
源および非哺乳動物ウイルス供給源に由来する核酸配列を含む核酸分子を意味す
る。非哺乳動物ウイルス核酸骨格は、広汎で種々の供給源から選択され得る。例
えば、以下を参照のこと：米国特許第５，７３１，１８２号の表１（この特許は
、本明細書に擱いて参考として援用される）。非哺乳動物ウイルス核酸骨格は、
非哺乳動物細胞へキャリアベクター核酸をトランスフェクトする際に、そのキャ
リアベクターへと挿入される核酸配列を含む、パッケージングされたキャリアウ
イルスを産生するに十分である。

【００４１】「キャリアウイルス」とは、哺乳動物細胞に結合し得、そしてそのキャリアベ
クターのゲノムをその細胞の核へと送達し得る、キャプシド形成されたキャリア
ベクターである。

【００４２】本明細書において使用される「リガンド核酸」とは、本発明のキャリアウイル
スを哺乳動物細胞へと結合させ、そして侵入させることを可能にするタンパク質
をコードする核酸を意味する。そのタンパク質をコードする核酸は、そのリガン
ドをコードする核酸の発現を調節する発現制御配列に作動可能に連結され得る。

【００４３】「ヘルパー機能核酸」とは、１つ以上のタンパク質、ペプチドまたはポリペプ
チドをコードするか、またはＲＮＡに転写される、１つ以上の核酸配列であり、
ここで、その１つ以上のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたはＲＮＡは、
組換えウイルスの産生のために特定のウイルスによって必要とされる。その配列
は、天然に存在するヘルパー機能であり得るか、または変異されたかもしくは変
更されたがそのそれぞれのヘルパー機能を保持する配列であり得る。この配列は
、ヘルパーウイルスに由来し得るか、または組換えウイルスの産生のためのヘル
パー機能として作用する非ウイルスタンパク質をコードする、天然に存在するか
もしくは人工の核酸配列であり得る。ＲＮＡに転写されるか、またはタンパク質
、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする核酸配列は、ヘルパー機能をコー
ドする核酸の発現を調節する発現制御配列に作動可能に連結され得る。

【００４４】「複製および／またはキャプシド形成核酸」とは、組換えウイルスの複製およ
びキャプシド形成に必要なタンパク質またはポリペプチドをコードする、核酸配
列（単数または複数）である。この配列は、天然に存在する複製またはキャプシ
ド形成の配列であり得るか、あるいは変異されもしくは変更されたが、複製もし
くはキャプシド形成のそれらのそれぞれの機能を保持する配列であり得る。その
タンパク質をコードするその核酸配列は、複製およびキャプシド形成の配列をコ
ードする核酸の発現を調節する発現制御配列に作動可能に連結され得る。

【００４５】「レプリコン」とは、エピソーム性複製起源であり、そして核酸複製を開始す
るそれらの必要なタンパク質（またはこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ）
である。

【００４６】（キャリアベクター）本発明のキャリアベクターは、非哺乳動物ウイルスの核酸に由来するキメラベ
クター骨格である。このキャリアベクターは、適切な非哺乳動物宿主細胞で複製
およびキャプシド形成され得るに十分なベクター配列を含む。そのキャリアベク
ターはまた、以下の挿入物のうち１つ以上を含む：包埋された組換えウイルスゲ
ノム；哺乳動物細胞と相互作用し得るタンパク質の発現を提供するリガンド核酸
；組換えウイルスを複製およびキャプシド形成するために必要な複製および／ま
たはキャプシド形成核酸；ならびにヘルパーウイルス機能核酸。

【００４７】好ましい実施形態において、そのキャリアベクターは、非哺乳動物ウイルスゲ
ノム骨格内に包埋される組換えウイルスゲノムを含む。この組換えウイルスゲノ
ムは、発現調節配列に関連する導入遺伝子を含み得る。ここで、その導入遺伝子
および調節配列は、哺乳動物ウイルスの隣接するエレメントに囲まれる。あるい
は、その組換えウイルスゲノムは、導入遺伝子を含まないが、その配列において
欠失もしくは点変異を含み、その結果、それは、減弱化された複製能のある組換
えウイルス、または複製欠損組換えウイルスを産生する他の欠失もしくは点変異
を産生する。

【００４８】より好ましい実施形態において、そのキャリアベクターは、包埋される組換え
ウイルスゲノムおよび以下のいずれかまたはその両方を含む：１）複製および／
またはキャプシド形成をコードする核酸配列、ならびに２）ヘルパー機能をコー
ドする核酸配列。本発明のさらにより好ましい実施形態において、そのキャリア
ベクターは、哺乳動物細胞と相互作用し得るタンパク質の発現を提供するリガン
ド核酸をさらに含む。別の好ましい実施形態において、そのリガンド核酸は、特
定の哺乳動物細胞レセプターに結合し得るタンパク質をコードする。

【００４９】最も好ましい実施形態において、そのキャリアベクターは、包埋される組換え
ウイルスゲノム、および哺乳動物細胞における組換えウイルスの産生に必要なそ
れらの核酸挿入物の全てを含む。例えば、そのキャリアベクターを含むそのキャ
リアウイルスが組換えＡＡＶウイルスについて複製およびキャプシド形成のタン
パク質を発現する細胞株に感染するために使用されるべき場合（例えば、米国特
許第５，６５８，７８５号に記載されるＡ６４細胞株、およびＰＣＴＵＳ９８
／１９４６３に記載されるＢ５０細胞株）、そのキャリアベクターは、包埋され
る組換えウイルスゲノムおよびヘルパー機能、ならびに必要に応じてそのリガン
ド核酸を含む。あるいは、キャリアウイルスが組換えＡＡＶウイルスについてヘ
ルパー機能を発現する細胞株に感染するために使用されるべき場合（例えば、Ｅ
１を発現する２９３細胞株）、そのキャリアベクターは、包埋される組換えウイ
ルスゲノム、ＡＡＶについての複製およびキャプシド形成核酸（ｒｅｐおよびｃ
ａｐ）、ならびにＥ１に加えて必要されるヘルパー機能（例えば、Ｅ２ａ、Ｅ４
ＯＲＦ６およびＶＡＩＲＮＡ）、ならびに必要に応じてそのリガンド核酸を含
む。

【００５０】そのキャリアウイルスが、ヘルパー機能を必要としない組換えレトロウイルス
を産生するために使用されるべき場合、そのキャリアベクターは、包埋される組
換えレトロウイルスウイルスゲノムならびにその複製およびキャプシド形成につ
いて必要とされる核酸（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、ならびに必要
に応じてそのレトロウイルスがレンチウイルスである場合、調節または補助タン
パク質をコードする核酸（例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）
の１つ以上を含む。そのキャリアウイルスがｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖまたは
レンチウイルスの場合の上記の他の機能を発現する細胞株において、組換えレト
ロウイルスを産生するために使用されるべき場合、そのキャリアウイルスは、包
埋される組換えレトロウイルスゲノムおよび必要に応じてリガンド核酸のみを含
むことが必要である。同様に、そのキャリアウイルスが、組換えアデノウイルス
を産生するために使用されるべき場合、そのキャリアベクターは、包埋される組
換えアデノウイルスゲノムおよびその複製およびキャプシド形成のために必要と
される核酸配列を含む。その組換えアデノウイルスゲノムの複製およびキャプシ
ド形成のために必要とされる核酸配列の型は、組換えアデノウイルスゲノムから
欠失されるアデノウイルス遺伝子、およびキャリアウイルスが感染する哺乳動物
細胞株が任意のアデノウイルス遺伝子を発現する（例えば、２９３細胞がＥ１を
発現する）かどうかに依存する。任意のキャリアベクターゲノムハイブリダイゼ
ーション、哺乳動物のキャリアウイルスによる感染を増大させるリガンド核酸を
必要に応じて含み得る。

【００５１】包埋される組換えウイルスゲノムおよび他の核酸挿入物は、別個のキャリアベ
クターに保有され得るが、最も好ましい実施形態において、包埋される組換えウ
イルスゲノムおよび全ての他の所望の核酸挿入物は、単一のキャリアベクター上
に保有される。単一のキャリアベクターの利点は、その哺乳動物宿主細胞のその
キャリアウイルスによる単一の感染のみが組換えウイルスを産生するために必要
とされることである。

【００５２】本発明の別の実施形態において、そのキャリアベクターが哺乳動物細胞におい
て複製することができないことは、そのキャリアベクターに対して哺乳動物レプ
リコンを供給することによって克服される。レプリコンの提供は、そのキャリア
ベクターによって感染される哺乳動物細胞が、増殖しかつ分裂する哺乳動物細胞
の集団のすべてで染色体外でキャリアベクターの十分なコピー数を維持すること
を確実にする。

【００５３】この説明に基づいて、キャリアベクターの他の実施形態は、当業者に容易に明
白である。

【００５４】（非哺乳動物ウイルス骨格）そのキメラキャリアベクターは、非哺乳動物ウイルス骨格から構築される。そ
の骨格は、非哺乳動物ウイルスのゲノム全体である必要はないが、非哺乳動物宿
主における複製に必要なゲノムのその部分のみであり得る。好ましくは、そのベ
クター骨格は、無脊椎動物ウイルスに由来する。米国特許第５，７３１，１８２
号の表１は、キメラベクターの骨格を形成するために使用され得るウイルスのい
くつかの例を列挙する。その配列は、Ｇｅｎｂａｎｋのような種々の供給源から
利用可能である。好ましい実施形態において、無脊椎動物ＤＮＡウイルスは、バ
キュロウイルスである。より好ましい実施形態において、バキュロウイルスは、
グラニュロウイルスまたは核多角体ウイルスである。さらにより好ましい実施形
態において、非哺乳動物ウイルス骨格は、バキュロウイルスオートグラファ核多
角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する。例えば、以下を参照のこと：ＧｅｎＢ
ａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ２２８５８。

【００５５】好ましい実施形態において、その非哺乳動物ウイルス骨格は、その通常の宿主
細胞において複製を行ない得なければならないが、哺乳動物細胞において複製を
行ない得ない。例えば、本明細書において例示されるそのバキュロウイルス骨格
は、昆虫細胞においてのみ複製する。

【００５６】（包埋される組換えウイルスゲノム）本発明の方法は、高力価の組換えウイルス（すなわち、哺乳動物細胞を標的に
するために送達されるようにそこに挿入される導入遺伝子を有する組換えウイル
ス、または導入遺伝子を有しないがむしろウイルス遺伝子において変異もしくは
欠失を有し、そしてワクチンとして使用されるべき組換えウイルス（例えば、減
弱化されおよび複製能のある組換えウイルスまたは複製欠損変異体ウイルス））
の大規模産生を可能にする。その組換えウイルスは、哺乳動物細胞に導入遺伝子
を送達するために使用するため、またはワクチンとして使用するための、任意の
目的のウイルスであり得る。導入遺伝子の送達のための好ましい組換えウイルス
は、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス
アンプリコン、およびＢ型肝炎ウイルスを包含する。

【００５７】導入遺伝子を含む組換えウイルスを製造するために、本発明の方法は、所望の
導入遺伝子で開始し、次いで、適切な発現調節配列（ＥＲＳ）（例えば、プロモ
ーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位）と導入遺伝子とを会合させ、次い
でこのＥＲＳ導入遺伝子構築物を、そこに通常見出される遺伝子の代わりに、製
造されるべきウイルスのパッケージングエレメントの間に挿入する。置換の長さ
が置換されるべきものよりも短く、そしてそのより短い長さが適切なパッケージ
ングに対して障害を提示する場合、必要に応じてスペーサーまたは「スタファー
」（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列が、パッケージングのための適切な長さを維持するた
めに挿入され得る。隣接エレメントによって囲まれて構築されるＥＲＳ導入遺伝
子の構築物全体は、本発明の組換えウイルスのゲノムであり、次いでこれは、そ
のキャリアベクターのゲノム内へと包埋され、その点でそれは、包埋された組換
えウイルスゲノムとして存在する。これらのエレメントの各々は、以下に詳述さ
れる。

【００５８】（導入遺伝子）導入遺伝子配列の組成は、得られる組換えウイルスのための意図される使用に
依存する。例えば、導入遺伝子配列の１つの型は、レポーターまたはマーカーの
配列を含み、これは、発現の際に、検出可能なシグナルを生成する。そのような
レポーターまたはマーカーの配列としては、以下をコードするＤＮＡ配列が挙げ
られるがそれらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉβラクタマーゼ、βガラクトシダ
ーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、グリー
ン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ、真核生物膜結合タンパク質（例えば
、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質、ならびに
それらに指向される高親和性抗体が存在するか、または慣用的に作製され得る当
該分野において周知の他のものを含む）、ならびにとりわけ赤血球凝集素または
ｍｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合される膜結合タンパク質を含む融合
タンパク質。

【００５９】調節エレメントと会合するときその発現を駆動するこれらの配列は、酵素、Ｘ
線撮影、比色、蛍光または他の分光法のアッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ
および免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび免疫組織化学）を含む、従
来の手段によって検出可能な信号を提供する。例えば、その導入遺伝子がＬａｃ
Ｚ遺伝子である場合、組換えウイルスの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性につ
いてのアッセイによって検出される。同様に、その導入遺伝子がルシフェラーゼ
である場合、その組換えウイルス遺伝子発現は、ルミノメータにおいて光生成に
よって測定され得る。

【００６０】しかし、所望である場合、その導入遺伝子は、この方法によって生成される組
換えウイルスを介して細胞または動物へと送達され得る非マーカー遺伝子である
。その導入遺伝子は、生物学および医学において有用な広汎で種々の遺伝子産物
（タンパク質、アンチセンス核酸（例えば、ＲＮＡ）、または触媒ＲＮＡ）から
選択され得る。本発明を使用して、遺伝子欠損を矯正または改善し得る。ここで
、正常な遺伝子は発現されるが、正常レベル未満で発現される。そしてまた、本
発明を使用して遺伝子欠損を矯正または改善し得る。ここで、機能的な遺伝子産
物は発現されない。導入遺伝子配列の好ましい型は、治療遺伝子であり、これは
、宿主細胞内で所望の矯正遺伝子産物を発現する。これらの治療核酸配列は、代
表的には、発現の際に、遺伝性または非遺伝性の遺伝子欠損を矯正し得、補完し
得または補償し得、あるいは後天性の障害または疾患を処置し得る、産物をコー
ドする。しかし、選択される導入遺伝子は、研究にとって所望される任意の産物
をコードし得る。その導入遺伝子配列の選択は、本発明の限定ではない。導入遺
伝子配列の選択は、本願の教示に従って、当業者の技術常識内である。

【００６１】本発明はまた、複数サブユニットタンパク質によって生じる遺伝子欠損を矯正
または改善するために使用され得る、組換えウイルスおよびその組成物を産生す
る方法を包含する。特定の状況において、異なる導入遺伝子を使用して、そのタ
ンパク質の各々のサブユニットをコードし得る。これは、そのタンパク質サブユ
ニットをコードするＤＮＡの大きさが大きな場合（例えば、免疫グロブリンまた
は血小板由来増殖因子レセプターについて）に所望され得る。細胞が複数サブユ
ニットタンパク質を生成するために、細胞は、異なるサブユニットの各々を発現
する組換えウイルスに感染される。

【００６２】あるいは、およびより好ましくは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ
導入遺伝子によってコードされ得る。この場合、単一の導入遺伝子は、そのサブ
ユニットの各々をコードするＤＮＡを含み、各々のサブユニットについてＤＮＡ
は、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。ＩＲＥＳの使用
は、複数遺伝子またはポリシストロン性ｍＲＮＡの作製を可能にする。ＩＲＥＳ
エレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボゾームスキャニングモデル
を回避し得、そして内部部位で翻訳を開始し得る（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒａｎｄ
Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルス科（ポリオウイルスおよ
び脳心筋炎）の２つのメンバーに由来するＩＲＥＳエレメントが記載されている
（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒａｎｄＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。同様に、哺
乳動物ｍＲＮＡに由来するＩＲＥＳもまた記載されている（Ｍａｃｅｊａｋａ
ｎｄＳａｒｎｏｗ，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーデ
ィングフレームに連結され得る。ＩＲＥＳエレメントにより、各々のオープンリ
ーディングフレームは、効率よい翻訳のためにリボソームにアクセス可能である
。従って、複数の遺伝子は、単一のプロモーター／エンハンサーを用いて発現さ
れて、単一のメッセンジャーを転写し得る。これは、そのサブユニットの各々を
コードするＤＮＡの大きさが十分に小さくそのサブユニットをコードするＤＮＡ
およびＩＲＥＳの合計がそのウイルスが包含し得るＤＮＡ挿入物の最大の大きさ
を超えない場合に好ましい。例えば、ｒＡＡＶについて、挿入物の大きさは、お
よそ４．８キロベースよりも小さくあり得る。しかし、そのヘルパー機能の全て
を欠くアデノウイルスについて、その挿入物の大きさは、およそ２８キロベース
である。

【００６３】有用な遺伝子産物は、ホルモン、増殖因子および分化因子を包含し、これらと
しては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：インスリン、グルカゴン、
成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、成長ホル
モン放出因子（ＧＲＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモ
ン（ＡＣＴＨ）、プロラクチン、メラトニン、バソプレッシン、β−エンドルフ
ィン、ｍｅｔ−エンケファリン、ｌｅｕ−エンケファリン、プロラクチン放出因
子、プロラクチン阻害因子、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホ
ルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモ
ン（ＬＨ）、絨毛膜性ゴナドトロピン（ＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、エンドスタチン、顆粒球コロニー刺
激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧ
Ｆ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ２、酸性線維芽細胞増
殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子
ａ（ＴＧＦａ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉお
よびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβを含むトランスフォーミ
ング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのいずれか１つ、アクチビン、
インヒビン、または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）のいずれか１つ（ＢＭＰ
１−１５）、ヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ
）増殖因子ファミリーのいずれか１つ、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄
養性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＮＴ
−６、毛様体神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）、神経膠細胞株由来神経栄養性因子（
ＧＤＮＦ）、ニュルトゥイン（ｎｅｕｒｔｕｉｎ）、ペルセフィン（ｐｅｒｓｅ
ｐｈｉｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、セマフォリン／コラプシンのファミリー
のいずれか１つ、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
、エフリン、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃｈ
ｅｄｇｅｈｏｇ）およびチロシンヒドロキシラーゼ。

【００６４】他の有用な遺伝子産物としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない、
免疫系を調節するタンパク質が挙げられる：サイトカインおよびリンホカイン（
例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ−ｌα
、ＩＬ−ｌβ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７
、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉ
Ｌ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、およびＩＬ−１７））、単球化学誘引性タ
ンパク質（ＭＣＰ−１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単
球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ
（ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、インターフェロン（ＩＦＮ）ＩＦＮ−α、ＩＦＮ
−βおよびＩＦＮ−γ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド。免疫系に
よって産生される遺伝子産物もまた、本発明に包含される。これらとしては、以
下が挙げられるがそれらに限定されない：免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細
胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩおよ
びクラスＩＩのＭＨＣ分子、ならびに操作されたＭＨＣ分子（単鎖ＭＨＣ分子を
含む）。有用な遺伝子産物としてはまた、補体調節タンパク質（例えば、膜補因
子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＤ
５９が挙げられる。

【００６５】なお他の有用な遺伝子産物としては、以下が挙げられる：ホルモン、増殖因子
、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質につい
てのレセプターの任意の１つ。そのようなレセプターの例としては、とりわけ以
下が挙げられる：ｆｌｔ−１、ｆｌｋ−ｌ、ＴＩＥ−２、ｔｒｋファミリーのレ
セプター（例えば、ＴｒｋＡ、ＭｕＳＫ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧＦ
レセプター、ＨＥＲ２、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＦＧＦ
ファミリーのレセプター、ＴＧＦβレセプター、インターロイキンレセプター、
インターフェロンレセプター、セロトニンレセプター、αアドレナリン作動性レ
セプター、βアドレナリン作動性レセプター、ＧＤＮＦレセプター、ｐ７５ニュ
ーロトロフィンレセプター。本発明は、細胞外マトリクスタンパク質についての
レセプター（例えば、インテグリン）、膜貫通結合タンパク質についての対向レ
セプター（例えば、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−
３およびＩＣＡＭ−４））、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、ならびにセレクチ
ン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンを包含する。本発明
は、コレステロール調節のためのレセプターを包含する。これには、ＬＤＬレセ
プター、ＨＤＬレセプター、ＶＬＤＬレセプター、およびスカベンジャーレセプ
ターが含まれる。本発明は、これらのレセプターについてのアポリポタンパク質
リガンド（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶおよびＡｐｏＥを含む）を包含する。本発
明はまた、ステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーのような遺伝子産
物包含する。これには、グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセ
プター、ビタミンＤレセプターおよび他の核レセプターが含まれる。さらに、有
用な遺伝子産物としては、以下が挙げられる：抗細菌性ペプチド（例えば、デフ
ェンシンおよびマガイニン（ｍａｇｉｎｉｎ））、転写因子（例えば、ｊｕｎ、
ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ｍｙ
ｂ、ＭＲＧ１、ＣＲＥＭ、Ａｌｘ４、ＦＲＥＡＣ１、ＮＦ−κＢ、ロイシンジッ
パーファミリーのメンバー、Ｃ２Ｈ４ジンクフィンガータンパク質（Ｚｉｆ２６
８を含む、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、Ｃ６ジンクフィンガータンパク質）（グルココ
ルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプターを含む）、ＰＯＵドメイン
タンパク質（Ｐｉｔｌに例示される）、ホモドメインタンパク質（ＨＯＸ−１を
含む）、塩基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質（ｍｙｃ、ＭｙｏＤ
およびミオゲニンを含む）、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２
Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、
ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インタ
ーフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合
タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質（例えば、ＧＡＴＡ
−３）、ならびにフォークヘッドファミリーのウイング付きへリックスタンパク
質。

【００６６】他の有用な遺伝子産物としては、以下が挙げられる：カルバモイルシンセター
ゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ
、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒ
ドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１アンチトリプシン、グ
ルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩ因
子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ
因子、第ＸＩ因子、フォンビルブラント因子、スーパーオキシドジスムターゼ、
グルタチオンペルオキシダーゼおよびグルタチオンレダクターゼ、ヘムオキシゲ
ナーゼ、アンギオテンシン変換酵素、エンドセリン−２、心房ナトリウム利尿性
ペプチド、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、プラスミノゲンアクチベーター、
ヘパリン補因子ＩＩ、活性化プロテインＣ（第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ）、プロテイ
ンＣ、アンチトロンビン、シスタチオンβシンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキ
シラーゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣ
ｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒ
ドロゲナーゼ、インスリン、βグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、
肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ（
Ｐ−タンパク質とも称される）、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、メンケス病タン
パク質、腫瘍サプレッサー（例えば、ｐ５３）、嚢胞性線維症膜貫通レギュレー
ター（ＣＦＴＲ）、ウィルソン病遺伝子ＰＷＤの産物、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキ
シドジスムターゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラ
ーゼ、アセチルコリンシンセターゼ、プロホルモンコンバターゼ、プロテアーゼ
インヒビター、ラクターゼ、リパーゼ、トリプシン、胃腸酵素（キモトリプシン
を含む）、ならびにペプシン、アデノシンデアミナーゼ、α１アンチトリプシン
、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）、ＧＬＵＴ−１、ＧＬ
ＵＴ−２、トレハロースホスフェートシンターゼ、ヘキソキナーゼＩ、ＩＩおよ
びＩＩＩ、グルコキナーゼ、コラーゲンの個々の鎖または型の任意の１つ以上、
エラスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンおよびテ
ネイシン、ならびに自殺遺伝子（例えば、チミジンキナーゼおよびシトシンデア
ミナーゼ）。

【００６７】他の有用な導入遺伝子としては、以下が挙げられる：天然に存在しないポリペ
プチド（例えば、キメラまたはハイブリッドのポリペプチド、または挿入、欠失
、またはアミノ酸置換を含む天然に存在しないアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド）。例えば、操作された単鎖免疫グロブリンは、特定の免疫無防備状態の患者
において有用であり得る。他の有用なタンパク質は、それらの膜貫通ドメインお
よび細胞質ドメインを欠く短縮型レセプターを含む。これらの短縮型レセプター
の機能を使用して、それらのそれぞれのリガンドを、そのレセプターによる同時
性のシグナル伝達なしにそれらに結合することによって、アンタゴナイズし得る
。他の型の天然に存在しない遺伝子配列としては、アンチセンス分子および触媒
核酸（例えば、リボザイム）が挙げられる。これは、遺伝子の過剰発現を減少す
るために使用され得る。

【００６８】他の有用な導入遺伝子としては、免疫応答を生成し得る抗原性ペプチドをコー
ドするものが挙げられる。これらの導入遺伝子を含む組換えベクターは、遺伝免
疫のために使用され得る。有用な導入遺伝子としては、以下に特異的なペプチド
をコードする導入遺伝子が挙げられる：エプスタイン−バーウイルス；ＨＩＶ；
サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩおよびＩＩ（Ｈ
ＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ）；Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎
およびＥ型肝炎；仮性狂犬病ウイルス；狂犬病ウイルス；サイトメガロウイルス
；ＲＳウイルス；パラインフルエンザウイルス１型〜４型；流行性耳下腺炎ウイ
ルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；麻疹ウイルス；インフルエンザウイルス
Ａ型、Ｂ型およびＣ型；ロタウイルス；単純ヘルペスウイルス１型および２型；
水痘帯状疱疹ウイルス；ヒトヘルペスウイルス６型；ハンタウイルス；アデノウ
イルス；ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ｃｈｌａｍｙｄｉａｔ
ｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、
ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；不定型マイコバクテリア；
ネコ白血病ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ウシ免疫不全ウイルス；ウマ感染
性貧血ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス；ビスナウイルス；Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種。その導入遺伝子はまた、
腫瘍および癌について免疫を提供するために腫瘍抗原からのペプチドに対して指
向され得る。

【００６９】（発現制御配列）多数の発現制御配列（ネイティブ、構成的、誘導性、および／または組織特異
的のもの）が当該分野において公知であり、そしてこれを利用してその導入遺伝
子、ならびにその組換えウイルスの複製およびキャプシド形成の機能、そのヘル
パー機能およびそのリガンドをコードする核酸配列の発現を駆動し得る。発現制
御配列の選択は、所望される発現の型に依存する。真核生物の細胞について、発
現制御配列は、代表的に、プロモーター、エンハンサー（例えば、免疫グロブリ
ン遺伝子に由来するもの、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなど）、およびスプ
ライスドナーおよびアクセプター部位を含み得るポリアデニル化配列を包含する
。そのポリアデニル化配列は概して、導入遺伝子配列の後でかつ、その導入遺伝
子の３’隣接配列の前に挿入される。本発明において有用な導入遺伝子を有する
分子はまた、所望に応じてプロモーター／エンハンサー配列とその導入遺伝子と
の間に配置されるイントロンを含み得る。１つの可能なイントロン配列はまた、
ＳＶ−４０に由来し、そしてＳＶ−４０Ｔイントロン配列と称される。使用さ
れ得る別のベクターエレメントは、上記のような内部リボソーム進入部位（ＩＲ
ＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列を使用して、単一の遺伝子転写物からの１つを超え
るポリペプチドを産生する。ＩＲＥＳ配列導入は、遺伝子のため、または複製お
よびキャプシド形成のポリペプチド、ヘルパー機能もしくはそのリガンドをコー
ドする他の任意の核酸配列のために使用され得る。これらおよび他の一般的なベ
クターエレメントの選択は、慣用的であり、そして多くのそのような配列が利用
可能である［例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌおよび
そこに引用される（例えば、３．１８−３．２６および１６．１７−１６．２７
において引用される）参考文献およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］。

【００７０】１つの実施形態において、高レベルの構成的発現が所望される。そのようなプ
ロモーターの例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：レトロウ
イルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター／エンハンサー、サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー［例えば、以
下を参照のこと：Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３
０（１９８５）］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモー
ター、細胞質βアクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧ
Ｋ）プロモーター。

【００７１】別の実施形態において、誘導性プロモーターが所望され得る。誘導性プロモー
ターは、シスまたはトランスのいずれかで、外因的に供給される化合物によって
調節されるものであり、これには以下が挙げられるがそれらに限定されない：亜
鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅ
ｘ）−誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラ
ーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］；エクジソン昆虫プロモーター
［Ｎｏｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３
：３３４６−３３５１（１９９６）］；テトラサイクリン抑制性系［Ｇｏｓｓｅ
ｎｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５
４７−５５５１（１９９２）］；テトラサイクリン誘導性系［Ｇｏｓｓｅｎｅ
ｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；以下
もまた参照のことＨａｒｖｅｙｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）］；ＲＵ４８６−誘導性系［Ｗ
ａｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１
９９７）およびＷａｎｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，４：４３２−
４４１（１９９７）］；ならびにラパマイシン誘導性系［Ｍａｇａｒｉｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９
７）；Ｒｉｖｅｒａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８
−１０３２（１９９６）］。他の型の誘導性プロモーターであって、この状況に
おいて有用であり得るものは、特定の生理学的状態（例えば、温度、急性期、ま
たは複製細胞のみ）によって調節されるものである。好ましい実施形態において
、導入遺伝子は、ＡＡＶのネイティブｐ５プロモーターの制御下にある。

【００７２】別の実施形態において、導入遺伝子または目的の核酸配列のためのネイティブ
プロモーターが使用される。ネイティブプロモーターは、その導入遺伝子または
核酸配列の発現がネイティブ発現を模倣すべきことが望ましい場合に好ましくあ
り得る。そのネイティブプロモーターは、その導入遺伝子または他の核酸配列の
発現が一過的または発生的、あるいは組織特異的な様式で、あるいは特定の転写
刺激に応答して調節されなければならない場合に使用され得る。さらなる実施形
態において、他のネイティブ発現制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメ
ント、ポリアデニル化またはＫｏｚａｋコンセンサス配列）はまた、ネイティブ
発現を模倣するために使用され得る。

【００７３】１つの実施形態において、その組換えウイルスゲノムは、組織特異的なプロモ
ーターに作動可能に連結される導入遺伝子を含む。例えば、骨格筋における発現
が所望される場合、筋肉において活性なプロモーターが使用され得る。これらに
は、とりわけ以下が挙げられる：骨格αアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロ
フィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、
ならびに天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成筋肉プロモー
ター［以下を参照のこと：Ｌｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１
７：２４１−２４５（１９９９）］。組織特異的であるプロモーターの例は、と
りわけ、以下について公知である：肝臓［アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイ
ルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，
３：１００２−９（１９９６）；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈ
ｎｏｔｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．．７：１５０３−１４（
１９９６）］、骨［ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，Ｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７）；骨シアロタンパク
質、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６
５４−６４（１９９６）］、リンパ球［ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重
鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖］、神経［ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プ
ロモーター，Ａｎｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂ
ｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３）、神経フィラメント軽鎖遺伝子、Ｐ
ｉｃｃｉｏｌｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．８８：５６１１−５（１９９１）；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃ
ｃｉｏｌｉｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．１５：３７３−８４（１９９５）］
。

【００７４】当然、全てのベクターおよび発現制御配列が本発明の導入遺伝子または他の核
酸配列のすべてを発現するにおいて等価に良好に機能するとは限らない。しかし
、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくこれらの発現制御配列のなかか
ら選択を行ない得る。選択される適切な宿主細胞において機能する適切なプロモ
ーター／エンハンサーの配列は、本願によって提供されるガイダンスを用いて当
業者によって選択され得る。そのような選択は、慣用的な事項であり、そして分
子または構築物を限定するものではない。

【００７５】所望の核酸配列について適切な発現制御配列を同定する１つの方法において、
１つ以上の発現制御配列を選択し得、そして調節されるべき核酸配列にその発現
制御配列を作動可能に連結し得る。次いで、発現制御配列および調節される配列
を含むこれらの作動可能に連結される配列をキャリアベクターのゲノムへ挿入し
得る。１つの実施形態において、発現制御配列および導入遺伝子を含む組換えウ
イルスゲノムを、本発明の非哺乳動物ベクターへと挿入し得る。本明細書におい
て教示されるような組換えベクターを産生およびパッケージングするための方法
の１つの後に、インビトロまたはインビボで適切な細胞に感染させ得る。その細
胞におけるその導入遺伝子のコピー数は、サザンブロットまたは定量ＰＣＲによ
ってモニタリングされ得る；ＲＮＡ発現のレベルは、ノーザンブロットまたは定
量ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングされ得；そしてタンパク質発現のレベルは
、ウェスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ、導入遺伝子の遺伝
子産物の生物学的活性の試験（インビトロまたはインビボのいずれか）、あるい
は、遺伝子欠損の矯正もしくは改善のための試験によってモニタリングされ得る
。同様な様式で、１つ以上の発現制御配列を選択し得、そして複製およびキャプ
シド形成タンパク質、ヘルパー機能またはリガンドをコードする核酸配列にその
選択された発現制御配列を作動可能に連結し得、そして本発明のベクターへとそ
の得られた所望の核酸分子を挿入し得る。また、１つ以上のベクター複製配列を
選択肢得、そして本発明のベクターへとそれらを挿入し得る。パッケージングお
よび非哺乳動物細胞への感染後、例えば、そのリガンドの発現に対するまたはそ
のベクターの複製に対するその特定の効果を、上記の方法の一つによって測定し
得る。また、機能的試験を使用して、リガンドをコードする核酸配列に作動可能
に連結される１つ以上の特定の発現制御配列が哺乳動物細胞に効率的に感染し得
るキャリアウイルスを産生するか否かを判定し得る。多数の異なる発現制御配列
をアッセイして、哺乳動物細胞感染についてどれが最も有効であるかを判定し得
る。同じことは、種々のベクター複製配列を用いて行われ得る。

【００７６】さらに、哺乳動物宿主細胞への感染および組換えウイルスの獲得の後、その組
換えウイルスで哺乳動物細胞を感染させ得、次いで複製およびキャプシド形成の
タンパク質ならびに／またはヘルパー機能の発現を、上記の方法のうちの１つに
よって測定し得る。また、機能的試験を使用して、１つ以上のヘルパー機能また
は複製もしくはキャプシド形成機能に作動可能に連結される１つ以上の特定の発
現制御配列が感染性の組換えウイルスの産生を支持し得るか否かを判定し得る。
多くの発現制御配列のうちどれが、高力価の感染性組換えウイルスを産生するに
おいて最も有効であるかを判定し得る。

【００７７】（隣接エレメント）隣接エレメント（ｆｌａｎｋｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）は、多くのウイルスの
複製、切除およびパッケージングのために必要とされ、そして各々の型のウイル
スがその自分の型の隣接エレメントを有する。野生型ウイルスにおいて、これら
のエレメントは、そのウイルスＤＮＡが宿主細胞染色体に組み込まれるときに、
そのウイルス遺伝子に隣接する。ウイルスに組み込まれる場合、その野生型ウイ
ルスが宿主染色体からレスキューされるとき、その隣接エレメントは、ウイルス
ＤＮＡとともに切除され、そしてビリオンへのパッケージングのために適切な形
態においてレスキューされるウイルスＤＮＡの周りの隣接する位置に残留する。
非組み込み型染色体外ウイルス（例えば、ＨＳＶ）について、隣接配列は、ＤＮ
Ａ複製およびパッケージングにおける機能を果たす。組換えウイルスにおいて、
隣接エレメントの間のウイルス核酸配列の多くまたはすべては、ウイルスから除
去され、そして導入遺伝子およびその関連する発現調節配列に置換される。

【００７８】本発明の１つの実施形態において、その組換えウイルスは、組換えアデノウイ
ルスであり、そして発現調節配列およびそのアデノウイルス隣接エレメントに作
動可能に連結された選択された導入遺伝子を含む。アデノウイルス隣接エレメン
トは、ＩＴＲであり、そして１００−２００ｂｐ長である。多数のアデノウイル
ス隣接エレメントが公知である（例えば、ヒトアデノウイルス１型から４６型、
チンパンジーアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ウシアデノウイルスに由来
するもの（すべて、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａ
ｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９から入手可能である）。

【００７９】別の実施形態において、その組換えウイルスは、組換えレトロウイルスであり
、そして発現調節配列およびレトロウイルス隣接エレメントに作動可能に連結さ
れた選択された導入遺伝子を含む。その隣接エレメントは、レトロウイルスゲノ
ムの５’末端および３’末端に存在する長末端反復（ＬＴＲ）配列である。これ
らのＬＴＲは、強力なプロモーターおよびエンハンサーの配列を含み、そしてま
た、宿主細胞のゲノムにおける組み込みに必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０
）。多数のレトロウイルスＬＴＲが公知である。例えば、以下を参照のこと：米
国特許第５，６７２，５１０号。

【００８０】本発明のさらに別の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶであ
り、そして発現調節配列およびＡＡＶ隣接エレメントに作動可能に連結された選
択された導入遺伝子を含む。天然に存在するＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに
おいて５’および３’末端でのおよそ１４５ｂｐからなる。ＡＡＶＩＴＲは、
野生型および組換えの両方のＡＡＶビリオンの複製、切除およびキャプシド形成
に必要である。

【００８１】別の実施形態において、組換えウイルスは、ウイルス遺伝子の１つ以上の変異
または欠失を含むヘルペスウイルス誘導体であるか、またはヘルペスウイルスの
アンプリコンであるかのいずれかである。いずれの場合においても、隣接エレメ
ントは、ウイルス末端反復である（例えば、そのウイルスがＨＳＶである場合は
「α」配列）。ＨＳＶアンプリコンは、所望の発現調節配列に作動可能に連結さ
れた、パッケージング配列（α）、ＤＮＡのウイルス複製起点（ｏｒｉ）および
目的の導入遺伝子カセットを含む欠損ＨＳＶゲノムである。ヘルパーヘルペスウ
イルスまたは代替のヘルパー機能の存在下で、そのアンプリコンは、複製され、
そしてヘッド−テールコンカテマーとしてパッケージングされて、野生型の大き
さのゲノムを形成する。

【００８２】別の実施形態において、その組換えウイルスは、組換え欠損Ｂ型肝炎（ＨＢＶ
）であり、発現調節配列に作動可能に連結され、そしてＨＢＶゲノムに挿入され
た選択された導入遺伝子を含む。インビトロ研究によって、そのゲノムの８０％
までもが欠損されても、組換えＢ型肝炎ウイルスがヘルパー依存性パッケージン
グおよび逆転写についての能力を保持することが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈｅ
ｔａｌ．，１９９０）。これは、そのゲノムの大部分が外来性の遺伝子材料に
置き換えられ得ることを示唆する。この肝臓栄養性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓ
ｍ）および残存率（組み込み）は、肝臓に指向される遺伝子移入について特に魅
力的な特性であった。

【００８３】（リガンドＤＮＡ）ほとんどの非哺乳動物ウイルスは、哺乳動物細胞には感染性ではないが、いく
つかの場合において、非哺乳動物ウイルスが特定の特に感染に感受性の哺乳動物
細胞株に感染することが報告されている［Ｂａｒｓｏｕｍｅｔａｌ．，Ｈｕ
ｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ８：２０１１−２０１８（１９９７年１１
月２０日）］。組換えウイルスを製造するために用いられるべき宿主細胞が非哺
乳動物ウイルスによる感染に感受性ではない場合、その非哺乳動物ウイルスは、
非哺乳動物骨格においてリガンドＤＮＡを組み込むことにより改変され得る。非
哺乳動物骨格はまた、リガンドＤＮＡを組み込んで非哺乳動物ウイルスによる哺
乳動物宿主細胞の感染を増大させることによって改変され得る。続いて産生され
る非哺乳動物ウイルスによるそのリガンドＤＮＡの発現は、哺乳動物細胞の感染
または感染の増加を可能にする。本発明のキャリアベクターの骨格は、所望の哺
乳動物細胞によって認識されるリガンドを産生するに必要とされる成分をコード
するＤＮＡの付加によって改変される。

【００８４】このリガンドＤＮＡは、発現されるときにキャプシド形成されるキャリアベク
ターの表面に存在し、従って、哺乳動物細胞標的レセプターに対するリガンドを
提示し、そしてそのキャリアベクターが哺乳動物細胞に結合しそして侵入するこ
とを可能にする遺伝子産物を生じる遺伝子から選択される［Ｂａｒｓｏｕｍｅ
ｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ８：２０１１−２０１８
（１９９７年１１月２０日）］。そのリガンドＤＮＡは、そのリガンド遺伝子産
物が、そのキャリアベクターの複製されるＤＮＡと共同して発現されて非哺乳動
物細胞における効率的なキメラキャリアベクター産生を可能にすることを確実に
する発現調節配列の調節制御下に配置される。その非哺乳動物発現調節配列は、
それがその非哺乳動物宿主細胞における調節機能を行ない得る限り、その骨格の
ネイティブ調節配列と同一、類似または異なり得る。好ましい実施形態において
、その発現調節配列は、非哺乳動物ベクター骨格が由来するネイティブ非哺乳動
物ウイルスに由来するプロモーターを包含する。より好ましい実施形態において
、そのプロモーターは、多角体病初期プロモーター（ｐｏｌＨ）であり、そして
その非哺乳動物ベクター骨格は、バキュロウイルスに由来する。

【００８５】一般に、リガンドＤＮＡが非哺乳動物発現調節配列によって調節される場合、
そのリガンドＤＮＡは、その哺乳動物宿主細胞にそのキメラベクターが感染する
場合に発現されない。そのＤＮＡによってコードされるリガンドの発現の非存在
は、そのキャリア非哺乳動物ベクターからコードされる組換えウイルス皮膜への
リガンドの組み込みを妨害するために有用であり得る。これは、その構造的一体
性を破壊し得るかまたは動物における有害な免疫原性反応を生じ得る。しかし、
リガンド発現がその哺乳動物宿主細胞において所望される場合、代替のまたはさ
らなる発現調節配列は、そのリガンドをコードする配列に作動可能に連結されて
、哺乳動物および非哺乳動物の宿主細胞におけるその発現を可能にし得る。ある
いは、そのリガンドＤＮＡが発現されるいくつかの場合が存在し得る。なぜなら
、その非哺乳動物発現調節配列もまたその哺乳動物細胞において活性化されるか
らである。

【００８６】そのリガンドＤＮＡは、それが哺乳動物細胞に結合しそして進入することを可
能にするように成熟非哺乳動物ウイルスを改変するタンパク質、ポリペプチドま
たはペプチドをコードする本質的に任意の核酸であり得る。このリガンドは、天
然に存在するタンパク質、所望の結合能を有する天然に存在するタンパク質のフ
ラグメント、または所望の結合能を有する、人工もしくは変異されたポリペプチ
ドもしくはペプチドであり得る。そのリガンドは、一般的な特異性の一つであり
得、これは、広汎で種々の哺乳動物細胞への結合を可能にする（例えば、水胞性
口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）遺伝子、ウシシンシチウムウイル
ス（ＢＳＶ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子、または以下に例示されるような
両親媒性エンベロープ遺伝子）か、またはそれは、より特異的であり得、標的に
される特定の細胞型への結合を可能にする。例えば、そのリガンドは、静電的相
互作用を介してかまたはその哺乳動物細胞と相互作用する一般的な他の機構を介
してそのウイルスが結合することを生じ得るか、またはそれは、特定のリガンド
−レセプター相互作用であり得る。

【００８７】有用なリガンド核酸は、非哺乳動物ウイルスが哺乳動物細胞と相互作用するこ
とを可能にするリガンドをコードする任意の核酸であり得る。例えば、そのリガ
ンドは、そのウイルスと、そのキャリアウイルスによって感染されるべき哺乳動
物宿主細胞において見出されるレセプターについての哺乳動物細胞との間の静電
的相互作用を増大させるリガンドであり得る。他の有用なリガンド核酸としては
以下が挙げられるがそれらに限定されない：目的の哺乳動物宿主細胞がレセプタ
ーを発現する、ペプチドホルモン、増殖（成長）因子、または他の正常に分泌さ
れた因子をコードする核酸。リガンドとして有用な核酸としては、通常の細胞レ
セプターを有し、そして導入遺伝子について上記に開示される、すべてのそれら
の分泌される因子、ペプチドホルモンおよび増殖因子が挙げられる。例えば、そ
のリガンド核酸は以下をコードし得る：ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ
、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ａｐｏＥ、ａｐｏＡｌ、ａｐｏＡ４
、ＥＰＯ、ＰＴＨ、ＧＨまたはＧＲＦ。そのリガンド核酸は、ネイティブまたは
遺伝子操作される免疫グロブリン（例えば、ＳｃＦｖ、キメラ免疫グロブリン、
ヒト化免疫グロブリンなど）あるいはその哺乳動物細胞における特定の細胞表面
タンパク質に特異的に結合するＭＨＣ分子をコードし得る。目的の他のリガンド
核酸は、コラーゲン、エラスチン、トロンボスポンジン、テネイシンまたはビト
ロネクチンのような細胞外マトリクス（これは、インテグリンおよび他の細胞膜
貫通レセプターに結合する）のメンバーをコードする。通常分泌されるリガンド
をコードする核酸配列は、そのリガンドについてのコード配列の５’末端または
３’末端のいずれかで「アンカードメイン」をコードする核酸配列を取り込むこ
とによって改変され得る。アンカードメインは、ウイルス皮膜におけるリガンド
を確実にする領域である。好ましい実施形態において、そのアンカードメインは
、そのリガンドについてのコード配列の３’末端に存在する。さらに好ましい実
施形態において、そのアンカードメインは、ＨＩＶｇｐ４１のようなウイルス
皮膜タンパク質に由来する（これは、ｇｐ１２０皮膜タンパク質をウイルスエン
ベロープに固定する）。他の例としては、デングウイルスのＥタンパク質または
ワクシニアウイルスの１４ｋＤａタンパク質を含む。

【００８８】そのリガンド核酸はまた、哺乳動物細胞の細胞膜に通常固定されるタンパク質
をコードし得る。これは、哺乳動物宿主細胞における特定の細胞表面タンパク質
または対向レセプターに結合する。この型のリガンド核酸の例としては、以下が
挙げられる：多数のＣＤ抗原（例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＣＴＬＡ
−４レセプターおよびＢ−７）、インテグリン（例えば、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−
１、およびｐ１５０、９５）、細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ
−２、ＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−４）、ならびにセレクチン（例えば、Ｅ−
セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチン）。このリガンドはまた、人
工または変異される対向レセプター（例えば、細胞表面固定またはハイブリッド
免疫グロブリンもしくはＴＣＲ）であり得る。

【００８９】１つの実施形態において、そのリガンドは、通常ウイルス上に存在し、そして
哺乳動物への結合を媒介するリガンドである（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０、ま
たはインフルエンザ由来のＨＡ）。別の実施形態において、そのリガンドは、通
常細菌細胞上に存在し、そして哺乳動物細胞への結合を媒介するリガンドである
（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡは
免疫グロブリンに結合することが知られる）。

【００９０】別の実施形態において、その哺乳動物宿主細胞株は、遺伝子操作されてリガン
ドに特異的に結合するレセプターを発現させる。従って、その哺乳動物宿主細胞
へのそのキャリアウイルスの高度に特異的な結合を促進する哺乳動物宿主細胞−
キャリアウイルス系を設計し得る。例えば、増殖因子レセプター（例えば、ＥＰ
Ｏレセプター）を発現するように哺乳動物宿主細胞を操作し得、そしてそのＥＰ
Ｏ遺伝子を含むリガンド核酸を含むようにそのキャリアベクターを設計し得る。
当業者は、本明細書を参酌して、多数の哺乳動物宿主細胞−キャリアウイルス相
互作用性レセプター−リガンド系を同定し得る。

【００９１】１つの実施形態において、そのリガンドＤＮＡはＶＳＶ−Ｇ遺伝子である。こ
の遺伝子は、バキュロウイルス多角体病（ｐＰＨ）初期プロモーターの制御下に
配置され得る。そのＶＳＶ−Ｇタンパク質は、発現されるとき、成熟キャリアウ
イルスを改変して、その結果、それが哺乳動物宿主細胞に結合し得、それによっ
てそれに感染し得る［Ｂａｒｓｏｕｍ、前出］。本発明の別の実施形態において
、そのリガンドＤＮＡは、ＢＳＶｅｎｖ遺伝子であり、これは、本発明の状況
において、屡次の様式で機能する。

【００９２】別の好ましい実施形態において、本発明は、非哺乳動物ウイルスがシアル酸を
有する糖タンパク質を通常終結させないという事実を利用する。従って、そのリ
ガンドＤＮＡは、アシアロ糖タンパク質を発現する遺伝子であり、これは、哺乳
動物れクチン（例えば、肝臓アシアロ糖タンパク質レセプター）に結合し、次い
でその哺乳動物細胞への進入を容易にする。

【００９３】（複製およびキャプシド形成の核酸）複製およびキャプシド形成の機能は、組換えウイルスゲノムの複製、切除およ
び感染性組換えビリオンまたはウイルスへのキャプシド形成に必要である。各々
の型の組換えウイルスは、異なる型の複製およびキャプシド形成の機能を必要と
する。例えば、その組換えウイルスがレトロウイルスである場合、その複製およ
びキャプシド形成の機能は、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの遺
伝子（ならびにレンチウイルスの場合には、また、ＨＩＶｔａｔ、ｒｅｖ、ｎ
ｅｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒのような制御または補助遺伝子を含む）を包含するが
、他方、その組換えウイルスがＡＡＶである場合、その複製およびキャプシド形
成の機能は、ＡＡＶ由来のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を包含する。

【００９４】上記のように、そのキャリアベクターまたはその哺乳動物宿主細胞のいずれか
は、特定の組換えウイルスに必要なこれらの複製およびキャプシド形成の機能を
コードする核酸を含み得る。哺乳動物宿主細胞（例えば、米国特許第５，６５８
，７８５号において記載されるＡ６４細胞株、およびＰＣＴＵＳ９８／１９４
６３に記載されるＢ５０細胞株）は、組換えＡＡＶの複製およびパッケージング
のためのＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する。同様に、組換えアデノ
ウイルスの複製およびパッケージングのために必要な、アデノウイルス遺伝子を
発現する哺乳動物宿主細胞は、公知である［例えば、以下を参照のこと：米国特
許第５，８５１，８０６号およびＡｍａｌｔｉｆａｎｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：３３５２−６（１９９６）］
か、または構築され得、そして組換えレトロウイルスの複製およびパッケージン
グのために必要なレトロウイルス遺伝子を発現する多数の哺乳動物宿主細胞が構
築されている［例えば、以下を参照のこと：Ｃｏｎｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６３４９−６３５３（１９８４
）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５
−２９０２（１９８６）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５）；およびＳｏｒｇｅｅｔａｌ．，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７（１９８４）］。ヘルペ
スウイルスのパッケージングのために必要な遺伝子を含む細胞株（例えば、以下
を参照のこと：米国特許第５，８５１，８２６号）もまた公知である。

【００９５】細胞株が特定の組換えウイルスゲノムを複製、切除およびパッケージングする
ための全ての必要な複製およびキャプシド形成の機能を含む場合、そのキャリア
ベクターは、いずれかの複製および／またはキャプシド形成の核酸配列を含む必
要はない。その細胞株は、適切なタンパク質をコードする核酸で一過的にまたは
安定にかのいずれかで形質導入することによって必要な複製およびキャプシド形
成の機能を含み得る。好ましい実施形態において、その細胞株は、複製およびキ
ャプシド形成の機能を安定に含む。さらに、その細胞株は、構成的または誘導的
にその複製およびキャプシド形成の機能を発現し得る。構成的または誘導的な発
現は、当該分野において公知のまたは「発現調節配列」において上記に考察され
るような発現調節配列のいずれかを使用することによって制御され得る。好まし
い実施形態において、その複製およびキャプシド形成の機能の発現は誘導性であ
る。より好ましい実施形態において、その複製およびキャプシド形成の機能は、
安定にトランスフェクトされるかまたは感染され、そして誘導的に発現される。
さらにより好ましい実施形態において、その複製およびキャプシド形成の機能の
発現は、それらのネイティブのプロモーターによって調節される。

【００９６】本発明において用いられる哺乳動物細胞株は、複製またはキャプシド形成に必
要な機能のいずれも含まないか、または複製もしくはキャプシド形成に必要な機
能の一部のみを含み得る。哺乳動物細胞株が複製またはキャプシド形成に必要な
機能をいずれも含まない場合、これらの機能は、その組換えウイルスの産生のた
めのベクターによってその細胞へと導入されなければならない。好ましい実施形
態において、本発明の１つ以上のキャリアウイルスを用いて複製およびキャプシ
ド形成の機能をコードする核酸でその哺乳動物細胞株を形質導入する。より好ま
しい実施形態において、複製およびキャプシド形成の機能を含む単一のキャリア
ウイルスを用いて、その哺乳動物細胞株を形質導入する。さらにより好ましい実
施形態において、その複製およびキャプシド形成の機能、包埋された組換えウイ
ルスゲノムおよび組換えウイルス産生に必要な任意の他の核酸配列を含む単一の
キャリアウイルスを使用して、その哺乳動物細胞株を形質導入する。

【００９７】その哺乳動物細胞株が複製またはキャプシド形成の機能のいくつかを含む場合
、これらの機能は、その組換えウイルスの産生のためのベクターによってその細
胞へと導入されねばならない。好ましい実施形態において、１つ以上のキャリア
ウイルスを使用して、欠失する複製およびキャプシド形成の機能をコードする核
酸でその哺乳動物細胞株を形質導入する。より好ましい実施形態において、欠失
する複製およびキャプシド形成の機能を含む単一のキャリアウイルスを用いてそ
の哺乳動物細胞株を形質導入する。さらにより好ましい実施形態において、欠失
する複製およびキャプシド形成の機能、包埋された組換えウイルスゲノムおよび
組換えウイルス産生のために必要な他の任意の核酸配列を含む単一のキャリアウ
イルスを使用して、その哺乳動物細胞株を形質導入する。

【００９８】組換えウイルスのために必要な複製およびキャプシド形成の機能は、組換えウ
イルスの型に依存して異なる。一般に、必要な複製およびキャプシド形成の機能
は、種々の組換えウイルスについて当該分野において公知である。組換えベクタ
ーの好ましい実施形態において、組換えＡＡＶは、複製およびキャプシド形成の
ためにｒｅｐおよびｃａｐを必要とし、組換えレトロウイルスは、ｇａｇ、ｐｏ
ｌおよびｅｎｖ（ならびにレンチウイルスについてｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ
）を必要とし、組換えアデノウイルスは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１−Ｌ５、ｐＩ
ＸおよびＩＶａ２の遺伝子の単独でまたは組み合わせてコードされる機能のすべ
てまたは部分を必要とし、そして組換えヘルペスウイルスは、必要とされるヘル
ペスウイルス遺伝子を含む、ヘルパーヘルペスウイルスまたはキャリアベクター
によって提供され得る、大多数の遺伝子を必要とする。この宿主哺乳動物細胞お
よびキャリアウイルスは一緒になって、その哺乳動物宿主細胞からの感染性組換
えウイルスを入手するために、特定の組換えウイルスについて必要な複製および
キャプシド形成の機能に寄与しなければならない。

【００９９】１つの実施形態において、複製およびキャプシド形成機能は、複製およびキャ
プシド形成機能を有する天然に存在するタンパク質をコードする核酸によってコ
ードされる。別の実施形態において、複製およびキャプシド形成機能は、なおそ
れぞれの複製およびキャプシド形成機能を維持する天然に存在するタンパク質の
フラグメントまたはムテインをコードする核酸によってコードされる。本発明の
別の実施形態において、他の組換えウイルスは、所望の特定の組換えウイルスに
適切な複製およびキャプシド形成機能をコードする核酸を使用して産生され得る
。他の型の組換えウイルスならびにこれらのウイルスが必要とする複製およびキ
ャプシド形成機能は、当該分野で公知である。

【０１００】好ましい実施形態において、組換えＡＡＶの産生が所望される場合、ｒｅｐお
よびｃａｐ配列は、ネイティブＡＡＶｐ５プロモーターによって調節される。
別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスの産生が所望される場合
、アデノウイルスのための複製およびキャプシド形成機能をコードする核酸配列
は、それらのネイティブアデノウイルスプロモーターによって調節される。ネイ
ティブプロモーターはまた、他の組換えウイルス（ヘルペスウイルスおよびＨＢ
Ｖを含むが、これらに限定されない）の複製およびキャプシド形成機能の発現を
調節するために使用され得る。

【０１０１】より好ましい実施形態において、複製およびキャプシド形成機能は、キャリア
ベクターに挿入される核酸配列によってコードされる。キャリアベクター上にこ
れらの配列を有する利点は、このキャリアウイルスによる感染前に細胞株を構築
しなくてもよいことである。複製およびキャプシド形成機能を発現する細胞株を
作製および維持することは、しばしば困難である。なぜなら、これらの機能を提
供するタンパク質の多くは、哺乳動物細胞に対して毒性であるからである。従っ
て、キャリアベクター上に複製およびキャプシド形成機能配列を挿入する別の利
点は、複製およびキャプシド形成機能が、組換えウイルスの産生を所望する場合
にこのキャリアウイルスを哺乳動物細胞に感染させたときにのみ、この哺乳動物
細胞において発現されることである。さらに好ましい実施形態において、キャリ
アウイルスは、導入遺伝子およびＡＡＶ由来のＩＴＲを含む包理された組換えウ
イルスゲノムを有し、さらに、この包理されたＡＡＶゲノムの複製およびキャプ
シド形成のためのｒｅｐ遺伝子配列およびｃａｐ遺伝子配列を有する。さらによ
り好ましい実施形態において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の発現は、それ
らのネイティブプロモーターによって調節されるか、またはｒｅｐ／ｃａｐは、
ｗｔＡＡＶを形成するような相同組換えおよび非相同組換えを減少または排除
するために、プロモーターから離される。同様に、組換えレトロウイルス、アデ
ノウイルス、ヘルペスウイルスおよびＨＢＶを産生するキャリアウイルスの好ま
しい実施形態において、これらのキャリアウイルスは、複製およびキャプシド形
成機能をコードする核酸配列を含む。より好ましい実施形態において、複製およ
びキャプシド形成機能をコードする核酸配列は、それらのネイティブプロモータ
ーによって調節される。

【０１０２】（ヘルパー機能）多くのウイルスは、それら自体で複製、切除およびパッケージングすることが
可能でなく、これらを行うためにヘルパー機能を必要とする。ヘルパー機能はま
た、導入遺伝子の挿入のためにそのゲノムの大部分が欠失された組換えウイルス
の産生にも必要とされる。ヘルパー機能の性質は、組換えウイルスの型および／
または欠失されたゲノム量に依存して異なり得る。ヘルパー機能としては、ウイ
ルスタンパク質、非ウイルスタンパク質、ならびに物理的因子および／または化
学的因子が含まれる。どのヘルパー機能が必要とされるかは、当該分野で公知の
事項から同定し得る。例えば、ＡＡＶは、アデノウイルスまたはヘルペスウイル
ス由来のヘルパー機能、あるいは異なる化学的因子または物理的因子由来のヘル
パー機能を必要とすることが公知である。あるいは、当業者は、本明細書中に開
示される組成物および方法を使用する組換えウイルスの産生に、どのヘルパー機
能が必要とされるか決定し得る。

【０１０３】高レベルの組換えウイルス産生にどのヘルパー機能が必要とされるかを同定す
るために、ヘルパー機能の非存在下で、哺乳動物宿主細胞にキャリアベクターを
感染させ得、そして感染性組換えウイルスの力価を測定し得る。次いで、この哺
乳動物宿主細胞に、潜在的なヘルパー機能をコードする種々の核酸を形質導入し
得る。このようなヘルパー機能は、ヘルパー機能をコードすることが公知である
か、ヘルパー機能をコードすると考えられている、任意の核酸であり得る。好ま
しい実施形態において、ヘルパー機能は、１以上のウイルスタンパク質である。
より好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスタンパク質は、成熟ヘルパー
ウイルスを産生するには不十分である。哺乳動物宿主細胞に潜在的なヘルパー機
能をコードする種々の核酸を形質導入した後、次いで、組換えウイルスの力価を
測定し得る。

【０１０４】キャリアウイルスが組換えＡＡＶゲノムを含む場合、ヘルパー機能が、感染性
組換えＡＡＶの産生に必要とされる。好ましい実施形態において、ヘルパー機能
は、ウイルス由来の核酸である。より好ましい実施形態において、ヘルパー機能
は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−
２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）または仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）由来
である。さらにより好ましい実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイル
ス由来のＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ２ａであり、そしてＥ４ＯＲＦ６およびＶＡＩ
もまた含み得る。別の好ましい実施形態において、この核酸は、ＨＳＶのヘリカ
ーゼ−プライマーゼ複合体（ＵＬ５、ＵＬ８およびＵＬ５２）およびＨＳＶの主
要一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＬ２９）由来のヘルパー機能をコードする。
ヘルパー機能はまた、７つ全てのＨＳＶＤＮＡ複製遺伝子（ＵＬ５、ＵＬ８、
ＵＬ５２、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ９およびＵＬ４２）を含み得る。あるいは
、組換えＡＡＶのためのヘルパー機能は、化学的因子および物理的因子（紫外線
、シクロヘキシミド、ヒドロキシウレアおよび種々の発癌物質を含む）によって
提供され得る。

【０１０５】組換えウイルスの産生に必要とされるヘルパー機能は、当該分野で公知の任意
の方法によって哺乳動物宿主細胞に送達され得る。ヘルパー機能は、ベクター（
例えば、プラスミド）でのトランスフェクションによって、ヘルパー機能を含む
ウイルスベクターでの感染によって、または当該分野で公知の他の方法（上記で
議論された方法（例えば、ＤＮＡの微粒子銃注射、ＤＮＡ結合体の使用など）を
含む）によって、送達され得る。トランスフェクションまたは感染は、安定また
は一過性であり得る。あるいは、哺乳動物細胞株は、ヘルパー機能を安定的に発
現し得る（染色体外エピソーム上でか、または細胞ゲノムへの組み込みを介して
かのいずれかで）。さらに、いくつかのヘルパー機能が哺乳動物細胞株によって
発現され、他方、他のヘルパー機能が、ベクターによって導入される。例えば、
２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）は、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ
１ｂタンパク質を構成的に産生する。従って、組換えＡＡＶの産生のために、感
染性組換えＡＡＶの産生に必要とされるヘルパー機能（例えば、Ｅ２Ａ、Ｅ４Ｏ
ＲＦ６およびＶＡＩ）は、ベクターのトランスフェクションまたは感染によって
、宿主細胞に導入される。

【０１０６】好ましい実施形態において、ヘルパー機能は、キャリアウイルスによって哺乳
動物細胞に形質導入される。より好ましい実施形態において、いくつかまたは全
てのヘルパー機能が、包理された組換えウイルスゲノムを含むキャリアウイルス
によって哺乳動物細胞に形質導入される。さらにより好ましい実施形態において
、全てのヘルパー機能が、その包理された組換えウイルスゲノム、任意の必要と
される複製およびキャプシド形成機能、ならびに必要に応じてリガンドＤＮＡを
含むキャリアウイルスによって哺乳動物細胞に形質導入される。最も好ましい実
施形態において、キャリアベクターは、バキュロウイルス骨格を有する。内部リ
ボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、単一のプロモーターのみが、Ｅ２Ａおよ
びＥ４ｏｒｆ６の２つのタンパク質に使用される場合、このＥ２ＡとＥ４ｏｒｆ
６との間に配置され得る。あるいは、各々のヘルパー機能遺伝子は、それ自身の
プロモーターを用いて供給され得る。これらの遺伝子は、構成的または誘導性の
種々のプロモーター（例えば、それぞれ、ＣＭＶ最初期プロモーター／エンハン
サーまたはＭＭＴＶＬＴＲ）の調節制御下にあり得る。ヘルパー機能がキャリ
アベクター自体に提供されるか、または宿主細胞によって提供されるかに拘わら
ず、これらの遺伝子を調節するプロモーターは、構成的または誘導性であり得る
。

【０１０７】ヘルパー機能の発現は、シス（ｃｉｓ）調節またはトランス（ｔｒａｎｓ）調
節を含む、当該分野で公知かまたは上記のような発現調節配列のいずれかによっ
て調節され得る。発現調節配列は、構成的発現、誘導性発現、組織特異的発現、
細胞型特異的発現または分化段階特異的発現、あるいはヘルパー機能タンパク質
のネイティブプロモーターからの発現を提供する。好ましい実施形態において、
ヘルパー機能タンパク質のネイティブプロモーターが使用される。別の好ましい
実施形態において、ヘルパー機能タンパク質の誘導性プロモーターが使用される
。別の好ましい実施形態において、ヘルパー機能タンパク質の構成的プロモータ
ーが使用される。さらに好ましい実施形態において、この構成的プロモーターは
、ＣＭＶプロモーターである。別の好ましい実施形態において、１以上の構成的
プロモーターが、特定のヘルパー機能タンパク質のために使用され、そして１以
上のネイティブプロモーターが、他のヘルパー機能タンパク質に使用される。

【０１０８】１つの実施形態において、ヘルパー機能に必要とされる各々のタンパク質また
はポリペプチドは、その発現が、それ自体のプロモーターおよびポリアデニル化
シグナルならびに任意の配列（例えば、エンハンサー）によって調節される核酸
によって、コードされる。別の実施形態において、核酸は、単一の転写物に転写
され、この転写物が、ヘルパー機能に必要とされる１より多いタンパク質または
ポリペプチドをコードする。この場合において、ＩＲＥＳは、個々のタンパク質
またはポリペプチドの各々のコード配列の間に配置され、そのポリシストロン性
ｍＲＮＡの続いての翻訳を可能にし得る。単一のポリシストロン性転写物のみが
産生される場合、単一のプロモーター、任意のエンハンサーおよびポリアデニル
化シグナルのみが、ヘルパー機能をコードする核酸の転写の調節に必要とされる
。また、単一のタンパク質をコードするモノシストロン性ｍＲＮＡおよび複数の
タンパク質をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡの両方を使用することによっ
て、ヘルパー機能をコードし得る。

【０１０９】本発明の好ましい実施形態において、キャリアベクターは、包理された組換え
ＡＡＶゲノムおよびヘルパー機能を含む。さらに好ましい実施形態において、ヘ
ルパー機能は、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ２ａを含み、そしてより
好ましくは、Ｅ４ＯＲＦ６およびＶＡＩを含む。さらにより好ましい実施形態に
おいて、ヘルパー機能は、単一のポリシストロン性転写物によってコードされ、
ヘルパー機能のプロモーターは、構成的プロモーター、好ましくはＣＭＶプロモ
ーターである。

【０１１０】他の組換えウイルスは、異なるヘルパー機能を必要とするか、または全く必要
とせず、しかし、全ての場合において、これらのヘルパー機能は、この包理され
た組換えウイルスゲノムを保有するキャリアベクター上にか、別々のキャリアウ
イルス上にか、哺乳動物宿主細胞を形質導入し得る異なる型のベクター上に提供
され得るか、あるいは哺乳動物宿主細胞自体において内因的に発現される。

【０１１１】（哺乳動物宿主細胞）細胞培養物に適用され得る任意の型の哺乳動物細胞が、組換えウイルスゲノム
を産生するために使用され得る。一般に、本発明において使用される哺乳動物宿
主細胞は、非哺乳動物キャリアウイルスによって感染され得る哺乳動物宿主細胞
である。この哺乳動物宿主細胞は、リガンド核酸によってコードされるリガンド
を発現しない非哺乳動物キャリアウイルスによって感染され得る哺乳動物宿主細
胞であり得るか、リガンド核酸によってコードされるリガンドを発現する非哺乳
動物キャリアウイルスによって感染され得る哺乳動物宿主細胞であり得るか、あ
るいはリガンド核酸を発現するかまたは発現しないキャリアベクターに感染され
る細胞であり得る。あるいは、この哺乳動物宿主細胞は、キャリアウイルスによ
って通常感染されないが、このキャリアウイルスが非哺乳動物宿主細胞に結合し
得るような細胞レセプターを形質導入され得る、哺乳動物宿主細胞であり得る。
例えば、哺乳動物宿主細胞は、増殖因子レセプターで形質導入され得、これによ
って、この哺乳動物宿主細胞は、その特定の増殖因子をそのレセプターのリガン
ドとして発現するキャリアウイルスによって感染され得る。

【０１１２】キャリアウイルスによって感染される能力に加えて、哺乳動物宿主細胞の別の
好ましい特性は、非哺乳動物キャリアウイルスを脱コート化し得ることである。
哺乳動物宿主細胞の第３の好ましい特性は、組換えウイルスを高レベルで複製す
る能力である。好ましい実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、非哺乳動物キ
ャリアウイルスを取り込み、このキャリアウイルスを効率的に脱コート化し、そ
してこの組換えウイルスを高レベルで複製する哺乳動物宿主細胞である。

【０１１３】適切な哺乳動物宿主細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫおよび種々のマウス細胞（例えば、１０Ｔ１／２
細胞およびＷＥＨＩ細胞）、アフリカミドリザル細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯ
Ｓ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、ならびにヒト細胞（ＶＥＲＯ
細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞およびＨＴ１０８０細胞）。
好ましい実施形態において、適切な哺乳動物細胞としては、２９３細胞（アデノ
ウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂタンパク質を発現するヒト胚性腎臓細胞）、Ｂ−５
０細胞（ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐを発現するＨｅＬａ細胞（ＰＣＴＵＳ９
８／９４６３を参照のこと））、３Ｔ３細胞（マウス胚性線維芽腫細胞株）、Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３細胞の亜系統）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓癌細胞株）
、Ｓａｏｓ−２細胞（ヒト骨原性肉腫細胞株）、ＨｕＨ７細胞またはＨｅＬａ細
胞（ヒト癌細胞株）が挙げられる。

【０１１４】上記に列挙した哺乳動物宿主細胞に加えて、他の哺乳動物宿主細胞が使用され
得る。当業者は、細胞株が哺乳動物細胞株としての使用に適切であるか否かを決
定し得、これは、この細胞株に、組換えウイルスを産生するために必要とされる
全ての成分を含むキャリアウイルスを感染させ、組換えウイルスが産生される条
件下でこの細胞を培養し、次いで、産生される感染性組換えウイルスの力価を測
定することによる。次いで、当業者は、その潜在的な宿主細胞において産生され
た感染性ウイルスの力価を、他の宿主細胞によって産生された宿主細胞と比較し
て、この細胞株が組換えウイルス産生に良好である否かを決定し得る。

【０１１５】非哺乳動物キャリアウイルス（例えば、バキュロウイルス）に対する昆虫細胞
上および哺乳動物細胞上の両方のレセプターは未知であるが、バキュロウイルス
は、これらの細胞表面上に発現される硫酸ヘパリンを介して、少なくとも一部、
それらの細胞に結合し得ると考えられる。いかなる理論にも束縛されることは望
まないが、その細胞表面上に高レベルの硫酸ヘパリンを発現する細胞は、キャリ
アウイルス（特に、バキュロウイルス）によって、その細胞表面上に低レベルの
硫酸ヘパリンを発現する細胞よりも、より容易に感染され得る。従って、特定の
細胞株が潜在的な哺乳動物宿主細胞であるか否かを同定する１つの方法は、その
細胞表面上の硫酸ヘパリンのレベルを測定することである。

【０１１６】（キャリアウイルスを作製および産生する方法）本発明は、上記の新規キャリアベクターを構築し、そして大量のこのキャリア
ベクターを産生する方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：１．以下の１以上の核酸挿入物を挿入することによって、非哺乳動物ウイルス
骨格ＤＮＡまたはその複製能力部分を改変する工程：１）発現調節配列に作動可
能に連結されかつ隣接エレメントが隣接する導入遺伝子を含む、組換えウイルス
ゲノム；２）発現調節配列に作動可能に連結されているヘルパー機能をコードす
る核酸配列；３）この組換えウイルスの複製および／またはキャプシド形成機能
をコードする核酸配列；４）非哺乳動物細胞において活性である発現調節配列に
作動可能に連結されている、リガンドＤＮＡ；および５）この非哺乳動物ウイル
ス骨格、改変された哺乳動物ウイルス骨格あるいはこの骨格または改変された骨
格の複製能力部分の配列を調節する、調節制御配列；２．得られたキャリアベクターを非哺乳動物宿主細胞に形質導入する工程；３．この非哺乳動物宿主細胞を、キャリアウイルスが産生される条件下で増殖
させる工程；および４．この非哺乳動物宿主細胞からこのキャリアウイルスを収集する工程。

【０１１７】好ましい実施形態において、このキャリアベクターは、この組換えウイルスゲ
ノムを含むように改変される。より好ましい実施形態において、このキャリアベ
クターは、この組換えウイルスゲノム、ならびに複製および／またはキャプシド
形成機能をコードする核酸挿入物および組換えウイルスの産生に必要とされるヘ
ルパー機能のいずれかまたは両方を含むように改変される。さらにより好ましい
実施形態において、このキャリアベクターは、この組換えウイルスゲノム、複製
および／またはキャプシド形成機能をコードする核酸挿入物および組換えウイル
スの産生に必要とされるヘルパー機能の全て、ならびにリガンドをコードする核
酸挿入物を含むように改変される。

【０１１８】非哺乳動物宿主細胞は、当該分野で公知の任意の宿主細胞または米国特許第５
，７３１，１８２号の表１に記載される任意の宿主細胞であり得る。非哺乳動物
宿主細胞ウイルス骨格ＤＮＡは、非哺乳動物種に感染する任意のウイルスに由来
し。これらの哺乳動物種としては、当該分野で公知の種または米国特許第第５，
７３１，１８２号の表１に記載される種が挙げられる。好ましい実施形態におい
て、このキャリアベクターの非哺乳動物骨格は、バキュロウイルス由来であり、
そして非哺乳動物細胞は昆虫細胞である。より好ましい実施形態において、昆虫
細胞においてバキュロウイルスキャリアウイルスにより作製されたキャリアウイ
ルスは、高力価で産生される。好ましくは、バキュロウイルスが用いられる場合
、任意の実施形態において産生されたキャリアバキュロウイルスの力価は、昆虫
細胞において１０⁸ｐｆｕ／ｍｌまたは１０⁹ｐｆｕ／ｍｌより大きく；より好ま
しくは、力価は、１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌまたは１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌより大きく；そ
してさらにより好ましくは、この力価は１０¹²ｐｆｕ／ｍｌより大きい。本発明
はまた、同様の力価を有するバキュロウイルスキャリアウイルスを含む哺乳動物
宿主細胞の溶解物および上清を含む。

【０１１９】キャリアベクターを含む非哺乳動物細胞は、当該分野で公知の方法または本明
細書中に記載の方法により増殖され得る。大量の非哺乳動物ウイルスを産生する
ための方法は、当該分野で周知であり、米国特許第５，８７１，９８６号に記載
される。非哺乳動物キャリアウイルスは、非哺乳動物宿主細胞により産生された
上清からまたは溶解された細胞から、当該分野で公知の方法または本明細書中に
記載の方法により精製され得る。非哺乳動物ウイルスを収集および精製するため
の方法は、当該分野で周知であり、そして米国特許第５，８７１，９８６号に記
載される。非哺乳動物ウイルスを収集し、そして精製する方法は、実施例６に記
載される。

【０１２０】キャリアベクターがキャプシド形成された場合に産生されるキャリアウイルス
は、必要に応じてリガンドの付加により改変された、通常の野生型キャプシドを
有する。一般に、リガンド核酸の発現は、発現調節配列により調節され、この発
現調節配列は、非哺乳動物宿主細胞において転写および翻訳を促進する。このよ
うな発現調節配列は、目的の非哺乳動物細胞において活性な非哺乳動物細胞プロ
モーターを含み得、そして必要に応じてエンハンサー配列、ポリアデニル化シグ
ナル、または当該分野で公知のもしくは上記に記載の任意の他の発現調節配列を
含み得る。好ましい実施形態において、非哺乳動物骨格における他の核酸挿入物
は、発現されなくてもよいし、より低レベルで発現されてもよい。なぜなら、そ
れらのプロモーターは、非哺乳動物細胞において活性でないか、またはあまり活
性ではないからである。潜在的に毒性のウイルス成分（例えば、ヘルパー機能ま
たは複製／キャプシド形成機能）は発現されないか、またはより低レベルで発現
されるかのいずれかであるので、高力価のキャリアウイルスが非哺乳動物細胞に
おいて産生され得る。

【０１２１】（キャリアベクターから組換えウイルスを産生する方法）本発明の別の局面は、上記の方法により産生されるキャリアウイルスを用いる
ことにより組換えウイルスを産生して、哺乳動物細胞を感染させ、続いてこの哺
乳動物から組換えウイルスを収集し、そして精製する方法である。この方法は、
以下の工程を包含する：１．キャリアウイルスに哺乳動物宿主細胞を感染させる工程であって、ここで
、このキャリアウイルスが、必要に応じてこのキャリアウイルスの表面上にリガ
ンドを発現する、工程；２．感染させた哺乳動物宿主細胞を、埋め込まれた組換えウイルスゲノムが複
製され、切り出され、そしてキャプシド形成される条件下で増殖させる工程；お
よび３．この哺乳動物宿主細胞からこの組換えウイルスを収集する工程。

【０１２２】この哺乳動物宿主細胞は、当該分野で公知か、「哺乳動物宿主細胞」の下で本
明細書中上記に記載されるか、または適切な宿主細胞として「哺乳動物宿主細胞
」の下で記載される方法により同定される任意の哺乳動物宿主細胞であり得る。
感染前の哺乳動物宿主細胞は、以下のうちの１つ以上を発現する哺乳動物宿主細
胞であり得る：１）複製機能および／もしくはキャプシド形成機能（例えば、Ｂ
−５０細胞または以前に記載されたレトロウイルス細胞株にうちの１つ）；２）
ヘルパー機能に必要な、いくつかまたは全て（例えば、２９３細胞）；ならびに
／または３）哺乳動物宿主細胞ゲノムにおいて安定に組み込まれた、埋め込まれ
た組換えウイルスゲノム。あるいは、哺乳動物宿主細胞は、キャリアウイルスに
よる感染の前にこれらの他のエレメントのいずれも含まない。

【０１２３】哺乳動物宿主細胞は感染され得、そして当該分野で公知の方法または本明細書
中に記載の方法により増殖され得る。哺乳動物宿主細胞を非哺乳動物ウイルスに
感染させるための方法は、本明細書中にまたはＢａｒｓｏｕｍら（前出）に記載
される。一旦哺乳動物宿主細胞が感染されると、任意の必要とされる複製および
／またはキャプシド形成機能ならびにヘルパー機能に作動可能に連結された発現
調節配列が活性化される。哺乳動物宿主細胞のネイティブな転写および翻訳成分
とともに、複製および／またはキャプシド形成機能ならびにヘルパー機能の発現
は、埋め込まれた組換えウイルスゲノムの複製、切り出し、およびキャプシド形
成を可能にし、それにより組換えウイルスの産生を引き起こす。

【０１２４】一般に、非哺乳動物キャリアウイルスは、哺乳動物細胞の感染し得るが、この
キャリアウイルスは、哺乳動物細胞において複製しない。なぜなら、非哺乳動物
キャリアウイルスの複製に必要な成分は、哺乳動物細胞に存在しないからである
。このキャリアウイルスがリガンド核酸を含む場合、リガンド発現を制御する発
現調節配列は、一般に、哺乳動物細胞において機能せず、その結果、リガンド発
現は、哺乳動物宿主細胞において生じない。しかし、キャリアウイルスの複製ま
たはリガンドの発現が、哺乳動物宿主細胞において所望される場合、さらなる発
現調節配列が、哺乳動物キャリアウイルスの複製、切り出し、および／またはパ
ッケージング、ならびに／あるいはリガンドの発現に必要とされる配列に、作動
可能に連結され得る。

【０１２５】組換えウイルスは、当該分野で公知の方法または本明細書中に記載の方法によ
り哺乳動物宿主細胞により産生された上清または溶解された細胞から精製され得
る。哺乳動物宿主細胞由来の種々の型の組換えウイルスを収集し、そして精製す
るための方法は、当該分野で周知であり、そしてＰＣＴＵＳ９７／１５７１６
に記載される。組換えウイルスを収集し、そして精製する方法はまた、実施例６
に記載される。

【０１２６】上記で議論されるように、好ましい実施形態において、１つ以上のキャリアウ
イルスは、特定の哺乳動物宿主細胞における組換えウイルスの産生に必要な全て
の核酸挿入物を含む。従って、宿主細胞が複製およびキャプシド形成機能を含む
場合、キャリアウイルスは、埋め込まれた組換えウイルスゲノムおよび任意の必
要なヘルパー機能を含む。同様に、宿主細胞が埋め込まれた組換えウイルスゲノ
ムを含む場合、１つ以上のキャリアウイルスは、必要な複製およびキャプシド形
成機能ならびに任意の必要なヘルパー機能を含むが、宿主細胞が必要なヘルパー
機能を含む場合、１つ以上のキャリアウイルスが、複製およびキャプシド形成機
能ならびに埋め込まれた組換えウイルスゲノムを含む。

【０１２７】好ましい実施形態において、単一のキャリアウイルスは、特定の哺乳動物宿主
細胞において組換えウイルスの産生に必要な核酸挿入物の全てを含む。例えば、
組換えＡＡＶがＢ−５０細胞において産生される場合、キャリアウイルスは、埋
め込まれた組換えウイルスゲノムおよびＡＡＶ産生に必要なそれらのヘルパー機
能を含む。同様に、組換えＡＡＶが、ＡＡＶ産生に必要な機能のいずれも発現し
ない哺乳動物宿主細胞において産生される場合、キャリアウイルスは、埋め込ま
れた組換えウイルスゲノム、ＡＡＶ産生に必要な複製およびキャプシド形成機能
ならびにヘルパー機能を含む。

【０１２８】記載された組換えウイルスを産生する方法は、この方法が、精製することなく
、ヘルパーウイルスおよび野生型ウイルスを実質的に含まない本質的に均質な組
換えウイルスを産生するので、有用である。組換えウイルスは、ヘルパーウイル
スおよび野生型ウイルスを含まない。なぜなら、成熟ヘルパーウイルスを産生す
るに十分なヘルパーウイルス遺伝子が存在しないからである。組換えウイルスは
、野生型ウイルスを含まない。なぜなら、相同組換えは種々の技術により避けら
れるからである。例えば、相同組換えにより産生された野生型ＡＡＶは、いくつ
かのストラテジーを用いて避けられ得る。ｒｅｐ／ｃａｐ配列および埋め込まれ
た組換えウイルスゲノムは、キャリアベクター上のいくつかの遺伝子座に配置さ
れて、組換え事象の尤度を最小化し得る。ｒｅｐ／ｃａｐ配列および埋め込まれ
た組換えウイルスゲノムはまた、それらが相同性の領域を有さないように設計さ
れ得る。さらに、ＡＡＶは５．０ｋｂを超えるパッケージには耐えられないので
、当業者は、所望される配列（例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ）とそのプロモーターと
の間に「スタッファー」核酸配列を組み込み得る。従って、組換えが生じた場合
ですら、得られるＡＡＶゲノムは大きすぎて、パッケージできず、ｗｔＡＡＶは
産生されない。ｒｅｐ翻訳の完全性を維持するために、スタッファー配列は、ス
プライスドナー部位およびアクセプター部位を用いて構築され得る。その結果、
得られたｍＲＮＡおよび最終的に産生されたｒｅｐタンパク質は、変化を受けて
いない。同様な方法を他の型の組換えウイルスについて用いて、野生型ウイルス
の組換えおよび産生を避け得る。

【０１２９】この方法はまた、工業的生産に容易に合わせて調節され得る。なぜなら、この
方法は、高力価で大量に産生され得るキャリアウイルスによる哺乳動物宿主細胞
の簡単な感染のみを必要とし得るからである。好ましい実施形態において、本明
細書中に記載された方法により産生された組換えウイルスは、高力価で産生され
る。組換えＡＡＶについては、力価は、好ましくは、１産生細胞につき１０⁴粒
子より大きく、より好ましくは、１産生細胞につき１０⁵〜１０⁶粒子より大きく
、そしてなおより好ましくは、１産生細胞につき１０⁷粒子より大きい。組換え
アデノウイルスについては、力価は、好ましくは、１産生細胞につき１０⁴粒子
より大きく、より好ましくは、１産生細胞につき１０⁵粒子より大きく、そして
なおより好ましくは、１産生細胞につき１０⁶粒子より大きい。組換えヘルペス
ウイルスについては、力価は、好ましくは、１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌより大きく、よ
り好ましくは、１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌより大きく、そしてなおより好ましくは、１
０¹³ｐｆｕ／ｍｌより大きい。レトロウイルスについては、力価は、好ましくは
、１０⁶〜１０⁷コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌより大きく、より好ましくは
、１０⁸ｃｆｕ／ｍｌより大きく、そしてなおより好ましくは、１０⁹ｃｆｕ／ｍ
ｌより大きい。本発明はまた、組換えウイルスを含む哺乳動物宿主細胞の溶解物
および上清を含む。これらの溶解物および上清は、従来技術の方法により産生さ
れるものとは異なる。なぜなら、これらは、野生型ウイルスもヘルパーウイルス
も含まないからである。

【０１３０】好ましい実施形態において、この方法を用いて高力価の、かつヘルパーウイル
スおよび野生型ウイルスの非存在下で組換えＡＡＶを製造する。所望の導入遺伝
子（これに作動可能に連結された適切な発現調節配列を含む）は、当該分野で公
知の手段により、ＡＡＶＩＴＲの間に配置される。実際のパッケージングと適
合する長さに導入物の長さを維持するために、スペーサーＤＮＡが必要に応じて
、所望の導入遺伝子に挿入され得る。次いで、この組換えウイルスゲノムは、必
須でない遺伝子座に、当該分野で公知の手段により、バキュロウイルスに埋め込
まれる。必要とされるヘルパー機能、複製およびキャプシド形成機能、ならびに
／または埋め込まれた組換えウイルスゲノムは、ポリヘドリン遺伝子部位、ｐ１
０遺伝子部位に配置され得る。すなわち、一方がポリヘドリン遺伝子部位に配置
され得、そして他方が、ｐ１０遺伝子部位に配置され得る（図１を参照のこと）
。バキュロウイルス骨格はまた、リガンド核酸（例えば、ＶＳＶ−Ｇ遺伝子）を
含むように改変され得る。バキュロウイルスはまた、ｒｅｐおよびｃａｐ配列、
ならびにアデノウイルス由来のヘルパー機能（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４Ｏ
ＲＦ６およびＶＡＩ、またはＨＳＶ遺伝子ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ
２９）を含むように改変され得る。キャリアベクターは、昆虫細胞（例えば、Ｓ
ｆ９細胞）に形質導入され、この細胞は、バキュロウイルスが産生される条件下
で増殖され、そしてバキュロウイルスは、収集され、そして精製される。次いで
、バキュロウイルスを用いて、哺乳動物細胞を感染させ、哺乳動物細胞は組換え
ウイルスが複製される条件下で増殖され、切り出され、キャプシド形成され、そ
して組換えＡＡＶウイルスが収集され、そして必要に応じて精製される。

【０１３１】別の好ましい実施形態において、この方法を用いて、高力価、かつヘルパーウ
イルスおよび野生型アデノウイルスの非存在下で、アデノウイルス遺伝子の全て
を欠失した組み換え「無能力（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスを製造する。
以前に、当業者は、アデノウイルス遺伝子の全てを、ＩＴＲおよびシス作用性パ
ッケージングシグナルを除いて除去したアデノウイルスゲノム由来の「中身を取
り除いた（ｇｕｔｔｅｄ）」アデノウイルスプラスミドを作製した。目的の導入
遺伝子、転写調節配列、および必要に応じてスタッファーＤＮＡを含む外来ＤＮ
Ａが付加されて、約３６ｋｂの挿入物を得る。プラスミドは、ＤＮＡカセットが
、導入遺伝子およびスタッファーＤＮＡの上流にパッケージングシグナルを含み
、そしてＡｄＩＴＲがこのようなＤＮＡカセットに隣接するように設計される
。このプラスミドを細胞（例えば、２９３細胞）にトランスフェクトした。アデ
ノウイルスＥ１およびＥ３遺伝子、ならびにアデノウイルスパッケージングシグ
ナル内の配列を欠いたヘルパーアデノウイルスを用いて、中身を取り除いたアデ
ノウイルスプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞に感染させて、トラン
スで複製およびキャプシド形成機能を提供した。この方法を用いると、低レベル
の相同組換えがヘルパーＡｄにおけるパッケージングシグナルの欠失をレスキュ
ーする。従って、ヘルパーおよび「無能力」アデノウイルス両方が産生される。
ＣｓＣｌ勾配により、組換え「無能力」アデノウイルスベクターからヘルパーア
デノウイルスを分離しなければならない。さらに、他の欠点としては、高レベル
の夾雑するヘルパーウイルスおよび低収率の無能力Ａｄベクターが挙げられた。

【０１３２】本発明の方法を用いると、夾雑するヘルパーＡｄの産生を生じる相同組換えが
避けられ得る。ヘルパーアデノウイルスを使用することよりむしろ、当業者は、
中身を取り除いたＡｄゲノムの複製およびパッケージングに必要なアデノウイル
ス機能を含むキャリアベクターを構築し得る。１つの実施形態において、キャリ
アベクターは、ＩＴＲ、Ｅ１、パッケージングシグナルを含まず、必要に応じて
Ｅ３も含まないアデノウイルスの完全ゲノムを含む。次いで、当業者は、このキ
ャリアウイルスで哺乳動物細胞を感染させ得、そして導入遺伝子、ＩＴＲおよび
パッケージングシグナルを含む上記のプラスミドでトランスフェクトし得る。別
の実施形態において、当業者は、２つの別個のキャリアウイルスを構築し得る。
一方は、上記のヘルパーアデノウイルス機能を含み、他方は、ＡｄＩＴＲ、パ
ッケージングシグナルおよび導入遺伝子カセットを含む中身を取り除いたＡｄ構
築物を含む。あるいは、当業者は、ヘルパーアデノウイルス機能ならびに、ＩＴ
Ｒ、パッケージングシグナルおよび導入遺伝子／スタッファーＤＮＡを含む導入
遺伝子カセットの両方を含む単一のキャリアベクターを構築し得る。アデノウイ
ルス機能および導入遺伝子カセットは、ポリヘドリン遺伝子座、ｐ１０遺伝子座
に配置され得る。すなわち、一方は、ポリヘドリン遺伝子座に配置され得、そし
て他方はｐ１０遺伝子座に配置され得る（図１を参照のこと）。

【０１３３】別の好ましい実施形態において、この方法を用いて、組換えヘルパーウイルス
アンプリコンベクターを産生する。上記で議論されるように、ヘルペスウイルス
アンプリコンは、パッケージングのための「α」配列、およびＨＳＶ複製起点を
必要とする。ｏｒｉ_Sまたはｏｒｉ_L複製起点のいずれかが使用され得るが、ｏｒ
ｉ_S起源が好ましい。当業者は、ヘルペスウイルスアンプリコンを含むキャリア
ベクターを構築し得る。１つの実施形態において、カセットは、５’から３’方
向に、「α」配列、続いて、目的の導入遺伝子、続いてＨＳＶ複製起点、続いて
必要に応じてスペーサー、続いて別の「α」配列を含む。これは、例えば、バキ
ュロウイルスにおけるポリヘドリンまたはｐ１０遺伝子座のいずれかに挿入され
得る。その後に産生されるキャリアウイルスを用いて、ヘルパーヘルペスウイル
スと同時感染させた哺乳動物細胞に感染させ得る。あるいは、ヘルパーヘルペス
ウイルス機能は、同じまたは別個のキャリアベクターに配置され得、そしてこれ
を用いて哺乳動物細胞を感染させ得る。次いで、組換えヘルペスウイルスアンプ
リコンベクターは、哺乳動物細胞から単離され、そして精製され得る。

【０１３４】（組換えウイルス組成物）本発明の別の実施形態は、本発明の方法によって産生される組換えウイルスで
ある。他の組換えウイルスの調製物とは異なり、本発明の方法によって産生され
る調製物は、高力価の本質的に相同な組換えウイルスをもたらし、これはヘルパ
ーを有さず、そして野生型のウイルスを有さない。この組換えウイルスは、イン
ビボおよびインビトロでの一過性および安定な遺伝子の任意の形態についての使
用のための薬理学的組成物として処方され得る。この組換えウイルスは、インビ
ボおよびエキソビボの遺伝子治療、遺伝的免疫化、インビトロタンパク質産生お
よび診断アッセイのために使用され得る。

【０１３５】遺伝子治療について、この組換えウイルスは、エキソビボまたはインビボで細
胞に導入され得る。このウイルスがエキソビボで細胞に導入される場合、この組
換えウイルスは、インビトロで細胞を感染するために使用され得、次いでこの細
胞は、所望の場合、引き続いて哺乳動物に（例えば、門脈または脾臓に）導入さ
れ得る。あるいは、この組換えウイルスは、哺乳動物に直接（例えば、静脈内ま
たは腹腔内に）投与され得る。徐放性デバイス（例えば、移植可能なポンプ）は
、このウイルスの細胞への送達を容易にするために使用され得る。このウイルス
が哺乳動物に投与される場合、感染される特定の細胞は、送達の方法を制御する
ことによって標的化され得る。例えば、この組換えウイルスの門脈または肝動脈
への血管内投与は、組換えウイルスが肝臓細胞を標的化することを容易にするた
めに使用され得る。

【０１３６】上記の方法によって産生される組換えウイルスは、好ましくは生物学的に適合
性の溶液または薬学的に受容可能な送達ビヒクル中に懸濁して、患者に投与され
得る。適切なビヒクルとしては、滅菌した生理食塩水が挙げられる。薬学的に受
容可能なキャリアとして公知であり、そして当業者に周知の他の水性および非水
性滅菌懸濁液は、この目的のために使用され得る。

【０１３７】この組換えウイルスは、所望の細胞を感染するために十分な量で投与され、そ
して過度の不利なく、または医学的に受容可能な生理学的効果を有して修正効果
を提供するために、十分なレベルの形質導入および選択した導入遺伝子（または
ワクチンの場合におけるウイルス性遺伝子産物）の発現を提供し、これは医学分
野における当業者によって決定され得る。従来の、および薬学的に受容可能な投
与経路としては、標的器官、組織または部位への直接投与；鼻腔内；静脈内；筋
肉内；皮下；皮内；経口および投与の他の非経口経路が挙げられる。投与経路は
、所望の場合、組合わされ得る。

【０１３８】組換えウイルスの投薬量は、主に組換えウイルスの型のような因子（すなわち
、このウイルスがＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルスなどであるか否か）
、処置される状態、および選択される遺伝子に依存する。投薬量はまた、患者の
年齢、体重および健康に依存して変化し得る。例えば、組換えアデノウイルスの
有効なヒト投薬量は、一般に、投与される用量当たりアデノウイルスを１×１０ ⁷ または１×１０⁸または１×１０⁹または１×１０¹⁰または１×１０¹¹または１
×１０¹²または１×１０¹³または１×１０¹⁴または１×１０¹⁵粒子の濃度で含む
約０．５ｍｌ〜５０ｍｌの範囲である。この投薬量は、任意の有害な副作用に対
する修正の利点のバランスを取るように調節される。選択される遺伝子の発現の
レベルは、投薬量投与の型および頻度を決定するためにモニターされ得る。

【０１３９】以下の本発明の実施例は例示のみであり、そして本発明の範囲を限定するよう
には意図されない。

【０１４０】（実施例１）（細胞株の維持およびウイルスの増殖）ヒト胚腎臓細胞株２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）を、１０％ＦＢＳ（
Ｈｙｃｌｏｎｅ）ならびに５０μｇのペニシリン、５０μｇのストレプトマイシ
ン、および１０μｇのネオマイシン／ｍｌ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を補充したＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯＢＲＬ）において
維持した。昆虫細胞株ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、１０％ＦＢＳならびに５０μｇのペニシリン、５０
μｇのストレプトマイシン、および１０μｇのネオマイシン／ｍｌを補充したＳ
Ｆ９００−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中で維持した。ヒトアデノウイルス
５型（ＡＴＣＣＶＲ−５）を、２９３細胞中で増殖し、そしてＣｓＣｌ勾配遠
心分離を介して精製した（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ，１９７８）。

【０１４１】（実施例２）（組換えプラスミド構築）標準的なＤＮＡ組換え技術を、組換えプラスミドを作製するために使用した（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。５ｐプロモーターの上流のＤｒａＩＩＩ部位
とポリアデニル化シグナルの下流のＮｃｏＩ部位との間のｐＡＶ２（ＡＴＣＣ
３７２１６）のＲｅｐおよびＣａｐ配列を取り出した。このＲｅｐおよびＣａｐ
配列を、複数のクローニング工程を通して、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモー
ターの制御下でＧＦＰを含むカセットに置換して、ｐＡＶ２ｃｉｓＥＦＧＦＰを
作製した（図２）。次いで、ＡＡＶＩＴＲおよびＧＦＰ遺伝子の両方を含むカ
セット全体を、複数のクローニング工程を通して、ＢＶ−ＣＺＰＧ（ポリヘドリ
ンプロモーターの制御下でＶＳＶ−Ｇ遺伝子を有するバキュロウイルスシャトル
プラスミド；Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．のＤｒ．ＪｉｍＢａｒｓｏｕｍによって
厚意で提供された）のＳｐｅＩおよびＢｇＩＩＩ部位中にクローニングして、ｐ
ＢＶ−ｃｉｓＥＦＧＦＰを得た（図３）。

【０１４２】アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、およびＶＡＩを、Ａｄ
５ＤＮＡからサブクローニングした。手短に言うと、Ｅ４ＯＲＦ６を、最初に
ｐＩＲＥＳｌｎｅｏ（ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
）のＳｍａＩおよびＸｂａＩ部位に挿入し、ｐＩＲＥＳＯＲＦ６を得た。次に、
Ｅ２Ａコード配列を含むＳａｕ３ＡＩ−ＢｓｒＧＩフラグメントを、複数のクロ
ーニング工程を介してプラスミドｐＩＲＥＳＯＲＦ６のＢａｍＨＩ／ＢｓｔＸＩ
部位中に挿入して、プラスミドｐＥ２ＡｉＯＲＦ６を得た。この構築物において
、Ｅ２ＡおよびＥ４ＯＲＦ６遺伝子は、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）由来のＩ
ＲＥＳによって分離しており、そして両方の遺伝子は、Ｅ２Ａ遺伝子の上流の単
一のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にある。次
に、ＶＡＩ遺伝子を含むＡｄ５ＤＮＡのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを
、平滑末端クローニングを通してｐＥ２ＡｉＯＲＦ６のＸｈｏＩ部位に挿入して
、ｐＥ２ＡｉＯＲＦ６−ＶＡＩを得た。ＣＭＶ−Ｅ２ＡｉＯＲＦ６−ＶＡＩを含
むカセット全体を、バキュロウイルスシャトルプラスミドＢＶ−ＣＺＰＧのＨｐ
ａＩおよびＳｐｅＩ部位にクローニングして、ｐＢＶ−ＥｉＯＶを得た（図２）
。

【０１４３】ＤｒａＩＩＩ部位（これは、ＡＡＶ−２ｐ５プロモーターの上流である）と
ＢｓａＩ部位（これは、ポリアデニル化シグナルの下流である）との間に位置す
るＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（図２）を、ｐＢＶ−ＥｉＯＶのＳｐ
ｅＩおよびＰａｃＩ部位にマルチクローニング工程を介してクローニングして、
ｐＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣを得た（図３）。Ａｄ５ＥｌおよびｃｉｓＥＦＧＦＰを
、複数工程を介してｐＢＶ−ＥｉＯＶにクローニングして、ｐＢＶ−ＥｉＯＶ−
ｃｉｓＥＦＧＦＰ−Ｅｌプラスミドを得た（図３）。プラスミドｐＡｃ−ｃｉｓ
ＥＦＧＦを、いくつかのクローニング工程を介して、ＡＡＶ−２ＩＴＲｓに隣
接するＧＦＰ遺伝子を含むカセットをｐＡｃＵＷｌ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に
挿入することによって構築した。ｐＥＢＶＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由
来のＥＢＶＯｒｉのＸｂａｌ−ＳｓｐＩフラグメントを、ｐＢＶｃｉｓＥＦＧＦ
ＰおよびｐＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣに挿入して、ｐＢＶ−ｃｉｓＥＦＧＦＰ−ＥＢ
ＶＯｒｉ（図３）およびｐＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣ−ＥＢＶＯｒｉ（図３）を作製
した。ＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をｐＡｄＡＦ６（Ａｄヘルパー遺
伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４全体、およびＶＡＩを保有するプラスミド；Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＤｒ．ＧｕａｎｇｐｉｎｇＧａｏに
よって厚意で提供された）にクローニングして、ｐＡｄＡＦ６−ＲＣを得た（図
３）。

【０１４４】「ｐ」が先行する構築物への言及は、プラスミドをいいし、他方、先行する「
ｐ」のない構築物への言及は、ウイルスをいう。例えば、ｐＢＶ−ＥｉＯＶ−Ｒ
Ｃは、プラスミドをいい、一方、ＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣは、改変されたバキュロ
ウイルスをいう。

【０１４５】（実施例３）（２９３細胞のトランスフェクションおよび２９３−ＣＧ３の安定な細胞株の
選択）２９３細胞を、６ｃｍ直径の組織培養皿中で約７０％のコンフルエンシーまで
増殖させ、そしてリン酸カルシウムトランスフェクション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、１９８９）によって、１μｇのｐＩＲＥＳ１ｎｅｏおよび１０μｇのｐＡＶ
２ｃｉｓＥＦＧＦＰで一晩同時トランスフェクトした。細胞に、１０％ＦＢＳを
含む新鮮な培地を給餌し、そして２４時間培養した。トリプシン処理の後、細胞
を、１０％ＦＢＳを含む新鮮な培地中に１：２０の希釈で播種した。さらに２４
時間インキュベーションした後、１，２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）を含む新鮮な培地を細胞単層に添加して、Ｇ４１８耐性細胞を選択し
た。Ｇ４１８を含む培地を、最初のＧ４１８耐性細胞コロニーのほとんどが形成
されるまで、３〜４日毎に交換した。合計５０コロニーが選ばれ、このうち６つ
が構成的なＧＦＰ発現を実証した。これらの６つのコロニーを、Ｇ４１８の存在
下で拡張させ、そしてプラスミドｐＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣでのトランスフェクト
によって機能的ｒＡＡＶをレスキューするその能力について試験した。通常、ク
ローンが樹立された場合、全ての非耐性細胞が死滅することを確実にするために
、このクローンを、Ｇ４１８含有培地中に３〜５継代維持した。次いで、この細
胞をＧ４１８を含まない培地中に維持した。一つの細胞クローン（２９３−ＣＧ
３）が、ｒＡＡＶレスキューの高い効率を示し、そしてこれをさらなる実験に使
用した。

【０１４６】（実施例４）（ｒＡＡＶ産生についての２９３−ＣＧ３の機能試験）いくつかのプラスミドを用いて、ｒＡＡＶ産生についての２９３−ＣＧ３の効
率を試験した。この細胞を、トランスフェクションの前に、最初に６ウェルプレ
ートに１×１０⁶細胞／ウェルの密度で２〜４時間播種した。各ウェルにおける
細胞に、１６７μｌのＣａＰＯ₄の最終容量で５μｇのプラスミドＤＮＡを与え
た（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。１６時間インキュベーションした後、細
胞に新鮮な培地を給餌した。３日後、細胞を収集し、そしてｒＡＡＶ力価（形質
導入単位）を決定した。この結果を、２つの別々の実験から決定された値の平均
として表１に示した。この結果は、２９３−ＣＧ３細胞株が、ｒＡＡＶ産生に非
常に効率的であり、使用するヘルパープラスミドのコンフィギュレーションに依
存して、細胞当たり約３０〜１７０の形質導入単位を産生することを示す。

【０１４７】

【表１】（実施例５）（組換えバキュロウイルスの産生）ＶＳＶ−Ｇ偽型組換えバキュロウイルスを作製するために、ＢａｃＰＡＫバキ
ュロウイルス発現系（ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
）を使用した。プラスミドＤＮＡ（ｐＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣ、ｐＢＶ−ｃｉｓＥ
ＦＧＦＰ、またはｐＢＶ−ＥｉＯＶｃｉｓＥＦＧＦＰ−Ｅ１のうちの１つ）を、
製造者のプトロコルに従って、Ｂｓｕ３６Ｉ消化ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡでＳｆ
２１細胞に同時トランスフェクトした。この培地を、トランスフェクションの３
日後に収集し、そして組換えバキュロウイルスを、制限希釈アッセイによって９
６ウェルプレート上でスクリーニングした。手短に言うと、トランスフェクショ
ンから収集した培地を、２×１０⁵細胞／ｍｌのＳｆ２１細胞を含む１０ｍｌの
昆虫培地の各々において、１０^-2、１０^-3、１０^-4、および１０^-5に希釈した。
次いで、この混合物を９６ウェルプレートに、１００μｌ／ウェルでプレーティ
ングした。

【０１４８】５〜７日間感染した後、細胞をウイルス感染の徴候（ＶＳＶ−Ｇ発現によって
媒介される細胞融合；Ｅｉｄｅｌｍａｎら、１９８４を参照のこと）について試
験した。最低希釈においてウイルス感染を示したウェルに印をつけ、そしてこの
ウイルスを収集した（Ｃｈｅｎら、１９９４）。この細胞を溶解し、そして組換
えＤＮＡの存在を確認するためにＤＮＡハイブリダイゼーションに使用した。陽
性のクローンを１０ｍｌに増殖し、そして各クローンの１ｍｌを６ウェルプレー
トに２９３細胞増殖を形質導入するために使用した。この２９３細胞を、ｒＡＡ
Ｖレスキューのための組換えバキュロウイルスによって提供されないエレメント
を保有するプラスミドでトランスフェクトした。３日間形質導入した後、細胞を
溶解し、そしてこの溶解物を８４−３１細胞（２９３細胞由来のＥ１／Ｅ４二重
相補的細胞株；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４
３，１９９６を参照のこと）を形質導入するために使用した。マーカー遺伝子の
発現は、ｒＡＡＶのレスキューを示した。純粋な組換えバキュロウイルスを得る
ために、ｒＡＡＶレスキューを最も良くレスキューし得るクローンを、さらに３
〜４ラウンドスクリーニングし、ｒＡＡＶレスキューの補助について試験した。
機能性クローンを、９６ウェルプレート上でさらに３〜４ラウンドスクリーニン
グして、純粋な組換えバキュロウイルスを得た。

【０１４９】非ＶＳＶ−Ｇ偽型組換えバキュロウイルスを作製するために、Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ）を使用した。製造者のプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを、バ
キュロウイルス性ＤＮＡでＳｆ２１細胞に同時トランスフェクトした。野生型バ
キュロウイルス由来の組換えバキュロウイルスを区別するためにＸ−ｇａｌ染色
を使用したことを除いて、上記のＶＳＶ−Ｇ偽型バキュロウイルスについて記載
したのと同様に、組換えバキュロウイルスを９６ウェルプレート上でスクリーニ
ングした。

【０１５０】（実施例６）（本発明の方法の使用によるｒＡＡＶの産生）（細胞を形質導入する方法）形質導入のために、組換えバキュロウイルスを、４℃、２０，０００ｒｐｍで
３０分間遠心分離することによって、最初にペレットにした。次いで、このペレ
ットを、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁した。この培地を細胞単層から除去し、そし
てバキュロウイルスを細胞に添加した。８〜１６時間インキュベーションした後
、細胞に、１０％ＦＢＳを含む新鮮な培地を給餌した。形質導入の７２時間後に
、細胞を収集した。バキュロウイルス形質導入された細胞を収集し、そして氷浴
上で超音波処理（１分毎に、３回の超音波パルス）することによって、ＤＯＣ溶
解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣ１₂、０
．５％デオキシコール酸ナトリウム）中に溶解した。４℃、１３，０００ｒｐｍ
で５分間遠心分離することによって細胞砕片を除去し、そして上清を集めた。こ
の上清を、実施例７に記載されるようなｒＡＡＶ滴定について使用した。

【０１５１】（バキュロウイルスＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣおよびＢＶ−ｃｉｓＥＦＧＦＰによ
る２９３細胞の形質導入）ＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣは、Ａｄヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、および
ＶＡＩ、ならびにＡＡＶｒｅｐおよびキャップ遺伝子を提供する。ＢＶ−ｃｉ
ｓＥＦＧＦＰは、マーカー遺伝子ＧＦＰに隣接するＡＡＶＩＲＴの両方を有す
るＡＡＶベクター配列を提供する。２９３細胞は、Ｅ１ａおよびＥ１ｂを発現す
る。従って、ＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣおよびＢＶ−ｃｉｓＥＦＧＦＰの両方での２
９３細胞の形質導入は、この細胞に、ＥＦ１αプロモーターに作動可能に連結さ
れ、そしてＡＡＶＩＴＲに隣接するＧＦＰ導入遺伝子を含む、埋包されたＡＡ
Ｖウイルス性遺伝子；ＶＳＶ−Ｇリガンド；Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲ
Ｆ６、およびＶＡＩを含むヘルパー機能；ならびに複製およびキャプシド形成、
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する。これらの機能は、この細胞が、組換えＡＡＶを
産生することを可能にする。

【０１５２】（バキュロウイルスＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣＴによる２９３−ＣＧ３細胞の形質
導入）ＡＡＶベクターは２９３−ＧＣ３細胞において安定に組み込まれたことから、
リガンド核酸、ヘルパー機能および複製、ならびに組換えＡＡＶを産生するため
のキャプシド形成機能を提供するために、ＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣのみが必要とさ
れた。

【０１５３】（バキュロウイルスＢＶ−ＥｉＯＶ−ｃｉｓＥＦ６ＦＰ−Ｅ１によるＲｅｐ−
Ｃａｐ発現細胞の形質導入）バキュロウイルスＢＶ−ＥｉＯＶ−ｃｉｓＥＦＧＦＰ−Ｅ１は、Ａｄヘルパー
遺伝子Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、およびＶＡＩ、ならびにマーカー遺伝子Ｇ
ＦＰに隣接するＡＡＶ−ＩＴＲＳの両方を有するＡＡＶベクターを提供する。Ａ
ＡＶｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子は、Ｂ５０のような安定なｒｅｐ−ｃａｐ細胞株に
よって提供される（Ｇａｏら、１９９８）。

【０１５４】（実施例７）（バキュロウイルス形質導入によって産生されるｒＡＡＶの滴定）実施例６において記載されるように調製されるバキュロウイルス形質導入細胞
由来のｒＡＡＶ溶解物を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、１０^-2、１０^-3、お
よび１０^-4に希釈し、そして滴定アッセイについて使用した。２４ウェルプレー
トを、最初に０．１％ゼラチンで３０分間コーティングし、次いで２９３ベース
の８４−３１細胞の２×１０⁵細胞／ウェルでプレーティングした（Ｆｉｓｃｈ
ｅｒら、１９９６）。３〜４時間のインキュベーションの後、この細胞に１００
粒子／細胞のアデノウイルスを３０分間感染させ（アデノウイルスは、一本鎖Ａ
ＡＶの二本鎖ＡＡＶへの転換を助け、そしてこれはＡＡＶ滴定のために広く使用
される）、次いで希釈ｒＡＡＶ溶解物を添加した。ｒＡＡＶによる２４時間の形
質導入の後に、この細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで３０分間固
定した。このパラホルムアルデヒドをＰＢＳに置換し、そしてＧＦＰ発現細胞を
、蛍光顕微鏡によって計数した。

【０１５５】（実施例８）（ＶＳＶ−Ｇ偽型バキュロウイルスを使用するｒＡＡＶの産生）組換えバキュロウイルスＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣを使用して、ｒＡＡＶ産生のた
めに２９３−ＣＧ３細胞を形質導入した。この細胞を、形質導入の前２〜４時間
で、最初に６ウェルプレート上に、１×１０⁶細胞／ウェルの密度でプレーティ
ングした。バキュロウイルスＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣを、４℃、２０，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離することによって濃縮し、血清含有ＤＭＥＭ中に再懸濁し
、次いで表２に示される量で細胞に添加した。１６時間インキュベーションした
後、細胞を新鮮な培地で給餌した。合計３日間の形質導入の後、細胞を収集し、
そしてｒＡＡＶ力価（形質導入単位）を決定した。この結果を、２つの別々の実
験から決定された値の平均として、表２に示す。この結果は、Ａｄヘルパーおよ
びＡＡＶｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子を保有する組換えバキュロウイルスが、２９３
−ＣＧ３細胞を首尾よく形質導入し得、そしてｒＡＡＶを産生し得ることを示す
。インプットバキュロウイルスの感染多重度（ｍｏｉ）の増加によって、より高
い力価のｒＡＡＶが産生された。

【０１５６】

【表２】（実施例９）（ＶＳＶ−Ｇ偽型および非偽型バキュロウイルスによる、異なる哺乳動物細胞
株の形質導入効率）バキュロウイルスによって効率的に形質導入される適切な細胞株を同定するた
めに、多くの細胞株を試験した。細胞を６ウェルプレートに播種し、そして約８
０％のコンフルエンシーまで増殖した。無血清ＤＭＥＭ中で、バキュロウイルス
を、示されたｍｏｉでこの細胞に添加し、この細胞と一晩インキュベートし、そ
して１２〜１５時間後に新鮮な培地に置き換えた。組換えバキュロウイルスによ
る形質導入の４８時間後に、ＧＦＰ発現細胞を、単層中の全ての細胞のパーセン
テージとして記録した。

【０１５７】表３に示される結果は、概してＶＳＶ−Ｇ偽型バキュロウイルス（ＢＶ−ｃｉ
ｓＥＦＧＦＰ）が、非偽型バキュロウイルス（Ａｃ−ｃｉｓＥＦＧＦＰ）よりも
はるかに効率的に哺乳類細胞を形質導入することを示す。しかし、ＨｅｐＧ２お
よびＳａｏｓ−２細胞株は、バキュロウイルスによるＨｅＬａ細胞株および２９
３細胞株よりも、より形質導入性（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｂｌｅ）であることが見
出された。２９３細胞における筋書きと同様に、ＡｄＥ１遺伝子のこれらの細
胞の染色体への挿入は、以前の実施例に列挙される組換えバキュロウイルスを使
用する、これらの細胞からのｒＡＡＶの産生をさらに容易にするはずである。Ｓ
ａｏｓ−２細胞が、バキュロウイルスコーティング上のＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質
の存在とも非存在とも無関係に、バキュロウイルスによる感染に対して高度に許
容的であることは、注目すべきである。この細胞株の使用は、非偽型バキュロウ
イルスを使用するｒＡＡＶ産生についての利点を提供し得る。

【０１５８】上記に列挙された全ての文書は、本明細書中に参考として援用される。本発明
の多数の改変および変化は、上記に確認される明細書に含まれ、そしてこれは当
業者に明らかであることが予想される。本発明のプロセスについてのこのような
改変および変化は、本明細書に添付される特許請求の範囲に含まれると考えられ
る。

【０１５９】

【表３】（参考文献）１．ＪｏｎｅｓＮ，ＳｈｅｎｋＴ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｄｅｌｅｔ
ｉｏｎａｎｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｏｆａｄｅｎ
ｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ５．Ｃｅｌｌ１９７８年１月；１３（１）：１８１
−８。２．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＰｒｅｓｓ．１９８９。３．ＧａｏＧＰ，ＱｕＧ，ＦａｕｓｔＬＺ，ＥｎｇｄａｈｌＲＫ，Ｘｉ
ａｏＷ，ＨｕｇｈｅｓＪＶ，ＺｏｌｔｉｃｋＰＷ，ＷｉｌｓｏｎＪＭ．
Ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒａｌｖ
ｅｃｔｏｒｓｆｒｏｍａＲｅｐ／Ｃａｐｃｅｌｌｌｉｎｅａｎｄ
ｈｙｂｒｉｄｓｈｕｔｔｌｅｖｉｒｕｓ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１
９９８年１１月１日；９（１６）：２３５３−６２。４．ＦｉｓｈｅｒＫＪ，ＧａｏＧＰ，ＷｅｉｔｚｍａｎＭＤ，ＤｅＭａｔ
ｔｅｏＲ，ＢｕｒｄａＪＦ，ＷｉｌｓｏｎＪＭ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏ
ｎｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓｆｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｉｓｌｉｍｉｔｅｄｂｙ
ｌｅａｄｉｎｇ−ｓｔｒａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＪＶｉｒｏｌ１９
９６年１月；７０（１）：５２０−３２。５．Ｅｉｄｅｌｍａｎ，Ｏ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｔｒａｌｋａ，Ｔ．Ｓ
．，およびＢｌｕｍｅｎｔｈａｌ，Ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２
５９：４６２２−４６２８。６．Ｃｈｅｎ，Ｈ．およびＰａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ１９９４，１７：４０−４２。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）またはｐ１０遺伝子のいずれ
かの位置に挿入された標的遺伝子を有する組換えバキュロウイルスの模式図であ
る。

【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ＡＡＶ２型の遺伝子マップを表す。図２Ａは、ウイル
スゲノムの模式図である。ｒｅｐは複製タンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、
Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードし、そしてｃａｐは、キャプシド形成
機能（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）をコードする。右向きの矢印：ｐ５、ｐ
ｌ９、およびｐ４０のウイルスプロモーター；下向きの垂直矢印：３’−ＩＴＲ
の上流の共通のポリアデニル化シグナル。図２Ｂは、３つのプロモーターの各々
に由来する転写物を表す。Ａ_n：ポリアデニル化。

【図３】図３は、本発明にもいて用いられる構築されたプラスミドの模式図である。

【図４】図４は、伝統的なアデノウイルス感染／プラスミド同時トランスフェクション
方法によるｒＡＡＶ産生に関与する工程を示す（Ｓｈｅｎｋｅｔａｌ．、米
国特許第５，４３６，１４６号）。

【図５】図５は、２つの組換えバキュロウイルス（ＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣおよびＢＶ−
ｃｉｓＥＦＧＦＰ）の使用によるｒＡＡＶ産生に必要な工程を示す。

【図６】図６は、１つの組換えバキュロウイルス（ＢＶＥｉＯＶ−ＲＣ）とともに、
安定な細胞株２９３−ＣＧ３を使用することによるｒＡＡＶ産生のために必要な
工程を示す。

【図７】図７は、組換えバキュロウイルス（ＢＶ−ＥｉＯＶ−ｃｉｓＥＦＧＦＰ−Ｅ１
）とともに、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子を発現する安定な細胞株を使用
することによるｒＡＡＶ産生のために必要な工程を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チェン，ハイフェンアメリカ合衆国ペンシルベニア 19063，メディア，アイリスレーン 749 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA03 CA04 DA02 EA02 FA02 FA18 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB00 AC14 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 AA03 AA13 BA35 CA01 MA17 MA22 MA23 MA52 MA56 MA59 MA66 NA10 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA22 MA23 MA52 MA56 MA59 MA66 NA05 NA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えウイルスを作製するためのキャリアベクターであって
、ここで、該キャリアベクターは、非哺乳動物の細胞中で複製され得る、非哺乳
動物ウイルスの骨格、あるいは該骨格の一部または改変体を含む、キャリアベク
ター。
【請求項２】請求項１に記載のキャリアベクターであって、該キャリアベ
クターは、以下の１以上のエレメント：１）包埋された組換えウイルスゲノム；
２）該組換えウイルスゲノムの複製およびキャプシド形成に必要とされるタンパ
ク質をコードする核酸配列；３）ヘルパー機能をコードする核酸配列；４）哺乳
動物の細胞と相互作用し得るリガンドをコードする核酸配列；および５）非哺乳
動物ウイルスの骨格あるいは該骨格の複製能を有する部分または改変体中の配列
を制御する調節制御配列を含む、キャリアベクター。
【請求項３】哺乳動物の細胞レセプターに結合し得るリガンドをコードす
る核酸配列を含む、請求項２に記載のキャリアベクター。
【請求項４】包理された組換えウイルスゲノムをさらに含む、請求項１、
２または３のいずれか１項に記載のキャリアベクター。
【請求項５】前記組換えウイルスゲノムの複製およびキャプシド形成に必
要とされるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１、２または
３のいずれか１項に記載のキャリアベクター。
【請求項６】ヘルパー機能をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１
、２または３のいずれか１項に記載のキャリアベクター。
【請求項７】非哺乳動物ウイルスの骨格あるいは該骨格の複製能を有する
部分または改変体中の核酸配列の発現を調節する調節制御配列をさらに含む、請
求項１、２または３のいずれか１項に記載のキャリアベクター。
【請求項８】前記組換えウイルスゲノムの複製およびキャプシド形成に必
要とされるタンパク質をコードする核酸配列、およびヘルパー機能をコードする
核酸配列をさらに含む、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のキャリア
ベクター。
【請求項９】包埋された組換えウイルスゲノム、ならびに該組換えウイル
スゲノムの複製およびキャプシド形成に必要とされるタンパク質をコードする核
酸配列ならびに／またはヘルパー機能をコードする核酸配列をさらに含む、請求
項１、２または３のいずれか１項に記載のキャリアベクター。
【請求項１０】感染性組換えウイルスを産生するために、哺乳動物の宿主
細胞によって必要とされる全ての前記エレメントを含む、請求項１、２または３
のいずれか１項に記載のキャリアベクター。
【請求項１１】哺乳動物の細胞と相互作用し得るリガンドをコードする前
記核酸配列が、非哺乳動物のプロモーターの調節制御下にある、請求項２または
３に記載のキャリアベクター。
【請求項１２】前記リガンドが、哺乳動物の細胞レセプターに結合し得る
、請求項１１に記載のキャリアベクター。
【請求項１３】請求項２または３に記載のキャリアベクターであって、前
記包埋された組換えウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノ
ウイルス、レトロウイルスまたはヘルペスウイルス由来の隣接配列を含む、キャ
リアベクター。
【請求項１４】請求項１３に記載のキャリアベクターであって、前記包埋
された組換えウイルスゲノムが、ＡＡＶ由来の隣接配列を含み、そして該キャリ
アベクターが、ＡＡＶの複製に必要とされるヘルパー機能を提供するタンパク質
をコードするヘルパー配列をさらに含む、キャリアベクター。
【請求項１５】請求項１４に記載のキャリアベクターであって、前記ヘル
パー配列が、アデノウイルス（Ａｄ）ＤＮＡ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ｉ型ＤＮＡもしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＩ型ＤＮＡ、仮性狂犬病
ウイルス（ＰＲＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはワクシニアウイル
ス由来である、キャリアベクター。
【請求項１６】請求項１５に記載のキャリアベクターであって、ここで、
前記ヘルパー配列が、アデノウイルス遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒ
ｆ６およびＶＡＩからなる群から選択される少なくとも１個の遺伝子産物、ある
いはＨＳＶ１型遺伝子ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９からなる群か
ら選択される少なくとも１個の遺伝子産物をコードする、キャリアベクター。
【請求項１７】ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする核酸
配列をさらに含む、請求項１４に記載のキャリアベクター。
【請求項１８】前記包埋された組換えウイルスゲノムが、アデノウイルス
由来の隣接配列およびパッケージングシグナルを含む、請求項１３に記載のキャ
リアベクター。
【請求項１９】前記包埋された組換えウイルスゲノムが、ヘルペスウイル
ス「α」パッケージング配列およびヘルペスウイルスの複製起点を含む、請求項
１３に記載のキャリアベクター。
【請求項２０】前記包埋された組換えウイルスゲノムが、導入遺伝子を含
み、該導入遺伝子の発現は、該導入遺伝子に作動可能に連結された発現調節配列
によって調節される、請求項２または３に記載のキャリアベクター。
【請求項２１】キャリアウイルスを産生するための方法であって、該方法
、以下：ａ）非哺乳動物ウイルスの骨格ＤＮＡ、あるいは該骨格の複製能を有する部分
または改変体を、以下のｉ）〜ｖ）：ｉ）発現調節配列に作動可能に連結され、そして側方エレメントが隣接
する導入遺伝子を含む、組換えウイルスゲノム、ｉｉ）発現調節配列に作動可能に連結されたヘルパー機能をコードする核
酸配列、ｉｉｉ）組換えウイルスに対して、複製および／またはキャプシド形成機能
をコードする、核酸配列、ｉｖ）非哺乳動物の細胞において活性である、発現調節配列に作動可能に
連結される、リガンドＤＮＡ、およびｖ）該非哺乳動物ウイルスの骨格、改変された非哺乳動物ウイルスの骨
格または該骨格もしくは改変された骨格の複製能を有する部分中の配列を調節す
る、調節制御配列、を含む１以上の核酸挿入物を挿入することによって改変する工程；ｂ）得られた該キャリアベクターを非哺乳動物の宿主細胞に形質導入する工程
；ｃ）キャリアウイルスが産生される条件下で該哺乳動物の宿主細胞を増殖する
工程；ならびにｄ）該非哺乳動物の宿主細胞から該キャリアウイルスを収集する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】前記非哺乳動物ウイルスの骨格が、バキュロウイルス由来
であり、そして前記非哺乳動物の宿主細胞が、昆虫細胞である、請求項２１に記
載の方法。
【請求項２３】請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法によっ
て産生される、キャリアウイルスを含む、溶解物または上清。
【請求項２４】前記キャリアウイルスを精製する工程をさらに包含する、
請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】請求項２１、２２または２４のいずれか１項に記載の方法
によって産生される、キャリアウイルスの精製された調製物。
【請求項２６】組換えウイルスを産生するための方法であって、該方法は
、以下：ａ）哺乳動物の宿主細胞にキャリアウイルスを感染させる工程であって、該キ
ャリアウイルスは、該ウイルスの表面でリガンドを必要に応じて発現する、工程
；ｂ）包埋された組換えウイルスゲノムが複製、切除およびキャプシド形成され
る条件下で、該感染された哺乳動物の宿主細胞を増殖させる、工程；ならびにｃ）該哺乳動物宿主細胞から該組換えウイルスを収集する工程、を包含する、方法。
【請求項２７】請求項２６に記載の方法であって、前記哺乳動物の宿主細
胞が、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳ
Ｃ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、Ｈ
Ｔ１０８０、２９３、Ｂ−５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ
−２、Ｈｕｈ７またはＨｅＬａ細胞から選択される、方法。
【請求項２８】請求項２６または２７のいずれか１項に記載の方法によっ
て産生される組換えウイルスを含む、溶解物または上清。
【請求項２９】前記哺乳動物の宿主細胞から前記組換えウイルスを精製す
る工程をさらに包含する、請求項２６または２７のいずれか１項に記載の方法
【請求項３０】請求項２６、２７または２９のいずれか１項に記載の方法
によって産生される、精製された組換えウイルス。
【請求項３１】請求項２５に記載のキャリアウイルスまたは請求項３０の
記載の組換えウイルスを含み、そして薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む
、薬学的組成物。
【請求項３２】所望の導入遺伝子の一過性または安定的な遺伝子移入のた
めの方法であって、前記哺乳動物の細胞に、請求項３０に記載の組換えウイルス
を感染させる工程を包含する、方法。
【請求項３３】前記一過性または安定的な遺伝子移入が、遺伝子免疫、遺
伝子欠損の矯正、またはインビトロ、インビボ、もしくはエキソビボでのタンパ
ク質の産生のためである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】ワクチンとして点変異または欠失を含む組換えウイルスを
使用する方法であって、該方法は、弱毒化した複製能を有する組換えウイルスま
たは複製欠損組換えウイルスを、請求項２６の方法によって産生する工程、およ
び免疫原性応答を誘導するのに有効な用量で組換えウイルスを投与する工程を包
含する、方法。
【請求項３５】請求項３１に記載の薬学的組成物であって、前記キャリア
ウイルスは、前記組換えアデノウイルスの複製およびキャプシド形成に必要とさ
れるアデノウイルス配列をさらに含む、薬学的組成物。