JP2023520927A - タンパク質凝集障害の処置のための組成物および方法 - Google Patents

タンパク質凝集障害の処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

ポリグルタミン媒介性タンパク質凝集を特異的に低下させるために、細胞の生得的なシャペロン機構、具体的にはＨｓｐ７０媒介性システムを動員する新規なクラスの融合タンパク質が開示される。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）による、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，２５１号の優先権を主張する。前述の出願の全内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
配列表
この出願は、２０２１年４月９日に最終変更され、かつ本明細書と共に電子提出された、「２６９５４８－４８９６４９＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名の配列表（１５０，０３１バイト）を全体として参照により組み入れている。
細胞内で発現した全てのタンパク質は、適切に機能するためにそれらの意図された構造へ正しくフォールドされる必要がある。増え続ける疾患および障害が、タンパク質の不適切なフォールディングならびに／またはタンパク質およびリポタンパク質、加えて感染性タンパク質性物質の不適切な沈着および凝集と関連づけられることが示されている。コンフォメーション病またはプロテオパチーとしても知られている、ミスフォールディングにより引き起こされる疾患の例には、嚢胞性線維症（ＣＦ）、ポリグルタミンリピート障害、パーキンソン病（ＰＤ）、およびアルツハイマー病（ＡＤ）が挙げられる。変異タンパク質は、細胞において凝集し、典型的な細胞毒性細胞封入体の原因となる。
タンパク質リピート伸長障害として同定された障害は、アミノ酸のホモポリマーストレッチ、しばしばグルタミン残基、すなわち、ポリグルタミン（ポリＱ）のストレッチの伸長を含有する。少なくとも８つの神経変性障害は、ポリグルタミン伸長と関連づけられており、その障害には、ハンチントン病（ＨＤ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、およびいくつかの型の脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）が挙げられる。
これらの遺伝的に異なる疾患の間で共有される一つの共通の生理学的特性は、その疾患を患っている患者が全て、彼らの脳内にタンパク質性沈着物を有することが見出されることである。これらの疾患のそれぞれにおいて、タンパク質沈着物は異なるタンパク質に関連づけられるが、そのタンパク質は全て、グルタミンの伸長ストレッチを含有する。今まで、疾患関連タンパク質におけるこのポリグルタミン（ポリＱ）配列の伸長ストレッチは、全てのポリグルタミンリピート疾患に結びつけられる唯一の既知の遺伝子変異である。
ハンチントン病（ＨＤ）は、主に大脳皮質および線条体における、選択的神経細胞喪失およびアストロサイト増加によって特徴づけられる遺伝性ポリグルタミンリピート疾患である（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌ ２００７）。研究中の最新の薬物治療は、特徴的な運動不全の抗舞踏病性／神経遮断性薬での処置か、またはハンチンチンの発現の低下（無差別的かまたは変異型に対して選択的かのいずれか）のいずれかに限定されるが、認知症および精神医学的障害を含む疾患の進行性の性質に作用する原因療法はない（Ｂｏｎｅｌｌｉ、２００７）。
ＨＤは、タンパク質ハンチンチンにおいて伸長したポリグルタミンリピート（ポリＱ）ストレッチへ翻訳する、ハンチンチン遺伝子（ＩＴ－１５）の最初のエクソンにおける不安定なＣＡＧリピート伸長により引き起こされる。３７個より多いグルタミン残基の病的なポリＱの長さは、アミノ末端ハンチンチン断片を含有する細胞質の、核周囲の、および核の封入体の出現ならびにタンパク質の隔離に関連している（Ｉｍａｒｉｓｉｏら、２００８）。
現在、ＨＤについて利用可能な処置は主に、肉眼で見える症状を管理することに限定されている。例えば、ＦＤＡによって承認された最も新しい化合物の一つである、テトラベナジンは、ＨＤ患者において運動過剰を低下させるための薬物である。テトラベナジンは、神経伝達物質の早期分解を促進する小胞アミン輸送体（ＶＭＡＴ）阻害剤である。したがって、その薬物は、単に症状を処置するだけであり、疾患の根を処置するのではない。ＨＤを処置するために現在、用いられている他の薬物には、神経遮断剤およびベンゾジアゼピンが挙げられる。ＨＤの根本的原因に取り組もうと試みている、現在知られている処置はない。他のポリグルタミンリピート疾患の処置のための承認された治療はない。
したがって、特に、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に基づいた病態を有する疾患、ならびに異種性凝集物の場合における疾患に対して、特異的な抗原、タンパク質、糖タンパク質、またはリポタンパク質を標的化するように最適化された新しい治療モダリティーの開発の必要性が存在する。
熱ショック７０ｋＤａタンパク質（本明細書では「Ｈｓｐ７０ｓ」と呼ぶ）は、様々な種の細胞においてシャペロンタンパク質の遍在性クラスを構成する（Ｔａｖａｒｉａら、（１９９６） Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ １、２３～２８）。Ｈｓｐ７０は、機能するために、Ｊドメインタンパク質およびヌクレオチド交換因子（ＮＥＦ）などのコシャペロンタンパク質と呼ばれるアシスタントタンパク質を必要とする（Ｈａｒｔｌら、（２００９）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６、５７４～５８１）。タンパク質をフォールドするためのＨｓｐ７０シャペロン機構の最新モデルにおいて、Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ結合状態とＡＤＰ結合状態との間を循環し、Ｊドメインタンパク質は、フォールディングまたはリフォールディングを必要とする別のタンパク質（「クライアントタンパク質」と呼ばれる）と結合して、Ｈｓｐ７０のＡＴＰ結合型（Ｈｓｐ７０－ＡＴＰ）と相互作用する（Ｙｏｕｎｇ（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８８、２９１～３００；Ｍａｙｅｒ、（２０１０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３９、３２１～３３１）。Ｊドメインタンパク質－クライアントタンパク質複合体のＨｓｐ７０－ＡＴＰとの結合は、ＡＴＰ加水分解を刺激し、それは、Ｈｓｐ７０タンパク質において立体構造変化を引き起こし、ヘリックスの蓋を閉じ、それにより、クライアントタンパク質とＨｓｐ７０－ＡＤＰとの間の相互作用を安定化し、加えて、Ｊドメインタンパク質の放出を誘発し、その後、そのＪドメインタンパク質は、別のクライアントタンパク質と自由に結合できる。
したがって、このモデルにより、Ｊドメインタンパク質は、様々なクライアントタンパク質の捕獲およびそのＨｓｐ７０機構へのリクルートメントを促進する、架橋として働いて、適切な立体構造へのフォールディングまたはリフォールディングを促すことにより、Ｈｓｐ７０機構内で重要な部分を果たす（Ｋａｍｐｉｎｇａ ＆ Ｃｒａｉｇ（２０１０）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１、５７９～５９２）。Ｊドメインファミリーは、原核生物（ＤｎａＪタンパク質）から真核生物（Ｈｓｐ４０タンパク質ファミリー）にわたる種において広く保存されている。Ｊドメイン（約６０～８０ａａ）は、４つのヘリックス：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶで構成されている。ヘリックスＩＩおよびＩＩＩは、「ＨＰＤモチーフ」を含有する可動性ループを介して接続されており、そのＨＰＤモチーフは、Ｊドメインにわたって高度に保存されており、活性にとって重要な意味をもつと考えられる（Ｔｓａｉ ＆ Ｄｏｕｇｌａｓ、（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１、９３４７～９３５４）。ＨＰＤ配列内の変異は、Ｊドメイン機能を消失させることが見出されている。
ハンチントン病などのプロテオパチーについて上記で提供された背景を考えると、ミスフォールドされたタンパク質のレベルを低下させることが、これらの壊滅的な障害の症状を処置する、防止する、または別様に改善するための手段として役に立ち得ること、およびタンパク質ミスフォールディングを修復する細胞の生得的な能力の動員が、追求するべき当然の選択であろうことは明らかなように思われる。実際、シャペロンに基づいた治療用物質を開発することにおけるいくつかの試みが、これらの疾患についての有望なストラテジーであることを示唆している。しかしながら、これらの治療的適用は、おそらくクライアントタンパク質に関してシャペロンの相対的な乱交雑により、望ましくない結果を伴うことが見出される場合が多かった。例えば、ヒト腫瘍の圧倒的多数は、Ｈｓｐ７０を過剰発現し、Ｈｓｐ７０の過剰発現は、発癌のリスクの増加および癌患者における予後不良をもたらすことが見出されている（Ｍｕｒｐｈｙ（２０１３）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、３４：１１８１～１１８８）。同様に、シャペロン修飾因子の適用は、おそらく選択性の欠如により、標的タンパク質に密接に関係した酵素の阻害を生じ得る（Ｐｅｒｅｉｒａら、（２０１８）Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０１８、９、１７４０～１７５２）。したがって、シャペロンに基づいた治療の開発の成功は、病的タンパク質への特異性を提供することを必要とする。したがって、プロテオパチーの処置のための高度に特異的なシャペロンを開発する必要性が存在する。
本発明者らは、ポリグルタミン媒介性タンパク質凝集を特異的に低下させるための、細胞の生得的なシャペロン機構、具体的にはＨｓｐ７０媒介性システムを動員する新規なクラスの融合タンパク質を開発している。タンパク質分泌および発現を増強するために、Ｈｓｐ７０と相互作用するコシャペロンである、Ｈｓｐ４０（Ｊタンパク質とも呼ばれる）の断片を含む融合タンパク質を用いる、本発明者らによる以前の研究においてとは違って、本研究は、ポリグルタミンリピートを含有する細胞内タンパク質により引き起こされるタンパク質凝集および細胞毒性を低下させることを目的として、Ｊドメイン含有融合タンパク質を用いる。この関連において、本発明者らは、機能に必要とされるＪドメインのエレメントが、タンパク質発現および分泌を増強することにおけるＪドメインの使用とは全く異なるという驚くべき発見をし、本融合タンパク質の作用様式について別個の機構を実証した。本明細書に記載された融合タンパク質は、Ｊドメイン、およびポリグルタミンリピートに対する親和性を有するドメインを含む。融合タンパク質内のポリグルタミン結合性ドメインの存在は、ポリグルタミンリピートを有するタンパク質の凝集の特異的な低下を生じる。
Ｅ１． したがって、第１の態様において、Ｊタンパク質のＪドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む単離された融合タンパク質が本明細書で開示される。
Ｅ２． Ｊタンパク質のＪドメインが真核生物起源である、Ｅ１に記載の融合タンパク質。
Ｅ３． Ｊタンパク質のＪドメインがヒト起源である、Ｅ１～Ｅ２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ４． Ｊタンパク質のＪドメインが細胞質に局在する、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ５． Ｊタンパク質のＪドメインが、配列番号１～５０からなる群から選択される、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ６． Ｊドメインが、配列番号１、５、６、１０、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ７． Ｊドメインが配列番号５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ８． Ｊドメインが配列番号１０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ９． Ｊドメインが配列番号２４の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１０． Ｊドメインが配列番号３１の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１１． Ｊドメインが配列番号４９の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１２． ポリグルタミン結合性ドメインが、チオレドキシン－Ｑ６２凝集の阻害を測定する間接的アッセイを用いて試験された場合、２μＭ以下、例えば１μＭ以下、５００ｎＭ以下、３００μＭ以下、２００ｎＭ以下の、ポリグルタミンリピート（例えば、チオレドキシン－Ｑ６２構築物）に対するＫＤを有する、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１３． ポリグルタミン結合性ドメインが、配列番号５１～６８からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１４． ポリグルタミン結合性ドメインが、配列番号５７、配列番号６２、または配列番号６８の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１５． 複数のポリグルタミン結合性ドメインを含む、Ｅ１～Ｅ１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１６． ２つのポリグルタミン結合性ドメインからなる、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１７． 複数のＪドメインからなる、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１８． 以下の構築物：
ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｄ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｈ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｉ． ＤＮＡＪ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｊ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｋ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｌ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｍ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｎ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｏ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｑ． Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
ｓ． Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｑ
のうちの１つを含み、
ここで、
Ｑはポリグルタミン結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１９． 配列番号５のＪドメイン配列および配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメイン配列を含む、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２０． 配列番号５のＪドメイン配列、および配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメイン配列の２個のコピーを含む、Ｅ１～Ｅ１９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２１． 配列番号５のＪドメイン配列、および配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメイン配列の３個のコピーを含む、Ｅ１～Ｅ１９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２２． 配列番号８９～１５８からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２３． 配列番号９０、１２２、１３９、１４０、１４１、１５７、および１５８からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２４． 配列番号１２２の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２５． 配列番号１３９の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２６． 配列番号１４０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２７． 配列番号１４１の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２８． 配列番号９０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２９． 配列番号１５７の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３０． 配列番号１５８の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３１． 標的化試薬をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３２． エピトープをさらに含む、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３３． 細胞透過剤をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３４． 細胞透過剤が、配列番号８５～８８からなる群から選択されるペプチド配列を含む、Ｅ３３に記載の融合タンパク質。
Ｅ３５． シグナル配列をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３６． シグナル配列が、配列番号１５９～１６１からなる群から選択されるペプチド配列を含む、Ｅ３５に記載の融合タンパク質。
Ｅ３７． 細胞において病的タンパク質の凝集を低下させる能力がある、Ｅ１～Ｅ３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３８． ポリグルタミンリピート媒介性細胞毒性を低下させる能力がある、Ｅ１～Ｅ３７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３９． Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
Ｅ４０． 前記核酸がＤＮＡである、Ｅ３９に記載の核酸配列。
Ｅ４１． 前記核酸がＲＮＡである、Ｅ３９～Ｅ４０のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４２． 前記核酸が少なくとも１個の修飾核酸を含む、Ｅ３９～Ｅ４１のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４３． プロモーター領域、５’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）シグナルなどの３’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ３９～Ｅ４２のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４４． プロモーター領域が、ＣＭＶエンハンサー配列、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、およびＧＦＡＰプロモーターからなる群から選択される配列を含む、Ｅ４３に記載の核酸配列。
Ｅ４５． Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸配列を含むベクター。
Ｅ４６． アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアまたは粘液腫）、パラミクソウイルス（麻疹、ＲＳＶ、またはニューキャッスル病ウイルス）、バキュロウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、およびフラビウイルスからなる群から選択される、Ｅ４５に記載のベクター。
Ｅ４７． ＡＡＶである、Ｅ４５またはＥ４６に記載のベクター。
Ｅ４８． カプシドおよびＥ４１またはＥ４２に記載のベクターを含むウイルス粒子。
Ｅ４９． カプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、偽型ＡＡＶ、アカゲザル由来ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ－ＤＪａｎ ＡＡＶカプシド変異体、ＡＡＶハイブリッドセロタイプ、臓器向性ＡＡＶ、心臓向性ＡＡＶ、および心臓向性ＡＡＶＭ４１変異体からなる群から選択される、Ｅ４８に記載のウイルス粒子。
Ｅ５０． カプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される、Ｅ４８またはＥ４９に記載のウイルス粒子。
Ｅ５１． カプシドがＡＡＶ２である、Ｅ４８～Ｅ５０のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５２． カプシドがＡＡＶ５である、Ｅ４８～Ｅ５０のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５３． カプシドがＡＡＶ８である、Ｅ４８～Ｅ５０のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５４． カプシドがＡＡＶ９である、Ｅ４８～Ｅ５０のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５５． カプシドがＡＡＶｒｈ１０である、Ｅ４８～Ｅ５０のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５６． Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子からなる群から選択される作用物質、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
Ｅ５７． 細胞においてポリグルタミンタンパク質の毒性を低下させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５６に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
Ｅ５８． 細胞が対象内にある、Ｅ５７に記載の方法。
Ｅ５９． 対象がヒトである、Ｅ５７またはＥ５８に記載の方法。
Ｅ６０． 細胞が中枢神経系の細胞である、Ｅ５７～Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６１． 対象が、ポリグルタミンリピート疾患を有すると同定されている、Ｅ５７～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２． ポリグルタミンタンパク質が、ハンチンチン、アトロフィン－１、アタキシン１、アタキシン２、Ｃａｖ２．１、アタキシン７、ＴＡＴＡ結合性タンパク質、アタキシン３、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択される、Ｅ５７～Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３． 細胞においてポリグルタミンタンパク質の凝集の低下がある、Ｅ５７～Ｅ６２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６４． ポリグルタミンリピート疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象において、ポリグルタミンリピート疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５６に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、方法。
Ｅ６５． ポリグルタミンリピート疾患が、ハンチントン病、ＳＣＡ １型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、ＤＲＰＬＡ、およびＳＢＭＡからなる群から選択される、Ｅ６４に記載の方法。
Ｅ６６． 対象においてポリグルタミンリピート疾患を防止するまたはその進行を遅延させることにおける使用のための、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５６に記載の薬学的組成物の１つまたは複数の使用。
Ｅ６７． 細胞においてタンパク質凝集を低下させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５６に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
Ｅ６８． 細胞が対象内にある、Ｅ６７に記載の方法。
Ｅ６９． 対象がヒトである、Ｅ６７～Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７０． 細胞が中枢神経系の細胞である、Ｅ６７～Ｅ６９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７１． 対象が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、プリオン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される疾患を有すると同定されている、Ｅ６７～Ｅ７０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７２． 細胞においてタンパク質の凝集の低下がある、Ｅ６７～Ｅ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７３． タンパク質凝集疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象において、タンパク質凝集疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５６に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、方法。
Ｅ７４． ポリグルタミンリピート疾患が、ハンチントン病、ＳＣＡ １型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、ＤＲＰＬＡ、およびＳＢＭＡからなる群から選択される、Ｅ７３に記載の方法。
Ｅ７５． 対象においてタンパク質凝集疾患を防止するまたはその進行を遅延させることにおける使用のための、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ３９～Ｅ４４のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４５～Ｅ４７のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４８～Ｅ５５のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５６に記載の薬学的組成物の１つまたは複数の使用。
代表的なヒトＪドメイン配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す図である。高度に保存されたＨＰＤドメインは、強調表示された四角形内に示されている。 代表的なヒトＪドメイン配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す図である。 Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含むいくつかの実例的な融合タンパク質構築物を示す図である。 ポリグルタミン伸長の正常レベル（ＧＦＰ－ＨＴＴＱ２３における２３個のリピート）かまたは変異体レベル（ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４における７４個のリピート）のいずれかを有するハンチンチンタンパク質断片を含有するレポーター構築物も発現する細胞において融合タンパク質（構築物１～７）を発現することの、フィルタートラップアッセイにより測定された場合のタンパク質凝集への効果を示す図である。 ハンチンチンレポーター構築物ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４を発現する細胞においてハンチンチン凝集を低下させる、改変型Ｊドメインを有する追加の融合タンパク質構築物の能力を示す図である。 融合タンパク質構築物内の異なるリンカーの比較を示す図である。 蛍光顕微鏡法により測定された場合の、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４単独（図６ａ）、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ２３単独（図６ｂ）、または保存ＨＰＤモチーフ内に変異を有する融合タンパク質であるＪＢ１（Ｐ３３Ｑ）－２ＸＱＢＰ１を同時発現するＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４（図６ｄ）と比較した、Ｊ－２ＸＱＢＰ１構築物（図６ｃ）を発現する細胞におけるタンパク質凝集の低下を示す。 蛍光顕微鏡法（図７Ａ）およびフィルタートラップアッセイ（図７Ｂ）により測定された場合のタンパク質凝集を低下させる能力について試験された追加の構築物を示す図である。 Ｕ８７－ＭＧグリオーマ細胞において構築物５６（ＪＢ１－ＪＢ１－ＱＢＰ１）を発現することの効果を示す図である。Ａ． Ｕ８７－ＭＧグリオーマ細胞を、構築物５６ありまたはなしでＭｙｃタグ付き正常ＨＴＴ（Ｑ２３）またはｍＨＴＴ（Ｑ７４）を発現させるようにレンチウイルスに感染させた。培地を、２日目および４日目に新鮮な培地と交換した。細胞を、７日目に、フィルタートラップアッセイのために溶解した。０．５μｇまたは２．５μｇの総タンパク質を、フィルタートラップアッセイ装置にアプライし、その後、抗ＨＴＴ抗体（ＭＷ８）を用いるイムノブロッティングアッセイを行った。Ｂ． 感染後７日目に、Ｕ８７－ＭＧ細胞から培地を収集した。培地における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ－Ｃｙｔｏｘ（商標）アッセイキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により測定した。値は、平均値±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５。 野生型マウスにおける対照または構築物５３発現ｒＡＡＶカプシド（ＡＡＶ ｒｈ１０における）のＩＣＶ投与の効果を示す図である。Ａ． 各マウスについての体重を、ＩＣＶ ＡＡＶ注射後、毎日、記録した。Ｂ． 凍結皮質切片を、抗Ｆｌａｇ抗体（１、４；緑色）および抗ＮｅｕＮ抗体（２、５；赤色）で染色し、Ｄａｐｉ（３、６；青色）で対比染色した。画像は、代表的な皮質領である。パネル１～３：対照ＡＡＶｒｈ１０の注射；パネル４～６：Ｆｌａｇ－ＱＢＰ１－ＪＢ１－ＱＢＰ１－Ｆｌａｇ ＡＡＶｒｈ１０の注射。
定義
本明細書および特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指図しない限り、複数の指示物を含む。例えば、用語「１つの細胞」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すのに本明細書で交換可能に用いられる。ポリマーは直鎖状または分岐状であり得、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、それは非アミノ酸により中断されてもよい。それらの用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の操作により、修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。
本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸のいずれかを指し、それには、Ｄ型またはＬ型の両方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体が挙げられるが、それらに限定されない。標準一文字または三文字コードが、アミノ酸を名付けるために用いられる。
「宿主細胞」は、対象ベクターについてのレシピエントであり得、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含む。その子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な変異によって、最初の親細胞と必ずしも完全に同一（形態において、または全ＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）というわけではない。宿主細胞は、インビボでこの発明のベクターでトランスフェクトされた細胞を含む。
本明細書で開示された様々なポリペプチドを記載するために用いられる場合の「単離された」は、その天然の環境のコンポーネントから識別および分離されており、ならびに／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑コンポーネントは、典型的には、本ポリペプチドについての診断的または治療的使用に干渉する材料であり、それには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、体積あたりの分子の濃度または数が、その天然に存在する対応物のそれより一般的に大きい点で、その天然に存在する対応物から区別可能である。一般的に、組換え手段により生成され、かつ宿主細胞において発現したポリペプチドは、「単離」されていると見なされる。
「単離された」ポリヌクレオチド、またはポリペプチドをコードする核酸、または他のポリペプチドをコードする核酸は、それが、そのポリペプチドをコードする核酸の天然源において通常付随している少なくとも１つの夾雑核酸分子から識別および分離されている核酸分子である。単離された、ポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然で見出される形または設定以外をとる。したがって、単離された、ポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然の細胞において存在する場合のその特定のポリペプチドをコードする核酸分子から区別される。しかしながら、単離された、ポリペプチドをコードする核酸分子には、そのポリペプチドを通常発現する細胞に含有される、ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられ、ここで、例えば、その核酸分子は、天然細胞の位置とは異なる、染色体または染色体外の位置にある。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は交換可能に用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、そのポリマーのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造への修飾が与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識コンポーネントとのコンジュゲーションなど、ポリマー化後にさらに修飾され得る。
本明細書で定義される場合、用語「ポリグルタミン障害」または「ポリグルタミンリピート障害」は、細胞内のポリグルタミン凝集物の形成に関連した障害を指し、好ましくは、ハンチントン病（ＨＤ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、および脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、またはＭＪＤ／ＳＣＡ３を指す。
同様に、用語「ポリグルタミン含有タンパク質」は、少なくとも１０個、例えば、少なくとも１３個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個またはそれ以上のグルタミンアミノ酸のストレッチを含有するタンパク質を指す。多くの場合、ポリグルタミン含有タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、異常に高いレベルのポリグルタミンを含有する。ポリグルタミンストレッチを含有するタンパク質には、ハンチンチン、アトロフィン－１、アタキシン１、アタキシン２、Ｃａｖ２．１、アタキシン７、ＴＡＴＡ結合性タンパク質、アタキシン３、およびアンドロゲン受容体が挙げられるが、それらに限定されない。
「ベクター」は、好ましくは適切な宿主において自己複製する、核酸分子であり、それは、挿入された核酸分子を宿主細胞の中へおよび／または宿主細胞間で転移させる。その用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への挿入のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能する複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、上記の機能の１つより多くを提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞の中へ導入された場合、転写され、かつポリペプチドへ翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターで構成された適切な宿主細胞を含意する。
用語「作動可能に連結された」は、記載されたコンポーネントの並置であって、そこで、それらのコンポーネントが、それらの意図された様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列と「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合した条件下で達成されるように、ライゲーションされている。「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子と近接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するようにトランスでまたはある距離を置いて作用する発現制御配列の両方が挙げられ得る。用語「発現制御配列」は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングに作用するのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに、必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物体によって異なる；原核生物において、そのような制御配列には、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる；真核生物において、一般的に、そのような制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必須であるコンポーネントを含むことが意図され、その存在が有利である追加のコンポーネント、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。他に言及がない限り、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターへ挿入することの本明細書での記載または言及は、その挿入される核酸もまた、その挿入される核酸分子を含有する発現ベクターが適合性宿主細胞または生物体の適合性細胞へ導入される場合、コードされた融合タンパク質の発現に必要とされる、機能性プロモーターならびに他の転写および翻訳制御エレメントとベクター内で作動可能に連結されていることを意味する。
ポリヌクレオチドに適用される場合の「組換え型の」は、そのポリヌクレオチドが、宿主細胞において潜在的に発現し得る構築物を生じる、インビトロクローニング、制限および／またはライゲーションのステップ、ならびに他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は、本明細書で交換可能に用いられる。それらは、転写および翻訳された後、特定のタンパク質をコードする能力がある少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、そのポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限り、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得、それは、コード領域全体またはそのセグメントを網羅し得る。「融合遺伝子」は、一緒に連結されている少なくとも２つの異種性ポリヌクレオチドで構成される遺伝子である。
用語「疾患」および「障害」は、当技術分野において容認可能な医療水準および行為により同定された病的状態を示すように、交換可能に用いられる。
本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、疾患またはその１つもしくは複数の症状の重症度および／または期間を低下させまたは改善する；有害なまたは病的な状態の進展を防止する；病的状態の退行を引き起こす；病的状態に関連した１つまたは複数の症状の再発、発達、発生、または進行を防止する；障害を検出する；あるいは、治療（例えば、別の予防または治療剤の投与）の予防的または治療的効果を増強しまたは向上させるのに十分である治療の量を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「Ｊドメイン」は、Ｈｓｐ７０およびその同族の内因性ＡＴＰアーゼ触媒活性を加速する能力を保持する断片を指す。様々なＪタンパク質のＪドメインが決定されており（例えば、Ｋａｍｐｉｎｇａら （２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．、１１：５７９～５９２；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら （２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４：１６９７～１７０９参照（それぞれは、全体として参照により組み入れられている））、以下のいくつかのホールマークによって特徴づけられる：４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、および通常、ヘリックスＩＩとＩＩＩの間に高度に保存された、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸のトリペプチド配列モチーフ（「ＨＰＤモチーフ」と呼ばれる）を有することにより特徴づけられる。典型的には、Ｊタンパク質のＪドメインは、５０アミノ酸長から７０アミノ酸長の間であり、Ｈｓｐ７０－ＡＴＰシャペロンタンパク質とのＪドメインの相互作用（結合）の部位は、ヘリックスＩＩ内から伸びる領域であると考えられており、ＨＰＤモチーフは、Ｈｓｐ７０ ＡＴＰアーゼ活性の刺激に必要である。本明細書で用いられる場合、用語「Ｊドメイン」は、Ｈｓｐ７０の内因性ＡＴＰアーゼ活性を加速する能力を保持する、天然のＪドメイン配列およびその機能性バリアントを含むことを意図され、その能力は、当技術分野においてよく知られた方法を用いて測定することができる（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｈｏｒｎｅら （２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８５、２１６７９～２１６８８参照）。ヒトＪドメインの非限定的リストは、表１に提供されている。
詳細な説明
本発明者らは、Ｊタンパク質のＪドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質構築物と、細胞をある程度、接触させることが、ポリグルタミン含有タンパク質の凝集を低下させる予想外の効果を生じることを見出している。ポリグルタミンリピートを含有するそのようなタンパク質の凝集は、いくつかの壊滅的な疾患を引き起こすと考えられており、その疾患には、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）１型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、および球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、ポリグルタミンリピート障害を処置するための、例えばそれを必要とする対象においての、有用な組成物および方法が本明細書に提供される。
シャペロンに基づいた治療に関連した問題を克服するために、本発明者らは、高い特異性を有する人工シャペロンタンパク質をデザインすることが可能であるかどうかを調べた。本発明者らは、Ｈｓｐ７０結合／活性化のためのエフェクタードメイン（Ｊドメイン配列）、およびポリグルタミンリピートを有するタンパク質に対する特異性を与えるドメインを含む一連の融合タンパク質構築物をデザインした。生じた融合タンパク質は、Ｈｓｐ７０およびその同族の内因性ＡＴＰアーゼ触媒活性を加速するように作用し、その結果として、タンパク質フォールディングの増加および凝集の低下を生じる。
Ｉ． 融合タンパク質構築物
ａ． 本発明における有用なＪドメイン
様々なＪタンパク質のＪドメインが決定されている。例えば、Ｋａｍｐｉｎｇａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．、１１：５７９～５９２（２０１０）；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４：１６９７～１７０９（２００５）参照。本発明の融合タンパク質を調製することにおいて有用なＪドメインは、主にＨｓｐ７０ ＡＴＰアーゼ活性を加速するＪドメインの特徴を定義する鍵を握る。したがって、本発明において有用な単離されたＪドメインは、４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、および通常、ヘリックスＩＩとＩＩＩの間に高度に保存された、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸のトリペプチド配列（「ＨＰＤモチーフ」と呼ばれる）を有することにより特徴づけられる、ポリペプチドドメインを含む。典型的には、Ｊタンパク質のＪドメインは、５０アミノ酸長から７０アミノ酸長の間であり、Ｈｓｐ７０－ＡＴＰシャペロンタンパク質とのＪドメインの相互作用（結合）の部位は、ヘリックスＩＩ内から伸びる領域であると考えられており、ＨＰＤモチーフは、原始的な活性の基礎をなす。代表的なＪドメインには、ＤｎａＪＢ１、ＤｎａＪＢ２、ＤｎａＪＢ６、ＤｎａＪＣ６のＪドメイン、ＳＶ４０のラージＴ抗原のＪドメイン、および哺乳動物のシステインストリングタンパク質（ＣＳＰ－α）のＪドメインが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の融合タンパク質に用いられ得るこれらを始めとするＪドメインについてのアミノ酸配列は、表１に提供されている。保存ＨＰＤモチーフは、太字で強調されている。実施された予備実験は、ＨＰＤモチーフの不可欠性を確認している；実際、ＤＮＡ ＪＢ１３由来のＪドメイン（配列番号１６）を用いた融合タンパク質構築物は、タンパク質凝集を低下させる能力があることを見出されなかった（構築物５９）。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、ＨＰＤドメインを含むＪドメイン配列を含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１～１５、１７～５０からなる群から選択される、Ｊタンパク質のＪドメインを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１、５、６、１０、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択される、Ｊタンパク質のＪドメインを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメインを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１０のＪドメインを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２４のＪドメインを含む。さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３１のＪドメインを含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４９のＪドメインを含む。
Figure 2023520927000001
Figure 2023520927000002
Figure 2023520927000003
Figure 2023520927000004
ｂ． ポリグルタミン結合性ドメイン
融合タンパク質はまた、少なくとも１つのポリグルタミン結合性ドメインを含む。ポリグルタミン結合性ドメインは、融合タンパク質を形成するようにＪドメインと連結された一本鎖ポリペプチドまたは多量体ポリペプチドであり得る。
ポリグルタミン結合性ドメインは、細胞内に病的レベルで存在する場合のポリグルタミン含有タンパク質を結合することができる十分な親和性を有することが理想的である。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、チオレドキシン－Ｑ６２凝集の阻害を測定する間接的アッセイを用いて試験された場合、２μＭ以下、例えば１μＭ以下、５００ｎＭ以下、３００μＭ以下、２００ｎＭ以下の、ポリグルタミンリピート（例えば、チオレドキシン－Ｑ６２構築物）に対するＫＤを有するポリグルタミン結合性ドメインを含む（Ｎａｇａｉら （２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（１４）１０４３７～１０４４２）。
ＱＢＰ１配列（配列番号５７）およびその誘導体もまた、ＴＤＰ－４３（Ｍｏｍｐｅａｎら （２０１９）Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、６７５、１０８１１３）、α－シヌクレイン（Ｈｅｒｖａｓら （２０１２）ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０（５）、ｅ１００１３３５）、およびプリオンホモログ（Ｈｅｒｖａｓら （２０１２）ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０（５）、ｅ１００１３３５）などの他のアミロイド形成性タンパク質の凝集を遮断することが報告されており、その配列は、重要な単量体β立体構造変化の乱交雑性阻害剤と考えられている。したがって、別の実施形態において、配列番号５１～６８からなる群から選択されるポリグルタミン結合性ドメイン（例えば、表２参照）を含む融合タンパク質が、タンパク質ミスフォールディングによって引き起こされる疾患ならびに／またはＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、プリオン病、およびレビー小体型認知症などの疾患に関連したタンパク質凝集を低下させるために用いられる。
ポリグルタミン結合性ドメインは、以前に同定され、かつ特徴づけられている（例えば、Ｎａｇａｉら、前記；Ｗａｒａｇａｉら （１９９９）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ８、９７７～９８７；Ｉｍａｆｕｋｕら （１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２５３、１６～２０参照）。したがって、別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５１～６８からなる群から選択されるポリグルタミン結合性ドメイン（例えば、表２参照）を含む。一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメインを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号６２のポリグルタミン結合性ドメインを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号６８のポリグルタミン結合性ドメインを含む。
別の実施形態において、融合タンパク質はまた、Ｊドメインと化学的にコンジュゲートされるポリグルタミン結合性タンパク質の使用を企図する。ポリグルタミン結合性ドメインは、Ｊドメインと直接的にコンジュゲートされ得る。あるいは、それは、リンカーによりＪドメインとコンジュゲートされ得る。例えば、当業者に知られて、かつポリグルタミン結合性ドメインをＪドメインと、または標的化ドメインを、ポリグルタミン結合性ドメインおよびＪドメインを含む融合タンパク質と架橋するのに有用である多数の化学的架橋剤がある。例えば、架橋剤は、分子を段階的な様式で連結するために用いることができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質をコンジュゲートするためのより特異的なカップリング方法をデザインする能力を提供し、それにより、ホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低下させる。様々なヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において知られており、それには、スクシンイジミル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４－スクシンイミジルオキシカルボニル－ａ－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）－トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、一般的により高い水溶性を有するＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。加えて、連結鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤は、インビボでのリンカー切断の量を低下させるためにアルキル誘導体として、代わりに合成することができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤および光反応性架橋剤を含む、いくつかの他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、およびジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ（フォーブス－コリ（Forbes-Cori）病）は、この開示に用いられる有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ビス－［Ｂ－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ－スクシンイミジル－６（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質カップリング技術の最近の概説について、参照により本明細書に組み入れられた、Ｍｅａｎｓら、（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １：２～１２を参照されたい。
Figure 2023520927000005
ｃ． 任意選択のリンカー
本明細書に記載された融合タンパク質は、任意選択で、１つまたは複数のリンカーを含有することができる。リンカーは、ペプチド性または非ペプチド性であり得る。リンカーの目的は、とりわけ、タンパク質内の機能性ドメインの間（例えば、Ｊドメインとポリグルタミン結合性ドメインの間、ポリグルタミン結合性ドメインのタンデム配置の間、Ｊドメインとポリグルタミン結合性ドメインと任意選択の標的化試薬のいずれかの間、またはＪドメインとポリグルタミン結合性ドメインと任意選択の検出ドメインまたはエピトープのいずれかの間）に、そのドメインのそれぞれの最適な機能のために、適切な距離を与えることである。明らかに、リンカーは、好ましくは、本発明の融合タンパク質のＪドメイン、標的タンパク質結合性ドメインのそれぞれの機能に干渉しない。リンカーは、本発明の融合タンパク質に存在する場合には、標的タンパク質（ポリＱタンパク質）によって引き起こされる細胞毒性を減弱するように選択され、直接的付着が所望の効果を達成するならば、それは省略され得る。本発明の融合タンパク質に存在するリンカーは、本明細書に記載されているようなタンパク質ドメインまたは融合タンパク質全体をコードする核酸セグメントをインフレームで挿入されている発現ベクターのクローニング部位あたりの核酸のセグメント上に存在するヌクレオチド配列によってコードされる１個または複数のアミノ酸を含み得る。一実施形態において、ペプチドリンカーは、１アミノ酸長から２０アミノ酸長の間である。別の実施形態において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸長から１５アミノ酸長の間である。なお別の実施形態において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸長から１０アミノ酸長の間である。
本発明による融合タンパク質を作製するために１つまたは複数のポリペプチドリンカーを選択することは、当業者の知識と技能の範囲内である。例えば、Ａｒａｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１４（８）：５２９～５３２（２００１）；Ｃｒａｓｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１３（５）：３０９～３１４（２０００）；Ｇｅｏｒｇｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１５（１１）：８７１～８７９（２００３）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：５９２９～５９３４（１９９８）参照（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
本発明による融合タンパク質を調製することにおいて用いられ得る２個以上のアミノ酸のリンカーの例には、下記の表３に提供されたものが挙げられるが、それらに限定されない。
Figure 2023520927000006
ｄ． 標的化試薬
本明細書に開示された融合タンパク質はさらに、標的化部分を含み得る。本明細書で用いられる場合、用語「標的化部分」および「標的化試薬」は、交換可能に用いられ、細胞においてまたは対象の身体において、融合タンパク質の結合、輸送、蓄積、滞留時間、生物学的利用率を増強し、またはその生物活性もしくは治療効果を改変する、融合タンパク質に会合した物質を指す。標的化部分は、組織、細胞、および／または細胞内のレベルで機能性を有し得る。標的化部分は、例えば融合タンパク質の対象への投与で、融合タンパク質の特定の細胞、組織、または器官への局在化を方向づけることができる。一実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。別の実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。なお別の実施形態において、標的化部分は内部に位置する。別の実施形態において、標的化部分は、化学的コンジュゲーションを介して融合タンパク質と付着する。
標的化部分には、とりわけ、有機もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体もしくはその断片、成長因子、酵素、レクチン、抗原もしくは免疫原、ウイルスもしくはそのコンポーネント、ウイルスベクター、受容体、受容体リガンド、毒素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドもしくはアプタマー、ヌクレオチド、炭水化物、糖、脂質、糖脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド、ホルモン、成長因子、化学誘引物質、サイトカイン、ケモカイン、薬物、または小分子が挙げられ得るが、それらに限定されない。
本発明の例示的実施形態において、標的化部分は、標的細胞または組織、例えば、神経細胞、中枢神経系、および／または末梢神経系において、プラットフォーム、またはその関連したリガンドおよび／もしくは活性物質の結合、輸送、蓄積、滞留時間、生物学的利用率を増強し、またはその生物活性もしくは治療効果を改変する。したがって、標的化部分は、中枢神経系に関連した細胞受容体に対する特異性を有し得、または血液脳関門（ＢＢＢ）を経由してのＣＮＳへの送達の増強に別様に関連する。結果的に、上記のようなリガンドは、リガンドと標的化部分の両方であり得る。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第１０，１１１，９６５号に記載されているような、細胞透過性ペプチドであり得る。別の実施形態において、標的化部分は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１６／１３１，５９１号に記載されているような、抗体またはその抗原結合性断片もしくは一本鎖誘導体であり得る。
標的化部分は、標的化された細胞送達のためのプラットフォームに、そのコアと直接的または間接的に結合することにより、連結され得る。例えば、コアがナノ粒子を含む実施形態において、標的化部分のナノ粒子とのコンジュゲーションは、ナノ粒子にＰＥＧを繋ぎ止めるために用いられる類似した官能基を利用することができる。したがって、標的化部分は、標的化部分の官能化を通してナノ粒子と直接的に結合することができる。あるいは、標的化部分は、上記で論じられているように、標的化部分の官能化ＰＥＧとのコンジュゲーションを通して、ナノ粒子と間接的に結合することができる。標的化部分は、共有結合性、非共有結合性、または静電気性相互作用によってコアと接着することができる。一実施形態において、標的化部分はペプチドである。特定の実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＮ末端と共有結合性に付着するペプチドである。
ｅ． エピトープ
ある特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質に追加の性質を与えることができる任意選択のエピトープまたはタグを含有する。本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」および「タグ」は、典型的には融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端と付着する、典型的には３００アミノ酸長以下の、アミノ酸配列を指すのに交換可能に用いられる。一実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、精製を促進するために用いられるエピトープを含む。精製に有用なそのようなエピトープの例には、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（配列番号１６２）、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１６３）、Ｈｉｓ６エピトープ（配列番号１６４）、ｃ－ｍｙｃ（配列番号１６５）、ＨＡ（配列番号１６６）、Ｖ５エピトープ（配列番号１６７）、またはグルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ（配列番号１６８）が挙げられる。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、対象、例えばヒトへ投与された時、融合タンパク質の半減期を増加させるために用いられるエピトープを含む。半減期を増加させるために有用なそのようなエピトープの例には、ヒトＦｃ配列が挙げられる。したがって、一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインに加えて、ヒトＦｃエピトープを含む。エピトープは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。
ｆ．細胞透過性ペプチド
なお他の実施形態において、本明細書に記載された融合タンパク質はさらに、細胞透過性ペプチドを含み得る。細胞透過性ペプチドは、コンジュゲートされたカーゴを、それが小分子であろうと、ペプチドであろうと、タンパク質であろうと、核酸であろうと、細胞へ運ぶことが知られている。本発明の融合タンパク質における細胞透過性ペプチドの非限定的例には、ポリカチオン性ペプチド、例えば、ＨＩＶ ＴＡＴペプチド４９－５７、ポリアルギニン、およびペネトラチンｐＡｎｔａｎ（４３－５８）、両親媒性ペプチド、例えば、ｐｅｐ－１、疎水性ペプチド、例えば、Ｃ４０５Ｙ、およびその他同種類のものが挙げられる。下記の表４参照。
Figure 2023520927000007
したがって、一実施形態において、本融合タンパク質はさらに、細胞透過性ペプチドおよび融合タンパク質を含み、細胞透過性ペプチドが、配列番号８５～８８からなる群から選択され、融合タンパク質が配列番号８９～１５８からなる群から選択される。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号８５のシグナル配列、および配列番号８９～１５８からなる群から選択される融合タンパク質を含む。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号８６の細胞透過性ペプチド、および配列番号８９～１５８からなる群から選択される融合タンパク質を含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８７の細胞透過性ペプチド、および配列番号８９～１５８からなる群から選択される融合タンパク質を含む。さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８８の細胞透過性ペプチド、および配列番号８９～１５８からなる群から選択される融合タンパク質を含む。細胞透過性ペプチドを含む本融合タンパク質構築物を発現する細胞は、対象、例えばヒト対象（例えば、ポリグルタミンリピート障害を有し、または患うリスクがある患者）へ投与され得る。本融合タンパク質は、細胞から分泌され、ポリグルタミンリピート含有タンパク質凝集および／または関連した細胞毒性を低下させるのを助ける。
別の実施形態において、本融合タンパク質はさらに、Ｎ末端上に位置するシグナル配列を含む。シグナル配列は、配列番号１５９～１６１からなる群から選択され得る。
ｇ． Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインの配置
本明細書に記載された融合タンパク質は、多数の様式で配置され得る。一実施形態において、ポリグルタミン結合性ドメインは、ＪドメインのＣ末端側へ付着している。別の実施形態において、ポリグルタミン結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側へ付着している。ポリグルタミンドメインおよびＪドメインは、いずれの立体配置においても、任意選択で、上記のようなリンカーを介して分離され得る。
いくつかの実施形態において、Ｊドメインは、複数のポリグルタミン結合性ドメイン、例えば、２つのポリグルタミン結合性ドメイン、３つのポリグルタミン結合性ドメイン、４つのポリグルタミン結合性ドメイン、またはそれ以上と付着し得る。ポリグルタミン結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側へ付着し得る。あるいは、ポリグルタミン結合性ドメインは、ＪドメインのＣ末端側へ付着し得る。なお別の実施形態において、ポリグルタミン結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側およびＣ末端側に付着し得る。複数のポリグルタミン結合性ドメインのそれぞれは、同じポリグルタミン結合性ドメインであり得る。別の実施形態において、融合タンパク質における複数のポリグルタミン結合性ドメインのそれぞれは、異なるポリグルタミン結合性ドメイン（すなわち、異なる配列）であり得る。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下の群：
ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｄ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｈ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｉ． ＤＮＡＪ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｊ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｋ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｌ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｍ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
ｎ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｏ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
ｑ． Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、 ａｎｄ
ｓ． Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｑ
から選択される構造を含み得、
ここで、
Ｑはポリグルタミン結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである。
一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５、６、１０、２４、および３１からなる群から選択されるＪドメインを含む。一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメインを含む。
別の実施形態において、ポリグルタミン結合性ドメインは、配列番号５７、６２、および６８からなる群から選択される。一つの特定の実施形態において、ポリグルタミン結合性ドメインは配列番号５７である。
なお、別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメインおよび配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメインを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９０～１０４、１２２～１４５、１４７、および１５２～１５８からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメイン、および配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメインの少なくとも２個のコピーを含む。特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９２～９５、１０３～１０４、および１２２～１４３からなる群から選択される配列を含む。
Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質構築物の非限定的例は、図１に模式的に描かれ、下記の表５にも示されている。別の実施形態において、特定の融合タンパク質構築物は、配列番号８９～１５７からなる群から選択される。
Figure 2023520927000008
Figure 2023520927000009
Figure 2023520927000010
Figure 2023520927000011
Figure 2023520927000012
Figure 2023520927000013
Figure 2023520927000014
Figure 2023520927000015
ＩＩ． 融合タンパク質構築物をコードする核酸
本発明の別の態様によれば、（ａ）前述の実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸が提供される。本発明は、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする、単離された核酸、ならびに融合タンパク質をコードするそのような核酸分子と相補的な配列、加えて、その相同バリアントを提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸と相補的な配列、加えて、その相同バリアントを作製するための方法を包含する。本発明のこの態様による核酸は、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡであり得る。
さらに別の態様において、（ａ）融合タンパク質をコードするヌクレオチドを合成しおよび／またはアセンブルするステップ、（ｂ）コード遺伝子を、宿主細胞に適切な発現ベクターへ組み入れるステップ、（ｃ）適切な宿主細胞を発現ベクターで形質転換するステップ、ならびに（ｄ）融合タンパク質が形質転換宿主細胞において発現することを引き起こしまたは可能にする条件下で宿主細胞を培養し、それにより、生物活性融合タンパク質を産生し、産生された生物活性融合タンパク質が、当技術分野において知られた標準タンパク質精製方法によって、単離された融合タンパク質として回収される、ステップを含む、融合タンパク質を産生する方法が開示される。分子生物学における標準組換え技術が、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために用いられる。
本発明によれば、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする核酸配列（またはその相補体）は、適切な宿主細胞において融合タンパク質の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を作製するために用いられる。いくつかのクローニングストラテジーは、本発明を実施するのに適しており、その多くは、本発明の融合タンパク質またはその相補体をコードする遺伝子を含む構築物を作製するために用いられる。いくつかの実施形態において、クローニングストラテジーは、本発明の融合タンパク質またはその相補体をコードする遺伝子を産生するために用いられる。
ある特定の実施形態において、１つまたは複数の融合タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡ分子であり、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡであり得る。
様々な実施形態において、核酸は、所望のポリペプチドを一過性に発現するために細胞へ導入されるｍＲＮＡである。本明細書で用いられる場合、「一過性の」は、数時間、数日間、または数週間の期間の間の、組み込まれていない導入遺伝子の発現を指し、発現の期間は、ゲノムへ組み込まれ、または細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含有される場合のポリヌクレオチドの発現についての期間より短い。
特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、インビトロで転写されたｍＲＮＡである。本明細書で用いられる場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」とは、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するために用いられる鋳型を含む。
特定の実施形態において、ｍＲＮＡはさらに、５’キャップもしくは修飾５’キャップおよび／またはポリ（Ａ）配列を含み得る。本明細書で用いられる場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始後すぐに真核生物メッセンジャーＲＮＡの「最前部（ｆｒｏｎｔ）」または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結され、かつリボソームによって認識され、かつＲＮアーゼから保護される末端基を含む。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、その安定性または翻訳の効率を調節するために修飾され得る。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、約５０個から約５０００個の間のアデニンのポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約１００塩基から約１０００塩基の間、約２００塩基から約５００塩基の間、または約３００塩基から約４００塩基の間のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、または約１０００塩基もしくはそれ以上のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、局在化、安定性、または翻訳の効率を調節するために化学的または酵素的に修飾され得る。
本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」およびその他同種類のものは、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下で定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１個または複数のヌクレオチドが、付加し、または欠失し、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを含む。この点において、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更を、参照ポリヌクレオチドに行うことができ、それにより変更されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当技術分野においてよく理解されている。
ある特定の実施形態において、核酸配列は、目的の遺伝子（例えば、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を核酸カセット内に含む。本明細書で用いられる場合、用語「核酸カセット」または「発現カセット」は、ＲＮＡおよびその後、ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝的配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的の遺伝子、例えば、目的のポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つまたは複数の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的の遺伝子、例えば目的のポリヌクレオチドを含有する。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、またはそれ以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡへ転写され、必要に応じて、タンパク質もしくはポリペプチドへ翻訳され、形質転換細胞における活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を起こし、適切な細胞内コンパートメントへと標的化することまたは細胞外のコンパートメントへの分泌により、生物活性のために適切なコンパートメントへと転位することができるように、ベクター内に位置的にかつ順序的に方向づけられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即時挿入に適応した３’および５’末端を有し、例えば、それは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。カセットは、単一ユニットとして、プラスミドまたはウイルスベクターへ除去および挿入され得る。
特定の実施形態における使用に適した実例的な遍在性発現制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスのサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰｌ ｌプロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦｌａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物の翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（ｂ－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５、１４７７～１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター（Ｏｋａｂｅら （１９９７）ＦＥＢＳ ｌｅｔ． ４０７：３１３～９）、ｂ－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負制御領域が欠失し、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位に置換された（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Ｈａａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２００３；７７（ｌ７）：９４３９～９４５０）が挙げられるが、それらに限定されない。
一実施形態において、プロモーターなどの導入遺伝子標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメント（例えば、Ｐｏｗｅｌｌら （２０１５）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９（１０２）：４９～５７（その内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている）参照）が、本明細書に記載されたポリヌクレオチドと共に用いられ得る。たいていの組織において発現を促進するプロモーターには、ヒト伸長因子ｌａ－サブユニット（ＥＦｌａ）、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられるが、それらに限定されない。組織特異的発現エレメントは、ある特定の細胞型へ発現を制限するために用いられ、それには、例えば、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトへ発現を制限するために用いられ得る神経系プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。ニューロンについての組織特異的発現エレメントの非限定的例には、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ηβ２、ＰＰＥ、Ｅｎｋ、およびＥＡＡＴ２のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。アストロサイトについての組織特異的発現エレメントの非限定的例には、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２のプロモーターが挙げられる。オリゴデンドロサイトについての組織特異的発現エレメントの非限定的例には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターが挙げられる。Ｙｕら（全体として参照により組み入れられた（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ、７：６３）は、ラットＤＲＧ細胞および一次ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩａ、ＰＧＫ、およびＵＢＣプロモーター下でのｅＧＦＰの発現を、レンチウイルスベクターを用いて評価し、ＵＢＣが、他の３つのプロモーターより弱い発現を示し、全てのプロモーターについてたった１０～１２％だけのグリア発現があることを見出した。Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍら（全体として参照により組み入れられた、Ｅ．Ｎｅｕｒｏ ２０１５）は、ＣＭＶおよびＵＢＣプロモーターを有するＡＡＶ８ならびにＣＭＶプロモーターを有するＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を、運動皮質内の注射後、評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩａプロモーターを含有するプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモーターでの発現より高い持続性気道発現を示した（例えば、全体として参照により組み入れられた、Ｇｉｌｌら、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８巻、１５３９～１５４６参照）。Ｈｕｓａｉｎら（全体として参照により組み入れられた（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）は、ｈＧＵＳＢプロモーター、ＨＳＶ－１ＬＡＴプロモーター、およびＮＳＥプロモーターを有するΗβΗ構築物を評価し、ΗβΗ構築物が、マウス脳においてＮＳＥより弱い発現を示すことを見出した。ＰａｓｓｉｎｉおよびＷｏｌｆｅ（全体として参照により組み入れられた、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ２００１、１２３８２～１２３９２）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のΗβΗベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間の持続性発現があることを見出した。Ｘｕら（全体として参照により組み入れられた、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８、１３２３～１３３２）により、ＣＭＶ－ｌａｃＺ、ＣＭＶ－ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）との比較として、ＮＦ－ＬおよびＮＦ－Ｈプロモーターが用いられた場合、全ての脳領域における低発現が見出された。Ｘｕらは、プロモーター活性が、降順で、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬ、およびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドのプロモーターであり、ＮＦＨは、９２０ヌクレオチドのプロモーターであり、両方とも肝臓に存在しないが、ＮＦＨが、自己受容感覚ニューロン、脳、および脊髄において豊富であり、ＮＦＨは心臓に存在する。Ｓｃｎ８ａは、４７０ヌクレオチドのプロモーターであり、ＤＲＧ、脊髄、および脳中に発現し、特に、海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に特に高い発現が見られる。（例えば、全体として参照により組み入れられた、Ｄｒｅｗｓら ２００７およびＲａｙｍｏｎｄら ２００４参照）。
ＩＩＩ． 融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター
本発明による核酸を含むベクターもまた提供される。そのようなベクターは、好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の転写／翻訳に必要なエレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター配列）などの追加の核酸配列を含む。前記ベクターはまた、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を選択または維持するために選択マーカー（例えば、抗生物質）をコードする核酸配列を含み得る。用語「ベクター」は、別の核酸分子を移入させまたは輸送する能力がある核酸分子を指す。移入した核酸は、一般的に、ベクター核酸分子と連結され、例えば、その中へ挿入される。ベクターは、細胞において自己複製を指示する配列を含み得、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図された１つまたは複数のポリヌクレオチドを罹患細胞（例えば、神経細胞）へ送達するために用いられる。一実施形態において、ベクターは、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする、インビトロで合成されまたは合成的に調製されたｍＲＮＡである。非ウイルスベクターの実例には、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、それらに限定されない。
ベクターの実例には、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓｌ、Ｔｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ Ｉ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、およびそれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。ベクターの追加の実例には、非限定的に、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰｌ由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用なウイルスの実例には、非限定的に、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（vims））、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの実例には、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されたポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためにそのような発現ベクターへライゲーションされ得る。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で用いられる場合、用語「エピソームの」は、宿主の染色体ＤＮＡへの組込みなしに、かつ分裂する宿主細胞から徐々に失われることなしに複製することができる、つまり、前記ベクターが染色体外にまたはエピソーム的に複製する、ベクターを指す。
ベクターは、様々な部位特異的リコンビナーゼのいずれかについての１つまたは複数の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼについての標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組込みに必要とされる任意の部位に加えてであることは、理解されるべきである。本明細書で用いられる場合、用語「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」は、リコンビナーゼが認識しかつ結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについての１つの組換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）を含む３４塩基対配列である、ｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１～５２７（１９９４）の図１参照）。ＦＬＰリコンビナーゼについての適切な認識部位には、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６）、ＦＩ、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、ＦｙＦｓ（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）が挙げられるが、それらに限定されない。
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、それらは、リコンビナーゼ酵素ｌインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ－ｃ３１によって認識される。（ｐＣ３１ ＳＳＲは、ヘテロタイプな部位、ａｔｔＢ（３４ｂｐ長）とａｔｔＰ（３９ｂｐ長）の間のみの組換えを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。細菌ゲノムおよびファージゲノム、それぞれにおけるファージインテグラーゼについての付着部位に関して名付けられたａｔｔＢおよびａｔｔＰはどちらも、おそらくφ０３１ホモダイマーにより結合される、不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。生成部位、ａｔｔＬおよびａｔｔＲは、事実上、さらなるｔｐＱＡ １媒介性組換えに対して不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）、反応を不可逆性にさせている。挿入を触媒することについて、ａｔｔＢ保有ＤＮＡは、ａｔｔＰ部位がゲノムａｔｔＢ部位へ挿入するより容易に、ゲノムａｔｔＰ部位へ挿入することが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）。したがって、典型的なストラテジーは、相同組換えにより、ａｔｔＰ保有「ドッキング部位」を、限定された遺伝子座へ位置づけ、その後、そのａｔｔＰ保有「ドッキング部位」が、挿入としてのａｔｔＢ保有の入ってくる配列とパートナーを組まされる。
本明細書で用いられる場合、「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な配列内リボソーム進入を促進し、それにより、遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７～８３、ならびにＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ １９９５ ＲＮＡ １（１０）：９８５～１０００参照。特定の実施形態において、ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つもしくは複数のＩＲＥＳ配列、または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに用いられるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。
本明細書で用いられる場合、用語「コザック配列」は、リボソームの小サブユニットとのｍＲＮＡの最初の結合を大いに促進し、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す（Ｋｏｚａｋ、１９８６、Ｃｅｌｌ ４４（２）：２８３～９２、およびＫｏｚａｋ、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５（２０）：８１２５－４８）。特定の実施形態において、ベクターは、コンセンサスコザック配列を有するポリヌクレオチド、ならびにＪドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。異種性核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を方向づけるエレメントは、異種性遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含む。
本明細書で企図された特定の実施形態における使用に適したウイルスベクター系の実例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスのベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
様々な実施形態において、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、細胞、例えば、神経細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を細胞に形質導入することにより、導入される。ＡＡＶは、小さい（約２６ｎｍ）複製欠損の、主にエピソーム性の、無エンベロープのウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムへ組み入れ得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最小限で、導入遺伝子、ならびにその制御配列、ならびに５’および３’ ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）で構成される。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐ長である。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ６９６２８１５Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ７４７９５５４Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ７２８２１９９Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ９（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ９７３７６１８Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ ｒｈ１０（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ９７９０４７２Ｂ２に記載された）、またはＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲおよびカプシド配列を含む。一実施形態において、本発明のベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ ｒｈ１０からなる群から選択されるカプシド内へ被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２内に被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ５内に被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ８内に被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ９内に被包される。なお一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ ｒｈ１０内に被包される。
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列が１つのＡＡＶ血清型から単離され、かつカプシド配列が異なるＡＡＶ血清型から単離されているキメラｒＡＡＶが用いられる。例えば、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来したカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と呼ばれる。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つに由来したカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来したカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ配列およびＡＡＶ２に由来したカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態において、操作および選択方法は、目的の細胞を形質導入する可能性をより高くするために、ＡＡＶカプシドへ適用することができる。
ｒＡＡＶベクターの構築、その産生および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号；第９，１６９，４９２号；第９，０１２，２２４号；第８，８８９，６４１号；第８，８０９，０５８号；および第８，７８４，７９９号に開示されており、それらの特許のそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
ＩＶ． 送達
特定の実施形態において、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルスのベクターにより細胞へ導入される。特定の実施形態において企図されたポリヌクレオチドの非ウイルス性送達の実例的方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態において企図された特定の実施形態における使用に適したポリヌクレオチド送達系の実例には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供される送達系が挙げられるが、それらに限定されない。リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適しているカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１８０～１８７；およびＢａｌａｚｓら、（２０Ｗ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２０１１：１～１２参照。抗体により標的化された、細菌由来の、非生存のナノセルに基づいた送達もまた、特定の実施形態において企図される。
特定の実施形態において企図されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボで、個々の患者への投与により、典型的には、下に記載されているように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注入）により、くも膜下腔内注射、脳室内注射、または局所適用により、送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者（例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄液、組織生検など）から外植された細胞または万能ドナーの造血幹細胞などのエクスビボでの細胞へ送達され、その後、その細胞を患者へ再植え込みされ得る。
一実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物体へ直接的に投与される。
適切にパッケージングされかつ製剤化されたウイルスベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）へくも膜下腔内送達を介して送達され得る。例えば、アデノ随伴ウイルスベクターは、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１５／７７１，４８１号に記載された方法を用いて送達され得る。
あるいは、裸のＤＮＡが投与され得る。投与は、分子を血液または組織細胞との最終的な接触へ導入するために通常用いられる経路のいずれかによってであり、その経路には、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、それらに限定されない。そのような核酸を投与する適切な方法が利用でき、当業者によく知られており、特定の組成物を投与するために１つより多い経路を用いることができるが、特定の経路が、別の経路より速効性が高くかつより効果的な反応を提供することができる。
様々な実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、細胞、例えば、神経細胞または神経幹細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えばレンチウイルスを細胞に形質導入することにより、導入される。本明細書で用いられる場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピーへ転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムへ共有結合性に組み込む、ＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適した実例的なレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「レンチウイルス」は、複雑なレンチウイルスの一群（または一属）を指す。実例的なレンチウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ １型およびＨＩＶ ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶに基づいたベクターバックボーン（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを改変することの結果としてのいくつかの安全性の増強を含有する。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、複製欠損ベクター、例えば、Ｕ３領域として知られた、右側（３’）のＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、ウイルス複製の最初のラウンドを超えてのウイルス転写を防止するように（例えば、欠失または置換により）改変されている、ベクターを指す。追加の安全性増強は、５’ ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動させる異種性プロモーターと置き換えることにより提供される。用いられ得る異種性プロモーターの例には、例えば、ウイルスのサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（vims）（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）のプロモーターが挙げられる。ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、公知の方法に従って作製される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００９；９：１０ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０；Ｋｕｔｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． ２００９；４（４）：４９５～５０５ ｄｏｉ：ｌ０．ｌ０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２参照。
本明細書で企図されたある特定の実施形態によれば、ウイルスベクターバックボーン配列の大部分または全部は、レンチウイルス、例えばＨＩＶ－１に由来している。しかしながら、レトロウイルスおよび／もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる源が用いられ得、またはレンチウイルス配列のある部分における組み合わせられた多数の置換および変更が、トランスファーベクターが本明細書に記載された機能を実施する能力を損なうことなく、受け入れられ得ることは理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当技術分野において知られており、Ｎａｌｄｉｎｉら（ｌ９９６ａ、ｌ９９６ｂ、および１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７）；Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；および第５，９９４，１３６号を参照されたい（それらの多くは、本明細書で企図されたウイルスベクターまたはトランスファープラスミドを作製するように適応し得る）。
様々な実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、標的細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスを細胞へ形質導入することにより導入される。アデノウイルスに基づいたベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率の能力があり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に単純な系において大量に産生され得る。たいていのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅｌａ、Ｅｌｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、その複製欠損ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉内で見出される細胞などの非分裂性の分化細胞を含む複数の型の組織をインビボで形質導入することができる。通常のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。
複製欠損である、現在のアデノウイルスベクターの生成および伝播は、２９３と名付けられた固有のヘルパー細胞株を利用し得、その細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞からＡｄ５ ＤＮＡ断片により形質転換され、Ｅｌタンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムからなくても済むため（Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｓｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の助けを借りる現在のアデノウイルスベクターは、Ｅｌ、Ｄ３、または両方のいずれかの領域において外来ＤＮＡを有する（Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ、１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ、１９９２；Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ、１９９２）に用いられている。異なる組織へ組換えアデノウイルスを投与することにおける研究には、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ ＆ Ｇｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３～９（１９９８））。
様々な実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、対象の標的細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２を細胞に形質導入することにより導入される。
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含む、エンベロープ型正二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶに基づいたウイルスベクターは、１つまたは複数の必須または非必須のＨＳＶ遺伝子が欠損している。一実施形態において、ＨＳＶに基づいたウイルスベクターは、複製欠損である。たいていの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために１つまたは複数の最初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去する欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組合せからなる群から選択される最初期遺伝子が欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、結果として長期ＤＮＡ発現を生じ得る、潜伏期を進入できるその能力、および最大２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡ挿入断片を収容できるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶに基づいたベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３に記載されている（それらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
Ｖ． 融合タンパク質を発現する細胞
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載された融合タンパク質を発現する細胞を提供する。細胞は、上記で記載されているような融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトされ得る。一実施形態において、細胞は原核細胞である。別の実施形態において、細胞は真核細胞である。なお別の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。別の実施形態において、細胞は、ポリグルタミンリピート障害を患っており、または患うリスクがある患者に由来するヒト細胞である。細胞は神経細胞または筋肉細胞であり得る。
融合タンパク質を発現する細胞は、融合タンパク質を産生することにおいて有用であり得る。この実施形態において、細胞は、融合タンパク質を過剰発現するベクターをトランスフェクトされる。融合タンパク質は、任意選択で、エピトープ、例えば、（それぞれ、プロテインＡカラムまたは抗ＦＬＡＧ抗体カラムを用いる）精製を促進する、本明細書に記載されているようなヒトＦｃドメインまたはＦＬＡＧエピトープを含有し得る。エピトープは、融合タンパク質の残りの部分と、リンカー、または精製中もしくは後にエピトープが融合タンパク質から除去され得るようにプロテアーゼ基質配列を介して、接続され得る。
融合タンパク質を発現する細胞はまた、治療関連において有用であり得る。一実施形態において、細胞は、治療を必要とする患者（例えば、ポリグルタミンリピート障害を患っており、または患うリスクがある患者）から収集される。一実施形態において、細胞は神経細胞である。その後、収集された細胞は、融合タンパク質を発現するベクターをトランスフェクトされる。その後、トランスフェクト細胞は、トランスフェクト細胞について濃縮または選択するように処理され得る。トランスフェクト細胞はまた、細胞の異なる型、例えば、神経細胞へ分化するように処置され得る。処理後、トランスフェクト細胞は、患者へ投与され得る。一実施形態において、細胞は、くも膜下腔内注射、頭蓋内注射、または脳室内注射による中枢神経系への定方向的注射（directed injection）により、投与される。
代替の実施形態において、融合タンパク質の分泌型を発現する細胞が用いられ得る。例えば、融合タンパク質構築物は、Ｎ末端にシグナル配列を有するようにデザインされ得る。代表的なシグナル配列は下記の表６に示されている。
Figure 2023520927000016
したがって、一実施形態において、本融合タンパク質は、シグナル配列および融合タンパク質を含み、シグナル配列が、配列番号１５９～１６１からなる群から選択され、融合タンパク質が，配列番号８９～１５８からなる群から選択される。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号１１６のシグナル配列および配列番号８９～１５８からなる群から選択される融合タンパク質を含む。シグナル配列を含む融合タンパク質構築物を発現する細胞は、対象、例えばヒト対象（例えば、ポリグルタミンリピート障害を有し、または患うリスクがある患者）へ投与され得る。本融合タンパク質は、細胞から分泌され、ポリグルタミンリピート含有タンパク質凝集および／または関連細胞毒性を低下させるのを助ける。
上記で記載されているように、ある特定の実施形態において、本融合タンパク質はさらに、細胞透過性ペプチドを含み得る。シグナル配列および細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質を発現する細胞は、シグナル配列を欠く融合タンパク質を分泌する能力がある。細胞透過性ペプチドも含む分泌性融合タンパク質は、その後、すぐ近くの細胞に進入する能力があり、それらの細胞において、ポリグルタミンリピートタンパク質により媒介される凝集および／または細胞毒性を低下させる潜在能力を有する。
ＶＩ． 使用の方法
別の態様において、本発明は、障害において、および／またはポリグルタミンリピート関連タンパク質凝集により媒介されるポリグルタミンリピート疾患、障害、もしくは状態において、有益な効果を達成するための方法を提供する。ポリグルタミンリピート疾患は、ハンチントン病、ＳＣＡ １型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、ＤＲＰＬＡ、およびＳＢＭＡからなる群から選択される。一実施形態において、ポリグルタミンリピート疾患はハンチントン病である。
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリグルタミンリピート疾患、障害、または状態を有する、ヒトなどの対象を処置するための方法であって、治療的または予防的有効量の融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードする核酸、または本明細書に記載されたそのような融合タンパク質をコードするウイルスベクターを対象へ投与するステップを含み、前記投与が、結果として、ポリグルタミンリピート疾患、障害、または状態に関連した１つまたは複数の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床エンドポイントの向上を生じる、方法を提供する。
他の実施形態において、本発明は、細胞におけるポリグルタミン含有タンパク質の凝集を低下させる方法を提供する。細胞は、培養細胞または単離された細胞であり得る。細胞はまた、対象、例えば、ヒト対象の由来であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト対象の中枢神経系内にある。別の実施形態において、ヒト対象は、ポリグルタミンリピート疾患を患っており、または患うリスクがあり、ポリグルタミンリピート疾患には、ハンチントン病、ＳＣＡ １型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、ＤＲＰＬＡ、およびＳＢＭＡが挙げられるが、それらに限定されない。
ポリグルタミン含有タンパク質の凝集は、いくつかの方法で検出され得る。一例において、凝集したポリグルタミン含有タンパク質は、遊離（すなわち、可溶性）ポリグルタミン含有タンパク質から、溶解性に基づいて、例えば、細胞可溶化物の選択的フィルターを通しての通過により不溶性凝集物をトラップすることにより、区別され得る。凝集していないタンパク質は、これらのフィルターを通過し、一方、凝集物は、フィルター上に保持され、それは、様々な試薬を用いて検出され得、その試薬には、ポリグルタミン含有タンパク質に対して方向づけられた抗体が挙げられる。本明細書に記載されているような、融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子で処理された細胞試料の可溶化液における、トラップされた凝集タンパク質の量は、処理されていないまたは対照処理された細胞からの可溶化液と比較することができ、その場合、対照試料と比較しての、処理された試料における凝集したポリグルタミン含有タンパク質の量の低下は、融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子の有効性を示している（例えば、Ｋｉｍら、（２０１４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３４：６４３～６５２、および実施例１参照）。対照と比較した、凝集したポリグルタミン含有タンパク質におけるより大きな低下は、より高い効力を示す。ポリグルタミン含有タンパク質の凝集の低下はまた、例えばポリグルタミン含有タンパク質を検出する標識試薬での免疫蛍光顕微鏡法を用いて、細胞において直接的に検出され得る（例えば、Ｄｉｆｉｇｌｉａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：１９９０～１９９３、および実施例１参照）。例えば、変異体（ポリグルタミン伸長型）ハンチンチンが、ハンチントン病を有する患者のＨＤ皮質および線条体における神経細胞封入体およびジストロフィー性神経突起に局在して見出される。
したがって、一実施形態において、方法は、未処理または対照細胞と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ポリグルタミン含有タンパク質の凝集を低下させるのに有効な融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子の量を細胞と接触させるステップを含む。
さらに別の態様において、本明細書に記載された組成物は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される疾患に関連したタンパク質凝集を低下させる方法に用いられ得る。実施例セクションに記載されているように、本明細書に記載されたいくつかの構築物が、インビトロで試験されており、これらの疾患に関連している、ＴＤＰ－４３およびＳＯＤ１の変異型の病的凝集を低下させることが見出されている。したがって、一実施形態において、方法は、未処理または対照細胞と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ＴＤＰ－４３の凝集を低下させるのに有効な量の、本明細書に記載された、融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、またはウイルス粒子と細胞を接触させるステップを含む。別の実施形態において、ＳＯＤ１の凝集を低下させる方法が提供される；その方法は、未処理または対照細胞と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ＳＯＤ１の凝集を低下させるのに有効な量の、本明細書に記載された、融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、またはウイルス粒子と細胞を接触させるステップを含む。
ＶＩＩ． 薬学的組成物
本明細書で企図された組成物は、本明細書で企図されているような、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む１つまたは複数の融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子修飾された細胞などを含み得る。組成物は、薬学的組成物が挙げられるが、それに限定されない。「薬学的組成物」は、単独かまたは１つもしくは複数の他の治療モダリティーと組み合わせての細胞または動物への投与のための薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液として製剤化された組成物を指す。必要に応じて、組成物は、なお他の作用物質、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性物質も組み合わせて、投与され得ることも理解されるであろう。追加の作用物質が、意図された治療を送達する本組成物の能力に悪影響を及ぼさないならば、本組成物にまた含まれ得る他のコンポーネントに、事実上、制限はない。
句「薬学的に許容される」は、合理的な利益／リスク比に釣り合って、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに、健全な医学的判断の範囲内において、適している、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように、本明細書で用いられる。
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」、「希釈剤」、または「賦形剤」には、ヒトまたは家畜における使用について容認できるとして、米国食品医薬品局によって認可されている、非限定的に、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶剤、界面活性剤、または乳化剤が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体には、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動物および植物脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリーの水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬学的製剤中に用いられる任意の他の適合性物質が挙げられるが、それらに限定されない。
ＶＩＩＩ． 投薬量
本明細書に記載された組成物（例えば、融合タンパク質構築物、核酸、または遺伝子治療ウイルス粒子を含む組成物）の投薬量は、本化合物の薬力学的性質；投与の様式；レシピエントの年齢、健康、および体重；症状の性質および程度；処置の頻度、およびもしあれば、同時処置の型；ならびに処置されることになっている動物における本化合物のクリアランス速度などの多くの因子に依存して変動し得る。本明細書に記載された組成物は、臨床応答に依存して、必要に応じて調整され得る、適切な投薬量で、最初、投与され得る。いくつかの態様において、組成物の投薬量は、予防的または治療的有効量である。
ＩＸ． キット
（ａ）本明細書に記載された、細胞または対象においてポリグルタミンリピートタンパク質の凝集を低下させる、融合タンパク質構築物、そのような融合タンパク質をコードする核酸、またはそのような核酸を包含するウイルス粒子を含む薬学的組成物、および（ｂ）本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む添付文書を含むキットが企図される。いくつかの態様において、キットは、（ａ）本明細書に記載された細胞または対象においてポリグルタミンリピートタンパク質の凝集を低下させる、本明細書に記載された組成物を含む薬学的組成物、（ｂ）追加の治療剤、および（ｃ）本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む添付文書を含む。
Ｊドメインが、凝集タンパク質の適切なフォールディングを促進するように特定的に操作され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ＨＴＴタンパク質におけるポリグルタミンリピートを標的化するようにデザインされたいくつかの融合タンパク質構築物をデザインし、試験した。
実施例１：融合タンパク質デザイン
Ａ． 方法
一般的な技術および材料
本発明の実施は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの通常の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１；「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７；シリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；「ＰＣＲ ２：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ、およびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」 Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；「Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１１版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、２００５；ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ、２０００（それらの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている）参照。ＨＥＫ－２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入された。抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。ウサギ抗ＧＦＰ抗体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入された。精製、検出、および特徴づけを容易にするために、これらの実施例に用いられる融合タンパク質構築物の一部は、配列番号８９～１５８に提供される配列に加えて、タンパク質のＣ末端にリンカー配列および／または配列番号１６３のＦＬＡＧエピトープなどのエピトープを含有し得る。
ＨＥＫ２９３細胞におけるタンパク質の発現および検出
様々なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞へ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、トランスフェクトした。細胞可溶化物を、発現したタンパク質について、イムノブロットアッセイを用いて分析した。培地の試料を、分析前に、遠心分離して、デブリを除去した。細胞を、２ｍＭ ＰＭＳＦおよびプロテアーゼカクテル（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル；Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）中に溶解した。短時間の超音波処理後、試料を、発現したタンパク質について、イムノブロットアッセイを用いて分析した。イムノブロット分析について、試料を、ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に流した。その後、分離されたタンパク質バンドを、ＰＶＤＦ膜へ転写した。
発現したタンパク質を、化学発光シグナルを用いて検出した。簡単に述べれば、ブロットを、特定のエピトープ（例えば、ＧＦＰ）を結合する能力がある一次抗体と反応させた。反応していない一次抗体を洗い流した後、酵素連結型二次抗体（例えば、ＨＲＰ連結型抗ＩｇＧ抗体）を、ブロットと結合した一次抗体分子と反応させた。すすいだ後、化学発光試薬を加え、ブロットにおいて結果として生じた化学発光シグナルを、Ｘ線フィルム上に捕獲した。
フィルタートラップアッセイ
ＧＦＰ－ＨＴＴ（Ｑ２３）またはＧＦＰ－ＨＴＴ（Ｑ７４）をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ＳＤＳ溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ＳＤＳ）中でホモジナイズした。短時間の超音波処理後、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定した。フィルタートラップ装置において、陰圧下で、等しいタンパク質量を、０．２２ｕｍ酢酸セルロース膜へアプライした。膜の洗浄後、トラップされたタンパク質（凝集タンパク質）を、抗ＧＦＰ抗体を用いるイムノブロットアッセイにより検出した。
蛍光顕微鏡法
場合によっては、ポリグルタミン含有ＧＦＰレポーター構築物（下記）の凝集を、インビボで蛍光顕微鏡法を用いて、検出した。レポーター構築物、加えてＪドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質を発現する培養細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて５分間固定した。ＰＢＳでの３回の５分間洗浄後、核ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。トランスフェクト細胞におけるｍＨｔｔ凝集物（ＧＦＰ病巣）を含有する細胞のパーセンテージをカウントした。
Ｂ． レポーター構築物
ポリグルタミン含有タンパク質の凝集を低下させる様々な融合タンパク質構築物の能力を試験するために、ＧＦＰに基づいたレポーター構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞を作製した。
ＨＥＫ２９３細胞を、培養し、下記の表７に示されているように、１３アミノ酸リンカーを介してＧＦＰのＣ末端と融合した、２３ポリＱトラクトかまたは７４ポリＱトラクトのいずれかを含むアミノ酸配列をそれぞれ、ＨＴＴエクソン１内に含有するレポーター構築物ＧＦＰ－ＨＴＴ Ｑ２３またはＧＦＰ－ＨＴＴ Ｑ７４をコードするプラスミドをトランスフェクトした。
改変型マルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を有するｐｃＤＮＡ３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、バックボーンプラスミドとして用いた。タンパク質配列をコードするＤＮＡ分子を、標準プロトコールを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、または相補ＤＮＡ分子のアニーリングにより取得した。ＨＴＴ（Ｑ２３）およびＨＴＴ（Ｑ７４）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を合成した（ＢｉｏＢａｓｉｃ、Ｃａｎａｄａ）。グリシン－セリンのリンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）および剛性リンカー配列（ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ）、それぞれをコードするＤＮＡ配列、ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣおよびＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧを有するＤＮＡ分子を、標準方法により合成された相補性一本鎖をアニールすることにより得た。それぞれのリンカーをコードするｃＤＮＡ配列を、バックボーンプラスミドへ挿入した。
Figure 2023520927000017
Ｃ． 融合タンパク質構築物
ｉ． ドメイン配置
融合タンパク質の最適な立体構造を決定するために、ヒトＨｓｐ４０に由来したＪドメイン配列（ＤｎａＪＢ１、すなわち、配列番号５）、および伸長ポリＱトラクトに対する特異的な結合親和性についてコンビナトリアルスクリーニングアプローチにより同定されたが、正常ＨＴＴ ３２に見出されるポリＱモチーフに対する結合親和性については同定されなかった、１１アミノ酸の合成ペプチド（配列番号５７）である、ポリグルタミン結合性ペプチド１（ＱＢＰ１）を含むいくつかの融合タンパク質構築物を作製した。いくつかの最初の融合タンパク質構築物（配列番号８９～９３）をデザインし、Ｊドメインに対するＱＢＰ１の位置を変化させた（すなわち、任意選択のリンカーありまたはなしで、ＪドメインのＮ末端またはＣ末端に付着させた）。ＪＢ１－ＱＢＰ１（構築物２、配列番号９０）およびＱＢＰ１－ＪＢ１（構築物３、配列番号９１）と名付けられた２つの構築物はどちらも、それぞれ、ヒトＤｎａＪＢ１由来のＪドメイン（配列番号５）のＣ末端およびＮ末端に、短いリンカー配列を介して付着した単一のＱＢＰ１（配列番号５７）を含有する。これらの融合タンパク質構築物をコードするベクターを、細胞へ、上記のレポーター構築物と共に、トランスフェクトした。フィルタートラップアッセイを用いて決定された場合の、これらの構築物のタンパク質凝集の程度を、短いポリグルタミンリピート（ＧＦＰ－ＨＴＴＱ２３）レポーター構築物単独を発現する細胞、長いリピート（ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４）レポーター構築物単独を発現する細胞、加えて、長いリピートレポーター、およびヒトＤｎａＪＢ１由来のＪドメインを含むが、ポリグルタミン結合性ドメインを含まない構築物（構築物番号１、配列番号８９）を発現する細胞におけるそれらに関して、比較した。図３に示され、また下記の表８に要約されているように、予想通り、フィルタートラップアッセイを用いて測定した場合、長いリピート（ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４）レポーターは、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ２３レポーターより高いレベルの凝集を示す。検出可能な凝集は、ＤｎａＪＢ１対照構築物の同時発現によって低下しなかった。しかしながら、ＪＢ１－ＱＢＰ１（構築物２）またはＱＢＰ１－ＪＢ１（構築物３）との同時発現は、結果として、それぞれ、対照凝集レベルの７６％および６７％を生じた。
Figure 2023520927000018
レポーター構築物を発現する細胞をまた、蛍光顕微鏡法により観察した。本発明者らは、以前報告された結果と一致して、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４が顕著な核封入体を生成し（図６ａ）、一方、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ２３レポーター構築物を発現する細胞のＧＦＰ蛍光が細胞質中に、より散在性に分布する（図６ｂ）ことを見出した。ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４を融合タンパク質構築物４（ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１）と同時発現させた場合、凝集の大部分が消失したことを観察した（図６ｃ）。人為的結果の可能性を排除するために、陰性対照として、Ｊドメインの「ＨＰＤ」配列内に点変異を挿入した。下記のセクションｉｉｉに記載されているように、その結果として生じた構築物８（ＪＢ１（Ｐ３３Ｑ）－２ＸＱＢＰ１、配列番号９６）は、フィルタートラップアッセイにより、凝集を低下させる能力をほとんどもたないことが見出された。構築物８の同時発現は、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４分布へ効果を生じず、融合タンパク質構築物を含まないＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４対照とは区別できない、顕著な核封入体を有した（図６ａと比較した、図６ｄ）。さらに、その効果は、ＤｎａＪＢ１ Ｊドメインのみを含有し、ポリグルタミン結合性ドメインを含まない構築物１の同時発現が、凝集を低下させることに効果を生じなかったため（未呈示）、伸長ＨＴＴに対して特異的であるように思われる。以前の研究は、ＱＢＰ１と融合されたＣＭＡペプチドからなる融合タンパク質が、インビトロで変異体ＨＴＴタンパク質を選択的に分解することにおいて有効であったことを示していた（Ｂａｕｅｒら （２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２８、２５６～２６３）。これらの構築物が同等の活性を有するかどうかを試験するために、本発明者らは、ＱＢＰ１ペプチドの１つかまたは２つのタンデムコピーのいずれかと融合されたＣＭＡペプチドを作製した。しかしながら、ＣＭＡに基づいたペプチドは、フィルタートラップアッセイを用いて、ＨＴＴ凝集の感知できるほどの低下を示すことができなかった（データ未呈示）。
ｉｉ． 複数のポリグルタミン結合性タンパク質
以下の追加の構築物を、作製し、ＨＴＴＱ７４レポーター構築物の凝集を低下させるそれらの能力について試験した（図２参照）：
・ＤｎａＪＢ１ ＪドメインのＣ末端に付着したＱＢＰ１の２つのタンデムリピートを含む構築物４（配列番号９２）；
・ＤｎａＪＢ１ ＪドメインのＣ末端に付着したＱＢＰ１の３つのタンデムリピートを含む構築物５（配列番号９３）；
・ＱＢＰ１によって両側で挟まれたＤｎａＪＢ１ Ｊドメインを含む、構築物６（配列番号９４）；および
・ＱＢＰ１－ＤｎａＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１配置でＤｎａＪＢ１ ＪドメインおよびＱＢＰ１の３つのコピーを含む、構築物７（配列番号９５）。
図３に示されているように、ポリグルタミン結合性ドメインの少なくとも２つのコピーを含有する全ての融合タンパク質構築物は、凝集のより大きい低下を生じた。構築物４、５、６、および７は全て、凝集を少なくとも５０％、低下させる能力があり、構築物４および６は、凝集を少なくとも９０％、低下させる能力があった。
ｉｉｉ Ｊドメイン内の必要条件
本発明者らによる以前の実験は、タンパク質分泌および発現を増強することを目的として、Ｊドメイン融合タンパク質を用いた（Ｈｉｓｈｉｙａ ＆ Ｋｏｙａ （２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．、７：８５３１）。その研究において、ヘリックスＩＩ内に位置した、１１アミノ酸のＪドメインの断片を含有する融合タンパク質構築物が、標的タンパク質の分泌および全体的な発現の増強を与え得ることが決定された。非分泌性の細胞毒性ポリグルタミンリピート含有タンパク質の細胞毒性および／または凝集を低下させるための本融合タンパク質構築物におけるＪドメインについての必要条件が、以前の観察と同様であるかどうかを決定するために、構築物８～１４を作製し、凝集を低下させる能力について、再び、フィルタートラップアッセイおよびレポーター構築物としてのＧＴＰ－ＨＴＴＱ７４を用いて、試験した。図４およびまた下記の表９に示されているように、保存されたＨＰＤモチーフ（構築物８）におけるプロリンを変異させることが、凝集を低下させるその構築物の能力を大いに減弱させた（対応する野生型構築物（構築物４、ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１）による、７０％より大きい低下と比較して、たった７％の低下）。
驚くべきことに、Ｎ末端欠失を含有するが１０アミノ酸のストレッチを含む３つの欠失構築物（構築物９、１０、および１１）は全て、凝集を低下させる最小の能力を有した（対応する構築物４による、７０％より大きい低下と比較して、全て１０％未満）。したがって、トランスで提供される場合のＪドメインの機能は、目的のタンパク質と直接的に融合されるＪドメインによって果たされる役割とは有意に異なるように思われる。
Figure 2023520927000019
Ｊドメインの、ヘリックスＩＶから始まるＣ末端短縮を有する構築物１２は、凝集を少なくとも６０％、低下させることが見出された。最後に、ＤｎａＪＢ１から（Ｊドメインの後）３３個の追加のアミノ酸を含有する融合タンパク質構築物は、ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１（構築物４）（７０．３％）と等価のレベルの凝集の低下（６８％）を有することが見出された。
これらの結果は、非分泌性のポリグルタミンリピート含有タンパク質の凝集を低下させるためのＪドメインについての構造的必要条件が、タンパク質分泌および／または発現を増強するための以前の研究において試験されたものとは、本融合タンパク質構築物において劇的に異なることを示唆し、本融合タンパク質構築物の作用機構が、以前の研究とは異なることを実証している。
ｉｖ． リンカーの効果
この実施例１においてこれまで記載された融合タンパク質構築物のほとんどは、Ｊドメインとポリグルタミン結合性ドメインとの間に可動性リンカー（Ｇ４Ｓ）４を含有した。このリンカーの重要性および／または必要性を試験するために、以下の２つの追加の構築物を作製した：
・構築物１５、ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１（可動性リンカーなし）；ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１（構築物４）と類似するが、（Ｇ４Ｓ）４リンカーが除去されている；
・構築物１６、ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１（剛性リンカー）；これもまたＪＢ１－２ＸＱＢＰ１（構築物４）と類似するが、（Ｇ４Ｓ）４リンカーがより短い剛性リンカーで置き換えられている。
図５およびまた下記の表１０に示されているように、Ｊドメインとポリグルタミン結合性ドメインとの間のリンカーの変化は、ＧＦＰ－ＨＴＴＱ７４レポーター構築物の凝集を低下させる融合構築物の能力にほとんど効果を生じず、全ての３つの構築物は、少なくとも７５％低下を示した。
Figure 2023520927000020
ｖ． 異なるＪドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインの使用
他のＪドメインを含む融合タンパク質構築物が凝集を低下させることができるかどうかを決定するために追加の構築物を作製し、試験した。下記の表１１は、異なるリンカーのＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１構築物の効力への効果を試験するために作製されたいくつかの構築物をリストアップする。
Figure 2023520927000021
構築物ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１（１）～ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１（１５）（構築物３４～４８）を、ＨＴＴＱ７４レポーター構築物と共に細胞において同時発現させ、タンパク質凝集を低下させる能力を、フィルタートラップアッセイを用いて、決定した。表１１に示されているように、ほとんどの構築物は、タンパク質凝集を強力に低下させることが見出され、構築物４（ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１）とおおよそ同等の活性であった。
下記の表１２に提供されたいくつかの追加の構築物を作製して、ポリグルタミン結合性ドメインと融合された場合の他のＪドメイン配列が、タンパク質凝集を低下させる能力があるかどうかを試験し、ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１（１）（構築物３４）の効力と比較した。
Figure 2023520927000022
表１２に示されているように、ＨＴＴＱ７４レポーター構築物を発現する細胞における構築物５８、６０、６１、および６３の同時発現は全て、ＤＮＡ Ｊ１に基づいた構築物と同等のレベルでのタンパク質凝集の劇的な低下を生じ、複数のＪドメインが、活性融合タンパク質を形成する能力があることを実証した。
構築物１７～３１（配列番号１０５～１１９）を含む追加の構築物を、下記の表１３に提供されているように、異なるＪドメインおよび／またはポリグルタミン結合性ドメインを用いてデザインした。
Figure 2023520927000023
ｖｉ． 凝集関連細胞毒性の低下の試験
本発明者らは次に、検出可能なタンパク質凝集の低下に加えて、タンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集に関連する場合が多い細胞毒性の低下を検出することができるかどうかを試験した。構築物３４（ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１（１）、配列番号１２２）のｍｔＨＴＴタンパク質細胞毒性への能力を、Ｕ－８７ ＭＧグリオーマ細胞株において査定した。ＨＴＴ ｅｘ１断片のｃ－ｍｙｃタグ付き野生型または変異体を、構築物３４ありまたはなしで、レンチウイルストランスフェクションによって発現させた。上記の結果と一致して、ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１（１）（構築物３４）は、凝集形成を強く抑制した（図８Ａ参照）。ｍｔＨＴＴはＨＥＫ２９３細胞において有意な細胞毒性を誘導しなかったが（データ未呈示）、ＬＤＨ－Ｃｙｔｏｔｏｘ（商標）アッセイキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した場合、感染後７日目にＵ８７－ＭＧ細胞から収集された培地におけるＬＤＨ活性の増加によって証明されているように、Ｕ－８７ ＭＧ細胞において、ｍｔＨＴＴ（７４リピートを含有）により引き起こされた細胞毒性効果が、観察されたが、正常なＨＴＴ（２３リピートを含有）については観察されなかった（図８Ｂ）（値は平均値±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５）。ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＱＢＰ１（１）（構築物３４）との同時発現は、ｍｔＨＴＴの細胞毒性効果を強く抑制した。これらの結果は、Ｊドメイン融合タンパク質が、タンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集だけでなく、タンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集に関連した細胞毒性もまた低下させる能力があることを実証している。
ｖｉｉ． 他のタンパク質の凝集を低下させることにおける構築物の試験
本発明者らは次に、他の疾患タンパク質の凝集を低下させおよび／または他の疾患タンパク質を排除する能力があるかどうかを決定するためにいくつかの構築物を試験した。ＨＥＫ２９３細胞を培養し、ＧＦＰ融合体（ＧＦＰ－ＴＤＰ－４３ＦＬまたはＧＦＰ－ＴＤＰ－４３ＣＴＦ）としてＴＤＰ－４３完全長（ＦＬ）またはＴＤＰ－４３ＣＴＦ（２０８～４１４）をコードするプラスミドをそれにトランスフェクトした。いくつかの研究において、核移行シグナルに変異を有する（３アミノ酸の配列８２ＫＲＫ８４がＡＡＡの代わりに用いられた）ｃ－ｍｙｃタグ付きＴＤＰ－４３ ＦＬまたはＴＤＰ－４３を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。構築物５３（Ｆｌａｇ－ＱＢＰ１－ＪＢ１－ＱＢＰ１－Ｆｌａｇ、配列番号１４１）を、ＴＤＰ－４３の病原型も発現する細胞において同時発現させた時、凝集を起こしやすいＴＤＰ－４３レポーターの総量が、保存ＨＰＤドメイン内に点変異を有するコンパニオン対照と比較して、大いに低下することが見出された（データ未呈示）。ＤＮＡ ＪドメインおよびＱＢＰ１を含む追加の構築物もまた、病原性ＴＤＰ－４３を低下させることにおいて有効であり、その構築物には、ＪＢ１－ＱＢＰ１（構築物２）、ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１（構築物４）、ＪＢ１－ＪＢ１－ＱＢＰ１（構築物５６）、ＪＢ１－ＱＢＰ１－ＪＢ１－ＱＢＰ１（構築物５７）、ＪＢ１ＱＢＰ１（１）（構築物番号６４）、ＪＢ１ＱＢＰ１（２）（構築物番号６５）、ＪＢ１ＱＢＰ１（３）（構築物番号６６）、ＪＢ１ＱＢＰ１（４）（構築物番号６７）、ＪＢ１ＱＢＰ１（５）（構築物番号６８）、ＪＢ１ＱＢＰ１（６）（構築物番号６９）、およびＪＢ１ＱＢＰ１（７）（構築物番号７０）が挙げられる（下記の表１４参照）。
Figure 2023520927000024
融合タンパク質構築物が、ＡＬＳなどの疾患とまた関連しているＳＯＤ１の変異原性型の凝集を低下させる能力があるかどうかを決定するために、さらなる試験を実施した。この場合もやはり、ＪＢ１－ＱＢＰ１の同時発現は、ＳＯＤ１のＧ８５ＲおよびＧ９３Ａバリアントのレベルを低下させたが、保存ＨＰＤドメインに点変異を含有するコンパニオン対照は低下させないことが見出された（データ未呈示）。以下の構築物：ＪＢ１ＱＢＰ１（１）（構築物番号６４）、ＪＢ１ＱＢＰ１（２）（構築物番号６５）、ＪＢ１ＱＢＰ１（３）（構築物番号６６）、ＪＢ１ＱＢＰ１（４）（構築物番号６７）、ＪＢ１ＱＢＰ１（５）（構築物番号６８）、ＪＢ１ＱＢＰ１（６）（構築物番号６９）、およびＪＢ１ＱＢＰ１（７）（構築物番号７０）もまた、ＳＯＤ１の変異原性（Ｇ８５Ｒ）バリアントのレベルを低下させることが見出された（データ未呈示）。したがって、本発明者らは、本明細書に記載された融合タンパク質が、ポリグルタミン含有タンパク質の病原性凝集を低下させることができるだけでなく、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、およびレビー小体型認知症などのタンパク質凝集障害に関与するいくつかのタンパク質の凝集を低下させることにおいても有用であると結論づける。
実施例２
融合タンパク質構築物をコードするＡＡＶベクター
例示的な遺伝子治療ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ－アクチンプロモーターを含有するＣＡＧプロモーターの制御下での、表５の融合タンパク質構築物、具体的には構築物２、４、６、７、１７、および２０～３１、加えて対照構築物１（ＤｎａＪＢ１ Ｊドメインのみ）、ＧＦＰ（陰性対照）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを有するＡＡＶ９ベクターにより構築される。ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１をコードするｃＤＮＡは、コザック配列の下流に位置し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナルによりポリアデニル化される。カセット全体は、ＡＡＶ－２の２つの非コード末端逆位配列によって隣接されている。
強い構成的合成ＣＡＧプロモーター（Ｏｋａｂｅら、前記に記載された、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチン遺伝子のプロモーター、第１のエクソン、および第１のイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライス受容体）により駆動される構築物５３（Ｆｌａｇ－ＱＢＰ１－ＪＢ１－ＱＢＰ１－Ｆｌａｇ、配列番号１４１）をコードする核酸カセットは、ＡＡＶベクターへ配置され、ＡＡＶ ｒｈ１０カプシド中へと被包された。いかなる挿入断片も含まないコンパニオン対照もまた、ＡＡＶ ｒｈ１０中へ被包された。
組換えＡＡＶベクターは、上記のものと類似したバキュロウイルス発現系を用いて調製される（Ｕｒａｂｅら、２００２；Ｕｎｚｕら、２０１１（Ｋｏｔｉｎ、２０１１に概説されている））。簡単に述べれば、複製およびパッケージングのためのＲＥＰをコードする１つ、ＡＡＶ９のカプシドについてのＣＡＰ－５をコードする１つ、および発現カセットを有する１つである、３つの組換えバキュロウイルスが、ＳＦ９昆虫細胞に感染するために用いられる。精製は、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速アフィニティ媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて実施される。ベクターは、導入遺伝子についてのプライマー－プローブの組合せでのＱＰＣＲを用いて滴定され、力価は、１ｍｌあたりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｍｌ）として表される。ベクターの力価は、およそ８×１０１３～２×１０１４ＧＣ／ｍｌの間である。
実施例３
ハンチントン病のマウスモデルにおける発現および効力の試験
実験をまず、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、構築物５３の発現を確認するために、および発現が動物に有害な効果を生じないかどうかを確かめるために行った。Ｐ１において、上記のような対照かまたは構築物５３のいずれかを含有する６×１０１０ｖｇ ＡＡＶ ｒｈ１０カプシドを、脳室内注射により注射した。マウスを、運動失調、後肢虚弱、または足の引きずりについて観察した。ＡＡＶ注射から１週間後、体重測定および臨床観察を毎週、行った。３週間目、マウス（ｎ＝３）を、ＣＯ２により人道的に安楽死させて、ＡＡＶ発現を確認した。図９Ａに示されているように、ＩＣＶ注射後３週間の間、体重の差は見られなかった。加えて、構築物の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体で染色することにより確認した。図９Ｂに示されているように、凍結皮質切片を、抗Ｆｌａｇ抗体（１、４；緑色）および抗ＮｅｕＮ抗体（２、５；赤色）で染色し、Ｄａｐｉ（３、６；青色）で対比染色した。画像は、代表的な皮質領である。パネル１～３：対照ＡＡＶｒｈ１０の注射；パネル４～６：構築物５３ ＡＡＶｒｈ１０の注射。
そのようなトランスジェニックマウス系統の例は、Ｒ６／２株である（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、Ｃｅｌｌ ８７：４９３～５０６（１９９６））。Ｒ６／２マウスは、（内因性プロモーターの制御下で）ヒトＨＤ遺伝子のエクソン１を過剰発現する、トランスジェニックのハンチントン病マウスである。Ｒ６／２ヒトＨＤ遺伝子のエクソン１は、伸長したＣＡＧ／ポリグルタミンリピートの長さ（平均で１５０個のＣＡＧリピート）を有する。これらのマウスは、ヒトハンチントン病の多くの特徴を有する、進行性で、最終的に致死的な神経学的疾患を発症する。一部、ハンチンチンのＮ末端部分（ＨＤエクソン１によりコードされる）により構成される、異常な凝集物が、Ｒ６／２マウスにおいて、細胞の細胞質と核の両方で観察される（Ｄａｖｉｅｓら、Ｃｅｌｌ ９０：５３７～５４８（１９９７））。例えば、トランスジェニック動物におけるヒトハンチンチンタンパク質は、少なくとも５５個のＣＡＧリピートおよびより好ましくは約１５０個のＣＡＧリピートを含む遺伝子によりコードされる。
これらのトランスジェニック動物は、生後８週間目から１０週間目までの、体重増加の低下、寿命の低下、および異常な歩調により特徴づけられる運動障害、静止時振戦、後肢の握り行動、および活動亢進により特徴づけられる、ハンチントン病様表現型を発症し得る（例えば、Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、前記参照）。その表現型は、進行性に運動低下へと悪化する。これらのトランスジェニックマウスの脳もまた、神経伝達物質受容体（グルタミン酸、ドーパミン作動性）の変化、Ｎ－アセチルアスパラギン酸（神経細胞完全性のマーカー）の濃度の減少、ならびに線条体および脳サイズの低下などの神経化学的および組織学的異常を示す。したがって、評価することは、神経伝達物質のレベル、神経伝達物質受容体のレベル、脳サイズ、および線条体サイズに関連したパラメータを査定することを含み得る。加えて、トランスジェニックのヒトハンチンチンタンパク質の一部または完全長を含有する異常な凝集物が、これらの動物（例えば、Ｒ６／２トランスジェニックマウス系統）の脳組織に存在する。例えば、Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、前記；Ｄａｖｉｅｓら、Ｃｅｌｌ ９０：５３７～５４８（１９９７）；Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １５（４）：２３９～２５１（２０００）、およびＣｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６４８０～６４８５（１９９８）参照。
動物モデルにおいて本出願に記載された試験化合物または既知の化合物の効果を試験するために、本融合タンパク質および対応する対照をコードするベクターを含有する異なるＡＡＶウイルス粒子が、トランスジェニック動物へ投与される。一実施形態において、ウイルス粒子は、尾静脈注射により投与される。別の実施形態において、ウイルス粒子は、筋肉内注射により投与される。なお別の実施形態において、粒子は、頭蓋内注射により、例えば、Ｓｔａｎｅｋら、（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ． ２５：４６１～４７４に記載されているように、投与される。
投与後、疾患進行が、モニターされ、対照注射されたマウスと比較される。一実施形態において、ハンチントン病様症状が動物において診断される。その後、例えばマウスモデルについての上記のような、ハンチントン病様症状の進行が、モニターされて、試験化合物での処置が症状の低下または遅延を生じるかどうかを決定する。別の実施形態において、これらの動物におけるハンチンチンタンパク質凝集物の脱凝集がモニターされる。その後、動物は屠殺され得、脳スライスが取得される。その後、脳スライスは、トランスジェニックヒトハンチンチンタンパク質、その一部分、またはヒトハンチンチンタンパク質もしくはその一部分を含む融合タンパク質を含有する凝集物の存在について分析される。この分析は、例えば、脳組織のスライスを抗ハンチンチン抗体で染色し、抗ハンチンチン抗体を認識する、ＦＩＴＣでコンジュゲートされた二次抗体を加える（例えば、抗ハンチンチン抗体がマウス抗ヒト抗体であり、二次抗体がヒト抗体に特異的である）ステップ、およびタンパク質凝集物を蛍光顕微鏡法により可視化するステップを含み得る。あるいは、抗ハンチンチン抗体は、ＦＩＴＣで直接的にコンジュゲートされ得る（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｓｈｉｎｋａｗａら、（２０１１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、２２：３５７１～３５８３参照）。その後、ハンチンチンタンパク質凝集物のレベルが、蛍光顕微鏡法により可視化される。
他の態様
この明細書で言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に示されて、全体として参照により組み入れられているかのように同じ程度で、全体として参照により本明細書に組み入れられている。本出願における用語が、参照により本明細書に組み入れられた文書においてと異なって定義されていることが見出された場合、本明細書に提供された定義がその用語についての定義としての役割を果たすものとする。
本発明は、その特定の態様に関連して記載されているが、本発明はさらに改変することができ、一般的に本発明の原理に従い、かつ当技術分野内での公知または慣習的な実施範囲内に入り、上記で示された本質的な特徴に適用することができような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または適応を網羅することを、この出願は意図され、主張された範囲内に従うことは理解されるであろう。

Claims (66)

  1. Ｊタンパク質のＪドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む単離された融合タンパク質。
  2. Ｊタンパク質のＪドメインが真核生物起源である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. Ｊタンパク質のＪドメインがヒト起源である、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. Ｊタンパク質のＪドメインが細胞質に局在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. Ｊタンパク質のＪドメインが、配列番号１～５５からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. Ｊドメインが、配列番号１、５、６、１０、１６、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択される配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. Ｊドメインが配列番号５の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. Ｊドメインが配列番号１０の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. Ｊドメインが配列番号２４の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  10. Ｊドメインが配列番号３１の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. Ｊドメインが配列番号４９の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  12. ポリグルタミン結合性ドメインが、配列番号５１～６８からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. ポリグルタミン結合性ドメインが、配列番号５７の配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. 複数のポリグルタミン結合性ドメインを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  15. ２つのポリグルタミン結合性ドメインからなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 以下の構築物：
    ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
    ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｄ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
    ｅ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
    ｆ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
    ｇ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
    ｈ． Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｉ． ＤＮＡＪ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
    ｊ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
    ｋ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
    ｌ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｍ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ、
    ｎ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｏ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｑ、
    ｑ． Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
    ｒ． Ｑ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
    ｓ． Ｑ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｑ
    のうちの１つを含み、
    ここで、
    Ｑはポリグルタミン結合性ドメインであり、
    ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
    Ｘは任意選択のリンカーである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 配列番号５のＪドメイン配列および配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメイン配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 配列番号５７のポリグルタミン結合性ドメイン配列の２個のコピー、および配列番号５のＪドメイン配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 配列番号８９～１５７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 配列番号９０の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. 配列番号９１の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  22. 配列番号９２の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  23. 配列番号９３の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  24. 標的化試薬をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  25. エピトープをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  26. シグナル配列をさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  27. 細胞においてポリグルタミン含有タンパク質の凝集を低下させる能力がある、請求項１～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  28. ポリグルタミンリピート媒介性細胞毒性を低下させる能力がある、請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  29. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
  30. 核酸がＤＮＡである、請求項２９に記載の核酸配列。
  31. 核酸が少なくとも１個の修飾核酸を含む、請求項２９または請求項３０に記載の核酸配列。
  32. プロモーター領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の核酸配列。
  33. プロモーター領域が、ＣＭＶエンハンサー配列、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、およびＧＦＡＰプロモーターからなる群から選択される配列を含む、請求項３２に記載の核酸配列。
  34. 請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。
  35. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアまたは粘液腫）、パラミクソウイルス（麻疹、ＲＳＶ、またはニューキャッスル病ウイルス）、バキュロウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、およびフラビウイルスからなる群から選択される、請求項３４に記載のベクター。
  36. ＡＡＶである、請求項３４または請求項３５に記載のベクター。
  37. カプシドおよび請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクターを含むウイルス粒子。
  38. カプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、偽型ＡＡＶ、アカゲザル由来ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ－ＤＪａｎ ＡＡＶカプシド変異体、ＡＡＶハイブリッドセロタイプ、臓器向性ＡＡＶ、心臓向性ＡＡＶ、および心臓向性ＡＡＶＭ４１変異体からなる群から選択される、請求項３７に記載のウイルス粒子。
  39. カプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される、請求項３７または請求項３８に記載のウイルス粒子。
  40. カプシドがＡＡＶ２である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  41. カプシドがＡＡＶ５である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  42. カプシドがＡＡＶ８である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  43. カプシドがＡＡＶ９である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  44. カプシドがＡＡＶｒｈ１０である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  45. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子からなる群から選択される作用物質、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
  46. 細胞においてポリグルタミンタンパク質の毒性を低下させる方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項４５に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、前記方法。
  47. 細胞が対象内にある、請求項４６に記載の方法。
  48. 対象がヒトである、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
  49. 細胞が中枢神経系の細胞である、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 対象が、ポリグルタミンリピート疾患を有すると同定されている、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. ポリグルタミンタンパク質が、ハンチンチン、アトロフィン－１、アタキシン１、アタキシン２、Ｃａｖ２．１、アタキシン７、ＴＡＴＡ結合性タンパク質、アタキシン３、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択される、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 細胞においてポリグルタミンタンパク質の凝集の低下がある、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. ポリグルタミンリピート疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象において、ポリグルタミンリピート疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項４５に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、前記方法。
  54. ポリグルタミンリピート疾患が、ハンチントン病、ＳＣＡ １型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、ＤＲＰＬＡ、およびＳＢＭＡからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 対象においてポリグルタミンリピート疾患を防止するまたはその進行を遅延させることにおける使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項４５に記載の薬学的組成物の１以上の使用。
  56. 細胞においてタンパク質凝集を低下させる方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項４５に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、前記方法。
  57. 細胞が対象内にある、請求項５６に記載の方法。
  58. 対象がヒトである、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
  59. 細胞が中枢神経系の細胞である、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 対象が、ポリグルタミンリピート疾患を有すると同定されている、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. ポリグルタミンタンパク質が、ハンチンチン、アトロフィン－１、アタキシン１、アタキシン２、Ｃａｖ２．１、アタキシン７、ＴＡＴＡ結合性タンパク質、アタキシン３、およびアンドロゲン受容体からなる群から選択される、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 対象が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される疾患を有すると同定されている、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 細胞においてタンパク質の凝集の低下がある、請求項５６～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. タンパク質凝集疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象において、タンパク質凝集疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項４５に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、前記方法。
  65. ポリグルタミンリピート疾患が、ハンチントン病、ＳＣＡ １型、ＳＣＡ ２型、ＳＣＡ ６型、ＳＣＡ ７型、ＳＣＡ １７型、ＭＪＤ／ＳＣＡ３、ＤＲＰＬＡ、およびＳＢＭＡからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 対象においてタンパク質凝集疾患を防止するまたはその進行を遅延させることにおける使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３７～４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項４５に記載の薬学的組成物の１つまたは複数の使用。
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