CN115667289A - 用于治疗蛋白聚集障碍的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一类新型融合蛋白来募集细胞的先天伴侣机制，特别是Hsp70介导的系统，以特异性地减少多聚谷氨酰胺介导的蛋白聚集。

Description

用于治疗蛋白聚集障碍的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2020年4月10日递交的美国临时专利申请63/008,251的优先权。上述申请的全部内容特此通过参考以其全部结合。
序列表
本申请通过参考以其全部结合标题为“269548-489649_SequenceListing_ST25.txt”的序列表(150,031字节)，其于2021年4月9日进行最后一次修改，并以电子方式随同递交。
背景
细胞内表达的所有蛋白均需要正确地折叠成其预期结构以便正确地发挥功能。越来越多的疾病和障碍显示与蛋白的不适当折叠和/或蛋白和脂蛋白的不适当沉积和聚集以及感染性蛋白物质有关。也被称为构象病或蛋白质构象病，由错误折叠引起的疾病的实例包括囊性纤维化(CF)、多聚谷氨酰胺重复障碍、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)。突变蛋白在细胞中聚集引起典型的细胞毒性细胞包涵体。
鉴定为蛋白重复扩展障碍的障碍含有氨基酸同聚延伸的扩展，通常为一段谷氨酰胺残基或多聚谷氨酰胺(poly Q)。至少8种神经退行性障碍与多聚谷氨酰胺扩展有关，包括亨廷顿病(HD)、脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)以及几种形式的脊髓小脑性共济失调(SCA)。
在这些基因上不同的疾病中共具的一种共同生理特征为患有这些疾病的患者均被发现在其脑中具有蛋白沉积。尽管在这些疾病的每一种中，蛋白沉积与不同蛋白有关，但所述蛋白均含有一段扩展的谷氨酰胺。迄今为止，疾病相关蛋白中该段扩展的多聚谷氨酰胺(polyQ)序列为所有多聚谷氨酰胺重复疾病中涉及的唯一的已知基因突变。
亨廷顿病(HD)为遗传性多聚谷氨酰胺重复疾病，其特征为主要在大脑皮质和纹状体中的选择性神经元细胞丢失和星形细胞增多(Vonsattel 2007)。当前正在研究的药物疗法限于用抗舞蹈病/神经安定药物治疗特征性运动障碍或减少亨廷顿蛋白的表达(对突变型不加区别或有选择性)，但没有影响疾病进展性质(包括痴呆和精神障碍)的病因治疗(Bonelli, 2007)。
HD由亨廷顿基因(IT-15)第一外显子中不稳定的CAG重复扩展引起，其翻译成亨廷顿蛋白中延长的多聚谷氨酰胺(polyQ)重复延伸。超过37个谷氨酰胺残基的病理学polyQ长度与含有氨基-末端亨廷顿蛋白片段和隔离蛋白的胞质、核周和核内含体的出现有关(Imarisio等人，2008)。
目前，可用的HD治疗主要限于控制宏观症状。例如，由FDA批准的最新化合物之一丁苯那嗪为用于在HD患者中减少运动机能亢进性运动的药物。丁苯那嗪为促进神经递质早期降解的囊泡单胺转运蛋白(VMAT)抑制剂。因此，该药物仅治疗症状，而不是疾病的根源。目前用于治疗HD的其他药物包括神经安定剂和苯二氮䓬类。目前没有已知的治疗试图解决HD的根本原因。没有获批准用于治疗其他多聚谷氨酰胺重复疾病的疗法。
因此，需要开发被优化以靶向特定抗原、蛋白、糖蛋白或脂蛋白的新治疗方式，特别是针对具有基于蛋白错误折叠和聚集的病理学的疾病以及在异质聚集体的情况下。
热休克70 kDa蛋白(本文中被称为“Hsp70”)在广泛种类物种的细胞中构成一类泛在的伴侣蛋白(Tavaria等人，(1996) Cell Stress Chaperones 1, 23-28)。Hsp70需要被称为辅助伴侣蛋白的辅助蛋白，比如J结构域蛋白和核苷酸交换因子(NEF) (Hartl等人，(2009) Nat Struct Mol Biol 16, 574-581)，以便发挥功能。在用于折叠蛋白的Hsp70伴侣机件(Hsp70 chaperone machinery)的当前模型中，Hsp70在ATP-和ADP-结合状态之间循环，并且J结构域蛋白与另一个需要折叠或再折叠的蛋白(被称为“客户蛋白”)结合，与ATP-结合形式的Hsp70 (Hsp70-ATP)相互作用(Young (2010) Biochem Cell Biol 88, 291-300；Mayer, (2010) Mol Cell 39, 321-331)。J结构域蛋白-客户蛋白复合体与Hsp70-ATP的结合刺激ATP水解，这引起Hsp70蛋白的构象变化，闭合螺旋盖，从而稳定客户蛋白与Hsp70-ADP之间的相互作用，以及这引发J结构域蛋白的释放，所述J结构域蛋白然后与另一个客户蛋白自由结合。
因此，根据该模型，J结构域蛋白在Hsp70机件内通过充当桥梁，促进广泛种类客户蛋白的捕获和募集到Hsp70机件中以促进折叠或再折叠成适当的构象而发挥关键作用(Kampinga & Craig (2010) Nat Rev Mol Cell Biol 11, 579-592)。J结构域家族在从原核生物(DnaJ蛋白)到真核生物(Hsp40蛋白家族)范围内的物种中广泛保守。J结构域(约60-80 aa)由4个螺旋组成：I、II、III和IV。螺旋II和III经含有“HPD基序”的柔性环连接，该基序在J结构域中高度保守，并且被认为对活性至关重要(Tsai & Douglas, (1996) J BiolChem 271, 9347-9354)。已发现HPD序列内的突变可消除J结构域功能。
鉴于以上对诸如亨廷顿病等蛋白质构象病提供的上下文，显而易见降低错误折叠蛋白的水平可充当治疗、预防或以其他方式改善这些破坏性障碍的症状的手段，并且募集细胞修复蛋白错误折叠的先天能力将是应追求的符合逻辑的选择。事实上，许多开发基于伴侣蛋白的治疗剂的尝试已表明是对于这些疾病的有希望的策略。然而，这些治疗应用通常被发现与不期望的结果有关，可能是由于伴侣蛋白相对于客户蛋白的相对混杂性所致。例如，绝大多数人类肿瘤过度表达HSP70，并且已经发现HSP70的过度表达会导致癌症患者的致癌风险增加和预后不良(Murphy (2013) Carcinogenesis, 34:1181-1188)。同样，伴侣蛋白修饰剂的应用可导致抑制与靶蛋白密切相关的酶，这可能是由于缺乏选择性所致(Pereira等人，(2018) Chem. Sci., 2018, 9, 1740-1752)。因此，成功开发基于伴侣蛋白的疗法需要提供对病理蛋白的特异性。因此，需要开发高度特异性的伴侣蛋白用于治疗蛋白质构象病。
发明概述
本发明人已经开发了一类新型融合蛋白来募集细胞的先天伴侣机制，特别是Hsp70介导的系统，以特异性地减少多聚谷氨酰胺介导的蛋白聚集。与本发明人先前使用包含Hsp40蛋白(也称为J蛋白，一种与Hsp70相互作用的辅助伴侣蛋白)的片段的融合蛋白来增强蛋白分泌和表达的研究不同，出于减少由含有多聚谷氨酰胺重复的胞内蛋白引起的蛋白聚集和细胞毒性的目的，本研究采用含有J结构域的融合蛋白。在这种背景下，本发明人已做出令人惊讶的发现，功能所需的J结构域元件与J结构域在增强蛋白表达和分泌中的使用截然不同，表明本融合蛋白作用模式的独特机制。本文描述的融合蛋白包含J结构域和对多聚谷氨酰胺重复具有亲和力的结构域。融合蛋白内多聚谷氨酰胺结合结构域的存在导致特异性减少具有多聚谷氨酰胺重复的蛋白聚集。
E1. 因此，在第一方面，本文公开的是分离的融合蛋白，其包含J蛋白的J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域。
E2. E1的融合蛋白，其中J蛋白的J结构域具有真核起源。
E3. E1-E2中任何一项的融合蛋白，其中J蛋白的J结构域具有人类起源。
E4. E1-E3中任何一项的融合蛋白，其中J蛋白的J结构域在胞质上定位。
E5. E1-E4中任何一项的融合蛋白，其中J蛋白的J结构域选自SEQ ID No: 1-50。
E6. E1-E5中任何一项的融合蛋白，其中J结构域包含选自SEQ ID NO: 1、5、6、10、24、25、31和49的序列。
E7. E1-E6中任何一项的融合蛋白，其中J结构域包含SEQ ID NO: 5的序列。
E8. E1-E6中任何一项的融合蛋白，其中J结构域包含SEQ ID NO: 10的序列。
E9. E1-E6中任何一项的融合蛋白，其中J结构域包含SEQ ID NO: 24的序列。
E10. E1-E6中任何一项的融合蛋白，其中J结构域包含SEQ ID NO: 31的序列。
E11. E1-E6中任何一项的融合蛋白，其中J结构域包含SEQ ID NO: 49的序列。
E12. E1-E11中任何一项的融合蛋白，其中当使用测量硫氧还蛋白-Q62聚集抑制的间接测定进行测试时，多聚谷氨酰胺结合结构域对多聚谷氨酰胺重复(例如硫氧还蛋白-Q62构建体)具有2 µM或更小，例如1 µM或更小、500 nM或更小、300 µM或更小、200 nM或更小的KD。
E13. E1-E12中任何一项的融合蛋白，其中多聚谷氨酰胺结合结构域包含选自SEQID NO: 51-68的序列。
E14. E1-E13中任何一项的融合蛋白，其中多聚谷氨酰胺结合结构域包含SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的序列。
E15. E1-E14中任何一项的融合蛋白，其包含多个多聚谷氨酰胺结合结构域。
E16. E1-E15中任何一项的融合蛋白，其由两个多聚谷氨酰胺结合结构域组成。
E17. E1-E15中任何一项的融合蛋白，其由多个J结构域组成。
E18. E1-E17中任何一项的融合蛋白，其包含以下构建体之一：
a. DNAJ-X-Q，
b. DNAJ-X-Q-X-Q，
c. DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
d. Q-X-DNAJ，
e. Q-X-Q-X-DNAJ，
f. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ，
g. Q-X-DNAJ-X-Q，
h. Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q，
i. DNAJ-X-DNAJ-X-Q，
j. Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
k. DNAJ-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
l. Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
m. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
n. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q，
o. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
p. DnaJ-X-DnaJ-X-Q-X-Q，
q. Q-X-DnaJ-X-DnaJ，
r. Q-X-Q-X-DnaJ-X-DnaJ，和
s. Q-X-DnaJ-X-DnaJ-X-Q
其中，
Q为多聚谷氨酰胺结合结构域，
DNAJ为J蛋白的J结构域，和
X为任选的接头。
E19. E1-E18中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域序列和SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域序列。
E20. E1-E19中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域序列和SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域序列的两个拷贝。
E21. E1-E19中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域序列和SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域序列的三个拷贝。
E22. E1-E21中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含选自SEQ ID No: 89-158的序列。
E23. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含选自SEQ ID No: 90、122、139、140、141、157和158的序列。
E24. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 122的序列。
E25. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 139的序列。
E26. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 140的序列。
E27. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 141的序列。
E28. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 90的序列。
E29. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 157的序列。
E30. E1-E22中任何一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 158的序列。
E31. E1-E30中任何一项的融合蛋白，其进一步包含靶向试剂。
E32. E1-E31中任何一项的融合蛋白，其进一步包含表位。
E33. E1-E32中任何一项的融合蛋白，其进一步包含细胞穿透剂。
E34. E33的融合蛋白，其中细胞穿透剂包含选自SEQ ID NO: 85-88的肽序列。
E35. E1-E34中任何一项的融合蛋白，其进一步包含信号序列。
E36. E35的融合蛋白，其中信号序列包含选自SEQ ID NO: 159-161的肽序列。
E37. E1-E36中任何一项的融合蛋白，其能够减少细胞中致病蛋白的聚集。
E38. E1-E37中任何一项的融合蛋白，其能够减少多聚谷氨酰胺重复介导的细胞毒性。
E39. 编码E1-E38中任何一项的融合蛋白的核酸序列。
E40. E39的核酸序列，其中所述核酸为DNA。
E41. E39-E40中任何一项的核酸序列，其中所述核酸为RNA。
E42. E39-E41中任何一项的核酸序列，其中所述核酸包含至少一个修饰的核酸。
E43. E39-E42中任何一项的核酸序列，进一步包含启动子区、5’ UTR、3’ UTR比如多聚(A)信号。
E44. E43的核酸序列，其中启动子区包含选自CMV增强子序列、CMV启动子、CBA启动子、UBC启动子、GUSB启动子、NSE启动子、突触蛋白启动子、MeCP2启动子和GFAP启动子的序列。
E45. 包含E39-E44中任何一项的核酸序列的载体。
E46. E45的载体，其中载体选自腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘病毒(牛痘或黏液瘤)、副粘病毒(麻疹、RSV或新城疫病毒)、杆状病毒、呼肠孤病毒、甲病毒和黄病毒。
E47. E45或E46的载体，其中载体为AAV。
E48. 包含衣壳和E41或E42的载体的病毒粒子。
E49. E48的病毒粒子，其中衣壳选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、假型AAV、恒河猴衍生的AAV、AAVrh8、AAVrh10和AAV-DJanAAV衣壳突变体、AAV杂合性血清型、嗜器官性AAV、嗜心性AAV和嗜心性AAVM41突变体。
E50. E48或E49的病毒粒子，其中衣壳选自AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAVrh10。
E51. E48-E50中任何一项的病毒粒子，其中衣壳为AAV2。
E52. E48-E50中任何一项的病毒粒子，其中衣壳为AAV5。
E53. E48-E50中任何一项的病毒粒子，其中衣壳为AAV8。
E54. E48-E50中任何一项的病毒粒子，其中衣壳为AAV9。
E55. E48-E50中任何一项的病毒粒子，其中衣壳为AAV rh10。
E56. 药用组合物，其包含选自以下的药剂：E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E41-E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和药学上可接受的载剂或赋形剂。
E57. 降低细胞中多聚谷氨酰胺蛋白毒性的方法，其包括使所述细胞与有效量的一种或多种选自以下的药剂接触：E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和E56的药用组合物。
E58. E57的方法，其中细胞处于受试者体内。
E59. E57或E58的方法，其中受试者为人类。
E60. E57-E59中任何一项的方法，其中细胞为中枢神经系统的细胞。
E61. E57-E60中任何一项的方法，其中受试者被鉴定为患有多聚谷氨酰胺重复疾病。
E62. E57-E61中任何一项的方法，其中多聚谷氨酰胺蛋白选自亨廷顿蛋白、肌萎缩蛋白-1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、Cav2.1、共济失调蛋白7、TATA结合蛋白、共济失调蛋白3和雄激素受体。
E63. E57-E62中任何一项的方法，其中细胞中多聚谷氨酰胺蛋白的聚集减少。
E64. 在需要其的受试者中治疗、预防或延缓多聚谷氨酰胺重复疾病进展的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种选自以下的药剂：E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和E56的药用组合物。
E65. E64的方法，其中多聚谷氨酰胺重复疾病选自亨廷顿病、1型SCA、2型SCA、6型SCA、7型SCA、17型SCA、MJD/SCA3、DRPLA和SBMA。
E66. E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和E56的药用组合物中的一种或多种用于在受试者中预防或延缓多聚谷氨酰胺重复疾病进展的用途。
E67. 减少细胞中蛋白聚集的方法，其包括使所述细胞与有效量的一种或多种选自以下的药剂接触：E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和E56的药用组合物。
E68. E67的方法，其中细胞处于受试者体内。
E69. E67-E68中任何一项的方法，其中受试者为人类。
E70. E67-E69中任何一项的方法，其中细胞为中枢神经系统的细胞。
E71. E67-E70中任何一项的方法，其中受试者被鉴定为患有选自ALS、FTD、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、海马硬化、朊病毒病和路易体痴呆的疾病。
E72. E67-E71中任何一项的方法，其中细胞中蛋白的聚集减少。
E73. 在需要其的受试者中治疗、预防或延缓蛋白聚集疾病进展的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种选自以下的药剂：E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和E56的药用组合物。
E74. E73的方法，其中多聚谷氨酰胺重复疾病选自亨廷顿病、1型SCA、2型SCA、6型SCA、7型SCA、17型SCA、MJD/SCA3、DRPLA和SBMA。
E75. E1-E38中任何一项的融合蛋白、表达E1-E38的融合蛋白的细胞、E39-E44中任何一项的核酸、E45-E47中任何一项的载体、E48-E55中任何一项的病毒粒子和E56的药用组合物中的一种或多种用于在受试者中预防或延缓蛋白聚集疾病进展的用途。
附图描述
图1A显示代表性人类J结构域序列的Clustal Omega序列比对。高度保守的HPD结构域在突出显示框中显示。
图1B显示代表性的人类J结构域序列的Clustal Omega序列比对。
图2显示一些包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的说明性融合蛋白构建体。
图3显示如通过在细胞中表达融合蛋白(构建体1-7)的过滤捕集测定测量的对蛋白聚集的影响，所述细胞也表达含有具有正常水平(GFP-HTTQ23中23个重复)或突变水平(GFP-HTTQ74中74个重复)的多聚谷氨酰胺扩展的亨廷顿蛋白片段的报告构建体。
图4显示具有修饰的J结构域的另外融合蛋白构建体在表达亨廷顿蛋白报告构建体GFP-HTTQ74的细胞中减少亨廷顿蛋白聚集的能力。
图5显示融合蛋白构建体中不同接头的比较。
图6显示如通过荧光显微术测量的表达J-2XQBP1构建体的细胞中蛋白聚集的减少(图6c)，并与单独的GFP-HTTQ74 (图6a)、单独的GFP-HTTQ23 (图6b)或共表达JB1 (P33Q)-2XQBP2的GFP-HTTQ74 (一种在保守HPD基序内具有突变的融合蛋白) (图6d)进行比较。
图7显示如通过荧光显微术(图7A)和过滤捕集测定(图7B)测量的测试了减少蛋白聚集能力的另外构建体。
图8显示在U87-MG胶质瘤细胞中表达构建体56 (JB1-JB1-QBP1)的作用。A. 用慢病毒感染U87-MG胶质瘤细胞以表达具有或不具有构建体56的Myc标记的正常HTT (Q23)或mHTT (Q74)。第2和第4天用新鲜培养基替换培养基。第7天裂解细胞以进行过滤捕集测定。将0.5 µg或2.5 µg总蛋白施用于过滤捕集测定装置，然后使用抗HTT抗体(MW8)进行免疫印迹测定。B. 感染之后7天从U87-MG细胞收集培养基。通过LDH-CytoTM测定试剂盒(BioLegend)测量培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。数值表示平均值±SD。*p<0.05。
图9显示野生型小鼠中ICV给予表达对照或构建体53的rAAV衣壳(在AAV rh10中)的作用。A. 在ICV AAV注射后，每天记录每只小鼠的体重。B. 冷冻皮质切片用抗Flag抗体(1、4，绿色)和抗NeuN抗体(2、5，红色)进行染色，并用Dapi (3、6，蓝色)进行复染。图像为代表性的皮质区。图1-3：注射对照AAVrh10；图4-6，注射Flag-QBP1-JB1-QBP1-Flag AAVrh10。
定义
如申请书和权利要求中使用的，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指涉。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为直形或分支的，其可包含修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。该术语还包括已修饰的氨基酸聚合物，例如通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，比如与标记成分的缀合。
如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于D或L光学异构体两者以及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单或三字母代码来指定氨基酸。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可为或已经是主题载体的受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于自然、偶然或故意突变，后代可能不一定与初始亲本细胞完全相同(在形态学或总DNA组的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明载体进行体内转染的细胞。
当被用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”意指已从其自然环境的成分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其自然环境的污染物成分为一般会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白的或非蛋白的溶质。如对本领域技术人员显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区别开来。另外，“浓缩”、“分离”或“稀释”的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段可与其天然存在的对应物的区别在于，每体积的分子浓度或数量通常大于其天然存在的相应物。通常，通过重组手段制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
“分离的”多核苷酸或编码多肽的核酸或者其他编码多肽的核酸为被鉴定并分离自至少一种污染物核酸分子的核酸分子，所述污染物核酸分子通常在编码多肽的核酸的天然来源中与之相关。分离的编码多肽的核酸分子并不在其于自然界中发现的形式或环境中。因此，分离的编码多肽的核酸分子与存在于天然细胞中时的特定的编码多肽的核酸分子区别开来。然而，分离的编码多肽的核酸分子包括通常表达多肽的细胞中含有的编码多肽的核酸分子，例如当核酸分子处于与天然细胞不同的染色体或染色体外位置时。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci) (基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离DNA、具有任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，比如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合之后进一步被修饰，比如通过与标记成分缀合。
如本文定义的，术语“多聚谷氨酰胺障碍”或“多聚谷氨酰胺重复障碍”是指与胞内多聚谷氨酰胺聚集物形成相关的障碍，优选地是指亨廷顿病(HD)、脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)和脊髓小脑性共济失调(SCA) 1型、SCA 2型、SCA 6型、SCA 7型、SCA 17型或MJD/SCA3。
同样，术语“含有多聚谷氨酰胺的蛋白”是指含有一段至少10个，例如至少13个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或更多个谷氨酰胺氨基酸的蛋白。在许多情况下，含有多聚谷氨酰胺的蛋白当与野生型蛋白相比较时含有异常高水平的多聚谷氨酰胺。含有多聚谷氨酰胺延伸的蛋白包括但不限于亨廷顿蛋白、肌萎缩蛋白-1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、Cav2.1、共济失调蛋白7、TATA结合蛋白、共济失调蛋白3和雄激素受体。
“载体”为一种核酸分子，优选地在适当的宿主中自我复制，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语包括主要发挥将DNA或RNA插入到细胞中的功能的载体、主要发挥复制DNA或RNA的功能的复制载体以及发挥转录和/或翻译DNA或RNA的功能的表达载体。还包括提供多于一种以上功能的载体。“表达载体”为可在被引入到适当的宿主细胞中时转录并翻译成一种或多种多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意指由可发挥功能以产生期望的表达产物的表达载体组成的合适的宿主细胞。
术语“可操作地连接”是指所述组件的并置，其中组件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式进行连接。“可操作地连接”的序列可包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列和反式或远距离作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列两者。术语“表达控制序列”是指影响其连接的编码序列的表达和处理所需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，比如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(比如Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当期望时，增强蛋白分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在对表达和处理至关重要的组件，并且还可包括其存在为有利的另外组件，例如前导序列和融合伴侣序列。除非另外指明，否则本文中将编码本发明融合蛋白的核酸分子插入到表达载体中的描述或说明意指当将含有插入的核酸分子的表达载体被引入到相容性宿主细胞或相容性生物体细胞中时，插入的核酸分子也已在载体内与所编码融合蛋白的表达所需的功能启动子及其他转录和翻译控制元件可操作连接。
如应用于多核苷酸的，“重组”意指多核苷酸为体外克隆、限制和/或连接步骤以及产生可潜在地在宿主细胞中表达的构建体的其他程序的各种组合的产物。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。它们是指含有至少一个能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白的开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可为基因组或cDNA，只要多核苷酸含有至少一个开放阅读框，其可涵盖整个编码区或其区段。“融合基因”为由至少两个连接在一起的异源多核苷酸组成的基因。
术语“疾病”和“障碍”可互换地用于指示根据本领域中可接受的医学标准和实践鉴定的病理状态。
如本文使用的，术语“有效量”是指疗法的量，其足以减少或改善疾病或者其一种或多种症状的严重性和/或持续时间；防止有害或病理状态的发展；引起病理状态的消退；防止与病理状态相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展；检测障碍；或者增强或改善疗法的预防或治疗的一种或多种效果(例如给予另一种预防或治疗剂)。
如本文使用的，术语“J结构域”是指保留加速Hsp70及其同源物固有的ATP酶催化活性的能力的片段。多种J蛋白的J结构域已经被确定(参见例如Kampinga等人，(2010)Nat. Rev., 11: 579-592；Hennessy等人，(2005) Protein Science, 14: 1697-1709，其每一个均通过参考以其全部结合)，并且其特征为多种以下特征：其特征为4个α-螺旋(I、II、III、IV)，并且通常在螺旋II和III之间具有高度保守的组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸三肽序列基序(被称为“HPD基序”)。一般地，J蛋白的J结构域长度在50-70个氨基酸之间，并且J结构域与Hsp70-ATP伴侣蛋白的相互作用(结合)位点据信是从螺旋II延伸的区域，并且HPD基序为刺激Hsp70 ATP酶活性必需的。如本文使用的，术语“J结构域”意指包括保留加速Hsp70固有的ATP酶活性的能力的天然J结构域序列及其功能变体，其可使用本领域众所周知的方法进行测量(参见例如Horne等人，(2010) J. Biol. Chem., 285, 21679-21688，其通过参考以其全部结合至本文中)。人类J结构域的非限制性列表提供于表1中。
详述
本发明人发现，某些细胞与包含J蛋白的J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白构建体的接触具有意想不到的减少含有多聚谷氨酰胺的蛋白的聚集的效果。据信，此类含有多聚谷氨酰胺重复的蛋白的聚集引起多种毁灭性疾病，包括但不限于亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调(SCA) 1型、SCA 2型、SCA 6型、SCA 7型、SCA 17型、MJD/SCA3、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)和脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)。因此，本文提供例如在需要其的受试者中治疗多聚谷氨酰胺重复障碍的有用组合物和方法。
为克服与基于伴侣蛋白的疗法相关的问题，我们研究了是否有可能设计具有高特异性的人工伴侣蛋白。我们设计了一系列融合蛋白构建体，其包含用于Hsp70结合/激活的效应子结构域(J结构域序列)和赋予对具有多聚谷氨酰胺重复的蛋白的特异性的结构域。所得融合蛋白起到加速Hsp70及其同源物固有的ATP酶催化活性的作用，导致蛋白折叠增加和聚集减少。
I. 融合蛋白构建体
a. 可用于本发明的J结构域
已测定了多种J蛋白的J结构域。参见例如Kampinga等人，Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)；Hennessy等人，Protein Science, 14:1697-1709 (2005)。可用于制备本发明融合蛋白的J结构域具有主要加速HSP70 ATP酶活性的J结构域的关键定义特征。因此，可用于本发明的分离的J结构域包含多肽结构域，其特征为4个α-螺旋(I、II、III、IV)，并且通常在螺旋II和III之间具有高度保守的组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸三肽序列(称为“HPD基序”)。一般地，J蛋白的J结构域长度在50-70个氨基酸之间，并且J结构域与Hsp70-ATP伴侣蛋白的相互作用(结合)位点据信是从螺旋II延伸的区域，并且HPD基序为原始活性的基础。代表性的J结构域包括但不限于DnaJB1、DnaJB2、DnaJB6、DnaJC6的J结构域，SV40大T抗原的J结构域，和哺乳动物半胱氨酸链蛋白(CSP-α)的J结构域。可用于本发明融合蛋白的这些和其他J结构域的氨基酸序列提供于表1中。保守的HPD基序以粗体突出显示。进行的初步实验确认HPD基序的重要性：的确，发现使用来自DNA JB13 (SEQ ID NO: 16)的J结构域的融合蛋白构建体不能够减少蛋白聚集(构建体59)。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含含有HPD结构域的J结构域序列。在一个实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ ID No: 1-15、17-50的J蛋白的J结构域。在另一个实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 1、5、6、10、24、25、31和49的J蛋白的J结构域。在一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域。在一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 10的J结构域。在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 24的J结构域。在又另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 31的J结构域。在仍然另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 49的J结构域。
表1. 代表性的人类J结构域序列
Figure 547207DEST_PATH_IMAGE002
Figure 464347DEST_PATH_IMAGE004
Figure 306402DEST_PATH_IMAGE006
Figure 701611DEST_PATH_IMAGE008
Figure 515983DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
b. 多聚谷氨酰胺结合结构域
融合蛋白还包含至少一个多聚谷氨酰胺结合结构域。多聚谷氨酰胺结合结构域可为单链多肽，或者为与J结构域结合以形成融合蛋白的多聚多肽。
理想的是多聚谷氨酰胺结合结构域具有足够的亲和力，以能够在细胞内以病理水平存在时结合含有多聚谷氨酰胺的蛋白。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含多聚谷氨酰胺结合结构域，当使用测量硫氧还蛋白-Q62聚集抑制的间接测定进行测试时，其对多聚谷氨酰胺重复(例如硫氧还蛋白-Q62构建体)具有2 µM或更小，例如1 µM或更小、500 nM或更小、300 µM或更小、200 nM或更小的KD (Nagai等人，(2000) J. Biol. Chem., 275 (14)10437-10442)。
已报道，QBP1序列(SEQ ID NO: 57)及其衍生物还阻断诸如TDP-43 (Mompeán等人，(2019) Archives of Biochemistry and Biophysics, 675, 108113)、α-突触核蛋白(Hervás等人，(2012) PLOS Biology, 10(5), e1001335)和朊病毒同源物(Hervás等人，(2012) PLOS Biology, 10(5), e1001335)等其他淀粉样蛋白的聚集，并且这些序列已被认为是关键单体β-构象变化的混杂抑制因子。因此，在另一个实施方案中，使用包含选自SEQ ID NO: 51-68的多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白(参见例如表2)以减少与由蛋白错误折叠引起的疾病和/或比如ALS、FTD、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、海马硬化、朊病毒病和路易体痴呆相关的蛋白聚集。
先前已经鉴定和表征多聚谷氨酰胺结合结构域(参见例如Nagai等人，同前；Waragai等人，(1999) Hum Mol Genet 8, 977-987；Imafuku等人，(1998) BiochemBiophys Res Commun 253, 16-20)。因此，在另一个实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ IDNO: 51-68的多聚谷氨酰胺结合结构域(参见例如表2)。在一个特定实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域。在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQID NO: 62的多聚谷氨酰胺结合结构域。在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:68的多聚谷氨酰胺结合结构域。
在另一个实施方案中，融合蛋白还考虑使用与J结构域化学缀合的多聚谷氨酰胺结合蛋白。多聚谷氨酰胺结合结构域可与J结构域直接缀合。或者，其可通过接头与J结构域缀合。例如，存在大量化学交联剂，其为本领域技术人员已知的，并且可用于使多聚谷氨酰胺结合结构域与J结构域交联，或使靶向结构域与包含多聚谷氨酰胺结合结构域和J结构域的融合蛋白交联。例如，交联剂为异双官能交联剂，其可被用于以逐步方式连接分子。异双官能交联剂提供设计用于缀合蛋白的更特异性偶联方法从而减少诸如同蛋白聚合物等不想要的副反应发生的能力。本领域已知广泛种类的异双官能交联剂，包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。那些具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的交联剂可作为通常具有更大水溶性的N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物得到。另外，在连接链内具有二硫键的那些交联剂可代替地合成为烷基衍生物，从而减少体内接头裂解的量。除异双官能交联剂之外，还存在许多其他交联剂，包括同双官能和光反应性交联剂。辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)和庚二酰亚胺酸二甲酯二盐酸盐(Forbes-Cori病)为有用的同双官能交联剂的实例，而双-[β-(4-叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亚胺基-6(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)为用于本公开的有用光反应性交联剂的实例。关于蛋白偶联技术的新近综述，参见Means等人，(1990) Bioconj. Chem. 1:2-12，通过参考结合至本文中。
表2：多聚谷氨酰胺结合结构域的实例
Figure DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE016
c. 任选的接头
本文描述的融合蛋白可任选地含有一个或多个接头。接头可为肽或非肽的。除了别的之外，接头的目的为在蛋白内的功能结构域之间(例如J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域之间、多聚谷氨酰胺结合结构域的串联排列之间、J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域与任选的靶向试剂之间或者J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域与任选的检测结构域或表位之间)提供足够的距离，以优化每个结构域的功能。显然，接头优选地不干扰根据本发明的融合蛋白的靶蛋白结合结构域J结构域的相应功能。如果接头存在于本发明的融合蛋白中，则对其进行选择以减弱由靶蛋白(polyQ蛋白)引起的细胞毒性，并且如果直接附接达到期望的效果，则可省略接头。存在于本发明融合蛋白中的接头可包含由存在于表达载体克隆位点中或周围的核酸区段上的核苷酸序列编码的一个或多个氨基酸，在所述表达载体中框内插入编码如本文描述的蛋白结构域或整个融合蛋白的核酸区段。在一个实施方案中，肽接头的长度在1个氨基酸-20个氨基酸之间。在另一个实施方案中，肽接头的长度在2个氨基酸-15个氨基酸之间。在仍然另一个实施方案中，肽接头的长度在2个氨基酸-10个氨基酸之间。
选择一个或多个多肽接头以产生根据本发明的融合蛋白处于本领域技术人员的知识和技能范围内。参见例如Arai等人，Protein Eng., 14(8): 529-532 (2001)；Crasto等人，Protein Eng., 13(5): 309-314 (2000); George等人，Protein Eng., 15(11):871-879 (2003)；Robinson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5929-5934 (1998)，其每一个均通过参考以其全部结合至本文中。
可用于制备根据本发明的融合蛋白的两个或更多个氨基酸接头的实例包括但不限于以下表3中提供的那些。
表3：接头序列
SEQ ID NO: 长度 序列
69 2 SR
70 4 GTGS
71 5 GLESR
72 4 GGSG
73 4 GGGS
74 5 DIAAA
75 9 DIAAALESR
76 15 GGGGSGGGGSGGGGS
77 11 AEAAAKEAAAK
78 15 SGGGSGGGGSGGGGS
79 25 DIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA
80 5 GGGGS
81 5 EAAAK
82 10 GGGGSGGGGS
83 10 EAAAKEAAAK
84 2 LE
d. 靶向试剂
本文公开的融合蛋白可进一步包含靶向部分。如本文使用的，术语“靶向部分”和“靶向试剂”可互换使用，并且是指与融合蛋白相关的物质，其增强融合蛋白在细胞中或受试者体内的结合、转运、累积、停留时间、生物利用度，或者改变融合蛋白在细胞中或受试者体内的生物活性或治疗效果。靶向部分可在组织、细胞和/或亚细胞水平上具有功能性。靶向部分可将融合蛋白直接定位至特定细胞、组织或器官，例如在将融合蛋白给予受试者体内时。在一个实施方案中，靶向部分位于融合蛋白的N-末端。在另一个实施方案中，靶向部分位于融合蛋白的C-末端。在仍然另一个实施方案中，靶向部分位于内部。在另一个实施方案中，靶向部分经化学缀合附接于融合蛋白。
靶向部分可包括但不限于有机或无机分子、肽、肽模拟物、蛋白、抗体或其片段、生长因子、酶、凝集素、抗原或免疫原、病毒或其组分、病毒载体、受体、受体配体、毒素、多核苷酸、寡核苷酸或适体、核苷酸、碳水化合物、糖、脂质、糖脂、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、类固醇、激素、生长因子、化学引诱剂、细胞因子、趋化因子、药物或小分子等。
在本发明的示例性实施方案中，靶向部分增强平台或者其相关配体和/或活性剂在靶细胞或组织(例如神经元细胞、中枢神经系统和/或外周神经系统)中的结合、转运、累积、停留时间、生物利用度或者改变其生物活性或治疗效果。因此，靶向部分可能对与中枢神经系统相关的细胞受体具有特异性，或者与经血脑屏障(BBB)向CNS的递送增强有关。因此，如上所述，配体既可为配体也为靶向部分。
在一些实施方案中，靶向部分可为细胞穿透肽，例如如在美国专利号10,111,965中所述，其通过参考以其全部结合。在另一个实施方案中，靶向部分可为抗体或抗体结合片段或其单链衍生物，例如如在美国序列号16/131,591中所述，其通过参考以其全部结合至本文中。
靶向部分可通过直接或间接地结合于核心而偶联于平台以进行靶向细胞递送。例如，在其中核心包含纳米粒子的实施方案中，靶向部分与纳米粒子的缀合可利用用于将PEG栓系于纳米粒子的类似官能团。因此，靶向部分可通过靶向部分的官能化而直接结合于纳米粒子。或者，如上所述，靶向部分可通过靶向部分与官能化PEG的缀合而间接地结合于纳米粒子。靶向部分可通过共价、非共价或静电相互作用附接于核心。在一个实施方案中，靶向部分为肽。在一个特定实施方案中，靶向部分为共价附接于融合蛋白的N-末端的肽。
e. 表位
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白含有可赋予融合蛋白另外特性的任选的表位或标签。如本文使用的，术语“表位”和“标签”可互换地用于指长度一般为300个氨基酸或更少的氨基酸序列，其一般附接于融合蛋白的N-末端或C-末端。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白进一步包含被用于促进纯化的表位。此类对纯化有用的表位的实例包括人类IgG1 Fc序列(SEQ ID NO: 162)、FLAG表位(DYKDDDDK，SEQ ID NO: 163)、His6表位(SEQ IDNO: 164)、c-myc (SEQ ID NO:165)、HA (SEQ ID NO: 166)、V5表位(SEQ ID NO:167)或谷胱甘肽-s-转移酶(SEQ ID NO: 168)。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白进一步包含当被给予受试者(例如人类)时被用于增加融合蛋白半衰期的表位。可用于增加半衰期的此类表位的实例包括人类Fc序列。因此，在一个特定实施方案中，融合蛋白除J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域之外还包含人类Fc表位。该表位位于融合蛋白的C-末端。
f. 细胞穿透肽
在仍然其他实施方案中，本文描述的融合蛋白可进一步包含细胞穿透肽。已知细胞穿透肽携带缀合的货物(无论是小分子、肽、蛋白还是核酸)进入细胞中。本发明融合蛋白中细胞穿透肽的非限制性实例包括但不限于聚阳离子肽(例如HIV TAT肽49-57、聚精氨酸和穿膜肽(penetratin) pAntan (43-58))、两亲肽(例如pep-1)、疏水肽(例如C405Y)等。参见以下表4。
表4：细胞穿透肽的实例
SEQ ID NO: 序列
85 RKKRRQRRR
86 RQIKWFQNRRMKWKK
87 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
88 CSIPPEVKFNKPFVYLI
因此，在一个实施方案中，融合蛋白进一步包含细胞穿透肽和融合蛋白，其中细胞穿透肽选自SEQ ID NO: 85-88，而融合蛋白选自SEQ ID NO: 89-158。在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 85的信号序列，并且融合蛋白选自SEQ ID NO: 89-158。在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 86的细胞穿透肽，并且融合蛋白选自SEQ IDNO: 89-158。在仍然另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 87的细胞穿透肽，并且融合蛋白选自SEQ ID NO: 89-158。在又另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 88的细胞穿透肽，并且融合蛋白选自SEQ ID NO: 89-158。可将表达具有细胞穿透肽的融合蛋白构建体的细胞给予受试者，例如人类受试者(例如具有患有多聚谷氨酰胺重复障碍或处于其风险下的患者)。融合蛋白从细胞分泌，其助于减少含有多聚谷氨酰胺重复的蛋白的聚集和/或相关细胞毒性。
在另一个实施方案中，融合蛋白进一步包含信号序列，其位于N-末端。信号序列可选自SEQ ID NO: 159-161。
g. J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的排列
本文描述的融合蛋白可以多种方式排列。在一个实施方案中，多聚谷氨酰胺结合结构域附接于J结构域的C-末端侧。在另一个实施方案中，多聚谷氨酰胺结合结构域附接于J结构域的N-末端侧。呈任一配置的多聚谷氨酰胺结构域和J结构域均可任选地经如上所述的接头分隔开。
在一些实施方案中，J结构域可附接于多个多聚谷氨酰胺结合结构域，例如两个多聚谷氨酰胺结合结构域、三个多聚谷氨酰胺结合结构域、四个多聚谷氨酰胺结合结构域或更多。多聚谷氨酰胺结合结构域可附接于J结构域的N-末端侧。或者，多聚谷氨酰胺结合结构域可附接于J结构域的C-末端侧。在仍然另一个实施方案中，多聚谷氨酰胺结合结构域可附接于J结构域的N-末端和C-末端侧。多个多聚谷氨酰胺结合结构域中的每一个可为相同的多聚谷氨酰胺结合结构域。在另一个实施方案中，融合蛋白中多个多聚谷氨酰胺结合结构域中的每一个可为不同的多聚谷氨酰胺结合结构域(即不同的序列)。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含选自以下的结构：
a. DNAJ-X-Q，
b. DNAJ-X-Q-X-Q，
c. DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
d. Q-X-DNAJ，
e. Q-X-Q-X-DNAJ，
f. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ，
g. Q-X-DNAJ-X-Q，
h. Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q，
i. DNAJ-X-DNAJ-X-Q，
j. Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
k. DNAJ-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
l. Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
m. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
n. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q，
o. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
p. DnaJ-X-DnaJ-X-Q-X-Q，
q. Q-X-DnaJ-X-DnaJ，
r. Q-X-Q-X-DnaJ-X-DnaJ，和
s. Q-X-DnaJ-X-DnaJ-X-Q
其中：
Q为多聚谷氨酰胺结合结构域，
DNAJ为J蛋白的J结构域，和
X为任选的接头。
在一个实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 5、6、10、24和31的J结构域。在一个特定实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域。
在另一个实施方案中，多聚谷氨酰胺结合结构域选自SEQ ID NO: 57、62和68。在一个特定实施方案中，多聚谷氨酰胺结合结构域为SEQ ID NO: 57。
在仍然另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域和SEQ ID NO:57的多聚谷氨酰胺结合结构域。在一个实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 90-104、122-145、147和152-158的序列。
在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域和SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域的至少两个拷贝。在特定实施方案中，融合蛋白包含选自SEQ IDNO: 92-95、103-104和122-143的序列。
包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白构建体的非限制性实例示意性描绘于图1中，并且还显示于以下表5中。在另一个实施方案中，具体融合蛋白构建体选自SED ID NO: 89-157。
表5：融合蛋白构建体
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*含有2X或3X的构建体指示存在多聚谷氨酰胺结合结构域的2或3个串联拷贝。例如，JB1-2XQBP1指示QBP1 (SEQ ID NO: 57)的两个串联拷贝。
II. 编码融合蛋白构建体的核酸
根据本发明的另一方面，提供分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序列：(a)编码前述实施方案中任何一个的融合蛋白的多核苷酸，或(b) (a)的多核苷酸的互补物。本发明提供编码包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白的分离的核酸，以及与此类编码融合蛋白的核酸分子互补的序列，包括其同源变体。在另一方面，本发明包括产生编码本文公开的融合蛋白的核酸以及与编码融合蛋白的核酸分子互补的序列(包括其同源变体)的方法。根据本发明该方面的核酸可为前信使RNA (前体mRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA、基因组DNA (gDNA)、PCR扩增的DNA、互补DNA (cDNA)、合成DNA或重组DNA。
在又另一方面，公开了产生融合蛋白的方法，包括(a) 合成和/或组装编码融合蛋白的核苷酸，(b) 将编码基因掺入到适合于宿主细胞的表达载体中，(c) 用表达载体转化适当的宿主细胞，和(d) 在引起或允许融合蛋白在转化的宿主细胞中表达的条件下培养宿主细胞，从而产生生物活性融合蛋白，其通过本领域已知的标准蛋白纯化方法作为分离的融合蛋白回收。分子生物学中的标准重组技术被用于制备本发明的多核苷酸和表达载体。
根据本发明，编码本文公开的融合蛋白的核酸序列(或其互补物)被用于产生指导融合蛋白在适当的宿主细胞中表达的重组DNA分子。几种克隆策略适合于实施本发明，其中许多种被用于产生包含编码本发明融合蛋白的基因或其互补物的构建体。在一些实施方案中，克隆策略被用于创建编码本发明融合蛋白的基因或其互补物。
在某些实施方案中，编码一种或多种融合蛋白的核酸为RNA分子，并且可为前信使RNA (前体mRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA、基因组DNA (gDNA)、PCR扩增的DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。
在各种实施方案中，核酸为被引入到细胞中以短暂表达期望的多肽的mRNA。如本文使用的，“短暂”是指非整合转基因的表达持续数小时、数天或数周的时间段，其中如果被整合到基因组中或包含在细胞中稳定的质粒复制子中，则表达的时间段小于多核苷酸的表达时间段。
在特定实施方案中，编码多肽的mRNA为体外转录的mRNA。如本文使用的，“体外转录的RNA”是指RNA，优选地为已在体外合成的mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含被用于产生体外转录的RNA的模板。
在特定实施方案中，mRNA可进一步包含5’帽或修饰的5’帽和/或多聚(A)序列。如本文使用的，5’帽(也被称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)为修饰的鸟嘌呤核苷酸，在转录开始之后不久已被添加至真核生物信使RNA的“前端”或5’末端。5’帽包含连接于第一转录核苷酸，并且被核糖体识别并保护免受RNA酶的末端基团。可修饰加帽部分以调节mRNA的功能性，比如其稳定性或翻译效率。在特定实施方案中，mRNA包含约50-约5000个腺嘌呤之间的多聚(A)序列。在一个实施方案中，mRNA包含约100-约1000个碱基之间、约200-约500个碱基之间或约300-约400个碱基之间的多聚(A)序列。在一个实施方案中，mRNA包含约65个碱基、约100个碱基、约200个碱基、约300个碱基、约400个碱基、约500个碱基、约600个碱基、约700个碱基、约800个碱基、约900个碱基或者约1000或更多个碱基的多聚(A)序列。多聚(A)序列可化学或酶促修饰以调节mRNA功能性，比如定位、稳定性或翻译效率。
如本文使用的，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示显著序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语包括与参考多核苷酸相比其中一个或多个核苷酸已被添加、缺失或替换为不同的核苷酸的多核苷酸。在这方面，本领域中应当很好理解的是，可对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，藉此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物功能或活性。
在某些实施方案中，核酸序列包含核酸盒内编码感兴趣基因的核苷酸序列(例如包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白)。如本文使用的，术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内可表达RNA，并且进而表达多肽的基因序列。在一个实施方案中，核酸盒含有一个或多个感兴趣的基因，例如一个或多个感兴趣的多核苷酸。在另一个实施方案中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、多聚(A)序列和一个或多个感兴趣的基因，例如一个或多个感兴趣的多核苷酸。载体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个核酸盒。核酸盒在载体内按位置和依序定向，使得盒中的核酸可被转录成RNA并在必要时翻译成蛋白或多肽，在转化细胞中经受活性所需的适当翻译后修饰，且通过靶向于适当的胞内隔室或分泌到胞外隔室中而被移位至适当的隔室用于生物活性。优选地，盒具有适于准备插入到载体中的3’和5’末端，例如其在每端处具有限制性内切核酸酶位点。可将盒取出并作为单个单元插入到质粒或病毒载体中。
适用于特定实施方案的说明性泛在表达控制序列包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒性猿猴病毒40 (SV40)(例如早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV) LTR、单纯疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α (EFlα)启动子、早期生长反应1 (EGR1)、铁蛋白H (FerH)、铁蛋白L (FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核生物翻译起始因子4A1 (EIF4A1)、热休克70 kDa蛋白5 (HSPA5)、热休克蛋白90 kDa β成员1 (HSP90B1)、热休克蛋白70 kDa (HSP70)、β-驱动蛋白(β -KIN)、人类ROSA 26位点(Irions等人，NatureBiotechnology 25, 1477-1482 (2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子(Okabe等人，(1997) FEBS let. 407:313-9)、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND) U3启动子(Haas等人，Journal of Virology. 2003;77(l7): 9439-9450)。
在一个实施方案中，至少一种元件可与本文描述的多核苷酸一起使用，以增强转基因靶标特异性和表达(参见例如Powell等人，(2015) Discovery Medicine 19(102):49-57，其内容通过参考以其全部结合至本文中)，比如启动子。在大多数组织中促进表达的启动子包括但不限于人类延伸因子1α亚基(EF1α)、立即早期巨细胞病毒(CMV)、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)或泛素C (UBC)。组织特异性表达元件可被用于限制特定细胞类型的表达，所述元件比如但不限于神经系统启动子，其可被用于限制神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的表达。用于神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)、甲基CpG结合蛋白2 (MeCP2)、CaMKII、mGluR2、NFL、NFH、ηβ2、PPE、Enk和EAAT2启动子。用于星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。用于少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子。Yu等人((2011) Molecular Pain, 7:63，通过参考以其全部结合)使用慢病毒载体评估了在大鼠DRG细胞和原代DRG细胞中处于CAG、EFIa、PGK和UBC启动子下的eGFP表达，并发现UBC显示的表达比其他3个启动子更弱，且所有启动子中均仅见10-12%的神经胶质表达。Soderblom等人(E. Neuro 2015，通过参考以其全部结合)在运动皮质中注射之后在具有CMV和UBC启动子的AAV8和具有CMV启动子的AAV2中的eGFP的表达。鼻内给予含有UBC或EFIa启动子的质粒显示出的持续气道表达大于CMV启动子的表达(参见例如Gill等人，(2001) Gene Therapy, Vol. 8, 1539-1546；通过参考以其全部结合)。Husain等人((2009) Gene Therapy，通过参考以其全部结合)评估了具有hGUSB启动子、HSV-1LAT启动子和NSE启动子的HβH构建体，并且发现HβH构建体显示出的在小鼠脑中的表达弱于NSE。Passini和Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392，通过参考以其全部结合)评估了在新生小鼠脑室内注射后HβH载体的长期效果，并且发现持续表达至少1年。Xu等人((2001) Gene Therapy, 8, 1323-1332；通过参考以其全部结合)发现，当使用NF-L和NF-H启动子时，与CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE (0.3 kb)、NSE (1.8 kb)和NSE(1.8 kb + wpre)相比较，所有脑区中均为低表达。Xu等人发现，启动子活性按降序为NSE (1.8 kb)、EF、NSE (0.3 kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL和NFH。NFL为650个核苷酸的启动子而NFH为920个核苷酸的启动子，其两者均不存在于肝脏中，但NFH在感觉本体感受神经元、脑和脊髓中丰富而NFH存在于心脏中。Scn8a为470个核苷酸的启动子，其遍及DRG、脊髓和脑表达，在海马神经元和小脑浦肯野细胞、皮质、丘脑和下丘脑中可见特别高的表达(参见例如Drews等人，2007和Raymond等人，2004；通过参考以其全部结合)。
III. 包含编码融合蛋白的核酸的载体
还提供包含根据本发明的核酸的载体。此种载体优选地包含另外的核酸序列，比如编码磷酸酶的核酸序列的转录/翻译所需的元件(例如启动子和/或终止子序列)。所述载体还可包含编码选择标记(例如抗生素)的核酸序列，以选择或保持用所述载体转化的宿主细胞。本文使用术语“载体”来指能够转移或转运另一核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常连接于载体核酸分子，例如插入到其中。载体可包括指导细胞中自主复制的序列，或者可包括足以允许进入宿主细胞DNA内的整合的序列。在特定实施方案中，非病毒载体被用于将一个或多个本文考虑的多核苷酸递送至受影响的细胞(例如神经元细胞)中。在一个实施方案中，载体为体外合成或合成制备的编码包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白的mRNA。非病毒载体的说明性实例包括但不限于mRNA、质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒和细菌人工染色体。
载体的说明性实例包括但不限于质粒、自主复制序列和转座元件，例如piggyBac、睡美人(Sleeping Beauty)、Mosl、Tcl/水手(mariner)、Tol2、mini-Tol2，Tc3、MuA、HimarI、青蛙王子(Frog Prince)及其衍生物。载体的另外说明性实例非限制性地包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(比如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或Pl衍生的人工染色体(PAC))、噬菌体(比如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。可用作载体的病毒的说明性实例非限制性地包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多泡病毒(例如SV40)。表达载体的说明性实例包括但不限于用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；用于在哺乳动物细胞中的慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V 5-DESTTM、pLenti6/V 5-DESTTM和pLenti6.2/V 5-GW/lacZ (Invitrogen)。在特定实施方案中，本文公开的多肽的编码序列可被连接到此类表达载体中用于在哺乳动物细胞中表达多肽。
在特定实施方案中，载体为附加型载体或保持在染色体外的载体。如本文使用的，术语“附加型”是指能够在不整合到宿主染色体DNA内的情况下复制且不从分裂的宿主细胞中逐渐丢失的载体，这也意味着所述载体在染色体外或附加体上复制。
载体可包含一个或多个重组位点用于广泛种类的位点特异性重组酶中任何一种。应当理解，位点特异性重组酶的靶位点为除载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)整合所需的任何位点之外的。如本文使用的，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别并结合的特定核酸序列。
例如，Cre重组酶的一个重组位点为loxP，其为34个碱基对的序列，包含两个13个碱基对的反向重复(充当重组酶结合位点)，侧翼为8个碱基对的核心序列(参见Sauer, B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)的图1)。FLP重组酶的合适识别位点包括但不限于：FRT (McLeod等人，1996)，FI、F2、F3 (Schlake和Bode, 1994)，FyFs(Schlake和Bode, 1994)，FRT(LE) (Senecoff等人，1988)，FRT (RE) (Senecoff等人，1988)。
识别序列的其他实例为attB、attP、attL和attR序列，其被重组酶l整合酶(例如phi-c3l)识别。pC3l SSR仅介导异型位点attB (长度34 bp)和attP (长度39 bp)之间的重组(Groth等人，2000)。attB和attP分别以细菌和噬菌体基因组上噬菌体整合酶的附接位点命名，两者均含有可能被φ031同二聚体结合的不完全反向重复(Groth等人，2000)。产物位点attL和attR对进一步的tpQA 1介导的重组为有效惰性的(Belteki等人，2003)，使反应不可逆。对于催化插入，已经发现携带attB的DNA插入到基因组attP位点中比attP位点插入到基因组attB位点中更容易(Thyagarajan等人，2001；Belteki等人，2003)。因此，典型的策略通过同源重组将携带attP的“对接位点”定位到确定的位点中，然后将其与携带attB的进入序列配对以进行插入。
如本文使用的，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入到顺反子(蛋白编码区)的起始密码子(比如ATG)从而导致基因的非帽依赖性翻译的元件。参见例如Jackson等人，1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83)以及Jackson和Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000。在特定实施方案中，载体包括编码一种或多种多肽的一种或多种感兴趣的多核苷酸。在特定实施方案中，为实现多种多肽中每一种的有效翻译，多核苷酸序列可由一个或多个IRES序列或编码自剪切多肽的多核苷酸序列分离。在一个实施方案中，用于本文考虑的多核苷酸的IRES为EMCV IRES。
如本文使用的，术语“Kozak序列”是指极大地促进mRNA与核糖体小亚基的初始结合并增加翻译的短核苷酸序列。(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92，和Kozak, 1987.Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48)。在特定实施方案中，载体包含具有共有Kozak序列并且编码包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白的多核苷酸。指导异源核酸转录物的有效终止和聚腺苷酸化的元件增加异源基因表达。转录终止信号通常发现于聚腺苷酸化信号的下游。在特定实施方案中，载体包含在编码待表达多肽的多核苷酸3’的聚腺苷酸化序列。
适用于本文考虑的特定实施方案的病毒载体系统的说明性实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和牛痘病毒载体。
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)转导细胞，将一种或多种编码包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白的多核苷酸引入到细胞(例如神经元细胞)中。AAV为小型(~26 nm)复制缺陷型的主要为附加型的非包膜病毒。AAV可感染分裂和非分裂细胞两者，并可将其基因组掺入到宿主细胞的基因组中。重组AAV (rAAV)一般至少由转基因及其调控序列以及5’和3’ AAV反向末端重复(ITR)组成。ITR序列长度为约145 bp。在特定实施方案中，rAAV包含从AAV1、AAV2 (描述于例如US6962815B2中，其通过参考以其全部结合至本文中)、AAV3、AAV4、AAV5 (描述于例如US7479554B2中，其通过参考以其全部结合至本文中)、AAV6、AAV7、AAV8 (描述于例如US7282199B2中，其通过参考以其全部结合至本文中)、AAV9 (描述于例如US9737618B2中，其通过参考以其全部结合至本文中)、AAV rh10 (描述于例如US9790472B2中，其通过参考以其全部结合至本文中)或AAV 10中分离的ITR和衣壳序列。在一个实施方案中，将本发明的载体包封到选自AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAV rh10的衣壳中。在一个实施方案中，载体包封于AAV2中。在一个实施方案中，载体被包封于AAV5中。在一个实施方案中，载体被包封于AAV8中。在一个实施方案中，载体被包封于AAV9中。在仍然一个实施方案中，载体被包封于AAV rh10中。
在一些实施方案中，使用嵌合rAAV，ITR序列从一种AAV血清型中分离和衣壳序列从另一种AAV血清型中分离。例如，具有衍生自AAV2的ITR序列和衍生自AAV6的衣壳序列的rAAV被称为AAV2/AAV6。在特定实施方案中，rAAV载体可包含来自AAV2的ITR以及来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中任何一种的衣壳蛋白。在优选的实施方案中，rAAV包含衍生自AAV2的ITR序列和衍生自AAV6的衣壳序列。在优选的实施方案中，rAAV包含衍生自AAV2的ITR序列和衍生自AAV2的衣壳序列。
在一些实施方案中，可将设计改造和选择方法应用于AAV衣壳，以使其更可能转导感兴趣的细胞。
rAAV载体的构建、产生及其纯化已公开于例如美国专利号9,169,494、9,169,492、9,012,224、8,889,641、8,809,058和8,784,799中，其每一个均通过参考以其全部结合至本文中。
IV. 递送
在特定实施方案中，通过非病毒或病毒载体将一种或多种编码包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白的多核苷酸引入到细胞中。特定实施方案中考虑的多核苷酸非病毒递送的说明性方法包括但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质转染、显微注射、生物弹道术、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米粒子、聚阳离子或脂质核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-葡聚糖介导的转移、基因枪和热休克。
特定实施方案中考虑的适用于特定实施方案的多核苷酸递送系统的说明性实例包括但不限于由Amaxa Biosystems、Maxcyte, Inc.、BTX Molecular Delivery Systems和Copernicus Therapeutics Inc提供的那些。脂质转染试剂为商业销售的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。文献中已描述了适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质。参见例如Liu等人，(2003) Gene Therapy. 10: 180-187；和Balazs等人，(20W) Journal of Drug Delivery. 2011 :1-12。在特定实施方案中还考虑抗体靶向的、细菌衍生的、基于无生命纳米细胞的递送。
包含特定实施方案中考虑的多核苷酸的病毒载体可通过给予单个患者，一般通过全身给予(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)，通过鞘内注射、脑室内注射或局部施用而体内递送，如下所述。或者，载体可离体递送至细胞，比如移植自单个患者(例如动员外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)的细胞或全适供体造血干细胞，然后将细胞重新植入患者体内。
在一个实施方案中，将包含编码本文公开的融合蛋白的多核苷酸的病毒载体直接给予生物体以用于体内细胞转导。
适当地包装和配制的病毒载体可经鞘内递送而被递送到中枢神经系统(CNS)中。例如，腺相关病毒载体可使用美国序列号15/771,481中描述的方法来递送，所述专利通过参考以其全部结合至本文中。
或者，可给予裸DNA。给予通过通常用于使分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。给予此类核酸的合适方法对本领域技术人员为可得且众所周知的，而且尽管可使用多于一种途径来给予特定组合物，但特定途径通常能提供比另一种途径更直接和更有效的反应。
在各种实施方案中，通过将用包含一种或多种多核苷酸的逆转录病毒(例如慢病毒)转导细胞，将一种或多种编码本文公开的融合蛋白的多核苷酸引入到细胞，例如神经元细胞或神经元干细胞中。如本文使用的，术语“逆转录病毒”是指一种RNA病毒，其将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝，并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适用于特定实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)以及慢病毒。如本文使用的，术语“慢病毒”是指一组(或属)复杂逆转录病毒。说明性的慢病毒包括但不限于：HIV (人类免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)；梅迪-维斯纳病毒(VMV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施方案中，基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)为优选的。
由于修饰LTR，慢病毒载体优选地含有几个安全性增强。“自失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如，其中被称为U3区的右侧(3’) LTR增强子-启动子区已被修饰(例如通过缺失或取代)以防止超出第一轮病毒复制的病毒转录。通过用异源启动子替换5’LTR的U3区以在病毒粒子产生期间驱动病毒基因组的转录，来提供另外的安全性增强。可使用的异源启动子的实例包括例如病毒性猿猴病毒40 (SV40) (例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV) (例如立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)启动子。在某些实施方案中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如Kutner等人，BMC Biotechnol. 2009; 9:10.doi: 10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，Nat. Protoc. 2009; 4(4):495-505. doi: l0.l038/nprot.2009.22。
根据本文考虑的某些具体实施方案，大多数或所有病毒载体骨架序列衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解，可使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可容纳某些慢病毒序列中的许多取代和改变而不损害转移载体执行本文描述的功能的能力。此外，本领域已知多种慢病毒载体，参见Naldini等人，(l996a、l996b和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998；美国专利号6,013,516和5,994,136，其中许多可进行修改以产生本文考虑的病毒载体或转移质粒。
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的腺病毒转导细胞，将一种或多种编码本文公开的融合蛋白的多核苷酸引入到靶细胞中。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，并且不需要细胞分裂。用此类载体，已经得到高滴度和高表达水平。这种载体可在相对简单的系统中大量产生。大多数腺病毒载体被设计改造，使得转基因替换Ad Ela、Elb和/或E3基因；随后复制缺陷型载体在反式提供缺失基因功能的人类293细胞中繁殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织，包括非分裂的分化细胞，比如在肝脏、肾脏和肌肉中发现的那些。常规Ad载体具有大的携带能力。
复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可利用被定名为293的独特辅助细胞系，其通过Ad5 DNA片段从人胚肾细胞转化并组成性地表达E1蛋白(Graham等人，1977)。由于E3区在腺病毒基因组中并非必要的(Jones & Shenk, 1978)，因此当前的腺病毒载体借助于293细胞在E1、D3或两个区中携带外源DNA (Graham & Prevec, 1991)。腺病毒载体已被用于真核基因表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus &Horwitz, 1992；Graham & Prevec, 1992)。将重组腺病毒给予不同组织方面的研究包括气管滴注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、外周静脉内注射(Herz & Gerard, 1993)以及脑内立体定位接种(Le Gal La Salle等人，1993)。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于伴随肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等人，Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998))。
在各种实施方案中，一种或多种编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过用包含该一种或多种多核苷酸的单纯疱疹病毒(例如HSV-l、HSV-2)转导细胞而被引入到受试者的靶细胞中。
成熟HSV病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，其中病毒基因组由152 kb的线性双链DNA分子组成。在一个实施方案中，基于HSV的病毒载体在一个或多个必需或非必需HSV基因中存在缺陷。在一个实施方案中，基于HSV的病毒载体为复制缺陷的。大多数复制缺陷的HSV载体含有缺失以去除一个或多个立即早期、早期或晚期HSV基因从而防止复制。例如，HSV载体可能在选自以下的立即早期基因中存在缺陷：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其组合。HSV载体的优点为其进入可导致长期DNA表达的潜伏期的能力以及其可容纳至高25 kb的外源性DNA插入物的大型病毒DNA基因组。基于HSV的载体描述于例如美国专利号5,837,532、5,846,782和5,804,413以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO99/06583中，其每一个均通过参考以其全部结合至本文中。
V. 表达融合蛋白的细胞
在又另一方面，本发明提供表达本文描述的融合蛋白的细胞。细胞可用编码如上文描述的融合蛋白的载体进行转染。在一个实施方案中，细胞为原核细胞。在另一个实施方案中，细胞为真核细胞。在仍然另一个实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一个特定实施方案中，细胞为人类细胞。在另一个实施方案中，细胞为源于患有多聚谷氨酰胺重复障碍或处于患有多聚谷氨酰胺重复障碍风险下的患者的人类细胞。细胞可为神经元细胞或肌细胞。
表达融合蛋白的细胞可用于产生融合蛋白。在该实施方案中，用过度表达融合蛋白的载体转染细胞。融合蛋白可任选地含有表位，例如如上文描述的人类Fc结构域或FLAG表位，这将促进纯化(分别使用蛋白A-或抗FLAG抗体柱)。表位可经接头或蛋白酶底物序列连接于融合蛋白的其余部分，使得在纯化期间或之后，表位可从融合蛋白中去除。
表达融合蛋白的细胞也可用于治疗环境。在一个实施方案中，细胞采集自需要疗法的患者(例如患有多聚谷氨酰胺重复障碍或处于患有多聚谷氨酰胺重复障碍风险下的患者)。在一个实施方案中，细胞为神经元细胞。然后用表达融合蛋白的载体转染采集的细胞。然后可处理转染细胞以富集或选择转染的细胞。转染的细胞也可进行处理以分化成不同类型的细胞，例如神经元细胞。处理之后，可将转染细胞给予患者。在一个实施方案中，通过经鞘内注射、颅内注射或脑室内注射将细胞直接注射到中枢神经系统中来给予。
在备选实施方案中，可使用表达融合蛋白分泌形式的细胞。例如，融合蛋白构建体可设计为在N-末端具有信号序列。代表性的信号序列显示于以下表6中。
表6：代表性的信号序列
SEQ ID NO: 序列
159 MGVKVLFALICIAVAEA
160 MAPVQLLGLLVLFLPAMRC
161 MAVLGLLFCLVTFPSCVLS
因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含信号序列和融合蛋白，其中信号序列选自SEQ ID NO: 159-161，而融合蛋白选自SEQ ID NO: 89-158。在另一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 116的信号序列，并且融合蛋白选自SEQ ID NO: 89-158。可将表达具有信号序列的融合蛋白构建体的细胞给予受试者，例如人类受试者(例如患有患有多聚谷氨酰胺重复障碍或处于其风险下的患者)。融合蛋白由细胞分泌，助于减少含有多聚谷氨酰胺重复的蛋白的聚集和/或相关细胞毒性。
如上文所述，在某些实施方案中，融合蛋白可进一步包含细胞穿透肽。表达包含信号序列和细胞穿透肽的融合蛋白的细胞将能够分泌没有信号序列的融合蛋白。还包含细胞穿透肽的分泌性融合蛋白然后将能够进入附近的细胞，并且可能减少在那些细胞中由多聚谷氨酰胺重复蛋白介导的聚集和/或细胞毒性。
VI. 使用方法
在另一方面，本发明提供一种方法，用于在障碍中和/或在由多聚谷氨酰胺重复相关蛋白的聚集介导的多聚谷氨酰胺重复疾病、障碍或病症中实现有益效果。多聚谷氨酰胺重复疾病选自亨廷顿病、1型SCA、2型SCA、6型SCA、7型SCA、17型SCA、MJD/SCA3、DRPLA和SBMA。在一个实施方案中，多聚谷氨酰胺重复疾病为亨廷顿病。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有多聚谷氨酰胺重复疾病、障碍或病症的诸如人类等受试者的方法，包括给予受试者治疗或预防有效量的融合蛋白、编码此类融合蛋白的核酸或编码本文描述的此类融合蛋白的病毒载体的步骤，其中所述给予导致与多聚谷氨酰胺重复疾病、障碍或病症相关的一个或多个生化或生理参数或临床终点的改善。
在其他实施方案中，本发明提供减少含有多聚谷氨酰胺的蛋白在细胞中聚集的方法。细胞可为培养细胞或分离细胞。细胞也可来自受试者，例如人类受试者。在一个实施方案中，细胞位于人类受试者的中枢神经系统中。在另一个实施方案中，人类受试者患有包括但不限于以下的多聚谷氨酰胺重复疾病或处于患有其的风险下：亨廷顿病、1型SCA、2型SCA、6型SCA、7型SCA、17型SCA、MJD/SCA3、DRPLA和SBMA。
可以多种方式检测含有多聚谷氨酰胺的蛋白的聚集。在一个实例中，聚集的含有多聚谷氨酰胺的蛋白可基于溶解性区别于游离的(即可溶的)含有多聚谷氨酰胺的蛋白，例如通过将细胞裂解物选择性通过过滤器捕集不溶性聚集物。非聚集的蛋白通过这些过滤器，而聚集物将保留在过滤器上，这可使用任何数量的试剂(包括针对含有多聚谷氨酰胺的蛋白的抗体)进行检测。用如本文所述的融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸、载体或病毒粒子处理的细胞样品裂解物中捕集的聚集蛋白的量可与来自未处理或对照处理的细胞的裂解物进行比较，其中当与对照样品相比较时，处理样品中聚集的含有多聚谷氨酰胺的蛋白的量减少指示融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸、载体或病毒粒子的功效(参见例如Kim等人，(2014) Mol. Cell. Biol., 34: 643-652和实施例1)。当与对照组相比较时，聚集的含有多聚谷氨酰胺的蛋白减少更大指示效力更高。含有多聚谷氨酰胺的蛋白的聚集减少也可在细胞中直接进行检测，例如用检测含有多聚谷氨酰胺的蛋白的标记的试剂，使用免疫荧光显微术(参见例如Difiglia等人，(1997) Science, 277: 1990-1993和实施例1)。例如，在亨廷顿病患者的HD皮质和纹状体中发现突变(多聚谷氨酰胺扩展的)亨廷顿蛋白局限于神经元包涵体和营养障碍性神经突起。
因此，在一个实施方案中，方法包括使细胞接触一定量的融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸、载体或病毒粒子，其在与未处理或对照细胞相比较时有效减少含有多聚谷氨酰胺的蛋白的聚集至少10%，例如至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%。
在又另一个方面，本文描述的组合物可被用于减少与选自ALS、FTD、帕金森病、亨廷顿病、阿尔兹海默病、海马硬化和路易体痴呆的疾病相关的蛋白聚集的方法。如实施例部分所述，本文描述的许多构建体已进行体外测试并且发现可减少与这些疾病相关的突变形式TDP-43和SOD1的病理聚集。因此，在一个实施方案中，方法包括使细胞接触一定量的融合蛋白、编码本文描述的融合蛋白的核酸、载体或病毒粒子，其在与未治疗或对照细胞相比较时可有效减少TDP-43的聚集至少10%，例如至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%。在另一个实施方案中，提供减少SOD1聚集的方法：方法包括使细胞接触一定量的融合蛋白、编码本文描述的融合蛋白的核酸、载体或病毒粒子，其在与未处理或对照细胞相比较时可有效减少SOD1的聚集至少10%，例如至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%。
VII. 药用组合物
本文考虑的组合物可包含一种或多种含有J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白、编码此类融合蛋白的多核苷酸、包含它的载体、基因修饰细胞等，如本文所考虑的。组合物包括但不限于药用组合物。“药用组合物”是指以药学上可接受或生理上可接受的溶液配制的用于单独或者与一种或多种其他治疗方式组合地给予细胞或动物的组合物。还将理解的是，如果需要，组合物也可与其他药剂组合给予，所述其他药剂比如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学疗法、前药、药物、抗体或其他各种药用活性剂。组合物中还可包括的其他成分几乎没有限制，条件是该另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。
本文中采用短语“药学上可接受的”来指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文使用的，“药学上可接受的载剂”、“稀释剂”或“赋形剂”非限制性地包括任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂，其已由美国食品药品监督管理局批准为可用于人类或家养动物。示例性的药学上可接受的载剂包括但不限于糖类，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、石蜡、动物和植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油类，比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，比如丙二醇；多元醇类，比如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药用制剂中采用的任何其他相容性物质。
VIII. 剂量
本文描述的组合物(例如包括融合蛋白构建体、核酸或基因疗法病毒粒子的组合物)的剂量可根据许多因素而变化，所述因素比如化合物的药效学特性；给予模式；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；治疗的频率和同时治疗的类型(如果存在的话)；以及化合物在待治疗动物中的清除率。本文描述的组合物最初可以合适的剂量进行给予，所述合适的剂量可根据临床反应根据需要调整。在一些方面，组合物的剂量为预防或治疗有效的量。
IX. 试剂盒
考虑包括以下的试剂盒：(a) 药用组合物，包括融合蛋白构建体、编码此类融合蛋白的核酸或包括此类核酸的病毒粒子，其减少多聚谷氨酰胺重复蛋白在本文描述的细胞或受试者中的聚集，和(b) 具有实施本文描述的任何方法的说明的包装插页。在一些方面，试剂盒包括(a) 药用组合物，包括本文描述的减少多聚谷氨酰胺重复蛋白在本文描述的细胞或受试者中聚集的组成，(b) 另外的治疗剂，和(c) 具有实施本文描述的任何方法的说明的包装插页。
实施例
为测试J结构域是否可特异性地设计改造以促进聚合蛋白的正确折叠，我们设计并测试了许多被设计来靶向HTT蛋白中的多聚谷氨酰胺重复的融合蛋白构建体。
实施例1：融合蛋白设计
A. 方法
一般技术和材料
除非另外表明，否则本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，其处于本领域技术的范围内。参见Sambrook, J.等人，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,”第3版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2001；“Current protocols in molecular biology”, F. M.Ausubel等人编, 1987；“Methods in Enzymology”系列，Academic Press, San Diego,Calif.；“PCR 2: a practical approach”, M. J. MacPherson, B. D. Hames和G. R.Taylor编, Oxford University Press, 1995；“Antibodies, a laboratory manual”Harlow, E.和Lane, D.编, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；“Goodman &Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,”第11版, McGraw-Hill,2005；和Freshney, R. I., “Culture of Animal Cells: A Manual of BasicTechnique,”第4版, John Wiley & Sons, Somerset, N J, 2000，其内容通过参考以其全部结合至本文中。HEK-293细胞(人胚胎肾细胞)购自American Type Culture Collection(Manassas, VA)。抗FLAG抗体购自Thermo Fisher Scientific。兔抗GFP抗体购自GenScripts (Piscataway, NJ)。为便于纯化、检测和表征，这些实施例中使用的一些融合蛋白构建体除了以SEQ ID NO: 89-158提供的序列之外，还可含有接头序列和/或表位，比如蛋白C-末端的SEQ ID NO:163的FLAG表位。
HEK293细胞中蛋白的表达和检测
用Lipofectamine 3000转染试剂(Thermo Fisher Scientific)将编码各种蛋白构建体的表达载体质粒转染到HEK293细胞中。使用免疫印迹测定分析细胞裂解物的表达蛋白。在分析之前，将培养基样品离心以去除碎片。细胞在含有2 mM PMSF和蛋白酶混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail; Sigma)的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS)中裂解。短暂声处理之后，使用免疫印迹测定分析样品的表达蛋白。对于免疫印迹分析，样品在SDS-样品缓冲液中煮沸，并在聚丙烯酰胺电泳上运行。之后，将分离的蛋白泳带转移至PVDF膜上。
使用化学发光信号检测表达蛋白。简言之，印迹与能够结合特定表位(例如GFP)的一级抗体反应。在冲洗掉未反应的一级抗体之后，使得二级酶联抗体(例如HRP连接的抗IgG抗体)与结合于印迹的一级抗体分子反应。冲洗后，加入化学发光试剂，并在X射线胶片上捕获印迹中产生的化学发光信号。
过滤捕集测定
将用GFP-HTT(Q23)或GFP-HTT(Q74)转染的HEK293细胞在SDS-裂解缓冲液(10 mMTris, pH8.0, 150 mM NaCl, 2% SDS)中均质化。短暂声处理之后，通过BCA测定试剂盒(Pierce)测量蛋白浓度。将等量的蛋白在过滤捕集装置中于负压下施用于0.22 um醋酸纤维素膜上。膜洗涤之后，使用抗GFP抗体通过免疫印迹测定检测捕集蛋白(聚集蛋白)。
荧光显微术
在一些情况下，使用荧光显微术体内检测含有多聚谷氨酰胺的GFP报告构建体(如下所述)的聚集。将表达报告构建体以及包含J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白的培养细胞用PBS洗涤，并用PBS中的4%多聚甲醛固定5分钟。在用PBS洗涤3次5分钟之后，用DAPI染色核DNA。计数转染细胞中含有mHtt聚集物(GFP焦点)的细胞的百分比。
B. 报告构建体
为测试各种融合蛋白构建体减少含有多聚谷氨酰胺的蛋白的聚集的能力，产生了表达基于GFP的报告构建体的HEK293细胞。
培养HEK293细胞并用编码报告构建体GFP-HTT Q23或GFP-HTT Q74的质粒转染该细胞，所述质粒含有HTT外显子1内的氨基酸，分别具有23个或74个polyQ的段，经13个氨基酸的接头与GFP的C-末端融合，如以下表7所示。
具有修饰的多克隆位点(MCS)的pcDNA3 (Life Technologies, Grand Island,NY)被用作骨架质粒。编码蛋白序列的DNA分子通过聚合酶链式反应(PCR)、基因合成或标准方案的互补DNA分子退火得到。合成编码HTT(Q23)和HTT(Q74)的氨基酸序列的DNA分子(BioBasic, Canada)。通过使由标准方法合成的互补单链退火，得到具有分别编码甘氨酸-丝氨酸接头序列(GGGGSGGGGSGGGGS)和刚性接头序列(AEAAAKEAAAK)的DNA序列GGAGGCGGAGGCAGTGGTGGTGGGGGAAGCGGTGGAGGTGGAAGC和GCCGAGGCGGCGGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAG的DNA分子。将编码相应接头的cDNA序列插入到骨架质粒中。
表7：HTT报告构建体
Figure DEST_PATH_IMAGE042
C. 融合蛋白构建体
i. 结构域排列
为确定融合蛋白的最佳配置，产生几种融合蛋白构建体，其包含源于人类Hsp40的J结构域序列(DnaJB1，或SEQ ID NO: 5)和多聚谷氨酰胺结合肽1 (QBP1，一种11 aa的合成肽(SEQ ID NO:57))，所述QBP1通过组合筛选方法鉴定其与扩展的polyQ段但不与正常HTT32中存在的polyQ基序结合的特异性结合亲和力。设计了许多初始融合蛋白构建体(SEQ IDNO: 89-93)，改变QBP1相对于J结构域的位置(即附接于J结构域的N-末端或C-末端，有或没有任选的接头)。被命名为JB1-QBP1 (构建体2，SEQ ID NO: 90)和QBP1- jb1 (构建体3，SEQ ID NO: 91)的两个构建体均含有经短接头序列分别附接于来自人类DnaJB1的J结构域(SEQ ID NO: 5)的C-末端和N-末端的单个QBP1 (SEQ ID NO: 57)。将编码这些融合蛋白构建体的载体与以上描述的报告构建体一起转染到细胞中。如使用过滤捕集测定确定的，这些构建体的蛋白聚集程度与表达单独的短多聚谷氨酰胺重复(GFP-HTTQ23)报告构建体的细胞、单独的长重复(GFP-HTTQ74)报告基因以及表达长重复报告基因和包含来自人类DnaJB1的J结构域但没有多聚谷氨酰胺结合结构域的构建体(构建体1，SEQ ID NO: 89)的细胞的那些进行比较。如图3所示的还有以下表8中所概述的，正如预期的那样，当使用过滤捕集测定进行测量时，长重复(GFP-HTTQ74)报告基因显示出比GFP-HTTQ23报告基因更高的聚集水平。通过DnaJB1对照构建体的共表达并没有减少可检测的聚集。然而，与JB1-QBP1(构建体2)或QBP1-JB1 (构建体3)共表达分别导致对照聚集水平的76%和67%。
表8：融合蛋白构建体在减少聚集中的相对活性
报告基因 融合蛋白构建体编号(SEQ ID NO:) 构建体名称 %聚集(相对于单独的Q74)
GFP 无 无 0%
GFP-HTTQ23 无 无 6.65%
GFP-HTTQ74 无 无 100%
GFP-HTTQ74 1 (89) 仅JB1 126.69%
GFP-HTTQ74 2 (90) JB1-QBP1 75.87%
GFP-HTTQ74 3 (91) QBP1-JB1 67.47%
GFP-HTTQ74 4 (92) JB1-2XQBP1 9.86%
GFP-HTTQ74 5 (93) JB1-3XQBP1 41.11%
GFP-HTTQ74 6 (94) QBP1-JB1-QBP1 5.62%
GFP-HTTQ74 7 (95) QBP1-JB1-2XQBP1 22.99%
还通过荧光显微术观察表达报告构建体的细胞。我们发现GFP-HTTQ74造成明显的核内含体(图6a)，而表达GFP-HTTQ23报告构建体的细胞的GFP荧光遍及细胞质分布更广泛(图6b)，与先前报道的结果一致。当我们将GFP-HTTQ74与融合蛋白构建体4 (JB1-2XQBP1)共表达时，我们观察到大多数聚集消失(图6c)。为消除假象的可能性，我们在J结构域的“HPD”序列中插入点突变作为阴性对照。如以下第iii部分所述，通过过滤捕集测定发现所得构建体8 (JB1(P33Q)-2XQBP1，SEQ ID NO: 96)几乎没有减少聚集的能力。共表达构建体8对GFP-HTTQ74的分布没有影响，明显的核内含体与没有融合蛋白构建体的GFP-HTTQ74对照无法区别的(图6d，与6a相比较)。此外，这种效应似乎对扩展的HTT具有特异性，因为共表达仅含有DnaJB1 J结构域而没有多聚谷氨酰胺结合结构域的构建体1对减少聚集没有影响(未显示)。先前的研究已表明，由与QBP1融合的CMA肽组成的融合蛋白在体外选择性降解突变HTT蛋白中有效(Bauer等人，(2010) Nat. Biotech. 28, 256-263)。为测试这些构建体是否具有类似活性，我们产生了与QBP1肽的一个或两个串联拷贝融合的CMA肽。然而，使用过滤捕集测定，基于CMA的肽未能显示出明显的HTT聚集减少(数据未显示)。
ii. 多种多聚谷氨酰胺结合蛋白
产生以下另外的构建体并测试其减少HTTQ74报告构建体聚集的能力(参见图2)：
• 构建体4 (SEQ ID NO: 92)，其包含附接于DnaJB1 J结构域C-末端的QBP1的两个串联重复；
• 构建体5 (SEQ ID NO: 93)，其包含附接于DnaJB1 J结构域C-末端的QBP1的三个串联重复；
• 构建体6 (SEQ ID NO: 94)，其包含被QBP1夹在任一侧上的DnaJB1 J结构域；和
• 构建体7 (SEQ ID NO: 95)，呈QBP1-DnaJB1-QBP1-QBP1排列的DnaJB1 J结构域和QBP1的三个拷贝。
如图3所示，所有含有至少两个拷贝的多聚谷氨酰胺结合结构域的融合蛋白构建体均导致聚集减少。构建体4、5、6和7均能够将聚集减少至少50%，且构建体4和6能够将聚集减少至少90%。
iii. J结构域内的要求
出于增强蛋白分泌和表达的目的，本发明人先前的实验采用J结构域融合蛋白(Hishiya & Koya (2017) Sci Rep., 7:8531)。在该项研究中，确定含有位于螺旋II内短至11个氨基酸的J结构域片段的融合蛋白构建体可赋予增强的靶蛋白的分泌和总体表达。为确定本融合蛋白构建体中的J结构域减少非分泌性、细胞毒性含有多聚谷氨酰胺重复的蛋白的细胞毒性和/或聚集的要求是否与早先的观察结果相似，产生了构建体8-14并再次使用过滤捕集测定和GTP-HTTQ74作为报告构建体测试其减少聚集的能力。如图4还有以下表9所示，在保守的HPD基序中使脯氨酸突变(构建体8)极大地降低该构建体减少聚集的能力(仅减少7%，与相应的野生型构建体(构建体4，JB1-2XQBP1)减少大于70%相比较)。
令人惊讶的是，3个含有N-末端缺失但包括10个氨基酸延伸的缺失构建体(构建体9、10和11)均具有最小的减少聚集能力(均小于10%，与相应的构建体4减少大于70%相比较)。因此，当J结构域反式提供时，其功能似乎显著不同于由直接与感兴趣的蛋白融合的J结构域所发挥的作用。
表9：具有改变的J结构域的融合蛋白构建体在减少聚集中的相对活性
Figure DEST_PATH_IMAGE044
构建体12具有J结构域的C-末端截短，开始螺旋IV，被发现将聚集减少至少60%。最后，含有来自DnaJB1的33个另外氨基酸(在J结构域之后)的融合蛋白构建体被发现具有与JB1-2XQBP1(构建体4) (70.3%)等同的聚集减少的水平(68%)。
这些结果表明，本融合蛋白构建体中对J结构域减少非分泌性、含有多聚谷氨酰胺重复的蛋白的聚集的结构要求显著不同于先前研究中所测试的增强蛋白分泌和/或表达的那些，表明本融合蛋白构建体的作用机制不同于早先研究的那些。
iv. 接头的作用
迄今为止，在该实施例1中描述的大多数融合蛋白构建体均在J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域之间含有柔性接头(G4S)4。为测试该接头的重要性和/或必要性，产生了以下两种另外的构建体：
• 构建体15，JB1-2XQBP1 (无柔性接头)，类似于JB1-2XQBP1 (构建体4)，但(G4S)4接头被去除；
• 构建体16，JB1-2XQBP1 (刚性接头)，也类似于JB1-2XQBP1 (构建体4)，但(G4S)4接头被替换为更短的刚性接头。
如图5还有以下表10所示，J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域之间接头的改变对融合构建体减少GFP-HTTQ74报告构建体聚集的能力影响甚小，所有三种构建体均显示减少至少75%。
表10：具有改变的接头的融合蛋白构建体的相对活性
Figure DEST_PATH_IMAGE046
v. 不同J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域的使用
产生了另外的构建体进行测试，以确定包含其他J结构域的融合蛋白构建体是否能够减少聚集。以下表11列出所产生的多种构建体以测试不同接头对JB1-QBP1-QBP1构建体的功效的影响：
表11：JB1-QBP1-QBP1构建体的优化
构建体编号 SEQ ID NO: 构建体名称 描述 聚集的减少(%)
4 92 JB1-2XQBP1 JB1-长柔性-QBP1-QBP1 24.86%
34 122 JB1-QBP1-QBP1 (1) JB1-长柔性-QBP1-Flag-QBP1 96.34
35 123 JB1-QBP1-QBP1 (2) JB1-QBP1-刚性-QBP1 97.94
36 124 JB1-QBP1-QBP1 (3) JB1-QBP1-柔性-QBP1 95.70
37 125 JB1-QBP1-QBP1 (4) JB1-柔性-QBP1-刚性-QBP1 96.95
38 126 JB1-QBP1-QBP1 (5) JB1-柔性-QBP1-柔性-QBP1 96.94
39 127 JB1-QBP1-QBP1 (6) JB1-刚性-QBP1-刚性-QBP1 98.09
40 128 JB1-QBP1-QBP1 (7) JB1-刚性-QBP1-柔性-QBP1 95.98
41 129 JB1-QBP1-QBP1 (8) JB1-刚性-QBP1-刚性-QBP1 91.07
42 130 JB1-QBP1-QBP1 (9) JB1-刚性-QBP1-柔性-QBP1 86.96
43 131 JB1-QBP1-QBP1 (10) JB1-QBP1-长柔性-QBP1 99.45
44 132 JB1-QBP1-QBP1 (11) JB1-QBP1-长刚性-QBP1 99.63
45 133 JB1-QBP1-QBP1 (12) JB1-柔性-QBP1-长柔性-QBP1 91.13
46 134 JB1-QBP1-QBP1 (13) JB1-柔性-QBP1-长刚性-QBP1 100
47 135 JB1-QBP1-QBP1 (14) JB1-刚性-QBP1-长柔性-QBP1 99.65
48 136 JB1-QBP1-QBP1 (15) JB1-刚性-QBP1-长刚性-QBP1 100
49 137 JB1-QBP1-QBP1 (16) JB1-长柔性-QBP1-柔性-QBP1 82.54
50 138 JB1-QBP1-QBP1 (17) JB1-长柔性-QBP1-刚性-QBP1 90.93
51 139 JB1-QBP1-QBP1 (18) JB1-QBP1-柔性-QBP1 96.55
52 140 JB1-QBP1-QBP1 (19) JB1-柔性-QBP1-柔性-QBP1 96.87
53 141 Flag-QBP1-JB1-QBP1-Flag 79.86
54 142 QBP1-JB1-QBP1 (1) 0
55 143 QBP1-JB1-QBP1 (2) 9.45
56 144 JB1-JB1-QBP1 68.55
57 145 JB1-QBP1-JB1-QBP1 94.12
构建体JB1-QBP1-QBP1 (1) - JB1-QBP1-QBP1 (15) (构建体34-48)与HTTQ74报告构建体一起在细胞中共表达，并使用过滤捕集测定确定减少蛋白聚集的能力。如表11所示，发现大多数构建体有效地减少蛋白聚集，活性与构建体4 (JB1-2XQBP1)大致类似。
产生以下表12中提供的多种另外构建体，以测试其他J结构域序列在与多聚谷氨酰胺结合结构域融合时是否能够减少蛋白聚集，并与JB1-QBP1-QBP1 (1) (构建体34)的功效相比较。
表12. 产生的具有不同J结构域的融合蛋白的功效
Figure DEST_PATH_IMAGE048
如表12所示，在表达HTTQ74报告构建体的细胞中共表达构建体58、60、61和63均导致蛋白聚集显著减少，其水平与基于DNA J1的构建体类似，表明多种J结构域能够形成活性融合蛋白。
包括构建体17-31 (SEQ ID NO: 105-119)在内的另外构建体被设计为具有如以下表13中提供的不同J结构域和/或多聚谷氨酰胺结合结构域。
表13：具有改变的J结构域和/或多聚谷氨酰胺结合结构域的构建体
构建体编号 SEQ ID NO: 构建体名称 J结构域 PolyQ结合结构域 # PolyQ结构域
17 105 JB2-2XQBP1 DnaJB2 QBP1 2
18 106 JB6-2XQBP1 DnaJB6 QBP1 2
19 107 JC6-2XQBP1 DnaJC6 QBP1 2
20 108 JB1-2XQBP2 DnaJB1 QBP2 2
21 109 JB1-scFv(MW1) DnaJB1 scFv(MW1) 1
22 110 JB1-polyQ(25) DnaJB1 polyQ(25) 1
23 111 JB2-2XQBP2 DnaJB2 QBP2 2
24 112 JB6-2XQBP2 DnaJB6 QBP2 2
25 113 JC6-2XQBP2 DnaJC6 QBP2 2
26 114 JB2-scFv(MW1) DnaJB2 scFv(MW1) 1
27 115 JB6-scFv(MW1) DnaJB6 scFv(MW1) 1
28 116 JC6-scFv(MW1) DnaJC6 scFv(MW1) 1
29 117 JB2-polyQ(25) DnaJB2 polyQ(25) 1
30 118 JB6-polyQ(25) DnaJB6 polyQ(25) 1
31 119 JC6-polyQ(25) DnaJC6 polyQ(25) 1
vi. 测试聚集相关细胞毒性的降低
我们接下来测试除可检测的蛋白聚集减少之外，我们是否还可检测通常与蛋白错误折叠和/或聚集相关的细胞毒性降低。在U-87 MG胶质瘤细胞系中评价构建体34 (JB1-QBP1-QBP1(1)，SEQ ID NO: 122)对mtHTT蛋白细胞毒性的能力。经慢病毒转染在有或没有构建体34的情况下表达c-myc标记的HTT ex1片段的野生型或突变体。与以上结果一致，JB1-QBP1-QBP1 (1) (构建体34)强烈地抑制聚集形成(参见图8A)。尽管mtHTT在HEK293细胞中没有诱导显著的细胞毒性(数据未显示)，但在U-87 MG细胞中观察到由mtHTT (含有74个重复)而不是正常HTT (含有23个重复)引起的细胞毒性效应，如通过LDH-CytotoxTM测定试剂盒(BioLegend, San Diego, CA, USA)测量的感染之后7天从U87-MG细胞中采集的培养基中LDH活性增加所证明的(图8B) (数值表示平均值±SD。*p < 0.05)。与JB1-QBP1-QBP1 (1) (构建体34)共表达强烈地抑制mtHTT的细胞毒性效应。这些结果表明，J结构域融合蛋白不仅能够减少蛋白错误折叠和/或聚集，而且能够减少与蛋白错误折叠和/或聚集相关的细胞毒性。
vii. 构建体在减少其他蛋白聚集方面的测试
我们接下来测试多种构建体以确定其是否能够减少聚集和/或消除其他疾病蛋白。培养HEK293细胞，并用编码TDP-43全长(FL)或TDP-43CTF (208-414)作为GFP融合体(GFP-TDP-43FL或GFP-TDP-43CTF)的质粒将其转染。在一些研究中，在HEK293细胞中表达核定位信号中具有突变(三个氨基酸的序列82KRK84被AAA取代)的c-myc标记的TDP-43 FL或TDP-43。当构建体53 (Flag-QBP1-JB1-QBP1-Flag，SEQ ID NO: 141)在也表达致病形式的TDP-43的细胞中共表达时，当与在保守的HPD结构域内具有点突变的同伴对照相比较，发现聚合倾向的TDP-43报告基因的总量大大地减少(数据未显示)。包含DNA J结构域和QBP1的另外构建体也有效降低致病性TDP-43，所述构建体包括JB1-QBP1 (构建体2)、JB1-2XQBP1(构建体4)、JB1-JB1-QBP1 (构建体56)、JB1-QBP1-JB1-QBP1 (构建体57)、JB1QBP1 (1)(构建体编号64)、JB1QBP1 (2) (构建体编号65)、JB1QBP1 (3) (构建体编号66)、JB1QBP1(4) (构建体编号67)、JB1QBP1 (5) (构建体编号68)、JB1QBP1 (6) (构建体编号69)和JB1QBP1 (7) (构建体编号70) (参见以下表14)：
构建体编号 SEQ ID NO: 构建体名称 描述 聚集的减少(%)
64 90 JB1-QBP1 JB1-长柔性-QBP1 32.90
65 153 JB1QBP1 (2) JB1-QBP1 23.32
66 154 JB1QBP1 (3) JB1-柔性-QBP1 24.81
67 155 JB1QBP1 (4) JB1-刚性-QBP1 42.76
68 156 JB1QBP1 (5) JB1-QBP1 73.70
69 157 JB1QBP1 (6) JB1-柔性-QBP1 74.76
70 158 JB1QBP1 (7) JB1-刚性-QBP1 70.15
进行进一步测试以确定融合蛋白构建体是否能够减少SOD1的诱变形式的聚集，这也与诸如ALS等疾病有关。再次地，发现JB1-QBP1而不是保守HPD结构域中含有点突变的同伴对照的共表达降低SOD1的G85R和G93A变体的水平(数据未显示)。以下构建体：JB1QBP1(1) (构建体编号64)、JB1QBP1 (2) (构建体编号65)、JB1QBP1 (3) (构建体编号66)、JB1QBP1 (4) (构建体编号67)、JB1QBP1 (5) (构建体编号68)、JB1QBP1 (6) (构建体编号69)和JB1QBP1 (7) (构建体编号70)，也被发现降低SOD1的诱变变体(G85R)的水平(数据未显示)。因此，我们得出结论，本文描述的融合蛋白不仅能够减少含多聚谷氨酰胺的蛋白的致病性聚集，而且还可用于减少与蛋白聚集障碍有关的多种蛋白的聚集，所述障碍比如ALS、FTD、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、海马硬化和路易体痴呆。
实施例2：编码融合蛋白构建体的AAV载体
示例性的基因疗法载体由AAV9载体构建，其携带编码表5的融合蛋白构建体(特别是构建体2、4、6、7、17和20-31)以及对照构建体1 (仅DnaJB1 J结构域)、GFP (阴性对照)的密码子优化的cDNA，处于CAG启动子的控制下，含有巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白增强子。编码JB1-2XQBP1的cDNA位于Kozak序列的下游，并通过牛生长激素聚腺苷酸化(BGHpA)信号进行聚腺苷酸化。整个盒的侧翼为AAV-2的两个非编码末端反向序列。
将编码构建体53 (Flag-QBP1-JB1-QBP1-Flag，SEQ ID NO: 141)的由强组成型合成CAG启动子(CMV增强子、启动子、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体，如Okabe等人所述，同前)驱动的核酸盒置于AAV载体中，并包封到AAV rh10衣壳中。将没有任何插入物的同伴对照构建体也包封到AAV rh10中。
重组AAV载体使用类似于以上描述的杆状病毒表达系统进行制备(Urabe等人，2002；Unzu等人，2011 (在Kotin, 2011年中综述)。简言之，3种重组杆状病毒(一种编码REP用于复制和包装、一种编码CAP-5用于AAV9的衣壳以及一种具有表达盒)被用于感染SF9昆虫细胞。使用AVB Sepharose高速亲和介质(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway,NJ)进行纯化。将载体用引物-探针组合使用QPCR对转基因进行滴定，并且将滴度表示为每ml的基因组拷贝数(GC/ml)。载体的滴度大约在8 x 1013-2 x 1014 GC/ml之间。
实施例3：亨廷顿病小鼠模型中表达和功效的测试
首先在野生型C57BL/6J小鼠中进行实验以确认构建体53的表达，并确定其表达是否对动物具有有害作用。在P1处通过脑室内注射来注射6x1010 vg AAV rh10衣壳，所述衣壳含有如以上描述的对照或构建体53。观察小鼠的共济失调、后肢无力或脚步拖曳。AAV注射之后一周，每周进行体重和临床观察。小鼠(n=3)在3周时通过CO2人道安乐死以确认AAV的表达。如图9A所示，在ICV注射之后的3周期间发现体重没有差异。另外，通过用抗FLAG抗体染色确认构建体的表达。如图9B所示，冷冻皮质切片用抗FLAG抗体(1、4，绿色)和抗NeuN抗体(2、5，红色)染色，并用Dapi (3、6，蓝色)复染。图像为代表性的皮质区。图1-3：注射对照AAVrh10；图4-6，注射构建体53 AAVrh10。
此类转基因小鼠品系的实例为R6/2系(Mangiarini等人，Cell 87: 493-506(1996))。R6/2小鼠为转基因亨廷顿病小鼠，其过度表达人类HD基因的外显子一(在内源性启动子的控制下)。R6/2人类HD基因的外显子1具有扩展的CAG/多聚谷氨酰胺重复长度(平均150个CAG重复)。这些小鼠发展出渐进性、最终致命的具有人类亨廷顿病许多特征的神经系统疾病。在R6/2小鼠的细胞质和细胞核两者中均观察到部分地由亨廷顿蛋白的N-末端部分(由HD外显子1编码)构成的异常聚集(Davies等人，Cell 90: 537-548 (1997))。例如，转基因动物体内的人类亨廷顿蛋白由至少包括55个CAG重复，并且更优选地包括约150个CAG重复的基因编码。
这些转基因动物在出生之后8-10周会发展出亨廷顿病样表型，其特征为体重的增加减少；寿命缩短；以及特征为步态异常、静止性震颤、后肢紧扣和多动的运动障碍(参见例如Mangiarini等人，同前)。表型逐渐向运动功能减退恶化。这些转基因小鼠的脑也表现出神经化学和组织学异常，比如神经递质受体(谷氨酸、多巴胺能)的变化、N-乙酰天冬氨酸(神经元完整性的标志物)浓度下降以及纹状体和脑大小减小。因此，评价可包括与神经递质水平、神经递质受体水平、脑大小和纹状体大小相关的评估参数。另外，含有转基因部分或全长人类亨廷顿蛋白的异常聚集物存在于这些动物(例如R6/2转基因小鼠品系)的脑组织中。参见例如Mangiarini等人，同前；Davies等人，Cell 90: 537-548 (1997),Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000)和Cha等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95: 6480-6485 (1998)。
为在动物模型中测试受试化合物或本申请中描述的已知化合物的效果，将含有编码融合蛋白和相应对照的载体的不同AAV病毒粒子给予转基因动物。在一个实施方案中，病毒粒子通过尾静脉注射给予。在另一个实施方案中，病毒粒子通过肌内注射给予。在仍然另一个实施方案中，粒子通过颅内注射给予，例如如在Stanek等人，(2014) Hum. Gene.Ther. 25:461-474中所述。
给予之后，监测疾病进展并将其与对照注射小鼠进行比较。在一个实施方案中，在动物体内评估亨廷顿病样症状。例如，然后监测例如如上描述的小鼠模型的亨廷顿病样症状的进展，以确定用测试化合物治疗是否导致减少或延缓症状。在另一个实施方案中，监测这些动物体内亨廷顿蛋白聚集物的解聚集。然后可处死动物并得到脑切片。然后对脑切片分析含有转基因人类亨廷顿蛋白或其一部分或者包含人类亨廷顿蛋白的融合蛋白或其一部分的聚集物的存在。这种分析可包括例如用抗亨廷顿蛋白抗体染色脑组织切片，并加入识别抗亨廷顿蛋白抗体的与FITC缀合的二级抗体(例如抗亨廷顿蛋白抗体为小鼠抗人抗体而二级抗体对人类抗体具有特异性)，并通过荧光显微术使蛋白聚集物可视化。或者，抗亨廷顿蛋白抗体可直接与FITC缀合(参见例如Shinkawa等人，(2011) Mol. Biol. Cell, 22:3571-3583，其通过参考以其全部结合至本文中)。然后通过荧光显微术使亨廷顿蛋白聚集物的水平可视化。
其他方面
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过参考以其全部结合至本文中，达到如同每个单个出版物、专利或专利申请均被具体且单独地指示通过参考以其全部结合的相同程度。在发现本申请中的术语在通过参考结合至本文中的文件中进行了不同定义的情况下，本文提供的定义将用作该术语的定义。
尽管本发明已结合其具体方面进行描述，但是将被理解的是，本发明能够进行进一步修改，并且本申请预期涵盖通常按照本发明的原理且包括此类自本公开的偏离的对本发明的任何变化、使用或改编，并且落入要求保护的范围内，所述偏离处于本发明所属领域内已知或惯常的实践内并且可被应用至上文阐述的基本特征。
序列表
<110> 索拉生物科学有限公司
<120> 用于治疗蛋白聚集障碍的组合物和方法
<130> 269548-489649
<140> TBD
<141> 2021-04-07
<150> 63/008,251
<151> 2020-04-10
<160> 170
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工
<220>
<223> DNAJB7
<400> 11
Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Leu Gln Arg Tyr Ala Ser Pro Glu Asp
1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Tyr His Lys Val Ala Leu Lys Trp His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Pro Glu Asn Lys Glu Glu Ala Glu Arg Lys Phe Lys Glu Val Ala
35 40 45
Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asn Asp Glu Lys Arg Asp Ile Tyr Asp
50 55 60
Lys Tyr Gly
65
<210> 12
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJB8
<400> 12
Asn Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Gln Ala Ser Ala Ser Pro Glu Asp
1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Arg Trp His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Pro Asp Asn Lys Glu Glu Ala Glu Lys Lys Phe Lys Leu Val Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Lys Lys Arg Ser Leu Tyr Asp
50 55 60
Arg Ala Gly
65
<210> 13
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJB9
<400> 13
Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Gly Val Pro Lys Ser Ala Ser Glu Arg Gln
1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Phe His Lys Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Lys Ser Pro Asp Ala Glu Ala Lys Phe Arg Glu Ile Ala Glu Ala
35 40 45
Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Ala Asn Arg Arg Lys Glu Tyr Asp Thr Leu
50 55 60
Gly
65
<210> 14
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJB11
<400> 14
Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp
1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg
20 25 30
Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala
35 40 45
Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg Lys Gln Tyr Asp Thr
50 55 60
Tyr Gly
65
<210> 15
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJB12
<400> 15
Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Arg Gly Ala Ser Asp Glu Asp Leu Lys
1 5 10 15
Lys Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Leu Lys Phe His Pro Asp Lys Asn His
20 25 30
Ala Pro Gly Ala Thr Glu Ala Phe Lys Ala Ile Gly Thr Ala Tyr Ala
35 40 45
Val Leu Ser Asn Pro Glu Lys Arg Lys Gln Tyr Asp Gln Phe Gly Asp
50 55 60
Asp
65
<210> 16
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJB13
<400> 16
Asp Tyr Tyr Ser Val Leu Gly Ile Thr Arg Asn Ser Glu Asp Ala Gln
1 5 10 15
Ile Lys Gln Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Leu Lys His His Pro Leu Lys
20 25 30
Ser Asn Glu Pro Ser Ser Ala Glu Ile Phe Arg Gln Ile Ala Glu Ala
35 40 45
Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Met Lys Arg Gly Ile Tyr Asp Lys Phe
50 55 60
Gly
65
<210> 17
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJB14
<400> 17
Asn Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Thr Lys Asp Ala Gly Asp Glu Asp
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Phe His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn His Ala Pro Gly Ala Thr Asp Ala Phe Lys Lys Ile Gly Asn Ala
35 40 45
Tyr Ala Val Leu Ser Asn Pro Glu Lys Arg Lys Gln Tyr Asp Leu Thr
50 55 60
Gly
65
<210> 18
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC1
<400> 18
Asn Phe Tyr Gln Phe Leu Gly Val Gln Gln Asp Ala Ser Ser Ala Asp
1 5 10 15
Ile Arg Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Leu Thr Leu His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Lys Asp Glu Asn Ala Glu Thr Gln Phe Arg Gln Leu Val Ala Ile
35 40 45
Tyr Glu Val Leu Lys Asp Asp Glu Arg Arg Gln Arg Tyr Asp Asp Ile
50 55 60
Leu
65
<210> 19
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC2
<400> 19
Asp His Tyr Ala Val Leu Gly Leu Gly His Val Arg Tyr Lys Ala Thr
1 5 10 15
Gln Arg Gln Ile Lys Ala Ala His Lys Ala Met Val Leu Lys His His
20 25 30
Pro Asp Lys Arg Lys Ala Ala Gly Glu Pro Ile Lys Glu Gly Asp Asn
35 40 45
Asp Tyr Phe Thr Cys Ile Thr Lys Ala Tyr Glu Met Leu Ser Asp Pro
50 55 60
Val Lys Arg Arg Ala Phe Asn Ser Val Asp
65 70
<210> 20
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC3
<400> 20
Asp Tyr Tyr Lys Ile Leu Gly Val Lys Arg Asn Ala Lys Lys Gln Glu
1 5 10 15
Ile Ile Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Trp His Pro Asp Asn
20 25 30
Phe Gln Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Ala Glu Lys Lys Phe Ile Asp
35 40 45
Ile Ala Ala Ala Lys Glu Val Leu Ser Asp Pro Glu Met Arg Lys Lys
50 55 60
Phe Asp Asp Gly Glu
65
<210> 21
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC4
<400> 21
Thr Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Val His Pro Gly Ala Ser Thr Glu Glu
1 5 10 15
Val Lys Arg Ala Phe Phe Ser Lys Ser Lys Glu Leu His Pro Asp Arg
20 25 30
Asp Pro Gly Asn Pro Ser Leu His Ser Arg Phe Val Glu Leu Ser Glu
35 40 45
Ala Tyr Arg Val Leu Ser Arg Glu Gln Ser Arg Arg Ser Tyr Asp Asp
50 55 60
Gln Leu
65
<210> 22
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC5
<400> 22
Gly Glu Ser Leu Tyr His Val Leu Gly Leu Asp Lys Asn Ala Thr Ser
1 5 10 15
Asp Asp Ile Lys Lys Ser Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro
20 25 30
Asp Lys Asn Pro Asp Asn Pro Glu Ala Ala Asp Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Asn Asn Ala His Ala Ile Leu Thr Asp Ala Thr Lys Arg Asn Ile Tyr
50 55 60
Asp Lys Tyr Gly Ser Leu
65 70
<210> 23
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC5B
<400> 23
Ala Leu Tyr Glu Ile Leu Gly Leu His Lys Gly Ala Ser Asn Glu Glu
1 5 10 15
Ile Lys Lys Thr Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys His His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Ala Thr Glu Lys Phe Lys Glu Ile Asn Asn
35 40 45
Ala His Ala Ile Leu Thr Asp Ile Ser Lys Arg Ser Ile Tyr Asp Lys
50 55 60
Tyr Gly
65
<210> 24
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC6
<400> 24
Thr Lys Trp Lys Pro Val Gly Met Ala Asp Leu Val Thr Pro Glu Gln
1 5 10 15
Val Lys Lys Val Tyr Arg Lys Ala Val Leu Val Val His Pro Asp Lys
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Pro Tyr Glu Gln Tyr Ala Lys Met Ile Phe Met Glu
35 40 45
Leu Asn Asp Ala Trp Ser Glu Phe Glu Asn Gln Gly Gln Lys Pro Leu
50 55 60
Tyr
65
<210> 25
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC7
<400> 25
Asp Tyr Tyr Lys Ile Leu Gly Val Asp Lys Asn Ala Ser Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Met His His Pro Asp Arg
20 25 30
His Ser Gly Ala Ser Ala Glu Val Gln Lys Glu Glu Glu Lys Lys Phe
35 40 45
Lys Glu Val Gly Glu Ala Phe Thr Ile Leu Ser Asp Pro Lys Lys Lys
50 55 60
Thr Arg Tyr Asp Ser Gly Gln
65 70
<210> 26
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC8
<400> 26
Asn Pro Phe Glu Val Leu Gln Ile Asp Pro Glu Val Thr Asp Glu Glu
1 5 10 15
Ile Lys Lys Arg Phe Arg Gln Leu Ser Ile Leu Val His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Gln Asp Asp Ala Asp Arg Ala Gln Lys Ala Phe Glu Ala Val Asp
35 40 45
Lys Ala Tyr Lys Leu Leu Leu Asp Gln Glu Gln Lys Lys Arg Ala Leu
50 55 60
Asp Val Ile Gln
65
<210> 27
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC9
<400> 27
Asp Leu Tyr Arg Val Leu Gly Val Arg Arg Glu Ala Ser Asp Gly Glu
1 5 10 15
Val Arg Arg Gly Tyr His Lys Val Ser Leu Gln Val His Pro Asp Arg
20 25 30
Val Gly Glu Gly Asp Lys Glu Asp Ala Thr Arg Arg Phe Gln Ile Leu
35 40 45
Gly Lys Val Tyr Ser Val Leu Ser Asp Arg Glu Gln Arg Ala Val Tyr
50 55 60
Asp Glu Gln Gly
65
<210> 28
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC10
<400> 28
Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Ser Ser Arg Glu
1 5 10 15
Ile Arg Gln Ala Phe Lys Lys Leu Ala Leu Lys Leu His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Pro Asn Asn Pro Asn Ala His Gly Asp Phe Leu Lys Ile Asn Arg
35 40 45
Ala Tyr Glu Val Leu Lys Asp Glu Asp Leu Arg Lys Lys Tyr Asp Lys
50 55 60
Tyr Gly
65
<210> 29
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC11
<400> 29
Asp Tyr Tyr Ser Leu Leu Asn Val Arg Arg Glu Ala Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Arg Leu Cys Met Leu Tyr His Pro Asp Lys
20 25 30
His Arg Asp Pro Glu Leu Lys Ser Gln Ala Glu Arg Leu Phe Asn Leu
35 40 45
Val His Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro Gln Thr Arg Ala Ile
50 55 60
Tyr Asp Ile Tyr Gly
65
<210> 30
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC12
<400> 30
Asp Tyr Tyr Thr Leu Leu Gly Cys Asp Glu Leu Ser Ser Val Glu Gln
1 5 10 15
Ile Leu Ala Glu Phe Lys Val Arg Ala Leu Glu Cys His Pro Asp Lys
20 25 30
His Pro Glu Asn Pro Lys Ala Val Glu Thr Phe Gln Lys Leu Gln Lys
35 40 45
Ala Lys Glu Ile Leu Thr Asn Glu Glu Ser Arg Ala Arg Tyr Asp His
50 55 60
Trp Arg
65
<210> 31
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC13
<400> 31
Asp Ala Tyr Glu Val Leu Asn Leu Pro Gln Gly Gln Gly Pro His Asp
1 5 10 15
Glu Ser Lys Ile Arg Lys Ala Tyr Phe Arg Leu Ala Gln Lys Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Pro Glu Gly Arg Asp Met Phe Glu Lys Val Asn Lys
35 40 45
Ala Tyr Glu Phe Leu Cys Thr Lys Ser Ala Lys Ile Val Asp Gly Pro
50 55 60
Asp Pro
65
<210> 32
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC14
<400> 32
Asn Pro Phe His Val Leu Gly Val Glu Ala Thr Ala Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Gln Leu Ala Val Met Val His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn His His Pro Arg Ala Glu Glu Ala Phe Lys Val Leu Arg Ala Ala
35 40 45
Trp Asp Ile Val Ser Asn Ala Glu Lys Arg Lys Glu Tyr Glu Met Lys
50 55 60
Arg
65
<210> 33
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC15
<400> 33
Glu Ala Gly Leu Ile Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Gly Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ile Arg Thr Ala His Arg Arg Val Met Ile Leu Asn His Pro Asp Lys
20 25 30
Gly Gly Ser Pro Tyr Val Ala Ala Lys Ile Asn Glu Ala Lys Asp Leu
35 40 45
Leu Glu Thr Thr Thr Lys His
50 55
<210> 34
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC16
<400> 34
Asp Pro Tyr Arg Val Leu Gly Val Ser Arg Thr Ala Ser Gln Ala Asp
1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Lys Leu Ala Arg Glu Trp His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Lys Asp Pro Gly Ala Glu Asp Lys Phe Ile Gln Ile Ser Lys Ala
35 40 45
Tyr Glu Ile Leu Ser Asn Glu Glu Lys Arg Ser Asn Tyr Asp Gln Tyr
50 55 60
Gly
65
<210> 35
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC17
<400> 35
Asp Leu Tyr Ala Leu Leu Gly Ile Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Glu
1 5 10 15
Val Lys Lys Ala Tyr Arg Gln Lys Ala Leu Ser Cys His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Pro Asp Asn Pro Arg Ala Ala Glu Leu Phe His Gln Leu Ser Gln
35 40 45
Ala Leu Glu Val Leu Thr Asp Ala Ala Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Lys
50 55 60
Val Arg
65
<210> 36
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC18
<400> 36
Asn Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Arg Asp Ala Ser Asp Glu Glu
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Phe His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Cys Ala Pro Gly Ala Thr Asp Ala Phe Lys Ala Ile Gly Asn Ala
35 40 45
Phe Ala Val Leu Ser Asn Pro Asp Lys Arg Leu Arg Tyr Asp Glu Tyr
50 55 60
Gly
65
<210> 37
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC19
<400> 37
Glu Ala Ala Leu Ile Leu Gly Val Ser Pro Thr Ala Asn Lys Gly Lys
1 5 10 15
Ile Arg Asp Ala His Arg Arg Ile Met Leu Leu Asn His Pro Asp Lys
20 25 30
Gly Gly Ser Pro Tyr Ile Ala Ala Lys Ile Asn Glu Ala Lys Asp Leu
35 40 45
Leu Glu Gly Gln Ala Lys Lys
50 55
<210> 38
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC20
<400> 38
Asp Tyr Phe Ser Leu Met Asp Cys Asn Arg Ser Phe Arg Val Asp Thr
1 5 10 15
Ala Lys Leu Gln His Arg Tyr Gln Gln Leu Gln Arg Leu Val His Pro
20 25 30
Asp Phe Phe Ser Gln Arg Ser Gln Thr Glu Lys Asp Phe Ser Glu Lys
35 40 45
His Ser Thr Leu Val Asn Asp Ala Tyr Lys Thr Leu Leu Ala Pro Leu
50 55 60
Ser Arg Gly Leu Tyr Leu Leu Lys
65 70
<210> 39
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC21
<400> 39
Cys His Tyr Glu Ala Leu Gly Val Arg Arg Asp Ala Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Leu Asp Asn Ala Ala Glu Ala Ala Glu Gln Phe Lys Leu Ile Gln
35 40 45
Ala Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Gln Glu Arg Ala Trp Tyr Asp
50 55 60
Asn His Arg
65
<210> 40
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC22
<400> 40
Leu Ala Tyr Gln Val Leu Gly Leu Ser Glu Gly Ala Thr Asn Glu Glu
1 5 10 15
Ile His Arg Ser Tyr Gln Glu Leu Val Lys Val Trp His Pro Asp His
20 25 30
Asn Leu Asp Gln Thr Glu Glu Ala Gln Arg His Phe Leu Glu Ile Gln
35 40 45
Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Gln Pro Arg Lys Pro Trp Gly Ser Arg
50 55 60
Arg
65
<210> 41
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC23
<400> 41
Asn Pro Tyr Glu Val Leu Asn Leu Asp Pro Gly Ala Thr Val Ala Glu
1 5 10 15
Ile Lys Lys Gln Tyr Arg Leu Leu Ser Leu Lys Tyr His Pro Asp Lys
20 25 30
Gly Gly Asp Glu Val Met Phe Met Arg Ile Ala Lys Ala Tyr Ala Ala
35 40 45
Leu Thr Asp Glu Glu Ser Arg Lys Asn Trp Glu Glu Phe Gly
50 55 60
<210> 42
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC24
<400> 42
Asp Trp Tyr Ser Ile Leu Gly Ala Asp Pro Ser Ala Asn Ile Ser Asp
1 5 10 15
Leu Lys Gln Lys Tyr Gln Lys Leu Ile Leu Met Tyr His Pro Asp Lys
20 25 30
Gln Ser Thr Asp Val Pro Ala Gly Thr Val Glu Glu Cys Val Gln Lys
35 40 45
Phe Ile Glu Ile Asp Gln Ala Trp Lys Ile Leu Gly Asn Glu Glu Thr
50 55 60
Lys Arg Glu Tyr Asp Leu Gln Arg
65 70
<210> 43
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC25
<400> 43
Asp Cys Tyr Glu Val Leu Gly Val Ser Arg Ser Ala Gly Lys Ala Glu
1 5 10 15
Ile Ala Arg Ala Tyr Arg Gln Leu Ala Arg Arg Tyr His Pro Asp Arg
20 25 30
Tyr Arg Pro Gln Pro Gly Asp Glu Gly Pro Gly Arg Thr Pro Gln Ser
35 40 45
Ala Glu Glu Ala Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Tyr Glu Thr Leu Lys
50 55 60
Asp Glu Glu Thr Arg Lys Asp Tyr Asp Tyr Met Leu
65 70 75
<210> 44
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC26
<400> 44
Ser Arg Trp Thr Pro Val Gly Met Ala Asp Leu Val Ala Pro Glu Gln
1 5 10 15
Val Lys Lys His Tyr Arg Arg Ala Val Leu Ala Val His Pro Asp Lys
20 25 30
Ala Ala Gly Gln Pro Tyr Glu Gln His Ala Lys Met Ile Phe Met Glu
35 40 45
Leu Asn Asp Ala Trp Ser Glu Phe Glu Asn Gln Gly Ser Arg Pro Leu
50 55 60
Phe
65
<210> 45
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC27
<400> 45
Asp Ser Trp Asp Met Leu Gly Val Lys Pro Gly Ala Ser Arg Asp Glu
1 5 10 15
Val Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys
20 25 30
Cys Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp Ala Phe Lys Ala Val Val Asn Ala
35 40 45
Arg Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile Lys
50 55
<210> 46
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC28
<400> 46
Glu Tyr Tyr Arg Leu Leu Asn Val Glu Glu Gly Cys Ser Ala Asp Glu
1 5 10 15
Val Arg Glu Ser Phe His Lys Leu Ala Lys Gln Tyr His Pro Asp Ser
20 25 30
Gly Ser Asn Thr Ala Asp Ser Ala Thr Phe Ile Arg Ile Glu Lys Ala
35 40 45
Tyr Arg Lys Val Leu Ser His Val Ile Glu Gln Thr Asn Ala Ser Gln
50 55 60
Ser
65
<210> 47
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC29
<400> 47
Ile Leu Lys Glu Val Thr Ser Val Val Glu Gln Ala Trp Lys Leu Pro
1 5 10 15
Glu Ser Glu Arg Lys Lys Ile Ile Arg Arg Leu Tyr Leu Lys Trp His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Pro Glu Asn His Asp Ile Ala Asn Glu Val Phe Lys
35 40 45
His Leu Gln Asn Glu Ile Asn Arg Leu Glu Lys Gln Ala Phe Leu Asp
50 55 60
Gln Asn Ala Asp Arg Ala Ser Arg Arg Thr Phe Ser Thr Ser Ala Ser
65 70 75 80
Arg Phe Gln Ser Asp Lys Tyr Ser
85
<210> 48
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DNAJC30
<400> 48
Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Val Pro Ser Thr Ala Thr Gln Ala Gln
1 5 10 15
Ile Lys Ala Ala Tyr Tyr Arg Gln Cys Phe Leu Tyr His Pro Asp Arg
20 25 30
Asn Ser Gly Ser Ala Glu Ala Ala Glu Arg Phe Thr Arg Ile Ser Gln
35 40 45
Ala Tyr Val Val Leu Gly Ser Ala Thr Leu Arg Arg Lys Tyr Asp Arg
50 55 60
Gly Leu
65
<210> 49
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> SV40 J结构域
<400> 49
Gln Leu Met Asp Leu Leu Gly Leu Glu Arg Ser Ala Trp Gly Asn Ile
1 5 10 15
Pro Leu Met Arg Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Cys Lys Glu Phe His Pro
20 25 30
Asp Lys Gly Gly Asp Glu Glu Lys Met Lys Lys Met Asn Thr Leu Tyr
35 40 45
Lys Lys Met Glu Asp Gly Val Lys Tyr Ala His Gln Pro Asp Phe Gly
50 55 60
<210> 50
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Bacterial J-结构域
<400> 50
Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu
1 5 10 15
Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro
20 25 30
Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr
50 55 60
Asp Gln Tyr Gly His Ala
65 70
<210> 51
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PQBP1
<400> 51
Met Pro Leu Pro Val Ala Leu Gln Thr Arg Leu Ala Lys Arg Gly Ile
1 5 10 15
Leu Lys His Leu Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Ile Ile Ala Glu Asp
20 25 30
Tyr Asp Asp Asp Pro Val Asp Tyr Glu Ala Thr Arg Leu Glu Gly Leu
35 40 45
Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Val Phe Asp Pro Ser Cys Gly Leu Pro Tyr
50 55 60
Tyr Trp Asn Ala Asp Thr Asp Leu Val Ser Trp Leu Ser Pro His Asp
65 70 75 80
Pro Asn Ser Val Val Thr Lys Ser Ala Lys Lys Leu Arg Ser Ser Asn
85 90 95
Ala Asp Ala Glu Glu Lys Leu Asp Arg Ser His Asp Lys Ser Asp Arg
100 105 110
Gly His Asp Lys Ser Asp Arg Ser His Glu Lys Leu Asp Arg Gly His
115 120 125
Asp Lys Ser Asp Arg Gly His Asp Lys Ser Asp Arg Asp Arg Glu Arg
130 135 140
Gly Tyr Asp Lys Val Asp Arg Glu Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Asp
145 150 155 160
Arg Asp Arg Gly Tyr Asp Lys Ala Asp Arg Glu Glu Gly Lys Glu Arg
165 170 175
Arg His His Arg Arg Glu Glu Leu Ala Pro Tyr Pro Lys Ser Lys Lys
180 185 190
Ala Val Ser Arg Lys Asp Glu Glu Leu Asp Pro Met Asp Pro Ser Ser
195 200 205
Tyr Ser Asp Ala Pro Arg Gly Thr Trp Ser Thr Gly Leu Pro Lys Arg
210 215 220
Asn Glu Ala Lys Thr Gly Ala Asp Thr Thr Ala Ala Gly Pro Leu Phe
225 230 235 240
Gln Gln Arg Pro Tyr Pro Ser Pro Gly Ala Val Leu Arg Ala Asn Ala
245 250 255
Glu Ala Ser Arg Thr Lys Gln Gln Asp
260 265
<210> 52
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PQBP-2
<400> 52
Arg Pro Asp Gln Glu Arg Leu Leu Leu Arg Gly Trp Val Pro Arg Trp
1 5 10 15
Pro His Gln Pro Ala Ala Ala Glu Ala Ala Pro Asp Arg Val Pro Pro
20 25 30
Glu Leu Thr Leu Thr Leu Gln Tyr Ser Arg Asn Thr Glu Arg Cys Gly
35 40 45
Ile His Met Ala Ile His His Cys Gln Pro Asp Asn
50 55 60
<210> 53
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PQBP-3
<400> 53
Arg Arg Arg Trp Trp Thr Arg Ala Ser Trp Pro Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Gly Thr Gly Cys Cys Ser Gly Ser Pro Thr Ala Ala Arg Pro Pro
20 25 30
Ser Pro Trp Arg Lys Thr Arg Lys Gly Thr Met Ser Leu Thr
35 40 45
<210> 54
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PQBP-4
<400> 54
Arg Arg Gly Thr Arg Arg Leu Lys Met Asn Arg Leu Gln Pro Phe Ile
1 5 10 15
Thr His Gly Tyr Leu Cys His Glu
20
<210> 55
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PQBP-5
<400> 55
Arg Arg Arg Lys Ser Arg Lys Glu Asn Gln Val Met Gln Lys Val Arg
1 5 10 15
Arg Val Gln Met Met Lys Lys Pro Gly Leu Lys Arg Ser Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Asp Ser Ser Ser Arg Arg Lys Lys
35 40
<210> 56
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VCP
<400> 56
Arg Phe Pro Ser Gly Asn Gln Gly Gly Ala Gly Pro Ser Gln Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Thr Gly Gly Ser Val Tyr Thr Glu Asp Asn Asp Asp Asp
20 25 30
Leu Tyr Gly
35
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP1
<400> 57
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
1 5 10
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<213> 人工
<220>
<223> QBP2
<400> 58
His Trp Trp Arg Ser Trp Tyr Ser Asp Ser Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP3
<400> 59
His Glu Trp His Trp Trp His Gln Glu Ala Ala
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP4
<400> 60
Trp Gly Leu Glu His Phe Ala Gly Asn Lys Arg
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP5
<400> 61
Trp Trp Arg Trp Asn Trp Ala Thr Pro Val Asp
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP6
<400> 62
Trp His Asn Tyr Phe His Trp Trp Gln Asp Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MW1-LC
<400> 63
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1 5 10 15
Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Thr Val Leu Gly
115
<210> 64
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MW1-HC
<400> 64
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1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gly Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1C2-LC
<400> 65
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Arg Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Phe Val Met
35 40 45
Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala His Arg Tyr Leu Ser Ile Ser
65 70 75 80
Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Thr Val Leu Gly
115
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> PolyQ(25)
<400> 66
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
1 5 10 15
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
20 25
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MW7
<400> 67
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Ser Gly Val
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
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Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
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Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
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<213> 人工
<220>
<223> Happ1
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Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
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Leu Cys Val Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Asn Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Val Asp Gly Thr Ala Gly
115
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<400> 69
000
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<213> 人工
<220>
<223> GTGS
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Gly Thr Gly Ser
1
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<213> 人工
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Gly Leu Glu Ser Arg
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<213> 人工
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Gly Gly Ser Gly
1
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Gly Gly Gly Ser
1
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<213> 人工
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Asp Ile Ala Ala Ala
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<213> 人工
<220>
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<400> 75
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<213> 人工
<220>
<223> GGGGSGGGGSGGGGS
<400> 76
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<213> 人工
<220>
<223> AEAAAKEAAAK
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<211> 15
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<213> 人工
<220>
<223> SGGGSGGGGSGGGGS
<400> 78
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<213> 人工
<220>
<223> DIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA
<400> 79
Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
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<213> 人工
<220>
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<400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser
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<213> 人工
<220>
<223> GGGGSGGGGS
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<211> 10
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<213> 人工
<220>
<223> EAAAKEAAAK
<400> 83
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
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<400> 84
000
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<220>
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<213> 人工
<220>
<223> RQIKWFQNRRMKWKK
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Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
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<213> 人工
<220>
<223> KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
<400> 87
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
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<213> 人工
<220>
<223> CSIPPEVKFNKPFVYLI
<400> 88
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1 5 10 15
Ile
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1
<400> 89
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1 5 10 15
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20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala
65 70 75 80
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85 90
<210> 90
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-QBP1
<400> 90
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1 5 10 15
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20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly
100 105 110
Leu Glu
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP1-JB1
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1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Glu Phe
20 25 30
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
35 40 45
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
50 55 60
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
65 70 75 80
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
85 90 95
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala
100 105 110
Leu Glu
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-2XQBP1
<400> 92
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly
100 105 110
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<213> 人工
<220>
<223> JB1-3XQBP1
<400> 93
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130
<210> 94
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<400> 94
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Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly
130 135 140
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<210> 95
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<213> 人工
<220>
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<400> 95
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100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly
130 135 140
Leu Glu Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
145 150 155
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1(P33Q)-2XQBP1
<400> 96
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
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50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly
100 105 110
Leu Glu Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
115 120 125
<210> 97
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1(20-31)-2XQBP1
<400> 97
Met Gly Thr Gly Ser Glu Phe Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala
1 5 10 15
Leu Arg Tyr Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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35 40 45
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50 55 60
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65
<210> 98
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1(19-43)-2XQBP1
<400> 98
Met Gly Thr Gly Ser Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln
1 5 10 15
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Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
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50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1(17-75)-2XQBP1
<400> 99
Met Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg
1 5 10 15
Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala
20 25 30
Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp
85 90 95
Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly Leu Glu Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro
100 105 110
Gly Ile Phe Asp
115
<210> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1(1-57)-2XQBP1
<400> 100
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly Leu Glu
85 90 95
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
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<213> 人工
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Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys
85 90 95
Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly Leu Glu Ser Asn Trp Lys Trp Trp
100 105 110
Pro Gly Ile Phe Asp
115
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<213> 人工
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20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Pro Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Ala Asn Gly Thr Ser Phe Ser Tyr Thr Phe His Gly
85 90 95
Asp Pro His Ala Met Phe Ala Glu Phe Phe Gly Gly Asp Ile Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Glu Ala Ala
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<213> 人工
<220>
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50 55 60
Tyr Asp Arg Tyr Gly Arg Glu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
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Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly Leu Glu Ser Asn
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Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
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Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Asp Ile
50 55 60
Tyr Asp Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn
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Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly Leu Glu Ser Asn Trp Lys
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20 25 30
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50 55 60
Leu Tyr Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp
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Gly Ile Phe Asp
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
100 105 110
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
115 120 125
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Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser
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Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr
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Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln
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Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser
275 280 285
His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
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Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu
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Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val
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Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Ala Ala Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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<213> 人工
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Asp Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ala Glu Lys Lys Phe Lys Glu
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Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys Arg Glu Ile
50 55 60
Tyr Asp Arg Tyr Gly Arg Glu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
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His Trp Trp Arg Ser Trp Tyr Ser Asp Ser Val Gly Leu Glu His Trp
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Trp Arg Ser Trp Tyr Ser Asp Ser Val
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<213> 人工
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<223> JB6-2XQBP2
<400> 112
Met Val Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Gln Arg His Ala Ser Pro
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Glu Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro
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35 40 45
Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Asp Ile
50 55 60
Tyr Asp Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala His Trp
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Trp Arg Ser Trp Tyr Ser Asp Ser Val Gly Leu Glu His Trp Trp Arg
100 105 110
Ser Trp Tyr Ser Asp Ser Val
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<213> 人工
<220>
<223> JC6-2XQBP2
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Lys Ala Thr Gly Gln Pro Tyr Glu Gln Tyr Ala Lys Met Ile Phe Met
35 40 45
Glu Leu Asn Asp Ala Trp Ser Glu Phe Glu Asn Gln Gly Gln Lys Pro
50 55 60
Leu Tyr Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala His Trp Trp Arg Ser
85 90 95
Trp Tyr Ser Asp Ser Val Gly Leu Glu His Trp Trp Arg Ser Trp Tyr
100 105 110
Ser Asp Ser Val
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Asp Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ala Glu Lys Lys Phe Lys Glu
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Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys Arg Glu Ile
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Tyr Asp Arg Tyr Gly Arg Glu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser
225 230 235 240
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile
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Glu Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro
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65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Gln Val
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Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
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Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Tyr Met
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Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Phe
130 135 140
Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
165 170 175
Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
180 185 190
Gly Arg Gly Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
195 200 205
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser
225 230 235 240
Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser
245 250 255
Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys
260 265 270
Tyr Val Met Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly
275 280 285
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu
290 295 300
Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly
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Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly
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Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln
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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser
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Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr
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Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Arg
165 170 175
Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly
180 185 190
Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala
225 230 235 240
Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
245 250 255
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met
260 265 270
Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
275 280 285
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser
290 295 300
Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
305 310 315 320
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325 330 335
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
115
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
100 105 110
Gln Gln Gln Gln
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Met Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala
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Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
165 170 175
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
180 185 190
Tyr Cys Ile Tyr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
195 200 205
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met
225 230 235 240
Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
245 250 255
Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu
275 280 285
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
290 295 300
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
305 310 315 320
Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Glu Ile
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-Happ1
<400> 121
Met Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala
1 5 10 15
Asp Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Lys Ala Leu Gln Trp His Pro
20 25 30
Asp Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ala Glu Lys Lys Phe Lys Glu
35 40 45
Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys Arg Glu Ile
50 55 60
Tyr Asp Arg Tyr Gly Arg Glu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
85 90 95
Met Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly
100 105 110
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser
115 120 125
Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
130 135 140
Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
145 150 155 160
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
165 170 175
Arg Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
180 185 190
Leu Cys Val Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Asn Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Val Asp Gly Thr Ala Gly
210
<210> 122
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-QBP1-QBP1 (1)
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1 5 10 15
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20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly
100 105 110
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn
115 120 125
Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
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<211> 104
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<213> 人工
<220>
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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85 90 95
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<213> 人工
<220>
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Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys
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Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<400> 128
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
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<213> 人工
<220>
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<400> 129
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
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50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
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85 90 95
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
100 105
<210> 132
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-QBP1-QBP1 (11)
<400> 132
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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100 105 110
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
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100 105 110
Leu Glu
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-QBP1-QBP1 (14)
<400> 135
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
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Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Gly Gly Gly Gly Ser
85 90 95
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100 105 110
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
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100 105 110
Leu Glu
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<211> 134
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<400> 137
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro
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Gly Ile Phe Asp Leu Glu
130
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<211> 134
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<400> 138
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
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Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
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Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Glu
100 105 110
Ala Ala Ala Lys Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Leu Glu
130
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-QBP1-QBP1 (19)
<400> 140
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Glu Phe Met Gly Lys Asp Tyr
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<210> 143
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBP1-JB1-QBP1 (2)
<400> 143
Met Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-JB1-QBP1
<400> 144
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1-QBP1-JB1-QBP1
<400> 145
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Ser Ser Asn Trp
65 70 75 80
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85 90 95
Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His Pro Asp Lys Asn Lys Glu
115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe Asp Arg Tyr Gly Glu Glu
145 150 155 160
Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys
180 185 190
Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Ser Arg Gly Asp Tyr Lys Asp
195 200 205
Asp Asp Asp Lys
210
<210> 146
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB6-QBP1-QBP1
<400> 146
Met Val Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Gln Arg His Ala Ser Pro
1 5 10 15
Glu Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro
20 25 30
Asp Lys Asn Pro Glu Asn Lys Glu Glu Ala Glu Arg Lys Phe Lys Gln
35 40 45
Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Asp Ile
50 55 60
Tyr Asp Lys Tyr Gly Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly Asp Ile Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
85 90 95
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asp Tyr
100 105 110
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys
115 120 125
Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
130 135
<210> 147
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB13-QBP1-QBP1
<400> 147
Met Gly Gln Asp Tyr Tyr Ser Val Leu Gly Ile Thr Arg Asn Ser Glu
1 5 10 15
Asp Ala Gln Ile Lys Gln Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Leu Lys His His
20 25 30
Pro Leu Lys Ser Asn Glu Pro Ser Ser Ala Glu Ile Phe Arg Gln Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Met Lys Arg Gly Ile Tyr
50 55 60
Asp Lys Phe Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Gly Asp Ile Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser
85 90 95
Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
100 105 110
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp
115 120 125
Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
130 135
<210> 148
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JA1-QBP1-QBP1
<400> 148
Met Val Lys Glu Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn
1 5 10 15
Ala Thr Gln Glu Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys
20 25 30
Tyr His Pro Asp Lys Asn Pro Asn Glu Gly Glu Lys Phe Lys Gln Ile
35 40 45
Ser Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Glu Leu Tyr
50 55 60
Asp Lys Gly Gly Glu Gln Ala Ile Lys Glu Gly Asp Ile Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser
85 90 95
Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
100 105 110
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp
115 120 125
Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
130 135
<210> 149
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JC7-QBP1-QBP1
<400> 149
Met Asp Tyr Tyr Lys Ile Leu Gly Val Asp Lys Asn Ala Ser Glu Asp
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Met His His Pro Asp
20 25 30
Arg His Ser Gly Ala Ser Ala Glu Val Gln Lys Glu Glu Glu Lys Lys
35 40 45
Phe Lys Glu Val Gly Glu Ala Phe Thr Ile Leu Ser Asp Pro Lys Lys
50 55 60
Lys Thr Arg Tyr Asp Ser Gly Gln Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys
85 90 95
Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
100 105 110
Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly
115 120 125
Ile Phe Asp Leu Glu
130
<210> 150
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DnaJ-QBP1-QBP1
<400> 150
Met Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala
1 5 10 15
Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr
20 25 30
His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys
35 40 45
Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala
50 55 60
Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys
85 90 95
Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
100 105 110
Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly
115 120 125
Ile Phe Asp Leu Glu
130
<210> 151
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> SV40-QBP1-QBP1
<400> 151
Met Gln Leu Met Asp Leu Leu Gly Leu Glu Arg Ser Ala Trp Gly Asn
1 5 10 15
Ile Pro Leu Met Arg Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Cys Lys Glu Phe His
20 25 30
Pro Asp Lys Gly Gly Asp Glu Glu Lys Met Lys Lys Met Asn Thr Leu
35 40 45
Tyr Lys Lys Met Glu Asp Gly Val Lys Tyr Ala His Gln Pro Asp Phe
50 55 60
Gly Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
85 90 95
Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Ala Ala
100 105 110
Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
115 120 125
<210> 152
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (1)
<400> 152
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Asp Ile Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
100 105 110
<210> 153
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (2)
<400> 153
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Ser Asn Trp Lys Trp
65 70 75 80
Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
85
<210> 154
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (3)
<400> 154
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser
65 70 75 80
Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
85 90
<210> 155
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (4)
<400> 155
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp Leu Glu
85 90
<210> 156
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (5)
<400> 156
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Ser Asn Trp Lys Trp
65 70 75 80
Trp Pro Gly Ile Phe Asp
85
<210> 157
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (5)
<400> 157
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser
65 70 75 80
Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
85 90
<210> 158
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> JB1QBP1 (7)
<400> 158
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe
50 55 60
Asp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ser Asn Trp Lys Trp Trp Pro Gly Ile Phe Asp
85 90
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MGVKVLFALICIAVAEA
<400> 159
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 160
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MAPVQLLGLLVLFLPAMRC
<400> 160
Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala
1 5 10 15
Met Arg Cys
<210> 161
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MAVLGLLFCLVTFPSCVLS
<400> 161
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 162
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 表位
<400> 162
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 163
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> DYKDDDDK
<400> 163
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 164
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HHHHHH
<400> 164
His His His His His His
1 5
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> EQKLISEEDL
<400> 165
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> YPYDVPDYA
<400> 166
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 167
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GKPIPNPLLGLDST
<400> 167
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 168
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 表位
<400> 168
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp
210 215 220
<210> 169
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GFP-HTTQ23
<400> 169
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Gly Arg Thr Gln Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Phe Ala Thr Leu Glu
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln
260 265 270
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
275 280 285
Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Leu
290 295 300
Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln Pro
305 310 315 320
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala Val Ala Glu Glu
325 330 335
Pro Leu His Arg Pro
340
<210> 170
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GFP-HTTQ74
<400> 170
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Gly Arg Thr Gln Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Phe Ala Thr Leu Glu
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln
260 265 270
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
275 280 285
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
290 295 300
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
305 310 315 320
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
325 330 335
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
340 345 350
Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln
355 360 365
Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala Val
370 375 380
Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro
385 390

Claims (66)

1.分离的融合蛋白，其包含J蛋白的J结构域和多聚谷氨酰胺结合结构域。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述J蛋白的J结构域具有真核起源。
3.权利要求1或权利要求2的融合蛋白，其中所述J蛋白的J结构域具有人类起源。
4.权利要求1-3中任何一项的融合蛋白，其中所述J蛋白的J结构域在胞质上定位。
5.权利要求1-4中任何一项的融合蛋白，其中所述J蛋白的J结构域选自SEQ ID No: 1-55。
6.权利要求1-5中任何一项的融合蛋白，其中所述J结构域包含选自SEQ ID NO: 1、5、6、10、16、24、25、31和49的序列。
7.权利要求1-6中任何一项的融合蛋白，其中所述J结构域包含SEQ ID NO: 5的序列。
8.权利要求1-6中任何一项的融合蛋白，其中所述J结构域包含SEQ ID NO: 10的序列。
9.权利要求1-6中任何一项的融合蛋白，其中所述J结构域包含SEQ ID NO: 24的序列。
10.权利要求1-6中任何一项的融合蛋白，其中所述J结构域包含SEQ ID NO: 31的序列。
11.权利要求1-6中任何一项的融合蛋白，其中所述J结构域包含SEQ ID NO: 49的序列。
12.权利要求1-11中任何一项的融合蛋白，其中所述多聚谷氨酰胺结合结构域包含选自SEQ ID NO: 51-68的序列。
13.权利要求1-12中任何一项的融合蛋白，其中所述多聚谷氨酰胺结合结构域包含SEQID NO:57的序列。
14.权利要求1-13中任何一项的融合蛋白，其包含多个多聚谷氨酰胺结合结构域。
15.权利要求1-14中任何一项的融合蛋白，其由两个多聚谷氨酰胺结合结构域组成。
16.权利要求1-15中任何一项的融合蛋白，其包含以下构建体之一：
a. DNAJ-X-Q，
b. DNAJ-X-Q-X-Q，
c. DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
d. Q-X-DNAJ，
e. Q-X-Q-X-DNAJ，
f. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ，
g. Q-X-DNAJ-X-Q，
h. Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q，
i. DNAJ-X-DNAJ-X-Q，
j. Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
k. DNAJ-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
l. Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
m. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q，
n. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q，
o. Q-X-Q-X-Q-X-DNAJ-X-Q-X-Q-X-Q，
p. DnaJ-X-DnaJ-X-Q-X-Q，
q. Q-X-DnaJ-X-DnaJ，
r. Q-X-Q-X-DnaJ-X-DnaJ，和
s. Q-X-DnaJ-X-DnaJ-X-Q
其中，
Q为多聚谷氨酰胺结合结构域，
DNAJ为J蛋白的J结构域，和
X为任选的接头。
17.权利要求1-16中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域序列和SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域序列。
18.权利要求1-17中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 5的J结构域序列和SEQ ID NO: 57的多聚谷氨酰胺结合结构域序列的两个拷贝。
19.权利要求1-18中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:89-157的序列。
20.权利要求1-19中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 90的序列。
21.权利要求1-19中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 91的序列。
22.权利要求1-19中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 92的序列。
23.权利要求1-19中任何一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 93的序列。
24.权利要求1-23中任何一项的融合蛋白，其进一步包含靶向试剂。
25.权利要求1-24中任何一项的融合蛋白，其进一步包含表位。
26.权利要求1-25中任何一项的融合蛋白，其进一步包含信号序列。
27.权利要求1-26中任何一项的融合蛋白，其能够减少细胞中含有多聚谷氨酰胺的蛋白的聚集。
28.权利要求1-27中任何一项的融合蛋白，其能够减少多聚谷氨酰胺重复介导的细胞毒性。
29.编码权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的核酸序列。
30.权利要求29的核酸序列，其中所述核酸为DNA。
31.权利要求29或权利要求30的核酸序列，其中所述核酸包含至少一个修饰的核酸。
32.权利要求29-31中任何一项的核酸序列，进一步包含启动子区、5’ UTR、3’ UTR和多聚(A)信号。
33.权利要求32的核酸序列，其中所述启动子区包含选自CMV增强子序列、CMV启动子、CBA启动子、UBC启动子、GUSB启动子、NSE启动子、突触蛋白启动子、MeCP2启动子和GFAP启动子的序列。
34.包含权利要求29-33中任何一项的核酸序列的载体。
35.权利要求34的载体，其中所述载体选自腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘病毒(牛痘或黏液瘤)、副粘病毒(麻疹、RSV或新城疫病毒)、杆状病毒、呼肠孤病毒、甲病毒和黄病毒。
36.权利要求34或权利要求35的载体，其中所述载体为AAV。
37.包含衣壳和权利要求34-36中任何一项的的载体的病毒粒子。
38.权利要求37的病毒粒子，其中所述衣壳选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、假型AAV、恒河猴衍生的AAV、AAVrh8、AAVrh10和AAV-DJan AAV衣壳突变体、AAV杂合性血清型、嗜器官性AAV、嗜心性AAV和嗜心性AAVM41突变体。
39.权利要求37或权利要求38的病毒粒子，其中所述衣壳选自AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAVrh10。
40.权利要求37-39中任何一项的病毒粒子，其中所述衣壳为AAV2。
41.权利要求37-39中任何一项的病毒粒子，其中所述衣壳为AAV5。
42.权利要求37-39中任何一项的病毒粒子，其中所述衣壳为AAV8。
43.权利要求37-39中任何一项的病毒粒子，其中所述衣壳为AAV9。
44.权利要求37-39中任何一项的病毒粒子，其中所述衣壳为AAV rh10。
45.药用组合物，其包含选自以下的药剂：权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和药学上可接受的载剂或赋形剂。
46.降低细胞中多聚谷氨酰胺蛋白毒性的方法，其包括使所述细胞与有效量的一种或多种选自以下的药剂接触：权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和权利要求45的药用组合物。
47.权利要求46的方法，其中所述细胞处于受试者体内。
48.权利要求46或权利要求47的方法，其中所述受试者为人类。
49.权利要求46-48中任何一项的方法，其中所述细胞为中枢神经系统的细胞。
50.权利要求46-49中任何一项的方法，其中所述受试者被鉴定为患有多聚谷氨酰胺重复疾病。
51.权利要求46-50中任何一项的方法，其中所述多聚谷氨酰胺蛋白选自亨廷顿蛋白、肌萎缩蛋白-1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、Cav2.1、共济失调蛋白7、TATA结合蛋白、共济失调蛋白3和雄激素受体。
52.权利要求46-51中任何一项的方法，其中所述细胞中所述多聚谷氨酰胺蛋白的聚集减少。
53.在需要其的受试者中治疗、预防或延缓多聚谷氨酰胺重复疾病进展的方法，所述方法包括给予有效量的一种或多种选自以下的药剂：权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和权利要求45的药用组合物。
54.权利要求53的方法，其中所述多聚谷氨酰胺重复疾病选自亨廷顿病、1型SCA、2型SCA、6型SCA、7型SCA、17型SCA、MJD/SCA3、DRPLA和SBMA。
55.权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和权利要求45的药用组合物中的一种或多种用于在受试者中预防或延缓多聚谷氨酰胺重复疾病进展的用途。
56.减少细胞中蛋白聚集的方法，其包括使所述细胞与有效量的一种或多种选自以下的药剂接触：权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和权利要求45的药用组合物。
57.权利要求56的方法，其中所述细胞处于受试者体内。
58.权利要求56或权利要求57的方法，其中所述受试者为人类。
59.权利要求56-58中任何一项的方法，其中所述细胞为中枢神经系统的细胞。
60.权利要求56-59中任何一项的方法，其中所述受试者被鉴定为患有多聚谷氨酰胺重复疾病。
61.权利要求56-60中任何一项的方法，其中所述多聚谷氨酰胺蛋白选自亨廷顿蛋白、肌萎缩蛋白-1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、Cav2.1、共济失调蛋白7、TATA结合蛋白、共济失调蛋白3和雄激素受体。
62.权利要求56-61中任何一项的方法，其中受试者被鉴定为患有选自ALS、FTD、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、海马硬化和路易体痴呆的疾病。
63.权利要求56-62中任何一项的方法，其中所述细胞中蛋白的聚集减少。
64.在需要其的受试者中治疗、预防或延缓蛋白聚集疾病进展的方法，所述方法包括给予有效量的一种或多种选自以下的药剂：权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和权利要求45的药用组合物。
65.权利要求64的方法，其中所述多聚谷氨酰胺重复疾病选自亨廷顿病、1型SCA、2型SCA、6型SCA、7型SCA、17型SCA、MJD/SCA3、DRPLA和SBMA。
66.权利要求1-28中任何一项的融合蛋白、表达权利要求1-28中任何一项的融合蛋白的细胞、权利要求29-33中任何一项的核酸、权利要求34-46中任何一项的载体、权利要求37-44中任何一项的病毒粒子和权利要求45的药用组合物中的一种或多种用于在受试者中预防或延缓多聚谷氨酰胺重复疾病进展的用途。
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