KR20240049295A - 방사선 유발 타액 기능저하를 예방하기 위한 aqp1 유전자 요법 - Google Patents
방사선 유발 타액 기능저하를 예방하기 위한 aqp1 유전자 요법 Download PDFInfo
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Abstract
이온화 방사선 (IR)으로 치료 전에 침샘에 아쿠아포린-1 (AQP1) 상보적 데옥시리보핵산 (cDNA)을 투여하면 이후 IR-유발 기능 손실을 예방한다. (예: 두부 및 경부 암 환자에서) IR 치료 전에 AQP1 (예: 인간 AQP1; hAQP1)을 투여하면 IR-유발 타액 기능저하를 감소시키거나 또는 예방하여 타액 생산량을 상승시킬 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 특허 출원은 2021년 8월 4일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/229,279호의 우선권을 주장하며, 이는 참조에 의해 통합된다. 본 특허 출원은 또한 2022년 1월 7일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/297,342호의 우선권을 주장하며, 이는 참조에 의해 통합된다.
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두부 및 경부 암 환자에 대한 일반적인 치료는 이온화 방사선 (ionizing radiation: IR)을 포함한다. 그러나, 이들 환자에게 IR을 투여하면 침샘이 손상되어, 회복 불능의 손상을 입어서 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미친다.
이러한 병태에 대한 기존 요법은 존재하지 않는다. 그러나, 방사선 요법 후 아쿠아포린-1 (aquaporin-1: AQP1)을 코딩하는 벡터를 투여하면 침샘의 복구 및 재조작에 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 과정은 일부 측면에서는 효과적이지만, 환자에게 상당한 통증 및 고통을 초래할 수 있고 구강 건강에 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 따라서, 침샘에 대한 IR 요법의 부정적인 영향을 극복하기 위해, IR 치료를 받는 환자, 예컨대 두부 및 경부 암 환자를 치료하기 위한 개선된 방법이 여전히 필요하다.
발명의 간략한 요약
본 발명에 따르면, 놀랍게도 AQPI를 코딩하는 벡터를 방사선 조사 (irradiation) 전에 투여함으로써 IR 요법의 유해한 효과를 감소시키거나 또는 예방할 수 있다는 것을 발견하였다. IR 치료 전에 침샘에 AQP1 상보적 데옥시리보핵산 (cDNA)을 투여하면 이후 IR-유발 기능 손실을 예방한다. (예: 두부 및 경부 암 환자에서) IR 치료 전에 AQP1 (예: 인간 AQP1; hAQP1)을 투여하면 IR-유발 타액 기능저하를 감소시키거나 또는 예방하여 타액 생산량을 상승시킬 수 있다.
따라서, 일 양상에 따르면, 본 발명은 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애 (예: 기능저하)의 예방 또는 감소를 위해 AQP1 단백질을 코딩하는 벡터 (예: AAV 벡터) 및 이러한 벡터를 포함하는 비리온 (예: AAV 비리온)을 제공한다. 또한, 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 벡터 또는 비리온의 용도를 제공한다. 일 양상에서, 이러한 벡터 또는 비리온은 방사선-유발 타액 기능장애로부터 대상체를 보호하는데 유용하다.
일 양상에 따르면, 본 발명은 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 아쿠아포린 (AQP) 단백질을 코딩하는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 후에 상기 대상체에게 이온화 방사선을 투여하고, 이에 의해 상기 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 침샘 기능은 이온화 방사선 투여 전의 침샘 기능과 동등하거나, 또는 적어도 동등한 수준으로 유지될 수 있다.
상기 AQP 단백질은 AQP1 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 AQP 단백질일 수 있다. 예를 들어, 일 양상에서, 상기 AQP1 단백질은 인간 AQP1 (hAQP1) 단백질이거나 또는 이를 포함한다.
상기 AQP (예: hAPQP1)를 코딩하는 벡터는 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 벡터이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 양상에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 (예: 혈청형 2 또는 혈청형 5 아데노바이러스 벡터)이거나 또는 이를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated viral: AAV) 벡터 (예: AAV2, AAV5, AAV6, AAV44.9, 또는 BAAV)이거나 또는 이를 포함한다.
상기 바이러스 벡터 (예: AAV 벡터)는 벡터로서 또는 상기 벡터 (예: AAV 벡터)를 포함하는 비리온으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 일 양상에서, 상기 비리온은 AAV 비리온이거나 또는 이를 포함한다. 상기 벡터 또는 비리온은 임의의 적합한 위치에서 임의의 적합한 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 양상에서, 상기 벡터 또는 비리온은 대상체의 침샘에 투여된다.
도 1은 AQP1 처리된 마우스에서 타액 흐름 (saliva flow)을 보여주는 그래프이다. 타액 흐름은 체중 1 gm당 마이크로리터 (microliters)로 제시된다.
도 2는 AQP1 처리된 마우스에서 타액 흐름을 보여주는 그래프이다. 타액 흐름은 체중 1 gm당 마이크로리터로 제시된다.
도 3은 AQP1 처리된 마우스에서 타액 흐름을 보여주는 그래프이다. 타액 흐름은 체중 1 gm당 마이크로리터로 제시된다.
도 4는 단일 세포 RNAseq로 분석한 침샘 세포의 히트맵 (heatmap)이다. nonIR, GFP 처리된 IR 마우스, 또는 AQP1 처리 전 (AQP1 B) 또는 처리 후 (AQP1 A)의 단일 세포 RNAseq로부터의 데이터를 사용하여 UMAP를 생성하고, 16개의 별개의 세포 클러스터 (y-축)를 확인하였다. 4가지 조건들 각각에서 서로 다른 클러스터들 간의 세포들의 분포를 비교하여 히트맵을 생성하였다.
도 5의 A-D는 마우스 악하선 (submandibular glands)의 조직학 이미지이다. 상기 이미지는 일반적으로 문 (hilum) 부근의 각 샘의 동일한 영역을 전체 스캔한 슬라이드로부터 수득하였다. 5X 구분선의 점선 박스는 방사선으로 인한 변화, 섬유화, 위축 및 염증을 포함하는 특징들을 강조하기 위한 사진을 삽입하였다. 도 5A는 방사선 조사 전 AAV-GFP에 해당한다. 도 5B는 방사선 조사 전 AAV-AQP1에 해당한다. 도 5C는 방사선 조사 후 AAV-GFP에 해당한다. 도 5D는 방사선 조사 후 AAV-AQP1에 해당한다.
도 2는 AQP1 처리된 마우스에서 타액 흐름을 보여주는 그래프이다. 타액 흐름은 체중 1 gm당 마이크로리터로 제시된다.
도 3은 AQP1 처리된 마우스에서 타액 흐름을 보여주는 그래프이다. 타액 흐름은 체중 1 gm당 마이크로리터로 제시된다.
도 4는 단일 세포 RNAseq로 분석한 침샘 세포의 히트맵 (heatmap)이다. nonIR, GFP 처리된 IR 마우스, 또는 AQP1 처리 전 (AQP1 B) 또는 처리 후 (AQP1 A)의 단일 세포 RNAseq로부터의 데이터를 사용하여 UMAP를 생성하고, 16개의 별개의 세포 클러스터 (y-축)를 확인하였다. 4가지 조건들 각각에서 서로 다른 클러스터들 간의 세포들의 분포를 비교하여 히트맵을 생성하였다.
도 5의 A-D는 마우스 악하선 (submandibular glands)의 조직학 이미지이다. 상기 이미지는 일반적으로 문 (hilum) 부근의 각 샘의 동일한 영역을 전체 스캔한 슬라이드로부터 수득하였다. 5X 구분선의 점선 박스는 방사선으로 인한 변화, 섬유화, 위축 및 염증을 포함하는 특징들을 강조하기 위한 사진을 삽입하였다. 도 5A는 방사선 조사 전 AAV-GFP에 해당한다. 도 5B는 방사선 조사 전 AAV-AQP1에 해당한다. 도 5C는 방사선 조사 후 AAV-GFP에 해당한다. 도 5D는 방사선 조사 후 AAV-AQP1에 해당한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 침샘 (예: 이하선, 악하선 또는 설하선)에 영향을 미치는 IR 치료를 받는 대상체 (예: 인간 환자)를 아쿠아포린 (AQP) 단백질을 코딩하는 벡터로 사전-치료하는 (pretreating) 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 암 예컨대 두부 및 경부 암에 대한 IR 치료를 받는 대상체에게 적용될 수 있다. 따라서, 제1 양상에 따르면, 본 발명은 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 아쿠아포린 (AQP) 단백질을 코딩하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 후에 상기 대상체에게 이온화 방사선을 투여하고, 이에 의해 상기 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된, 아쿠아포린 단백질 (aquaporin protein)은 또한 AQP 단백질로서 지칭되며, 예시되는 아쿠아포린 단백질 (예: 인간 아쿠아포린 ("hAQP"))의 활성, 예컨대 물이 통과할 수 있는 채널을 형성하는 능력을 나타내는 임의의 단백질이거나 또는 이를 포함할 수 있다. AQP 단백질, 핵산 및 관련 벡터가 당업자에게 알려져 있으며, 비-제한적인 예로서 US 특허 제10,166,299호에 기재되어 있고, 그 전체 내용은 본원에 참조에 의해 통합된다.
본 발명의 맥락에서, AQP 단백질은 야생형 (wt) AQP 서열을 갖거나 또는 이를 포함할 수 있거나 (즉, 이는 천연 AQP 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가짐), wt AQP 단백질의 임의의 일부이거나 또는 이를 포함할 수 있거나, 또는 천연 AQP 단백질의 변이체이거나 또는 이를 포함할 수 있고, 단 이러한 일부 또는 변이체는 물이 통과할 수 있는 채널을 형성하는 능력을 보유한다. 물이 통과할 수 있는 채널을 형성하는 본 발명의 AQP 단백질의 능력을 결정하는 분석은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, Lui et al., Journal of Biological Chemistry, 281, 15485-15495 (2006)를 참조하고, 그 전체 내용은 본원에 참조에 의해 통합됨).
일 양상에서, 본 발명의 방법에 유용한 단백질은 자연 발생 AQP1 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하는 AQP1 단백질이다. 인간 AQP1 단백질의 예로는 NCBI Reference No. NP_932766.1 (서열 번호: 1), NCBI Reference No. NP_001171989.1 (서열 번호: 2), 및 NCBI Reference No. NP_001171990.1 (서열 번호: 3), 및 NP_001171991.1 (서열 번호: 4)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 뮤린 (murine) AQP1 단백질의 예로는 서열 번호: 5를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용하기 위한 AQP 단백질, 핵산 및 관련 벡터의 예는 본원 및 US 특허 제10,166,299호 (그 전체 내용은 참조에 의해 통합됨)에 기재되어 있다.
일 양상에서, AQP1 단백질은 AQP1 단백질의 아미노산 서열의 일부를 포함하며, 여기서 AQP1 단백질의 이러한 일부는 물이 통과할 수 있는 세포막 내 채널을 형성하는 능력을 보유한다. AQP1 단백질의 여러 이소형 (isoforms)이 존재한다. 따라서, 일 양상에서, AQP1 단백질은 AQP-단백질의 이소형이거나 또는 이를 포함하며, 이러한 이소형은 물이 통과할 수 있는 채널을 형성하는 능력을 보유한다. 일 양상에서, AQP1 단백질은 AQP1 단백질의 이소형 또는 다른 자연 발생 변이체의 일부이거나 또는 이를 포함하며, 여기서 이러한 일부는 물이 통과할 수 있는 막 내 채널을 형성하는 능력을 보유한다. AQP1 단백질의 기능적 부분 및 변이체, 예컨대 AQP1 단백질의 보존적 변이체를 생성하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
또한, 유전자 조작에 의해 변경된 AQP1 단백질 변이체가 본 발명에 포함된다. 이러한 변이체와 관련하여, 변이체가 본원에 기재된 적어도 하나의 AQP1 단백질 활성을 보유하는 한, 아미노산 서열의 모든 타입의 변경이 허용된다. 이러한 변형의 예로는 아미노산 결실, 아미노산 삽입, 아미노산 치환 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상 (예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산이 해당 단백질의 활성에 유의미한 영향을 주지 않으면서 단백질의 아미노 및/또는 카복시 말단으로부터 제거될 수 있다는 것이 당업자에 의해 잘 이해된다. 유사하게, 하나 이상 (예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산이 종종 해당 단백질의 활성에 유의미한 영향을 주지 않고 단백질에 삽입될 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 단리된 변이체 단백질은 또한 본원에 개시된 야생형 AQP1 단백질과 비교하여 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 해당 단백질의 활성이 유의미하게 영향을 받지 않는 한 모든 아미노산 치환이 허용된다. 이와 관련하여, 아미노산은 이들의 물리적 특성에 기반하여 그룹으로 분류될 수 있다는 것이 당해 기술 분야에서 인식되고 있다. 이러한 그룹의 예로는 하전된 아미노산, 하전되지 않은 아미노산, 극성의 하전되지 않은 아미노산, 및 소수성 아미노산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 치환을 함유하는 바람직한 변이체는 아미노산이 동일한 그룹의 아미노산으로 치환된 변이체이다. 이러한 치환을 보존적 치환이라고 한다.
목적하는 아미노산 치환 (보존적 또는 비-보존적 여부에 관계없이)은 이러한 치환이 필요한 시점에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 사용하여 AQP1 단백질의 중요한 잔기를 확인하거나, 또는 본원에 기재된 AQP1 단백질의 친화도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 상기 AQP1 단백질 변이체는 본원에 기재된 AQP1 단백질 (예: 서열 번호: 1-5)에 비해 적어도 하나 (예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 이들 값들의 임의의 범위)의 아미노산 치환 (예: 보존적 치환)을 포함한다. 일 양상에서, 상기 AQP1 단백질은 본원에 기재된 AQP1 단백질 (예: 서열 번호: 1-5)과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 단백질은 본원에 개시된 서열 및 개시된 이의 변이체로 전체적으로 구성될 수 있고, 이러한 단백질은 AQP1 활성을 부여하지 않지만 다른 유용한 기능을 갖는 아미노산 서열을 추가로 함유할 수 있다. 물이 통과할 수 있는 채널을 형성하는 해당 단백질의 능력에 추가 서열이 원치 않는 영향을 미치지 않는 한, 임의의 유용한 추가 아미노산 서열이 단리된 단백질 서열에 추가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단리된 단백질은 펩티드를 시각화하거나 또는 정제하는데 유용한 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 표지 (예: 효소) 또는 태그 (예: 항체 결합 부위)로서 역할을 한다. 이러한 표지 및 태그의 예로는 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 글루타티온-s-트란스퍼라제, 티오레독신, HIS-태그, 비오틴 태그 및 형광 태그를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 단백질 표지화 및 태깅을 위한 다른 유용한 서열이 당업자에게 알려져 있다.
상기 기재된 변형에 추가하여, 본 발명의 단리된 단백질은 추가로 변형될 수 있으며, 단 이러한 변형은 물이 통과할 수 있는 채널을 형성하는 해당 단백질의 능력에 유의미한 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 해당 단백질의 안정성, 용해도 또는 흡수성을 증가시키기 위한 이러한 변형이 수행될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 펩티드의 PEG화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 팔미토일화, 아미드화 및/또는 다른 화학적 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
AQP1 단백질은 기능성 AQP1 단백질을 발현하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. AQP1 단백질은 인간 또는 다른 포유동물 AQP1 단백질의 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 추가적인 예로는 뮤린, 고양이, 개, 말, 소, 양, 돼지 또는 다른 반려 동물, 다른 동물원 동물, 또는 다른 가축 AQP1 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일 양상에서, AQP1 단백질은 인간 AQP1 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 다른 양상에서, AQP1 단백질은 뮤린 AQP1 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 일부를 포함한다.
일 양상에서, AQP1 단백질은 융합 세그먼트에 연결되고; 이러한 단백질을 AQP1 융합 단백질이라고 한다. 이러한 단백질은 AQP1 단백질 도메인 (본원에서는 또한 AQP1 도메인으로 지칭됨) 및 융합 세그먼트를 포함한다. 융합 세그먼트는 AQP1 단백질의 특성을 증진시킬 수 있는 임의의 크기의 아미노산 세그먼트이다. 예를 들어, 본 발명의 융합 세그먼트는 AQP1 융합 단백질의 안정성을 증가시키거나, 가요성을 추가하거나, 또는 AQP1 융합 단백질의 다량체화를 증진 또는 안정화시킬 수 있다. 융합 세그먼트의 예로는 면역글로불린 융합 세그먼트, 알부민 융합 세그먼트, 및 단백질의 생물학적 반감기를 증가시키고, 단백질에 가요성을 제공하고, 및/또는 다량체화를 가능하게 하거나 또는 안정화시키는 임의의 다른 융합 세그먼트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 융합 세그먼트를 사용하는 것은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 융합 세그먼트는 본 발명의 AQP1 단백질의 아미노 말단 및/또는 카복실 말단에 연결될 수 있다. 본원에서 사용된, "연결 (join)"은 유전 공학 기술을 사용한 부착에 의한 결합을 의미한다. 이러한 일 양상에서, AQP1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 융합 세그먼트를 코딩하는 핵산 분자에 물리적으로 연결되어 2개의 코딩 서열들은 프레임 내에 존재하고 전사 산물은 연속 융합 단백질을 형성한다. 일 양상에서, AQP1 단백질은 융합 세그먼트에 직접 연결될 수 있거나, 또는 AQP1 단백질은 융합 세그먼트에 하나 이상의 아미노산의 링커에 의해 연결될 수 있다.
본원에 기재된 AQP1 단백질 (예: AQP1 융합 단백질)을 코딩하는 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드)가 또한 본 발명의 일 양상으로서 제공된다. 상기 핵산 분자는 DNA, cDNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 자연 발생, 합성 및/또는 재조합일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체 (예: 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 및 유사물)를 포함할 수 있다. 코딩 서열에서의 침묵 돌연변이는 유전자 코드의 축퇴 (즉, 중복성)로 인해 발생하며, 이로 인해 하나 초과의 코돈이 동일한 아미노산 잔기를 코딩할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 류신은 CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, 또는 TTG로 코딩될 수 있고; 세린은 TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, 또는 AGC로 코딩될 수 있으며; 아스파라긴은 AAT 또는 AAC로 코딩될 수 있고; 아스파르트산은 GAT 또는 GAC로 코딩될 수 있으며; 시스테인은 TGT 또는 TGC로 코딩될 수 있고; 알라닌은 GCT, GCC, GCA, 또는 GCG로 코딩될 수 있으며; 글루타민은 CAA 또는 CAG로 코딩될 수 있고; 티로신은 TAT 또는 TAC로 코딩될 수 있으며; 이소류신은 ATT, ATC, 또는 ATA로 코딩될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달할 수 있고 및/또는 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있게 하는 요소들을 포함하는 구조체의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들어, AQP1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열과 적합한 조건하에 달성되도록 결찰된다. 상기 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질-코딩 유전자 선두의 개시 코돈 (즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하는 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지 및 정지 코돈을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적절한 프로모터에는 SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 CMV 급초기 I 프로모터, 폭스바이러스 프로모터, 30K 프로모터, I3 프로모터, sE/L 프로모터, 7.5K 프로모터, 40K 프로모터, 및 C1 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
AQP1 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인 비트로 방법, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사-기반 증폭 시스템 (TAS), 자가-유지 서열 복제 시스템 (3SR) 및 ≤ 레플리카제 증폭 시스템 (QB)에 의해 클로닝 또는 증폭될 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질 (zinc finger protein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 해당 분자의 DNA 서열에 기반한 프라이머를 사용하여 cDNA의 중합효소 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다. 다양한 클로닝 및 인 비트로 증폭 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 사용하기 위한 벡터에는 플라스미드 (예: DNA 플라스미드), 박테리아 벡터, 및 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 폭스바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 폴리오 바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터를 포함한다. 상기 벡터가 플라스미드 (예: DNA 플라스미드)인 경우, 상기 플라스미드는 키토산과 복합체를 형성할 수 있다.
일 양상에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 (예: 혈청형 2 또는 혈청형 5) 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터이거나 또는 이를 포함한다. 이러한 AAV 벡터는 AAV1 벡터, AAV2 벡터, AAV3 벡터, AAV4 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV8 벡터, AAV9 벡터, AAV10 벡터, AAV11 벡터, AAV12 벡터, AAV44.9 (U.S. 특허출원공개 제2018/0355376호 (그 전체 내용이 본원에 통합됨), 및 전술한 U.S. 특허 제10,166,299호에 기재됨), AAAV 벡터, 및 BAAV 벡터로부터 선택될 수 있고, 여기서 이러한 벡터는 본원에 기재된 AQP1 단백질을 코딩한다.
일 양상에서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, 또는 BAAV 벡터이거나 또는 이를 포함하고, 여기서 각 벡터는 본원에 기재된 AQP1 단백질을 코딩한다. 일 양상에서, 상기 AAV 벡터는 AAV ITR 및 AQP1 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 CMV 프로모터를 포함한다.
AQP1 단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터가 또한 제공된다. 이러한 플라스미드 벡터는 또한 제어 영역, 예컨대 AAV ITR, AQP1 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 이러한 플라스미드 벡터는 또한 전형적으로 약물 내성을 코딩하는 핵산 분자뿐만 아니라 다수의 제한 효소 부위를 포함한다.
본 발명은 또한 AAV 비리온을 제공한다. 본원에서 사용된, AAV 비리온은 AAV 캡시드에 캡시드화된 본 발명의 AQP1 단백질을 코딩하는 AAV 벡터를 포함한다. AAV 캡시드의 예로는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, AAV44.9 캡시드, AAAV 캡시드, BAAV 캡시드, 및 당업자에게 알려져 있는 다른 AAV 혈청형 유래의 캡시드를 포함한다. 일 양상에서, 상기 캡시드는 키메라 캡시드, 즉 하나 초과의 혈청형 유래의 VP 단백질을 포함하는 캡시드이다. 본원에서 사용된, 본 발명의 AAV 비리온의 혈청형은 VP 캡시드 단백질에 의해 부여된 혈청형이다. 예를 들어, AAV2 비리온은 AAV2 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 포함하는 비리온이다. 비리온이 침샘의 관 또는 샘꽈리 세포 (acinar cell)를 효율적으로 형질도입할 수 있는 한 임의의 AAV 비리온이 본 발명의 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
일 양상에서, 상기 AAV 비리온은 AAV2 비리온, AAV5 비리온, AAV6 비리온 및 BAAV 비리온으로부터 선택되고, 여기서 상기 비리온 내의 AAV 벡터는 AQP1 단백질을 코딩한다.
본원에 개시된 AAV 벡터 및 AAV 비리온을 생산하는데 유용한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 간략하게, 본 발명의 AAV 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 기술을 사용하여 관심 핵산 서열을 단리하고, 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 당업자에게 알려져 기술, 예컨대 제한 효소 소화, 결찰, PCR 증폭 등을 사용하여 이들을 함께 연결시킴으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 AAV 비리온을 생산하는 방법은 전형적으로 (a) 본 발명의 AAV 벡터를 숙주에 도입하는 단계, (b) 헬퍼 벡터를 상기 숙주 세포에 도입하는 단계 (여기서 상기 헬퍼 벡터는 AAV 벡터로부터 누락된 바이러스 기능을 포함함), 및 (c) 헬퍼 바이러스를 상기 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. AAV 벡터를 AAV 비리온으로 복제 및 패키징을 달성하기 위해 AAV 비리온 복제 및 패키징을 위한 모든 기능이 존재해야 한다. 일부 경우에는 헬퍼 벡터에 의해 코딩된 바이러스 기능들 중 적어도 하나가 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다. 벡터 및 헬퍼 바이러스의 도입은 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있으며, 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있다. 그 다음에 숙주 세포를 배양하여 AAV 비리온을 생산하고, 그 다음에 표준 기술, 예컨대 CsCl 구배를 사용하여 정제한다. 잔류 헬퍼 바이러스 활성은 알려진 방법, 예컨대 열 불활성화 (heat inactivation)를 사용하여 불활성화시킬 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 사용 준비된 고도로 정제된 AAV 비리온을 높은 역가로 생성한다.
명시된 혈청형의 AAV 벡터는 동일한 혈청형의 캡시드에 패키징될 수 있다. 예를 들어, AAV2 벡터는 AAV2 캡시드에 패키징될 수 있다. 다른 경우에, 명시된 혈청형의 AAV 벡터는 생성된 비리온의 향성 (tropism)을 변형시키기 위해 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징된다. AAV 벡터 혈청형 및 AAV 캡시드 혈청형의 조합은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 벡터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함할 수 있어서, 상기 코딩 서열의 발현은 발현 제어 서열과 적합한 조건하에 달성된다. 상기 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질-코딩 유전자 선두의 개시 코돈 (즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하는 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지 및 정지 코돈을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "인핸서 (enhancer)"는 예를 들어 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역으로부터 수 킬로베이스 (kilobases) 이격되어 위치할 수 있으며, 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴 또는 DNA 구조의 변화를 매개할 수 있다. 다양한 서로 다른 공급원으로부터의 다수의 인핸서가 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, (예를 들어, 기탁소 예컨대 ATCC 및 기타 상업적 또는 개별 공급원으로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서 또는 이들 내에 이용 가능하다. 프로모터 (예: 일반적으로 사용되는 CMV 프로모터)를 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드는 또한 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 업스트림, 내부 또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 CMV 인핸서/닭 (chicken) β-액틴 프로모터 (또한, "CAG 프로모터"라고 함)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 추가로, 상기 벡터는 벡터의 형질감염/형질도입 효율을 확인하기 위해 리포터를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
AQP 단백질을 코딩하는 벡터 (예: AAV 벡터)를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. AQP1 단백질을 코딩하는 AAV 벡터를 포함하는 AAV 비리온을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 이러한 조성물은 담체 (예: 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 수성 용액, 예컨대 생리학적으로 적합한 완충액을 포함할 수 있다. 조성물에 포함되는 부형제의 예로는 물, 식염수, 링거 용액 및 기타 생리학적으로 균형 잡힌 염 수용액을 포함한다. 일부 양상에서, 예를 들어 입자 안정성을 유지하거나 또는 응집을 방지하기 위해 부형제가 부가된다. 이러한 부형제의 예로는 당업자에게 알려져 있는 입자 안정성을 유지하기 위한 마그네슘, 점착을 감소시키기 위한 플루론산, 응집을 감소시키기 위한 만니톨, 및 유사물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
조성물은 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 편리하게 제제화된다. 이러한 조성물을 제제화하는 기술은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터 (예: AAV 벡터) 또는 비리온은 식염수 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 용액과 조합될 수 있다. 일부 양상에서, 부형제가 또한 부가된다. 또 다른 양상에서, 벡터 (예: AAV 벡터) 또는 비리온을 포함하는 조성물이 건조되고, 식염수 용액 또는 기타 약학적으로 허용 가능한 용액을 투여 전에 조성물에 부가할 수 있다.
또한, 상기 벡터 또는 비리온은 단독으로 또는 약학적 제제의 일부로서 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
상기 조성물 (예: 약학적 조성물)은 하나 이상의 다른 추가 치료제를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 사용하기에 적합할 수 있는 이러한 추가 치료제의 예로는 유전자 요법, 항염증제, 자유 라디칼 제거제, 방사선 보호제 (radioprotectants), 및 타액 생성을 증가시키는 약제 또는 약물을 포함한다.
상기 바이러스 벡터 (예: AAV 벡터)는 대상체에게 벡터로서 또는 벡터 (예: AAV 벡터)를 포함하는 비리온으로서 투여될 수 있다. 일 양상에서, 상기 비리온은 AAV 비리온이다. 상기 벡터 또는 비리온은 임의의 적합한 위치에서 임의의 적합한 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 양상에서, 상기 벡터 또는 비리온은 대상체의 침샘에 투여된다.
본원에서 사용된, 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 벡터 또는 비리온의 능력은 방사선-유발 타액 기능장애를 완전히 또는 부분적으로 제거하는 이러한 벡터 또는 비리온의 능력을 의미한다. 예를 들어, 타액의 흐름과 관련하여, 본 발명의 방법은 그러한 흐름을 정상적인 개인 (즉, 방사선을 투여받지 않은 개인)에서 관찰되는 값의 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 회복시킬 수 있다.
본 개시내용은 벡터 또는 비리온을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 이러한 투여로 방사선 조사 후 대상체에서 침샘 기능을 유지한다. 본원에서 사용된, 상기 벡터 또는 비리온이 투여된 대상체에서 침샘 기능을 유지한다는 것은 방사선 투여 후 침샘 기능이 방사선 투여 전 대상체에서의 침샘 기능과 동등 (또는 적어도 동등)한 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 벡터 또는 비리온이 투여된 대상체에게 방사선을 조사한 후에, 대상체에서의 침샘 기능은 악화되지 않았고, 방사선 조사 전의 기능과 동등 (또는 적어도 동등)하다. 본 발명의 일 양상에서, 상기 방법은 (a) 이온화 방사선으로 치료하지 않은 대상체에게 AQP 단백질을 코딩하는 벡터를 투여하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 후에 상기 대상체에게 이온화 방사선을 투여하고, 이에 의해 상기 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된, "대상체 (subject)"는 인간 및 다른 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 고양이, 개, 돼지, 소, 말, 다른 반려 동물, 다른 동물원 동물, 실험 동물 (예: 마우스), 및 가축을 포함한다.
상기 벡터 또는 비리온은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 상기 벡터 또는 비리온은 에어로졸로 투여된다. 일부 양상에서, 상기 벡터 또는 비리온은 점막 (mucosa)에 투여된다. 일부 양상에서, 상기 벡터 또는 비리온은 조직 또는 장기에 직접 투여된다. 일부 양상에서, 상기 벡터 또는 비리온은 침샘 (예: 이하선, 악하선 또는 설하선)에 투여된다.
본 발명은 또한 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 엑스 비보 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 벡터 또는 비리온을 대상체의 신체 외부의 세포, 조직 또는 장기에 투여한 다음에, 해당 세포, 조직 또는 장기를 신체에 배치하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있다.
양상들에서, 본 발명은 AQP1 단백질을 코딩하는 AAV 벡터로 형질감염된 세포 (예: 침샘 세포), 조직 또는 장기를 제공한다. 상기 세포 (예: 침샘 세포), 조직 또는 장기 (예: 침샘, 예컨대 이하선, 악하선 또는 설하선)는 방사선 조사를 받을 계획이거나 또는 방사선 조사를 받은 대상체의 세포, 조직 또는 장기, 또는 엑스 비보 세포, 조직 또는 장기일 수 있다.
상기 벡터, 비리온, 또는 이의 조성물 (예: 약학적 조성물)은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 적합할 수 있는 그러한 추가 치료제의 예로는 유전자 요법, 항염증제, 자유 라디칼 제거제, 방사선 보호제, 및 타액 생성을 증가시키는 약제 또는 약물을 포함한다.
대상체에게 투여되어 효과적인 (즉, 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는) 본원에 개시된 조성물의 투여량은 대상체의 병태, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 예시되는 투여량은 대상체의 1 킬로그람 (kilogram)당 약 104개의 비리온 입자 내지 1 킬로그람당 약 1012개의 비리온 입자의 범위 (예: 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 및 이들의 범위)일 수 있다. 바람직한 투여량은 1 킬로그람당 약 106개의 비리온 입자 내지 1 킬로그람당 약 1012개의 비리온 입자의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1 킬로그람당 약 108개의 비리온 입자 내지 1 킬로그람당 약 1012개의 비리온 입자의 범위이다.
대안적인 예시되는 투여량은 상기 샘 1 그람 (gram)당 약 104개의 비리온 입자 내지 상기 샘 1 그람당 약 1012개의 비리온 입자의 범위 (예: 약 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1011, 1012 또는 이들의 범위)일 수 있다.
일부 양상들에서, 상기 투여량은 상기 샘을 충전하는데 필요한 유체 (fluid)의 양에 의해 결정된다. 벡터와 세포의 접촉이 발생하려면, 상기 벡터를 세포에 도입하기 위해 상기 샘을 유체로 충전해야 한다. IR 환자의 경우, 부피는 위축 및 섬유화에 따라, 약 500 μL 내지 약 2.5 mL의 범위 (예: 500 μL, 600 μL, 700 μL, 800 μL, 900 μL, 1 mL, 1.1 mL, 1.2 mL, 1.3 mL, 1.4 mL, 1.5 mL, 1.6 mL, 1.7 mL, 1.8 mL, 1.9 mL, 2 mL, 2.1 mL, 2.2 mL, 2.3 mL, 2.4 mL, 2.5 mL, 또는 이들의 범위)이다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는 IR 치료 전 및 후에 AQP1을 코딩하는 벡터 (AAV 벡터)의 투여가 침샘 기능을 촉진한다는 것을 입증한다.
모든 뮤린 실험은 NIDCR (National Institute of Dental and Craniofacial Research) 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 8주령의 암컷 C3H 마우스 (National Cancer Institute Animal Production Area)를 사용하였다. 7-8마리의 C3H 마우스 그룹을 방사선 조사 (IR) 전 10일 또는 조사 후 2개월에 GFP, AQP1, 뉴투린 (neurturin) 또는 AAV2-AQP1+ AAV2-뉴투린의 조합을 코딩하는 AAV2 벡터들로 처리하였다.
구체적으로, 치료 그룹들에는 IR 전 10일 또는 IR 후 60일에 AAV2-GFP (1010 vp/g) 또는 AAV2-hAQP1 (1010 또는 107 vp/g) 또는 AAV2NRTN (106, 108, 또는 1010 vp/g)의 주사를 포함하였다. 기저선 타액 (non-IR)은 벡터 전달 또는 IR 전에 수집하였다. 침샘에 방사선 조사를 위해, 각 동물을 특별히 제작된 Lucite 지그 (jig)에 배치하였다. 이러한 지그는 마취제를 사용하지 않고 동물을 고정시키고, 두부 및 경부 부위에만 IR을 허용한다.
Therapax DXT300 X-선 조사장치 (Pantak)를 사용하여 마우스에게 5분할 (5일 동안 6 Gy/day)로 조사하였다. IR 후에, 동물을 상기 지그로부터 꺼내어, 기후- 및 광-제어된 환경에 수용하고 (케이지당 5마리), 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 바이러스 벡터를 악하선에 전달하기 위해, 마우스를 케타민 (60 mg/kg) 및 크실라진 (8 mg/kg)으로 근육 내로 마취시키고, 그 후 벡터는 두 악하선으로 후관 주입 (retro-ductal infusion)을 통해 전달하였다. 캐뉼러 삽입 중에, 형질도입 효율을 증가시키기 위해, 0.5 mg/kg 아트로핀을 근육 내로 적용하여 타액 분비를 억제하였다.
타액 수집을 위해, 마우스를 전술한 바와 같이 마취시킨 후에, 필로카르핀 (pilocarpine)을 체중 1 kg당 0.25 mg으로 피하 주사하여 타액 분비를 자극하였다. 전체 타액을 75-mm 헤마토크릿 튜브 (hematocrit tube, Drummond)를 사용하여 1.5 mL 사전-중량 에펜도르프 튜브에 20분 동안 수집하고, 즉시 냉동하였다. 10개월 후에, 마우스를 이산화탄소 챔버에서 희생시키고, 분석을 위해 상기 샘을 채취하였다. 실험 시작 전에 마우스로부터 타액을 수집하였다 (기저선/non-IR). 그 결과는 도 1-3에 제시한다.
그 결과는 AAV2-GFP 처리된 마우스와 비교하여, AAV2-AQP1 처리가 IR 전에 투여되는 경우 타액 흐름의 손실을 방지할 수 있거나 또는 IR 후 타액 흐름의 회복을 개시할 수 있음을 보여준다 (p＜.01) (도 1-3 참조). 대조적으로, 뉴투린은 타액 흐름의 손실만을 방지할 수 있고, 실질적인 회복을 개시할 수 없었다. 더욱이, 상기 2개의 벡터들의 조합은 시너지 효과를 나타내지 않았으며, IR 전 또는 후에 AAV2AQP1 벡터 단독 투여로 달성된 수준을 넘어서는 타액 흐름의 실질적인 증가를 나타내었다.
이러한 결과는 IR 치료 전 및 후에 AAV-AQP1의 투여가 침샘 기능을 촉진한다는 것을 뒷받침한다.
본 발명 이전에는 AQP1 유전자 요법은 AQP1 발현이 체액 이동을 위한 촉진된 경로를 형성하기 위해 안정한 상피 세포를 필요로 한다는 것이 통상적인 이해였다. AQP1의 임상 시험에서, 환자는 IR 치료 후 적어도 2년을 필요로 하였다. IR 치료 후에 유의미한 세포 전환 및 리모델링이 존재하기 때문에, AQP1 AAV DNA는 IR 치료 후 형질도입된 세포로부터 손실되어 (즉, 지속되지 않음), 체액 이동을 위한 촉진된 경로를 형성할 수 없을 것으로 기대되었다. 예를 들어, Malik et al., J. Virol., 71(3): 1776-1783 (1997))은 AAV가 비분열 세포에서만 지속될 수 있고 경시적으로 분열 집단에서 소실된다는 것을 교시하고 있다. Li et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 62(5): 1510-1516 (2005))은 IR 후에 상기 선에서 유의미한 리모델링이 일어나고, 변화로 인해 기능 손실이 뒤따른다고 교시하고 있다. 또한, Vitolo et al., Oral Diseases, 8: 183-191 (2002))은 AQP1 유전자 요법은 상기 선의 회복을 위한 것인 반면에, 다른 접근법은 상기 선에 대한 IR 손상을 예방하기 위한 것이라고 교시하고 있다. Vitolo 등은 또한 침샘은 천천히 분열하는 세포 집단이며, AAV 형질도입이 침샘에서 지속될 수 있음을 개시하였다.
그러므로, 본 발명 이전에는 AQP1 유전자 요법이 IR-유발 기능저하에 대한 예방 접근법으로 사료되지 않았으며, 이는 AQP1 유전자 요법이 IR 후 침샘과 같은 변화 및 리모델링 환경에서는 지속되지 않았기 때문이다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, IR 치료 전 및 후에 AAV-AQP1의 투여는 침샘 기능을 촉진한다는 본원에 개시된 본 발명은 놀랍고 예상치 못한 일이다.
실시예 2
본 실시예는 IR 전 및 후의 타액 흐름의 기전을 특성화한다.
nonIR, GFP 처리된 IR 마우스, 또는 AQP1 처리 전 (AQP1B) 또는 처리 후 (AQP1A)의 단일 세포 RNAseq로부터의 데이터를 사용하여 UMAP를 생성하고, 16개의 별개의 세포 클러스터를 확인하였다. 4가지 조건들 각각에서 서로 다른 클러스터들 간의 세로 분포를 비교하여 도 4의 히트맵을 생성하였다.
AQP1B는 nonIR과 동일한 클레이드 (clade)에서 발견될 수 있는 반면에, GFP 및 AQP1A는 각각 별개의 클레이드에 있고, AQP1B/nonIR 클레이드와는 별개의 클레이드에 있다. 그 결과는 AQP1A 및 AQP1B 간의 세포 집단이 상이하다는 것을 시사한다. 또한, AQP1B의 세포 타입-기반 분포의 클레이드 조직은 nonIR과 가장 유사하지만, AQP1A는 이러한 그룹 및 IR 효과 GFP 그룹과 별개의 클레이드를 형성한다.
이러한 결과는 타액 흐름이 IR 전에 제공되는 경우 침샘 보호의 결과임을 뒷받침하며; 그러나, IR 후에 제공되는 경우 별개의 세포 집단 및 환경에서 타액 흐름의 회복이 가능하다.
실시예 3
본 실시예는 방사선 조사 전 AAV-AQP1의 투여가 방사선 조사 후 AAV-AQP1의 투여와 비교하여 병리학적 변화가 적다는 것을 입증하였다.
마우스 악하선의 조직학을 평가하였다. 조사 전 AAV-GFP (도 5A), 조사 전 AAV-AQP1 (도 5B), 조사 후 AAV-GFP (도 5C), 및 조사 후 AAV-AQP1 (도 5D)을 투여한 마우스의 이미지를 일반적으로 문 부근의 각 샘의 동일한 영역을 전체 스캔한 슬라이드로부터 수득하였다. 상기 샘의 전반적인 형태학적 변화는 H&E 염색으로 평가하였다.
0-3의 등급 스케일을 사용하여, 위축, 섬유화 및 면역 침윤에 대해 절편을 평가하였다. 전체적으로 모두 위축 및 섬유화가 증가하였다. 이들은 또한 선내 배중심 형성 (intraglandular germinal center formation)과 선 캡슐 (gland capsule) 내에 존재하는 반응성 림프절에 염증이 증가하였다. 다핵 샘꽈리 세포 (multinucleate acinar cells)의 수가 증가하고, 일부 영역에서 관 증식 (ductal hyperplasia)이 나타났다.
그러나, 치료후 그룹의 평균 스코어는 2.2 +/- 0.75였고, 치료전 그룹의 평균 스코어는 1.5+/-.54였다 (p＞0.05). 그러므로, IR 치료 후 그룹은 IR 치료 전 그룹과 비교하여 더 주목할만한 병리학적 변화를 보이는 경향이 있었다 (도 5A-D).
이러한 결과는 AQP1을 코딩하는 벡터를 조사 전에 투여하면 AQPI를 코딩하는 벡터를 조사 후에 투여하는 경우에 관찰되는 유해 효과를 감소시킨다는 것을 뒷받침한다.
본원에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은, 각 참조문헌이 참조에 의해 개별적으로 및 구체적으로 표시되고, 본원에 그 전체로 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 참조에 의해 통합된다.
본 발명을 서술하는 맥락에서 (특히 하기 청구범위의 맥락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 "적어도 하나" 및 유사한 지시어의 사용은 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 하나 이상의 항목들의 목록이 뒤따르는 용어 "적어도 하나"의 사용 (예를 들어, "적어도 하나의 A 및 B")은, 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 열거된 항목들로부터 선택된 하나의 항목 (A 또는 B) 또는 열거된 항목들 중 2개 이상의 임의의 조합 (A 및 B)을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포괄하는" 및 "함유하는"은, 달리 언급하지 않는 한, 개방형 (open-ended) 용어 (즉, "포함하지만 이에 한정되지 않음"을 의미함)로서 해석되어야 한다. 본원에서 값들의 범위의 기재는 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 단지 해당 범위내에 속하는 각각의 별개 값을 개별적으로 기재하는 약식 방법으로 제공되는 것으로 의도되며, 각각의 별개 값은 본원에서 개별적으로 기재되는 것처럼 명세서에 통합된다. 본원에 기재된 모든 방법들은 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예, 또는 예시적 표현 (예: "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 두는 것은 아니다. 명세서의 어떤 표현도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 지시하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 방식을 포함하여 본 발명의 바람직한 구체예들이 본원에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 구체예들의 변형은 전술된 설명을 읽을 때 당업자들에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 것으로 기대하며, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 본 발명이 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는, 본원에 첨부된 청구범위에 기재된 대상의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 더욱이, 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 전술한 요소들의 모든 가능한 변형으로의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
생물학적 서열
하기 서열들이 본원에서 참조된다:
Claims (15)
- 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애 (radiation-induced salivary dysfunction)를 예방하거나 또는 감소시키는 방법으로서,
(a) 아쿠아포린 (aquaporin: AQP) 단백질을 코딩하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및
(b) 상기 (a) 후에 상기 대상체에게 이온화 방사선 (ionizing radiation)을 투여하고,
이에 의해 상기 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 단계를 포함하는 방법. - 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 방법에서 아쿠아포린 (AQP) 단백질을 코딩하는 벡터의 용도로서, 상기 방법은:
(a) 아쿠아포린 (AQP) 단백질을 코딩하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및
(b) 상기 (a) 후에 상기 대상체에게 이온화 방사선을 투여하고,
이에 의해 상기 대상체에서 방사선-유발 타액 기능장애를 예방하거나 또는 감소시키는 단계를 포함하는 것인 아쿠아포린 (AQP) 단백질을 코딩하는 벡터의 용도. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 벡터를 상기 대상체의 침샘에 투여하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AQP 단백질은 AQP1 단백질을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 4에 있어서, 상기 AQP1 단백질은 인간 AQP1 단백질을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 6에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 7에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 혈청형 2 또는 혈청형 5를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 6에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated viral: AAV) 벡터를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 9에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV6, AAV44.9, 또는 BAAV를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV 벡터를 포함하는 비리온 (virion)으로서 투여되는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 11에 있어서, 상기 비리온은 AAV 비리온을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 침샘 기능은 이온화 방사선 투여 전의 침샘 기능과 동등하거나 또는 적어도 동등한 수준으로 유지되는 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 환자인 것인 방법 또는 용도.
- 청구항 14에 있어서, 상기 환자는 두부 및 경부 암 (head and neck cancer)을 앓고 있는 것인 방법 또는 용도.
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