CN117813314A

CN117813314A - 用于治疗神经纤维瘤疾患的组合物和方法

Info

Publication number: CN117813314A
Application number: CN202280049047.XA
Authority: CN
Inventors: S·R·普洛特金; M·伍顿; D·苏海; S·高
Original assignee: Nf2 Treatment Co
Current assignee: Nf2 Treatment Co
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2024-04-02
Also published as: WO2022261209A1; US20230056226A1; EP4352079A1

Abstract

本文提供了用于治疗神经纤维瘤疾患的组合物和方法，诸如从病毒载体表达Merlin蛋白或其功能片段。

Description

用于治疗神经纤维瘤疾患的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年6月8日提交的美国临时申请号63/202,359的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

神经纤维瘤病2(NF2)是一种罕见的遗传性疾患，由编码肿瘤阻抑蛋白Merlin的NF2基因中的种系突变引起。这些突变导致Merlin蛋白缺陷，Merlin蛋白调节细胞过程，包括接触抑制、增殖和凋亡。NF2的特点是生长缓慢的肿瘤，诸如：神经鞘瘤(由施万细胞产生)、脑膜瘤(由蛛网膜细胞产生)、室管膜瘤(由室管膜细胞产生)以及青少年白内障和视网膜错构瘤。

NF2的典型表现包括双侧前庭神经鞘瘤，这是发生在第八脑神经上的多小叶肿块。前庭神经鞘瘤导致听力丧失、耳鸣、耳聋、头晕和失去平衡。患者通常会因为肿瘤生长的影响(包括对耳朵的耳毒性作用，导致内耳中与声音感觉有关的细胞死亡)或治疗肿瘤的干预措施(包括部分或完全切除听觉神经)而变得耳聋。如果不加以控制，这些肿瘤最终会压迫脑干并导致死亡。其他症状可能包括毁容、面部无力、头痛和视力丧失。

几乎所有受影响的个体都在30岁前出现这些神经鞘瘤。对于患有散发性NF2的个体(略多于一半)，NF2诊断的平均年龄在18至24岁之间。NF2患者的预期寿命为69岁，比一般人群的预期寿命短11年。

患有NF2的患者终生有80％的可能性发展脑膜瘤。脑膜瘤发生在脑膜、大脑或脊髓的内层，并且起源于蛛网膜细胞。这些患者出现的患脑膜瘤的中位数量为三个。超过33％的肿瘤特征为显著生长(>1mm/年)。此外，由于NF2基因的体细胞突变，脑膜瘤也可能发生在散发性(非NF2)患者中。散发性脑膜瘤是最常见的脑肿瘤(占所有脑肿瘤的约35％)，并且可能因压迫大脑或脊柱而导致神经功能缺损。脑膜瘤的发生是NF2患者永久性发病和死亡的最大驱动因素。

目前还没有FDA批准的用于脑膜瘤的药物。目前的护理标准包括手术或放射治疗。对于完全切除的脑膜瘤来说，复发并不常见。相反，次全切除与高复发率相关。对于患有非手术脑膜瘤的患者来说，放射治疗是一个合理的选择。然而，辐射与继发性癌症发病率增加有关，这在肿瘤抑制综合征的背景下尤其成问题。因此，许多临床医生尽量减少在NF2患者、特别是年轻患者中使用放射治疗。

NF2患者发生脊髓室管膜瘤的风险增加。这些肿瘤起源于室管膜细胞，并且通常发生在脑干或脊柱内。室管膜瘤常呈“珍珠串”状出现，在颈椎有多个病变。只有一部分室管膜瘤需要治疗。标准方法是手术切除，并针对手术切除后复发的病变保留放射治疗。

除了第八脑神经(CN8)或前庭蜗神经之外，NF2患者通常在其他脑神经上出现神经鞘瘤，包括：CN3：动眼神经、CN4：滑车神经、CN5：三叉神经、CN6：外展神经、CN7：面部神经、CN9：舌咽神经、CN10：迷走神经、CN11：脊副神经、CN12：舌下神经。这些神经的任何损伤或功能丧失都可能导致头颈部出现多种疾病。

NF2患者还可能出现多种眼睛病症，包括：白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(RP)(视网膜变性)、视网膜和RPE复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)、和凝视诱发耳鸣(GET)。

因此，需要用于治疗NF2患者的组合物和方法。本实施方式满足了这些需求以及其他需求。

发明内容

在一些实施方式中,提供了一种腺相关病毒(AAV)，其包括腺相关病毒衣壳蛋白和转基因，所述转基因编码全长Merlin蛋白或其一个或多个活性片段，诸如但不限于，Merlin同种型1的残基1-359、Merlin同种型1的残基1-313、Merlin同种型1的残基1-219、Merlin同种型1的残基1-73、Merlin同种型1的残基312-595、Merlin同种型1的残基479-595、Merlin同种型1的残基503-595或其组合。

在一些实施方式中，提供了包括本文所提供的AAV的组合物。

在一些实施方式中，提供了包括本文所提供的AAV和药学上可接受的载体的药物组合物。

在一些实施方式中，将Merlin蛋白递送至细胞的方法，所述方法包括使细胞与本文所提供的AAV接触的步骤。

在一些实施方式中，治疗患有NF2的受试者的方法，所述方法包括向患有NF2的受试者给药本文所提供的AAV。

在一些实施方式中，抑制受试者中神经鞘瘤、脑膜瘤或室管膜瘤生长的方法，所述方法包括给药本文所提供的AAV。

在一些实施方式中，预防受试者中神经鞘瘤、室管膜瘤或脑膜瘤生长或形成的方法，所述方法包括向受试者给药本文所提供的AAV。

在一些实施方式中，治疗患有与merlin缺陷相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患该疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者给药本文所提供的AAV。

在一些实施方式中，本文提供了包括与SEQ ID NO:2至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的核酸分子，或编码Merlin蛋白或其活性片段的核酸序列。

在一些实施方式中，提供了包括本文所提供的核酸分子和载体的组合物。

在一些实施方式中，提供了产生如本文所提供的AAV的方法，所述方法包括使细胞与如本文所提供的核酸分子接触以产生AAV。

附图说明

专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用之后,专利局将提供带有一张或多张的彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。

图1示出了重组DNA质粒的非限制性载体(质粒)图谱，所述重组DNA质粒可以用于产生AAV颗粒，所述AAV颗粒包括在CAG启动子下编码Merlin蛋白的核酸分子以表达MERLIN蛋白。

图2示出了重组DNA质粒的非限制性载体(质粒)图谱，所述重组DNA质粒可用于产生AAV颗粒，所述AAV颗粒包括在CAG启动子下编码Merlin蛋白的核酸分子以表达MERLIN蛋白，该实例包括HPRT填充序列、HBV的转录后调控元件以及与图4中所示的质粒相比修饰的左侧AAV2 ITR。此外，已经使用卡那霉素选择基因修饰了细菌骨架，以利于人类临床研究中的测试。

图3显示了示例性蛋白质印迹，其证明用AAV9-CAG-Merlin-v2转导的HEK 293T细胞可以过表达Merlin(NF2)。

图4示出了示例性小脑组织切片，其在通过脑池内(intracisternal magna，ICM)注射给药AAV9-CAG-Merlin-v2(2TX-G38)或AAV9-CAG-eGFP(2TX-C10)后28天时从食蟹猴(cynomolgus macaques)获得，并且通过免疫组织化学对eGFP进行染色，并证明了AAV9-CAG-eGFP的小脑生物分布。

图5显示了对eGFP的存在进行染色的宫颈DRG组织切片的示例性增强免疫荧光显微照片，该切片是从通过ICM注射给药AAV9-CAG-GFP后1个月的2月龄的Postn-Cre；Nf2^flox ^/flox小鼠获得的，其证明了在将AAV9-CAG-GFP注射到脑池中的Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠的DRG中eGFP的显著生物分布。

图6显示了对eGFP的存在进行染色的宫颈DRG组织切片的示例性增强免疫荧光显微照片，该切片是从通过ICM注射给药低剂量(组3；5.6E12vg/kg)AAV9-CAG-GFP后4周的2月龄的Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠获得的，并证明了所述小鼠的DRG中轴突细胞周围的SC中的GFP表达。

图7显示了对eGFP的存在进行染色的具有DRG远端神经的组织切片的示例性增强的免疫荧光显微照片，该切片是从通过ICM注射给药低剂量(组3；5.6E12 vg/kg)AAV9-CAG-GFP后4周的2月龄的Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠获得的，并证明在通过ICM给药的NF2敲除小鼠的DRG远端神经中也观察到eGFP。

图8是显示来自通过ICM注射给药AAV9-CAG-Merlin或AAV9-CAG-GFP后5个月的6月龄的Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠的背根神经节(DRG)的横截面中施万细胞(SC)核的密度(核/μm²)的图，证明与注射AAV9-CAG-GFP对照载体的小鼠相比，给药AAV9-CAG-Merlin的NF2敲除小鼠的SC增殖显著减少。

图9是pAAV_CAG_Merlin_Kan(SEQ ID NO:7)的载体图谱的非限制性实施方式，其可以用于产生包括在CAG启动子控制下编码Merlin的核酸分子的AAV颗粒。与图2类似，该载体图谱用卡那霉素抗性基因来举例说明以帮助选择，但也可以使用其他选择基因。

列举的实施方式

1.一种腺相关病毒(AAV)，包括AAV衣壳蛋白和转基因，所述转基因编码全长Merlin蛋白(例如Merlin同种型1或Merlin同种型2)或其一个或多个活性片段，诸如但不限于，Merlin同种型1的残基1-359、Merlin同种型1的残基1-313、Merlin同种型1的残基1-219、Merlin同种型1的残基1-73、Merlin同种型1的残基312-595、Merlin同种型1的残基479-595、Merlin同种型1的残基503-595或其组合。

2.根据实施方式1所述的AAV，其中所述转基因位于AAV反向末端重复内。

3.根据实施方式1或2所述的AAV，其中所述转基因可操作地连接至指导异源基因在宿主细胞中表达的调控序列。

4.根据实施方式3所述的AAV，其中所述调控序列包括启动子。

5.根据实施方式4所述的AAV，其中所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子，诸如但不限于神经元或神经元组织特异性启动子，包括但不限于本文提供的那些。

6.根据实施方式5所述的AAV，其中所述启动子是CAG启动子、CMV启动子、CBA启动子或SV40启动子。

7.根据前述实施方式中任一项所述的AAV，其中所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

8.根据实施方式7所述的AAV，其中所述AAV9衣壳蛋白包括具有以下氨基酸序列的蛋白质：

SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736；

SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736；或

SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736。

9.根据实施方式7所述的AAV，其中所述AAV9衣壳包括与SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

10.根据前述实施方式中任一项所述的AAV，其中由所述转基因编码的Merlin蛋白包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。

11.根据前述实施方式中任一项所述的AAV，其中由所述转基因编码的Merlin蛋白包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的序列或其活性片段。

12.根据前述实施方式中任一项所述的AAV，其中所述转基因包括编码包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:8的序列的蛋白质或其活性片段的核酸分子。

13.根据实施方式12所述的AAV，其中编码Merlin蛋白的核酸分子包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9的核酸序列或其各自的密码子优化形式。

14.根据实施方式2所述的AAV，其中所述AAV反向末端重复是AAV-2反向末端重复。

15.根据实施方式14所述的AAV，其中AAV2反向末端重复包括SEQ ID NO:4的序列。

16.根据前述实施方式中任一项所述的AAV，其中所述AAV包括所述转基因上游和5'(左侧)AAV ITR下游的核酸分子填充序列。

17.根据实施方式16所述的AAV，其中所述填充序列包括SEQ ID NO:6的序列。

18.根据前述实施方式中任一项所述的AAV，其中所述AAV包括位于所述转基因下游和右侧(3’)AAV(例如，AAV2)ITR上游的核苷酸内含子序列。

19.根据实施方式18所述的AAV，其中所述内含子序列是HPRE序列。

20.根据实施方式19所述的AAV，其中所述HPRE序列包括SEQ ID NO:5的序列。

21.一种组合物，包括实施方式1-20中任一项所述的AAV和生理相容性载体。

22.一种药物组合物，包括实施方式1-20中任一项所述的AAV和药学上可接受的载体。

23.一种将Merlin蛋白递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与实施方式1-20中任一项所述的AAV或实施方式21或22所述的组合物接触的步骤。

24.一种治疗患有NF2的受试者的方法，所述方法包括向所述患有NF2的受试者给药实施方式1-20中任一项所述的AAV或实施方式21或22所述的组合物。

25.根据实施方式24所述的方法，其中所述给药是室内(脑室内/心室内，intraventricular)、脑池内、鞘内、纹状体内、胸膜内、肌内、玻璃体内、静脉内或瘤内。

26.一种抑制受试者中神经鞘瘤、脑膜瘤或室管膜瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者给药实施方式1-20中任一项所述的AAV或实施方式21或22所述的组合物。

27.根据实施方式26所述的方法，其中所述受试者是患有NF2或NF2缺陷性疾患诸如神经鞘瘤病的受试者。

28.根据实施方式26所述的方法，其中所述给药是鞘内、静脉内、室内、纹状体内、胸膜内、肌内、脑池内或瘤内。

29.一种预防受试者中神经鞘瘤、室管膜瘤或脑膜瘤生长或形成的方法，所述方法包括向所述受试者给药实施方式1-20中任一项所述的AAV或实施方式21或22所述的组合物。

30.根据实施方式29所述的方法，其中所述受试者是患有NF2或NF2缺陷性疾患诸如神经鞘瘤病的受试者。

31.根据实施方式30所述的方法，其中所述给药是鞘内、静脉内、脑池内或瘤内。

32.一种治疗患有与merlin缺陷相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患该疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药实施方式1-20中任一项所述的AAV或实施方式21或22所述的组合物。

33.根据实施方式32所述的方法，其中所述疾患是2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病、神经鞘瘤(例如，前庭神经鞘瘤)；癌症(例如，血液癌症(例如，幼年粒单核细胞白血病)、白血病(例如，成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴细胞白血病、成人急性髓细胞白血病、儿童急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病，或毛细胞白血病)；淋巴瘤(例如，AIDS相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人霍奇金淋巴瘤、儿童霍奇金淋巴瘤、成人非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里综合征(sézary syndrome)、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤华氏巨球蛋白血症)；慢性骨髓增生性疾患；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤)；卵巢癌(例如，卵巢浆液性癌)；乳腺癌、浸润性乳腺癌；或神经皮肤疾患；(例如，间皮瘤、腹膜间皮瘤、皮肤鳞状细胞癌、泌尿道癌、甲状腺癌、胃癌、神经鞘瘤、肾细胞癌、垂体癌、卵巢癌、脑膜瘤、黑色素瘤、肺癌(例如，鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、混合型肺癌、肺腺癌)、肝癌、大肠癌、肝细胞癌、急性髓性白血病(AML)、呼吸消化道癌(鳞状细胞癌)、膀胱癌、骨癌(例如，骨肉瘤)、结直肠癌、室管膜瘤、结直肠癌、子宫内膜瘤(混合性腺鳞癌)或神经胶质瘤、或白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(RP)(视网膜变性)、视网膜和RPE复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)、或凝视诱发耳鸣(GET)。

34.根据实施方式23-33中任一项所述的方法，其中至少每6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、2年、三年、四年、五年、六年或更久给药所述AAV。

35.根据实施方式23-34中任一项所述的方法，其中静脉内、真皮内、皮下、鞘内、全身、脑池内、室内、实质内、胸膜内、纹状体内、肌内、玻璃体内或局部给药所述AAV。

36.一种核酸分子，包括与SEQ ID NO:2至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相同的序列。

37.根据实施方式30所述的核酸分子，其中所述核酸分子是分离的核酸分子。

38.根据实施方式36或37所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQ ID NO:2的序列。

39.根据实施方式36-39中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括AAV反向末端重复。

40.根据实施方式39所述的核酸分子，其中所述SEQ ID NO:2的序列结合在所述AAV反向末端重复内。

41.根据实施方式39或40所述的核酸分子，其中所述AAV反向末端重复是AAV2反向末端重复。

42.根据实施方式41所述的核酸分子，其中所述AAV2反向末端重复之一(例如，3’AAV ITR)包括SEQ ID NO:4的序列。

43.根据实施方式36-42中任一项所述的核酸分子，其中包括SEQ IDNO:2的核酸可操作地连接至指导由SEQ ID NO:2编码的蛋白质的表达的调控序列。

44.根据实施方式44所述的核酸分子，其中所述调控序列包括启动子。

45.根据实施方式44所述的核酸分子，其中所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。

46.根据实施方式37或38所述的核酸分子，其中所述启动子是CAG启动子、CMV启动子或SV40启动子。

47.根据实施方式36-46中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括位于SEQ ID NO:2转基因上游和5’(左侧)AAV ITR下游的填充序列。

48.根据实施方式47所述的核酸分子，其中所述填充序列包括SEQ ID NO:6的序列。

49.根据实施方式36-48中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括位于SEQ ID NO:2下游和右侧(3’)AAV(例如AAV2)ITR上游的核苷酸内含子序列。

50.根据实施方式49所述的核酸分子，其中所述内含子序列是HPRE内含子序列。

51.根据实施方式50所述的核酸分子，其中所述HPRE内含子序列包括SEQ ID NO:5的序列。

52.根据实施方式36-51中任一项所述的核酸分子，其中所述分子是质粒。

53.一种组合物，包括实施方式36-52中任一项所述的核酸分子和载体。

54.根据实施方式53所述的组合物，其中所述载体是转染试剂。

55.一种产生实施方式1-20中任一项所述的AAV颗粒的方法，所述方法包括使细胞与实施方式36-52中任一项所述的核酸分子或实施方式53或54所述的组合物接触(例如转染或电穿孔)以产生AAV。

56.根据实施方式55所述的方法，其中所述细胞是AAV包装细胞系的细胞。

57.根据实施方式56所述的方法，其中所述AAV包装细胞系是AAV9包装细胞系。

58.一种培养的宿主细胞，其包括编码AAV衣壳蛋白的重组核酸分子和编码Merlin蛋白的重组核酸分子。

59.根据实施方式58所述的细胞，其中所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

60.根据实施方式58或59所述的细胞，其中所述编码衣壳蛋白的核酸分子编码与具有以下氨基酸序列的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相同的蛋白质：SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736；SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736；或SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736。

61.根据实施方式58-60中任一项所述的细胞，其中所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源、或相同的蛋白质或其活性片段。

62.根据实施方式58-61中任一项所述的细胞，其中所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子编码包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8的序列的蛋白质或其活性片段。

63.根据实施方式58-62中任一项所述的细胞，其中所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:9至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

64.根据实施方式58-63中任一项所述的细胞，其中所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:9的序列。

65.根据实施方式58-64中任一项所述的细胞，其中所述重组核酸分子是质粒。

具体实施方式

本文提供的实施方式部分涉及用于治疗NF2疾病或者与Merlin蛋白缺陷相关的病症、肿瘤或疾患的组合物、方法和其他实施方式。

由于作为肿瘤阻抑蛋白发挥关键作用的功能性Merlin的减少导致神经纤维瘤病2或与merlin缺陷相关的病症、肿瘤或疾患，因此通过递送NF2基因的功能性拷贝来恢复Merlin活性可能会带来有效的治疗。

因此，在一些实施方式中，提供了包括编码Merlin蛋白的转基因的重组病毒。所使用的病毒类型可以是当用于感染细胞或受试者时将导致转基因和Merlin蛋白或其任何部分在细胞或受试者中表达的任何病毒。在一些实施方式中，该部分是Merlin蛋白的N末端片段(Tikoo et.al.,An Anti-Ras Function of Neurofibromatosis Type 2Gene Product(NF2/Merlin),The Journal of Biological Chemistry,Vol.269,No 38,Issue ofSeptember 23,1994pp.23387-23390；Cui et.al.,The NF2 tumor suppressor merlininteracts with Ras and RasGAP,which may modulate Ras signaling,Oncogene,Vol.38,2019,pp.6370-6381)。在一些实施方式中，所编码的Merlin的N末端片段包括Merlin同种型1的氨基酸残基1-359或由其组成。在一些实施方式中，所编码的Merlin的N末端片段包括Merlin同种型1的氨基酸残基1-313或由其组成。在一些实施方式中，所编码的Merlin的N末端片段包括Merlin同种型1的氨基酸残基1-219或由其组成。在一些实施方式中，所编码的Merlin的N末端片段包括Merlin同种型1的氨基酸残基1-73或由其组成。在一些实施方式中，该部分是Merlin蛋白的C末端片段(Cui et.al.,The NF2 tumorsuppressor merlin interacts with Ras and RasGAP,which may modulate Rassignaling,Oncogene,Vol.38,2019,pp.6370-6381)。在一些实施方式中，所编码的Merlin的C末端片段包括Merlin的同种型1的氨基酸残基312-595或由其组成。在一些实施方式中，所编码的Merlin的C末端片段包括Merlin的同种型1的氨基酸残基479-595或由其组成。在一些实施方式中，所编码的Merlin的C末端片段包括Merlin的同种型1的氨基酸残基503-595或由其组成。

在一些实施方式中，如本文所用，“活性片段”是野生型Merlin的具有生物活性的片段。在一些实施方式中，如本文所用，“同种型”是野生型Merlin的可变剪接变体。

在一些实施方式中，病毒是腺相关病毒(AAV)。AAV有许多天然存在的血清型可以供使用。在一些实施方式中，AAV血清型是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV-DJ。血清型是指由AAV的特定菌株编码的衣壳蛋白。此外，可以对包括不同AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白质进行工程改造，或从天然存在的血清型进行修饰，以具有增强的特性。衣壳工程化带来的增强特性可以包括但不限于易于大规模生产AAV、降低免疫原性、改变组织嗜性和/或为治疗应用提供有利的特性。因此，在一些实施方式中，提供了包括AAV衣壳蛋白和编码Merlin蛋白的转基因的AAV。制备AAV的方法是本领域已知的，并且可以在例如美国专利号7,906,111中找到，其全部内容通过引用并入本文。转基因可以掺入所谓的小基因(minigene)中，该小基因包括AAV反向末端重复以及编码Merlin蛋白的序列。转基因的序列还可以可操作地连接至调控元件或指导Merlin蛋白在宿主细胞中表达的序列。

调控元件可以包括常规控制元件，其以允许转基因在用质粒载体转染或用病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至转基因。如本文所用，“可操作地连接的”序列包括与感兴趣的基因邻近的表达控制序列和反式或相距一定距离起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。

表达控制序列可以包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA处理信号，诸如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。大量的表达控制序列，包括天然、组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，是本领域已知的并且可以使用。

组成型启动子的实例包括但不限于CAG启动子(Miyazaki et al,Gene.79(2):269–77；Niwa et al.,Gene.108(2):193–9)、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见例如Boshartet al,Cell,41:521-530(1985)、猿猴病毒40(SV40)启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、人延伸因子1α(EF1)启动子(Qin,J.Y.,Zhang,L.,Clift,K.L.,Hulur,I.,Xiang,A.P.,Ren,B.Z.,et al.(2010).Systematic comparisonof constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.PLoS One 5(5),e10611.doi:10.1371/journal.pone.0010611)和人泛素C启动子(UBC)(Qin,J.Y.,Zhang,L.,Clift,K.L.,Hulur,I.,Xiang,A.P.,Ren,B.Z.,etal.(2010).Systematiccomparison of constitutive promoters and the doxycycline-induciblepromoter.PLoS One 5(5),e10611.doi:10.1371/journal.pone.0010611)。诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素诸如温度、或特定生理状态(例如急性期、细胞的特定分化状态)的存在来调节，或仅在复制细胞中来调节。诱导型启动子和诱导型系统可以从多种商业来源获得。许多其他系统已经被描述并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的化合物调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(国际专利公开号WO 98/10088)；昆虫蜕皮激素启动子(No et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制系统(Gossen et al,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen et al,Science,268:1766-1769(1995)，还参见Harvey et al,Curr.Opin.Chem.BioL,2:512-518(1998))、RU486诱导系统(Wang et al,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari et al,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在本文中可用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态(例如温度、急性期、细胞的特定分化状态)或仅在复制细胞中调节的启动子。

在一些实施方式中，启动子是CAG启动子。在一些实施方式中，启动子是SV40启动子。在一些实施方式中，启动子是CMV启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在一些实施方式中，启动子不是组织或细胞特异性启动子。在一些实施方式中，启动子是组织或细胞特异性启动子。在一些实施方式中，启动子不是诱导型启动子。

在一些实施方式中，将使用Merlin产物的天然启动子。当需要Merlin的表达模拟天然表达时，可以使用天然启动子。当转基因的表达必须在时间上或发育上、或以组织特异性方式、或响应于特定转录刺激来调节时，可以使用天然启动子。在一些实施方式中，其他天然表达控制元件，诸如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列可以包括在启动子序列中，以便更接近地模拟天然表达。

在一些实施方式中，转基因包括可操作地连接至组织特异性启动子的基因。在一些实施方式中，启动子是神经元或神经元组织特异性启动子。这样的启动子的实例包括但不限于神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因(Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA,88:5611-5(1991))，神经元特异性VGF基因(Piccioli et al.,Neuron,15:373-84(1995))，或人突触蛋白启动子(Syn1),(Kugler,S.,Kilic,E.,and Bahr,M.(2003).Human synapsin 1genepromoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression froman adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transducedarea.Gene Ther.10(4),337–347.doi:10.1038/sj.gt.3301905,Kugler,S.,Meyn,L.,Holzmuller,H.,Gerhardt,E.,Isenmann,S.,Schulz,J.B.,et al.(2001).Neuron-specific expression of therapeutic proteins:evaluation of different cellularpromoters in recombinant adenoviral vectors.Mol.Cell Neurosci.17(1),78–96.doi:10.1006/mcne.2000.0929,McLean,J.R.,Smith,G.A.,Rocha,E.M.,Hayes,M.A.,Beagan,J.A.,Hallett,P.J.,et al.(2014).Widespread neuron-specific transgeneexpression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9neonatal intracerebroventricular injection.Neurosci.Lett.576,73–78.doi:10.1016/j.neulet.2014.05.044)，或鸡β肌动蛋白(CBA)，或CBh(CBA的杂种)(Grayet.al.,Optimizing Promoters for Recombinant Adeno-Associated Virus-MediatedGene Expression in the Peripheral and Central Nervous System Using Self-Complementary Vectors,HUMAN GENE THERAPY 22:1143–1153(September 2011)a MaryAnn Liebert,Inc.)，或MeCp2(Gray et.al.,Optimizing Promoters for RecombinantAdeno-Associated Virus-Mediated Gene Expression in the Peripheral and CentralNervous System Using Self-Complementary Vectors,HUMAN GENE THERAPY 22:1143–1153(September 2011)a Mary Ann Liebert,Inc.)，或PDGFβ(Ingusci et.al.,GeneTherapy Tools for Brain Diseases,Selene Ingusci,Frontiers in Pharmacology,July 1,2019)星形胶质细胞特异性，诸如GFA(Smith-Arica,J.R.,Morelli,A.E.,Larregina,A.T.,Smith,J.,Lowenstein,P.R.,and Castro,M.G.(2000).Cell-type-specific and regulatable transgenesis in the adult brain:adenovirus-encodedcombined transcriptional targeting and inducible transgeneexpression.Mol.Ther.2(6),579–587.doi:10.1006/mthe.2000.0215,；Lee,Y.,Messing,A.,Su,M.,and Brenner,M.(2008).GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.Glia 56(5),481–493.doi:10.1002/glia.20622)，少突胶质细胞特异性，诸如人髓磷脂相关糖蛋白(MAG),(von Jonquieres,G.,Mersmann,N.,Klugmann,C.B.,Harasta,A.E.,Lutz,B.,Teahan,O.,et al.(2013).Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.PLoSOne 8(6),e65646.doi:10.1371/journal.pone.0065646)，或髓鞘质碱性蛋白启动子(MBP)(von Jonquieres,G.,Frohlich,D.,Klugmann,C.B.,Wen,X.,Harasta,A.E.,Ramkumar,R.,et al.(2016).Recombinant human myelin-associated glycoprotein promoter drivesselective AAV-mediated transgene expression in oligodendrocytes.Front.Mol.Neurosci.9,13.doi:10.3389/fnmol.2016.00013)，小胶质细胞特异性，诸如F4/80(Rosario,A.M.,Cruz,P.E.,Ceballos-Diaz,C.,Strickland,M.R.,Siemienski,Z.,Pardo,M.,et al.(2016).Microglia-specific targeting by novel capsid-modified AAV6vectors.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.3,16026.doi:10.1038/mtm.2016.26)，或CD68(Rosario,A.M.,Cruz,P.E.,Ceballos-Diaz,C.,Strickland,M.R.,Siemienski,Z.,Pardo,M.,et al.(2016).Microglia-specific targeting by novel capsid-modified AAV6vectors.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.3,16026.doi:10.1038/mtm.2016.26)，谷氨酸能神经元特异性，诸如磷酸盐激活的谷氨酰胺酶启动子(PAG),(Rasmussen,M.,Kong,L.,Zhang,G.R.,Liu,M.,Wang,X.,Szabo,G.,et al.(2007).Glutamatergic or GABAergic neuron-specific,long-term expression in neocortical neurons from helper virus-freeHSV-1vectors containing the phosphate-activated glutaminase,vesicularglutamate transporter-1,or glutamic acid decarboxylase promoter.BrainRes.1144,19–32.doi:10.1016/j.brainres.2007.01.125)，或血管谷氨酸转运蛋白启动子(vGLUT),(Rasmussen,M.,Kong,L.,Zhang,G.R.,Liu,M.,Wang,X.,Szabo,G.,et al.(2007).Glutamatergic or GABAergic neuron-specific,long-term expression inneocortical neurons from helper virus-free HSV-1vectors containing thephosphate-activated glutaminase,vesicular glutamate transporter-1,or glutamicacid decarboxylase promoter.Brain Res.1144,19–32.doi:10.1016/j.brainres.2007.01.125)，以及GABA能神经元特异性，诸如谷氨酸脱羧酶启动子(GAD)(Rasmussen,M.,Kong,L.,Zhang,G.R.,Liu,M.,Wang,X.,Szabo,G.,et al.(2007).Glutamatergic or GABAergic neuron-specific,long-term expression inneocortical neurons from helper virus-free HSV-1vectors containing thephosphate-activated glutaminase,vesicular glutamate transporter-1,or glutamicacid decarboxylase promoter.Brain Res.1144,19–32.doi:10.1016/j.Brainres.2007.01.125)等。也可以使用其他启动子，诸如但不限于当需要在骨骼肌中表达时，应当使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼P-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，以及活性高于天然存在的启动子的合成肌肉启动子(参见Li et al.,Nat.Biotech.,17:241-245(1999))。其他组织特异性启动子包括已知用于肝脏的组织特异性启动子(白蛋白,Miyatake et al.,J.Virol.,71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子,Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP),Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))，骨骨钙素(Stein elal.,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen et aL,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996))，淋巴细胞(CD2,Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体链)。

转基因产物、启动子/增强子调控序列以及5'和3'AAV ITR的组合可以统称为“小基因”，以便在本文中引用。

在一些实施方式中，所使用的衣壳取自AAV9。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括具有以下氨基酸序列的一组病毒蛋白(VP1、VP2、VP3等)：SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736；SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736；或SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736的氨基酸序列的一组病毒蛋白(VP1、VP2、VP3等)。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736的氨基酸序列的一组病毒蛋白(VP1、VP2、VP3等)。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736的氨基酸序列的一组病毒蛋白(VP1、VP2、VP3等)。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括与以下至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736；SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736；或SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括与SEQ IDNO:3的氨基酸残基1至736至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括与SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，AAV9衣壳包括与SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方式中，重组AAV基因组编码Merlin蛋白。在一些实施方式中，Merlin是同种型1。在一些实施方式中，Merlin是同种型2。

在一些实施方式中，由转基因编码的Merlin蛋白包括与SEQ ID NO:1(同种型1)的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。在一些实施方式中，由转基因编码的Merlin蛋白包括SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方式中，重组AAV基因组编码Merlin蛋白的一个或多个活性片段。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基1-359、SEQ ID NO:1的残基1-313、SEQ ID NO:1的残基1-219、SEQ IDNO:1的残基1-73、SEQ ID NO:1的残基312-595、SEQ ID NO:1的残基479-595、SEQ ID NO:1的残基503-595或其任何组合。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQID NO:1的残基1-359。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基1-313。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基1-219。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基1-73。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基312-595。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基479-595。在一些实施方式中，一个或多个活性片段包括但不限于SEQ ID NO:1的残基503-595。

在一些实施方式中，活性片段可以包括与这样的片段至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。

在一些实施方式中，转基因包括编码包括SEQ ID NO:1的序列的蛋白质或其活性片段的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:2的核酸序列，或编码其活性片段的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括与SEQ ID NO:2或与编码其活性片段的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。

本文还提供了本文所述的多肽或核酸分子的变体，其包括与本文提供的氨基酸序列或核酸分子或野生型序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或核酸分子。例如，Merlin(NF2)的变体包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或序列同源性的多肽或其活性片段。例如，提供了编码Merlin(NF2)的核酸分子的变体,其包括与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或编码其活性片段的核酸分子。

在一些实施方式中，由转基因编码的Merlin蛋白包括与SEQ ID NO:8(同种型2)的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。在一些实施方式中，由转基因编码的Merlin蛋白包括SEQ ID NO:8的序列。在一些实施方式中，重组AAV基因组编码Merlin蛋白的一个或多个活性片段。在一些实施方式中，活性片段可以包括与这样的片段至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。

在一些实施方式中，转基因包括编码包括SEQ ID NO:8的序列的蛋白质或其活性片段的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:9的核酸序列，或编码其活性片段的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括与SEQ ID NO:9或与编码其活性片段的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。

本文还提供了本文所述的多肽或核酸分子的变体，其包括与本文提供的氨基酸序列或核酸分子或野生型序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或核酸分子。例如，Merlin(NF2)的变体包括与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或序列同源性的多肽或其活性片段。例如，提供了编码Merlin(NF2)的核酸分子的变体,其包括与SEQ ID NO:9具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或编码其活性片段的核酸分子。

两个序列之间的“同一性”或“序列同源性”(这些术语在本文中可互换使用)的计算如下进行。为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入缺口，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。使用GCG软件包中的GAP程序和Blossum 62评分矩阵将最佳比对确定为最佳分数，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”相当于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数量的函数。

本文所述的多肽变体可以是具有来自如上所述的多肽或其任何活性片段的野生型氨基酸序列的氨基酸修饰(例如，缺失、添加或置换，诸如保守置换)的那些。例如，Merlin的变体可以与Merlin(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8)有至少1、2、3、4、5个但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸的差异。序列还可以具有保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

本文还提供了分离的核酸分子。“分离的”蛋白质或核酸分子是指从可从中获得分离的蛋白质或核酸分子的天然样品的至少一种组分的至少90％中移出的纯化蛋白质或核酸分子。如果感兴趣的类别或类别群体基于重量-重量基础的至少5％、10％、25％、50％、75％、80％、90％、92％、95％、98％或99％纯，则蛋白质可以“至少”具有一定程度的纯度。

如本文所提供的，重组AAV可以包括AAV反向末端重复(ITR)。在一些实施方式中，使用的反向末端重复是AAV-2反向末端重复。也可以使用来自其他AAV血清型的ITR，并且这仅仅是一个非限制性实例。

除了作为用于递送Merlin蛋白的媒介物(例如通过递送编码Merlin蛋白的DNA)的AAV之外，还可以使用其他媒介物，诸如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等。因此，在一些实施方式中，提供了用于基因递送的重组病毒，其编码Merlin蛋白或其活性片段，并在感染的细胞中表达Merlin或其活性蛋白片段。AAV还可以用其他病毒结构蛋白或衣壳蛋白(非AAV)进行假型化，以帮助确定被AAV感染的细胞类型。因此，在一些实施方式中，AAV是假型AAV。

还提供了包括编码Merlin或其活性片段的AAV或病毒的组合物。在一些实施方式中，组合物包括编码Merlin或其活性片段的重组病毒，以及生理相容的载体。在一些实施方式中，组合物是药物组合物并且包括药学上可接受的载体。

通过“药学上可接受的”，意味着载体、稀释剂或赋形剂必须与重组病毒的其他成分相容并且对其接受者没有显著有害。

在一些实施方式中，组合物或药物组合物包括有效量的病毒。这也可以称为治疗有效量。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。组合物的治疗有效量可以根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及治疗剂在个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量也是这样一种量，其中由组合物引起的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所超过。

如本文所提供的，组合物可以包括药学上可接受的媒介物、载体或赋形剂。可用于本公开的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.的雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)第15版(1975)描述了适合于一种或多种治疗组合物和其他药剂的药物递送的组合物和制剂。

一般而言，用于递送的合适载体或媒介物的性质将取决于所采用的特定给药模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待给药的药物组合物还可以包含少量无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

在一些实施方式中，组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其他类似形式，可以包括以下的一种或多种：DMSO，无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠，非挥发性油，诸如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。

本文还提供了包括与SEQ ID NO:2至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子是分离的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2可以用于区分编码Merlin蛋白的内源mRNA和由编码Merlin蛋白的AAV产生的mRNA。SEQ ID NO:2是不同于天然mRNA的序列的非限制性实例，并且可以使用可以与天然序列区别的另一序列。因此，在一些实施方式中，提供了检测由AAV编码的Merlin mRNA的方法。在一些实施方式中，该方法包括使样品与对编码AAV的mRNA具有特异性且不与天然mRNA结合的探针接触，并在探针与编码AAV的mRNA结合相互作用时检测AAV mRNA。在一些实施方式中，该方法包括用对编码AAV的mRNA具有特异性的引物对样品进行RT-PCR以检测编码AAV的mRNA。在一些实施方式中，引物对编码AAV的mRNA具有特异性并且不与天然mRNA结合或相互作用。如本文所用，术语“天然mRNA”是指由细胞或生物体的未经修饰的原始DNA(即未经遗传操作的野生型)编码的RNA。这种类型的测定可以用于例如已经用本文提供的AAV组合物治疗的受试者以确定编码AAV的merlin蛋白的表达，该蛋白不同于天然蛋白。

在一些实施方式中，核酸分子包括AAV反向末端重复。在一些实施方式中，SEQ IDNO:2的序列结合在AAV反向末端重复内。在一些实施方式中，AAV反向末端重复是AAV2反向末端重复。在一些实施方式中，包括SEQ ID NO:2的核酸可操作地连接至指导由SEQ ID NO:2编码的蛋白质的表达的调控序列。在一些实施方式中，调控序列包括启动子。在一些实施方式中，启动子如本文所述。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。在一些实施方式中，启动子是CAG启动子、CMV启动子或SV40启动子。在一些实施方式中，启动子是CAG启动子。在一些实施方式中，启动子是CMV启动子。在一些实施方式中，启动子是SV40启动子。在一些实施方式中，核酸分子是质粒。

在一些实施方式中，使用非病毒载体。提供了包括本文描述的核酸分子的组合物。在一些实施方式中，组合物包括载体。在一些实施方式中，载体是转染试剂或促进核酸分子递送至细胞的试剂。在一些实施方式中，转染试剂是基于脂质的转染试剂。在一些实施方式中，载体是电穿孔剂。

本文提供的核酸分子可以用于产生编码Merlin蛋白的AAV。用于产生AAV的方法是本领域技术人员已知的并且可以使用任何方法。美国专利号7,906,111中提供了非限制性实例，该专利通过引用并入本文。例如，小基因可以被携带在被递送至宿主细胞的任何合适的载体(例如质粒)上。可以对质粒进行工程改造，使得它们适合于在原核细胞、哺乳动物细胞或两者中复制和任选地整合。在一些实施方式中，这些质粒(或携带5'AAV ITR-异源分子-3'AAV ITR的其他载体)包含允许小基因在真核生物和/或原核生物中复制的序列和用于这些系统的选择标记。选择标记或报告基因可以包括编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性等的序列。质粒还可以包含某些选择报告基因或标记基因，其可以用于发出细菌细胞中载体存在的信号，诸如氨苄青霉素抗性。质粒的其他组分可以包括复制起点和扩增子，诸如采用爱泼斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒核抗原的扩增子系统。该扩增子系统或其他类似的扩增子组件允许在细胞中进行高拷贝附加型复制。在一些实施方式中，携带小基因的分子被转染到细胞中，其可以在细胞中短暂存在。或者，小基因(携带5'AAV ITR-异源分子-3'ITR)可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，无论是染色体上还是作为附加体。在一些实施方式中，小基因可以以多个拷贝存在，任选地以头对头、头对尾或尾对尾串联体存在。合适的转染技术是已知的并且可以容易地用于将小基因递送至宿主细胞。

在一些实施方式中，AAV包括位于所述转基因的上游和5'(左侧)AAV ITR下游的核酸分子填充序列。在一些实施方式中，填充序列包括SEQ ID NO:6的序列。在一些实施方式中，AAV包括位于转基因的下游和右侧(3’)AAV(例如AAV2)ITR的上游的核苷酸内含子序列。在一些实施方式中，内含子序列是HPRE序列，诸如本文所述的那些。在一些实施方式中，HPRE序列包括SEQ ID NO:5的序列。

在一些实施方式中，当通过转染递送包括小基因的载体时，载体以约5μg至约100μg DNA、约10μg至约50μg DNA的量递送至约1X10⁴个细胞至约1X10¹³个细胞，或约1X10⁵个细胞。然而，考虑到因素诸如所选载体、递送方法和所选宿主细胞，可以调整载体DNA与宿主细胞的相对量。

用于产生AAV的宿主细胞本身可以选自任何生物体，包括原核(例如，细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。在一些实施方式中，宿主细胞选自任何哺乳动物物种，包括但不限于细胞诸如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO.W138、HeLa、293细胞(表达功能性腺病毒E1)、Saos-2、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2以及源自哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。对所用细胞的要求是不携带除E1、E2a和/或E4 ORF6之外的任何腺病毒基因，这样做是为了避免在AAV生产过程中污染病毒的同源重组；并且其能够感染或转染DNA并表达转染的DNA。

在一些实施方式中，宿主细胞用衣壳蛋白诸如AAV9衣壳稳定转染。它还可以具有由同一细胞产生的rep蛋白。或者，这些蛋白质可以在编码病毒蛋白质的单独质粒上编码，并同时被转染到细胞中或依次转染到宿主细胞中以产生编码Merlin的AAV。例如，可以使用的一种宿主细胞是用编码rep和cap的序列稳定转化的宿主细胞，并且其被使用腺病毒E1、E2a和E4ORF6 DNA以及携带如上所述的小基因的构建体来转染。也可类似地使用稳定的rep和/或cap表达细胞系，诸如B-50(国际专利申请公开号WO 99/15685)或美国专利号5,658,785中描述的那些。宿主细胞的另一种实例是包含足以表达E4 ORF6的最少腺病毒DNA的宿主细胞。还可以使用本文提供的AAV9帽序列构建其他细胞系。

宿主细胞的制备涉及技术诸如所选DNA序列的组装。该组装可以利用常规技术来完成。这样的技术包括众所周知的并且在上文引用的Sambrook et al.中描述的cDNA和基因组克隆，使用腺病毒和AAV基因组的重叠寡核苷酸序列，与聚合酶链式反应，合成方法和提供所需的核苷酸序列的任何其他合适的方法相结合。

将分子(作为质粒或病毒)引入至宿主细胞中也可以使用本领域技术人员已知的以及如整个说明书中所讨论的技术来完成。在一些实施方式中，使用标准转染技术，例如CaPO₄转染、基于脂质的转染或电穿孔，和/或通过杂合腺病毒/AAV载体感染到细胞系中，诸如人胚胎肾细胞系HEK 293(一种包含功能性腺病毒E1基因的人肾细胞系，其提供反式作用E1蛋白)。

AAV9衣壳蛋白还可以用于假型编码Merlin的其他病毒。因此，它们可以用于其他rAAV和非rAAV载体系统。这样的载体系统可以包括例如，慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、痘苗病毒和腺病毒系统等。

因此，在一些实施方式中，提供了产生如本文所提供的AAV的方法。在一些实施方式中，该方法包括使细胞与本文提供的核酸分子或其组合物接触以产生AAV。在一些实施方式中，细胞是AAV包装细胞系。在一些实施方式中，AAV包装细胞系是AAV9包装细胞系，诸如本文或美国专利号7,906,111中描述的那些，该专利的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，提供了培养的宿主细胞，其包括编码AAV衣壳蛋白的重组核酸分子和编码Merlin蛋白的重组核酸分子。在一些实施方式中，衣壳蛋白是如本文所述的AAV9衣壳蛋白或其变体。

在一些实施方式中，提供了将Merlin蛋白递送至细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使细胞与编码Merlin的AAV或病毒接触，诸如本文所述的那些。在一些实施方式中，所述方法包括非病毒递送方法，诸如针注射、弹道DNA注射、声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔或电穿孔、转染及其任何组合。在一些实施方式中，非病毒方法包括脂质体或聚合物载体及其组合，其用于递送编码Merlin蛋白的遗传物质。

在一些实施方式中，提供了治疗患有NF2或其他merlin缺陷的受试者的方法，所述方法包括向患有NF2或其他merlin缺陷的受试者给药编码Merlin的病毒或AAV，诸如本文提供的那些。给药方法可以是任何合适的方法，诸如本文描述的那些。在一些实施方式中，给药是鞘内、静脉内、胸膜内或瘤内。

在一些实施方式中，提供了抑制受试者中神经鞘瘤、脑膜瘤、间皮瘤或室管膜瘤生长的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给药编码Merlin的病毒或AAV，诸如本文提供的那些。给药方法可以是任何合适的方法，诸如本文描述的那些。在一些实施方式中，给药是鞘内、脑池内、静脉内、胸膜内或瘤内给药。

在一些实施方式中，提供了治疗患有NF2的受试者的方法。在一些实施方式中，受试者是患有NF2的受试者。在一些实施方式中，受试者是患有NF2缺陷的受试者。如本文所用，术语“NF2缺陷”是指受试者中由突变或失活的Merlin蛋白引起的病症或疾患。这也可以称为“Merlin缺陷”。这些病症可以是本文提供的各种类型的肿瘤或疾患。在一些实施方式中，疾患如本文所提供。在一些实施方式中，疾患是白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(RP)

(视网膜变性)、视网膜和RPE复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)或凝视诱发耳鸣(GET)。在一些实施方式中，提供了治疗患有与merlin缺陷相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患该疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者给药AAV，诸如本文提供的那些。

在一些实施方式中，提供了预防受试者中脊髓神经鞘瘤或脑膜瘤生长或形成的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给药编码Merlin的病毒或AAV，诸如本文提供的那些。给药方法可以是任何合适的方法，诸如本文描述的那些。在一些实施方式中，给药是鞘内、静脉内或瘤内。在一些实施方式中，受试者是患有NF2的受试者。

在一些实施方式中，提供了治疗患有与merlin相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患该疾患的风险的受试者的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给药编码Merlin的病毒或AAV，诸如本文提供的那些。给药方法可以是任何合适的方法，诸如本文描述的那些。在一些实施方式中，给药是鞘内、静脉内、胸膜内或瘤内。在一些实施方式中，受试者是患有NF2的受试者。在一些实施方式中，所述疾患是2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病、神经鞘瘤(例如，前庭神经鞘瘤)；癌症(例如，血液癌症(例如，幼年粒单核细胞白血病)、白血病(例如，成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴细胞白血病、成人急性髓细胞白血病、儿童急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病，或毛细胞白血病)；淋巴瘤(例如，AIDS相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人霍奇金淋巴瘤、儿童霍奇金淋巴瘤、成人非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤华氏巨球蛋白血症)；慢性骨髓增生性疾患；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤)；卵巢癌(例如，卵巢浆液性癌)；乳腺癌、乳腺浸润性导管癌；或神经皮肤疾患；(例如，间皮瘤、胸膜间皮瘤、胸膜上皮样间皮瘤、皮肤黑色素瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、甲状腺间变性癌、胃癌、神经鞘瘤、肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、垂体癌、卵巢癌、脑膜瘤、黑色素瘤、肺癌(例如，鳞状细胞癌、混合型肺癌、肺腺癌)、肝癌、大肠癌、肝细胞癌、急性髓性白血病(AML)、呼吸消化道癌(鳞状细胞癌)、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、骨癌(例如，骨肉瘤)、结直肠癌、室管膜瘤、结直肠癌、结直肠腺癌、胰腺癌、子宫内膜瘤(混合性腺鳞癌)、子宫内膜样腺癌、或胶质瘤、或常规多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，疾患是白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(RP)(视网膜变性)、视网膜和RPE复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)或凝视诱发耳鸣(GET)。

如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。

如本文所用，术语“包括”、“具有”、“具”和“包括”以及它们的结合词，如本文所用，意思是“包括但不限于”。虽然多种组合物和方法以“包括”各种组分或步骤(解释为“包括但不限于”的意思)来描述，但是组合物、方法和装置还可以“基本上由各种组分或步骤组成”或“由各种组分或步骤组成”，并且这样的术语应被解释为定义本质上封闭的成员群体。

术语“共给药”等旨在涵盖向单个患者给药选定的治疗剂，且旨在包括其中通过相同或不同的给药途径或在相同或不同时间给药药剂的治疗方案。

本文使用的术语“受试者”或“患者”包括但不限于人类和非人类脊椎动物，诸如野生动物、家养动物和农场动物。在某些实施方式中，本文描述的受试者或患者是动物。在某些实施方式中，受试者或患者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人类。在某些实施方式中，受试者或患者是非人类动物。在某些实施方式中，受试者或患者是非人类哺乳动物。在某些实施方式中，受试者或患者是驯养动物，诸如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方式中，受试者或患者是伴侣动物，诸如狗或猫。在某些实施方式中，受试者或患者是家畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方式中，受试者或患者是动物园动物。在另一种实施方式中，受试者或患者是研究动物，诸如啮齿动物、狗或非人灵长类动物。在某些实施方式中，受试者或患者是非人类转基因动物，诸如转基因小鼠或转基因猪。

本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”指治疗性治疗和预防性或预先性措施，其中目的是抑制、预防或减缓(减轻)不期望的生理病症、疾患或疾病，或改善、抑制或以其他方式获得有益的或期望的临床结果。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的改善或减轻；病症、疾患或疾病的程度减轻；病症、疾患或疾病的状态稳定(即不恶化)；延迟病症、疾患或疾病的发作或减缓其进展；病症、疾患或疾病状态的改善；缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测到的还是不可检测到的，或者病症、疾患或疾病的增强或改善；以及预防疾患或疾病表现。治疗包括引起临床上显著的反应而不产生过度的副作用。治疗还包括与不接受治疗的情况下的预期生存期相比延长生存期。

“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA、或mRNA或病毒RNA)中核苷酸的特定序列的固有特性，以在生物过程中充当模板合成其他聚合物和大分子，后者具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。

如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何材料。

本文使用的术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，诸如掺入有重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在一些实施方式中，表达载体是本文所述的甲病毒。

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。“改善”是指疾病体征或症状的数量或严重程度降低。

给患者给药的制剂和途径

当考虑临床应用或方法时，有必要以适合于预期应用的形式制备药物组合物——表达构建体、病毒、表达载体、融合蛋白、转染或转导的细胞。一般而言，这将需要制备除了本文提供的病毒或质粒之外基本上不含热原以及可能对人类或动物有害的其他杂质的组合物。

重组核酸、病毒产物或其药物组合物可以例如以每剂量约1-5百万个颗粒的剂量递送。可以提供包含产品的小瓶或其他容器，例如每小瓶的体积为约0.25ml至约10ml，例如约0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10ml，例如约2ml。

当将重组核酸、病毒或病毒产物引入至患者中时，人们通常可能希望采用合适的盐和缓冲液。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当给药于动物或人时不产生显著的不良反应、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是已知的。除非任何常规介质或试剂与载体或细胞不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可掺入至组合物中。

配制后，可以以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量给药溶液。制剂易于以多种剂型给药，诸如注射溶液、药物释放胶囊等。例如，对于以水溶液形式肠胃外给药，如果需要的话可以适当缓冲该溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。就此而言，可以使用无菌水介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，然后添加到1000ml的皮下注射液中或注射到拟输注部位(参见例如“雷明顿药物科学”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据接受治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责给药的人员将为个体受试者确定适当的剂量。此外，对于人体给药，制剂可以满足FDA办公室生物制品标准所要求的无菌、热原性以及一般安全和纯度标准。

组合物可以配制用于雾化递送至受试者。对于气雾剂递送，所描述的组合物可以配制在水溶液诸如水或生理相容的缓冲液诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以包含一种或多种配制剂，诸如助悬剂、稳定剂或分散剂。

将本公开的多核苷酸递送至受试者的所需细胞的本公开的递送系统不限于本公开的病毒。在一些实施方式中，递送载体包括本文所提供的病毒。这些可以用于治疗疾患或病症诸如本文所述的那些的方法。

在一些实施方式中，将治疗剂至少每6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、2年、三年、四年、五年、六年或更久给药一次。在一些实施方式中，将治疗剂静脉内、皮内、皮下、鞘内给药，其包括室内、脑池内、或注射到腰部位置、脑池内、胸膜内、玻璃体内、视网膜下、肌内、全身或局部，诸如瘤内注射。

试剂盒

另外，这些重组核酸、病毒或其药物组合物的某些组分或实施方式可以在试剂盒中提供。例如，任何重组核酸或病毒可以单独或与来自预调节或后调节步骤的任何其他试剂的单独容器以及任选的使用说明书一起冷冻或冷藏并包装为试剂盒提供。

一些实施方式还涉及试剂盒中的任何前述组合物。在一些实施方式中，试剂盒可包括安瓿、一次性注射器、胶囊、小瓶、管等。在一些实施方式中，试剂盒可以包括包含本文实施方式的局部制剂的单剂量容器或多剂量容器。在一些实施方式中，每个剂量容器可包括一个或多个单位剂量。在一些实施方式中，试剂盒包括包含药物组合物的预填充注射器。在一些实施方式中，试剂盒可以包括施用器。在一些实施方式中，试剂盒包括调理/治疗阶段所需的所有组分。在一些实施方式中，细胞组合物可以包含防腐剂或不含防腐剂(例如，在一次性容器中)。在一些实施方式中，可以制备重组核酸、病毒产物并在适合运送到医院或治疗中心的期望阶段冷冻或冷藏。

本文引用了各种序列，这样的序列在适用时可以包括以下序列中的一个或多个：

MERLIN同种型1(SEQ ID NO:1):

MAGAIASRMSFSSLKRKQPKTFTVRIVTMDAEMEFNCEMKWKGKDLFDLVCRTLGLRETWFFGLQYTIKDTVAWLKMDKKVLDHDVSKEEPVTFHFLAKFYPENAEEELVQEITQHLFFLQVKKQILDEKIYCPPEASVLLASYAVQAKYGDYDPSVHKRGFLAQEELLPKRVINLYQMTPEMWEERITAWYAEHRGRARDEAEMEYLKIAQDLEMYGVNYFAIRNKKGTELLLGVDALGLHIYDPENRLTPKISFPWNEIRNISYSDKEFTIKPLDKKIDVFKFNSSKLRVNKLILQLCIGNHDLFMRRRKADSLEVQQMKAQAREEKARKQMERQRLAREKQMREEAERTRDELERRLLQMKEEATMANEALMRSEETADLLAEKAQITEEEAKLLAQKAAEAEQEMQRIKATAIRTEEEKRLMEQKVLEAEVLALKMAEESERRAKEADQLKQDLQEAREAERRAKQKLLEIATKPTYPPMNPIPAPLPPDIPSFNLIGDSLSFDFKDTDMKRLSMEIEKEKVEYMEKSKHLQEQLNELKTEIEALKLKERETALDILHNENSDRGGSSKHNTIKKLTLQSAKSRVAFFEEL

编码MELRIN同种型1的核酸序列(SEQ ID NO:2)

ATGGCCGGCGCGATTGCTTCCCGGATGTCATTCTCCTCACTTAAAAGAAAACAGCCTAAGACTTTTACCGTGCGGATCGTGACTATGGATGCAGAGATGGAATTCAACTGCGAGATGAAGTGGAAGGGAAAGGACCTCTTCGACCTCGTCTGTCGCACCTTGGGACTGCGGGAAACCTGGTTCTTCGGACTGCAGTACACAATCAAGGACACCGTGGCCTGGCTGAAAATGGACAAGAAGGTCCTGGACCACGACGTGTCCAAGGAAGAACCCGTGACTTTCCACTTTCTGGCCAAGTTCTACCCGGAGAACGCTGAGGAAGAACTCGTGCAGGAGATCACTCAGCATCTGTTCTTTTTACAAGTCAAGAAGCAAATCCTAGATGAGAAGATCTACTGCCCGCCGGAAGCGTCCGTGCTTCTGGCTTCCTACGCGGTGCAGGCCAAATATGGAGACTACGATCCCTCCGTGCACAAGCGCGGGTTCCTGGCCCAAGAGGAACTGCTGCCTAAGCGCGTGATCAACCTGTACCAGATGACCCCCGAGATGTGGGAGGAACGAATTACGGCTTGGTACGCGGAGCATCGCGGCAGAGCACGCGATGAAGCCGAGATGGAGTACCTGAAGATCGCGCAGGATCTTGAGATGTACGGGGTCAACTATTTCGCCATCCGCAACAAGAAGGGCACCGAACTCCTGCTTGGAGTGGACGCACTCGGGCTCCACATCTACGACCCGGAAAACCGCCTGACTCCCAAGATCAGCTTCCCTTGGAACGAAATCAGAAACATTTCCTACTCGGATAAGGAATTCACGATCAAGCCACTGGACAAAAAGATTGACGTGTTCAAGTTCAACTCGTCGAAGCTGCGCGTGAACAAGCTGATACTGCAACTGTGCATTGGCAATCACGACCTGTTTATGCGCCGGCGGAAGGCCGACTCATTGGAGGTCCAACAGATGAAGGCCCAGGCCCGCGAGGAAAAGGCTCGCAAGCAGATGGAACGGCAGAGGCTGGCCAGAGAGAAGCAGATGCGGGAAGAGGCCGAACGCACCCGGGATGAACTGGAGCGCAGGCTGCTGCAGATGAAGGAAGAAGCAACCATGGCCAACGAAGCGCTGATGCGGAGCGAAGAAACCGCGGACCTGTTGGCCGAAAAGGCTCAGATCACCGAGGAAGAAGCCAAGCTCCTTGCGCAAAAGGCCGCCGAGGCCGAACAGGAGATGCAGAGAATCAAGGCCACCGCCATCAGAACCGAAGAAGAGAAGCGGCTCATGGAACAGAAAGTGTTGGAAGCCGAGGTGCTGGCGCTTAAGATGGCAGAGGAGTCCGAGAGAAGGGCCAAAGAGGCAGACCAGCTGAAGCAGGATCTGCAGGAAGCCCGGGAAGCCGAGCGGCGGGCGAAGCAGAAGCTCTTGGAAATCGCCACCAAACCGACTTACCCACCGATGAATCCTATTCCCGCCCCCCTCCCCCCTGACATTCCCTCCTTCAACCTCATCGGAGACTCCCTGTCCTTCGACTTCAAAGACACCGATATGAAGCGGCTGTCTATGGAAATTGAAAAGGAAAAGGTCGAGTACATGGAGAAGTCCAAGCATCTGCAAGAGCAACTCAACGAACTCAAAACTGAGATCGAAGCTCTGAAGCTGAAGGAAAGAGAGACTGCCCTGGACATTCTCCATAACGAAAACTCGGACAGGGGTGGTAGCAGCAAGCACAACACCATCAAGAAGCTGACTCTGCAATCGGCCAAGAGCCGCGTGGCATTCTTCGAGGAGCTGTAACTCGAGGATTA

AAV9衣壳(SEQ ID NO:3)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

可以用作替代ITR的左侧ITR序列替换了pAV-CAG-Merlin内的原始片段。(SEQ IDNO:4)

ACATGTCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGGTCGCGTCTAGTTATTAATGCATACTAGTTACCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG

HPRE片段(SEQ ID NO:5)

CTCGAGTAAATAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGTCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGTCATCGATATC

可以用作pAV-CAG-Merlin-V2构建体中的填充序列的HPRT1内含子1DNA序列。(SEQID NO:6)

ACTAGTTACAGCTCTGGTAGCGGTAACCATGCGTATTTGACACACGAAGGAACTAGGGAAAAGGCATTAGGTCATTTCAAGCCGAAATTCACATGTGCTAGAATCCAGATTCCATGCTGACCGATGCCCCAGGATATAGAAAATGAGAATCTGGTCCTTACCTTCAAGAACATTCTTAACCGTAATCAGCCTCTGGTATCTTAGCTCCACCCTCACTGGTTTTTTCTTGTTTGTTGAACCGGCCAAGCTGCTGGCCTCCCTCCTCAACCGTTCTGATCATGCTTGCTAAAATAGTCAAAACCCCGGCCAGTTAAATATGCTTTAGCCTGCTTTATTATGATTATTTTTGTTGTTTTGGCAATGACCTGGTTACCTGTTGTTTCTCCCACTAAAACTTTTTAAGGGCACTAGT

pAAV2_CAG_Merlin_Kan，一种DNA载体(SEQ ID NO:7)

GTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGG

CTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGA

CGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTC

GTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGAT

ACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGA

AAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGC

GCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTG

TCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGT

CAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTA

CGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTCCTGCAGGCAG

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCG

TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA

GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGGTCG

CGTCTAGTTATTAATGCATACTAGTTACAGCTCTGGTAGCGGTAACCAT

GCGTATTTGACACACGAAGGAACTAGGGAAAAGGCATTAGGTCATTT

CAAGCCGAAATTCACATGTGCTAGAATCCAGATTCCATGCTGACCGAT

GCCCCAGGATATAGAAAATGAGAATCTGGTCCTTACCTTCAAGAACAT

TCTTAACCGTAATCAGCCTCTGGTATCTTAGCTCCACCCTCACTGGTTT

TTTCTTGTTTGTTGAACCGGCCAAGCTGCTGGCCTCCCTCCTCAACCG

TTCTGATCATGCTTGCTAAAATAGTCAAAACCCCGGCCAGTTAAATATG

CTTTAGCCTGCTTTATTATGATTATTTTTGTTGTTTTGGCAATGACCTGG

TTACCTGTTGTTTCTCCCACTAAAACTTTTTAAGGGCACTAGTTACCAT

TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT

CCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGC

AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAAT

GACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG

GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCAT

GGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCC

CTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGC

GATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGG

GCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGC

AGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGC

GGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGG

AGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCC

TCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGT

GAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGG

TTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGG

GGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCC

GCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTC

GGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTT

CATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTG

TGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTGGATCGGTACCAGCCACCAT

GGCCGGCGCGATTGCTTCCCGGATGTCATTCTCCTCACTTAAAAGAAA

ACAGCCTAAGACTTTTACCGTGCGGATCGTGACTATGGATGCAGAGAT

GGAATTCAACTGCGAGATGAAGTGGAAGGGAAAGGACCTCTTCGACC

TCGTCTGTCGCACCTTGGGACTGCGGGAAACCTGGTTCTTCGGACTG

CAGTACACAATCAAGGACACCGTGGCCTGGCTGAAAATGGACAAGAA

GGTCCTGGACCACGACGTGTCCAAGGAAGAACCCGTGACTTTCCACT

TTCTGGCCAAGTTCTACCCGGAGAACGCTGAGGAAGAACTCGTGCAG

GAGATCACTCAGCATCTGTTCTTTTTACAAGTCAAGAAGCAAATCCTA

GATGAGAAGATCTACTGCCCGCCGGAAGCGTCCGTGCTTCTGGCTTCC

TACGCGGTGCAGGCCAAATATGGAGACTACGATCCCTCCGTGCACAA

GCGCGGGTTCCTGGCCCAAGAGGAACTGCTGCCTAAGCGCGTGATCA

ACCTGTACCAGATGACCCCCGAGATGTGGGAGGAACGAATTACGGCT

TGGTACGCGGAGCATCGCGGCAGAGCACGCGATGAAGCCGAGATGGA

GTACCTGAAGATCGCGCAGGATCTTGAGATGTACGGGGTCAACTATTT

CGCCATCCGCAACAAGAAGGGCACCGAACTCCTGCTTGGAGTGGACG

CACTCGGGCTCCACATCTACGACCCGGAAAACCGCCTGACTCCCAAG

ATCAGCTTCCCTTGGAACGAAATCAGAAACATTTCCTACTCGGATAAG

GAATTCACGATCAAGCCACTGGACAAAAAGATTGACGTGTTCAAGTT

CAACTCGTCGAAGCTGCGCGTGAACAAGCTGATACTGCAACTGTGCA

TTGGCAATCACGACCTGTTTATGCGCCGGCGGAAGGCCGACTCATTGG

AGGTCCAACAGATGAAGGCCCAGGCCCGCGAGGAAAAGGCTCGCAA

GCAGATGGAACGGCAGAGGCTGGCCAGAGAGAAGCAGATGCGGGAA

GAGGCCGAACGCACCCGGGATGAACTGGAGCGCAGGCTGCTGCAGA

TGAAGGAAGAAGCAACCATGGCCAACGAAGCGCTGATGCGGAGCGA

AGAAACCGCGGACCTGTTGGCCGAAAAGGCTCAGATCACCGAGGAA

GAAGCCAAGCTCCTTGCGCAAAAGGCCGCCGAGGCCGAACAGGAGA

TGCAGAGAATCAAGGCCACCGCCATCAGAACCGAAGAAGAGAAGCG

GCTCATGGAACAGAAAGTGTTGGAAGCCGAGGTGCTGGCGCTTAAGA

TGGCAGAGGAGTCCGAGAGAAGGGCCAAAGAGGCAGACCAGCTGAA

GCAGGATCTGCAGGAAGCCCGGGAAGCCGAGCGGCGGGCGAAGCAG

AAGCTCTTGGAAATCGCCACCAAACCGACTTACCCACCGATGAATCCT

ATTCCCGCCCCCCTCCCCCCTGACATTCCCTCCTTCAACCTCATCGGA

GACTCCCTGTCCTTCGACTTCAAAGACACCGATATGAAGCGGCTGTCT

ATGGAAATTGAAAAGGAAAAGGTCGAGTACATGGAGAAGTCCAAGCA

TCTGCAAGAGCAACTCAACGAACTCAAAACTGAGATCGAAGCTCTGA

AGCTGAAGGAAAGAGAGACTGCCCTGGACATTCTCCATAACGAAAAC

TCGGACAGGGGTGGTAGCAGCAAGCACAACACCATCAAGAAGCTGA

CTCTGCAATCGGCCAAGAGCCGCGTGGCATTCTTCGAGGAGCTGTAA

CTCGAGTAAATAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTG

TGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGC

TTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCT

CGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACC

CCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCA

ACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGG

AACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGC

TTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACA

ATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGG

CTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCC

GTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGC

TCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGTCCGACCACGGGGCGCA

CCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACC

GTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGA

ACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGA

CTTTCAGCAATGTCATCGATATCCGATCCACCGGATCTAGATAACTGAT

CATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAAC

CTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTT

GTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATA

GCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTG

TGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGGTAACCACGTGCG

GACCCAACGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCT

CTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCC

CGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGC

GCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATC

TGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCC

CTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCG

TGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCT

TCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAA

TCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGA

CCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCC

CTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAAT

AGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGG

CTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAA

AAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATT

AACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCC

GCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCC

CTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGAC

CGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA

ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA

TGTCATGACGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAAT

ATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATT

GAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCG

CGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTC

GCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGA

AGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTT

GCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGA

ATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATG

CATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTAT

TAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAG

TGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAA

CAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAA

CGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCC

TGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACC

GGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTT

GACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATC

GCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAG

TTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA

ATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTC

TAATCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGT

CAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTC

TGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCG

GTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTA

ACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAG

CCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCT

MERLIN同种型2蛋白(SEQ ID NO:8):

MAGAIASRMSFSSLKRKQPKTFTVRIVTMDAEMEFNCEMKWKGKDLFDLVCRTLGLRETWFFGLQYTIKDTVAWLKMDKKVLDHDVSKEEPVTFHFLAKFYPENAEEELVQEITQHLFFLQVKKQILDEKIYCPPEASVLLASYAVQAKYGDYDPSVHKRGFLAQEELLPKRVINLYQMTPEMWEERITAWYAEHRGRARDEAEMEYLKIAQDLEMYGVNYFAIRNKKGTELLLGVDALGLHIYDPENRLTPKISFPWNEIRNISYSDKEFTIKPLDKKIDVFKFNSSKLRVNKLILQLCIGNHDLFMRRRKADSLEVQQMKAQAREEKARKQMERQRLAREKQMREEAERTRDELERRLLQMKEEATMANEALMRSEETADLLAEKAQITEEEAKLLAQKAAEAEQEMQRIKATAIRTEEEKRLMEQKVLEAEVLALKMAEESERRAKEADQLKQDLQEAREAERRAKQKLLEIATKPTYPPMNPIPAPLPPDIPSFNLIGDSLSFDFKDTDMKRLSMEIEKEKVEYMEKSKHLQEQLNELKTEIEALKLKERETALDILHNENSDRGGSSKHNTIKKPQAQGRRPICI

MERLIN同种型2编码区(SEQ ID NO:9):

ATGGCCGGGGCCATCGCTTCCCGCATGAGCTTCAGCTCTCTCAAGAGGAAGCAACCCAAGACGTTCACCGTGAGGATCGTCACCATGGACGCCGAGATGGAGTTCAATTGCGAGATGAAGTGGAAAGGGAAGGACCTCTTTGATTTGGTGTGCCGGACTCTGGGGCTCCGAGAAACCTGGTTCTTTGGACTGCAGTACACAATCAAGGACACAGTGGCCTGGCTCAAAATGGAC

AAGAAGGTACTGGATCATGATGTTTCAAAGGAAGAACCAGTCACCTT

TCACTTCTTGGCCAAATTTTATCCTGAGAATGCTGAAGAGGAGCTGGT

TCAGGAGATCACACAACATTTATTCTTCTTACAGGTAAAGAAGCAGAT

TTTAGATGAAAAGATCTACTGCCCTCCTGAGGCTTCTGTGCTCCTGGC

TTCTTACGCCGTCCAGGCCAAGTATGGTGACTACGACCCCAGTGTTCA

CAAGCGGGGATTTTTGGCCCAAGAGGAATTGCTTCCAAAAAGGGTAA

TAAATCTGTATCAGATGACTCCGGAAATGTGGGAGGAGAGAATTACTG

CTTGGTACGCAGAGCACCGAGGCCGAGCCAGGGATGAAGCTGAAATG

GAATATCTGAAGATAGCTCAGGACCTGGAGATGTACGGTGTGAACTAC

TTTGCAATCCGGAATAAAAAGGGCACAGAGCTGCTGCTTGGAGTGGA

TGCCCTGGGGCTTCACATTTATGACCCTGAGAACAGACTGACCCCCAA

GATCTCCTTCCCGTGGAATGAAATCCGAAACATCTCGTACAGTGACAA

GGAGTTTACTATTAAACCACTGGATAAGAAAATTGATGTCTTCAAGTTT

AACTCCTCAAAGCTTCGTGTTAATAAGCTGATTCTCCAGCTATGTATCG

GGAACCATGATCTATTTATGAGGAGAAGGAAAGCCGATTCTTTGGAAG

TTCAGCAGATGAAAGCCCAGGCCAGGGAGGAGAAGGCTAGAAAGCA

GATGGAGCGGCAGCGCCTCGCTCGAGAGAAGCAGATGAGGGAGGAG

GCTGAACGCACGAGGGATGAGTTGGAGAGGAGGCTGCTGCAGATGA

AAGAAGAAGCAACAATGGCCAACGAAGCACTGATGCGGTCTGAGGA

GACAGCTGACCTGTTGGCTGAAAAGGCCCAGATCACCGAGGAGGAG

GCAAAACTTCTGGCCCAGAAGGCCGCAGAGGCTGAGCAGGAAATGC

AGCGCATCAAGGCCACAGCGATTCGCACGGAGGAGGAGAAGCGCCT

GATGGAGCAGAAGGTGCTGGAAGCCGAGGTGCTGGCACTGAAGATG

GCTGAGGAGTCAGAGAGGAGGGCCAAAGAGGCAGATCAGCTGAAGC

AGGACCTGCAGGAAGCACGCGAGGCGGAGCGAAGAGCCAAGCAGA

AGCTCCTGGAGATTGCCACCAAGCCCACGTACCCGCCCATGAACCCA

ATTCCAGCACCGTTGCCTCCTGACATACCAAGCTTCAACCTCATTGGT

GACAGCCTGTCTTTCGACTTCAAAGATACTGACATGAAGCGGCTTTCC

ATGGAGATAGAGAAAGAAAAAGTGGAATACATGGAAAAGAGCAAGC

ATCTGCAGGAGCAGCTCAATGAACTCAAGACAGAAATCGAGGCCTTG

AAACTGAAAGAGAGGGAGACAGCTCTGGATATTCTGCACAATGAGAA

CTCCGACAGGGGTGGCAGCAGCAAGCACAATACCATTAAAAAGCCTC

AAGCCCAAGGCAGAAGACCTATCTGCATT

尽管已经针对各种优选实施方式描述了实施方式，但其并不旨在限制于此，而是本领域技术人员将认识到，在实施方式的精神和所附权利要求书的范围内，可以进行各种变化和修改。

实施例

实施例1.编码Merlin同种型1的AAV设计。设计了用于产生编码Merlin同种型1的AAV载体的AAV质粒。将转基因在KpnI和XhoI位点亚克隆到pAV-ACG(Vigene Biosciences)中。整个AAV基因组(不包括ITR)已得到序列确认。

Merlin的序列如下：

MAGAIASRMSFSSLKRKQPKTFTVRIVTMDAEMEFNCEMKWKGK

DLFDLVCRTLGLRETWFFGLQYTIKDTVAWLKMDKKVLDHDVSKEEPV

TFHFLAKFYPENAEEELVQEITQHLFFLQVKKQILDEKIYCPPEASVLLAS

YAVQAKYGDYDPSVHKRGFLAQEELLPKRVINLYQMTPEMWEERITAW

YAEHRGRARDEAEMEYLKIAQDLEMYGVNYFAIRNKKGTELLLGVDAL

GLHIYDPENRLTPKISFPWNEIRNISYSDKEFTIKPLDKKIDVFKFNSSKLR

VNKLILQLCIGNHDLFMRRRKADSLEVQQMKAQAREEKARKQMERQR

LAREKQMREEAERTRDELERRLLQMKEEATMANEALMRSEETADLLAE

KAQITEEEAKLLAQKAAEAEQEMQRIKATAIRTEEEKRLMEQKVLEAEV

LALKMAEESERRAKEADQLKQDLQEAREAERRAKQKLLEIATKPTYPP

MNPIPAPLPPDIPSFNLIGDSLSFDFKDTDMKRLSMEIEKEKVEYMEKSKH

LQEQLNELKTEIEALKLKERETALDILHNENSDRGGSSKHNTIKKLTLQS

AKSRVAFFEEL(SEQ ID NO:1)

载体中提供的核苷酸序列只是说明性的，并且由于遗传密码的简并性，其他核苷酸序列可以用于编码Merlin蛋白。在本实施例中，以下核苷酸序列可以用于编码Merlin蛋白(未显示终止密码子)。

ATGGCCGGCGCGATTGCTTCCCGGATGTCATTCTCCTCACTTAAAAGAAAACAGCCTAAGACTTTTACCGTGCGGATCGTGACTATGGATGCAGAGATGGAATTCAACTGCGAGATGAAGTGGAAGGGAAAGGACCTCTTCGACCTCGTCTGTCGCACCTTGGGACTGCGGGAAACCTGGTTCTTCGGACTGCAGTACACAATCAAGGACACCGTGGCCTGGCTGAAAATGGAC

AAGAAGGTCCTGGACCACGACGTGTCCAAGGAAGAACCCGTGACTTT

CCACTTTCTGGCCAAGTTCTACCCGGAGAACGCTGAGGAAGAACTCG

TGCAGGAGATCACTCAGCATCTGTTCTTTTTACAAGTCAAGAAGCAAA

TCCTAGATGAGAAGATCTACTGCCCGCCGGAAGCGTCCGTGCTTCTGG

CTTCCTACGCGGTGCAGGCCAAATATGGAGACTACGATCCCTCCGTGC

ACAAGCGCGGGTTCCTGGCCCAAGAGGAACTGCTGCCTAAGCGCGTG

ATCAACCTGTACCAGATGACCCCCGAGATGTGGGAGGAACGAATTAC

GGCTTGGTACGCGGAGCATCGCGGCAGAGCACGCGATGAAGCCGAGA

TGGAGTACCTGAAGATCGCGCAGGATCTTGAGATGTACGGGGTCAACT

ATTTCGCCATCCGCAACAAGAAGGGCACCGAACTCCTGCTTGGAGTG

GACGCACTCGGGCTCCACATCTACGACCCGGAAAACCGCCTGACTCC

CAAGATCAGCTTCCCTTGGAACGAAATCAGAAACATTTCCTACTCGGA

TAAGGAATTCACGATCAAGCCACTGGACAAAAAGATTGACGTGTTCA

AGTTCAACTCGTCGAAGCTGCGCGTGAACAAGCTGATACTGCAACTG

TGCATTGGCAATCACGACCTGTTTATGCGCCGGCGGAAGGCCGACTCA

TTGGAGGTCCAACAGATGAAGGCCCAGGCCCGCGAGGAAAAGGCTC

GCAAGCAGATGGAACGGCAGAGGCTGGCCAGAGAGAAGCAGATGCG

GGAAGAGGCCGAACGCACCCGGGATGAACTGGAGCGCAGGCTGCTG

CAGATGAAGGAAGAAGCAACCATGGCCAACGAAGCGCTGATGCGGA

GCGAAGAAACCGCGGACCTGTTGGCCGAAAAGGCTCAGATCACCGA

GGAAGAAGCCAAGCTCCTTGCGCAAAAGGCCGCCGAGGCCGAACAG

GAGATGCAGAGAATCAAGGCCACCGCCATCAGAACCGAAGAAGAGA

AGCGGCTCATGGAACAGAAAGTGTTGGAAGCCGAGGTGCTGGCGCTT

AAGATGGCAGAGGAGTCCGAGAGAAGGGCCAAAGAGGCAGACCAGC

TGAAGCAGGATCTGCAGGAAGCCCGGGAAGCCGAGCGGCGGGCGAA

GCAGAAGCTCTTGGAAATCGCCACCAAACCGACTTACCCACCGATGA

ATCCTATTCCCGCCCCCCTCCCCCCTGACATTCCCTCCTTCAACCTCAT

CGGAGACTCCCTGTCCTTCGACTTCAAAGACACCGATATGAAGCGGC

TGTCTATGGAAATTGAAAAGGAAAAGGTCGAGTACATGGAGAAGTCC

AAGCATCTGCAAGAGCAACTCAACGAACTCAAAACTGAGATCGAAGC

TCTGAAGCTGAAGGAAAGAGAGACTGCCCTGGACATTCTCCATAACG

AAAACTCGGACAGGGGTGGTAGCAGCAAGCACAACACCATCAAGAA

GCTGACTCTGCAATCGGCCAAGAGCCGCGTGGCATTCTTCGAGGAGCTG(SEQ ID NO:2)

另外，尽管本实施例以及下面的实施例说明了Merlin同种型1的使用，但也可以使用Merlin同种型2来代替它。

实施例2:载体可表达Merlin蛋白

AAV9载体用于转导HEK293细胞，该载体可以基于图1或图2中所示的质粒。AAV9载体包括编码Merlin蛋白的转基因。分析并检测细胞中Merlin蛋白的表达。这些结果如图3中所示,其显示了检测蛋白质表达的蛋白质印迹。

实施例3.Merlin的病毒递送以治疗NF2。

将编码正常(野生型)NF2(Merlin)的腺相关病毒(AAV)给药于患有NF2的患者的中枢神经系统(CNS)。AAV通过鞘内注射给药，但也可以通过多次瘤间注射、室内或静脉注射给药。Merlin在CNS中的表达阻止肿瘤进展和/或导致肿瘤消退。AAV包括AAV衣壳和可操作地连接至组成型启动子的NF2转基因。AAV基于AAV-DJ(Grimm D,et al.(2008)In vitro andin vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding andretargeting of adeno-associated viruses.J Virol.82:5887-911.)或AAV-9(Gao G.etal.(2004)Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in humantissues.J Virol.78:6381-8；Hocquemiller,M.et al.(2016)Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNSDiseases.Hum Gene Ther.7:478-496)。组成型启动子是CAG(Fitzsimons,et al.(2002)Promoters and regulatory elements that improve adeno-associated virus transgene expression in the brain.Methods28:227-36.)。不受任何特定理论的束缚，该启动子的使用使得转基因能够在大多数细胞中组成型表达。然而，可以使用组织特异性启动子。NF2转基因是人类序列优化的神经纤维瘤病2(NF2)基因，也可称为“h-soNF2”。所使用的NF2同种型将是最长的(595个氨基酸)，但可以使用其他同种型或其活性片段来代替。

实施例4.NF2的表达减少NF2转基因小鼠中的脊髓神经鞘瘤和裸(SCID)小鼠中的脑膜瘤异种移植物。将实施例1的AAV鞘内递送至患有脊髓神经鞘瘤的成年转基因NF2小鼠或具有脑膜瘤异种移植物的裸小鼠。对小鼠进行监测，然后在处死后收获肿瘤细胞和正常施万细胞和蛛网膜细胞。通过蛋白质印迹证实全长人merlin的存在。对肿瘤进行体积测量，并且发现肿瘤负荷减少。

实施例5.AAV-NF2在2型神经纤维瘤病的细胞培养模型中具有功能。最初，实施例1的AAV用于将merlin基因递送至细胞，并且该基因是有功能的并产生merlin蛋白。使用人merlin特异性抗体通过蛋白质印迹法评估来自AAV递送的转基因的人merlin产生。细胞系可以是例如RT4大鼠神经鞘瘤细胞系。还进行了集落形成测定，并且发现AAV-NF2在软琼脂测定中减少集落形成。

实施例6.pAV-CAG-Merlin-V2是改进的AAV基因治疗质粒

pAV-CAG-Merlin-V2是通过修饰原始Merlin构建体(pAV-CAG-Merlin)中的序列元件而产生的，如图1和图2中所示。克隆策略基于原始Merlin构建体中的核苷酸位置。pAV-CAG-Merlin-V2是一种重组腺相关病毒(AAV)DNA质粒，大小为6892个碱基对(bp)(图2)，其包含源自AAV血清型2(AAV2)的反向末端重复(ITR)序列和表达Merlin蛋白的转基因盒。在pAV-CAG-Merlin-V2中，左侧ITR被修饰以包括填充序列，其可以用于赋予最佳的AAV包装效率。HPRE序列被插入到Merlin蛋白编码序列的下游，以促进转基因表达。该载体被修饰以包括卡那霉素抗性基因，以便于生产在重组AAV生产中使用的DNA产物。

表达盒包括以下：与编码密码子优化的Merlin蛋白的序列偶联的CAG启动子，随后是乙型肝炎病毒(HPRE)的转录后调节元件，然后是转录终止SV40聚腺苷酸化(SV40-polyA)序列。不受任何特定理论的束缚，HPRE元件是顺式作用序列，其促进无内含子转录物的细胞质定位并有助于更高的基因表达。此外，将源自次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)基因内含子1区域的400bp填充序列插入左侧ITR下游和CAG启动子上游，以将AAV包装大小扩展至4487bp。卡那霉素抗性基因(KanR)包括在质粒骨架中作为选择标记。

为了产生质粒以增加AAV包装效率，可以修饰左侧ITR序列。左侧ITR可以包括：

ACATGTCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGGTCGCGTCTAGTTATTAATGCATACTAGTTACCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG(SEQ ID NO:4)

产生去除任何人工标签诸如组氨酸标签或FLAG标签的载体。基因治疗载体携带的转基因大多缺乏内含子序列。无内含子的转录本可能不太稳定，并且容易在细胞核内积累。乙型肝炎病毒(HPRE)的转录后调控元件(PRE)可以通过促进mRNA从细胞核输出到细胞质、增强3'端加工和稳定性，从而增加无内含子基因的细胞质mRNA的积累。因此，在重组Merlin转录物中添加HPRE元件以提高转基因mRNA的稳定性和转基因表达。合成HPRE片段并插入在XhoI位点(2906)和EcoRV位点(3000)之间。乙型肝炎病毒(HPRE)的转录后调控元件(PRE)可以是如下：

CTCGAGTAAATAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGTCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGTCATCGATATC(SEQ ID NO:5)

在构建体的5'端CAG启动子前面引入填充序列。AAV载体的最佳包装大小为4.1～4.9kb(Grieger et al.2005)。原始Merlin构建体的包装大小仅为3.5kb。为了增加AAV载体包装大小，将源自HPRT1基因内含子1区域的400bp填充序列插入左侧ITR序列下游和CAG启动子序列上游。通过添加此序列，AAV增大而有利于有效包装到AAV衣壳中。HPRT1内含子1序列用作填充序列，但也可以使用其他填充序列。填充序列可以如下：

ACTAGTTACAGCTCTGGTAGCGGTAACCATGCGTATTTGACACACGAAGGAACTAGGGAAAAGGCATTAGGTCATTTCAAGCCGAAATTCACATGTGCTAGAATCCAGATTCCATGCTGACCGATGCCCCAGGATATAGAAAATGAGAATCTGGTCCTTACCTTCAAGAACATTCTTAACCGTAATCAGCCTCTGGTATCTTAGCTCCACCCTCACTGGTTTTTTCTTGTTTGTTGAACCGGCCAAGCTGCTGGCCTCCCTCCTCAACCGTTCTGATCATGCTTGCTAAAATAGTCAAAACCCCGGCCAGTTAAATATGCTTTAGCCTGCTTTATTATGATTATTTTTGTTGTTTTGGCAATGACCTGGTTACCTGTTGTTTCTCCCACTAAAACTTTTTAAGGGCACTAGT(SEQ ID NO:6)

实施例7.食蟹猴(Cynomolgus Macaques)中小脑中从AAV载体表达的Merlin。

进行了研究以评价当由小脑池内(ICM)给予食蟹猴时，AAV9-CAG-Merlin-v2和AAV9-CAG-eGFP用于治疗2型神经纤维瘤病(NF2)的安全性和生物分布。另一个目标是确认每种载体在感兴趣区域的施万细胞、蛛网膜细胞和室管膜细胞中的转基因递送和表达。对每个收集的组织切片进行绿色荧光蛋白(GFP；兔抗GFP)分析(通过免疫染色)。制备每个组织样品的扫描用于GFP的免疫染色和免疫荧光。图4显示通过ICM给药AAV9-CAG-eGFP的食蟹猴小脑中eGFP生物分布的免疫组织化学图像。这些数据使用替代生物标志物生物分布证明ICM给药途径提供的AAV9载体可以在适当的组织中表达蛋白质，并且可能提供表达merlin蛋白的AAV9载体可以恢复正常merlin功能的证据。eGFP表达被用作Merlin表达的替代标记，因为动物表达天然Merlin蛋白，其与AAV9载体表达的merlin没有区别。

实施例8.与用AAV9-CAG-GFP处理的小鼠相比，在给药AAV9-CAG-Merlin v2的NF2敲除小鼠中，施万细胞密度降低。

将Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠用5μL或10μL的测试物品(AAV9-CAG-Merlin或AAV9-CAG-Merlin-v2)或阴性对照载体(AAV9-CAG-GFP)注射到小脑池(ICM)中。在Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠模型中，在Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠的背根神经节(DRG)中观察到SC增生，类似于在患有NF2的人类中观察到的情况。6个月大时，与对照小鼠相比，Postn-Cre；Nf2^flox ^/flox小鼠DRG中的SC数量(SC增生和神经鞘瘤肿瘤)显著增加。Periostin-Cre:NF2^flox/flox小鼠与NF2^flox/flox小鼠交配。

研究设计:

组1a：用AAV9-CAG-GFP(低剂量对照，5.6E12 vg/kg)注射的4×1月龄幼鼠

组1b：用AAV9-CAG-GFP(高剂量对照，4E13 vg/kg)注射的4×1月龄幼鼠

组2a：用AAV9-CAG-Merlin v1(低剂量，5.6E12 vg/kg)注射的10×1月龄幼鼠

组2b：用AAV9-CAG-Merlin v2(高剂量7E13 vg/kg)注射的10×1月龄幼鼠

组3：注射AAV-GFP(低剂量对照，5.6E12 vg/kg)的5×1月龄幼鼠在注射后4周处死以分析组织分布。

给药后观察小鼠5个月(组1a、1b、2a、2b)或4周(组3)。组1b两只小鼠(AAV9-CAG-GFP)由于体重过度减轻而分别在22天和50天后被处死。在给药观察期之后，处死小鼠以进行进一步分析。为了评估AAV9-CAG-Merlin的抗增殖活性，通过SC核数/μm²测量背根神经节(DRG)组织学切片中的施万细胞(SC)计数，并对AAV9-CAG-Merlin注射小鼠和AAV9-CAG-GFP注射对照的值进行统计分析。使用GFP抗体进行免疫组织化学分析AAV-GFP表达和组织分布(组3)以及6个月时AAV-GFP表达的持续性(组2)。

作为AAV9-CAG-merlin构建体的生物分布的代表，开发了AAV9-CAG-eGFP构建体，其中Merlin转基因被替代生物标志物蛋白替代。预计该构建体的eGFP表达将与用Merlin构建体转导的类似组织的预期生物分布相关。在注射了AAV9-CAG-GFP的Postn-Cre；Nf2^flox ^/flox小鼠的DRG中观察到eGFP的显著生物分布，如图5中的增强的免疫荧光显微照片所示。增强免疫荧光分析表明，在通过ICM给药给予低剂量(组3；5.6E12 vg/kg)的AAV9-CAG-GFP并且4周后处死的小鼠中,在轴突细胞(施万细胞)周围的细胞中存在eGFP表达(图6)。DRG远端的神经在施万细胞中也显示出eGFP的表达(图7)。DRG的全宽的切片显示了eGFP在DRG整个区域的分布表达。

为了评估AAV9-CAG-Merlin和AAV9-CAG-Merlin-v2的抗增殖活性，对AAV9-CAG-Merlin和AAV9-CAG-Merlin-v2处理的动物中每平方微米组织的细胞核数量进行计数，并与给药AAV9-CAG-eGFP阴性对照的小鼠进行比较。与给药同等剂量的AAV9-CAG-GFP的类似小鼠相比，在AAV9-CAG-Merlin-v2的高剂量组中观察到SC核数/μm²的统计显著减少。与AAV9-CAG-GFP相比，在AAV9-CAG-Merlin v2的低剂量组中观察到#SC核数/μm²略有减少(无统计学意义)。图8显示与AAV9-CAG-GFP注射的对照相比，在AAV9-CAG-Merlin给药后5个月的6月龄的Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠的DRG横截面中施万细胞(SC)细胞核的密度(细胞核/μm²)显著降低。

本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和网页，无论这样的文献和类似材料的格式如何，均明确地通过引用将其全部并入。如果所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾，包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术等，则以本申请为准。

虽然已经结合各种实施方式和实施例描述了组合物、方法等，但并不旨在将它们限制于这样的实施方式或实施例。相反，如本领域技术人员将理解的，本公开涵盖各种替代、修改和等同物。

虽然已经参考具体说明性非限制性实施方式示出和描述了组合物和方法，但是应当理解，可以在形式和细节上做出各种改变而不脱离本公开的精神和范围。因此，旨在要求保护落入本公开的范围和精神内的所有实施方式及其等同物。本公开的组合物、方法、系统和测定的权利要求、描述和图表不应被理解为限制于所描述的元素顺序，除非有这样的说明。

Claims

2.根据权利要求1所述的AAV，其中，所述转基因位于AAV反向末端重复内。

3.根据权利要求1或2所述的AAV，其中，所述转基因可操作地连接至指导异源基因在宿主细胞中表达的调控序列。

4.根据权利要求3所述的AAV，其中，所述调控序列包括启动子。

5.根据权利要求4所述的AAV，其中，所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子，诸如但不限于神经元或神经元组织特异性启动子，包括但不限于本文提供的那些。

6.根据权利要求5所述的AAV，其中，所述启动子是CAG启动子、CMV启动子、CBA启动子或SV40启动子。

7.根据前述权利要求中任一项所述的AAV，其中，所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

8.根据权利要求7所述的AAV，其中，所述AAV9衣壳蛋白包括具有以下氨基酸序列的蛋白质：

SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736；

SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736；或

SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736。

9.根据权利要求7所述的AAV，其中，所述AAV9衣壳包括与SEQ ID NO:3的氨基酸残基203至736至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述的AAV，其中，由所述转基因编码的Merlin蛋白包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的AAV，其中，由所述转基因编码的Merlin蛋白包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的序列或其活性片段。

12.根据前述权利要求中任一项所述的AAV，其中，所述转基因包括编码包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:8的序列的蛋白质或其活性片段的核酸分子。

13.根据权利要求12所述的AAV，其中，编码Merlin蛋白的核酸分子包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9的核酸序列或其各自的密码子优化形式。

14.根据权利要求2所述的AAV，其中，所述AAV反向末端重复是AAV-2反向末端重复。

15.根据权利要求14所述的AAV，其中，AAV2反向末端重复包括SEQ ID NO:4的序列。

16.根据前述权利要求中任一项所述的AAV，其中，所述AAV包括位于所述转基因上游和5'(左侧)AAV ITR下游的核酸分子填充序列。

17.根据权利要求16所述的AAV，其中，所述填充序列包括SEQ ID NO:6的序列。

18.根据前述权利要求中任一项所述的AAV，其中，所述AAV包括位于所述转基因下游和右侧(3')AAV(例如，AAV2)ITR上游的核苷酸内含子序列。

19.根据权利要求18所述的AAV，其中，所述内含子序列是HPRE序列。

20.根据权利要求19所述的AAV，其中，所述HPRE序列包括SEQ ID NO:5的序列。

21.一种组合物，包括权利要求1-20中任一项所述的AAV和生理相容性载体。

22.一种药物组合物，包括权利要求1-20中任一项所述的AAV和药学上可接受的载体。

23.一种将Merlin蛋白递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-20中任一项所述的AAV或权利要求21或22所述的组合物接触的步骤。

24.一种治疗患有NF2的受试者的方法，所述方法包括向所述患有NF2的受试者给药权利要求1-20中任一项所述的AAV或权利要求21或22所述的组合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述给药是室内、脑池内、鞘内、纹状体内、胸膜内、肌内、玻璃体内、静脉内或瘤内。

26.一种抑制受试者中神经鞘瘤、脑膜瘤或室管膜瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-20中任一项所述的AAV或权利要求21或22所述的组合物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述受试者是患有NF2或NF2缺陷性疾患诸如神经鞘瘤病的受试者。

28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述给药是鞘内、静脉内、室内、纹状体内、胸膜内、肌内、脑池内或瘤内。

29.一种预防受试者中神经鞘瘤、室管膜瘤或脑膜瘤生长或形成的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-20中任一项所述的AAV或权利要求21或22所述的组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述受试者是患有NF2或NF2缺陷性疾患诸如神经鞘瘤病的受试者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述给药是鞘内、静脉内、脑池内或瘤内。

32.一种治疗患有与merlin缺陷相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患所述疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-20中任一项所述的AAV或权利要求21或22所述的组合物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述疾患是2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病、神经鞘瘤(例如，前庭神经鞘瘤)；癌症(例如，血液癌症(例如，幼年粒单核细胞白血病)、白血病(例如，成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴细胞白血病、成人急性髓细胞白血病、儿童急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病，或毛细胞白血病)；淋巴瘤(例如，AIDS相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人霍奇金淋巴瘤、儿童霍奇金淋巴瘤、成人非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤华氏巨球蛋白血症)；慢性骨髓增生性疾患；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤)；卵巢癌(例如，卵巢浆液性癌)；乳腺癌、浸润性乳腺癌；或神经皮肤疾患；(例如，间皮瘤、腹膜间皮瘤、皮肤鳞状细胞癌、泌尿道癌、甲状腺癌、胃癌、神经鞘瘤、肾细胞癌、垂体癌、卵巢癌、脑膜瘤、黑色素瘤、肺癌(例如，鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、混合型肺癌、肺腺癌)、肝癌、大肠癌、肝细胞癌、急性髓性白血病(AML)、呼吸消化道癌(鳞状细胞癌)、膀胱癌、骨癌(例如，骨肉瘤)、结直肠癌、室管膜瘤、结直肠癌、子宫内膜瘤(混合性腺鳞癌)或神经胶质瘤、或白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(RP)(视网膜变性)、视网膜和RPE复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)、或凝视诱发耳鸣(GET)。

34.根据权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，至少每6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、2年、三年、四年、五年、六年或更久给药所述AAV。

35.根据权利要求23-34中任一项所述的方法，其中，静脉内、真皮内、皮下、鞘内、全身、脑池内、室内、实质内、胸膜内、纹状体内、肌内、玻璃体内或局部给药所述AAV。

37.根据权利要求30所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是分离的核酸分子。

38.根据权利要求36或37所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括SEQID NO:2的序列。

39.根据权利要求36-39中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括AAV反向末端重复。

40.根据权利要求39所述的核酸分子，其中，所述SEQ ID NO:2的序列结合在所述AAV反向末端重复内。

41.根据权利要求39或40所述的核酸分子，其中，所述AAV反向末端重复是AAV2反向末端重复。

42.根据权利要求41所述的核酸分子，其中，所述AAV2反向末端重复之一(例如，3’AAVITR)包括SEQ ID NO:4的序列。

43.根据权利要求36-42中任一项所述的核酸分子，其中，包括SEQ ID NO:2的核酸可操作地连接至指导SEQ ID NO:2编码的蛋白质的表达的调控序列。

44.根据权利要求44所述的核酸分子，其中，所述调控序列包括启动子。

45.根据权利要求44所述的核酸分子，其中，所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。

46.根据权利要求37或38所述的核酸分子，其中，所述启动子是CAG启动子、CMV启动子或SV40启动子。

47.根据权利要求36-46中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括位于SEQID NO:2转基因上游和5’(左侧)AAV ITR下游的填充序列。

48.根据权利要求47所述的核酸分子，其中，所述填充序列包括SEQ ID NO:6的序列。

49.根据权利要求36-48中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括位于SEQID NO:2下游和右侧(3')AAV(例如AAV2)ITR上游的核苷酸内含子序列。

50.根据权利要求49所述的核酸分子，其中，所述内含子序列是HPRE内含子序列。

51.根据权利要求50所述的核酸分子，其中，所述HPRE内含子序列包括SEQ ID NO:5的序列。

52.根据权利要求36-51中任一项所述的核酸分子，其中，所述分子是质粒。

53.一种组合物，包括权利要求36-52中任一项所述的核酸分子和载体。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述载体是转染试剂。

55.一种产生权利要求1-20中任一项所述的AAV颗粒的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求36-52中任一项所述的核酸分子或权利要求53或54所述的组合物接触(例如转染或电穿孔)以产生AAV。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述细胞属于AAV包装细胞系。

57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述AAV包装细胞系是AAV9包装细胞系。

59.根据权利要求58所述的细胞，其中，所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

60.根据权利要求58或59所述的细胞，其中，所述编码衣壳蛋白的核酸分子编码与具有以下氨基酸序列的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相同的蛋白质：SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至736；SEQ ID NO:3的氨基酸残基138至736；或SEQID NO:3的氨基酸残基203至736。

61.根据权利要求58-60中任一项所述的细胞，其中，所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源、或相同的蛋白质或其活性片段。

62.根据权利要求58-61中任一项所述的细胞，其中，所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子编码包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8的序列的蛋白质或其活性片段。

63.根据权利要求58-62中任一项所述的细胞，其中，所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:9至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

64.根据权利要求58-63中任一项所述的细胞，其中，所述编码Merlin蛋白的重组核酸分子包括SEQ ID NO:9的SEQ ID NO:2的序列。

65.根据权利要求58-64中任一项所述的细胞，其中，所述重组核酸分子是质粒。