CN103930114A - 给药和治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2(NF2)基因的基因产物,并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的NF2基因的功能性同工型1蛋白质或其功能性片段,并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
Description
发明领域
本发明涉及治疗癌症的方法。
发明背景
粘着斑激酶(本文简称为FAK)是一种非受体蛋白酪氨酸激酶,其在粘着斑(focal adhesions)中具有信号传导和支架的功能。FAK是细胞粘附、迁移和存活的中心调节因子(central regulator)。因此,FAK抑制为治疗多种癌症提供了重要途径。在治疗中,将对FAK抑制剂无响应的患者与对FAK抑制剂响应的患者分开是重要的,以便可对无响应患者提供替代治疗。
附图简述
图1显示了通过蛋白质印迹法检测到的多种细胞系中NF2的基因产物(蛋白质)的蛋白质印迹检测图像。图1A显示多种NF2同工型,而图1B仅显示NF2的同工型1。
图2显示人细胞系NCI-H2052(NF2突变株,其中未检测到merlin同工型1)和人细胞系MSTO-211H(野生型NF2,其中检测到merlin同工型1)中FAK[图2A]和磷酸化的FAK(pFAK)[图2B]的蛋白质水平的蛋白质印迹检测图像。
图3显示在5种间皮瘤细胞系和1种肺细胞系中NF2的同工型1(merlin同工型1)的蛋白质基因产物的免疫组织化学检测图像(左图为其中未检测到merlin同工型1的细胞;右图为其中检测到merlin同工型1的细胞)。
图4为按merlin同工型1状态分类的经化合物A治疗的患者的Kaplan-Meier无进展生存期图。
图5为经化合物A治疗的患者的治疗持续时间的条线图,其中标注了merlin同工型1的状态。
图6为在经化合物A治疗的患者中,在最佳响应时的肿瘤测定中(研究者评估),相对于基线的变化百分数的柱状图(其根据RECIST标准测定),其中标注了merlin同工型1的状态。
发明概述
本发明涉及在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2(NF2)基因的基因产物,且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的NF2基因的功能性同工型1蛋白质或其功能性片段,且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
发明详述
在机体的组织和器官中,细胞外基质(ECM)为细胞结构(cellularorganization)提供环境和骨架。ECM和组织细胞间的相互作用在发育、内稳态、细胞生长和细胞存活的调控中起着重要作用。细胞和ECM间或细胞-细胞间的异常相互作用可导致结构改变,提高细胞迁移、侵袭和生长性质,最终导致人类疾病形成。癌症是失调的细胞迁移与生长发展成侵袭性和转移性疾病的人类疾病的最佳实例。
与ECM的细胞相互作用包括通过ECM组分衔接细胞受体的细胞粘附。ECM结合,或者更确切地说纤维结合蛋白结合至跨膜整合素家族的蛋白质,在该ECM-细胞界面处形成动态的蛋白质簇,通常被称为粘着斑复合体(focaladhesion complexes)(或粘着斑(focal contacts))。这些复合体将ECM与细胞骨架连接。在该界面处,结构和信号传导复合体的形成对该细胞具有重要的调节作用。据描述,许多具有支架和信号传导性质的蛋白质集中于粘着斑上。所述非受体蛋白酪氨酸激酶,粘着斑激酶(FAK),也称为PKT2或蛋白酪氨酸激酶2,在粘着斑中具有信号传导和支架的功能,并且已显示作为该复合体、细胞粘附、迁移和生存的中心调节因子[1-3]。
FAK由研究者独立地发现,该研究者试图了解整合素依赖性细胞粘附的控制,以理解贴壁依赖性细胞生长以及在肿瘤细胞情况中的非贴壁依赖性细胞生长[4,5]。其它研究者探索v-src癌基因的基质以了解其转化机理。作为src在粘着斑中的基质和结合搭档,FAK的发现提供了对非贴壁依赖性细胞生长和保护免受细胞失巢凋亡的机理的初步了解[6,7]。多项研究已将FAK表达水平和/或活化状态与癌症生成和进展相关联。FAK的活化常常可通过磷酸化的FAK(pFAK)的水平,更确切地说可通过酪氨酸397(FAK的自磷酸化位点,也是src的结合位点)磷酸化的pFAK的量推断。更高水平的pFAK与癌症的早期阶段向更晚期阶段转变相关,且重要的是,与转移性疾病相关[3,8,9]。
国际申请PCT/US2009/062163号,其国际申请日为2009年10月27日;国际公开WO2010/062578号,其国际公开日为2010年6月03日;公开并要求保护2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(此后称为“化合物A”),或其药学上可接受的盐,连同尤其是在癌症的治疗中用作FAK活性抑制剂的药学上可接受的盐,上述文献的全部公开内容引入本文作为参考,且其中化合物A为实施例41a的化合物。
国际申请PCT/US/2008003235号,其国际申请日为2008年3月10日,国际公开WO2008/115369号,其国际公开日为2008年9月25日,描述了用作FAK活性抑制剂的其它化合物,上述文献的全部公开内容引入本文作为参考。
化合物A正作为一项新的癌症治疗剂在人中进行测试。期望能够鉴别更可能对FAK抑制剂如化合物A响应的基因型和表型。
II型神经纤维瘤病(NF2)是一种遗传性癌症综合征,其由该NF2(神经纤维瘤蛋白-2或merlin)基因的遗传性种系突变所导致。所述NF2基因为肿瘤抑制因子,且在NF2综合征中观察到肿瘤抑制功能异常或不存在。该综合征的特征在于患者发展神经系统肿瘤,包括神经鞘瘤、脑膜瘤和室管膜瘤。肿瘤的发展伴有剩余等位基因的体细胞失活。还在大部分散在的神经系统肿瘤中发现NF2基因的突变,突出了该肿瘤抑制因子在中枢神经系统癌症中的重要性[10]。此外,NF2的纯合突变(homozygous mutation)也在其它肿瘤类型中得以确认,这些肿瘤类型包括:恶性间皮细胞瘤(50%)、甲状腺肿瘤(17%)、膀胱肿瘤(11%)、皮肤肿瘤(5%)、胃肿瘤(5%)、骨肿瘤(3%)、肾肿瘤(2%)、乳腺肿瘤(2%)和肠道肿瘤(2%)[11]。而且最终,该NF2基因的蛋白质产物(常称为merlin)作为一种重要的神经胶质细胞生长调节因子已涉及调节src结合ErbB2并影响src-FAK通路[12]。这些观察表明merlin可在胶质母细胞瘤中起作用。
NF2基因的蛋白质产物最常被称为merlin,但也被称为神经纤维瘤蛋白-2。已描述Merlin的多个同工型,而同工型1和同工型2是最常见的[13]。据报道,同工型1隐匿NF2的肿瘤抑制活性并通过其它剪接外显子16和外显子17得到蛋白质的不同羧基端而与同工型2区别。多项研究已鉴定了与merlin相互作用的跨膜蛋白质和细胞内蛋白质,一些通过保守结构域,包括tri-lobular amino terminal Four point one、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)(FERM)结构域相互作用。这些相互作用对于细胞骨架控制、细胞运动性和细胞侵袭是重要的。在HIPPO信号传导通路(在黑腹果蝇中阐释的哺乳动物中保守的通路)中,Merlin还与邻近的蛋白质发生相互作用[14]。HIPPO通路涉及细胞增殖、细胞存活和器官大小。这些细胞活性的HIPPO通路调控允许merlin对癌细胞生长和进展施加影响[13]。
恶性间皮细胞瘤是一种高度攻击性且致命性疾病,其通常与暴露于石棉相关[15]。间皮瘤的特征为非常具有侵袭性,并且在约40-50%的病例中,通过染色体22q12处的染色体变化,NF2基因突变或者丢失。显示在缺失NF2的间皮瘤细胞中merlin的强制表达(forced expression)抑制了细胞运动性以及侵袭性。也已显示merlin的再表达会降低FAK的磷酸化并中断与src和p85(磷酸肌醇3-激酶的调节亚基)的结合。这些研究表明merlin的失活导致FAK活化并且其是间皮瘤发病机制中重要的一步[16]。
本发明发现一些NF2突变癌细胞或merlin阴性癌细胞比它们的野生型对应物对FAK抑制剂更敏感;因此,可通过基于患者的NF2突变状态或merlin同工型1表达状态,例如基于存在或不存在NF2的基因产物如merlin同工型1蛋白对患者进行早期筛选以改善FAK抑制剂的有效性。
NF2基因和NF2基因突变
本发明涉及治疗癌症的方法,其包括向患有一种或多种NF2突变的癌症患者给药在药学上可接受的组合物中有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括向所述需要治疗的人给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐,其中所述人经测定患有具有以下突变的癌症:至少一种神经纤维瘤蛋白2(NF2)突变,或导致可检测量的NF2基因的基因产物(例如merlin同工型1蛋白质)不存在的任何突变,或导致可检测量的NF2基因的功能基因产物(例如功能merlin同工型1蛋白质或其片段)不存在的任何突变。与无该类突变的患者相比,向患有具有以下突变的癌症的患者给药FAK抑制剂使得一种或多种症状增强:至少一种神经纤维瘤蛋白2(NF2)突变,或导致可检测量的NF2基因的基因产物(例如merlin同工型1蛋白质)不存在的任何突变,或导致可检测量的NF2基因的功能基因产物(例如功能merlin同工型1蛋白质或其片段)不存在的任何突变。
野生型NF2基因(NM_000268和Gene ID:4771)的表达导致多基因产物即多种同工型的表达。例如,野生型NF2基因的表达导致至少NF2基因的同工型1和同工型2的表达。由于非野生型NF2基因具有一个或多个突变,该非野生型NF2基因的表达可导致NF2基因的一种或多种同工型的基因产物的表达不足。在一些实施方案中,NF2基因中的突变,即NF2突变,导致一种或多种基因产物或其片段不被表达成mRNA或蛋白质。在一些实施方案中,从需要癌症治疗的人获得的样品包含具有NF2突变的细胞,其中所述突变导致可检测的mRNA转录物,该mRNA转录物不翻译成蛋白质,该突变导致未成熟终止密码子(premature stop codon)。在其它实施方案中,NF2突变导致mRNA和翻译蛋白质的表达不足,例如,由于染色体丢失或NF2基因的其它缺失导致的所述NF2突变。在其它实施方案中,所述NF2突变(例如,由于染色体丢失、NF2基因的缺失,或导致未成熟终止密码子的突变),导致可检测量的NF2同工型1表达不足或不存在。
在另外的实施方案中,所述NF2突变导致由所述NF2基因表达的蛋白质的表达不足,其中所述蛋白质为肿瘤抑制因子的同工型。在另一实施方案中,未被表达的所述肿瘤抑制因子同工型为NF2同工型1。在另一实施方案中,NF2基因中的突变导致NF2同工型1基因产物的表达不足。在另外的实施方案中,突变NF2基因的同工型1蛋白质基因产物未被表达。在另一实施方案中,突变NF2基因的同工型1蛋白质基因产物不以可检测的量存在。在另外的实施方案中,NF2同工型1蛋白质基因产物的功能片段,即在体内或体外测量中保留肿瘤抑制活性的片段,不以可检测的量存在。
在其它实施方案中,NF2基因的基因产物可被表达,即以可检测的量存在,然而所述基因产物可能是非功能性的。基因产物的功能缺失可以任何方式发生,且包括突变。因此,本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的NF2基因的功能性同工型1蛋白质或其功能性片段,并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向该人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中,如果在从人获得的癌症中检测到NF2突变,则向其给药FAK抑制剂。在本文的方法中,其中肿瘤抑制同工型的表达不足,例如NF2同工型1的表达不足,所述方法包括向患有癌症的人给药FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。一项实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括检测所述癌症中NF2基因的一种或多种同工型的表达,并且如果未检测到肿瘤抑制同工型的表达,则给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。本文的另一实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括获得所述癌症的一个或多个细胞的样品,检测所述样品中NF2同工型1的表达,并且如果未检测到所述NF2同工型1,则给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中,其中未检测到NF2同工型1,所述检测为NF2基因的同工型1蛋白质基因产物的检测。本文的另一实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括获得所述癌症的一个或多个细胞的样品,检测所述样品中存在或不存在NF2的同工型1和一种或多种其它同工型,并且如果未检测到同工型1,则给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。
在其它实施方案中,野生型NF2的同工型1表达于需要治疗癌症的人的肿瘤或其样品中。在另一实施方案中,所述NF2基因的野生型同工型1基因产物以可检测的量存在。在另一实施方案中,所述野生型NF2的同工型1的片段以可检测的量存在。在另一实施方案中,所述NF2基因的同工型1基因产物的片段为功能性片段,其中所述NF2的同工型1基因产物的片段保留了体外或体内或体内和体外的肿瘤抑制活性。在一些实施方案中,其中NF2的同工型1基因产物为蛋白质或其功能性片段,而且所述同工型1蛋白质以可检测的量存在于人的样品中,所述人经2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐治疗,而且所述方法还包括加强对癌症的监测。在一些实施方案中,其中所述NF2同工型1基因产物为蛋白质或其功能性片段,而且所述同工型1蛋白质以可检测的量存在于人的样品中,所述人经2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺与其它抗癌剂组合治疗,而且所述方法还包括加强对癌症的监测。
在另一实施方案中,从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的NF2的同工型1基因产物用作生物标记,其中在所述样品中不存在可检测量的NF2同工型1表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗。在另一实施方案中,从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的NF2的同工型1基因产物用作生物标记,其中所述基因产物为蛋白质,且其中所述样品中不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白2同工型1蛋白质表明所述人适用于FAK抑制剂治疗。在另一实施方案中,从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的NF2的同工型1基因产物如神经纤维瘤蛋白2同工型1蛋白质用作生物标记,其中所述样品中不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白2同工型1蛋白质表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗,其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺,且其中所述癌症治疗是针对间皮瘤的。
Merlin同工型1
NF2基因的蛋白质基因产物常被称为merlin(UniProt No.P35240),也被称为神经纤维瘤蛋白-2。因此,本领域的技术人员能够认识merlin同工型1蛋白质与神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质和NF2同工型1蛋白质相同。本领域已知所述NF2的同工型1蛋白质基因产物,或merlin同工型1蛋白质具有肿瘤抑制功能。Merlin同工型1蛋白质可被简写为merlin;而merlin指的是merlin同工型1或多种同工型根据上下文应当是清楚的。本文中,不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质的细胞(例如肿瘤细胞)被称为“merlin阴性”。本文中,如果在癌或肿瘤中,或至少在一部分癌细胞中,例如一部分从需要治疗癌症的人获得的作为样品的癌细胞中,不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质,则所述癌为“merlin阴性癌”。本文中,不存在可检测量的功能性merlin同工型1蛋白质的细胞(例如肿瘤细胞)同样被称为merlin阴性。本文中,如果在癌或肿瘤中,或在至少一部分癌细胞中,例如一部分从需要治疗癌症的人获得的作为样品的癌细胞中,不存在可检测量的功能性merlin同工型1蛋白质,则所述癌也为merlin阴性癌。
如上所述,可由NF2基因中的突变导致不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质。可由异常转录或翻译,或多种转录后或翻译后加工(正常的和异常的)导致不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质。可由启动子或merlin同工型1mRNA转录必需的其它调节序列中的突变导致不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质。此外,可由于多种表观遗传现象导致不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质;例如,可通过表观遗传机制抑制merlin同工型1蛋白质。不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质可能是遗传修饰的结果,所述遗传修饰包括但不限于,在一个或多个其它基因中的交替、突变、缺失、插入等,所述其它基因不是NF2基因但是merlin表达(例如,merlin同工型1mRNA或蛋白质表达)所需要的,包括但不限于转录、剪接、翻译或蛋白质稳定性所需要的因子。
在本发明的一些实施方案中,merlin同工型1蛋白质可以可检测量存在,但是所述merlin同工型1蛋白质不是功能性的。不存在可检测量的功能性merlin同工型1蛋白质可能由于多种原因如突变、异常转录或翻译、或异常的转录后或翻译后加工发生。具有功能缺失的merlin同工型1蛋白质的癌细胞将可能与具有不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质的癌细胞显示相同的表型;例如,与患有具有功能性merlin同工型1蛋白质的癌症的人相比,该表型将允许在具有所述癌细胞的人中使用本文公开的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐改善治疗。该表型也可包括升高水平的pFAK表达。
本领域的技术人员能够建立功能缺失的merlin同工型1蛋白质,包括但不限于通过merlin蛋白测量下游信号传导。下游信号传导的一种此类通路是涉及MST1/2和LATS1/2激酶的规范通路(canonical pathway),其调节转录因子YAP/TAZ。测量所述下游信号传导任选包括测定测定所述激酶(例如MST1/2和/或LAT1/2)的靶点的磷酸化状态和/或磷酸化水平。测量所述下游信号传导任选包括测量YAP/TAZ转录复合物的靶基因的表达水平。本领域的技术人员能够测量与merlin有关的激酶通路的下游信号传导。
本发明的一项实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定从所述人获得的肿瘤样品中存在或不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质或其功能性片段,并且如果未检测到merlin同工型1蛋白质或其功能性片段,则向所述人给药有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
另一实施方案为治疗在有需要的人中merlin阴性癌症的方法,其包括向所述人给药治疗有效量的FAK抑制剂。在另一项治疗人中merlin阴性癌症的方法的实施方案中,所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中,在从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质或其功能性片段用作生物标记,其中所述样品中不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质或其功能性片段表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗。在另一项实施方案中,在从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质或其功能性片段用作生物标记,其中所述样品中不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质或其功能性片段表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗,其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺,且其中所述癌症治疗是针对间皮瘤的。
pFAK
磷酸化的FAK或pFAK,可在具有一个或多个NF2突变的细胞,例如肿瘤细胞中过表达。例如,pFAK在一些具有NF2基因突变的肿瘤细胞中过表达,其中所述NF2基因突变导致NF2基因的同工型1蛋白质基因产物的表达不足。因此,在一些实施方案中,pFAK以更高的量存在于肿瘤细胞中,其中不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白2同工型1蛋白质或merlin同工型1蛋白质。(如本领域已知和本文所述,神经纤维瘤蛋白2同工型1蛋白质与merlin同工型1蛋白质有相同的氨基酸序列,而且各自还可被称为其它名称,如NF2同工型1蛋白质)。
在本文治疗癌症的方法的一个实施方案中,所述方法包括测定从有需要的人获得的样品中pFAK的水平,并且与对照样品相比,如果测定的pFAK水平升高,则向所述人给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中,所述对照样品是从正常患者组织中制得的。在另一实施方案中,所述对照样品是从包含野生型NF2基因的细胞中制得的。在另一实施方案中,使用多个对照样品。
在本文另一治疗癌症的方法的实施方案中,测定不存在或存在可检测量的NF2同工型1并测定pFAK的水平。在另一实施方案中,如果观察到pFAK升高且未观察到可检测量的NF2同工型1,则给药FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。在另一治疗癌症的方法的实施方案中,所述方法包括测定pFAK水平,所述癌症为间皮瘤,且如果给药,则所述FAK抑制剂为式I的FAK抑制剂,优选化合物A。
存在或不存在可检测量的基因产物
检测存在或不存在NF2的基因产物(例如同工型1)意味着建立可能在样品中表达的基因产物(例如NF2同工型1蛋白质、神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质,或merlin同工型1蛋白质),并且例如,其可在用于检测的任何特定分析的背景噪音之上的水平检测到。本领域的技术人员通晓从低信号或背景信号区分表明基因产物表达或存在的正信号。可实施阳性对照和阴性对照以确立与正信号区别的背景或噪音。例如,“减除(cutoff)”可通过在不表达感兴趣的基因产物的阴性对照中测定背景噪音如染色或其它测量信号的水平来确立。因此,存在基因产物意味着在组织中例如一个或多个细胞中或组织内的部分细胞中,所述基因产物在背景水平之上可检测到。相反,不存在基因产物意味着在组织中例如一个或多个细胞中或组织内的部分细胞中,所述基因产物在背景水平之上不可测量。
不存在或存在可检测量的基因产物(其中所述基因产物为蛋白质),可通过多种本领域公知的任何方法完成检测。这些方法包括但不限于以下的一种或多种:质谱、2D、电泳、HPLC、蛋白质测序和多种免疫学检测方法。所述免疫学检测方法包括但不限于免疫亲和性分析、免疫沉淀分析、免疫细胞化学分析、ELISA、固相夹心分析、免疫印迹、高通量免疫印迹、免疫组织化学,或这些技术的组合。
免疫组织化学
优选地,在本文一项实施方案中,存在或不存在可检测量的NF2基因的同工型1基因产物通过检测蛋白质测定。在另一项其中蛋白质被检测的实施方案中,所述蛋白质为神经纤维瘤蛋白-2同工型1。在另一项治疗癌症的实施方案中,其中蛋白质被检测,不存在或存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质通过免疫组织化学(IHC)测定。
IHC是使用一种或多种对蛋白质特异性的抗体检测组织样品如肿瘤活检样品中的所述蛋白质的方法。(在这种意义上,抗体特定检测的蛋白质常被称作抗原)。所述抗体与所述蛋白质的结合通过染色和显微术分辨。IHC是本领域所公知的。
通常,获得的组织样品必须迅速保存以避免细胞蛋白质和组织结构的分解。常常,在保存前,所述组织经血液灌注或冲洗。用于IHC的组织样品的制备方法也是本领域所公知的,其包括但不限于,石蜡包埋、快速冷冻、福尔马林固定和甲醛固定。
制备的组织,如石蜡包埋的组织,通常使用切片机切成4-5μm厚度的薄片。然后将这些切片固定在涂布有粘合剂的玻片上。这些粘合剂通常通过表面经3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)或聚-L-赖氨酸处理的玻片添加。玻片可另外地经其它适宜的粘合剂包括明胶、卵白蛋白或市场上可得的胶水涂布。固定后,干燥所述切片。石蜡包埋的玻片可在烘箱或微波炉中干燥以去石腊化。
冷冻切片可使用预冷却的恒冷切片机制备并固定在粘性的玻片上。这些切片通常在室温干燥过夜并通过浸没在预冷却的(-20℃)丙酮中固定,尽管基于待检测的组织和蛋白质,所述干燥步骤可根据本领域的技术人员决定而省略。
在染色和检测样品中蛋白质存在或不存在前,所述组织样品是“暴露的”,以使抗体接触所述蛋白质。该过程常称为抗原修复,且可通过本领域已知的多种手段如加热或酶促手段(包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶,或其它蛋白酶)完成。
所述抗体与样品中蛋白质的结合可通过与所述抗体在多种本领域公知的溶液或缓冲液中温育完成。缓冲液可含有阻断剂,其阻断所述抗体对组织的非特异性结合;阻断可在组织样品玻片和抗体温育前或温育过程中完成。所述方法中使用的抗体的量可影响随后通过显微术分辨的信号的水平,而且本领域的技术人员知晓例如通过测试所述抗体的稀释液来测定和优化用于特定IHC分析中的抗体的量。
通常,IHC中使用的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在检测神经纤维瘤蛋白-2同工型1的情况中,所述抗体必须能够检测其它同工型可能存在的组织中存在或不存在同工型1蛋白质。所以,必须使用神经纤维瘤蛋白-2同工型1特异性抗体。所述特异性抗体经常为单克隆抗体;然而,本领域的技术人员能够识别适于检测样品中存在或不存在NF2同工型1的多克隆抗体制剂。优选地,在本文的一项实施方案中,存在或不存在NF2基因的同工型1蛋白质基因产物的检测包括:使样品接触针对神经纤维瘤蛋白-2同工型1的单克隆抗体,其中该抗体能够可检测地结合神经纤维瘤蛋白-2同工型1,并且不会可检测地结合其他神经纤维瘤蛋白-2同工型。在另一项实施方案中,所述抗神经纤维瘤蛋白-2同工型1单克隆抗体不会可检测地结合NF2的同工型2蛋白质基因产物。在另一项实施方案中,所述抗体为多克隆抗体制剂,其中所述多克隆抗体能够结合神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质,而不结合神经纤维瘤蛋白-2同工型2蛋白质。在其他实施方案中,其中所述单克隆抗体或所述多克隆抗体可检测地结合神经纤维瘤蛋白-2同工型1但不会可检测地结合神经纤维瘤蛋白-2同工型2,所述单克隆抗体或所述多克隆抗体也不会可检测地结合除同工型1外的其它同工型。
抗体结合蛋白质的检测可通过本领域公知的多种方法完成,所述方法如标记有荧光团(fluorofore)的抗体的免疫荧光检测或与免疫过氧化物酶结合的抗体的免疫过氧化物酶染色。本领域公知的其它检测方法包括显色检测、放射性、化学发光,以及其它生物的和酶的标记或标签。也可使用间接检测,且可具有优点,如基于生物素/抗生物素蛋白的系统和其它在本领域的知识和技能内的二次检测系统(secondary detection systems)。
本领域的技术人员也可使用对比染色以使细胞或细胞区室,如细胞核可视化。
基因检测
NF2基因突变也可在基因水平上,单独测定或与测定存在或不存在基因产物如蛋白质组合测定。这样的基因测试可通过本领域公知的多种手段完成,所述手段包括但不限于,测序、RT-PCR,和原位杂交,如基于荧光的原位杂交(FISH)。
根据本发明的一项实施方案,在有需要的人中治疗癌症的方法包括检测在从所述人获得的样品中NF2基因中的突变,测定所述NF2基因中的突变是否导致NF2同工型1的表达不足,并且如果所述突变导致NF2同工型1的表达不足,则向所述人给药治疗有效量的FAK抑制剂,如本文的化合物A,或其药学上可接受的盐。在另一项实施方案中,测定所述NF2基因中的突变是否导致NF2同工型1的表达不足包括进行选自以下的方法:测序、RT-PCR和FISH。在另一项实施方案中,测定所述NF2基因中的突变是否导致NF2同工型1的表达不足包括进行选自以下的方法:测序、RT-PCR和FISH。测序、RT-PCR和FISH允许本领域的技术人员建立NF2基因中的染色体丢失或其它缺失,所述染色体丢失或其它缺失会导致NF2基因产物(尤其是同工型1蛋白质)的表达不足。测序和RT-PCR允许本领域的技术人员建立点突变、插入或缺失,所述点突变、插入或缺失会导致未成熟终止密码子和导致NF2基因产物(尤其是同工型1蛋白质)的表达不足。
根据本发明的其它实施方案中,测定患者是否在给定基因处具有会响应FAK抑制剂的具体突变包括:
a.在从受治疗者肿瘤获得的生物学样品上进行基因分型技术以测定所述患者是否具有携带至少一个NF2同工型突变体的肿瘤。
b.使所述突变的检测与以下的可能性增加相关(与如果所述突变未检测的可能性相比):当给药FAK抑制剂,任选式I的FAK抑制剂,任选化合物A时,经历一个或多个增加的响应率、更长的无进展生存期或更长的总生存期的一种或多种。
FAK抑制剂
在本文任何治疗癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法中,FAK抑制剂可为式(I)的化合物或其盐:
其中:
R1为卤素、CF3、C1-C6-烷基、异丙烯基、(C2-C6-烯基)、C3-C6-环烷基、C1-C6-烷氧基,或氰基;
在R2中,当p不为0时,各R2独立地为F、Cl、CF3、甲基、甲氧基、CH2CF3、-(X)q-C1-C4-亚烷基-R4、-(X-C1-C4-亚烷基)q-NR5-C(O)-R6、(X-C1-C4-亚烷基)q-(NR5)q-SOx-R7、(X-C1-C4-亚烷基)q-Y-N(R8)2;5至6元杂环烷基-(R9)q基团,或5至6元杂芳基-(R10)r基团;
R3独立地为H、C3-C6-环烷基、C1-C6-烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6-亚烷基-R4、O-C1-C6-亚烷基-R4,或R3基团与Z一起形成任选被甲基、C1-C4-亚烷基-R4或C3-C6-环烷基取代的5至6元环;
R4为H、-(Q)q-N(R8)2、OH、SH、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷巯基,或5至6元杂环烷基-(R9)q基团;
R5为H或C1-C6-烷基;
R6为H、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、N(R8)2,或5至6元杂芳基-(R10)r基团;
R7为C1-C6-烷基、苯基-(R9)q,或5至6元杂芳基-(R10)r基团;
R8独立地为H、C1-C6-烷基、-O-C1-C6-烷基,或与其相连的氮原子一起形成5或6元杂环烷基;
R9为H、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、-(Q)q-N(R8)2、-Q-C1-C6-烷基、-C1-C6烷基R4,或5至6元杂环烷基;
R10为H、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基,或-Q-C2-C6-烷基;
R11为C1-C6-烷基、CF3、-CH2CF3、-(Q)q-C1-C4-亚烷基-R4、-Q-N(R8)2、苯基-(R5)s、5至6元杂环烷基-(R9)q基团,或5至6元杂芳基-(R10)r基团;
R12为H、C1-C6-烷基、F、Cl、CF3、OH、CN、硝基、COOH、-COO-C1-C6-烷基、-Y-N(R8)2、C3-C6-环烷基-R14、-(X)q-C1-C6-亚烷基-R4、(X-C1-C6-亚烷基)q-NR5-C(O)-R6、-(X-C1-C6-亚烷基)q-(NR5)q-SOx-R7、(X-C1-C6-亚烷基)q-Y-N(R8)2、杂环烷基-(R9)q、杂芳基-(R10)r,或苯基-(R15)s;
R13为H、F、Cl、C1-C6-烷基,或C3-C6-环烷基;或R12和R13与它们相连的碳原子一起形成稠合的5至6元碳环烷基(carbocycloalkyl)或杂环烷基;
R14独立地为H、C1-C6-烷基、-NR5-SO2-R7、Y-N(R8)2,或-(X)q-C1-C6-亚烷基-R4;
R15独立地为F、Cl、CF3、C1-C3-烷基,或C1-C3-烷氧基;
p为0、1、2或3;
q为0或1;
r为0、1或2;
s为0、1、2或3;
x为1或2;
Q为-C(O)-、-S(O)-或-SO2-;
X为NR5、O、S、-S(O)-或-SO2-;
Y为化学键、SO2或C(O);且
Z为N或CR5。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中Q为C(O)和Z为N。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中R1为Cl、CF3或CN。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中R2为F。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中一个R3为甲基,而另一个R3为H。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中一个R3为甲氧基,另一个R3为H。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中R11为C1-C6-烷基。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中R12为C1-C6-烷基、羟基甲基,或环丙基。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中R13为H。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为式(I)的化合物,且其中p为0或1。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺,或其药学上可接受的盐。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺盐酸盐。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其中所述FAK抑制剂为于药学上可接受的组合物中的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺,或其药学上可接受的盐。
本发明还涉及治疗一些癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的癌症的方法,其包括给药WO2008/115369中所述的任一种例示的化合物,其中所述癌症具有至少一种NF2突变。
本发明的一项实施方案为式I的化合物,其用于治疗人中的癌症,其中所述癌症不具有可检测量的NF2基因的基因产物。本发明的另一项实施方案为式I的化合物,其用于治疗人中的癌症,其中所述癌症不具有可检测量的NF2基因的同工型1。本发明的另一项实施方案为式I的化合物,其用于治疗人中的癌症,其中所述癌症不具有可检测量的merlin蛋白质。本发明的另一项实施方案为式I的化合物,其用于治疗人中的癌症,其中所述癌症不具有可检测量的merlin同工型1蛋白质。在本段中,在本发明的其它实施方案中,所述癌症为间皮瘤且所述式I的化合物为化合物A,如本文所述。
本发明涉及FAK抑制剂在制备用于在已确认适于所述治疗的人中治疗癌症的药物中的用途,其中通过所述癌症中不存在可检测量的NF2同工型1基因产物(如神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质或merlin同工型1蛋白质)确认所述人适于所述治疗。本发明的其它实施方案涉及前述用途,其中所述FAK抑制剂为化合物A且所述癌症为间皮瘤。
本发明还涉及确认将对本文所述的FAK抑制剂响应的癌症的方法。在一项实施方案中,确认将对式I的FAK抑制剂响应的癌症的方法包括检测所述癌症的样品中存在或不存在NF2基因的同工型1基因产物,从而当在所述样品中未检测到所述NF2基因的同工型1基因产物时,确认将对式I的FAK抑制剂响应的癌症。在另一实施方案中,确认将对式I的FAK抑制剂响应的癌症的方法包括:
a)从需要治疗的人获得所述癌症的样品;
b)检测所述样品中存在或不存在NF2基因的同工型1基因产物;和
c)当所述样品中未检测到NF2基因的同工型1基因产物时,确定所述癌症可用有效量的式I的FAK抑制剂治疗。
样品
在本文所述的方法中,使用从需要治疗癌症的人获得的样品测定不存在或存在可检测量的NF2的同工型1基因产物。在本文所述的其它方法中,使用从需要治疗癌症的人获得的样品中测定不存在或存在可检测量的功能性merlin同工型1蛋白质。如上文所述和下文详述的样品,其包括一个或多个可疑的肿瘤细胞,例如,被称为肿瘤样品。在一些实施方案中,所述样品为可疑肿瘤细胞的活检样品。在一些实施方案中,所述样品可为组织活检样品。在其他实施方案中,所述样品为细胞的活检样品,所述细胞基于其它测试癌症或确认肿瘤或癌症的生长状态的手段已知为癌性的细胞(例如肿瘤)。可从需要治疗癌症的人获得的其它样品包括但不限于蛋白质、核苷酸、细胞囊泡(blebs)或细胞组分、血清、细胞、血液、血液组分如循环肿瘤DNA、尿液和唾液。
样品的处理、保护和储存,例如用于测定存在或不存在可检测量的NF2基因的同工型1基因产物,或用于测定存在或不存在可检测量的功能性merlin同工型1蛋白质,取决于所采用的特定分析法。例如,本领域已知的,本文通常所述的IHC处理需要某种制剂和储存条件。
癌症
患有以下癌症的人对使用本文的FAK抑制剂的治疗显示改善的响应:其中不存在可检测量的NF2基因的同工型1基因产物(例如merlin同工型1蛋白质)的癌症,或其中不存在可检测量的功能性merlin同工型1蛋白质的癌症。在一些实施方案中,所述癌症选自神经鞘瘤、脑膜瘤和室管膜瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、皮肤癌、胃癌、骨癌、肾癌、乳腺癌和肠癌。在其他实施方案中,所述皮肤癌为黑素瘤。在优选的实施方案中,所述癌症为间皮瘤。
试剂盒
在另一实施方案中,本发明提供了用于治疗癌症如间皮瘤的试剂盒,包括用于检测样品中存在或不存在NF2基因的同工型1基因产物的试剂盒,其包含:(a)检测NF2基因的同工型1基因产物如merlin同工型1蛋白质或神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质的试剂。在另一实施方案中,所述用于检测NF2基因的同工型1基因产物的试剂为与所述NF2基因的同工型1基因产物可检测地结合的抗体,任选地,所述同工型1基因产物为merlin同工型1蛋白质或神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质。在另一实施方案中,所述与NF2基因的同工型1基因产物(如merlin同工型1蛋白质)可检测地结合的抗体不与其它基因产物同工型,例如NF2的同工型2基因产物(如merlin同工型2蛋白质)可检测地结合。
定义
如本领域所熟悉的,术语“野生型”指的是以无基因修饰的天然种群或给定基因位点的二倍性(2n)状态中存在的多肽或多核苷酸序列。偏离二倍体(其中患者具有三个或多个基因备份)被视为“扩增的”。也如本领域所熟悉的,“变型”包括相比于野生型多肽或多核苷酸中的相应氨基酸或核酸,分别对氨基酸或核酸具有至少一处修饰的多肽或多核苷酸序列。术语变型包括单核苷酸多态性(SNP),其中相比于最普遍的(野生型)核酸链,单碱基对差异存在于核酸链序列中。本文所用的“基因修饰”或“基因修饰的”指的是,但不限于,一个或多个碱基的任何抑制、替换、扩增、缺失和/或插入至一个或多个DNA序列中。而且,本文所用的“基因修饰的”指的是编码多肽或分别具有至少一个核酸或氨基酸缺失、替换或抑制的多肽的基因。选择性剪接(或差别剪接)是由基因转录(初级基因转录物或前mRNA)产生的RNA的外显子在RNA剪接过程中以多种方式再连接的过程。所得到的不同的mRNA可被翻译成不同的蛋白质同工型;因此单个基因可编码多种蛋白质。剪接变型为由选择性剪接得到的活性mRNA。
遗传变型和/或SNP可通过已知方法确认。例如,野生型或SNP可通过DNA扩增和测序技术、DNA和RNA检测技术(分别包括但不限于Nothern和Southern印迹法),和/或各种生物芯片和阵列技术确认。WT和突变体多肽可通过多种技术(包括但不限于免疫诊断技术如ELISA和蛋白质印迹法)检测。肿瘤细胞中DNA扩增可通过定量DNA检测技术如基于PCR的方法确认。此外,基于微阵列的方法可用于测量DNA扩增。这些方法包括基于微阵列的比较基因组杂交(Greshock,J.等,Genome Res14:179-87.)和DNA“SNP芯片”(Bignell,G.R.等,2004Genome Res14:287-95)。
如本文所使用的,检测等位基因或多态性的方法包括但不限于血清学和遗传学方法。所检测的等位基因或多态性可功能性地涉及影响个体的表型,或者所检测地等位基因或多态性可能是与功能性多态性/等位基因连锁不平衡的等位基因或多态性。如本领域的技术人员所清楚的,多态性/等位基因在受治疗者的基因组DNA中显示,但也从由该区转录或翻译的RNA、cDNA或蛋白质序列中检测到。
众所周知,在遗传学中,从不同来源获得的同一基因的核苷酸和相关的氨基酸序列在编号方法和精确的序列上均有不同。这样的不同可能是由于编号方法、基因内固有的序列变异性,和/或测序错误。因此,本领域的技术人员应当理解,本文通过序号提及的特定多态性位点包括对应于该基因内的序列和定位的那些多态性位点,即使使用了不同的编号/命名法来描述它们。
如本文所使用的,根据一个或多个基因的多态性等位基因或在至少一个多肽中的突变或编码至少一个多肽的基因将受治疗者(或DNA或其它生物学样品)“基因分型”意味着检测受治疗者(或样品)中存在或不存在所述基因或基因表达产物(例如,hnRNA、mRNA或蛋白质)的突变的、等位的或多态性形式。从该基因表达的相关的RNA或蛋白质也可用于检测突变体或多态性变型。如本领域所公知的,对于特定的等位基因,个体可能是杂合的或纯合的。可存在两种以上等位基因的形式,因此可以有3种以上可能的基因型。如本文所使用的,一种等位基因可被检测到,当其它可能的等位基因变型被排除时;例如,当发现一个特定的核酸位置既不是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T),也不是胞嘧啶(C)时,可以推断在该位置存在鸟嘌呤(G)(即,在受治疗者中,G被“检测到”或“诊断到”)。序列变异可被直接(通过,例如测序)或间接(例如,通过限制性片段长度多态性分析,或已知序列探针杂交检测,或参照链构象多态性),或通过其它已知的方法检测。
如本文所使用的,种群的“基因亚类”由具有特定基因型或至少一个体细胞突变的肿瘤的种群的成员组成。在二等位基因多态性的情况中,种群可能被分成三个亚类:等位基因1的纯合子(1,1)、杂合子(1,2),和等位基因2的纯合子(2,2)。可使用多种标准定义受治疗者的“种群”例如经化合物A治疗的个体或患有癌症的个体。在一些情况中,种群的一个基因亚类相比于另一个基因亚类可能对治疗具有较高的响应可能性。另一个实例,具有特定基因型的患者可能证明有特定表型的响应升高或降低的风险。在本文方法的一些实施方案中,由NF2基因全部或部分缺失的癌症患者的亚类对使用化合物A治疗具有较好的响应(例如,因为该缺失也在对化合物A响应的肿瘤中发现,其中所述肿瘤细胞或部分所述肿瘤细胞由于NF2基因全部或部分缺失不具有可检测量的神经纤维瘤蛋白-2同工型1)。
如本文所使用的,基于基因分型,“易感”或“有升高的风险”特定表型响应的受治疗者比在靶多态性位点处具有不同基因型的个体将更可能显示该表型。如果所述表型响应基于多等位基因多态性或基于一种以上基因分型,则在多种可能的基因型间相对风险可能不同。
如本文所使用的,对治疗的“响应”及其语法变化,包括但不限于患者在接受药物后患者的临床状况改善。响应也可意味着患者的状况在治疗起始的基础上未恶化。响应可通过测量疾病或病症的某些显示来定义。对于癌症,响应可意味着,但不限于,患者中肿瘤和/或肿瘤细胞的尺寸或数目减小。响应也可通过其它终点如患者中前肿瘤(pre-tumorous)细胞的数目减少或减轻,或疾病进展不足(常被称为“疾病稳定”或“疾病进展时间”(“Time to progressionof disease”))来定义。
如本文所使用的“基因测试”(也称为基因筛选)指的是测试从受治疗者获得的生物学样品以测定所述受治疗者的基因型;并且可用于测定所述受治疗者的基因型是否包括引起或增加对特定表型敏感性的(或与引起或增加对该表型敏感性的一种或多种等位基因连锁不平衡的)等位基因。
用于测试一个或多个突变的生物学样品可选自癌组织或正常组织,其包括但不限于蛋白质、核苷酸、细胞囊泡或细胞组分、血清、细胞、血液、血液组分如循环肿瘤DNA、尿液和唾液。样品可为组织活检样品。测试突变可通过本领域已知的和/或本文所述的若干种技术进行。
任何核酸包括基因或PCR产物或其片段或部分的序列可通过本领域已知的任何方法(化学测序或酶法测序)测序。DNA的“化学测序”指的是如Maxam和Gilbert(1977)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:560)中所述的方法,其中DNA通过各自的碱基特异性反应随机裂解。DNA的“酶法测序”指的是如Sanger(Sanger等,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463)中所述的方法。
常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术包括测序技术是本领域的技术人员所公知的。这类技术在文献中有完全地说明。参见,例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(herein"Sambrook等,1989");DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985));Transcription AndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
肽核酸(PNA)亲和性分析是传统杂交分析的衍生方法(Nielsen等,Science254:1497-1500(1991);Egholm等,J.Am.Chem.Soc.114:1895-1897(1992);James等,Protein Science3:1347-1350(1994))。PNA是遵循沃森-克里克碱基配对原理的结构DNA模拟物,并用于标准DNA杂交分析。PNA在杂交分析中显示较高的特异性,因为PNA/DNA错配比DNA/DNA错配更不稳定而且互补性PNA/DNA链比互补性DNA/DNA链形成更强的键。
已研发出DNA微阵列以检测基因变型、多态性和细胞遗传改变(例如,DNA扩增和缺失)(Taton等,Science289:1757-60,2000;Lockhart等,Nature405:827-836(2000);Gerhold等,,Trends in Biochemical Sciences24:168-73(1999);Wallace,R.W.,Molecular Medicine Today3:384-89(1997);Blanchardand Hood,Nature Biotechnology149:1649(1996);(Greshock,J.等,2004.Genome Res14:179-87;Bignell,G.R.等,2004Genome Res14:287-95))。DNA微阵列由高速机器人在玻璃或尼龙基质上制造的,并且含有已知名称的DNA片段(“探针”)。所述微阵列用于基于传统的碱基配对原理匹配已知和未知DNA片段(“靶”)。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用,且本文中用作以下物质的总称:天然蛋白质、片段、肽,或多肽序列的类似物。因此,天然蛋白质、片段和类似物为多肽属的不同种类。
本文中多肽序列中突变的术语“X#Y”是本领域公认的,其中“#”表示突变在所述多肽的氨基酸编号中的位置,“X”表示在野生型氨基酸序列中在该位置发现的氨基酸,而“Y”表示该位置的突变氨基酸。例如关于K-ras多肽的符号“G12S”表示在野生型K-ras序列的氨基酸编号12位处存在甘氨酸,而且在突变K-ras序列中该甘氨酸被丝氨酸替换。
在多肽或编码多肽的基因及其语法变型中,术语“至少一个突变”或其类似术语,意指多肽或编码多肽的基因具有一个或多个等位基因变型、剪接变型、衍生变型、替换变型、缺失变型,和/或插入变型、融合多肽、直系同源基因(orthologs),和/或种间同系物。举例而言,NF2的至少一个突变包括NF2,其中多肽(例如merlin同工型1蛋白质)或编码所述多肽的基因的部分或全部序列在细胞中不存在或不表达从而在所述细胞中产生至少一种merlin同工型1蛋白质。例如,NF2蛋白质基因产物(merlin蛋白质,包括merlin同工型1蛋白质)可由截短形式(truncated form)的细胞产生,而且所述截短形式的序列相较于截头序列可能是野生型的。缺失可意味着不存在全部或部分基因或由基因编码的蛋白质。此外,在细胞中表达的或由细胞编码的一些蛋白质可能是突变的,而相同细胞中产生的相同蛋白质的其它拷贝可能是野生型的。当患者的癌症具有至少一种形式的某些突变时,所述患者的癌症会被视为具有该突变。而且,如本文所使用的,NF2突变包括完全丢失所有基因和部分编码merlin同工型(如merlin同工型1)的基因,包括通过缺失、部分染色体丢失或染色体丢失。或者,NF2突变包括翻译或转录所述NF2基因所必需的任何调控元件中的突变或缺失,使得所述突变或缺失导致所述NF2基因的转录或翻译不足。因此,NF2突变包括翻译或转录所述NF2基因所必需的任何调控元件中的突变或缺失,使得所述突变或缺失导致细胞(例如肿瘤细胞)中同工型1的表达不足。此外,突变包括能够中断细胞中NF2基因产物(如merlin同工型1)表达的遗传物质的任何插入。
如本文所使用的,“遗传异常”是指相对于受治疗者细胞的正常天然核酸含量的缺失、替换、添加、易位、扩增等。术语“突变体NF2”指的是具有至少一个突变的NF2基因。某些示例性NF2突变体多肽包括但不限于等位基因变型、剪接变型、衍生变型、替换变型、缺失变型,和/或插入变型、融合多肽、直系同源基因和种间同系物。在一些实施方案中,突变体NF2多肽包括在C端或N端另外的残基,例如但不限于,前导序列残基、靶残基(targetingresidues)、氨基端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、标记残基(tag residues)和/或融合蛋白残基。
本文中提及的术语“多肽”意指具有至少10个碱基长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或两种核苷酸中任一类型核苷酸的修饰形式)的多聚形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本文中提及的“寡核苷酸”包括天然存在和修饰的核苷酸,其通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸键连接在一起。寡核苷酸是一种多核苷酸亚类,其通常包括200个碱基或更少的长度。优选地,寡核苷酸为10至60碱基长度并且最优选12、13、14、15、16、17、18、19或20至40碱基长度。寡核苷酸通常为单链的,例如用于探针,尽管寡核苷酸可以是双链的,例如用于构建基因突变体。寡核苷酸可以是正义或反义寡核苷酸。
寡核苷酸探针,或探针,是一种核酸分子,其尺寸范围通常为约8个核苷酸至数百个核苷酸长度。该分子通常用于通过在严格杂交条件下与靶核酸序列杂交确认样品中的该靶核酸序列。杂交条件如上所详述。
PCR引物也为核酸序列,尽管PCR引物通常为非常短长度的寡核苷酸,其用于聚合酶链反应。本领域的技术人员可使用从靶序列得到的序列信息研发和生产PCR引物和杂交探针。(参见,例如Sambrook等,上述,或Glick等,上述)。
如本文所使用的,术语“扩增”及其语法变型指的是在染色体补体中存在一个或多个另外的基因拷贝。在一些实施方案中,编码Ras蛋白质的基因可在细胞中扩增。HER2基因的扩增与某些类型的癌症相关。已在人唾液腺和胃肿瘤衍生的细胞系、胃和结肠腺癌以及乳腺腺癌中发现HER2基因的扩增。Semba等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6497-6501(1985);Yokota等,Oncogene,2:283-287(1988);Zhou等,Cancer Res.,47:6123-6125(1987);King等,,Science,229:974-976(1985);Kraus等,EMBO J.,6:605-610(1987);van de Vijver等,Mol.Cell.Biol.,7:2019-2023(1987);Yamamoto等,Nature,319:230-234(1986)。
如本文所使用的蛋白质或多肽的“过度表达”及其语法变型意指相对于正常细胞,给定细胞产生某些蛋白质的数量增加。举例而言,相对于非肿瘤细胞,肿瘤细胞可过度表达蛋白质。此外,相对于野生型蛋白质,突变体蛋白质可在细胞中过度表达。如本领域所熟悉的,细胞中多肽的表达水平可标准化为管家基因如肌动蛋白。在一些情况中,相比于非肿瘤细胞,某种多肽可在肿瘤细胞中不足表达(underexpressed)。
如本文所使用的,“表达至少一种基因产物所必需的核酸”指的是编码基因的任何部分和/或可操作地连接编码基因产物的核酸但不必包含编码序列的核酸序列。举例而言,表达至少一种基因产物所必需的核酸包括但不限于增强子、启动子、调控序列、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化序列和/或编码序列。在特定细胞中多肽的表达水平可被但不限于细胞基因组中各种调控元件和/或非编码序列的突变、缺失和/或替换影响。
如本文所使用的,“治疗”意指有益的改变与病症相关的一种或多种症状的任何方式。因此,该术语包括治愈或改善所述病症的症状或副作用或降低所述病症的进展速率。治疗还包括例如与未经治疗的人的无进展生存期相比,延长无进展生存期。治疗还包括与经FAK抑制剂治疗且患有具有可检测量的merlin同工型1蛋白质的肿瘤的人相比,延长经FAK抑制剂治疗且患有不存在可检测量的merlin同工型1蛋白质的肿瘤的人的无进展生存期。在本文治疗癌症的方法的一些实施方案中,治疗意指一种或多种症状获得临床上显著的改善,其可任选通过RECIST标准测量。在其它实施方案中,治疗意指一种或多种症状获得统计学上显著的改善,其可任选通过RECIST标准测量。在本文治疗癌症的方法的一些实施方案中,其中通过RECIST标准测量一种或多种症状的改善,所述RECIST标准为RECIST1.1标准。
如本文所使用的,术语“癌症(cancer)”、“瘤(neoplasm)”和“肿瘤(tumor)”可互换使用并且以单数或复数形式使用,指的是细胞经历恶变使得它们对于宿主生物体是病理性的。原发癌细胞(即,细胞自恶变位点附近获得)可通过建立好的技术(尤其是组织检查)和非癌性细胞容易地区分。如本文所使用的,癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞,也包括自癌祖细胞衍生的任何细胞。该细胞包括转移癌细胞,和衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及一类正常显示为实体瘤的癌症时,“临床上可检测的”肿瘤是基于肿瘤实体可检测的,例如,通过CAT扫描、MR成像、X射线、超声或触诊的方法和/或由于自患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的一类肿瘤。肿瘤可以是造血系统肿瘤,例如血液细胞肿瘤等。基于该肿瘤的临床病状的具体实例包括白血病如慢性髓细胞白血病或急性髓细胞白血病;骨髓瘤如多发性骨髓瘤;淋巴瘤等。
如本领域所熟悉的,术语“完全缓解”、“完全响应”和“完全消退”意指作为对治疗的响应,所有可检测到的癌症体征和/或症状都消失。本领域也了解,癌症的可检测到的体征或症状可根据治疗中的癌症的类型和阶段来定义。例如,患有HCC的受治疗者对治疗的“完全响应”可被定义为在X射线和CT扫描下未发现可见的肝脏肿瘤。在一些情况下,临床反应可以根据如下描述的RECIST1.1标准定义(Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J等,New responseevaluation criteria in solid tumours:Revised RECIST guideline(version1.1).Eur JCancer2009;45:228-247):
RECIST1.1标准
靶病变的评估
靶病变的响应评价的定义如下:
完全响应(CR):所有靶病变消失。所有病理性淋巴结短轴必须<10mm。
部分响应(PR):以基线直径总和作为参考(例如从基线变化的百分比),靶病变的直径总和减少至少30%。
疾病稳定:既未充分缩小到符合PR也未充分增大到符合疾病进展。
疾病进展(PD):以自治疗开始时记录的最小直径总和为参考(例如从最低点变化的百分比,其中最低点定义为自治疗开始所记录的最小直径总和),靶病变的直径总和增加至少20%。此外,所述总和必须从最低点绝对增加5mm。
不适用(NA):基线无靶病变。
不可评估(NE):不能被分类为上述五种定义的一种。
非靶病变的评估
非靶病变的响应评价的定义如下:
完全响应(CR):所有非靶病变消失。所有在基线被确认为疾病位点的淋巴结必须为非病理性的(例如,短轴<10mm)。
非CR/非PD:持续存在一个或多个非靶病变或在基线被确认为疾病位点的淋巴结短轴≥10mm。
疾病进展(PD):现存非靶病变明确进展。
不适用(NA):基线无非靶病变。
不可评估(NE):不能被分类为上述四种定义的一种。
新病变
表示疾病进展的新恶性肿瘤必须是明确的。基线未扫描的解剖部位在随访中确认的病变视为新病变。
任何可疑的新病变应当继续随访。治疗可根据研究者的考虑继续直至下次预定的评价。如果在下次预定的评价时,所述新病变被视为明确的,则应当记录进展。
总体响应的评估
以下表格表示对于基线时患有可测量疾病的受治疗者而言,在有或没有新病变出现的靶病变和非靶病变中,所有可能的肿瘤响应组合在各时间点的总体响应。
对于基线时患有可测量疾病的受治疗者而言,按照RECIST1.1评估总体响应
靶病变 | 非靶病变 | 新病变 | 总体响应 |
CR | CR或NA | 无 | CR |
CR | 非CR/非PD或NE | 无 | PR |
PR | 非PD或NA或NE | 无 | PR |
疾病稳定 | 非PD或NA或NE | 无 | SD |
NE | 非PD或NA或NE | 无 | NE |
PD | 任何 | 有或无 | PD |
任何 | PD | 有或无 | PD |
任何 | 任何 | 有 | PD |
CR=完全响应,PR=部分响应,PD=疾病进展,NA=不适用,和NE=不可评估
RECIST1.0标准
可测量的和不可测量的疾病的定义
可测量的疾病:存在至少一种可测量的病变。
可测量的病变:至少在一个维度上可以精确测量的病变,且最长直径(LD)为:
·常规技术下≥20mm(医学影像[皮肤或口腔病变]、触诊、普通X-射线、CT或MRI),
或
·螺旋CT扫描≥10mm。
不可测量的病变:所有其它病变,包括太小而不需要测量的病变(最长直径:常规技术<20mm,或螺旋CT扫描<10mm),该类病变包括骨骼病变、软脑膜病变、腹水、胸腔或心包腔积液、皮肤/肺淋巴管炎、未证实且接着通过影像学技术的腹部肿块、囊性病变,或仅有间接证据记录的病变(例如,实验室数据)。
测量方法
常规CT和MRI:最小尺寸的病变应该2倍于重建间隔。假如以最小10mm连续重建的方式提供影像,基线病变的尺寸最小可以为20mm。优选MRI,当使用MRI时,病变随后的测量必须使用相同的成像顺序在相同的解剖平面上进行。可能的话,应该使用同一扫描仪。
螺旋CT:假如以5mm间隔连续重建的方式提供影像,基线病变最小可以为10mm。本规范适用于胸部、腹部和骨盆肿瘤。
胸部X-射线:可接受胸部X-射线显示的病变为可测量的病变,只要其边界清楚并为肺实质所包围。但是,优选MRI。
临床检查:只有当病变位于浅表部位(例如皮肤结节和可摸到的淋巴结)时,才认为临床检测病变可通过RECIST标准测量。在皮肤病变的情况下,要求使用彩色影像(包括视野内的比例尺和患者研究编号以估计病变大小)来记录。
靶病变和非靶病变的基线记录
所有可测量的病变(每个器官最多有5个且总数最多为10个,代表所有所涉及的器官)应在基线时确认为靶病变并记录。
靶病变应根据其大小(病变的LD)和其准确重复测量适宜性(临床地或通过影像技术)来选择。
计算所有靶病变的LD总和并作为基线总LD报道。该基线总LD将作为表征目标肿瘤响应的参考。
所有其它病变(或疾病位置)应确认为非靶病变,并且也应该在基线时记录。不需要测量这些病变,但在随访期间应当注意其存在或消失。
标识病变的记录应当包括评价日期、病变位置描述、尺寸和用于随访病变的诊断研究类型。
所有测量应使用比例尺或测径器以公制标准进行和记录。
响应标准
治疗开始后每6周进行疾病评价。然而,经历部分或完全响应的受治疗者必须在至少28天后进行疾病确定评价。评价应当在第28天之后不久(如时间安排允许)进行,但不得早于第28天。
靶病变的响应评价的定义如下:
靶病变的评估
完全响应(CR):所有靶病变消失。
部分响应(PR):以基线总LD作为参考,靶病变LD总和减少至少30%。
疾病稳定(SD):从治疗开始,以最小总LD作为参考,最小的总LD既未充分缩小到符合PR也未充分增大到符合疾病进展(PD)。从治疗开始或一个或多个新病变出现起记录最小总LD作为病变参考。
非靶病变的评估
用于测定非靶病变的目标肿瘤响应的标准的定义如下:
完全响应:所有非靶病变消失。
不完全响应/疾病稳定:一个或多个非靶病变存留。
疾病进展:一个或多个新病变出现和/或现存非靶病变明显进展。
基于RECIST响应的总体响应的评估
总体响应是从治疗开始至疾病进展/复发所记录的最佳响应。通常,受治疗者的最佳响应的指定将取决于测量和确认标准二者的完成。
以下表格表示在有或没有新病变出现的靶病变和非靶病变中,所有可能的肿瘤响应组合的最佳总体响应的评估。
靶病变 | 非靶病变 | 新病变 | 总体响应 |
CR | CR | 无 | CR |
CR | 不完全响应/(SD) | 无 | PR |
PR | 非PD | 无 | PR |
SD | 非PD | 无 | SD |
PD | 任何 | 有或无 | PD |
任何 | PD | 有或无 | PD |
任何 | 任何 | 有 | PD |
注:对于出现需要中断治疗的全身健康状况恶化且没有客观证据表明疾病进展的受治疗者,应该归类为“症状性恶化”。即使在中断治疗后,也应该尽最大努力记录客观的进展情况。
在一些情况下,可能难以区分残存疾病和正常组织。当完全响应的评估取决于该确定时,建议对残存病变进行研究(细针抽吸/活检)以确认完全响应状态。
组合
当给药FAK抑制剂如但不限于化合物A用于治疗癌症时,本文所用的术语“共同给药”和其衍生术语是指同时给药或任何方式的单独连续给药本文所述的FAK抑制化合物和一种或多种其它已知可用于治疗癌症的活性成分(包括化学治疗和放射治疗)。本文所用的术语一种或多种其它活性成分包括任何已知的或在给药需要治疗癌症的患者时证明有利性质的化合物或治疗药物。如果不是同时给药,所述化合物应在与彼此相近的时间给药。此外,化合物是否以同一剂型给药无关紧要,例如,一种化合物可能局部给药,而另一种化合物可能口服给药。
典型地,在治疗本发明中的癌症时,可以共同给药对于待治疗的敏感的肿瘤具有活性的任何抗肿瘤药物。该药物的实例参考V.T.Devita和S.Hellman(主编)的Cancer Principles and Practice of Oncology,第6版(2001年2月15日),Lippincott Williams&Wilkins Publishers。本领域一般技术人员将能够根据药物的具体特征和所涉及癌症辨别药物的何种组合将是有用的。可用于本发明的典型抗肿瘤药物包括,但不限于,抗微管剂,例如二萜类化合物和长春花生物碱;铂配位络合物;烷基化剂,例如氮芥、氧氮磷杂环己二烯(oxazaphosphorine)、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯;抗生素例如蒽环类(anthracyclin)、放线菌素和博莱霉素;拓扑异构酶II抑制剂,例如表鬼臼毒素;抗代谢剂,例如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物;拓扑异构酶I抑制剂,例如喜树碱;激素和激素类似物;信号转导途径抑制剂;非-受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂;免疫治疗剂;促细胞凋亡剂;以及细胞周期信号传导抑制剂。
用于与本发明的FAK抑制化合物组合或共同给药的一种或多种其它活性药物(抗瘤药物)的实例是化疗药物。
抗微管或抗有丝分裂剂是时相特异性药物(phase specific agent),其在细胞周期中的M期或有丝分裂期对肿瘤细胞的微管具有活性。抗微管剂的实例包括但不限于二萜类化合物和长春花生物碱。
天然来源的二萜类化合物是时相特异性的抗癌剂,其在细胞周期中的G2/M期起作用。认为二萜类化合物通过与该蛋白结合,使微管的β-微管蛋白亚单位稳定。然后使蛋白的分解受到抑制,有丝分裂停止,接着发生细胞死亡。二萜类化合物的实例包括但不限于紫杉醇及其类似物多西紫杉醇。
紫杉醇,5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4,10-二乙酸酯2-苯甲酸酯13-(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸酯,其是从太平洋紫杉树(Taxus brevifolia)中分离出来的天然二萜产物,且在商业上可得到可注射的溶液其为萜类紫杉烷家族的成员。其在1971年由Wani等人首次分离出来(J.Am.Chem,Soc.,93:2325,1971),并通过化学和X-射线结晶学方法表征其结构。其活性的机理之一是关于紫杉醇能结合微管蛋白,进而抑制癌细胞生长。Schiff等,Proc.Natl,Acad,Sci.USA,77:1561-1565(1980);Schiff等,Nature,277:665-667(1979);Kumar,J.Biol,Chem,256:10435-10441(1981)。有关一些紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的综述,参见:D.G.I.Kingston等,Studies in Oranic Chemistry vol.26,标题为“New trends in NaturalProducts Chemistry1986”,Attaur-Rahman,P.W.Le Quesne,Eds.(Elsevier,Amsterdam,1986)pp219-235。
在美国,已经批准紫杉醇的临床使用,用于治疗难治的卵巢癌(Markman等,Yale Journal of Biology and Medicine,64:583,1991;McGuire等,Ann.Intem,Med.,111:273,1989)和用于治疗乳腺癌(Holmes等,J.Nat.Cancer Inst.,83:1797,1991)。其为治疗皮肤癌(Einzig等,Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.,20:46)和头颈癌(Forastire等,Sem.Oncol.,20:56,1990)的可能的候选药物。该化合物还具有治疗多囊性肾病(Woo等,Nature,368:750,1994)、肺癌和疟疾的潜力。采用紫杉醇治疗患者,导致骨髓抑制(多重细胞谱系(multiple cell lineages),Ignoff,R.J.等,Cancer Chemotherapy Pocket Guide,1998),这与高于阈浓度(50nM)的给药的持续时间有关(Kearns,C.M.等,Seminars in Oncology,3(6)p.16-23,1995)。
多西紫杉醇,5β-20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮13-(2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸,N-叔丁基酯,4-乙酸酯2-苯甲酸酯,三水合物,在商业上可得到可注射的溶液多西紫杉醇可用于治疗乳腺癌。多西紫杉醇是适量(q.v.)紫杉醇的半合成衍生物,其利用天然前体即从欧洲浆果紫杉树的针叶中提取的10-去乙酰基浆果赤霉素III制备。多西紫杉醇的剂量限制性毒性是嗜中性白细胞减少症。
长春花生物碱是来源于长春花属植物的时相特异性的抗肿瘤药物。长春花生物碱通过特异性地结合微管蛋白而在细胞周期的M期(有丝分裂)起作用。因此,被结合的微管蛋白分子不能聚合成微管。认为有丝分裂在中期被停止,随后细胞死亡。长春花生物碱的实例包括但不限于长春碱,长春新碱和长春瑞滨。
长春碱,长春碱硫酸盐,以注射液市售。尽管已经表明其有可能作为各种实体瘤的二线治疗,但是其最初表明用于治疗睾丸癌和各种淋巴瘤,包括霍奇金病以及淋巴细胞和组织细胞的淋巴瘤。骨髓抑制是长春碱的剂量限制性副作用。
长春新碱,长春碱22-氧代-硫酸盐,以注射溶液市售。长春新碱显示用于治疗急性白血病,还发现用于治疗多数霍奇金和非霍奇金恶性淋巴瘤。脱发和神经作用是长春新碱最常见的副作用,并产生较小程度的骨髓抑制和胃肠粘膜炎作用。
长春瑞滨,3',4'-二脱氢-4'-脱氧-C'-去甲长春碱(norvincaleukoblastine)[R-(R*,R*)-2,3-二苹果酸(1:2)(盐)],以长春瑞滨酒石酸盐注射溶液市售,是半合成的长春花生物碱。长春瑞滨可作为单独的药物或与其它化学治疗剂(如顺铂)组合,用于治疗各种实体瘤,特别是非小细胞肺癌、晚期乳腺癌和激素难治的前列腺癌。骨髓抑制是长春瑞滨最常见的剂量限制性副作用。
铂配位络合物是非时相特异性的抗癌剂,其与DNA相互作用。铂络合物进入肿瘤细胞,进行水合作用,并与DNA形成内部和相互间的交叉连接,导致对肿瘤不利的生物学作用。铂配位络合物的实例包括但不限于顺铂和卡铂。
顺铂,顺式-二氨二氯合铂,以注射溶液市售。顺铂最初用于治疗转移性睾丸癌和卵巢癌以及晚期的膀胱癌。顺铂的主要剂量限制性副作用是肾毒性和耳毒性,所述肾毒性可通过水合和利尿来控制。
卡铂,二氨[1,1-环丁烷-二羧酸根(2-)-O,O']合铂,以注射溶液市售。卡铂最初用于晚期卵巢癌的一线和二线治疗。骨髓抑制是卡铂的剂量限制性毒性。
烷基化剂是非时相特异性的抗癌药物和强亲电试剂。通常,烷基化剂借助于烷基化作用,通过DNA分子的亲核部分如磷酸基(phosphate)、氨基、巯基、羟基、羧基和咪唑基,与DNA形成共价键。这种烷基化作用破坏核酸功能,导致细胞死亡。烷基化剂的实例包括但不限于氮芥(如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)、磺酸烷基酯(如白消安、亚硝基脲如卡莫司汀),以及三氮烯(如达卡巴嗪)。
环磷酰胺,2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氧氮磷杂环己二烯2-氧化物一水合物,以注射溶液或片剂市售。环磷酰胺可作为单独的药物或与其它化学治疗剂组合,用于治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。脱发、恶心、呕吐和白细胞减少症是环磷酰胺最常见的剂量限制性副作用。
美法仑,4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯基丙氨酸,以注射溶液或片剂市售。美法仑可用于多发性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮癌的姑息疗法。骨髓抑制是美法仑最常见的剂量限制性副作用。
苯丁酸氮芥,4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸,以片剂市售。苯丁酸氮芥可用于慢性淋巴细胞性白血病,恶性淋巴瘤(如淋巴肉瘤、巨滤泡性淋巴瘤和霍奇金病)的姑息疗法。骨髓抑制是苯丁酸氮芥最常见的剂量限制性副作用。
白消安,1,4-丁二醇二甲磺酸酯,以片剂市售。白消安用于慢性髓细胞性白血病的姑息疗法。骨髓抑制是白消安最常见的剂量限制性副作用。
卡莫司汀,1,3-[双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲,以单瓶装的冻干产物市售。卡莫司汀可作为单独的药物或与其它药物组合,用于脑瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤的姑息疗法。延迟的骨髓抑制是卡莫司汀最常见的剂量限制性副作用。
达卡巴嗪,5-(3,3-二甲基-1-三氮亚烷基)-咪唑-4-甲酰胺,以单瓶装的产物市售。达卡巴嗪可用于转移性恶性黑素瘤的治疗,并且可与其它药物组合,用于霍奇金病的二线治疗。恶心、呕吐和厌食是达卡巴嗪最常见的剂量限制性副作用。
抗生素类抗癌剂是非时相特异性的药物,其结合或嵌入DNA中。通常,这种作用导致稳定的DNA复合物或链断裂,破坏核酸的正常功能,导致细胞死亡。抗生素类抗肿瘤药物的实例包括但不限于放线菌素(如放线菌素D);蒽环类(anthrocyclins)(如柔红霉素和多柔比星);以及博来霉素。
放线菌素D(Dactinomycin,也称为Actinomycin D),以注射液形式市售。放线菌素D可用于威尔曼瘤和横纹肌肉瘤的治疗。恶心、呕吐和厌食是放线菌素D最常见的剂量限制性副作用。
柔红霉素,(8S-顺-)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃糖基(hexopyranosyl))氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮(naphthacenedione)盐酸盐,以脂质体可注射形式或可注射形式市售。柔红霉素可在急性非淋巴细胞性白血病和晚期HIV相关的卡波西肉瘤的治疗中用于诱导缓解。骨髓抑制是柔红霉素最常见的剂量限制性副作用。
多柔比星,(8S,10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃糖基)氧基]-8-乙醇酰基-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮盐酸盐,以或注射溶液市售。多柔比星主要用于急性成淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病的治疗,但也是治疗某些实体瘤和淋巴瘤的有用组分。骨髓抑制是多柔比星最常见的剂量限制性副作用。
博来霉素,是从轮丝链霉菌(streptomyces verticilus)菌株中分离出来的细胞毒素糖肽类抗生素的混合物,以市售。博来霉素可作为单独的药物或与其它药物组合,用于鳞状细胞癌、淋巴瘤和睾丸癌的姑息疗法。肺部和皮肤毒性是博来霉素最常见的剂量限制性副作用。
拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于表鬼臼脂毒素。
表鬼臼脂毒素是来源于曼德拉草(mandrake)植物的时相特异性的抗肿瘤药物。表鬼臼脂毒素通常通过与拓扑异构酶II和DNA形成三元复合物,导致DNA链断裂来影响处于细胞周期的S和G2期的细胞。链断裂积聚,接着细胞死亡。表鬼臼脂毒素的实例包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。
依托泊苷,4'-去甲基-表鬼臼脂毒素9[4,6-0-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷],以注射溶液或胶囊市售,并且常称之为VP-16。依托泊苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗睾丸癌和非小细胞肺癌。骨髓抑制是依托泊苷最常见的副作用。白细胞减少症的发生率(incidence)倾向于比血小板减少症的发生率更严重。
替尼泊苷,4'-去甲基-表鬼臼脂毒素9[4,6-0-(R)-噻吩亚甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷],以注射溶液市售,并且通常称之为VM-26。替尼泊苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗儿童急性白血病。骨髓抑制是替尼泊苷最常见的剂量限制性副作用。替尼泊苷可引起白细胞减少症和血小板减少症。
抗代谢肿瘤药物是时相特异性的抗肿瘤药物,其作用于细胞周期的S期(DNA合成),通过抑制DNA的合成,或者通过抑制嘌呤或嘧啶碱基的合成进而限制DNA的合成。因此,S期不能继续下去,接着细胞死亡。抗代谢类抗肿瘤药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤,以及吉西他滨。
5-氟尿嘧啶,5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮,以氟尿嘧啶市售。5-氟尿嘧啶的给药导致胸苷酸合成的抑制,并且还掺入到RNA和DNA中。结果通常是细胞死亡。5-氟尿嘧啶可作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌和胰腺癌。骨髓抑制和粘膜炎是5-氟尿嘧啶的剂量限制性副作用。其它的氟嘧啶类似物包括5-氟脱氧尿嘧啶核苷(氟尿苷)和5-氟脱氧尿嘧啶核苷一磷酸。
阿糖胞苷,4-氨基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2(1H)-嘧啶酮,以市售,并且通常称之为Ara-C。认为阿糖胞苷在S-期具有细胞时相特异性,其通过将阿糖胞苷末端掺入到生长的DNA链中而抑制DNA链的延长。阿糖胞苷作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗急性白血病。其它的胞苷类似物包括5-氮杂胞苷和2',2'-二氟脱氧胞苷(吉西他滨)。阿糖胞苷引起白细胞减少症、血小板减少症和粘膜炎。
巯基嘌呤,1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮一水合物,以嘌呤市售。巯基嘌呤在S-期通过至今尚未清楚的机理抑制DNA的合成具有细胞时相特异性。巯基嘌呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗急性白血病。预期骨髓抑制和胃肠粘膜炎是高剂量巯基嘌呤的副作用。可使用的巯基嘌呤类似物是硫唑嘌呤。
硫鸟嘌呤,2-氨基-1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮,以市售。硫鸟嘌呤在S-期通过至今尚未清楚的机理抑制DNA的合成具有细胞时相特异性。硫鸟嘌呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗急性白血病。骨髓抑制,包括白细胞减少症、血小板减少症和贫血是给药硫鸟嘌呤最常见的剂量限制性副作用。然而,还发生胃肠副作用,而且该副作用可能是剂量限制性的。其它的嘌呤类似物包括喷司他丁、赤式羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨。
吉西他滨,2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷一盐酸盐(β-异构体),以市售。吉西他滨通过阻断细胞通过G1/S边界的发展在S-期具有细胞时相特异性。吉西他滨可与顺铂组合,用于治疗局部的晚期非小细胞肺癌,也可以单独地用于治疗局部的晚期胰腺癌。骨髓抑制(包括白细胞减少症、血小板减少症和贫血)是给药吉西他滨最常见的剂量限制性副作用。
甲氨蝶呤,N-[4[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸,以甲氨蝶呤钠市售。甲氨蝶呤在S-期具有细胞时相特异性作用,其通过抑制合成嘌呤核苷酸和胸苷酸所需的脱氢叶酸还原酶来抑制DNA的合成、修复和/或复制。甲氨蝶呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合,用于治疗绒毛膜癌、脑膜白血病、非霍奇金淋巴瘤,以及乳腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌和膀胱癌。预期骨髓抑制(白细胞减少症、血小板减少症和贫血)和粘膜炎是给药甲氨蝶呤的副作用。
喜树碱,包括喜树碱和喜树碱衍生物,其可作为拓扑异构酶I抑制剂来使用或开发。认为喜树碱细胞毒素活性与其拓扑异构酶I抑制活性相关。喜树碱的实例包括但不限于伊立替康、托泊替康,以及下述7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20-喜树碱的各种旋光体。
盐酸伊立替康,(4S)-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基]-1H-吡喃并[3',4',6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮盐酸盐,以注射溶液市售。
伊立替康是喜树碱的衍生物,其与其活性代谢物SN-38一起结合在拓扑异构酶I-DNA复合物上。认为由于双链不可修复的(irreparable)断裂,导致出现细胞毒性,所述断裂是由拓扑异构酶I:DNA:伊立替康或SN-38三元复合物与复制酶之间的相互作用引起的。伊立替康可用于治疗结肠或直肠的转移癌。盐酸伊立替康的剂量限制性副作用是骨髓抑制,包括嗜中性白细胞减少症,以及包括腹泻的GI效应。
盐酸托泊替康,(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3',4',6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮一盐酸盐,以注射溶液市售。托泊替康是喜树碱的衍生物,其与拓扑异构酶I-DNA复合物结合,并阻止单链断裂的再连接,所述单链断裂是拓扑异构酶I响应DNA分子的扭转张力(torsional strain)所引起的。托泊替康用于卵巢转移癌和小细胞肺癌的二线治疗。盐酸托泊替康的剂量限制性副作用是骨髓抑制,主要是嗜中性白细胞减少症。
同样感兴趣的是以下式A的喜树碱衍生物,目前正在研发,其包括外消旋混合物(R,S)形式以及R和S对映异构体:
已知为化学名“7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20(R,S)-喜树碱(外消旋混合物)或“7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20(R)-喜树碱(R对映异构体)或“7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱(S对映异构体)。该化合物以及相关化合物(包括制备方法)公开在美国专利6,063,923;5,342,947;5,559,235;5,491,237和于1997年11月24日提交的审查中的美国专利申请08/977,217中。
激素和激素类似物为治疗癌症有用的化合物,其中激素和癌症的生长和/或停止生之间存在关系。用于治疗癌症的激素和激素类似物的实例包括,但不限于,肾上腺皮质类固醇类(例如泼尼松和泼尼松龙),其用于治疗儿童的恶性淋巴瘤和急性白血病;氨鲁米特和其它芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、vorazole和依西美坦),其用于治疗肾上腺皮质癌和包含雌激素受体的激素依赖性乳腺癌;孕酮(例如醋酸甲地孕酮),其用于治疗激素依赖性乳腺癌和子宫内膜癌;雌激素、雄激素以及抗雄激素(例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸环丙孕酮)和5α-还原酶(例如非那雄胺和度他雄胺),其用于治疗前列腺癌和良性前列腺肥大;抗雌激素(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene,以及美国专利5,681,835、5,877,219和6,207,716中公开的选择性雌激素受体调节剂(SERMS)),其用于治疗激素依赖性乳腺癌和其它易发性癌症;以及促性腺素-释放激素(GnRH)及其类似物,其刺激黄体生成激素(LH)和/或促卵泡激素(FSH)的释放,用于治疗前列腺癌,例如,LHRH激动剂和拮抗剂,例如醋酸戈舍瑞林和luprolide。
来曲唑(商品名绯玛拉)是一种用于手术后治疗激素敏感性乳腺癌的口服非甾体芳香化酶抑制剂。雌激素通过芳香化酶的活性经雄激素转化产生。然后雌激素结合雌激素受体,引起细胞分裂。来曲唑通过竞争性的、可逆的结合芳香化酶的细胞色素P450单位的血红素阻止芳香化酶产生雌激素。该作用是特异性的,而且来曲唑不降低盐皮质激素类或皮质类固醇类的产生。
信号转导途径抑制剂为阻断或抑制引起细胞内变化的化学过程的那些抑制剂。本文所用的该变化为细胞增殖或分化。用于本发明的信号传导抑制剂包括受体酪氨酸激酶、非-受体酪氨酸激酶、SH2/SH3区域阻断剂、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇-3激酶、肌醇信号,以及Ras癌基因的抑制剂。
多种蛋白酪氨酸激酶催化细胞生长的调节中涉及的多种蛋白中的特定酪胺酰残基的磷酸化。该蛋白酪氨酸激酶可以大致分类为受体或非-受体激酶。
受体酪氨酸激酶为跨膜蛋白,其具有胞外配体结合区域、跨膜区域,以及酪氨酸激酶区域。受体酪氨酸激酶涉及细胞生长的调节,并通常称为生长因子受体。许多这些激酶的不合适的或不受控制的活化,即异常激酶生长因子受体活化(例如过表达或突变),已经显示出导致不受控制的细胞生长。因此,该激酶的异常活性已经与恶性组织生长联系起来。因此,该激酶的抑制剂可以提供癌症治疗方法。生长因子受体包括,例如,表皮生长因子受体(EGFr)、血小板衍生生长因子受体(PDGFr)、erbB2、erbB4、血管内皮生长因子受体(VEGFr)、具有免疫球蛋白-样和表皮生长因子同源性区域的酪氨酸激酶(TIE-2)、胰岛素生长因子-I(IGFI)受体、巨噬细胞集落刺激因子(cfms)、BTK、ckit、cmet、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)、ephrin(eph)受体,以及RET原癌基因。生长受体的多种抑制剂处于研发之中,包括配体拮抗剂、抗体、酪氨酸激酶抑制剂和反义寡核苷酸。生长因子受体和抑制生长因子受体功能的药剂公开在,例如,Kath,John C.,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(6):803-818;Shawver等,DDT Vol2,No.2February1997;以及Lofts,F.J.等,“Growth factor receptors as targets”,New Molecular Targetsfor Cancer Chemotherapy,ed.Workman,Paul and Kerr,David,CRC press1994,London中。
酪氨酸激酶(其不是生长因子受体激酶)被称为非-受体酪氨酸激酶。用于本发明的非-受体酪氨酸激酶,其为抗癌症药物的靶点或潜在靶点,包括cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(黏着斑激酶)、Brutons酪氨酸激酶,以及Bcr-Abl。此类抑制非受体酪氨酸激酶功能的非受体激酶和药物在Sinh,S.andCorey,S.J.,(1999)Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research8(5):465–80;和Bolen,J.B.,Brugge,J.S.,(1997)Annual review of Immunology.15:371-404有所描述。
SH2/SH3区域阻断剂为断裂多种酶或适体(adaptor)蛋白中的SH2或SH3区域结合的药剂,包括PI3-K p85亚单位、Src家族激酶、适体分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)和Ras-GAP。SH2/SH3区域作为抗癌药物的靶点在Smithgall,T.E.(1995),Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.34(3)125-32中有所讨论。
丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂包括MAP激酶级联阻断剂,其包括Raf激酶(rafk)、促分裂原或胞外调节的激酶(MEK),以及胞外调节的激酶(ERK)的阻断剂;并且蛋白激酶C家族成员阻断剂包括PKC(alpha、beta、gamma、epsilon、mu、lambda、iota、zeta)、IkB激酶家族(IKKa、IKKb)、PKB家族激酶、AKT激酶家族成员,PDK1以及TGFβ受体激酶的阻断剂。此类丝氨酸/酸酸激酶和其抑制剂在Yamamoto,T.,Taya,S.,Kaibuchi,K.,(1999),Journal ofBiochemistry.126(5)799-803;Brodt,P,Samani,A.,and Navab,R.(2000),Biochemical Pharmacology,60.1101-1107;Massague,J.,Weis-Garcia,F.(1996)Cancer Surveys.27:41-64;Philip,P.A.,and Harris,A.L.(1995),Cancer Treatmentand Research.78:3-27;Lackey,K.等,Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters,(10),2000,223-226;美国专利6,268,391;和Martinez-Iacaci,L.等,Int.J.Cancer(2000),88(1),44-52中有所描述。
包括PI3-激酶、ATM、DNA-PK,以及Ku的阻断剂的磷脂酰肌醇-3激酶家族成员的抑制剂也用于本发明。此类激酶在Abraham,R.T.(1996),CurrentOpinion in Immunology.8(3)412-8;Canman,C.E.,Lim,D.S.(1998),Oncogene17(25)3301-3308;Jackson,S.P.(1997),International Journal of Biochemistryand Cell Biology.29(7):935-8;和Zhong,H.等,Cancer res,(2000)60(6),1541-1545中有所描述。
肌醇信号抑制剂,例如磷脂酶C阻断剂以及肌醇类似物也可用于本发明中。该信号抑制剂公开在Powis,G.,和Kozikowski A.,(1994)New MolecularTargets for Cancer Chemotherapy ed.,Paul Workman and David Kerr,CRC press1994,London中。
信号转导途径抑制剂的其它类型为Ras癌基因的抑制剂。该抑制剂包括法呢基转移酶、牛儿基-牛儿基转移酶、CAAX蛋白酶、反义寡核苷酸、核糖酶和免疫疗法的抑制剂。该抑制剂已经显示出在含有野生型突变ras的细胞中阻断ras激活,因此作为抗增殖药剂。Ras癌基因抑制在Scharovsky,O.G.,Rozados,V.R.,Gervasoni,S.I.Matar,P.(2000),Journal of Biomedical Science.7(4)292-8;Ashby,M.N.(1998),Current Opinion in Lipidology.9(2)99–102;和Bennett,C.F.and Cowsert,L.M.BioChim.Biophys.Acta,(1999)1489(1):19-30中有所讨论。
如上所述,拮抗受体激酶配体结合的抗体也用作信号转导抑制剂。该类信号转导途径抑制剂包括使用人化的抗体至受体酪氨酸激酶的胞外配体结合区域。例如Imclone C225EGFR特异性抗体(见Green,M.C.等,MonoclonalAntibody Therapy for Solid Tumors,Cancer Treat.Rev.,(2000),26(4),269-286);erbB2抗体(见Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbBFamily Receptor Tyrosine Kniases,Breast cancer Res.,2000,2(3),176-183);以及2CB VEGFR2特异性抗体(见Brekken,R.A.等,Selective Inhibition of VEGFR2Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice,Cancer Res.(2000)60,5117-5124)。
非-受体激酶血管生成抑制剂也有用于本发明。血管生成相关的VEGFR和TIE2的抑制剂在上文信号转导抑制剂中讨论(两种受体均为受体酪氨酸激酶)。血管生成通常与erbB2/EGFR信号传导联系起来,因为erbB2和EGFR的抑制剂已经显示出抑制血管生成,主要地VEGF表达。因此,erbB2/EGFR抑制剂与血管生成抑制剂的组合是有意义的。因此,非-受体酪氨酸激酶抑制剂也可以与本发明的EGFR/erbB2抑制剂组合使用。例如,抗VEGF抗体,其不识别VEGFR(受体酪氨酸激酶)但结合配体;整合素的小分子抑制剂(alphav beta3),其抑制血管生成;内皮抑素和血管抑素(非RTK)也可证实用于与所公开的erb家族抑制剂组合。(参见Bruns CJ等(2000),Cancer Res.,60:2926-2935;Schreiber AB,Winkler ME,and Derynck R.(1986),Science,232:1250-1253;Yen L等(2000),Oncogene19:3460-3469)。
帕唑帕尼,可以市售,是一种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。帕唑帕尼以盐酸盐存在,其化学名为5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺单盐酸盐。帕唑帕尼被批准用于治疗患有晚期肾细胞癌的患者。
贝伐单抗,可以市售,是一种阻断VEGF-A的人源化单克隆抗体。被批准用于治疗多种癌症,包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌和胶质母细胞瘤。
mTOR抑制剂包括但不限于雷帕霉素(FK506)和雷帕霉素类似物、RAD001或依维莫司(Afinitor)、CCI-779或替西罗莫司、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687和Pp121。
依维莫司由Novartis以出售,其为西罗莫司的40-O-(2-羟基乙基)衍生物,而且作为mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶点)抑制剂作用类似于西罗莫司。它目前用作免疫抑制剂以预防器官移植排斥和治疗肾细胞癌。已经对依维莫司和其它mTOR抑制剂用于多种癌症进行了很多研究。它具有以下化学结构(式II)和化学名称:
二羟基-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]丙-2-基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮。
贝沙罗汀以出售并且是类视黄醇亚类中的一员,其选择性活化类视黄醇X受体(RXR)。这些类视黄醇受体具有不同于视黄酸受体(RAR)的生物学活性。其化学名为4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸。贝沙罗汀用于治疗在使用至少一种其它药物不能成功治疗疾病的人中皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL,一类皮肤癌)。
索拉菲尼以市售,其为一类称为多激酶抑制剂的药物。其化学名为4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺。索拉菲尼用于治疗晚期肾细胞癌(一类起始于肾的癌症)。索拉菲尼也用于治疗不能切除的肝细胞癌(一类不能用手术治疗的肝癌)。
免疫治疗方案中使用的药物也可用于与式(I)的化合物组合。有许多免疫策略可产生针对erbB2或EGFR的免疫响应。这些策略通常在肿瘤疫苗的范围内。通过使用小分子抑制剂组合抑制erbB2/EGFR信号传导通路可大大地提高免疫方法的有效性。针对erbB2/EGFR的免疫学/肿瘤疫苗方法的讨论可在Reilly RT等,(2000),Cancer Res.60:3569-3576;和Chen Y,Hu D,Eling DJ,Robbins J,and Kipps TJ.(1998),Cancer Res.58:1965-1971中找到。
erbB抑制剂的实例包括拉帕替尼、厄洛替尼和吉非替尼。拉帕替尼,N-(3-氯-4-{[(3-氟苯基)甲基]氧基}苯基)-6-[5-({[2-(甲基磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(如式I所示)是一种有效的、口服的、小分子、erbB-1和erbB-2(EGFR和HER2)酪氨酸激酶双重抑制剂,其被批准与卡培他滨组合用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。
式(I)的化合物的游离碱、盐酸盐和二甲苯磺酸盐可根据WO99/35146(公开于1999年7月15日);和WO02/02552(公开于2002年1月10日)中所公开的方法来制备。
厄洛替尼,N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二{[2-(甲基氧基)乙基]氧基}-4-喹唑啉胺(以商品名Tarceva市售),如式II所示:
厄洛替尼的游离碱和盐酸盐可根据例如U.S.5,747,498的实施例20制备。
吉非替尼,N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉)丙氧基]4-喹唑啉胺,如式III所示:
吉非替尼,以商品名市售(Astra-Zenenca),是一种erbB-1抑制剂,适用于作为铂类和多西紫杉醇化疗方案均失败的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者治疗的单一疗法。吉非替尼的游离碱、盐酸盐和双盐酸盐可根据1996年4月23日提交的国际专利申请PCT/GB96/00961号(公开日为1996年10月31日,公开号为WO96/33980)制备。
曲妥珠单抗是一种人源化单克隆抗体,其与HER2受体结合。它最初的适应症为HER2阳性的乳腺癌。
西妥昔单抗是一种小鼠人嵌合抗体,其抑制表皮生长因子受体(EGFR)。
帕妥珠单抗(也称为2C4,商品名Omnitarg)是一种单克隆抗体。是被称为“HER二聚化抑制剂”的一类药物的第一种。通过结合HER2,其抑制HER2与其它HER受体的二聚化,这理论上导致延缓肿瘤生长。帕妥珠单抗在WO01/00245(公开于2001年1月4日)中有所描述。
利妥昔单抗是一种嵌合单克隆抗体,其以和出售。利妥昔单抗结合B细胞上的CD20并引起细胞凋亡。利妥昔单抗通过静脉给药并批准用于治疗类风湿性关节炎和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
奥法木单抗是一种完全的人单克隆抗体,其以出售。奥法木单抗结合B细胞上的CD20并用于治疗福达拉滨(Fludara)和艾伦单抗(Campath)难以治疗的成人慢性淋巴细胞性白血病(CLL;一类白细胞癌症)。
用于促细胞凋亡方案的药剂(例如,bcl-2反义寡核苷酸)也可用于本发明的组合中。蛋白质的Bcl-2家族的成员阻断凋亡。上调的bcl-2因此已经与化学抗性联系起来。研究表明表皮生长因子(EGF)刺激bcl-2家族(即,mcl-1)的抗凋亡成员。因此,设计的下调bcl-2在肿瘤中的表达的策略已经证明临床有益,而且现已进入II/III期临床试验,即Genta的G3139bcl-2反义寡核苷酸。这样的促细胞凋亡策略使用bcl-2反义寡核苷酸在Water JS等,(2000),J.Clin.Oncol.18:1812-1823;和Kitada S等,(1994),Antisense Res.Dev.4:71-79中有所讨论。
细胞周期信号传导抑制剂抑制涉及控制细胞周期的分子。蛋白激酶的家族称为细胞周期蛋白依赖激酶(CDK),而且它们与称为细胞周期蛋白的蛋白家族的相互作用控制真核细胞周期的进展。不同细胞周期蛋白/CDK复合物的协调活化和失活对于细胞周期的正常进展至关重要。细胞周期信号传导的一些抑制剂处于研发之中。例如,细胞周期蛋白依赖激酶的实例包括CDK2、CDK4和CDK6,以及其抑制剂在例如Rosania等,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(2):215-230中有所描述。
在一项实施方案中,本发明要求保护的癌症治疗方法包括测定从所述人获得的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2(NF2)基因的基因产物,并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向该人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐以及共同给药至少一种抗癌药物和所述FAK抑制剂。例如,本发明提供在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定从所述人获得的肿瘤样品中存在或不存在可检测量的merlin或其功能性片段,并且如果未检测到merlin或其功能性片段,则向所属人给药有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐,以及至少一种抗癌药物,如选自以下的一种:抗微管药物、铂配位络合物、烷化剂、抗生素药物、拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢药、拓扑异构酶I抑制剂、激素和激素类似物、信号转导通路抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂、免疫治疗剂、促细胞凋亡剂以及细胞周期信号传导抑制剂。
药物组合物
尽管式(I)的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物以化学原料药给药是可能的,但以药物组合物的活性成分提供也是可能的。因此,本发明的实施方案还提供药物组合物,其包括治疗有效量的化合物A,和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述载体、稀释剂或赋形剂在与制剂的其它成分相容和对其接受者无害方面必须是可接受的。根据本发明的另一方面,还提供了制备药物组合物的方法,其包括将化合物A与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
药物制剂可以每单位剂量含有预定量活性成分的单位剂量形式提供。该单位可含有,例如0.5mg至3.5g,优选1mg至1500mg,一天1至3次式(I)的化合物,取决于正在治疗的疾病、给药途径和患者的年龄、体重和状况。优选的单位剂量制剂为含有如上所述的日剂量或分剂量(sub-dose),或其适宜部分的活性成分的那些制剂。而且,这类药物制剂可通过药学领域公知的任何方法制备。在一项实施方案中,所述人被给药约80mg至约1500mg,一天两次(BID)FAK抑制剂。在另一项实施方案中,所述人被给药约300mg至约1500mg,一天两次(BID)FAK抑制剂。在另一项实施方案中,所述人被给药约300mg至约1000mg,一天两次(BID)FAK抑制剂。在另一项实施方案中,所述人被给药50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450或1500mg,一天两次(BID)FAK抑制剂。
药物制剂可适应于通过任何适合途径给药,例如口(包括口腔或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉或皮内)途径。这类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备,例如将所述活性成分与所述载体或赋形剂混合。
适用于口服给药的药物制剂,可以以下形式提供独立的单位,如胶囊或片剂;粉末剂或颗粒剂;水或非水液体中的溶液或混悬液;可食用泡沫(foams或whips);或水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。
例如,对于以片剂或胶囊形式的口服给药,活性药物组分可与口服的、非毒性的药学可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等混合。粉末剂通过将所述化合物碾碎至适宜的精细大小并与类似碾碎的药物载体如可食用碳水化合物例如淀粉或甘露醇混合而制备。调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂也可加入于所述制剂中。
胶囊是通过制备如上所述的粉末混合物并填充已形成的明胶壳中制备。助流剂和润滑剂如胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇可在填充操作前加入至粉末混合物中。当摄取胶囊时,也可加入崩解剂或助溶剂如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以改善药物的利用度。
而且,当需要或必须时,适宜的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可掺入至该混合物中。适宜的粘合剂包括淀粉,明胶,天然糖类如葡萄糖或β-乳糖,玉米甜味剂,天然或合成胶如阿拉伯胶、黄蓍胶,藻酸钠,羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于,淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂通过例如以下方法调配:制备粉末混合物,制粒或预压片(slugging),添加润滑剂和崩解剂,和压制成片。粉末混合物通过将所述化合物(适宜地碾碎)与上文所述稀释剂或基质,以及任选地,与粘合剂如羧甲基纤维素和藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮,溶液抑制剂(retardant)如石蜡,再吸收促进剂如季盐(quaternary salt),和/或吸收剂如膨润土、高岭土或磷酸氢钙混合而制备。所述粉末混合物可通过使用粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶浆或者纤维素溶液或聚合物料溶液润湿,并强制过筛而制粒。作为制粒的另一方案,该粉末混合物可通过压片机,结果是不完全地形成的半制品碎裂成颗粒。可通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油润滑所述颗粒以防止粘附片剂成型模。然后将润滑的混合物压制成片。本发明的化合物也可与自由流动的惰性载体混合并未经制粒或预压片步骤直接压制成片。可提供由虫胶密封衣、糖衣或聚合材料衣,和蜡质抛光衣(polishcoating of wax)构成的透明或不透明的保护性包衣。染料可加入这些包衣中以区分不同的单位剂型。
口服流体如溶液、糖浆剂和酏剂可以剂量单位形式制备从而使给定量含有预定量的所述化合物。糖浆剂可通过将所述化合物溶于适宜调味的水溶液中来制备,而酏剂是通过使用无毒醇载体来制备。混悬液可通过将所述化合物分散于无毒载体中配制。还可加入增溶剂和乳化剂如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚,防腐剂,矫味添加剂如薄荷油或天然甜味剂或糖精或其它人造甜味剂等。
如果适当的话,可将用于口服给药的剂量单位制剂微胶囊化。也可例如通过将颗粒材料包被或包埋于聚合物、蜡等中将制剂制成延时或持续释放。
剂量单位形式也可以是脂质体递送系统形式,如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可自多种磷脂类如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
应当理解除上文特别提及的成分外,考虑到制剂的类型,所述制剂可包括其他本领域的常规药物,例如适于口服的制剂可包括香味剂。
式(I)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物的治疗有效量取决于许多因素,包括例如所述动物的年龄和体重、需要治疗的精确病症及其严重度、制剂的性质,以及给药途径,并最终取决于主治医师或兽医的考虑。然而用于治疗癌性病症的如本文所述的那些式(I)的化合物或其盐或溶剂合物的有效量通常在每天每千克接受者(哺乳动物)体重0.1至100mg的范围中,且更通常在每天每千克体重1至50mg的范围中。因此,对于70kg的成年哺乳动物,每天的实际量通常为7至3500mg而且此量可以每天单次给药或更通常以每天多次(如两次、三次、四次、五次或六次)亚剂量给药使得总日剂量相同。其盐或溶剂合物的有效量可根据式(I)化合物本身的有效量的比例来确定。可以预计相似的剂量适于治疗上文提及的其它病症。
根据本发明的这些方面所给药的或所开具的化合物的量取决于许多因素,包括例如患者的年龄和体重、需要治疗的精确病症、所述病症的严重度、并发症、肝功能或肾功能、所述制剂的性质和给药途径。最终,该量取决于主治医师的判断。
实施例
以下实施例仅用于说明而非用于以任何方式限制本发明的范围。实施例中引用的每篇参考文献均全部引入作为参考。
实施例1:化合物A的制备
化合物A可根据国际公开WO2010/062578号的公开内容并根据以下所示的方法制备。
化合物A的小规模制备
2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨
基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺
向微波管中加入2-[(2,5-二氯-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(70mg,0.224mmol)、{3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-胺(70mg,0.503mmol)和碳酸铯(230mg,0.706mmol)。将反应混合物经氮气脱气10分钟。同时,加入BINAP(50mg,0.080mmol)和乙酸钯(II)(10mg,0.045mmol)。将反应混合物在微波中在160℃加热40分钟。粗产物在反相HPLC(Gilson)上纯化,经含有0.1%甲酸的CH3CN/H2O洗脱,得到标题化合物(15mg,15%);MS:M(C20H23ClN6O2)=414.89,(M+H)+=415,416;1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm9.42(br.s.,1H)8.71(br.s.,1H)8.02(s,1H)7.54(br.s.,1H)7.06(t,J=7.5Hz,1H)6.48(s,1H)6.32(br.s.,1H)5.86(s,1H)4.47(dt,J=13.4,6.7Hz,1H)3.92(s,3H)2.26(s,3H)1.41-1.43(d,J=6.6Hz,2H)。
化合物A的大规模制备
中间体1
2-[(2,5-二氯-4-吡啶基)氨基]苄腈
将2,5-二氯-4-碘吡啶(100g,365mmol)、2-氨基苄腈(43.1g,365mmol)和三聚磷酸钾(233g,1095mmol)于1,4-二烷(2.5L)中的溶液经N2流脱气。向该溶液添加DPEPhos(15.73g,29.2mmol)和乙酸钯(3.28g,14.60mmol)。在回流下搅拌所述反应混合物18小时。所述溶液经0.5英寸塞力特硅藻土和0.2英寸二氧化硅过滤。蒸发所述溶液。将固体混悬于乙醚中并过滤。蒸发乙醚,并过滤所得到的固体。分离2-[(2,5-二氯-4-吡啶基)氨基]苄腈(80g,288mmol,79%收率),为橙色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm6.49(s,1H)7.50(td,J=7.58,1.01Hz,1H)7.56(d,J=7.58Hz,1H)7.80(td,J=7.83,1.77Hz,1H)7.95(dd,J=7.83,1.52Hz,1H)8.26(s,1H)9.05(brs,1H);HPLC Rt=2.88min,MS(ESI):263.9,265.9[M+H]+。
中间体2
2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]苄腈
将2-[(2,5-二氯-4-吡啶基)氨基]苄腈(110g,396mmol)、3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-胺(55.1g,396mmol)和碳酸铯(387g,1187mmol)于1,4-二烷(2.5L)中的溶液通过N2气流脱气,并加入2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘(BINAP)(19.71g,31.7mmol),然后加入乙酸钯(3.55g,15.83mmol)。在N2下将反应混合物加热至回流过夜。过滤反应混合物并浓缩液体。加入乙酸乙酯(1500mL),然后加入1M HCl(1000mL)。分离各层。乙酸乙酯经1M HCl(总计1000mL,1x)洗涤直至通过HPLC观测不到产物。合并HCl相,并用乙酸乙酯(3x1000mL)反洗,直至HCl层中产物峰相对纯净。然后将HCl层用NaOH(50w/w,然后1M)碱化至pH~4,得到浑浊溶液。加入乙酸乙酯(2000mL)并分离各层。乙酸乙酯经盐水洗涤并蒸发。在中和后(加入乙酸乙酯后)过滤反应混合物得到一些产物。在蒸发过程中分离产物也可通过过滤白色固体(其来自母液)进行。合并所有固体和蒸发后的产物。分离2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]苄腈(80g,207mmol,52.4%收率),为黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.24(d,J=6.57Hz,6H)2.08(s,3H)4.34(五重峰,J=6.57Hz,1H)5.87(s,1H)5.97(s,1H)7.41(td,J=7.58,1.01Hz,1H)7.47(d,J=8.08Hz,1H)7.75(td,J=7.83,1.52Hz,1H)7.90(dd,J=7.83,1.52Hz,1H)7.94(s,1H)8.42(d,J=17.43Hz,2H);HPLCRt=2.36min,MS(ESI):[M+H]+=367.1,368.1。
中间体3
2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]苯甲
酸
将2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]苄腈(80g,218mmol)溶解于1,4-二烷(1.5L)中并加入1M NaOH(1500mL,1500mmol)。回流所述混悬液过夜。在冷却至室温后,加入乙酸乙酯(1L)并分离各层。水层经1L乙酸乙酯洗涤。合并有机层并用0.1M NaOH(1L)反洗直至有机层中观察不到产物。然后将有机层弃除。然后合并的水层经1L乙酸乙酯洗涤。然后用乙酸酸化水层(非常缓慢至pH~7)。过滤出固体并分离2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]苯甲酸(67g,165mmol,76%收率),为黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.28(d,J=6.57Hz,6H)2.11(s,3H)4.41(五重峰,J=6.57Hz,1H)5.96(s,1H)6.83(s,1H)7.09(ddd, J=8.02,5.12,3.03Hz,1H)7.40(1H)7.52-7.61(m,2H)7.91-8.16(m,2H)8.55(s,1H)10.17(brs,1H)13.64(brs,1H);HPLCRt=2.35min,MS(ESI):[M+H]+=386.1。
2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨
基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺
向2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]苯甲酸(67g,174mmol)和1-羟基苯并三唑(29.3g,191mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(700mL)中的溶液中加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(36.6g,191mmol),并搅拌该溶液30分钟。加入O-甲基羟胺盐酸盐(15.95g,191mmol)并再搅拌该溶液15分钟,然后冷却至0℃并逐滴加入二异丙基乙基胺(91mL,521mmol)。在室温搅拌反应混合物过夜。加入水(4000mL)并用乙酸(20mL)酸化该溶液。该溶液经2x2L乙酸乙酯萃取。有机层经水(1L)、盐水洗涤,并经MgSO4干燥、过滤并蒸发。分离2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(74g,164mmol,94%收率,92%纯度),为黄色泡沫。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.27(d,J=6.57Hz,6H)2.10(s,3H)3.71(s,3H)4.39(五重峰,J=6.51Hz,1H)5.93(s,1H)6.66(s,1H)7.08-7.19(m,1H)7.49-7.64(m,3H)7.98(s,1H)8.50(s,1H)9.50(s,1H)11.93(s,1H).;HPLC Rt=2.13min,MS(ESI):[M+H]+=415.1。
实施例1产物的纯化
将2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(173.3g,63.5%w/w,265.2mmol)溶解于乙酸乙酯(3.50L,20体积)中并加热至约50℃。向该溶液中加入Si-thiol(功能化的硅胶)(87g,50%上样)。将混合物在约50℃维持16-20小时。然后滤除Si-thiol硅胶。滤饼经乙酸乙酯(2x200mL)冲洗并合并滤液。然后合并的滤液经pH9.4的1M甲酸铵水溶液(5x1L)洗涤,经水、盐水洗涤,并经硫酸镁干燥。过滤干燥的EtOAC并汽提至干燥,得到黄色泡沫。其在50-55℃干燥约2小时以达到恒重160g。将该物质在二氯甲烷(800mL,5体积)中浆化,加热至回流以得到溶液,并过滤。将溶液冷却至20-25℃。产物在冷却后结晶。约2小时后,通过过滤收集产物并用二氯甲烷冲洗。在50-55℃干燥白色固体14-16小时至恒重。分离2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(85.0g,204.9mmol,77%总收率),为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.27(d,J=6.57Hz,6H)2.10(s,3H)3.70(s,3H)4.39(五重峰,J=6.57Hz,1H)5.92(s,1H)6.66(s,1H)7.02-7.24(m,1H)7.45-7.68(m,3H)7.98(s,1H)8.48(s,1H)9.49(br.s,1H)11.91(s,1H)。C18HPLC RT=6.2分钟(99.0%纯度)。MS(ESI):415.0[M+H]+。
将2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(235.2g总重量,228.0g测定含量,549.5mmol)在乙酸乙酯(7.1L,30体积)中浆化。将混合物加热至约50-55℃以得到浑浊溶液。过滤该浑浊溶液。用15-20分钟向过滤的溶液中加入2.0M HCl的乙醚溶液(210g,281mL,1.02当量)。加入HCl后,观察到白色浆液。在室温搅拌该浆液约16-20小时。通过过滤收集产物并用乙酸乙酯(2x500mL)洗涤。在50-55℃/<5mm Hg干燥湿滤饼16-20小时至恒重。分离2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺单盐酸盐(245.9g,544.7mmol,96%收率),为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.32(d,J=6.57Hz,6H)2.18(s,3H)3.70(s,3H)4.35-4.62(m,1H)6.12(br.s,1H)6.60(br.s,1H)7.19-7.41(m,1H)7.48-7.75(m,3H)8.09(s,1H)9.59-9.99(m,2H)11.98(br.s,1H)。C18HPLC RT=6.1分钟(99.6%纯度)。MS(ESI):414.8[M+H]+。
生物学数据:
实施例2:蛋白质印迹中使用的抗体
使用蛋白质印迹的标准方法并且用于这些研究特异性抗体为:抗-FAK(Millipore#05-537)、抗-pFAK(InVitrogen44-624G)、抗-merlin(Santa Cruz#28247)、抗-merlin同工型1(Santa Cruz#332)。结果如图1所示。
实施例3:人细胞系
在这些研究中使用可从ATCC得到的5种人间皮瘤细胞系和两种另外的人肺癌细胞系。细胞在含有10%FBS、1%L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠的RPMI1640培养基中在标准细胞培养条件下生长。间皮瘤细胞系:NCI-H2052、MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H226、NCI-H2452,和另外的肺癌细胞系:A549和SW-1573。另外的三种间皮瘤细胞系,Mero-41、Mero-82和Mero-14,在相同的条件下生长。
实施例4:不依赖于贴壁的生长-死亡试验
在不依赖于贴壁的细胞生长试验中评估对化合物A的细胞响应,该试验定量了细胞生长抑制的程度和细胞种群的净变化。该试验在黑色、透明底、未经处理的384孔板(Greiner#781096)中进行。使用非组织培养物处理的平板或低粘附平板以防止在试验过程中细胞粘附到平板上是重要的。简而言之,该试验如下所述进行。
通过将5g无菌甲基纤维素(Sigma#M0512)溶解于495mL细胞培养基中制备甲基纤维素溶液的1%(重量/体积)储备液。将甲基纤维素溶液放置于玻璃容器中并高压灭菌器灭菌。将含有10%FBS、1%L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠的RPMI1640培养基加入至冷却的甲基纤维素中。如果细胞生长需要不同的细胞培养基,则可替换培养基。在4℃强力搅拌维持灭菌条件下,所述溶解通常需要耗费1天。
以0.65%甲基纤维素(终浓度)和终体积48μL中每孔1000个细胞的试验条件将细胞涂覆于384孔平板。这通过稀释从培养物获得的细胞并重悬于含有1%甲基纤维素的生长培养基(稀释至2.0833x104个细胞/mL)来实现。通过反转将细胞混合以均匀分布,消散气泡并使用正压分注滴管(positivedisplacement pipette)放置48μL至孔中。将所述平板放置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中。
在384孔平板中完成于DMSO中的系列稀释,开始于第一栏中的20μL化合物储备液和其它孔中的10μL DMSO。从化合物孔中转移10μL至含DMSO的孔中,混合,并横穿平板转移10μL继续系列稀释。然后将4μL该DMSO稀释的化合物加入新的含有105μL适当生长培养基的384孔平板的孔中。该“化合物平板”用于向在甲基纤维素中含有细胞的试验平板给药。
将从“化合物平板”各孔得到的2μL加入至“试验平板”的各个孔中(各孔含有48μL于甲基纤维素中的细胞)以开始试验。将这些试验平板放置于细胞培养箱中持续6天。随机选择一个平板并用Cell TiterGlo(CTG)在化合物加入时显色以表示时间等于零(T0)的平板,即表示化合物加入时的细胞数目。
在第6天,通过显色所述平板,在各平板的底部放置黑色贴纸以阻断光线,加入25μL CTG,并在室温温育所述平板20分钟来停止试验。使用发光方案(luminescence protocol)在EnVision(Perkin-Elmer)上扫描所述平板。
结果以T0值的百分数表示并对化合物浓度作图。所有值均进行“无细胞”背景扣除,将T0值标准化至100%,并表示在化合物加入时细胞的数目。使用4参数曲线拟合方程通过拟合浓度响应曲线确定细胞响应并确定抑制50%生长的浓度(gIC50)。gIC50值是生长窗的中点(在T0和DMSO对照生长之间)。通过Ymin-T0值定量测量种群中的净变化,其通过从浓度响应曲线拟合测得的Ymin值(%)减去T0值(100%)来确定。
实施例6:NF2肿瘤抑制基因(NF2基因的同工型1蛋白质基因产物,也称为神经纤维瘤蛋白-2同工型1蛋白质,也称为merlin同工型1蛋白质)的表达
通过全细胞裂解物的蛋白质印迹法来评估间皮瘤细胞系中NF2基因的肿瘤抑制同工型的表达。NF2基因生成两种主要的基因产物,由595个氨基酸组成的merlin同工型1蛋白质和由590个氨基酸组成的merlin同工型2蛋白质。使用检测同工型1和2两者的抗体,在所分析的7个细胞中的4个中检测到预期分子量的两条显著条带,恰好低于75千道尔顿(KD)(图1A)。三种细胞系NCI-H226、NCI-H2052和SW1573缺少双条带(doublet)的上条带,表明较长(较低迁移率)的同工型1未被表达。特异性检测merlin同工型1的抗体确认了该观察结果(图1B)。其它细胞系的分析结果如表3中所示。
实施例7:免疫组织化学
通过免疫组织化学(IHC)评估4种间皮瘤细胞系和1种肺细胞系,如图3所示。Merlin同工型1的IHC染色图谱与蛋白质印迹法中看到的图谱相同(见图1的蛋白质印迹)。三种细胞系(NCI-H226、NCI-H2052和SW-1573)的merlin同工型1染色为阴性(左图),而三种细胞系(NCI-H28、NCI-2452和MSTO-211H)的merlin同工型1染色为阳性(右图)。
实施例8:细胞系中含有NF2基因的基因组DNA的评估和NF2基因的同工型1的mRNA表达的评估
通过测序从所述细胞系得到的基因组DNA(gDNA)和mRNA(cDNA)提供NF2基因状态的另外确认。基因的表达形式(cDNA)的测序结果与表1中所示的gDNA一致。此外,测序表达的mRNA允许独立确认同工型1和同工型2状态。从测序cDNA和gDNA二者得到的结果与蛋白质印迹和IHC分析得到的结果一致。这些不同的分析方法造成相同的关于merlin状态的细胞系分类。
表1
NF2基因和表达的RNA产物的序列分析。5种人间皮瘤和2种人肺细胞系用于NF2基因产物的同工型1和同工型2的mRNA(cDNA)和NF2基因的基因组DNA(gDNA)的序列分析。
细胞系 | cDNA(同工型1和2) | gDNA |
A549 | 均为同工型,无变化 | 全覆盖,无变化 |
NCI-H28 | 均为同工型,无变化 | 全覆盖,无变化 |
*NCI-H226 | 均未扩增 | 丢失外显子1 |
*NCI-2052 | 两者,Arg341Stp | 全覆盖,Arg341Stp |
NCI-H2452 | 均为同工型,无变化 | 全覆盖,无变化 |
MSTO-211H | 均为同工型,无变化 | 全覆盖,无变化 |
*SW-1573 | 均未扩增 | 丢失外显子1-4 |
实施例9:NF2突变体和NF2野生型细胞中FAK和pFAK水平的比较
为进一步研究merlin同工型1表达、FAK表达、FAK磷酸化状态和对FAK抑制响应之间的关系,选择两种细胞系用于评估。选择NCI-H2052作为NF2突变体细胞系(其缺少merlin同工型1蛋白质的表达)和MSTO-211H作为NF2野生型细胞系(其显示merlin同工型1蛋白质的表达)。FAK和pFAK(Y397)表达的水平使用从在甲基纤维素不依赖于贴壁的条件下生长的细胞获得的全细胞裂解物通过蛋白质印迹来表征,如图2所示。蛋白质印迹表明与NF2野生型细胞系相比,NF2突变体细胞系中总FAK蛋白质的水平略高(图2A)。更显著地,与MSTO-211H NF2野生型细胞系相比,NCI-H2052NF2突变体细胞系中pFAK水平大大升高(图2B)。将相同量的蛋白质上样至样品凝胶(所述量通过蛋白质浓度确定)上。使用抗-肌动蛋白抗体在蛋白质印迹上检测到的肌动蛋白(未显示)的量证实与转移至印迹膜上的量相等。因此,尽管在具有突变体NF2的间皮瘤细胞系中观察到总FAK蛋白质水平的小幅增加,但是NF2突变体细胞系中磷酸化的并且假定活化的FAK的水平大幅增加。
实施例10:通过FAK抑制剂化合物A抑制细胞生长的评估
在不依赖于贴壁的甲基纤维素试验中生长的2种间皮瘤细胞系中评估FAK抑制剂化合物A的生长抑制活性(表2),并进一步重新测试这2种细胞系及另外4种细胞系(表3)。
在首次不依赖于贴壁的试验中,尽管两种细胞系具有生长抑制响应(其由gIC50值定量),但两种细胞系的敏感性之间存在很大的差异(表2)。与NF2野生型(其表达NF2的同工型1蛋白质并被称为merlin阳性)MSTO-211H细胞相比,NF2突变体(即,其不表达由NF2基因得到的同工型1蛋白质并因此被称为merlin阴性)NCI-H2052间皮瘤细胞系对1/19浓度的化合物响应以诱导50%生长抑制。此外,在6天试验期间,即使存在最高浓度(~30μM)的化合物A,NF2野生型MSTO-211H细胞也显示细胞种群的增加。这可从Ymin-T0值为343%观察到,自试验起始时的100%增加。相反,与起始时相比,NF2突变体细胞系(NCI-H2052)在试验结束时具有相同数量的细胞,Ymin-T0值基本上为0(-3%)。细胞数目无变化表明化合物A能够完全阻断NF2突变体细胞系在试验过程中的细胞生长和增殖。
表2
生长抑制 | 净种群变化 | |
细胞系 | gIC50(nM) | Ymin-T0(%) |
MSTO-211H | 3588 | 343 |
NCI-H2052 | 186 | -3 |
在第二次不依赖于贴壁的试验中,通过蛋白质印迹测定NF2的同工型1蛋白质基因产物(即merlin同工型1蛋白质,或简称merlin蛋白质)。所有5种merlin阴性细胞系具有有效的生长抑制(gIC50值<250nM)而merlin阳性细胞系需要~10μM化合物达到50%生长抑制。在试验过程中,merlin阴性细胞系中细胞种群并未增加,而且一些细胞系表明净细胞减少(net cell kill)(负的Ymin-T0值)。[注:Ymin-T0值为0%表明在试验过程中细胞数目无变化]。如正的Ymin-T0值所示,merlin阳性MSTO-211H细胞系在化合物A的存在下具有细胞种群净增加。这些结果如表3所示。
表3
merlin状态 | 细胞系 | 生长抑制 | 净种群变化 |
gIC50(nM) | Ymin-T0(%) | ||
阴性 | Mero-41 | 54 | -54 |
阴性 | Mero-82 | 59 | -22 |
阴性 | Mero-14 | 63 | -55 |
阴性 | NCI-H226 | 196 | -18 |
阴性 | NCI-H2052 | 236 | 7 |
阳性 | MSTO-211H | 10859 | 367 |
实施例11:临床研究设计
设计一项多部分I期研究以测定在患有晚期实体瘤的患者中化合物A的最大耐受剂量(MTD)、安全性、耐受性、药动学(PK)、药效学(PD)和抗肿瘤活性。研究的部分1使用剂量递增方法确认MTD,并在本文中有所描述。部分2-3正在进行中。部分2进一步探索化合物A在MTD或在MTD之下的安全性和耐受性,而部分3评估化合物A在MTD和在MTD之下的剂量的药效学。部分4对在本概括说明时增加的患者尚未开放,并将探索在患有复发性多形性胶质母细胞瘤的患者中化合物A的安全性、耐受性、药动学和临床活性。部分5对在本概括说明时增加的患者尚未开放,并将探索给药数周化合物A的药动学。患有间皮瘤的患者有资格参与,例如研究的部分1。在采集到以下数据时,患有间皮瘤的患者有资格参与研究的部分1-3。
纳入/排除标准:合格患者:≥18岁,患有对可接受的标准疗法无响应或无标准或治愈性疗法的经组织学或细胞学确认诊断为恶性实体瘤的晚期实体瘤。所有患者提供签字的知情同意书。需要患者具有吞咽和保留口服给药的能力,对于男性和有分娩可能的女性应遵循方案确定的节育措施,显示适当的器官系统功能,和提供如方案中确定的存档的肿瘤样品。在研究的部分2-3中,纳入文献中报道患有过度表达FAK并对可接受的标准疗法无响应或无标准或治愈性疗法的肿瘤的患者。还要求部分3中的受治疗者具有可经得起活检的实体肿瘤。
排除患者:在28天内或距离在先治疗5个半衰期(最小10天持续时间)服用过研究的抗癌药物或在最近3周(对于在先的丝裂霉素C或硝基脲(nitrosureas)是6周)内接受化学治疗或在最近4周内进行过任何大手术、放疗或免疫治疗。患有干扰药物的药动学的活性胃肠道疾病或此前切除小肠的患者不能入选。其它排除标准包括先前抗癌疗法未解决的毒性>1级(脱发除外),男性QTcF间期>450毫秒(女性470)或先天性长QT综合征、急性冠脉综合症病史、纽约心脏协会所定义的II-IV类心衰、具有症状或未治疗的脑转移、原发性中枢神经系统恶性肿瘤(在部分1-3中)、哺乳期妇女(nursing females)、食用方案中限定的食物或禁止的药物,或任何严重的和/或不稳定的先前存在的医学、精神病症或其它妨害受治疗者安全或获得知情同意书的情况。
安全性和有效性的评价:评估安全性的规范包括体重、心率、血压、体温、临床实验室检查、12导联ECG以及神经系统和身体的评估。研究过程中的不良事件使用CTCAE v4.0(Common Terminology Criteria for AdverseEvents(CTCAE)Version4.0,US Department of Health and Human Services,National Institutes of Health,National Cancer Institute,May2009)评价。
在筛选和给药起始后每6周进行疾病评价。根据RECIST Version1.1将响应记录为完全响应(CR)、部分响应(PR)、疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。
实施例12:纳入临床试验的患者活检中merlin状态的免疫组织化学测定:
为测定目前I期试验中间皮瘤群体中merlin丢失能否预测对化合物A的响应,通过免疫组织化学(IHC)评价在筛选时采集的存档组织(FFPE)中的merlin水平,并将结果与中值无进展生存期(PFS)的临床终点相关联。
Mosaic laboratories,Inc研发出一种自定义IHC分析(custom IHC assay),其采用兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc,catalog#SC332)使用1:1600的稀释液。通过Envision+兔HRP(DAKO)检测试剂盒评估抗体信号,并且染色强度(0-3+级)用于分类所测试临床样品的merlin状态(merlin阳性=野生型或merlin阴性=merlin丢失)。
使用包含显示不同merlin表达的6种细胞系(从ATCC获得的SW1573、NCI-2052、NCI-H226、NCI-H28、NCI-2452和MSTO-211H)的间皮瘤细胞系验证图谱(validation panel)获得呼叫阈值(the threshold for the call),固定H-评分(10或>2+级染色=merlin阳性和<10或2+级=merlin阴性)。确证信号的亚细胞定位(即细胞核、细胞浆和细胞膜)但不用于测定阈值。在该分析的技术验证过程中通过准确度和精确度研究(其解决该分析的日间和日内的变异性)进一步优化所述呼叫阈值。用于分析验证的相同细胞系中存在或不存在merlin通过蛋白质印迹以及cDNA和基因组DNA的Sanger测序独立确认。
所测试的细胞系中merlin的丢失取决于3个观测:对于NCI-H226,编码起始密码子的外显子1丢失;对于SW-1573,外显子1-4丢失;和对于NCI-2052,外显子11中终止密码子(Arg341)存在。关于临床相关性,采用自定义的GSK NF2-1IHC分析测试29个可用间皮瘤样品中的24个的merlin并将merlin状态与中值PFS相关联(请参见有效性分析)。所获得的结果表明在患有复发性间皮瘤的患者中,merlin可作为化合物A临床活性的潜在预测生物标记物。
统计分析:
描述性统计学用于人口学分析、临床实验室分析以及疾病特征分析。使用Kaplan-Meier方法测定无进展生存期,其是本领域所公知的并在Kaplan EL和Meier P,1958,Non-parametric estimation from Incomplete Observations JASA53:457-481,和Lee ET,Statistical Methods for Survival Data Analysis,2ndedition,John Wiley and Sons,New York,1992中有所描述,上述每篇文献均全部引入作为参考。
结果:
表4提供了所有患者和间皮瘤患者群体的人口统计特征。
表4.人口统计特征
所有患者 | 间皮瘤患者 | |
项目 | 数目(%) | 数目(%) |
患者数目 | 62(100) | 29(100) |
中值年龄(范围) | 61(21–84) | 64(47-84) |
性别 | ||
女性 | 23(37) | 6(21) |
男性 | 39(63) | 23(79) |
种族 | ||
西班牙人/拉丁美洲人 | 3(5) | 3(10) |
非西班牙人/非拉丁美洲人 | 59(95) | 26(90) |
Merlin状态的评估:根据从患者获得的活检样品的IHC(如实施例12所述)测量结果,29名间皮瘤患者中,14名为merlin阴性,9名为merlin阳性,6名未知。
有效性分析:在患有间皮瘤的患者中,26名在开始治疗后进行放射学评价。3名患者在放射学评价前从研究中排除。作为对治疗的最佳响应,14名患者具有SD,3名患者具有非CR/非PD,以及9名患者具有PD。在最佳响应时,肿瘤负荷从基线的百分比变化如图6所示。该图中仅包括在基线具有可测量疾病并且进行基线后扫描的患者。尽管无患者经历PR或CR,但在一些患有间皮瘤的患者中看到小的响应(例如,肿瘤缩小,但未达到PR所需的水平)。总中值无进展生存期(PFS)为17.7周(95%CI9.7,24.1)。在merlin阴性和阳性受治疗者中,中值PFS分别为24.1(n=14;95%CI6.0,29.3)和11.4(n=9;95%CI7.3,未确定)(图4)。各患者的治疗持续时间如图5所示,比较merlin阴性和merlin阳性患者。相比于9名merlin阳性患者中的3名,14名merlin阴性患者中的7名仍在研究中,持续大于4个月。所接受的剂量如该图左侧栏所示。
尽管本发明的优选实施方案由上述举例说明,但应当理解本发明不限于本文公开的精确的说明,并保留在权利要求范围内进行的所有改进的权利。
参考文献:
1.McLean,G.W.,et al.,The role of focal-adhesion kinase in cancer-a newtherapeutic opportunity.Nat Rev Cancer,2005.5(7):p.505-15.
2.Mitra,S.K.,D.A.Hanson,and D.D.Schlaepfer,Focal adhesion kinase:incommand and control of cell motility.Nat Rev Mol Cell Biol,2005.6(1):p.56-68.
3.Zhao,J.and J.L.Guan,Signal transduction by focal adhesion kinase incancer.Cancer Metastasis Rev,2009.
4.Guan,J.L.,J.E.Trevithick,and R.O.Hynes,Fibronectin/integrininteraction induces tyrosine phosphorylation of a120-kDa protein.CellRegul,1991.2(11):p.951-64.
5.Kornberg,L.J.,et al.,Signal transduction by integrins:increased proteintyrosine phosphorylation caused by clustering of beta1integrins.Proc NatlAcad Sci U S A,1991.88(19):p.8392-6.
6.Kanner,S.B.,et al.,Monoclonal antibodies to individualtyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-encoded tyrosinekinases.Proc Natl Acad Sci U S A,1990.87(9):p.3328-32.
7.Schaller,M.D.,et al.,pp125FAK a structurally distinctive protein-tyrosinekinase associated with focal adhesions.Proc Natl Acad Sci U S A,1992.89(11):p.5192-6.
8.Schultze,A.and W.Fiedler,Therapeutic potential and limitations of newFAK inhibitors in the treatment of cancer.Expert Opin Investig Drugs,2010.19(6):p.777-88.
9.Schwock,J.,N.Dhani,and D.W.Hedley,Targeting focal adhesion kinasesignaling in tumor growth and metastasis.Expert Opin Ther Targets,2010.14(1):p.77-94.
10.Evans,D.G.,Neurofibromatosis type2(NF2):a clinical and molecularreview.Orphanet J Rare Dis,2009.4:p.16.
11.Yi,C.,et al.,A tight junction-associated Merlin-angiomotin complexmediates Merlin's regulation of mitogenic signaling and tumor suppressivefunctions.Cancer Cell,2011.19(4):p.527-40.
12.Houshmandi,S.S.,et al.,The neurofibromatosis2protein,merlin,regulatesglial cell growth in an ErbB2-and Src-dependent manner.Mol Cell Biol,2009.29(6):p.1472-86.
13.Stamenkovic,I.and Q.Yu,Merlin,a"magic"linker between extracellularcues and intracellular signaling pathways that regulate cell motility,proliferation,and survival.Curr Protein Pept Sci,2010.11(6):p.471-84.
14.Schneider,M.D.,Development.A cardiac nonproliferation treaty.Science,2011.332(6028):p.426-7.
15.Robinson,B.W.and R.A.Lake,Advances in malignant mesothelioma.NEngl J Med,2005.353(15):p.1591-603.
16.Poulikakos,P.I.,et al.,Re-expression of the tumor suppressor NF2/merlininhibits invasiveness in mesothelioma cells and negatively regulates FAK.Oncogene,2006.25(44):p.5960-8.
Claims (16)
1.在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2(NF2)基因的基因产物,并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物,则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法,其还包括检测磷酸化的FAK(p-FAK)。
3.权利要求1或2的方法,其还包括如果NF2基因的同工型1基因产物存在,则检测NF2的同工型1基因产物的功能的缺失。
4.权利要求3的方法,其还包括如果可检测量的NF2基因的同工型1基因产物存在且检测到NF2基因的同工型1基因产物的功能缺失,则向所述人给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中使用免疫组织化学(IHC)测定存在或不存在NF2基因的基因产物或同工型1基因产物。
6.权利要求5的方法,其中IHC包括使用结合NF2基因的同工型1基因产物但不结合NF2基因的其它同工型基因产物的抗体。
7.权利要求1-6任一项的方法,其中所述使用FAK抑制剂的治疗导致无进展生存(PFS)时间增加。
8.权利要求7的方法,其中所述PFS时间的增加是有临床意义的。
9.权利要求7或8的方法,其中所述PFS时间的增加是统计学显著的。
10.权利要求1-10任一项的方法,其中所述样品包含一个或多个肿瘤细胞。
11.权利要求1-11任一项的方法,其中所述NF2基因的基因产物为蛋白质或其功能性片段。
12.在有需要的人中治疗癌症的方法,其包括括测定所述人的肿瘤样品中存在或不存在可检测量的merlin或其功能性片段,并且如果未检测到merlin或其功能性片段,则向所述人给药有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
13.在有需要的人中治疗merlin阴性癌症的方法,其包括向所述人给药治疗有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。
14.权利要求1-13任一项的方法,其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
15.权利要求1-14任一项的方法,其中所述癌症选自神经鞘瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、皮肤癌、胃癌、骨癌、肾癌、乳腺癌和肠癌。
16.权利要求17的方法,其中所述癌症为间皮瘤。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010062578A1 (en) * | 2008-10-27 | 2010-06-03 | Glaxosmithkline Llc | Pyrazolylaminopyridines as inhibitors of fak |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010062578A1 (en) * | 2008-10-27 | 2010-06-03 | Glaxosmithkline Llc | Pyrazolylaminopyridines as inhibitors of fak |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115298541A (zh) * | 2020-03-20 | 2022-11-04 | 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 | 检测聚山梨醇酯的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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