附图简述
结合以下与附图结合获得的详细描述,可更全面地理解本发明,其中:
图1.GC-ADC模型对西妥昔单抗起反应:图A(图1A):通过西妥昔单抗产生的反应者(上面3个模型)和非反应者(下面三排8个模型)的代表性肿瘤生长抑制。图B(图1B):模型GA0022的药效分析。在0、6、24和72小时时间点西妥昔单抗治疗后模型GA0022肿瘤的pERK-IHC分析。显示了IHC图像和评分。图C(图1C):通过肿瘤对西妥昔单抗(DT/DC)的反应分选PDX-GC模型。右边部分的反应者展示较高的EGFRmRNA水平和IHC染色强度,和仅有的两例(GA0075和GA0152,CN>5)基因扩增。
图2.抗肿瘤活性与EGFR基因扩增和过表达的相关性。(加框的项表示具有EGFR基因扩增的模型)。图A(图2A):GC-ADC肿瘤肿瘤对西妥昔单抗反应的瀑布图;图B(图2B):使用AffymetrixSNP6芯片分析进行的GC模型的EGFR基因拷贝数分析。图C(图2C):如AffymetixGeneChipHG-U219测量的相对mRNA水平。D如通过pPCR测量的EGFRmRNA表达。
图3.将LobodaRAS途径标签评分对比随时间推移的肿瘤尺寸绘图。发现LobodaRAS途径标签评分与肿瘤反应几乎没有相关性。
图4.具有EGFR过表达/基因扩增的GC-ADC模型不具有HER2过表达/基因扩增。图A:EGFR和HER2表达水平;图B:EGFR和HER2基因拷贝数。
图5.反应者和非反应者的代表性图像。反应者GA0152和GA0075展示IHC评分3+,和基因扩增(GA0075,CN=5.8;GA0152,CN>15),然而非反应者GA0119和GA0139具有IHC低表达并且无基因扩增。左边:反应者和非反应者的代表性肿瘤生长曲线。中间:肿瘤模型的IHC分析;右边:胃癌的双色FISH测定。
发明详述
本发明总体上涉及用于利用抗EGFR试剂治疗胃肿瘤,具体地治疗先前已被确定具有特定EGFR生物标志物的患者的方法。本发明允许通过向患者施用治疗剂即抗EGFR抗体来治疗对所述治疗较大可能起反应的患者,所述患者经发现具有扩增的编码EGFR蛋白的基因或EGFR过表达(如通过mRNA表达、蛋白质表达或活性水平测量的。本发明部分基于如下发现:EGFR基因扩增(例如如通过荧光原位杂交(FISH),通过微阵列分析,或通过本领域中已知的其它方法检测的)或EGFR过表达提供了选择用于治疗的患者的基础,因为EGFR基因扩增或EGFR过表达使反应与治疗关联。
在一个方面,本发明提供用于确定患者是否适合于抗EGFR治疗的方法,其包括检测患者的样本中EGFR生物标志物的存在或不存在,其中EGFR生物标志物的存在指示患者适合于抗EGFR治疗。
所述药物可以是针对表皮生长因子受体(EGFR)的任何药物。如本文中所用,针对EGFR的药物是指可改变EGFR的活性的组合物,诸如可增加、减小、消除、增强、延迟、减弱或阻断EGFR的活性的组合物。在一些实施方案中,所述组合物在转录水平、翻译水平、翻译后水平和/或蛋白质水平上针对EGFR。所述组合物可特异性靶向EGFR或靶向至少EGFR。在一些实施方案中,所述组合物可引起EGFR的基因抑制和/或基因沉默,例如敲低或敲除EGFR。在一些实施方案中,所述组合物可改变EGFR蛋白活性,诸如改变EGFR与其配体的结合活性和/或其诱导下游信号转导途径的能力。在一些实施方案中,所述药物是EGFR的配体的拮抗剂或抗体,例如,表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、HB-EGF、双调蛋白、β-细胞素、epigen和/或表皮调节素的拮抗剂或抗体。在一些实施方案中,所述药物可靶向EGFR和/或配体并且阻断配体-受体结合。在一些实施方案中,所述药物可引起受体和/或配体的构象变化以及减弱或灭活EGFR介导的细胞信号转导。
在一些实施方案中,所述药物针对由EGFR与ErbB受体家族的另一个成员形成的异二聚体诸如EfbB2/Her2/neu,或由两个EGFR分子形成的同二聚体。
在一些实施方案中,所述药物针对EGFR的信号转导途径下游。如本文中所用,术语“针对EGFR的信号转导途径下游的药物”是指包含可改变EGFR的信号转导途径下游诸如EGFR的一个或多个下游靶标的活性的试剂的组合物。EGFR信号转导途径在Sechacharyulu等人(TargetingtheEGFRsignalingpathwayincancertherapy,ExpertOpinTherTargets,2012年1月;16(1):15-31.),Oda等人(Acomprehensivepathwaymapofepidermalgrowthfactorreceptorsignaling,MolecularSystemsBiology1:2005.0010)中以及发育EGFR信号转导途径在(PathwayMaps,ThomsonReuters,2012)中进行了描述,所述每一篇文献出于所有目的整体并入本文。
在一些实施方案中,所述药物包括小分子。如本文中所用,术语“小分子”是指具有小于500MW的分子量的分子,其中所述药物是非肽基或肽试剂。在一些实施方案中,所述药物包括蛋白质或多肽。在一些实施方案中,所述药物包括杂交分子。在一些实施方案中,所述药物为抗体。在一些实施方案中,所述药物为抗EGFR抗体。在一些实施方案中,所述药物为抗EGFR配体抗体。在一些实施方案中,所述药物为人源化抗EGFR配体抗体。在一些实施方案中,所述抗体为单克隆抗体。
在一些实施方案中,所述药物为抗EGFR抗体。在一些实施方案中,所述药物为西妥昔单抗或其功能性变体或衍生物。抗EGFR抗体的非限制性实例已在PCT公开号WO/2011/140151、WO/2007/058823、WO/2011/080209、WO/2010/080463、WO/2012/020059、WO/2011/080209、WO/2011/059762、WO/2011/152525、WO/2011/140254、WO/2010/034441、WO/2011/156617、WO/2005/090407、WO/2013/006547、WO/2008/140493、WO/2011/156617、美国专利号5942602、6129915、7723484、7618631、7598350和美国专利申请公开号20100166755、20080274114、20130142812、20110158987、20120107234、20110117110、20110287002、20120149879、20120282633、20100009390、20050238640、20060154334、20120231021和20130149299中进行了描述,所述每个申请、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入。
如本文中所用,术语″表皮生长因子受体″(″EGFR″)是指编码结合表皮生长因子(EGF)并从而被其激活的膜多肽的基因。EGFR在文献中也被称为ERBB、ERBB1和HER1。示例性EGFR是人表皮生长因子受体(参见Ullrich等人(1984)Nature309:418-425;Genbank登录号NP-005219.2;完整编码序列AY588246.1)。EGF配体的结合激活EGFR(例如导致细胞内促有丝分裂信号转导的活化,EGFR的自磷酸化)。本领域普通技术人员将理解,除了EGF以外,其它配体也可结合于EGFR并使其激活。此类配体的实例包括,但不限于,双调蛋白、表皮调节素、TGF-α、β-细胞素和发夹结合EGF(HB-EGF)。人EGFR的细胞内结构域包含包含从邻近跨膜结构域的氨基酸直至EGFR的COOH-末端的多肽序列。细胞内结构域,除其它以外,包含酪氨酸激酶结构域。
如本文中所用,″EGFR基因″是指编码EGFR基因产物的核酸,所述EGFR基因产物例如,EGFRmRNA、EGFR多肽等。
如本文中所用,″抗EGFR试剂″是指能够直接或间接结合于EGFR并且抑制EGFR的激活,或调节EGFR的信号转导途径下游的活性的任何试剂。抗EGFR试剂包括结合于EGFR并且抑制EGFR的激活的抗体,以及抑制EGFR激活的小分子酪氨酸激酶抑制剂或″激酶抑制剂″。针对EGFR的抗体包括IgG;IgM;IgA;保留EGFR结合能力的抗体片段,例如,Fv、Fab、F(ab)2、单链抗体等;嵌合抗体等。EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂包括EGFR-选择性酪氨酸激酶抑制剂。EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂可具有在约50Da至约10,000Da的范围内的分子量。
根据本发明,“抗EGFR试剂”或″EGFR抑制剂″可以是抑制(阻断、降低、拮抗、减少、逆转)表皮生长因子受体(EGFR),包括任何EGFR的表达和/或生物活性的任何试剂。因此,抗EGFR试剂可包括,但不限于药品/化合物/肽设计或选择、抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、核酸(包括核酶、反义核酸、RNAi和适体)或抑制EGFR的表达和/或生物活性的任何其它试剂。例如,已知的EGFR的抑制剂包括药物吉非替尼(ZD1839,AstraZeneca,UK)和埃罗替尼(OSI774,Genentech,USA)以及单克隆抗体、西妥昔单抗(Imclone,Bristol-MyersSquibb)。然而,本发明不限于这些特定的试剂,并且可包括此类试剂或具有与这些试剂大体上相似的生物活性的试剂的激动剂。蛋白质诸如EGFR的生物活性或生物作用是指通过如在体内(即,在所述蛋白质的天然生理环境中)或体外(即,在实验室条件下)测量的或观察到的由所述蛋白质的天然存在的形式展示或表现的任何功能。EGFR的生物活性包括,但不限于,与EGF的结合、受体同或异二聚化、酪氨酸激酶活性和与细胞自动调节和发育相关的下游活性。
酪氨酸激酶抑制剂代表靶向细胞诸如肿瘤细胞中的受体和/或非受体酪氨酸激酶的一类治疗剂或药物。在某些情况下,酪氨酸激酶抑制剂是靶向疗法的基于抗体(例如,抗酪氨酸激酶单克隆抗体等)或基于多核苷酸(例如,酪氨酸激酶反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸,等)形式。优选地,酪氨酸激酶抑制剂是通过结合酶的ATP结合位点抑制靶酪氨酸激酶的小分子。小分子酪氨酸激酶抑制剂的实例包括,但不限于,吉非替尼舒尼替尼(SU11248)、埃罗替尼(OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016;GW2016)、卡奈替尼(CI1033)、塞玛替尼(semaxinib)(SU5416)、伐他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY43-9006)、伊马替尼(ST1571)、达沙替尼(BMS-354825)、来氟米特(SU10)、凡德他尼(ZD6474)、其药学上可接受的盐、其衍生物、其类似物及其组合。适合用于本发明的酪氨酸激酶抑制剂的另外实例包括喹唑啉(例如,PD153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉等)、吡啶并嘧啶、嘧啶并嘧啶、吡咯并嘧啶(例如,CGP59326、CGP60261、CGP62706等)、吡唑并嘧啶、4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶、姜黄素(二阿魏酰基甲烷)、4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺、含硝基噻吩部分的tyrphostines、喹喔啉(参见例如,美国专利号5,804,396)、tryphostins(参见,例如,美国专利号5,804,396)、PD0183805、PKI-166、EKB-569、IMC-1C11,(LY900003;ISIS3521),和PCT公开号WO99/09016、WO98/43960、WO97/38983、WO99/06378、WO99/06396、WO96/30347、WO96/33978、WO96/33979和WO96/33980中描述的酪氨酸激酶抑制剂。
示例性抗EGFR试剂为抗EGFR抗体,包括但不限于抗EGFR抗体:西妥昔单抗(ERBITUXTM)、帕尼单抗(VECTIBIXTM)、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、抗体806、Sym004和MM-151(以它们的鼠形式、嵌合形式或人源化形式存在的),包括它们的免疫有效片段(Fab、Fv)和免疫缀合物,尤其是免疫细胞因子。对于EGFR细胞外结构域是特异的其它抗体(或其它结合分子)在本领域中是已知的并且被设想用于本文中(参见,例如,美国专利号5,459,061、5,558,864、5,891,996、6,217,866、6,235,883、6,699,473和7,060,808;欧洲专利号EP0359282和EP0667165)。
如本文中所用,术语″肿瘤样本″意指包含获自癌症患者的肿瘤材料的样本。该术语包括临床样本,例如通过手术切除获得的组织和通过活检(诸如例如髓芯活检或细针活检)获得的组织。术语还涵盖包括获自除原发肿瘤外的部位的肿瘤细胞例如循环肿瘤细胞的样本。术语涵盖为患者的肿瘤细胞的后代的细胞,例如,来源于原发肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的细胞培养物样本。该术语涵盖可包括在体内从肿瘤细胞脱落的蛋白质或核酸材料的样本,例如骨髓、血液、血浆、血清等。该术语还涵盖针对肿瘤细胞富集的或另外地在它们获得后处理的样本以及包括从患者的肿瘤材料获得的多核苷酸和/或多肽的样本。
如本文中所用,术语“标志物”或“生物标志物”涵盖广泛的细胞内和细胞外事件以及整个生物体的生理变化。标志物可基本代表细胞功能的任何方面,例如,但不限于,信号转导分子、转录因子、代谢产物、基因转录物的产生水平或速率,以及蛋白质的翻译后修饰。标志物可包括转录物水平、速率和/或稳定性的部分和/或全基因组分析,以及蛋白质水平、活性和/或修饰的部分和/或全蛋白质组分析。标签可以指相较于临床上正常受试者待治疗的受试者中被上调或下调的基因或基因产物。标签还可指相较于未治疗受试者被治疗的患有疾病的受试者中被上调或下调的基因或基因产物。即,基因或基因产物对于其可用于(任选地与其它基因或基因产物一起)的被处理的细胞是充分特异,以鉴定、预测或检测小分子的功效。因此,在一些实施方案中,标签是具有化合物在患病细胞中的功效或该患病细胞对利用化合物的治疗的反应的特征的基因或基因产物。
如本文中所用,“EGFR生物标志物”是指EGFR基因扩增和/或EGFR的过表达。EGFR的过表达可涉及如通过转录物丰度、转录物稳定性、转录速率、翻译速率、翻译后修饰、蛋白质丰度、蛋白质稳定性和/或蛋白质酶促活性、mRNA、蛋白质和/或蛋白质活性等测量的过表达。如本文中所用,术语“基因活性”是指基因表达水平、RNA活性水平或蛋白质活性水平。如本文中所用,术语“RNA活性水平”是指mRNA丰度、合成速率和/或稳定性等。如本文中所用,术语“蛋白质活性水平”是指蛋白质丰度、合成速率、稳定性、酶促活性、磷酸化速率等。
在一些实施方案中,关于生物标志物的信息获自一个或多个测试。测试可由受试者自身,由医生,由护士,由测试实验室,由保健提供者或能够进行所述测试的任何其它方来进行。随后可由相同方或由第二方,诸如受试者自身、医生、护士、测试实验室、保健提供者、内科医生、临床试验人员、医院、实验室、研究所或能够分析测试以确定受试者是否对药物起反应的任何其他方来分析含有生物标志物信息的测试结果。
在某些实施方案中,可建立EGFR基因拷贝数或EGFR的过表达的阈值水平,以及将患者肿瘤样本中的EGFR基因拷贝数或EGFRmRNA或蛋白质的表达水平与″预定阈值水平″(也称为″预定水平″或“预定截止值”)比较。
EGFR拷贝数或表达水平的预定水平,有时被称为预定截止值,可使用本领域中已知的方法,特别地使用接受者操作特征曲线或“ROC”曲线来建立。实际上,ROC曲线通常通过将变量值对比其在″正常″和″患病″群体中的相对频率绘制曲线,和/或通过比较来自治疗前、治疗期和/或治疗后的受试者的结果来计算。在某些实施方案中,比较正常样本对比测试样本的EGFR表达或基因拷贝数,或这两者。在一些实施方案中,EGFR基因拷贝数为至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。在一些实施方案中,通过与一个或多个标准水平比较或通过与本领域中已知为标准水平的水平比较来测定增加。测量基因扩增、增加的表达、增加的RNA或DNA水平以及确定蛋白质是否具有组成型活性的方法在本领域中是公知的并且任何此类方法可用于本发明。
为了测定EGFR生物标志物或其它目标生物标志物诸如HER2的存在或不存在,将从用于特定测试或测定的报告基团检测到的信号与对应于预定截止值或预定阈值水平的信号进行比较。在一个实施方案中,用于生物标志物的检测的预定阈值水平是从不患有所述疾病例如不患有胃癌的患者的样本获得的平均水平(averagemeanlevel)。一般地,产生高于预定阈值水平3个标准差的样本被认为对于癌症呈阳性。在可选择的优选实施方案中,按照Sackett等人,ClinicalEpidemiology:ABasicScienceforClinicalMedicine,LittleBrownandCo.,1985,第106-7页的方法,使用ROC测定截止值。简言之,在该实施方案中,可从对应于用于诊断测试结果的每一个可能的截止值的成对真阳性率(即,灵敏度)和假阳性率(100%特异度)的曲线图测定截止值。曲线图上最接近左上角的截止值(即,包围最大面积的值)是最准确的截止值,并且产生高于通过该方法测定的截止值的信号的样本可被认为是阳性的。或者,可将截止值沿着曲线图向左偏移,以使假阳性率降至最低,或向右偏移,以使假阴性率降至最低。一般地,产生高于通过该方法测定的截止值的信号的样本被认为对癌症呈阳性。
在一些实施方案中,可将代表患者对利用抗EGFR试剂的治疗的反应的ROC曲线用于定义目标函数。例如,目标函数可反映ROC曲线下面积。通过使针对用抗EGFR试剂治疗的患者的EGFR基因拷贝数(例如,EGFR基因扩增)或EGFR的过表达的水平的曲线下面积最大化,可使癌症患者是否将对利用抗EGFR试剂的治疗起反应最大化。在一些其它实施方案中,可约束ROC曲线以提供大于特定值的曲线下面积。具有0.5的曲线下面积的ROC曲线表示完全随机性,然而1.0的曲线下面积反映两组的完全分离。因此,在某些实施方案中,最小可接受值,诸如0.75,可用作约束条件。
在一些其它实施方案中,其它特性诸如ROC曲线的斜率等于1所处的点的使用;灵敏度与特异度的积是最大时所处的点的使用;或这些ROC-曲线特性的两个或更多个的组合可用于定义目标函数。
在某些实施方案中,EGFR过表达(例如,mRNA或蛋白质表达)以这样的水平存在,所述水平在肿瘤组织中为在肿瘤由其产生的相同类型的正常组织中的至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或更多。
在一些实施方案中,肿瘤样本中EGFR基因拷贝数或EGFR的过表达的水平或这两种水平相对于预定阈值水平的升高指示癌症患者将对利用抗EGFR试剂的治疗起反应。在一些实施方案中,肿瘤样本中EGFR基因拷贝数相对于预定阈值水平的下降的水平指示癌症患者将对利用EGFR抑制剂的治疗不起反应。
本发明还部分涉及如下观察,具有EGFR生物标志物(过表达和/或基因扩增)的HuPrime模型也不具有HER2生物标志物(过表达和/或基因扩增)以及反之亦然,即在单个模型中不会同时观察到EGFR和HER2的过表达(基因扩增)(参见实施例)。因此,在一个实施方案中,肿瘤样本中EGFR基因拷贝数或EGFR过表达相对于预定阈值水平的升高的水平以及HER2生物标志物的缺乏,被用作用于选择利用抗EGFR试剂的进行治疗的患者的指标。在这一点上,人酪氨酸激酶受体类型受体(HER2)基因的核苷酸序列在本领域中也是已知的,并且可见于例如GenBank登录号M16789、M16790、M16791、M16792和M11730(全部通过引用并入本文)下。核苷酸探针和抗HER2抗体在本领域中也是已知的并且可获得用作HER2基因和蛋白质的探针以测定其表达水平/活性。
术语″基因拷贝数″(GCN)通常被定义为每基因组的基因数目。术语″EGFR基因拷贝数″意指每细胞核的EGFR基因数目的比率。在非致瘤性或非赘生性细胞中,EGFR基因拷贝数接近或小于2。在非致瘤性或或非赘生性来源的组织切片中,如果利用原位杂交检测的话,GCN接近或小于2。
术语″增加的EGFR基因拷贝数″、″扩增的EGFR基因拷贝数″或“EGFR基因扩增”意指与患者相关的肿瘤的细胞中的上文中定义的比率比与相同来源的非赘生性细胞相关的肿瘤的细胞中的特定比率或阈值水平高或被扩增。在一个实施方案中,所述比率或阈值水平(EGFR基因的数目/细胞核)大于2或3或4或5或6或7。在另一个实施方案中,所述比率或阈值水平接近或大于4。在某些实施方案中,术语增加的或扩增的EGFR基因拷贝数意指大于非致瘤性或非赘生性细胞中的EGFR基因拷贝数的GCN。在某些实施方案中,EGFRGCN或阈值水平可大于4,诸如4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、30.5、14、14.5、15、50.5、16或更大。在某些实施方案中,EGFRGCN或阈值水平可小于4,诸如3.5、3或2.5。
在一些实施方案中,接近或大于4的EGFR基因拷贝数鉴定可能对利用-EGFR试剂的治疗起反应的癌症患者。
根据这些适用于″增加的”或“扩增的″EGFR基因拷贝数的前述值,由对利用EGFR抑制剂或抗EGFR抗体的治疗不起反应,或无有效或积极地反应,或无反应的患者的肿瘤细胞呈现的相对减少或更低或无扩增的拷贝数的比率值小于2。在一个实施方案中,所述比率或阈值水平小于4。在一些实施方案中,小于4的EGFR基因拷贝数鉴定了癌症患者和可能对利用抗EGFR试剂的治疗无反应的患者。
用于测定EGFR生物标志物,例如EGFR或其它目标生物标志物(例如,HER2生物标志物)的基因扩增或过表达的存在的方法包括基因表达谱分析。此类方法包括基于多核苷酸的杂交分析、基于多核苷酸的测序的方法和基于蛋白组学的方法。本领域中已知的用于定量样本中的mRNA表达的示例性方法包括northern印迹和原位杂交(Parker和Barnes,MethodsinMolecularBiology106:247-283(1999));RNA酶保护测定(Hod,Biotechniques13:852-854(1992))和基于PCR的方法,诸如反转录PCT(RT-PCR)(Weis等人,TrendsinGenetics8:263-264(1992))。可使用可识别序列特异性双链体,包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体。下一代测序、qPCR、qcPCR和数字PCR也可用于测定EGFR表达水平。
用于检测核酸诸如RNA或DNA的水平的方法在本领域中已被详尽描述并且对于本领域普通技术人员来说是公知的。用于检测RNA的方法可包括但不限于RT-PCR、northern印迹分析、基因表达分析、微阵列分析、基因表达芯片分析、杂交技术(包括FISH)、表达微珠芯片测定和色谱分析以及本领域中已知的任何其它技术。用于检测DNA的方法可包括但不限于PCR、实时PCR、数字PCR、杂交(包括FISH)、微阵列分析、SNP检测测定、SNP基因分型测定和色谱分析以及本领域中已知的任何其它技术。
用于检测蛋白质和多肽的方法包括但不限于蛋白质浓度的分光光度测定、定量氨基酸分析、蛋白质浓度测定、色谱测定、免疫印迹分析、凝胶电泳,(随后染色方法,但不限于考马斯蓝、银染、SyberGreen、SyberGold)、杂交、多重细胞因子测定、免疫测定、ELISA、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定、Bradford蛋白质测定和Lowry蛋白质测定以及本领域中已知的任何其它技术。蛋白质检测还可包括检测稳定的或具有活性的蛋白质的水平,并且还可使用方法诸如动力学测定、激酶测定、酶测定和翻译后修饰测定(例如,用于测定磷酸化和糖基化状态的测定)。
如本文中所用,术语“预定标准水平”或“预定活性特征谱”是指代表特定群体中一种或多种生物标志物的平均、代表性特性或特征的标准化数据或数据集。此类特性或特征包括,但不限于,转录物丰度、转录物稳定性、转录速率、翻译速率、翻译后修饰、蛋白质丰度、蛋白质稳定性和/或蛋白质酶促活性等。在一些实施方案中,受试者的特定群体由约5个、约10个、约20个、约50个、约100个、约200个、约300个、约400个、约500个、约1000个、约5000个、约10K个或更多的个体受试者组成。预定活性特征谱可以是在受试者的特定群体已被全部暴露于药物之前、期间或之后收集的标准化数据或数据集。在一些实施方案中,所述特定群体由临床上正常的受试者组成。如本文中所用,术语“临床上正常的受试者”是指不具有或大体上不具有与胃肿瘤相关的症状的受试者。预定标准水平可使用多种本领域普通技术人员已知的方法来确定。一般地,用于生物标志物的标准水平通过测定足够大数量的获自正常健康对照受试者的样本中的EGFR生物标志物的水平来测定。在一些实施方案中,标准水平信息可获自公共可获得的数据库以及其它来源。(参见,例如,Bunk,D.M.,Clin.Biochem.Rev.,28(4):131-137(2007);SurajPeril,等人,GenomeRes.13:2363-2371(2003);Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,TwentyFirstEdition(2005)。
关于与生物标志物水平的检测、定量和比较相关的方法,参见,例如,CurrentProtocolsinMolecularBiology,编辑Ausubel,FrederickM.(2010);CurrentProtocolsinProteinScienceLast,编辑Coligan,JohnE.,等人(2010);CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,编辑Egli,Martin(2010);CurrentProtocolsinBioinformatics,编辑Baxevanis,AndreasD.(2010);和MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,Sambrook,Joseph(2001),所述所有文献通过引用整体并入本文。
EGFR表达水平还可使用多种可获得的微阵列中的任何一种来评估。在该方法中,将目标多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)排列在基底上。随后在适合于与从测试样本的mRNA产生的可检测地标记的cDNA特异性杂交的条件下接触排列的序列。mRNA的来源通常是从肿瘤样本,和任选地从作为内部对照的相同的患者的正常组织或细胞系分离的总RNA。可以例如从冷冻或存档的石蜡包埋的并且固定的(例如福尔马林-固定的)组织样本提取mRNA。用于本文的示例性微阵列包括,但不限于AffymetrixHG-U219GeneChip或AffymetrixSNP6阵列(Affymetrix,SantaClara,CA)。
在某些实施方案中,EGFR基因拷贝数或mRNA表达水平的检测使用杂交测定来实现。核酸杂交只包括将探针(例如,寡核苷酸或更大的多核苷酸)与靶核酸在其中探针与其互补靶标可通过互补碱基配对形成稳定的杂交双链体的条件下接触。如本文中所用,杂交条件是指在其下使用核酸分子来鉴定相似核酸分子的标准杂交条件。此类标准条件公开于例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabsPress,1989.Sambrook等人(同上)中,所述参考文献通过引用整体并入本文(具体参见,第9.31-9.62页)中。此外,计算实现允许不同程度的核苷酸错配的杂交的适当的杂交和洗涤条件的公式对于本领域普通技术人员来说是已知的。
在低严格度条件(例如,低温和/或高盐)下,在即使其中退火的序列不是优选地互补的情况中,将形成杂交双链体(例如,DNA:DNA、RNA:RNA或RNA:DNA)。因此,杂交的特异性在较低严格度下降低。相反地,在较高严格度(例如,较高的温度或较低的盐)下,成功的杂交需要较少的错配。
杂交的核酸通过检测连接至样本核酸的一个或多个标记来检测。可利用本领域普通技术人员公知的许多方法中的任何方法掺入所述标记。
在一个实施方案中,EGFR基因拷贝数使用CFISH分析来检测。FISH(双色)法可使用商购可得的试剂和方法,诸如本文中的实施例中描述的那些试剂和方法来进行。(参见,例如,AbbottPathVysionEGFRDNAProbe试剂盒(Abbott,DownersGrove,IL)。在某些实施方案中,用于此类FISH分析的经标记的探针包含对于染色体7p12上的EGFR基因座是特异的光谱橙色荧光团标记的EGFR(303kb),和/或被靶向位于染色体7的着丝粒区域(CEP7;7p11.1-q11.1)的α-卫星DNA序列的光谱绿色荧光团标记的染色体计数器探针(5.4kb)。
许多常规检测法利用酶。一般用于灵敏性检测的酶底物的类型通常是比色、放射性或荧光。常规比色底物在酶对生色底物作用后产生新的颜色(或光谱吸收的变化)。该类型的检测是有利的,因为产生的色原可通过光学显微镜检查或利用光谱设备来容易地检测。用于检测的设备的成本通常也低于其它方法;例如在病理学中,通过酶辣根过氧化物酶作用于底物3,3′-二氨基联苯胺(DAB)产生的褐色只需要简单的明场光学显微镜来观察活检切片。可与辣根过氧化物酶结合使用的其它色原包括,但不限于,3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和Bajoran紫。可与碱性磷酸酶结合使用的其它色原包括,但不限于,坚固红和Ferangi蓝。许多色原对于本领域普通技术人员来说是可获得的,并且通过由公司诸如ThermoFisherScientific提供的目录商购获得。
检测方法中所用的各种标记包括荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)和酶(例如,LacZ、CAT、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶,和葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶等,通常用作可检测的酶),或能够形成复合物如链霉亲和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体复合物的结合对的成员,包括,例如,兔IgG和抗兔IgG;荧光团;光散射或等离子体共振材料,诸如金或银颗粒或量子点;或放射性标记;和用为本领域普通技术人员已知的任何其它信号生成标记物(如例如由RichardP.Hoagland在theMolecularProbesHandbook的第6版增刊中描述的)标记的探针。在某些实施方案中,经标记的探针包括对于染色体7p12上的EGFR基因座是特异的光谱橙色荧光团标记的EGFR(303kb),和/或被靶向位于染色体7的着丝粒区域(CEP7;7p11.1-q11.1)的α-卫星DNA序列的光谱绿色荧光团标记的染色体计数器探针(5.4kb)。
在某些实施方案中,所述杂交核酸,诸如EGFR基因或其片段,通过金属标记或“酶促金属学(enzymaticmetallography)”和最优选地在银的情况下原位杂交(SISH)测定(参见例如,专利申请US20080299555A1)来检测。具体地,酶促金属学允许通过常规明视场显微镜检测染色体中的单拷贝的靶基因而无需浸油。SISH还使得能够以允许单个地计数信号(诸如针对单个基因拷贝的离散金属沉积点)的分辨率检测基因拷贝。在一个实施方案中,本发明允许检测细胞核中的人染色体7中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个拷贝的EGFR基因,如离散金属沉积。
可以例如使用FISH或SISH测定测量根据本发明的肿瘤细胞中细胞核中的基因和染色体的拷贝数,并且可以例如在免疫组织化学测定中评价肿瘤细胞核、细胞质和/或膜中的蛋白质表达。可在原发肿瘤、转移肿瘤、局部复发的肿瘤或其它肿瘤背景中进行这些测试,例如FISH、SISH和免疫组织化学,以及其它检测法。肿瘤样本可以是新鲜的、冷冻的、固定的或以另外方式保存的。
人表皮生长因子受体(EGFR)基因的核苷酸序列在本领域中是已知的,并且可例如根据GenBank登录号AY588246(通过引用并入本文)找到。核苷酸探针在本领域中也是已知的,并且可获得用作检测EGFR基因的探针。例如,用于检测EGFR和染色体7着丝粒序列的此类探针是可获得的(例如,LSIEGFRSpectrumOrange/CEP7SpectrumGreen探针(Vysis,AbbottLaboratories)。
可检测合适的组织,诸如通过活检获得的肿瘤组织和细胞材料中的蛋白质表达。例如,可将可被固定的患者肿瘤活检样本与选择性结合待检测的蛋白质的抗体、抗体片段或适体接触,和确定所述抗体、其片段或适体是否已结合于所述蛋白质。蛋白质表达可使用本领域中的多种标准方法来测量,包括,但不限于:Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、表面等离子体共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸/电离时间飞行(MALDI-TOF)质谱分析,显微细胞计数(microcytometry)、微阵列,显微镜检查、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术。在一个实施方案中,免疫组织化学(IHC)分析用于检测蛋白质表达。IHC法和用于检测蛋白表达的评估标准详细地描述于例如Hirsch等人,J.Clin.Oncol.2003,21:3798-3807中。
EGFR基因扩增或过表达可导致增强的EGFR活性。异常高的EGFR激活导致几种细胞内底物的磷酸化,这又产生促有丝分裂信号转导以及其它肿瘤诱导活性。因此,在某些实施方案中,测定EGFR生物标志物的存在可包括测量EGFR生物活性的一个或多个指标,如使用细胞增殖测定、细胞凋亡测定、受体结合测定、受体磷酸化测定等测定的。
关于涉及生物标志物水平的检测、定量和比较的方法,参见,例如,CurrentProtocolsinMolecularBiology,编辑Ausubel,FrederickM.(2010);CurrentProtocolsinProteinScienceLast,编辑Coligan,JohnE.,等人(2010);CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,编辑Egli,Martin(2010);CurrentProtocolsinBioinformatics,编辑Baxevanis,AndreasD.(2010);和MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,Sambrook,Joseph(2001),所述所有参考文献通过引用整体并入本文。
本发明的另一个方面提如下方法,所述方法用于提供实验室服务,包括接收胃肿瘤患者的样本,进行如本文中所述的测试以检测样本中EGFR生物标志物的存在或不存在,和为患者的保健提供者提供测试结果。
本发明还提供试剂盒,所述试剂盒包含适合用于检测EGFR生物标志物的试剂和根据本文中描述的方法使用所述EGFR生物标志物确定用于胃肿瘤患者的治疗选项的说明书。此类试剂盒通常包含进行诊断测定必需的两种或更多种组分。组分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如,试剂盒中的一个容器可含有特异性结合EGFR(和/或在某些实施方案中,HER2蛋白)的单克隆抗体或其片段。此类抗体或片段可被提供来附接于支持材料,如上文中描述的。一个或多个另外的容器可密封组分,诸如试剂或缓冲液,以用于测定。此类试剂盒还可或可选择地含有如上所述含有适合用于抗体结合的直接或间接检测的报告基团的检测试剂。
或者,试剂盒可被设计来检测生物样本中编码EGFR(和/或HER2)蛋白的mRNA的水平,或用于检测EGFR基因扩增。此类试剂盒通常包含至少一种与EGFRDNA或编码EGFR蛋白的多核苷酸杂交的如上所述的寡核苷酸探针或引物。此类寡核苷酸可以用于例如PCR或杂交测定中。可存在于此类试剂盒内的另外的组分包括有利于编码EGFR或HER2蛋白的多核苷酸的检测的第二寡核苷酸和/或诊断试剂或容器。
用于获得生物样本的方法在本领域中是公知的,并且可使用用于获得生物样本的任何标准方法。用于本发明的方法的生物样本包括但不限于血清、血液、血浆、全血和其衍生物、皮肤、毛发、毛囊、唾液、口腔粘液、阴道粘液、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、射精前液体(考珀液)、排泄物、活检、腹水、脑脊液、淋巴液以及组织提取物样本或活检(参见,例如,ClinicalProteomics:MethodsandProtocols,第428卷,于MethodsinMolecularBiology,编辑AntoniaVlahou(2008)中)。在一个实施方案中,本发明的生物样本发明包括食道的任何细胞或组织样本,例如食道癌的原位或循环或迁移细胞。在另一个实施方案中,本发明的生物样本包括食道的任何提取物,或细胞或组织样本的部分或全部级分,例如,食道癌的原位或循环或迁移细胞。
药物组合物和治疗方法
本发明提供用于治疗胃肿瘤的方法,其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的如本文中描述的抗EGFR试剂,其中所述患者已被确定为含有EGFR生物标志物。如本文中所用,术语″有效量″是指使得能够获得所需治疗结果的一种或多种化合物的量。有效量可包含在一个或多个剂量内,即,可能需要单次剂量或多次剂量来获得所需治疗终点。如本文中所用,术语“治疗有效量”是指治疗病症,或减轻或防止损伤或损害(任选地不引起显著的负面或有害副作用)所需的一种或多种试剂的水平或量。例如,治疗有效量包括足以产生所需治疗结果(例如疾病或病症的严重度的减轻)的包含例如一种或多种可调节EGFR途径的化合物的药物制剂的量。在一个实施方案中,胃肿瘤是胃腺癌。本文中描述的方法包括用于治疗任何类型的胃癌,包括肠道和弥漫性胃腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道平滑肌肉瘤、胃肠道类癌和胃肠道淋巴瘤的方法,其中患者已被确定含有如本文中定义的EGFR生物标志物。在某些实施方案中,所述方法用于治疗胃癌。在具体的实施方案中,所述方法包括用于治疗表达EGFR的癌症,诸如胃癌的方法,其中所述癌症不是食管胃腺癌(OGA)或转移性结直肠癌。在一个实施方案中,本发明提供用于治疗胃肿瘤的方法,其包括向需要此种治疗的患者施用治疗有效量的如本文中描述的抗EGFR试剂,其中所述患者已被确定含有EGFR生物标志物但不含有HER2生物标志物。
另一个实施方案提供用于通过向癌症患者施用治疗有效量的本文中公开的抗EGFR试剂(诸如EGFR特异性抗体)来预防胃癌的转移的方法,所述胃癌包括,但不限于,肠道和弥漫性胃腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道平滑肌肉瘤、胃肠道类癌和胃肠道淋巴瘤,其中所述患者已被确定含有如本文中定义的EGFR生物标志物。在这一点上,本发明方法包括施用一定量的抗EGFR试剂,所述试剂,在施用后,以统计上显著的方式(即,相对于对于本领域普通技术人员来说是已知的适当对照)抑制、预防或延迟胃癌的转移。在某些实施方案中,所述患者已被确定含有EGFR生物标志物但不含有HER2生物标志物。因此,在一个实施方案中,本发明提供用于预防胃癌的转移的方法,其中有此需要的患者被施予抗EGFR试剂而非抗HER2试剂。
如本文中所用,术语″治疗(treatment/treating)″等是指为了获得疗效施用试剂或进行方法(例如,放射、手术方法等)。疗效在完全或部分预防疾病诸如癌症,或其症状方面可以是预防性,和/或在实现疾病和/或疾病的症状的部分或完全治愈方面可以是治疗性的。如本文中所用,″治疗″涵盖哺乳动物的,特别地人的疾病,诸如癌症的任何治疗,并且包括:(a)防止疾病或疾病的症状在可对疾病易感但还未被诊断为患有其(例如,包括可与原发疾病相关或由其引起的疾病)的受试者中发生;(b)抑制疾病,即阻止其发展;和(c)缓解疾病,即引起疾病的消退或阻止其进展。
如本文中所用,在患者对抗EGFR试剂治疗起反应的背景中,术语″起反应的″、″有益的反应″、″有益的患者反应″和″临床上有益的反应″、″临床益处″等可互换使用并且指与不利的反应(对治疗无反应和/或具有不利的事件)相反的有利的患者对药物的反应。在个体患者中,有益的反应可根据许多临床参数来表达,包括可检测的肿瘤的消失(完全反应,CR)、肿瘤尺寸和/或癌细胞数目的减小(部分反应,PR)、肿瘤生长停滞(稳定的疾病,SD)、抗肿瘤免疫应答的增强、可能地导致肿瘤的消退或排斥、与肿瘤相关的一个或多个症状的达到一定程度的缓解;治疗后存活期的长度的增加;和/或治疗后给定的点上减少的死亡率。肿瘤尺寸和/或癌细胞数目和/或肿瘤转移的持续增加指示对治疗的有益反应的缺乏。
在群体中,药物的临床益处,即其功效可基于一个或多个终点来评价。例如,在一个实施方案中,总反应率(ORR)的分析将在用药物治疗后经历CR或PR的那些患者分类为反应者。疾病控制(DC)的分析将用药物治疗后经历CR、PR或SD的那些患者分类为反应者。
如本文中使用的,术语″无进展生存期″是指从患者的治疗直至患者的癌症进展或死亡(无论哪个首先发生)的时间间隔。
如本文中所用,根据本发明的反应者是在抗EGFR治疗后展现治疗功效(例如,展现有益的临床反应)的个体。如果患者已被确定为具有EGFR生物标志物,那么患者是反应者,其将在用抗EGFR试剂治疗后展现有益的临床反应。
如本文中所用,术语″非反应者″或″无反应″是指在用EGFR抑制剂治疗后不展现治疗功效(例如,有益的临床反应)的患者。在某些实施方案中,非反应者可能已被确定为具有EGFR生物标志物。在一些其它实施方案中,非反应者可能已被确定为不具有EGFR生物标志物。
短语“确定治疗功效”或“确定治疗的功效”及其变型可包括用于确定治疗正为受试者提供益处的任何方法。术语“治疗功效”及其变型通常通过由与疾病相关的一个或多个体征或症状的减轻来指示,并且可由本领域普通技术人员容易地确定。“治疗功效”还可指通常与疾病的标准或非标准治疗,即用于治疗癌症的化学疗法或放射疗法相关的毒性的体征和症状的预防或改善。治疗功效的确定通常是适应症和疾病特异性的并且可包括本领域中已知或可获得的用于确定治疗将对患者提供有益作用的任何方法。例如,治疗功效的证据可包括但不限于疾病或适应症的缓解,对于癌症这可包括但不限于肿瘤尺寸、肿瘤转移等的减小或减少。此外,治疗功效还可包括受试者的总体健康的一般性改善,诸如但不限于患者生活质量的提高,预测的受试者存活率的增加、抑郁的减轻或适应症的复发率的降低(缓解时间的增加)。(参见,例如,Physicians′DeskReference(2010))。
对于本发明的方法,所述EGFR生物标志物可以是EGFR基因扩增和/或EGFR过表达的任何体外或体内指标,诸如EGFRRNA水平、具有组成型活性的EGFR、EGFR活性、EGFR途径活化或EGFR途径的信号转导。在一个实施方案中,EGFR生物标志物包括与EGFR基因扩增和/或EGFR过表达相关的DNA、RNA或蛋白质水平上的任何突变形式,诸如L858R/T790M双突变、插入突变(外显子20:2319-2320)、缺失突变(外显子19:2236-2350)。在另一个实施方案中,EGFR生物标志物包括与EGFR基因扩增和/或EGFR过表达直接或间接相关的任何测量。在一些实施方案中,EGFR生物标志物选自当与预定标准水平比较时,EGFR基因扩增、增加的EGFR表达、升高的EGFRRNA水平、具有组成型活性的EGFR和增强的EGFR途径活化或增强的EGFR途径信号转导。
本文中描述的抗EGFR试剂诸如抗EGFR抗体以纯的形式或以适当的药物组合的施用可通过用于起着类似效用的试剂的任何可接受的施用模式来进行。药物组合物可通过将抗EGFR试剂(例如,抗体)或含抗EGFR试剂组合物与适当的生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备,并且可被配制成呈固体、半固体、液体或气体形式的制剂,诸如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球和气溶胶。此外、其它药物活性成分(包括如本文其它地方所述的其它抗癌剂)和/或合适的赋形剂诸如盐、缓冲液和稳定剂,但不必存在于组合物中。施用可以通过多种不同的途径来实现,包括,但不限于口服、肠胃外、经鼻、静脉内、皮内、皮下或局部途径。优选的施用模式取决于待治疗或预防疾病的性质。施用后,减少、抑制、防止或延迟癌症的进展和/或转移的的量被认为是有效的。
抗EGFR抗体治疗可包括使用抗EGFR抗体或抗体样治疗剂(包括(无任何限制)具有一个或多个抗EGFRCDR的任何分子)的任何治疗。在一个实施方案中,抗EGFR抗体治疗包括任何批准的抗EGFR抗体,例如,西妥昔单抗(也称为爱必妥(erbitux))或其生物相似物或衍生物,例如完全人抗EGFR抗体等。西妥昔单抗(由ImClone和Bristol-MyersSquibb在北关和由MerckKGaA在世界上其余地方销售的)是阻断表皮生长因子(EGF)受体(EGFR)的激活的重组人/小鼠嵌合单克隆抗体。西妥昔单抗可通过静脉内输注来提供用于转移性结直肠癌和头颈癌的治疗。在一些实施方案中,将西妥昔单抗配制于pH7.0至7.4的无菌无色液体中。在一些实施方案中,以2mg/mL的浓度将西妥昔单抗配制在100mg(50mL)或200mg(100mL)中。在一些实施方案中,将西妥昔单抗配制在单次使用小瓶中。在一些实施方案中,西妥昔单抗制剂包含8.48mg/mL氯化钠、1.88mg/mL磷酸氢二钠七水合物、0.41mg/mL磷酸二氢钠一水合物和无菌注射用水。用于施用西妥昔单抗的方法和制剂是医学领域普通技术人员公知的,并且施用西妥昔单抗、西妥昔单抗的给药方案或用于西妥昔单抗的配制的任何公知方法预期用于本发明的方法。详细的组成和使用西妥昔单抗的方法描述于描述于美国专利号8075916、7977336、6217866,所述每一个专利出于所有目的通过引用整体并入。
在一些实施方案中,可将本发明的生物标志物与指示相同药物和/或用于治疗胃肿瘤患者的不同药物的功效的另一种生物标志物一起使用。
在一些实施方案中,获自样本的信息包括基于EGFR基因扩增或EGFR基因过表达水平的升高或降低的指数值。例如,可基于增加或减少的比率为EGFR基因扩增或EGFR基因过表达的水平指定指数值。在一些实施方案中,增加或减少越大,则指数值越大。在一些实施方案中,可将指数值汇编为组以产生组合。在一些实施方案中,将组合与预定标准相比较。在一些实施方案中,组合与预定标准的比较指示利用治疗实体的治疗的治疗功效。在一些实施方案中,组合与预定标准的比较可用于修改利用治疗实体的治疗的治疗方案。
在某些实施方案中,施用的量足以导致肿瘤消退,如通过存活肿瘤的量的统计上显著的减少,例如肿瘤质量的至少50%的减少,或由改变的(例如,具有统计显著性的减少)扫描尺寸指示的。在其它实施方案中,施用的量足以导致胃癌的临床上相关的减少。
治疗的精确剂量和持续时间是待治疗的疾病的函数,并且可使用已知的测试方案或通过在本领域中已知的模型系统中测试组合物并从其外推来通过经验确定。还可进行临床对照试验。剂量还可随待缓解的病症的严重度而变化。通常配制并施用药物组合物以产生治疗上有用的作用同时使不期望的副作用减小至最低程度。组合物可被施用一次,或可被分成许多更小的剂量来以一定的时间间隔施用。对于任何特定的受试者,可按照个体需要随时间推移调整特定的剂量方案。
可单独施用或与其它已知的癌症治疗诸如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力学疗法等组合地施用包含如本文中描述的抗EGFR试剂的组合物。还可将组合物与抗生素组合施用。在一些实施方案中,化学治疗剂包括但不限于长春碱、长春新碱、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、依托泊苷、光辉霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、氟尿嘧啶、亚叶酸和依立替康。在一些实施方案中、靶向治疗剂包括但不限于贝伐单抗、曲妥珠单抗、埃罗替尼、帕尼单抗、索拉非尼、英夫利昔单抗、阿达木单抗、巴利昔单抗、达珠单抗和奥马珠单抗。在一些实施方案中,以约40Gy至80Gy的剂量施用放射治疗剂。在一些实施方案中,剂量为约50Gy至约70Gy,在一些实施方案中,剂量为约50Gy至约65Gy。在一些实施方案中,以约50Gy、约55Gy、约60Gy或约65Gy的剂量施用放射治疗剂。
施用这些和相关药物组合物的典型途径从而包括,但不限于,口服、局部、经皮肤、吸入、胃肠外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内途径。如本文中所用,术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。配制根据本发明的某些实施方案的药物组合物,以允许其中包含的活性成分在向患者施用该组合物后是生物可利用的。将向受试者或患者施用的组合物可采取1个或多个剂量单位的形式,其中例如,片剂可以是单个剂量单位,呈气溶胶形式的本文中描述抗EGFR试剂的容器可以容纳多个剂量单位。对于本领域普通技术人员来说,制备此类剂型的实际方法是已知,或将是显而易见的;例如,参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版(PhiladelphiaCollegeofPharmacyandScience,2000)。待施用的组合物将在任何情况下含有治疗有效量的抗EGFR试剂,例如如本文中所述的抗EGFR抗体,以用于根据本文中的教义治疗目标疾病或病症。
药物组合物可呈固体或液体形式。在一个实施方案中,载体是颗粒剂,以便组合物呈例如片剂或粉剂形式。载体可以是液体,其中组合物是例如口服油、注射液体或气溶胶,其用于例如吸入施用。当想要口服施用,药物组合物优选呈固体或液体形式,其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式被包含在本文中被当作为固体或液体的形式中。
作为用于口服施用的固体组合物,可将药物组合物配制成粉剂、粒剂、压制的片段剂、丸剂、胶囊、口香糖、晶片等。此类固体组合物将通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用的载体。此外,可存在以下试剂的一种或多种:粘合剂诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂诸如淀粉、乳糖或糊精、崩解剂诸如藻酸、藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等;润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotex;助流剂诸如胶体二氧化硅;甜味剂诸如蔗糖或糖精;调味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或甜橙香精;和着色剂。当药物组合物呈胶囊形式,例如明胶胶囊时,其可能,除了上述类型的材料以外,还含液体载体诸如聚乙二醇或油。
药物组合物可呈液体形式,例如,酏剂、糖浆剂、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例,液体可用于口服施用或通过注射递送。当期望口服施用时,优选组合物,除了现有化合物外,还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂中的一种或多种。在期望通过注射施用的组合物中,可包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
液体药物组合物,无论它们是溶液、悬浮液还是其它类似的形式,可包括以下试剂的一种或多种:无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液,优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油诸如合成的单或二甘油酯(其可作为溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂;抗微生物剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂诸如乙二胺四乙酸;缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可被封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在某些实施方案中,生理盐水是优选的组合物。可注射药物组合物优选是无菌的。
期望用于胃肠外或口服施用的液体药物组合物应当含有一定量的抗EGFR试剂,诸如本文中描述的EGFR特异性抗体,以便可获得适当的剂量。通常地,该量为至少0.01%的组合物中的抗体。当期望口服施用时,可使该量在组合物的重量的0.1%与约70%之间变化。某些口服药物组合物含有约4%至约75%的抗体。在某些实施方案中,制备根据本发明的药物组合物和制剂,以使胃肠外剂量单位在稀释前含有按重量计0.01%至10%的抗体。
该药物组合物可意欲用于局部施用,在这种情况下,载体可适当地包括溶液、乳液、软膏或凝胶基剂。基质,例如,可包括以下材料的一种或多种:凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂诸如水和醇,以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于用于局部施用的药物组合物中。如果期望进行经皮施用,该组合物可包含经皮贴剂或离子电渗装置。该药物组合物可意欲以例如栓剂的形式用于直肠施用,所述栓剂将在直肠中融化并释放出药物。用于直肠施用的组合物可含有油性基质作为合适的无刺激性赋形剂。此类基质包括,但不限于,羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
药物组合物可包含各种材料,所述材料改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如,组合物可包含形成包围活性成分的涂层壳体的材料。形成涂层壳体的材料通常是惰性的,并且可选自例如糖、虫胶以及其它肠包衣剂。或者,可将活性成分封装在明胶胶囊中。呈固体或液体形式的药物组合物可包含结合本发明的抗体并从而帮助化合物递送的试剂。可在该能力中发挥作用的适当试剂包括其它单克隆或多克隆抗体,一种或多种蛋白质或脂质体。药物组合物可基本上由可作为气溶胶施用的剂量单位组成。术语气溶胶用于指范围从具有胶体性质的系统变化至由加压包装组成的系统的多种系统。递送可以是通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的适当的泵系统。可在单相、双相或三相系统中递送双气溶胶以递送活性成分。气溶胶的递送包括可一起形成试剂盒的必需容器、激活剂、阀门、子容器等。本领域普通技术人员可确定优选的气溶胶而无需过度实验。
药物组合物可通过制药领域中公知的方法来制备。例如期望通过注射施用的药物组合物可通过将包含抗EGFR试剂,诸如本文中描述的EGFR特异性抗体和任选的一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂的组合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液来制备。可添加表面活性剂以促进均一溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与抗体组合物非共价相互作用以促进抗体在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
可以以治疗有效的量施用组合物,所述治疗有效量将取决于多种因素,所述因素包括所使用的特定化合物(例如,EGFR特异性抗体)的活性;化合物代谢稳定性和作用长度;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;施用模式和时间;排泄速率;药物组合;特定病症或状况的严重程度;和受试者经历的治疗。
还可将包含抗EGFR试剂诸如EGFR特异性抗体的组合物与一种或多种其它治疗剂同时施用,在所述其它治疗剂施用之前或施用之后施用。在一个实施方案中,本发明提供用于治疗胃肿瘤的方法,其包括向需要此种治疗的患者施用有效量的两种或更多种抗EGFR试剂的组合,其中所述患者已被确定含有EGFR生物标志物。在这一点上,所述治疗可包含有效量的选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、抗体806、Sym004、MM-151和本文中描述的其它抗EGFR试剂的两种或更多种抗EGFR试剂的组合。
在一个实施方案中,本发明提供用于治疗胃肿瘤的方法,其包括向需要此种治疗的患者施用有效量的抗EGFR试剂,其中所述患者已被确定含有与胃癌的护理治疗的标准组合的EGFR生物标志物。胃癌的标准治疗包括:手术、放射疗法或化学疗法,或这些治疗的组合。手术可包括去除胃的患病部分和附近淋巴结的手术或在某些情况下可包括胃切除术。目前,对于胃癌的治疗不存在世界范围内使用的单一标准化疗治疗。然而,化疗治疗可包括至少两种药物氟尿嘧啶(5-FU,Adrucil)和顺铂(Platinol)的组合。与5-FU类似(诸如卡培他滨或Xeloda)和与顺铂类似(诸如奥沙利铂或乐沙定)的其它药物似乎是等同的。通常使用的其它药物包括多西他赛(Taxotere)、紫杉醇(Taxol)、伊立替康(Camptosar)和表柔比星(Ellence)。
如可由本领域普通技术人员所理解的,联合治疗可包括含有抗EGFR试剂和一种或多种另外的活性剂的单一药物剂量制剂的施用,以及在其自已的分开的剂量制剂中包含抗EGFR试剂和每一种活性剂的组合物的施用。例如,可将如本文中描述的抗EGFR抗体和其它活性剂在单一口服剂量组合物诸如片剂或胶囊中一起向患者施用,或每一种试剂以单独的口服剂量制剂施用。类似地,可将如本文中描述的抗EGFR抗体和另一种活化剂在单一胃肠外剂量组合物中诸如在盐溶液或其它生理上可接受的溶液中一起向患者施用,或每一种试剂以单独的胃肠外剂量制剂施用。当使用单独的剂量制剂时,可在基本上相同的时间(即同时),或在单独错开的时间(即相继地)并以任意顺序施用包含抗EGFR试剂诸如抗体的组合物和一种或多种另外的活性剂;联合治疗被理解为包括所有这些方案。
因此,在某些实施方案中,还设想了与一种或多种其它治疗剂组合的包含抗EGFR试剂诸如EGFR特异性抗体的组合物的施用。此类治疗剂在本领域中可被接受为用于如本文中描述的特定疾病状态(诸如癌症,特别地胃癌)的标准治疗。设想的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂或其它活性辅助剂。
在某些实施方案中,可将抗EGFR试剂,诸如抗EGFR抗体与任何数量的化学治疗剂结合向被鉴定为具有EGFR生物标志物的患者施用。化学治疗剂的实例包括烷化剂,诸如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶诸如苯并多巴,卡波醌、甲基多巴和尿多巴;乙烯亚胺和甲基三聚氰胺,包括六甲蜜胺、三乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺;氮芥诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氮芥氧化物盐酸盐、关法仑、新恩比兴、胆固醇苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥;亚硝基脲诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀;抗生素诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博菜霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯关司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢产物诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙;嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU;雄激素、诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸、环硫雄醇、关雄烷、睾内酯;抗肾上腺素药诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦;叶酸补充剂,诸如亚叶酸;醋葡醛内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基乙酰丙酸;安吖啶;bestrabucil;比生群;依达曲沙;地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺;地吖醌;依氟鸟氨酸;依利乙胺;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;香菇多糖;氯尼达明;米托胍腙;米托蒽醌;莫哌达醇;硝氨丙吖啶;喷司他丁;蛋氨氮芥;吡柔比星;足叶草酸;2-鬼臼酸乙肼;甲基苄肼;PSK.RTM;丙亚胺;西左非兰;螺环锗;细格孢氮杂酸;三亚胺醌;2,2′,2″-三氯三乙胺;氨基甲酸乙酯;长春地辛;达卡巴嗪;甘露醇氮芥;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;gacytosine;阿糖胞苷(″Ara-C″);环磷酰胺;塞替派;紫杉烷类,诸如紫杉酚(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(Rhne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨;6-硫代鸟嘌呤,巯嘌呤,氨甲喋呤;铂类似物如顺铂和卡铂;奥沙利铂;伊立替康;长春花碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺维本;诺肖林;替尼泊苷;柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达;伊班膦酸盐;CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸衍生物如TargretinTM(贝沙罗汀)、PanretinTM(阿利维a酸);ONTAKTM(地尼白介素);埃斯波霉素;卡培他滨;和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括在该定义中的是用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,诸如抗雌激素类,包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫西芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素类,诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林;和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
可将多种其它治疗剂与本文中描述的抗EGFR试剂结合使用。在一个实施方案中,向被鉴定为具有EGFR生物标志物的患者施用抗EGFR试剂与抗炎剂。抗炎剂或药物包括,但不限于,类固醇和糖皮质激素类(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)、非甾体抗炎药(NSAIDS),包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和麦考酚酯。
示例性NSAID选自由以下组成的组:布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂诸如(罗非昔布)和(塞来昔布)以及唾液酸盐(sialylates)。示例性镇痛药选自由以下组成的组:醋氨酚、羟考酮,盐酸丙氧芬的曲马多。示例性糖皮质激素类选自由以下组成的组:可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物反应改性剂包括针对细胞表面标志物(例如,CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂诸如TNF拮抗剂(例如,依那西普阿达木单抗和英夫利昔单抗)、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应改性剂包括单克隆抗体以及分子的重组形式。示例性DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内注射)和米诺环素。
包含本文中描述的抗EGFR试剂诸如EGFR特异性抗体的组合物,可用保护抗体免受从身体快速清除的载体,诸如时间释放制剂或包衣来制备。此类载体包括控释制剂,诸如,但不限于,埋植剂和微胶囊化递送系统,以及生物可降解的生物相容性聚合物,诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本领域普通技术人员已知的其它制剂。
实施例1
EGFR基因扩增和过表达是对胃腺癌的西妥昔单抗治疗起反应的预测性生物标志物
本实施例描述了为了鉴定反应者和非反应者,随后发现预测性生物标志物而在一个组群的全分子注释的(表达和突变特征谱分析)初始亚洲胃腺癌(GC-ADC)患者来源的异种移植物(PDX)中进行的随机西妥昔单抗试验的结果。
引言和概述
无任何体外操作的患者来源异种移植物(PDX)反映了患者的组织病理学和遗传学特征谱9-14。其作为临床前癌症模型具有提高的预测能力,并且使得能够进行真正的个体化疗法和发现预测性生物标志物。所述模型也称为“Avatar小鼠”或“xenopatient”,并且它们的大的集合可潜在地反映患者中的肿瘤多样性。由于癌症患者群体的广泛多样性,因此临床试验的成功很大程度上取决于包含可能地表达期望的靶标并且具有正确的基因特征谱的反应者,和排除非反应者。这些模型从而可用于通过建立临床试验形式的模型来检验研究的靶向药物。
建立称为GC-ADC模型(与先前描述NSCLC-HuPrime类似)15的胃腺癌(GC-ADC)PDX的大的集合。测试19个GC的组群以评价肿瘤对西妥昔单抗的反应,并且发现一个亚组的具有EGFR基因扩增和过表达的GC-ADC对西妥昔单抗作出良好反应。该观察表明EGFR基因拷贝和/或过表达可用作预测患者对西妥昔单抗的反应的潜在实用单一生物标志物,这是与GC-ADC中的HER2/情形的该情况类似的情形。使用EGFR基因拷贝数作为患者选择标准的具有前景的临床研究对于进一步确认观察是必要的,并且可导致西妥昔单抗作为GC-ADC治疗的最终监管批准。
发现:在测试的19个PDXGC模型中,有4个模型(21%)对西妥昔单抗起反应(通过ΔT/ΔC>20%定义的)。表达特征谱分析和拷贝数变异分析显示所有4个反应者具有扩增的EGFR基因和/或相应高的EGFR表达,与15个非反应者(ΔT/ΔC>20%)相反。该结果与在EXTRA(其中具有EGFR扩增的所有4个患者都是反应者的II期试验)中产生的观察一致。这些结果表明EGFR基因扩增和/或高表达是该亚组的GC-ADC的关键致癌驱动者,这对于NSCLC和CRC是不常见的。
解释:EGFR基因扩增和过表达可用作GC-ADC的西妥昔单抗反应的单一预测生物标志物。
材料和方法
患者样本、异种移植物、西妥昔单抗治疗实验和模型表征。在按先前描述的方法手术10后,立即将手术取出的新鲜GC肿瘤组织用于皮下移植进6-8周龄雌性Balb/c裸鼠(BeijingHFKBioscienceCo.Ltd.,Beijing,China)。将已建立的肿瘤模型连续地再移植以进行传代和进行研究。患者样本的存取和使用由北京肿瘤医院伦理委员会以及来自患者的知情同意书批准。所有程序在CrownBioscienceSFP设施中于无菌条件下进行。严格按照美国国立卫生研究院的实验动物护理与使用指南中的推荐来进行参与我们的研究的所有实验动物的实验。方案由CrownBioscience,Inc.(CrownBioscienceIACUCCommittee)的动物实验伦理委员会批准。
用于在PDX模型中评价肿瘤对西妥昔单抗的反应的方法先前已进行了详细描述15,17。每周两次监测肿瘤生长,并且计算%ΔT/ΔC值以用于评估肿瘤对西妥昔单抗的反应(ΔT=处理组的肿瘤体积变化并且ΔC=对照组的肿瘤体积变化)。
模型表征,包括使用AffyU219、SNP6、IHC、qPCR进行的表达谱分析、癌基因突变分析,已在先前进行了详细描述15,17。
抗肿瘤活性的评价。当肿瘤体积达到100-150mm时,将小鼠随机分入2组,每组5只具有相似平均肿瘤体积的小鼠。分组后立即用媒介物(PBS,每周一次腹膜内注射或IP,进行2周)处理对照组,并且用西妥昔单抗(每周一次IP注射,持续2周,50mg/kg,MerckKGaA)注射处理组。每周2次监测肿瘤生长,计算DT/DC值以评估肿瘤对处理的反应(处理组中的DT5肿瘤体积变化和对照组中的DC5肿瘤体积变化)。用于异种移植的小鼠的总数为200只(对于20个PDX模型,10只小鼠/模型)。
GC肿瘤的EGFRIHC分析。将标准免疫组织化学(IHC)用于分析来自PDX异种移植物模型的肿瘤组织。简言之,按照标准组织学程序将组织固定在10%中性缓冲福尔马林中,随后包埋在石蜡中。在脱蜡和再水化后,在95uC下将3-mm厚的组织切片于0.01M柠檬酸钠(pH6.0)溶液中预处理30分钟,随后以15200的终稀释度用兔抗人EGFR抗体(CellSignaling,Boston,USA)进行染色。使用DetectionSystemHRPPolymer试剂盒(LabVision,Fremont,USA)检测阳性染色。将DAB用作显色底物,并用Gill’s苏木精(FisherScientific,FairLawn,NJ)对切片进行复染。随后按照由Shia等人在2005年推荐的标准由3个观察者以盲方式独立地对测试样本评分:当在肿瘤中不存在特异性膜染色时评分为0,并且当存在高于本底水平的肿瘤细胞膜的任何染色时为评分为正。基于膜的染色强度将正的案例进一步分类为11、21和31。通过在低倍(1003)下扫描肿瘤切片来鉴定强度最大的区域,随后在高放大倍数(4003)下,使用具有DP71数码相机(Olympus,Melville,NY)的OlympusBX51显微镜检查系统对图像进行照相。
GC-PDX的基因表达谱分析和基因拷贝数分析。从荷瘤小鼠收集新鲜GCPDX肿瘤组织,将其快速冷冻,并在用于遗传和基因组分析之前于280uC下贮存。关于基因谱分析,按照制造商的说明书使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)从冷冻组织分离总RNA,随后使用RNeasymini柱(Qiagen)进行纯化。在Bioanalyzer(Agilent)上评估RNA质量。按照标准方案(3’IVT表达试剂盒用户手册,P/N702646Rev.8,Affymetrix)只将具有高质量(RIN.8)的RNA样本用于在AffymetrixHG-U219阵列板上进行表达谱测定。通过RMA算法对所有样本的原始CEL数据集进行标准化。探针组强度表示为log(2)转化的值。对于使用AffymetrixSNP6.0芯片的CNV测定,按照制造商的说明书,使用基因组DNA组织和血液分离试剂盒(Qiagen)分离和纯化基因组DNA。按照标准Affymetrix方案(Genomewidesnp6_manual,Affymetrix)进行DNA处理和芯片杂交。将原始CEL数据进行QC化并过滤以除去低检出率样本,并且通过PICNIC和/或PennCNV法进行基因拷贝数分析。对于所有样本,通过定量RT-PCR测定相对EGFR基因表达水平。使用人EGFR特异性引物,通过TaqManq-PCR使提取的mRNA经历扩增。人GAPDH基因用作参照。从AppliedBiosystems获得EGFR的TaqMan探针和引物(测定ID:Hs01076078_ml)、GAPDH(测定ID:Hs99999905_ml)。使用DCT相对定量处理由系统产生的原始数据。DCT5(靶基因的CT值)-(参照基因的CT值)。随后将DCT值转化成强度值(相对mRNA水平52‘(2DCT)。同样地,也通过定量PCR测定EGFR基因拷贝数。简言之,通过TaqManq-PCR使相同基因组DNA经历扩增。EGFR的引物(测定ID:Hs04960197_cn)和RNA酶P(作为内源参照)(部分编号4401631)购自AppliedBiosystems。将原始数据传至CopyCaller软件并进行分析。
EGFR突变分析。进行与对西妥昔单抗的抗性相关的常见致癌基 因诸如EGFR(外显子18;19;20;21)、KRAS(外显子2;3;4)、BRAF(外显 子15;V600E)、c-MET(外显子14;16;17;18;19;21)、PI3KC(外显子1;9;20) 的基因热点分析以鉴定肿瘤中的突变。简言之,按照制造商的说明书, 使用上述试剂盒从组织提取基因组DNA。用于突变分析的引物示于 表5中。在50mL含有如下试剂的反应混合物中进行聚合酶链式反应: 100ng的基因组DNA、5mL103PCR缓冲液、0.2mM的每一种引物、 0.2mM43dNTP和1mLTaGE。将反应进行40个扩增循环。将扩增 的PCR产物进行凝胶纯化,并随后通过Sanger自动化测序仪(ABI) 进行测序。已通过BLAST搜索确保引物对人基因的特异性。使用 BioEdit软件进行测序数据比对分析和突变鉴定。
CFISH分析。按照制造商的方案(Abbott,DownersGrove,IL),使用AbbottPathVysionEGFRDNA探针试剂盒进行FISH(双色)程序。光谱橙色荧光团标记的EGFR(303kb)对于染色体7p12上的EGFR基因座是特异的,并且光谱绿色荧光团标记的染色体计数器探针(5.4kb)靶向位于染色体7的着丝粒区域(CEP7;7p11.1-q11.1)的α-卫星DNA序列。简言之,对FFPE切片进行脱蜡,随后用胃蛋白酶进行消化,并杂交。使经处理的载片变性,并与探针杂交,随后用15μLDAPI/抗褪色溶液进行复染,然后用配备有单带通滤波器组的OLYMPUSBX51荧光显微镜(OLYMPUSBX51,Japan)在1000倍下进行扫描,以检测DAPI、罗丹明(7p12)和FITC(染色体7)。
统计分析。使用学生t检验(对于两个比较)和单因素ANOVA检验(用于多重比较)评价肿瘤体积的数据。使用SPSS16.0分析所有数据。P<0.05被认为是统计上显著的。Fisher’s精确检验用于评估EGFR扩增模型与非扩增模型之间的反应差异(参见quantitativeskills.com/sisa/statistics/fisher.htm)。
结果
一个亚组的GC模型对西妥昔单抗起反应。我们开始通过进行用于评估潜在的西妥昔单抗活性的临床试验样研究来测试随机选择的GC-ADC模型的组群。这些模型首先通过皮下接种将从GC-ADC患者手术取出的肿瘤组织移植进免疫受损的Balb/c裸鼠来建立。原始患者诊断和描述概述于表2和表3中。第二,使19个随机选择的模型经历每周一次的西妥昔单抗处理,持续2周(1mg/小鼠或50mg/kg)。肿瘤对西妥昔单抗的反应通过ΔT/ΔC15来定量,并且概述于表4中。可按照活性将模型分成两类:4/19或21%的GC-ADC对西妥昔单抗处理起反应(几乎完全反应,ΔT/ΔC<0%);15/19或79%不起反应(具有部分或完全抗性,ΔT/ΔC>30%)。这两个种类的代表性肿瘤生长抑制曲线示于图1A中。通过ΔT/ΔC值测量的肿瘤反应的定量概述于表1A和表1B中。GA0152和GA0075是西妥昔单抗敏感模型的实例,然而GA0119和GA0139是抗性模型。在GC-ADC模型中看到这些相当不同的反应与我们在CRC17和NSCLC15 模型中观察到的反应有些不同。然而,我们的数据表明,一个亚组的GC可潜在地从西妥昔单抗获益。也值得指出的是,由于低于100%的移植物植入转化率(在我们手上通常为30至50%)和反应者或非反应者中的偏向性转化率的可能性,在该GC-ADC研究中观察到的21%的反应者可能不一定反映GC-ADC患者群体中的潜在反应者的真实百分比。
约50%的反应者展现EGFR基因扩增。为了发现西妥昔单抗反应的潜在预测性标志物,我们因此进行这些模型的分子表征,包括全基因组拷贝数变异和转录组特征谱分析,首先,我们使用Affymetrix全基因组人SNP6.0阵列和PICNIC(预测癌症中的积分拷贝数(PredictingIntegralCopyNumbersInCancer))算法调查GC-PDX的拷贝数变异。我们发现所有4个反应者的EGFR拷贝数高于大多数的那些非反应者(表1,P=0.002)。为了进一步确认该发现,我们通过实时定量PCR(q-PCR)评估EGFR基因拷贝数,并且发现所有反应者具有≥4的拷贝数,然而只16个非反应者中只有2个(12.5%)具有≥4的拷贝数。这两个组之间的差异是显著的(P=0.008)。通过SNP61PICNIC分析得到的最高值15和通过q-PCR得到的1040.9来自GA0152,共也是最佳反应者。
为了进一步确认EGFR基因扩增,我们还进行荧光原位杂交(FISH),一种用于测定HER2基因扩增以在临床实践中指导晚期GC的抗HER2治疗的更精确的测定。观察至少100个非重叠间期细胞核的EGFR的拷贝数。EGFR状态被评分为每细胞核EGFR信号的数目。我们的结果显示在2/4(50%)的分别具有5.8(GA0075)和.15(GA0152)的平均拷贝数的反应者中存在EGFR扩增(图1C,表1)。GA0152也具有.15的EGFR/CEP7比率。因此,2/4(50%)的反应者可通过EGFR扩增来预测。
随后通过进行单剂量药效分析研究,EGFR信号转导是否确实在这些肿瘤中被西妥昔单抗灭活。荷瘤动物首先用西妥昔单抗处理,随后在处理后6、24和72小时的时间点上收获肿瘤。作为实例,通过免疫化学分析(IHC)处理分析GA0022肿瘤组织的pERK(EGFR信号转导的下游效应子)。结果明确地显示肿瘤中pERK的减少(图1B),与相同模型中观察到抗肿瘤活性相关。
控制CRC的对西妥昔单抗反应的因子似乎对GC-ADC的反应没有显著贡献。为了发现观察到的GC-ADC的反应的预测性生物标志物,系统性分析该组群的模型的一些常见致癌基因的表达和基因拷贝数以及基因突变。激活突变,包括KRAS、BRAF(V600E)、c-MET、EGFR、AKT和PI3KC的突变与CRC患者的对西妥昔单抗的抗性相关15,17-21。因此,首先通过这些致癌基因的热点突变测序分析这些模型。有趣地,少数测试的模型,无论是反应者还是非反应者,显示除PIK3CA中的含G13D的GA0139和含327-329缺失的GA044外的任何突变(表1)。因此,GC对西妥昔单抗的无反应很明显不能简单地归因于这些致癌基因突变。
在单独的早期研究中,已观察到CRC对西妥昔单抗的反应依赖于RAS途径信号转导,或与低Loboda-RAS途径标签评分相关17,22。从而有趣地知道RAS信号转导途径或Loboda评分是否对GC反应具有相似影响。令我们惊讶的是,发现LobodaRAS途径标签评分与肿瘤反应几乎没有关系(参见图3),这表明RAS途径的活化状态对GC-ADC的对西妥昔单抗的反应或抗性的贡献没有在CRC中看到的大。
EGFR基因扩增似乎是一个亚组的对西妥昔单抗起反应的GC-ADC中的致癌驱动者。然而,在另一方面,AffymetixHG-U219GeneChip分析显示所有4个反应者表达高水平的EGFR(mRNA水平),并且所有15个弱反应者与较低水平的表达相关(图2A和2C,表1)。该观察似乎是似合理的,因为通过较高的表达获得的EGFR的较高活性可驱动这些肿瘤的致癌转化,从而通过西妥昔单抗的灭活可抑制肿瘤生长。
此外,使用AffymetrixSNP6分析,通过检查基因拷贝研究较高EGFR表达背后的遗传缺陷(图2B)。有趣地,所有反应者具有对应的EGFR基因扩增(图2A和2B)(表1,表4)(P-值<0.00026,按照Fisher’s精确检验)。该几近完美的关系表明EGFR基因扩增可能是反应者中的关键致癌驱动者,和用于预测GC-ADC中对西妥昔单抗的反应的潜在实用单一生物标志物。为了进一步确认基因扩增,我们还进行EGFR-荧光原位杂交,或FISH(一种临床实用测定),以评估所有这些模型的EGFR基因扩增状态。FISH数据确实确认了通过SNP6看到的观察。作为实例,GA152FISH分析明确地表明EGFR扩增。临床上接受的FISH程序使得能够在西妥昔单抗GC-ADC治疗的临床上开发用于西妥昔单抗治疗的伴随诊断。
表4.通过不同方法测定EGFR拷贝数
模型ID |
EGFR SNP6 PICNIC |
EGFR qPCR |
EGFR FISH |
GA0114 |
6 |
|
N/A |
GA2140 |
|
|
N/A |
GA0119 |
5 |
|
0.99 |
GA0139 |
5 |
1.06 |
|
GA0138 |
5 |
0.96 |
|
GA0037 |
5 |
1.50 |
|
GA0033 |
5 |
+0.64 |
|
GA0023 |
4 |
0.00 |
|
GA0080 |
6 |
0.94 |
|
GA0151 |
|
N/A |
|
GA0044 |
5 |
N/A |
|
GA0098 |
5 |
N/A |
|
GA0060 |
5 |
N/A |
+ |
GA0025 |
N/A |
0.32 |
|
GA0022 |
7 |
1.21 |
|
GA046 |
7 |
N/A |
|
GA0075 |
8 |
2.29 |
|
GA0152 |
15 |
8.22 |
|
阴影表示反应者
表5.用于突变分析的引物的小组。
所有反应者展现较高EGFRmRNA表达水平。在另一方面,使用AffymetrixHG-U219GeneChip进行的转录组特征谱分析显示所有4个反应者都表达比所有16个非反应者更高的水平的EGFRmRNA表达(P=0.003)(表1)。EGFR基因表达通过对比管家基因GAPDH的q-RT-PCR(定量反转录-PCR)来进一步定量。在所测试的样本中,4个展现高EGFRmRNA水平(相对强度≥0.5,任意定义的)的样本全都反应者,与显示中等至低EGFRmRNA水平(相对强度≤0.1)的剩余模型相反(表1,图1C)。差异是显著的(P=0.002)。具体地,最高值来自GA0152(10.5,通过GeneChip分析,和13,通过q-RT-PCR),其可归因于上述EGFR扩增。
所有反应者展现较高EGFR免疫组织化学评分。随后我们进行EGFR免疫组织化学(IHC),一种测定针对GC的抗HER2治疗的HER2表达的临床上实用的测定。IHC在12/20(60%)的模型中显示阳性EGFR免疫染色。在它们当中,6/12具有为11的染色强度评分,3/12具有为21的染色强度评分,以及3/12具有为31的染色强度评分。所有反应者中都发现EGFRIHC31,然而非反应者展示较低的EGFRIHC评分0-21(P50.002)(表1,图1C)。典型的EGFR强免疫染色(GA0152和GA0075)示于图1B中。这些结果表明EGFR高表达(在mRNA和蛋白质水平上)与对西妥昔单抗的反应相关。相关致癌基因的突变是罕见的。还已通过热点突变测序在这些模型中研究与EGFR途径相关的一些常见致癌基因例如KRAS、BRAF(V600E)、c-MET、EGFR、AKT和PI3KC的基因突变。有趣地,少数测试的模型,无论是反应者还是非反应者,都显示除PIK3CA中的含G13DKRAS突变的GA0139、含327-329缺失的GA0044和含G545YPIK3CA突变的GA0098外的任何异常(表1)。因此,GC异种移植物对西妥昔单抗的无反应很明显不能简单地归因于这些致癌基因突变。
讨论
本研究明确地表明,一个亚组的具有EGFR基因扩增和过表达的GC-ADC模型对西妥昔单抗起反应(4/4)。与此一致,在EXTRAII期试验中4个EGFR扩增的患者中有4个是针对西妥昔单抗与顺铂/卡培他滨的联合治疗反应者(NCT00477711)16,从而支持PDX模型的假定的预测能力和我们的假说:EGFR是西妥昔单抗GC-ADC治疗的预测性生物标志物。当数据变得可获得时,该假定还可通过回顾性检查最近在胃-食道癌中完成的III期试验EXPAND来确认。可在临床环境中常规地进行用于EGFR基因扩增的FISH,从而使得该方法能够用作比较诊断法。因此,可容易地实施此类前瞻性试验。最终的批准为GC-ADC患者提供了除了用于具有HER2基因扩增的患者的曲妥珠单抗以外的又一种靶向疗法。
然而在NSCLC(Yang等人,提交中)和CRC17 中未观察到在GC对西妥昔单抗的反应中所看到对EGFR基因扩增的重度依赖性,这表明不同癌症类型之间的巨大差异。非常有趣地,GC-ADC中的该EGFR依赖性以某种方式反映了GC-ADC中的曲妥珠单抗反应的Her2依赖性。该相似性为GC的西妥昔单抗治疗的伴随诊断(正如曲妥珠单抗的伴随诊断一样)提供了明确可行的开发途径。
另一个有趣的观察是具有EGFR过表达(也为基因扩增)的模型不具有HER2过表达(或基因扩增),并且反之亦然,即在单个模型中未观察到这两个基因的同时过表达(基因扩增)(参见图4A和4B)。该观察表明两个基因的扩增/过表达不驱动肿瘤形成。因此,合理的是,没有理由使用西妥昔单抗和曲妥珠单抗的组合来治疗GC患者。
我们的数据指向GC中的西妥昔单抗反应与mRNA和蛋白质水平上的EGFR高表达以及EGFR基因扩增之间的正相关。该相关通过具有最高EGFRmRNA表达、IHC评分和基因扩增的GA0152来举例说明。数据似乎表明通过更较高表达产生的EGFR的较高活性驱动这些肿瘤中的致癌转化,从而利用西妥昔单抗来使其失活,从而抑制肿瘤生长。EGFR的过表达在两种情况下可归因于基因扩增。
我们的数据还显示mRNA和蛋白质水平上的EGFR高表达与反应相关。然而,由于不在临床样本中常规地测定EGFR基因的mRNA表达,并且IHC可由于生物和技术因素的原因而具有争议,因此我们建议FISH与IHC测试的组合适合于作为常规临床实践(与抗HER2治疗的临床实践类似)来预测西妥昔单抗功效。
总之,我们的研究表明具有高EGFRmRNA表达和IHC评分的GC亚型可受益于西妥昔单抗治疗,并且通过FISH检测的EGFR基因扩增也可精确地预测反应者,阳性预测值约为50%。这些标志物对于将来指导潜在成功的临床试验和最终作为用于临床治疗的患者分层指导是有帮助的。
参考文献
1.KamangarF,DoresGM,AndersonWF.Patternsofcancerincidence,mortality,andprevalenceacrossfivecontinents:definingprioritiestoreducecancerdisparitiesindifferentgeographicregionsoftheworld.JClinOncol.2006May10;24(14):2137-50.
2.KelleyJR,DugganJM.Gastriccancerepidemiologyandriskfactors.JClinEpidemiol.2003Jan;56(1):1-9.
3.BangYJ,VanCutsemE,FeyereislovaA,ChungHC,ShenL,SawakiA,etal.TrastuzumabincombinationwithchemotherapyversuschemotherapyalonefortreatmentofHER2-positiveadvancedgastricorgastro-oesophagealjunctioncancer(ToGA):aphase3,open-label,randomisedcontrolledtrial.Lancet.2010Aug28;376(9742):687-97.
4.CiardielloF,TortoraG.EGFRantagonistsincancertreatment.NEnglJMed.2008Mar13;358(11):1160-74.
5.BonnerJA,HarariPM,GiraltJ,CohenRB,JonesCU,SurRK,etal.Radiotherapypluscetuximabforlocoregionallyadvancedheadandneckcancer:5-yearsurvivaldatafromaphase3randomisedtrial,andrelationbetweencetuximab-inducedrashandsurvival.LancetOncol.Jan;11(1):21-8.
6.PintoC,DiFabioF,BaroneC,SienaS,FalconeA,CascinuS,etal.PhaseIIstudyofcetuximabincombinationwithcisplatinanddocetaxelinpatientswithuntreatedadvancedgastricorgastro-oesophagealjunctionadenocarcinoma(DOCETUXstudy).BrJCancer.2009Oct20;101(8):1261-8.
7.PintoC,DiFabioF,SienaS,CascinuS,RojasLlimpeFL,CeccarelliC,etal.PhaseIIstudyofcetuximabincombinationwithFOLFIRIinpatientswithuntreatedadvancedgastricorgastroesophagealjunctionadenocarcinoma(FOLCETUXstudy).AnnOncol.2007Mar;18(3):510-7.
8.LordickF,LuberB,LorenzenS,Hegewisch-BeckerS,FolprechtG,WollE,etal.Cetuximabplusoxaliplatin/leucovorin/5-fluorouracilinfirst-linemetastaticgastriccancer:aphaseIIstudyoftheArbeitsgemeinschaftInternistischeOnkologie(AIO).BrJCancer.2010Feb2;102(3):500-5.
9.DingL,EllisMJ,LiS,LarsonDE,ChenK,WallisJW,etal.Genomeremodellinginabasal-likebreastcancermetastasisandxenograft.Nature.2010Apr15;464(7291):999-1005.
10.MarangoniE,Vincent-SalomonA,AugerN,DegeorgesA,AssayagF,deCremouxP,etal.Anewmodelofpatienttumor-derivedbreastcancerxenograftsforpreclinicalassays.ClinCancerRes.2007Jul1;13(13):3989-98.
11.NematiF,Sastre-GarauX,LaurentC,CouturierJ,MarianiP,DesjardinsL,etal.Establishmentandcharacterizationofapanelofhumanuvealmelanomaxenograftsderivedfromprimaryand/ormetastatictumors.ClinCancerRes.2010Apr15;16(8):2352-62.
12.NematiF,DanielC,ArveloF,LegrierME,FrogetB,LivartowskiA,etal.Clinicalrelevanceofhumancancerxenograftsasatoolforpreclinicalassessment:exampleofin-vivoevaluationoftopotecan-basedchemotherapyinapanelofhumansmall-celllungcancerxenografts.AnticancerDrugs.2010Jan;21(1):25-32.
13.FichtnerI,RolffJ,SoongR,HoffmannJ,HammerS,SommerA,etal.Establishmentofpatient-derivednon-smallcelllungcancerxenograftsasmodelsfortheidentificationofpredictivebiomarkers.ClinCancerRes.2008Oct15;14(20):6456-68.
14.HennesseyPT,OchsMF,MydlarzWW,HsuehW,CopeL,YuW,etal.Promotermethylationinheadandnecksquamouscellcarcinomacelllinesissignificantlydifferentthanmethylationinprimarytumorsandxenografts.PLoSOne.2011;6(5):e20584.
15.YangM,XiaomingSong,JianyunDeng,JieCai,TaipingChen,Jean-PierreWery,YiyouChenandQixiangLi.OvercomingdrugresistancewithtailoredtreatmentregimeninpatientderivedxenograftsfromAsianNSCLCpatientsresistanttoEGFRinhibitors.2012;Submitted.
16.ZhangX,JianmingXu,LinShen,LinYang,JunLiang,NongXu,YuxianBai6,JiejunWang.AMulticenterProspectivePhaseIIstudyofCetuximabwithCisplatin/CapecitabineforuntreatedpatientswithAdvancedGastricorEsophago-gastricAdenocarcinoma(EXTRAstudy).2012.
17.ChenD,PetraRoss-Macdonald,ShengGuo,,JieCai,RolfRyseck,CraigFairchild,HeshanideSilva,JianCao,AiqingHe,XiaomingSong,MengmengYang,JianyunDeng,TaipingChen1,Jean-PierreWery1,YiyouChen1andQixiangLi.CetuximabresponseinCRCpatient-derivedxenograftsispredictedbyRASpathwayactivationratherthanKRASmutationstatus.2012.
18.LievreA,BachetJB,LeCorreD,BoigeV,LandiB,EmileJF,etal.KRASmutationstatusispredictiveofresponsetocetuximabtherapyincolorectalcancer.CancerRes.2006Apr15;66(8):3992-5.
19.DeRoockW,ClaesB,BernasconiD,DeSchutterJ,BiesmansB,FountzilasG,etal.EffectsofKRAS,BRAF,NRAS,andPIK3CAmutationsontheefficacyofcetuximabpluschemotherapyinchemotherapy-refractorymetastaticcolorectalcancer:aretrospectiveconsortiumanalysis.LancetOncol.2010Aug;11(8):753-62.
20.DeRoockW,DeVriendtV,NormannoN,CiardielloF,TejparS.KRAS,BRAF,PIK3CA,andPTENmutations:implicationsfortargetedtherapiesinmetastaticcolorectalcancer.LancetOncol.2011Jun;12(6):594-603.
21.DiNicolantonioF,MartiniM,MolinariF,Sartore-BianchiA,ArenaS,SalettiP,etal.Wild-typeBRAFisrequiredforresponsetopanitumumaborcetuximabinmetastaticcolorectalcancer.JClinOncol.2008Dec10;26(35):5705-12.
22.LobodaA,NebozhynM,KlinghofferR,FrazierJ,ChastainM,ArthurW,etal.AgeneexpressionsignatureofRASpathwaydependencepredictsresponsetoPI3KandRASpathwayinhibitorsandexpandsthepopulationofRASpathwayactivatedtumors.BMCMedGenomics.2010;3:26.
23.Jemaletal.CA.CanerJ.Clin.61,69-90(2011)
24.Hanetal.,PhaseIIstudyandbiomarkeranalysisofcetuximabcombinedwithmodifiedFOLFOX6inadvancedgastriccancerBr.J.Cancer100,298-304(2009)
25.Kimetal.AprospectivephaseIIstudyofcetuximabincombinationwithXELOX(capecitabineandoxaliplatin)inpatientswithmetastaticand/orrecurrentadvancedgastriccancer.Invest.NewDrugs29,366-373(2011)
26.Lordicketal.Capecitabineandcisplatinwithorwithoutcetuimabforpatientswithpreviouslyuntreatedadvancedgastriccancer(EXPAND):arandomised,open-labelphase3trial.LancetOncol.14,490-499(2013)
27.Luberetal.Biomarkeranalysisofcetuximabpusoxaliplatin/leucovorin/5-fluorouracilinfirst-linemetastaticgastricandoesophago-gastricjunctioncancer:resultsfromaphaseIItrialoftheArbeitsgemeinschaftInternistischeOnkologie(AIO)BMCCancer11,509(2011)
28.Shiaetal.,Epidermalgrowthfactorreceptorexpressionandgeneamplificationincolorectalcarcinoma:animmunohistochemicalandchromogenicinsituhbridizationstudy.Mod.Pathol.