CN111926021A - 重组人norrin胱氨酸结生长因子表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种重组核酸，所述重组核酸含有编码人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核苷酸序列。本申请还涉及一种融合核酸、载体、药物制剂及其用途。

Description

重组人norrin胱氨酸结生长因子表达载体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种重组人norrin胱氨酸结生长因子表达载体及其应用。

背景技术

家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)是一种严重的遗传性玻璃体视网膜疾病。它是导致青少年视网膜脱离和致盲的原因之一。其典型表现为周边视网膜血管形成不完全、末梢毛细血管呈毛刷状。周边视网膜血管化不完全的患者可无任何眼部症状，当血管异常导致视网膜缺氧进一步发展时，可引起不同程度的病变及视力障碍。FEVR的遗传方式多样，已明确的FEVR致病基因存在于进化高度保守且在眼部结构的发育和新生血管形成中发挥重要作用的Wnt和Norrin-β-catenin信号通路中。目前，尚没有FEVR基因治疗方面的研究。因此，本领域亟需开发一种治疗有效的重组人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)表达体系及其应用。

发明内容

本申请提供了一种重组核酸，其含有编码人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核苷酸序列，且所述核苷酸序列包括至少一个选自下组的序列：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥99％相同性；

(c)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥98％相同性；

(d)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性；以及

(e)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥80％相同性，优选地≥85％相同性，更优选地≥90％相同性。

在某些实施方式中，所述核苷酸序列包括至少一个选自下组的序列：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥99％相同性；

(c)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥98％相同性；以及

(d)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性。

在某些实施方式中，所述重组核酸编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.:3所示。

本申请还提供了一种融合核酸，其包含如本申请所述的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3(I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为无、或5’-UTR序列；

Z2为如本申请所述的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

本申请还提供了一种载体，其含有如本申请所述的重组核酸或本申请所述的融合核酸。

在某些实施方式中，所述载体选自质粒或病毒载体。

在某些实施方式中，所述载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其组合。

在某些实施方式中，所述载体为AAV载体。

在某些实施方式中，所述载体的血清型选自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、或其组合。

在某些实施方式中，所述载体选自DNA病毒载体或逆转录病毒载体。

本申请还提供了一种如本申请所述的载体的用途，其用于制备制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。

本申请还提供了一种宿主细胞，其含有本申请所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本申请所述的重组核酸或本申请所述的融合核酸。

在某些实施方式中，所述宿主细胞选自293T细胞、感光细胞、其他视觉细胞、(视)神经细胞、或其组合。

在某些实施方式中，所述感光细胞为锥状细胞和/或杆状细胞，所述其他视觉细胞为双节细胞。

本申请还提供了一种药物制剂，其含有：

(a)本申请所述的载体，以及

(b)药学上可接受的药用载体和/或赋形剂。

在某些实施方式中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂以及其组合。

在某些实施方式中，药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹¹-1×10¹³个病毒/毫升,更佳地2×10¹¹-1×10¹²个病毒/毫升。

本申请还提供了如本申请所述的药物制剂的用途，其用于治疗眼部疾病，较佳地治疗视网膜病变。

在某些实施方式中，所述视网膜病变是遗传性视网膜病变，较佳地为常家族性渗出性视网膜病变FEVR。

在某些实施方式中，所述载体或药物制剂能显著提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性。

在某些实施方式中，所述载体或药物制剂能有效提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性长达3个月，优选地长达6个月。

本申请还提供了一种重组人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的制备方法，其包括步骤：培养本申请所述的宿主细胞，从而得到重组人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)。

本申请的重组核酸、融合核酸、载体、宿主细胞和/或药物制剂具有一种或多种以下效果：可以提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的转录和/或表达、可以用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病、可以治疗遗传性视网膜病变和/或可以治疗常家族性渗出性视网膜病变FEVR。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1显示的是序列优化后的本申请人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)核苷酸序列与野生型人norrin胱氨酸结生长因子核苷酸序列的开放阅读框序列比较。其中上行表示优化后的本申请核苷酸序列，下行为野生型核苷酸序列，”|”表示两者对应位点一致；两者的同源性为74％。

图2显示的是norrin胱氨酸结生长因子转录本的蛋白结构示意图。其中结构域A编码norrin胱氨酸结生长因子的信号肽域，结构域B编码norrin胱氨酸结生长因子的C-末端胱氨酸结构域。

图3显示的是对PCR产物电泳检测，从重组克隆中筛选出目的条带为1614bp左右的正确克隆。其中，泳道M为蛋白marker；泳道1为正确的重组腺相关病毒表达载体AAV-MCS-rAAV2/2-rhNDP。

图4显示的是本申请的重组腺相关病毒表达载体AAV-MCS-rAAV2/2-rhNDP的结构示意图。

图5显示的是SDS-PAGE电泳检测本申请重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP纯度的考马斯亮蓝染色结果。其中，泳道1为蛋白marker；泳道2为本申请重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP。

图6显示的是兔眼玻切镜下眼底拍照。其中图6A为对照组(rAAV2/2-ZsGreen)，其中图6B为实验组A(本申请rAAV2/2-rhNDP)。

图7显示的是显微镜下观察到的兔眼球HE切片内的视网膜。其中左图7A为实验组A(本申请rAAV2/2-rhNDP)，右图7B为对照组(rAAV2/2-ZsGreen)。

图8显示的是兔眼球视网膜的人norrin胱氨酸结生长因子的荧光定量PCR相对表达量提高倍数的检测结果。其中，实验组A为注射本申请rAAV2/2-rhNDP组，实验组B为注射野生型rAAV2/2-hNDP组，对照组为注射rAAV2/2-ZsGreen组。

图9显示的是家兔眼球视网膜的人norrin胱氨酸结生长因子的蛋白质免疫印迹检测的定量分析结果，实验组A为注射本申请rAAV2/2-rhNDP组，实验组B为注射野生型rAAV2/2-hNDP组，对照组为注射rAAV2/2-ZsGreen组。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“约”通常是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

在本申请中，术语“含有”或“包括(包含)”通常是指开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

在本申请中，序列“同一性”或“相同性”通常是通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列“同一性”或“相同性”的测量是本领域技术人员熟知的方法。例如，“同一性”可以指两个序列在特定的比较窗或区段范围内基于核苷酸对核苷酸比较的相关性。因此，同一性定义为两个DNA区段的相同链(正义链或反义链)之间的相同性、对应性或等同性的程度。“序列同一性百分数”是这样计算的：将两个进行最佳比对的序列在特定区域范围内进行比较；确定两个序列中出现相同碱基或氨基酸的位置的数量，以得到相匹配位置的数量；将这种位置的数量除以被比较区段中的位置总数，所得的商再乘以100。序列的最佳比对可以通过Smith&Waterman，Appl.Math.2：482(1981)的算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的算法、Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444(1988)的方法和执行相关算法的计算机程序(例如Clustal Macaw Pileup(Higgins etal.，CABIOS.5L151-153(1989))、FASTDB(Intelligenetics)、BLAST(National Center forBiomedical Information；Altschul et al.，Nucleic Acids Research 25：3389-3402(1997))、PILEUP(Genetics Computer Group，Madison，Wis)或GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics ComputerGroup，Madison，Wis)来进行。(参见美国专利5,912,120。)

在本申请中，术语“受试者”、“需要的对象”通常是指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、兔、大鼠、小鼠、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

在本申请中，术语“(重组)人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)”、“NDP(蛋白)”、“hNDP(蛋白)”、“多肽”、“本申请多肽”和“本申请蛋白”通常具有相同的意义，在本文可互换使用。NDP编码的Norrin是一个含有133个氨基酸且富含半胱氨酸的分泌蛋白。Norrin包括2个主要部分：一部分是位于蛋白质N端决定蛋白质定位的信号肽；另一部分是由6个半胱氨酸形成的特征性半胱氨酸结，是受体结合和后续信号转导所需的结构构象。例如，所述norrin胱氨酸结生长因子可以是如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

在本申请中，术语“家族性渗出性视网膜病变”或“FEVR”通常是指一种严重的遗传性玻璃体视网膜疾病。它是导致青少年视网膜脱离和致盲的原因之一。

在本申请中，术语“编码”通常是指多核苷酸例如基因、DNA或mRNA中特定核苷酸序列的固有性质，即所述序列可以充当模板，以在生物学过程中合成具有规定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或规定的氨基酸序列的其它聚合物和大分子以及由此导致的生物学性质。因此，当相应于基因的mRNA在细胞或其它生物学系统中的转录和翻译导致蛋白质产生时，则该基因、cDNA、或RNA可以编码该蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)两者都可以被称作编码蛋白、或该基因或cDNA的其它产物。例如，本申请的编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的基因可以用于在生物学过程中合成相应的mRNA和/或相应的多肽。

在本申请中，术语“配体”通常指特异性结合和或以反应方式结合或复合靶细胞或组织上的受体，底物，抗原决定簇或其它结合位点的任意分子。例如，配体可以包括卷曲蛋白受体4。

在本申请中，术语“信号通路”通常指当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象。例如，信号通路可以包含Wnt信号通路。例如，信号通路可以包含Norrin-β-catenin信号通路。

在本申请中，术语“结合”通常表示两个或多个生物分子或化合物之间的物理或化学相互作用。结合包括离子的、非离子的、氢键、范德瓦尔斯、疏水相互作用等。结合可以是直接的或间接的，间接是由于或通过另一生物分子或化合物的影响。直接结合指不是由于或通过另一生物分子或化合物的影响而发生的，而是没有其它实质上的化学中间物而发生的相互作用。例如，结合可以是一个分子的结构域与另一个分子的结构域直接结合。例如，结合可以是norrin胱氨酸结生长因子的结构域A与卷曲蛋白受体4结合。例如，norrin胱氨酸结生长因子的结构域A可以是6个半胱氨酸形成的特征性半胱氨酸结，所结合的卷曲蛋白受体4的结构域可以是N-末端半胱氨酸富集区域(CRD)。例如，编码用于norrin胱氨酸结生长因子与配体结合的结构域可以包含核苷酸序列为SEQ ID NO.:1所示的第39-132位的核苷酸序列的全长或片段，或具有≥80％同源性的其突变体。

在本申请中，术语“定位”通常是指蛋白质翻译表达之后，在所述蛋白质的结构域的存在下，使得所述蛋白质可以被分泌到细胞的特定位置。例如，特定位置可以是含不同膜结构的亚细胞器、细胞膜上和/或细胞外。例如，所述编码用于决定蛋白质定位的结构域可以包含核苷酸序列为SEQ ID NO.:1所示的第1-38位的核苷酸序列的全长或片段，或具有≥80％同源性的其突变体。

在本申请中，术语“载体”通常是指含本申请的重组核酸或融合核酸DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。构建载体的方法可以包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还可以包括翻译起始用的核糖体结合位点、调节序列和转录终止子。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。例如，包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者调节序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。例如，包含编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的序列的质粒载体和/或病毒载体。

在本申请中，术语“病毒载体”通常是指适用于在靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。例如靶细胞可以是视网膜靶细胞。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体：腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。例如，病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组，也可以整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核酸序列的病毒载体可以是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

在本申请中，术语“腺相关病毒(adeno-associated virus)”或“AAV”通常也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。末端的反向重复序列对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。腺相关病毒可以感染多种细胞。例如，腺相关病毒可以作为重组腺相关病毒载体，以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。腺相关病毒载体可采用本领域的标准方法制备，任何血清型的腺相关病毒均是合适的。复制缺陷重组腺相关病毒可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带腺相关病毒衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的腺相关病毒重组体。例如，重组腺相关病毒载体可以被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。例如，本申请的包含编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的序列的重组腺相关病毒载体。

在本申请中，术语“血清型”通常是指通过血清学方法对腺相关病毒衣壳表面的表位进行检测，并对腺相关病毒进行分型。腺相关病毒具有多种常见血清型，100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

在本申请中，术语“宿主细胞”通常可以是指原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子可以包含以下组：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。例如，选择293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。例如，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

在本申请中，术语“培养”通常可以是用常规方法培养宿主细胞，表达本申请的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本申请中，术语“得到”所述norrin胱氨酸结生长因子(NDP)通常可以是用常规方法获取宿主细胞表达的重组人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)。norrin胱氨酸结生长因子(NDP)可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本申请中，术语“重组核酸”可以是指重组人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)优化基因序列。重组人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)基因，其优化核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其大小为402bp，起始于密码子ATG，编码133个氨基酸，其中第1-38位可以为信号肽域的编码序列；第39-132位可以为C-末端胱氨酸结构域的编码序列。本申请的重组核酸可以是DNA形式或RNA形式。例如，所述重组核酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。

在本申请中，术语“融合核酸”通常可以是指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。例如，可以是所述的编码人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核酸可操作性地连接UTR序列。例如，可以是所述的编码人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核酸可操作性地连接启动子序列。例如，可以是所述的编码人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核酸可操作性地连接含有稳定结构的ployA序列。

在本申请中，术语“核苷酸连接序列”通常是指用于连接两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。例如，核苷酸连接序列可以是连接子。例如，连接子包含选自以下组长度的寡核苷酸：1-30个核苷酸、1-15个核苷酸和3-6个核苷酸。例如，连接子包含核苷酸接头序列，所述核苷酸接头序列由限制性内切酶EcoRI和/或SalI酶切形成。

在本申请中，术语“可操作地连接”可以是指核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

在本申请中，术语“表达”可以是指本申请的重组核酸、融合核酸、载体在宿主细胞中转录出目的RNA和/或翻译出目的蛋白。例如，目的蛋白可以是norrin胱氨酸结生长因子(NDP)。本申请提供的编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的重组核酸或融合核酸，可以体外或体内生产norrin胱氨酸结生长因子(NDP)或norrin胱氨酸结生长因子(NDP)融合蛋白，所述融合蛋白或者含所述融合蛋白的制剂可应用于制备治疗家族性渗出性视网膜病变FEVR。本申请经优化的编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核酸表达量更高，从而可以翻译出更多的norrin胱氨酸结生长因子(NDP)，而优化后的norrin胱氨酸结生长因子(NDP)可以更容易在人宿主细胞中表达。将含有本申请重组核酸、融合核酸、载体的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂可以在玻璃体腔内保持活力，并转染到视网膜细胞。本申请核酸可以编码比现有技术表达更多的norrin胱氨酸结生长因子(NDP)，可以合适地治疗家族性渗出性视网膜病变(FEVR)。

在本申请中，术语“治疗”通常是指试图改变所治疗的对象的自然进程的干预，并且可以用于预防进行或在临床病理学过程中进行。理想的效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，遏制，减少或抑制疾病的任何直接或间接病理后果，改善或缓解疾病状态，以及引起缓解或改善预后。例如，治疗眼部疾病可以是恢复受试者的视力，可以是增加或维持受试者视网膜神经纤维层厚度，可以是增加或维持受试者视网膜神经节细胞的数量。

在本申请中，术语“遗传性视网膜病变”通常是指由于遗传因素产生的视网膜异常的病变情况。例如，遗传方式可以为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X性连锁遗传。例如，遗传性视网膜病变可以是家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。例如，视网膜异常或视网膜病变可以包括但不限于视网膜皱褶、黄斑异位和视网膜脱离和/或伴发眼部继发性病变。

在本申请中，术语“逆转录病毒”通常是指感染分裂细胞的整合病毒。例如，本申请的逆转录病毒载体可由下列逆转录病毒构建而成：HIV、MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)、MSV(莫洛尼鼠肉瘤病毒)、HaSV(哈威肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳氏肉瘤病毒)、弗兰德(Friend)病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、慢病毒、或所公开的缺陷型逆转录病毒载体。

在本申请中，术语“DNA病毒载体”通常是指本领域技术人员已知的任何DNA病毒。例如，该DNA病毒载体感染哺乳动物细胞。例如，哺乳动物的实例可以包括实验用动物(如狗、猫、大鼠、小鼠和兔)、农场动物(如牛、马和羊)、以及灵长类(如猴子和人)。例如，DNA病毒可以为单链或双链DNA病毒。例如，DNA病毒可以是EB病毒(EBV)。例如，DNA病毒可以是Kaposi’s肉瘤相关疱疹病毒，也被称为疱疹病毒8(KSHV)。例如，DNA病毒可以是巨细胞病毒(HCMV)。

在本申请中，术语“整合”通常是指例如逆转录病毒在细胞感染之后，通过被称为逆转录的分子过程，从病毒粒子中携带的两个RNA分子产生双链DNA分子，之后该DNA共价地整合到宿主细胞基因组中，在细胞和/或病毒因子的帮助下表达所述病毒的基因。

在本申请中，术语“质粒”通常是指双链DNA的自包含式分子，容易接受额外(外源)DNA且容易引入到合适宿主细胞中。已描述了可在多种真核和原核宿主中复制和/或表达的许多载体，包括质粒和真菌载体。非限制性实例可以包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen，San Diego，Calif.)或pMAL质粒(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和许多适当的宿主细胞，其中使用本文公开或引用的方法或者相关领域技术人员已知的方法。

在本申请中，术语“药学上可接受的药用载体(carrier)”或“赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。相容性在此指的可以是组合物中各组份能和本申请的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体(carrier)部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

在本申请中，术语“药物制剂”或“组合物”可以是指具有安全有效量的活性成分和药学上可接受的药用载体(carrier)或赋形剂(excipient)的组合。例如，本申请所述药物组合物中的“活性成分”可以是指本申请所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。例如，本申请所述的活性成分、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。例如，本申请所述的“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。例如，本申请的药物制剂可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。例如，药物制剂可以是液体、可注射液体。例如，药物制剂可以是干粉、冻干制剂。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。例如，所述“药物制剂”或“组合物”可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，“药物制剂”或“组合物”作为可注射液体被提供。例如，可注射液体可以作为胶囊或注射器被提供。组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

发明详述

重组核酸

一方面，本申请提供一种重组核酸，所述重组核酸可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)或其截短体的核苷酸序列。所述norrin胱氨酸结生长因子可以包含SEQ IDNO.:3所示的氨基酸序列。

例如，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO.:1中的核苷酸序列。

例如，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含与SEQ ID NO.:1具有至少90％同源的核苷酸序列，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种核苷酸序列，并且所述核苷酸序列施用能够激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路和/或提高norrin胱氨酸结生长因子的表达。

例如，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含与SEQ ID NO.:1具有至少90％同源的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列，例如与至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种核苷酸序列完全互补，并且所述核苷酸序列施用能够激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路和/或提高norrin胱氨酸结生长因子的表达。

例如，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子截短体的核苷酸序列。

一方面，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子的截短体。例如，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子结构域B的核苷酸序列。例如，所述结构域B可以是norrin胱氨酸结生长因子的C-末端胱氨酸结构域，所述结构域B用于与其它信号分子进行结合以启动信号传导，例如可以激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。例如，编码所述结构域B的核苷酸序列为SEQ ID NO.:1所示的第39-132位的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列施用能够激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路和/或提高norrin胱氨酸结生长因子的表达。

一方面，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子的截短体。例如，所述编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子结构域A和结构域B的核苷酸序列。例如，所述结构域A可以是norrin胱氨酸结生长因子的信号肽域，所述结构域A引导表达的目的蛋白向分泌通路转移。例如，所述结构域B可以是norrin胱氨酸结生长因子的C-末端胱氨酸结构域，所述结构域B用于与其它信号分子进行结合以启动信号传导，例如可以激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。例如，编码所述结构域A的核苷酸序列为SEQ ID NO.:1所示的第1-38位的核苷酸序列，编码所述结构域B的核苷酸序列为SEQ ID NO.:1所示的第39-132位的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列施用能够激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路和/或提高norrin胱氨酸结生长因子的表达。

在另一方面，本申请提供一种重组核酸，所述重组核酸可以包含DNA、cDNA和/或mRNA。例如，所述重组核酸包含单链重组核酸和/或双链重组核酸。

在另一方面，本申请的重组核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或肽核酸(PNA)。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。例如，核酸序列将编码如本申请描述的norrin胱氨酸结生长因子。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。例如，本申请的核酸分子还可以不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

在另一方面，本申请的重组核酸相对于野生型编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列，转录水平可以有提高，表达量可以显著提高。

融合核酸

一方面，本申请提供一种融合核酸，所述融合核酸包含本申请所述的编码norrin胱氨酸结生长因子或其截短体的重组核酸。

在另一方面，所述融合核酸还可以包含一个或多个启动子序列。例如，所述启动子序列可以包含CMV。例如，所述启动子与所述重组核酸的核苷酸序列可以直接或间接连接。例如，所述启动子与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述启动子与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述启动子的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接。

在另一方面，所述融合核酸还可以包含一个或多个UTR序列。例如，所述UTR序列可以包含5’-UTR序列。例如，所述UTR序列可以包含3’-UTR序列。

在另一方面，所述启动子序列可以包含一个或多个5’-UTR序列。例如，所述5’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以直接或间接连接。例如，所述5’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述5’-UTR序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接。

在另一方面，所述启动子序列可以包含一个或多个3’-UTR序列。例如，所述3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以直接或间接连接。例如，所述3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述3’-UTR序列的5’端与所述重组核酸的核苷酸序列的3’端可以直接或间接连接。例如，所述3’-UTR序列可以包含polyA序列。

在另一方面，所述融合核酸还可以包含启动子序列和5’-UTR序列。例如，所述启动子序列和5’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以直接或间接连接。例如，所述启动子序列和5’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述启动子序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接，和5’-UTR序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接。

在另一方面，所述融合核酸还可以包含启动子序列和3’-UTR序列。例如，所述启动子序列和3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以直接或间接连接。例如，所述启动子序列和3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述启动子序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接，和3’-UTR序列的5’端与所述重组核酸的核苷酸序列的3’端可以直接或间接连接。例如，所述3’-UTR序列可以包含polyA序列。

在另一方面，所述融合核酸还可以包含启动子序列、5’-UTR序列和3’-UTR序列。例如，所述启动子序列、5’-UTR序列和3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以直接或间接连接。例如，所述启动子序列、5’-UTR序列和3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列可以可操作地连接。例如，所述启动子序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接，5’-UTR序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端可以直接或间接连接，和3’-UTR序列的5’端与所述重组核酸的核苷酸序列的3’端可以直接或间接连接。例如，所述3’-UTR序列可以包含polyA序列。

在另一方面，所述间接连接可以包含通过连接子连接。例如，所述连接子可以包含选自以下组长度的寡核苷酸：1-30个核苷酸、1-15个核苷酸和3-6个核苷酸。例如，所述连接子可以包含选自以下组长度的寡核苷酸：1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、8个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸。

例如，所述连接子可以包含核苷酸接头序列，所述核苷酸接头序列可以由限制性内切酶酶切形成。例如，所述限制性内切酶可以包含EcoRI和/或SalI。

载体

一方面，本申请提供一种载体，所述载体可以包含一个或多个本申请所述重组核酸和/或融合核酸的整体、截短体和/或其片段。例如，所述载体可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子的序列。

在另一方面，所述载体可以包含一个或多个启动子。启动子可以介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的来源可以是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。例如，可以是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。例如，启动子可以为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。例如，启动子可以为延伸生长因子-1α(EF-1α)。例如，也可使用其他组成型启动子序列，可以包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，可以包括但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本申请不应被限于组成型启动子的应用，诱导型启动子也可以被考虑为本申请的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当期望进行表达时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当期望不进行表达时关闭表达。诱导型启动子的例子可以包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。例如，一个或多个所述启动子可以为CMV、CAG和/或神经特异启动子SYN。例如所述启动子可以为CMV。

例如，所述一个或多个启动子CMV可以位于载体的任意位置，而且所述CMV能够启动所述norrin胱氨酸结生长因子的表达。例如，CMV可以位于编码norrin胱氨酸结生长因子的序列之前。

在另一方面，所述载体可以包含一个或多个增强子。例如，所述一个或多个增强子可以位于载体的任意位置，而且所述增强子能够增强norrin胱氨酸结生长因子的表达。例如，所述增强子可以位于靠近起始位点的上游和/或下游。

在另一方面，所述载体可以包含一个或多个转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点和/或同源重组位点。例如，所述载体可以包含一个或多个选择性标记的基因序列，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

例如，一个与多个所述转录终止信号、所述多腺苷酸化序列、所述复制起点、所述选择性标记、所述核酸限制性位点和/或所述同源重组位点可以与一个或多个启动子与一个或多个所述增强子可操作地连接。例如，所述转录终止信号、所述多腺苷酸化序列、所述复制起点、所述选择性标记、所述核酸限制性位点和/或所述同源重组位点可以位于靠近启动子和/或增强子的上游和/或下游。

在另一方面，许多表达载体可应用norrin胱氨酸结生长因子在哺乳动物细胞(较佳地为人)表达。例如，所述载体可以选自以下组：慢病毒载体、DNA病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。例如，所述载体可以选自腺相关病毒。例如，所属载体的血清型可以选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和/或AAVAnc80，或其变体及组合。例如，腺相关病毒可以选自AAV2、AAV5、AAV7和/或AAV8，或其组合。例如，腺相关病毒可以选自AAV2。

例如，所述AAV2载体可以是AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8或AAV2/9。例如，所述AAV2载体可以包含pAAV-RC5-Amp、RC8-cap、AAV2/8、AAV-helper-Amp、AAV-helper。例如，所述病毒载体包含质粒AAV-MCS。例如，所述病毒载体包含质粒AAV-MCS。

在另一方面，病毒载体可以被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。在没有辅助病毒诸如腺病毒的存在的情况下，野生型AAV的复制可以是非常低效率的。例如，重组的腺相关病毒的复制基因和/或衣壳基因可以以反式被提供在pRep/Cap质粒中。例如，仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被腺病毒或另一个质粒提供。例如，也可对慢病毒载体做出上述的修饰。

在另一方面，非病毒载体诸如质粒可与助剂联用以有利于载体被靶细胞的摄取。例如，助剂可以包括聚阳离子剂。例如，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本申请中使用的载体可以适于在体内或体外使用，并且可以适于在人类中使用。

宿主细胞

一方面，本申请提供一种宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以包含一个或多个本申请所述重组核酸、融合核酸的整体、截短体和/或其片段，和/或载体。例如，所述宿主细胞染色体中整合有外源的一个或多个本申请所述重组核酸、融合核酸的整体、截短体和/或其片段。

在另一方面，所述宿主细胞包含哺乳动物细胞。例如，所述宿主细胞包含人细胞。例如，所述宿主细胞可以包含293T细胞、感光细胞、其他视觉细胞和/或视神经细胞。例如，所述感光细胞可以包含锥状细胞(视锥细胞)和/或杆状细胞(视杆细胞)。例如，所述其他视觉细胞可以包含但不限于给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、Muller细胞、视网膜神经节细胞和/或无长突细胞。

药物制剂、治疗和制备药物用途

一方面，本申请提供一种药物制剂。例如，所述药物制剂可以包含一个或多个本申请的重组核酸、一个或多个本申请的融合核酸和/或一个或多个本申请的载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受载体或赋形剂可以是指不具有治疗活性且具有可接受的毒性的任何成分，例如配制药物产品中可以使用的缓冲剂、溶剂、张力物质(tonicityagent)、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或聚合物。例如，所述制剂可以为液体制剂。

例如，所述药物制剂可以包含一个或多个本申请的载体。例如，载体可以包含了重组核酸和/或融合核酸，所述的重组核酸可以包含编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列。

在另一方面，所述药物制剂包含一个本申请的载体。例如，所述载体的含量包含1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升。例如，所述载体的含量包含1×10¹¹-1×10¹³个病毒/毫升。例如，所述载体的含量包含2×10¹¹-1×10¹²个病毒/毫升。例如，所述载体的含量包含1×10⁹个病毒/毫升、1×10¹⁰个病毒/毫升、1×10¹¹个病毒/毫升、2×10¹¹个病毒/毫升、2×10¹¹个病毒/毫升、4×10¹¹个病毒/毫升、6×10¹¹个病毒/毫升、8×10¹¹个病毒/毫升、9×10¹¹个病毒/毫升、1×10¹²个病毒/毫升、2×10¹²个病毒/毫升、3×10¹²个病毒/毫升、5×10¹²个病毒/毫升、1×10¹³个病毒/毫升、1×10¹⁴个病毒/毫升、1×10¹⁵个病毒/毫升、1×10¹⁶个病毒/毫升。

例如，当所述药物制剂包含一个本申请的载体，所述药物制剂的给药方式可以是将一个所述载体施用于细胞或受试者。例如，当所述药物制剂包含两个或两个以上的本申请的载体，所述药物制剂的给药方式可以是将两个或两个以上的载体同时施用于细胞或受试者。例如，当所述药物制剂包含两个或两个以上的本申请的载体，所述药物制剂的给药方式可以是将两个或两个以上的载体按任意先后顺序施用于细胞或受试者。例如，所述药物制剂可以在眼内注射。例如，所述制剂可以在玻璃体腔注射。

在另一方面，本申请提供一种恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病的方法。例如，所述眼部疾病可以为视网膜病变。例如，所述视网膜病变可以为家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。例如，将本申请所述药物制剂施用于细胞或受试者。

在另一方面，本申请提供一种提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性的方法。例如，所述药物用于激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。例如，将本申请所述药物制剂施用于细胞或受试者。

在另一方面，本申请提供一种载体、重组核酸、融合核酸和/或药物制剂在制备药物中的用途。例如，所述药物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。例如，所述眼部疾病可以为视网膜病变。例如，所述视网膜病变可以为家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。例如，所述药物用于提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性。例如，所述药物用于激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。

在另一方面，本申请提供一种载体、重组核酸、融合核酸和/或药物制剂。例如，其用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。例如，所述眼部疾病可以为视网膜病变。例如，所述视网膜病变可以为家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。例如，其用于提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性。例如，所述药物用于激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。

例如，所述药物制剂可以引起所述norrin胱氨酸结生长因子(NDP)在视网膜细胞中的长效高表达。例如，所述高表达可以是指施用本申请所述药物制剂后，细胞或受试者体内norrin胱氨酸结生长因子表达量可以为未施用的1.1倍以上，1.3倍以上，1.5倍以上，两倍以上，三倍以上，五倍以上，十倍以上，二十倍以上，二十二倍以上，三十倍以上，五十倍以上，一百倍以上，五百倍以上，一千倍以上，或一千五百倍以上。例如，所述高表达可以是指施用本申请所述药物制剂后，细胞或受试者体内norrin胱氨酸结生长因子表达量可以为施用对照载体后表达量的1.1倍以上，1.3倍以上，1.5倍以上，两倍以上，三倍以上，五倍以上，十倍以上，二十倍以上，二十二倍以上，三十倍以上，五十倍以上，一百倍以上，五百倍以上，一千倍以上，或一千五百倍以上。例如，所述长效可以是指，在施用本申请的载体或药物制剂后，细胞或受试者体内相比未施用或施用对照载体可以在至少7天，至少15天，至少20天，至少30天，至少45天，至少60天，至少90天，或至少三个月，至少四个月，至少五个月，至少六个月的时间内维持该norrin胱氨酸结生长因子的高表达量。

例如，所述药物制剂可以长效激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。例如，所述激活可以是指施用本申请所述药物制剂后，细胞或受试者体内Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路下游蛋白的激活和/或抑制水平可以为未施用的1.1倍以上，1.3倍以上，1.5倍以上，两倍以上，三倍以上，五倍以上，十倍以上，二十倍以上，二十二倍以上，三十倍以上，五十倍以上，一百倍以上，五百倍以上，一千倍以上，或一千五百倍以上。例如，所述激活可以是指施用本申请所述药物制剂后，细胞或受试者体内Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路下游蛋白的激活和/或抑制水平可以为施用对照载体后表达量的1.1倍以上，1.3倍以上，1.5倍以上，两倍以上，三倍以上，五倍以上，十倍以上，二十倍以上，二十二倍以上，三十倍以上，五十倍以上，一百倍以上，五百倍以上，一千倍以上，或一千五百倍以上。例如，所述长效可以是指，在施用本申请的载体或药物制剂后，细胞或受试者体内相比未施用或施用对照载体可以在至少7天，至少15天，至少20天，至少30天，至少45天，至少60天，至少90天，或至少三个月，至少四个月，至少五个月，至少六个月的时间内维持上述Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路下游蛋白的激活和/或抑制水平。

例如，所述药物制剂在眼内注射可以不引起受试者明显的炎症反应或其他并发症。例如，所述炎症反应或其他并发症可以是眼压升高、结膜充血，眼部炎症，眼底出血者或晶体发白损伤，眼分泌物增多和/或眼内炎。

在本申请中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴；例如，所述受试者可以包括DBA/2J小鼠。在本申请中，所述细胞可以包含细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞、293T细胞。

制备方法

一方面，本申请提供了一种制备norrin胱氨酸结生长因子的方法。例如，可以通过用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得本申请的重组核酸和/或融合核酸的核苷酸全长序列或其片段。例如，对于PCR扩增法，可以根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。例如，当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，可以完全通过化学合成来得到编码norrin胱氨酸结生长因子的DNA序列，然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。例如，本申请的重组核酸、融合核酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

在另一方面，在获得本申请的序列后，可以用重组法来大批量地获得所述序列。例如，可以将其克隆入载体，再转入宿主细胞，然后通过常规培养和分离方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。例如，还可以用人工合成的方法来合成有关序列，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。例如，可以通过应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法获得本申请的核酸序列。用于PCR的引物可根据本文所公开的本申请的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

在另一方面，可以利用常规技术将本申请的编码norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列导入宿主细胞(如哺乳动物细胞)。例如，包括将本申请的重组核酸、融合核酸或载体转导入宿主细胞内。例如，获得的宿主细胞可以用常规方法培养，表达本申请的基因所编码的norrin胱氨酸结生长因子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养，当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，可以用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在另一方面，所述norrin胱氨酸结生长因子可在宿主细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。例如，可利用norrin胱氨酸结生长因子物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法进行分离和纯化。这些本领域技术人员所熟知方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本申请还提供以下的实施方式：

1.一种重组核酸，其包含编码norrin胱氨酸结生长因子(NDP)全长或其截短体的核苷酸序列，所述norrin胱氨酸结生长因子(NDP)全长或其截短体包含norrin胱氨酸结生长因子的结构域B，编码所述结构域B的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列具有≥99％同源性的核苷酸序列；

c)与SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列具有≥98％同源性的核苷酸序列；

d)与SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列具有≥95％同源性的核苷酸序列；

e)与SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列；

f)与SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列具有≥85％同源性的核苷酸序列；

以及

g)与SEQ ID NO.:1所示第39-132位的核苷酸序列具有≥80％同源性的核苷酸序列。

2.根据实施方式1所述的重组核酸，所述结构域B用于结合配体以激活信号通路。

3.根据实施方式2所述的重组核酸，所述配体包含卷曲蛋白受体4。

4.根据实施方式2-3中任一项所述的重组核酸，所述结构域B与所述配体的N-末端半胱氨酸富集区域(CRD)结合。

5.根据实施方式2-4中任一项所述的重组核酸，所述激活信号通路包含Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。

6.根据实施方式1-5中任一项所述的重组核酸，所述截短体包含norrin胱氨酸结生长因子的结构域A和结构域B，编码所述结构域A的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列具有≥99％同源性的核苷酸序列；

c)与SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列具有≥98％同源性的核苷酸序列；

d)与SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列具有≥95％同源性的核苷酸序列；

e)与SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列；

f)与SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列具有≥85％同源性的核苷酸序列；

以及

g)与SEQ ID NO.:1所示第1-38位的核苷酸序列具有≥80％同源性的核苷酸序列。

7.根据实施方式6所述的重组核酸，所述结构域A用于决定所述norrin胱氨酸结生长因子表达后的定位。

8.根据实施方式7所述的重组核酸，所述定位包含所述norrin胱氨酸结生长因子表达后分泌到细胞的特定位置。

9.根据实施方式8所述的重组核酸，所述特定位置包含细胞膜上和/或细胞膜外。

10.根据实施方式1-9中任一项所述的重组核酸，其包含选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥99％同源性的核苷酸序列；

c)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥98％同源性的核苷酸序列；

d)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥95％同源性的核苷酸序列；

e)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列；

f)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥85％同源性的核苷酸序列；以及

g)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥80％同源性的核苷酸序列。

11.根据实施方式1-10中任一项所述的重组核酸，其包含与选自以下组的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥99％同源性的核苷酸序列；

c)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥98％同源性的核苷酸序列；

d)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥95％同源性的核苷酸序列；

e)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列；

f)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥85％同源性的核苷酸序列；以及

g)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有≥80％同源性的核苷酸序列。

12.根据实施方式1-11中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸包含DNA、cDNA和/或mRNA。

13.根据实施方式1-12中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸包含单链重组核酸和/或双链重组核酸。

14.一种融合核酸，其包含实施方式1-13中任一项所述的重组核酸的核苷酸序列。

15.根据实施方式14所述的融合核酸，其包含启动子序列。

16.根据实施方式15所述的融合核酸，所述启动子包含CMV。

17.根据实施方式15-16中任一项所述的融合核酸，所述启动子与所述重组核酸的核苷酸序列直接或间接连接。

18.根据实施方式15-17中任一项所述的融合核酸，所述启动子的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端直接或间接连接。

19.根据实施方式14-18中任一项所述的融合核酸，其包含UTR序列。

20.根据实施方式14-19中任一项所述的融合核酸，其包含5’-UTR序列。

21.根据实施方式20所述的融合核酸，所述5’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列直接或间接连接。

22.根据实施方式20-21中任一项所述的融合核酸，所述5’-UTR序列的3’端与所述重组核酸的核苷酸序列的5’端直接或间接连接。

23.根据实施方式14-22中任一项所述的融合核酸，其包含3’-UTR序列。

24.根据实施方式23所述的融合核酸，所述3’-UTR序列包含polyA序列。

25.根据实施方式23-24中任一项所述的融合核酸，所述3’-UTR序列与所述重组核酸的核苷酸序列直接或间接连接。

26.根据实施方式23-25中任一项所述的融合核酸，所述3’-UTR序列的5’端与所述重组核酸的核苷酸序列的3’端直接或间接连接。

27.根据实施方式17-26中任一项所述的融合核酸，所述间接连接包含通过连接子连接。

28.根据实施方式27所述的融合核酸，所述连接子包含选自以下组长度的寡核苷酸：1-30个核苷酸、1-15个核苷酸和3-6个核苷酸。

29.根据实施方式27-28中任一项所述的融合核酸，所述连接子包含核苷酸接头序列，所述核苷酸接头序列由限制性内切酶酶切形成。

30.根据实施方式29所述的融合核酸，所述限制性内切酶包含EcoRI和/或SalI。

31.一种载体，其包含实施方式1-13中任一项所述的重组核酸和/或实施方式14-30中任一项所述的融合核酸。

32.根据实施方式31所述的载体，其包含启动子。

33.根据实施方式32所述的载体，所述启动子与所述重组核酸和/或所述融合核酸的核苷酸序列可操作地连接。

34.根据实施方式31-33中任一项所述的载体，其包含增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点和/或同源重组位点。

35.根据实施方式34所述的载体，所述启动子与所述增强子、所述转录终止信号、所述多腺苷酸化序列、所述复制起点、所述选择性标记、所述核酸限制性位点和/或所述同源重组位点可操作地连接。

36.根据实施方式31-35中任一项所述的载体，其包括质粒和/或病毒载体。

37.根据实施方式36所述的载体，其中所述病毒载体慢病毒载体、DNA病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

38.根据实施方式36-37中任一项所述的载体，其中所述病毒载体为腺相关病毒，所述腺相关病毒具备选自以下组的血清型：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10。

39.根据实施方式36-38中任一项所述的载体，其中所述病毒载体包含质粒AAV-MCS。

40.根据实施方式31-39中任一项所述的载体，所述载体用于表达norrin胱氨酸结生长因子。

41.一种分离的细胞，其包含实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸和/或实施方式31-40中任一项所述的载体，或所述细胞染色体中整合有外源的如实施方式1-13中任一项所述的重组核酸或实施方式14-30中所述的融合核酸。

42.根据实施方式41所述的细胞，其包含哺乳动物细胞。

43.根据实施方式42所述的细胞，所述哺乳动物包含人。

44.根据实施方式41-43中任一项所述的细胞，其选自以下组：293T细胞、感光细胞、双节细胞和视神经细胞。

45.根据实施方式44所述的细胞，所述感光细胞包含锥状细胞和/或杆状细胞。

46.根据实施方式41-45中任一项所述的细胞，其选自以下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、视网膜神经节细胞和无长突细胞。

47.一种药物制剂，其包含实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸和/或实施方式31-40中任一项所述的载体，以及药学上可接受的佐剂。

48.根据实施方式47所述的药物制剂，其包含冻干制剂和/或液体制剂。

49.根据实施方式47-48中任一项所述的药物制剂，其中所述载体的含量包含1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升。

50.根据实施方式47-49中任一项所述的药物制剂，其中所述载体的含量包含1×10¹¹-1×10¹³个病毒/毫升。

51.根据实施方式47-50中任一项所述的药物制剂，其中所述载体的含量包含2×10¹¹-1×10¹²个病毒/毫升。

52.根据实施方式47-51中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂用于治疗眼部疾病，所述眼部疾病包含家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。

53.根据实施方式47-52中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂用于提高眼球norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性。

54.根据实施方式47-53中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂用于提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达至本底表达的三倍或超过三倍。

55.根据实施方式47-54中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂用于提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达至本底表达的五倍或超过五倍。

56.一种长期提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸、实施方式31-40中任一项所述的载体和/或实施方式47-55中任一项所述的药物制剂。

57.根据实施方式56所述的方法，所述载体包含腺相关病毒载体。

58.根据实施方式56-57中任一项所述的方法，所述方法激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。

59.一种应用，所述应用包括向有需要的对象施用治疗有效量的实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸、实施方式31-40中任一项所述的载体和/或实施方式47-55中任一项所述的药物制剂。

60.根据实施方式59所述的应用，所述应用包含治疗眼部疾病。

61.根据实施方式60所述的应用，所述眼部疾病包含治疗家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。

62.根据实施方式61所述的应用，所述家族性渗出性玻璃体视网膜病变由norrin胱氨酸结生长因子突变引起。

63.根据实施方式59-62中任一项所述的应用，所述载体包含腺相关病毒载体。

64.根据实施方式59-63中任一项所述的应用，所述重组核酸、所述融合核酸、所述载体和/或所述药物制剂在眼内注射。

65.根据实施方式64所述的应用，所述眼内注射包含玻璃体腔内注射。

66.根据实施方式59-65中任一项所述的应用，所述对象包含人和非人哺乳动物。

67.根据实施方式59-66中任一项所述的应用，所述应用提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性。

68.根据实施方式59-67中任一项所述的应用，所述应用提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性3个月或超过3个月。

69.根据实施方式59-68中任一项所述的应用，所述应用提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性6个月或超过6个月。

70.根据实施方式59-69中任一项所述的应用，所述应用激活Wnt信号通路和/或Norrin-β-catenin信号通路。

71.实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸和/或实施方式31-40中任一项所述的载体在制备药物中的用途，其中所述药物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。

72.根据实施方式71所述的用途，所述眼部疾病包含视网膜病变。

73.根据实施方式72所述的用途，所述眼部疾病包含家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。

74.一种实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸和/或实施方式31-40中任一项所述的载体，其用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。

75.一种实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸和/或实施方式31-40中任一项所述的载体，其用于治疗视网膜病变。

76.一种实施方式1-13中任一项所述的重组核酸、实施方式14-30中任一项所述的融合核酸和/或实施方式31-40中任一项所述的载体，其用于治疗家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1病毒载体构建及其病毒包装纯化

本申请对野生型申请人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的基因序列进行优化，未优化的野生DNA编码序列的表达量很低。通过所述序列优化，并经过分析和试验筛选，获得了本申请的编码人norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列。其中，人norrin胱氨酸结生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，野生型编码人norrin胱氨酸结生长因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示，本申请经过序列优化的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

如图1所示，经过序列比对的本申请的重组核酸与野生型核苷酸序列的序列相似度为74％。如图2所示，所述norrin胱氨酸结生长因子转录本的蛋白结构示意图。其中结构域A编码norrin胱氨酸结生长因子的信号肽域，结构域B编码norrin胱氨酸结生长因子的C-末端胱氨酸结构域。

病毒载体构建。将本申请的重组人norrin胱氨酸结生长因子基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)加EcoRI和SalI两个酶切位点，以该新基因设计引物用PCR扩增，获得的产物与AAV-MCS质粒载体分别进行EcoRI和SalI双酶切，回收酶切产物，T4 DNA连接酶(Ligase)连接过夜。连接产物转化感受态细胞得到重组腺相关病毒表达载体。

重组子的筛选和鉴定。取LB平板涂布得到的重组腺相关病毒表达载体，37℃培养后出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有氨苄青霉素(Amp)浓度为100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200转/分钟培养8小时。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照提取试剂盒(Biomiga)及说明书。取1微升质粒作为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序如表1所示。

表1 PCR扩增程序

所述特异性引物为：

正向引物(1F):5’-ttggcaaagaattgggattc-3’(序列如SEQ ID NO.:4所示)；

反向引物(1R):5’-acccgtagatctctcgagca-3’(序列如SEQ ID NO.:5所示)。

如图3所示，对PCR产物电泳检测，得到一个大小约450bp左右的目的条带。该鉴定结果表明该克隆中含有目的基因。

菌液保存及PCR扩增及其片段测序。吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1:3比例混匀，于-80℃保存，进行菌液测序。将测序得到的序列与重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因比对分析。成功得到序列正确的重组腺相关病毒表达载体AAV-MCS-rAAV2/2-rhNDP。

如图4所示，所述表达载体AAV-MCS-rAAV2/2-rhNDP的结构示意图。

重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP包被。转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞，培养基为加入含10％牛血清的DMEM，置37℃含5％的CO₂的培养箱中培养过夜；转染当天细胞换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒(Invitrogen)进行转染，具体步骤为：每个转染瓶取pAdHelper(BioVector)、pAAV-r2c5(BioVector)、本申请的AAV-MCS-rAAV2/2-rhNDP质粒按说明书要求比例混合，与加入DMEM的PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15分钟；将A试剂同30mL含10％牛血清的DMEM混合均匀，编号B试剂；将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％的CO₂的培养箱中继续培养；转染16小时后，换含10％牛血清的DMEM的培养基。转染48小时后，收取细胞，将收取的细胞用PBS重悬，并反复冻融3次，获得本申请所述含有病毒载体rAAV2/2-rhNDP的细胞。

重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP的纯化与浓缩。采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP。

病毒纯度验证。灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶，分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带。

如图5所示，重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP条带清晰，比例正常，无可见杂带，纯度在99％以上。

重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP的滴度测定采用荧光定量PCR方法。实验材料：SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)，包装病毒用目的质粒准确定量，对待测病毒进行荧光定量检测，在PCR八联管(Bio-red)中PCR反应条件为预变性：95℃10分钟；循环：95℃15秒，60℃1分钟。最终确定重组腺相关病毒rAAV2/2-rhNDP基因组滴度为1×1012vg/mL。

参考以上方法，构建、分离纯化表达野生型人norrin胱氨酸结生长因子的病毒载体rAAV2/2-hNDP。

实施例2兔玻璃体腔注射实验

取24只兔子分为3组，分为实验组A(本申请rAAV2/2-rhNDP)、实验组B(野生型rAAV2/2-hNDP)和对照组(rAAV2/2-ZsGreen，来源：山东维真生物科技有限公司)，分别吸取50微升的1×10¹²vg/mL的rAAV2/2-rhNDP、rAAV2/2-hNDP和rAAV2/2-ZsGreen在距角膜缘外3毫米处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。各组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。

如图6所示，术后一个月的眼底照相，结果显示所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害，表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

如图7所示，苏木精-伊红染色法(HE)检测术后一个月的实验组A(本申请rAAV2/2-rhNDP)、实验组B(野生型rAAV2/2-hNDP)和对照组(rAAV2/2-ZsGreen)兔眼球切片中兔视网膜神经节细胞数量。结果显示实验组A(结果如图7A所示)和对照组(结果如图7B所示)的视网膜神经节细胞数量基本一样，且结构完整，表明本申请病毒载体rAAV2/2-rhNDP是安全的，没有对视网膜造成损伤。

实时荧光定量PCR检测人norrin胱氨酸结生长因子的表达。利用TRIZOL试剂盒提取实验组A(本申请rAAV2/2-rhNDP)、实验组B(野生型rAAV2/2-hNDP)和对照组(rAAV2/2-ZsGreen)兔子视网膜的总RNA并反转录合成cDNA模板。然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物(兔-actin作为内参)：

兔-actin-正向引物：CCTTCTACAACGAGCTGCGC(序列如SEQ ID NO.:6所示)；

兔-actin-反向引物：TACAGGGACAGCACGGCC(序列如SEQ ID NO.:7所示)；

hNDP-正向引物：TGTCGTTCAGCACTGTCCTC(序列如SEQ ID NO.:8所示)；

hNDP-反向引物：GATGTACCGGTAGGTGGCAG(序列如SEQ ID NO.:9所示)；

rhNDP-正向引物：CTCAAGCAGCCTTTTCGCAG(序列如SEQ ID NO.:10所示)；

rhNDP-反向引物：TTCGCAATGGCAACTCAGGA(序列如SEQ ID NO.:11所示)。

荧光定量PCR的反应。在实时荧光定量PCR仪器(Real-time PCR DetectionSystem)上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix 12.5微升、ddH₂O 8微升，一对引物各1微升，cDNA样品2.5微升，总体系25微升。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。按照95℃预变性1秒，94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸45秒，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。采用相对定量方法研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。

如图8所示，实验组A、实验组B的基因mRNA的相对表达量均比对照组高，实验组A的mRNA的水平相对表达水平比实验组B高。表明本申请病毒载体rAAV2/2-rhNDP在视网膜上的norrin胱氨酸结生长因子表达量明显高于野生型，提高了4倍。

蛋白质免疫印迹(Western blot)检测人norrin胱氨酸结生长因子的表达。一抗兔源抗人norrin胱氨酸结生长因子，来源sigma，二抗为山羊抗兔，来源sigma。分离实验组A(本申请rAAV2/2-rhNDP)、实验组B(野生型rAAV2/2-hNDP)和对照组(rAAV2/2-ZsGreen)的家兔眼球的视网膜，按100微升/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液，匀浆器匀浆后离心收取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50微克计算各组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质免疫印迹检测。抗体孵育后进行化学发光试剂(ECL)显影。

如图9所示，实验组A的人norrin胱氨酸结生长因子相对表达水平明显高于实验组B和对照组，有显著差异P＞0.05，表明实验组A视网膜上人norrin胱氨酸结生长因子的表达水平明显提高，相对于实验组B和对照组分别提高了约3倍和6倍。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 重组人norrin胱氨酸结生长因子表达载体及其应用

<130> 0179-PA-005

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> rhNDP

<400> 1

atgagaaagc atgtactggc agccagcttt tctatgctca gccttctggt tatcatgggg 60

gacaccgatt ctaagaccga ttctagcttt atcatggact ctgacccacg gaggtgcatg 120

cggcatcact acgtggactc aatcagccac cctctttaca agtgcagcag caaaatggtg 180

ctcctggcaa ggtgcgaggg tcattgtagc caggcatcta ggagtgagcc tctggtgtca 240

tttagcaccg tgctcaagca gccttttcgc agtagttgcc actgctgccg gcctcagacc 300

agcaaattga aggcacttag gctccgctgt agcggcggta tgaggctgac cgctacatac 360

aggtatatcc tgagttgcca ttgcgaagag tgcaactcct ga 402

<210> 2

<211> 402

<212> DNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 2

atgagaaaac atgtactagc tgcatccttt tctatgctct ccctgctggt gataatggga 60

gatacagaca gtaaaacgga cagctcattc ataatggact cggaccctcg acgctgcatg 120

aggcaccact atgtggattc tatcagtcac ccattgtaca agtgtagctc aaagatggtg 180

ctcctggcca ggtgcgaggg gcactgcagc caggcgtcac gctccgagcc tttggtgtcg 240

ttcagcactg tcctcaagca acccttccgt tcctcctgtc actgctgccg gccccagact 300

tccaagctga aggcactgcg gctgcgatgc tcagggggca tgcgactcac tgccacctac 360

cggtacatcc tctcctgtca ctgcgaggaa tgcaattcct ga 402

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 3

Met Arg Lys His Val Leu Ala Ala Ser Phe Ser Met Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Val Ile Met Gly Asp Thr Asp Ser Lys Thr Asp Ser Ser Phe Ile Met

20 25 30

Asp Ser Asp Pro Arg Arg Cys Met Arg His His Tyr Val Asp Ser Ile

35 40 45

Ser His Pro Leu Tyr Lys Cys Ser Ser Lys Met Val Leu Leu Ala Arg

50 55 60

Cys Glu Gly His Cys Ser Gln Ala Ser Arg Ser Glu Pro Leu Val Ser

65 70 75 80

Phe Ser Thr Val Leu Lys Gln Pro Phe Arg Ser Ser Cys His Cys Cys

85 90 95

Arg Pro Gln Thr Ser Lys Leu Lys Ala Leu Arg Leu Arg Cys Ser Gly

100 105 110

Gly Met Arg Leu Thr Ala Thr Tyr Arg Tyr Ile Leu Ser Cys His Cys

115 120 125

Glu Glu Cys Asn Ser

130

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 1F

<400> 4

ttggcaaaga attgggattc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 1R

<400> 5

acccgtagat ctctcgagca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> actin-F

<400> 6

ccttctacaa cgagctgcgc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> actin-R

<400> 7

tacagggaca gcacggcc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hNDP-F

<400> 8

tgtcgttcag cactgtcctc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hNDP-R

<400> 9

gatgtaccgg taggtggcag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> rhNDP-F

<400> 10

ctcaagcagc cttttcgcag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> rhNDP-R

<400> 11

ttcgcaatgg caactcagga 20

Claims (18)

1.一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸含有编码人norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的核苷酸序列，且所述核苷酸序列包括至少一个选自下组的序列：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥99％相同性；

(c)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥98％相同性；

(d)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性；以及

(e)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥80％相同性，优选地≥85％相同性，更优选地≥90％相同性。

2.如权利要求1所述的重组核酸，其编码的蛋白质如SEQ ID NO.:3所示。

3.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1-2任一项所述的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为无、或5’-UTR序列；

Z2为如权利要求1-3任一项所述的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1-2任一项所述的核苷酸序列或权利要求3-4任一项所述的融合核酸。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体选自质粒或病毒载体。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其组合。

8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述载体为AAV载体。

9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，血清型选自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或其组合。

10.如权利要求5-9任一项所述的载体，其特征在于，所述载体选自DNA病毒载体或逆转录病毒载体。

11.如权利要求5-10任一项所述的载体的用途，其特征在于，用于制备制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。

12.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有：

(a)权利要求5-10任一项所述的载体，以及

(b)药学上可接受的药用载体和/或赋形剂。

13.如权利要求12所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂以及其组合。

14.如权利要求12-13任一项所述的药物制剂，其特征在于，药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹¹-1×10¹³个病毒/毫升，更佳地2×10¹¹-1×10¹²个病毒/毫升。

15.如权利要求12-14任一项所述的药物制剂的用途，其特征在于，用于治疗眼部疾病，较佳地治疗视网膜病变。

16.如权利要求15所述的药物制剂的用途，其特征在于，所述视网膜病变是遗传性视网膜病变，较佳地为家族性渗出性视网膜病变FEVR。

17.如权利要求11、15-16任一项所述的用途，其特征在于，所述载体或药物制剂能显著提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性。

18.如权利要求11，15-17任一项所述的用途，其特征在于，所述载体或药物制剂能有效提高norrin胱氨酸结生长因子(NDP)的表达和/或活性长达3个月，优选地长达6个月。

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