CN110891593A

CN110891593A - 基因的norrin诱导表达及其治疗疾病的用途

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Publication number: CN110891593A
Application number: CN201880044645.1A
Authority: CN
Inventors: 文德林·戴利; 肯尼思·米顿; 金伯利·迪恩森; 迈克尔·T·崔斯
Original assignee: Ritnor Solutions LLC
Current assignee: Ritnor Solutions LLC
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2020-03-17
Also published as: WO2018204909A3; WO2018204909A2; EP3618851A2; JP2023027172A; EP3618851A4; US20200268838A1; JP2020518675A; KR20200015523A

Abstract

提供了一种增加基因CASP3和THBD的表达并降低基因COL18A1、CPB2、NPR1、OCLN、BMP2、CLCL6、IL12B、SELPLG、CX3CL1、CASP3、THBD、COL18A1、CPB2、NPR1、CLDN5、CLD3、PIGF、BDNF、CNTF、VEGF‑A、CAM‑1、PGF、FOX‑01、FOX‑04、PDGFB、TGFA、HGF、VE‑钙粘蛋白或PLAU的表达的方法。结果，治疗了与这些基因的表达有关的疾病。半胱天冬酶3由CASP3(GenBank程序集登记号：GCA_000001405.22)编码并且分裂并活化半胱天冬酶6和7；以及通过半胱天冬酶8、9和10处理和活化蛋白质本身。半胱天冬酶3是参与淀粉样蛋白‑β4A前体蛋白的分裂的主要半胱天冬酶，这与阿尔茨海默病中和脊髓损伤后的神经元死亡有关。由于半胱天冬酶3与细胞凋亡有关，因此CASP3的上调可用于诱导功能障碍性细胞去除。

Description

基因的NORRIN诱导表达及其治疗疾病的用途

相关申请

本申请要求2017年5月5日提交的美国临时申请序列号62/501,940的优先权权益，其内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及通过向组织(例如视网膜、大脑和外周脉管)施加组织norrin蛋白调节该组织中的基因表达的方法；特别是涉及产生有效治疗疾病的基因调节。

背景技术

视网膜病变是对眼睛视网膜的任何损害，这可导致视力障碍。视网膜病变通常指视网膜血管疾病，或由异常血流引起的视网膜损害。通常，视网膜病变是全身性疾病的眼部表现，如在糖尿病或高血压中或对于早产儿视网膜病变(ROP)所见的。

视网膜病变或视网膜血管疾病可大致分为增生型和非增生型。两种类型的视网膜病变均通过不同机制改变流向视网膜的正常血流而引起疾病。视网膜由中央的视网膜动脉的小血管分支供应。增生性视网膜病变是指由异常血管生长引起的损伤。通常，血管生成是组织生长和形成的自然部分，其中血管生成是生理过程，通过该生理过程从先前存在的血管形成新血管。当出现异常高或快速的血管生成时，就会出现称为新血管形成的血管过度生长，其中过度生长的血管通常易碎、薄弱且不能有效地灌注视网膜组织。这些薄弱而脆弱的血管也经常渗漏，使流体、蛋白质和其他碎屑渗出到视网膜中。过度生长的血管也由于强度差而易于出血。在非增生型中，由于血管本身的直接损伤或折中而发生流到视网膜的异常的血液流动。非增生性损伤的许多常见原因包括高血压性视网膜病变，早产儿视网膜病变，放射性视网膜病变，日光性视网膜病变和镰状细胞病相关的视网膜病变。

为了补偿由于各种视网膜病变引起的缺血组织中氧和营养物的缺乏，与渗透性有关的细胞因子被过度上调。

各种炎性疾病的特征在于渗漏诱导的水肿。在细胞水平上，该水肿与折中的上皮细胞或内皮细胞之间的连接有关。与这种类型的炎症有关的一种这样的机制是缺血组织通过过度上调参与渗透性的细胞因子来补偿氧和营养物的缺乏。由于诸如VE-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-5的细胞间粘附分子的耗竭，血管内皮生长因子(VEGF)的过度表达引起血管渗透性增加。克罗恩氏病和炎症性肠病已示出出通过失效的紧密连接机制的进展。(JDSchulzke et al，Ann N Y Acad Sci.2009May；1165:294-300.doi:10.1111)。

在包括血管和大脑在内的多种组织中发现内皮紧密连接，血管壁的内皮层形成受控的可渗透屏障，其位于血管和血管周围隔室之间的界面处。尽管内皮充当严格分隔两个隔室的有效屏障，但它也可以充当可渗透过滤器，其允许在屏障的管腔侧和非管腔侧之间选择性交换溶质和水。通过紧密连接失效破坏平衡功能，导致血管、淋巴体系和大脑的各种炎性症状。虽然此类症状通常用甾族或非甾族抗炎药治疗，但这种现有疗法在功效和副作用方面具有限制。

另外，许多癌症仅通过由血管内皮生长因子(VEGF)传播的血管生成而发展。另外，肿瘤的转移必然需要使这种细胞之间的连接变松，以使细胞成为循环的。

上皮层和内皮层是交换位点和屏障，用于离子和分子在组织和生物体的循环体系之间的运送。相邻的上皮细胞和内皮细胞之间的络合物包括紧密连接和黏着连接。脊椎动物的上皮细胞和内皮细胞呈现出紧密连接，其位于黏着连接的顶端。紧密连接在上皮和内皮极化中具有组织作用，并对溶质通过细胞内空间的扩散建立了顶-侧屏障(门功能)。紧密连接还限制了脂质和膜蛋白在顶部和基底膜之间的运动(围栏功能)。紧密连接是高度有序的膜接触部位，包括膜内原纤维网络。紧密连接包括跨膜蛋白，其包括闭锁蛋白、紧密连接蛋白-5和连接粘附分子(JAM)，以及许多胞质外周蛋白。这些在现有技术的图1中示意性地示出。虽然跨膜蛋白介导细胞与细胞之间的粘附，但胞质紧密连接斑块包含各种类型的蛋白(例如PDZ蛋白，例如ZO(闭合小环蛋白)家族)，这些蛋白将紧密连接跨膜蛋白连接到基础细胞骨架。这些衔接子还将调节蛋白(例如蛋白激酶、磷酸酶、小GTP酶和转录因子)募集到紧密连接处。结果，结构蛋白(肌动蛋白和血影蛋白)和调节蛋白(肌动蛋白结合蛋白，GTP酶和激酶)与跨膜蛋白并列。这种蛋白质支架促进了高度有序的结构的组装，例如调节上皮细胞极性、增生和分化的连接络合物或信号传导斑块。这种支架在视网膜色素上皮中也是可操作的。

眼睛中脉管渗透性的增加可导致水肿。虽然已经研究了诸如糖尿病的水肿原因的临床特征，但是很少关注解决视网膜脉管中弱化的细胞间连接。与脉管渗漏有关的水肿可引起并发症，如黄斑水肿和渗出性视网膜脱离。

包括视网膜色素上皮的上皮具有将循环系统中的血液与其他组织分离的功能。上皮是交换部位也是屏障，用于离子和分子在生物体的组织和循环系统之间的运送。相邻细胞之间的络合物包括紧密连接和黏着连接。脊椎动物的上皮细胞呈现出紧密连接，其位于黏着连接的顶部。紧密连接在上皮极化中具有组织作用，并对溶质通过细胞内空间的扩散建立了顶-侧屏障(门功能)。紧密连接还限制了脂质和膜蛋白在顶部和基底膜之间的运动(围栏功能)。紧密连接是高度有序的膜接触部位，包括膜内原纤维网络。紧密连接包括跨膜蛋白，包括闭合蛋白、紧密连接蛋白-5和连接粘附分子(JAM)、以及许多胞质外周蛋白。这些在现有技术的图1中示意性地示出。虽然跨膜蛋白介导细胞间粘附，但胞质紧密连接斑块包含各种类型的蛋白(例如PDZ蛋白，例如ZO(封闭小环蛋白)家族)，这些蛋白将紧密连接跨膜蛋白连接到基础细胞骨架。这些衔接子还将调节蛋白(例如蛋白激酶，磷酸酶，小GTP酶和转录因子)募集到紧密连接处。结果，结构蛋白(肌动蛋白和血影蛋白)和调节蛋白(肌动蛋白结合蛋白，GTP酶和激酶)与跨膜蛋白并列。这种蛋白质支架促进了高度有序的结构的组装，例如调节上皮细胞极性、增生和分化的连接络合物或信号传导斑块。这种支架在视网膜色素上皮中也是可操作的。

VEGF通过诱导关键内皮细胞粘附分子VE-钙粘蛋白的快速内吞作用诱导血管渗透性，从而破坏内皮屏障功能。该过程由VEGFR通过Vav2(未示出)(一种鸟苷酸交换因子)的Src依赖磷酸化由小GTP酶Rac的活化而启动。Rac活化又促进VE-钙粘蛋白的细胞内尾巴中高度保守的基序的p21活化激酶(PAK)介导的磷酸化。这导致细胞间连接的分解。(Gavardet al，Nat Cell Biol.2006Nov；8(11):1223-34.Epub 2006Oct 22)。

在图1的左图所示的具有完整的紧密连接的正常起作用的视网膜色素上皮细胞中，VEGF未结合至其相应的受体VEGFR，并且紧密连接蛋白-5从编码紧密连接蛋白-5基因在细胞核中正常表达并由内质网加工。闭锁蛋白、紧密连接蛋白-5和JAM一起形成功能性的紧密连接，而VE-钙粘蛋白形成并组织了黏着连接。

相反，如图1的右图所示，在VEGF结合到VEGFR的情况下，Src/Rac/Pak络合物作用于β-连环蛋白而使黏着连接处不稳定。所得的级联可以视为破坏了紧密连接蛋白-5的表达和组装，导致紧密连接结构的损失。图2是示出各种基因的现有技术研究以及每种基因对血液视网膜屏障完整性(BRB)的潜在影响的表格。

Norrin，也称为Norrie疾病蛋白或X-连锁渗出性玻璃体视网膜病变2蛋白(EVR2)，其是一种在人体内由NDP基因编码的蛋白。Norrin蛋白诱导的信号调节脊椎动物视网膜的血管发育并控制耳朵中重要血管。norrin以高亲和力结合到Frizzled 4(norrin是Frizzled受体亚型4(Fz4)的配体)。norrin以纳摩尔亲和力结合Fz4(Xu等，Cell，2004；116：883-895；Clevers，Curr Biol，2004；14：R436-437；Nichrs，Dev Cell，2004；6：453-454)并且Frizzled 4基因敲除小鼠表现出异常的视网膜血管发育。

norrin与Fz4的相互作用取决于细胞表面受体LRP5。(Xu，2004)。Frizzled受体与β-连环蛋白典型信号传导途径联接。通过frizzled受体结合使糖原合酶激酶(GSK)3β和Axin失活，这稳定了β-连环蛋白，其随后积聚在细胞核中并活化了在G1-S相转变中至关重要的靶基因(如细胞周期蛋白D1或c-Myc)的转导。(Willert等，Curr Opin Genet Dev，1998；8：95-102)。已经表明，抑制norrin活性可排除与眼部疾病有关的血管生成(US 2010/0129375)。

如所指出的，增生性视网膜病变的标志是过度的VEGF表达，其导致血管渗透性。VEGF通过直接磷酸化细胞间连接蛋白、增加降解连接蛋白的酶的表达以及通过诱导使单核细胞粘附在血管内壁上的白细胞粘附，而启动血液视网膜屏障(BRB)的破坏。使用norrin(一种Wnt信号传导配体)进行的实验表明，norrin可以稳定血管，从而恢复OIR小鼠模型视网膜中的BRB。配体是与生物分子形成络合物以服务生物学目的的物质。在蛋白质-配体结合中，配体通常是通过与靶蛋白上的位点结合而产生信号的分子。结合通常导致靶蛋白的构象改变。Wnt信号传导途径是一组信号转导途径，其由蛋白质组成，这些蛋白质通过细胞表面受体将信号传递到细胞中。已表征了三种Wnt信号传导途径：典型Wnt途径，非典型平面细胞极性途径和非典型Wnt/钙途径。通过将Wnt-蛋白配体结合至Frizzled家族受体(其将生物信号传递至细胞内的散乱蛋白)，激活了所有这三个途径。

虽然通过重建连接视网膜内皮细胞的连接蛋白(如紧密连接蛋白和VE-钙粘蛋白)可以看到血液视网膜屏障(BRB)恢复的证据，以及尽管典型的Wnt信号传导可以直接上调紧密连接蛋白的表达，这并不完全说明障碍的恢复。另外，尽管已知增生性视网膜病变(PR)导致BRB破坏，并且抗VEGF控制增生，但是抗VEGF对视网膜屏障的作用只是暂时的。此外，尽管在治疗与眼睛中脉管渗漏有关的水肿时并未涉及norrin蛋白，但仍需要用norrin确定可有助于血管稳定的途径。然而，由于norrin暴露而调节表达的其他基因仍然未知。

因此，需要通过施用norrin来调节基因表达和与之相关的疾病治疗的方法，例如用以治疗与脉管渗漏有关的视网膜水肿。此外，由于增生性视网膜病变导致血液视网膜屏障(BRB)破坏，而尽管抗VEGF控制增生，但它们对视网膜屏障的作用只是短暂的。因此，需要具有改善的长期功效的治疗。

发明内容

提供了一种治疗脉管屏障的方法，该方法包括将脉管暴露于norrin，并留给norrin足够的时间来调节BMP2、CLCL6、IL12B、SELPLG、CX3CL1、CASP3、THBD、COL18A1、CPB2、NPR1、CLDN5、CLD3、PIGF、BDNF、CNTF、VEGF-A、CAM-1、PGF、FOX-01、FOX-04、PDGFB、TGFA、HGF、VE-钙粘蛋白和PLAU中的至少一种基因的基因表达。

附图说明

将在附图和本发明的以下详细描述中阐明本发明的这些和其他方面。

图1是具有完整细胞连接(左图)和弱化或破坏的细胞连接(右图)的细胞的现有技术示意图，其示出了VEGF在改变某些突出的细胞途径的途径中的功能；

图2是示出各种基因以及每种基因对血液视网膜屏障完整性的潜在影响的现有技术研究的表；

图3是本发明有效诱导VE-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-5的细胞表达的可能途径的示意图；

图4是用于评价本发明的有效性的步骤的示意图；

图5示出了用于测试“人血管生成生长因子”设置的阵列；

图6示出了用于测试“人内皮细胞生物学”设置的阵列；

图7示出了在单独暴露于介质24小时之后(左上图)、在暴露于VEGF(100ng/ml的介质)(右上图)之后，暴露于norrin(250ng/ml的介质)之后(左下图)、以及暴露于VEGF(100ng/ml介质)和norrin(250ng/ml介质)两者(右下图))之后，对VE-钙粘蛋白免疫染色的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)的20倍放大荧光显微照片(在细胞周围的边界处的绿色)；

图8示出了在单独暴露于介质24小时之后(左上图)、在暴露于VEGF(100ng/ml的介质)(右上图)之后，暴露于norrin(250ng/ml的介质)之后(左下图)、以及暴露于VEGF(100ng/ml介质)和norrin(250ng/ml介质)两者(右下图))之后，对紧密连接蛋白-5免疫染色的HRMEC的40倍放大荧光显微照片(在细胞周围的边界处的绿色)；

图9是在未添加、VEGF、norrin、或VEGF和norrin的组合后24小时的HRMEC单层中紧密连接蛋白-5的mRNA表达的归一化柱状图，表明norrin恢复了紧密连接蛋白-5的表达；

图10是视网膜显微照片，其描绘了眼睛未注射norrin(左图)和眼睛注射了norrin(右图)的小鼠的氧诱导性视网膜病变(OIR)模型的眼睛中的伊文思蓝渗漏，图像是在注入norrin后3天拍摄的，其中亮(白色)指示血管渗漏，注射的眼睛表示毛细血管网的保存；

图11A和11B是示出分别在不同治疗条件下紧密连接蛋白-5和VE-钙粘蛋白的相对表达的柱状图；

图12A和12B是示出分别在不同治疗条件下在7小时和24小时时骨形态发生蛋白2(BMP2)的相对表达的柱状图；和

图13A和13B是示出分别在不同治疗条件下在7小时和24小时时肝细胞生长因子(HGF)的相对表达的柱状图。

具体实施方式

本发明具有的实用性在于一种增加基因CASP3和THBD的表达并降低基因COL18A1、CPB2、NPR1、OCLN和PLAU的表达的方法。结果，治疗了与这些基因的表达有关的疾病。

具体地，半胱天冬酶3由CASP3(GenBank程序集登记号：GCA_000001405.22)编码并且分裂并活化半胱天冬酶6和7；并且通过半胱天冬酶8、9和10处理和活化蛋白质本身。半胱天冬酶3是参与淀粉样蛋白-β4A前体蛋白的分裂的主要半胱天冬酶，这与阿尔茨海默病中和脊髓损伤后的神经元死亡有关。由于半胱天冬酶3与细胞凋亡有关，因此CASP3的上调可用于诱导功能障碍性细胞去除。

THBD基因编码血栓调节蛋白(TM)(其是在内皮细胞表面上表达的完整膜蛋白)并充当凝血酶的辅因子。它通过将凝血酶从促凝血酶转化为抗凝血酶减少了血液凝固。血栓调节蛋白也在人间皮细胞、单核细胞和树突状细胞亚群上表达。其增加的表达用于限制与手术、遗传性高凝障碍、糖尿病或心脏和血管疾病有关的凝血作用。

SERPINE1基因编码纤溶酶原活化物抑制剂-1(PAI-1，其也称为内皮纤溶酶原活化物抑制剂)或丝氨酸蛋白酶抑制剂E1，并且该蛋白用作组织纤溶酶原活化物(tPA)和尿激酶(uPA)(即，纤溶酶原和因此的纤维蛋白溶解的活化物)的主要抑制剂。因此，与norrin施用有关的其增加的表达在增强纤维蛋白溶解方面是在临床上有效的。

COL18A1基因编码胶原α-1(XVIII)链。该胶原蛋白是多路复用、细胞外基质蛋白中的一种，其包含多个被非胶原结构域中断的三螺旋结构域(胶原结构域)。通过蛋白水解产生的XVIII型胶原的C端片段是内皮抑素，一种有效的抗血管生成蛋白，因此，通过norrin施用降低其表达可有效限制血管生成过度血管生长，例如在与年龄相关的黄斑变性和增生视网膜病变中观察到的。

CPB2基因编码羧肽酶-2，并且当它被凝血酶/血栓调节蛋白络合物在残基Arg92处通过蛋白水解活化时，表现出羧肽酶活性。活化的羧肽酶2减少了纤维蛋白溶解，因此CPB2的降低表达具有减少血管渗漏和出血的意义。

NPR1基因编码利钠肽受体A/鸟苷酸环化酶A(心房利钠肽受体A)，并且该受体的水平和活性决定了在不同的组织中的肽激素心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)的生物学作用，其主要是为了维持盐和水的体内平衡。结果，该基因的下调具有减少血管渗漏的意义。

PLAU基因编码参与细胞外基质降解的丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.73)，并且在通过纤溶酶原中Arg-Val键的特异性分裂将纤溶酶原转化为纤溶酶方面是有用的。结果，该基因的下调对内皮细胞渗漏具有治疗意义。

基因BMP2、CLCL6、IL12B、SELPLG、CX3CL1、CASP3、THBD、COL18A1、CPB2、NPR1、CLDN5、CLD3、PIGF、BDNF、CNTF、VEGF-A、CAM-1、PGF、FOX-01、FOX-04、PDGFB、TGFA、HGF、VE-钙粘蛋白均代表视网膜表达共有的常规基因名称。

不受限于特定的操作理论，norrin蛋白与视网膜上皮细胞的frizzled-4受体的结合限制了β-连环蛋白的降解，然后积聚并定位于上皮细胞核，随后通过基因转导与TCF/LEF(T细胞因子/淋巴增强因子)一起诱导细胞应答。然后转录紧密连接蛋白-5和VE-钙粘蛋白基因，并通过内质网制造相应的蛋白质。得到的蛋白质修复折中的细胞连接。这在图3中示意性地示出。在本发明的某些实施方式中，紧密连接蛋白-5和VE-钙粘蛋白也要在实验研究中获得或使用。

在本文中，关于本发明的理解使用以下定义。

“施用”在本文中定义为向受试者的视网膜提供norrin蛋白或含norrin的组合物的手段。这样的施用可以通过任何途径进行，包括但不限于口服，经皮(例如口腔粘膜)，通过注射(例如皮下，静脉内，肠外，向腹膜内，眼内)，通过吸入(例如口或鼻内)，或局部(例如眼药水，乳霜等)。当然，药物制剂是通过适合每种给药途径的形式给出的。

“改变”是指通过例如本文所述的那些标准的本领域已知方法检测到的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如本文所用的，改变包括表达水平的至少10％的变化，优选25％的变化，更优选40％的变化，最优选表达水平的50％或更大的变化。

“类似物”是指不等同但具有与norrin蛋白相似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留了相应天然产生的norrin的生物活性，同时具有某些生物化学修饰，相对于天然产生的多肽，其可以增强类似物的功能。这样的生化修饰可以增加类似物的蛋白酶抗性、溶解性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然的氨基酸。

在本公开中，“包括”，“包含”和“具有”等可以具有美国专利法赋予它们的含义，并且可以表示“包括”，“包含”等；“基本上由...组成”或“基本上组成”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在比所列举的更多的内容，只要所提及的基本或新颖的特征不由所提及之外的存在所改变，但排除现有技术的实施方式。

“对照”是指标准或参考的状态。

“检测”是指识别待检测的分析物的存在、不存在或数量。

“可检测标记”是指一种组合物，当其与感兴趣的分子连接时，使感兴趣的分子通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学工具可被检测。例如，有用的标记包括放射性同位素，磁珠，金属珠，胶体颗粒，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，如在ELISA中通常使用的)，生物素，地高辛或半抗原。

“片段”是指norrin的一部分。该部分优选包含天然的人norrin多肽的133个氨基酸残基的全长的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以包含40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或甚至完整的133个氨基酸。

“截短体”是指包括具有多达40个氨基酸残基的norrin蛋白质的多肽末端分裂的norrin的片段。

“分离的多肽”是指已经从天然伴随其的组分中分离出的norrin的多肽类似物。通常，当多肽按重量计至少60％游离于蛋白质以及与其天然结合的天然存在的有机分子时，该多肽被分离。优选地，制剂是按重量计至少75％、更优选地至少90％、并且最优选地至少99％的本发明的多肽。例如通过从天然源提取，通过编码这种多肽的重组核酸的表达，或通过化学合成蛋白质，可以获得本发明的分离的多肽。纯度可以通过任何适当的方法来测量，例如柱色谱法，聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析。

Norrin用于限定多肽或其片段，该多肽或其片段具有如下所示的与NCBI登记号NP_000257.1至少约85％的氨基酸同一性，并且具有结合视网膜上皮细胞的frizzled-4受体的能力。

gil4557789lreflNP_000257.1l norrin前体[智人]

MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSDPRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVLLARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECNS(SEQ ID NO.1)

如本文所用的“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获得试剂。

术语“患者”或“受试者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物。仅作为示例，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人的哺乳动物，例如非人的灵长类动物，牛，马，犬，绵羊或猫科动物。

“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或可批准的，或在美国药典或用于动物(包括人)的其他公认的药典中列出的。

“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与试剂一起施用给受试者，并且不会破坏其药理活性并且当以足以递送治疗量的药剂的剂量施用时是无毒的赋形剂、载体或稀释剂。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。例如，范围1到50应该理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字的组合或子范围，以及介于上述整数之间的所有小数的值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可以在一个方向上包括1到10、1到20、1到30以及1到40，或者在另一个方向包括50到40、50到30、50到20、以及50到10。

“减少”是指至少10％、25％、50％、75％或100％的负变化。

序列同一性通常使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(1710大学大道，Madison，Wis.53705,BLAST，BESTFIT，GAP)或PILEUP/PRETTYBOX程序)来测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e"³与e"¹⁰⁰之间的概率分数表示密切相关的序列。

如本文所用的术语“治疗”等是指减轻或改善与BRB折中有关的病症和/或症状。

通常，治疗有效剂量应产生约0.1ng/ml至约50-100μg/ml的化合物的血清浓度。

除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“一”和“该”应理解为一个或多个。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“约”应理解为在本领域的标准公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差之内。约可以理解为所述值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％之内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。

norrin是一种分泌到细胞外空间中的133氨基酸长蛋白质。两个主要结构域定义了一般的norrin蛋白结构：信号肽指导分子的定位；半胱氨酸结基序提供了frizzled-4受体结合所需的三级确认。(Meitinger，T等，Nat Genet，1993；5：376-380；Berger，W等，HumMol Genet，1996；5：51-59)。保留结合frizzled-4受体能力的norrin的截短体和片段在本文中是可操作的。在本发明的一些实施方式中，norrin的截短体或片段保留了半胱氨酸结基序。

通过计算机模型突出了半胱氨酸结基序的重要性，该计算机模型证实了在形成norrin的结构确认中半胱氨酸残基之间的二硫键的需要。然而，除半胱氨酸结基序以外的区域中的突变产生不完全的蛋白质折叠，并导致家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)和相关的玻璃体视网膜病变。

在本发明的一些实施方式中，norrin的-24残基N-端截短体具有以下氨基酸序列：

KTDSSFIMDSDPRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVLLARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECNS(SEQ ID NO.2)(登记号#Q00604)

已经发现，与norrin相比，一些片段和截短体(例如SEQ ID NO：2)具有改善的溶解度。

本发明进一步包括与norrin基本上同源并且仍保留选择性结合frizzled-4受体的能力的变体和等同物。这些可包含例如保守取代突变，即，一个或多个氨基酸被相似氨基酸取代。例如，保守取代是指氨基酸被同一通用类别内的另一氨基酸取代，例如，一个酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代。

本发明的norrin可以是重组的norrin、天然norrin或保持frizzled-4结合特性的合成norrin。在本领域中将认识到，可以改变本发明的一些氨基酸序列而不会显著影响蛋白质的结构或功能。因此，本发明进一步包括具有实质活性的norrin变体；这样的突变体包括缺失，插入，倒置，重复和类型替换。本文可操作的norrin突变体示例性地包括相对于R64E的SEQ ID NO：1的氨基酸取代。可选地，生物活性肽是相对于SEQ ID NO：1的多重突变体：T27A，S28A，S29A；P36A，R37A，R38A；Y120A，R121A，Y122A；或H127A，E129A，E130A；或其组合。在多重突变中突变的任何氨基酸均可作为单一突变进行操作。在Smallwood,PM等,JBiol Chem,2007：282：4057-4068的图6A或Ke,J等,Genes&Dev.2013：27：2305-2319中说明了本文可操作的其他序列突变。应当理解，在不同氨基酸位点处的其他突变是类似可操作的。还应理解，保守氨基酸在任何特定位点处的突变优选被突变为甘氨酸或丙氨酸。还应理解，突变至任何中性带电的、带电的、疏水的、亲水的、合成的、非天然的、非人的或其他氨基酸是类似可操作的。

可选地在包含在本发明化合物内的norrin蛋白质的结构(一级，二级或三级)中进行修饰和改变，其可能导致或可能不导致具有与本文公开的示例性多肽相似的特征的分子。可以理解，保守氨基酸碱基的变化最有可能影响所得到的蛋白质的活性。然而，还应理解，可操作用于受体相互作用、抵抗或促进蛋白质降解、细胞内或细胞外运输、分泌、蛋白质-蛋白质相互作用、翻译后修饰(如糖基化，磷酸化，硫酸化等)的氨基酸变化可以导致本发明化合物的活性增加或降低，同时保留一些改变或维持生理活性的能力。已知发生某些氨基酸取代序列中其他氨基酸而没有明显的活性损失。

在进行这种改变时，考虑了氨基酸的亲水指数。根据本发明，一些氨基酸可以由具有相似亲水指数的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物活性的多肽。根据其疏水性和电荷特性，为每个氨基酸指定一个亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

在不希望限于特定理论的情况下，可以认为，氨基酸的相对亲水性决定了所得多肽的二级结构，其进而限定了多肽与其他分子的相互作用。本领域已知氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一氨基酸取代，并且仍然获得功能上等效的多肽。在这种变化中，亲水指数在.±.2之内的氨基酸的取代是优选的，在.±.1以内的那些是特别优选的，而在.±.0.5之内的那些是更特别优选的。

如上所概括的，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性，亲水性，电荷，尺寸等。考虑了各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括(初始残基：示例性取代)：(Ala：Gly，Ser)，(Arg：Lys)，(Asn：Gln，His)，(Asp：Glu，Cys，Ser)，(Gln：Asn)，(Glu：Asp)，(Gly：Ala)，(His：Asn，Gln)，(Ile：Leu，Val)，(Leu：Ile，Val)，(Lys：Arg)，(Met：Leu，Tyr)，(Ser：Thr)，(Thr：Ser)，(Tip：Tyr)，(Tyr：Trp，Phe)，和(Val：Ile，Leu)。

norrin和类似物可以进一步修饰以包含通常不是蛋白质一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改善溶解度、生物半衰期、蛋白质的吸收、或结合亲和力。这些部分还可以减少或消除蛋白质等的任何期望的副作用。在Remington's PharmaceuticalSciences,第20版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(2000)中可以找到这些部分的概述。

本文所述的分离的norrin可以通过本领域已知的任何合适的方法产生。这类方法的范围从直接的蛋白质合成方法到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在合适的转化宿主中表达那些序列。在一些实施方式中，使用重组技术通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选地，可以通过位点特异性诱变可以诱变该序列以提供其功能类似物。(Zoeller等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA81：5662-5066(1984)和美国专利No.4,588,585)。

根据本发明，使具有折中连接的视网膜上皮细胞的紧密连接和黏着连接暴露于一定剂量的norrin、其截短体或其片段。暴露于norrin后，所得到的细胞具有明显更高水平的细胞连接紧密连接蛋白-5和VE-钙粘蛋白。因此，本发明逆转了包括VEGF在内的细胞因子对视网膜和脉络膜上皮细胞的作用。从而减少了与折中的视网膜或脉络膜上皮细胞连接有关的视网膜水肿和视网膜脱离。

观察到SEQ ID NO：2的norrin截短体可有效增加浓度为10至1000ng/ml的紧密连接蛋白-5和VE-钙粘蛋白的细胞连接水平。

本发明还涉及药物组合物，其包括单独地有效量的norrin或有效量的norrin与药学上可接受的载体、赋形剂或添加剂组合。特别优选的衍生物是增加施用到哺乳动物的norrin的生物利用度(例如，通过视觉地使施用norrin的脉络膜更容易吸收到血液中)或相对于天然蛋白增强norrin向生物隔室(例如视网膜)的递送的那些。

为了制备根据本发明的药物组合物，优选根据常规药物混合技术将治疗有效量的norrin与药学上可接受的载体紧密混合以产生剂量。根据施用所需的制剂形式，例如眼，口服，局部或肠胃外，载体可以采取多种形式，包括凝胶，乳膏，软膏，洗剂和经时间释放的可植入制剂等。

norrin也与辅助治疗剂(例如抗VEGF剂)一起施用。本文中可操作的抗VEGF剂说明性地包括抑制由VEGF刺激的酪氨酸激酶的贝伐单抗兰尼单抗小分子，例如拉帕替尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼、帕唑帕尼或其组合。提供了一种组合治疗剂，其包括抗VEGF剂和norrin。令人惊讶地发现，通过同时抑制结合到细胞的VEGF以及刺激紧密连接和黏着连接蛋白的表达，可以增强常规抗VEGF剂的功效。举例来说，抗VEGF剂通常在约75％的具有继发于糖尿病的黄斑水肿的迹象的受试者中是有效的。在同时施用norrin的情况下，该效力提高85％以上。

用于眼睛，肠外，皮内，皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水，盐溶液，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成的溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。

液体口服制剂形式的施用使用了诸如悬浮液、酏剂和溶液的形式的载体，可以使用合适的载体和添加剂，其包括水，乙二醇，油，酒精，调味剂，防腐剂，着色剂等。对于固体口服施用，以诸如粉末、片剂、胶囊的形式提供制剂，对于诸如栓剂的固体制剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖载体(例如葡萄糖、甘露糖醇、乳糖)和相关载体、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂或崩解剂。如果需要，可以通过标准技术将片剂或胶囊做成肠溶型或缓释型。norrin以冻干形式的固体剂量或丸粒状液滴形式提供。

在一个实施方式中，活性化合物与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于从体内快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊递送体系。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。

脂质体悬浮液也可以是药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。例如，脂质体制剂可以通过将适当的脂质溶解在无机溶剂中然后蒸发该无机溶剂而在容器表面上留下干燥脂质的薄膜来制备。然后将活性化合物的水溶液引入容器中。然后用手旋转容器以从容器的侧面释放脂质物质并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。本领域普通技术人员熟知的其他制备方法也可用于本发明的这一方面。

适用于皮肤局部施用的制剂可以软膏、乳膏、凝胶和糊剂的形式存在，包括在药物可接受的载体中待施用的成分。优选的局部递送体系是含有待施用成分的透皮贴剂。

用于直肠施用的制剂可以作为具有合适的基质的栓剂存在，其包括例如可可脂或水杨酸酯。

肠胃外制剂可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果静脉内施用，优选的载体包括例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

对于肠胃外制剂，载体通常将包含无菌水或氯化钠水溶液，但是可以包括其他组分，包括有助于分散的那些。当然，在使用无菌水并将其保持无菌状态的情况下，也必须对norrin和载体进行灭菌。也可以制备可注射的悬浮液，在这种情况下，可以使用适当的液体载体、悬浮剂等。

适用于肠胃外或眼部施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，从而使制剂与预定接受者的血液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括助悬剂和增稠剂。使用前，该制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在仅需要添加无菌液体载体(例如用于注射的水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

活性化合物的施用范围可以从连续(静脉滴注)到每天多次口服施用(例如Q.I.D.)，并且可以包括局部、眼睛、肠胃外、肌肉内、静脉内、皮下、脉络膜内或透皮施用(其可包含穿透增强剂)。

受试者治疗剂的应用可以是局部的，以便在感兴趣的部位施用。可以使用各种技术在感兴趣的部位处提供受试者norrin，例如注射、导管的使用、套管针、射弹、普朗尼克凝胶、支架、缓释药物聚合物或其他提供内部进入的器件。在由于从患者身上移开而可访问器官或组织的情况下，可以将这种器官或组织浸入含有受试者norrin的介质中，可以将受试者norrin涂在器官上，或者可以任何方便的方式施加。

norrin可以通过适于有效地获得所需的局部或全身生理或药理作用的组合物的控制和缓释的器件来施用。该方法包括将缓释药物递送系统定位在需要释放药剂的区域，以及允许药剂通过器件到期望的治疗区域。更具体地，通过适合于直接植入眼睛的玻璃体内的眼部器件来施用norrin。令人惊讶地发现，本发明的这种器件提供了各种norrin的受控的缓释以治疗眼睛，而没有有害的局部和全身副作用的风险。该眼部递送方法的目的是使眼内器件中包含的药物量最大化，同时使其尺寸最小化，以延长植入物的持续时间。参见，例如，美国专利5,378,475；5,773,019；6,001,386；6,217,895，6,375,972和6,756,058。

norrin的其他递送方法包括：可以应用于眼内晶状体以预防炎症或后囊膜混浊的眼部递送系统，可以直接插入视网膜下方或巩膜上的玻璃体中的眼部递送系统，其中插入的实现可以通过注射系统或通过外科手术植入该系统，缓释药物递送系统，以及提供受控和持续施用有效地获得所需的局部或全身性生理或药理效果的药物的方法，该方法包括在所需位置处手术植入缓释药物递送体系统。

实例包括但不限于以下：缓释药物递送系统，其包括含有norrin的内部储液器，对药剂的通道不可渗透的内管，该内管具有第一端和第二端并至少覆盖内部储液器的一部分，内管的尺寸和制成材料使得内管能够支撑其自身的重量，位于内管第一端的不可渗透构件，该不可渗透构件防止药剂通过所述内管第一端从储液器中流出，以及位于所述内管第二端的可渗透构件，所述可渗透构件允许药剂通过所述内管第二端从所述储液器中扩散出来。一种向眼睛的一部分施用norrin的方法，包括：植入缓释器件以将norrin递送至眼睛的玻璃体或脉络膜，或用于向脉络膜或眼睛的一部分施用本发明的化合物的可植入的缓释器件；缓释药物递送器件包括：a)含有norrin的药物芯部；b)至少一个整体式杯，该整体式杯基本上对于溶剂的通道是不可渗透的，其围绕并限定了内部腔室以容纳药物芯部，该整体式杯包括敞开的顶端，该敞开的顶端具有至少一个围绕该整体式杯的敞开顶端的至少一部分的凹入的凹槽；c)对于norrin通道是可渗透的可渗透塞，该可渗透塞位于整体式杯的敞开顶端，其中凹槽与可渗透塞相互作用，将其保持在适当位置并封闭该敞开的顶端，该可渗透塞允许药物从药物芯部出来，通过可渗透塞，并从整体式杯的敞开顶端流出。缓释的norrin递送器件包括具有所需溶解度的内芯部norrin和聚合物涂层，该聚合物层对于norrin是可渗透的，其中该聚合物涂层完全覆盖内芯部。

norrin可以微球形式施用。例如，norrin可购自Minneapolis,Minn.的R&D体系，或使用Fu,K等,J.Pharm.Sci.,2003；92:1582-91的自发乳化技术加载到基本上如Jiang,C等,Mol.Vis.,2007；13:1783-92所述的生物可降解微球中的克隆、表达和纯化的。通过将200mg的50:50的聚丙交酯-乙醇酸共聚物(PLGA)溶解在5ml的体积比为4：1的三氟乙醇:二氯甲烷中并添加8mg氢氧化镁，以使封装过程中的蛋白质聚集最小化，来合成并加载微球。可以在溶于3ml PBS中的300μl的7mg牛血清白蛋白(BSA)和100mg的多库酯钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，密苏里州)中重构10μg norrin。可以将溶液涡旋并在温和搅拌下倒入200ml的1％(w/v)的聚乙烯醇(PVA，88％水解)中。可以通过搅拌三小时使微球硬化，通过离心收集，并洗涤三遍以除去残留的PVA。如果不打算立即注射微球，则将其在液氮中快速冷冻，冻干72小时，并在-20℃下保存在干燥器中。含norrin的微球具有由粒径确定的8μm的平均直径。norrin也可以通过玻璃体内注射施用。例如，溶液中的norrin可如上所述包装到微球中，或在细胞中表达，或溶液中的纯化形式可通过实质上如Jiang,2007所述通过玻璃体内注射暴露于视网膜。使用眼科手术显微镜(Moller-Wedel GmbH,Wedel,德国)，使用外径约为100μm的斜面玻璃微针，玻璃体内注射可在在全身麻醉下进行。在PBS中以2％和10％(w/v)制备微球悬浮液，并在注射前立即短暂涡旋以确保均匀分散。可以使用30号皮下注射针在角膜缘后1.5mm对巩膜穿孔。通过使用50μl Hamilton注射器(Hamilton Co，里诺，内华达州)，通过该通道将五微升测试样品可选地注入玻璃体。为确保充分输送并防止撞击，注射完成后，将针固定就位一分钟，然后缓慢抽出。另外，可以同时进行穿刺术以减轻压力并由此防止回流。

norrin也可以通过控释递送系统递送至视网膜而施用。可植入的控释递送系统在美国专利申请公开2005/0281861中进行了描述，并且以每个最终配制的胶囊100μg包装到这种系统中。例如，可以在巩膜上开2到3mm的切口后，用镊子或套管针将含norrin的药物输送系统放置在眼睛中。可替代地，可以不进行切口并且通过将套管针或其他输送器件直接穿过眼睛插入而将系统放置在眼睛中。将系统放置在眼睛中后，器件的去除可导致自密封开口。在美国专利申请公开号2004/0054374中公开了用于将植入物插入到眼睛中的器件的示例，其通过引用并入本文。系统的位置可影响元件周围的医疗组分或药物的浓度梯度，从而影响释放速率(例如，放置在更靠近玻璃体边缘的元件可导致较慢的释放速率)。因此，优选将系统放置在视网膜表面附近或玻璃体的后部中。

优选的单位剂量制剂是含有所施用成分的每日剂量或单位，如上所述的每日分剂量或其适当分数的那些。

norrin发明的剂量方案基于多种因素，包括BRB渗漏的程度、施用途径、眼部容量、黄斑分离量和所用的具体norrin。因此，剂量方案可以宽范围变化，但是可以使用标准方法常规地确定。

在某些实施方式中，norrin每天施用一次；在其他实施方式中，norrin每天施用两次；在其他实施方式中，norrin每两天施用一次，每三天施用一次，每四天施用一次，每五天施用一次，每六天施用一次，每七天施用一次，每两周施用一次，每三周施用一次，每四周施用一次，每两个月施用一次，每六个月施用一次，或每年施用一次。给药间隔可根据各个患者的需要进行调整。对于较长的施用间隔，可以使用延时释放或长效制剂。

药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂说明性地包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液及其组合。

控释肠胃外组合物可以是水悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液、乳剂的形式，或者活性成分可以掺入生物相容性载体、脂质体、纳米颗粒、植入物或输液器件。

用于制备微球和/或微胶囊的材料包括可生物降解/可生物蚀解的聚合物，例如PLGA、聚酯polyglactin、聚(氰基丙烯酸异丁酯)，聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)和聚(乳酸)。

当配制控释肠胃外制剂时可以使用的生物相容性载体包括碳水化合物，例如右旋糖酐、蛋白质，例如白蛋白、脂蛋白或抗体。

用于植入物的材料可以是不可生物降解的，例如聚二甲基硅氧烷，或者是可生物降解的，例如，聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酯)。

防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和苯扎氯铵。

通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯)中形成本发明的化合物的微胶囊基质来制备可注射的长效形式。根据化合物与聚合物的比例以及所用的特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备长效可注射制剂。

任何上述控释、延时释放和缓释组合物可以配制成在约30分钟至约1周、约30分钟至约72小时、约30分钟至24小时、约30分钟至12小时、约30分钟至6小时、约30分钟至4小时以及约3小时至10小时内释放活性成分。在实施方式中，在将药物组合物施用到受试者之后，有效浓度的活性成分在受试者中持续4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时或更长时间。

当norrin作为药物施用于人或动物时，norrin可本身或作为包含活性成分与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合的药物组合物给出。

可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平和施用的时程，以获得对于特定患者、组合物以及施用方式有效实现所需治疗反应的活性成分的量，而对患者是无毒的。通常，norrin施用的量足以减轻或消除与视网膜水肿或黄斑变性或FEVR有关的症状。

示例性的眼部剂量范围包括每天0.00001mg至250mg，每天0.0001mg至100mg，每天1mg至100mg，每天10mg至100mg，每天1mg至10mg，以及每天0.01mg至10mg。试剂的优选剂量是患者可以耐受并且不会出现严重或不可接受的副作用的最大剂量。在一些发明的实施方式中，治疗有效剂量产生约0.1ng/ml至约50-100μg/ml的norrin的眼部浓度。在一些发明的实施方式中，将50nM至1μM的试剂施用于受试者的眼睛。在相关实施方式中，约50-100nM、50-250nM、100-500nM、250-500nM、250-750nM、500-750nM、500nM至1μM、或750nM至1μM的norrin被施用于受试者的眼睛。

有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。通常，norrin素的起作用的量或有效量是通过首先施用低剂量的药剂，然后逐渐增加所施用的剂量直至在治疗的受试者中观察到期望的作用(例如，减轻或消除与视网膜水肿有关的症状)且具有最小或可接受的毒副作用来确定的。用于确定施用本发明的药物组合物的合适剂量和给药方案的适用方法描述于例如Goodman和Oilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics,Goodman等,eds.,11th Edition,McGraw-Hill2005，以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th and 21stEditions,Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia,Eds.,Lippencott Williams&Wilkins(2003和2005)中，均通过引用并入本文。

以下是norrin可以如何克服细胞间粘附分子的内皮细胞耗尽和使血管重新稳定的体外和体内实例，其仅用于举例说明，而不用于限制本发明的范围。

体外分析

实施例1：使用表达阵列的norrrin血管稳定化

由于先前已表明norrin在增生性视网膜病变(PR)的氧诱导性视网膜病变(OIR)模型中恢复血视网膜屏障(BRB)，因此进行了实验以探讨可能导致norrin血管稳定化的途径，因此我们研究了在人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中的norrin诱导的基因表达变化。

在实验中，将HRMEC(P5-P8)接种到细胞附着因子包被的板上并生长至融合。

达到融合后，在分离mRNA之前，将板中的介质替换为以下介质并孵育24小时(或7小时)；

介质：用于阵列和连接探针taqman的10％FBS/CSC介质(细胞体系)或不含氢化可的松(Millipore)的2.5％FBS/EndoGro

用于BMP2/HGF taqman分析的VEGFA165-b：R&D体系(100ng/ml)和norrin：R&D体系(250ng/ml)或(200ng/ml)。

使用Agilent Absolutely RNA RT-PCR Kit从细胞中分离出mRNA，然后使用用于阵列的Qiagen RT2 First Strand Kit和用于单独Taqman分析的Agilent AffinityScript QPCR cDNA合成试剂盒将0.5-1ug转化为cDNA。

FAM标记的Taqman基因表达分析用Vic标记的TBP Taqman分析进行多重化，其用于归一化。

RT-PCR在Stratagene MX3000P体系上运行。

结合图4如下建立测试阵列：使用Qiagen RT² PCR Profiler阵列，将阵列设置为“血管生成生长因子”和“人内皮细胞生物学”，其中每个阵列均包含针对84个相关途径基因的PCR分析。

使用两种阵列类型比较了在norrin处理的和未处理的(仅介质)HREC中的表达。使用SYBR Green RT-PCR检测后，通过ΔCT法计算倍数差异。

图5示出了用于测试“人血管生成生长因子”设置的阵列。

图6示出了用于测试“人内皮细胞生物学”设置的阵列。

实验结果揭示了两种一般模式：

norrin起到减少炎症介体的表达的作用

norrin影响尿激酶途径信号转导

Taqman分析结果

实施例2：

在对照条件下，紧密连接蛋白-5定位于这些细胞的细胞间边界，如图7的左上图所示。添加VEGF后(右上图，图7)，可以看到细胞间粘附分子的减少以及鹅卵石形态的损失。然而，通过VEGF和norrin的组合(右下图，图7)，连接蛋白和形态得以恢复。记录了单独的norrin的作用(左下图，图7)。

实施例3：紧密连接蛋白-5在细胞中的免疫染色–VEGF挑战

用小鼠抗人紧密连接蛋白-5抗体在4℃下代替抗人VE-钙粘蛋白重复该过程过夜。用PBS洗涤后，将细胞用抗人紧密连接蛋白5抗体特异的染料偶联二级抗体孵育，随后在使用荧光显微镜成像之前在PBS中洗涤。

在对照条件下，紧密连接蛋白-5定位于这些细胞的细胞间边界，如图8的左上图所示。添加VEGF后(右上图，图8)，可以看到细胞间粘附分子的减少以及鹅卵石形态的损失。然而，通过VEGF和norrin的组合(右下图，图8)，连接蛋白和形态得以恢复。记录了单独的norrin的作用(左下图，图8)。

实施例4：紧密连接蛋白-5mRNA在细胞中的表达–VEGF挑战

重复实施例3的方法，其中用VEGF作为挑战剂代替TGF-β。检测到的紧密连接蛋白-5mRNA的量示出在图9中，归一化为仅对照的介质。观察到norrin增加紧密连接蛋白-5表达水平，其超过介质对照的表达水平。

实施例4：OIR MICE中血管渗漏和紧密连接蛋白-5染色的体内分析

小鼠氧诱导性视网膜病变模型(OIR)用于产生缺血性视网膜，因此可以评价血管形态和功能上的变化。在高氧环境中饲养小鼠产生无血管的视网膜的区域。一旦恢复到正常的氧气环境，血管就变得渗漏并以未经调节的方式生长。可以通过全身性注射荧光染料(伊文思蓝或荧光素)然后在显微镜下观察视网膜来可视化渗漏量。在OIR小鼠中，可以看到伊文思蓝染料从视网膜血管渗漏出并且紧密连接蛋白-5被破坏(图10的左图)。然而，在无血管视网膜的OIR诱导之后用norrin注射的OIR眼睛中，伊文思蓝染料被限制在血管中(图10的右图)。图像是在右眼中注射norrin后4天拍摄的。

图11A和11B是示出分别在不同治疗条件下紧密连接蛋白-5和VE-钙粘蛋白在24小时之后的相对表达的柱状图。应该注意，BMP2 taqman分析结果与降低的BMP2表达的阵列结果不匹配。

图12A和12B是示出分别在不同治疗条件下在7小时和24小时时骨形态发生蛋白2(BMP2)的相对表达的柱状图。应该注意，HGF taqman分析的结果与阵列中观察到的结果相似：norrin降低了HGF表达。

基因表达阵列揭示了在经norrin处理的(24小时)HRMEC中差异表达(最负)的多个基因。这些基因中的一些是炎症介体；BMP2，CLCL6，IL12B，SELPLG&CX3CL1。

在阵列和taqman分析中，尿激酶信号传导途径中涉及norrin失调的HGF和一些其他基因(SPINK5，PLAU PAI-1)。尿激酶途径导致降解ECM和连接蛋白的酶的活化。HGF增加尿激酶(uPA)活性，产生EC迁移表型(Colombo，E.等(2007)，Hepatocyte Growth Factor/Scatter Promotes Retinal Angiogenesis through Increased UrokinaseExpression.IOVS,48(4),

1793-1800)。此外，先前的研究已经表明尿激酶受体(UPAR)的抑制可以克服紧密连接蛋白-5蛋白表达的VEGF-A抑制(Motta，C.等(2016)，Molecular mechanisms MediatingAntiangiogenic Action of the Urokinase Receptor-Derived Peptide UPARANT inHuman Retinal Enodothelial Cells.57,5723-5735)。

如本领域技术人员从先前的具体说明以及从附图和权利要求中将认识到的，可以对本发明的优选实施方式进行修改和改变，而不脱离所附权利要求书中限定的本发明的范围。

Claims

1.一种治疗脉管屏障的方法，包括：

使所述脉管暴露于norrin；和

留给所述norrin足够的时间来调节BMP2、CLCL6、IL12B、SELPLG、CX3CL1、CASP3、THBD、COL18A1、CPB2、NPR1、BMP2、CLCL6、IL12B、SELPLG、CX3CL1、CASP3、THBD、COL18A1、CPB2、NPR1、CLDN5、CLD3、PIGF、BDNF、CNTF、VEGF-A、CAM-1、PGF、FOX-01、FOX-04、PDGFB、TGFA、HGF、VE-钙粘蛋白和PLAU中的至少一个基因的基因表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过所述norrin调节所有所述基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述脉管屏障是在受试者体内的视网膜血管。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述受试者具有与年龄有关的黄斑变性或增生性视网膜病变。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述暴露步骤是通过眼内注射。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述暴露步骤是通过全身施用。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述受试者是人。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述受试者是以下中的一个：牛，马，绵羊，猪，山羊，鸡，猫，狗，小鼠，豚鼠，仓鼠，兔，大鼠，和来源于前述中的一者的细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述norrin为SEQ ID NO.2的多肽。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述norrin是SEQ ID NO.1的片段，所SEQ ID NO.1的片段结合所述视网膜血管细胞的frizzled-4受体。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述norrin是重组的。

12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括：在留给所述norrin足够的时间来调节所述基因表达之后，使染料与所述视网膜血管细胞接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述染料是伊文思蓝染料或荧光素。