ES2941502T3 - Variantes de cápsides de virus adenoasociado y procedimientos de utilización de las mismas - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan variantes de proteínas de la cápside de virus adenoasociados (AAV) que tienen una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental, que, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una mayor infectividad de uno o más tipos de células de la retina. en comparación con el infect! vidad de las células de la retina por un virión AA V que comprende la proteína de la cápside AAV parental no modificada. También se proporcionan viriones de AAV recombinantes y composiciones farmacéuticas de los mismos que comprenden una proteína de la cápside de AAV variante como se describe en el presente documento, métodos para producir estas proteínas y viriones de la cápside de AAVr, y métodos para usar estas proteínas y viriones de la cápside de AAVr en investigación y en la práctica clínica, por ejemplo en , por ejemplo, el suministro de secuencias de ácido nucleico a una o más células de la retina para el tratamiento de trastornos y enfermedades de la retina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de cápsides de virus adenoasociado y procedimientos de utilización de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente invención descrita en el presente documento se refiere generalmente al campo de los viriones de virus adenoasociados (AAV) que comprenden variantes de proteínas de la cápside tal como se reivindica.

ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN

[0002] Las enfermedades hereditarias de la retina abarcan un gran grupo de enfermedades genéticas heterogéneas que afectan aproximadamente a 1 de cada 3000 personas (más de 2 millones de personas en todo el mundo) y son una fuente importante de pérdida grave de la visión o ceguera. Las enfermedades retinianas complejas y multifactoriales, tales como la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (wAMD) y la retinopatía diabética (DR), afectan incluso a más personas, con 1,7 millones de estadounidenses que actualmente viven con pérdida grave de la visión central asociada con wAMD y casi un tercio de los adultos mayores de 40 años con diabetes siendo discapacitados visuales. Estas enfermedades suelen estar asociadas con la disfunción o muerte de uno o más tipos de células de la retina, en algunos casos debido a la ausencia de expresión o función de una proteína clave, por ejemplo, RPE65 en LCA2, en otros casos debido a mutaciones genéticas que crear productos génicos tóxicos, por ejemplo, mutaciones dominantes que afectan al plegamiento de la proteína rodopsina, o en otro casos, debido a cambios en la fisiología retinal inducidos por la expresión ectópica de una proteína, por ejemplo, VEGF en wAMD.

[0003] Un enfoque para abordar esta gran necesidad no médica es la terapia mediada por virus adenoasociados (AAV) basada en genes, en la que se usa un virus adenoasociado recombinante (rAAV) para suministrar un gen a uno o más tipos de células en la retina, por ejemplo, para reemplazar un gen que falta, para corregir un gen defectuoso dominante o para proporcionar una plantilla para la terapia continua de proteínas. Si bien la terapia génica clínica basada en AAV ha tenido un éxito cada vez mayor, todavía está plagada de deficiencias con respecto a las propiedades del vector viral, que incluyen, por ejemplo, dirigirse a las células deseadas de la retina con alta eficiencia. Por ejemplo, se han identificado y caracterizado múltiples serotipos homólogos de AAV de primates y numerosos serotipos de primates no humanos, siendo AAV2 el mejor caracterizado entre los serotipos de a Av y el primero en adaptarse como vehículo de suministro de genes en el ojo. Sin embargo, no se ha descrito que estos AAV (incluido AAV2) sean efectivos para transducir los tipos de células más profundas de la retina cuando se suministran mediante administración intravítrea. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de nuevas variantes de AAV con capacidades de transducción superiores que proporcionen un suministro basado en genes más eficaz a las células de la retina para el tratamiento de enfermedades oculares. Existe una necesidad en la técnica de tales variantes de AAV que muestren un perfil de transducción retiniana mejorado, en algunos casos ampliamente, en otros casos preferentemente a ciertos tipos de células retinales, en comparación con los AAV de tipo salvaje y las variantes de AAV conocidas en la técnica.

[0004] El AAV de origen natural es un virus de ADN monocatenario que contiene tres marcos de lectura abiertos, rep, cap y aap. El primer gen, rep, codifica cuatro proteínas necesarias para la replicación del genoma (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40), el segundo, cap, expresa tres proteínas estructurales (VP1-3) que se ensamblan para formar la cápside viral, y el tercero expresa la proteína activadora del ensamblaje (AAP) que es esencial para el ensamblaje de la cápside. El AAV depende de la presencia de un virus auxiliar, tal como un adenovirus o un herpesvirus, para la replicación activa. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV establece un estado latente en el que su genoma se mantiene episomalmente o se integra en el cromosoma huésped en el locus AAVS1.

[0005] Pueden usarse técnicas de evolución dirigida in vitro e in vivo para seleccionar variantes de AAV que ofrezcan una mejora con respecto a los vectores actuales de suministro de genes basados en AAV. Dichas técnicas de evolución dirigida se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación PCT WO 2014/194132 y Kotterman & Schaffer (Nature Review Genetics, AOP, publicada en línea el 20 de mayo de 2014; doi: 10.1038/nrg3742). La evolución dirigida es un enfoque de ingeniería de la cápside que emula la evolución natural a través de rondas iterativas de diversificación genética y procesos de selección, lo que permite la acumulación de mutaciones beneficiosas que mejoran progresivamente la función de una biomolécula, tal como un virión basado en AAV. En este enfoque, los genes cap de AAV de tipo salvaje se diversifican para crear grandes bibliotecas genéticas que se empaquetan para generar bibliotecas de partículas virales, y se aplica una presión selectiva para aislar variantes únicas con fenotipos superiores que pueden superar las barreras de administración de genes.

[0006] Se han descrito variantes de AAV, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 9.193.956; 9;186;419; 8.632.764; 8.663.624; 8.927.514; 8.628.966; 8.263.396; 8.734.809; 8.889.641; 8.632.7; 8.691.948; 8.299.295; 8.802.440; 8.445.267; 8.906.307; 8.574.583; 8.067.015; 7.588.772; 7.867.484; 8.163.5 43; 8.283.151; 8.999.678; 7.892.809; 7.906.111; 7.259.151; 7.629.322; 7.220.577; 8.802.080; 7.198.951; 8.31 8.480; 8.962.332; 7.790.449; 7.282.199; 8.906.675; 8.524.446; 7.712.893; 6.491.907; 8.637.255; 7.186.522; 7 .105.345; 6.759.237; 6.984.517; 6.962.815; 7.749.492; 7.259.151; y 6.156.303; Números de publicación de Estados Unidos 2013/0295614; 2015/0065562; 2014/0364338; 2013/0323226; 2014/0359799; 2013/0059732; 2014/0037585; 2014/0056854; 2013/0296409; 2014/0335054; 2013/0195801; 2012/0070899; 2011/0275529; 2011/0171262; 2009/0215879; 2010/0297177; 2010/0203083; 2009/0317417; 2009/0202490; 2012/0220492; 2006/0292117; y 2004/0002159; Números de publicación europea 2692731 A1; 2383346 B1; 2359865 B1; 2359866 B1; 2359867 B1; y 2357010 B1; 1791858 B1; 1668143 B1; 1660678 B1; 1664314 B1; 1496944 B1; 1456383 B1; 2341068 B1; 2338900 B1; 1456419 B1; 1310571 B1; 1456383 B1; 1633772 B1; y 1135468 B1;y números de publicación internacional (PCT) WO 2014/124282; WO 2013/170078; WO 2014/160092; documento WO 2014/103957; WO 2014/052789; documento WO 2013/174760; WO 2013/123503; WO 2011/038187; y WO 2008/124015; WO 2003/054197; sin embargo, ninguna de estas referencias divulga las realizaciones y/o las características y/o la composición de las estructuras de materia de las variantes de AAV descritas en el presente documento.

[0007] El documento WO2017218842A1 describe variantes de virus adenoasociados y procedimientos para usar los mismos. El documento WO2009012176A2 describe procedimientos y composiciones para tratar enfermedades cerebrales.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención está definida por las reivindicaciones. En el presente documento se proporcionan variantes de proteínas de la cápside del virus adenoasociado (AAV), según se reivindica, que tienen una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside del AAV parental, que, cuando están presentes en un virión del AAV, confieren una mayor infectividad de uno o más tipos de células de la retina en comparación con la infectividad de las células de la retina por un virión de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV parental no modificada. También se proporcionan viriones de AAV recombinantes y composiciones farmacéuticas de los mismos que comprenden una variante de la proteína de la cápside de AAV, tal como se describe en el presente documento, procedimientos para producir variantes de proteínas de la cápside de AAV y viriones, y procedimientos para usar estas proteínas de la cápside de AAVr y viriones en investigación y en la práctica clínica, por ejemplo, en el suministro de secuencias de ácidos nucleico a una o más células de la retina para el tratamiento de trastornos y enfermedades de la retina.

[0009] En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan variantes de proteínas de la cápside del virus adenoasociado (AAV), tal como se define en las reivindicaciones, teniendo estas variantes de proteínas de la cápside del AAV una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos en relación con una cápside del AAV parental, que, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una mayor infectividad de uno o más tipos de células retinales (por ejemplo, una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones, conos), una célula ganglionar de la retina (ROC), una célula glial (por ejemplo, una célula glial de Müller, una célula microglial), una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal y/o una célula del epitelio pigmentado de la retina (RPE)) en comparación con la infectividad de las células de la retina por un virión de ^a A^v que comprende una proteína de la cápside de AAV parental que no comprende la modificación de la secuencia de aminoácidos.

[0010] En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan viriones de AAV recombinantes (rAAV), tal como se define en las reivindicaciones, comprendiendo estos viriones de rAAV una variante de la proteína de la cápside, tal como se describe en el presente documento, donde los viriones de rAAV exhiben una mayor infectividad de uno o más tipos de células retinales (por ejemplo, una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones, conos), una célula ganglionar de la retina (RGC), una célula glial (por ejemplo, una célula glial de Müller, una célula microglial), una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal y/o una célula del epitelio pigmentado de la retina (RPE)) en relación con la infectividad de la célula de la retina por un virión de AAV que comprende una proteína de cápside de AAV parental no modificada correspondiente. En algunas realizaciones, el virión de rAAV exhibe una mayor infectividad de todas las células de la retina en relación con el virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental. En otras realizaciones, el virión de rAAV exhibe una mayor infectividad de ciertos tipos de células de la retina, pero no de otros en relación con el virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental. Dicho de otra manera, el virión de rAAV exhibe una mayor infectividad que es preferencial para ciertos tipos de células de la retina, pero no para otros, por ejemplo, el rAAV muestra preferentemente una infectividad aumentada de uno o más tipos de células seleccionados entre células fotorreceptoras, células ganglionares de la retina, células gliales, células bipolares, células amacrinas, células horizontales y/o células del epitelio pigmentado de la retina (RPE), pero no demuestra una mayor infectividad de todos los tipos de células.

[0011] En algunas realizaciones, el virión de rAAV comprende un ácido nucleico heterólogo. En algunas de tales realizaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica un ARN que codifica un polipéptido. En otras de dichas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico heterólogo codifica un ARN que no codifica un polipéptido, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico heterólogo, un agente de interferencia de ARN, un ARN guía para una nucleasa, etc.

[0012] También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden los viriones de rAAV infecciosos en cuestión y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0013] También se proporciona un virión de rAAV que comprende una variante de la proteína de la cápside tal como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de administración de un ácido nucleico heterólogo a una célula diana (tal como una célula de la retina) poniendo en contacto la célula diana con el virión de rAAV. En algunas realizaciones, la célula diana está in vivo, tal como en el ojo de un individuo que necesita tratamiento para una enfermedad ocular. En otras realizaciones, la célula diana es in vitro.

[0014] También se proporciona un virión de rAAV tal como se reivindica para su uso en procedimientos de tratamiento de una enfermedad ocular administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de viriones de rAAV que comprenden una variante de la proteína de la cápside tal como se describe en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de los viriones de rAAV.

[0015] También se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica una variante de la proteína de la cápside de AAV tal como se describe en el presente documento y una célula huésped que comprende el ácido nucleico aislado. En aún otras realizaciones, el ácido nucleico aislado y/o la célula huésped aislada comprende el rAAV.

[0016] La variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una inserción tal como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una mayor infectividad de una célula de la retina en comparación con la infectividad de una célula de la retina por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. El péptido comprende la secuencia definida en las reivindicaciones.

[0017] En algunas realizaciones, el péptido consiste esencialmente en la secuencia ISDQTKH (SEQ ID NO: 14).

[0018] En algunos aspectos, la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en la que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión AAV, confiere una mayor infectividad de una célula retiniana en comparación con la infectividad de una célula retinal por un virión AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.

[0019] En aspectos relacionados, la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica y una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en la que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión AAV, confiere una mayor infectividad de una célula retinal comparada con la infectividad de una célula retinal por un virión AAV que comprende la proteína de la cápside AAV parental correspondiente.

[0020] También se describe en el presente documento una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) y una sustitución P34A en relación a AAV2.

[0021] También se describe en el presente documento una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) y las sustituciones de aminoácidos N312^k , N449D, N551S, I698V y L735Q en relación con AAV2.

[0022] También se describen en este documento procedimientos para la fabricación y/o administración de un rAAV que comprende una variante de cápside de AAV, tal como se describe en este documento. Además, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden un rAAV que comprende una variante de cápside de AAV, tal como se describe en el presente documento y para usar en los procedimientos descritos en el presente documento.

[0023] En otras realizaciones, el virión AAV que comprende la variante de la proteína de la cápside en los párrafos anteriores puede incorporar cualquiera de las realizaciones descritas anterior o posteriormente. De hecho, se entiende que ciertas características de la presente invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la presente invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones pertenecientes a la presente invención están específicamente abarcadas por la presente invención y se describen en el presente documento como si todas y cada una de las combinaciones se divulgara de forma individual y explícita. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas están abarcadas de manera específica por la presente invención y se describen en el presente documento como si todas y cada una de las subcombinaciones se divulgara de forma individual y explícita.

[0024] La presente invención está definida por las reivindicaciones.

[0025] Otras características y ventajas de la presente invención descrita en este documento serán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0026] La presente invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. El expediente de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos en color previa solicitud y pago de la tasa necesaria. Se enfatiza que, de acuerdo con la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras. La Figura 1 representa realizaciones de una metodología de evolución dirigida. La etapa (a) representa la generación de una biblioteca de cápside viral que comprende combinaciones de técnicas de mutación de ADN y genes cap. La etapa (b) representa el empaquetamiento de los virus de modo que cada partícula viral está compuesta por una cápside mutante que rodea el gen cap que codifica esa cápside y se purifica. A continuación, la biblioteca de la cápside se somete a presión selectiva in vitro o in vivo. En este aspecto de la tecnología de evolución dirigida, se recolectan tejidos o material celular de interés para el aislamiento de variantes de AAV que han infectado con éxito esa diana, y se recuperan los virus exitosos. La etapa (c) representa el enriquecimiento de la Etapa 1 de los clones exitosos a través de la selección repetida. La etapa (d) representa el enriquecimiento de la etapa 2 de los genes cap seleccionados que se someten a rediversificación y etapas de selección adicionales para aumentar iterativamente la aptitud viral. La etapa (e) representa las variantes, identificadas como aciertos durante las etapas 1 y 2 de selección de vectores, que se fabricarán como vectores de AAV recombinantes y se caracterizarán por el nivel de transducción de varios tipos de células y dianas de tejido. Por la naturaleza del proceso de evolución dirigido por AAV, las variantes que se describen en este documento ya han demostrado la capacidad de transducir células de la retina y suministrar un genoma (el genoma que codifica el gen cap variante) durante el proceso de selección.

La figura 2 proporciona un esquema de montaje plano de la retina que muestra dónde se recolectan las muestras a partir de las cuales se amplifican los genomas virales en un área amplia de la retina.

La Figura 3 muestra una amplificación por PCR de genomas virales de la capa de células ganglionares (GCL), la capa nuclear interna (INL), la capa nuclear externa/fotorreceptora (ONL) y el tejido retiniano de la capa del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de una ronda representativa de selección . Tanto el ojo derecho (imagen superior) como el ojo izquierdo (imagen inferior) fueron inyectados con la biblioteca. Se tomaron muestras de la retina interna (adentro), retina media (medio) y retina externa/periférica (afuera). Las bandas dentro de los recuadros rojos representan la amplificación exitosa de los genomas virales.

Las Figuras 4A-4^d muestra la frecuencia de motivos dentro del análisis de secuenciación. La Figura 4A proporciona el análisis de secuenciación de la Ronda 3. La Figura 4B proporciona el análisis de secuenciación de la Ronda 4. La Figura 4C proporciona el análisis de secuenciación de la Ronda 5. La Figura 4D proporciona el análisis de secuenciación de la Ronda 6.

La Figura 5 proporciona un modelo tridimensional representativo de AAV2 que contiene un heptámero aleatorio después del aminoácido 587.

La Figura 6 proporciona una alineación de las SEQ ID NOS: 1-11 de AAV de tipo salvaje que muestra ubicaciones de aminoácidos entre y a lo largo de los serotipos de tipo salvaje (naturales) AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV4-10.

La Figura 7 proporciona imágenes de fluorescencia de fondo de ojo tomadas con un Heidelberg Spectralis™ de la retina de un mono verde africano después de la administración intravítrea de 2 * 1011 genomas vectoriales (vg) de AAV2 que suministran un transgén GFP bajo el control del promotor CMV (AAV2.CMV.GFP). Las imágenes se tomaron al inicio (A) y a los 14 días (B), 28 días (C) y 42 días (D) después de la inyección. La Figura 8 proporciona imágenes de fluorescencia de fondo de ojo tomadas con un Heidelberg Spectralis™ de la retina de un mono verde africano después de la administración intravítrea de 2 * 1011 genomas vectoriales (vg) de la nueva variante de AAV LAISDQTKHA+P34A que suministra un transgén GFP bajo el control del promotor CMV (LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP). Imágenes tomadas al inicio (A) y a los 14 días (B), 28 días (C) y 42 días (D) después de la inyección.

La Figura 9 proporciona imágenes de fluorescencia del fondo de ojo tomadas con un Heidelberg Spectralis ™de las retinas de monos Cynomolgus tras la administración intravítrea de la nueva variante de AAV LAISDQTKHA+P34A que suministra un transgén GFP bajo el control del promotor CAG (LAISDQTKHA+P34A.c Ag .EGFP). (A) La retina de un mono inyectado por vía intravítrea con 2 * 1011 vg de vector, fotografiada 14 días (A1), 21 días (A2) y 28 días (A3) después de la inyección. (B) La retina de un mono inyectado por vía intravítrea con 1 * 1012 vg de vector, fotografiada 14 días (B1) y 21 días (B2) después de la inyección.

Las Figuras 10A-10E proporcionan los resultados del análisis inmunohistoquímico de la retina de un mono inyectado intravítreamente con 1 * 1012vg de la nueva variante de AAV LAISDQTKHA+P34A que suministra un transgén de GFP bajo el control del promotor CAG, analizado tres semanas después de la inyección. Toda la inmunohistoquímica se proporciona junto con la imagen de fluorescencia del fondo de ojo correspondiente, con un cuadro rojo para indicar aproximadamente en qué parte de la retina se realizó el análisis. Figura 10A: Se observó una transducción robusta de epitelio pigmentario de retina (RPE) y fotorreceptor utilizando un anticuerpo específico de GFP (rojo). La inmunotinción del fotorreceptor de cono usando un anticuerpo de opsina M/L se muestra en blanco. Figuras 10B y 10C: Se observó una transducción robusta de fotorreceptores de conos y bastones (Figura 10B) y RPE (Figura 10C) mediante fluorescencia de EGFP directa (verde) y mediante inmunohistoquímica usando un anticuerpo específico de GFP (rojo). Los melanosomas en RPE aparecen negros en la imagen. Figura 10D: La transducción de fotorreceptores de cono (identificados por opsina M/L, blanco) y células ganglionares de la retina (RGC) en y alrededor de la fóvea se observó mediante fluorescencia de EGFP directa (verde) y mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico de GFP (rojo). Las imágenes en los paneles centrales son una ampliación mayor (63X) del área indicada por un cuadro blanco en el panel izquierdo. Figura 10E: se observó la transducción de células ganglionares de la retina (RGC) y la capa de células ganglionares de la retina mediante fluorescencia de EGFP directa (paneles derechos, verde; el panel inferior derecho es un aumento de 63X del panel superior derecho); el panel superior izquierdo muestra la región bajo iluminación de campo brillante.

Las Figuras 11A-11F proporcionan datos sobre la transducción de células del epitelio pigmentario de la retina humana (RPE) in vitro por el virus de AAV recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV LAISDQTKHA+P34A y un transgén GFP bajo el control del promotor CAG. Las células que se diferenciaron en células RPE de una línea de células madre embrionarias humanas (Figuras 11A y 11C) o de células madre pluripotentes inducidas derivadas de fibroblastos humanos (FB-iPSC) (Figuras 11B y 11D) se infectaron con la nueva variante de AAV LAISDQTKHA+P34A.CAG.GFP o control de tipo salvaje AAV2.CAG.GFP. Figuras 11A y 11B: Imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares 7 días después de la infección a una MOI de 500 demuestran que la nueva variante de la cápside de AAV (paneles de la izquierda) transduce las células RPE mejor que la cápside de AAV2 de tipo salvaje (paneles de la derecha). Figuras 11C y 11D: La cuantificación del porcentaje de células RPE positivas para GFP en cada cultivo mediante citometría de flujo revela que la nueva variante de la cápside de AAV proporciona una mejora significativa, dependiente de la dosis, en el número de células transducidas sobre la cápside de AAV2 de tipo salvaje, independientemente de la fuente celular. Figuras 11E y 11F: La cuantificación de la cantidad de ^g F^p en cada cultivo por transferencia Western revela que la nueva variante de AAV proporciona una mejora significativa en la expresión del transgén sobre la cápside de tipo salvaje independientemente de la fuente celular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0027] Antes de que se describan los presentes procedimientos y composiciones, debe entenderse que la presente invención no se limita a un procedimiento o composición particular descrito y, como tal, puede variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

[0028] La presente invención descrita en este documento se ilustra en las figuras y la descripción. Sin embargo, aunque en las figuras se ilustran realizaciones particulares, no se pretende limitar la presente invención a la realización o realizaciones específicas ilustradas y/o descritas. La presente invención está definida por las reivindicaciones.

[0029] Por tanto, las figuras pretenden ser ilustrativas y no restrictivas.

[0030] Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese rango también se describen de manera específica. Cada rango más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un rango establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese rango establecido está abarcado dentro de la presente invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el rango, y cada rango en el que alguno, ninguno o ambos límites están incluidos en los rangos más pequeños también está incluido dentro de la presente invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango establecido incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen alguno o ambos de los límites incluidos también están incluidos en la presente invención.

[0031] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen algunos procedimientos y materiales potenciales y preferidos.

[0032] Cualquier procedimiento enumerado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

[0033] Se observa que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el"/” la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un virión de AAV recombinante" incluye una pluralidad de dichos viriones y la referencia a "la célula fotorreceptora" incluye la referencia a una o más células fotorreceptoras y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Por tanto, esta afirmación pretende servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la mención de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".

[0034] Las publicaciones discutidas en este documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí contenido debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales, por lo que es posible que sea necesario confirmarlas de forma independiente.

DEFINICIONES

[0035] A menos que se defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta tecnología.

[0036] El virus adenoasociado es un parvovirus no patógeno compuesto por un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb dentro de una cápside icosaédrica sin envoltura. El genoma contiene tres marcos de lectura abiertos (ORF) flanqueados por repeticiones terminales invertidas (ITR) que funcionan como el origen viral de la replicación y la señal de empaquetamiento. El ORF de rep codifica cuatro proteínas no estructurales que desempeñan funciones en la replicación viral, la regulación transcripcional, la integración específica del sitio y el ensamblaje del virión. El ORF de cap codifica tres proteínas estructurales (VP 1-3) que se ensamblan para formar una cápside viral de 60 unidades. Finalmente, un ORF presente como un marco de lectura alternativo dentro del gen cap produce la proteína activadora de ensamblaje (AAP), una proteína viral que localiza las proteínas de la cápside de AAV en el nucléolo y funciona en el proceso de ensamblaje de la cápside.

[0037] Hay varios serotipos naturales ("de tipo salvaje") y más de 100 variantes conocidas de AAV, cada una de las cuales difiere en la secuencia de aminoácidos, particularmente dentro de las regiones hipervariables de las proteínas de la cápside y, por lo tanto, en sus propiedades de suministro de genes. Ningún AAV se ha asociado con ninguna enfermedad humana, lo que hace que el AAV recombinante sea atractivo para aplicaciones clínicas.

[0038] A los efectos de la presente descripción, la terminología "AAV" es una abreviatura de virus adenoasociado, que incluye, sin limitación, el propio virus y sus derivados. Excepto donde se indique lo contrario, la terminología se refiere a todos los subtipos o serotipos y a las formas recombinantes y competentes para la replicación. El término "AAV" incluye, sin limitación, a Av tipo 1 (AAV-1 o AAV1), AAV tipo 2 (AAV-2 o AAV2), AAV tipo 3A (AAV-3A o AAV3A), AAV tipo 3B (AAV-3B o AAV3B), AAV tipo 4 (AAV-4 o AAV4), AAV tipo 5 (AAV-5 o AAV5), AAV tipo 6 (AAV-6 o AAV6), AAV tipo 7 (AAV-7 o AAV7), AAV tipo 8 (AAV-8 o AAV8), AAV tipo 9 (AAV-9 o AAV9), AAV tipo 10 (AAV-10 o AAV10 o AAVrh10), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV caprino, AAV equino, AAV de primate , AAV de no primates y AAV ovino. "AVV de primate" se refiere a AAV que infecta primates, “AVV de no primates” se refiere a AAV que infecta a mamíferos que no son primates, “AAV bovino” se refiere a AAV que infecta a mamíferos bovinos, etc.

[0039] Las secuencias genómicas de varios serotipos de AAV, así como las secuencias de las repeticiones terminales nativas (TR), las proteínas Rep y las subunidades de la cápside son conocidas en la técnica. Tales secuencias se pueden encontrar en la literatura o en bases de datos públicas, tales como GenBank. Véase, por ejemplo, los números de acceso de GenBank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729 .1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) y AA088208 (AAVrh10).

[0040] Véase también, por ejemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. J. Virology 73:1309; Según Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Según Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al. Alabama. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Morris et al. (2004) Virology 33:375 383; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y la patente de EE.UU. No. 6.156.303.

[0041] Las secuencias de proteínas cap (cápside) existentes de forma natural asociadas con los serotipos de AAV se conocen en la técnica e incluyen las descritas en el presente documento como AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3A (SEQ ID NO: 3 ), AAV3B (SEC ID NO: 4), AAV4 (SEC ID NO: 5), AAV5 (SEC ID NO: 6), AAV6 (SEC ID NO: 7), AAV7 (SEC ID NO: 8), AAV8 (SEC ID NO: 9), AAV9 (SEC ID NO: 10), AAV10 (SEC ID NO: 11) y AAVrh10 (SEC ID NO: 12). Los términos "variante de la proteína de la cápside de AAV" o "variante de AAV" se refieren a una proteína de la cápside de AAV que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una modificación o sustitución (incluida la eliminación, inserción, mutación puntual, etc.) en relación con secuencias de proteínas de la cápside de AAV existentes de forma natural o de "tipo salvaje", por ejemplo, tal como se establece en SEQ ID NO: 1-12 en este documento. Una variante de la proteína de la cápside de AAV puede tener aproximadamente un 80 % de identidad o más con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de tipo salvaje, por ejemplo, un 85 % de identidad o más, un 90 % de identidad o más, o un 95 % de identidad o más con la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de tipo salvaje, por ejemplo, un 98 % o 99 % de identidad con la proteína de la cápside de tipo salvaje. Una variante de la proteína de la cápside de AAV puede no ser una proteína de la cápside de tipo salvaje.

[0042] Para los fines de la presente descripción, "virión de AAV" o "partícula viral de AAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV y un polinucleótido de AAV encapsidado.

[0043] Para los fines de la descripción del presente documento, la terminología "rAAV" es una abreviatura que se refiere a virus adenoasociado recombinante. "Recombinante", tal como se aplica a un polinucleótido, significa que el polinucleótido es el producto de varias combinaciones de etapas de clonación, restricción o ligadura, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que es distinta de un polinucleótido que se encuentra en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen, respectivamente, réplicas de la construcción de polinucleótidos original y la progenie de la construcción de virus original.

[0044] El término "vector de rAAV" abarca viriones de rAAV (es decir, partículas virales de rAAV) (por ejemplo, un virión de rAAV infeccioso), que por definición incluyen un polinucleótido de rAAV; y también abarca polinucleótidos que codifican rAAV (por ejemplo, un polinucleótido monocatenario que codifica rAAV (ss-rAAV); un polinucleótido bicatenario que codifica rAAV (ds-rAAV), por ejemplo, plásmidos que codifican rAAV y similares).

[0045] Si un virión de AAV comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido que no sea un genoma de AAV de tipo salvaje, por ejemplo, un transgén que se suministrará a una célula diana, un agente de ARNi o un agente CRISPR que se suministrará a una célula diana, etc.), normalmente se denomina "virión de AAV recombinante (rAAV)" o "partícula viral de rAAV". En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, y generalmente por dos, secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV.

[0046] El término "empaquetamiento" se refiere a una serie de eventos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y la encapsidación de una partícula de AAV. Los genes "rep" y "cap" de AAV se refieren a secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas de replicación y encapsidación de virus adenoasociados. rep y cap de AAV se denominan en el presente documento "genes de empaquetamiento" de AAV.

[0047] La terminología "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que AAV (por ejemplo , AAV de tipo salvaje) sea replicado y empaquetado por una célula de mamífero. Se conocen en la técnica una variedad de tales virus auxiliares para AAV, incluidos adenovirus, herpesvirus y poxvirus, tales como vaccinia. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más utilizado. Numerosos adenovirus de origen humano, de mamíferos no humanos y de aves son conocidos y están disponibles en depósitos, tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), así como citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV); que también están disponibles en depósitos, tales como ATCC.

[0048] La terminología "función o funciones del virus auxiliar" se refiere a la función o funciones codificadas en un genoma de virus auxiliar que permite la replicación y el empaquetamiento de AAV (junto con otros requisitos para la replicación y el empaquetamiento descritos en este documento). Tal como se describe en el presente documento, la "función del virus auxiliar" se puede proporcionar de varias formas, incluso proporcionando virus auxiliares o proporcionando, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos que codifican la función o funciones requeridas a una célula productora en trans. Por ejemplo, un plásmido u otro vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas adenovirales se transfecta en una célula productora junto con un vector de rAAV.

[0049] La terminología virus o partícula viral "infecciosa" es aquella que comprende una cápside viral ensamblada competentemente y es capaz de suministrar un componente de polinucleótido en una célula para la cual la especie viral es trópica. El término no implica necesariamente ninguna capacidad de replicación del virus. Los ensayos para contar partículas virales infecciosas se describen en otra parte de esta descripción y en la técnica. La infectividad viral se puede expresar como la proporción de partículas virales infecciosas con respecto a partículas virales totales. Los procedimientos para determinar la proporción de partículas virales infecciosas con respecto a partículas virales totales son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11: S337 (que describe un ensayo de título infeccioso TCID50); y Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. Ver también los Ejemplos.

[0050] El término "tropismo", tal como se usa en el presente documento, se refiere al reconocimiento preferencial por parte de un virus (por ejemplo, un AAV) de células de una especie huésped particular o de tipos de células particulares dentro de una especie huésped. Por ejemplo, un virus que puede infectar células del corazón, pulmón, hígado y músculo tiene un tropismo más amplio (es decir, aumentado) en relación con un virus que puede infectar sólo células de pulmón y músculo. El tropismo también puede incluir la dependencia de un virus de tipos particulares de moléculas de la superficie celular del huésped. Por ejemplo, algunos virus pueden infectar solo células con glicosaminoglicanos de superficie, mientras que otros virus pueden infectar solo células con ácido siálico (estas dependencias pueden probarse utilizando varias líneas celulares deficientes en clases particulares de moléculas como posibles células huésped para la infección viral). En algunos casos, el tropismo de un virus describe las preferencias relativas del virus. Por ejemplo, un primer virus puede infectar todos los tipos de células, pero tiene mucho más éxito en infectar aquellas células con glicosaminoglicanos de superficie. Se puede considerar que un segundo virus tiene un tropismo similar (o idéntico) al primer virus si el segundo virus también prefiere las mismas características (por ejemplo, el segundo virus también tiene más éxito en infectar aquellas células con glicosaminoglicanos de superficie), incluso si el las eficiencias de transducción absolutas no son similares. Por ejemplo, el segundo virus podría ser más eficiente que el primer virus para infectar cada tipo de célula determinada probada, pero si las preferencias relativas son similares (o idénticas), aún se puede considerar que el segundo virus tiene un tropismo similar (o idéntico) al primer virus. En algunas realizaciones, el tropismo de un virión que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión no está alterado en relación con un virión de origen natural. En algunas realizaciones, el tropismo de un virión que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión se expande (es decir, se amplía) en relación con un virión de origen natural. En algunas realizaciones, el tropismo de un virión que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión se reduce en relación con un virión de origen natural.

[0051] La terminología virus "competente para la replicación" (por ejemplo, un AAV competente para la replicación) se refiere a un virus fenotípicamente salvaje que es infeccioso y también es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o que funciona como un virus auxiliar). En el caso de AAV, la competencia de replicación generalmente requiere la presencia de genes de empaquetamiento de AAV funcionales. En general, los vectores de rAAV, tal como se describen en este documento, son incompetentes para la replicación en células de mamífero (especialmente en células humanas) en virtud de la falta de uno o más genes de empaquetamiento de AAV. Típicamente, tales vectores de rAAV carecen de secuencias de genes de empaquetamiento de AAV para minimizar la posibilidad de que se generen AAV competentes para la replicación mediante la recombinación entre genes de empaquetamiento de AAV y un vector de rAAV entrante. En muchas realizaciones, las preparaciones de vector de rAAV, tal como se describen en el presente documento, alguna, si las tienen, a Vv competentes para la replicación (rcAAV, también denominado como TCA) (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 102 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 104 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 10 partículas rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 1012 partículas de rAAV, o ningún rcAAV).

[0052] El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, incluidos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, y puede estar interrumpido por componentes que no son nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones en la estructura de nucleótidos pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. El término polinucleótido, tal como se usa en el presente documento, se refiere indistintamente a moléculas monocatenarias y bicatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización del presente documento que comprenda un polinucleótido abarca tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formas complementarias de cadena sencilla conocidas o previstas para formar la forma de doble cadena.

[0053] Un polinucleótido o polipéptido tiene un cierto porcentaje de "identidad de secuencia" con otro polinucleótido o polipéptido, significa que, cuando se alinea, ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencia se puede determinar de varias maneras diferentes. Para determinar la identidad de la secuencia, las secuencias se pueden alinear utilizando procedimientos y programas informáticos, incluido BLAST, disponible en la red en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Otro algoritmo de alineación es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, EE. UU., una subsidiaria de propiedad total de Oxford Molecular Group, Inc. Otras técnicas de alineación se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, E^e . UU. De particular interés son los programas de alineación que permiten espacios en la secuencia. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en las alineaciones de secuencias. Ver Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Además, el programa GAP que utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch se puede utilizar para alinear secuencias. Véase J. Mol. Biol. 48: 443­ 453 (1970).

[0054] El término "gen" se refiere a un polinucleótido que realiza una función de algún tipo en la célula. Por ejemplo, un gen puede contener un marco de lectura abierto que sea capaz de codificar un producto génico. Un ejemplo de un producto génico es una proteína, que se transcribe y traduce a partir del gen. Otro ejemplo de un producto génico es un ARN, por ejemplo, un producto de ARN funcional, por ejemplo, un aptámero, un ARN de interferencia, un ARN ribosómico (ARNr), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN no codificante (ARNnc), un ARN guía para nucleasas, etc., que se transcribe pero no se traduce.

[0055] La terminología "producto de expresión génica" o "producto génico" es una molécula resultante de la expresión de un gen particular, tal como se define anteriormente. Los productos de expresión génica incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un aptámero, un ARN de interferencia, un ARN mensajero (ARNm), un ARNr, un ARNt, un ARN no codificante (ARNnc) y similares.

[0056] El término "agente de ARNsi" ("pequeño ARN de interferencia" o "ARN de interferencia corto" (o ARNsi)) es una doble cadena de ARN de nucleótidos que reconoce un gen de interés (un "gen diana"). Una "cadena doble de ARN" se refiere a la estructura formada por el emparejamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN, formando una región de ARN de doble cadena (ARNds). El ARNsi "reconoce" un gen porque la secuencia de nucleótidos de la porción de doble cadena del ARNsi es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana. En algunas realizaciones, la longitud de la doble cadena de ARNsi es inferior a 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la doble cadena puede tener una longitud de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud de la doble cadena es de 19 a 25 nucleótidos. En algunas realizaciones, el reconocimiento de genes mediado por ARNsi se logra mediante el uso de ARN de interferencia dirigido por ADN (ddARNi), que es una técnica de silenciamiento de genes que utiliza construcciones de ADN para activar las vías de interferencia de ARN endógeno (ARNi) de una célula animal. Tales construcciones de ADN están diseñadas para expresar ARN de doble cadena autocomplementarios, típicamente ARN de horquilla corta (ARNsh), que una vez procesados provocan el silenciamiento de un gen o genes diana. Cualquier ARN, incluidos los ARNm endógenos o los ARN virales, se puede silenciar mediante el diseño de construcciones para expresar ARN de doble cadena complementario a la diana de ARNm deseado. Como tal, la porción de doble cadena de ARN de un agente de ARNsi puede ser parte de una estructura de horquilla corta denominada ARNsh. Además de la parte de doble cadena, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle colocada entre las dos secuencias que forman la doble cadena. El bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones, el bucle tiene una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener porciones salientes en 3' o 5'. En algunas realizaciones, el saliente es un saliente en 3' o 5' de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En general, el nivel del producto de expresión (por ejemplo, ARNm, polipéptido, etc.) de un gen diana se reduce mediante un agente de ARNsi (por ejemplo, un ARNsi, un ARNsh, etc.) que contiene secuencias específicas de nucleótidos de doble cadena que son complementarias a al menos un segmento de 19-25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, una secuencia de 20-21 nucleótidos) del transcrito del gen diana, incluida la región 5' no traducida (UT), el ORF o la región 3' UT. En algunas realizaciones, los ARN de interferencia cortos tienen una longitud de aproximadamente 19-25 nt. Véanse, por ejemplo, las solicitudes PCT WOO/44895, WO99/32619, WO01/75164, WO01/92513, WO01/29058, WO01/89304, WO02/16620 y WO02/29858; y la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20040023390 para descripciones de la tecnología de ARNsi. El ARNsi y/o el ARNsh pueden estar codificados por una secuencia de ácido nucleico, y la secuencia de ácido nucleico también puede incluir un promotor. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir una señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación mínima sintética.

[0057] La terminología "ARN antisentido" abarca ARN que es complementario a un producto de expresión génica. Por ejemplo, un ARN antisentido dirigido a un ARNm específico es un agente basado en ARN (o puede ser un ARN modificado) que es complementario al ARNm, donde la hibridación del ARN antisentido con el ARNm altera la expresión del ARNm (por ejemplo, alterando la estabilidad del ARN, alterando la traducción del ARN, etc.). También se incluyen en "ARN antisentido" los ácidos nucleicos que codifican un ARN antisentido.

[0058] Con respecto a los "agentes CRISPR/Cas9", el término "CRISPR" abarca repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/sistemas asociados a CRISPR (Cas) que evolucionaron para proporcionar a bacterias y arqueas una inmunidad adaptativa contra virus y plásmidos mediante el uso de ARN CRISPR (ARNcr) para guiar el silenciamiento de los ácidos nucleicos invasores. La proteína Cas9 (o equivalente funcional y/o variante de la misma, es decir, proteína similar a Cas9) contiene de forma natural actividad de ADN endonucleasa que depende de la asociación de la proteína con dos moléculas de ARN naturales o sintéticas llamadas ARNcr y ARNtracr (también llamadas ARN guía). En algunos casos, las dos moléculas se unen covalentemente para formar una sola molécula (también denominada ARN guía único ("ARNsg")). De este modo, la Cas9 o proteína similar a Cas9 se asocia con un ARN de reconocimiento de ADN (cuyo término abarca la configuración de ARN guía de dos moléculas y la configuración de ARN guía de una sola molécula), que activa la Cas9 o proteína similar a Cas9 y guía la proteína a una secuencia de ácido nucleico diana.

[0059] Si la proteína Cas9 o similar a Cas9 conserva su función enzimática natural, escindirá el ADN diana para crear una rotura de doble cadena, lo que puede conducir a la alteración del genoma (es decir, edición: eliminación, inserción (cuando está presente un polinucleótido donante), reemplazo, etc.), alterando así la expresión génica. Algunas variantes de Cas9 (cuyas variantes están abarcadas por el término similar a Cas9) se han alterado de tal manera que tienen una menor actividad de escisión de ADN (en algunos casos, escinden una sola cadena en lugar de ambas cadenas del ADN diana, mientras que en otros casos, se han reducido severamente a ninguna actividad de escisión de ADN). Las proteínas similares a Cas9 con actividad de escisión de ADN disminuida (incluso sin actividad de escisión de ADN) aún pueden guiarse a un ADN diana para bloquear la actividad de la ARN polimerasa. De manera alternativa, la proteína Cas9 o similar a Cas9 puede modificarse fusionando un dominio de activación de la transcripción VP64 a la proteína Cas9 y coadministrando la proteína de fusión con una proteína auxiliar MS2-P65-HSF1 y un único ARN guía que comprende aptámeros de ARN MS2 en el tetrabucle y el tallo-bucle para formar un complejo mediador de activación sinérgica (Cas9-SAM) en la célula que activa la transcripción. Por lo tanto, las proteínas similares a Cas9 enzimáticamente inactivas pueden dirigirse a una ubicación específica en un ADN diana mediante un ARN de reconocimiento de ADN para bloquear o activar la transcripción del ADN diana. El término "agentes CRISPR/Cas9", tal como se usa en el presente documento, abarca todas las formas de CRISPR/Cas9 tal como se describe anteriormente o como se conoce en la técnica.

[0060] Se puede encontrar información detallada sobre los agentes CRISPR, por ejemplo, en (a) Jinek et al., Science. 2012 17 de agosto; 337 (6096): 816-21: "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptative bacterial immunity"; (b) Qi et al., Cell. 201328 de febrero; 152(5): 1173-83: "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression", y (c) solicitud de patente estadounidense número 13/842,859 y solicitud PCT número PCT/US13/32589;

[0061] Por lo tanto, el término "agente CRISPR", tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier agente (o ácido nucleico que codifica dicho agente), que comprende secuencias naturales y/o sintéticas, que se pueden usar en el sistema basado en Cas9 (por ejemplo, una Cas9 o proteína similar a Cas9; cualquier componente de un ARN dirigido a ADN, por ejemplo, un ARN similar a crARN, un ARN similar a tracrARN, un ARN guía único, etc.; un polinucleótido donante; y similares).

[0062] Por "nucleasas con dedos de zinc" (ZFN) se entiende endonucleasas de ADN artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión a ADN con dedos de zinc a un dominio de escisión de ADN. Los ZFN se pueden diseñar para reconocer secuencias de ADN deseadas y esto permite que las nucleasas con dedos de zinc escindan secuencias diana únicas. Cuando se introducen en una célula, los ZFN se pueden usar para editar el ADN diana en la célula (por ejemplo, el genoma de la célula) mediante la inducción de roturas de dobles cadenas. Para obtener más información sobre el uso de ZFN, véase, por ejemplo: Asuri et al., Mol Ther. febrero de 2012; 20(2):329-38; Bibikova et al. Science. 2 de mayo de 2003; 300 (5620): 764; Madera et al. Science. 15 de julio de 2011; 333 (6040): 307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 agosto; 15 (8): 87S-85; Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 octubre; 40 (10): 759-65; Ekker et al, Zebrafish 2008 Summer; 5(2): 121-3; Young et al, Proc Natl Acad Sci USA. 26 de abril de 2011; 108(17): 7052-7; Goldberg et al., Cell. 5 de marzo de 2010; 140(5): 678-91; Geurts et al., Science. 24 de julio de 2009; 325 (5939): 433; Flisikowska y otros, PLoS One. 2011;6(6): e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 13 de junio de 2011; Proc Natl Acad Sci USA. 19 de julio de 2011; 108 (29): 12013-7; y Yu et al., Cell Res. 2011 noviembre; 21 (11): 1638-40.

[0063] El término "agente ZFN" abarca una nucleasa con dedos de zinc y/o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa con dedos de zinc.

[0064] La terminología "nucleasa efectora de tipo activador de transcripción" o agentes "TALEN" se refiere a las nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALEN) que son endonucleasas de ADN artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión de ADN efector TAL (tipo activador de transcripción) a un dominio de escisión del ADN. Las TALENs se puede diseñar rápidamente para unir prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada y, cuando se introducen en una célula, se pueden usar TALENs para editar el ADN diana en la célula (por ejemplo, el genoma de la célula) mediante la inducción de roturas de doble cadena. Para obtener más información sobre el uso de TALEN, consulte, por ejemplo: Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 7 de julio de 2011; 29 (8): 731-4; Wood et al. Science. 15 de julio de 2011; 333 (6040): 307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 5 de agosto de 2011; 29 (8): 695-6; y Huang et. al., Nat Biotechnol. 5 de agosto de 2011; 29 (8): 699-700.

[0065] El término "agente TALEN" abarca un TALEN y/o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TALEN.

[0066] La terminología "elemento de control" o "secuencia de control" se refiere a una secuencia de nucleótidos involucrada en una interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional de un polinucleótido, incluida la replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar la frecuencia, la velocidad o la especificidad del proceso, y puede ser de naturaleza potenciadora o inhibidora. Los elementos de control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de ADN capaz, en determinadas condiciones, de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante normalmente situada aguas abajo (en la dirección 3') del promotor. Los promotores pueden actuar de forma ubicua, es decir, activos en muchos tipos de células, por ejemplo, promotores CAG o CMV; o específico de tejido o célula, por ejemplo, el promotor rho, que es activo en bastones, o el promotor opsina, que es activo en conos.

[0067] La terminología "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición de elementos genéticos, en la que los elementos están en una relación que les permite operar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una región codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber residuos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga esta relación funcional.

[0068] La terminología "vector de expresión" abarca un vector que comprende una región polinucleotídica que codifica un polipéptido de interés y se usa para efectuar la expresión de la proteína en una célula diana deseada. Un vector de expresión también puede comprender elementos de control unidos operativamente a la región codificante para facilitar la expresión de la proteína en la diana. La combinación de elementos de control y un gen o genes a los que están unidos operativamente para la expresión se denomina a veces "cassette de expresión", un gran número de los cuales son conocidos y están disponibles en la técnica o pueden construirse fácilmente a partir de componentes que están disponibles en la técnica.

[0069] El término "heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor extraído de su secuencia de codificación nativa y unido operativamente a una secuencia de codificación con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterólogo. Por lo tanto, por ejemplo, un rAAV que incluye una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico heterólogo es un rAAV que incluye un polinucleótido que normalmente no se incluye en un AAV de tipo salvaje de origen natural, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico que normalmente no está codificado por un AAV de tipo salvaje de origen natural.

[0070] La terminología "alteración genética" y "modificación genética" (y variantes gramaticales de las mismas) se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un proceso en el que un elemento genético (por ejemplo, un polinucleótido) se introduce en una célula que no sea por mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo a la célula, o puede ser una copia adicional o una versión mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alteración genética puede efectuarse, por ejemplo, transfectando una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido a través de cualquier proceso conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación con fosfato de calcio o contacto con un complejo de polinucleótido-liposoma. La alteración genética también puede efectuarse, por ejemplo, mediante transducción o infección con un virus de ADN o ARN o un vector viral. Generalmente, el elemento genético se introduce en un cromosoma o minicromosoma en la célula; pero se incluye en este término cualquier alteración que cambie el fenotipo y/o genotipo de la célula y su progenie.

[0071] Con respecto a la modificación celular, la terminología "modificado genéticamente" o "transformado" o "transfectado" o "transducido" por ADN exógeno (por ejemplo, a través de un virus recombinante) se refiere a cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. La presencia del ADN exógeno da como resultado un cambio genético permanente o transitorio. El ADN transformante puede estar integrado o no (unido covalentemente) en el genoma de la célula. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

[0072] Tal como se usa en el presente documento, se dice que una célula está alterada, transducida, modificada genéticamente o transformada "de manera estable" con una secuencia genética si la secuencia está disponible para realizar su función durante el cultivo prolongado de la célula in vitro y/o durante un período prolongado de tiempo in vivo. Generalmente, dicha célula está alterada hereditariamente (modificada genéticamente) en el sentido de que se introduce una alteración genética que también es heredable por la progenie de la célula alterada.

[0073] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente marcador. Los polipéptidos, tales como los polipéptidos antiangiogénicos, los polipéptidos neuroprotectores y similares, cuando se analizan en el contexto de la administración de un producto génico a un sujeto mamífero, y sus composiciones, se refieren al polipéptido intacto respectivo, o cualquier fragmento o derivado genéticamente modificado del mismo, que conserva la función bioquímica deseada de la proteína intacta. De manera similar, las referencias a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antiangiogénicos, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antiangiogénicos y otros de dichos ácidos nucleicos para usar en el suministro de un producto génico a un sujeto mamífero (que puede denominarse “transgenes” para suministrar en una célula diana), incluyen polinucleótidos que codifican el polipéptido intacto o cualquier fragmento o derivado modificado genéticamente que posea la función bioquímica deseada.

[0074] Tal como se usa en el presente documento, un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, virión, célula huésped, proteína u otra sustancia "aislados" se refiere a una preparación de la sustancia desprovista de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes cuando la sustancia o una sustancia similar tiene lugar de forma natural o se prepara inicialmente a partir de la misma. Así, por ejemplo, se puede preparar una sustancia aislada usando una técnica de purificación para enriquecerla a partir de una mezcla de origen. El enriquecimiento se puede medir sobre una base absoluta, tal como el peso por volumen de solución, o se puede medir en relación con una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla de origen. Los enriquecimientos crecientes de las realizaciones de esta divulgación son cada vez más aislados. Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, célula huésped u ora sustancia aislados están purificados, en algunas realizaciones, por ejemplo, son puros desde aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más.

[0075] Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en este documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad) aparezcan en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o en riesgo de adquirir la enfermedad pero aún no ha sido diagnosticado de tenerla; (b) inhibir la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, provocar la regresión de la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, mejorar la enfermedad y/o uno o más síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, las composiciones y procedimientos en cuestión pueden estar dirigidos al tratamiento de enfermedades de la retina. Los procedimientos no limitativos para evaluar las enfermedades de la retina y su tratamiento incluyen medir la función de la retina y sus cambios, por ejemplo, cambios en la agudeza visual (por ejemplo, agudeza visual mejor corregida [BCVA], deambulación, navegación, detección y discriminación de objetos), cambios en el campo visual (por ejemplo, perimetría estática y cinética del campo visual), examen clínico (por ejemplo, examen con lámpara de hendidura de los segmentos anterior y posterior del ojo), respuesta electrofisiológica a todas las longitudes de onda de luz y oscuridad (por ejemplo, todas las formas de electrorretinografía (ERG) [campo completo, multifocal y patrón], todas las formas de potencial evocado visual (VEP), electrooculografía (EOG), visión del color, adaptación a la oscuridad y/o sensibilidad al contraste; medir cambios en la anatomía o la salud utilizando medidas anatómicas y/o fotográficas, por ejemplo, tomografía de coherencia óptica (OCT), fotografía de fondo de ojo, oftalmoscopia con láser de barrido con óptica adaptativa, fluorescencia y/o autofluorescencia; medir la motilidad ocular y los movimientos oculares (por ejemplo, nistagmo, preferencia de fijación y estabilidad), medir los resultados informados (cambios informados por el paciente en conductas y actividades visuales y no guiadas visualmente, resultados informados por el paciente [PRO], evaluaciones basadas en cuestionarios de calidad de vida, actividades diarias y medidas de la función neurológica (por ejemplo, imágenes por resonancia magnética nuclear (MRI) funcional).

[0076] Los términos "individuo", "huésped", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un mamífero, incluidos, pero sin limitación, seres humanos; primates no humanos, incluidos los simios; animales mamíferos deportivos (por ejemplo, caballos); animales de granja mamíferos (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mamíferos mascotas (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).

[0077] En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano que previamente ha estado expuesto de forma natural a AAV y, como resultado, alberga anticuerpos anti-AAV (es decir, anticuerpos neutralizantes de AAV). En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano al que se le ha administrado previamente un vector de AAV (y como resultado puede albergar anticuerpos anti-AAV) y necesita la readministración del vector para el tratamiento de una afección diferente o para un tratamiento adicional de la misma afección. En base a los resultados positivos en los ensayos clínicos que involucran el suministro del gen de AAV a, por ejemplo, el hígado, el músculo y la retina, todos los tejidos afectados por los anticuerpos neutralizantes contra este vehículo, existen muchas aplicaciones terapéuticas/dianas de enfermedades.

[0078] El término "cantidad eficaz", tal como se usa en el presente documento, es una cantidad suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. A los fines de esta divulgación, una cantidad eficaz de un compuesto (por ejemplo, un virión de rAAV infeccioso) es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, retardar o retrasar la progresión de (y/o los síntomas asociados con) un estado de enfermedad particular (por ejemplo, una enfermedad de la retina). Por consiguiente, una cantidad eficaz de un virión de rAAV infeccioso es una cantidad del virión de rAAV infeccioso que es capaz de suministrar de manera eficaz un ácido nucleico heterólogo a una célula diana (o células diana) del individuo. Las cantidades efectivas pueden determinarse de forma preclínica, por ejemplo, detectando en la célula o tejido el producto génico (ARN, proteína) que está codificado por la secuencia heteróloga de ácido nucleico utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, RT-PCR, transferencia Western, ELISA, fluorescencia u otras lecturas de indicadores, y similares. Las cantidades efectivas pueden determinarse clínicamente, por ejemplo, detectando un cambio en el inicio o la progresión de la enfermedad utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, autofluorescencia de fondo, angiografía con fluoresceína, OCT, microperimetría, óptica adaptativa, etc. y similares, tal como se describe en este documento y se conoce en la técnica.

[0079] La terminología "célula retinal" se refiere en el presente documento a cualquiera de los tipos de células que componen la retina, tales como, sin limitación, células ganglionares retinales (RG), células amacrinas, células horizontales, células bipolares, células fotorreceptoras, células gliales de Müller, células microgliales y epitelio pigmentado de la retina (RPE). La terminología "células fotorreceptoras" se refiere en el presente documento, sin limitación, a células bastoncillos o "bastones" y células cono o "conos". La terminología "células de Müller" o "glia de Müller" se refiere a las células gliales que soportan las neuronas en la retina de los vertebrados.

[0080] La terminología "evolución dirigida" se refiere a una metodología de ingeniería de la cápside, in vitro y/o in vivo, que emula la evolución natural a través de rondas iterativas de diversificación genética y procesos de selección, acumulando así mutaciones beneficiosas que mejoran progresivamente la función de una biomolécula. La evolución dirigida a menudo implica un procedimiento in vivo denominado "biopanning" para la selección de variantes de AAV de una biblioteca cuyas variantes poseen un nivel más eficiente de infectividad de un tipo de célula o tejido de interés.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0081] Los virus adenoasociados (AAV) son una familia de parvovirus con un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb contenido dentro de una cápside sin envoltura. El genoma viral de un AAV natural tiene 2 repeticiones terminales invertidas (ITR), que funcionan como el origen viral de la replicación y la señal de empaquetamiento, que flanquean 2 marcos de lectura abiertos (ORF) primarios: rep (que codifican proteínas que funcionan en la replicación viral, regulación transcripcional, integración específica del sitio y ensamblaje del virión) y cap. El ORF de cap codifica 3 proteínas estructurales que se ensamblan para formar una cápside viral de 60 unidades. Se han aislado muchas variantes y serotipos de AAV de origen natural, y ninguno se ha asociado con enfermedades humanas.

[0082] Las versiones recombinantes de AAV se pueden usar como vectores de administración de genes, donde se inserta un marcador o gen terapéutico de interés entre las ITR en lugar de rep y cap. Se ha demostrado que estos vectores transducen tanto las células en división como las que no se dividen in vitro e in vivo y pueden dar como resultado una expresión transgénica estable durante años en tejido posmitótico. Véase, por ejemplo, Knipe DM, Howley PM. Virología de Fields. Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, EE. Uu ., 2007; Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 11854-9; Atchison RW, Casto BC, Hammon WM Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 1965; 149: 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci USA 1966; 55: 1467­ 74; Blacklow N^r , Hoggan MD, Rowe WP. Isolation of adenovirus-associated viruses from man. Proc Natl Acad Sci USA 1967; 58: 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology 1984; 134: 52-63; Mayor HD, Melnick JL. Small deoxyribonucleic acid-containing viruses (picodnavirus group). Nature 1966; 210: 331-2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology 2004; 330: 375-83; Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther 2004; 11: 805-10.

[0083] El AAV recombinante (denominado en el presente documento simplemente como "AAV") ha dado resultados prometedores en un número creciente de ensayos clínicos. Sin embargo, existen impedimentos para la administración de genes que pueden limitar la utilidad de AAV, tales como respuestas inmunitarias contra la cápside, baja transducción de ciertos tejidos, incapacidad para la administración dirigida a tipos de células específicos y una capacidad de carga relativamente baja. En muchas situaciones, no hay suficiente conocimiento mecanístico para potenciar de manera efectiva el diseño racional con la capacidad de mejorar AAV. Como alternativa, ha surgido la evolución dirigida como estrategia para crear nuevas variantes de AAV que satisfagan necesidades biomédicas específicas. Las estrategias de evolución dirigida aprovechan la diversificación genética y los procesos de selección para permitir la acumulación de mutaciones beneficiosas que mejoran progresivamente la función de una biomolécula. En este proceso, los genes cap de AAV de tipo salvaje se diversifican mediante varios enfoques para crear grandes bibliotecas genéticas que se empaquetan para generar bibliotecas de partículas virales, y, a continuación, se aplica presión selectiva para aislar variantes novedosas que pueden superar las barreras de suministro de genes. Es importante destacar que no es necesario conocer la base mecánica que subyace a un problema de suministro de genes para la evolución dirigida de la función, lo que puede acelerar el desarrollo de vectores mejorados.

[0084] Normalmente, las variantes descritas en el presente documento se generaron mediante el uso de una biblioteca y/o bibliotecas de AAV. Dicha biblioteca o bibliotecas de AAV se generan mutando el gen cap, el gen que codifica las proteínas estructurales de la cápside de AAV, mediante una serie de técnicas de evolución dirigida conocidas y fácilmente disponibles para el experto en el campo de la ingeniería de genoma viral. Véase, por ejemplo, Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. l5° Anu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J.Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J.Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J.T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J.T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J.T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); y Koerber, J.T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009). Dichas técnicas, sin limitación, son las siguientes: i) PCR propensa a errores para introducir mutaciones puntuales aleatorias en el marco de lectura abierto (ORF) de cap de AAV a una tasa modificable predeterminada; ii) recombinación viral in vitro o in vivo o "reordenamiento de ADN" para generar quimeras aleatorias de genes cap de AAV para producir una biblioteca de genes con múltiples serotipos de AAV; iii) Inserciones aleatorias de péptidos en sitios definidos de la cápside mediante ligación de oligonucleótidos degenerados en el ORF de cap; iv) inserciones definidas de secuencias que codifican péptidos en ubicaciones aleatorias del ORF de cap de AAV usando mutagénesis de transposones; v) Reemplazar los bucles de superficie de las cápsides de AAV con bibliotecas de secuencias peptídicas diseñadas bioinformativamente en función del nivel de conservación de cada posición de aminoácido entre los serotipos y variantes naturales de AAV para generar bibliotecas "bucle-intercambio”; vi) sustitución aleatoria de aminoácidos en posiciones de degeneración entre los serotipos de AAV para generar bibliotecas de variantes ancestrales (Santiago-Ortiz et al. 2015); y una combinación de dichas técnicas de las mismas.

[0085] El reordenamiento aleatorio de ADN genera quimeras que combinan sus propiedades parentales de formas únicas y, a menudo, beneficiosas; sin embargo, algunas pueden ser incapaces de empaquetarse lo que, en efecto, reduce la diversidad de la biblioteca. La concentración de diversidad de la biblioteca se logra a través de técnicas de inserción de péptidos, tales como, sin limitación, iii-iv) anteriores. La diversidad de la biblioteca también se concentra en técnicas, tales como v) anterior, y dicha concentración se dirige a múltiples regiones hipervariables, que se encuentran en bucles expuestos a la superficie, de la cápside de AAV. Si bien muchas de las técnicas generan variantes de cápsides con solo una pequeña área de la cápside mutada, estas técnicas pueden combinarse con estrategias de mutagénesis adicionales para modificar la cápside completa.

[0086] Una vez que se generan la biblioteca o bibliotecas de AAV, a continuación, los virus se empaquetan, de modo que cada partícula de AAV se compone de una cápside mutante que rodea un gen cap que codifica esa cápside, y se purifica. A continuación, las variantes de la biblioteca se someten a técnicas de presión selectiva in vitro y/o in vivo conocidas y fácilmente disponibles para los expertos en el campo de AAV. Véase, por ejemplo, Maheshri, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); y Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011). Por ejemplo, sin limitación, las variantes de AAV se pueden seleccionar usando i) columnas de afinidad en las que la elución de diferentes fracciones produce variantes con propiedades de unión alteradas; ii) células primarias, aisladas de muestras de tejido o líneas de células inmortales que imitan el comportamiento de las células en el cuerpo humano, que producen variantes de AAV con mayor eficiencia y/o especificidad de tejido; iii) modelos animales, que imitan un entorno de terapia génica clínica, que producen variantes de AAV que han infectado con éxito el tejido diana; iv) modelos de xenoinjertos humanos que producen variantes de AAV que tienen células humanas injertadas infectadas; y/o una combinación de técnicas de selección de las mismas.

[0087] Una vez que se seleccionan los virus, pueden recuperarse mediante técnicas conocidas, tales como, sin limitación, replicación mediada por adenovirus, amplificación por PCR, secuenciación y clonación de próxima generación, y similares. A continuación, los clones de virus se enriquecen a través de rondas repetidas de las técnicas de selección y el ADN de AAV se aísla para recuperar los genes cap variantes seleccionados de interés. Dichas variantes seleccionadas pueden someterse a más modificaciones o mutaciones y, como tales, sirven como un nuevo punto de partida para etapas de selección adicionales para aumentar iterativamente la aptitud viral de AAV. Sin embargo, en ciertos casos, se han generado cápsides exitosas sin mutación adicional.

[0088] Las variantes de AAV descritas en el presente documento se generaron, al menos en parte, mediante el uso de metodología de evolución dirigida in vivo, tales como las técnicas descritas anteriormente, que implican el uso de cribados retinales de primates después de la administración intravítrea. Como tales, las variantes de cápsides de AAV descritas en el presente documento comprenden una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos que confieren una transducción más eficaz de las células de la retina de primate que una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. Tal como se usa en el presente documento, una "proteína de la cápside de AAV parental correspondiente" se refiere a una proteína de la cápside de AAV del mismo serotipo de AAV de tipo salvaje o variante que la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión, pero que no comprende una o más modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión.

[0089] La variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión comprende un péptido heterólogo con una longitud de 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos insertados covalentemente en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, donde la inserción del péptido comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14). Por "bucle de GH" o bucle IV de la proteína de la cápside de AAV se entiende la porción accesible al disolvente denominada en la técnica bucle de GH o bucle IV de la proteína de la cápside de AAV. Para el bucle de GH/bucle IV de la cápside de AAV, véase, por ejemplo, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; y Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955. Así, por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de aproximadamente los aminoácidos 411-650 de una proteína de la cápside de VP1 de AAV. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV1, aminoácidos 570-611 de VP1 de AAV2, dentro de los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3A, dentro de los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3B, dentro de los aminoácidos 569-610 de VP1 de AAV4, dentro de los aminoácidos 560-601 de VP1 de AAV5, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VP1 de AAV6, dentro de los aminoácidos 572 a 613 de VP1 de AAV7, dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VP1 de AAV8, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VP1 de AAV9, o dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VP1 de AAV10, o los aminoácidos correspondientes de cualquier variante de los mismos. Los expertos en la técnica sabrían, basándose en una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside de varios serotipos de AAV, donde estaría un sitio de inserción "correspondiente a los aminoácidos de AAV2" en una proteína de la cápside de cualquier serotipo de AAV determinado. Véase también la figura 6 para una alineación de las SEQ ID NOS: 1-11 de AVV de tipo salvaje que proporciona las localizaciones de aminoácidos entre y a lo largo de los serotipos de tipo salvaje (naturales) ^a AV1, AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV4-10.

[0090] En ciertas realizaciones, el sitio de inserción es un sitio de inserción único entre dos aminoácidos adyacentes ubicados entre los aminoácidos 570-614 de VP1 de cualquier serotipo de AAV de tipo salvaje o variante de AAV, por ejemplo, el sitio de inserción está entre dos aminoácidos adyacentes ubicados en los aminoácidos 570-610, aminoácidos 580-600, aminoácidos 570-575, aminoácidos 575-580, aminoácidos 580­ 585, aminoácidos 585-590, aminoácidos 590-600, o aminoácidos 600-614, de VP1 de cualquier serotipo o variante de AAV. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 580 y 581, los aminoácidos 581 y 582, los aminoácidos 583 y 584, los aminoácidos 584 y 585, los aminoácidos 585 y 586, los aminoácidos 586 y 587, los aminoácidos 587 y 588, los aminoácidos 588 y 589, o los aminoácidos 589 y 590. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 575 y 576, los aminoácidos 576 y 577, los aminoácidos 577 y 578, aminoácidos 578 y 579, o aminoácidos 579 y 580. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 590 y 591, los aminoácidos 591 y 592, los aminoácidos 592 y 593, aminoácidos 593 y 594, aminoácidos 594 y 595, aminoácidos 595 y 596, aminoácidos 596 y 597, aminoácidos 597 y 598, los aminoácidos 598 y 599 o los aminoácidos 599 y 600. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV3A, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV3B, entre los aminoácidos 584 y 585 de AAV4, entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV10.

[0091] La inserción peptídica descrita en el presente documento tiene una longitud tal como se define en las reivindicaciones.

[0092] En otra realización, una inserción peptídica descrita en el presente documento comprende de 1 a 4 aminoácidos espaciadores en el extremo amino terminal (terminal N) y/o en el extremo carboxilo (terminal C) de cualquiera de las inserciones peptídicas descritas en el presente documento. Los aminoácidos espaciadores ejemplares incluyen, sin limitación, leucina (L), alanina (A), glicina (G), serina (S), treonina (T) y prolina (P). En ciertas realizaciones, una inserción peptídica comprende 2 aminoácidos espaciadores en el extremo N-terminal y 2 aminoácidos espaciadores en el extremo C-terminal. En otras realizaciones, una inserción peptídica comprende 2 aminoácidos espaciadores en el extremo N-terminal y 1 aminoácido espaciador en el extremo C-terminal.

[0093] Las inserciones peptídicas descritas en el presente documento no se han descrito previamente y/o insertado en una cápside de AAV. Sin desear limitarse a la teoría, la presencia de cualquiera de las inserciones peptídicas descritas puede actuar para reducir la afinidad de la variante de la cápside por el sulfato de heparina, lo que probablemente reduce la unión a la matriz extracelular en la parte frontal de la retina de los primates. Además, los motivos de inserción de péptidos descritos en el presente documento pueden conferir una transducción mejorada de las células de la retina de los primates mediante la adición de un dominio de unión al receptor de la superficie celular.

[0094] En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión no incluye ninguna otra modificación de la secuencia de aminoácidos distinta de una inserción peptídica, tal como se define en las reivindicaciones en el bucle GH o el bucle IV. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión comprende una inserción peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos, tal como se define en las reivindicaciones, y la variante de la cápside de AAV no incluye ninguna otra sustitución, inserción o deleción de aminoácidos (es decir, la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende dicha inserción y, por lo demás, es idéntica a la proteína de la cápside de AAV correspondiente). Dicho de otro modo, la variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende dicha inserción es por lo demás idéntica a la proteína de la cápside de AAV parental en la que se ha insertado el péptido. Como otro ejemplo, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión comprende una inserción peptídica que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se define en las reivindicaciones, en la que la inserción del péptido se encuentra entre los aminoácidos 587 y 588 de la VP1 de la cápside de AAV2 o los aminoácidos correspondientes de una VP1 de otro AAV parental, por ejemplo entre los aminoácidos 588 y 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 o AAV9, entre los aminoácidos 586 y 587 de VP1 de AAV4, entre los aminoácidos 577 y 578 de VP1 de AAV5, entre los aminoácidos 589 y 590 de VP1 de AAV7, entre los aminoácidos 590 a 591 de VP1 de AAV8 o AAV10, etc. en el que la variante de la secuencia de la proteína de la cápside de AAV es, por lo demás, idéntica a la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente secuencia, por ejemplo cualquiera de las SEQ ID NO: 1-12.

[0095] En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión, además de comprender una inserción peptídica, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento o como se conoce en la técnica, en el bucle de GH, comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 sustituciones o deleciones de aminoácidos, por ejemplo, de 1 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25-50, de aproximadamente 50-100 sustituciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la proteína de la cápside de AAV parental. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside en cuestión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, o 98 % o más, por ejemplo, o 99 % de identidad con la correspondiente cápside de AAV parental, por ejemplo, una proteína de cápside de tipo salvaje, tal como se establece en SEQ ID NO: 1-12.

[0096] En una realización adicional, la una o más sustituciones de aminoácidos están en los residuos de aminoácidos 1, 15, 34, 57, 66, 81, 101, 109, 144, 164, 176, 188, 196, 226, 236, 240, 250, 312, 363, 368, 449, 456, 463, 472, 484, 524, 535, 551, 593, 698, 708, 719, 721 y/o 735 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 tal como se numeró antes de la inserción del péptido, o el residuo o residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de la cápside de AAV. En algunas de tales realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L y L735Q de proteína de la cápside VP1 de AAV2 tal como se numeró antes de la inserción del péptido, o el residuo o residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de la cápside de AAV.

[0097] En una realización preferida, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende a) una inserción peptídica en el Bucle GH de la proteína de la cápside, en la que la inserción del péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), LGISDQTKHA (SEQ ID ⁿ O: 29) y LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), y b) uno o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en la que el aminoácido o aminoácidos sustituidos no aparecen de forma natural en las posiciones correspondientes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q y una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en: M1L+L15P+P535S, P34A, P34A+S721L, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, Q164K+V708I , T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, N312K, N312K+N449D+D472N+N551S+I698V+L735Q, P363L, R484C+V708I, T456K y V708I. Preferiblemente, el sitio de inserción del péptido está ubicado entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV.

[0098] En una realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID N^o : 28) o LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2 o los aminoácidos correspondientes de otra cápside de AAV, y además comprende una sustitución de aminoácido P34A en el residuo 34 en relación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o el residuo correspondiente de otra cápside de AAV. La cápside de AAV variante puede tener al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o la cápside de AAV parental correspondiente. En una realización particularmente preferida, la cápside de AAV variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLK.PGPPPPKAAERHKDDSRGLVLPGYK

YLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQ

ERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEP

DSSSGTGKAGQQPARK.RLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMAT

GSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNH

LYKQJSSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFR

PKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQG

CLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFS

YTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLiDQYLYYLSRTNTPSG'ITTQSRLQFSQA

GASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSL

VNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVIJFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTN

PVATKQYGSVSTNLQRGNLAISDQTKHARQAATADVNTQGVLPGMVWQDR

DVYLQGP1WAK1PHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSA

AKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPF.IQYTSNYNKSVNVDFTVDT

NGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:42)

[0099] En otra realización particularmente preferida, la cápside de AAV variante comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) o que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) o LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre los aminoácidos 587 y 588 de la proteína de la cápside de AAV2 o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV y comprende la sustitución de aminoácido N312K en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la correspondiente sustitución en otro serotipo parental de AAV y opcionalmente comprende además las sustituciones de aminoácidos N449D, D472N, N551S, I698V y/o L735Q en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 o las sustituciones correspondientes en otro serotipo parental de AAV. En otra realización particularmente preferida, la cápside de AAV variante comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) o que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) o LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV y comprende las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V y L735Q en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o sustituciones en los residuos correspondientes en otro serotipo parental de AAV. La cápside de AAV variante puede tener al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o más de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. En una realización particularmente preferida, la cápside de AAV variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPK.PAERHKDDSRGLVLPGYK

YLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQ

ERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEP

DSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMAT

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VATEOYGSVSTNLORGNLAISDOTKHAROAATADVOSTQGVLPGNWWQPRD

VYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQ1LIKNTPVPANPSITFSAA

KFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEYQYTSNYNKSVNVDFTVDT

NGVYSEPRPIGTRYLTRNQ (SEQ ID NO:43)

[0100] En otra realización, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende a) una inserción de péptido ubicada entre los aminoácidos 588 y 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 o AAV9, los aminoácidos 586 y 587 de AAV4, los aminoácidos 577 y 578 de AAV5, los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, o aminoácidos 590 a 591 de AAV8 o AAV10, comprendiendo la inserción peptídica una secuencia de aminoácidos seleccionada de ISDQTKH (SEQ ID NO:14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) y LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), y b) una sustitución de valina por isoleucina en el aminoácido 709 de AAV3A o AAV3B, una sustitución de alanina por isoleucina en la posición 709 de AAV1 o AAV6, una sustitución de asparagina por isoleucina en el aminoácido 707 de AAV4 o el aminoácido 709 de AAV9 o una sustitución de treonina por isoleucina en el aminoácido 710 de AAV7 o el aminoácido 711 de AAV8 o AAV10 o una sustitución de glutamina por isoleucina en el aminoácido 697 de AAV5 y es opcionalmente, por lo demás, idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 3-12. En realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) o LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y b) una sustitución del aminoácido valina por isoleucina en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 2 a 5 , de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos.

[0101] En otra realización más, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: :28) o LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y b) una sustitución del aminoácido valina por isoleucina en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0102] En otra realización más, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LAISDQTKHA (^s E^q ID NO: 28) o LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la cápside de AAV variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:

MAADGYLPDWLEDTLSEG1RQWWKLKPGPPPPKPAERHK.DDSRGLVLPGYK

ylgpftcgldkgepvneadaaalehdkaydrqldsgdnpyikynhadaefq

ERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEP

DSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGOPPAAPSGLGTOTMAT

GSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVnTSTRTWALPTYNNH

LYKQ1SSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNREHCHFSPRDWQRLÍNKNWGFR

PKRL.NFKLFNIQVKEVTQNDGITriANMLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQG

CLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFS

YTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNTLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQA

GASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNN'SEYSWTGATKYHLKGRDSL

VNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVD1EKVMITDEEEIRTTN

PVATEOYGSVSTNLORGNLGISDOTtCHAROAATADVNTOGVLPGMVWODR

DVYLQGPIWAKIPUTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIUKNTPVPANI’STTFSA

AKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDT

NGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:44)

[0103] En varios aspectos, se proporciona una variante de proteína de la cápside de AAV tal como se define en las reivindicaciones que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en el que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una mayor infectividad de una célula retinal comparada con la infectividad de una célula retinal por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.

[0104] En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácidos de P34A en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o una sustitución de aminoácidos de P33A en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV5 (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6 y comprende una sustitución de aminoácidos P34A o P33A en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 o AAV5 respectivamente. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución de aminoácidos de P34A en comparación con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos P34A en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10 o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 expuesta en SEQ ID NO: 2.

[0105] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 164 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en donde el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 164 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el virión de rAAV comprende una sustitución de aminoácido de glutamina por lisina en el aminoácido 164 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV1, AAV2 o AAV6 o en el aminoácido 165 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV7, AAV8 o AAV10; o comprende una sustitución de serina por lisina en el aminoácido 160 de AAV5 o comprende una sustitución de alanina por lisina en el aminoácido 164 de AAV9. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 164 (por ejemplo, Q164K) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2), en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 expuesta en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución de aminoácidos Q164K en comparación con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y por lo demás es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos Q164K y V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o las sustituciones correspondientes en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2) y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o mayor, de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2.

[0106] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 698 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en donde el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 698 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el virión de rAAV comprende una sustitución de aminoácido de isoleucina por valina en el aminoácido 698 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, o en el aminoácido 699 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV3A, AAV3B o AAV9, o en el aminoácido 687 de AAV5, o en el aminoácido 700 de AAV7, o en el aminoácido 701 de AAV8 o AAV10. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 699 (por ejemplo, I698V) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2), en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 expuesta en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución de aminoácido I698V en comparación con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o de otro modo es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2.

[0107] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 109 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2). En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 109 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido de serina por treonina en la posición 109 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV1, AAV3A, AAV3B, ^a A^v 4, AAV7, AAV8, AAV9 o AAV10 o en la posición 108 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV5 o AAV6. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos S109T en comparación con la secuencia de aminoácidos AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10 o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos. En otras realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido S109T y una sustitución de aminoácido A593^e en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos S109T y A493V y opcionalmente A593V y/o V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o las correspondientes sustituciones en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2) y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos S109T, A493V, A593E y V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o las correspondientes sustituciones en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2) y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos S109T y V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o de otro modo es idéntica a la secuencia de aminoácidos de AAV2.

[0108] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 593 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2). En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 593 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido de glicina por glutamato en el aminoácido 594 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV1, AAV3A, AAV6 o AAV9, o en el aminoácido 583 de AAV5, o en el aminoácido 596 de AAV8 o AAV10, o una sustitución del aminoácido arginina por glutamato en el aminoácido 594 de AAV3B, o una sustitución del aminoácido aspartato por glutamato en el aminoácido 592 de AAV4 o una sustitución del aminoácido glutamina por glutamato en la posición 595 de AAV7. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos A593E en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y no comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A y S196P. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E y N596D en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 % identidad con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2. En otras realizaciones, la variante de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E y N596D en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de AAV2. En otras realizaciones, la variante de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E y V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente 99% de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No 2. En otras realizaciones, la variante de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos A593E y V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y de otro modo es idéntica a la secuencia de aminoácidos de AAV2.

[0109] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2) en donde el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente. Preferiblemente, el virión de rAAV no comprende una sustitución de prolina por serina en el aminoácido 250 en comparación con AAV2 o un aminoácido correspondiente en otro serotipo parental de AAV. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de valina por isoleucina (V708I) en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 o es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la variante de la proteína de la cápside no comprende una sustitución de aminoácido P250S. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de valina por isoleucina en el aminoácido 709 de AAV3A o AAV3B, una sustitución de alanina por isoleucina en la posición 709 de AAV1 o AAV6, una sustitución de asparagina por isoleucina en el aminoácido 707 de AAV4 o el aminoácido 709 de AAV9 o una sustitución de treonina por isoleucina en el aminoácido 710 de AAV7 o el aminoácido 711 de AAV8 o AAV10 o una sustitución de glutamina por isoleucina en el aminoácido 697 de AAV5. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 2 a 5, de 5 a 10 o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos y en la que la variante de la proteína de la cápside no comprende una sustitución de aminoácido P250S. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos V708I y también comprende una sustitución de aminoácidos A593E y/o S109T en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2. En otras realizaciones relacionadas, la variante de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos V708I y A593E en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside es por lo demás idéntica a la secuencia de aminoácidos de AAV2. En otras realizaciones relacionadas, la variante de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos V708I y S109T en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside es por lo demás idéntica a la secuencia de aminoácidos de AAV2. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos V708I y V719M en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 o de otro modo es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos V708I y R733C en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o de otro modo es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos V708I y G727D en comparación con la secuencia de aminoácidos de a AV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o de otro modo es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0110] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 196 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en donde el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente y es opcionalmente distinto de la prolina. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con toda la longitud de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 y comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 196 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) y es opcionalmente diferente a una sustitución S196P. En realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución del aminoácido serina por tirosina en el aminoácido 196 de AAV2 o AAV9 o en el aminoácido 197 de AAV7, AAV8 o AAV10 o en el aminoácido 186 de AAV5; o una sustitución de alanina por tirosina en el aminoácido 196 de AAV1 o AAV6; o una sustitución de metionina por tirosina en el aminoácido 191 de AAV4; o una sustitución de treonina por tirosina en el aminoácido 196 de AAV3A o AAV3B. En una realización relacionada, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución de aminoácidos S196Y en comparación con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 196 distinta de una sustitución S196P (por ejemplo, comprende una sustitución S196Y) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2), en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 expuesta en SEQ ID NO: 2.

[0111] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 175 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en donde el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 175 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, la variante de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos Q175H en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 tal como se establece en SEQ ID NO: 2 o una sustitución de glutamina por histidina en la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 175 (por ejemplo, Q175H) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2), en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 expuesta en SEQ ID NO: 2.

[0112] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 64 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en donde el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 64 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el virión de rAAV comprende una sustitución de aminoácidos P64S en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 como se establece en SEQ ID NO: 2 o una sustitución de prolina por serina en la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 64 (por ejemplo, P64S) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2), en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 expuesta en SEQ ID NO: 2.

[0113] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % a una secuencia de la cápside de AAV de tipo salvaje seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12 y también comprende i) una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en P34A, S109T+V708I, A593E N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K y I698V y/o (ii) una inserción peptídica tal como se define en las reivindicaciones.

[0114] En algunas realizaciones, la cápside de AAV variante comprende las una o más sustituciones de aminoácidos y/o inserciones peptídicas especificadas y, por lo demás, es idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1-12.

[0115] En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV es una proteína de la cápside ancestral. Por proteína ancestral de la cápside se entiende un ancestro evolutivo de una proteína de la cápside que se encuentra hoy en la naturaleza, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, A^a V8, A^a V9, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13, que se genera in silico mediante sustitución aleatoria de aminoácidos en posiciones de degeneración entre las proteínas de la cápside de AAV que se encuentran en la naturaleza en la actualidad. A continuación, se proporciona un ejemplo no limitativo de una cápside ancestral, en la que las posiciones de degeneración (residuos 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661,662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) están marcados con una "X":

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQ

KQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGD

NPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKT

APGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGE

PPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVI

TTSTRTWALPTYNNHLYKQISSXSXGXTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHF

SPRDWQRLINNNVVGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVrriANNLTSTVQVFS

DSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFM1PQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLE

YFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAMSQSLDRLMNPLIDQYLYYLXRTQ

S'IGGTAGXXELLFSQXGPXXMSXQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLXQNNNSNF

AWTGATKYHLNGRXSLVNPGVAMATHKDDEXRFFPSSGVLIFGKXGAGXNN

TXIJCNVMXTXEEEIKTTNPVATEXYGVVAXNLQSSNTAPXTGXVNSQGALP

GMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNI’PVP

ANPPXXFXXAKFASF1TQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKS

XN VDFA V XXXGVYXEPRPIGTR YLTRNL (SEQ IDNO:58)

[0116] En algunas realizaciones, la proteína de la cápside ancestral comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:58. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside ancestral comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de AAV2, por ejemplo, tal como se establece en SEQ ID NO 2. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside ancestral comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99%, o más, de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la secuencia ancestral descrita en SEQ ID NO: 58 o en SEQ ID NO: 2 y comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: alanina (A) en 264, alanina (A) en 266, serina (S) en ^{268, alanina (A) en 448, treonina (T) en 459, Arginina (R) en 460, Alanina (A) en} 467^{, Serina (S) en 470,} Asparagina (N) en 471, Alanina (A) en 474, Serina (S) en 495, asparagina (D) en 516, asparagina (D) en 533, glutamina (Q) en 547, alanina (A) en 551, Alanina (A) en 555, ácido glutámico (E) en 557, metionina (M) en 561, serina (S) en 563, glutamina (Q) en 577, serina (S) en 583, valina (V) en 593, Treonina (T) en 596, Alanina (A) en 661, Valina (V) en 662, Treonina (T) en 664, Prolina (P) en 665, Treonina (T) en 710, ácido aspártico (D) en 717, asparagina (N) en 718, ácido glutámico (E) en 719 y serina (S) en 723. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, en algunos casos, el 100 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la siguiente secuencia de aminoácidos y comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consiste en: alanina (A) en 264, alanina (A) en 266, serina (S) en 268, alanina (A) en 448, treonina (T) en 459, Arginina (R) en 460, Alanina (A) en 467, Serina (S) en 470, Asparagina (N) en 471, Alanina (A) en 474, Serina (S) en 495, asparagina (D) en 516, asparagina (D) en 533, glutamina (Q) en 547, alanina (A) en 551, alanina (A) en 555, Ácido glutámico (E) en 557, Metionina (M) en 561, Serina (S) en 563, Glutamina (Q) en 577, Serina (S) en 583, Valina (V) en 593, Treonina (T) en 596, Alanina (A) en 661, Valina (V) en 662, Treonina (T) en 664, Prolina (P) en 665, Treonina (T) en 710, ácido aspártico (D) en 717, asparagina (N) en 718, ácido glutámico (E) en 719 y serina (S) en 723:

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQK.Q

DDGRGEVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNP

YLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAP

GKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPL.GEPP

AGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRV1TT

STRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSP

RDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSD

SEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYF PSQMI.RTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQST

GGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAW

TGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTA

LENVMMTSEEE1KTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGM

VWQNRDVYLQGPIWAK1PHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANP

PAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNV

DFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:59).

[0117] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98% idéntica a una secuencia de la cápside de AAV de tipo salvaje seleccionada del grupo que consiste en la variante ancestral descrita en el presente documento como SEQ ID NO: 58, comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: Alanina (A) en 264, Alanina (A) en 266, Serina (S) en 268, Alanina (A) en 448, Treonina (T) en 459, Arginina (R) en 460, Alanina (A) en 467, Serina (S) en 470, Asparagina (N) en 471, Alanina (A) en 474, Serina (S) en 495, Asparagina (D) en 16, Asparagina (D) en 533, Glutamina (Q) en 547, Alanina (^a ) en 551, Alanina (^a ) en 555, Ácido Glutámico (E) en 557, Metionina (M) en 561, Serina (S) en 563, Glutamina (q ) en 577, Serina (s ) en 583, Valina (V) en 593,Treonina (T) en 596, Alanina (A) en 661, Valina (V) en 662, Treonina (T) en 664, Prolina (P) en 665, Treonina (T) en 710, Ácido aspártico (D) en 717, Asparagina (N) en 718, Ácido glutámico (E) en 719 y Serina (S) en 723; y también comprende i) una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K y I698V y/o (ii) una inserción peptídica tal como se define en las reivindicaciones.

[0118] En algunas realizaciones, la variante de la cápside de AAV comprende una o más sustituciones de aminoácidos y/o inserciones peptídicas especificadas y, por lo demás, es idéntica a la SEQ ID NO: 59.

[0119] Las variantes de AAV descritas en el presente documento se generaron mediante el uso de evolución dirigida in vivo que implica el uso de pantallas retinales de primates después de la administración intravítrea. En algunas realizaciones, las variantes de las proteínas de la cápside descritas en el presente documento, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una mayor transducción de una célula de la retina en comparación con la transducción de la célula de la retina por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente o el AAV de tipo salvaje. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las variantes de proteínas de la cápside descritas en el presente documento, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una transducción más eficiente de células de la retina de primates que los viriones de AAV que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente o la proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje, por ejemplo, las células de la retina absorben más viriones de AAV que comprenden la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión que viriones de AAV que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental o el AAV de tipo salvaje. En algunas de tales realizaciones, la variante del virión de AAV o la variante rAAV exhibe al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, el aumento de la transducción de una célula retinal en comparación con la transducción de la célula retinal por un virión de AAV de tipo salvaje o rAAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. En algunas de tales realizaciones, las variantes de proteínas de la cápside descritas en el presente documento, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una transducción más amplia de las células de la retina de primate que los viriones de AAV que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente o la proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje. En otras palabras, la variante del virión de AAV transduce tipos de células no transducidas por viriones que comprenden la proteína de la cápside AAV parental correspondiente y, por lo tanto, más tipos de células en la retina que el virión de AAV parental correspondiente. En algunas realizaciones, la variante del virión de AAV transduce preferentemente una célula de la retina, por ejemplo, un virión de rAAV en cuestión infecta una célula de la retina con 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50 veces, o más de 50 veces, la especificidad que otra célula retinal o una célula no retinal, por ejemplo, una célula fuera del ojo. En algunas realizaciones, la célula retinal transducida es una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones, conos). En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula ganglionar retinal (RGC). En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula epitelial retinal (célula RPE). En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula glial de Müller. En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula microglial. En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula amacrina. En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula bipolar. En algunas realizaciones, la célula retinal es una célula horizontal. Un aumento en la transducción de una célula retiniana, por ejemplo, mayor eficiencia de transducción, transducción más amplia, transducción más preferencial, etc. puede evaluarse fácilmente in vitro o in vivo mediante varios procedimientos en la técnica para medir la expresión génica. Por ejemplo, el AAV se puede empaquetar con un genoma que comprende un casete de expresión que comprende un gen informador, por ejemplo, una proteína fluorescente, bajo el control de un promotor ubicuo o específico de tejido, y se puede evaluar el grado de transducción detectando la proteína fluorescente mediante, por ejemplo, con microscopio de fluorescencia. Como otro ejemplo, el AAV se puede empaquetar con un genoma que comprende una secuencia de ácido nucleico con código de barras, y se puede evaluar el grado de transducción detectando la secuencia de ácido nucleico mediante, por ejemplo, PCR. Como otro ejemplo, el AAV se puede empaquetar con un genoma que comprende un casete de expresión que comprende un gen terapéutico para el tratamiento de una enfermedad de la retina, y se puede evaluar el grado de transducción detectando el tratamiento de la enfermedad de la retina en un paciente afectado al que se le administró el AAV.

[0120] También se proporciona una variante del vector rAAV como se reivindica para su uso en el tratamiento de enfermedades oculares que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades monogénicas, enfermedades genéticas complejas, enfermedades adquiridas y lesiones traumáticas. Los ejemplos de enfermedades monogénicas incluyen, pero no se limitan a, síndrome de Bardet-Biedl; enfermedad de Batten; distrofia cristalina de Bietti; coroideremia; atrofia coriorretiniana; degeneración coriorretiniana; distrofias de conos o conos-bastones (autosómica dominante, autosómica recesiva y ligada al cromosoma X); ceguera nocturna estacionaria congénita (autosómica dominante, autosómica recesiva y ligada al cromosoma X); trastornos de la visión del color, incluyendo acromatopsia (incluyendo ACHM2, ACHM3, ACHM4 y ACHM5), protanopia, deuteranopia y tritanopia; ataxia de Friedreich; amaurosis congénita de Leber (autosómica dominante y autosómica recesiva), que incluye, pero no limitado a, LCA1, LCA2, LCA3, LCA4, LCA6, LCA7, LCA8, LCA12 y LCA15; Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber; distrofia macular (autosómica dominante y autosómica recesiva), que incluye, pero sin limitación, degeneración macular aguda, distrofia macular viteliforme de Best, distrofia de patrón, distrofia macular de Carolina del Norte, drusas hereditarias, distrofia del fondo de ojo de Sorsby, malattia levantanese y retinopatía de precocidad determinada genéticamente; enfermedad del desarrollo ocular-retiniana; albinismo ocular; atrofias ópticas (autosómica dominante, autosómica recesiva y ligada al cromosoma X); retinitis pigmentosa (autosómica dominante, autosómica recesiva, ligada al cromosoma X y rasgos heredados mitocondrialmente), cuyos ejemplos incluyen RP1, RP2, RP3, RP10, RP20, RP38, RP40 y RP43; retinosquisis ligada al cromosoma X; enfermedad de Stargardt; y síndrome de Usher, incluyendo, pero no limitado a, USH1B, USH1C, USH1D, USH1F, USH1G, USH2A, USH2C, USH2D y USH3. Los ejemplos de enfermedades genéticas complejas incluyen, pero no se limitan a, glaucoma (ángulo abierto, ángulo cerrado, tensión baja, tensión normal, congénito, neovascular, pigmentario, pseudoexfoliación); degeneración macular relacionada con la edad y otras formas de degeneración macular, formas tanto exudativas como no exudativas (autosómica dominante y autosómica recesiva), tales como la degeneración macular aguda, la degeneración macular viteliforme; retinopatía del premadurez; y síndrome de Vogt Koyanagi-Harada (VKH). Los ejemplos de enfermedades adquiridas incluyen, pero no se limitan a, neurorretinopatía macular aguda; neuropatía óptica isquémica anterior y neuropatía óptica isquémica posterior; enfermedad de Behcet; oclusión de rama venosa retiniana; neovascularización coroidea; retinopatía diabética, incluyendo retinopatía diabética proliferativa y complicaciones asociadas; uveítis diabética; edema, tal como edema macular, edema macular cistoideo y edema macular diabético; trastornos de la membrana epirretiniana; telangiectasia macular; coroiditis multifocal; disfunción retiniana diabética no retinopatía; tumores oculares; atrofias ópticas; desprendimiento de retina; trastornos de la retina, tales como oclusión de la vena central de la retina, vitreorretinopatía proliferativa (PVR), enfermedad oclusiva venosa y arterial de la retina, oclusión vascular, enfermedad uveítica de la retina; derrame uveal; enfermedad infecciosa e infiltrante de la retina; enfermedades del nervio óptico, tales como la atrofia óptica adquirida. Los ejemplos de lesiones traumáticas incluyen, pero no se limitan a, histoplasmosis; traumatismo del nervio óptico; trauma ocular que afecta un sitio o ubicación ocular posterior; traumatismo retiniano; infección viral del ojo; infección viral del nervio óptico; una afección ocular posterior causada por o influenciada por un tratamiento con láser ocular; afecciones oculares posteriores causadas o influenciadas por una terapia fotodinámica; fotocoagulación; retinopatía por radiación; y oftalmía simpática.

[0121] En otra realización, una variante de la cápside descrita en el presente documento comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico, tal como, sin limitación, un ARN de interferencia, un ARN no codificante largo, un ARN no codificante corto, un ARN antisentido, un aptámero, un polipéptido, un anticuerpo secretado, un anticuerpo monocatenario, un dominio Vhh, un receptor soluble, un aficuerpo, una knottina, una DARPin, una centurina, una chaperona, una nucleasa específica de sitio que proporciona la inmactivación (“knock-down”) específica del sitio de la función del gen o una nucleasa específica del sitio modificada que proporciona la activación de la transcripción específica del gen.

[0122] Una variante del virión de rAAV descrito en el presente documento comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN de interferencia. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN largo no codificante. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN corto no codificante. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN antisentido. En algunas realizaciones, el producto génico es un aptámero. En algunas realizaciones, el producto génico es un polipéptido. En algunas realizaciones, el producto génico es un anticuerpo secretado. En algunas realizaciones, el producto génico es un anticuerpo monocatenario. En algunas realizaciones, el producto génico es un dominio V^hh. En algunas realizaciones, el producto génico es un receptor soluble. En algunas realizaciones, el producto génico es un aficuerpo. En algunas realizaciones, el producto génico es un knottin. En algunas realizaciones, el producto génico es una DARPin. En algunas realizaciones, el producto génico es una centurina. En algunas realizaciones, el producto génico es una chaperona. En algunas realizaciones, el producto génico es una nucleasa específica del sitio que proporciona la inactivación específica del sitio de la función del gen.

[0123] Los usos del producto génico incluyen, pero no se limitan a, aumentar el nivel de un factor en una célula, aumentar el nivel de un factor en una célula vecina a través de la secreción de un factor, disminuir el nivel de un factor en una célula, o disminuir el nivel de un factor en una célula vecina a través de la secreción de un factor. El producto génico puede diseñarse para complementar el nivel de un producto génico defectuoso o faltante, disminuir el nivel de un producto génico defectuoso o faltante, introducir un nuevo producto génico de apoyo, complementar el nivel de un producto génico de apoyo, disminuir el nivel de un producto génico obstaculizador, o tanto reducir el nivel de un producto génico obstaculizador como introducir o complementar el nivel de un producto génico de apoyo.

[0124] Los productos génicos suministrados por las variantes de AAV en cuestión se pueden usar para alterar el nivel de los productos génicos o la actividad de los productos génicos directa o indirectamente relacionados con enfermedades y traumas de la retina. Los genes cuyos productos génicos están directa o indirectamente ligados a enfermedades genéticas incluyen, por ejemplo, el factor de tipo 6 de ribosilación de ADP (ARL6); proteína de interacción 1 BBSome (BBIP1); proteína 1 BBSome (BBS1); proteína 2 BBSome (BBS2); proteína 4 BBSome (BBS4); proteína 5 BBSome (BBSS); proteína 7 BBSome (BBS7); proteína 9 BBSome (BBS9); proteína 10 BBSome (BBS10); proteína 12 BBSome (BBS12); proteína centrosomal de 290 kDa (CEP290); proteína de transporte intraflagelar 172 (IFT172); proteína de transporte intraflagelar 27 (IFT27); inositol polifosfato-5-fosfatasa E (INPP5E); miembro 13 de la subfamilia J de canales de potasio de rectificación interna (KCNJ13); factor de tipo 1 de transcripción de cremallera de leucinas (LZTFL1); proteína del síndrome de McKusick-Kaufman (MKKS); proteína del síndrome de Meckel tipo 1 (MKS1); proteína de nefronoptisis 3 (NPHP1); antígeno 8 del cáncer de colon definido serológicamente (SDCCAG8); proteína 32 que contiene motivo tripartito (TRIM32); dominio de repetición tetratricopéptido 8 (TTC8); proteína de la enfermedad de Batten (Cl N3); citocromo P4504V2 (CYP4V2); proteína escort Rab 1 (CHM); proteína 13 que contiene el dominio PR (regulador positivo) (PRDM13); receptor acoplado a proteína G RPE-retinal (RGR); Miembro 1 de la familia del dominio TEA (TEAD1); proteína de tipo 1 del receptor que interactúa con arilhidrocarburo (AIPL1); factor de transcripción homeobox del fotorreceptor de tipo cono-bastón otx (CRX); proteína activadora de guanilato ciclasa 1A (GUCA1A); guanilato ciclasa específica de la retina (GUCY2D); miembro de la familia 3 asociado a la membrana de transferencia de fosfatidilinositol (PITPNM3); prominina 1 (PROM1); periferina (PRPH); periferina 2 (PRPH2); proteína 1 de exocitosis de membrana sináptica reguladora (R1MS1); semaforina 4A (SEMA4A); homólogo humano de la proteína unc119 de C. elegans (UNC119); transportador de cassette de unión a a Tp - retinal (ABCA4); dominio 9 de ADAM metalopeptidasa (ADAM9); factor de transcripción activador 6 (ATF6); marco de lectura abierto 2 del cromosoma 21 (C21orf2); marco de lectura abierto 37 del cromosoma 8 (C8orf37); canal de calcio; dependiente del voltaje; subunidad alfa 2/delta 4 (CACNA2D4); miembro 1 de la familia relacionado con cadherina (protocadherina 21) (CDHR1); proteína similar a la ceramida quinasa (CERKL); subunidad alfa del canal catiónico controlado por GMPc del fotorreceptor de cono (CNGA3); subunidad beta 3 del canal catiónico controlado por nucleótido cíclico de cono (CNGB3); ciclina M4 (CNNM4); proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G); polipéptido 2 de actividad de transducción alfa (GNAT2); miembro 2 de la subfamilia V de canales de potasio (KCNV2); Fosfodiesterasa 6C (PDE6C); Fosfodiesterasa 6H (PDE6H); proteoma de proteína centriolar B de centriolo 1 (POC1B); miembro RAB28 de la familia de oncogenes RAS (RAB28); factor de transcripción homeobox 2 de retina y pliegue neural anterior (RAX2); 11-cis retinol deshidrogenasa 5 (RDH5); proteína 1 que interactúa con el regulador RP GTPasa (RPGRIP1); miembro 5 de la familia similar a tubulina tirosina ligasa (TTLL5); subunidad alfa-1 del canal de calcio dependiente de voltaje de tipo L (CACNA1F); regulador de GTPasa de retinosis pigmentaria (RPGR); subunidad alfa de transducina de bastón (GNAT1); subunidad beta de GMPc fosfodiesterasa de bastón (PDE6B); rodopsina (RHO); proteína de unión a calcio 4 (CABP4); receptor acoplado a proteína G 179 (OPR179); rodopsina quinasa (GRK1); receptor metabotrópico de glutamato 6 (GRM6); proteína 3 de dominios transmembrana de tipo inmunoglobulina de repeticiones ricas en leucina (LRIT3); arrestina (antígeno s) (SAG); familia de transportadores de soluto 24 (SLC24A1); canal de cationes de potencial de receptor transitorio, subfamilia M, miembro 1 (TRPM1); nictalopina (NYX); opsina de cono verde (OPN1LW); opsina de cono rojo (OPN1MW); opsina de cono azul (OPN1SW); frataxina (FXN); inosina monofosfato deshidrogenasa 1 (IMPDH1); proteína homeobox 2 ortodenticular (OTX2); homólogo 1 de crumbs (CRB1); proteína 1 que contiene el dominio de muerte (DTHD1); factor de diferenciación de crecimiento 6 (GDF6); proteína homóloga de Chlamydomonas de transporte intraflagelar 140 (IFT140); proteína B1 que contiene motivo IQ (IQCB1); lebercilina (LCA5); lecitina retinol aciltransferasa (LRAT); nicotinamida nucleótido adenililtransferasa 1 (NMNAT1); proteína RD3 (RD3); retinol deshidrogenasa 12 (RDH12); proteína de 65 kD específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65); proteína asociada a la espermatogénesis 7 (SPATA7); proteína tipo tubby 1 (TULP1); genes mitocondriales (KSS, LHON, MT-ATP6, MT-TH, MT-TL1, MT-TP, MT-TS2, NADH deshidrogenasas codificadas mitocondrialmente [MT-ND]); bestrofina 1 (BEST1); proteína 5 relacionada con la necrosis tumoral y C1q y de colágeno (C1QTNF5); proteína de matriz extracelular 1 de tipo fibrilina que contiene EGF (EFEMP1); elongación de la proteína de ácidos grasos muy largos (ELOVL4); homólogo 2 de fascin retinal, proteína de unión a actina (FSCN2); proteína 1B activadora de guanilato ciclasa (GUCA1B); hemicentina 1 (HMCN1); proteoglicano 1 de la matriz interfotorreceptora (IMPG1); proteína 1 de tipo retinitis pigmentosa 1 (RP1L1); inhibidor tisular de metaloproteinasas-3 (TIMP3); factor H del complemento (CFH); factor D del complemento (CFD); componente 2 del complemento (C2); componente 3 del complemento (C3); factor B del complemento (CFB); modulador 2 de autofagia regulado por daños en el ADN (DRAM2); proteoglicano 2 de sulfato de condroitina (VCAN); mitofusina 2 (MFN2); miembro 1 del grupo F de la subfamilia 2 de receptores nucleares (NR2F1); atrofia óptica 1 (OPA1); proteína transmembrana 126A (TMEM126A); homólogo A de la translocasa 8 de la membrana mitocondrial interna (TIMM8A); anhidrasa carbónica IV (CA4); hexoquinasa 1 (HK1); proteína tipo kelch 7 (KLHL7); grupo E3 de la subfamilia 2 de receptores nucleares (NR2E3); cremallera de leucinas de la retina neural (NRL); miembro 3 de la subfamilia W de la familia 2 de receptores olfativos (OR2W3); factor 3 de procesamiento de pre-ARNm (PRPF3); factor 4 de procesamiento de pre-ARNm (PRPF4); factor 6 de procesamiento de pre-ARNm (PRPF6); factor 8 de procesamiento de pre-ARNm (PRPF8); factor 31 de procesamiento de pre-ARNm (PRPF31); proteína 1 de la membrana del segmento externo de la retina (ROM1); proteína de retinitis pigmentosa 1 (RP1); proteína 1 asociada a PIM1-quinasa (RP9); ribonucleoproteína nuclear pequeña de 200 kDa (SNRNP200); fosfoproteína 2 secretada (SPP2); proteína rica en arginina/serina que se une a topoisomerasa I (TOPORS); proteína de unión al factor de ribosilación ADP de tipo 2 (ARL2BP); marco de lectura abierto 71 del cromosoma 2 (C2orf71); clarina-1 (CLRN1); subunidad alfa del canal controlado por GMPc de bastones (CNGA1); subunidad beta del canal controlada por GMPc de bastones (CNGB1); citocromo P4504V2 (CYP4V2); dehidrodoliquil difosfato sintetasa (DHDDS); polipéptido 38 de la caja DEAH (DHX38); subunidad 1 del complejo de proteínas de membrana ER (EMC1); homólogo de eyes shut/spacemaker (EYS); miembro A de la familia con similitud de secuencia 161 (FAM161A); receptor 125 acoplado a proteína G (GPR125); heparán-alfa-glucosaminida N-acetiltransferasa (HGSNAT); isocitrato deshidrogenasa 3 beta específica de NAD(+) (IDH3B); proteoglicano 2 de la matriz interfotorreceptora (IMPG2); proteína KIAA1549 (KIAA1549); proteína centrosomal kizuna (KIZ); quinasa asociada a células germinales masculinas (MAK); tirosina quinasa del receptor del protooncogén c-mer (MERTK); mevalonato quinasa (MVK); quinasa 2 relacionada con NIMA (nunca en el gen A de la mitosis) (NEK2); proteína 1 de diferenciación neuronal (NEUROD1); subunidad alfa de la GMPc fosfodiesterasa (PDE6A); gamma de bastones específica defosfodiesterasa 6G GMPc (PDE6G); proteína de degeneración progresiva de conos y bastones (PRCD); proteína de unión a retinol 3 (RBP3); proteína de unión a retinaldehído 1 (RLBP1); miembro 14 de la familia 7 de portadores de soluto (SLC7A14); usherin (USH2A); proteína con dedos de zinc 408 (ZNF408); proteína con dedos de zinc 513 (ZNF513); proteína del síndrome oral-facial-digital 1 (OFD1); retinosis pigmentaria 2 (RP2); retinosquisina (RS1); proteína 12 que contiene el dominio de abhidrolasa (ABHD12); gen similar a cadherina 23 (CDH23); proteína centrosomal de 250 kDa (CEP250); miembro 2 de la familia de unión a calcio e integrina (CIB2); whirlin (DFNB31); homólogo 1 de susceptibilidad a convulsiones audiogénicas monogénicas (GPR98); histidil-ARNt sintetasa (HARS); miosina VIIA (MYO7A); protocadherina 15 (PCDH15); harmonina (USH1C); homólogo humano de proteína de armazón de ratón que contiene repeticiones de anquirina y dominio SAM (USH1G); distrofina (DMD); norrina (NDP); fosfoglicerato quinasa (PGK1); calpaína 5 (CAPN5); homólogo del receptor frizzled-4 Wnt (FZD4); proteína integral de membrana 2B (ITM2B); proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP5); microARN 204 (MIR204); proteína de retinoblastoma 1 (RB1); tetraspanina 12 (TSPAN12); marco de lectura abierto 65 del cromosoma 12 (C12orf65); cadherina 3 (CD^h 3); proteína relacionada con frizzled de tipo membrana (MFRP); ornitina aminotransferasa (OAT); grupo V de fosfolipasa A2 (PLA2G5); proteína de unión a retinol 4 (RBP4); regulador de la señalización de proteína G 9 (RGS9); regulador de la proteína de unión a señalización de proteína G 9 (RGS9BP); ARMS2; proteína del grupo 6 de complementación de deficiencia de reparación de roedores con complemento cruzado de reparación por escisión (ERCC6); fibulina 5 (FBLN5); HtrA serina peptidasa 1 (HTRA1); receptor tipo toll 3 (TLR3); y receptor tipo toll 4 (TLR4).

[0125] Los genes cuyos productos génicos inducen o promueven la apoptosis se denominan en el presente documento "genes proapoptóticos" y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos proapoptóticos". Las dianas proapoptóticas incluyen, por ejemplo, productos del gen Bax; productos del gen Bid; productos del gen Bak; Productos del gen Bad; Bcl-2; Bcl-X1. Los productos génicos antiapoptóticos incluyen un inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X.

[0126] Los genes cuyos productos génicos inducen o promueven la angiogénesis se denominan en el presente documento "genes proangiogénicos" y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos proangiogénicos". Las dianas proangiogénicas incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1); receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2); tirosina quinasa 1 relacionada con Fms (Fltl); factor de crecimiento de placenta (PGF); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); angiopoyetinas; Sonic hedgegog. Los genes cuyos productos génicos inhiben la angiogénesis se denominan en el presente documento "genes antiangiogénicos" y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos antiangiogénicos". Los productos génicos antiangiogénicos incluyen endostatina; tumstatina; angiostatina; factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), y proteínas de fusión o anticuerpos que son específicos para dianas proangiogénicas y/o sus receptores, por ejemplo, las proteínas de fusión anti-VEGF sFLT1 o Eylea, los anticuerpos específicos de VEGF Lucentis™ y Avastin™, etc.

[0127] Los genes cuyos productos génicos funcionan como moduladores inmunitarios, por ejemplo, factores del complemento, receptores de tipo toll, se denominan "genes inmunomoduladores". Entre los ejemplos de genes inmunomoduladores se incluyen citocinas, quimiocinas y proteínas de fusión o anticuerpos que son específicos para ellos y/o sus receptores, por ejemplo, la proteína de fusión anti-IL-6 Rilonacept™, el anticuerpo específico del factor H del complemento lampamizumab, etc. Genes cuyos productos génicos funcionan como factores neuroprotectores, por ejemplo, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR); factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF); factor de viabilidad derivado de bastones (RdCVF); factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); neurturina (NTN); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor de crecimiento nervioso (NGF); neurotrofina-4 (NT4); factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); factor de crecimiento epidérmico. Genes cuyos productos génicos funcionan como opsinas sensibles a la luz, por ejemplo, opsina; rodopsina; canal rodopsina; halo rodopsina.

[0128] En algunos casos, un producto génico de interés es una endonucleasa específica del sitio que proporciona la eliminación específica del sitio de la función del gen, por ejemplo, cuando la endonucleasa elimina un alelo asociado con una enfermedad de la retina. Por ejemplo, cuando un alelo dominante codifica una copia defectuosa de un gen que, cuando es de tipo salvaje, es una proteína estructural de la retina y/o proporciona una función retinal normal, una endonucleasa específica del sitio puede dirigirse al alelo defectuoso y eliminar el alelo defectuoso.

[0129] Además de eliminar un alelo defectuoso, también se puede usar una nucleasa específica de sitio para estimular la recombinación homóloga con un ADN donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Por lo tanto, por ejemplo, un virión de rAAV en cuestión se puede usar para suministrar una endonucleasa específica del sitio que elimina un alelo defectuoso y se puede usar para suministrar una copia funcional del alelo defectuoso, lo que resulta en la reparación del alelo defectuoso, proporcionando así la producción de una proteína retinal funcional (por ejemplo, retinosquisina funcional, RPE65 funcional, periferina funcional, etc.). Véase, por ejemplo, Li et al. (2011) Nature 475:217. En algunas realizaciones, un virión de rAAV descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una endonucleasa específica del sitio; y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, donde la copia funcional codifica una proteína retiniana funcional. Las proteínas funcionales de la retina incluyen, por ejemplo, retinoschisina, RPE65, proteína 1 que interactúa con el regulador GTPasa de la retinitis pigmentosa (RGPR), periferina, periferina-2 y similares.

[0130] Las endonucleasas específicas de sitio que son adecuadas para su uso incluyen, por ejemplo, meganucleasas; nucleasas con dedos de zinc (ZFN); nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN); y Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/asociadas a CRISPR (Cas), donde dichas endonucleasas específicas de sitio no se producen de forma natural y se modifican para reconocer un gen específico. Dichas nucleasas específicas de sitio pueden diseñarse para cortar ubicaciones específicas dentro de un genoma, y la unión de extremos no homólogos puede reparar la ruptura mientras se insertan o eliminan varios nucleótidos. Dichas endonucleasas específicas de sitio (también denominadas "INDEL") a continuación arrojan la proteína fuera de marco y eliminan efectivamente el gen. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N° 2011/0301073.

[0131] En algunas realizaciones de la variante del vector de rAAV descrita en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, promotor de citomegalovirus (CMV) (Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55(2): 431-441), potenciador temprano de CMV/promotor de p-actina de pollo (CBA)/intrón de p-globina de conejo (CAG) (Miyazaki et al. (1989) Gene 79(2): 269-277, CBSB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13(6): 1074-1084), promotor del factor de elongación humano 1a (EF1a) (Kim et al. (1990) Gene 91(2): 217-223), promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (PGK) (Singer-Sam et al. (1984) Gene 32(3): 409-417, promotor mitocondrial de cadena pesada (Loderio et al. (2012) PNAS 109(17): 6513-6518), promotor de ubiquitina (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261: 101-105). En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un elemento regulador específico de tejido o específico de tipo de célula. Por ejemplo, en algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unida operativamente a un elemento regulador específico del fotorreceptor (por ejemplo, un promotor específico del fotorreceptor), por ejemplo, un elemento regulador que confiere la expresión selectiva del gen unido operativamente en una célula fotorreceptora. Los elementos reguladores específicos de fotorreceptores adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina quinasa (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); un promotor del gen de la beta fosfodiesterasa (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9: 1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentosa (Nicoud et al. (2007) supra); un potenciador del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP) (Nicoud et al. (2007) supra); un promotor del gen de IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225), un promotor del gen de opsina (Tucker et al. (1994) PNAS 91:2611-2615), un promotor del gen de retinosquisina (Park et al. (2009) Gene Therapy 16(7): 916-926), un promotor del gen de la proteína del homeodominio CRX (Furukawa et al. (2002) The Journal of Neuroscience 22(5): 1640-1647), un promotor del gen del polipéptido 1 (ONAT1) de la actividad de transducción alfa de la proteína de unión a nucleótidos de guanina (Lee et al. (2010) Gene Therapy 17:1390-1399), un promotor del gen de la proteína cremallera de leucina (NRL) específica de la retina neural (Akimoto et al. (2006) PNAS 103(10): 3890-3895), promotor de la arrestina de cono humano (hCAR) (Li et al. (2002) Biochemistry and molecular biology 43: 1375-1383) y los promotores PR2.1, PR1.7, PR1.5 y PR1.1 (Ye et al. (2016) Human Gene Therapy 27(1): 72-82)). En algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un elemento regulador específico de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) (por ejemplo, un promotor específico de RPE), por ejemplo, un elemento regulador que confiere la expresión selectiva del gen unido operativamente en una célula RPE. Los elementos reguladores específicos de RPE adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor del gen RPE65 (Meur et al. (2007) Gene Therapy 14: 292-303), un promotor del gen de la proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP) (Kennedy et al. (1998) Journal of Biological Chemistry 273: 5591-5598), un promotor del gen del factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF, también conocido como serpina F1) (Kojima et al. (2006) Molecular and Cellular Biochemistry 293(1-2): 63-69), y un promotor de la distrofia macular viteliforme (VMD2) (Esumi et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry 279(18): 19064-19073). En algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un elemento regulador específico de células gliales de Müller (por ejemplo, un promotor específico de células gliales), por ejemplo, un elemento regulador que confiere expresión selectiva del gen unido operativamente en una célula glial de la retina. Los elementos reguladores específicos de la glía adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor de la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) (Besnard et al. (1991) Journal of Biological Chemistry 266(28): 18877-18883). En algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unida operativamente a un elemento regulador específico de una célula bipolar (por ejemplo, un promotor específico bipolar), por ejemplo, un elemento regulador que confiere la expresión selectiva del gen unido operativamente en una célula bipolar. Los elementos reguladores específicos bipolares adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor GRm 6 (Cronin et al. (2014) EMBO Molecular Medicine 6(9): 1175-1190).

[0132] Para los fines de la invención, la descripción del presente documento proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la proteína de la cápside de AAV tal como se describe anteriormente. Un ácido nucleico aislado puede ser un vector AAV, por ejemplo, un vector AAV recombinante.

[0133] La divulgación en el presente documento también proporciona una variante de virión de rAAV, tal como se reivindica para su uso, en un procedimiento para tratar una enfermedad de la retina, comprendiendo el procedimiento administrar a un individuo que lo necesite una cantidad eficaz de una variante de un virión de rAAV que comprende un transgén de interés como se describe anteriormente y divulgado en este documento. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica podría determinar fácilmente una cantidad efectiva del virión rAAV en cuestión y que la enfermedad había sido tratada analizando un cambio en uno o más parámetros anatómicos o funcionales, por ejemplo, agudeza visual, campo visual, sensibilidad electrofisiológica a la luz y la oscuridad, visión del color, sensibilidad al contraste, anatomía, salud y vasculatura de la retina, motilidad ocular, preferencia de fijación y estabilidad.

[0134] Los procedimientos no limitativos para evaluar la función retiniana y sus cambios incluyen evaluar la agudeza visual (por ejemplo, agudeza visual mejor corregida [BCVA], deambulación, navegación, detección y discriminación de objetos), evaluar el campo visual (por ejemplo, perimetría de campo visual estática y cinética), realizar un examen clínico (por ejemplo, examen con lámpara de hendidura de los segmentos anterior y posterior del ojo), evaluación de la respuesta electrofisiológica a todas las longitudes de onda de luz y oscuridad (por ejemplo, todas las formas de electrorretinografía (ERG) [campo completo, multifocal y patrón], todas las formas de potencial visual evocado (VEP), electrooculografía (EOG), visión del color, adaptación a la oscuridad y/o sensibilidad al contraste). Los procedimientos no limitativos para evaluar la anatomía y la salud de la retina y sus cambios incluyen la tomografía de coherencia óptica (OCT), la fotografía del fondo de ojo, oftalmoscopía con láser de barrido con óptica adaptativa (AO-SLO), fluorescencia y/o autofluorescencia; medir la motilidad ocular y los movimientos oculares (por ejemplo, nistagmo, preferencia de fijación y estabilidad), medir los resultados informados (cambios informados por el paciente en conductas y actividades visuales y no guiadas visualmente, resultados informados por el paciente [PRO], evaluaciones basadas en cuestionarios de calidad de vida, actividades diarias y medidas de la función neurológica (por ejemplo, imágenes por resonancia magnética nuclear (MRI) funcional).

[0135] En algunas realizaciones, una cantidad eficaz del virión de rAAV en cuestión da como resultado una disminución en la tasa de pérdida de la función retiniana, la integridad anatómica o la salud retiniana, por ejemplo, una disminución de 2, 3, 4 o 5 veces o más en la tasa de pérdida y, por lo tanto, progresión de la enfermedad, por ejemplo, una disminución de 10 veces o más en la tasa de pérdida y, por lo tanto, progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del virión de rAAV en cuestión da como resultado una ganancia en la función visual, la función retiniana, una mejora en la anatomía o la salud de la retina y/o una mejora en la motilidad ocular y/o una mejora en la función neurológica, por ejemplo, una mejora de 2, 3, 4 o 5 veces o más en la función de la retina, la anatomía o la salud de la retina, y/o mejora en la motilidad ocular, por ejemplo, una mejora de 10 veces o más en la función de la retina, anatomía o salud retiniana, y/o mejora de la motilidad ocular. Como entenderá fácilmente el experto en la materia, la dosis requerida para lograr el efecto de tratamiento deseado estará típicamente en el intervalo de 1 * 108 a aproximadamente 1 * 1015viriones recombinantes, típicamente denominados por el experto en la materia como de 1 * 108 a aproximadamente 1 * 1015"genomas del vector".

[0136] Un virión de rAAV en cuestión puede administrarse mediante inyección intraocular, por ejemplo, mediante inyección intravítrea, inyección subretiniana, inyección supracoroidea o mediante cualquier otro modo o vía de administración conveniente que resulte en la administración del virión de rAAV al ojo. Otros mancestodos o vías de administración convenientes incluyen, sin limitación, inyecciones intravenosas, intraarteriales, perioculares, intracamerales, subconjuntivales y subtenonianas y administración tópica e intranasal. Cuando se administra a través de una inyección intravítrea, el virión de rAAV en cuestión puede desplazarse a través del vítreo y atravesar la membrana limitante interna (también denominada en el presente documento como membrana limitante interna o "ILM"; una membrana acelular transparente delgada sobre la superficie de la retina que forma el límite entre la retina y el cuerpo vítreo, formado por astrocitos y los pies terminales de las células de Müller), y/o se desplaza a través de las capas de la retina de manera más eficaz, en comparación con la capacidad de un virión de AAV que comprende la correspondiente proteína de la cápside de AVV parental.

[0137] Se aísla, por ejemplo, se purifica una variante de la proteína de la cápside descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside descrita en el presente documento se incluye en un vector AAV o un virión AAV recombinante (rAAV). En otras realizaciones, dichos vectores variantes de AAV y/o viriones variantes de AAV se usan en un procedimiento in vivo o ex vivo para tratar enfermedades oculares en la retina de primates.

[0138] La divulgación en el presente documento proporciona además células huésped, tales como, sin limitación, células huésped aisladas (modificadas genéticamente) que comprenden un ácido nucleico en cuestión. Una célula huésped según la invención, descrita en el presente documento, puede ser una célula aislada, tal como una célula procedente de un cultivo celular in vitro. Dicha célula huésped es útil para producir una variante de virión de rAAV en cuestión, tal como se describe en este documento. En una realización, dicha célula huésped se modifica genéticamente de forma estable con un ácido nucleico. En otras realizaciones, una célula huésped se modifica genéticamente de forma transitoria con un ácido nucleico. Dicho ácido nucleico se introduce de forma estable o transitoria en una célula huésped, utilizando técnicas establecidas, que incluyen, pero sin limitación, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por liposomas y similares. Para una transformación estable, un ácido nucleico generalmente incluirá además un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables bien conocidos, tales como la resistencia a la neomicina y similares. Dicha célula huésped se genera introduciendo un ácido nucleico en cualquiera de una variedad de células, por ejemplo, células de mamíferos, incluidas, por ejemplo, células murinas y células de primate (por ejemplo, células humanas). Los ejemplos de células de mamífero incluyen, pero sin limitación, células primarias y líneas celulares, donde los ejemplos de líneas celulares incluyen, pero sin limitación, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, fibroblastos de ratón 3T3, fibroblastos C3H10T1/2, células CHO, y similares. Ejemplos de células huésped incluyen, sin limitación, células HeLa (por ejemplo, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, ATCC No. CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC No. CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, At CC No. CCL10), células PC12 (ATCC No. CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC No. CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC No. CCLI.3), células de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC No. CRL1573), células HLHepG2 y similares. También puede fabricarse una célula huésped usando un baculovirus para infectar células de insecto, tales como células Sf9, que producen AAV (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. N° 7,271,002; solicitud de patente de EE.UU. N° de serie 12/297,958). En algunas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente incluye, además de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la proteína de la cápside de AAV, como se describió anteriormente, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas rep de AAV. En otras realizaciones, una célula huésped comprende además un vector variante de rAAV. Se puede generar una variante de virión de rAAV utilizando dichas células huésped. Los procedimientos para generar un virión rAAV se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. N° 2005/0053922 y la publicación de patente de EE. UU. N° 2009/0202490.

[0139] La divulgación en el presente documento proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende: a) la variante de virión de rAAV, tal como se describe anteriormente y se divulga en el presente documento; y b) un portador, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el portador, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable es adecuado para su uso en un paciente humano o no humano. Dichos excipientes, portadores, diluyentes y tampones incluyen cualquier agente farmacéutico que pueda administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, en dichos vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias reguladoras del pH y similares. Se conoce en la técnica una amplia variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no es necesario discutirlos en detalle en este documento. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito ampliamente en una variedad de publicaciones, que incluyen, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) HC Ansel et al., eds., 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) AH Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. En algunos aspectos de la presente invención, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1015 virus recombinantes o de 1 * 108 a aproximadamente 1 * 1015genomas vectoriales, en laque cada uno de dichos virus recombinantes comprende un genoma que codifica uno o más productos génicos.

[0140] Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar al experto en la materia una divulgación y una descripción completas a modo de orientación sobre cómo fabricar y utilizar las variantes de cápsides de AAV descritas en el presente documento, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención descrita en el presente documento. Además, los siguientes ejemplos no pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados.

EJEMPLOS

[0141] Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo fabricar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

[0142] Los procedimientos generales en bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short protocols in Molecular Biology, 4a ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).

[0143] Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta descripción están disponibles de proveedores comerciales, tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.

Ejemplo 1

[0144] Inyección intravítrea y recogida de tejido. Se administró la dosis mediante inyección intravítrea a través de la esclerótica (aproximadamente 3 mm detrás del limbo mediante un procedimiento y un dispositivo de administración adecuado para uso humano) a un único macaco cynomolgus macho (Macaca fascicularis) de 4 a 10 años de edad y con un peso de al menos 4 kg. El animal fue anestesiado y se le administró el anestésico tópico. Se administraron 100 pl de la biblioteca a cada ojo.

[0145] Se sacrificó el animal por personal veterinario capacitado usando una inyección intravenosa de pentobarbital sódico de 100 mg/kg el día 14 ± 3. Los ojos fueron nucleados y almacenados a 4 °C hasta la disección.

[0146] Disección de tejido. Los ojos se cortaron a lo largo de la ora serrata con un bisturí y se extrajo el segmento anterior. Se hicieron cortes en relieve en la retina alrededor de la fóvea para permitir el montaje plano de la retina y se extrajo el vítreo. Se recogieron seis muestras de retina de cada cuadrante (superior, inferior, nasal y temporal), tal como se muestra en la Figura 2, y se aisló material celular correspondiente a células RPE, fotorreceptores, células biopolares, células amacrinas, células horizontales y/o células ganglionares.

[0147] Evolución Dirigida. El proceso de evolución dirigida se muestra en las Figuras 1A-1E. Brevemente, se crea una biblioteca de cápsides virales que comprende más de 20 combinaciones patentadas de técnicas de mutación de ADN y genes cap (Figura 1A). A continuación, los virus se empaquetan (Figura 1B), de modo que cada partícula esté compuesta por una cápside mutante que rodea el gen cap que codifica esa cápside, y se purifica. La biblioteca de las cápsides se coloca bajo presión selectiva in vivo. El tejido o material celular de interés se recoge para aislar las variantes de AAV que han infectado con éxito esa diana, y los virus exitosos se recuperan. Los clones exitosos se enriquecen a través de la selección repetida (Etapa I - Figura 1D). Los genes cap seleccionados se someten a continuación a una rediversificación patentada y se enriquecen a través de más etapas de selección para aumentar iterativamente la aptitud viral (Etapa 2 - Figura 1D). Las variantes identificadas durante las etapas 1 y 2 de selección de vectores demuestran la capacidad de transducir células de retina de primates (figura 1E).

[0148] Recuperación exitosa de genomas de cápside de AAV: Rondas 1-6. Las cápsides recuperadas de cada ronda de selección se usaron para empaquetar la biblioteca inyectada para iniciar la ronda de selección subsiguiente. La recuperación de los genes de la cápside del tejido representa la internalización exitosa de los vectores de la biblioteca en el tejido de interés. Después de la Ronda 4, se incorporó una rediversificación adicional de la biblioteca antes del empaquetamiento de la biblioteca y la inyección para la Ronda 5. La recuperación de genomas virales de RPE, P^r , capa nuclear interna (INL) y tejido retiniano de capa de células ganglionares (GCL) de una ronda representativa de selección se muestra en la Figura 3. Las bandas dentro de los recuadros representan la recuperación exitosa de los genomas virales.

[0149] Análisis de secuenciación: Rondas 3-6. Durante las rondas 3-6, se realizó la secuenciación sobre clones individuales dentro de la biblioteca para determinar la frecuencia de variantes dentro de la población. Las variantes se evaluaron por la presencia de motivos dentro de los datos de secuenciación. Las variantes se agruparon en motivos en función de la presencia de una variación unificadora (por ejemplo, una mutación puntual específica o una secuencia de inserción de péptido específica en una ubicación consistente dentro de la cápside) que se produjo en múltiples secuencias. Los motivos que representan al menos el 5 % de la población secuenciada en dos o más rondas de selección o al menos el 10 % de la población secuenciada en una o más rondas de selección se representan en la Figura 4A (Análisis de secuenciación de la Ronda 3), 4B (Análisis de secuenciación de la Ronda 4), 4C (análisis de secuenciación de la ronda 5) y 4D (análisis de secuenciación de la ronda 6).

[0150] Varios clones representativos que se identificaron como que conferían una mayor infectividad de las células de la retina se enumeran en la Tabla 1 a continuación (cada clon contiene la sustitución o sustituciones identificadas y/o la inserción del péptido y, por lo demás, es idéntica a la SEQ ID NO: 2; la ronda de selección, el número y la frecuencia de secuencias (entre paréntesis) se enumeran para cada clon):

Tabla 1. Modificaciones de la secuencia de aminoácidos en la proteína de la cápside de VP1 de AAV que confieren una mayor infectividad de una o más células de la retina. Las sustituciones enumeradas en la columna 2 se basan en la secuencia de aminoácidos para AAV2 de tipo salvaje, es decir, en ausencia de é tido insertado.

______

[0151] También se identificó como una cápside que tenía una infectividad aumentada de una o más células de la retina un clon que tenía la siguiente secuencia ancestral de la cápside de VP1:

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQ DDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNP YLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKXRVLEPLGLVEEGAKTAP GKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPP AGPSGl.GSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITT STRT W ALPTYNNHLYKQISSAS AGSTN DNHYFG Y STPWGYFDFNRFHCHFSP RDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKJEV'ITNDGVTIIANNLTSTVQVFSD SEYQLPYVLGSAUQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYF PSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQST GGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQARNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAW TGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTA LENVMMTSEEE1KTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPÜM VWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQÍLIKNTPVPANP PAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNV DFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL. (SEQ ID NO:59)

[0152] Esta variante de cápside ancestral se desarrolla a partir de la cápside ancestral de SEQ ID NO: 58, en la que las posiciones de degeneración (residuos 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) evolucionó para comprender alanina (A) en 264, alanina (A) en 266, serina (S) en 268, alanina (A) en 448, treonina (T) en 459, arginina (R) en 460, alanina (A) en 467, serina (S) en 470, asparagina (N) en 471, alanina (A) en 474, serina (S) en 495, asparagina (D) en 516, asparagina (D) en 533, glutamina (Q) en 547, alanina (A) en 551, alanina (A) en 555, ácido glutámico (E) en 557, metionina (M) en 561, serina (S) en 563, glutamina (Q) en 577, serina (S) en 583, valina (V) en 593, treonina (T) en 596, alanina (A) en 661, valina (V) en 662, treonina (T) en 664, prolina (P) en 665, treonina (T) en 710, ácido aspártico (D) en 717, asparagina (N) en 718, ácido glutámico (E) en 719 y serina (S) en 723.

[0153] Los viriones variantes de AAV descritos en el presente documento pueden incorporar parámetros, características, modificaciones, ventajas y variaciones de diseño racional razonables que son fácilmente evidentes para los expertos en la técnica en el campo de la ingeniería de vectores virales de AAV.

Ejemplo 2

[0154] Se empleó la evolución dirigida para descubrir nuevas variantes de virus adenoasociados (AAV) con administración superior de genes a las células de la retina después de la administración intravítrea (IVT), una vía de administración con ventajas significativas sobre otros procedimientos de administración de genes al ojo humano (Ejemplo 1). El tropismo celular después de la administración intravítrea de la nueva variante de AAV que comprende una sustitución P34A y el péptido LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) insertado en el aminoácido 588 (LAISDQTKHA+P34A) se evaluó in vivo en primates no humanos (NHP) como un ejemplo representativo de la capacidad de las variantes de AAV que contienen ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) para transducir células de la retina.

[0155] Se fabricaron viriones de AAV recombinantes que comprenden una cápside de AAV2 o la nueva variante de la cápside LAISDQTKHA+P34A y un genoma que comprende un transgén de proteína fluorescente verde (GFP) unido operativamente a un promotor de CMV (AAV2.CMV.GFP y LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP, respectivamente) o un promotor CAG (AAV2.CAG.EGFP y LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP, respectivamente) utilizando procedimientos estándar. Se inyectaron por vía intravítrea monos verdes africanos (Figuras 7, 8) o macacos Cynomolgus (Figura 9) con varias dosis de vector que van desde 4 * 1010 vg a 1 * 1012 le12 vg por ojo (consulte las leyendas de las figuras para obtener detalles) y la transducción de las células de la retina se evaluó en vida mediante imágenes de fluorescencia del fondo del ojo con un Heidelberg Spectralis™.

[0156] La administración intravítrea de AAV que comprende la nueva variante LAISDQTKHA+P34A dio como resultado una expresión transgénica más amplia y robusta en la retina NHP que AAV2 (Figuras 7-9). Las imágenes revelan que la nueva cápside de la variante AAV proporciona una expresión robusta dentro del centro de la fóvea (un área rica en conos); en el anillo parafoveal (un área rica en células ganglionares de la retina) y en la periferia (un área rica en muchos tipos de células, incluidos bastones, glía de Muller, células amacrinas, células bipolares) tan pronto como 2 semanas después de la inyección. Por el contrario, y de acuerdo con los resultados informados por otros, el AAV2 de tipo salvaje proporciona una expresión más débil que se encuentra principalmente en el anillo parafoveal y solo puede detectarse en puntos de tiempo posteriores. El análisis inmunohistoquímico de varias regiones de la retina realizado 3 semanas después de la inyección confirmó que muchos tipos de células retinales, incluyendo células epiteliales del pigmento retinal, fotorreceptores de bastones y conos, y células de ganglios retinales, se habían transducido con éxito por toda la retina (figuras 10A-E).

[0157] Este estudio ilustra la administración de genes superiores por la variante que comprende ISDQTKH siguiendo una ruta de administración clínicamente preferida en comparación con el AAV2 clínicamente relevante. Se puede lograr una eficacia similar con otras variantes que comprenden este motivo de inserción de péptido. Asimismo, se puede lograr una eficacia similar con otras variantes descritas en el presente documento que se identificaron utilizando el mismo enfoque de evolución dirigida.

Ejemplo 3

[0158] El tropismo celular de la nueva variante de AAV LAISDQTKHA+P34A para las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y las células fotorreceptoras (PR) se evaluó in vitro en el uso de células RPE y células PR generadas a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de fibroblastos (FB-iPSC) o células madre embrionarias humanas (ESC).

[0159] Se fabricaron viriones de AAV que comprenden una cápside de AAV2 o la nueva variante de la cápside LAISDQTKHA+P34A y un genoma que comprende un transgén de proteína verde fluorescente (EGFP) unido operativamente a un promotor CAG (AAV2.CAG.EGFP y LA1SDQTKHA+P34A.CAG.EGFP, respectivamente) utilizando procedimientos estándar. Se generaron cultivos de células RPE humanas a partir de la línea de células madre embrionarias humanas ESI-017 o células madre pluripotentes inducidas derivadas de fibroblastos humanos ("FB-iPSC") usando un protocolo de diferenciación de 45 días. La maduración en células RPE se confirmó mediante la detección de la expresión de marcadores de RPE maduros, incluidos RPE65 y BEST1; la síntesis de VEGF y PEDF; y la capacidad de fagocitar segmentos externos de bastones. Se generaron cultivos de PR mediante el paradigma de formación de la copa óptica en múltiples etapas y se confirmó que comprendían PR mediante la detección de la expresión de Recoverin y S Opsin después de 179 días de cultivo.

[0160] En relación con AAV2, LAISDQTKHA+P34A proporcionó una eficiencia de transducción significativamente mayor y expresión transgénica en cultivos de RPE humanas siete días después de la infección según lo determinado por inmunofluorescencia (Figuras 11A-B), citometría de flujo (aumento de 2,7 veces; Figuras 11C -D) y análisis de transferencia Western (Figuras 11E-F). Del mismo modo, se logró una transducción y expresión robustas utilizando LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP en cultivos PR humanos 32 días después de la infección. Este estudio ilustra la capacidad superior de las variantes que comprenden ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) para administrar genes a las células de la retina.

[0161] Lo anterior simplemente ilustra los principios de la presente invención.

[0162] Además, todos los ejemplos y el lenguaje condicional enumerados en este documento están destinados principalmente a ayudar al lector a comprender los principios de la presente invención y los conceptos aportados por los inventores para promover la técnica, y deben interpretarse sin limitación a tales ejemplos y condiciones específicamente citados.

[0163] La presente invención está definida por las reivindicaciones.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Variante de la proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV) que comprende un péptido heterólogo con una longitud de 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos insertados covalentemente en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en la que la inserción del péptido comprende la secuencia de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14).

2. Variante de la proteína de la cápside de AAV de la reivindicación 1, en la que el péptido de inserción tiene ^{de 1 a 3 aminoácidos espaciadores (Y}1^-Y3^{) en el extremo amino y/o carboxilo terminal de la secuencia de} aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), preferiblemente en la que el péptido de inserción es LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28).

3. Variante de la proteína de la cápside de AAV, según la reivindicación 1 ó 2, en la que el sitio de inserción está ubicado entre los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV.

4. Variante de la proteína de la cápside de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína de la cápside comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o una o más sustituciones correspondientes en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV, preferiblemente una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: MIL, L15P, P34A, n 57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, 1698V, V708I, V719M, S721L, y L735Q, más preferiblemente una sustitución de aminoácido P34A.

5. Variante de la proteína de la cápside de AAV, según la reivindicación 4, en la que la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido P34A en relación con VP1 de AAV2 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90 %, idéntica al menos un 95 %, idéntica al menos un 98 % o idéntica en un 100% a la longitud total de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:42, preferiblemente en la que la proteína de la cápside consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta como s Eq ID NO:42.

6. Variante de la proteína de la cápside de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína de la cápside confiere a un virión de AAV recombinante infeccioso (rAAV) una infectividad aumentada, preferiblemente una infectividad aumentada al menos dos veces, de una célula de la retina en comparación con la infectividad de la célula de la retina por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.

7. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la variante de la proteína de la cápside de AAV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Virión de rAAV que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferiblemente que comprende además un ácido nucleico heterólogo, preferiblemente un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico, preferiblemente en el que el producto génico es un proteína o ARN de interferencia.

9. Composición farmacéutica que comprende un virión de rAAV, según la reivindicación 8 y un portador, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable.

10. Virión de rAAV, según la reivindicación 8, o una composición farmacéutica, según la reivindicación 9, para uso como medicamento.

11. Virión de rAAV o una composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 10, para usar en un procedimiento de administración de un ácido nucleico heterólogo a una célula de la retina, preferiblemente a una célula de la retina seleccionada del grupo que consiste en células ganglionares retinales, células amacrinas, células horizontales, células bipolares, células fotorreceptoras, células gliales de Muller, células microgliales y epitelio pigmentario de la retina, preferiblemente mediante inyección intravítrea.