ES2344739T3

ES2344739T3 - Proteina capsidial vp1 modificada del parvovirus b19.

Info

Publication number: ES2344739T3
Application number: ES05799042T
Authority: ES
Inventors: Susanne Modrow; Torsten Lowin; Markus Mobs; Michael Broker
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2010-09-06
Anticipated expiration: 2025-09-23
Also published as: PL1791858T3; PT1791858E; US20070286870A1; EP1791858A2; US9573979B2; WO2006032697A2; CY1110185T1; DE602005020815D1; WO2006032697A3; ES2556710T3; EP2149583B1; EP1791858B1; US20170260239A1; ATE465173T1; EP2149583A1

Abstract

Proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19 que tiene una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre del parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Sec ID Nº: 1, en la que uno o más de los restos aminoacídicos conservados en el centro activo de la fosfolipasa A2 se modifican en la posición 153: histidina; en la posición 157: tirosina; en la posición 162: lisina; y/o en la posición 168: tirosina.

Description

Proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19.

La presente invención se refiere a proteínas y partículas capsidiales del parvovirus B19 modificadas, a sus usos y a la fabricación de medicamentos que incluyen vacunas para el tratamiento de enfermedades asociadas al parvovirus B19.

El parvovirus B19 se descubrió en 1975 como causante de infecciones sistémicas en adultos que eran asintomáticos o tenían síntomas leves no específicos tales como cefalea, pirexia, malestar, fatiga y mialgia (1, 2, 3). En 1984 el parvovirus B19 se identificó como el agente etiológico de eritema infeccioso, también conocidos como quinta enfermedad (4). El virus se extiende a nivel mundial pero se limita exclusivamente a huéspedes humanos. Con respecto a diferencias regionales aproximadamente del 40 al 60 por ciento de la población presenta anticuerpos contra proteínas virales a los 20 años. La infección es endémica, sin embargo alcanza brotes regionales al finalizar el invierno y en la primavera. El virus es muy estable. En general se transmite por vía oral desde individuos con infección aguda (5). Además de esta vía de infección principal el virus puede transmitirse por la sangre y productos derivados de la sangre por vía parenteral y verticalmente de la madre al feto (6, 7, 8, 9). La replicación productiva masiva del parvovirus B19 tiene lugar en las células progenitoras eritroides (10). Por lo tanto durante la infección aguda la carga viral es extremadamente alta y pueden presentarse hasta 10^{13} partículas y/o genomas virales por mililitro de sangre periférica. El virus se une a las células precursoras de eritrocitos usando el antígeno P del grupo sanguíneo (globósido) como el receptor celular para la adsorción (11). Se ha observado que después de la infección y la eliminación de la sangre periférica los genomas virales están presentes en las células de la médula ósea y en la piel, en las células sinoviales, en tejidos hepáticos y en el endotelio del miocardio (12, 13, 14, 15, 16, 17). Hasta ahora no está claro si estas células producen las proteínas virales y/o las partículas de B19 infecciosas y si el genoma viral puede reactivarse para la replicación productiva.

Habitualmente la infección por parvovirus B19 carece de síntomas clínicos o puede dar como resultado una enfermedad similar a la gripe. Particularmente los niños pueden padecen eritema infeccioso (quinta enfermedad), una enfermedad eruptiva autolimitada (18, 19, 20). También se ha relacionado el parvovirus B19 con un amplio espectro de enfermedades (Tabla 1): puede producirse anemia transitoria, leucocitopenia o trombocitopenia sin necesitar ninguna terapia. Sin embargo, en algunos pacientes se observó trombocitopenia grave, aplasia eritrocitaria pura o pancitopenia. Junto con estas secuelas hematológicas de hepatitis por infección aguda, también puede producirse ocasionalmente miocarditis, miositosis, lesión pulmonar aguda y enfermedades neurológicas (12, 21, 22, 23, 24). En gestantes, como manifestaciones clínicas, se ha descrito aborto espontáneo, hidrops fetal no inmune y muerte fetal intrauterina (25, 26). En gestantes no inmunes con infección aguda se ha observado un índice de mortalidad fetal de aproximadamente el 9% (9, 27). Sin embargo también hay estudios que describen un mayor porcentaje para el desarrollo de hidrops fetal en gestantes no inmunes infectadas por B19 (28). Dependiendo del estado hematológico del huésped; por ejemplo pacientes con anemia falciforme o talasemia, la infección por B19 da lugar a una crisis aplásica. La infección persistente por parvovirus B19 se ha descrito en pacientes con y sin inmunodeficiencias subyacentes (29, 30).

Además de estas manifestaciones generales la infección por parvovirus B19 puede inducir un amplio espectro de fenómenos autoinmunes. Las citopenias autoinmunes son trastornos hematológicos bien conocidos que pueden afectar a cualquier linaje celular de la médula ósea. En la inmensa mayoría de casos únicamente una de las líneas celulares se afecta. Sin embargo, se conoce la destrucción simultánea mediada autoinmune de granulocitos neutrófilos y trombocitos debido a la infección persistente por parvovirus B19 (31). El parvovirus B19 se ha identificado como un posible desencadenante en algunos casos de trombocitopenia inmune (32, 33, 34, 35). El espectro clínico de la artropatía autoinmune varía desde artralgias leves a vasculitis necrotizante severa (Tabla 1). En algunos brotes de eritema infeccioso, se han descrito generalmente artralgias y artritis. La infección por B19 puede producir una poli artropatía periférica simétrica en adultos. Normalmente los síntomas son autolimitantes pero pueden persistir durante algunos meses. Ocasionalmente, en pacientes con poliartralgia/poliartritis de larga duración se ha observado viremia combinada con anticuerpos IgM/IgG contra las proteínas VP1 y/o VP2 estructurales. Algunos de estos cumplieron con los criterios de la artritis reumatoide (AR) (26, 37). Sin embargo el desarrollo de AR después de infección aguda por parvovirus parece ser inusual (38, 39). En niños se conoce bien la relación de la infección por B19 con artritis-artralgias. Algunos de los niños afectados pueden desarrollar artritis crónica indistinguible de la artritis idiopática juvenil (40, 41, 42, 43). El espectro clínico incluye mono, oligo y poliartritis. Adicionalmente se observa frecuentemente viremia persistente en niños con artritis idiopática juvenil sistémica. En niños con diversas formas de artritis juvenil se amplificó ADN del B19 en el 57% del suero y/o del líquido sinovial de aquellos con infección previa por parvovirus B19. En muchos pacientes podría demostrarse la presencia continua de partículas virales e inmunocomplejos en la sangre periférica así como en el líquido sinovial (44). A pesar del desarrollo y de la presencia de inmunoreacción específica del B19 los niños no podían eliminar el virus y mostraron un estado de viremia prolongado o persistencia viral en el líquido sinovial.

La infección por parvovirus B19 se ha asociado con diversas formas de vasculitis, colagenosis y puede imitar al lupus eritematoso sistémico (LES) en niños y adultos (39, 45, 46). Similar a la situación en pacientes con artritis también se ha descrito en pacientes con LES infección por parvovirus B19 como agente causante o desencadenante de la enfermedad reumática (47, 48, 49, 50, 51). Recientemente, se describió una asociación entre la infección persistente por parvovirus B19 y la producción de anticuerpos anti-fosfolipídicos en pacientes pediátricos y adultos con enfermedades reumáticas (52). El síndrome anti fosfolipídico (SAF) (53) se caracteriza, al igual que algunas infecciones por parvovirus B19, por una amplia diversidad de manifestaciones hemocitopénicas y vaso-oclusivas. Adicionalmente la pérdida fetal recurrente y la asociación con anticuerpos dirigidos contra fosfolípidos cargados negativamente y cofactores de proteínas, principalmente \beta2-glicoproteína-I son importantes características del SAF. La hipótesis con respecto a una patogenicidad común del síndrome anti-fosfolipídico y las características autoinmunitarias observadas en la infección por B19 no sólo se basa por la estrecha asociación entre la presencia de anticuerpos anti-fosfolipídicos y la infección por parvovirus B19 sino también por la similitud en la presentación de síntomas clínicos en pacientes con infección por parvovirus B19 y en pacientes con el síndrome anti fosfolipídico (SAF).

La cápside icosaédrica del parvovirus B19 comprende dos proteínas estructurales, VP1 (83 kDa) y VP2 (58 kDa), que son idénticas excepto en 227 aminoácidos (aa) en el extremo amino-terminal de la proteína VP1 (la región única de VP1).

En la secuencia de aminoácidos de la región única de VP1 está presente un motivo fosfolipasa A2 que abarca las posiciones 130 a 195 (centro activo Fosfolipasa A2) (54). Uno de los mecanismos patogénicos implicado en el desencadenamiento de la producción de anticuerpos anti-fosfolipídicos podría ser la actividad de tipo fosfolipasa-A2 observada en la región única de VP1 de la proteína estructural VP1 del parvovirus B19 (54). Esta actividad enzimática está presente en las partículas infecciosas del B19, en las cápsides vacías recombinantes constituidas por las proteínas VP1/VP2 y en preparaciones de la región única de VP1 purificada. Esto puede contribuir a los procesos inflamatorios inducidos por la producción de leucotrienos y prostaglandinas, pero también puede conducir a la generación de productos de escisión naturales inusuales a partir de compuestos fosfolipídicos celulares que pueden inducir anticuerpos aPL en combinación con un fondo genético distinto.

Hasta ahora no hay disponible ninguna vacuna para prevenir la infección por parvovirus B19. Con respecto a los transcursos graves que se observan en asociación con la infección, los problemas asociados con la infección en gestantes y el potencial viral para inducir una amplia diversidad de respuestas autoinmunes en el desarrollo de una vacuna segura que protege contra infecciones por parvovirus B19 se han usado cápsides vacías recombinantes purificadas constituidas por las proteínas VP1/VP2 expresadas por vectores de baculovirus en un ensayo en fase I y se demostró la inducción exitosa de anticuerpos neutralizantes contra B19 en voluntarios (55). Sin embargo, la aplicación de esta vacuna se combinó con una diversidad de efectos secundarios. Además de hinchazón en la zona de aplicación de las inyecciones, en más del 50% de los voluntarios se indicaron síntomas malestar general como fiebre, cefalea y diarrea. Estos efectos secundarios indican que la aplicación de la vacuna produce la manifestación sistémica de los efectos secundarios que se sabe que están asociados con la activación de las reacciones básicas de defensa asociadas con la inflamación. Durante las reacciones inmunes tempranas después de infecciones, por ejemplo, estos efectos se asocian principalmente con la activación de fosfolipasas A2 celulares y citosólicas. Estas enzimas son responsables de la producción de ácido araquidónico como precursor de la producción de prostaglandina y leucotrieno, la inducción de diversas cito- y quimiocinas conduce a fiebre y malestar general.

Los efectos secundarios observados por Ballou y colaboradores que usan cápsides vacías de VP1/VP2 producidas por baculovirus recombinantes (55) se debe probablemente a la actividad de tipo fosfolipasa-A2 que es parte de la región única de VP1 de la proteína capsidial viral VP1.

Girod y col. (The Journal of General Virology 83(5) (2000): 973-978) describen la actividad de la fosfolipasa A2 del parvovirus del virus adeno-asociado de tipo 2 (VAA-2).

Shields y col. (American Journal of Obstetrics & Gynaecology 182(1) (2000): 18) describen una proteína capsidial del parvovirus B19 usada para incubar con diversos sistemas celulares diferentes que produce reducción del crecimiento y de la formación de colonias de las células incubadas.

El documento WO 03/006067 describe parvovirus de animales y sus efectos oncotóxicos.

El documento WO 00/306668 A desvela que el parvovirus B19 se une al antígeno P en células huésped, por ejemplo en células hematopoyéticas humanas y otras células sanguíneas y que las proteínas o fragmentos capsidiales de los mismos pueden inhibir el crecimiento de las células que poseen el antígeno P.

El problema subyacente de la presente invención es proporcionar medicamentos tales como una vacuna contra el parvovirus B19 para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas con el parvovirus B19 con mínimos efectos secundarios.

La presente invención aborda este problema cambiando/modificando ventajosamente la proteína capsidial VP1 del parvovirus B19 reduciendo por lo tanto la actividad de tipo fosfolipasa A2 en la región única de VP1 de la proteína capsidial viral VP1.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína capsidial VP1 del parvovirus B19 que tiene una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre del parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, en la que uno o mas de los restos aminoacídicos conservados en el centro activo de la fosfolipasa A2 está modificado en la posición 153: histidina; posición 157: tirosina; posición 162: lisina y/o posición 168: tirosina.

De acuerdo con la presente invención, la actividad fosfolipasa natural se reduce (lo que incluye la completa anulación de la actividad). Por lo tanto, las regiones de la proteína que están implicadas en la reducción de esta actividad fosfolipasa pueden modificarse de acuerdo con la presente invención. Estos cambios comparados con la secuencia de tipo silvestre pueden introducirse por intercambios, deleciones o inserciones de aminoácidos. Un experto en la materia puede valorar fácilmente la reducción de la actividad fosfolipasa basándose en la metodología desvelada en este documento, especialmente con el ensayo descrito en la Figura 2 de Dorsch y col, 2002 (54). Por otro lado, los cambios no deben modificar significativamente el rendimiento inmunológico de la vacuna (es decir que la mutación no debe influir de manera adversa en las propiedades inmunogénicas).

De acuerdo con la presente invención, los restos aminoacídicos en la región única de VP1 de la proteína capsidial VP1 (aminoácidos 100-220, específicamente 130 a 195) están modificados. Esta región está muy conservada en los tres genotipos del parvovirus B19 que hasta ahora se han identificado (60; Fig. 2). Sin embargo aunque obviamente esta región está conservada, pueden observarse diferencias en la actividad de diferentes genotipos de parvovirus B19: Genotipo 1: 100%, Genotipo 2: 70%, Genotipo 3: 59%. La referencia en cuando a la actividad de tipo silvestre significa que para comparar el mutante de tipo silvestre se selecciona el genotipo más próximo (por ejemplo si se fabrica un mutante de genotipo 2, la actividad fosfolipasa del mutante se compara con el tipo silvestre del genotipo 2).

En general, toda la proteína VP1 puede someterse a la introducción de mutaciones para reducir o eliminar la actividad de tipo fosfolipasa A2 de esa proteína. Sin embargo, como las mutaciones fuera de la región única de VP1 (aminoácidos 100-220, específicamente 130 a 195) normalmente tienen, si lo tienen, un potencial de reducción bajo sobre la actividad fosfolipasa, las mutaciones dentro de esta región única de VP1 se realizan de acuerdo con la presente invención. No obstante, también pueden introducirse mutaciones fuera de la región de la región única de VP1, por ejemplo, por amino-truncamientos o por mutaciones en la región de los aminoácidos 50-90, especialmente 59-81. Si una mutación realiza la reducción esperada de la actividad fosfolipasa puede tratarse fácilmente por la combinación de la expresión del mutante con un ensayo de actividad funcional. Dichos ensayos de actividad fosfolipasa se encuentran bien disponibles en la técnica y también se describen en este documento.

Los sitios de mutación específicamente preferidos están alrededor de los aminoácidos (Tyr(130), Gly(132), Gly(134), Asp(154)) de unión a Ca^{2} o alrededor en la red catalítica (His(153), Tyr(157), Tyr(168)), incluyendo la unión fosfolipídica (Lys(162)), es decir aminoácidos 125-140 y 50-175, especialmente 127-137, 152-160 y 165 a 171 (véase también la Sec ID Nº 1 y la Figura 2 para las secuencias).

Los intercambios preferidos son los intercambios normalmente usados en las estrategias de mutación para reducir la actividad enzimática, por ejemplo, sustitución de un aminoácido con una cadena lateral funcional (His, Lys, Tyr, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, etc.) por un aminoácido con una cadena lateral no funcional del mismo o diferente tamaño (Ala, Phe, Leu, Pro, Ile, etc.) o por una cadena lateral funcional diferente (por ejemplo, Asn \rightarrow Asp, Gln \rightarrow Ser, etc.). Algunas veces, también es suficiente una ligera diferencia (Val \rightarrow Ala, Ser \rightarrow Thr, etc.).

De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, se modifican uno o más de los restos aminoacídicos conservados en el centro activo de la fosfolipasa A2. Los restos aminoacídicos en la posición 153: histidina; 157: tirosina; 162: lisina; 168: tirosina; 195: ácido aspártico se han descrito como partes de la triada catalítica de la fosfolipasa A2 pancreática bovina y se han implicado en la orientación y especificidad del sustrato (58, 59). La modificación de uno o más de los restos de 153: histidina, 157: tirosina, 162: lisina, 168: tirosina produce una reducción incluso más pronunciada de la actividad de tipo fosfolipasa A2, mientras que la modificación y el cambio del resto de 195: ácido aspártico produce una actividad potenciada de tipo fosfolipasa A2.

Por tanto de acuerdo con la presente invención, se modifica uno o más de los restos aminoacídicos en la posición 153: histidina; posición 157: tirosina; posición 162: lisina; y/o posición 168: tirosina.

De acuerdo con otra realización preferida, la histidina 153 se modifica a alanina; la tirosina 157 se modifica a fenilalanina; la lisina 162 se modifica a leucina y/o la tirosina 168 se modifica a fenilalanina.

En general, la mutación de acuerdo con la presente invención debe ser lo menor posible (para no modificar demasiado las propiedades inmunogénicas): normalmente una baja cantidad de sustituciones de aminoácidos (6, 5, 4, 3, 2 o preferentemente 1) y una corta inserción o deleción (30, 20, 10, 5 ó 1 aminoácido) debe ser suficiente para reducir o eliminar eficazmente la actividad fosfolipasa. Sin embargo, siempre que las propiedades inmunogénicas no cambien de manera significativa, no se excluyen inserciones, deleciones más largas (50, 100, 200 aminoácidos) o un mayor número de sustituciones. Sin embargo, las últimas, las mutaciones múltiples también son menos preferidas debido a aspectos económicos.

Si los mutantes tienen propiedades inmunogénicas similares o no puede determinarse fácilmente por ejemplo por reacción con anticuerpos específicos o determinando in vitro o in vivo la capacidad para inducir respuestas inmunes. Generalmente, los mutantes deberían mostrar (con o sin adyuvantes específicos) aproximadamente el 50% de inmunogenicidad in vivo como el tipo silvestre (sin adyuvantes, o preferentemente, con el mismo adyuvante que el mutante), determinado por al menos un procedimiento aplicado y aceptado científicamente (revisión por pares), por ejemplo ensayos ELISpot de unión a anticuerpos, etc. (véase también: el apartado ejemplos de la presente solicitud).

\newpage

De acuerdo con la presente invención, la región única de VP1 modificada o la proteína capsidial VP1 modificada de la presente invención produce una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre. Preferentemente, la reducción es de al menos el 30% en comparación con el tipo silvestre (es decir el 70% o menos de la actividad de tipo silvestre). Se prefiere adicionalmente una reducción del 50% o menor, 30% o menor, 20% o menor, o 10% o menor de la actividad de tipo silvestre. La actividad de referencia del tipo silvestre y del mutante se determina preferentemente de acuerdo con un ensayo de actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 normalizado, especialmente de acuerdo con la figura 2 de (54).

Especialmente, estos mutantes que carecen completamente de esta actividad (es decir inferior al 5%, inferior al 1%, o inferior a 0,1%, dependiendo de los límites de detección del procedimiento) son más adecuados para su uso y protección en vacunas de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, la alternancia de los restos aminoacídicos se realiza por mutagénesis dirigida.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la proteína capsidial VP1 modificada proporcionada por la presente invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un vector de expresión recombinante que comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican la región única de VP1 modificada y la proteína capsidial VP1 modificada proporcionada por la presente invención.

Preferentemente, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente la proteína capsidial VP2 del parvovirus B19 especialmente en el que la proteína puede expresarse junto con la cápside VP1 modificada. Sin embargo, también la expresión combinada de las proteínas VP1 y VP2 que usan dos vectores que se introducen en las células tiene sus ventajas para propósitos específicos.

Más preferentemente, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente invención comprende un producto de fusión en el que la región única VP1 modificada o la proteína capsidial VP1 modificada se fusiona con la proteína capsidial VP2.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, la célula huésped es E. coli, una levadura o una célula animal.

Más preferentemente la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae. Esta especie de levadura se ha usado durante dos décadas para producir partículas recombinantes de HBsAg (antígeno de superficie de la hepatitis B) que protegen contra la infección por el virus de la hepatitis B. Se ha demostrado que el uso de vacunas del VHB derivadas de S. cerevisiae recombinante es seguro, observándose efectos secundarios en escasísimas ocasiones.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la producción de la región única de VP1 modificada o la proteína capsidial VP1 modificada o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 transformando una célula huésped, expresando la cápside de VP1 (y opcionalmente la cápside de VP2), recuperando la proteína (o proteínas), opcionalmente como partículas similares a virus, usando la célula huésped de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente en dicho procedimiento la región única de VP1 modificada y/o la proteína capsidial VP1 modificada y/o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 se aíslan y/o purifican.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona la región única de VP1 modificada y/o la proteína capsidial VP1 modificada o el producto de fusión de la región única de VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 que pueden obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona la región única de VP1 modificada y/o la proteína VP1 modificada o el producto de fusión de la región única de VP1 modificada y/o la proteína VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 para su uso como medicamentos.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de la región única de VP1 modificada, la proteína VP1 modificada con o sin proteína capsidial VP2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la infección por parvovirus B19 y/o enfermedades reumáticas y autoinmunes asociadas con el parvovirus B19.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso del producto de fusión de la región única de VP1 modificada, la proteína VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la infección por parvovirus B19 y/o enfermedades reumáticas y autoinmunes asociadas con el parvovirus B19.

Preferentemente el tratamiento es contra artralgias; artritis; más preferentemente monoartritis, oligoartritis, poliartritis, artritis reumatoide y/o artritis idiopática juvenil; lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis, más preferentemente vasculitis leucocitoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome papulopurpúrico en guantes y calcetines (SPPGC), enfermedad de Kawasaki, arteritis de células gigantes (ACG), poliarteritis nodosa y/o granulomatosis de Wegener; dermatomiositis; neutropenia autoinmune; trombocitopenia autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica autoinmune; y/o síndrome hemofagocítico asociado a un virus (SHAV).

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de la región única de VP1 modificada, la proteína capsidial VP1 modificada o el producto de fusión de la región única de VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la presente invención en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de las células huésped de la presente invención en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan las partículas recombinantes similares a un virus constituidas por la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención con o sin proteína capsidial VP2.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporcionan las partículas recombinantes similares a un virus constituidas por el producto de fusión de la región única de VP1 modificada, la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, pueden usarse las partículas recombinantes similares a un virus para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la infección por parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas con parvovirus B19.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la presente invención en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende la región única de VP1 modificada, la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención con o sin la proteína capsidial VP2.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19 que comprende el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden adicionalmente uno o más transportadores y/o adyuvantes adecuados para los propósitos de la vacunación.

Por lo tanto, las composiciones proporcionadas por la presente invención, especialmente en forma de una vacuna, pueden comprender adicionalmente una sustancia autoinmunoestimuladora, preferentemente seleccionada del grupo constituido por un compuesto policatiónico, preferentemente un polímero policatiónico, más preferentemente un péptido policatiónico, especialmente poliarginina, polilisina o un péptido antimicrobiano, polímeros; desoxinucleótidos inmunoestimuladores (ODN); péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys; compuestos neuroactivos especialmente la hormona de crecimiento humana; alumbre, adyuvante completo o incompleto de Freund o combinaciones de los mismos.

La presente vacuna comprende preferentemente

-: como antígeno, una proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención

-: un péptido que comprende una secuencia R_{1}-XZXZ_{N}XZX-R_{2}, en la que N es un número entero entre 3 y 7, preferentemente 5, X es un resto aminoacídico natural y no natural cargado positivamente, Z es un resto aminoacídico seleccionado del grupo constituido por L, V, I, F y/o W, y R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente entre sí del grupo constituido por -H, -NH_{2}, -COCH_{3}, -COH, un péptido con hasta 20 restos aminoacídicos o un grupo peptídico reactivo o un engarce peptídico con o sin un péptido; X-R_{2} puede ser una amida, éster o tioéster del resto aminoacídico C-terminal del péptido (en lo sucesivo denominado también "Péptido A") y/o

-: una molécula de ácido oligodesoxinucleico (ODN) inmunoestimulador que tiene la estructura de acuerdo con la fórmula (I)

: 1

en la que

R1 se selecciona de hipoxantina y uracilo,

cualquier X es O ó S,

cualquier NMP es un 2' desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina-, desoxiinosina-, desoxicitosina-, desoxiuridina-, desoxitimidina-, 2-metil-desoxii-
nosina-, 5-metil-desoxicitosina-, desoxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-de-
soxiguanina-, 2-dimetil-desoxiguanosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina-monofosfato o -monotiofosfato, NUC es un 2' desoxinucleósido, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina-, desoxiguanosina-, desoxiinosi-
na-, desoxicitosina-, desoxiinosina-, desoxitimidina-, 2-metil-desoxiuridina-, 5-metil-desoxicitosina-, desoxipseudou-
ridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxiguanosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina,

a y b son números enteros de 0 a 100 con la condición de que a + b esté entre 4 y 150 y

B y E son grupos comunes para terminaciones 5' ó 3' de moléculas de ácido nucleico (en lo sucesivo denominados también "I-/U-ODN").

Por supuesto, la presente vacuna puede contener adicionalmente otras sustancias, por ejemplo diluyentes o transportadores farmacéuticamente aceptables, sustancias tamponantes o estabilizantes, etc.

La vacuna de acuerdo con la presente invención también puede contener otros adyuvantes o adicionales, específicamente un adyuvante Al(OH)_{3} (alumbre).

Como se entiende en este documento, el alumbre incluye todas las formas de adyuvantes basados en Al^{3+} usados en medicina e investigación humana y animal. Especialmente, incluye todas las formas de hidróxido de aluminio como se define en Römpp, 10ª Ed. páginas 139/140, formas en gel de los mismos, fosfato de aluminio, etc.

Los péptidos o compuestos policatiónicos a usar de acuerdo con la presente invención pueden ser cualquier compuesto policatiónico que muestre el efecto característico de acuerdo con el documento WO 97/30721. Los compuestos policatiónicos preferidos se seleccionan de los polipéptidos básicos, policationes orgánicos, poliaminoácidos básicos o mezclas de los mismos. Estos poliaminoácidos deberían tener una longitud de cadena de al menos 4 restos aminoacídicos. Especialmente preferidas son las sustancias que contienen enlaces peptídicos, como polilisina, poliarginina y polipéptidos que contienen más del 20%, especialmente más del 50% de aminoácidos básicos en el intervalo de más de 8, especialmente más de 20, restos aminoacídicos o mezclas de los mismos. Otros policationes preferidos y sus composiciones farmacéuticas se describen en el documento WO 97/30721 (por ejemplo, polietileneimina) y en el documento WO 99/38528. Preferentemente estos polipéptidos contienen entre 20 y 500 restos aminoacídicos, especialmente entre 30 y 200 restos.

Estos compuestos policatiónicos pueden producirse químicamente o de manera recombinante o pueden proceder de fuentes naturales.

Los (poli)péptidos catiónicos también pueden ser péptidos microbianos antibacterianos policatiónicos. Estos (poli)péptidos pueden ser de origen procariota o eucariota o pueden producirse químicamente o de manera recombinante. Los péptidos también pueden pertenecer a la clase de péptidos antimicrobianos de origen natural. Dichos péptidos de defensa a huésped o defensivos también son una forma preferida del polímero policatiónico de acuerdo con la presente invención. Generalmente, como polímero policatiónico se usa un compuesto que permitido como una activación del producto final (o regulación negativa) del sistema inmune adaptativo, preferentemente mediado por las células presentadoras de antígeno CPA (incluyendo las células dendríticas).

Adicionalmente, los compuestos neuroactivos, tales como la hormona de crecimiento (humana) (como se describe por ejemplo en el documento WO 0124822), pueden usarse como inmunoestimulantes (Inmunizadores).

Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen VIH-REV o VIH-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos antennapedia, quitosan u otros derivados de quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas por producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos preferidos son la catelicidina o sustancias relacionadas o derivadas de la catelicidina, especialmente catelicidinas de ratón, bovinas o especialmente humanas y/o catelicidinas. Las sustancias de catelicidinas relacionadas o derivadas contienen toda o partes de la secuencia de catelicidina con al menos 15-20 restos aminoacídicos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales por aminoácidos que no se encuentran entre los 20 aminoácidos convencionales. Por otra parte, pueden introducirse otros restos catiónicos en dichas moléculas de catelicidina. Estas moléculas de catelicidina son las preferidas para combinar con la composición antígeno/vacuna de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, de manera sorprende estas moléculas de catelicidina han resultado ser también eficaces como un adyuvante para un antígeno sin la adición de adyuvantes adicionales. Por lo tanto es posible usar dichas moléculas de catelicidina como adyuvantes eficaces en las formulaciones de vacunas con o sin sustancias inmunoactivantes adicionales.

La vacuna de acuerdo con la presente invención contiene preferentemente como Péptido A KLKL_{5}KLK y/o como I-/U-ODN oligo d(IC)_{13}. (La combinación del Péptido A y del Oligo-d(IC)_{13} también se denomina IC31). Estas dos sustancias son específicamente ventajosas de acuerdo con la presente invención.

La vacuna de acuerdo con la presente invención puede contener un oligodesoxinucleótido que contiene un motivo CpG como ácido nucleico inmunomodulador. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores para usar de acuerdo con la presente invención pueden ser de origen sintético, procariota y eucariota. En el caso de origen eucariota, el ADN debe proceder de, basándose en el árbol filogenético, especies menos desarrolladas (por ejemplo insectos, pero también otras). En una realización preferida de la invención el oligodesoxinucleótido inmunogénico (ODN) es una molécula de ADN producida sintéticamente o mezclas de dichas moléculas. También se incluyen los derivados o modificaciones de los ODN tales como análogos tiofosfato sustituidos (restos tiofosfato sustituidos por fosfato) como por ejemplo se describe en las patentes de Estados Unidos US 5.723.335 y US 5.663.153 y otros derivados y modificaciones, que estabilizan preferentemente la composición (o composiciones) inmunoestimuladora pero no cambian sus propiedades inmunológicas. Un motivo de secuencia preferido es un motivo de ADN de seis bases que contiene un dinocleótido CpG (no metilado) flanqueado por dos purinas en 5' y dos pirimidinas en 3' (5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3'). Los motivos CpG contenidos en los ODN de acuerdo con la presente invención son más comunes en el ADN microbiano que en el de vertebrados superiores y presentan diferencias en el patrón de metilación. Sorprendentemente, las secuencias que estimulan las CPA (células presentadoras de antígeno) de ratón no son muy eficaces para las células humanas. Los ODN palindrómicos o no palindrómicos preferidos para usar de acuerdo con la presente invención se describen por ejemplo en las solicitudes de Patente Australianas A 1973/2000, A 805/2001, EP 0 468 520 A2, WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962, WO 99/51259 y WO 99/56755 todas ellas incorporadas en este documento por referencia. Los ADN/ODN pueden producirse químicamente o de manera recombinante o pueden proceder de fuentes naturales. Las fuentes naturales preferidas son los insectos.

La vacuna de acuerdo con la presente invención puede contener preferentemente un péptido policatiónico y un oligodesoxinucleótido que contiene un motivo CpG en combinación. La combinación de CpG-ODN y péptido policatiónico tiene efectos de mejora en las composiciones de vacuna, que son comparables a los efectos de la combinación del Péptido A y los I-/U-ODN y no solo pueden combinarse con el Péptido A y los I-/U-ODN sino que incluso pueden usarse en lugar de estos. Por supuesto, pueden usarse todas las mezclas de ácidos nucleicos inmunoestimuladores diferentes (I-/U-ODN, CpG-ODN,...) y variantes del Péptido A (así como otros Inmunizadores) de acuerdo con la presente invención.

Previamente se ha demostrado (documento WO 02/13857) que los péptidos antimicrobianos derivados de la catelicidina, de origen natural o derivados de los mismos tienen una respuesta inmune que estimula la actividad y por lo tanto constituyen adyuvantes de inducción de tipo 1 muy eficaces (Inmunizadores). Las principales fuentes de péptidos antimicrobianos son gránulos de neutrófilos y células epiteliales que revisten los tractos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario. En general estos se encuentran en los sitios anatómicos más expuestos a la invasión microbiana, se secretan en los fluidos corporales internos o se almacenan en los gránulos citoplásmicos de los fagocitos profesionales (neutrófilos).

En el documento WO 02/32451 se describe un adyuvante de inducción de tipo 1 (Inmunizador) que puede potenciar fuertemente la respuesta inmune contra un antígeno específico co-administrado y por lo tanto constituye un adyuvante muy eficaz, el Péptido A que comprende una secuencia R_{1}-XZXZ_{N}XZX-R_{2}. Un péptido específicamente preferido es KLKLLLLLKLK. Además de péptidos antimicrobianos de origen natural, se han producido e investigado péptidos sintéticos antimicrobianos. El péptido sintético antimicrobiano KLKLLLLLKLK-NH_{2} demostró tener actividad quimioterapéutica significativa en ratones infectados con Staphylococcus aureus; los neutrófilos humanos se activaron para producir el anión superóxido (O_{2}^{-}) mediante la calreticulina de la superficie celular. Se observó que el número y la posición de K y L exactos eran críticos para la actividad antimicrobiana del péptido sintético.

La presente invención es especialmente beneficiosa si la vacuna se administra por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica o transdérmica. Sin embargo, para la presente invención también son adecuadas otras formas de aplicación, tales como parenteral, intravenosa, intranasal, oral o aplicación tópica.

El antígeno contra el parvovirus de acuerdo con la presente invención puede mezclarse con un adyuvante (Inmunizador) (composición) o formularse específicamente de otra manera por ejemplo como liposoma, formulación retardada, etc.

Las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un individuo en cantidades eficaces conocidas por los expertos en la materia. La optimización de la cantidad de antígeno y la cantidad de inmunizador puede comenzar a partir de cantidades establecidas y usando procedimientos disponibles.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende una región única de VP1 modificada, una proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención y reactivos auxiliares.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende un producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención y reactivos auxiliares.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la presente invención y reactivos auxiliares.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona la región única de VP1 modificada, la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención con o sin proteína capsidial VP2 como un agente para modificar la actividad de una actividad de la fosfolipasa A2 huésped, por ejemplo por terapia génica o usando ARN o ARNi antisentido.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la presente invención como un agente para modificar la actividad de una actividad de la fosfolipasa A2 huésped.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la presente invención como un agente para modificar la actividad de una actividad de la fosfolipasa A2 huésped.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, de los que pueden extraerse características, realizaciones y ventajas adicionales. Debe entenderse que los presentes ejemplos solo se proporcionan a modo de ilustración y no a modo de limitación de la divulgación.

La Figura 1 muestra una comparación inmunológica de una proteína ts (de tipo silvestre) y mutante

La Figura 2 muestra un alineamiento de la proteína VP1 del parvovirus.

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Ejemplo 1

La producción de antígenos contra VP1/VP2 sin actividad enzimática puede conseguirse por modificación de los restos que son parte del centro activo por mutagénesis dirigida. A pesar del hecho de que el tamaño global de las enzimas celulares con actividad fosfolipasa A2 dependiente de Ca^{2+}-y la región única de VP1 viral es diferente, los alineamientos que comparan las secuencias de aminoácidos revelan diversos restos conservados en la región que representan el centro activo de la enzima. Se observaron aminoácidos conservados en las siguientes posiciones:

Resto 153; histidina; resto 157: tirosina; resto 162: lisina; resto 168: tirosina; resto 195: ácido aspártico. Los aminoácidos respectivos se han descrito como partes de la triada catalítica de la fosfolipasa A2 pancreática bovina y se han implicado en la orientación y especificidad del sustrado. Por lo tanto, la modificación de estos restos en la región única de VP1 por mutagénesis dirigida se realizó usando la reacción en cadena de la polimerasa con un cebador mutado y una extensión solapada como se ha descrito inicialmente por Ho y colaboradores (56). Como se muestran en la tabla 2 la actividad de tipo fosfolipasa A2 de la región única de VP1 podría reducirse intercambiando ambas tirosinas 157 y 168 por fenilalanina y modificando la lisina 162 por leucina. Sin embargo el intercambio del ácido aspártico 195 por alanina conduce a una potenciación inesperada de la actividad de la enzima viral indicando distintas diferencias entre las enzimas fosfolipasa A2 viral y celular. Podría conseguirse una destrucción casi total de la actividad enzimática solamente modificando la histidina 153 por alanina. Se puede llegar a la conclusión de que este resto aminoacídico es parte del centro activo y es más importante para la actividad enzimática de la región única de VP1. Su modificación está asociada con la destrucción completa de la actividad viral de tipo fosfolipasa A2.

TABLA 1 Enfermedades autoinmunes que se describen en asociación con la infección por el parvovirus B19

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TABLA 2 Actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 en la región única de VP1 del parvovirus B19 y variantes construidas por mutagénesis dirigida

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Ejemplo 2 Estudio de Comparación para la Inmunogenicidad entre proteínas VP1 de tipo silvestre y mutante

Inoculación de ratones. Se inocularon grupos de 5 ratones hembra Balc/C con 50 \mug de preparaciones purificadas de la región única de VP1/de tipo silvestre y la región única de VP1/H153A en emulsión con adyuvantes de Freund completos. Se extrajeron muestras sanguíneas retrobulbares los días 0, 3, 7, 10, 14, 18 y 28 después de la inoculación. Los sueros se ensayaron para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra la región única de VP1/de tipo silvestre en ensayos ELISA.

Producción de proteínas. Se clonaron las secuencias que codifican la región única de VP1/de tipo silvestre y la región única de VP1/H153A en el vector de expresión T7 pET21a_int en fusión con una interna y un dominio de unión a quitina como se ha descrito anteriormente (Dorsch y col., 2001, Dorsch y col., 2002). Las construcciones se introdujeron en la cepa de E. coli BL21. Las bacterias se inocularon con medio CL (caldo de Luria) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se incubaron a 37ºC. Se indujo la expresión de la proteína recombinante añadiendo IPTG 1 mM durante al menos 3 h de cultivo. Las bacterias se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 30 ml de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH a 8,5 y se lisaron usando una Prensa de French. El residuo se sedimentó a 10000 g. El sobrenadante se cargó en una columna de quitina (NEB) usando el sistema FPLC, (cromatografía líquida de proteína rápida) (Pharmacia Biosystems, Freiburg). La columna se lavó con 2 volúmenes de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5, 8 volúmenes de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2 mM, pH 8,5 y 2 volúmenes de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM NaCl 100 mM, pH 8,5. Después de esto la proteína se eluyó usando 3 volúmenes de DTT 50 mM en tampón HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5. Las fracciones se ensayaron para determinar las proteínas recombinantes mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida - Dodecil sulfato sódico) y tinción con plata. Las fracciones positivas se unificaron y se concentraron usando un concentrador Centriplus (volumen de exclusión 3 kD; Amicon, Beverly, USA). La concentración de la proteína se determinó después de diálisis frente a PBS (KH_{2}PO_{4} 0,9 mM, Na_{2}HPO_{2} 0,8 mM X12H_{2}O; KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM) usando un ensayo Bradford (Bio Rad Laboratories, Hercules, USA).

Ensayo ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación (Maxisorb, Nunc, Wiesbaden, FRG) durante una noche con proteína purificada (región única de VP1/de tipo silvestre, 10 ng/pocillo) en tampón NaCO_{3} 0,2 M, pH 9,2 que contenía NaCl 0,15 M. Los sueros se usaron en diluciones de 1:100 en PBS/Tween-20 al 0,5% y se detectaron anticuerpos IgG usando IgG de conejo anti-ratón policlonal acoplado a HRP como anticuerpos secundarios (dilución 1:5000 en PBS/Tween-20 al 0,5%, da Dako, Hamburg FRG) y TMB como sustrato, la densidad óptica se determinó a 450 nm.

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Resultados

Comenzando desde el día 7 después de la inoculación los anticuerpos IgG dirigidos contra la región única de VP1/de tipo silvestre eran detectables en ratones que se habían inoculado con las dos preparaciones purificadas de la región única de VP1/de tipo silvestre y la región única de VP1/H153A (Figura 1). Las cantidades de anticuerpos aumentaron de manera continua hasta el día 28 después de la inoculación. No pudieron observarse diferencias en la reactividad de los ratones inoculados con la región única de VP1/de tipo silvestre o la región única de VP1/H153A. Estos resultados indican que las dos proteínas son muy antigénicas. Los anticuerpos inducidos contra la variante de la región única de VP1/H153A tienen la capacidad de unirse a la región única de VP1/de tipo silvestre que se había usado como antígeno en el ELISA indicando un elevado grado de reactividad cruzada. Los ratones que se inocularon con PBS en emulsión con adyuvantes completos de Freund no desarrollaron ninguna cantidad significativa de anticuerpos específicos contra VP1.

Se inoculó en ratones el antígeno de la región única de VP1/de tipo silvestre y el antígeno mutante (His153Ala). La producción de anticuerpos específicos contra VP1 se analizó mediante ELISA. No se observaron diferencias en cuanto a la capacidad de los dos antígenos para provocar la producción de anticuerpos específicos contra VP1. Los anticuerpos contra el antígeno mutante His153Ala eran similarmente activos para unirse a la región única de VP1 de tipo silvestre y viceversa. Esto indica que la variante mutante His153Ala de la región única de VP1 del parvovirus B19 tiene una capacidad comparable para provocar la producción de anticuerpos a la del dominio de la proteína de tipo silvestre. Puesto que se sabe que los principales epítopes neutralizantes se localizan en diferentes partes de la proteína del centro activo de la enzima de tipo fosfolipasa A2 viral y cuando no se ven afectados por ninguna de las mutaciones introducidas, los efectos sobre la inmunogenicidad de las proteínas son poco probables (57).

La combinación de las dos estrategias - la producción de cápsides de VP1/VP2 en S. cerevisiae recombinante y la destrucción de la actividad de tipo fosfolipasa A2- tiene el potencial para producir una vacuna que permita la prevención de la infección por el parvovirus B19 sin un número de efectos secundarios reducidos debido a la producción elevada de leucotrieno y prostaglandina y sin potencial peligroso para inducir reacciones autoinmunes que pueden derivar en enfermedades reumáticas de larga duración.

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Leyenda

Figura 1. El desarrollo de anticuerpos IgG contra la región única de VP1/de tipo silvestre. Se inocularon grupos de 5 ratones con la región única de VP1/de tipo silvestre, la región única de VP1/H153A o PBS. Las muestras de suero extraídas los días que se indican después de la inoculación se ensayaron en ELISA usando como antígeno la región única de VP1. En cada caso se determinaron los valores promedio obtenidos del ensayo de muestras individuales de 5 ratones.

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<110> AG inter celular

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<120> Parvovirus

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<130> r49100

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<140> EP05799042.6

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<141> 23-09-2005

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<150> EP04450180.7

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<151> 24-09-2004

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<160> 4

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<170> Patent In version 3. 3

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<210> 1

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<211> 781

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<212> PRT

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<213> Parvovirus B19

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<400> 1

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5

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6

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7

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8

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<210> 2

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<211> 781

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<212> PRT

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<213> Parvovirus B19

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<400> 2

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9

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10

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11

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12

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<210> 3

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<211> 781

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<212> PRT

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<213> Parvovirus B19

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<400> 3

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13

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14

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15

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<210> 4

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> adyuvante

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<400> 4

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16

Claims

1. Proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19 que tiene una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre del parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Sec ID Nº: 1, en la que uno o más de los restos aminoacídicos conservados en el centro activo de la fosfolipasa A2 se modifican en la posición 153: histidina; en la posición 157: tirosina; en la posición 162: lisina; y/o en la posición 168: tirosina.

2. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la histidina 153 se modifica a alanina.

3. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la tirosina 157 se modifica a fenilalanina.

4. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la lisina 162 se modifica a leucina.

5. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la tirosina 168 se modifica a fenilalanina.

6. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la sustitución de los restos aminoacídicos se realiza por mutagénesis dirigida.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 caracterizado porque adicionalmente comprende una proteína capsidial VP2 del parvovirus B19.

10. Un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína capsidial VP1 modificada se fusiona con la proteína capsidial VP2.

11. Una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 que es E. coli, una levadura, preferentemente Saccharomyces cerevisiae o células animales.

13. Un procedimiento de producción de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 10, usando la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la proteína capsidial VP1 modificada y/o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 están aislados y/o purificados.

15. La proteína capsidial VP1 modificada o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 que pueden obtenerse usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

16. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 15, o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 para su uso como medicamentos.

17. El uso de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 y 16, con o sin proteína capsidial VP2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra una infección por parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas al parvovirus B19.

18. El uso del producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y de la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra una infección por el parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas al parvovirus B19.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado por que el tratamiento es contra artralgias; artritis; más preferentemente monoartritis, oligoartritis, poliartritis, artritis reumatoide y/o artritis idiopática juvenil; lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis, más preferentemente vasculitis leucocitoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome papulopurpúrico en guantes y calcetines (SPPGC), enfermedad de Kawasaki, arteritis de células gigantes (ACG), poliarteritis nodosa y/o granulomatosis de Wegener; dermatomiositis; neutropenia autoinmune; trombocitopenia autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica autoinmune; y/o síndrome hemofagocítico asociado a un virus (SHAV).

20. El uso de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 y 16 o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial de VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

21. El uso de las células huésped de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12 en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

22. Partículas recombinantes similares a un virus constituidas por la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó 15 a 16 con o sin proteína capsidial VP2.

23. Partículas recombinantes similares a un virus constituidas por el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16.

24. El uso de las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la infección por parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas al parvovirus B19.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 caracterizado porque el tratamiento es contra tratamiento es contra artralgias; artritis; más preferentemente monoartritis, oligoartritis, poliartritis, artritis reumatoide y/o artritis idiopática juvenil; lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis, más preferentemente vasculitis leucocitoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome papular purpúrico en guantes y calcetines (SPPGC), enfermedad de Kawasaki, arteritis de células gigantes (ACG), poliarteritis nodosa y/o granulomatosis de Wegener; dermatomiositis; neutropenia autoinmune; trombocitopenia autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica autoinmune; y/o síndrome hemofagocítico asociado a virus (SHAV).

26. El uso de las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

27. Una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 y 16, con o sin la proteína capsidial VP2.

28. Una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16.

29. Una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23.

30. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, que comprende adicionalmente uno o más transportadores y/o adyuvantes adecuados para los propósitos de vacunación.

31. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, que comprende adicionalmente una sustancia inmunoestimuladora, seleccionada preferentemente del grupo que comprende polímeros policatiónicos, especialmente polipéptidos policatiónicos, desoxinucleótidos inmunoestimuladores (ODN); péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys; compuestos neuroactivos, especialmente una hormona de crecimiento humana; alumbre, adyuvantes completos o incompletos de Freund o combinaciones de estos.

32. Un kit de diagnóstico que comprende:

i): una proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 ó 16 y

ii): reactivos complementarios.

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33. Un kit de diagnóstico que comprende:

i): un producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, y

ii): reactivos complementarios.

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34. Un kit de diagnóstico que comprende:

i): partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 y

ii): Reactivos complementarios.

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35. Una proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 ó 16 con o sin proteína capsidial VP2 como un agente para modificar la actividad de una actividad de la fosfolipasa A2 huésped.

36. Un producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 como un agente para modificar la actividad de una actividad de la fosfolipasa A2 huésped.

37. Partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 como un agente para modificar la actividad de una actividad de la fosfolipasa A2 huésped.