DE60124523T2

DE60124523T2 - Zusammensetzung einer Parvovirus VP1-Proteinvariante und eines arvovirus NS1-Proteins zur Induktion von Zytolyse

Info

Publication number: DE60124523T2
Application number: DE60124523T
Authority: DE
Inventors: Laurent Daeffler; Jürg Nüesch; Jean Rommelaere
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2021-07-11
Also published as: US8450289B2; ATE345352T1; EP1275658B1; AU2002336926A1; WO2003006067A2; WO2003006067A3; EP1275658A1; DE60124523D1; US20040208886A1; US20100029751A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine zytotoxische pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend DNA Sequenzen, wobei die DNA Sequenzen (a) ein Parvovirus NS1 Protein und ein Parvovirus VP1 Protein oder (b) ein Parvovirus NS1 Protein, ein Parvovirus NS2 Protein und ein Parvovirus. VP1 Protein kodieren. Die Zusammensetzung der Erfindung ist als Toxin zur Behandlung von Tumorerkrankungen von Nutzen.
Parvovirus bezeichnet eine Gattung der Parvoviridae Virusfamilie. Die Parvovirus-Gattung umfasst eine Anzahl von kleinen, ikosahedrischen Viren, die sich ohne ein Helfervirus replizieren können. Das Parvovirus enthält eine einzelsträngige DNA mit einer Länge von etwa 5,000 bp. An den 3' und 5' Enden der DNA gibt es jeweils eine palindromische Sequenz. Die DNA kodiert für zwei Kapsidproteine, VP1 und VP2, sowie für zwei regulatorische Nichtstrukturproteine, NS1- und NS-2. Letztere Proteine sind phosphoryliert und zeigen eine nukleäre bzw. sowohl zytoplasmatische als auch nukleäre Lokalisation. Die beiden Kapsidproteine VP1 und VP2 werden durch überlappende offene Leserahmen kodiert, so dass die VP2 kodierende Region vollständig von der VP1 kodierenden Region umfasst ist. Bei einer natürlichen Infektion werden Kapsidproteine aufgrund von alternativem Splicing in einem VP1:VP2 Verhältnis von 1:10 exprimiert. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass die Region der Kapsidproteine, die für VP1 (N-terminale Region) spezifisch ist, Motive enthält, die für die zelluläre Phospholipase A üblich sind, und tatsächlich diese Wirkung in vitro ausübt. Das kalziumabhängige, sekretierte PLA₂, mit dem das Parvovirus VP1 Ähnlichkeit hat, ist an den Signalwegen beteiligt, die über die Permeabilisierungsmembranen die Zelllyse verursachen. Demgegenüber ist gezeigt worden, dass NS1 durch Mitglieder der Proteinkinase C Familie reguliert wird, die wiederum einer Regulation durch Phospholipasen unterliegen.
Parvoviren werden üblicherweise von Populationen ihres natürlichen Wirts gut toleriert, in denen sie ohne augenscheinliche pathologische Zeichen fortbestehen. Dies liegt sowohl am Schutz von Föten und Neugeborenen durch die mütterliche Immunität als auch an der bemerkenswerten Beschränkung einer Parvovirus-Replikation auf einen begrenzten Bereich von proliferierenden Zielgeweben bei erwachsenen Tieren. Diese Wirtstoleranz betrifft besonders Nagetierparvoviren, zum Beispiel den Minute Virus of Mice (MVM) und H-1 Virus in ihren jeweiligen natürlichen Wirten, nämlich Mäusen und Ratten. Darüber hinaus können Menschen mit den letzteren Viren infiziert sein, ohne dass es ein Anzeichen für damit verbundene, schädliche Wirkungen aus bestehenden epidemiologischen Untersuchungen und klinischen Versuchen gibt. Demgegenüber ist gezeigt worden, dass sich autonome Parvoviren vorzugsweise in neoplastisch transformierten Zellen verbreiten und diese töten. Außerdem bestehen sie aus einer Virenklasse, die trotz der Tatsache, dass sie in ihren infizierten Wirten eine Virämie hervorrufen, meist eine apathogene Infektion erzeugen. Aus diesen Gründen sollen autonome Parvoviren ausgezeichnete Werkzeuge für die Krebsgentherapie sein. Besonderes Interesse gilt den rekombinanten Vektoren, die ihren natürlichen Onkotropismus sowie ihr onkolytisches und onkosuppressives Potential beibehalten.
NS1, das bedeutendste Nichtstrukturprotein, ist für die virale DNA Replikation notwendig und nimmt an der Regulation der viralen Genexpression teil. Insbesondere transaktiviert NS1 den Promotor P38 und besitzt DNA Bindung, Helikase und DNA-Nicking Aktivitäten. Weiterhin induziert NS1 einen zytotoxischen und/oder zytostatischen Stress in sensiblen Wirtszellen.
Daher erscheint es ratsam, NS1 in Parvovirusvektoren zu halten, um (a) ihre spezifische Kompetenz für eine NS1-abhängige DNA Replikation und Genexpression in Tumorzellen aufrechtzuerhalten, was zu einer verstärkten Produktion von therapeutischen Mitteln am gewünschten Ort (Onkotropismus) führt, (b) den Vorteil der NS1 Zytotoxizität auszunutzen, um neoplastische Zellen zu töten, und Tumorantigene zu verbreiten, um eine Antikrebsimmunität (Onkolyse) auszulösen, und (c) noch unbekannte Effekte zu erzielen, die zum Weiterbestehen (Speichern) eines tumorfreien Status (Onkosuppression) beitragen können.
Die gegenwärtigen Parvovirusvektoren nehmen (aus den oben erörterten Gründen) die Wildtyp Gene und einen aus einer Vielfalt von unterschiedlichen Transgenen auf, die Antitumorreaktionen hervorzurufen sollen. Bei den meisten, bis jetzt berücksichtigten Anwendungen wurden die Transgene wegen ihrer Fähigkeit gewählt, die zelluläre Immunität des Wirts gegen den Krebs hochzufahren. Obwohl die durch solche Vektoren hervorgerufenen Transgenexpression erfolgreich auf den Tumorort gerichtet wurde und besonders hoch war, war die Dauer der Therapie relativ kurz, d.h. drei bis fünf Tage, was wahrscheinlich an dem mittels NS1 induzierten Töten von transduzierten Zellen liegt. Neue Entwicklungen, die die Regulation des NS1 Proteins betreffen, haben gezeigt, dass die Zytotoxizität dieses Proteins ein regulierter Prozess ist. Weiterhin werden NS1 Varianten durch die ortsgerichtete Mutagenese von mutmaßlichen regulatorischen Elementen erzeugt, die im Hinblick auf ihr zytotoxisches Potential hoch- und runtergefahren bzw. -moduliert werden, während replikative Funktionen beibehalten werden (europäische Patentanmeldung Nr. 99115161.4). Diese Varian ten können eine verlängerte Expression von Transgenen, die von Parvovirusvektoren (weniger toxische Varianten) beherbergt werden, ermöglichen oder statten infektiöse Parvoviren mit einer erhöhten Onkotoxizität aus (toxischere Varianten).
Unter Berücksichtigung auf die Verwendung von NS1 als Onkotoxin zusammen mit parvoviralen aber auch nicht parvoviralen Vektoren ist festzustellen, dass NS1 allein, obwohl es die Apoptose bei bestimmten Krebszellen (Leukämien) induzieren kann, oft nur eine zytostatische Wirkung hat, die mit morphologischen Änderungen (Zellschrumpfung) und einer drastischen Störung des Zytoskeletts in Abwesenheit einer Zelllyse oder von apoptotischen Zeichen einhergeht. NS1-exprimierende Zellen bleiben über einen langen Zeitraum in diesem Zustand, der daher gemeinsame Merkmale mit einer abschließenden Differenzierung aufweist. Diese NS1-vermittelte Induktion eines zellulären abschließenden Zustands ist wegen einer beschränkten Tumorzellproliferation als solches interessant, dennoch ist sie nicht geeignet, die Aufnahme von tumorassoziierten Antigenen (TAAs) durch Präsentieren von Immunsystemzellen auszulösen, was den Tumorzelltod bedingt. Dies ist eine sehr gravierende Beschränkung der Verwendung von NS1 als solchem: Da nur ein kleiner Teil der Tumorzellen erwartungsgemäß getötet wird, ist es wichtig, dass die direkte Toxizität des Vektors (die nur transduzierte Zellen beeinträchtigt) durch das Immunsystem verstärkt wird, um eine begleitende unterdrückende Wirkung auf nicht infizierte Tumorzellen zu erzielen.
Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Verbesserung der therapeutischen Nützlichkeit von NS1 vorzusehen, z.B. im Hinblick auf die NS1 Zytotoxizität, um neoplastische Zellen zu töten und Tumorantigene zu verbreiten und so eine Antikrebsimmunität auszulösen.
Gemäß der Erfindung wird dies durch die Gegenstände der Ansprüche erzielt.
Die vorliegende Erfindung beruht darauf, dass die Anmelderin ein neues Toxin aufgefunden hat, bei dem es sich um eine Kombination aus zwei Parvovirusprodukte kodierenden Vektoren, NS1 Protein und Kapsid VP1 Protein oder einem Teil davon handelt. Da VP1 ein großes Protein ist (83 kDa, 2453 bp ORF), das selbst einer Regulation unterliegt (es wird posttranslational modifiziert), wurden kleine Fusionsproteine konstruiert, die eine VP1-spezifische Region enthalten, und zusammen mit dem Effektorprotein NS1 nach einer Transfektion in Säugetierzellen exprimiert. Während sie von den Zellen für sich allein gut toleriert werden, erhöhten die Fusionsproteine die intrinsische Zytotoxizität von NS1 signifikant, wie durch das Verschwinden von VP1/NS1 enthaltenden Zellen in einer Zeitfunktion gemessen (durch in transfizierten Zellen vorhandene Fluoreszenzproteine überwacht; siehe 1). Diese erhöhte Toxizität zeigt sich anhand einer Zytolyseinduktion, wie sie durch die Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH) sowohl bei Vorhandensein von Wildtyp NSI als auch von VPI spezifischer Region offenkundig ist, ein Merkmal, das bei der alleinigen Expression von Wildtyp NSI fehlt (4). In dieser Hinsicht ist festzustellen, dass die toxischen Wirkungen von NSI und VPI derart wechselseitig sein könnten, dass nicht nur VPI eine steigende NSI Toxizität hat, sondern auch dass NSI in der Lage ist, die VPI induzierte Zytolyse zu aktivieren. Als Schlussfolgerung hat dieses neue Toxin die Fähigkeit, einen Zelltod und nicht nur einfach einen Zellproliferationsstopp zu bewirken. In dem analysierten zellulären System hatte das NS1-VP1 Toxin, wie sich zeigte, eine erhöhte lytische Aktivität. Daher erhält das tumoral exprimierte NS1-VP1 Toxin eine stärkere Fähigkeit zum Töten von Tumorzellen, was wiederum die Beladung von präsentierenden Zellen mit TAAs und die Aktivierung einer Antikrebsimmunreaktion stimulieren sollte.
Die vorliegende Erfindung stellt eine zytotoxische pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die DNA Sequenzen umfasst, wobei die DNA Sequenzen (a) ein Parvovirus NS1 Protein und ein Parvovirus VP1 Protein oder (b) ein Parvovirus NS1 Protein, ein Parvovirus NS2 Protein und ein Parvovirus VP1 Protein kodieren.
Der Ausdruck „Parvovirus" umfasst jeden Parvovirus, insbesondere einen Nagetier-Parvovirus, wie beispielsweise Minute Virus of Mice (MVM) und ein H-1 Virus.
Die Expression „NS1 Protein" umfasst jedes NS1 Protein, d.h. das native Protein, das von den oben beschriebenen Parvoviren erhältlich ist, sowie modifizierte Versionen davon, die biologisch aktiv sind (siehe z.B. Genebank Hinterlegungsnummer PO3134; Astell u.a., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 999-1018). Solche modifizierten Versionen des NS1 Proteins umfassen auch die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 99115161.4 offenbarten Mutanten.
Der Ausdruck „VP1 Protein" umfasst jedes VP1 Protein, d.h. das native Protein, das von den oben beschriebenen Parvoviren erhältlich ist, sowie modifizierte Versionen und Fusionsproteine, die noch immer biologisch aktiv sind (siehe z.B. Genebank Hinterlegungsnummer PO3137; Astell u.a., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 999-1018). Beispiele für modifizierte Versionen sind verkürzte und mutante Formen des VP1 Proteins.
Der Ausdruck „ein Parvovirus NS1 Protein und ein Parvovirus VP1 Protein" umfasst auch NS1-VP1 Fusionsproteine. Die NS1-VP1 Fusionsproteine umfassen jedes NS1-VP1 Fusionsprotein, das die biologische Wirkung von beiden Proteinpartnern zeigt. Vorzugsweise entspricht das NS1 Protein dem N-terminalen Partner des Fusionsproteins. DNA Sequenzen, die solche Proteine kodieren, können vom Fachmann durch bekannte Verfahren konstruiert werden. Der Fachmann kann auch DNA Sequenzen konstruieren, die ein Fusionsprotein kodieren, wobei das NS1 bzw. VP1 Protein verkürzt aber noch aktiv ist/sind.
Assays zum Überwachen der biologischen Proteinaktivitäten (VP1; PLA₂ Aktivität) sind dem Fachmann bekannt und können wie die Messungen der Arachidonsäurefreisetzung (Balsinde u.a., PNAS USA 95 (1998), 7951-7956) oder die Herstellung von Prostaglandin E2 (Newton u.a., 1998, IBC 48, 32312-21) oder wie im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das VP1 Protein mit einem Trägerprotein fusioniert, was es z.B. ermöglicht, die Expression des VP1 Proteins in einer Wirtszelle festzustellen. Besonders bevorzugt sind die Trägerproteine grün fluoreszierendes Protein (GFP), NS1, IL-2, IP10, Cytatine, Cro oder Signalpeptide, die das Protein auf ausgeprägte Stellen in der Zelle richten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das VP1 Protein (oder der VP1 Partner des Fusionsproteins) ein verkürztes Protein, das noch die gewünschte biologische Aktivität zeigt. Solche verkürzten Versionen des VP1 Proteins können vom Fachmann gemäß Standardverfahren hergestellt werden. Die biologische Aktivität der VP1 Fragmente kann zum Beispiel durch das im nachfolgenden Beispiel 2 beschriebene Verfahren untersucht werden.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst das verkürzte VP1 Protein die VP1 Domäne, die die Phospholipase A Aktivität aufweist. Diese Aktivität ist im spezifischen N-terminalen Teil des VP1 Proteins lokalisiert (Reste 1 bis 142) (siehe 2; Zadori u.a. (2000), VIII. Parvovirus-Arbeitstagung Mont Tremblant, Quebec, Kanada).
Eine DNA Sequenz, die von der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst ist, kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorhanden sein. Ein Fachmann kennt Beispiele dafür. Im Fall eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC Derivate, pGEX-2, pET3b, T7-bezogene Expressionsvektoren und pQE-8: Für die Expression in Hefe sind zum Beispiel pY100 und Ycpad1 zu erwähnen, während für die Expression in Tierzellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8, pMSCND und pCEV4 zu nennen sind. Der Baculovirus Expressionsvektor pAcSGHisNT-A ist besonders für die Expression in Insektenzellen geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor, der die DNA Sequenz(en) gemäß der Erfindung enthält, ein Virus, z.B. ein Adenovirus, Vaccinia Virus, ein AAV Virus oder ein Parvovirus, wie beispielsweise MVM oder H-1, wobei ein Parvovirus bevorzugt ist. Der Vektor kann auch ein Retrovirus, wie beispielsweise MoMULV, MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV, sein. Geeignete Promotoren umfassen den starken konstitutiven humanen oder Maus Cytomegalovirus (CMV) immediate early Promotor, den induzierbaren P38 Parvoviruspromotor, den Parvovirus P4 Promotor und die gewebe- und tumorspezifischen Promotoren.
Zum Konstruieren von Expressionsvektoren, die die DNA Sequenz(en) gemäß der Erfindung enthalten, ist es möglich, allgemeine Verfahren zu verwenden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese Verfahren umfassen z.B. die in vitro Rekombinationsverfahren, synthetische Methoden und in vivo Rekombinationsverfahren, wie beispielsweise in Sambrook u.a., oben beschrieben. Diese Vektoren können in geeigneten Wirtszellen verbreitet werden.
Diese Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugetierzellen. Die E. coli Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 XLiBlue und SG13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die Tierzellen L, A9, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa und die Insektenzellen sf9 sind bevorzugt. Verfahren zum Transformieren dieser Wirtszellen, zum phänotypischen Auswählen von Transformanten und zum Exprimieren der DNA gemäß der Erfindung mittels der oben beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann durch Kultivieren der oben beschriebenen Transformante unter geeigneten Bedingungen und durch Isolieren des/der Proteins/e der Zusammensetzung von der Transformante oder dem Medium erzeugt werden. Verfahren zum Kultivieren der Transformanten, Isolieren und Reinigen des/der Proteins/e sind dem Fachmann bekannt.
Darüber hinaus umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung vorzugsweise geeignete pharmazeutische Träger. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmitteln, sterile Lösungen usw. Solche Träger können mit herkömmlichen Verfahren formuliert werden und können der Person in einer geeigneten Dosis verabreicht werden.
Obwohl dies nicht Teil des beanspruchten Gegenstands ist, setzt die vorliegende Erfindung voraus, dass die Verabreichung der Zusammensetzung auf unterschiedliche Weisen bewirkt werden kann, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Der Verabreichungsweg hängt natürlich vom Wesen der Erkrankung, z.B. Tumor, und der Art der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Verbindung(en) ab. Der Dosierungsplan wird vom behandelnden Art und anderen klinischen Faktoren festgelegt. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt ist, hängt die Dosierung für jeden Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe, Körperoberfläche, dem Alter und Geschlecht des Patienten, der bestimmten zu verabreichenden Verbindung, der Verabreichungszeit und dem Verabreichungsweg, der Tumorart, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen gleichzeitig zu verabreichenden Medikamenten. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in Form von (einem) genetischen Element(en), das/die die Parvovirusproteine kodiert/en, verabreicht. Geeignete Vektoren und Verfahren zur in vitro oder in vivo Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann bekannt; siehe z.B. WO 94/29469 oder WO 97/00957. Die DNA Sequenzen, die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst sind, können der Zielstelle direkt, z.B. durch ballistische Abgabe, als kolloidales Dispersionssystem oder mittels Katheter an eine Stelle in der Arterie, verabreicht werden. Die kolloidalen Dispersionssysteme, die zur Abgabe der obigen DNA Sequenzen verwendet werden können, umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Perlen und lipidbezogene Systeme, einschließlich Öl/Wasser-Emulsionen, (gemischte) Mizellen, Liposome und Lipoplexe. Das bevorzugte kolloidale System ist ein Liposom. Die Zusammensetzung des Liposoms ist gewöhnlich eine Kombination aus Phospholipiden und Steroiden, insbesondere Cholesterin. Der Fachmann ist in der Lage, solche Liposome auszuwählen, die für die Abgabe des gewünschten DNA Moleküls geeignet sind. Organspezifische oder zellspezifische Liposome können z.B. verwendet werden, um die Abgabe nur an das gewünschte Gewebe zu erzielen. Das Targeting von Liposomen kann vom Fachmann durch Anwenden von allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden. Dieses Targeting umfasst das passive Targeting (Anwenden der natürlichen Tendenz der Liposome, sich auf die RES-Zellen in Organen zu verteilen, die sinusoi dale Kapillaren enthalten) oder das aktive Targeting (zum Beispiel durch Koppeln des Liposoms an einen spezifischen Ligand, z.B. einen Antikörper, einen Rezeptor, Zucker, Glycolipid, Protein usw. mit bekannten Verfahren). In der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise monoklonale Antikörper verwendet, um Liposome über spezielle Zelloberflächenliganden auf spezielle Tumoren zu richten.
Obwohl die in vivo Behandlung des Tier- und Menschenkörpers vom Umfang der Erfindung ausgeschlossen ist, setzt die Erfindung voraus, dass Zellkulturen oder Organismen, z.B. tumortragende Organismen, behandelt werden können. Sollten die DNAs in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als separate genetische Elemente verabreicht werden, können Zeitintervalle zwischen ihren jeweiligen Verabreichungen angewendet werden. Alternativ können stabil transfizierte Zelllinien, die das VP1 Protein exprimieren, erzeugt werden. In Abwesenheit von NS1 wird die VP1 Komponente von Wirtszellen über längere Zeiträume gut toleriert. Die zytolytische Wirkung wird nur ausgeübt, wenn die VP1 Komponente gleichzeitig mit der NS1 Komponente exprimiert wird. Es ist daher möglich, Tumorzelllinien auszuwählen, die stabil die VP1 Komponente exprimieren und einen induzierbaren Klon der NSI Komponente enthalten (oder auch nicht), welcher ruhig gehalten wird. Nach der NS1 Expression (als Ergebnis von NS1 Gentransfer oder Induktion) werden die Tumorzellen lysiert, was in vitro oder in vivo erreicht werden kann (nach der Transplantation von VP1 exprimierenden Zellen), um die Freisetzung, Aufnahme und Präsentation von tumorassoziierten Antigenen auszulösen. Darüber hinaus können die Zusammensetzung der Erfindung oder die entsprechenden DNA Sequenzen in Kombination mit anderen Agenzien (wie beispielsweise Zytokinen) in Gen- und Krebstherapieansätzen angewendet werden.
Schließlich ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Toxins zur Behandlung von Tumorerkrankungen von Nutzen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: A9 Zellen, die auf Objektträgern (NeoLab, Heidelberg, Deutschland) wachsen gelassen wurden, wurden mit den angegebenen Konstrukten (100 ng/Loch) mittels 1 μl Lipofektamin (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) transfiziert. Transfizierte- lebende Zellen wurden durch ihre grüne Fluoreszenz identifiziert und in täglichen Abständen mittels eines Umkehrwinkel-Fluoreszenzmikroskops (Leica IL2) überwacht.

(A) Aufnahmen von fluoreszierenden, transfizierten Zellen, erhalten nach 2, 4, 5 und 6 Tagen nach der Transfektion.
(B) Statistische Bewertung der NS1/VP1 Toxizität. Transfizierte, GFP exprimierende (fluoreszierende) Zellen wurden in täglichen Intervallen gezählt und ihr Überleben wurde als prozentualer Anteil der Zahl von fluoreszierenden Zellen am Tag 2 nach der Transfektion ausgedrückt. Schematische Darstellung der Effektorkonstrukte, die PLA₂ (die aktive Domäne des VP1 Polypeptids) und/oder NS1 Parvovirus MVM exprimieren. Beide Effektorgene werden unter der Kontrolle des parvoviralen P4 Promotors exprimiert. Um die Zellen, die die transfizierte DNA enthalten, zu überwachen, wurde das Gen für das grün fluoreszierende Protein mit der PLA₂ Domäne fusioniert. Die Phosphorylierungsstellenmutante NS1:S473A (Dettwiler u.a., J. Virol. 73 (1999), 7410-7420) wurde als repräsentative nicht toxische NS1 Mutante ausgewählt.

Mutantes PLA₂ wurde mittels PCR erzeugt, die das HD-Motiv ersetzt (aa 41/42), d.h. die aktive Stelle des PLA₂ Enzyms, und zwar durch Methioninreste. Der Toxizitätsassay wurde gemäß Corbau u.a., Virology 278 (2000), 151-167 durchgeführt.
Wie in (A) und (B) gezeigt, hatten Wildtyp NS1 und die PLA₂ Domäne von VP1 eine synergistische Wirkung, insofern als die Zytotoxizität von gleichzeitig exprimierten aktiven Polypeptiden mit der Wirkung jedes Effektorproteins allein verglichen wurde, wie durch das Verschwinden der fluoreszierenden/transfizierten Zellen gezeigt.
2: Schematische Darstellung der Parvovirus VP Proteine

(A) VP1, das große 83 kDa Kapsidprotein umfasst 716 Aminosäuren, während dem VP2 die 142 N-terminalen Aminosäuren fehlen und es aufgrund eines alternativen Splicings der Vorläufer mRNAs bei Methionin 143 beginnt. Die einzige VP1 Region wird als schraffiertes Rechteck dargestellt.
(B) Vergrößern der VP1-spezifischen Region, das die Aminosäuren 1 bis 142 des VP1 Proteins umfasst. Die vier Motive, die Homologie zu den zellulären PLA₂s zeigen, sind als gekreuzte Regionen angegeben und die entsprechenden Aminosäuresequenzen von VP1 sind am Boden angegeben. Die mutmaßliche aktive Stelle für die PLA₂ Aktivität wird in Großbuchstaben angegeben.

3: Schematische Darstellung von Beispielen der VP1 und VP1 Varianten, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden

(A) VP1 Deletionsmutanten verschiedener Größen
(B) VP1 Fusionspeptide, die „Träger"-Polypeptide verwenden Beispiele für Kassetten für die Expression von VP1 Varianten, um synergistische Wirkungen zusammen mit NS1 zu erhalten

4 Das Experiment umfasst die Verwendung des Promega-Kit „CytoTox 96^®" nicht radioaktiven Zytotoxizitätsassay (Promega, Mannheim, Deutschland). LDH ist ein zytosolisches Enzym, das nach Zelllyse freigesetzt wird. Das freigesetzte LDH wird mittels eines enzymatischen Assays gemessen, der zur Umwandlung eines Tetrazoliumsalzes (INT) in ein rotes Formazanprodukt führt. Die Farbintensität, gemessen mit einem standardmäßigen 96er Plattenleser bei 490 nm ist proportional zur Zahl der lysierten Zellen. Es wurden Experimente in 96er Platten durchgeführt, die 2000 Maus A9 Zellen pro Loch enthielten. Eine Infektion wurde 24 Stunden nach dem Verbreiten der Zellen in einer Vielzahl von 10 infektiösen Viruseinheiten pro Zelle durchgeführt. Das Kulturmedium wurde 6 Tage nach der Transfektion gesammelt und direkt auf LDH Aktivität getestet, wie vom Hersteller beschrieben. Die Gesamtmenge an LDH in den Zellen steht für 100 %.

(B) Schematische Darstellung von VP1 Konstrukten, die für den LDH Assay verwendet werden. Ihre Konstruktion ist im Beispiel 1C ausführlich beschrieben.

Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Konstruktion von Vektoren zur Expression von VP1 Varianten
(a) pP4-VP1-GFP
Die kodierende Sequenz für das VP1-GFP Fusionsprotein wurde durch chimäre Polymerasekettenreaktion (PCR) mittels des Primer paars 5'-ATG ACT CCA TGG CGC CTC CAG CTA AAA AGA-3' (A) und 5'-TCG CCC TTG CTC ACC ATC GTT TGA CTC CTT TGC TG-3' (B) unter Verwendung von pTM1-VP als Matrize erhalten, um die Kodierungssequenz für die VP1-spezifische Domäne der Parvovirus VP-Proteine zu erzielen. Das Primerpaar 5'-AGG AGT CAA ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3' (C) und 5'-ACG GTC TCG AGT AGC GAC CGG CGC TCA GTT GG-3' (D) mit pEGFP (Clontech, Heidelberg, Deutschland) als Matrize wurde verwendet, um die GFP kodierende Sequenz zu erhalten. In einer zweiten PCR Reaktion wurden die VP1- und GFP-Fragmente aufgrund von überlappenden Sequenzen aneliert und weiter mittels der Primer A und D amplifiziert. Nach der Amplifikation wurde das PCR Produkt mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und XbaI verdaut und in den auf ähnliche Weise gespaltenen Vektor pDB-MVMp ligiert; siehe 1C. pDB-MVMp bildet einen infektiösen molekularen MVMp-Klon (Kestler u.a., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 1619-1632).
(b) pP4-NS1-VP1
Das Konstrukt bildet einen eukaryontischen Expressionsvektor unter der Kontrolle des Parvovirus P4 Promotors (S-Phasen/Transformations-reguliert). Die Kodierungssequenz für das NS1-VP1-Fusionsprotein wurde durch chimäre PCR mittels des Primerpaars 5'-GGT CAA TCT ATT CGC ATT GAT-3' (A) und 5'-GAG GCG CCA TGT CCA AGT TCA GCG GCT CGC-3' (B) für die Amplifikation der Matrize pTM1-NS1 Nüesch u.a., Virology 191 (1992), 406-416) erhalten, um das NS1 Fragment voller Länge zu erzielen. Es wurde das Primerpaar 5'-GAA CTT GGA CAT GGC GCC TCC AGC TAA AAG-3' (C) und 5'-ATA CGC CCG GGC TAG GTT TGA CTG CTT TGC TGT-3' (D) mit pTM1-VP1 als Matrize verwendet, um die VP1 Kodierungssequenz zu erhalten. In einer zweiten PCR Runde wurden die beiden Fragmente mittels der Primer A und D kombiniert. Nach der Amplifikation wurde das PCR Produkts mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und SmaI verdaut und in den mit XhoI und StuI verdauten Vektor pTHis-NS1 ligiert (Nüesch u.a., Virology 209 (1995), 122-135). Um pP4-NS1-VP1 zu erhalten, wurde die Kodierungssequenz der NS1-VP1 Variante mittels PCR unter Verwendung eines N-terminalen Primers, enthaltend eine SmaI Restriktionsstelle zusammen mit einem eine XbaI Spaltstelle enthaltenden C-terminalen Primer, amplifiziert. Dieses SmaI-bis-XbaI NS1-VP1 Fragment wurde dann in das mit EcoRV und XbaI gespaltene pP4-GFP überführt. Der Klon pP4-NS1-VP1 wurde am 15. Mai 2001 bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM 14300 nach den Verordnungen des Budapester Verlags hinterlegt.
(c) pP4-NS1+2-P4-VP1-GFP
Um pP4-NS1-P4-VPI-GFP zu erhalten, das für Transfektionsexperimente verwendet wird, wurde das PmeI-bis-XbaI Fragment von pP4-VPI-GFP (oder für die Kontrollen pP4-GFP, pP4-mPLA-GFP) in das mit StuI und XbaI gespaltene pDB-MVMp oder pDB-NS1:S473A übertragen (Corbau u.a., Virology 278 (2000), 151-167).
Um pP4-NS1+2-P4-VPI-GFP rekombinante MVM Virus zu erhalten, wurde das P4-VPI-GFP Fragment mittels eines Primers 5'-ATA CGA GAT CTG TTT AAA CCA AGG CGC GAA AAG G-3' in der P4 Promotorregion, enthaltend eine N-terminale GblII Spaltstelle und des Primers D im C-Terminus von GFP, welcher eine XbaI Stelle aufweist, amplifiziert. Dieses GglII-bis-XbaI Fragment wurde dann in die mit BglII und XbaI gespaltene Kapsidregion von pD-MVMp kloniert. Der Klon pP4-NS1+sPA-VPI-GFP wurde am 15. Mai 2001 bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM 14301 nach den Verordnungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
In ähnlicher Weise wurden die BglII/XbaI Fragmente von P4-GFP und P4-mPLA-GFP in den infektiösen DNA Klon von MVMp übertragen.
Beispiel 2: Toxizitätsassay

(a) A9 Zellen, die auf Objektträgern (Neolab) wachsen gelassen wurden, wurden mit den im obigen Beispiel 1 beschriebenen und in den 1C und 3 gezeigten Konstrukten transfiziert, die die GFP (Fusion-)Proteine mittels Lipofektamin exprimieren. Fluoreszierende Zellen wurden in täglichen Intervallen auf ihren Gesamtaufbau hin überwacht. Aus den in der 1B gezeigten Ergebnissen kann geschlossen werden, dass NS1 und VP1 Fusionsproteine synergistisch wirken, um die transfizierten A9 Zellen zu töten. Die Einzelheiten des Experiments sind in der Legende der 1 angegeben.
(b) A9 Zellen wurden mit verschiedenen mehreren rekombinanten Parvoviren transduziert, die VP1 Varianten oder Mutanten davon enthielten. In täglichen Intervallen wurde die Freisetzung von endogenem LDH (Lactatdehydrogenase) mittels herkömmlicher Kits gemessen, um Messungen für die Zytolyse zu erhalten. Die Einzelheiten des Experiments sind in der Legende der 4 angegeben.

Claims

Zytotoxische pharmazeutische Zusammensetzung umfassend DNA Sequenzen, wobei die DNA Sequenzen (a) ein Parvovirus NS1 Protein und ein Parvovirus VP1 Protein, oder (b) ein Parvovirus NS1 Protein, ein Parvovirus NS2 Protein und ein Parvovirus VP1 Protein kodieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 1(a), wobei das VP1 Protein mit einem Trägerprotein fusioniert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Trägerprotein grün-fluoreszierendes Protein (GFP) ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das VP1 Protein ein trunkiertes VP1 Protein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das trunkierte VP1 Protein die VP1 Domäne umfasst, die Phospholipase A Aktivität zeigt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die DNA Sequenzen in einen Expressionsvektor eingefügt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Expressionsvektor ein Parvovirus Vektor ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der Expressionsvektor pP4-NS1-VP1 (Hinterlegungsnummer DSM 14300) oder pP4-NS1+2-P4-VP1-GFP (Hinterlegungsnummer DSM 14301) ist.