DE60003632T2

DE60003632T2 - Verwendung von apoptose-induzierende mittel zur herstellung eines mittels zur behandlung von (auto)immunkrankheiten

Info

Publication number: DE60003632T2
Application number: DE60003632T
Authority: DE
Inventors: Hubertus Mathieu NOTEBORN; Maria Alexandra PIETERSEN
Original assignee: Leadd BV
Current assignee: Leadd BV
Priority date: 1999-01-11
Filing date: 2000-01-10
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2020-01-11
Also published as: WO2000041497A2; JP2003500336A; HUP0200552A2; DE60003632D1; EA200100770A1; PT1143994E; NO20013397L; ZA200105632B; TR200102713T2; ATE244014T1; IL144228A0; EP1143994B1; ES2202039T3; EP1143994A2; MXPA01006998A; AU3083500A; IL144228A; NO20013397D0; CA2359392A1; US20050271624A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Therapien, die auf Molekularbiologie beruhen. Die Erfindung betrifft des Weiteren die Diagnose des Risikos einer zukünftigen Erkrankung. Insbesondere betrifft die Erfindung das Gebiet der Behandlung und Risikodiagnose von (Auto)Immunerkrankungen und/oder entzündlichen Erkrankungen. Die Erfindung betrifft auch das Auslösen einer Apoptosis in bestimmten Zellen, die mit den (Auto)Immunerkrankungen verbunden sind oder in Zusammenhang stehen.
Autoimmunerkrankungen sind eine Gruppe schwerer Krankheiten, die durch entzündliche Erkrankungen gekennzeichnet sind, wie die Crohn'-Krankheit, die chronische Pankreatitis, einige Formen von Diabetes, Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis (Bischoff et al., 1996; Firestein, 1995, 1998; Liblau et al., 1995). Als einer der Hauptvertreter dieser Familie von Erkrankungen wird die rheumatoide Arthritis (RA) ausführlicher als repräsentativ für die Anwendungen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
RA befällt die Gelenke, aber auch andere Organe. Die Erkrankung betrifft weltweit 1 bis 2% der erwachsenen Bevölkerung. Frauen sind häufiger betroffen als Männer, in einem Geschlechtsverhältnis von 3 : 1. Das klinische Spektrum wie auch der Verlauf der Erkrankung sind sehr unterschiedlich. Bei einer schwachen Erkrankung kann die Gelenksentzündung für eine begrenzte Zeitperiode vorhanden sein und keine Gelenkszerstörung auftreten. Dieses Muster ist relativ selten. Die meisten Patienten haben ständig hohe oder unterschiedliche Stärken einer Erkrankungsaktivität. Dies ist mit schlimmeren Folgen der Erkrankung in Bezug auf eine Behinderung und Gelenkszerstörung verbunden (Van Zeben et al., 1994).
RA ist mit einem erhöhten Mortalitätsrisiko verbunden (Wolfe, 1990). Die Gelenkszerstörung beginnt bei RA früh. Die höchste Rate einer Erosionsbildung scheint während der ersten 2 Jahre nach dem Ausbruch der RA vorzuliegen. Vor kurzem wurde der Beweis erbracht, dass in den folgenden Jahren ein kontinuierliches Fortschreiten der Erosionen stattfindet (Sharp et al., 1991; Van der Heijde et al., 1992).
Die Ätiologie von RA bleibt ungelöst, obwohl die Pathophysiologie von RA ein dynamisches Forschungsgebiet ist (Breedveld, 1998). Ein einfaches Schema, das diese dramatische Erkrankung erklärt, ist, dass die Entzündung und Gelenkszerstörung durch das Einströmen von Lymphozyten in die Synovialis ausgelöst wird. Sie stimulieren Plasmazellen, Mastzellen, Makrophagen und insbesondere fibroblastartige Synoviozyten zur Erzeugung entzündlicher Mediatoren, wie Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha und Interleukin 1. Diese Mediatoren können Matrix abbauende Aktivitäten einleiten, die schließlich zu einer Gelenkszerstörung führen. Diese Aktivitäten umfassen die Aktivierung fibroblastartiger Synoviozyten zur Erzeugung von Collagenase, die Einleitung einer Knochen- und Knorpelresorption und die verstärkte Expression von Chemokinen und von Adhäsion- und HLA-Molekülen, die alle zu einer weiteren Stimulierung der Immunantwort oder zu einem weiteren Einströmen von Zellen in die Gelenkhöhle führen (Breedveld, 1998).
Vor kurzem wurden Daten vorgelegt, dass FLS bei RA irreversibel verändert sind und dass ein autonomer Prozess ihnen ermöglicht, selbst nach der Entfernung aus dem Gelenkentzündungsmilieu aktiviert zu bleiben. Die Zellen migrieren weiter und breiten sich weiter aus, ohne zusätzliche endogene Stimulation, wenn auch eingeschränkt im Vergleich zur stimulierten Situation (Firestein, 1995). Während Zellteilung ein möglicher Mechanismus der FLS-Akkumulierung ist, gibt es selten einen Beweis für eine ausschweifende Zellteilung und DNA-Synthese in der Intimaauskleidung. Die vorliegende Erfindung offenbart, dass das Induzieren einer Apoptosis in diesen Zellen zur Bekämpfung der Wirkungen der Erkrankung nützlich ist. Wenn die Proliferation tatsächlich relativ gering ist, können Abnormalitäten in der Zelltodrate zu einer Hyperplasie der Auskleidung bei Synovitis beitragen. Das Ausmaß der Apoptosis in der rheumatoiden Synovialis wurde erst kürzlich untersucht (Firestein et al., 1995, 1995a). Apoptosis ist durch ein Schrumpfen von Zellen, eine Segmentierung durch das Schrumpfen von Zellen, eine Segmentierung des Nukleus, eine Verdichtung und Spaltung von DNA in Fragmente von Domänegröße, auf die in den meisten Zellen ein internukleosomaler Abbau folgt, gekennzeichnet. Schließlich fragmentieren die apoptotischen Zellen zu membranumschlossenen apoptotischen Körpern, die durch benachbarte Zellen rasch phagozytiert werden. Daher bewirkt die Apoptosis eine viel geringere Zerstörung von Gewebe als die Nekrose, die nicht physiologische Art des Zelltodes (Wyllis et al., 1980; Arend und Wyllie, 1991).
Obwohl der Mechanismus einer abnormalen reduzierten Apoptosis bei RA nicht vollständig geklärt ist, scheint eine defekte p53-Funktion beim Überleben und Tod von Synoviozyten eine vorherrschende Rolle zu spielen (Conway et al., 1995). Mountz et al. (1994) berichteten, dass eine defekte Apoptosis mit anderen Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang steht, wie mit systemischem Lupus erythematodes, Gefäßentzündungssyndromen, Behcet-Krankheiten und der entzündlichen Darmerkrankung. Daher besteht gemäß der vorliegenden Erfindung eine therapeutische Maßnahme zur Heilung von RA und anderen (Auto)Immunerkrankungen in der Umgehung der apoptotischen Blocks in solchen Zeilen durch Auslösen eines (alternativen) apoptotischen Pfades.
Die Erfindung stellt daher die Verwendung eines Apoptosis induzierenden Mittels bereit, das seine Wirkung in aberranten Zellen zeigt, die an (Auto)Immunerkrankungen beteiligt sind oder mit diesen in Zusammenhang stehen, in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen und/oder Immunerkrankungen, wobei das Apoptosis induzierende Mittel das Apoptosis induzierende Protein Apoptin oder ein anderes Protein mit apoptinartiger Aktivität ist. Insbesondere stellt die Erfindung die Verwendung eines Apoptosis induzierenden Mittels in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bereit. Die Schädigung bei allen oben genannten Störungen/Erkrankungen beinhaltet für gewöhnlich ein Schädigung, die direkt oder indirekt durch eine bestimmte Untergruppe von Zellen (wie FLS bei RA) verursacht wird, die in gewisser Weise außer Kontrolle sind (übermäßige Proliferation oder andere Aktivität, oder Mangel an reguliertem Zelltod, oder Nekrose oder dergleichen). Es ist daher sinnvoll, wenn Apoptosis in einer solchen Untergruppe von Zellen durch Versehen solcher Zellen mit einem Apoptosis induzierenden Mittel induziert werden kann. Apoptosis ist dem nekrotischen Zelltod vorzuziehen, da sie zu weniger Abbauprodukten führt, siehe oben. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist jede Methode zweckdienlich, durch welche die Zielzellen mit apoptotischer Aktivität versehen werden können. Es ist jedoch bevorzugt, dass die apoptotische Aktivität durch eine proteinhaltige Substanz bereitgestellt wird, für die ein Gen kodiert, das an die Zielzelle durch ein Genabgabevehikel abgegeben wird. Ein Genabgabevehikel ist hierin als jedes Vehikel definiert, das imstande ist, ein Gen an eine Zelle abzugeben, sei es viralen oder nicht viralen Ur sprungs. Das Gen sollte derart abgegeben werden, dass es in der Zielzelle funktionell exprimiert werden kann.
Die pharmazeutische Formulierung des Apoptosis induzierenden Mittel oder des Genabgabevehikels ist ähnlich den pharmazeutischen Formulierungen für andere Mittel zur Auslösung des Zelltodes für eine bestimmte Population von Zielzellen. Für Genabgabevehikel, wie Adenoviren, wurden bereits viele Formulierungen für Abgabe-Gene an bestimmte Anzahlen von Zellen von vielen anderen offenbart, und daher müssen solche Formulierungen hier nicht näher behandelt werden. Andere Formulierungen für andere Genabgabevehikel können analog oder wie in der relevanten Technik beschrieben zusammengesetzt sein.
Damit alle unerwünschten Wirkungen der Genabgabevehikel gemäß der Erfindung ausgeschaltet werden können, ist bevorzugt, der genetischen Information ein Suizidgen hinzuzufügen. Somit sieht die Erfindung auch eine Verwendung vor, in der das Genabgabevehikel des Weiteren ein Suizidgen umfasst. Es ist natürlich bevorzugt, dass das Gen unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors steht. Zu bekannten Suizidgenen zählen Gene, die für Thymidinkinasen kodieren, oder andere zytotoxische proteinhaltige Substanzen.
Zur weiteren Verringerung unerwünschter Wirkungen der Genabgabevehikel gemäß der Erfindung ist bevorzugt, dass das Genabgabevehikel einen Tropismus für seine Zielzellen hat (oder mit diesem versehen ist), was bedeutet, dass es eine höhere Bindungs- und/oder Eintrittsaffinität für die Zielzelle hat als für andere Zellen. Dies kann einfach durch Auswählen eines Genabgabevehikels erreicht werden, das einen solchen Tropismus hat, oder durch Versehen eines Abgabevehikels mit einem solchen Tropismus von einem Organismus oder einer Substanz, der/die eine verstärkte Affinität für die Zielzelle hat. Wenn kein solcher Organismus oder keine solche Substanz verfügbar ist, kann dieser) durch Phage-Display-Screening von Zufallssequenzen mit Affinität für die Zielzellen, oder andere Screening-Techniken bereitgestellt werden. Wenn ein Genabgabevehikel mit einem Tropismus für eine andere Zielzelle als bei seinem ursprünglichen Tropismus versehen ist, wird dies häufig als zielgerichtete Gentherapie bezeichnet. Die Erfindung steht daher auch eine Verwendung gemäß der Erfindung vor, wobei das Genabgabevehikel einen Tropismus für hämopoetische Zellen oder vorzugsweise für fibroblastartige Synoviozyten hat. Alternativ sieht die Erfindung eine Verwendung gemäß der Erfindung vor, wobei das Genabgabevehikel mit einem zielgerichteten Mittel, insbesondere einem zielgerichteten Mittel für fibroblastartige Synoviozyten versehen ist. Ein bevorzugtes Genabgabevehikel gemäß der Erfindung ist ein rekombinantes Adenovirus. Rekombinante Adenoviren sind in dem Gebiet der Gentherapie gut bekannt und müssen hier nicht näher erklärt werden. Sichere Wege, diese herzustellen und zu verwenden, sind in zahlreichen Veröffentlichungen offenbart.
Das bevorzugte Apoptosis induzierende Mittel gemäß der Erfindung ist Apoptin oder ein funktionales Fragment, Derivat oder Äquivalent davon, oder ein Protein mit apoptinartiger Aktivität. Apoptin ist ein Protein, das vom Chicken Anaemia Virus abgeleitet wird, und ist in der Folge ausführlicher besprochen. Ein funktionales Derivat enthält ein Protein, in dem eine Anzahl von Aminosäureresten modifiziert oder hinzugefügt wurden, ohne die Aktivität zu beeinträchtigen (was bedeutet, dass es weiterhin Apoptosis induziert, wenn auch in einem anderen (höheren oder geringeren) Ausmaß). Dasselbe gilt natürlich auch für Fragmente oder Kombinationen von Fragmenten mit Derivatisierungen. Funktionale Äquivalente sind Gegenstücke von Apoptin (Chicken Anaemia Virus Protein 3) in anderen Organismen. Ein sehr wichtiger Vorteil von Apoptin gegenüber anderen Apoptosis induzierenden Mitteln ist, dass es seine Aktivität nicht in einem signifikanten Ausmaß in normalen Zellen zeigt, während die vorliegende Erfindung demonstriert, dass es seine Wirkung in den aberranten Zellen zeigt, die an (Auto)Immunerkrankungen beteiligt sind oder mit diesen zusammenhängen.
Es ist auch bevorzugt, dass die Apoptinexpression induzierbar gemacht wird.
Die Erfindung stellt des Weiteren einen Test für die Wahrscheinlichkeit, dass Zellen in der Art von (Auto)Immunerkrankungen aberrant werden, bereit. Dieser Test beinhaltet das Versehen einer Probe von Zellen, von welchen vermutet wird, dass sie aberrant werden können, mit einem Protein mit apoptotischer Aktivität, wie einem Gen, das für Apoptin oder ein Derivat oder Fragment davon kodiert, und das anschließende Aussetzen solcher Zellen einer Belastung, wie einer osmotischen Belastung, einem Hitzschock, einer infektiösen Belastung, UV, usw.. Zellen mit einer Neigung zur Aberranz erfahren nach dieser Be handlung eine Apoptosis. Zellen, die diese Fähigkeit nicht besitzen, bleiben weitgehend unbetroffen. Somit kann die Wahrscheinlichkeit zukünftiger (Auto)Immunerkrankungen für ein Individuum untersucht werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
In vitro führt die Synthese des vom Chicken Anaemia Virus (CAV) abgeleiteten Proteins Apoptin in transformierten Hühnerzellen zur Auslösung einer Apoptosis (Noteborn et al., 1994; Noteborn und Koch, 1995; Noteborn et al., Noteborn und Van der Eb, 1998). Apoptin ist ein kleines Protein, nur 121 Aminosäuren lang, das eher basisch und reich an Prolinen, Serinen und Threoninen ist (Noteborn et al., 1991).
Apoptin und andere Proteine mit apoptinartiger Aktivität können Apoptosis auch in menschlichen malignen und transformierten Zelllinien induzieren, nicht aber in nicht transformierten menschlichen Zellen (Danen-Van Oorschot et al., 1997; Noteborn et al., 1998a). Wir haben festgestellt, dass Apoptin induzierte Apoptosis in Abwesenheit von funktionalem p53 stattfindet (Zhuang et al., 1995a) und durch Bcl-2, Bcr-Abl (Zhuang et al., 1995, 1995b), das Bcl-2 assoziierende Protein BAG-1 und das Kuhpockenprotein CrmA (Noteborn, 1996; Danen-Van Oorschot et al., 1997a; Danen-Van Oorschot et al., 1998) nicht blockiert werden kann.
In vitro induziert Apoptin keine Apoptosis in normalen diploiden lymphoiden, dermalen, epidermalen, endothelialen oder glatten Muskelzellen. Wenn jedoch normale Zellen Apoptin und ein transformierendes Protein, wie SV40 Large T Antigen, co-exprimieren, erfahren die Zellen eine Apoptosis. Diese Daten zeigen, dass Apoptin induzierte Apoptosis auch unter nicht etablierten tumorbildenden Situationen stattfinden kann (Noteborn et al., 1998b). In den analysierten transformierten Zellen, die alle eine Apoptin induzierte Apoptosis erfahren, befindet sich Apoptin im Zellkern (Noteborn et al., 1998). Im Gegensatz dazu wurde Apoptin vorwiegend im Zytoplasma normaler, nicht transformierter Zellen vorgefunden (Danen-Van Oorschot, 1997). Die Co-Expression mit einem transformierenden Protein ermöglicht jedoch, dass Apoptin im Kern vorhanden ist, was zur Auslösung der Apoptosis führt (Noteborn et al., 1998a). In Fibroblasten, die von zu Krebs neigenden Individuen stammen, induziert Apoptin keine Apoptosis und befindet sich nicht in deren Kern. Nach einer UV- Bestrahlung jedoch (die eine aberrante SOS-Antwort in diesen Zellen hervorruft, die einem vorübergehenden Transformierungszustand entspricht), kann Apoptin in diesen Zellen Apoptosis induzieren (Zhang et al., 1999). Andererseits sprachen Fibroblasten von gesunden Individuen nicht auf die Apoptin induzierte Apoptosis nach UV-Behandlung an. Dies zeigt, dass eine Prädisposition notwendig ist, die bei der Auslösung Apoptin aktiviert.
Vor kurzem haben Noteborn und Pietersen (1998) die Erzeugung und Charakterisierung eines Apoptin exprimierenden, adenoviralen Vektors, AdMLPvp3, beschrieben. Dieser Vektor ermöglicht eine effiziente Synthese von Apoptin in vitro wie auch in vivo. Sie zeigten, dass Apoptin sein Spezifität für krebsbildende/transformierte Zellen behält, wenn es durch einen adenoviralen Vektor eingeführt und exprimiert wird. Experimente an Ratten zeigten, dass AdMLPvp3 sicher z. B. mittels intravenöser Injektion verabreicht werden konnte. Wiederholte intravenöse Dosen von AdMLPvp3 wurden ebenso gut vertragen, was darauf hinweist, dass das Apoptin exprimierende Virus ohne starke schädliche Wirkungen verabreicht werden kann. Diese Ergebnisse werden durch die Tatsache bestätigt, dass transgene Mäuse erzeugt wurden, die Apoptin in einer großer Anzahl ihrer Zellen erzeugen (Noteborn und Zhang, 1998). Eine einzige intratumorale Injektion von adMLPvp3 in einen xenogenen Tumor führte zu einer deutlichen Verringerung des Tumorwachstums (Pietersen et al., 1999).
Die intrinsische Spezifität und die inhärente geringe Toxizität machen Apoptin synthetisierende Adenovirusvektoren zu viel versprechenden Werkzeugen für die Behandlung fester Tumore.
Die Erfindung stellt nun in einer Ausführungsform eine Gentherapie bereit, die eine Nutzung der Merkmale des Apoptosis induzierenden Proteins Apoptin oder anderer Proteine mit apoptinartiger Aktivität für die Herstellung eines Medikaments ermöglicht, für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie RA.
Ein solches Genabgabevehikel, das ein unabhängig infektiöser Vektor ist, zum Beispiel ein Virus oder ein von einem Virus abgeleiteter Vektor, ein Liposom oder ein Polymer oder dergleichen, der selbst zum Beispiel Zellen infizieren oder auf einer andere Weise genetische Informationen an diese liefern kann, zum Beispiel Zellen, die Autoimmunerkrankungen hervorrufen oder an diesen beteiligt sind.
Die genetische Information umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein mit apoptinartiger Aktivität kodiert. Die Erfindung stellt auch ein Genabgabevehikel bereit, dessen Fähigkeit, apoptinartige apoptotische Aktivität zu exprimieren, verstärkt ist.
Das Genabgabevehikel, das somit durch die Erfindung bereitgestellt wird, kann zum Beispiel ein Adenovirus oder ein Retrovirus, Parvovirus oder andere DNA- oder RNA-rekombinante Viren sein, die als Abgabevehikel verwendet werden können, oder ein Plasmovirus. Zusätzlich stellt die Erfindung ein Genabgabevehikel bereit, das auch mit einem spezifischen Liganden oder Zielmolekül oder mit Zielmolekülen ergänzt ist, durch welche das Genabgabevehikel spezifisch zur Abgabe seiner genetischen Information an eine Zielzelle der Wahl gelenkt werden kann. Ein solches Zielmolekül kann zum Beispiel ein virales Spike-Protein, ein Rezeptormolekül oder ein Antikörper sein, der mit einem Oberflächenrezeptor oder Protein von Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, reaktionsfähig ist.
Ebenso stellt die Erfindung ein Genabgabevehikel bereit, das in der Diagnose von z. B. Autoimmunerkrankungen, wie RA, verwendet werden kann. Ein solches Genabgabevehikel kann z. B. zur in vitro Diagnose verwendet werden, wobei Gewebe- oder Zellproben oder Biopsien von einem Menschen oder Tier zu nehmen sind. Solche Proben können dann ausgewertet oder getestet werden, indem sie in Kultur oder direkt mit dem Genabgabevehikel infiziert werden, das zur Expression z. B. apoptinartiger Aktivität imstande ist. Mit RA in Zusammenhang stehende Zellen, wie fibroblastartige Synoviozyten oder Zellen, die mit anderen Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, erfahren nach der Apoptin-Synthese eine Apoptosis. Insbesondere, wenn diese Zellen mit Wachstumsserum stimuliert werden, lösen Zytokinfaktoren und/oder andere Faktoren ein noch "aggressiveres Wachstum" dieser Zellen aus. Als Alternative ist die Position von Apoptin im Kern von Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, ein weiterer Marken für die diagnostische Analyse von RA-Zellen oder Zellen, die von anderen Autoimmunerkrankungen abgeleitet werden. Die Gegenwart von Apoptin kann z. B. mit klassischen (immuno-) histochemischen Techniken nachgewiesen werden, d. h., mikroskopisch oder mit automatisierten Zellsortierungstechniken.
Insbesondere betrifft die Erfindung Anti-Autoimmuntherapien. Die Behandlung von Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, findet z. B. durch Expression von Apoptin durch direkte Infektion dieser Zellen mit Genabgabevehikeln, wie Adenovirusvektoren, statt, die eine kodierende Sequenz für ein Protein mit apoptinartiger Aktivität enthalten. Daher stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform Genabgabevehikel bereit, wie den Adenovirusvektor, der Apoptin exprimiert, das ein wirksames Anti-Autoimmun-Agens ist. Zusätzlich bewirkt die Apoptin-Expression in Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, auch indirekt einen Zelltod in jenen Zellen, die mit der Autoimmunerkrankung in Zusammenhang stehen, die nicht Apoptin exprimieren. Diese so genannte begleitende Wirkung ("by-stander effect") verbessert die Apoptinbehandlung von Autoimmunerkrankungen noch mehr.
Die Apoptin-Synthese induziert nicht oder wenigstens nicht nachweisbar oder signifikant Apoptosis in normalen gesunden Zellen, was darauf hinweist, dass die Toxizität einer in vivo Behandlung mit rekombinanten Apoptin-Vehikeln, wie dem Adenovirusvektor, der die Apoptin-Synthese reguliert, gering ist.
Die Expression von Apoptin in Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, kann auch durch Infizieren von Zellen mit anderen DNA- und/oder RNA-viralen Vektoren außer Adenovirusvektoren erfolgen, die eine kodierende Sequenz für Apoptin enthalten, wie Retroviren oder Parvoviren (Lopez-Guerro et al., 1997). Zusätzlich können virusabgeleitete Vektorsysteme, wie Plasmoviren (Noguiez-Hellin, 1996) für die Auslösung einer Apoptin induzierten Apoptosis in Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, verwendet werden.
Die Erfindung ermöglicht auch die Identifizierung der wesentlichen zellularen Faktoren, die in der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen, wie RA, eine Rolle spielen.
DIAGNOSTISCHER TEST AUF EINE NEIGUNG ZU (AUTO)IMMUNERKRANKUNGEN
Die Daten, die in diesem Bericht vorgelegt werden, ermöglichen die Entwicklung eines Tests zur Bestimmung, ob ein Individuum mit unbekanntem zellularen/genetischen Hintergrund zu Autoimmunerkrankungen im Vergleich zu normalen gesunden Personen neigt. Normale diploide Zellen (wie FLS) von einem Individuum, das zu (Auto)Immunerkrankungen neigt, sind für die Apoptin induzierte Apoptosis unempfindlich, werden dies aber nach der Belastungsbehandlung, wie chemische, osmotische, Wärme-, infektiöse und/oder Bestrahlungsbelastungen, wie UV- und Röntgenstrahlen. In der Folge ist ein Beispiel für einen solchen diagnostischen Test auf der Basis der Wirkung der UV-Bestrahlung beschrieben.
Primäre Zellen (z. B. FLS) sind von dem zu testenden Individuum zu isolieren und in einem geeigneten Medium zu kultivieren. Danach werden die Zellen mit UV bestrahlt und anschließend mit einem Plasmid, das für Apoptin kodiert, transfiziert, oder die Zellen werden zuerst transfiziert/infiziert und dann bestrahlt. Parallel dazu werden diploide Zellen von einem normalen gesunden Individuum als Kontrolle verwendet.
Unter Verwendung eines indirekten Immunofluoreszenztests auf der Basis Apoptin-spezifischer mAb's werden die Zellen auf die Gegenwart von Apoptin im Kern und/oder auf Apoptosis untersucht. Wenn der Prozentsatz an Zellen, die eine Apoptosis erfahren, unter den Apoptin-positiven, UV-behandelten Zellen signifikant höher ist als der Prozentsatz an Apoptosis in UV-behandelten Zellen eines normalen Individuums, ist dies ein deutlicher Beweis, dass das Individuum, von dem die Zellen isoliert werden, zu (Auto)Immunerkrankungen neigt.
Die Erfindung wird auf der Basis des folgenden experimentellen Teils ausführlicher beschrieben. Dies dient nur dem Zweck der Veranschaulichung und sollte nicht als Einschränkung des Schutzumfanges verstanden werden.
EXPERIMENTELLER TEIL
Zellen und Zellkulturbedingungen
Ad5 E1-transformierte menschliche, embryonale Retina- ("human embryonic retina" – HER) PER.C6-Zelllinien wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum ("fetal calf serum" – FCS) in einer 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Die Zelllinie PER.C6 wurde von Fallaux et al. (1996) erhalten. Zellkulturmedien, Reagenzien und Seren wurden von GIBCO Laboratories (Grand Island, NY) gekauft. Kulturgefäße wurden von Greiner (Nurtingen, Deutschland) gekauft.
Synoviozyten wurden von einem Patienten erhalten, der an rheumatoider Arthritis (RA) litt. Die Zellen wurden in MDM-Medium kultiviert, das 10% FCS enthielt. Nach einer adenoviralen Infektion wurden die Synoviozyten in MDM-Medium kultiviert, das mit 10% FCS oder mit 40% normalem Humanserum ergänzt war. Die Synoviozyten wurden von P. Goossens, Department of Rheumatology, Leiden University Medical Centre (LUMC), Leiden, Niederlande, erhalten.
Viren
Der rekombinante adenovirale Vektor AdMLPvp3 wurde für die virale Expression von Apoptin verwendet (Pietersen et al., 1999). Der Vektor AdMLPvp3 enthält den E1A-Verstärker, der an den Adenovirus Major Late ("starken, späten") Promotor (MLP) gebunden ist, um das Apoptin-Gen anzutreiben, das die vom Chicken Anaemia Virus (CAV) abgeleitete Region (Position Nr 427-868; Noteborn et al., 1991) enthält. Das rekombinante adenovirale AdCMVLacZ wurde als Kontroll-Adenovirus verwendet. AdCMVLacZ trägt das E.coli LacZ-Gen für Beta-Galactosidase unter der Steuerung des Cytomegalovirus-Verstärkers/Promotors (Pietersen et al., 1999).
Virustechniken
Plaquebestimmungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Graham und Prevec, 1991). Kurz gesagt, Adenovirus-Stämme wurden seriell in 2 ml DMEM, das 2% Pferdeserum enthielt, verdünnt und nahezu konfluentem PER-C6 in Platten mit 6 Vertiefungen zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurde das Medium durch F-15 Minimalmedium ("minimum essential medium" – MEM) ersetzt, das 0,85% Agarose (Sigma, USA), 20 mM HEPES (pH 7,4), 12,3 mM MgCl₂, 0,0025% L-Glutamin und 2% Pferdeserum (30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert) enthielt.
Die Produktion im kleinen Maßstab von Adenovirus-Lots wurde wie von Fallaux (1996) beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, nahezu konfluente PER.C6- Monoschichten wurden mit etwa 5 Plaque bildenden Einheiten ("plaque forming units" – pfu's) pro Zelle in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) infiziert, die 1% Pferdeserum enthielt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Inokulum durch frisches Medium (DMEM/2% Pferdeserum) ersetzt. Nach 48 Stunden wurden die nahezu vollständig Iosgelösten Zellen geerntet und in 1 ml PBS/1% Pferdeserum gesammelt. Das Virus wurde von den Erzeugerzellen in 3 Schockgefrier-/Auftau-Zyklen isoliert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 3000 U/min über 10 Minuten geklärt und bei –20°C gelagert.
Die PER.C6 erzeugten rAdV-Stammkulturen wurden auf das Vorhandensein eines rekombinanten-kompetenten Adenovirus durchmustert, indem eine pCR-Analyse mit Primern, die von der Ad5 ITR-Region (5'-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3') und der E1A-kodierenden Region (5'-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3') abgeleitet waren, wie von Noteborn und De Boer (1995) beschrieben, unter Verwendung einer Perkin Elmer PCR-Vorrichtung durchgeführt wurde. Das Vorhandensein eines 600 bp amplifizierten Fragments zeigte, dass replikationskompetentes (die E1-Region enthaltendes) Adenovirus in dem analysierten Virusstamm vorhanden ist (Pietersen et al., 1999).
Immunofluoreszenz und DAPI-Färbung
Die indirekte Immunofluoreszenz wurde wie von Noteborn et al. (1990) beschrieben durchgeführt. Für den Nachweis der Gegenwart von Apoptin und zur Bestimmung seiner zellularen Lokalisierung in infizierten Zellen wurden die Zellen mit 80% Aceton fixiert. Der indirekte Immunofluoreszenztest wurde mit einer dreifachen Verdünnung des monoklonalen Maus-Antikörpers (mAb) CVI-CAV-111.3 für Apoptin und einer 100-fachen Verdünnung von mAb LacZ (Boehringer Mannheim, Niederlande) für Beta-Galactosidase durchgeführt. Fluorescein-isothiocyanat-markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove PA, USA) wurde als zweiter Antikörper verwendet. Nukleare DNA wurde mit 1 Mikrogramm pro Milliliter 2,4-Diamino-2-phenylindol (DAPI), 2% Diazabicyclo[2,2,2]-octan (DABCO) in Glycerol/0,1 M TrisHCl, pH 8,0 (Telford et al., 1992) gefärbt.
TUNEL-Test
Terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (Tdt)-vermittelte dUTP Nick-Ende-Markierung (TUNEL) wurde unter Verwendung des in-situ Zelltoderfassungssatzes (Boehringer Mannheim, Deutschland) durchgeführt. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach der Permeabilisierung (0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumcitrat, 2 Minuten bei 4°C) wurden die Zellen mit der TUNEL-Reaktionsmischung (die Fluorescein-markierte Nukleotidpolymere und terminale Desoxynukleotidyl-Transferase enthielt) 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach einer Waschung mit PBS wurden die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert.
Giesma-Färbungs- und Beta-Galatosidase-Tests
Zum Erfassen der Anzahl anhaftender Zellen wurden die Zellen mit Giesma gefärbt. Nach einer (Schein)Infektion wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in Methanol : Essigsäure (3 : 1) 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden 30 Minuten in einer 3% Giesma-Lösung (Merck, Darmstadt, Deutschland) in 1 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Färben wurden die Zellen viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen und bei Luft trocknen gelassen. Zum Erfassen einer LacZkodierten Beta-Galactosidase-Aktivität wurden Zellen in Gewebekultur 24 Stunden nach der Infektion in eiskaltem 2% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehydlösung fixiert, in eiskalter PBS (enthaltend 2 mM MgCl₂) gewaschen und in 3 ml Reaktionsmischung (1 Milligramm pro Milliliter X-gal (Boehringer Mannheim, Deutschland), 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 2 mM MgCl₂ in PBS) bei 37°C 4 bis 16 Stunden inkubiert (Sanes et al., 1986).
ERGEBNISSE UND BESPRECHUNG
Ein in vitro Modell für die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) beim Menschen.
Zur Untersuchung möglicher therapeutischer Wirkungen der Synthese von Apoptin für RA-Patienten wurde ein in vitro Modell für RA erstellt. Zu diesem Zweck wurden fibroblastartige Synviozyten (FLS) von Patient OH, der an RA litt, isoliert. Die Zellen wurden in "nicht stimulierendem Medium", das fötales Kälberserum enthielt, oder in einem so genannten "stimulierenden" Medium, das 40% normales Humanserum enthielt, kultiviert. Insbesondere enthält das letztgenannte Medium Zytokine und andere stimulierende Faktoren, die der RA-Situation in vivo sehr ähnlich sind.
Diese "stimulierten" LFS ahmen die RA-Bedingungen hinsichtlich eines anderen, sehr wichtigen Aspekts nach. Das aberrante Wachstum von LFS in vivo und in vitro führt zu einer Sekretion verschiedener zellularer Faktoren, die ihr eigenes Zellwachstum und jenes von anderen (z. B. LFS) noch mehr stimulieren (Firestein, 1995). Die (kultivierten) mit RA in Zusammenhang stehenden LFS haben jedoch auch intrinsische genetische Veränderungen erfahren, die sie bereits im Vergleich zu normalen gesunden Zellen differenziert.
Adenovirusvektoren sind für die Expression eines Transgens in LFS, die mit RA in Zusammenhang stehen, sehr geeignet.
Gegenwärtig nutzt das effizienteste System zum Erreichen einer Transduktion eines Transgens bei der Mehrheit von Zellarten adenovirale Vektoren. Diese Vektoren haben mehrere Vorteile, die sie für einen in vivo Gentransfer besonders eignen. Rekombinante adenovirale Vektoren können in hohen Titern gezüchtet werden, haben die Fähigkeit nicht-mitotische Zellen zu transduzieren und integrieren ihre Genome nicht in Wirtszellen-DNA. Ferner wurden Adenovirusvektoren bereits für klinische Gentherapieversuche verwendet.
Wir haben untersucht, ob ein rekombinanter Apoptin-Adenovirusvektor zu einer effizienten Transduktion von RA-LFS-Zellen führen könnte. Zu diesem Zweck wurden diese LFS-Zellen mit dem replikationsdefizienten AdLacZ Vektor (moi 50) infiziert, der für das Beta-Galactosidase-Protein kodiert. Zwei Tage nach der Infektion wurden die LFS-Zellen fixiert und auf Beta-Galactosidase-Synthese analysiert. Etwa 40% der infizierten FLS waren im Beta-Galactosidase-Test positiv. Im Vergleich zu anderen Zelltypen, die mit rekombinanten Adenovirusvektoren infiziert waren, die Beta-Galactosidase exprimieren, ist dieser Transduktionsprozentsatz hoch.
Wir schließen daher, dass ein Adenovirusvektor sehr geeignet ist, um Transgene in RA-FLS zu erzeugen. Ein Beispiel eines Adenovirusvektors, der für die Expression von Apoptin geeignet ist, ist in 1 dargestellt.
Infektion von serumstimulierten RA-LFS mit AdMLPvp3 führt zu einem dramatischen Ausmaß des Zelltodes.
Anschließend bestimmten wir die zytotoxische Wirkung der Apoptin-Synthese in RA-LFS. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit dem negativen Kontrollvirus AdLacZ, AdMLPvp3 (beide moi: 50), das für Apoptin kodiert, infiziert oder scheininfiziert. Anschließend wurden die Zellen in einem "nicht stimulierenden" oder "stimulierenden" Medium gezüchtet. Drei und sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen durch Giemsa-Färbung auf Zelldichte untersucht.
Drei Tage und sechs Tage nach der Infektion zeigten die Zellen, die mit rekombinanten Adenovirusvektoren AdLacZ infiziert waren, keine signifikante Verringerung in der Zelldichte im Vergleich zu jenen, die scheinbehandelt waren. Diese Daten wurden sowohl für die "nicht stimulierenden" als auch für die "stimulierenden" Mediumbedingungen beobachtet.
Andererseits war jedoch die Zelldichte in den Schalen mit RA FLS, die mit dem rekombinanten Vektor AdMLPvp3 infiziert waren, deutlich verringert. Bereits drei Tage nach der Infektion (zwei Tage nach der "Stimulierung") "starben" nahezu alle RA FLS. Die Schalen, die nicht stimuliert waren, schienen keine signifikante Verringerung an Zellen aufzuweisen, die durch die Infektion mit AdMLPvp3 hervorgerufen wurde. Sechs Tage nach der Infektion jedoch war die Menge an AdMLPvp3-behandelten Zellen jedoch auch im Vergleich zu scheinbehandelten RA FLS signifikant verringert. Die Ergebnisse der Versuche, welche die Wirkung auf die Zelldichte von RA FLS-Kulturen, die mit AdLacZ, AdMLPvp3 infiziert oder scheinbehandelt waren, sechs Tage nach der Infektion zeigen, sind in 2 dargestellt.
Diese Ergebnisse beweisen, dass die Apoptin-Synthese spezifisch einen Zelltod in FLS verursacht, die von einem Patienten stammen, der an der Autoimmunerkrankung RA leidet. Die Infektion von Adenovirusvektoren als solches hat keine signifikante zytotoxische Wirkung auf RA FLS. Apoptin hat bereist eine mäßige negative Wirkung auf die Zelldichte von RA FLS, wenn sie unter "nicht stimulierenden" Bedingungen gezüchtet werden. Diese Daten legen nahe, dass sich die RA FLS von normalen gesunden menschlichen Zellen unterscheiden, wie von Firestein (1995, 1997, 1998) und anderen (Breedveld, 1997) angenommen wurde. Dieser Unterschied scheint von Apoptin "erkannt" zu werden.
Die Tatsache, dass Apoptin eine stärkere zelltötende Wirkung hat, wenn die RA FLS serumstimuliert sind, zeigt, dass Apoptin noch stärker aktiviert wird, wenn die FLS beginnen, verschiedene Faktoren, wie Zytokine, Chemokine, usw. zu sezernieren, die alle eine verstärkende Wirkung auf die Zellproliferation haben (Firestein, 1997), die zu einem eher transformiert-artigen Zustand führt.
Die Ergebnisse sind noch interessanter, wenn berücksichtigt wird, dass die AdMLPvp3-Infektion eine Apoptinproduktion in etwa 30 bis 40% der RAabgeleiteten FLS erzeugt (wie durch Immunofluoreszenzanalyse in parallel infizierten FLS-Kulturen bestimmt wurde), während nahezu alle FLS getötet werden. Es werden nicht nur die Apoptin-positiven FLS, sondern auch die Apoptin-negativen Zellen getötet. Dieses Ergebnis zeigt, dass die AdMLPvp3-Behandlung eine begleitende Wirkung hat. Höchstwahrscheinlich verursacht eine dramatische Verringerung von Wachstum stimulierenden und/oder Apoptosis verhindernden Faktoren auf Grund der Apoptin induzierten Apoptosis auch den Tod der Apoptin-negativen Zellen.
Wir schließen, dass Apoptin einen Zelltod in RA FLS herbeiführen kann, was sogar noch durch exogene und endogene Faktoren verstärkt wird. Diese Merkmale legen nahe, dass Apoptin ein therapeutisches Mittel zur Heilung von RA und anderen Autoimmunerkrankungen ist.
Die TUNEL-Analyse beweist, dass eine Apoptin-Synthese, die durch AdMLP vermittelt wird, Apoptosis in RA LFS induziert.
Zur Charakterisierung der Art des AdMLPvp3-induzierten Zelltodes wurde die Gegenwart von DNA-Strangbrüchen mit Hilfe des Enzyms terminale Desoxynukleotidyl-Transferase und Fitc-markiertem dUTP (TUNEL-Test) sichtbar gemacht. RA FLS wurden entweder mit AdMLPvp3 oder mit AdLacZ infiziert und nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 40% Humanserum stimuliert. Einen Tag später wurden die Zellen geerntet und für das Transgen gefärbt, um eine Ähnlichkeit in den Transduktionseffizienzen zu bestätigen, und parallel infizierten Schalen wurden dem TUNEL-Test unterzogen. Obwohl 40% der RA FLS Beta-Galactosidase exprimierten, wies nur gelegentlich eine einzige Zelle DNA-Brüche auf, die durch den TUNEL-Test nachgewiesen werden konnten. Im Gegensatz dazu schien die Häufigkeit von TUNEL-positiven Zellen nach der AdMLPvp3-Infektion in demselben Bereich zu liegen wie die Frequenz Apoptinpositiver Zellen nach der Infektion.
Wir schließen daher, dass Apoptin Apoptosis in Zellen induzieren kann, die ihr eigenes Potenzial, eine Apoptosis zu erfahren, verloren oder verringert haben. Die Tatsache, dass Apoptin Apoptosis in diesen RA LFS Zellen induzieren kann, zeigt, dass die Apoptinbehandlung in vivo ein sehr geringes Maß an Nebenwirkungen, wie Entzündungsreaktionen, verursacht.
Nukleare Lokalisierung von Apoptin in Humanserum-stimulierten RA LFS.
Zur Untersuchung der zellularen Lokalisierung von Apoptin in "stimulierten", RA-abgeleiteten FLS wurden die Zellen mit AdMLPvp3 1 Tag infiziert, einen weiteren Tag serumstimuliert und durch Immunofluoreszenz unter Verwendung eines Apoptin-spezifischen monoklonalen Antikörpers und einer DAPI-Färbung analysiert. Nahezu alle Apoptin-positiven Zellen enthielten Apoptin im Zellkern. Eine große Menge Apoptin-positiver Zellen enthielt bereits aberrante helle DAPI-Strukturen, die auf sehr späte apoptotische Zustände hinweisen; nämlich kondensiertes Chromatin/DNA. Auch diese Ergebnisse beweisen, dass die Apoptin-Synthese zur Auslösung einer Apoptosis in RA FLS führt.
Bisher zeigten alle Apoptin-empfindlichen Zellen für zellulare Bedingungen eine nukleare Lokalisierung von Apoptin (Noteborn et al., 1998b). Die vorgelegten Daten beweisen, dass die Apoptin-Aktivität in RA FLS auch mit seiner nuklearen Lokalisierung in Zusammenhang steht.
Die Infektion serumstimulierter LFS, die von zwei anderen RA Patienten stammten, mit AdMLPvp3 führt zu einem dramatischen Ausmaß an Zelltod.
Zur Untersuchung, ob eine Synthese von Apoptin zur Auslösung von Apoptosis in verschiedenen RA-Patienten führt, wurden mit RA in Zusammenhang stehende FLS auch von den RA-Patienten entnommen, die mit "E" und "Lo" bezeichnet sind. Die mit RA in Zusammenhang stehenden FLS, die von diesen RA-Patienten stammten, wurden vom Department of Rheumatology, Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande, erhalten.
Zu diesem Zweck wurden die LFS von den Patienten "E" und "Lo" mit AdMLPvp3, das für Apoptin kodiert, dem negativen Kontrollvirus AdLacZ, das für das nicht apoptotische Protein Beta-Galactosidase kodiert (beide moi: 50), infiziert oder scheininfiziert. Anschließend wurden die Zellen in "nicht stimulierendem" oder "stimulierendem" Medium gezüchtet. Drei Tage nach der Infektion (zwei Tage nach der Serumstimulation) wurden die Zellen durch DAPI-Färbung auf Zelldichte analysiert (Noteborn et al., 1998b). Die "nicht-stimulierten" wie auch die "stimulierten" Zellen, die mit dem rekombinanten Adenovirus AdLacZ infiziert waren, zeigten keine signifikante Verringerung in der Zelldichte im Vergleich zu jenen, die scheininfiziert waren.
Im Gegensatz dazu war die Zelldichte in den Schalen mit RA FLS, die von beiden Patienten "E" und "Lo" stammten und mit dem rekombinanten Vektor AdMLPvp3 infiziert waren, deutlich geringer. Die mit AdMLPvp3 behandelten Schalen, die nicht stimuliert waren, waren bereits weniger dicht als jene, die mit AdlacZ stimuliert oder scheinbehandelt waren. Diese Wirkung war in jenen Fällen noch signifikanter, in welchen die RA FLS mit 40% normalem Humanserum "stimuliert" waren. Die erhaltenen Ergebnisse dieser Experimente und jenes, das auf den RA FLS beruhte, die vom Patienten OH stammten, beweisen, dass die Apoptin-Synthese spezifisch einen Zelltod in FLS verursacht, die von verschiedenen Patienten stammen, die an der Autoimmunerkrankung RA leiden. Die Infektion von Adenovirusvektoren als solches hatte keine signifikante negative Wirkung auf die Zelldichte von RA FLS. Diese Merkmale bekräftigen die zuvor beschriebene Aussage, dass Apoptin ein therapeutisches Mittel zur Heilung von RA und anderen Autoimmunerkrankungen ist.
Konstruktion des Adenovirusvektors AdAgt-Apoptin
Der Adenovirusvektor AdMLPvp3 reguliert die Expression des Apoptin-Gens unter der Steuerung des Adenovirus Major Late Promotors (MLP). Der neuartige AdApt adenovirale Vektor enthält den Cytomegalovirus- (CMV-) Promotor, der auch optimal an die Helferzelllinie PER.C6 angepasst wurde. Zur Untersuchung, ob es möglich ist, Apoptin durch einen Adenovirusvektor unter der Regulierung von CMV zu erzeugen, wurde AdApt-Apoptin konstruiert.
Zu diesem Zweck wurde das BamHl-Fragment vom Plasmid pCMV-vp3 (Noteborn, 1996), das die Apoptin kodierenden Sequenzen enthält (Noteborn et al., 1991), in die BamHl-Stelle des 6,1 kb Transfervektors AdApt geklont, der von IntroGene, Leiden, Niederlande, erhalten wurde. Durch Sequenzanalyse und Restriktionsenzymaufschlüsse wurde die korrekte Orientierung des Apoptin-Gens unter der Regulierung des CMV bestimmt. Dieser Transfervektor wurde als pAdApt-Apoptin bezeichnet. Als negativer Kontroll-Adenovirus-Transfervektor wurden die Plasmide gewählt, die das Apoptin-Gen in der falschen Orientierung, dem CMV-Promotor entgegengesetzt, enthielten, und als AdAPT-AS bezeichnet. Danach wurden rekombinante Adenovirusvektoren, die das Apoptin-Gen unter der Regulierung des CMV-Promotors exprimieren, erzeugt. Zusätzlich wurde auch ein Kontroll-Adenovirus hergestellt, der das Apoptin-Gen in der entgegengesetzten Orientierung zum CMV-Promotor enthielt. Zu diesem Zweck wurden die PER-C6 Zellen (IntroGene, Leiden, Niederlande) mit dem Adenovirusvektor-Plasmid pAd5Alfll-ITR (E1–, E3+) und mit den Transferplasmiden pAdApt-Apoptin oder pAdApt-AS kotransfiziert. Nach der Beobachtung der zytopathogenen Wirkungen der transfizierten PER.C6 wurde das Medium, das die rekombinanten Adenovirusvektoren enthielt, geerntet und plaquegereinigt (Noteborn und Pietersen, 1998). Die verschiedenen plaquegereinigten rekombinanten Adenovirus-Chargen AdAPt-Apoptin, das für Apoptin kodiert, und der Kontrollvektor AdApt-AS, wurden durch PCR-Analyse auf die Gegenwart des Apoptin-Gens in der "korrekten" gegenüber der "falschen" Orientierung untersucht (Pietersen et al., 1999). Alle analysierten (insgesamt für jede Vektorart wenigstens 10) rekombinanten Adenovirus-Chargen enthielten das erwartete Apoptin-Gen. Die RCA-Analyse durch PCR (Pietersen et al., 1999) zeigte, dass in allen analysierten Chargen kein replikationskompetentes Adenovirus erzeugt wurde. Schließlich wurde die Erzeugung von Apoptinprotein durch AdApt-infizierte menschliche HepG2 Zellen durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 111.3 (Noteborn und Pietersen, 1998) untersucht. Es zeigte sich, dass die Zellen nahezu alle Apoptin-Protein erzeugten und sehr bald nach der Infektion apoptotisch wurden. Diese Erkenntnis weist auf die Tatsache hin, dass das erzeugte Apoptin als apoptotischer Auslöser vollkommen aktiv ist. Wie erwartet, färbten alle Zellen, die mit AdApt-AS infiziert waren, nicht für den monoklonalen Antikörper und wurden nicht apoptotisch. Als Schlussfolgerung zeigt die Tatsache, dass wir imstande sind, Apoptin durch verschiedene rekombinante Adenovirusvektoren entweder unter der Regulierung des Adeno virus MLP oder des CMV-Promotors zu erzeugen, dass Apoptin in jedem Adenovirusvektor erzeugt werden kann, ohne die Virus-Vektorproduktion zu beschränken.
Die Infektion von "serumstimulierten" RA FLS, die von dem RA-Patienten "E" stammten, mit AdApt-Apoptin führte zu einer signifikanten Auslösung eines Zelltodes, wie zuvor für den AdMLPvp3 rekombinanten Adenovirusvektor beschrieben wurde. Daher kann geschlossen werden, dass neben dem rekombinanten Adenovirusvektor AdMLPvp3 auch andere Adenovirusvektoren, die das Apoptin-Gen exprimieren, wie das AdApt-Apoptin rekombinante Adenovirus, als Adenovirusvektor als Basis für eine Therapie gegen Autoimmunerkrankungen wie RA verwendet werden können.
Diagnostischer Test für Zellen einer Autoimmunerkrankung auf der Basis von rAd-Apoptin.
Ein Marken für Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, ist das Ansprechen auf Apoptin-induzierte Apoptosis. Insbesondere führt die Stimulierung dieser Zellen mit Faktoren, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, wie gewissen Zytokinen und Wachstumsfaktoren, zu einem programmierten Zelltod, der durch die Synthese von Apoptin ausgelöst wird. Ferner ist ein weiterer Marken die zellulare Lokalisierung von Apoptin, die sich für Apoptin empfindliche Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, im Vergleich zu normalen gesunden Zellen unterscheidet.
Durch Infizieren der Zellen mit einem Vehikel, das Apoptin exprimiert, wie einem rekombinanten Adenovirus, das die Synthese von Apoptin reguliert, und Analysieren der zellularen Lokalisierung von Apoptin und/oder der Auslösung einer Apoptosis in diesen Zellen, kann nachgewiesen werden, ob eine Zelle von einem Patienten stammt, der an einer Autoimmunerkrankung leidet, oder nicht. Insbesondere nimmt bei der (Serum-) Stimulierung die nukleare Apoptin-Position und die Auslösung der Apoptosis signifikant zu.
Zum Beispiel werden die Zellen mit einem Adenovirus infiziert, das Apoptin exprimiert, und parallel mit einem Kontroll-Adenovirus, wie AdLacZ. Die Zellen werden auf Apoptin im Zytoplasma oder im Kern (Zellen, die mit Autoimmun erkrankungen in Zusammenhang stehen) durch z. B. einen Immunofluoreszenz-Test untersucht, der auf monoklonalen Antikörpern beruht, die für Apoptin spezifisch sind, wie 111.3 (Danen-Van Oorschot et al., 1998). Zusätzlich oder anstelle davon wird der Prozentsatz apoptotischer Zellen geschätzt.
Wenn der Prozentsatz apoptotischer Zellen für Zellen, die Apoptin synthetisieren, im Vergleich zu Zellen, die ein exogenes Kontrollprotein enthalten, wie Beta-Galactosidase, signifikant höher ist, stammen diese Zeilen von Patienten, die an einer Autoimmunerkrankung leiden.
Diagnostischer Test für die Identifizierung von Faktoren, die Autoimmunerkrankungen verursachen Neben intrinsischen Veränderungen von Zellen bei einer Autoimmunerkrankung verstärkt die Sekretion verschiedener Faktoren durch diese Zellen und höchstwahrscheinlich durch andere (immune) Zellen die Schwere der Autoimmunerkrankung, wie RA.
Daher kann der zuvor beschriebene diagnostische Test für die Identifizierung von Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen, auch für die Identifizierung von Faktoren verwendet werden, die die "Aggressivität" von Zellen verursachen und/oder verbessern, die klinische Zeichen von RA oder anderen Autoimmunerkrankungen verursacht.
Bei Behandlung mit einem solchen Faktoren erfahren Zellen, wie menschliche (RA) fibroblastartige Synoviozyten eine umfassende Apoptin-induzierte Apoptosis und/oder nehmen Apoptin in ihrem Kern auf.
Die Apoptin-induzierte Apoptosis zeigt transformiert-artige Zustände in Zellen an, die mit Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen.
Die Tatsache, dass Apoptin Apoptosis in ("stimulierten") RA FLS induzieren kann, zeigt, dass sich diese Zellen in einem transformierten Zustand befinden. Bisher wurde nicht bewiesen, dass Apoptin Apoptosis in normalen, nicht transformierten Zellen induziert, die vom Menschen oder einem anderen Säugetier stammten (Danen-Van Oorschot et al., 1997, Noteborn et al., 1998b, Zhang et al., 1999). Diese Daten werden durch die Tatsache bekräftigt, dass transgene Mäuse, die Apoptin in verschiedenen ihrer Gewebe exprimieren, normal aussehen. Keines ihrer Organe scheint auf Grund der Synthese von Apoptin in ihren Zellen eine verstärkte Apoptosis zu erfahren (Noteborn und Erkeland, unveröffentlichte Ergebnisse).
Die UV-Auslösung aberranter, mit Stress in Zusammenhang stehender Prozesse in normalen, nicht transformierten Zellen, die von Individuen mit zu Krebs neigenden Syndromen stammten, ermöglicht jedoch, dass Apoptin in diesen Zellen während einer Übergangsperiode Apoptosis induziert (Zhang et al., 1999). Apoptin induziert keine Apoptosis in UV-behandelten Zellen gesunder Individuen. Apoptin kann Apoptosis ziemlich mäßig in RA FLS induzieren. Zum Beispiel erhöht die Serumstimulierung von RA FLS das Ausmaß der Apoptininduzierten Apoptosis in z. B. RA FLS. Es scheint, dass diese RA FLS sich bereits von normalen gesunden Zellen unterscheiden, aber nach der "Stimulierung" noch aberranter (transformiert) werden. Diese Merkmale sind jenen, die für die UV-behandelten Zellen beschrieben wurden, ähnlich, die von zu Krebs neigenden Individuen stammten (Zhang et al., 1999). In beiden Fällen wurde ein zellularer Prozess geändert, der unter "normalen" Bedingungen von der Zelle bewältigt werden kann, aber bei einem spezifischen Reiz zu aberranten zellularen Prozessen führt, die eine beschleunigte Entwicklung von Krebs oder Autoimmunerkrankungen zur Folge haben.
Rheumatoide FLS erscheinen und verhalten sich oft wie normale Fibroblasten, was zu der Feststellung geführt hat, dass sie auf ihre Umgebung eher reagieren und nicht wie unabhängige (transformierte) Aggressoren agieren. Gewisse bruchstückhafte Beweise wurden jedoch vorgelegt, dass sie auch Eigenschaften transformierter Zellen aufweisen. Zum Beispiel ist ein Anhaften an Kunststoff oder extrazellulare Matrix im Allgemeinen für normale Fibroblasten notwendig, um in Kultur über längere Zeiträume zu proliferieren und zu überleben. Transformierte Zellen jedoch können in Suspension in halbfestem Medium ohne Kontakt mit einer festen Oberfläche wachsen. Während FLS für gewöhnlich unter Bedingungen wachsen und gedeihen, die ein Anhaften ermöglichen, können sie unter einigen Umständen unabhängig von einer Verankerung proliferieren (Lafyatis, et al., 1989). Ferner wurde die Expression mehrerer Onkogene, wie c-myc, für kultivierte FLS berichtet (Gay und Gay, 1989). Eine höhere endogene Freisetzung von Wachstumsfaktoren, wie dem Tumorwachstumsfaktor Beta und anderer Zytokine, wurde auch für FLS beschrieben (Bucala et al., 1991, Remmers et al., 1990; Geiler, 1994; Firestein, 1995 und 1995a). In einigen Fällen wurde auch der nicht-funktionelle Tumor-Suppressor p53 mit RA in Zusammenhang gebracht (Aupperle et al., 1998). Obwohl mutantes p53 kein Onkogen ist, verhindert es die Auslösung von Apoptosis durch endogene oder exogene Mittel, die nicht Apoptin sind.
Alle diese Daten zeigen, dass FLS irreversibel in RA verändert werden, und dass ein autonomer Prozess ihnen ermöglicht, selbst nach der Entfernung aus dem Gelenksentzündungsmilieu aktiviert zu bleiben (Firestein, 1995). Wir haben den Beweis geliefert, dass Apoptin diese transformiert-artigen Autoimmunzustände erkennen kann, was die Identifizierung der zellularen Faktoren ermöglicht, die bei solchen Erkrankungen wichtig sind.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die schematische Darstellung der wesentlichen Teile des rekombinanten Adenovirus AdMLPvp3, das das Gen enthält, das für Apoptin kodiert, unter der Regulierung des adenoviralen Major Late Promotors.
2 zeigt die schematische Darstellung der Apoptin-induzierten zytotoxischen Wirkung in kultivierten fibroblastartigen Synoviozyten (FLS), die von der Synovialis eines Patienten stammten, der an rheumatoider Arthritis litt. 1,5 × 104 Zellen wurden in Schalen mit 24 Vertiefungen 24 Stunden kultiviert, mit rekombinantem Adenovirus AdLacZ, das Beta-Galactosidase (LacZ) exprimiert, mit AdMLPvp3, das für Apoptin kodiert (Apoptin), infiziert oder scheininfiziert (Keines). Die FLS wurden unter normalen Bedingungen (NST) gezüchtet oder 1 Tag nach der Infektion mit 40% normalem Humanserum stimuliert (ST), wodurch aggressiver wachsende FLS induziert wurden, was der RA-Situation in vitro ähnlich ist. Schließlich wurden sechs Tage nach der Infektion mit Adenovirus oder nach der Scheininfektion die Zellmonoschichten fixiert und mit GIEMSA-Lösung gefärbt (+: stellt eine Menge lebender/anhaftender Zellen dar; –: bedeutet keine überlebenden/anhaftenden Zellen).
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Claims

Verwendung eines Apoptosis induzierenden Mittels, das seine Wirkung in aberranten Zellen zeigt, die an (Auto)Immunerkrankungen beteiligt sind oder mit diesen in Zusammenhang stehen, in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, wobei das Apoptosis induzierende Mittel das Apoptosis induzierende Protein Apoptin oder ein anderes Protein mit apoptinartiger Aktivität ist.
Verwendung eines Apoptosis induzierenden Mittels, das seine Wirkung in aberranten Zellen zeigt, die an (Auto)Immunerkrankungen beteiligt sind oder mit diesen in Zusammenhang stehen, in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Immunerkrankungen, wobei das Apoptosis induzierende Mittel das Apoptosis induzierende Protein Apoptin oder ein anderes Protein mit apoptinartiger Aktivität ist.
Verwendung eines Apoptosis induzierenden Mittels nach Anspruch 2, wobei die Behandlung von Immunerkrankungen die Behandlung von Autoimmunerkrankungen ist.
Verwendung eines Genabgabevehikels, umfassend ein Gen, das imstande ist ein Apoptosis induzierendes Mittel zu exprimieren, das seine Wirkung in aberranten Zellen zeigt, die an (Auto)Immunerkrankungen beteiligt sind oder mit diesen in Zusammenhang stehen, in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, wobei das Apoptosis induzierende Mittel das Apoptosis induzierende Protein Apoptin oder ein anderes Protein mit apoptinartiger Aktivität ist.
Verwendung eines Genabgabevehikels, umfassend ein Gen, das imstande ist ein Apoptosis induzierendes Mittel zu exprimieren, das seine Wirkung in aberranten Zellen zeigt, die an (Auto)Immunerkrankungen beteiligt sind oder mit diesen in Zusammenhang stehen, in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung Immunerkrankungen, wobei das Apoptosis induzierende Mittel das Apoptosis induzierende Protein Apoptin oder ein anderes Protein mit apoptinartiger Aktivität ist.
Verwendung eines Genabgabevehikels nach Anspruch 5, wobei die Behandlung von Immunerkrankungen die Behandlung von Autoimmunerkrankungen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Genabgabevehikel des Weiteren ein Suizidgen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Suizidgen induzierbar ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei das Genabgabevehikel einen Tropismus für hämopoetische Zellen aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei das Genabgabevehikel einen Tropismus für fibroblastartige Synoviozyten aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, wobei das Genabgabevehikel mit einem zielgerichteten Mittel versehen ist, insbesondere einem zielgerichteten Mittel für fibroblastartige Synoviozyten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 11, wobei das Genabgabevehikel ein rekombinantes Adenovirus umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Apoptosis induzierende Mittel Apoptin oder ein funktionales Fragment, Derivat oder Äquivalent davon umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Apoptosis induzierende Mittel induzierbar ist.
Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart von Zellen, die wahrscheinlich zu einer (Auto)Immunerkrankung führen, in einer Probe, umfassend das Versehen verdächtiger Zellen mit einem Protein, das apoptinartige Aktivität besitzt, und Aussetzen der Zellen einer Belastung, wie einem Wärmeschock, osmotischem Schock, einer UV- oder chemischen Belastung, und Bestimmen der Apoptosis, wobei das Protein mit apoptinartiger Aktivität durch ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt wird, welches für das Protein mit apoptinartiger Aktivität codiert.
Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Autoimmunerkrankungen in einem Individuum, umfassend das Erhalten einer Probe von dem Individuum, wobei die Probe Zellen umfasst, die an der Autoimmunerkrankung beteiligt sind, Versehen der Zellen mit einem Protein, das apoptinartige Aktivität besitzt, und Bestimmen der Apoptosis, wobei das Protein mit apoptinartiger Aktivität durch ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt wird, welches für das Protein mit apoptinartiger Aktivität codiert.