ES2202039T3 - Uso de agentes inductores de apoptosis en la preparacion de mrdicamentto para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. - Google Patents

Abstract

Utilización de un agente inductor de apoptosis, que muestra su efecto en células aberrantes involucradas o relacionadas con enfermedades autoinmunitarias, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inflamatorios, en la que dicho agente inductor de apoptosis es la proteína inductora de apoptosis apoptina u otras proteínas con actividad similar a la apoptina.

Description

Uso de agentes inductores de apoptosis en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

La presente invención se refiere al sector de terapias basadas en biología molecular. La invención se refiere además al diagnóstico del riesgo de enfermedades futuras. Más particularmente, la invención se refiere al sector de tratamiento y diagnóstico de riesgo de enfermedades autoinmunitarias y/o desórdenes inflamatorios. La invención se refiere también a la inducción de apoptosis en ciertas células asociadas o relacionadas con las enfermedades autoinmunitarias.

Las enfermedades autoinmunitarias son un grupo de graves enfermedades que se caracterizan por desórdenes inflamatorios, tales como la enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica, algunas formas de diabetes, colitis ulcerativa y artritis reumatoide (Bischoff y otros, 1996; Firestein, 1995, 1998; Liblau y otros, 1995). Como una de las representantes más importantes de esta familia de enfermedades, se describirá la artritis reumatoide (RA) de manera más detallada como representativo de las aplicaciones de la presente invención.

La RA afecta a las articulaciones pero también a otros órganos. La enfermedad afecta 1-2% de la población adulta en todo el mundo. Las mujeres se ven afectadas más frecuentemente que los hombres en una proporción de sexos de 3:1. El espectro clínico, así como el curso de la enfermedad, varían considerablemente. En una enfermedad suave la inflamación de la articulación puede encontrarse presente durante un periodo de tiempo limitado y puede no presentarse destrucción de la articulación. Este modelo es relativamente raro. La mayor parte de pacientes tienen de manera continuada niveles altos o variables de actividad de la enfermedad. Esto será asociado con resultados peores de la enfermedad con respecto a discapacidad y destrucción de las articulaciones (Van Zeben y otros 1994).

La RA está asociada con un riesgo incrementado de mortalidad (Wolfe, 1990). La destrucción de las articulaciones empieza pronto en la RA. La proporción más elevada de formación de erosión más elevada de formación de erosión parece tener lugar durante los primeros dos años después del inicio de RA. Recientemente, se ha evidenciado que en los años siguientes tiene lugar una continua progresión de erosiones (Sharp y otros, 1991); Van der Heijde y otros, 1992).

La etiología de RA no se ha resuelto todavía, si bien la patofisiología de RA es un área dinámica de investigación (Breedveld, 1998). Un esquema simple de explicación de esta grave enfermedad es que la inflamación y destrucción de tejidos se inician por un influjo de linfocitos en el fluido sinovial. Estimulan las células del plasma, mastocitos, macrófagos y especialmente sinoviocitos similares a fibroblastos que producen mediadores inflamatorios, tales como factor alfa de necrosis tumoral e interleuquina (1). Estos mediadores pueden inducir actividades de degradación de la matriz que eventualmente conducen a la destrucción de la articulación. Estas actividades incluyen la activación de sinoviocitos similares a fibroblastos que producen colagenasa, la inducción de reabsorción de huesos y cartílagos y la expresión incrementada de quimioquinas y de adherencia y moléculas HLA, todo lo cual conduce a una estimulación adicional en la respuesta inmune, o a un influjo adicional de células hacia adentro del espacio de la articulación (Breedveld, 1998).

Recientemente, se han facilitado datos con respecto a que los FLS son alterados irreversiblemente en RA y que un proceso autónomo permite que permanezcan activados incluso después de su eliminación del medio inflamatorio articular. Las células continúan emigrando e invadiendo sin estimulación exógena adicional, si bien de forma reducida en comparación con la situación estimulada (Firestein, 1995). Si bien la división celular es un mecanismo posible de acumulación de FLS, hay escasas pruebas de división celular abundante y síntesis de ADN en el recubrimiento íntimo. La presente invención da a conocer que la inducción de apoptosis en estas células es útil en la lucha contra los efectos de la enfermedad.

Si la proliferación es, en realidad, relativamente baja, entonces las anormalidades en la proporción de muerte celular pueden contribuir a la hiperplasia de recubrimiento en sinovitis. La magnitud de apoptosis en el fluido sinovial reumatoide ha sido examinada solo recientemente (Firestein y otros, 1995, 1995a). La apoptosis se caracteriza por la retracción de las células, segmentación por retracción de las células, segmentación del núcleo, condensación y fraccionamiento del ADN en fragmentos de dimensión de dominio en la mayor parte de células seguido por una degradación internucleosomal. Finalmente, las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos encerrados en una membrana que son fagocitados con rapidez por las células adyacentes. Por lo tanto, la apoptosis provoca mucha menos destrucción de tejidos que la necrosis, el tipo no fisiológico de muerte celular (Wyllie y otros, 1980; Arends and Wyllie, 1991).

Aunque el mecanismo de la apoptosis reducida anormal en RA no ha sido elucidado de modo completo, parece involucrarse un papel prominente de la función p53 defectuosa con la supervivencia y muerte de los sinoviocitos (Conway y otros, 1995).

Mountz y otros (1994) han informado que la apoptosis defectiva está relacionada con otras enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematosus sistémico y síndromes de vasculitis, enfermedades de Behcet, y enfermedad inflamatoria del vientre. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención un enfoque terapéutico para la curación de RA y otras enfermedades autoinmunes consistirá en evitar el bloque apóptico en dichas células al inducir una ruta apoptótica (alternativa). La invención proporciona para ello la utilización de un agente inductor de apoptosis que muestra su efecto en células aberrantes, involucradas, relacionadas con enfermedades autoinmunes en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inflamatorios y/o enfermedades inmunes, de manera que dicho agente inductor de apoptosis, proteína inductora de apoptosis, apoptina u otras proteínas con actividad similar a la apoptina. En particular, la presente invención da a conocer la utilización de un agente inductor de apoptosis en la preparación de un medicamento por el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Los daños en la totalidad de desórdenes/enfermedades anteriormente mencionadas comportan habitualmente daños provocados directamente o indirectamente por un cierto subconjunto de células (tales como FLS en RA) que de algún modo se encuentran fuera de control (excesiva proliferación u otra actividad o falta de muerte celular regulada, o necrosis o similares). Por lo tanto es útil tener la capacidad de inducir apoptosis en dicho subconjunto de células, facilitando dichas células un agente inductor de apoptosis.

La apoptosis es preferible a la muerte celular necrótica, porque conduce a menos productos de descomposición, ver citas anteriores. Cualquier forma en la que las células objetivo puedan ser dotadas de actividad apoptótica, es útil de acuerdo con la presente invención. No obstante, es preferente que la actividad apoptótica quede proporcionada por una substancia proteínica codificada por un gen, facilitada a la célula objetivo por un vehículo de suministro del gen. Un vehículo de suministro del gen se define como cualquier vehículo capaz de facilitar un gen a una célula, de origen vírico o no vírico. El gen debe ser facilitado de manera tal que pueda ser funcionalmente expresado en la célula objetivo.

La formulación farmacéutica del agente inductor de apoptosis o del vehículo de suministro del gen será similar a las formulaciones farmacéuticas para otros agentes inductores de muerte celular para una cierta población de células objetivo. Para vehículos, de suministro de genes, tales como adenovirus, se han dado a conocer ya muchas formulaciones para suministrar genes a un cierto número de células, por parte de muchos otros investigadores y por lo tanto no es necesario elaborar adicionalmente dichas formulaciones en esta descripción. Otras formulaciones para otros vehículos de suministro de genes pueden ser constituidas análogamente o tal como se ha descrito en la técnica anterior pertinente.

A efectos de tener la posibilidad de prescindir de efectos no deseados de los vehículos de suministro de genes de acuerdo con la invención, es preferible añadir un gen suicida a su información genética. De este modo, la invención proporciona una utilización en la que dicho vehículo de suministro de genes comprende además un gen suicida. Es preferible, desde luego, que dicho gen se encuentre bajo control de un promotor inducible. Entre los genes suicidas conocidos, se incluyen genes que codifican timidina quinasas u otras substancias proteínicas citotóxicas.

Con el objetivo de reducir adicionalmente los efectos no deseados de los vehículos de suministro de genes, de acuerdo con la invención, es preferible que el vehículo de suministro de genes tenga (o esté dotado de) un tropismo para sus células objetivo, con el significado de que tiene una afinidad de unión y/o de entrada para las células objetivo con respecto a las otras células. Esto se puede conseguir simplemente seleccionando un vehículo de suministro de genes que tenga dicho tropismo o al proporcionar un vehículo de suministro con dicho tropismo, a partir de un organismo o substancia que tiene una afinidad mejorada para la célula objetivo. Si no se dispone de ninguno de dichos organismos o substancias, se puede proporcionar a través de rastreo de visualización de fagos de secuencias al azar que tienen afinidad para las células objetivo u otras técnicas de rastreo. Si se proporciona un vehículo de suministro de gen con tropismo para una diferente célula objetivo con respecto a su tropismo original, ello se designa frecuentemente como terapia dirigida de genes. Por lo tanto, la invención da a conocer también una utilización de acuerdo con la misma, en la que dicho vehículo para suministro de genes tiene un tropismo para células hematopoiéticas, o preferentemente sinoviocitos similares a fibroblastos. De modo alternativo, la invención da a conocer una utilización de acuerdo con la misma, en la que dicho vehículo de suministro de genes ha sido dotado de medios de direccionado, especialmente un medio de direccionado para sinoviocitos parecidos a fibroblastos. Un vehículo de suministro de genes preferente de acuerdo con la invención es un adenovirus recombinante. Los adenovirus recombinantes son bien conocidos en el sector de la terapia genética y no necesitan elaboración adicional en esta descripción. Se han dado a conocer en numerosas publicaciones formas seguras de producir y utilizar los mismos.

El agente inductor de apoptosis preferente de acuerdo con la invención es apoptina o un fragmento funcional, derivado o equivalente de la misma (proteínas con actividad parecida a la apoptina). La apoptina es una proteína derivada de virus de anemia de pollos y se explicará más adelante de forma detallada. Un derivado funcional comprende una proteína en la que una serie de residuos de aminoácidos han sido modificados o añadidos sin afectar la actividad (con el significado de que todavía induce apoptosis, si bien en otra magnitud o medida (superior o inferior)). Lo mismo es desde luego válido para fragmentos o combinaciones de fragmentos con derivaciones. Los equivalentes funcionales son los correspondientes a la apoptina (proteína 3 de virus de anemia de pollos) en otros organismos. Una ventaja muy importante de la apoptina con respecto a otros agentes inductores de apoptosis es que no muestra su actividad de forma significativa en células normales, mientras que la presente invención muestra que exhibe su efecto en células aberrantes involucradas o relacionadas con enfermedades autoinmunes.

También es preferible que la expresión de la apoptina se haga inducible.

La invención proporciona además una prueba para la probabilidad de que las células pasen a ser aberrantes en la forma de enfermedades autoinmunes. Esta prueba comporta la disposición de una muestra de células de las que se sospecha que son capaces de resultar aberrantes con una proteína que tiene actividad apoptótica, tal como una apoptina que codifica un gen o un derivado o fragmento de la misma, y posteriormente someter dichas células a estrés, tal como estrés osmótico, choques térmicos, estrés infeccioso, UV, etc. Las células que son propensas a aberración, mostrarán apoptosis después de este tratamiento. Las células que no tienen esta potencia quedarán fundamentalmente no afectadas. Por lo tanto, se puede examinar la probabilidad de un individuo para futuras enfermedades autoinmunes.

Descripción detallada

La síntesis in vitro, de la apoptina proteína derivada de virus de anemia de pollo (CAV), en células transformadas de pollo, tiene como resultado la inducción de apoptosis (Noteborn y otros, 1994; Noteborn y Koch, 1995; Noteborn y otros, Noteborn y Van der Eb, 1998). La apoptina es una proteína pequeña, que tiene una longitud solamente de 121 aminoácidos, que es más bien básica y rica en prolinas, serinas y treoninas (Noteborn y otros, 1991).

La apoptina, y otras proteínas con actividad similar a la apoptina, pueden inducir también apoptosis en líneas celulares humanas malignas y transformadas, pero no en células humanas no transformadas (Danen-Van Oorschot y otros, 1997; Noteborn y otros, 1998a). Los inventores han establecido que la apoptosis inducida por apoptina tiene lugar en ausencia de p53 funcional (Zhuang y otros, 1995a), y no se puede bloquear por Bcl-2, Bcr-Abl (Zhuang y otros, 1995; 1995b), la proteína BAG-1 de asociación con Bcl-2, y la proteína de la viruela de vaca CrmA (Noteborn, 1996; Danen-Van Oorschot y otros, 1997a; Danen-Van Oorschot y otros, 1998). In vitro, la apoptina no induce apoptosis en células linfoides normales, dérmicas, epidérmicas, endoteliales, o de músculos lisos. No obstante, cuando las células normales coexpresan apoptina y una proteína de transformación, tal como el antígeno T grande SV40, las células sufrirán apoptosis. Estos datos indican que la apoptosis inducida por apoptina tendrá lugar también en situaciones tumorigénicas no establecidas (Noteborn y otros, 1998b). En las células transformadas analizadas, que en su totalidad sufren apoptosis inducida por apoptina, la apoptina queda localizada dentro del núcleo celular (Noteborn y otros, 1998). Como contraste, la apoptina se ha encontrado predominantemente en el citoplasma de células normales no transformadas (Danen-van Oorschot, 1997). No obstante, la coexpresión con una proteína transformante posibilita que la apoptina se encuentre presente en el núcleo, con el resultado de inducción de apoptosis (Noteborn y otros, 1998a). La apoptina no induce apoptosis, y no queda localizada en el núcleo de fibroblastos derivados de individuos con tendencia a cáncer. No obstante, después de irradiación con UV (provocando una respuesta SOS aberrante en estas células que se parece a un estado de transformación transitoria) la apoptina puede inducir apoptosis en estas células (Zhang y otros, 1999). Por otra parte, los fibroblastos de individuos sanos no responden a apoptosis inducida por apoptina después del tratamiento por UV. Esto muestra que es necesaria una predisposición que después de la inducción activará apoptina.

Recientemente, Noteborn y Pietersen (1998) han descrito la generación y caracterización de un vector adenoviral que expresa apoptina AdMLPvp3. Este vector permite una síntesis eficaz de apoptina in vitro y también in vivo. Los investigadores demostraron que la apoptina mantiene su especificidad para células tumorigénicas/transformadas cuando es introducida y expresada por un vector adenovírico. Los experimentos llevados a cabo en ratas han demostrado que el AdMLPvp3 puede ser administrado de manera segura, por ejemplo, por inyección intravenosa. Las dosis intravenosas repetidas de AdMLPvp3 fueron también bien toleradas, indicando que el virus que expresa apoptina se puede administrar sin efectos contrarios graves. Estos resultados quedan reforzados por el hecho de que se generaron ratones transgénicos que producen apoptina en un gran número de sus células (Noteborn y Zhang, 1998). Una sola inyección intratumoral de AdMLPvp3 en un tumor xenogeneico tuvo como resultado una reducción significativa del crecimiento tumoral (pietersen y otros, 1999).

La especificidad intrínseca y la baja toxicidad inherente hacen de los vectores de adenovirus de sintetización de apoptina prometedoras herramientas para el tratamiento de tumores sólidos.

La invención, en una realización, prevé terapia genética, que posibilita la utilización de las características de la apoptina como proteína inductora de apoptosis u otras proteínas con actividad similar a la apoptina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como RA.

Este vehículo de suministro de genes, que es un vector infeccioso, independientemente, por ejemplo, un virus o vector derivado de virus, un liposoma o un polímero o similar, que en sí mismo puede infectar o, en cualquier otra manera, puede suministrar información genética, por ejemplo, a células que provocan o están involucradas en enfermedades autoinmunitarias. La información genérica comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad similar a la apoptina. La invención da a conocer, asimismo, un vehículo de suministro de genes que ha sido incrementado notablemente en su capacidad para expresar actividad apoptótica similar a la apoptina.

El vehículo de suministro de genes conseguido de este modo por la invención puede ser, por ejemplo, un adenovirus o un retrovirus, parvovirus u otros virus recombinantes de ADN o ARN que se pueden utilizar como vehículo de suministro o un plasmovirus. Además, la invención da a conocer un vehículo de suministro de genes que ha sido suplementado, asimismo, con un ligando específico o molécula objetivo o moléculas objetivo, por lo cual el vehículo de suministro de genes puede estar dirigido específicamente a suministrar su información genética en una célula objetivo elegida. Esta molécula objetivo puede ser, por ejemplo, una proteína espiciforme viral ("viral spike"), molécula receptora o anticuerpo reactivo con un receptor superficial o proteína de células relacionadas con enfermedades autoinmunitarias.

Asimismo, la invención da a conocer un vehículo para el suministro de genes que puede ser utilizado en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes tales como RA. Este vehículo de suministro de genes puede ser utilizado, por ejemplo, para diagnóstico in vitro, en el que los tejidos o muestras de células o biopsias tienen que ser extraídas de un humano o un animal. Estas muestras pueden ser evaluadas o sometidas a prueba por infección de las mismas en cultivos o directamente con dicho vehículo de suministro de genes capaz de expresar, por ejemplo, actividad similar a apoptina. Las células relativas a RA, tal como sinoviocitos similares a fibroblastos, o células relacionadas con otras enfermedades autoinmunes, presentarán apoptosis después de síntesis de la apoptina. En especial, cuando estas células son estimuladas con factores de crecimiento, suero, factores de citocinesis y/o otros factores que inducen un "crecimiento agresivo" incluso más elevado de estas células. De modo alternativo, la localización nuclear de la apoptina en células relacionadas con enfermedades autoinmunes es otro marcador para análisis de diagnóstico de células RA o células que se derivan de otras enfermedades autoinmunes. La presencia de apoptina puede ser demostrada, por ejemplo, con técnicas histoquímicas clásicas (inmuno), es decir, microscópicamente o con técnicas de clasificación de células automatizadas.

En particular, la presente invención se refiere a terapias anti-autoinmunes. El tratamiento de células relacionadas con enfermedades autoinmunes tendrá lugar, por ejemplo, por expresión de apoptina por medio de infección directa de estas células con vehículos de suministro de genes tales como vectores de adenovirus que contienen una secuencia de codificación para una proteína con actividad similar a la apoptina. Por lo tanto, la invención, en otra realización adicional, da a conocer vehículos de suministro de genes tales como apoptina que expresa el vector adenovirus que es un potente agente anti-autoinmunitario. Además, la expresión de apoptina en células relacionadas con enfermedades autoinmunes provocará asimismo, indirectamente, muerte celular en las células relacionadas con enfermedades autoinmunes que no son expresamente apoptina. Este efecto llamado de "espectador" mejorará el tratamiento de apoptina de enfermedades autoinmunitarias de modo adicional.

La síntesis de apoptina no induce apoptosis en células sanas normales o por lo menos no lo hace de forma detectable o significativa, indicando que la toxicidad del tratamiento in vivo con los vehículos de apoptina recombinantes, tales como el vector de adenovirus que regula la síntesis de la apoptina, es baja.

La expresión de la apoptina en células que están relacionadas con enfermedades autoinmunitarias, puede tener lugar también al infectar células con otros vectores de ADN y/o ARN víricos, además detectores de adenovirus, que contienen una secuencia de codificación para la apoptina, tal como retrovirus o parvovirus (Lopez-Guerro y otros, 1997). Además, los sistemas de vectores derivados de virus, tal como los plasmovirus (Noguiez-Hellin, 1996) se pueden utilizar para la inducción de apoptosis inducida por apoptina en células relacionadas con enfermedades autoinmunitarias.

La invención posibilita también la identificación de los factores celulares esenciales que desempeñan un papel en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias tales como RA.

Ensayo de diagnóstico para tendencia autoinmunitaria

Los datos presentados en este informe han permitido a los inventores desarrollar un ensayo para determinar si un individuo con un antecedente desconocido celular/genético tiene tendencia a enfermedades autoinmunitarias en comparación con personas sanas normales. Las células diploides normales (tales como FLS) de un individuo con tendencia a una enfermedad autoinmunitaria son insensibles a apoptosis inducida por apoptina, pero pasan a serlo después de tratamiento de estrés, tal como estrés químico, osmótico, calor, infeccioso, y/o irradiación, por ejemplo, UV y X. A continuación se describe un ejemplo de dicho ensayo de diagnóstico basado en el efecto de irradiación UV.

Las células primarias (por ejemplo, FLS) se tienen que aislar del individuo a comprobar y se tienen que cultivar en un medio adecuado. A continuación, las células son irradiadas con UV y, posteriormente, son transfectadas con apoptina que codifica plásmido o las células son, en primer lugar, transfectadas/infectadas y a continuación irradiadas. En paralelo, se utilizan como control células diploides de un individuo sano normal.

Por utilización de un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, basado en Mab específico de apoptina, las células son analizadas en cuanto a presencia de apoptina en el núcleo y/o en cuanto a existencia de apoptosis. Si el porcentaje de células afectadas por apoptosis entre las células positivas de apoptina tratadas con UV, es significativamente más elevado que el porcentaje de apoptosis en células tratadas con UV de un individuo normal, ello será una prueba de que el individuo del que se han aislado las células tendrá tendencia a enfermedades autoinmunitarias.

La invención se explicará con mayor detalle en base a la siguiente parte experimental. Esta tiene solamente el objetivo de ilustrar la descripción y no se debe interpretar como limitación del ámbito de protección.

Parte experimental Células y condiciones de cultivo de las mismas

Se cultivaron líneas celulares (HER) PER.C6 de retina humana embriónicas transformadas Ad5 E1 en medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM) suplementadas con 10% de suero fetal de vaca (FCS) en 5% de atmósfera de CO_{2} a 370ºC. Se obtuvo la línea celular PER.C6 de Fallaux y otros (1996). Los medios de cultivo celular, reactivos y sueros fueron obtenidos de GIBCO Laboratories (Grand Island, NY). Los plásticos de cultivo fueron adquiridos de la firma Greiner (Nurtingen, Alemania).

Se derivaron sinoviocitos de un paciente que sufría artritis reumatoide (RA). Las células fueron cultivadas en medio MDM conteniendo 10% de FCS. Después de infección por adenovirus, los sinoviocitos fueron cultivados en medio MDM suplementado con 10% FCS o con 40% de suero humano normal. Los sinoviocitos fueron obtenidos de P.Goossens, Departamento de Reumatología, Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC), Leiden, Holanda.

Virus

Se utilizó el vector adenovírico recombinante AdMLPvp3 para expresión vírica de apoptina (Pietersen y otros, 1.999). El vector AdMLPvp3 contiene el amplificador E1A enlazado al Promotor Principal Tardío ("Major Late") (MLP) de adenovirus para activar el gen de apoptina, que comprende la región derivada de virus de anemia de pollos (CAV) (posiciones nt 427-868; Noteborn y otros, 1.991). Se utilizó AdCMVLacZ adenovírico recombinante como adenovirus de control. El AdCMVLacZ soporta el gen E.coliLacZ para beta-galactosidasa bajo control del amplificador/promotor de Citomegalovirus (Pietersen y otros, 1.999).

Técnicas de virus

Se llevaron a cabo ensayos de placa, tal como se han descrito anteriormente (Graham y Prevec, 1.991). Brevemente, se diluyeron seriadamente materiales de adenovirus en 2 ml de DMEM conteniendo 2% de suero de caballo y se añadieron a PER.C6 casi confluyentes en placas de 6 pocillos. Después de 2 horas de incubación a 370ºC, el medio fue sustituido por medio esencial mínimo F-15 (MEM) que contenía 0,85% de agarosa (Sigma, USA), 20mM HEPES (pH 7,4), 12,3 mM MgCl_{2}, 0,0025% L-glutamina, y 2% de suero de caballo (activado térmicamente a 560ºC durante 30 minutos).

Se llevó a cabo la producción, en pequeña escala, de lotes de adenovirus tal como se describe por Fallaux (1996). De modo breve, se infectaron monocapas casi confluyentes de PER.C6 con aproximadamente 5 unidades formadoras de placas (pfu) por célula, en solución salina con tampón fosfato (PBS) conteniendo 1% de suero de caballo. Después de 1 hora a temperatura ambiente, el inóculo fue sustituido por un medio fresco (DMEM/2% suero de caballo). Después de 48 horas, las células casi completamente liberadas fueron acogidas y reunidas en 1 ml PBS/1% suero de caballo. Se aisló el virus de las células productoras por 3 ciclos de congelación instantánea/descongelación. Los lisados fueron aclarados por centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos, y almacenados a -20ºC.

El PER.C6 producido de los materiales rAdV fue rastreado para averiguar la presencia de adenovirus recombinante-competente, al llevar a cabo análisis PCR con cebadores derivados de la región Ad5 ITR (5'-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3') y la región que codifica E1A (5'-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3') tal como se describe por Noteborn y De Boer (1.995) utilizando un aparato Perkin Elmer PCR. La presencia de un fragmento amplificado de 600 pares de base indica que existe el adenovirus competente de replicación (que contiene la región E1) en el material de virus analizado (Pietersen y otros, 1.999).

Inmunofluorescencia y tinción DAPI

Se llevó a cabo inmunofluorescencia indirecta tal como se describe por Noteborn y otros (1990). Para demostrar la presencia de apoptina y para establecer su localización celular en células infectadas, las células fueron fijadas con 80% de acetona. El ensayo de inmunofluorescencia indirecta fue llevado a cabo por dilución 3 veces del anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) CVI-CAV-111.3 para apoptina y una dilución de 100 veces de mAb LacZ (Boehringer Mannheim, Holanda) para beta-galactosidasa. Se utilizó anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con fluoresceina-isotiocianato (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove PA, USA) como segundo anticuerpo. Se efectuó tinción de ADN nuclear con 1 microgramo por militro de 2,4-diamino-2-fenilindol (DAPI), 2% de 1,4 diazabiciclo[2,2,2]-octano (DABCO) en glicerol/0,1 M TrisHCl pH 8,0 (Telford y otros, 1.992).

Ensayo túnel

Se llevó a cabo marcado de extremo con mella dUTP (TUNEL) mediado por deoxinucleotidil-transferasa terminal (Tdt) con utilización del equipo de detección de muerte celular in situ (Boehringer Mannheim, Alemania). Veinticuatro horas después de la infección se lavaron las células con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehido en PBS (pH 7,4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de permeabilización (0,1% Triton X-100, 0,1% citrato sódico, 2 minutos a 4ºC) las células se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL (conteniendo polímeros nucleótidos marcados por fluoresceína y deoxinucleotidil transferasa terminal) durante una hora a 37ºC. Después de lavado con PBS las células fueron analizadas por microscopio de fluorescencia.

Ensayos de tinción Giemsa y beta-galactosidasa

Para detección del número de células unidas se efectuó tinción de las células con Giemsa. Después de (falsa) infección, las células fueron lavadas dos veces con PBS y se fijaron en metanol: ácido acético (3:1) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Durante 30 minutos las células fueron incubadas en una solución al 3% de Giemsa (Merck, Darmstad, Alemania) en 1 mM Na_{2}HPO_{4}, pH 7,0) a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células fueron lavadas cuatro veces con agua desionizada y se dejaron secar al aire.

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Para detección de la actividad beta-galactosidasa codificada por LacZ se fijaron las células del cultivo de tejidos 24 horas después de la infección en una solución con enfriamiento con hielo de 2% paraformaldehido/0,2% glutaraldehido, se lavaron en PBS con enfriamiento con hielo (conteniendo 2 mM MgCl_{2}) y se incubaron en 3 ml de mezcla de reacción (1 miligramo por mililitro X-gal (Boehringer, Mannheim, Alemania), 5 mM de ferrocianuro potásico, 2mM MgCl_{2} en PBS) a 37ºC durante 4-16 horas (Sanes y otros, 1986).

Resultados y discusión Modelo in vitro para artritis reumatoide autoinmunitaria humana (RA)

Para estudiar posibles efectos terapéuticos de la síntesis de apoptina para pacientes de RA, los inventores han establecido un modelo in vitro para RA. Con este objetivo se aislaron sinoviocitos (FLS) similares a fibroblasto de un paciente OH afectado de RA. Las células fueron cultivadas en un medio "no estimulante" conteniendo suero fetal de vaca o en un medio de tipo llamado "estimulante" que contiene el 40% de suero humano normal. Especialmente el último medio contiene citocinas y otros factores estimulantes que se parecen íntimamente a la situación RA in vivo.

Estos LFS "estimulados" imitan las condiciones RA referentes a otro aspecto muy importante. El crecimiento aberrante de LFS in vivo y in vitro provocará secreción de varios factores celulares que estimulan su propio crecimiento celular y los de otros (por ejemplo, LFS) incluso de modo superior (Firestein, 1995). No obstante, los LFS relativos a RA (cultivo) han sufrido también cambios genéticos intrínsecos que les hace distintos en comparación con células sanas normales.

Los vectores de adenovirus son muy adecuados para expresión de un transgen en LFS relacionado con RA.

En la actualidad el sistema más eficaz para conseguir la transducción de un transgen a la mayor parte de tipos de células, utiliza vectores adenovíricos. Estos vectores tienen varias ventajas que los hacen particularmente adecuados para transferencia de genes in vivo. Los vectores adenovíricos recombinantes pueden ser cultivados a elevadas concentraciones, teniendo la capacidad de transducir células no mitóticas, y de no integrar sus genomas en ADN de las células huésped. Además, se han aplicado ya vectores de adenovirus en pruebas de tipo clínico de terapia por genes.

Los inventores han examinado si un vector de adenovirus recombinante de apoptina puede tener como resultado una transducción eficaz de células RA LFS. Con este objetivo, se infectaron células LFS con el vector deficiente en cuanto a replicación AdLacZ (moi 50), que codifica la proteína beta-galactosidasa. Dos días después de la infección, las células LFS fueron fijadas y analizadas para síntesis de beta-galactosidasa. Aproximadamente, el 40% de las células FLS infectadas fueron positivas en el ensayo de beta-galactosidasa. En comparación con otros tipos de células infectadas con vectores de adenovirus recombinante expresando beta-galactosidasa, este porcentaje de transducción es elevado.

Por lo tanto, los inventores llegaron a la conclusión de que un vector de adenovirus es muy adecuado para producir transgenes en RA FLS. Un ejemplo de un vector de adenovirus adecuado para la expresión de apoptina se muestra en la figura 1.

Infección de RA LFS estimulados por suero con AdMLP-vp3 tiene como resultado un notable nivel de muerte celular.

A continuación, se ha determinado el efecto citotóxico de la síntesis de apoptina en RA LFS. Con este objetivo, las células fueron infectadas con el virus de control negativo AdLacZ, AdMLPvp3 (ambos moi: 50) codificando apoptina o falsamente infectadas. A continuación, las células fueron cultivadas en un medio "no estimulante" o "estimulante". Tres y seis días después de la infección, las células fueron analizadas en cuanto a densidad de células por tinción Giemsa.

Tres días y seis días después de la infección, las células que fueron infectadas con vector de adenovirus recombinante AdLacZ no mostraron reducción significativa en la densidad celular, en comparación con las que habían sido falsamente tratadas. Estos datos fueron observados para las condiciones de medio "no estimulante" al igual que medio "estimulante".

Por otra parte, la densidad celular en los platillos con RA FLS infectados con el vector recombinante AdMLPvp3, no obstante, disminuyó significativamente. Incluso, tres días después de la infección (dos días después de la "estimulación") las células RA FLS "murieron" casi en su totalidad. Los platillos que no fueron estimulados no mostraron reducción significativa de células provocada por infección con AdMLP-vp3. No obstante, seis días después de la infección, la cantidad de células tratadas con AdMLPvp3 se redujo también de manera significativa en comparación con las células falsamente tratadas RA FLS. Los resultados de los experimentos, que muestran el efecto en la densidad celular de los cultivos RA FLS infectados con AdLacZ, AdMLPvp3 o con falso tratamiento a los seis días después de la infección, se muestran en la figura 2.

Estos resultados demuestran que la síntesis de apoptina provoca específicamente muerte celular en células FLS, que son derivadas de un paciente afectado de enfermedad autoinmunitaria RA. La infección de vectores adenovirus como tales, no tiene efecto citotóxico significativo sobre las células RA FLS. La apoptina tiene un efecto negativo moderado en la densidad celular de RA FLS, cuando se cultivan en condiciones "no estimulantes". Estos datos implican que las células RA FLS son distintas de las células sanas normales humanas, tal como ha sido sugerido por Firestein (1995, 1997, 1998) y otros (Breedveld, 1997). Esta diferencia parece haber sido "reconocida" por la apoptina.

El hecho de que la apoptina tiene un efecto de exterminación de células más potente cuando las células RA FLS son estimuladas por suero, indica que la apoptina resulta más activada cuando las células FLS empiezan a segregar varios factores, tales como citocinas, quimiocinas, etc., todas las cuales tienen un efecto aumentativo en la proliferación celular (Firestein, 1997) lo que conduce a una situación de tipo más transformado.

Los resultados son incluso más interesantes cuando se tiene en cuenta que la infección AdMLP-vp3 provoca producción de apoptina aproximadamente en 30-40% de las células FLS derivadas de RA (determinado por análisis de inmunofluorescencia en cultivos de FLS infectados en paralelo), mientras que casi todas las células FLS resultan exterminadas. No solamente las células FLS positivas de apoptina, sino también las células negativas de apoptina son exterminadas. Este resultado indica que el tratamiento AdMLPvp3 tiene efecto "espectador". Muy probablemente, una fuerte reducción de factores estimuladores de crecimiento y/o de prevención de apoptosis debido a la apoptosis invertida por apoptina provocará asimismo la muerte de las células negativas de apoptina.

Los inventores han llegado a la conclusión de que la apoptina puede inducir muerte celular en células RA FLS, lo que queda incluso incrementado por factores exógenos y endógenos. Estas características implican que la apoptina será un agente terapéutico para la curación de RA y otras enfermedades autoinmunitarias.

El análisis TUNEL demuestra que la síntesis de apoptina mediada por AdMLP induce apoptosis en RA LFS.

Para caracterizar la naturaleza de la muerte celular inducida por AdMLPvp3, los inventores han visualizado la presencia de roturas de las hebras de ADN con ayuda del encima terminal deoxinucleotidil transferasa y dUTP marcado con Fitc (ensayo TUNEL), las células RA FLS fueron infectadas con AdMLP-vp3 o con AdLacZ y después de 24 horas de haber estimulado las células con 40% de suero humano. Un día más tarde, las células fueron cosechadas y sometidas a tinción para el transgénico para confirmar similitud en eficacias de transducción y platillos infectados en paralelo fueron sometidos al ensayo TUNEL. Aunque el 40% de las células RA FLS expresaban beta- galactosidasa, solo ocasionalmente una célula única mostró roturas de ADN que pudieron ser detectadas por el ensayo TUNEL. Como contraste, la frecuencia de células TUNEL positivas después de infección por AdMLPvp3 apareció encontrarse en la misma gama o alcance que la frecuencia de las células positivas por apoptina después de la infección.

Por lo tanto, los inventores llegaron a la conclusión de que la apoptina puede inducir apoptosis en células, que han perdido o han reducido su propio potencial para sufrir apoptosis. El hecho de que la apoptina puede inducir apoptosis en estas células RA FLS, indica que el tratamiento de apoptina in vivo provocará un nivel muy bajo de efectos secundarios tales como reacciones inflamatorias.

Localización nuclear de apoptina en RA LFS estimulada por suero humano

Para examinar la localización celular de apoptina en células de FLS derivadas RA "estimuladas", las células fueron infectadas con AdMLPvp3 durante 1 día, sometidas a estimulación por suero durante otro día adicional y analizadas por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal específico de apoptina y tinción DAPI. Casi todas las células positivas de apoptina contenían apoptina en el núcleo celular. Un elevado número de células positivas de apoptina contenían ya estructuras brillantes aberrantes DAPI que indican condiciones apoptóticas muy tardías; es decir, cromatina/ADN condensada. Estos resultados demuestran nuevamente que la síntesis de apoptina resulta en la inducción de apoptosis en células de RA FLS.

Hasta el momento, todas las células sensibles por apoptina para condiciones celulares mostraron una localización nuclear de apoptina (Noteborn y otros, 1998b). Los datos que se han presentado demuestran que la actividad de apoptina en células RA FLS está también correlacionada con su localización nuclear.

La infección de células LFS estimuladas por suero derivada de otros dos pacientes EA con AdMLP-vp3 tiene como resultado un nivel notable de muerte celular.

Para examinar si la síntesis de apoptina tiene como resultado la inducción de apoptosis en diferentes pacientes RA, se han extraído también células FLS relativas a RA de pacientes de RA, indicados con las siglas "E" y "Lo". Las células FLS relacionadas con RA derivadas de dichos pacientes RA han sido obtenidas por el Departamento de Reumatología, Centro médico de la universidad de Leiden, Leiden, Holanda.

Con este objetivo las células LFS de los pacientes "E" y "Lo" se infectaron con AdMLPvp3 codificando apoptina, codificando el virus de control negativo AdLacZ la proteína no apoptótica beta-galactosidasa (ambas moi: 50) o falsamente infectadas. A continuación, las células fueron cultivadas en medios "no estimulante" o "estimulante". Tres días después de la infección (dos días después de la estimulación de suero), las células fueron analizadas en cuanto a densidad celular por tinción DAPI (Noteborn y otros, 1998b). Las células "no estimuladas", así como las células "estimuladas" que fueron infectadas con adenovirus recombinante AdLacZ, no muestran una reducción significativa en densidad celular, en comparación con las tratadas de modo ficticio.

Como contraste, la densidad celular en los platillos con células RA FLS derivadas de ambos pacientes "E" y "Lo" que fueron infectados con el vector recombinante AdMLPvp3 era significativamente menor. Los platillos tratados con AdMLPvp3 que no fueron estimulados, tenían una menor densidad que aquellos infectados con AdLacZ o tratados de modo ficticio. Este efecto era incluso más significativo en los casos en los que las células RA FLS habían sido "estimuladas" con 40% de suero humano normal.

Los resultados obtenidos de estos experimentos y el basado en células RA FLS derivadas de paciente OH, demuestran que la síntesis de apoptina provoca específicamente muerte celular en células FLS, que son derivadas de varios pacientes que están afectados de RA autoinmunitaria.

La infección de vectores de adenovirus, como tales, no tiene efecto negativo significativo en la densidad de células de RA FLS. Estas características apoyan la afirmación anteriormente descrita de que la apoptina es un agente terapéutico para la curación de RA y otras enfermedades inmunitarias.

Construcción del vector de adenovirus AdApt-Apoptina

El vector de adenovirus AdMLP-vp3 regula la expresión del gen apoptina bajo el control del promotor principal final ("major late") de adenovirus (MLP). El nuevo vector adenovírico AdApt contiene el promotor de citomegalovirus (CMV), que ha sido también adaptado de forma óptima a la línea celular helper PER.C6.

Para examinar si es posible producir apoptina por medio de un vector adenovirus bajo la regulación de CMV, los inventores han construido AdApt-Apoptina.

Con este objetivo, el fragmento BamHI del plásmido pCMV-vp3 (Noteborn, 1996) conteniendo las secuencias que codifican apoptina (Noteborn y otros, 1991) fue clonado en el lugar BamHI del vector de transferencia de 6,1-kb AdApt, que había sido obtenido de IntroGene, Leiden, Holanda. Por análisis de secuencia y digestiones de restricción de encima se determinaron la orientación correcta del gen apoptina bajo la regulación de CMV. Este vector de transferencia ha sido indicado pAdApt-Apoptina. Como vector de transferencia de adenovirus de control negativo se seleccionaron los plásmidos que contienen el gen de apoptina en la orientación desfavorable opuesta al promotor CMV y que se indica AdApt-AS.

A continuación, se generaron vectores de adenovirus recombinante expresando el gen apoptina bajo la regulación del promotor CMV. Además, también se realizó un control de adenovirus conteniendo el gen apoptina en orientación opuesta con respecto al promotor CMV. Con este objetivo, se cotransfectaron células PER.C6 (IntroGen, Leiden, Holanda) con el plásmido del vector adenovirus pAd5AlfII-ITR (E1-, E3+) y con los plásmidos de transferencia pAdApt-Apoptina o pAdApt-AS. Después de la observación de los efectos citopatogénicos de las células PER.C6 transfectadas, el medio que contenía los vectores recombinantes de adenovirus fueron recogidos y purificados por placas (Noteborn y Pietersen, 1998). Los diferentes lotes de adenovirus recombinante purificados por placas de AdApt-Apoptina codificando la Apoptina y el vector de control AdApt-AS fueron examinados por análisis PCR en cuanto a la presencia del gen Apoptina en la orientación "correcta" con respecto a la "errónea", respectivamente, (Pietersen y otros, 1999). Todos los lotes de adenovirus recombinante analizados (en total para cada tipo de vector, como mínimo, 10) contenían el gen de apoptina esperado. El análisis RCA por medio de PCR (Pietersen y otros 1999) reveló que en ninguno de los lotes analizados se había generado adenovirus competente de replicación. Finalmente, la producción de la proteína de apoptina por células humanas HepG2 infectadas por AdApt fue examinada por medio de inmunofluorescencia indirecta, utilizando el anticuerpo monoclonado 111.3, (Noteborn y Pietersen, 1998). Casi todas las células producían proteína Apoptina y pasaron a ser apoptóticas muy poco tiempo después de la infección. Este descubrimiento es indicativo del hecho de que la apoptina producida es completamente activa como inductor apoptótico. Tal como se podía esperar, todas las células infectadas con AdApt-AS no mostraron tinción para el anticuerpo monoclonal y no resultaron apoptóticas. Como conclusión, el hecho de que los inventores fueran capaces de producir apoptina por medio de varios vectores de adenovirus recombinante bajo la regulación del MLP del adenovirus o el promotor de CMV, indica que la apoptina puede ser producida en cualquier vector adenoviral sin limitación de la producción del vector del virus.

La infección de células RA FLS "estimuladas por suero", derivadas del paciente de RA "E", con AdApt Apoptina resultó en una inducción significativa de muerte celular tal como se ha descrito anteriormente para el vector de adenovirus recombinante AdMLP-vp3. Por lo tanto, se puede llegar a la conclusión de que además del vector de adenovirus recombinante AdMLP-vp3 también otro vector de adenovirus que expresa el gen de apoptina tal como adenovirus recombinante AdApt-Apoptina puede ser utilizado como vector de adenovirus como base para terapia contra enfermedades autoinmunes tales como RA.

Ensayo diagnóstico para células con enfermedad autoinmunitaria basado en rAd-apoptina

Un marcador para células relacionadas con enfermedades autoinmunes es la respuesta a apoptosis inducida por apoptina. Especialmente, después de la estimulación de estas células con factores relacionados a enfermedades autoinmunes, tales como, determinadas citocinas y factores de crecimiento, tiene como resultado la muerte celular programada inducida por síntesis de apoptina. Además, otro marcador es la localización celular de la apoptina, que es distinto para células sensibles a la apoptina con respecto a enfermedad autoinmune en comparación con células sanas normales.

Al infectar células con un vehículo que expresa apoptina, tal como, adenovirus recombinante que regula la síntesis de apoptina, y analizando la localización celular de apoptina y/o la inducción de apoptosis dentro de estas células, el investigador es capaz de demostrar si una célula se deriva de un paciente que sufre de una enfermedad autoinmune o no. En especial, después de la estimulación por suero la localización de la apoptina nuclear y la inducción de apoptosis aumentarán significativamente.

Por ejemplo, las células son infectadas con un adenovirus que expresa apoptina y en paralelo con un adenovirus de control, tal como AdLacZ. Las células serán sometidas a comprobación para apoptina en el citoplasma o en el núcleo (células relacionadas con autoinmunidad) por medio, por ejemplo, de un ensayo de inmunofluorescencia basado en anticuerpos monoclonales específicos para la apoptina, tal como 111.3 (Danen-Van Oorschot y otros, 1998). Además, o de manera alternativa se estimará el porcentaje de células apoptóticas.

Si el porcentaje de células apoptóticas es significativamente más elevado para células que sinteticen apoptina en comparación con células que contienen una proteína de control exógena, tales como beta-galactosidasa, estas células se derivan de pacientes que sufren una enfermedad autoinmune.

Ensayo diagnóstico para la identificación de factores que provocan enfermedades autoinmunes

Además de los cambios intrínsecos de células de enfermedades autoinmunes, la secreción de varios factores por estas células y muy probablemente por otras células (inmunes) incrementará la severidad de la enfermedad autoinmune, tal como RA.

Por lo tanto, el ensayo de diagnóstico antes descrito para la identificación de células relacionadas con enfermedades autoinmunes, puede ser utilizado también para la identificación de factores, que provocarán y/o mejorarán la "agresividad" de células que provocan signos clínicos de RA u otras enfermedades autoinmunes.

Después del tratamiento con dicho factor, células tales como sinoviocitos similares a fibroblastos humanos (RA), sufrirán extensa apoptosis inducida por apoptina y/o contendrán apoptina en sus núcleos.

La apoptosis inducida por apoptina es indicativa de condiciones de transformación dentro de células relacionadas con enfermedades autoinmunes.

El hecho de que la apoptina pueda inducir apoptosis en células RA FLS ("estimuladas"), indica que estas células se encuentran en condiciones transformadas. Hasta el momento, la apoptina se había demostrado que no induce apoptosis en células normales no transformadas, que eran de origen humano o de otros mamíferos (Danen-Van Oorschot y otros, 1997, Noteborn y otros, 1998b, Zhang y otros, 1999). Estos datos quedan soportados por el hecho de que ratones transgénicos; que expresan apoptina en varios de sus tejidos, tienen aspecto normal. Ninguno de esos órganos parece sufrir apoptosis incrementada, debido a síntesis de apoptina en sus células (Noteborn y Erkeland, resultados no publicados).

La inducción por UV de procesos aberrantes relacionados con estrés en células normales no transformadas, derivadas de individuos con síndromes con tendencia de cáncer, posibilita, no obstante, que la apoptina induzca apoptosis en estas células (Zhang y otros, 1999) durante un período transitorio. La apoptina no induce apoptosis en células tratadas por UV de individuos sanos. La apoptina puede inducir apoptosis de manera bastante moderada, en células RA FLS. Por ejemplo, la estimulación por suero de células RA FLS incrementa el nivel de apoptosis inducida por apoptina, por ejemplo, en células RA FLS. Parece que estas células RA FLS son ya distintas de células normales sanas, pero resultan incluso más aberrantes (transformadas) después de la "estimulación". Estas características se parecen a las descritas para células tratadas por UV derivadas de individuos con tendencia a cáncer (Zhang y otros, 1999). En ambos casos, se ha cambiado un proceso celular, que bajo condiciones "normales" puede ser controlado por la célula, pero que bajo estímulos específicos resultará en procesos celulares aberrantes que conducen al desarrollo acelerado de cáncer o de enfermedades autoinmunes.

La FLS reumatoide aparece frecuentemente y se comporta igual que fibroblastos normales, lo que ha conducido a la idea de que puede responder a su medio ambiente, en vez de actuar como agresores independientes (transformados). No obstante, se ha producido pruebas fragmentarias de que también muestren características de células transformadas. Por ejemplo, la adherencia a matriz plástica o extracelular se requiere de modo general para que los fibroblastos normales proliferen y sobrevivan en cultivos durante periodos de tiempo prolongados. No obstante, las células transformadas pueden crecer en suspensión en un medio semisólido sin contacto con una superficie sólida. Si bien, las células FLS crecen típicamente y progresan en condiciones que permiten adherencia, pueden proliferar en algunos casos de modo independiente al anclaje (Lafyatis y otros, 1989). Además, la expresión de varios oncógenos tales como c-myc ha sido indicada para células FLS cultivadas (Gay and Gay, 1989). También se han descrito para FLS liberación endógena más elevada de factores de crecimiento, tales como factor beta de crecimiento tumoral y otras citocinas (Bucala y otros, 1991; Remmers y otros, 1990; Geiler, 1994; Firestein, 1995 y 1995a). Asimismo, en algunos casos que el supresor tumoral no funcional p53 ha sido relacionado con RA (Aupperle y otros, 1998). Si bien el p53 mutante no es un oncógeno, impide la inducción de apoptosis por agentes endógenos o exógenos distintos a la apoptina.

\newpage

Todos estos datos indican que las células FLS son alteradas de modo irreversible en RA y que un proceso autónomo permite que permanezcan activadas incluso después de su retirada de un medio inflamatorio articular (Firestein, 1995). Los inventores han demostrado que la apoptina puede reconocer estas condiciones autoinmunes parecidas a transformación, que posibilita la identificación de los factores celulares importantes en dichas enfermedades.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la representación esquemática de las partes esenciales del adenovirus recombinante AdMLP-vp3, que contiene la apoptina que codifica el gen, bajo la regulación del promotor principal tardío ("major late") adenovírico.

La figura 2 muestra la representación esquemática del efecto citotóxico inducido para apoptino en sinoviocitos (FLS) parecidos a fibroblastos de cultivo derivados del fluido sinovial de un paciente que sufre de artritis reumatoide. Se cultivaron 1,5 x 10^{4} células en platos de 24 pocillos durante 24 horas, infectadas con adenovirus recombinante AdLacZ expresando beta-galactosidasa (LacZ), con apoptina (Apoptina) codificando AdMLP-vp3 o por infección simulada (NON). Las células FLS fueron cultivadas en condiciones normales (NST) o 1 día después de la infección, estimulados con 40% de suero humano normal (ST) induciendo FLS de crecimiento más agresivo que se parece a la situación RA in vitro. Finalmente, seis días después de la infección con virus adenovirus de infección simulada, las monocapas celulares fueron fijadas y tintadas con solución GIEMSA. (+: representa la cantidad de células

\hbox{vivas/fijadas; -:}

significa ninguna célula superviviente/fijada. Referencias

1. Arends, M.J., and Wyllie, A.H.1991. Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. International Review of Experimental Pathology 32, 223-254.

2. Aupperle, K.R., Boyle, D.L., Hendrix, M., Seftor, E.A., Zvaifler, N.J., Barbosa, M., and Firestein, G.S. Regulation of synoviocyte proliferation, apoptosis, and invasion by the p53 tumor-suppressor gene. (1998). American J. Pathology 152, 1091-1098.

3. Bischoff, J.R., Kirn, D.H., Williams, A., Heise, C., Horn, S., Muna, M., Ng, L., Nye, J., Sampson-Johannes, A., Fatteay, A., and McCormick. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. (1996). Science 274, 373-376.

4. Breedveld, F. New insights in the pathogenesis of Rheumatoid arthritis. (1998). The J. of Rheumatology 25, 3-7.

5. Bucala, R., Ritchlin, C., Winchester, R., Cerami, A. Constitutive production of inflammatory and mitogenic cytokines by rheumatoid synovial fibroblasts. (1991). J. Experimental Medicine 173, 569-574.

6. Conway, J.G., Wakefield, J.A., Brown, R.H., Marron, B.E., Sekut, L., Stimpson, S.A., McElroy, A., Menius, J.A., Jeffreys, J.J., Clark, R.L., McGeehan, G.M., and Conolly, K.M. Inhibition of cartilage and bone destruction in adjuvant arthritis in the rat by a matrix metalloproteinase inhibitor. (1995). J. Experimental Medicine 182, 449-457.

7. Danen-Van Oorschot A.A.A.M., Den Hollander, A., Takayama, S., Reed, J.C., Van der Eb, A.J., and Noteborn, M.H.M. Bag-1 inhibits p53-induced apoptosis but not apoptin-induced apoptosis. (1997). Apoptosis 2, 395-402.

8. Danen-Van Oorschot A.A.A.M., Fischer D., Grimbergen J.M., Klein B., Zhuang S.-M., Falkenburg J.H.F., Backendorf C., Quax P.H.A., Van der Eb A.J., Noteborn M.H.M. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. (1997a). Proceedings National Academy Sciences, USA 94: 5843-5847.

9. Danen-Van Oorschot, A.A.A.M., Van der Eb, A.J., and Noteborn, M.H.M. Apoptin-induced apoptosis: antitumor potential? (1998). In: Proceedings of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences Pharmaceutical Intervention in apoptotic pathways, pp 199-212.

10. Gay, S. and Gay, R.E. Cellular basis and oncogen expression of rheumatoid joint destruction. (1989). Rheumatology International 9, 105-113.

11. Geiler, T., Kriegsmann, J., Keyzer, G.M., Gay, R.E., Gay, S. A new model for rheumatoid arthritis generated by engraftment of rheumatoid synovial tissue and normal human cartillage into SCID mice. (1994). Arthritis Rheumatology 37, 1664-1671.

12. Fallaux, F. (1996). Gene Therapy for haemophilia A: Towards the use of adenoviral vectors? PhD Thesis, Leiden University, The Netherlands.

13. Firestein, G.S. Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. (1995). Arthritis and Rheumatism 39, 1781-1790.

14. Firestein, G.S. Apoptosis in rheumatoid arthritis synovium. (1995a). J. Clinical Investigations 96, 1631-1638.

15. Firestein, G.S. Rheumatoid arthritis: Etiology and Pathogenesis of Rheumatoid arthritis. (1997). Textbook of Rheumatology, 5th edition. Eds. Kelley, Harris, Ruddy and Sledge. Chapter 54, pp 851-897.

16. Firestein, G.S., Novel therapeutic strategies involving animals, arthritis, and apoptosis. (1998). Current opinion in Rheumatology 10, 236-241.

17. Graham, F.L., and Prevec, L. (1991). Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols. E.J. Murray, ed. The Humana Press, Clifton, N.J., USA, pp 109-128.

18. Lafyatis, R., Remmers, E.F., Roberts, A.B., Yocum, D.E., Sporn, M.B., and Wilder, R.L. Anchorage-independent growth of synoviocytes from arthritic and normal joints: stimulation by exogenous platelet-derived growth factor and inhibition of by transforming growth factor beta and retinoids. (1989). J. Clinical Investigations 83, 1267-1276.

19. Liblau, R.S., Singer, S.M., McDevitt, H.O. Th1 and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases. (1995). Immunol Today 16, 34-38.

20. Lopez-Guerro, J.A., Rayet, B., Tuynder, M., Rommelaere, J., and Dinsart, C. (1997). Constitutive activation of U937 promonocytic cell clones selected for their resistance to parvovirus H-1 infection. Blood 89, 1642-1653.

21. Mountz, J.D., Wu, J., Cheng, J., Zhou, T. Autoimmune disease: a problem of defective apoptosis. (1994). Arthritis and Rheumatism 37, 1415-1420.

22. Noguiez-Hellin, P., Robert-LeMeur, M., Salzmann, J.L., and Klatzmann, D. (1996). Plasmoviruses: nonviral/viral vectors for gene therapy. Proceedings National Academy Sciences USA 93, 4175-4180.

23. Noteborn, M.H.M. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of a anti-humor therapy. 1996. PCT application WO 96/41191.

24. Noteborn, M.H.M. and De Boer, G.F. (1995). Patent USA/no US 030, 335.

25. Noteborn, M.H.M., Danen-van Oorschot, A.A.A.M., and van der Eb, A.J. Chicken Anemia Virus: Induction of apoptosis by a single protein of a single-stranded DNA virus (1998). Seminars in Virology 8, 497-504.

26. Noteborn, M.H.M., Danen-Van Oorschot, A.A.A.M., and Van der Eb, A.J. The Apoptin® gene of chicken anemia virus in the induction of apoptosis in human tumorigenic cells and in gene therapy of cancer. (1998a). Gene Ther. Mol. Biol. Vol. 1, 399-406.

27. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Kant, A., Koch, G., Bos, J., Zantema, A., and Van der Eb, A.J. Expression of avian leukemia virus env-gp85 in Spodoptera frugiperda cells using a baculovirus expression vector. (1990). J. General Virology 71, 2641- 2648.

28. Noteborn M.H.M., De Boer G.F., Van Roozelaar D.J., Karreman C., Kranenburg O., Vos J.G., Jeurissen S.H.M., Hoeben R.C., Zantema A., Koch G., Van Ormondt H., Van der Eb A.J. Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. (1991) J Virology 65, 3131-3139.

29. Noteborn, M.H.M., Koch, G., Chicken anaemia virus infection: molecular basis of pathogenicity. Avian Pathol. 24 (1995), 11-31.

30. Noteborn, M.H.M. and Pietersen, A.M. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin. 1998. PCT application no PCT/NL98/00213

31. Noteborn, M.H.M., Todd D., Verschueren C.A.J., De Gauw H.W.F.M., Curran W.L., Veldkamp S., Douglas A.J., McNulty M.S., Van der Eb A.J., Koch G. A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. (1994). J. Virology 68, 346-351. Noteborn, M.H.M. and Van der Eb, A.J. Apoptin induced apoptosis: potential for antitumor therapy. (1998). Drug Resistance Updates 1, 99-103.

Noteborn, M.H.M., Zhang, Y.-H. Methods and means for determining the transforming capability of agents, for determining the predisposition of cells to become transformed and prophylactic treatment of cancer using apoptin-like activity. (1998). PCT application no PCT/NL/98/0725.

34. Noteborn, M.H.M., Zhang, Y.-H., and Van der Eb, A.J. (1998b). Apoptin specifically causes apoptosis in tumor cells and after UV-treatment in untransformed cells from cancer-prone individuals: A review, Mutation Research 400, 447-455.

35. Pietersen, A.M., Van der Eb, M.M., Rademaker, H.J., Van der Wollenberg, D.J.M., Rabelink, M.J.W.E., Kuppen, P.J.K., Van Dierendonck, J.H., Van Ormondt, H., Masman, D., Van de Velde, C.J.H., Van der Eb, A.J., Hoeben, R.C., and Noteborn, M.H.M. Specific tumor-cell killing with adenovirus vectors containing the Apoptin gene (1999). Gene Therapy, in press.

36. Remmers, E.F., Lafyatis, R., Kumkumian, G.K., Case, J.P., Roberts, A.B., Sporn, M.B., and Wilder, R.L. Cytokines and growth regulation of synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis and rats with streptococcal cell wall arthritis. (1990). Growth Factors 2, 179-188.

37. Sanes, J.R., Rubenstein, J.L., Nicolas, J.F. Use of 5 a recombinant retrovirus to study post-implementation cell lineage in mouse embryos. (1986). EMBO J. 5, 3133-3142.

38. Sharp, J.T., Wolfe, F., Mitchell, D.M., and Bloch, D.A. The progression of erosions and joint space narrowing scores in theumatoid arthritis during the first twenty-five years of disease. (1991). Arthritis and rheumatism 34, 660-668.

39. Telford, W.G., King, L.E., Fraker, P.J. Comparative evaluation of several DNA-binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry. (1992). Cytometry 13, 137-143.

40. Van der Heyde, D.M., Van Leeuwen, M.A., Van Riel, P.L., Koster, A.M., Van't Hof, M.A., Van Rijswijk, M.H., and Van der Putte, L.B. Biannual radiographic assessments of hands and feet in a three-year prospective following patients with early rheumatoid arthritis. (1992). Arthritis and Rheumatism 35, 26-34.

41. Van Zeben, D. Hazes, J.M., Zwinderman, A.H., Vandenbroucke, J.P., and Breedveld, F.C. The severity of rheumatoid arthritis: a 6-year follow-up study of younger women with symptoms of recent onset. (1994). J. Rheumatology 21, 1620-1625.

42. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.R., Currie, A.R. (1980). Cell death: The significance of apoptosis. International Review of Cytology 68, 251-306.

43. Wolfe, F. 50 years of antirheumatic therapy: the prognosis of rheumatoid arthritis. (1990). J. Rheumatology 17 (suppl 22), 24-32.

44. Zhang, Y., Abrahams, P., van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1999). Viral Protein Apoptin induces apoptosis in UV-C irradiated cells from individuals with various hereditary cancer-prone syndromes. In press.

45. Zhuang S.-M., Landegent J.E., Verschueren C.A.J., Falkenburg J.H.F., Van Ormondt H., Van der Eb A.J., Noteborn M.H.M. Apoptin, a protein encoded by chicken anemia virus, induces cell death in various human hematologic malignant cells in vitro. (1995). Leukemia 9 S1, 118-120.

46. Zhuang S.-M., Shvarts A., Jochemsen A.-G., Van Oorschot A.A.A.M., Van der Eb A.J., Noteborn M.H.M. Differential sensitivity to Ad5 E1B-21kD and Bcl-2 proteins of apoptin-induced versus p53-induced apoptosis. (1995a). Carcinogenesis 16: 2939-2945.

47. Zhuang S.-M., Shvarts A., Van Ormondt H., Jochemsen A.-G., Van der Eb A.J., Noteborn M.H.M. Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus, induces a p53-independent apoptosis in human osteosarcoma cells. (1995b). Cancer Research 55, 486-489.

Claims (16)

1. Utilización de un agente inductor de apoptosis, que muestra su efecto en células aberrantes involucradas o relacionadas con enfermedades autoinmunitarias, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inflamatorios, en la que dicho agente inductor de apoptosis es la proteína inductora de apoptosis apoptina u otras proteínas con actividad similar a la apoptina.

2. Utilización de un agente inductor de apoptosis, que muestra su efecto en células aberrantes involucradas con enfermedades autoinmunes o relacionadas con las mismas, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunes, en la que dicho agente inductor de apoptosis es la proteína inductora de apoptosis apoptina u otras proteínas con actividad similar a la apoptina.

3. Utilización de un agente inductor de apoptosis, según la reivindicación 2, en el que dicho tratamiento de enfermedades inmunes es tratamiento de enfermedades autoinmunes.

4. Utilización de un vehículo de suministro de genes que comprende un gen capaz de expresar un agente inductor de apoptosis, que muestra su efecto en células aberrantes involucradas con enfermedades autoinmunes o relacionadas con las mismas, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inflamatorios, en la que dicho agente inductor de apoptosis es la proteína inductora de apoptosis apoptina u otras proteínas con actividad similar a la apoptina.

5. Utilización de un vehículo de suministro de genes que comprende un gen capaz de expresar un agente inductor de apoptosis, que muestra su efecto en células aberrantes involucradas con enfermedades autoinmunes o relacionadas con las mismas, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunes, en la que dicho agente inductor de apoptosis es la proteína inductora de apoptosis apoptina u otras proteínas con actividad similar a la apoptina.

6. Utilización de un vehículo para suministro de genes, según la reivindicación 5, en el que dicho tratamiento de enfermedades inmunes es el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

7. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que dicho vehículo de suministro de genes comprende además un gen suicida.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que dicho gen suicida es inducible.

9. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en la que dicho vehículo de suministro de genes tiene tropismo para células hematopoiéticas.

10. Utilización, según las reivindicaciones 4-8, en la que dicho vehículo de suministro de genes tiene tropismo para sinoviocitos similares a fibroblastos.

11. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, en la que dicho vehículo de suministro de genes ha sido dotado de medios de direccionado, especialmente medios de direccionado para sinoviocitos similares a fibroblastos.

12. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 4-11, en la que dicho vehículo de suministro de genes comprende un adenovirus recombinante.

13. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente inductor de apoptosis comprende apoptina o un fragmento funcional derivado o equivalente del mismo.

14. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho agente inductor de apoptosis es inducible.

15. Método para determinar la presencia de células que resultarán probablemente en una enfermedad autoinmune en una muestra, que comprende el proporcionar a las células sospechosas una proteína que tiene actividad parecida a la apoptina, y sometiendo dichas células a estrés, tal como choque térmico, choque osmótico, UV o estrés químico y determinando apoptosis, de manera que dicha proteína que tiene actividad similar a la apoptina está constituida por una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína que tiene actividad parecida a la apoptina.

16. Método para determinar la presencia de enfermedades autoinmunes en un individuo, que comprende la disposición de una muestra de dicho individuo, comprendiendo dicha muestra células implicadas en dicha enfermedad autoinmune, proporcionando dichas células una proteína que tiene actividad parecida a la apoptina y determinar la apoptosis, de manera que dicha proteína que tiene actividad parecida a la apoptina está constituida por una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína que tiene actividad similar a la apoptina.