ES2224065T3 - Utilizacion de inhibidores de ikk-beta y procedimiento de localizacion de los indicados inhibidores. - Google Patents
Utilizacion de inhibidores de ikk-beta y procedimiento de localizacion de los indicados inhibidores.Info
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Abstract
Procedimiento de screening (selección primaria) para localizar inhibidores de IKK-beta en células endoteliales comprendiendo el procedimiento la compactación de un inhibidor potencial con células endoteliales activadas y una determinación de la secreción de la MCP-1 de las células endoteliales.
Description
Utilización de inhibidores de
IKK-\beta y procedimiento de localización de los
indicados inhibidores.
La presente invención se refiere a una nueva
aplicación de inhibidores especiales para la preparación de
medicamentos destinados a la prevención y al tratamiento de la
arteriosclerosis, así como a un procedimiento de screening
(selección primaria) especial para la localización de nuevos
inhibidores.
Es sabido que la arteriosclerosis es una
consecuencia de lesiones del endotelio vascular, que se ve
favorecida por hipertonía, formación de nódulos locales o falta de
oxigeno. Se supone que debido a las estructuras subendioteliales de
la pared vascular, que han quedado al descubierto debido a las
lesiones, se adhieren a los puntos dañados del endotelio plaquetas
circulantes (adherencia de plaquetas) y que a continuación forman
grumos entre si (agregación de plaquetas).
Debido a la interacción de las plaquetas con las
células endoteliales se forman multitud de procesos secundarios, que
dan lugar a una acumulación de lípidos en la pared vascular. Con la
acumulación de lípidos en la pared vascular comienza la formación de
las llamadas placas ateroescleróticas. En las placas se enriquecen
células esponjosas, que se forman a partir de macrófagos que han
inmigrado. Las células esponjosas absorben los lípidos acumulados y
los descomponen. Mientras que algunas lipoproteínas se pueden
descomponer de forma sencilla, en cambio la colesterina y el éster
de colesterina se mantienen prácticamente sin descomponer. Por lo
tanto las células esponjosas se sobrecargan de colesterina y éster
de colesterina.
Como consecuencia de las placas ateroescleróticas
pueden llegar a producirse necrosis centrales, en cuyas proximidades
se depositan sales calizas. En las fases avanzadas se pueden rasgar
las placas de manera que se forman lesiones ateroescleróticas, que a
continuación son recubiertas por un trombo. El engrosamiento de la
pared arterial y la formación de trombos superficiales pueden
estrechar el lumen vascular hasta llegar a cerrarlo por completo.
Los trombos que se desprenden de las arterias grandes provocan la
obstrucción de los vasos menores en la periferia del cuerpo. Las
alteraciones del riego sanguíneo arterial, que son debidas en la
mayoría de los casos a procesos ateroescleróticos, constituyen, en
un porcentaje de aproximadamente un 50%, la causa de muerte más
frecuente en los llamados países industrializados.
Los mecanismos moleculares de la aterogénesis
apenas se conocen, en particular los procesos que determinan la
quemotaxis de los monocitos y la transmigración de monocitos. Sin
embargo, es sabido que en los procesos de inflamación de la pared
arterial aparece citoquina MCP-1 (Monocyte
Chemoattractant Protein-1) y atrae monocitos al
lugar de la inflamación. También es sabido que la
MCP-1 se puede exprimir en células endoteliales. La
expresión y secreción de la MCP-1 se controla por
medio de cascadas de señales complejas. Los detalles de la expresión
y secreción de la MCP-1 en células endoteliales en
fases tempranas de aterogénesis no se conocen por el estado de la
técnica. En particular no se conocen proteínas de destino
relacionadas con la arteriosclerosis, influyendo sobre las cuales se
pudiera influir en la aparición y desarrollo precoz de la
enfermedad.
El impedimento o reducción de la atracción e
inmigración de monocitos en la pared vascular dentro del marco de
los procesos ateroescleróticos puede ralentizar el enriquecimiento
de células esponjosas en placas ateroescleróticas, y por lo tanto
sería adecuado para frenar o evitar los procesos
ateroescleróticos.
El objetivo de la invención es el de facilitar un
nuevo procedimiento mediante el cual se pueda evitar o tratar la
ateroesclerosis.
También es un objetivo de la presente invención
el de facilitar un procedimiento de screening (selección
primaria) para la localización de nuevas substancias activas
mediante las cuales se pueda evitar o tratar la ateroesclerosis.
Estos objetivos se resuelven de acuerdo con las
reivindicaciones. La presente invención está basada en el
conocimiento de que una expresión de la MCP-1 en
células endoteliales no presupone una agregación de plaquetas sobre
el endotelio vascular. Más bien las plaquetas activadas inducen ya
en una fase de aterogenesis una expresión de la
MCP-1 en células endoteliales, en la cual todavía no
se puede demostrar ninguna agregación de plaquetas. Se ha observado
que las plaquetas activadas, que in vivo simplemente se
adhieren de forma provisional pero firme sin llegar a aglomerarse,
en una monocapa endotelial activada por isquemia, desgranulan y
activan el factor de transcripción NF-\kappaB en
las células endoteliales contiguas. Esta nueva forma de interacción
entre las plaquetas y las células endoteliales activadas, que no
presupone ninguna clase de lesiones reconocibles, se diferencia por
una parte de las interacciones rolling, conocidas según el estado
de la técnica, en las que no se llega a producir una adherencia
firme, y por otra parte de la adherencia firme y formación de grumos
en la agregación de plaquetas, que no es solo transitoria sino
permanente. La activación de NF-\kappaB en las
células endoteliales producida por las plaquetas activadas da lugar
a una secreción de la MCP-1 de las células
endoteliales. Mediante la secreción de la MCP-1 se
atraen monocitos en las fases tempranas de aterogénesis, que pueden
llegar a inmigrar en la pared vascular. Por lo tanto una adherencia
simplemente transitoria de plaquetas activadas conduce a una
secreción de la MCP-1, que es condición para la
formación de las placas en los procesos ateroescleróticos.
La presente invención está basada además en el
conocimiento de que durante la activación de
NF-\kappaB transmitida por las plaquetas activadas
se fosforilizan y con ello queda activada la proteína inhibidora
I\kappaB especial de la
IKK-\beta-quinasa del complejo
IKK. Debido a la activación especial de corta duración debida a las
plaquetas activadas y con la participación de
IKK-\beta se produce una actividad de
fosforilización intensa y persistente de I\kappaB que dura hasta
una hora. Debido a la descomposición de la proteína inhibidora
I\kappaB que tiene lugar al mismo tiempo, se produce una
activación intensa y de larga duración de
NF-\kappaB y la correspondiente secreción de la
MCP-1. Esto resulta sorprendente con vistas al hecho
de que la interacción con las plaquetas tiene lugar solo durante un
tiempo relativamente corto.
El perfil de activación en el tiempo del complejo
IKK durante la activación debida a las plaquetas activadas es
básicamente distinto de las de la activación debida a
IL-1\beta o TNF, que ya son conocidos según el
estado de la técnica como activadores del complejo IKK. Las
plaquetas activadas activan el complejo IKK durante unos 60 minutos,
alcanzándose el nivel máximo de fosforilización al cabo de unos 30
minutos, y apenas se observa una diferencia entre la activación de
IKK-\alpha y IKK-\beta. El TNF
da lugar a una activación extremadamente intensa que dura solo unos
pocos minutos, en particular del complejo IKK, pero que al cabo de
20 minutos ya no se puede demostrar. En cambio
IL-1\beta provoca una activación de muy larga
duración, en particular de IKK-\beta, que persiste
durante unas dos horas. Sin embargo la activación de
IKK-\beta es considerablemente menos intensa que
la activación debida a las plaquetas
activadas.
activadas.
Mediante la activación del complejo IKK con
plaquetas activadas se activa por lo tanto la quinasa
\hbox{IKK- \beta } de forma intensa y de
larga duración, lo que resulta decisivo para la activación de
NF-\kappaB en relación con la secreción de la
MCP-1, y por lo tanto para la formación de placas en
los procesos ateroescleróticos. Este mecanismo no solamente afecta a
un paso decisivo en la regulación de procesos ateroescleróticos
precoces, sino también en la formación, propagación y
desestabilización de las placas.
La invención propone por lo tanto el empleo de un
inhibidor de IKK-\beta para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de o a la prevención de la
ateroesclerosis.
La invención ofrece la ventaja de que durante la
inhibición de IKK-\beta en una fase precoz de
aterogénesis, la capa endotelial todavía no está apantallada por la
agregación de plaquetas o por la formación de trombos superficiales,
de manera que las células endoteliales pueden ser alcanzadas de
forma sencilla y eficaz con inhibidores que influyen en una
expresión de la MCP-1. Esta fase está caracterizada
por unas lesiones endoteliales mínimas, a menudo denominadas
"fatty streaks".
La invención ofrece además la ventaja de que con
la inhibición del IKK-\beta en las células
endoteliales que estén contiguas a placas ateroescleróticas, se
puede evitar el engrosamiento de las placas o se pueden estabilizar
las placas existentes.
La invención ofrece además la ventaja de que se
inhibe una proteína en la cascada de señales de la expresión de
MCP-1, la cual juega un papel principal en la
activación mediante plaquetas activadas, aunque la proteína no es la
proteína NF-\kappaB, cuya influencia directa daría
lugar a efectos secundarios graves, ya que
NF-\kappaB también participa en la expresión de
otras proteínas, como por ejemplo en la expresión de citoquinas,
quemocinas, factores de crecimiento, por ejemplo TNF,
IL-1\beta, IL-8, moléculas de
adhesión, por ejemplo ICAM-1, VCAM-1
y ELAM-1, proteasas, como por ejemplo
MMP-9 y en la molécula protombógena TF. Mediante la
inhibición IKK-\beta se inhibe más bien una
proteína que afecta a una vía de activación
NF-\kappaB eficaz, relacionada especialmente con
procesos ateroescleróticos.
La invención ofrece además la ventaja de que al
evitar una secreción de larga duración de la MCP-1
procedente de células endoteliales, el efecto para evitar la
inmigración de monocitos es incomparablemente superior que al evitar
una secreción de la MCP-1 de corta duración pero más
intensa, tal como sucede en el caso de una inhibición de TNF.
La invención ofrece además la ventaja de que se
puede regular el flujo de monocitos/macrófagos a la pared vascular,
a nivel de la capa endotelial y por lo tanto antes de que los
monocitos/macrófagos hayan penetrado en la pared vascular.
A diferencia de los tratamientos convencionales
de ateroesclerosis, de acuerdo con la invención se puede elegir una
nueva clase de pacientes para una terapia, para quienes las terapias
conocidas resultan ineficaces o para quienes las terapias conocidas
se consideran inaceptables debido a los efectos secundarios.
Una primera subclase especial de pacientes
incluye a aquellos que para evitar un episodio cardiovascular, tal
como apoplejía o infarto cardiaco, son tratados de acuerdo con la
invención, como profilaxis primaria, con un inhibidor de
IKK-\beta, eligiéndose estos pacientes sobre la
base de una evaluación de los factores de riesgo y/o basándose en
un diagnóstico de una fase precoz de ateroesclerosis, pudiendo
asignarse a esta primera subclase especial.
La elección y asignación de pacientes basándose
en la evaluación de los factores de riesgo puede efectuarse sobre la
base de una evaluación de los factores de riesgo conocidos. La
evaluación de los factores de riesgo que se hayan determinado puede
efectuarse de modo subjetivo, basándose en la experiencia general
del médico que realiza el tratamiento, o de modo objetivo, basándose
en procedimientos de evaluación normalizados. Se empleará
preferentemente el procedimiento de evaluación normalizado. En
particular se empleará el sistema de evaluación propuesto por G.
Assmann y cols. (Circulation 2002; 105: 310-315),
basado en el estudio PROCAM. En este sistema de evaluación se
asignan a los siguientes factores de riesgo particulares de un
paciente unos coeficientes normalizados, de cuya suma resulta un
valor que está correlacionado con el riesgo de que aparezca un
episodio cardiovascular agudo en los próximos diez años: edad,
colesterina LDL, colesterina HDL, triglicéridos, fumador/no
fumador, diabetes mellitus, casos de MI en la familia, así como la
tensión arterial sistólica. Los pacientes que tengan un valor que
sea superior o igual a 50 se pueden seleccionar y asignar a esta
subclase.
La elección y asignación de pacientes basándose
en un diagnóstico de una fase precoz de ateroesclerosis puede
efectuarse tomando como base una evaluación de los síntomas
conocidos de existencia de ateroesclerosis. En particular se puede
efectuar la selección basándose en una medición del espesor de pared
intima-máxima de la arteria carotis interna, donde
un espesor superior a 1,2 mm es indicio de una alteración
ateroesclerótica. La medición del espesor de pared se efectúa
mediante un aparato de ultrasonido que permita una resolución
adecuada, tal como por ejemplo un aparato de ultrasonido
convencional con un cabezal sónico de 12 MHz.
A esta subclase pueden pertenecer también
pacientes en los que, hasta la fecha haya aparecido un episodio
cardiovascular y que presenten placas ricas en lípidos o incluso
placas con sedimentos de cal.
De acuerdo con la invención, en esta subclase se
puede impedir, mediante la administración de un inhibidor de
IKK-\beta, por profilaxis primaria, la progresión
de las alteraciones ateroescleróticas de los vasos, de manera que se
reduce el riesgo de un episodio cardiovascular o el aumento del
riesgo de un episodio cardiovascular.
Una segunda subclase especial de pacientes se
refiere a aquellos que, para evitar otros episodios cardiovasculares
como apoplejía o infarto, son tratados para profilaxis secundaria
después de un episodio cardiovascular, de acuerdo con la invención,
con un inhibidor de IKK-\beta. En este caso, los
pacientes se pueden seleccionar únicamente basándose en el episodio
primario y/o tal como se ha descrito anteriormente, basándose en una
evaluación de los factores de riesgo y/o basándose en un
diagnostico de ateroesclerosis, asignándolos a esta segunda subclase
especial.
La presente invención se refiere también por
tanto a procedimientos para la prevención o el tratamiento de la
ateroesclerosis, que están caracterizados porque a los pacientes se
les administra un inhibidor de IKK-\beta. El
inhibidor se puede administrar de todas las formas conocidas. Por
ejemplo, el inhibidor se puede administrar por vía enteral o
parenteral. El inhibidor también se puede administrar como fase
previa, por ejemplo como vector, mediante una terapia genética. La
administración enteral se realizará preferentemente por vía oral.
La administración parenteral puede ser intravenosa, intraarterial,
intramuscular o subcutánea, prefiriéndose la administración
intravenosa o intraarterial. También existe la posibilidad de
combinar la administración del inhibidor por vía enteral,
parenteral o mediante terapia genética. Para el caso de que se tenga
que administrar el inhibidor de forma repetida a lo largo de un
periodo de tiempo prolongado, se elegirá preferentemente un
inhibidor que se pueda administrar por vía oral.
En una forma de realización preferida, se trata
de pacientes pertenecientes a la primera subclase especial. En este
procedimiento para la prevención o el tratamiento de la
ateroesclerosis antes de un episodio cardiovascular primario, el
inhibidor se administra preferentemente por vía oral.
En otra forma de realización preferida los
pacientes son personas pertenecientes a la segunda subclase
especial. En este procedimiento para la prevención o el tratamiento
de la ateroesclerosis antes de un episodio cardiovascular primario,
el inhibidor se administra preferentemente por vía oral.
En otra forma de realización preferida se trata
de pacientes pertenecientes a la primera o a la segunda subclase
especial, administrándose el inhibidor como etapa previa a través de
un vector en las células endoteliales de los vasos, para tener
dispuesto el inhibidor en las células endoteliales como producto de
expresión de una o varias secuencias de nucleótidos del vector. Este
planteamiento ofrece la ventaja de que se evita la administración
repetida al paciente de un medicamento durante un período de tiempo
prolongado.
A continuación se describe la invención con
mayores detalles.
La inhibición de IKK-\beta
puede efectuarse a nivel de ADN por el hecho de que se impida la
expresión de la proteína. La inhibición puede iniciarse en todas
las fases de la expresión genética, así por ejemplo en el propio gen
o en los productos de expresión tales como ARNs y proteínas. Por el
estado de la técnica se conocen diversos procedimientos para la
alteración estructural de los genes. En particular, se remite al
empleo de vectores especiales. En los ejemplos se describe una
utilización especial de un vector. La expresión de
IKK-\beta se puede impedir además frenando la
trascripción o la traslación del gen IKK-\beta o
del correspondiente ARNm. Como ejemplos de tales inhibidores se
pueden citar los ARN-antisense y las ribocimas.
La inhibición de IKK-\beta, sin
embargo se puede efectuar también a nivel de proteína, inhibiendo
para ello la función de la proteína IKK-\beta
expresada. La inhibición a nivel de proteína puede efectuarse
mediante proteínas o no-proteínas. Como ejemplos de
proteínas inhibidoras pueden citarse anticuerpos que reaccionen con
epitopos de IKK-\beta, o proteínas que tengan una
interacción con un punto activo de IKK-\beta
impidiendo la actividad de fosforilización. Ejemplos de
no-proteínas son las substancias activas que tengan
interacción con un punto activo de IKK-\beta e
impidan la actividad de fosforilización. Para ejemplos especiales
de inhibidores moleculares de IKK-\beta se hace
referencia expresa a la patente US-A 5.939.302.
El inhibidor es preferentemente selectivo para
IKK-\beta.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el inhibidor es un compuesto que frena la
expresión del gen que codifica IKK-\beta, por
ejemplo una ribocima o un ARN-antisense. En una
forma de realización especialmente preferida, el inhibidor es un
ARN-antisense, que es complementario del ARNm
transcrito por el gen codificado IKK-\beta o una
parte de éste, preferentemente la zona codificada, y que se puede
combinar específicamente con este ARNm, con lo cual se reduce o
frena la síntesis de IKK-\beta. En otra forma de
realización especialmente preferida el inhibidor es una ribocima,
que es complementaria del ARNm transcrito por el gen codificado
IKK-\beta o una parte de éste, y que se puede
combinar específicamente con este ARNm y disgregarse de éste, con lo
cual se reduce o frena la síntesis de IKK-\beta.
Procedimientos adecuados para la preparación de
ARN-antisense se describen en las patentes
EB-B1 0 223 399 o EP-A1 0 458. Las
ribocimas se componen de un único ramal de ARN y pueden fisionar
intermolecularmente otros ARNs, por ejemplo, los ARNm transcritos
por las secuencias que codifican el IKK-\beta.
Estas ribocimas han de disponer principalmente de dos dominios, (1)
un dominio catalítico \gamma (2) un dominio que sea
complementario del ARN de destino, y que se pueda combinar con éste,
lo que constituye una condición previa para la fisión del ARN de
destino. Partiendo de las formas de proceder descritas en la
bibliografía existe mientras tanto la posibilidad de construir
ribocimas específicas que seccionen un ARN deseado en un punto
determinado preseleccionado (véase por ejemplo: Tanner y cols., en:
Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993,
415-426).
En otra forma de realización preferida, el
inhibidor es un vector.
En otra forma de realización preferida, el
inhibidor es un anticuerpo que combina IKK-\beta o
un fragmento de éste. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales, policlonales o sintéticos, o fragmentos de éstos. A
este respecto, el concepto de "fragmento" se refiere a todas
las partes del anticuerpo monoclonal (por ejemplo fragmentos Fab,
Fv o "single chain Fv"), que tengan la misma
epitopoespecificidad que el anticuerpo completo. Los anticuerpos
objeto de la invención son preferentemente anticuerpos monoclonales.
El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo procedente de un
animal (por ejemplo ratón), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo
quimérico o un fragmento de éstos. Los anticuerpos quiméricos,
semejantes a los anticuerpos humanos o los anticuerpos humanizados,
poseen un carácter antígeno potencial reducido, pero en cambio no
está reducida su afinidad con respecto al objetivo. La preparación
de anticuerpos quiméricos y humanizados, o de anticuerpos semejantes
a anticuerpos humanos ya ha sido descrita detalladamente (véase por
ejemplo Queen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029,
y Verhoeyan y cols., Science 239 (1988), 1534). Las inmunoglobulinas
humanizadas presentan unos sectores de estructura básica variable,
que proceden esencialmente de una inmunoglobulina humana (con la
designación de inmonoglobulina-aceptador) y la
complementariedad de los sectores determinantes que proceden
esencialmente de una inmunoglobulina no-humana (por
ejemplo de ratón) (con la designación de inmunoglobulina de
donante). El sector o sectores constantes proceden, en su caso,
también esencialmente de una inmunoglobulina humana. En la
administración a pacientes humanos, los anticuerpos humanizados (así
como los humanos) presentan una serie de ventajas frente a los
anticuerpos procedentes de ratones o de otras especies: (a) el
sistema inmunitario humano no debería reconocer como extraña la
estructura básica o el sector constante del anticuerpo humanizado y
por lo tanto, la respuesta inmune contra un anticuerpo de esta clase
que haya sido inyectado debería ser menor que frente a un anticuerpo
de ratón totalmente extraño o un anticuerpo quimérico parcialmente
extraño; (b) dado que el campo efector del anticuerpo humanizado es
humano, interactúa mejor con otras partes del sistema inmunitario
humano, y (c) los anticuerpos humanizados inyectados presentan un
tiempo de semidesintegración que es esencialmente equivalente al de
los anticuerpos humanos naturales, lo que permite administrar dosis
menores y con menor frecuencia en comparación con los anticuerpos de
otras especies.
También se pueden utilizar ácidos nucleicos que
combinen directamente con las proteínas, los llamados aptámeros.
Estos se identifican y depuran a través de las proteínas depuradas
de grandes bibliotecas de ARNs modificados químicamente.
Los inhibidores de aptámeros, de ribocima, de ARN
anti-sense y de anticuerpos se pueden administrar
como tales o también preferentemente a través de la terapia
genética, para lo cual se insertan preferentemente en un vector de
expresión unas secuencias de ADN codificadas adecuadas y se llevan
al tejido de destino. De esta manera, la presente invención
comprende también vectores de expresión que contengan estas
secuencias de ADN que codifiquen los inhibidores. La expresión
"vector" se refiere a un virus o a otro vehículo adecuado. Las
secuencias de ADN están enlazadas funcionalmente en el vector con
elementos reguladores, que permiten su expresión en células huésped
eucarióticas. Estos vectores contienen además de los elementos
reguladores, por ejemplo un promotor, típicamente un origen de
replicación y genes específicos que permiten la selección fenotípica
de una célula huésped transformada. Secuencias reguladoras adecuadas
se describen además en Goeddel: Gene Expresión Technology: Methods
in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Entre los
vectores de expresión adecuados para células de mamíferos se cuentan
por ejemplo los vectores procedentes de pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 y
pCEV4 así como de pcDNA/amp, pcDNAZ/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo,
psV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7,
pko-neo y de pHyg.
Las secuencias de ADN descritas anteriormente se
insertan preferentemente en un vector adecuado para la terapia
genética, por ejemplo bajo el control de un promotor específico del
tejido, y se transportan al interior de las células. En una forma
de realización preferida el vector que contiene las secuencias de
ADN antes descritas es un virus, como por ejemplo un adenovirus, un
virus adeno-asociado, vaccinia-virus
o retrovirus. Ejemplos de retrovirus adecuados son MomuLV, HaMuSV,
MuMTV, RSV o GaLV. Se prefieren especialmente los adenovirus, en
particular aquellos que contienen mutaciones E1 y/o E3
(delecciones), que pueden presentar adicionalmente una mutación E4
(delección) o los llamados adenovirus "glutless". Los vectores
adecuados para una terapia genética se describen además en las WO
93/04701, WO 92/22635 WO 92/20316, WO 92/19749 y WO 92/06180. Para
los fines de terapia genética, las secuencias de ADN objeto de la
invención también se pueden transportar a las células de destino en
forma de dispersiones coloidales. Esto incluye por ejemplo los
liposomas o los lipoplexos (Mannino y cols., Biotechniques 8 (1988),
682).
Para la construcción de los vectores de expresión
que contengan estas secuencias de ADN y secuencias de control
adecuadas se pueden emplear procedimientos generales conocidos en el
campo técnico. Estos conocimientos incluyen, por ejemplo técnicas de
recombinación in vitro, procedimientos sintéticos así como
procedimientos de recombinación in vivo, tal como se
describen en los libros de texto corrientes.
Los compuestos anteriores o que contengan estas
secuencias de ADN codificadas o vectores se administran
eventualmente con un soporte farmacéuticamente compatible.
El técnico conoce soportes adecuados y la
formulación de esta clase de medicamentos. Entre los soportes
adecuados se encuentran, por ejemplo, soluciones de sal de cocina
tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo emulsiones de
aceite/agua, humidificantes, soluciones estériles, etc. La dosis
adecuada la determina el médico que realiza el tratamiento, y
depende de diversos factores, como por ejemplo, de la edad, del
sexo, del peso del paciente, de la clase y fase de la cardiopatía o
de la forma de administración.
En otra forma de realización preferida, el
inhibidor es una sustancia activa que se elije de entre el grupo
siguiente:
Sulinda (véase Y. Yamamoto y cols., J. Biol.
Chem. 1999; 274 (38): 27307-14);
NEMO-binding domain peptide (véase May Mj. y cols.,
Science 2000; 289: 1550-4);
3-[(4-metilfenil)-sulfonil]-2-propenonitrilo
y
3-[(4-t-butilfenil-sulfonil]-2-propenonitrilo
(véase J. W. Pierce y cols., J. Biol. Chem. 1997;
272(34)).
La presente invención presenta además un
procedimiento de screening (selección primaria) para la
localización de inhibidores selectivos de
IKK-\beta, en elcual se utilizan células
endoteliales activadas para ensayar la eficacia de las sustancias
activas potenciales, especialmente para evitar una secreción de la
MCP-1.
Una actividad enzimática o expresión genética
reducida o totalmente frenada indica que el compuesto objeto del
ensayo es eficaz como inhibidor. El especialista conoce ensayos
adecuados. Este procedimiento se lleva a cabo en un ensayo celular,
en el que se emplean células endoteliales. En cuanto a los
compuestos objeto del ensayo se puede tratar de compuestos muy
diversos, tanto de compuestos de origen natural como también
sintéticos, orgánicos e inorgánicos, así como de polímeros (como por
ejemplo oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y
polinucleótidos), así como de pequeñas moléculas, anticuerpos,
azúcar, ácidos grasos, nucleótidos y análogos a nucleótidos,
análogos de estructuras de origen natural (por ejemplo
"imitadores" de péptido, análogos de ácido nucleico, etc.) y
otros numerosos compuestos. Además de esto se pueden clasificar como
material de partida gran número de compuestos frenadores de
IKK-\beta posiblemente útiles, en extractos de
productos naturales. Estos extractos pueden proceder de una gran
diversidad de fuentes, por ejemplo de especies de hongos,
actinomicetos, algas, insectos, protozoos, plantas y bacterias. Los
extractos que presenten actividad se pueden analizar entonces para
aislar la molécula activa. Véase por ejemplo Turner, J.
Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 3943 y Suh,
Anticancer Res. 15 (1995) 233-239. En la industria
biotecnológica y farmacéutica se conocen bien formatos de ensayo
básicamente adecuados para la identificación de compuestos de ensayo
que influyan en la expresión o actividad de
IKK-\beta y para el técnico resultan evidentes
otros ensayos adicionales y variaciones de estos ensayos. Las
alteraciones en el nivel de expresión IKK-\beta se
pueden investigar utilizando procedimientos bien conocidos para el
especialista. Esto incluye la vigilancia de la concentración de
ARNm (por ejemplo utilizando sondas o cebadores adecuados),
inmunoensayos en cuanto a la concentración de proteínas, ensayos de
protección de ARN, ensayos de amplificación y cualquier otro medio
que sea adecuado para una demostración y que sea conocido para el
especialista.
La búsqueda de inhibidores también puede
efectuarse a gran escala, por ejemplo clasificando en bibliotecas de
sustancias un número muy grande de compuestos candidatos, pudiendo
contener las bibliotecas de sustancias molécula sintéticas y/o
naturales.
En cualquier caso, la preparación y clasificación
simultánea de grandes bancos de moléculas sintéticas puede
realizarse mediante procedimientos bien conocidos de la química
combinatoria, véase por ejemplo van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997),
2159-2164 y Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997),
145-167. El procedimiento objeto de la invención
también se puede acelerar intensamente como screening
(selección primaria) de alto caudal ("high throughput
screening"). Los ensayos aquí descritos se pueden modificar
debidamente para utilizarlos en un procedimiento de esta clase.
La figura 1 muestra interacciones entre plaquetas
y células endoteliales in vivo. Las interacciones de células
endoteliales y plaquetas se investigaron mediante microscopía
intravital en arteriolos de la microvascularización de un intestino
de ratones, que habían sido sometidos a condiciones isquémicas
(ACTIVADO, activated). Unos animales experimentales sirvieron como
control (en reposo, resting). Figura 1A: Las plaquetas se
clasificaron de acuerdo con sus interacciones con las células
endoteliales, tal como se describe en el estado de la técnica (1,
2): las plaquetas rodantes se indican como número de células por
segundo y milímetro de diámetro de vaso (Rolling); las plaquetas
adheridas se indican como cantidad por mm^{2} de superficie
vascular (Firm adhesion), valor medio +- SEM, n = 6 animales de
ensayo por grupo. *p < 0,01 con respecto a los experimentales
(Método de Dunn'sche). Figura 1B: Plaquetas marcadas con
rodamina-6G se hicieron visibles en arteriolos
empleando microscopía fluorescente intravital. Aunque sólo hay pocas
plaquetas adheridas en el endotelio en los animales experimentales,
la adherencia de las plaquetas en las células endoteliales aumenta
de forma significativa en condiciones de isquemia. Ampliación de las
tomas: 450 veces.
La figura 2 muestra una adherencia de plaquetas -
endotelios hecha visible mediante microscopía electrónica, sobre una
monocapa endotelial. Se empleó la miscroscopía electrónica para
mostrar que las plaquetas se adhieren a una monocapa endotelial
postisquémica intacta. Figura 2A: Se muestra una plaqueta rodante
con contacto suelto respecto al endotelio. Obsérvese el aspecto
normal y la distribución normal de los gránulos de plaquetas. La
figura 2B muestra una plaqueta firmemente adherida a la monocapa
endotelial. En las zonas de separación y de firme adherencia la
plaqueta ha sufrido una desgranulación significativa, lo cual es
indicio de una segregación de compuestos procedentes de la
plaqueta. Ampliación: 20.000 veces. Las barras significan 0,5
\mum.
La figura 3 muestra que la adhesión de las
plaquetas al endotelio está relacionada con una activación de
NF-\kappaB. Unos cortes criostáticos de muestras
de intestino se incubaron con un anticuerpo monoclonal (mAb) frente
a p65 (= NF-\kappaB activado) emitido por
I\kappaB, seguido de un teñido sirviéndose de la técnica de
peroxidasa - antiperoxidasa. La inmunoreactividad p65 queda
señalizada por el producto de reacción rojo (que en la figura
aparece oscuro). Figura 3A: En los animales de control (Resting), en
el endotelio vascular no había prácticamente ninguna
inmunoreactividad de p65. Figura 3B: En experimentos con adhesión
endotélica de plaquetas intensificada (Activated) se encontró más
intensamente una coloración p65 en los arteriolos y en el tejido
circundante. Figura 3C: En las zonas con acumulación masiva de
plaquetas, que se muestra en una ampliación de un detalle de la
Figura 3B, el p65 emitido por I\kappaB se encontraba
preferentemente en la monocapa endotelial (flechas). Ampliación: 40
veces en la figura 3A y 3B y 100 veces en la figura 3C. Las barras
significan 10 \mum.
La figura 4 muestra el efecto de una interacción
transitoria de plaquetas activadas con HUVEC sobre la secreción de
la MCP-1. El HUVEC se trató, con o sin plaquetas
activadas, con \alpha-trombina (PLT; 2 \times
10^{8}/ml), IL-1\beta (100 pg/ml) o TNF (1,67
ng/ml), durante 5 a 300 minutos. A continuación se eliminaron las
plaquetas o citoquinas mediante lavado y se añadió nuevo medio de
cultivo. Las células se incubaron durante un total de 5 horas. A
continuación se aspiró el exceso y se empleó un ELISA para medir la
MCP-1. Las curvas muestran el valor medio +/- la
desviación estándar de cuatro experimentos independientes, cada uno
de los cuales se realizó tres veces.
La figura 5 muestra la activación de
NF-\kappaB dependiente de la simulación y la
descomposición de I\kappaB en HUVEC. Figura 5A: Extractos de
núcleo de HUVEC estimulado con plaquetas (PLT; 2 \times
10^{8}/ml) se investigaron mediante EMSA en cuanto a
NF-\kappaB o combinación Sp-1, lo
que está representado entre paréntesis. Figura 5B: Se analizaron
extractos de citosol procedentes de células estimuladas con
plaquetas sirviéndose de Western-Blots. Las
proteínas I\kappaB-\alpha,
I\kappaB-\varepsilon,
IKK-\alpha e IKK-\beta están
indicadas mediante puntas de flecha. Como control de carga sirvió
\alpha-actina. Figura 5C: Se investigaron
extractos de citosol procedentes de células estimuladas con
IL-\beta (100 pg/ml) sirviéndose de
Western-Blots. Figura 5D: Las células se incubaron
con TNF (1,67 ng/ml) y los extractos de citosol se investigaron
sirviéndose de Western-Blots. La flecha superior
muestra las formas fosforilizadas de
I\kappaB-\alpha o -\varepsilon. Para todos
los casos se muestra un Blot representativo (n = 3).
La figura 6 muestra la activación compleja
diferencial IKK en células endoteliales. Las células se incubaron
tal como se ha indicado y se prepararon extractos de citosol.
Después de una immunoprecipitación (IP) mediante anticuerpos de
antiquinasa, tal como se ha indicado, se efectuó un ensayo de
quinasa, empleando el sustrato
GST.I\kappaB-\alpha en presencia de
^{32}P-ATP. Se muestra una fosforilización del
sustrato en función del tiempo, respectivamente después de la
estimulación de HUVEC con plaquetas (PLT; 2 \times 10^{8}/ml)
(figura 6A), IL-1\beta (100 pg/ml) (figura 6B) o
TNF (1,67 ng/ml) (figura 6C). Para cada uno de los casos se muestra
un experimento representativo (n = 3). Figura 6D: Los ensayos de
quinasa se escanearon y se analizaron por densitometría. El diagrama
muestra los factores de inducción de la actividad IKK frente a los
controles, después de la estimulación.
La figura 7 muestra que la transcripción
dependiente del Promotor \kappaB- y
MCP-1/VCAM-1 se inhibe por
sobreexpresión de componentes del complejo IKK dominantes
negativos. Figura 7A y figura 7B: Se cotransformaron células ECV304
mediante 3kB.luci, pRLtk y plásmidos de hiperexpresión de quinasa
(IKK-\alpha, -\beta o NIK, tipo salvaje o
mutado, o un vector vacío, CVM), en transformacionesindividuales o
dobles, tal como se ha indicado. Después de una incubación durante
una noche se estimularon las células, bien con plaquetas activadas
(PLT; 108/ml) (figura 7A) o IL-1\beta (100 pg/ml)
(figura 7B), durante 60 minutos. Al cabo de otras 15 horas se
lisaron las células y se midió el RLU de luciérnaga y de
Renilla. Los resultados se muestran como múltiplos de la
inducción respecto a aquellos que se habían obtenido con células
transformadas CMV sin estimular. Las barras de la izquierda muestran
el efecto bien de NIK salvaje (wt) o mutado así como de
IKK-\alpha y -\beta sobre la transcripción
dependiente de \kappaB inducida por el estímulo. Se muestran
ensayos representativos (n = 3). Con; células no estimuladas. Figura
7C: Unas células tal como las indicadas se transformaron bien
mediante un plásmido reporter de luciferasa dependiente de un
promotor MCP-1 o VCAM-1, junto con
pRLtk e IKK, a través de plásmidos de expresión. Después de una
estimulación con plaquetas o IL-1\beta se midió el
RLU de luciérnaga y de Renilla. Los resultados se muestran
como porcentaje de inhibición obtenido en relación con las células
transformadas con el tipo salvaje (wt), que se indican en la línea
de puntos en el 100%. Las barras muestran el valor medio \pm
desviación estándar procedentes de tres experimentos independientes.
\alpha, IKK-\alpha; \beta,
IKK-\beta: KA el punto activo de quinasa está
mutado.
La figura 8 muestra que el transfer
IKK-\beta dominante negativo transmitido mediante
rAAV inhibe una secreción endotelial de la MCP-1
inducida por plaquetas e IL-1\beta. Los
subconfluentes HUVEC se dejaron sin tratar, o se transformaron
mediante mutantes de control, rAAV-GFP,
rAAV-IKK-\beta tipo salvaje o
rAAV-IKK-\beta_{\kappa A}
mutante dominante negativo. 48 horas después de una transformación
se dejaron las células sin tratar o se estimularon durante 60
minutos con plaquetas activadas (PLT; 2 \times 10^{8}/ml) o
IL-1\beta (100 pg/ml), se lavaron y se siguieron
incubando tal como está indicado. Figura 8A: Las células se
investigaron en cuanto a expresión GFP mediante citometría de flujo,
para determinar el rendimiento de transformación. La curva señalada
como non infected muestra células no infectadas, y la curva
marcada con rAAV-GFP-infected muestra
células que fueron tratadas con rAAV-GFP.
Aproximadamente el 50% de los HUVEC se infectan con
rAAV-GFP. Figura 8B: Una expresión de GFP se analizó
mediante microscopía fluorescente. Imagen superior: Contraste de
fases de la monocapa HUVEC; Imagen inferior: La correspondiente
micrografía de fluorescencia verde (puntos claros). Figura 8C: Se
investigaron extractos de citosol de HUVEC transformados con
rAAV-IKK-\beta,
rAAV-IKK-\beta_{\kappa A} o
rAAV-GFP mediante Western-Blots en
cuanto a proteína IKK-\beta endógena (GFP) y
sobreexprimida. Como control de carga se utilizó
\alpha-actina. Figura 8D: 4 horas después del
lavado se determinó cuantitativamente la MCP-1
soluble en el remanente de las células, sirviéndose de ELISA. Los
datos se muestran como valor medio \pm desviación estándar,
procedente cada uno de tres experimentos realizados por
duplicado.
La invención se describe a continuación con mayor
detalle sirviéndose de algunos ejemplos especiales.
Se emplearon ratones hembra Balb/c (Charles
River, Sulzfeld) de 5 a 7 semanas de edad (10 animales de ensayo, 10
donantes de plaquetas). El procedimiento quirúrgico es parte del
estado de la técnica (1, 2). En particular, se separó hacia el
exterior un segmento del yeyuno y se sometió a una isquemia
normotérmica de 60 minutos. Las plaquetas de los ratones se aislaron
de plétora y se marcaron con rodamina-6G. Las
interacciones entre plaquetas y células endoteliales se investigaron
en la microvascularización postisquémica en arteriolos submucosas
mediante microscopía intravital, 60 minutos antes y 60 después de la
isquemia. Se eligieron al azar cinco zonas interesadas, que no se
solapaban y se llevó a cabo una determinación cuantitativa de las
interacciones de plaquetas-células endotelicas.
Estas interacciones se clasificaron como adhesión de plaquetas
rodante ("Rolling") o firme.
Se tomaron muestras de los segmentos del
intestino 60 minutos antes y 60 minutos después de la isquemia. Para
fines de microscopía electrónica se fijó el tejido y se trató tal
como se describe en el estado de la técnica (2). Se cortaron zonas
ultradelgadas y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo
y se investigaron bajo un microscopio electrónico de transmisión
Zeiss EM 900 (Zeiss, Oberkochen), que funciona a 80 kV. A efectos
del teñido inmune las biopsias se colocaron en un compuesto O.C.T.
(Tissue-Tek; Miles Inc., Elkhart, IN, USA) y se
congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido. Para hacer visible
el NF-\kappaB activado se incubaron cortes
crioestáticos fijados con acetona (6 \mum) con
\alpha-p65mAb ratón antihumano conjugado con
biotina (Roche Diagnostics, Mannheim), que reacciona selectivamente
con p65 sólo en ausencia de I\kappaB, y que por lo tanto reconoce
la forma activada de NF-\kappaB, y que reacciona
de forma cruzada con los correspondientes antígenos de ratón (3).
Después de una incubación con el anticuerpo primario se tiñeron las
secciones con kits de inmunoistoquimia de peroxidada (Vectastain,
Camon, Wiesbaden). La actividad endógena de peroxidada se bloqueó
mediante metanol H_{2}O_{2} durante 10 minutos a temperatura
ambiente.
Se obtuvieron cultivos primarios de células
endótelicas de vena de ombligo humano (HUVEC) mediante tratamiento
con colagenasa de venas umbilicales, tal como se describe en (4). Se
reunieron las células de 4 - 6 preparaciones y se cultivaron sobre
placas de cultivo con 24 depresiones en un medio de cultivo de
células endótelicas completo (PromoCell, Heidelberg), que contenía
un 2% de FCS, 1 \mug/ml de hidrocortisona, 0,1 ng/ml de hEGF, 1,0
ng/ml de FGF, 50 \mug/ml de gentamicina y 2,5 \mug/ml de
anfotericina B.
La línea de células endoteliales humanas ECV304
(American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA) se cultivó
en M199, que estaba enriquecido con 10% de FCS, 1% de piruvato
sódico, 1 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina,
100 \mug/ml de estreptomicina (Biochrom, Berlín). Con el fin de
eliminar la contaminación por endotoxinas se sometieron todas las
soluciones cristaloides a ultrafiltración (U 200, Gambro,
Hechingen), y las soluciones madre de proteínas se descontaminaron
mediante columnas de polimixina (Pierce, Rockford, IL, USA). Para
excluir la contaminación por endotoxinas se evaluaron todas las
suspensiones de células en un ensayo de lisado con amoebocito con
limulus que formaba colorante (Schulz, Heidelberg), después de cada
uno de los experimentos.
Las concentraciones de proteína
MCP-1 se determinaron en los remanentes de HUVEC
mediante ELISA (Quantikine R&D,
Wiesbaden-Nordenstadt).
Las plaquetas se aislaron de plétora tratada con
anticoagulante
ácido-citrato-dextrosa, obtenido de
personas sanas, que no eran fumadoras, que no estuvieran bajo la
influencia de ningún medicamento del que se sepa que influye en la
función de las plaquetas. Las plaquetas se lavaron y se
resuspendieron en solución de Tyrode tampón/HEPES (HEPES 2,5 mM, 150
mM de NaCl, 12 mM de NaHCO_{3}, 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2
mM de CaCl_{2}, 5,5 mM de D-glucosa, 1mg/ml de
BSA, pH 7,4), para obtener un número de plaquetas de 4 \times
10^{8}/ml tal como se describe en (5). Las plaquetas se
preestimularon durante 20 minutos con 2 U/ml de
\alpha-trombina (Sigma, Deisenhofen), seguido de
una antagonización de la trombina mediante 5 U/ml de hirudina (Roche
Diagnostics). Se verificó la activación de las plaquetas mediante la
determinación de la expresión superficial P-selectin
y del receptor del fibrinógeno activado (LIBS-1,
Dr. Mark Ginsberg, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).
Se añadió 1 ml de la suspensión de plaquetas a 1 ml de medio
completo (cantidad final de plaquetas 10^{8}/ml) y se pasó a
depresiones con monocapas confluentes HUVEC sobre placas con 6
rebajes. Las células se dejaron sin tratar o se incubaron a 37ºC con
plaquetas tal como se indica.
Por último se eliminaron las plaquetas mediante
varias etapas de lavado cuidadosas y se añadió medio de cultivo a
las depresiones hasta que hubo trascurrido el tiempo total de
incubación. Mediante investigaciones provisionales, utilizando un
anti-CD42b mAb específico para plaquetas se aseguró
por vía microscópica y citometría de flujo que mediante el lavado se
habían eliminado todas las plaquetas de la monocapa de
endotelio.
Se prepararon y se analizaron extractos de
núcleos de las células tal como se describe en el estado de la
técnica (6). El oligonucleótido prototípico de cadenas de \kappa
inmunoglobulina se empleó como sonda y se marcó mediante el
fragmento Nenow de ADN polimerasa I (Roche Diagnostics). Las
proteínas de núcleo se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente en un tampón de combinación (6), mediante sondas
radiomarcadas con [\alpha-^{32}P]dCTP
(NEN Life Science Products, Bruselas, Bélgica). Las muestras se
dejaron correr en 0,25x TBE sobre geles de poliacrilamida al cuatro
por ciento no desnaturalizadas. La combinación del factor de
transcripción Sp-1 se analizó utilizando un
oligonucleótido de consenso (Promega, Heidelberg), que estaba
marcado con [\gamma-^{32}P]ATP (NEN Life
Science Products) y T4 quinasa de polinucleótido (Roche
Diagnostics). Los geles se secaron y se analizaron por
autoradiografía.
Se aislaron extractos de citosol y se llevó a
cabo una electroforesis y un blotting tal como se describe en el
estado de la técnica (6, 7). Después de transferirlas las membranas
se incubaron con anticuerpos contra
I\kappaB-\alpha (Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg), I\kappaB-\varepsilon (Profesor N.
Rice, NIH, Frederick, MD), IKK-\alpha,
IKK-\beta (Santa Cruz Biotechnology) o
\alpha-actina (Sigma). Las proteínas se hicieron
visibles sobre película de rayos X utilizando un reactivo químico
luminiscente Western Blot (NEN Life Science Products). Los tamaños
de las proteínas se confirmaron por medio de patrones de peso
molecular (Amersham Pharmacia Biotech, Braunschweig,
Bio-Rad, Munich).
Los extractos de citosol se sometieron a una
inmunoprecipitación (IP) (7) en tampón TNT, que contenía 1 mM de
ditiotreitol, 0,5 \muM
4-(2-aminoetil)-benzolsulfonilfluoruro
(AEBSF) y 0,75 \mug/ml respectivamente de leupeptina, antipaina,
aprotinina, pepstatina A, quimostatina (Sigma). Las combinaciones no
específicas se bloquearon mediante incubación con 1 \mug de IgG de
conejo normal (Santa Cruz Biotechnology) y 25 \mul de 6% proteína
A-Agarosa (Roche-Diagnostics)
durante 30 minutos a 4ºC, seguidos de una inumnoprecipitación
durante 2 horas a 4ºC con 1 \mug de un anticuerpo antiquinasa
adecuado (Santa Cruz Biotechnology). Después de lavar tres veces
respectivamente con TNT y tampón de quinasa (20 mM HEPES, pH 8,0; 10
mM de MgCl_{2}, 100 \muM de Na_{3}VO_{4}; 20 mM de
\beta-glicerofosfato; 50 mM de NaCl; 2 mM de
ditiotreitol; 0,5 \muM AEBSF, 0,75 \mug/ml respectivamente de
leupeptina, antipaina, aprotinina, pepstatina A, quimostatina), se
analizaron las proteinas precipitadas mediante un ensayo de quinasa.
La reacción se llevó a cabo en un tampón de quinasa durante 30
minutos a 30ºC en presencia de 5 \muCi
[\gamma-^{32}P]ATP (NEN Life Science
Products) y GST-I\kappaB-\alpha
(Santa Cruz Biotechnology).Las proteínas se analizaron mediante
PAGE y se hicieron visibles mediante autorradiografía.
En las investigaciones sobre transfección se
emplearon los siguientes plásmidos reporter:
- -
- 3x\kappaB-luci, un plásmido reportador de luciferasa de la luciérnaga, que contiene tres copias de un punto \kappaB prototípico (7);
- -
- VCAM-1.luci, comprendiendo 1811 pares de bases de la gama del promotor VCAM-1 (Dr. Nigel Mackmann, Scripps Research Instituite, La Jolla, CA); y
- -
- -MCT-1.luci, conteniendo las zonas proximales de promotor y distales de reforzador del gen MCP-1 humano (8, 9) (Dr. Teizo Yoshimura, NIH, Frederick, MD).
Se emplearon los siguientes plásmidos de
hiperexpresión:
- -
- IKK-\alpha
- -
- IKK-\beta
- -
- NIK
(Tipo salvaje y mutado, formas inactivas de
quinasa, Dr. Mike Rothe, Tularik Inc., South San Francisco,
CA).
Como control negativo se empleó ROCMV vacío
(Invitrogen, Groningen, Holanda). Estos plásmidos se cotransformaron
solos o en combinación, de forma transitoria, con un plásmido de
control de luciferasa Renilla, constitutivamente activo,
PRLtk (Promega), en células endoteliales, tal como se describe en el
estado de la técnica (10). Al cabo de 24 horas se estimularon las
células durante 60 minutos, bien con IL-1\beta o
con plaquetas, seguido de un cultivo durante otras 15 horas.
Después de la estimulación se lisaron las células y se determinó la
actividad de luciferasa, utilizando el sistema de ensayo dual
reportero de luciferasa (Promega). Los resultados se expresan como
relación entre las unidades luminosas relativas (RLU) de piróforos y
luciferasa-renilla.
El plásmido pTR-UF5 fue
facilitado por Dr. Muzyczka (Gene Therapy Center, Gainsville,
Florida) (11, 12) y el plásmido pDG fue facilitado por Dr.
Kleinschmidt (Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg,
Alemania) (11, 13). Se construyó un virus recombinante,
adeno-asociado deficiente de replicación (rAAV), que
contiene la proteína fluorescente verde (rAAV-GFP)
del tipo humano IKK-\beta
(rAAV-IKK-\beta) o
IKK-\beta_{KA}mutado(rAAV-IKK-\beta_{KA}),
en la forma siguiente: La secuencia de codificación de tipo salvaje
o del IKK-\beta mutado se insertó en la secuencia
multienlace del vector pTR-UF5. Los plásmidos
contenidos se cotransformaron a continuación con el plásmido pDG en
células subconfluentes HEK 293 empleando un método modificado de
coprecipitación de fosfato cálcico, y la generación de rAAV se
realizó tal como se describe en el estado de la técnica (13, 14).
El título de las partículas virales infecciosas (IVP) se evaluó
mediante infección de células HeLa proliferantes.
HUVEC se extendió sobre placas con 96 depresiones
a razón de 10^{4} células por depresión, en 200 \mul de medio
de cultivo. Al producirse la subconfluencia, aproximadamente 16 a 24
horas más tarde, se añadieron a cada célula de 1 a 3 \times
10^{3} IVP de rAAV. Los medios se cambiaron 16 horas después de
añadir rAAV, y las células transducidas se cultivaron durante otras
48 horas. A continuación se estimularon las células durante 60
minutos con plaquetas activadas con IL-1\beta o
\alpha-trombina, evaluándose 4 horas más tarde una
secreción de MCP-1. El rendimiento de la
transducción endotelial rAAV-GFP se evaluó mediante
citometría de flujo, microscopía fluorescente y Western Blot.
El modelo de ratón de la isquemia aquí utilizado
permite diferenciar distintas clases de adhesión de plaquetas, que
se hizo visible mediante microscopía intravital.
En estado fisiológico in vivo, las
plaquetas circulantes raras veces interactúan con el endotelio
microvascular (figura 1A y B en reposo). Se observaron pocas
plaquetas que rodaban a lo largo del revestimiento de células
endoteliales de los arteriolos (< 1/s/ml). Al mismo tiempo, por
mm^{2} de superficie de células endoteliales se encontraron
únicamente 38 \pm 16 plaquetas firmemente adheridas.
En cambio, en el caso de realizar mediciones
similares en arteriolos bajo condiciones de isquemia (isquemia de 60
minutos) se halló una adhesión de plaquetas en células endoteliales
tremendamente incrementada (figura 1 A y B activada). Se halló un
incremento de aproximadamente 160 veces en la interacción rodante y
un incremento de 13 veces de la adhesión firme de las plaquetas en
endotelio isquémico (P <0,01).
Para investigar las alteraciones morfológicas que
tienen lugar en las plaquetas cuando éstas se adhieren in
vivo al endotelio vascular se realizaron investigaciones con
microscopio electrónico. Se halló que algunas plaquetas aisladas se
adhieren a las células del endotelio también en ausencia de
agregados, sin que se pudieran reconocer defectos en la capa de
células del endotelio (figura 2). Estas plaquetas adheridas de
manera suelta a las células del endotelio (Rolling) mostraban el
dibujo típico de gránulos completos que todavía no están
desgranulados (figura 2a). En cambio las plaquetas que están
extendidas sobre la superficie de las células del endotelio
(adhesión firme) están caracterizados por una intensa secreción de
sus gránulos, tal como está demostrado por los organelos vacíos que
se hallan en estas zonas (figura 2B).
Por las investigaciones in vitro se conoce
que la interacción de las plaquetas activadas con células del
endotelio (co-cultivo permanente) dan lugar a una
expresión de genes de quemoquinas y moléculas de adhesión, a través
de una activación de NF-\kappaB. Para investigar
la activación de este factor de transcripción en zonas de mayor
adhesión de plaquetas al endotelio en la microvascularización, se
llevó a cabo una inmunohistoquimia sobre cortes criostáticos,
utilizando un mAb contra la subunidad NF-\kappaB
p65 liberada por I\kappaB. En ratones experimentales falta casi
totalmente la activación de NF-\kappaB (figura 3A,
Resting). En condiciones de una interacción más intensa entre
plaquetas y endotelio se observó en la microvascularización una
mayor inmunoreactividad de NF-\kappaB activado,
mostrado por marcación p65 ((figura 3B, activado) y principalmente
en la monocapa del endotelio contigua a los agregados de plaquetas
(figura 3C). Esto indica que una adhesión más intensa de plaquetas
al endotelio da lugar a una activación de
NF-\kappaB in vivo.
Dado que se observaron cantidades significativas
de NF-\kappaB activado en zonas que mostraron
adhesión de plaquetas, se investigaron los efectos de las plaquetas
activadas sobre HUVEC activados. Primeramente se investigó in
vitro el desarrollo a lo largo del tiempo de la secreción de
endotelios inducida por plaquetas en quemoquina
MCP-1, que se regula mediante
NF-\kappaB (8,9). Unas monocapas confluentes de
HUVEC se dejaron sin tratar o se incubaron durante 5 a 300 minutos
con plaquetas activadas con \alpha-trombina, 100
pg/ml de IL-1\beta o 1,67 ng/ml de TNF. A
continuación se retiraron las plaquetas o las citoquinas de la
monocapa endotelial y se determinó la cantidad de
MCP-1 en el remanente después de otras 4 horas de
incubación (co-cultivo transitorio).
La incubación transitoria de HUVEC con plaquetas
activadas durante 30 minutos dio lugar a un fuerte aumento de la
secreción de MCP-1, que es comparable con una
estimulación IL-1\beta (figura 4), siendo algo más
débil el efecto TNF. La incubación de HUVEC con plaquetas en reposo
no indujo ningún incremento significativo de la secreción de
MCP-1.
Con el fin de seguir aclarando el mecanismo
mediante el cual las plaquetas inducen la expresión de productos
genéticos de destino NF-\kappaB tales como
MCP-1, se llevaron a cabo experimentos para la
determinación del tiempo con el fin de observar una activación de
NF-\kappaB que se determinó mediante EMSA. Las
plaquetas activadas indujeron una activación intensa y dependiente
del tiempo de NF-\kappaB en HUVEC, observándose
los efectos máximos al cabo de 60 minutos (figura 5A). En los mismos
extractos de núcleos se investigó también la combinación de
proteínas con oligonucleótidos Sp-1, que actúan como
Loading-Control (figura 5A).
A continuación se investigó el marco de tiempo y
el volumen de proteólisis inducida por las plaquetas en la proteína
inhibidora I\kappaB. La incubación de HUVEC con plaquetas
activadas así como IL-1\beta dio lugar a una
proteólisis importante de I\kappaB-\alpha e
I\kappaB-\varepsilon (figuras 5B y C). A pesar
de que las muestras de proteólisis de la proteína I\kappaB eran
similares a continuación de ambos estímulos se observaron algunas
diferencias: el I\kappaB-\alpha se descompuso
algo más rápidamente después de la acción de
IL-1\beta, comenzando al cabo de 15 minutos
después de la incubación, en comparación con el caso de una
estimulación de plaquetas, donde se observó la descomposición
después de unos 30 minutos. A la inversa, las plaquetas inducen una
proteólisis anterior de I\kappaB-\varepsilon e
IL-1\beta (efecto significativo: 30 minutos con
respecto a 60). En fuerte contraste con ésto, TNF indujo una
descomposición mucho más rápida de ambas proteínas I\kappaB en
HUVEC (figura 5D).
Las proteínas I\kappaB se fosforilizan antes de
su descomposición, siendo provocado este proceso por el complejo
IKK. Para caracterizar el efecto de las plaquetas sobre este sistema
de quinasa, se emplearon ensayos de quinasa in vitro. HUVEC
fueron estimulados con plaquetas activadas,
IL-1\beta o TNF durante los periodos de tiempo
indicados, antes de preparar extractos de citosol. Se llevó a cabo
una inmunoprecipitación, bien con anticuerpos
IKK-\alpha o IKK-\beta, y se
determinó la actividad de quinasa mediante la medición del estado de
fosforilización de
GST-I\kappaB-\alpha. La
incubación con plaquetas indujo una activación notable del complejo
IKK con unos niveles de fosforilización máximos a los 30 minutos,
que en un plazo de 60 minutos descendieron rápidamente a los valores
de la línea base (figuras 6A y D). Se obtuvieron resultados
similares cuando se añadió IL-1\beta a HUVEC, a
pesar de que se observaron diferencias en un pico de activación a
los 45 minutos, que se mantuvieron por lo menos durante 90 minutos
(figuras 6B y D). Cuando se utilizó TNF para estimular HUVEC, la
activación de IKK se produjo rápidamente en un plazo de 2,5 minutos,
volviendo a valores más bajos al cabo de 20 minutos (figuras 6C y
D). En estas condiciones, los niveles de
IKK-\alpha y -\beta se mantuvieron constantes
(figuras 5B y C). Se obtuvieron unos resultados similares empleando
células ECV 304.
Con el fin de investigar el papel de las
proteínas IKK y NIK en las cascadas de señales que afectan a
NF-\kappaB, se transformó ECV 304 antes de la
estimulación con plaquetas o IL-1\beta, con
vectores de hiperexpresión para el tipo salvaje o quinasas mutadas
marcadas con flag, junto con un plásmido reporter de \kappaB
luciferasa. Un Western Blot, empleando un anticuerpo
anti-flag, confirmó que la proteína respectiva había
sido hiperexprimida en el sistema existente y que el vector de
control sin inserción no mostraba ninguna marca flag no específica.
Unos experimentos complementarios mostraron que las proteínas
precipitadas marcadas con flag eran activas para la quinasa,
mientras que las formas mutadas no mostraban actividad. Cuando se
hiperexprimió NIK, se observó una inducción drástica de la señal
3x\kappaB.luci, comparado con el control CMV, que se incrementó
aún más incubando las células con plaquetas activadas o
IL-1\beta (figuras 7A y B, columnas de la
izquierda). La transfección de NIK mutado provocó una disminución
drástica de este efecto tanto por la señal inducida por el tipo
salvaje como también por el incremento adicional causado por la
ulterior estimulación. Una cotransformación de tipo salvaje
IKK-\alpha y -\beta juntas tuvo también un
efecto directo sobre el plásmido 3\kappaB.luci, que se intensificó
notablemente mediante la estimulación, bien con plaquetas o con
IL-1\beta (figuras 7A y B, columna izquierda).
Una hiperexpresión de las formas mutadas de
IKK-\alpha y -\beta juntas, inhibió no sólo los
efectos directos sino también los inducidos por el estímulo,
desapareciendo casi totalmente la señal inducida por las plaquetas,
observándose un efecto más débil para IL-1\beta.
Cuando se exprimieron las quinasas individualmente, en lugar de
hacerlo en combinación, se halló una inhibición importante con
IKK-\beta_{KA}, como consecuencia de una
incubación con plaquetas o IL-1\beta (figuras 7A y
B, columnas de la derecha). IKK-\alpha_{KA} sólo
mostró efecto inhibidor para plaquetas, pero no para células
estimuladas con IL-1\beta.
Igualmente se investigó el efecto de una
hiperexpresión de IKK-\alpha y -\beta mutado
sobre la transcripción dependiente de plaquetas o dependiente del
promotor inducida por IL-1\beta. ECV 304 se
transformaron con vectores de hiperexpresión para tipo salvaje o
quinasas mutadas, junto con plásmidos reporter de luciferasa, que
contenían fragmentos promotores que llevaban MCP-1 o
VCAM-1 \kappaB. En este caso solamente se obtuvo
una reducción significativa de la transcripción inducida por
plaquetas o IL-1\beta mediante
IKK-\beta_{KA}, pero
noIKK-\alpha_{KA}, bajo la regulación de estos
promotores (figura 7C).
Para mostrar el efecto de una hiperexpresión de
IKK-\beta_{KA} sobre el nivel de proteínas, se
clonaron el tipo salvaje o secuencias mutadas de
IKK-\beta en un sistema de virus recombinante
adeno-asociado (13, 14). Las investigaciones se
realizaron en un principio para comprobar si los rAAV podían
transducir cultivos HUVEC primarios. Unas monocapas endoteliales
subconfluentes se incubaron durante 16 horas con
rAAV-GFP y después de otras 48 horas en cultivo de
células se analizó la expresión de GFP en HUVEC infectados, mediante
citometría de flujo y microscopía fluorescente (figuras 8A y B). Se
halló que en las condiciones aplicadas había una transducción
importante de HUVEC con un rendimiento de aproximadamente un 50%.
Esto supone una diferencia ventajosa respecto a la tasa de
transfección de aproximadamente un 5 a un 10%, tal como se encuentra
en HUVEC empleando los métodos de transfección convencionales. La
hiperexpresión de IKK-\beta mediante el sistema
rAAV se confirmó mediante el empleo de un análisis Western (figura
8C). Para investigar los efectos de hiperexpresión de
IKK-\beta e IKK-\beta_{KA}, se
transdujeron HUVEC con rAAV, que codifica estas proteínas, o
mediante el control rAAV-GFP. Después de la
incubación inicial, seguida de otro cultivo durante 48 horas, se
trataron las células transducidas durante 60 minutos con plaquetas
activadas con IL-1\beta, determinándose después de
4 horas una secreción de la MCP-1. Las células que
habían sido transducidas con
rAAV-IKK-\beta_{KA}, mostraron
una disminución importante de la secreción de la
MCP-1 inducida por plaquetas o
IL-1\beta, en comparación con las células tratadas
con rAAV-GFP o
rAAV-IKK-\beta (figura 8D). Estos
resultados muestran que el sistema rAAV, y el alto rendimiento de
transfección conseguido con ello, permiten la demostración directa a
través de una determinación de la concentración de proteínas, de que
el mutante negativo dominante IKK-\beta_{KA},
inhibe intensamente la expresión delgen endotelial de inflamación de
MCP-1, que es inducido por la interacción
transitoria con plaquetas activadas o
IL-1\beta.
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Blood 92, 507-512.
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Methods Enzymol. 316, 743-761.
Claims (3)
1. Procedimiento de screening (selección
primaria) para localizar inhibidores de IKK-\beta
en células endoteliales comprendiendo el procedimiento la
compactación de un inhibidor potencial con células endoteliales
activadas y una determinación de la secreción de la
MCP-1 de las células endoteliales.
2. Procedimiento de screening (selección
primaria) según la reivindicación 1, en el que se activan las
células endoteliales mediante plaquetas activadas.
3. Utilización de un inhibidor de
IKK-\beta, elegido entre Sulindac,
NEMO-binding domain peptide,
3-[(4-metilfenil)-sulfonil]-2-propenonitrilo
y
3-[(4-t-butilfenil)-sulfonil]-propenonitrilo,
para la preparación de un medicamento destinado a la
- (a)
- profilaxis primaria de ateroesclerosis en pacientes cuyo valor PROCAM sea mayor o igual a 50, o para la
- (b)
- profilaxis secundaria después de un episodio cardiovascular.
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