TWI804669B - 作為用於自體免疫疾病及IL-17 相關疾病之生物標記及治療標靶之AhR-ROR-γt 複合體 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種用於識別AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑之方法，其包括：(a)提供細胞培養物，其中該培養物中之細胞表現AhR蛋白質及磷酸-RORγt蛋白質；(b)在測試劑之存在下培育該細胞培養物；(c)在測試劑之存在下分析AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之含量；(d)比較在測試劑之存在下AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體與對照之含量；及(e)當比較步驟指示與對照相比，在測試劑之存在下AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之含量降低時，即識別該測試劑為AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。本發明亦揭示一種用於識別GLK-IQGAP1蛋白質複合體抑制劑之方法。本發明亦揭示經識別之抑制劑於製造用於治療疾病之藥劑中的用途。
Description
本發明大體上係關於自體免疫疾病，及更具體而言係關於作為IL-17產生及經IL-17介導疾病之治療標靶之GLK誘導的AhR-ROR γ T複合體。
自體免疫疾病係因免疫系統過度激活所產生。T輔助17細胞(Th17，產生IL-17A之CD4+ T細胞)及IL-17A於自體免疫疾病之發病機理中扮演關鍵作用。轉錄因子RORγt會結合至IL-17A啟動子並控制IL-17A基因轉錄。芳烴受體(AhR)透過在Th17分化期間誘導IL-17A轉錄及抑制負調節劑STAT1來促進Th17極化。T-細胞特異性AhR基因敲除小鼠具有受損之Th17分化且對Th17介導之實驗自體免疫性關節炎具有抵抗性。可於活體外在不同條件下衍生各種致病Th17亞群。此等不同Th17亞群於自體免疫疾病之發病機理中之活體內作用仍不清楚。
MAP4K3(亦稱作GLK)為哺乳動物類Ste20絲胺酸/蘇胺酸激酶。患有自體免疫疾病(諸如全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎
(RA)或成人發作的斯提耳氏病(Still's disease)(AOSD))之患者的臨床樣品顯示T細胞中具有急劇增加之GLK表現。然而，GLK過度表現如何導致多種人類自體免疫疾病仍不清楚。
於一態樣中，本發明係關於一種識別AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑之方法，其包括：(a)提供細胞培養物，其中該培養物中之細胞表現芳烴受體(AhR)蛋白質及磷酸-視黃酸受體相關孤兒核受體γt(RORγt)蛋白質；(b)在測試劑之存在下培育該細胞培養物；(c)在該測試劑之存在下分析該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之含量；(d)比較在該測試劑之存在下該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體與對照之含量；及(e)當該比較步驟指示與對照相比在測試劑之存在下該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之含量降低時，識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。
於一實施例中，該分析步驟使用抗磷酸-RORγt[Ser489]抗體進行免疫印漬。
於另一實施例中，該等細胞係選自由以下組成之群：Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、TCR活化之T細胞及過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞。
於另一實施例中，(i)該提供步驟提供用CFP-AhR、YFP-RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞；(ii)該分析步驟進行螢光共振能量轉移(FRET)分析；及(iii)當該比較步驟指示與對照相比在測試劑之存在下藉由YFP-RORγt發射之螢光強度降低時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。
於另一實施例中，(i)該提供步驟提供用抗原決定基標記之AhR、Myc-RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞；(ii)使用ALPHA分析利用抗Myc抗體結合之接受體珠(acceptor bead)及塗抗抗原決定基抗體之供體珠進行該分析步驟；及(iii)當該比較步驟指示與對照相比在測試劑之存在下藉由抗Myc抗體結合之接受體珠發射之信號減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑；其中該抗原決定基由SEQ ID NO：1之序列組成。
於另一實施例中，(i)該提供步驟提供選自由以下組成之群之細胞：Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、TCR活化之T細胞及過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞；(ii)該分析步驟進行原位鄰近接合分析(PLA)，其將作為初級抗體、二級抗體之抗AhR抗體及抗RORγt或抗磷酸-RORγt[Ser489]抗體用作PLA探針及螢光標記之互補寡核苷酸探針用於信號偵測；及(iii)當該比較步驟指示與對照相比在測試劑之存在下存在螢光信號減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。
於另一實施例中，(i)該提供步驟提供用Myc-AhR、抗原決定基標記之RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞；(ii)該分析步驟係進行共免疫沉澱分析，其係藉由將細胞提取物與抗抗原決定基瓊脂糖珠或抗Myc瓊脂糖珠培育以沉澱出該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體並將經以抗Myc或抗抗原決定基抗體免疫沉澱出之該AhR-磷酸-RORγt複合體進行免疫印漬；及(iii)當比較結果指示與對照相比，在測試劑之存在下存在信號之減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑；其中該抗原決定基由SEQ ID NO：1之序列組成。
於另一實施例中，(i)該提供步驟提供選自由以下組成之群之細胞：Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、TCR活化之T細胞及過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞；(ii)該分析步驟進行染色質免疫沉澱(ChIP)-DNA定序分析，其係使用抗RORγt抗體免疫沉澱出該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體及使用包含IL-17A啟動子DNA序列中之AhR結合位點核苷酸序列之引子對進行PCR以獲得PCR產物；及(iii)當該比較步驟指示與對照相比，在測試劑之存在下該PCR產物之數量減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt複合體之抑制劑。
於另一態樣中，本發明係關於一種識別GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑之方法，其包括：(a)提供細胞培養物，其中該培養物中之細胞表現GLK蛋白質及IQGAP1蛋白質；(b)在測試劑之存在下培育該細胞培養物；(c)在該測試劑之存在下分析該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之含量；(d)比較在該測試劑之存在下該GLK-IQGAP1蛋白質複合體與對照之含量；及(e)當該比較步驟指示與對照相比，在該測試劑之存在下該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之含量降低時，識別該測試劑為該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑。
於一實施例中，(i)該提供步驟提供選自由以下組成之群之細胞：GLK轉殖基因小鼠、過度表現GLK之細胞及過度表現GLK+IQGAP1之細胞；(ii)該分析步驟進行原位鄰近接合分析(PLA)，其將作為初級抗體、二級抗體之抗IQGAP1抗體及抗GLK或抗磷酸-IQGAP1[Ser480]抗體用作PLA探針及螢光標記之互補寡核苷酸探針用於信號偵測；及(iii)當該比較步驟指示與對照相比在測試劑之存在下存在螢光信號減少時，該識別步驟識別該測試劑為該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑
制劑。
於另一實施例中，該分析步驟使用抗磷酸-IQGAP1[Ser480]抗體進行免疫印漬。
於另一態樣中，本發明係關於有效量之藉由本發明方法識別之AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑於製造用於治療有需要之個體之IL-17A相關疾病之藥劑中的用途。
於一實施例中，該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬(verteporfin)或阿來西定(alexidine)二鹽酸鹽。
於另一實施例中，該IL-17A相關疾病係選自由以下組成之群：自體免疫疾病、過度表現GLK之癌細胞轉移及過度表現GLK之癌細胞復發。
於一實施例中，該IL-17A相關疾病為自體免疫疾病且該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽。
於另一實施例中，該IL-17A相關疾病為過度表現GLK之癌細胞轉移且該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽。
於另一實施例中，該IL-17A相關疾病為過度表現GLK之癌細胞轉移且該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬。
於另一態樣中，本發明係關於有效量之藉由本發明方法識別之GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑於製造用於治療有需要之個體之過度表現GLK之癌細胞轉移之藥劑中的用途。
於一實施例中，該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑為維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽。
本發明亦關於有效量之維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽於製造用於治療有需要之個體之過度表現GLK之癌細胞轉移之藥劑中的用途。
圖1顯示Lck-GLK轉殖基因小鼠顯示自體免疫表現型及選擇性增加之血清IL-17A含量。(A)小鼠之指定器官之經蘇木精及曙紅染色之切片。箭頭，浸潤免疫細胞。條，100μm。(B)藉由ELISA分析測定小鼠之血清自體抗體之含量。該等含量相對於野生型小鼠中之一者之值呈現。(C)藉由ELISA分析測定小鼠之細胞激素之血清含量。(D)藉由ELISA分析測定Lck-GLK及Lck-GLK/IL-17A KO小鼠之自體抗體之血清含量。該等含量相對於Lck-GLK小鼠中之一者之值呈現。(E)藉由GLK shRNA減弱IL-17A表現。將鼠科原代脾T細胞用GFP-人類GLK shRNA及對照GFP載體轉染。在轉染後第3天將經轉染之T細胞用抗小鼠CD3抗體刺激3小時及然後藉由流動式細胞測量術測定。資料顯示產生IL-17A之T細胞之事件(綠色螢光蛋白(GFP)閘控)。WT，野生型同窩對照；Lck-GLK，T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠。Lck-GLK/IL-17A KO，Lck-GLK；IL-17A缺乏小鼠。ANA，抗核抗體；α-dsDNA，抗dsDNA抗體；RF，類風濕因子。*，P值<0.05；**，P值<0.01(雙尾學生t-檢驗(Student’s t-test))。
圖2顯示GLK透過誘導AhR及RORγt增強IL-17A表現。(A)藉由即時PCR分析來自小鼠之外周血T細胞中之鼠科IL-17A mRNA含量。將IL-17A之表現水平標準化至Mrpl32含量。倍數變化相對於野生型小鼠之值呈現。顯示平均值±SEM。(B)IL-17A啟動子之螢光素酶報告基因活性。將Jurkat T細胞用編碼GLK或GLK激酶死亡(GLK-K45E)突變體之質粒加IL-17A啟動子(2kb)構築體共轉染。顯示平均值±SEM。(C)關於IL-
17A啟動子之轉錄因子之示意圖。(D)藉由ChIP-PCR使用來自個別免疫沉澱實驗之免疫複合體分析AhR、RORγt、STAT3、IRF4、KLF4或BATF與小鼠之T細胞中之IL-17A啟動子之結合。(E)IL-17A突變體啟動子之螢光素酶報告基因活性。將Jurkat T細胞用空載體或GLK質粒加含有AhR、RORγt(-877)或STAT3之突變結合元件之IL-17A啟動子構築體共轉染。(F)用空載體或編碼GLK之質粒共轉染之Jurkat T細胞中之AhR、RORγt(-877)及STAT3回應元件(XRE-Luc、RORγt-Luc及SIE-Luc)的螢光素酶報告基因活性。XRE，異源物回應元件；SIE，sis-可誘導元件。WT，野生型同窩對照；Lck-GLK，T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠。(B)、(E)及(F)顯示三個獨立實驗之平均值±SEM。*，P值<0.05；**，P值<0.01(雙尾學生t-檢驗)。
圖3顯示PKCθ將AhR磷酸化且誘導其核轉位。(A)藉由ELISA分析測定指定小鼠之細胞激素之血清含量。顯示平均值±SEM。WT，野生型同窩對照；Lck-GLK，T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠。Lck-GLK；AhRf/f；CD4-Cre，利用AhR條件基因敲除(cKO)小鼠繁殖之T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠。*，P值<0.05；**，P值<0.01(雙尾學生t-檢驗)。(B)無刺激之鼠科脾T細胞中之AhR之亞細胞定位的共焦顯微術。原始放大率，×630；條，10μm。(C)來自WT及Lck-GLK Tg小鼠之原代脾T細胞之細胞質及核部分中之AhR、GAPDH及組蛋白3的免疫印漬。(D)WT及Lck-GLK Tg小鼠之原代脾T細胞中之p-AhR(Ser-36)、AhR及GLK的免疫印漬。(E)於活體外激酶分析中使用自個別經轉染HEK293T細胞單離之Flag-GLK、Flag-PKCθ、Flag-IKKβ、Flag-IKKα及HA-AhR(作為受質)之AhR磷酸化及指定激酶的免疫印漬。(F)來自無刺激之WT及
Lck-GLK小鼠之原代脾T細胞之裂解物之內源AhR與PKCθ的共免疫沉澱(co-IP)。(G)來自野生型或Lck-GLK Tg小鼠之外周血T細胞中之內源PKCθ與AhR之間之相互作用的PLA。各紅點表示直接相互作用。將T-細胞核用DAPI染色(藍色)。(H)經純化之HA-標記之AhR加Myc標記之PKCθWT或PKCθ激酶死亡(K409W)突變體蛋白質之活體外激酶分析。(I)WT小鼠、Lck-GLK Tg小鼠及用PKCθ KO小鼠繁殖之Lck-GLK Tg小鼠之原代脾T細胞中之經磷酸化之AhR(Ser-36)、AhR、GLK及PKCθ的免疫印漬分析。(J)指定小鼠之原代脾T細胞中之AhR及PKCθ之亞細胞定位的共焦顯微術。原始放大率，×630；條，10μm。WT，野生型同窩對照；Lck-GLK，T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠；Lck-GLK；PKCθ-/-，用PKCθ基因敲除小鼠繁殖之Lck-GLK轉殖基因小鼠。
圖4顯示GLK透過AhR及RORγt相互作用誘導RORγt結合至IL-17A啟動子。(A)藉由ChIP-PCR分析RORγt與來自指定小鼠之T細胞中之IL-17A啟動子的結合。(B)使用來自無任何刺激之WT及Lck-GLK小鼠之原代脾T細胞之裂解物的內源AhR與RORγt之共免疫沉澱(co-IP)。(C)指定小鼠之原代T細胞中之AhR及RORγt之亞細胞定位的共焦顯微術。原始放大率，×630；條，10μm。(D)藉由ChIP-PCR使用抗RORγt免疫複合體分析AhR及RORγt與來自小鼠之T細胞中之IL-17A啟動子的結合。(E)針對來自指定小鼠之外周血T細胞中之內源AhR與RORγt之間之相互作用之鄰近接合分析(PLA)的共焦顯微術。(F)HA標記之AhR與Flag標記之RORγt使用用GLK-CFP、PKCθ-Myc、IKKβ-CFP或IKKα-Myc質粒共轉染之HEK293T細胞之裂解物的共免疫沉澱(IP)。(G)經純化之Flag標記之RORγt蛋白質及GST標記之AhR蛋白質之GST-沉降(pulldown)分析。使用
與Flag-RORγt加CFP-IKKβ或載體共轉染之HEK293T細胞之裂解物將Flag標記之RORγt蛋白質用Flag肽溶離。原始放大率，×630；條，10μm。
圖5顯示IKKβ將RORγt Ser-489磷酸化，其導致RORγt結合至AhR。(A)針對來自野生型、Lck-GLK Tg及Lck-GLK；IKKβf/f；CD4-Cre小鼠之外周血T細胞中之內源AhR與RORγt之間之相互作用之PLA的共焦顯微術分析。(B)野生型、Lck-GLK Tg及Lck-GLK；IKKβf/f；CD4-Cre小鼠之原代脾T細胞中之AhR及RORγt之亞細胞定位的共焦顯微術。原始放大率，×630；條，10μm。(C)藉由ELISA分析測定小鼠中之細胞激素之血清含量。顯示平均值±SEM。*，P值<0.05(雙尾學生t-檢驗)。(D)RORγt之重組蛋白與IKKβ之間之直接相互作用。經純化之His標記之RORγt蛋白質及GST標記之IKKβ蛋白質之GST-或His-沉降分析。(E)經免疫沉澱之Flag標記之RORγt及IKKβ或來自個別HEK293T轉染子之IKKβ激酶死亡(K44M)突變體蛋白質之活體外激酶分析。(F)RORγt之胰蛋白酶肽之質譜(MS)/MS片段化光譜含有Ser-489之磷酸化。(G)藉由免疫印漬使用用CFP標記之IKKβ加Flag標記之RORγt WT或RORγt-S489A突變體共轉染之HEK293T細胞證明抗磷酸-RORγt(Ser-489)之抗體特異性。(H)指定小鼠之原代脾T細胞中之p-RORγt(Ser-489)、RORγt、p-IKKβ(Ser-180/181)及IKKβ之免疫印漬。(I)HA標記之AhR與Flag標記之RORγt WT或RORγt-S489A突變體使用用載體或IKKβ-CFP質粒共轉染之HEK293T細胞之裂解物的共免疫沉澱(co-IP)。WT，野生型同窩對照；Lck-GLK，T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠。Lck-GLK；IKKβf/f；CD4-Cre，用IKKβ條件基因敲除小鼠繁殖之T-細胞特異性GLK轉殖基因小鼠。原始放大
率，×630；條，10μm。
圖6顯示TCR信號傳導誘導RORγt磷酸化及隨後AhR-RORγt相互作用。(A)原代脾T細胞中之p-RORγt(Ser-489)、RORγt、p-IKKβ(Ser-180/181)及IKKβ之免疫印漬。將T細胞用抗CD3抗體加鏈黴抗生物素(streptavidin)刺激。(B)來自用抗CD3抗體加鏈黴抗生物素刺激之鼠科原代脾T細胞之裂解物之內源AhR與RORγt的共免疫沉澱(co-IP)。(C)IKKβf/f或CD4-Cre；IKKβf/f小鼠之原代脾T細胞中之p-RORγt(Ser-489)、RORγt及IKKβ的免疫印漬。將T細胞用抗CD3抗體加鏈黴抗生物素刺激。(D)針對指定小鼠之原代T細胞中之內源AhR與RORγt之間之相互作用(左圖)或AhR與Ser-489磷酸化RORγt之間之相互作用(右圖)之鄰近接合分析(PLA)的共焦顯微術。如(C)刺激T細胞。原始放大率，×630；條，10μm。(E及F)來自指定小鼠之原代脾T細胞之上清液中之各種細胞激素的ELISA。將T細胞用板結合之抗CD3抗體刺激3天。顯示平均值±SD。(G)指定小鼠之原代脾T細胞之RORγt及GAPDH蛋白質之免疫印漬。(H)藉由過度表現GLK或TCR刺激之T細胞中之AhR-RORγt複合體誘導之IL-17A轉錄的示意模型。T-細胞特異性GLK轉殖基因(Lck-GLK Tg)小鼠之T細胞中之GLK過度表現透過PKCθ誘導AhR Ser-36磷酸化且亦透過IKKβ誘導RORγt Ser-489磷酸化。一旦RORγt經磷酸化，RORγt直接與AhR相互作用。經磷酸化之AhR負責將RORγt轉運至細胞核。AhR-RORγt複合體結合至IL-17A啟動子之RORγt-結合元件(-877至-872)及AhR-結合元件(-254至-249)二者，其導致誘導IL-17A轉錄。於正常T細胞中，T-細胞受體(TCR)刺激亦誘導GLK激酶活性及下游信號傳導，包括IKKβ活化、RORγt Ser-489磷酸化及AhR-RORγt相互作用。除了NF-κB外，亦需要其
他關鍵轉錄因子(諸如NFAT1或AP-1)用於T細胞中之IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及TNF-α之轉錄活化。「其他」表示其他關鍵轉錄因子。需要NF-κB用於TCR誘導之多種細胞激素之產生；然而，GLK-IKKβ-NF-κB級聯單獨不足以誘導多種細胞激素。共同地，GLK過度表現或TCR信號傳導透過T細胞中之AhR及RORγt誘導IL-17A轉錄。
圖7顯示於SLE患者中GLK+ Th17細胞之頻率增加。(A至D)來自6名健康對照及18名SLE患者之外周血白血球之GLK+及IL-17+ T細胞(CD3-閘控、CD3加CD4-閘控、CD3加CD8-閘控、或CD3加CD4-CD8-(雙負向(DN)-閘控))的流動式細胞測量術；左圖中顯示代表性健康對照(HC)及代表性SLE患者(SLEDAI=12)之結果。SLEDAI表示全身性紅斑狼瘡疾病活性指數。(E)顯示健康對照組及SLE患者組中之GLK+IL-17+ T細胞之統計分析。(F)SLEDAI與來自所有SLE患者(紅色)及健康對照(藍色)之CD4+ T子集中之GLK+IL-17+ T細胞之頻率之間的正相關及顯著回歸。(皮爾森(Pearson)相關係數：r=0.729，P=0.000053)。(G)用於檢測活性SLE(SLEDAI≧12)之T-細胞子集(CD3+、CD4+、CD8+或DN子集)中之GLK+IL-17+細胞之頻率的接受者操作特徵(ROC)曲線。CD3+ T細胞(0.935，P=0.002)、CD4+ T子集(0.944，P=0.001)、CD8+ T子集(0.792，P=0.036)及DN T子集(0.759，P=0.062)之GLK+IL-17+亞群之曲線下面積(AUC)值。
圖8顯示人類自體免疫T細胞中經磷酸化之RORγt與AhR相互作用。(A)藉由放大發光鄰近均質分析(ALPHA)測定之HEK293T細胞之裂解物中之Myc-AhR與Flag-RORγt之間之相互作用(<200nm)的信號。顯示平均值±SD。p-RORγt肽表示S489磷酸化之RORγt肽，482-
LFSTDVE{pS}PEGLSK-495。(B)自3名SLE患者、1名RA患者及3名HC新鮮單離之外周血T細胞中之p-RORγt(Ser-489)及RORγt的免疫印漬。(C)針對外周血T細胞中之AhR與RORγt之間之相互作用之PLA的共焦顯微術，該等T細胞自5名SLE患者、3名RA患者及2名健康對照新鮮單離。(D)針對來自2名SLE患者、2名RA患者及1名健康對照之外周血T細胞中之內源AhR與經磷酸化之RORγt之間之相互作用之PLA的共焦顯微術。SLE，全身性紅斑狼瘡；RA，類風濕性關節炎；HC，健康對照。原始放大率，×630；條，10μm。
圖9顯示GLK抑制劑C1(維替泊芬)阻斷AhR-RORγt複合體。(A)NF-κB驅動之報告基因分析於用或不用指定濃度下之GLK抑制劑C1(維替泊芬)處理之穩定GLK轉染之CHO-K1細胞中的螢光素酶活性。倍數變化相對於載體對照之值呈現。(B)在GLK抑制劑C1(維替泊芬)之存在或不存在下使GLK激酶域之重組蛋白加GST標記之激酶死亡PKCθ(K409W)之重組蛋白經歷活體外激酶分析。顯示平均值±SD。*，P值<0.05；**，P值<0.01(雙尾學生t檢驗)。(C)AhR-RORγt複合體藉由GLK抑制劑抑制。用C1(維替泊芬)(5μM)處理30分鐘之外周血T細胞中之AhR與RORγt或磷酸-RORγt(S489)之間之相互作用之鄰近接合分析(PLA)的共焦顯微術。該等T細胞自4名SLE患者及1名RA患者新鮮單離。C1表示維替泊芬；C2表示阿來西定二鹽酸鹽。(D)(C)之PLA信號之定量。(E)用CFP-AhR、YFP-RORγt及IKKβ質粒共轉染之HEK293T細胞之FRET分析。
表10顯示GLK誘導之AhR-RORγt複合體之抑制劑抑制小鼠中之IL-17產生及自體免疫反應。(A至C)GLK抑制劑C1(維替泊芬)投
與(0.556nmol/g每3天持續30天)對Lck-GLK Tg小鼠中之血清IL-17A及自體抗體之作用。(B)用C1(維替泊芬)或PBS處理之Lck-GLK Tg小鼠中之指定血清細胞激素之ELISA。(C)用C1(維替泊芬)或PBS處理之Lck-GLK Tg小鼠中之血清自體抗體之ELISA。顯示平均值±SEM。(D)用PBS或GLK抑制劑C1(維替泊芬)及C2處理之野生型小鼠中之實驗自體免疫腦脊髓炎(EAE)誘導。以1至5之標度呈現臨床評分(左圖)。在第16天MOG免疫小鼠之血清中之IL-17A之ELISA(右圖)。(E)用GLK抑制劑C1(維替泊芬)或PBS處理之野生型小鼠中之膠原蛋白誘導之關節炎(CIA)誘導。以1至16之標度呈現臨床評分(左圖)。在第28天膠原蛋白免疫小鼠之血清中之IL-17A之ELISA。顯示平均值±SEM。*，P值<0.05；**，P值<0.01；***，P值<0.001(雙尾學生t-檢驗)。C1表示維替泊芬；C2表示阿來西定二鹽酸鹽。
圖11顯示維替泊芬抑制Th17分化但是增強Treg分化。(A)產生IL-17A之CD4+ T細胞之流動式細胞測量術。於活體外在Th17分化期間將脾T細胞用維替泊芬(C1)(1或5μM)共處理。(B)產生IL-17A之CD4+ T細胞之流動式細胞測量術。將鼠科活體外分化之Th17細胞用PMA加伊屋諾黴素(ionomycin)刺激及用維替泊芬(C1)(1或5μM)共處理30分鐘。(C)產生Foxp3之CD4+ T細胞之流動式細胞測量術。於活體外在Treg分化期間將脾T細胞用維替泊芬(C1)(5μM)共處理。(D)產生Foxp3之CD4+ T細胞之流動式細胞測量術，該等細胞自野生型或Lck-GLK轉殖基因小鼠之CD4+ T細胞分化。
圖12顯示GLK誘導之AhR-RORγt複合體之抑制劑阻斷人類T細胞之IL-17產生。(A)用抗CD3/CD28刺激及用C1(維替泊芬)(5μM
或10μM)處理3天之鼠科原代T細胞之上清液中之各種細胞激素的ELISA。顯示平均值±SD。(B)人類T細胞之上清液中之IL-17A之ELISA。將T細胞用抗CD3/CD28刺激及用C1(維替泊芬)(1μM或5μM)或C2(1μM或5μM)處理3天。HC，健康對照；SLE，全身性紅斑狼瘡；RA，類風濕性關節炎；AS，強直性脊柱炎；PsA，牛皮癬性關節炎；PSS，原發性修格蘭氏(Sjögren's)症候群。顯示平均值±SD。C1表示維替泊芬；C2表示阿來西定二鹽酸鹽。
圖13顯示GLK誘導肺癌之遠端轉移。(A)Pol II-GLK轉殖基因構築體之示意圖。於GLK轉殖基因小鼠中，人類GLK cDNA藉由小鼠RNA聚合酶II(Pol II)啟動子驅動。(B)來自小鼠之鼠科外周血細胞中之轉殖基因人類GLK(hGLK)mRNA含量之即時PCR。將人類GLK mRNA含量標準化至小鼠Srp72 mRNA含量。顯示平均值±SEM。WT，野生型同窩對照；Pol II-GLK，Pol II-GLK轉殖基因小鼠。(C)來自8個月齡野生型(WT)、SPA-EGFRdel轉殖基因或SPA-EGFRdel；Pol II-GLK轉殖基因小鼠之肺組織之肺癌標記增殖細胞核抗原(PCNA)或H&E染色的代表性免疫組織化學。標度條，100μm。(D及E)來自1歲指定小鼠之肺(D)、頸部淋巴結(E)、腦(E)或肝(E)之EGFR缺失突變體表現或H&E染色的代表性免疫組織化學。LN，頸部淋巴結。標度條，100μm。
圖14顯示GLK抑制劑阻斷細胞自指定癌症之遷移。用GLK抑制劑C1(維替泊芬)(A；2μM或5μM)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)(B；2μM或5μM)處理之人類神經膠質瘤U87細胞、人類胰癌Panc-1、小鼠肺癌LL2細胞或人類肝癌Huh-7細胞之跨孔(Transwell)遷移分析。C1表示維替泊芬；C2表示阿來西定二鹽酸鹽。
圖15顯示GLK抑制劑抑制肺癌異種移植模型中之腫瘤生長。(A)將鼠科TC-1肺癌細胞皮下接種至野生型小鼠之右腹以建立TC-1異種移植模型。每3天將接種TC-1細胞之小鼠靜脈內注射PBS、C1(維替泊芬)(10uM)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)(17uM)持續15天。(B)於接受PBS、C1(維替泊芬)(10uM)或C2(17uM)處理後切除TC-1肺癌之照片。(C)量測腫瘤生長(平均腫瘤體積)持續15天。TC-1腫瘤尺寸進展作為投與C1或C2後之時間之函數。N.D.，不可檢測。C1表示維替泊芬；C2表示阿來西定二鹽酸鹽。
圖16顯示GLK抑制劑抑制小鼠中之肺癌轉移。(A)GLK激酶域結構與C1(維替泊芬)之分子對接。三維結構模型描述C1與預測之含有經磷酸化之Ser-170之GLK激酶域的結合。假定結合親和力為-7.4kcal/mol。(B)GLK激酶域結構與C2(阿來西定二鹽酸鹽)之分子對接。三維結構模型描述C2與預測之含有經磷酸化之Ser-170之GLK激酶域的結合。假定結合親和力為-7.0kcal/mol。(C)Flag標記之GLK與GFP融合GLK使用用Flag-GLK及GFP-GLK質粒共轉染之HEK293T細胞之裂解物的共免疫沉澱(co-IP)。將細胞用C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)處理。(D)於LLC/luc轉移性肺癌小鼠模型中每3天投與GLK抑制劑C1(0.556nmol/g)或C2(0.085nmol/g)持續30天。(E)藉由IVIS光譜檢測用C1(維替泊芬)、C2(阿來西定二鹽酸鹽)或媒劑處理之小鼠之螢光素酶活性。(F)定量自(e)之圖像中之LLC/luc細胞發射之光子之發光強度。(G)來自用C1(維替泊芬)、C2或媒劑處理之小鼠之肺組織之H&E的代表性免疫組織化學。標度條，0.5cm。(H)於LLC/luc轉移性肺癌小鼠模型中用C1(維替泊芬)、C2(阿來西定二鹽酸鹽)或媒劑處理之小鼠之肺組織中之GLK
與IQGAP1(上圖)或經磷酸化之IQGAP1 Ser-480(下圖)之間之相互作用的原位PLA分析。原始放大率，x40。
圖17顯示GLK缺乏小鼠顯示增加之壽命。(A)藉由生命表方法計算10隻野生型小鼠或15隻GLK缺乏小鼠之生存曲線。GLK缺乏小鼠展示相對於野生型小鼠之顯著延長之壽命(威爾科克森(Wilcoxon)檢驗，P=0.001)。(B)16個月齡野生型小鼠顯示灰毛髮，然而38個月齡GLK缺乏小鼠仍顯示健康毛髮。(C)4.5個月齡野生型小鼠、20個月齡野生型小鼠或20個月齡GLK缺乏小鼠之血清中之各種細胞激素之ELISA。顯示平均值±SEM。WT，野生型小鼠；GLK KO，GLK缺乏小鼠。*，P值<0.05；**，P值<0.01(雙尾學生t-檢驗)。
圖18顯示GLK與IQGAP1直接相互作用。(A)在酪胺酸磷酸酶抑制劑過釩酸鹽(25μM)之存在或不存在下來自用空載體或Flag標記之GLK轉染之HEK293T細胞之抗Flag免疫沉澱的銀染凝膠。箭頭指示GLK或GLK相互作用蛋白質之位置。(B)列出GLK蛋白質之四種過釩酸鹽誘導之酪胺酸磷酸化殘基。(C及D)來自用Flag標記之GLK、Myc標記之IQGAP1或兩種質粒轉染之HEK293T細胞之裂解物之抗Flag(C)或抗Myc(D)免疫複合體的共免疫沉澱。在各圖底部顯示在免疫沉澱(Pre-IP)之前之全細胞裂解物免疫印漬。使用β-微管蛋白作為內對照(loading control)。(E)來自用Flag標記之GLK或Flag標記之GLK突變體(Y366F、Y379F、Y574F或Y735F)轉染之HEK293T細胞之裂解物之抗Flag免疫複合體的共免疫沉澱。將HEK293T細胞用25μM過釩酸鹽處理2小時。(F)用空載體、3xFlag標記之GLK、Myc標記之IQGAP1或GLK連同IQGAP1質粒轉染之HEK293T細胞之原位PLA。箭頭指示PLA信號(紅色斑點)。原始放大率，
x40。標度條，10μm。(G)在圖上顯示每個區域之各組之相對PLA信號。(H)用編碼CFP-及YFP-融合之GLK及IQGAP1蛋白質之指定質粒轉染之HEK293T細胞的FRET分析。FRET信號藉由C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)之處理抑制(右圖)。(I)經純化之Flag標記之GLK及Myc標記之IQGAP1蛋白質之共免疫沉澱(Co-IP)。將來自HEK293T細胞裂解物之Flag標記之GLK及Myc標記之IQGAP1蛋白質各自用Flag及Myc肽溶離。
**，P值<0.01；***，P值<0.001。
圖19顯示IQGAP1在Ser-480處藉由GLK之磷酸化控制肺癌細胞遷移。(A)活體外激酶分析及經純化之野生型GLK、激酶死亡GLK及IQGAP1之免疫印漬。然後藉由Typhoon掃描器(GE)定量IQGAP1之磷酸化。(B)將活性(GTP結合)Cdc42蛋白質自用Cdc42及GLK加IQGAP1或IQGAP1(S480A)突變體共轉染之HEK293T細胞之裂解物免疫沉澱，接著免疫印漬分析。下圖顯示IQGAP1與Cdc42之間之共免疫沉澱(相互作用)。(C)將活性(GTP結合)Rac1蛋白質自用Rac1及GLK加IQGAP1或IQGAP1(S480A)突變體共轉染之HEK293T細胞之裂解物免疫沉澱，接著免疫印漬分析。下圖顯示IQGAP1與Rac1之間之共免疫沉澱(相互作用)。(D及E)使用G-LISA活性分析Biochem套組測定如(B)或(C)中之細胞裂解物之Cdc42或Rac1酵素活性。陽性，來自分析套組之陽性對照。SA，IQGAP1(S480A)突變體。(F)用Flag標記之GLK或GLK(P436/437A；P478/479A)質粒加表現Myc標記之IQGAP1、IQGAP1(S480A)或IQGAP1(△WW)之質粒轉染之HCC827細胞的遷移分析。原始放大率，x10。標度條，20μm。(G)在圖上顯示每個區域之遷移細胞之相對數目。(H)來自用指定質粒轉染之HCC827細胞之GLK及IQGAP1蛋白質之免疫印
漬。(I)用Flag標記之活化形式GLK(E351K)加Myc標記之IQGAP1 WT或IQGAP1-S480A突變體共轉染之HEK293T細胞中之磷酸-IQGAP1(Ser-480)的免疫印漬。*，P值<0.05。
圖20顯示GLK誘導肺癌之遠端轉移。(A)構成性活化GLK(E351K)突變體較野生型GLK誘導IKK之更高磷酸化含量。來自用指定質粒轉染之Jurkat T細胞之磷酸-IKK及GLK蛋白質之免疫印漬。使用微管蛋白作為內對照。(B)GLK或GLK(E351K)突變體蛋白質之基於ADP之激酶分析。將Flag標記之GLK或GLK(E351K)蛋白質自經轉染之HEK293T細胞裂解物免疫沉澱。(C)Pol II-GLK-E351K轉殖基因構築體之示意圖。構成性活化人類GLK(E351K)突變體cDNA藉由小鼠RNA聚合酶II(Pol II)啟動子驅動。(D)來自小鼠之鼠科外周血細胞中之轉殖基因人類GLK-E351K(hGLKE351K)mRNA含量的即時PCR。將人類GLK mRNA含量標準化至小鼠Srp72 mRNA含量。WT，n=4；Pol II-GLKE351K，n=4。顯示平均值±SEM。WT，野生型同窩對照；Pol II-GLKE351K，GLKE351K轉殖基因小鼠。(E)SPA-EGFRdel轉殖基因小鼠及SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K轉殖基因小鼠之肺癌中之GLK表現的免疫組織化學。標度條，100μm。(F)7個月齡SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K轉殖基因小鼠及SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K；IQGAP1-/-小鼠之肺癌中之EGFR缺失突變體表現及H&E染色的代表性免疫組織化學。標度條，100μm。(G)7個月齡SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K轉殖基因小鼠及SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K；IQGAP1-/-小鼠之腦及肝中之EGFR缺失突變體表現或H&E染色的代表性免疫組織化學。標度條，100μm。來自個別組之組織中之EGFR缺失突變體表現之比較(下圖)。
圖21顯示GLK-IQGAP1複合體與人類NSCLC之不良生存率具有相關性。(A)來自代表性患者之癌旁正常組織、鱗狀細胞癌(一種NSCLC)組織、腺癌(一種NSCLC)組織及小細胞肺癌(SCLC)組織中之GLK與IQGAP1之間之相互作用的原位PLA分析。原始放大率，x40。(B)在圖上顯示各組每個組織之GLK與IQGAP1之間之相互作用的PLA信號。NSCLC包括鱗狀細胞癌(SCC，n=56)、腺癌(ADC，n=17)、細支氣管肺泡癌(BC，n=11)及大細胞癌(LCC，n=8)。癌旁正常(NA)組織，n=68。小細胞肺癌(SCLC)，n=3。(C)根據NSCLC(n=66)之GLK-IQGAP1 PLA信號(PLA信號-高對PLA信號-低)之Kaplan-Meier生存估計。使用對數等級檢定(log-rank test)計算P值。(D)肺、淋巴結及骨組織之轉移性NSCLC細胞中之GLK與IQGAP1之間之相互作用的原位PLA。使用PCNA染色(綠色，FITC)標記肺癌細胞。虛線指示肺組織中之血管之血管壁。(E)使用對應於IQGAP1及磷酸-IQGAP1(Ser-480)之成對PLA探針之組合之代表性鱗狀細胞癌患者及代表性腺癌患者之腫瘤組織中之經磷酸化之IQGAP1 Ser-480的原位PLA。使用PCNA染色(綠色，FITC)標記肺癌細胞。原始放大率，x40。(F)在圖上顯示各組每個組織之GLK與IQGAP1之間之相互作用的PLA信號。NSCLC包括鱗狀細胞癌(SCC，n=53)、腺癌(ADC，n=17)、細支氣管肺泡癌(BC，n=11)及大細胞癌(LCC，n=8)。癌旁正常(NA)組織，n=68。小細胞肺癌(SCLC)，n=3。(G)根據NSCLC(n=63)之p-IQGAP1(Ser-480)PLA信號(PLA信號-高對PLA信號-低)之Kaplan-Meier生存估計。在組織陣列中，組織陣列片上之三個SCC組織受到破壞；因此，僅分析66個組織中63者。使用對數等級檢定計算P值。
術語「抗磷酸-RORγt[Ser489]抗體」係指「針對經磷酸化之RORγt絲胺酸-489之抗體，其可藉由將兔用磷酸-肽(例如，鼠科RORγt抗原決定基：483FSTDVE[pS]PEGLSK495；SEQ ID NO：5)免疫化而產生」。
術語「過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞」係指用3種各自編碼AhR、RORγt及IKKβ之不同質粒共轉染且該等三種蛋白質於細胞中會呈現過度表現之細胞。
術語「作為PLA探針之二級抗體」係指經一對寡核苷酸標記之二級抗體，其為DUOLINK®抗兔PLUS及抗小鼠MINUS PLA探針。此等探針為抗小鼠IgG及抗兔IgG。
縮略語：青色螢光蛋白(CFP)；黃色螢光蛋白(YFP)；DYKDDDDK(SEQ ID NO：1；FLAGTM肽)；芳烴受體(AhR；SEQ ID NO：29)；視黃酸受體相關之孤兒核受體γt(RORγt)(或RAR相關之孤兒受體γ，轉錄變異體2；SEQ ID NO.：30)；類ras GTP酶活化蛋白IQGAP1(SEQ ID NO：28)；Mus IL17A啟動子序列(SEQ ID NO：31)。
吾人已發現GLK信號傳導透過PKCθ及IKKβ會誘導AhR與磷酸-RORγt之間之新穎相互作用，導致IL-17A轉錄活化及自體免疫反應。本發明對本技術做出下列貢獻：(1)RORγt絲胺酸-489磷酸化位點；(2)AhR/磷酸-RORγt複合體；(3)IKKβ將RORγt絲胺酸-489磷酸化；(4)GLK-PKCθ-IKKβ-AhR/RORγt-IL-17A；(5)GLK信號傳導選擇性誘導IL-17A轉錄；(6)TCR刺激亦誘導RORγt絲胺酸-489磷酸化；(7)人類自體免疫患者T細胞中之GLK過度表現誘導之RORγt絲胺酸-489磷酸化及AhR/磷
酸-RORγt複合體；及(8)抑制AhR/磷酸-RORγt複合體、IL-17A產生或自體免疫反應之2種小分子GLK抑制劑之識別。吾人之發現結果表明，GLK或AhR/RORγt複合體形成之抑制劑(諸如維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽)可用作IL-17A介導之自體免疫疾病之IL-17A阻斷劑。
方法
小鼠。在國家衛生研究院(National Health Research Institutes/NHRI)下於AAALAC認可之動物居住設施中進行所有動物實驗。根據由機構動物護理(Institutional Animal Care)及NHRI之使用委員會批准之方案及指導方針使用所有小鼠。側接lox P之(floxed)AhR小鼠(JAX 0062003)、IL-17A缺乏小鼠(JAX 016879)、側接lox P之RORγt小鼠(JAX 008771)及側接lox P之IKKβ小鼠(EMMA 001921)係購自傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)或歐洲小鼠突變體檔案(European Mouse Mutant Archive，EMMA)。將三種上述小鼠系回交10代至C57BL/6背景。此研究中呈現之數據在性別匹配之4週至26週齡同窩活仔上進行。針對T細胞發育分析，使用5週齡性別匹配之小鼠。將此研究中所用之所有小鼠維持於溫度控制及無病原體籠中。
Lck-GLK轉殖基因小鼠及PKCθ基因敲除小鼠之產生。將編碼全長人類GLK之序列放在近端lck啟動子之下游。使用原核顯微注射產生C57BL/6背景中之Lck-GLK Tg小鼠。使用兩個獨立Lck-GLK Tg小鼠系。藉由TALEN介導之基因靶向產生PKCθ基因敲除小鼠。於突變對偶基因中刪除PKCθ內含子1及外顯子2之核苷酸5’-
GGTGGAACACTAAAAATAATATGTCTTAGAGCCCCATACATACAGTGTTTGTCTTTTGTCATTTTTCTAGGGAACAACCATGTCACCGTTTC-3’(SEQ ID NO：2)。針對小鼠中TALEN介導之基因靶向，進行TALEN mRNA之胚胎顯微注射。
Pol II-GLK轉殖基因小鼠及IQGAP1基因敲除小鼠之產生。
藉由NHRI轉殖基因小鼠核心，使用原核顯微注射產生C57BL/6背景中之Pol II-GLK Tg小鼠及Pol II-GLKE351K Tg小鼠。將編碼全長人類GLK之區域(野生型或E351K突變體)放在RNA聚合酶II(Pol II)啟動子之下游。藉由NHRI轉殖基因小鼠核心，使用TALEN mRNA之胚胎顯微注射產生C57BL/6背景中之IQGAP1基因敲除小鼠。於突變對偶基因中刪除IQGAP1外顯子1之核苷酸(nt)161鳥嘌呤。
細胞。於含有10%胎牛血清加盤尼西林(penicillin)(10個單位/ml)及鏈黴素(streptomycin)(10mg/ml)之RPMI-1640培養基(Invitrogen)中培養人類Jurkat T白血病細胞(TIB-152)。於含有10% FCS加盤尼西林(10個單位/ml)及鏈黴素(10mg/ml)之杜爾貝克改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中培養HEK293T細胞。測試使用之所有細胞系及證實支原體陰性。使用對CD11b、B220、CD49b、CD235及TER-119(MACS)磁偶聯之抗體自小鼠之脾、淋巴結或外周血陰性選擇原代鼠科T細胞。為誘導3天培養之T細胞之IL-17A產生(圖1E)，將原代T細胞在37℃下用生物素結合之抗CD3抗體(3μg/ml)加鏈黴抗生物素(3μg/ml)刺激3小時。
試劑及抗體。GLK抗體(α-GLK-N)藉由將兔用肽(鼠科GLK
抗原決定基：4GFDLSRRNPQEDFELI19；SEQ ID NO：3；等同於人類GLK蛋白質序列4-19)免疫而產生及用於圖2E、3D至E及4F。抗GLK單株抗體(純系C3)藉由將小鼠用肽(鼠科GLK抗原決定基：514EQRGTNLSRKEKKDVPKPI533；SEQ ID NO：4)免疫而產生及用於圖3F、3I。磷酸化之RORγt Ser-489之抗體藉由將兔用磷酸-肽(鼠科RORγt抗原決定基：483FSTDVE[pS]PEGLSK495；SEQ ID NO：5；對應於人類RORγt蛋白質序列485FSTETE[pS]PVGLSK497；SEQ ID NO：6)免疫而產生。抗Myc(純系9E10)、抗Flag(純系M2)及抗HA(純系12CA5)抗體係購自Sigma。抗p-AhR(Ser-36；#A0765)抗體係購自Assay Biotechnology。抗AhR(純系RPT9)、抗p-IKKβ(Ser-180/181；#ab55341)及抗GAPDH(純系mAbcam 9484，目錄號#ab9482)抗體係購自Abcam。抗PKCθ(#3551-1)及抗肌動蛋白(純系E184)抗體係購自Epitomics。抗p-PKCθ(Thr-538；#ab63365)、抗p-STAT3(Tyr-705；純系D3A7)、抗IKKα(#2682)、抗IKKβ(#2678)、抗p-SGK1(Thr-256；#2939)、抗SGK1(純系D27C11)、抗組蛋白3(#9715S)、抗IRF4(#4964S)及抗BATF(#8638S)抗體係購自Cell Signaling。抗STAT3(#06-596)及抗RORγt(純系6F3.1)抗體係購自Millipore。抗KLF4(#AF3158)及抗IL-23受體(#bs-1460)抗體各自係購自R&D及Bioss。
質粒及重組蛋白。先前報導GLK及GLK激酶死亡突變體(GLK-K45E)之表現質粒。藉由將個別cDNA次選殖至pCMV6-AC-CFP、pCMV6-AC-YFP、pCMV6-AC-Myc、pCMV6-AC-HA或pCMV6-AC-Flag載體構築CFP標記之PKCθ、YFP標記之AhR、CFP標記之AhR、Myc標記之PKCθ、HA標記之AhR及Flag標記之PKCθ質粒。藉由將RORγt
cDNA次選殖至pCMV6-AN-Flag或pCMV6-AN-YFP載體構築FLAGTM標記之RORγt及YFP標記之RORγt質粒。藉由將IKKβ cDNA次選殖至pRC-HA載體構築HA標記之IKKβ質粒。藉由定點誘變產生HA標記之AhR-S36A突變體及Myc標記之PKCθ-K409W(激酶死亡)突變體質粒。亦藉由次選殖至pGEX4T載體個別構築GST標記之PKCθ及GST標記之PKCθ-K409W質粒。將人類GLK shRNA(5’-GTGCCACTTAGAATGTTTGAAA-3’；SEQ ID NO：7)次選殖至pSUPER-GFP載體(OligoEngine)。IL-17A報告基因質粒為來自Dr.Warren Strober之禮物(Addgene質粒#20124)。根據製造商之方案使用PHUSIONTM DNA聚合酶(Thermo Fisher)藉由定點誘變產生含有AhR、RORγt(-877)、RORγt(-120)或STAT3之突變結合元件之IL-17A啟動子構築體。使用下列引子進行誘變(以粗體字體顯示突變的核苷酸)：AhR結合位點，5’-ATGTCCATACA T ACATG ATACTGAATCACAGC-3’(SEQ ID NO：8)；RORγt結合位點(-887)，5’-CTCAAAGACATAAAGGCAA CC GTGA TCTCATGG AGAGGAGAG-3’(SEQ ID NO：9)；RORγt結合位點(-120)，5’-GGTTCTGTGC TGCAAT CATTTGAGG(SEQ ID NO：10)；STAT3結合位點，5’-AGACAGATGTTGC CTGTCA TAAAGGGGTGGTT-3’(SEQ ID NO：11)。藉由DNA定序驗證突變體構築體。質粒pGL4.43-Luc2P-XRE(AhR回應性XRE-Luc)、pGL4.47-Luc2P-SIE(STAT3回應性SIE-Luc)、pGL4.32-Luc2P-NF-κB-RE-Hygro及pGL4螢光素酶報告基因載體係購自Promega。藉由將RORγt(-877)回應元件之四個副本選殖至pGL4.43螢光素酶報告基因載體構築RORγt(-877)回應元件驅動報告基因之質粒。針對
活體外結合分析，將經純化之AhR蛋白質自經HA-AhR轉染之HEK293T細胞單離，接著HA-肽溶離。經純化之重組GST-PKCθ及GST-IKKβ蛋白質係購自SignalChem。經純化之重組6xHis-RORγ蛋白質係購自MyBioSource。將GST標記之PKCθ K409W蛋白質之重組蛋白自大腸桿菌(E.coli)(BL21)單離及然後藉由GST-沉降分析純化。將經純化之Flag標記之RORγt蛋白質免疫沉澱及然後用來自HEK293T細胞之裂解物之Flag肽溶離，該等細胞經Flag-RORγt加CFP-IKKβ或載體共轉染。經純化之GST標記之AhR之重組蛋白係購自Abnova。
螢光素酶報告基因分析。將2-kb IL-17A啟動子驅動螢火蟲-螢光素酶報告基因質粒及海腎(renilla)-螢光素酶對照質粒(pRL-TK)共轉染至Jurkat T細胞。於24小時後，收穫106個細胞，用PBS洗滌，及再懸浮於60μl RPMI培養基加60μl裂解緩衝液中。數據表示螢火蟲-螢光素酶活性與海腎-螢光素酶活性之比率之平均值。
酶聯免疫吸附分析(ELISA)。藉由購自eBioscience之個別ELISA套組分析IL-1β、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α及TGF-β之血清含量。使用來自Biolegend之ELISA套組測定IL-17A含量。藉由購自Alpha Diagnostic International之ELISA套組分析抗核抗體(ANA)、抗dsDNA抗體及類風濕因子(RF)之血清含量。
放大發光鄰近均質分析(ALPHA)。根據來自Perkin Elmer Life Sciences之製造商之方案進行ALPHA技術/蛋白質間相互作用分析。當蛋白質-供體對係於200nm內時，藉由EnVision 2104多標記閱讀器偵測發光信號。
螢光共振能量轉移(FRET)分析。藉由EnVision 2104多標
記板式閱讀器(Perkin Elmer)檢查活細胞中之FRET信號。藉由透過430-nm濾波器(具有8nm頻寬)之光激發反應，及記錄透過530-nm濾波器(具有8nm頻寬)之發射螢光之強度。若蛋白質-蛋白質對緊密鄰近(1至10nm)，則將檢測到530-nm信號。使用下列公式計算FRET效率：FRET效率=((FRET-CFP×a-YFP×b)/YFP)×100%，其中FRET、CFP及YFP各自對應於透過FRET、CFP及YFP過濾裝置獲得之螢光強度；a及b各自為供體發射及接受體激發串擾比率。
AhR-RORγt複合體之原位鄰近接合分析(PLA)。根據製造商之說明使用DUOLINK®原位紅色起始(In Situ Red Starter)套組(Sigma)進行PLA分析。簡言之，將細胞用針對各分子對(AhR加PKCθ、AhR加RORγt或Flag加Myc)之兔或小鼠初級抗體培育，接著用與寡核苷酸(PLA探針)結合之物種特異性二級抗體培育。於接合及擴增反應後，藉由螢光顯微鏡(Leica DM2500)或共焦顯微鏡(Leica TCS SP5 II)將來自緊密鄰近(<40nm)之各對PLA探針之PLA信號形象化為個別紅點。各紅點表示直接相互作用。
GLK-IQGAP1複合體及磷酸化之IQGAP1之原位鄰近接合分析(PLA)。
將接種在無菌蓋玻片上之細胞用Flag標記之GLK及Myc標記之IQGAP1表現質粒共轉染，接著固定，滲透及阻斷。根據製造商之說明使用DUOLINK® In Situ-Red套組(Sigma)進行GLK-IQGAP1複合體之原位PLA分析。
針對使用人類肺組織之實驗，將組織切片脫蠟，抗原擷取
及非特異性結合阻斷，接著使用針對IQGAP1(1：4,000，CUSABIO)加GLK(1：3,000，mAb純系C3)或磷酸-IQGAP1 Ser-480(1：2,000，Allbio Science)之初級抗體原位PLA分析。藉由將小鼠用磷酸-肽(人類IQGAP1抗原決定基：473NTVWKQL[pS]SSVTGLT487；SEQ ID NO：32)免疫來產生磷酸化之IQGAP1 Ser-480之單株抗體。然後將組織切片用與寡核苷酸(PLA探針)結合之物種特異性二級抗體培育，接著接合及擴增反應。將GLK-IQGAP1複合體或磷酸化之IQGAP1/組織(3.14mm2)之PLA信號的數目計數。
染色質免疫沉澱(ChIP)分析。在室溫下將小鼠之外周血T細胞與1%甲醛交聯10分鐘。將裂解物在冰上音波處理(3×9秒)以產生隨機DNA片段(200至1,000bp)。將細胞提取物在4℃下在旋轉輪上用5μg抗RORγt、抗AhR或抗STAT3抗體加蛋白質G DYNABEADSTM(Invitrogen)免疫沉澱4小時。於洗滌3次後，將隨機DNA片段(包括IL-17A啟動子片段)與轉錄因子(諸如RORγt、AhR或STAT3)之間之免疫複合體在94℃下培育15分鐘用於逆向交聯，及然後用蛋白酶K處理。將DNA片段使用PCR純化套組純化及經歷PCR達35個循環。含有RORγt結合位點(-877至-872)及(-120至-115)、AhR結合位點(-254至-249)、STAT3結合位點(-150至-145)、IRF4結合位點(-429至-421)、KLF4結合位點(-1097至-1083)或BATF(-243至-176)之IL-17A啟動子之引子為：RORγt(-877至-872)，正向5’-CTGAAGAGCTGGGACCTAATG-3’(SEQ ID NO：12)，逆向5’-GACTACTAACAGGAGGAGATG-3’(SEQ ID NO：13)；RORγt(-120至-115)，正向5’-GGTTCTGTGCTGACCTCATTTGAG-3’(SEQ ID NO：14)，逆向5’-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3’(SEQ ID NO：15)；
AhR，正向5’-GAGACTCACAAACCATTACTATG-3(SEQ ID NO：16)，逆向5’-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3’(SEQ ID NO：17)；STAT3，正向5’-GAGACTCACAAACCATTACTATG-3’(SEQ ID NO：18)，逆向5’-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3’(SEQ ID NO：19)；IRF4，正向5’-GGGCAAGGGATGCTCTCTAG-3’(SEQ ID NO：20)，逆向5’-CTGAAGCTGCTGCAGAGCTG-3’(SEQ ID NO：21)；KLF4，正向：5’-GGGTATTATCCCAAGGGTATCC-3’(SEQ ID NO：22)，逆向5’-ATGCAGCATGAGGTGGACCGAT-3’(SEQ ID NO：23)；BATF，正向：5’-GAACTTCTGCCCTTCCCATCT-3’(SEQ ID NO：24)，逆向5’-CAGCACAGAACCACCCCTTT3’(SEQ ID NO：25)。
免疫沉澱、GST/His沉降及免疫印漬分析。藉由以下進行免疫沉澱：在4℃下將0.5至1mg蛋白質裂解物用1μg抗體預培育1小時，接著添加20μl蛋白質A/G-SEPHAROSE®珠持續3小時。針對GST-及His-沉降分析，將GST標記之蛋白質及His標記之蛋白質加其相互作用蛋白質各自用麩胱甘肽-SEPHAROSE®珠及Ni-SEPHAROSE®珠培育3小時。在4℃下將免疫複合體或GST/His-沉降複合體用裂解緩衝液(1.5mM MgCl2，0.2% NP40，125mM NaCl，5%甘油，25mM NaF，50mM Tris-HCl及1mM Na3VO4)洗滌三次，接著於5X負載緩衝液中在95℃下沸騰3分鐘。進行免疫印漬分析。
活體外GLK激酶分析。使用ADP-GLOTM激酶分析套組藉由量測活體外激酶反應中之ADP產生之速率來測定GLK激酶活性。針對激酶反應，在室溫下將GLK激酶域之重組蛋白(1μg)於激酶緩衝液(40mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl2，0.1mg/ml BSA，10mM DTT及0.1
mM Na3VO4)中用激酶死亡PKCθ之重組蛋白(K409W；0.15μg)加ATP(0.1mM)或髓磷脂鹼性蛋白(MBP)加ATP(0.1mM)培育30分鐘。
對GLK抑制劑之基於細胞之高通量篩選及活體外激酶篩選。針對100,000個分子之代表性庫在約10μM下進行基於細胞之高通量篩選。使用表現GLK及NF-κB螢光素酶報告基因之CHO-GLK-Luc細胞。於1,536孔板中反應體積為5μl(500個細胞)/孔。不存在陽性對照。此高通量篩選運動係成功的，測定之Z'因子為0.57至0.60。然而，細胞係極敏感，及篩選導致總共17,884個潛在命中，該等命中經挑選、再篩選及證實。最後，識別1,392種化合物高度抑制(>80%)CHO-GLK-Luc細胞之GLK誘導之NF-κB螢光素酶活性。針對GLK激酶活性之抑制藉由活體外激酶分析使用激酶死亡PKCθ蛋白質作為受質進一步篩選此等1,392種化合物。自該篩選，識別兩種潛在小分子GLK抑制劑(IC50<10μM)。
除了以上100,000個分子外，亦使用相同基於細胞(>90%抑制)及活體外篩選方法測試經FDA批准之藥物庫之1,200種化合物。自兩種庫(101,200種化合物)，最有效抑制劑為維替泊芬(下文中亦稱作C1)，其為經FDA批准之用於眼睛之黃斑變性之藥物(Newman,2016)。維替泊芬之式為C41H42N4O8。維替泊芬為用於視網膜治療之光活化藥物，然而於此研究中在無任何光化學處理下使用維替泊芬(C1)。
PKCθ或IKKβ之細胞轉染、T細胞刺激、活體外激酶分析及流動式細胞測量術分析。如先前所述進行此等實驗。
免疫螢光及共焦成像。將細胞固定於冷甲醇中2分鐘。於用0.25% Triton X-100滲透1小時後，將細胞用5%牛血清白蛋白(BSA)阻斷2小時。將細胞用初級抗體(1：200稀釋)培育24小時及然後用二級抗體
(1：500稀釋)培育2小時。二級抗體驢抗兔IgG-Alexa Fluor 568及山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488各自係購自Abcam及life technologies。將蓋玻片安裝於具有DAPI(GeneTex)之FLUOROSHIELDTM中及使用Leica TCS SP5共焦顯微鏡分析。
活體外T細胞分化分析。將CD4+脾T細胞自小鼠純化。將細胞(5×105)於塗覆有抗CD3(2μg/ml)及抗CD28(3μg/ml)抗體之48孔板中於1ml RPMI培養基中培養。針對Th17分化，將脾CD4+細胞於含有IL-23重組蛋白(50ng/ml，R&D)、IL-6重組蛋白(20ng/ml，R&D)、TGF-β重組蛋白(5ng/ml，R&D)、抗IL-4(5μg/ml，Biolegend)及抗IFN-γ(5μg/ml，Biolegend)抗體之培養基中培養。針對Th1分化，將CD4+脾細胞於含有IL-12重組蛋白(5ng/ml，R&D)及抗IL-4抗體(1μg/ml，Biolegend)之培養基中培養。
細胞遷移分析。
針對原代細胞遷移分析，將含有10% FBS之200ml IMDM中之2×105個細胞接種於跨孔(8μm孔徑，Corning)之上室，及將下室裝載含有20% FBS之500μm IMDM。針對癌細胞遷移分析，將含有10% FBS之200μl RPMI 1640中之5×104個細胞接種於跨孔(8μm孔徑，Corning)之上室，及將下室裝載含有10% FBS之500mm RPMI 1640。於37℃下培育24小時後，於用無水甲醇固定及用1%結晶紫溶液染色後將遷移至下室之細胞藉由亮場顯微鏡成像及計數。
液相層析-質譜法。於活體外激酶分析後，自INSTANTBLUETM染色之SDS-PAGE凝膠收集Flag標記之RORγt之蛋白質
譜帶。將蛋白質用胰蛋白酶消化及經歷如先前所述之藉由LTQ-Orbitrap Elite混合質譜儀之LC-MS/MS分析。
統計分析。重複所有實驗至少三次。將數據表示為平均值±SEM。使用雙尾學生t-檢驗分析兩個未配對組之間之統計顯著性。認為小於0.05之P值為統計上顯著。
細胞培養物及各種分析可用於進行及實踐本發明，諸如以下：基於細胞之分析：藉由IL-17A ELISA、IL-17A轉錄報告基因分析或免疫印漬測定之使用Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞或活化T細胞之藥物篩選。
建立過度表現GLK之穩定細胞。使用Neon轉染系統(Invitrogen Corporation)將Jurkat細胞用GLK質粒及2-kb IL-17A啟動子驅動之螢火蟲-螢光素酶報告基因質粒轉染。為選擇過度表現GLK之穩定細胞，將細胞於含有新黴素(neomycin)之RPMI-1640中培養至少2週。
IL-17A酶聯免疫吸附分析。將Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞或TCR活化之T細胞於RPMI培養基(200ml)中培育72小時。藉由針對IL-17A之酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定上清液中之IL-17A之含量。
IL-17A啟動子活性之螢光素酶報告基因分析。將106個過度表現GLK之穩定Jurkat細胞再懸浮於60μl RPMI培養基加60μl裂解/螢光素酶緩衝液中。數據表示具有平均值標準誤差(SEM)誤差條之螢火蟲-螢光素酶活性之平均值。
RORγt絲胺酸-489磷酸化。使用抗磷酸-RORγt[S489]抗體使Lck-
GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞或TCR活化之T細胞經歷免疫印漬。
蛋白質間相互作用分析：螢光共振能量轉移(FRET)分析、放大發光鄰近均質分析(ALPHA；PerkinElmer)、鄰近接合分析(PLA)及染色體免疫沉澱(ChIP)分析。
螢光共振能量轉移(FRET)分析。將HEK293T細胞用CFP-AhR、YFP-RORγt及IKKβ質粒共轉染及24小時後使用ENSPIRETM 2300多標記閱讀器偵測螢光強度。在432nm處激發CFP；量測在485nm處發射之所得螢光強度。在485nm處激發YFP；量測在540nm處發射之所得螢光強度。在432nm處激發FRET信號；量測在540nm處發射之所得螢光強度。
放大發光鄰近均質分析(ALPHA)。於總體積20μl之384孔白色Proxiplate中進行AlphaScreen結合分析。AlphaScreen Flag檢測套組係來自PerkinElmer Life Science。呈Flag塗覆提供AlphaScreen供體珠，及將接受體珠結合至抗Myc抗體。將Flag標記之AhR蛋白質及磷酸化之Myc標記之RORγt蛋白質於384孔板中混合在一起(5μl/孔)。當使用HEK293T轉染子(用Flag-AhR、Myc-RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞)時，每孔添加0.2μg裂解物。用於檢測GLK-IQGAP1相互作用，將細胞用Flag-GLK及Myc-IQGAP1共轉染。添加接受體珠(5μl/孔)及培育30分鐘。隨後添加供體珠(5μl/孔)及培育3小時，然後用EnVision多標記閱讀器(PerkinElmer life Science)量測。供體及接受體珠之最終濃度為20μg/ml。於HEPES緩衝液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05% Tween-20，0.5mM DTT)中進行所有稀釋。
原位鄰近接合分析(PLA)。使用Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過
度表現GLK之T細胞、活化T細胞或過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞。根據製造商之說明使用DUOLINK®原位紅色起始套組進行PLA分析。簡言之，將細胞用針對各分子對之兔或小鼠初級抗體(抗AhR抗體+抗RORγt抗體或抗AhR抗體+抗磷酸-RORγt[Ser489]抗體)培育，接著用與寡核苷酸(PLA探針)結合之物種特異性二級抗體培育。於接合及擴增反應後，藉由螢光或共焦顯微鏡將來自緊密鄰近(<40nm)之各對PLA探針之PLA信號形象化為個別紅點。各紅點表示直接相互作用。
共免疫沉澱分析。將HEK293T細胞用Myc-AhR、Flag-RORγt及IKKβ質粒共轉染。針對免疫沉澱，在4℃下將細胞提取物於連續旋轉之裂解緩衝液中用抗Flag瓊脂糖珠或抗Myc瓊脂糖珠培育2小時。將所得免疫沉澱物用裂解緩衝液洗滌三次及用抗Myc或抗Flag免疫印漬。
染色質免疫沉澱(ChIP)分析(用於檢測結合至IL-17A啟動子上之AhR結合位點之RORγt)。在室溫下將Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、活化T細胞或過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞與1%甲醛交聯10分鐘。將裂解物在冰上音波處理(3×9秒)以產生200至1,000bp DNA片段。將細胞提取物在4℃下在旋轉輪上用5μg抗RORγt抗體加蛋白質G DYNABEADSTM免疫沉澱4小時。於洗滌3次後，將免疫複合體在94℃下培育15分鐘用於逆向交聯，及然後用蛋白酶K處理。使用PCR純化套組將DNA片段純化及經歷PCR 35個循環。含有AhR結合位點(-254至-249)之IL-17A啟動子之引子為正向5’-GAGACTCACAAACCATTACTATG-3(SEQ ID NO：26)，逆向5’-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3’(SEQ ID NO：27)。
結果
Lck-GLK轉殖基因小鼠透過IL-17A形成自體免疫疾病
為研究活體內GLK過度表現之結果，吾人產生T-細胞特異性GLK轉殖基因(Lck-GLK Tg)小鼠。Lck-GLK Tg小鼠顯示T細胞及B細胞之正常發展；然而，8與16週齡之間之小鼠顯示後肢及尾之癱瘓、眼睛朦朧、或直腸炎及皮炎症狀。Lck-GLK Tg小鼠亦顯示肝脾腫大及淋巴結及腎腫大。組織學染色顯示此等小鼠之肺炎、腎炎及脾異常之誘導(圖1A)。Lck-GLK Tg小鼠中之血清自體抗體之誘導(圖1B)亦表明此等小鼠中之自體免疫反應之發展。為研究哪種促發炎細胞激素有助於Lck-GLK Tg小鼠之自體免疫疾病，藉由ELISA測定血清細胞激素。出人意料地，僅於4週齡Lck-GLK Tg小鼠之血清中選擇性誘導IL-17A(圖1C)，然而不誘導促發炎細胞激素IFN-γ及TNF-α。一致地，Lck-GLK Tg T細胞之活體外Th17分化相較於野生型T細胞之活體外Th17分化增加，然而Lck-GLK Tg T細胞之活體外Th1分化不受影響。此外，相較於野生型小鼠之未經刺激之T細胞，於Lck-GLK Tg小鼠之未經刺激之T細胞中誘導IL-17A產生。為排除轉殖基因之潛在位置效應，亦表徵第二Lck-GLK Tg小鼠系(Lck-GLK #2)。第二Lck-GLK Tg小鼠系亦顯示T細胞中之GLK過度表現及血清IL-17A含量之誘導。此等資料表明T細胞中之GLK過度表現誘導小鼠中之IL-17A產生。
為證實Lck-GLK Tg小鼠中之IL-17A之致病作用，將Lck-GLK Tg小鼠用IL-17A缺乏小鼠繁殖。GLK誘導之血清IL-17A含量藉由IL-17A缺乏顯著減少，而其他發炎性細胞激素含量不受影響。此外，自體抗體含量於Lck-GLK Tg/IL-17A缺乏小鼠中相較於Lck-GLK Tg小鼠中
之彼等亦顯著減少(圖1D)。Lck-GLK Tg/IL-17A缺乏小鼠顯示相較於Lck-GLK Tg小鼠中之彼等之腎、肝及肺中之浸潤發炎細胞之減少，同時顯示脾中之白髓及紅髓之正常分佈。資料表明IL-17A有助於Lck-GLK Tg小鼠中之自體免疫反應。為進一步證實IL-17A之誘導係由於GLK過度表現，吾人用GLK shRNA處理Lck-GLK T細胞。藉由在Lck-GLK Tg小鼠純化之T細胞中的GLK shRNA基因減弱會消除IL-17A過度產生(圖1E)。此等結果證實GLK過度表現會誘導小鼠中之IL-17A過度產生及隨後自體免疫表現型。
GLK透過活化AhR及RORγt誘導IL-17A轉錄
IL-23受體及磷酸化之STAT3之含量於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中未增加，表明IL-17A過度表現非由於IL-23信號傳導或IL-6/STAT3信號傳導之增強。與IL-17A蛋白質含量一致，IL-17A之mRNA含量於經純化之Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中相較於野生型小鼠之彼等顯著增加(圖2A)。吾人研究IL-17A過度表現是否係由於IL-17A啟動子之轉錄活化。Jurkat T細胞中之IL-17A啟動子活性藉由GLK過度表現，但是非藉由GLK激酶死亡(K45E)突變體增強(圖2B)。接下來，研究個別IL-17A轉錄因子與IL-17A啟動子之結合(圖2C至D)。染色質免疫沉澱(ChIP)分析顯示，於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中誘導AhR及RORγt(-877)與IL-17A啟動子之結合(圖2D)，然而不增強STAT3、IRF4、KLF4及BATF與IL-17A啟動子之結合(圖2D)。有趣地是，不顯著誘導RORγt與IL-17A啟動子之-120區域之結合(圖2D)；由其他人報導相似發現(Jain等人，2016；Zhang等人，2008)。與ChIP數據一致，GLK增強之IL-17A報告基因活性係因AhR結合
元件或RORγt結合位點(-877)之突變而消除，然而GLK誘導之IL-17A報告基因活性未受STAT3結合位點(圖2E)或RORγt(-120)結合位點之突變影響。值得注意的是，AhR回應元件驅動之報告基因(XRE-Luc)活性藉由GLK過度表現誘導(圖2F)，然而RORγt(-877)或STAT3回應元件驅動之報告基因(RORγt-Luc或SIE-Luc)活性未受影響(圖2F)。此等結果表明GLK信號傳導透過活化AhR及可能RORγt誘導IL-17A轉錄。
GLK透過AhR控制IL-17A產生及自體免疫反應
為進一步證實AhR於促進Lck-GLK Tg小鼠中之IL-17A產生之作用，吾人用T細胞特異性AhR基因敲除(AhR cKO：AhRf/f；CD4-Cre)小鼠繁殖Lck-GLK Tg小鼠。血清IL-17A含量於Lck-GLK/T-AhR cKO(Lck-GLK；AhRf/f；CD4-Cre)小鼠中急劇下降，然而血清TNF-α及IFN-γ含量未受AhR缺乏之影響(圖3A)。抗核抗體(ANA)、抗dsDNA抗體及類風濕因子(RF)之含量於Lck-GLK/AhR cKO小鼠中相較於Lck-GLK Tg小鼠中之彼等亦減少(Chuang Huai-Chia等人，「MAP4K3/GLK promotes lung cancer metastasis by phosphorylating and activating IQGAP1」Cancer Research，2019)。組織學染色顯示，Lck-GLK Tg小鼠之腎炎及脾異常之誘導會藉由AhR基因敲除而消除。Lck-GLK Tg小鼠之肝中之發炎性免疫細胞之浸潤亦藉由AhR基因敲除而受到抑制。資料指示AhR於Lck-GLK Tg小鼠中之IL-17A過度產生及自體免疫反應中起著關鍵作用。
PKCθ在Ser-36處將AhR磷酸化及誘導AhR核轉位
共焦圖像(使用兩種不同抗AhR抗體；圖3B)及亞細胞分級分離實驗
(圖3C)顯示，AhR核轉位於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中增強。此外，吾人檢查GLK信號傳導是否透過增強AhR之磷酸化誘導AhR核轉位。僅存在一種市售抗磷酸-AhR抗體，其檢測磷酸-Ser-36 AhR；然而，尚未證實Ser-36磷酸化於AhR核轉位中之作用。有趣地是，使用用於AhR磷酸化之抗磷酸-AhR抗體之免疫印漬分析顯示AhR Ser-36磷酸化於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中以及於抗CD3刺激之T細胞中增強(圖3D)。此等資料表明GLK過度表現(及TCR信號傳導)可透過增強T細胞中之AhR Ser-36磷酸化及核轉位誘導AhR活性。
吾人研究哪種激酶對GLK Tg小鼠之T細胞中之AhR之磷酸化及核轉位負責。SGK1可穩定Th17群體(Wu等人，2013)。基底或TCR誘導之SGK1活化於Lck-GLK T細胞中未改變，表明SGK1不涉及GLK誘導之AhR磷酸化。T細胞中之GLK信號傳導誘導PKCθ、IKKα及IKKβ之激酶活性。為測定哪種激酶將AhR磷酸化，將GLK、PKCθ、IKKα、IKKβ及AhR各者自經個別轉染之HEK293T細胞免疫沉澱及經歷活體外激酶分析。資料顯示AhR Ser-36磷酸化於活體外藉由PKCθ急劇誘導(圖3E)。使用野生型AhR或S36A突變體轉染子藉由免疫印漬證實抗體對AhR Ser-36磷酸化之特異性。免疫螢光及共焦成像分析顯示，PKCθ過度表現增強Jurkat T細胞及HEK293T細胞中之AhR核轉位，然而AhR-S36A突變保留於細胞質中甚至於過度表現PKCθ之細胞中。資料指示PKCθ介導之AhR之Ser-36磷酸化刺激AhR核轉位。於經純化之Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中誘導PKCθ與AhR之間之相互作用(圖3F)。此外，蛋白質間相互作用/ALPHA技術分析顯示PKCθ與AhR之間，但是非GLK與AhR之間之相互作用(<200nm)。此外，螢光共振能量轉移(FRET)分析顯示PKCθ/AhR共
轉染之Jurkat T細胞中之PKCθ與AhR之間之直接相互作用(1至10nm)。為研究活體內亞細胞定位及蛋白質相互作用(<40nm)，吾人使用對應於PKCθ及AhR之探針進行原位鄰近接合分析(PLA)。PLA資料顯示，Lck-GLK Tg小鼠之T細胞之細胞質中之強信號(圖3G)。使用對應於Myc及Flag標記之探針之原位PLA於過度表現Myc-PKCθ及Flag-AhR之HEK293T細胞中顯示相似結果。利用經純化之PKCθ及AhR蛋白質之活體外結合分析進一步證實此直接相互作用。此外，經純化之PKCθ的確在Ser-36處將AhR磷酸化，然而經純化之PKCθ之激酶死亡(K409W)突變體未將AhR磷酸化(圖3H)。此等資料證實PKCθ直接與AhR相互作用且在Ser-36處將AhR磷酸化，導致AhR核轉位。
為驗證PKCθ於AhR核轉位中之作用及其活體內功能，吾人使用TALEN技術產生PKCθ基因敲除(KO)小鼠。然後將Lck-GLK Tg小鼠用PKCθ KO小鼠繁殖以產生Lck-GLK；PKCθ-/-小鼠。如所預期，T細胞中GLK誘導之AhR Ser-36磷酸化會藉由PKCθ基因敲除而消除(圖3I)。免疫螢光及共焦成像分析顯示於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞核中大量檢測到AhR(圖3J)。相比之下，於野生型及Lck-GLK轉殖基因/PKCθ基因敲除(Lck-GLK；PKCθ-/-)小鼠之T細胞之細胞質中但是非細胞核中檢測到AhR表現(圖3J)。IL-17A及自體抗體之血清含量於Lck-GLK；PKCθ-/-小鼠中相較於Lck-GLK Tg小鼠中之彼等顯著減少。此外，於Lck-GLK轉殖基因/PKCθ基因敲除小鼠中發炎性表現型會被消除。總而言之，此等結果指示GLK透過活化T細胞中之PKCθ-AhR信號傳導來誘導IL-17A產生。
AhR與RORγt相互作用且將RORγt轉運至細胞核中
矛盾的是，AhR結合及RORγt結合元件二者是GLK誘導IL-17A報告基因活性所必需的(圖2E)；然而，GLK會誘導AhR(而非RORγt)回應元件之活性(圖2F)。吾人懷疑AhR可促進RORγt活性之誘導。吾人首先研究GLK是否透過AhR誘導RORγt結合至IL-17A啟動子。染色質免疫沉澱(ChIP)資料的確顯示GLK誘導RORγt結合至IL-17A啟動子於AhR基因敲除T細胞中會被消除(圖4A)。資料表明AhR會促進RORγt與IL-17A啟動子之結合。接下來，吾人研究AhR是否與RORγt相互作用。內源AhR與RORγt之間之相互作用於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中會急劇增強(圖4B)。共焦成像分析顯示，AhR及RORγt於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞核中之共定位(圖4C)。使用抗RORγt抗體之ChIP分析亦顯示RORγt與Lck-GLK小鼠之T細胞中之IL-17A啟動子之AhR結合元件的結合(圖4D)，表明RORγt會透過AhR-RORγt複合體形成而結合至AhR結合元件。此外，利用對應於AhR及RORγt之探針之原位鄰近接合分析(PLA)顯示於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞核中較野生型小鼠之彼等具有強相互作用信號(圖4E)。此等資料指示，Lck-GLK Tg小鼠之T細胞核中之AhR與RORγt之間之直接相互作用。此外，類似於AhR核轉位，GLK誘導之RORγt核轉位係藉由PKCθ基因敲除被消除(圖4C)。數據支持經PKCθ磷酸化之AhR會將RORγt募集至細胞核。AhR介導之RORγt核轉位進一步藉由AhR基因敲除證實；RORγt於Lck-GLK；AhRf/f；CD4-Cre小鼠之T細胞之細胞質中專門定位，即使在功能性PKCθ之存在下(圖4C，下圖)。因此，此結果排除PKCθ直接調節RORγt核轉位之可能性。綜整地，此等結果指示AhR直接與RORγt相互作用且將RORγt轉運至過度表現GLK之T細胞之核中。
AhR-RORγt相互作用是藉由IKKβ介導之RORγt Ser-489磷酸化誘導
出人意料地，原位鄰近接合分析(PLA)顯示，即使在Lck-GLK；PKCθ-/- T細胞之細胞質中AhR與RORγt之間具有相互作用(圖4E)。此結果表明AhR與RORγt之間之相互作用不是由AhR磷酸化調節。AhR與RORγt之間之相互作用於Lck-GLK；PKCθ-/- T細胞中仍可偵測到(圖4E)；此結果可係由於PKCθ基因敲除小鼠中之補償信號傳導事件。為識別刺激AhR與RORγt之間之相互作用之激酶，吾人最初測試GLK、IKKα或IKKβ於AhR-RORγt相互作用之誘導中之潛在作用。將激酶GLK、PKCθ、IKKα或IKKβ與AhR加RORγt共轉染至HEK293T細胞，接著進行共免疫沉澱分析。資料顯示IKKβ過度表現會增強AhR與RORγt之間之相互作用，然而GLK、PKCθ及IKKα之過度表現不會增強該相互作用(圖4F)。接下來，吾人測試IKKβ是否刺激RORγt磷酸化，該磷酸化然後誘導RORγt與AhR之相互作用。將Flag標記之RORγt從經以RORγt加IKKβ或載體共轉染之HEK293T細胞純化出來。GST-沉降分析顯示經純化之GST標記之AhR重組蛋白與來自RORγt加IKKβ共轉染之細胞之經純化之RORγt蛋白質會強烈相互作用(圖4G)。資料表明IKKβ透過誘導RORγt磷酸化會刺激AhR與RORγt之間之直接相互作用。相反，PLA資料顯示Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中之AhR與RORγt之間之GLK誘導之相互作用會藉由IKKβ基因敲除而消除(圖5A)。此外，共焦成像分析顯示IKKβ基因敲除會特定性地消除GLK轉殖基因T細胞中之RORγt而非AhR之核轉位(圖5B)。一致地，血清IL-17A含量亦於Lck-GLK；IKKβf/f；CD4-Cre小鼠中相較於Lck-GLK Tg小鼠中之彼等減少(圖5C)。接下來，吾人研究IKKβ是否直接與RORγt
相互作用。使用經純化之重組GST標記之IKKβ及His標記之RORγt蛋白質之GST-沉降分析及His-沉降分析顯示IKKβ與RORγt之間之直接相互作用(圖5D)。
為研究IKKβ是否將RORγt磷酸化，將Flag標記之RORγt、IKKβ及IKKβ激酶死亡(K44M)突變體自HEK293T轉染子個別免疫沉澱及然後經歷活體外激酶分析。資料顯示RORγt磷酸化於活體外藉由IKKβ但是非藉由IKKβ-K44M突變體誘導(圖5E)。為識別IKKβ靶向之RORγt磷酸化位點，單離活體外磷酸化之Flag標記之RORγt，接著質譜分析。識別Ser-489為藉由IKKβ之RORγt磷酸化位點(圖5F)。為證實RORγt Ser-489位點之磷酸化，吾人產生抗磷酸-RORγt(Ser-489)抗體，當用IKKβ共轉染時其特異性識別RORγt WT但是非S489A突變體(圖5G)。使用此磷酸-抗體之免疫印漬顯示於Lck-GLK Tg小鼠之T細胞中誘導RORγt Ser-489磷酸化，且該磷酸化會藉由IKKβ基因敲除而消除(圖5H)。一致地，在IKKβ過度表現下RORγt-S489A突變體無法與AhR相互作用(圖5I)。一併考慮，於過度表現GLK之T細胞中，IKKβ在Ser-489處將RORγt磷酸化及誘導其與AhR相互作用，該IKKβ然後將RORγt轉運至細胞核中及與RORγt合作以刺激IL-17A轉錄。
於TCR誘導之T細胞或人類自體免疫T細胞中經磷酸化之RORγt與AhR相互作用
吾人詢問經磷酸化之RORγt介導之AhR-RORγt相互作用是否亦藉由TCR信號傳導誘導。吾人發現鼠科T細胞中之下列IKKβ活化、RORγt Ser-489磷酸化的確藉由抗CD3刺激誘導(圖6A)。此外，共免疫沉澱分析及
PLA顯示內源RORγt與AhR之間之相互作用藉由TCR信號傳導誘導(圖6B)。AhR與Ser-489磷酸化之RORγt之間之相互作用亦藉由TCR信號傳導刺激。相反，T細胞中TCR誘導之RORγt Ser-489磷酸化(圖6C)及AhR-RORγt相互作用(圖6D)係藉由IKKβ條件基因敲除而消除。此等資料表明在T細胞活化期間誘導IKKβ介導之RORγt磷酸化及隨後AhR-RORγt相互作用。為研究IKKβ介導之RORγt磷酸化是否的確於TCR刺激後調節IL-17A產生，藉由ELISA測定來自抗CD3刺激T細胞之分泌之細胞激素。與先前報導(Gomez-Rodriguez等人，2009；Liu等人，2005)一致，TCR信號傳導誘導T細胞中之IL-17A產生(圖6E至F)。T細胞中TCR誘導之IL-17A產生會因IKKβ條件基因敲除而消除(圖6E)，支持TCR活化之IKKβ誘導正常T細胞中之IL-17A產生。如所預期，若干IKKβ/NF-κB介導之細胞激素(IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及TNF-α)之TCR誘導含量亦於IKKβ條件基因敲除小鼠之T細胞中降低(圖6E)。為進一步驗證IKKβ-RORγt-IL-17A路徑，使用來自T細胞特異性RORγt條件基因敲除小鼠之原代脾T細胞。不像IKKβ條件基因敲除，RORγt條件基因敲除僅會在TCR刺激後消除IL-17A產生(圖6F)。RORγt cKO小鼠之T細胞中之RORγt表現的消除可藉由免疫印漬分析驗證(圖6G)。資料表明IKKβ-RORγt活化主要在TCR信號傳導期間誘導IL-17A產生，而IKKβ-NF-κB活化調節多種細胞激素(包括IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及TNF-α)之產生(圖6H)。
GLK
+
IL-17A
+
T細胞為活性SLE之診斷生物標記
為證實GLK過度表現誘導SLE患者之T細胞中之IL-17A產生，吾人使用流動式細胞測量術表徵來自18名SLE患者及6名健康對照(表1)之T細
胞。流動式細胞測量術資料顯示GLK過度表現與所有SLE患者之T細胞中之IL-17A產生完全共存(圖7A)。此外，CD4+ T細胞中之GLK+IL-17A+細胞之頻率於所有18名SLE患者中相較於健康對照中之彼等急劇增加(圖7B、E)，而CD8+ T細胞中之彼等適度增加(圖7C、E)。相比之下，CD4-CD8-(雙陰性，DN)T細胞中之GLK+IL-17A+細胞之頻率於SLE群組中相較於健康對照組不顯著增加；僅三名SLE患者顯示極輕微增加(圖7D至E)。此等結果顯示SLE患者中之GLK+IL-17A+ T細胞主要為CD4+ T細胞，因此，此等CD4+ T細胞為GLK+ Th17細胞。此外，為研究GLK+IL-17A+ T細胞群體是否為活性SLE(SLEDAI≧12)之有用診斷生物標記，藉由線性回歸及接受者操作特徵(ROC)曲線分析分析GLK+IL-17A+ T細胞子集之頻率之診斷效用(圖7F至G)。CD4+ T細胞中之GLK+IL-17A+細胞之頻率(r=0.729，P=0.00053)與SLEDAI相關(圖7F)。根據ROC曲線之座標，CD4+ T細胞群體中之GLK+IL-17A+細胞之頻率之最佳截斷值15.5%。此外，CD4+ T細胞中之GLK+IL-17A+細胞之頻率具有用於識別活性SLE患者之100%之敏感性及88.9%之特異性(圖7G)。因此，GLK+ Th17細胞為活性SLE之診斷生物標記。值得注意的是，CD4+ T細胞中之GLK+IL-17A+頻率之曲線下面積(AUC)值(0.939，P<0.001)顯著高於CD8+或DN T細胞中之GLK+IL-17A+頻率之AUC值。共同地，此等結果表明T細胞中之GLK過度表現誘導IL-17A產生及致病Th17細胞，其有助於SLE患者亞群之發病機理。
表1顯示圖1中所用之SLE患者及健康對照之人口統計及疾病特徵。僅在SLE診斷之開始測定人口統計特徵。持續時間係指於SLE診斷後疾病時間之長度。加-減值為平均值±SD。
縮略語：SLE，全身性紅斑狼瘡；HC，健康對照；SLEDAI，SLE疾病活性指數；WBC，白細胞；HgB，血紅蛋白；dsDNA，雙股DNA；WHO，世界衛生組織；C3及C4，補體組分3及組分4；NA，不適用。
GLK於人類自體免疫患者T細胞中誘導RORγt Ser-489磷酸化及AhR-RORγt複合體
吾人先前報導證實GLK過度表現誘導RORγt Ser-489磷酸化及AhR-
RORγt複合體。吾人亦發現AhR與RORγt之間之相互作用可藉由經S489磷酸化之RORγt肽阻斷(圖8A)。資料進一步支持RORγt S489磷酸化控制AhR-RORγt複合體之形成。接下來，吾人使用免疫印漬及PLA進一步研究RORγt Ser-489磷酸化及AhR-RORγt複合體是否發生於人類自體免疫患者之T細胞中。免疫印漬資料顯示RORγt Ser-489磷酸化於自SLE及RA患者新鮮單離之未經刺激之外周血T細胞中急劇增強(圖8B)。此外，來自人類SLE及RA患者之未經刺激之外周血T細胞顯示AhR與RORγt之間(圖8C)或AhR與經磷酸化之RORγt之間(圖8D)之許多PLA相互作用信號。因此，GLK-PKCθ/IKKβ-AhR/RORγt信號級聯為TCR刺激或自體免疫T細胞中之IL-17A誘導之一般機理。
識別針對人類自體免疫患者T細胞中之GLK誘導之AhR-RORγt複合體之小分子抑制劑
因為AhR-RORγt複合體藉由GLK信號傳導誘導，吾人測試GLK-PKCθ-IKKβ信號傳導之抑制劑是否阻斷AhR-RORγt複合體，吾人使用GLK抑制劑處理作為實例。因為無市售GLK抑制劑，吾人使用螢光素酶報告基因分析及活體外激酶分析二者篩選101,200種化合物以識別GLK抑制劑。在有效抑制細胞系中之GLK信號傳導之此等化合物中，兩種化合物(維替泊芬及阿來西定二鹽酸鹽，各自稱作C1及C2)有效抑制細胞系中之GLK信號傳導及活體外GLK激酶活性二者(圖9A至B)。GLK抑制劑C1阻斷SLE及RA患者之T細胞中之AhR-RORγt複合體(圖9C)。PLA信號(圖9D)及FRET信號(圖9E)藉由C1(維替泊芬)處理抑制。
GLK誘導之AhR-RORγt複合體之抑制劑抑制小鼠中之IL-17產生及自體免疫反應
因為GLK誘導之AhR-RORγt複合體控制小鼠中之IL-17產生及自體免疫反應，吾人研究阻斷AhR-RORγt複合體之GLK抑制劑C1(維替泊芬)是否亦抑制T細胞特異性GLK轉殖基因(Lck-GLK Tg)小鼠中之IL-17產生及自體免疫反應。於藉由每3天靜脈內注射持續30天之GLK抑制劑C1(維替泊芬)處理(0.556nmol/g)後(圖10A)，Lck-GLK Tg小鼠中之血清IL-17A含量藉由C1(維替泊芬)處理相較於PBS處理之彼等顯著減少(圖10B)。此外，Lck-GLK Tg小鼠中之自體抗體之過度產生亦可藉由C1(維替泊芬)處理而消除(圖10C)。此等結果證實GLK過度表現會誘導IL-17A過度產生及自體抗體產生。為進一步驗證GLK抑制劑亦於IL-17A介導之動物模型中起作用，吾人將野生型小鼠在EAE及CIA誘導期間用C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)激發。C1(維替泊芬)處理(0.556nmol/g)及C2(阿來西定二鹽酸鹽)處理(0.085nmol/g)二者顯著抑制EAE誘導之小鼠之疾病嚴重度及血清IL-17A含量(圖10D)。C1(維替泊芬)處理亦抑制CIA誘導之小鼠之疾病嚴重度及血清IL-17A含量(圖10E)。資料顯示維替泊芬(C1)處理優先抑制所有三種自體免疫疾病模型中之IL-17A過度產生。此外，維替泊芬(C1)處理抑制Th17分化及活體外分化之Th17細胞之IL-17A產生二者(圖11A至B)。相比之下，維替泊芬(C1)處理增強活體外Treg(表現Foxp3之CD4+ T細胞)分化(圖11C)；一致地，Lgk-GLK轉殖基因小鼠之Treg分化相較於野生型小鼠之Treg分化減少(圖11D)。此等結果指示GLK抑制劑減少Th17細胞群體，但是增加Treg細胞群體。
GLK誘導之AhR-RORγt複合體之抑制劑阻斷人類T細胞
之IL-17產生
吾人進一步研究IL-17A產生是否可藉由人類及鼠科T細胞中之GLK誘導之AhR-RORγt複合體之抑制劑而消除。吾人首先使用用TCR信號傳導(抗CD3加抗CD28抗體)刺激之鼠科T細胞測試抑制劑實驗。吾人發現，鼠科T細胞之TCR誘導之IL-17A產生可藉由C1(維替泊芬)處理徹底消除，然而TCR誘導之IL-17B、IL-17E及IL-17F含量不會減少(圖12A)。TCR誘導之TNF-α及IFN-γ含量藉由C1(維替泊芬)處理部分降低(圖12A)；此降低可由於NF-κB活性藉由C1(維替泊芬)處理之抑制。接下來，吾人使用人類外周血T細胞研究IL-17產生藉由C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)之處理之阻斷效應。來自健康對照之外周血T細胞中之TCR誘導之IL-17A產生藉由C1(維替泊芬)處理顯著降低(圖12B)。人類自體免疫疾病患者之抗CD3/CD28刺激之T細胞之IL-17A產生藉由C1(維替泊芬)處理或C2(阿來西定二鹽酸鹽)處理徹底抑制(圖12B)。一併考慮，GLK抑制劑(維替泊芬及阿來西定二鹽酸鹽)抑制人類自體免疫患者T細胞中之GLK誘導之AhR-RORγt複合體及IL-17A產生，以及自體免疫動物模型之疾病嚴重度。因此，GLK、GLK信號傳導或GLK誘導之AhR-RORγt複合體可為用於自體免疫疾病之有前景的治療標靶。
GLK抑制劑阻斷癌細胞遷移及癌症轉移/復發
為研究GLK於癌症轉移/復發中之作用，吾人使用RNA聚合酶II(Pol II)啟動子驅動人類GLK cDNA產生全身GLK轉殖基因(Pol II-GLK Tg)小鼠(圖13A)。GLK過度表現藉由即時PCR證實(圖13B)。為研究GLK對癌症進展之作用，將Pol II-GLK Tg小鼠用經遺傳改造之肺癌小鼠系(肺特異
性肺表面活性物質蛋白質A(SPA)啟動子驅動EGFR缺失突變轉殖基因(SPA-EGFRdel Tg)小鼠系)繁殖。所有1歲齡SPA-EGFRdel Tg小鼠(9/9)的確發展肺癌(PCNA陽性)(圖13C)，及SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠(15/15)亦如此(圖13C)。使用抗EGFR缺失突變抗體之免疫組織化學分析顯示於SPA-EGFRdel Tg小鼠及SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠二者之肺癌中檢測到表現EGFRdel之細胞(圖13D)。吾人接下來研究GLK轉殖基因是否誘導肺癌(EGFRdel陽性)轉移至SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠之其他器官。吾人使用來自野生型及三種不同轉殖基因小鼠之頸部淋巴結、肝及腦之組織上之抗EGFR缺失突變抗體進行免疫組織化學。針對頸部淋巴結之區域轉移，除了一隻外所有(14/15)SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠顯示頸部淋巴結中之許多轉移性表現EGFRdel之肺癌細胞。相比之下，僅3/9 SPA-EGFRdel Tg小鼠顯示頸部淋巴結中之少量轉移性表現EGFRdel之肺癌細胞(圖13E)。針對遠端轉移，所有SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠顯示表現EGFRdel之肺癌細胞至腦(14/15)或肝(15/15)之轉移(圖13E及表2)。於9隻對照SPA-EGFRdel Tg小鼠中，僅一隻SPA-EGFRdel Tg小鼠(1/9)發展腦轉移及肝轉移二者，僅一隻(1/9)發展肝轉移，及其餘7隻小鼠不發展任何可檢測之遠端轉移(圖13E及表2)。此等結果表明GLK誘導肺癌至腦及肝之遠端轉移。表2顯示來自個別組之指定組織中之EGFR缺失突變表現的比較。
符號§表示僅3/9 SPA-EGFRdel Tg小鼠顯示頸部淋巴結中之少量轉移性表現EGFRdel之肺癌細胞。
吾人研究GLK抑制劑是否亦抑制癌細胞遷移。跨孔遷移分析顯示來自神經膠質瘤、胰癌、肺癌或肝癌之細胞之遷移藉由C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)之處理抑制(圖14)。此外，C1(維替泊芬)及C2(阿來西定二鹽酸鹽)處理二者抑制使用TC-1肺癌細胞之異種移植小鼠模型中之腫瘤生長(圖15)。為研究GLK缺乏是否導致肺癌轉移之減少，吾人使用藉由尾靜脈注射表現LLC之螢光素酶(LLC/luc)細胞之轉移性路易士肺癌(LLC)小鼠模型。吾人使用基於細胞之分析及活體外激酶分析識別兩種GLK抑制劑(維替泊芬及阿來西定二鹽酸鹽)。針對GLK激酶活性之C1(維替泊芬)及C2之IC50各自為1.15及10.05nM(表3)。分子對接分析顯示GLK抑制劑C1(維替泊芬)及C2(阿來西定二鹽酸鹽)各自在GLK二聚體之介面及GLK激酶域之活性位點處穩定結合至活性GLK激酶域(磷酸-GLK[Ser-170])(圖16A至B)。Flag標記之GLK蛋白質及GFP-GLK融合蛋白之二聚的確藉由C1(維替泊芬)處理阻斷(圖16C)。吾人用GLK抑制劑C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)藉由每3天靜脈內注射持續30天處理含LLC/luc細胞之小鼠(圖16D)。藉由活體內成像系統檢測小鼠中之LLC/luc
細胞之螢光素酶活性。將切除之肺稱量及經歷H&E染色。經注射小鼠之肺中之LLC/luc細胞之螢光素酶活性藉由C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)之處理降低(圖16E至F)。一致地，免疫組織化學分析亦顯示經C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)處理之小鼠中之癌症群落之減少(圖16G)。此外，肺組織中之GLK與IQGAP1之間之相互作用藉由C1(維替泊芬)或C2(阿來西定二鹽酸鹽)之處理抑制(圖16H，上圖)，及抑制肺組織中之IQGAP1磷酸化(圖16H，下圖)。共同地，資料表明GLK於肺癌轉移中起著關鍵作用。此等結果指示GLK抑制劑阻斷癌症轉移及癌症進展。表3顯示針對MAP4K之維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽之半最大抑制濃度(IC50)。藉由活體外激酶分析使用髓磷脂鹼性蛋白(MBP)作為受質測定GLK(MAP4K3)或其他MAP4K之激酶活性之抑制。使用各種MAP4K之激酶域之重組蛋白。C1，維替泊芬；C2，阿來西定二鹽酸鹽。
GLK缺乏小鼠顯示延長之壽命
為研究GLK之抑制是否可導致任何自發疾病，吾人在其生命期間監測野生型及GLK缺乏小鼠二者。出人意料地，GLK缺乏小鼠顯示壽命相較於野生型小鼠顯著延長(圖17A)。最老GLK缺乏小鼠為40.8個月齡。年老GLK缺乏小鼠(26.0至40.8個月)不發展任何腫瘤或可識別疾病。有趣的是，年老GLK缺乏小鼠仍顯示健康毛髮，然而年老野生型小鼠顯示灰色毛
髮(圖17B)。先前出版物指示T細胞介導之免疫反應(包括抗原誘導之IFN-γ、IL-2、IL-17A產生)於GLK缺乏T細胞中減少。此外，Th1/Th2/Th17分化藉由GLK缺乏減少。GLK缺乏小鼠亦抗MOG誘導之實驗自體免疫性腦脊髓炎之誘導。GLK缺乏小鼠之長壽可係由於發炎反應藉由GLK缺乏之抑制。此觀念藉由20個月齡GLK缺乏小鼠中之促發炎細胞激素IL-6、IL-17A、TNFα、IFN-γ及IL-1β之血清含量相較於年齡匹配之野生型小鼠之彼等急劇減少的資料支持(圖17C)。除了Th1細胞激素(IFN-γ)及Th17細胞激素(IL-17A)外，Th2細胞激素(IL-4)含量亦於年老GLK缺乏小鼠之血清中減少(圖17C)。資料表明GLK之抑制將不導致任何不利作用，相反可預防發炎。
吾人之發現指示GLK誘導之AhR-RORγt複合體為IL-17A介導之自體免疫疾病之生物標記及治療標靶。此外，GLK抑制劑(維替泊芬及阿來西定二鹽酸鹽)為潛在治療劑。
GLK直接與IQGAP1相互作用
於GLK之免疫沉澱後，將GLK相互作用蛋白質藉由SDS-PAGE解析及藉由銀染色視覺化(圖18A)。切下GLK轉染細胞中增強之七個最顯著蛋白質譜帶及然後藉由胰蛋白酶消化，及將所得蛋白質肽經受質譜分析。此外，藉由質譜分析識別GLK蛋白質上之四個過釩酸鹽誘導之酪胺酸磷酸化位點(Tyr-366、Tyr-379、Tyr-574及Tyr-735)(圖18B)。吾人識別若干假定GLK相互作用蛋白質，包括肌球蛋白(myosin)、IQGAP1、波形蛋白(vimentin)、腦發育蛋白(drebrin)及熱激蛋白70(HSP70)(藉由資料庫搜索評分自最高至最低排序)。在此等蛋白質中，選擇IQGAP1(細胞遷移之
陽性調節劑)用於進一步研究，然而肌球蛋白、熱激蛋白及細胞支架蛋白為可藉由質譜法檢測之常見污染蛋白質。接下來，吾人使用互惠共免疫沉澱分析證實GLK與IQGAP1之間之相互作用(圖18C至D)。將GLK與Flag標記之IQGAP1蛋白質及抗Flag抗體共免疫沉澱(圖18C至D)。GLK與IQGAP1之間之此共免疫沉澱可藉由GLK(Y735F)突變而消除(圖18E)，表明GLK蛋白質之Tyr-735磷酸化對GLK與IQGAP1之間之相互作用係重要的。利用對應於Flag(Flag標記之GLK)及Myc(Myc標記之IQGAP1)之PLA探針之組合之原位鄰近接合分析(PLA)顯示過度表現兩種蛋白質之細胞中較過度表現單獨各者之彼等之強PLA信號(圖18F至G)。PLA信號表明GLK與IQGAP1之間之直接相互作用(<40nm)。此外，使用CFP標記之GLK及YFP標記之IQGAP1融合蛋白之螢光共振能量轉移(FRET)分析顯示此等兩種分子之間之直接相互作用(1至10nm)(圖18H)。GLK-IQGAP相互作用之FRET信號藉由C1(維替泊芬)之處理抑制(圖18H，右圖)。為進一步證實直接相互作用，使用經純化之蛋白質進行共免疫沉澱實驗。將來自HEK293T細胞裂解物之Flag標記之GLK及Myc標記之IQGAP1蛋白質各自藉由用Flag及Myc肽溶離免疫複合體純化。共免疫沉澱分析顯示經純化之GLK與IQGAP1蛋白質之間之相互作用(圖18I)。來自不同方法(PLA、FRET及經純化之蛋白質)之資料表明GLK直接與IQGAP1相互作用。
GLK藉由在Ser-480處將IQGAP1磷酸化促進細胞遷移
因為GLK直接結合至IQGAP1，吾人推測GLK可為調節IQGAP1介導之細胞遷移之激酶。為測定GLK是否將IQGAP1磷酸化，使用GLK、GLK激酶死亡(K45E)突變體及IQGAP1之經純化之蛋白質進行活體外激酶分
析。IQGAP1磷酸化係藉由GLK但是非GLK激酶死亡(K45E)突變體誘導(圖19A)。於SDS-PAGE分級分離及質譜分析後，識別Ser-480為IQGAP1上之GLK磷酸化殘基。接下來，吾人測試GLK誘導之IQGAP1 Ser-480磷酸化是否調節Cdc42或Rac1之活化，以及IQGAP1與Cdc42或Rac1之相互作用。免疫沉澱資料顯示活性(GTP結合)Cdc42蛋白質於過度表現GLK加IQGAP1之細胞中增加；相反，活性Cdc42蛋白質含量藉由GLK加IQGAP1(S480A)突變體之過度表現減少(圖19B，下圖)。相比之下，活性(GTP結合)Rac1蛋白質含量不藉由GLK加IQGAP1過度表現增加(圖19C，下圖)。此等結果進一步藉由Cdc42及Rac1活化之ELISA結果支持(圖19D至E)。此外，共免疫沉澱資料顯示IQGAP1與Cdc42或Rac1之相互作用不受IQGAP1(S480A)突變之影響(圖19B至C之上圖)。為評價IQGAP1 Ser-480磷酸化於IQGAP1介導之細胞遷移中之作用，將HCC827細胞用IQGAP1(S480A)磷酸化缺乏突變體及GLK質粒共轉染。跨孔遷移分析顯示過度表現GLK之細胞之遷移之細胞數目藉由IQGAP1(S480A)突變體之過度表現減少(圖19F，右上圖；圖19G至H)。相反，HCC827肺癌細胞中之兩種IQGAP1 Ser-480擬磷(S480D及S480E)突變體之過度表現較IQGAP1或IQGAP1(S480A)突變體之過度表現誘導更高細胞遷移能力。此等結果表明IQGAP1 Ser-480磷酸化對IQGAP1活化及IQGAP1/Cdc42介導之細胞遷移負責。
吾人之結果表明GLK與IQGAP1相互作用及將IQGAP1磷酸化。吾人接下來研究GLK脯胺酸區域與IQGAP1 WW域之間之相互作用的確控制GLK-IQGAP1誘導之細胞遷移。用GLK及IQGAP1共轉染之HCC827肺癌細胞顯示較載體對照細胞之遷移之增強，然而GLK加
IQGAP1(△WW)突變體之共轉染可消除增強之細胞遷移(圖19F至G)。GLK(P436/437A)、(P478/479A)或(P436/437A；P478/479A)突變體之過度表現減少GLK誘導之細胞遷移(圖19F至G)。GLK及IQGAP1之過度表現藉由免疫印漬分析證實(圖19H)。為證實IQGAP1 Ser-480殘基之磷酸化，吾人產生抗磷酸-IQGAP1(Ser-480)單株抗體，其特異性識別IQGAP1 WT但是非S480A突變體(圖19I)。
IQGAP1介導GLK誘導之癌症轉移
吾人接下來研究GLK是否透過IQGAP1介導之癌細胞遷移促進肺癌之轉移。為縮短形成SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠中之肺癌轉移所需之時間(12個月)，吾人產生GLK突變轉殖基因小鼠系(Pol II-GLKE351K Tg)，其表現構成性活化GLK(E351K)突變體(圖20A至C)。值得注意的是，於先前出版物之補充資訊中報導GLK(E351K)突變；然而，直至此研究尚未證實GLK(E351K)突變之功能結果(圖20A至B)。藉由即時PCR證實GLK(E351K)突變體之過度表現(圖20D)。接下來，吾人將Pol II-GLKE351K Tg小鼠用SPA-EGFRdel Tg小鼠繁殖以產生SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K Tg小鼠，其顯示相較於SPA-EGFRdel Tg小鼠之彼等之肺之增強的GLK蛋白質含量(圖20E)。SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K Tg小鼠(8/8)的確形成肺癌(圖20F)及較SPA-EGFRdel；Pol II-GLK Tg小鼠在更年輕年齡(7個月齡)區域/遠端轉移。所有7個月齡SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K Tg小鼠顯示表現EGFRdel之肺癌細胞至腦及/或肝之遠端轉移(腦及肝二者[6/8]，僅腦[1/8]，及僅肝[1/8](圖19G及表4)。相比之下，所有SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K；IQGAP1-/-小鼠在7個月齡時不發展任何遠端轉移(3/3)(圖20G及
表4)。此等資料表明GLK於SPA-EGFRdel肺癌模型中透過IQGAP1誘導遠端轉移。為驗證此觀念，吾人於人類非小細胞肺癌(NSCLC)之組織中研究GLK與IQGAP1之間之相互作用，以及IQGAP1 Ser-480磷酸化。
GLK-IQGAP1複合體與人類NSCLC之不良生存率相關
為研究NSCLC組織中之GLK與IQGAP1之相互作用，吾人收集來自7名人類NSCLC患者之臨床肺組織，該等患者經歷肺切除術。吾人亦採用可自市面上購得之肺組織分析，該分析含有85個NSCLC組織(包括49個鱗狀細胞癌、17個腺癌、11個細支氣管肺泡癌及8個大細胞癌)及68個癌旁正常組織，以及3個小細胞肺癌組織。使此等組織經受利用對應於GLK及IQGAP1之成對PLA探針之組合之原位鄰近接合分析(PLA)。資料顯示NSCLC組織之大多數(81/92)但是非任何小細胞癌組織中之多個強PLA信號(圖21A至B)。來自NSCLC患者之癌旁正常組織之大多數(61/68)不顯示任何PLA信號，而7/68癌旁正常組織顯示更少PLA信號。NSCLC患者之癌旁正常組織中之少量PLA信號可為自原始病變遷移之轉移性癌細胞。此等結果表明肺組織中之GLK-IQGAP1複合體可為NSCLC之診斷生物標
記。接下來，吾人研究GLK-IQGAP1複合體是否可充當NSCLC之潛在預兆性生物標記。於聚類分析後，將NSCLC(鱗狀細胞癌及腺癌)患者(其生存數據係可得)分成四個PLA信號子組。具有最高PLA信號之兩個子組各自僅含有一名及兩名患者，因此，自進一步分析排除此等兩個子組。使用生存數據(自提供者可得)使其餘兩個子組(n=63)經歷Kaplan-Meier生存分析。具有高PLA信號之NSCLC患者顯示在隨訪期期間之不良生存率(n=63，PLA信號-高對PLA信號-低，P=0.069)(圖21C)。更高P值(P=0.069)可係由於排除具有最高PLA信號之三個數據。然而，具有更多GLK-IQGAP1複合體之NSCLC患者具有較具有較少GLK-IQGAP1複合體之患者更低生存率。因為40%至60%之NSCLC患者死於癌症切除術後之癌症復發，吾人研究GLK-IQGAP1複合體是否與NSCLC轉移相關。具有GLK-IQGAP1複合體之癌細胞在肺血管壁上/在肺血管壁附近特定累積(圖21D)；GLK-IQGAP1複合體陽性細胞亦存在於血管腔(圖21D)。此外，具有轉移性癌之骨、淋巴結或軟組織切片顯示GLK-IQGAP1複合體陽性細胞(圖21D)，使用(增殖細胞核抗原)PCNA染色驗證癌細胞(圖21D)。合併之圖像顯示此等組織中之GLK-IQGAP1複合體陽性細胞的確為癌細胞(圖21D)。資料表明具有GLK-IQGAP1複合體之肺癌細胞傾向於轉移。接下來，吾人檢查人類NSCLC組織中之GLK誘導之IQGAP1 Ser-480磷酸化。於若干失敗嘗試後，吾人最終獲得針對IQGAP1 Ser-480磷酸化之單株抗體(mAb)。然而，使用磷酸-IQGAP1 mAb之免疫染色信號不足夠強以提供可識別信號。為增強抗磷酸-IQGAP1 mAb之特異性及染色信號，吾人進行PLA，該PLA利用對應於IQGAP1及磷酸-IQGAP1 Ser-480之成對PLA探針之組合將磷酸化信號放大如同聚合酶鏈反應。使用表現IQGAP1
S480A突變體之細胞及IQGAP1基因敲除肺癌組織(SPA-EGFRdel；Pol II-GLKE351K；IQGAP1-/-)證實抗體特異性。使用人類NSCLC組織，吾人於測試之82.7%(72/87)之腫瘤組織中發現IQGAP1 Ser-480磷酸化之多個PLA信號(圖21E至F)。於相同細胞中磷酸-IQGAP1 PLA信號與PCNA染色共存(圖21E)。此外，於聚類分析後將NSCLC(鱗狀細胞癌及腺癌)患者分成PLA信號-高及PLA信號-低子組。Kaplan-Meier生存分析顯示具有高磷酸-IQGAP1 PLA信號之NSCLC患者具有在隨訪期期間之不良生存率(n=63，PLA信號-高對PLA信號-低，P=0.037)(圖21G)。共同地，吾人之發現結果表明，GLK藉由直接結合至IQGAP1及將IQGAP1磷酸化促進細胞遷移及癌症轉移。
本說明書中引用及討論之所有參考文獻之全文以引用的方式併入本文中且併入程度如同以引用的方式個別地併入各參考文獻般。
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<213> 人工序列
<220>
<223> PKCθ內含子1及外顯子2缺失序列
<400> 2
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠科GLK抗原決定基4至19
<400> 3
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠科GLK抗原決定基514至533
<400> 4
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠科RORγt抗原決定基
<400> 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類GLK shRNA
<400> 7
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AhR結合位點
<400> 8
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORγt結合位點(-887)
<400> 9
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORγt結合位點(-120)
<400> 10
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT3結合位點
<400> 11
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORγt(-877至-872)正向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORγt(-877至-872)逆向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORγt -120至-115正向引子
<400> 14
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORγt(-120至-115)逆向引子
<400> 15
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AhR正向引子
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AhR逆向引子
<400> 17
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT3正向引子
<400> 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT3逆向引子
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRF4正向引子
<400> 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRF4逆向引子
<400> 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF4正向引子
<400> 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF4逆向引子
<400> 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BATF正向引子
<400> 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BATF逆向引子
<400> 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-17A正向引子
<400> 26
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-17A逆向引子
<400> 27
<210> 28
<211> 1657
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
<210> 29
<211> 848
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
<210> 30
<211> 495
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
<210> 31
<211> 1520
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 31
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Claims (20)
- 一種用於識別AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑之方法，其包括：(a)提供細胞培養物，其中該培養物中之細胞表現芳烴受體(AhR)蛋白質及磷酸-視黃酸受體相關孤兒核受體γt(RORγt)蛋白質兩者；(b)在測試劑之存在下培育該細胞培養物；(c)在該測試劑之存在下，分析該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之含量；(d)比較在該測試劑之存在下該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體與對照之含量；及(e)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之含量降低時，識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。
- 如請求項1之方法，其中該分析步驟係使用抗磷酸-RORγt[Ser489]抗體進行免疫印漬。
- 如請求項1之方法，其中該等細胞係選自由以下組成之群：Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、TCR活化之T細胞及過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞。
- 如請求項1之方法，其中： (i)該提供步驟係提供經以CFP-AhR、YFP-RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞；(ii)該分析步驟係進行螢光共振能量轉移(FRET)分析；及(iii)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下藉由YFP-RORγt發射之螢光強度降低時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。
- 如請求項1之方法，其中：(i)該提供步驟係提供經以抗原決定基標記之AhR、Myc-RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞；(ii)使用ALPHA分析利用抗Myc抗體結合之接受體珠(acceptor bead)及塗抗抗原決定基抗體之供體珠進行該分析步驟；及(iii)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下藉由該抗Myc抗體結合之接受體珠發射之信號減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑；其中該抗原決定基由SEQ ID NO：1之序列組成。
- 如請求項1之方法，其中：(i)該提供步驟提供選自由以下組成之群之細胞：Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、TCR活化之T細胞及過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞；(ii)該分析步驟進行原位鄰近接合分析(PLA)，其將作為初級抗體、二級抗體之抗AhR抗體及抗RORγt或抗磷酸-RORγt[Ser489]抗體用作 PLA探針及螢光標記之互補寡核苷酸探針用於信號偵測；及(iii)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下存在螢光信號減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑。
- 如請求項1之方法，其中：(i)該提供步驟係提供經以Myc-AhR、抗原決定基標記之RORγt及IKKβ質粒共轉染之細胞；(ii)該分析步驟係進行共免疫沉澱分析，其係藉由將細胞提取物與抗抗原決定基瓊脂糖珠或抗Myc瓊脂糖珠培育以沉澱出該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體並將經以抗Myc或抗抗原決定基抗體免疫沉澱之該AhR-磷酸-RORγt複合體進行免疫印漬；及(iii)當該比較結果指示與該對照相比，在該測試劑之存在下存在信號之減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體之抑制劑；其中該抗原決定基由SEQ ID NO：1之序列組成。
- 如請求項1之方法，其中：(i)該提供步驟提供選自由以下組成之群之細胞：Lck-GLK轉殖基因小鼠之T細胞、過度表現GLK之T細胞、TCR活化之T細胞及過度表現AhR+RORγt+IKKβ之細胞；(ii)該分析步驟係進行染色質免疫沉澱(ChIP)-DNA定序分析，其係使用抗RORγt抗體以免疫沉澱出該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體及使用 包含IL-17A啟動子DNA序列中之AhR結合位點核苷酸序列之引子對進行PCR以獲得PCR產物；及(iii)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下該PCR產物之數量減少時，該識別步驟識別該測試劑為該AhR-磷酸-RORγt複合體之抑制劑。
- 一種用於識別GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑之方法，其包括：(a)提供細胞培養物，其中該培養物中之細胞表現生發中心激酶(GCK)類激酶(GLK)蛋白質及類Ras GTP酶活化蛋白IQGAP1(IQGAP1)蛋白質兩者；(b)在測試劑之存在下培育該細胞培養物；(c)在該測試劑之存在下，分析該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之含量；(d)比較在該測試劑之存在下該GLK-IQGAP1蛋白質複合體與對照之含量；及(e)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之含量降低時，識別該測試劑為該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑。
- 如請求項9之方法，其中：(i)該提供步驟提供選自由以下組成之群之細胞：GLK轉殖基因小鼠、過度表現GLK之細胞及過度表現GLK+IQGAP1之細胞； (ii)該分析步驟係進行原位鄰近接合分析(PLA)，其將作為初級抗體、二級抗體之抗IQGAP1抗體及抗GLK或抗磷酸-IQGAP1[Ser480]抗體用作PLA探針及螢光標記之互補寡核苷酸探針用於信號偵測；及(iii)當該比較步驟指示與該對照相比，在該測試劑之存在下存在螢光信號減少時，該識別步驟識別該測試劑為該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑。
- 如請求項9之方法，其中該分析步驟係使用抗磷酸-IQGAP1[Ser480]抗體進行免疫印漬。
- 一種藉由如請求項1之方法識別之有效量AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑之用途，其係用於製造抑制IL-17A產生之藥劑。
- 如請求項12之用途，其中該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬(verteporfin)或阿來西定(alexidine)二鹽酸鹽。
- 如請求項12之用途，其中該藥劑係用於治療患有選自由自體免疫疾病、過度表現GLK之癌細胞轉移及過度表現GLK之癌細胞復發組成之群之IL-17A相關疾病之個體。
- 如請求項14之用途，其中該IL-17A相關疾病為自體免疫疾病，且該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽。
- 如請求項14之用途，其中該IL-17A相關疾病為過度表現GLK之癌細胞轉移，且該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽。
- 如請求項14之用途，其中該IL-17A相關疾病為過度表現GLK之癌細胞轉移，且該AhR-磷酸-RORγt蛋白質複合體抑制劑為維替泊芬。
- 一種藉由如請求項9之方法識別之有效量GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑之用途，其係用於製造用於治療有需要個體之過度表現GLK之癌細胞轉移疾病之藥劑。
- 如請求項18之用途，其中該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑為維替泊芬或阿來西定二鹽酸鹽。
- 如請求項18之用途，其中該GLK-IQGAP1蛋白質複合體之抑制劑為維替泊芬。
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