KR20210046027A - 자가면역질환 및 IL-17A 관련 질환에 대한 바이오마커 및 치료 표적으로서의 AhR-ROR-γt 복합체 - Google Patents

자가면역질환 및 IL-17A 관련 질환에 대한 바이오마커 및 치료 표적으로서의 AhR-ROR-γt 복합체 Download PDF

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Abstract

AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제를 식별하는 방법으로서, (a) 배양물 내의 세포가 AhR 단백질 및 포스포-RORγt 단백질을 발현하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 시험 제제의 존재 하에 상기 세포 배양물을 인큐베이팅 하는 단계; (c) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준을 분석하는 단계; (d) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및 (e) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준이 감소가 있는 것으로 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하는 단계를 포함한다. GLK-IQGAP1 단백질 복합체 억제제를 식별하는 방법이 또한 개시된다. 질환(disease)을 치료하기 위한 약제의 제조에서 식별된 억제제의 사용이 또한 개시된다.

Description

자가면역질환 및 IL-17A 관련 질환에 대한 바이오마커 및 치료 표적으로서의 AhR-ROR-γt 복합체
본 발명은 일반적으로 자가면역질환(autoimmune disease)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 IL-17 생산(production) 및 IL-17 매개 질환(IL-17-mediated diseases)에 대한 치료 표적(therapeutic target)으로서 GLK-유도된 AhR-ROR 감마 T 복합체(GLK-induced AhR-ROR gamma T complex)에 관한 것이다.
자가면역질환은 면역계 과활성화(overactivation)로 인해 발생한다. T 헬퍼 17 세포(T helper 17 cells)(Th17, IL-17A-생산 CD4+ T 세포(IL-17A-producing CD4+ T cells)) 및 IL-17A는 자가면역질환의 발병기전(pathogenesis)에서 중요한 역할을 한다. 전사 인자(transcription factor) RORγt는 IL-17A 프로모터(IL-17A promoter)에 결합하고 IL-17A 유전자 전사를 제어(controls)한다. 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon receptor, AhR)는 IL-17A 전사를 유도하고(inducing) Th17 분화(differentiation) 동안 음성 조절자 STAT1(negative regulator STAT1)을 억제함으로써 Th17 분극화(polarization)를 촉진한다. T-세포-특이적 AhR 녹아웃 마우스(T-cell-specific AhR knockout mice)는 Th17 분화를 손상시켰으며(impaired), Th17 매개 실험적(experimental) 자가면역 관절염(autoimmune arthritis)에 내성이 있다. 다양한 병원성(pathogenic) Th17 하위 집단(subpopulations)은 다양한 조건 하에서 시험관내(in vitro)에서 유도될 수 있다. 자가면역질환의 발병기전에서 이러한 별개의(distinct) Th17 하위 집단의 생체내(in vivo) 역할은 불분명하게 남아 있다.
MAP4K3(GLK라고도 함)는 포유류 Ste20 유사 세린/트레오닌 키나아제(mammalian Ste20-like serine/threonine kinase)이다. 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA) 또는 성인발병 스틸병(adult-onset Still's disease, AOSD)과 같은 자가면역질환 환자의 임상(clinical) 샘플은 T 세포에서 GLK 발현이 극적으로 증가한 것으로 나타났다. 그러나, GLK 과발현(GLK overexpression)이 여러 인간 자가면역질환에 어떻게 기여하는지는 명확하지 않다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체(AhR-phospho-RORγt protein complex)의 억제제(inhibitor)를 식별하는(identifying) 방법에 관한 것으로, (a) 배양물 내의 세포가 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon Receptor)(AhR) 단백질 및 포스포-레티노산-수용체 관련 고아 핵 수용체 감마 t(RORγt)(phospho-Retinoic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma t(RORγt)) 단백질을 발현하는, 세포 배양물(cell culture)을 제공하는 단계; (b) 시험 제제(test agent)의 존재 하에 상기 세포 배양물을 인큐베이팅(incubating) 하는 단계; (c) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준을 분석(assaying)하는 단계; (d) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준을 대조군(control)과 비교하는 단계; 및 (e) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준이 감소가 있는 것으로 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별(identifying)하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 분석 단계는 항-포스포-RORγt [Ser489] 항체(anti-phospho-RORγt [Ser489] antibody)를 사용하여 면역블롯팅(immunoblotting)을 수행한다.
다른 일 실시예에서, 상기 세포는 Lck-GLK 형질 전환 마우스(Lck-GLK transgenic mice)의 T 세포, GLK-과발현 T 세포(GLK-overexpressing T cells), TCR-활성화된 T 세포(TCR-activated T cells) 및 AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포(AhR + RORγt + IKKβ overexpressing cells)로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 일 실시예에서, (i) 상기 제공 단계는 CFP-AhR, YFP-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된(co-transfected) 세포를 제공하고; (ii) 상기 분석 단계는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석을 수행하고; 및 (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 상기 YFP-RORγt에 의해 방출되는(emitted) 형광 강도(fluorescence intensity)의 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별한다.
다른 일 실시예에서, (i) 상기 제공 단계는 AhR 태그된 에피토프(epitope tagged AhR), Myc-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된 세포를 제공하고; (ii) 상기 분석 단계는 항-Myc 항체-접합된 수용체 비드(anti-Myc antibody-conjugated acceptor beads) 및 항-에피토프 항체-코팅된 공여자 비드(anti-epitope antibody-coated donor beads)와 함께 ALPHA 분석을 사용하여 수행되고; 및 (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 항-Myc 항체-접합된 수용체 비드에 의해 방출되는 신호(signal)의 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하고, 상기 에피토프는 서열 번호: 1(SEQ ID NO: 1)의 서열로 이루어진다.
다른 일 실시예에서, (i) 상기 제공 단계는 Lck-GLK 형질 전환 마우스의 T 세포, GLK-과발현 T 세포, TCR-활성화된 T 세포 및 AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포를 제공하고; (ii) 상기 분석 단계는, 일차(primary) 항체로서 항-AhR 항체(anti-AhR antibody)와 항-RORγt(anti-RORγt) 또는 항-포스포-RORγt [Ser489] 항체를, PLA 프로브(PLA probes)로서 이차(secondary) 항체를, 및 신호 검출용 형광 표지된 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브(fluorescent-labeled complementary oligonucleotide probes)를 사용하여 인 시츄(in situ) 근접 연결 분석(proximity ligation assay, PLA)을 수행하고; 및 (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 형광 신호 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별한다.
다른 일 실시예에서, (i) 상기 제공 단계는 Myc-AhR, RORγt 태그된 에피토프(epitope tagged RORγt) 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된 세포를 제공하고; (ii) AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체를 침전시키기(precipitate) 위해 항-에피토프 아가로스 비드(anti-epitope agarose beads) 또는 항-Myc 아가로스 비드(anti-Myc agarose beads)와 함께 세포 추출물(cell extracts)을 인큐베이팅하고(incubating), AHR-포스포-RORγt 복합체를 항-Myc 또는 항-에피토프 항체와 함께 면역 침전시켜(immunoprecipitated) 면역블롯팅함으로써(immunoblotting), 상기 분석 단계는 공동 면역 침전 분석(co-immunoprecipitation assay)을 수행하고; 및 (iii) 비교 결과(comparing result)가 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 신호의 감소가 있음을 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하고, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 서열로 이루진다.
다른 일 실시예에서, (i) 상기 제공 단계는 Lck-GLK 형질 전환 마우스의 T 세포, GLK-과발현 T 세포, TCR-활성화된 T 세포 및 AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포를 제공하고; (ii) 상기 분석 단계는, AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체를 면역 침전시키기 위해 항-RORγt 항체를 사용하고, PCR 산물을 얻기 위해 IL-17A 프로모터 DNA 서열의 AhR-결합 부위 뉴클레오티드 서열(AhR-binding site nucleotide sequence)을 포함하는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 염색질 면역 침전-DNA 시퀀싱(chromatin immunoprecipitation(ChIP)-DNA sequencing) 분석을 수행하고; 및 (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존해 하에 상기 PCR 산물의 양의 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 복합체의 억제제로 식별한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제를 식별하는 방법에 관한 것으로, (a) 배양물 내의 세포가 GLK 단백질 및 IQGAP1 단백질을 발현하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 시험 제제의 존재 하에 상기 세포 배양물을 인큐베이팅하는 단계; (c) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 수준을 분석하는 단계; (d) 상기 시험 제제의 존재 하에 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및 (e) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 수준이 감소가 있는 것으로 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 시험 제제를 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제로 식별하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, (i) 상기 제공 단계는 GLK 형질 전환 마우스, GLK-과발현 세포 및 GLK + IQGAP1-과발현 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 제공하고; (ii) 상기 분석 단계는, 일차 항체로 항-IQGAP1 항체 및 항-GLK 또는 항-포스포-IQGAP1 [Ser480] 항체를, PLA 프로브로 이차 항체를, 신호 검출용 형광 표지된 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 인 시츄(in situ) 근접 연결 분석(proximity ligation assay, PLA)을 수행하고; 및 (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 형광 신호 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제로 식별한다.
다른 일 실시예에서, 상기 분석 단계는 항-포스포-IQGAP1 [Ser480] 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은, IL-17A 관련 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IL-17A 관련 질환을 치료하기 위한 약제(medicament)의 제조에서, 본 발명의 방법에 의해 식별된 유효량의 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제의 용도에 관한 것이다.
일 실시예에서, 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀(verteporfin) 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드(alexidine dihydrochloride)이다.
다른 일 실시예에서, 상기 IL-17A 관련 질환은 자가면역질환(autoimmune disease), GLK-과발현 암세포 전이(GLK-overexpressing cancer cell metastasis) 및 GLK-과발현 암세포 재발(recurrence)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
다른 일 실시예에서, 상기 IL-17A 관련 질환은 자가면역질환이고, 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드인 것이다.
다른 일 실시예에서, 상기 IL-17A 관련 질환은 GLK-과발현 암세포 전이이고, 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드인 것이다.
다른 일 실시예에서, 상기 IL-17A 관련 질환은 GLK-과발현 암세포 전이이고, 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀인 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은, GLK-과발현 암세포 전이의 치료를 필요로 하는 대상체에서 GLK-과발현 암세포 전이를 치료하기 위한 약제의 제조에서, 본 발명의 방법에 의해 식별된 유효량의 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제의 용도에 관한 것이다.
일 실시예에서, 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제는 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드인 것이다.
또한 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서 GLK-과발현 암세포 전이를 치료하기 위한 약제의 제조에서, 유효량의 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
도 1은 Lck-GLK 형질 전환 마우스가 자가면역 표현형(phenotypes) 및 선택적으로 증가된 혈청(serum) IL-17A 수준(levels)을 나타낸다(display)는 것을 보여준다. (A) 마우스에서 표시된(indicated) 기관(organs)의 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신 염색 섹션(eosin-stained sections)이다. 화살표(arrows)는, 면역 세포(immune cells) 침윤성(immune cells). 바(Bar), 100 μm. (B) 마우스의 혈청 자가 항체(autoantibodies)의 수준은 ELISA 분석(ELISA assays)에 의해 결정되었다. 수준은 야생형 마우스(wild-type mice) 중 하나의 값에 상대적으로 표시된다(presented). (C) 마우스에서 사이토카인(cytokines)의 혈청 수준은 ELISA 분석에 의해 결정되었다. (D) Lck-GLK 및 Lck-GLK/IL-17A KO 마우스에서 자가 항체의 혈청 수준은 ELISA 분석에 의해 결정되었다. 수준은 Lck-GLK 마우스 중 하나의 값에 상대적으로 표시된다. (E) IL-17A 발현은 GLK shRNA에 의해 약화되었다(attenuated). 뮤린 일차 비장 T 세포(murine primary splenic T cells)를 GFP-인간 GLK shRNA 및 대조군 GFP 벡터로 형질 감염시켰다(transfected). 형질 감염된 T 세포를 항-마우스 CD3 항체(anti-mouse CD3 antibodies)로 3 시간 동안 자극한(stimulated) 다음 형질 감염 후 3 일에 유동 세포 분석(flow cytometry)에 의해 결정되었다. 데이터는 IL-17A-생산 T 세포(IL-17A-producing T cells)(녹색 형광 단백질(GFP)-게이트(green uorescent protein(GFP)-gated))의 행적(events)을 보여준다. WT, 야생형 한배 새끼 대조군(WT, wild-type littermate controls); Lck-GLK, T-세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스(T-cell-specific GLK transgenic mice). Lck-GLK/IL-17A KO, Lck-GLK; IL-17A 결핍(deficient) 마우스. ANA, 항-핵 항체(anti-nuclear antibody); α-dsDNA, 항-dsDNA 항체(anti-dsDNA antibody); RF, 류마티스 인자(rheumatoid factor). *, P 값 <0.05; **, P 값 <0.01 (양측 스튜던트 t-검정(two-tailed Student's t-test)).
도 2는 GLK가 AhR 및 RORγt를 유도하여 IL-17A 발현을 향상시킨다는(enhances) 것을 보여준다. (A) 마우스의 말초혈 T 세포(peripheral blood T cells)에서 뮤린 IL-17A mRNA 수준을 실시간 PCR(real-time PCR)로 분석했다(analyzed). IL-17A의 발현 수준은 Mrpl32 수준으로 정상화되었다(normalized). 폴딩(fold) 변화는 야생형 마우스의 값에 상대적으로 표시된다. 평균(means) ± SEM이 표시된다. (B) IL-17A 프로모터의 루시페라제(luciferase) 리포터 활성. 주르카트(Jurkat) T 세포를 GLK 또는 GLK 키나아제-사멸(dead) (GLK-K45E) 돌연변이체(mutant)와 IL-17A 프로모터(2kb) 구조물(construct)을 인코딩(encoding)하는 플라스미드로 공동 형질 감염(co-transfected)시켰다. 평균 ± SEM이 표시된다. (C) IL-17A 프로모터에 대한 전사 인자(transcription factors)의 개략도(schematic diagram). (D) 마우스의 T 세포에서 IL-17A 프로모터에 대한 AhR, RORγt, STAT3, IRF4, KLF4 또는 BATF의 결합(binding)을 개별(individual) 면역 침전(immunoprecipitation) 실험(experiments)의 면역 복합체(immunocomplexes)를 사용하여 ChIP-PCR로 분석했다. (E) IL-17A 돌연변이체 프로모터의 루시페라 제 리포터 활성. 주르카트 T 세포를 빈 벡터(empty vector) 또는 GLK 플라스미드와 AhR, RORγt (-877) 또는 STAT3에 대한 돌연변이된 결합 요소를 포함하는 IL-17A 프로모터 구조물로 공동 형질 감염시켰다. (F) GLK를 인코딩하는 빈 벡터 또는 플라스미드로 공동 형질 감염된 주르카트 T 세포에서 AhR, RORγt (-877) 및 STAT3 반응 요소(XRE-Luc, RORγt-Luc 및 SIE-Luc)의 루시페라제 리포터 활성. XRE, 생체 이식 반응 요소(xenobiotic responsive element); SIE, sis-유도가능한 요소(sis-inducible element). WT, 야생형 한배 새끼 대조군; Lck-GLK, T- 세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스. 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM이 (b), (e) 및 (f)에 표시된다. *, P 값 <0.05; **, P 값 <0.01 (양측 스튜던트 t-검정).
도 3은 PKCθ가 AhR을 인산화(phosphorylate)하고 핵 전좌(translocation)를 유도함을 보여준다. (A) 표시된 마우스로부터의 사이토카인의 혈청 수준은 ELISA 분석에 의해 결정되었다. 평균 ± SEM이 표시된다. WT, 야생형 한배 새끼 대조군; Lck-GLK, T- 세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스. Lck-GLK;AhRf/f; CD4-Cre, AhR 조건부 녹아웃(conditional knockout, cKO) 마우스로 사육된(bred) T- 세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스. *, P 값 <0.05; **, P 값 <0.01 (양측 스튜던트 t-검정). (B) 자극(stimulation)없이 뮤린 비장(splenic) T 세포에서 AhR의 세포 내(subcellular) 국소화(localization)의 공초점 현미경(Confocal microscopy). 원래 배율(Original magnification), Х 630; 바(bar), 10 μm. (C) WT 및 Lck-GLK Tg 마우스의 일차 비장 T 세포(primary splenic T cells)의 세포질(cytoplasmic) 및 핵 분획(nuclear fractions)에서 AhR, GAPDH 및 히스톤 3(histone 3)의 면역블롯팅(immunoblotting). (D) WT 및 Lck-GLK Tg 마우스의 일차 비장 T 세포에서 p-AhR(Ser-36), AhR 및 GLK의 면역블롯팅. (E) 개별적으로(individually) 형질 감염된 HEK293T 세포로부터 분리된(isolated) Flag-GLK, Flag-PKCθ, Flag-IKKβ, Flag-IKKα 및 HA-AhR(기질(substrate)로서)을 사용하는 시험관내 키나아제 분석에서 AhR 인산화(phosphorylation) 및 표시된 키나아제의 면역블롯팅. (F) 자극없이 WT 및 Lck-GLK 마우스로부터의 일차 비장 T 세포의 용해물(lysate)로부터 PKCθ와 내인성(endogenous) AhR의 공동 면역 침전(Co-immunoprecipitations, co-IP). (G) 야생형 또는 Lck-GLK Tg 마우스의 말초혈 T 세포에서 내인성 PKCθ와 AhR 간의 PLA의 상호 작용. 각 빨간색 점(red dot)은 직접적인 상호 작용을 나타낸다(represent). T 세포 세포핵(nucleus)은 DAPI(파란색)로 염색되었다. (H) 정제된(purified) HA-태그된(HA-tagged) AhR 및 Myc-태그된(Myc-tagged) PKCθ WT 또는 PKCθ 키나아제-사멸 (K409W) 돌연변이체 단백질의 시험관내 키나아제 분석. (I) PKCθ KO 마우스로 사육된 WT, Lck-GLK Tg 및 Lck-GLK Tg 마우스의 일차 비장 T 세포에서 인산화된 AhR(Ser-36), AhR, GLK 및 PKCθ의 면역블롯팅 분석. (J) 표시된 마우스의 일차 비장 T 세포에서 AhR 및 PKCθ의 세포 내 국소화의 공초점 현미경. 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm. WT, 야생형 한배 새끼 대조군; Lck-GLK, T-세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스; Lck-GLK;PKCθ-/-, PKCθ 녹아웃 마우스로 사육된 Lck-GLK 형질 전환 마우스.
도 4는 GLK가 AhR 및 RORγt 상호 작용을 통해 IL-17A 프로모터에 대한 RORγt 결합을 유도함을 보여준다. (A) 표시된 마우스의 T 세포에서 IL-17A 프로모터에 대한 RORγt의 결합을 ChIP-PCR로 분석했다. (B) 자극없이 WT 및 Lck-GLK 마우스의 일차 비장 T 세포의 용해물을 사용하여 RORγt와 내인성 AhR의 공동 면역 침전(co-IP). (C) 표시된 마우스의 일차 T 세포에서 AhR 및 RORγt의 세포 내 국소화의 공초점 현미경. 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm. (D) 마우스의 T 세포에서 IL-17A 프로모터에 대한 AhR 및 RORγt의 결합은 항-RORγt 면역 복합체를 사용하여 ChIP-PCR에 의해 분석되었다. (E) 표시된 마우스의 말초혈 T 세포에서 내인성 AhR 과 RORγt 간의 상호 작용에 대한 근접 연결 분석 (PLA)의 공초점 현미경. (F) GLK-CFP, PKCθ-Myc, IKKβ-CFP 또는 IKKα-Myc 플라스미드로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물을 사용하여 HA-태그된 AhR 및 Flag-태그된 RORγt의 공동 면역 침전(IP). (G) 정제된 Flag-태그된 RORγt 및 GST-태그된 AhR 단백질의 GST-풀다운 분석(GST-pulldown assays). Flag-태그된 RORγt 단백질은 Flag-RORγt와 함께 CFP-IKKβ 또는 벡터로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물을 사용하여 Flag 펩티드(Flag peptide)로 용리되었다(eluted). 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm.
도 5는 IKKβ가 RORγt Ser-489를 인산화시켜 AhR에 대한 RORγt 결합을 유도함을 보여준다. (A) 야생형, Lck-GLK Tg 및 Lck-GLK;IKKβf/f; CD4-Cre 마우스의 말초혈 T 세포에서 내인성 AhR 및 RORγt 간의 상호 작용에 대한 PLA의 공 초점 현미경 분석. (B) 야생형, Lck-GLK Tg 및 Lck-GLK; IKKβf/f;CD4-Cre 마우스의 일차 비장 T 세포에서 AhR 및 RORγt의 세포 내 국소화의 공 초점 현미경. 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm. (C) 마우스에서 사이토카인의 혈청 수준은 ELISA 분석에 의해 결정되었다. 평균 ± SEM이 표시된다. *, P 값 <0.05 (양측 스튜던트 t- 검정). (D) RORγt와 IKKβ의 재조합 단백질(recombinant proteins) 간의 직접적인 상호 작용. 정제된 His-태그된 RORγt 및 GST-태그된 IKKβ 단백질의 GST- 또는 His- 풀다운 분석. (E) 개별 HEK293T 형질감염체(transfectants)로부터의 면역 침전된 Flag-태그된 RORγt 및 IKKβ 또는 IKKβ 키나아제-사멸 (K44M) 돌연변이체 단백질의 시험관내 키나아제 분석. (F) RORγt의 트립신 분해 펩티드(tryptic peptides)의 질량 분석법(mass spectrometry, MS)/MS 단편화 스펙트럼(MS fragmentation spectra)은 Ser-489의 인산화를 포함한다. (G) 항-포스포-RORγt (Ser-489)의 항체 특이성(antibody specificity)은 CFP-태그된 IKKβ와 Flag-태그된 RORγt WT 또는 RORγt-S489A 돌연변이체로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포를 사용한 면역블롯팅에 의해 입증되었다(demonstrated). (H) 표시된 마우스의 일차 비장 T 세포에서 p-RORγt (Ser-489), RORγt, p-IKKβ (Ser-180/181) 및 IKKβ의 면역블롯팅. (I) 벡터 또는 IKK-CFP 플라스미드로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물을 사용하여 HA-태그된 AhR 및 Flag-태그된 RORγt WT 또는 RORγt-S489A 돌연변이체의 공동 면역 침전(co-IP). WT, 야생형 한배 새끼 대조군; Lck-GLK, T-세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스. Lck-GLK; IKKβf/f;CD4-Cre, IKKβ 조건부 녹아웃 마우스로 사육된 T-세포-특이적 GLK 형질 전환 마우스. 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm.
도 6은 TCR 신호 전달(signaling)이 RORγt 인산화 및 후속(subsequent) AhR-RORγt 상호 작용을 유도함을 보여준다. (A) 일차 비장 T 세포에서 p-RORγt (Ser-489), RORγt, p-IKKβ (Ser-180/181) 및 IKKβ의 면역블롯팅. 항-CD3 항체와 스트렙타비딘(streptavidin)으로 T 세포를 자극하였다. (B) 항-CD3 항체와 스트렙타비딘으로 자극된 뮤린 일차 비장 T 세포의 용해물로부터 RORγt와 내인성 AhR의 공동 면역 침전(co-IP). (C) IKKβf/f 또는 CD4-Cre;IKKβf/f 마우스의 일차 비장 T 세포에서 p-RORγt (Ser-489), RORγt 및 IKKβ의 면역블롯팅. 항-CD3 항체와 스트렙타비딘으로 T 세포를 자극하였다. (D) 표시된 마우스의 일차 T 세포에서 내인성 AhR과 RORγt (왼쪽 패널) 또는 AhR과 Ser-489-인산화된 RORγt (오른쪽 패널) 사이의 상호 작용에 대한 근접 연결 분석(PLA)의 공초점 현미경. T 세포는 (C)로 자극되었다. 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm. (E 및 F) 표시된 마우스로부터의 일차 비장 T 세포의 상층액(supernatants)에서 다양한 사이토카인의 ELISA. T 세포는 3 일 동안 플레이트-결합된(plate-bound) 항-CD3 항체로 자극되었다. 평균 ± SD가 표시된다. (G) 표시된 마우스의 일차 비장 T 세포로부터의 RORγt 및 GAPDH 단백질의 면역블롯팅. (H) GLK- 과발현 또는 TCR-자극된(TCR-stimulated) T 세포에서 AhR-RORγt 복합체에 의해 유도된 IL-17A 전사(transcription)의 도식 모델(Schematic model). T-세포-특이 적 GLK 형질 전환 (Lck-GLK Tg) 마우스의 T 세포에서 GLK 과발현은 PKCθ를 통해 AhR Ser-36 인산화를 유도하고, IKKβ를 통해 RORγt Ser-489 인산화를 유도한다. RORγt가 인산화되면 RORγt는 AhR과 직접 상호 작용한다. 인산화된 AhR은 RORγt를 세포핵으로 운반하는(transporting) 역할을 한다. AhR-RORγt 복합체는 IL-17A 프로모터의 RORγt 결합 요소(RORγt-binding element) (-877 ~ -872)와 AhR 결합 요소(AhR-binding element) (-254 ~ -249) 모두에 결합하여, IL-17A 전사를 유도한다. 정상 T 세포에서 T-세포 수용체 (TCR) 자극은, IKKβ 활성화, RORγt Ser-489 인산화 및 AhR-RORγt 상호 작용을 포함하여 GLK 키나아제 활성 및 다운스트림 신호 전달(downstream signaling)을 유도한다. NF-κB 외에도 T 세포에서 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-6 및 TNF-α의 전사 활성화를 위해 다른 중요한 전사 인자(critical transcription factors)(예: NFAT1 또는 AP-1)도 필요하다. "기타"는 다른 중요한 전사 인자를 의미한다(denote). NF-κB는 TCR에 의해 유도된 다중 사이토카인의 생산에 필요하다. 그러나, GLK-IKKβ-NF-κB 캐스케이드(cascade) 단독으로는 다중 사이토카인의 유도(induction)에 충분하지 않다. 종합적으로, GLK 과발현 또는 TCR 신호 전달은 T 세포에서 AhR 및 RORγt를 통해 IL-17A 전사를 유도한다.
도 7은 SLE 환자에서 GLK+ Th17 세포의 빈도(frequencies)가 증가함을 보여준다. (a-d) 6 명의 건강한 대조군(healthy controls)과 18 명의 SLE 환자의 말초혈 백혈구(leukocytes)로부터의 GLK+ 및 IL-17+ T 세포 (CD3-의존성(gated), CD3 및 CD4-의존성, CD3 및 CD8-의존성 또는 CD3 및 CD4-CD8- (이중 음성(DN)-의존성(double-negative(DN)-gated))의 유동 세포 분석; 대표(representative) 건강한 대조군(HC) 및 대표 SLE 환자(SLEDAI = 12)의 결과가 왼쪽 패널에 표시된다. SLEDAI는 전신 홍반성 루푸스 질환(systemic lupus erythematosus disease) 활성 지수(index)를 의미한다. (e) 건강한 대조군과 SLE 환자군에서 GLK+ IL-17+ T 세포의 통계적 분석이 표시된다. (f) 모든 SLE 환자 (빨간색) 및 건강한 대조군 (파란색)의 CD4+ T 하위 집합(subset)에서 SLEDAI와 GLK+ IL-17+ T 세포의 빈도 간의 양성(positive) 상관관계(correlation) 및 유의한(significant) 회귀(regression). (피어슨(Pearson) 상관 계수(correlation coefficient): r = 0.729, P = 0.000053). (g) 활성 SLE (SLEDAI ≥ 12)의 검출을 위한, T-세포 하위 집합(CD3+, CD4+, CD8+ 또는 DN 하위 집합)의 GLK+ IL-17+ 세포 빈도의 수신기 작동 특성(receiver operating characteristic, ROC) 곡선(curves). CD3+ T 세포 (0.935, P = 0.002), CD4+ T 하위 집합 (0.944, P = 0.001), CD8+ T 하위 집합 (0.792, P = 0.036) 및 DN T 하위 집합(0.759, P = 0.062)에서, GLK+ IL-17+ 하위 집단(subpopulation)의 커브 아래 영역(area under the curve, AUC) 값.
도 8은 인산화된 RORγt가 인간 자가면역 T 세포에서 AhR과 상호 작용함을 보여준다. (A) 증폭된(amplified) 발광 근접 균질 분석(luminescent proximity homogeneous assays, ALPHA)에 의해 결정된 HEK293T 세포의 용해물에서 Myc-AhR과 Flag-RORγt 간의 상호 작용(<200 nm) 신호. 평균± SD가 표시된다. p-RORγt 펩티드는 S489-인산화 RORγt 펩티드, 482-LFSTDVE{pS}PEGLSK-495를 의미한다. (B) 3 명의 SLE 환자, 1 명의 RA 환자 및 3 명의 HC로부터 갓 분리된 말초혈 T 세포에서 p-RORγt (Ser-489) 및 RORγt의 면역블롯팅. (C) 5 명의 SLE 환자, 3 명의 RA 환자 및 2 명의 건강한 대조군으로부터 갓 분리된 말초혈 T 세포에서 AhR과 RORγt 간의 상호 작용에 대한 PLA의 공초점 현미경. (D) 2 명의 SLE 환자, 2 명의 RA 환자 및 1 명의 건강한 대조군의 말초혈 T 세포에서 내인성 AhR 및 인산화된 RORγt 간의 상호 작용에 대한 PLA의 공초점 현미경. SLE, 전신 홍반성 루푸스; RA, 류마티스성 관절염; HC, 건강한 대조군. 원래 배율, Х 630; 바(bar), 10 μm.
도 9는 GLK 억제제 C1(베르테포르핀)이 AhR-RORγt 복합체를 차단함(block)을 보여준다. (A) 표시된 농도(concentration)에서 GLK 억제제 C1(베르테포르핀)의 유무에 관계없이 처리된 안정한 GLK 형질 감염된 CHO-K1 세포(GLK-transfected CHO-K1 cells)에서 NF-κB 구동 리포터(NF-κB-driven reporter) 분석의 루시페라제(Luciferase) 활성. 폴딩(fold) 변화는 벡터 대조군 값에 상대적으로 표시된다. (B) GLK 키나아제 도메인의 재조합 단백질과 GST-태크된 키나아제-사멸 PKCθ (K409W)의 재조합 단백질을 GLK 억제제 C1(베르테포르핀)의 존재 또는 부재하에 시험관내 키나아제 분석에 적용했다. 평균 ± SD가 표시된다. *, P 값 <0.05; **, P 값 <0.01(양측 스튜던트 t-검정). (C) AhR-RORγt 복합체는 GLK 억제제에 의해 억제되었다. 30 분 동안 C1(베르테포르핀)(5 μM)으로 처리된 말초혈 T 세포에서 AhR과 RORγt 또는 포스포-RORγt(S489) 간의 상호 작용에 대한 근접 연결 분석(PLA)의 공초점 현미경. T 세포는 4 명의 SLE 환자와 1 명의 RA 환자로부터 갓 분리되었다. C1은 베르테포르핀을 나타내고; C2는 알렉시딘 디하이드로클로라이드를 의미한다. (D) (C)의 PLA 신호의 정량화(Quantication). (E) CFP-AhR, YFP-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 FRET 분석.
도 10은 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체(GLK-induced AhR-RORγt complex)의 억제제가 마우스에서 IL-17 생산 및 자가면역반응을 억제함(suppress)을 보여준다. (A 내지 C) Lck-GLK Tg 마우스에서 혈청 IL-17A 및 자가 항체에 대한 GLK 억제제 C1(베르테포르핀) 투여(30 일 동안 3 일마다 0.556 nmole/g)의 효과. (B) C1(베르테포르핀) 또는 PBS로 처리된 Lck-GLK Tg 마우스에서 표시된 혈청 사이토카인의 ELISA. (C) C1 (베르테포르핀) 또는 PBS로 처리된 Lck-GLK Tg 마우스에서 혈청 자가 항체의 ELISA. 평균 ± SEM이 표시된다. (D) PBS 또는 GLK 억제제 C1(베르테포르핀) 및 C2로 처리된 야생형 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 유도. 임상 점수(clinical scores)는 1에서 5까지의 스케일(scale)로 표시된다(왼쪽 패널). 16 일째에 MOG-면역화된(MOG-immunized) 마우스의 혈청에서 IL-17A의 ELISA(오른쪽 패널). (E) GLK 억제제 C1(베르테포르핀) 또는 PBS로 처리된 야생형 마우스에서 콜라겐-유도된 관절염(Collagen-induced arthritis, CIA) 유도. 임상 점수는 1에서 16까지의 스케일로 표시된다(왼쪽 패널). 28 일째 콜라겐 면역화된(collagen-immunized) 마우스의 혈청에서 IL-17A의 ELISA. 평균 ± SEM이 표시된다. *, P 값 <0.05; **, P 값 <0.01; ***, P 값 <0.001 (양측 스튜던트 t-검정). C1은 베르테포르핀을 의미하고; C2는 알렉시딘 디하이드로클로라이드를 의미한다.
도 11은 베르테포르핀이 Th17 분화(differentiation)를 억제하지만 Treg 분화를 향상시킨다는 것을 보여준다. (A) IL-17A-생산 CD4+ T 세포의 유도 세포 분석. 비장 T 세포는 시험관내 Th17 분화 동안 베르테포르핀(C1)(1 또는 5 μM)과 함께 공동 처리되었다. (B) IL-17A-생산 CD4+ T 세포의 유동 세포 분석. 뮤린 시험관내 분화된 Th17 세포를 PMA와 이오노마이신(ionomycin)으로 자극하고 30 분 동안 베르테포르핀(C1)(1 또는 5μM)과 공동 처리했다. (C) Foxp3-생산 CD4+ T 세포의 유동 세포 분석. 비장 T 세포는 시험관내 Treg 분화 동안 베르테포르핀(C1)(5 μM)과 함께 공동 처리되었다. (D) 야생형 또는 Lck-GLK 형질 전환 마우스의 CD4+ T 세포와 분화된 Foxp3-생산 CD4+ T 세포의 유동 세포 분석.
도 12는 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체의 억제제가 인간 T 세포의 IL-17 생산을 차단함을 보여준다. (a) 항-CD3/CD28로 자극되고 C1(베르테포르핀)(5 μM 또는 10 μM)으로 3 일 동안 처리된 뮤린 일차 T 세포의 상층액에서 다양한 사이토카인의 ELISA. 평균 ± SD가 표시된다. (b) 인간 T 세포의 상층액에서 IL-17A의 ELISA. T 세포를 항-CD3/CD28로 자극하고 C1(베르테포르핀)(1 μM 또는 5 μM) 또는 C2(1 μM 또는 5 μM)로 3 일 동안 처리했다. HC, 건강한 대조군; SLE, 전신 홍반성 루푸스; RA, 류마티스 관절염; AS, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis); PsA, 건선성 관절염(psoriatic arthritis); PSS, 원발성 쇼그렌 증후군(primary Sjogren's syndrome). 평균 ± SD가 표시된다. C1은 베르테포르핀을 의미하고; C2는 알렉시딘 디하이드로클로라이드를 의미한다.
도 13은 GLK가 폐암(lung cancer)의 원격 전이(distant metastasis)를 유도함을 보여준다. (A) PolⅡ-GLK 형질 전환 구조물(PolⅡ-GLK transgenic construct)의 개략도. GLK 형질 전환 마우스에서 인간 GLK cDNA는 마우스 RNA 중합 효소 II(RNA polymerase II, PolⅡ) 프로모터에 의해 구동되었다. (B) 마우스로부터의 뮤린 말초혈 세포(murine peripheral blood cells)에서 형질 전환 인간 GLK(hGLK) mRNA 수준의 실시간 PCR. 인간 GLK mRNA 수준은 마우스 Srp72 mRNA(mouse Srp72 mRNA) 수준으로 정상화되었다(normalized). 평균 ± SEM이 표시된다. WT, 야생형 한배 새끼 대조군; PolⅡ-GLK, PolⅡ-GLK 형질 전환 마우스. (C) 8 개월 된 야생형(WT), SPA-EGFRdel 형질 전환 또는 SPA-EGFRdel의 폐(lung) 조직(tissues)에서 폐암 생성자(maker) 증식 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 또는 H&E 염색(H&E staining)의 대표적인 면역조직화학(immunohistochemistry); PolⅡ-GLK 형질 전환 쥐. 스케일 바(Scale bar), 100 μm. (D 및 E) 1 세(1-year-old) 표시된 마우스의 폐(D), 자궁 경부 림프절(cervical lymph nodes)(E), 뇌(brain)(E) 또는 간(liver)(E)에서 EGFR-결실(EGFR-deletion) 돌연변이체 발현 또는 H&E 염색의 대표적인 면역조직화학. LN, 자궁 경부 림프절. 스케일 바, 100 μm
도 14는 GLK 억제제가 표시된 암으로부터 세포의 이동(migration)을 차단함을 보여준다. 인간 신경교종 U87 세포(human glioma U87 cells), 인간 췌장암 Panc-1 세포(human pancreatic cancer Panc-1 cells), 마우스 폐암 LL2 세포(mouse lung cancer LL2 cells) 또는 GLK 억제제 C1(베르테포르핀)(a; 2 uM 또는 5 uM) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)(b; 2 uM 또는 uM)로 처리된 인간 간종 Huh-7 세포(human hepatoma Huh-7 cells)의 트랜스웰 이동 분석(Transwell migration assays). C1은 베르테포르핀을 나타내고; C2는 알렉시딘 디하이드로클로라이드를 나타낸다.
도 15는 GLK 억제제가 폐암 이종 이식 모델(lung cancer xenograft model)에서 종양 성장(tumor growth)을 억제함을 보여준다. (A) 뮤린 TC-1 폐암 세포(Murine TC-1 lung cancer cells)를 TC-1 이종이식(xenograft) 모델을 확립하기 위해 야생형 마우스의 오른쪽 옆구리(flank)에 피하(subcutaneously) 접종하였다(inoculated). TC-1 세포가 접종된 마우스에 PBS, C1(베르테포르핀)(10 uM) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)(17 uM)를 3 일마다 15 일 동안 정맥안으로(intravenously) 주사하였다(injected). (B) PBS, C1(베르테포르핀)(10 uM) 또는 C2(17 uM) 처리(treatment) 후 절제된(excised) TC-1 폐암(TC-1 lung cancers)의 사진. (C) 종양의 성장(평균 종양 부피(mean tumor volume))을 15 일 동안 측정하였다. C1 또는 C2 투여 후 시간의 함수로서 TC-1 종양 크기 진행(size progression). N.D., 감지할 수 없음(not detectable). C1은 베르테포르핀을 의미하고; C2는 알렉시딘 디하이드로클로라이드을 의미한다.
도 16은 GLK 억제제가 마우스에서 폐암 전이(metastasis)를 억제함을 보여준다. (A) C1(베르테포르핀)과 GLK 키나아제 도메인 구조의 분자 도킹(docking). 3 차원 구조 모델은 인산화된 Ser-170(phosphorylated Ser-170)을 포함하는 예측된 GLK 키나아제 도메인에 대한 C1의 결합을 묘사한다(depicts). 추정 결합 친화도는 -7.4 kcal/mol이었다. (B) GLK 키나아제 도메인 구조와 C2 (alexidine dihydrochloride)의 분자 도킹. 3 차원 구조 모델은 인산화된 Ser-170을 포함하는 예측된 GLK 키나아제 도메인에 대한 C2의 결합을 묘사한다(depicts). 추정 결합 친화성(putative binding affinity)은 -7.0 kcal/mol이었다. (C) Flag-GLK 및 GFP-GLK 플라스미드로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물을 사용하여 Flag-태그된 GLK 및 GFP-융합 GLK의 공동 면역 침전(co-IP). 세포를 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)로 처리하였다. (D) LLC/luc 전이성 폐암 마우스 모델(LLC/luc metastatic lung cancer mouse model)에서 30 일 동안 3 일마다 GLK 억제제 C1(0.556 nmole/g) 또는 C2(0.085 nmole/g)의 투여. (E) C1(베르테포르핀), C2 (알렉시딘 디하이드로클로라이드) 또는 비히클(vehicle)로 처리된 마우스에서 루시페라제 활성이 IVIS 스펙트럼(IVIS Spectrum)에 의해 검출되었다. (F) (e)의 이미지에서 LLC/luc 세포에서 방출된 광자(photons)의 발광 강도(luminescent intensity)를 정량화했다. (G) C1(베르테포르핀), C2 또는 비히클로 처리된 마우스의 폐 조직에서 H&E의 대표적인 면역조직화학. 스케일 바, 0.5cm. (H) C1(베르테포르핀), C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 또는 비히클로 처리된 마우스의 폐 조직에서 GLK와 IQGAP1(상부 패널) 또는 인산화된 IQGAP1 Ser-480(하부 패널) 간의 상호 작용에 대한 인 시츄 PLA 분석(In situ PLA assays) LLC/luc 전이성 폐암 마우스 모델. 원래 배율, x 40.
도 17은 GLK 결핍 마우스(GLK-deficient mice)가 증가된 수명(lifespan)을 나타낸다는 것을 보여준다. (A) 10마리의 야생형 또는 15마리의 GLK 결핍 마우스의 생존 곡선(survival curves)을 생명표 방법(life-table method)으로 계산했다. GLK 결핍 마우스는 야생형 마우스에 비해 상당한 수명 연장(extension)을 나타냈다 (Wilcoxon 테스트, P = 0.001). (B) 16 개월 된 야생형 마우스는 회색 머리카락(gray hair)을 나타낸 반면, 38 개월 된 GLK 결핍 마우스는 여전히 건강한 머리카락을 나타냈다. (C) 4.5 개월 된 야생형, 20 개월 된 야생형 또는 20 개월 된 GLK 결핍 마우스의 혈청에서 다양한 사이토카인의 ELISA. 평균 ± SEM이 표시된다. WT, 야생형 마우스; GLK KO, GLK 결핍 마우스. *, P 값 <0.05; **, P 값 <0.01 (양측 스튜던트 t- 검정).
도 18은 GLK가 IQGAP1과 직접 상호 작용함을 보여준다. (A) 티로신 포스파타제(tyrosine phosphatase) 억제제 퍼바나데이트(pervanadate)(25 μM)의 존재 또는 부재하에 빈 벡터(empty vector) 또는 Flag-태그된 GLK로 형질 감염된 HEK293T 세포로부터의 항-flag 면역 침전물(anti-Flag immunoprecipitates)의 은 염색 겔(Silver-stained gel). 화살표는 GLK 또는 GLK 상호 작용 단백질의 위치를 나타낸다. (B) GLK 단백질의 4개의 퍼바나데이트-유도된 티로신 인산화 잔기(pervanadate-induced tyrosine phosphorylation residues)가 나열되었다. (C 및 D) Flag-태그된 GLK, Myc-태그된 IQGAP1 또는 두 플라스미드로 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물로부터 항-Flag (C) 또는 항-Myc (D) 면역 복합체의 공동 면역 침전(Co-immunoprecipitation). 면역 침전(immunoprecipitation, Pre-IP) 전 전체 세포 용해물 면역블롯(immunoblot)은 각 패널의 하단에 표시된다. β-튜불린(β-Tubulin)이 로딩 대조군(loading control)으로 사용되었다. (E) Flag-태그된 GLK 또는 Flag-태그된 GLK 돌연변이체(Y366F, Y379F, Y574F 또는 Y735F)로 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물로부터의 항-Flag 면역복합체(immunocomplexes)의 공동 면역 침전. HEK293T 세포는 25 μM 퍼바나데이트로 2시간 동안 처리되었다. (F) IQGAP1 플라스미드와 함께 빈 벡터, 3xFlag-태그된 GLK, Myc-태그된 IQGAP1 또는 GLK로 형질 감염된 HEK293T 세포의 인 시츄 PLA. 화살표는 PLA 신호 (빨간색 점)를 나타낸다. 원래 배율, x 40. 스케일 바, 10 μm. (G) 필드(field) 당 각 그룹의 상대적 PLA 신호가 플롯(plot)에 표시된다. (H) CFP- 및 YFP- 융합 GLK 및 IQGAP1 단백질을 인코딩하는 표시된 플라스미드로 형질 감염된 HEK293T 세포의 FRET 분석. FRET 신호는 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)(오른쪽 패널)의 처리에 의해 억제되었다. (I) 정제된 Flag-태그된 GLK 및 Myc-태그된 IQGAP1 단백질의 공동 면역 침전 (Co-IP). HEK293T 세포 용해물에서 Flag-태그된 GLK 및 Myc-태그된 IQGAP1 단백질을 Flag 및 Myc 펩티드로 각각 용리되었다. **, P 값 <0.01; ***, P 값 <0.001.
도 19는 GLK에 의한 Ser-480에서 IQGAP1의 인산화가 폐암 세포 이동을 조절함을 보여준다. (A) 정제된 야생형 GLK, 키나아제-사멸 GLK 및 IQGAP1의 시험관내 키나아제 분석 및 면역블롯팅. IQGAP1의 인산화는 Typhoon 스캐너(GE)로 정량화되었다. (B) 활성(GTP- 결합(GTP-binding)) Cdc42 단백질은 Cdc42 및 GLK와 IQGAP1 또는 IQGAP1 (S480A) 돌연변이체로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물로부터 면역 침전된 후 면역블롯팅 분석이 이어졌다. 하단 패널은 IQGAP1과 Cdc42 간의 공동 면역 침전(상호 작용)을 보여준다. (C) 활성(GTP- 결합) Rac1 단백질은 Rac1 및 GLK와 함께 IQGAP1 또는 IQGAP1 (S480A) 돌연변이체로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포의 용해물로부터 면역 침전된 후 면역블롯팅 분석이 이어졌다. 하단 패널은 IQGAP1과 Rac1 간의 공동 면역 침전(상호 작용)을 보여준다. (D 및 E) (B) 또는 (C)에서와 같이 세포 용해물의 Cdc42 또는 Rac1 효소 활성은 G-LISA 활성화 분석 바이오캠 키트(G-LISA Activation Assay Biochem Kit)를 사용하여 결정되었다. 분석 키트의 양성, 양성 대조군. SA, IQGAP1 (S480A) 돌연변이체. (F) Flag-태그된 GLK 또는 GLK(P436/437A;P478/479A) 플라스미드와 Myc-태그된 IQGAP1, IQGAP1(S480A) 또는 IQGAP1(WW)을 발현하는 플라스미드로 형질 감염된 HCC827 세포의 이동 분석. 원래 배율, x 10. 스케일 바, 20 mm. (G) 필드 당 이동된 셀의 상대적 수가 플롯에 표시된다. (H) 표시된 플라스미드로 형질 감염된 HCC827 세포로부터의 GLK 및 IQGAP1 단백질의 면역블롯팅. (I) Flag-태그된 활성형 GLK(active-form GLK)(E351K)와 Myc-태그된 IQGAP1 WT 또는 IQGAP1-S480A 돌연변이체로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포에서 포스포-IQGAP1 (Ser-480)의 면역블롯팅. *, P 값 <0.05.
도 20은 GLK가 폐암의 원격 전이를 유도함을 보여준다. (A) 구성적으로 활성화된 GLK (E351K) 돌연변이체는 야생형 GLK보다 IKK의 더 높은 인산화 수준을 유도한다. 표시된 플라스미드로 형질 감염된 주르카트 T 세포에서 포스포-IKK 및 GLK 단백질의 면역블롯팅. 튜불린은 로딩 대조군으로 사용되었다. (B) GLK 또는 GLK(E351K) 돌연변이체 단백질의 ADP 기반 키나아제 분석. Flag-태그된 GLK 또는 GLK(E351K) 단백질은 형질 감염된 HEK293T 세포 용해물로부터 면역 침전되었다. (C) PolⅡ-GLK-E351K 형질 전환 구조물의 개략도. 구성적으로 활성화된 인간 GLK(E351K) 돌연변이체 cDNA는 마우스 RNA 중합 효소 II(PolⅡ) 프로모터에 의해 구동되었다. (D) 마우스로부터 뮤린 말초혈 세포에서 형질 전환 인간 GLK-E351K(hGLKE351K) mRNA 수준의 실시간 PCR. 인간 GLK mRNA 수준은 마우스 Srp72 mRNA 수준으로 정상화되었다. WT, n = 4; PolⅡ-GLKE351K, n = 4. 평균 ± SEM이 표시된다. WT, 야생형 한배 새끼 대조군; PolⅡ-GLKE351K, GLKE351K 형질 전환 마우스. (E) SPA-EGFRdel 형질 전환 마우스 및 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K 형질 전환 마우스의 폐암에서 GLK 발현의 면역 조직 화학. 스케일 바, 100 μm. (F) 7 개월 된 SPA-EGFRdel; PolⅡ-GLKE351K 형질 전환 마우스 및 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K;IQGAP1-/- 마우스의 폐암에서 EGFR-결실 돌연변이체 발현 및 H&E 염색의 대표적인 면역 조직 화학. 스케일 바, 100 μm. (G) 7 개월 된 SPA-EGFRdel;Pol±E351K 형질 전환 마우스 및 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K;IQGAP1-/- 마우스의 뇌 및 간에서 EGFR-결실 돌연변이체 발현 또는 H&E 염색의 대표적인 면역 조직 화학. 스케일 바, 100 μm. 개별 그룹의 조직에서 EGFR-결실 돌연변이체 발현 비교(하단 패널).
도 21은 GLK-IQGAP1 복합체가 인간 NSCLC의 불량한 생존(poor survival)과 상관 관계(correlated)가 있음을 보여준다. (A) 대표적 환자의 정상 인접 조직(normal adjacent tissues), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma)(한 유형의 NSCLC) 조직, 선암(adenocarcinoma)(한 유형의 NSCLC) 조직, 소세포 폐암종 (small cell lung carcinoma, SCLC) 조직에서 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용에 대한 인 시츄 PLA 분석. 원래 배율, x 40. (B) 조직 당 각 그룹 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용에 대한 PLA 신호가 플롯에 표시된다. NSCLC는 편평 세포 암종 (SCC, n=56), 선암(ADC, n=17), 기관지 폐포 암종(bronchioloalveolar carcinoma)(BC, n=11) 및 대세포 암종(large cell carcinoma)(LCC, n=8)을 포함했다. 정상 인접(NA) 조직, n=68. 소세포 폐암종(SCLC), n=3. (C) NSCLC(n=66)의 GLK-IQGAP1 PLA 신호(PLA 신호-높음(PLA signal-High) vs PLA 신호-낮음(PLA signal-Low))에 따른 Kaplan-Meier의 생존 추정치(estimates). P 값은 로그 순위 테스트(log-rank test)를 사용하여 계산되었다. (D) 폐, 림프절(lymph node) 및 뼈 조직의 전이성 NSCLC 세포에서 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용에 대한 인 시츄 PLA. PCNA 염색(녹색, FITC)을 사용하여 폐암 세포를 라벨링(label)했다. 점선(dotted lines)은 폐 조직에 있는 혈관의 혈관벽(vascular wall)을 나타낸다. (E) IQGAP1 및 포스포-IQGAP1(Ser-480)에 해당하는 페어링된(paired) PLA 프로브의 조합을 사용하는 대표적인 편평 세포 암종 환자 및 대표적인 선암 환자로부터의 종양 조직에서 인산화된 IQGAP1 Ser-480의 인 시츄 PLA. PCNA 염색(녹색, FITC)을 사용하여 폐암 세포를 라벨링했다. 원래 배율, x40. (F) 조직 당 각 그룹 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용에 대한 PLA 신호가 플롯에 표시된다. NSCLC는 편평 세포 암종(SCC, n=53), 선암(ADC, n=17), 기관지 폐포 암종(BC, n=11) 및 대세포 암종(LCC, n=8)을 포함했다. 정상 인접(NA) 조직, n=68. 소세포 폐 암종(SCLC), n=3. (G) NSCLC(n=63)의 p-IQGAP1(Ser-480) PLA 신호(PLA 신호-높음 vs PLA 신호-낮음)에 따른 Kaplan-Meier의 생존 추정치(estimates). 조직 배열(arrays) 중 조직 배열 슬라이드에 있는 3개의 SCC 조직이 손상되었다. 따라서 66개 조직 중 63개만 분석되었다. P 값은 로그 순위 테스트를 사용하여 계산되었다.
용어 "항-포스포-RORγt [Ser489] 항체(anti-phospho-RORγt [Ser489] antibody)"는 "인산화된 RORγt 세린-489 에 대한 항체로서, 이는 토끼를 포스포-펩티드로 면역화하여 발생시킬 수 있다(예: 뮤린 RORγt 에피토프(murine RORγt epitope): 483FSTDVE[pS])PEGLSK495; 서열 번호: 5)".
용어 "AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포"는 각각 AhR, RORγt 및 IKKβ를 인코딩하는 3개의 상이한 플라스미드로 공동 형질 감염되고, 세포에서 3개의 단백질의 과발현을 나타내는 세포를 지칭한다.
용어 "PLA 프로브(PLA probes)로서의 이차 항체(secondary antibodies as PLA probes)"는 DUOLINK® 항-토끼 PLUS 및 항-마우스 MINUS PLA 프로브인 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 표지된 이차 항체를 지칭한다. 이 프로브는 항-마우스 IgG 및 항-토끼 IgG다.
약어(Abbreviations): 시안 형광 단백질(Cyan Fluorescent Protein, CFP); 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP); DYKDDDDK (서열 번호: 1; FLAG ?? 펩티드); 아릴 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR; 서열 번호: 29); 레티노산-수용체 관련 고아 핵 수용체 감마 t(RORγt) (또는 RAR 관련 고아 수용체 감마, 전사체 변이체(transcript variant) 2; 서열 번호: 30); ras GTPase-활성화 유사 단백질 IQGAP1(ras GTPase-activating-like protein IQGAP1)(서열 번호: 28); Mus IL17A 프로모터 서열(Mus IL17A promoter sequence) (서열 번호: 31).
우리는 GLK 신호 전달이 PKCθ 및 IKKβ를 통해 AhR과 포스포-RORγt 간의 새로운 상호 작용을 유도하여 IL-17A 전사 활성화 및 자가면역반응을 유도한다는 것을 발견했다. 본 발명은 기술 분야에 다음과 같은 기여를 한다: (1) RORγt 세린-489 인산화 부위; (2) AhR/포스포-RORγt 복합체; (3) IKKβ는 RORγt 세린-489를 인산화한다; (4) GLK-PKCθ-IKKβ-AhR/RORγt-IL-17A; (5) GLK 신호 전달은 IL-17A 전사를 선택적으로 유도한다; (6) TCR 자극은 또한 RORγt 세린-489 인산화를 유도한다; (7) 인간 자가면역 환자 T 세포에서 GLK 과발현-유도된 RORγt 세린-489 인산화 및 AhR/포스포-RORγt 복합체; 및 (8) AhR/포스포-RORγt 복합체, IL-17A 생성 또는 자가면역반응을 억제하는 2개의 소분자(small-molecule) GLK 억제제의 식별(Identification). 우리의 연구 결과는 GLK 또는 AhR/RORγt 복합체 형성의 억제제(예: 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드)가 IL-17A 매개 자가면역질환에 대한 IL-17A 차단제(blocking agents) 로 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예
방법(methods)
마우스(Mice). 모든 동물 실험은 NHRI(National Health Research Institutes)의 AAALAC 인증 동물 수용 시설(AAALAC-accredited animal housing facilities)에서 수행되었다. 모든 마우스는 NHRI의 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에의해 승인된 프로토콜(protocol) 및 지침(guideline)에 따라 사용되었다. 플록화(Floxed) AhR 마우스(JAX 0062003), IL-17A 결핍 마우스(JAX 016879), 플록화 RORγt 마우스(JAX 008771) 및 플록화 IKKβ 마우스(EMMA 001921)는 Jackson Laboratory 또는 European Mouse Mutant Archive(EMMA)에서 구입했다. 앞서 언급된 3개의 마우스 라인은 C57BL/6 배경에 10 세대(generations) 동안 역교배되었다(backcrossed). 이 연구에 제시된 데이터는 성-매칭된(sex-matched) 4 ~ 26 주령의 한배 새끼(littermates)를 대상으로 수행되었다. T-세포 발달 분석을 위해 5 주령의 성-매칭된(sex-matched) 마우스를 사용했다. 이 연구에 사용된 모든 마우스는 온도 조절 및 병원균이 없는(pathogen-free) 케이지에서 유지되었다.
Lck-GLK 형질 전환 마우스 및 PKCθ 녹아웃 마우스(PKCθ knockout mice )의 발생(generation). 전장 인간 GLK 코딩 서열(full-length human GLK coding sequence)은 근위(proximal) lck 프로모터의 하류(downstream)에 위치시켰다. C57BL/6 배경의 Lck-GLK Tg 마우스는 전핵(pronuclear) 미세 주입(microinjection)을 사용하여 발생시켰다. 두개의 독립적인 Lck-GLK Tg 마우스 라인이 사용되었다. PKCθ 녹아웃 마우스는 TALEN 매개 유전자 표적화(TALEN-mediated gene targeting)에 의해 발생되었다. PKCθ 인트론(intron) 1 및 엑손(exon) 2의 뉴클레오타이드 5'- GGTGGAACACTAAAAATAATATGTCTTAGAGCCCCATACATACAGTGTTTGTCTTTTGTCATTTTTCTAGGGAACAACCATGTCACCGTTTC-3'(서열 번호: 2)는 돌연변이된 대립유전자(allele)에서 결실되었다. 마우스에서 TALEN 매개 유전자 표적화를 위해 TALEN mRNA의 배아(embryo) 미세 주입이 수행되었다.
PolⅡ-GLK 형질 전환 마우스 및 IQGAP1 녹아웃 마우스의 발생.
C57BL/6 배경의 PolⅡ-GLK Tg 마우스와 PolⅡ-GLKE351K Tg 마우스는 NHRI 형질 전환 마우스 코어(NHRI Transgenic Mouse Core)에 의한 전핵 미세 주입을 사용하여 발생되었다. 전장 인간 GLK 코딩 영역(야생형 또는 E351K 돌연변이체)은 RNA 중합 효소 II(RNA polymerase II, PolⅡ 프로모터의 하류에 위치시켰다. NHRI 형질 전환 마우스 코어에 의한 TALEN mRNA의 배아 미세 주입을 사용하여 C57BL/6 배경의 IQGAP1 녹아웃 마우스를 발생시켰다. IQGAP1 엑손 1의 뉴클레오티드(nt) 161 구아닌(guanine)은 돌연변이된 대립유전자에서 결실되었다.
세포(Cell). 인간 주르카트 T 백혈병 세포(TIB-152)는 10% 우 태아 혈청(fetal calf serum)과 페니실린(penicillin)(ml 당 10 유닛(units)) 및 스트렙토마이신(streptomycin)(ml 당 10mg)을 포함하는 RPMI-1640 배지(Invitrogen)에서 배양되었다. HEK293T 세포는 10% FCS와 페니실린(ml 당 10 유닛) 및 스트렙토마이신(ml 당 10mg)을 포함하는 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지에서 배양되었다. 사용된 모든 세포주가 테스트되었고 마이코플라스마(mycoplasma)에 대해 음성인 것으로 확인되었다. CD11b, B220, CD49b, CD235 및 TER-119(MACS)에 대해 자기적으로 결합된 항체를 사용하여 마우스의 비장(spleen), 림프절(lymph nodes) 또는 말초혈에서 일차 뮤린 T 세포가 음성으로 선택되었다. 3일 배양된 T 세포의 IL-17A 생산을 유도하기 위해(도 1E), 일차 T 세포를 비오틴-접합된 항-CD3 항체(Biotin-conjugated anti-CD3 antibodies)(ml 당 3μg)와 스트렙타비딘(ml 당 3μg)으로 37 ℃에서 3시간 동안 자극했다.
시약 및 항체(Reagents and antibodies). GLK 항체(α-GLK-N)는 토끼를 펩티드(뮤린 GLK 에피토프: 4GFDLSRRNPQEDFELI19; 서열 번호: 3; 인간 GLK 단백질 서열 4-19와 동일함)로 면역화하여 발생되었고, 도 2E, 3D-E 및 4F에 사용되었다. 항-GLK 단클론 항체(Anti-GLK monoclonal antibody)(클론 C3)는 펩티드(뮤린 GLK 에피토프: 514EQRGTNLSRKEKKDVPKPI533; 서열 번호: 4)로 마우스를 면역화하여 발생되었고 도 3F, 3I에 사용되었다. 인산화된 RORγt Ser-489에 대한 항체는 포스 포-펩티드(뮤린 RORγt 에피토프: 483FSTDVE[pS]PEGLSK495; 서열 번호: 5; 인간 RORγt 단백질 서열에 해당하는 485FSTETE[pS]PVGLSK497; 서열 번호: 6). 항-Myc(클론 9E10), 항-Flag(클론 M2) 및 항-HA(클론 12CA5) 항체는 Sigma에서 구입했다. 항-p-AhR(Ser-36; #A0765) 항체는 Assay Biotechnology에서 구입했다. 항-AhR(클론 RPT9), 항-p-IKKβ(Ser-180/181; #ab55341) 및 항-GAPDH(클론 mAbcam 9484, 카탈로그 #ab9482) 항체는 Abcam에서 구입했다. 항-PKCθ(#3551-1) 및 항-Actin(클론 E184) 항체는 Epitomics에서 구입했다. 항-p-PKCθ(Thr-538; #ab63365), 항-p-STAT3(Tyr-705; 클론 D3A7), 항-IKKα(#2682), 항-IKKβ(#2678), 항-p-SGK1(Thr-256; #2939), 항-SGK1(클론 D27C11), 항-히스톤 3(#9715S), 항-IRF4(#4964S) 및 항-BATF(#8638S) 항체는 Cell Signaling에서 구입했다. 항-STAT3(#06-596) 및 항-RORγt(클론 6F3.1) 항체는 Millipore에서 구입했다. 항-KLF4(#AF3158) 및 항-IL-23 수용체(#bs-1460) 항체는 각각 R&D 및 Bioss에서 구입했다.
플라스미드 및 재조합 단백질. GLK 및 GLK 키나아제-사멸 돌연변이체 (GLK-K45E)에 대한 발현 플라스미드는 이전에 보고되었다. CFP-태그된 PKCθ, YFP-태그된 AhR, CFP-태그된 AhR, Myc-태그된 PKCθ, HA-태그된 AhR 및 Flag-태그된 PKCθ 플라스미드는 개별 cDNA를 pCMV6-AC-CFP, pCMV6-AC-YFP, pCMV6-AC-Myc, pCMV6-AC-HA 또는 pCMV6-AC-Flag 벡터로 서브클로닝하여(subcloning) 구축되었다. FLAG??-태그된 RORγt 및 YFP-태그된 RORγt 플라스미드는 RORγt cDNA를 pCMV6-AN-Flag 또는 pCMV6-AN-YFP 벡터 안으로 서브클로닝하여 구축되었다. HA-태그된 IKKβ 플라스미드는 IKKβ cDNA를 pRC-HA 벡터 안으로 서브클로닝하여 구축되었다. HA-태그된 AhR-S36A 돌연변이체 및 Myc-태그된 PKCθ-K409W(키나아제-사멸) 돌연변이체 플라스미드는 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)에 의해 발생되었다. GST-태그된 PKCθ 및 GST-태그된 PKCθ-K409W 플라스미드는 또한 pGEX4T 벡터로 서브클로닝하여 개별적으로 구축되었다. 인간 GLK shRNA (5'-GTGCCACTTAGAATGTTTGAAA-3'; 서열 번호: 7)는 pSUPER-GFP 벡터 (OligoEngine) 안으로 서브클로닝되었다. IL-17A 리포터 플라스미드는 Warren Strober 박사(Addgene 플라스미드 #20124)의 선물이었다. AhR, RORγt(-877), RORγt(-120) 또는 STAT3에 대한 돌연변이된 결합 요소(binding element)를 포함하는 IL-17A 프로모터 구조물(constructs)은 제조업체의 프로토콜에 따라 PHUSION™ DNA 중합 효소(Thermo Fisher)를 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 발생되었다. 다음의 프라이머는 돌연변이유발(mutagenesis)에 사용되었다(돌연변이된 뉴클레오티드는 굵은 글꼴로 표시됨):
AhR-결합 부위, 5'-ATGTCCATACA T ACATG ATACTGAATCACAGC-3' (서열 번호: 8); RORγt-결합 부위(-887), (서열 번호: 9); RORγt-결합 부위(-120), 5'- GGTTCTGTGC TG CAA T CATTTGAGG(서열 번호: 10); STAT3-결합 부위, 5'-AGACAGATGTTGC C T GTCA TAAAGGGGTGGTT-3' (서열 번호: 11). 돌연변이체 구조물은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 플라스미드 pGL4.43-Luc2P-XRE(AhR 반응성(responsive) XRE-Luc), pGL4.47-Luc2P-SIE (STAT3 반응성 SIE-Luc), pGL4.32-Luc2P-NF-κB-RE-Hygro 및 pGL4 루시페라제(luciferase) 리포터 벡터는 Promega에서 구입했다. RORγt(-877) 반응 요소 구동 리포터(response element-driven reporter)에 대한 플라스미드는 4개의 RORγt(-877) 반응 요소를 pGL4.43 루시페라제 리포터 벡터 안으로 클로닝하여 구축되었다. 시험관내 결합 분석을 위해, 정제된 AhR 단백질을 HA-AhR-형질 감염된 HEK293T 세포로부터 분리한 다음 HA- 펩티드 용출을 수행하였다. 정제된 재조합 GST-PKCθ 및 GST-IKKβ 단백질은 SignalChem에서 구입했다. 정제된 재조합 6xHis-RORγ 단백질은 MyBioSource에서 구입했다. GST-태그된 PKCθ K409W 단백질의 재조합 단백질을 E. coli(BL21)에서 분리한 다음, GST-풀다운(GST-pulldown) 분석으로 정제했다. 정제된 Flag-태그된 RORγt 단백질을 면역 침전시킨 다음, Flag-RORγt와 CFP-IKKβ 또는 벡터 중 하나와 함께 공동 형질 감염시킨 HEK293T 세포의 용해물로부터의 Flag 펩티드로 용리되었다. GST-태그된 AhR의 정제된 재조합 단백질은 Abnova에서 구입했다.
루시페라제 리포터 분석. 2-kb IL-17A 프로모터 구동 반딧불이-루시페라제 리포터 플라스미드(promoter-driven firefly-luciferase reporter plasmid) 및 레닐라-루시페라제 대조군 플라스미드(renilla-luciferase control plasmid)(pRL-TK)를 주르카트 T 세포로 공동 형질 감염시켰다. 24 시간 후, 106 개의 세포가 수확되었고, PBS로 세척하고, 60 μl RPMI 배지와 60 μl 용해 완충액(lysis buffers)에 재현탁시켰다(resuspended). 데이터는 레닐라-루시페라제 활성에 대한 반딧불이-루시페라제 활성의 비율의 평균을 나타낸다.
효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA). IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ, TNF-α 및 TGF-β의 혈청 수준은 eBioscience에서 구입한 개별 ELISA 키트를 통해 분석되었다. IL-17A 수준은 Biolegend의 ELISA 키트를 사용하여 결정되었다. 항-핵 항체(ANA), 항-dsDNA 항체 및 류마티스 인자(RF)의 혈청 수준은 Alpha Diagnostic International에서 구입 한 ELISA 키트로 분석되었다.
증폭된 발광 근접 균질 분석(Amplified luminescent proximity homogeneous assays, ALPHA). ALPHA 기술/단백질-단백질 상호 작용 분석은 Perkin Elmer Life Sciences의 제조업체 프로토콜에 따라 수행되었다. 단백질-공여자 쌍이 200 nm 이내 일 때, EnVision 2104 Multilabel Reader에 의해 발광 신호(luminescent signal)가 감지되었다.
형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석. 살아있는 세포의 FRET 신호는 EnVision 2104 Multilabel Plate Reader(Perkin Elmer)에 의해 검출되었다. 반응은 430 nm 필터(8 nm 대역폭(bandwidth))를 통과하는 빛에 의해 여기되었고(excited), 530 nm 필터 (8 nm 대역폭)를 통과하는 방출된 형광의 강도가 기록되었다. 단백질-단백질 쌍이 인접 (close proximity)(1-10 nm)에 있으면 530 nm 신호가 감지될 것이다. FRET 효율(efficiency)은 다음 방정식을 사용하여 계산되었다. FRET 효율 = ((FRET - CFP × a - YFP × b)/YFP) Х 100%, 여기서 FRET, CFP 및 YFP는 FRET, CFP, 및 YFP 필터 세트 각각; a 및 b는 각각 공여자 방출(donor emission) 및 수용체 여기 크로스토크 비율(acceptor excitation crosstalk ratios)이다.
AhR-RORγt 복합체에 대한 인 시츄 근접 연결 분석(PLA). PLA 분석은 제조업체의 지침에 따라 DUOLINK® In Situ Red Starter 키트(Sigma)를 사용하여 수행되었다. 간단히 말해서, 세포를 각 분자 쌍(AhR + PKCθ, AhR + RORγt 또는 Flag + Myc)에 대한 토끼 또는 마우스 일차 항체와 함께 인큐베이션한(incubated) 다음 올리고뉴클레오티드와 접합된 종 특이적 이차 항체(PLA 프로브)와 함께 인큐베이션했다. 연결(ligation) 및 증폭(amplification) 반응 후, 인접한(<40 nm) PLA 프로브 쌍의 PLA 신호는 형광 현미경(fluorescence microscope)(Leica DM2500) 또는 공초점 현미경(Leica TCS SP5±을 통해 개별 빨간색 점으로 시각화 되었다. 각 빨간색 점은 직접적인 상호 작용을 나타낸다.
GLK-IQGAP1 복합체 및 인산화된 IQGAP1에 대한 인 시츄 근접 연결 분석 (PLA).
멸균 커버 슬라이드에 시딩된 세포를 Flag-태그된 GLK 및 Myc-태그된 IQGAP1 발현 플라스미드로 공동 형질 감염시킨 다음 고정, 투과화(permeabilization) 및 차단(blocking)을 수행했다. GLK-IQGAP1 복합체의 인 시츄 PLA 분석은 제조업체의 지침에 따라 DUOLINK® In Situ-Red 키트(Sigma)를 사용하여 수행되었다.
인간 폐(pulmonary) 조직을 사용하는 실험의 경우, 조직 절편을 파라핀 제거하고 항원을 회수하고 비특이적 결합을 차단한 다음 IQGAP1(1:4,000, CUSABIO)에 대한 일차 항체와 GLK(1:3,000, mAb 클론 C3) 또는 phospho-IQGAP1 Ser-480(1:2,000, Allbio Science)를 사용하여 인 시츄 PLA 분석을 수행했다. 인산화된 IQGAP1 Ser-480에 대한 단클론 항체는 포스포-펩티드(인간 IQGAP1 에피토프: 473NTVWKQL[pS]SSVTGLT487; 서열 번호: 32)로 마우스를 면역화하여 발생되었다. 조직 섹션(sections)은 올리고뉴클레오타이드(PLA 프로브)와 접합된 종 특이적 이차 항체와 인큐베이션된 후 연결 및 증폭 반응이 이어졌다. 조직당 GLK-IQGAP1 복합체 또는 인산화된 IQGAP1에 대한 PLA 신호의 수(3.14 mm2)가 계산되었다.
염색질 면역 침전(Chromatin immunoprecipitation, ChIP) 분석. 마우스의 말초혈 T 세포를 실온에서 10분 동안 1% 포름알데히드(formaldehyde)와 가교 결합시켰다(cross-linked). 용해물을 얼음 위에서 초음파 처리(sonicated)(3 x 9 초)하여 무작위 DNA 단편(fragments)(200-1,000 bp)을 생성했다. 세포 추출물은 5 μg의 항-RORγt, 항-AhR 또는 항-STAT3 항체와 단백질 G DYNABEADS™(Invitrogen)로 4시간 동안 회전하는(rotating) 바퀴에서 4℃에서 면역 침전되었다. 3회 세척 후, 무작위 DNA 단편(IL-17A 프로모터 단편 포함)과 전사 인자 (예: RORγt, AhR 또는 STAT3) 간의 면역 복합체를 94℃에서 15분 동안 역 가교(reverse cross-linking)를 위해 인큐베이션한 다음 프로테아제 K(protease K)로 처리했다. DNA 단편을 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고 35주기(cycles) 동안 PCR을 받았다. RORγt 결합 부위(-877 ~ -872) 및 (-120 ~ -115), AhR 결합 부위(-254 ~ -249), STAT3 결합 부위(-150 ~ -145), IRF4 결합 부위(-429 ~ -421), KLF4 결합 부위(-1097 ~ -1083) 또는 BATF(-243 ~ -176)는, RORγt(-877 ~ -872), 순방향(forward) 5'-CTGAAGAGCTGGGACCTAATG-3'(서열 번호: 12), 역방향(reverse) 5'- GACTACTAACAGGAGGAGATG-3' (서열 번호: 13); RORγt(-120 내지 -115), 순방향 5'-GGTTCTGTGCTGACCTCATTTGAG-3' (서열 번호: 14), 역방향 5'-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3'(서열 번호 15); AhR, 순방향 5'-GAGACTCACAAACCATTACTATG-3 (서열 번호: 16), 역방향 5'-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3'(서열 번호: 17); STAT3, 순방향 5'-GAGACTCACAAACCATTACTATG-3' (서열 번호: 18), 역방향 5'-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3' (서열 번호: 19); IRF4, 순방향 5'-GGGCAAGGGATGCTCTCTAG-3'(서열 번호: 20), 역방향 5'-CTGAAGCTGCTGCAGAGCTG-3' (서열 번호: 21); KLF4, 정방향: 5'-GGGTATTATCCCAAGGGTATCC-3' (서열 번호: 22), 역방향, 5'-ATGCAGCATGAGGTGGACCGAT-3'(서열 번호: 23); BATF, 정방향: 5'-GAACTTCTGCCCTTCCCATCT-3'(서열 번호: 24), 역방향, 5'-CAGCACAGAACCACCCCTTT 3'(서열 번호: 25)였다.
면역 침전(Immunoprecipitation), GST/His 풀다운(pulldown) 및 면역블롯팅(immunoblotting) 분석. 면역 침전은 0.5-1 mg 단백질 용해물을 1 μg 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션한 다음 3시간 동안 20 μl의 단백질 A/G-SEPHAROSE® 비드를 첨가하여 수행했다. GST- 및 His- 풀다운 분석의 경우, GST-태그된 단백질 및 His-태그된 단백질과 이들의 상호 작용 단백질을 각각 글루타티온-SEPHAROSE® 비드(glutathione-SEPHAROSE® beads) 및 Ni-SEPHAROSE® 비드와 함께 3시간 동안 인큐베이션했다. 면역 복합체 또는 GST/His-풀다운 복합체를 용해 완충액(1.5 mM MgCl2, 0.2% NP40, 125 mM NaCl, 5% 글리세롤, 25 mM NaF, 50 mM Tris-HCl 및 1 mM Na3VO4)으로 4℃에서 3회 세척했고, 95℃에서 5X 로딩 버퍼에서 3분 동안 끓였다. 면역블롯팅 분석이 수행되었다.
시험관내 GLK 키나아제 분석( In vitro GLK kinase assays). GLK 키나아제 활성은 ADP-GLO™ 키나아제 분석 키트를 사용하여 시험관내 키나아제 반응에서 ADP 생산 속도를 측정하여 결정되었다. 키나아제 반응을 위해, GLK 키나아제 -도메인(1 μg)의 재조합 단백질을 키나아제-사멸 PKCθ(K409W; 0.15 μg) + ATP(0.1 mM) 또는 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP) + ATP(0.1 mM) 키나아제 버퍼(40 mM Tris-HCl, pH7.5, 20 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA, 10 mM DTT 및 0.1 mM Na3VO4)에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
GLK 억제제에 대한 세포 기반 고처리량 스크리닝(Cell-based high-throughput screening)및 시험관내 키나아제 스크리닝. 세포 기반 고처리량 스크리닝은 ~ 10 μM에서 100,000개 분자의 대표적인 라이브러리에 대해 수행되었다. GLK 및 NF-κB-루시페라제 리포터를 발현하는 CHO-GLK-Luc 세포가 사용되었다. 반응 부피는 1,536-웰 플레이트에서 웰당 5 μl(500 셀)이었다. 양성 대조군(positive control)은 없었다. 이 고처리량 스크리닝 캠페인은 0.57 ~ 0.60의 결정된 Z' 계수로 성공적이었다. 그러나, 세포는 매우 민감하고 스크리닝 결과 총 17,884개의 잠재적 히트(potential hits)가 선별되고(picked), 재스크리닝되고(re-screened), 확인되었다(confirmed). 마지막으로, 1,392개의 화합물이 CHO-GLK-Luc 세포의 GLK-유도된 NF-κB-루시페라제 활성의 높은 억제(> 80%)에 대해 식별되었다. 이들 1,392 화합물은 기질로서 키나아제-사멸 PKCθ 단백질을 사용하는 시험관내 키나아제 분석에 의해 GLK 키나아제 활성의 억제에 대해 추가로 스크리닝되었다. 스크리닝에서 두 가지 잠재적인 소분자 GLK 억제제(IC50 <10 μM)가 식별되었다.
위의 100,000개 분자 외에도, FDA 승인 약물 라이브러리의 1,200개 화합물도 동일한 세포 기반(> 90% 억제) 및 시험관내 스크리닝 접근법을 사용하여 테스트되었다. 두 라이브러리(101,200개 화합물)에서 가장 효과적인 억제제는 눈의 황반 변성(macular degeneration)에 대한 FDA 승인 약물(FDA-approved drug) 인 베르테포르핀(이하 C1이라고도 함)이다(Newman, 2016). 베르테포르핀의 화학식(formula)은 C41H42N4O8다. 베르테포르핀은 망막 치료용 광활성 약물(light-activated drug)인 반면 베르테포르핀(C1)은 이 연구에서 광화학적(photochemical) 과정 없이 사용되었다.
세포 형질 감염(Cell transfections), T- 세포 자극(T-cell stimulation), PKCθ 또는 IKKβ에 대한 시험관내 키나아제 분석 및 유동 세포 분석. 이러한 실험은 앞단에 설명한대로 수행되었다.
면역 형광법(Immunofluorescence) 및 공초점 이미징. 세포를 차가운 메탄올(methanol)에 2분 동안 고정시켰다. 0.25% Triton X-100으로 1시간 동안 침투(permeation) 한 후, 세포를 5% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 2시간 동안 차단했다. 세포를 일차 항체(1:200 희석)와 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 이차 항체(1:500 희석)와 2시간 동안 인큐베이션했다. 이차 항체 당나귀 항-토끼 IgG-Alexa Fluor 568 및 염소 항-마우스 IgG-Alexa Fluor 488은 각각 Abcam과 life Technologies에서 구입했다. 커버 슬라이드를 DAPI(GeneTex)가 있는 FLUOROSHIELD™에 장착하고 Leica TCS SP5 공초점 현미경을 사용하여 분석했다.
시험관내 T 세포 분화 분석( In vitro T-cell differentiation assays). CD4+ 비장 T 세포는 마우스에서 정제되었다. 세포(5 x 105)는 항-CD3(2 μg/ml) 및 항-CD28(3 μg/ml) 항체로 코팅된 48-웰 플레이트에서 1 ml RPMI 배지에서 배양되었다. Th17 분화를 위해, CD4+ 비장 세포는, IL-23 재조합 단백질(50 ng/ml, R&D), IL-6 재조합 단백질(20 ng/ml, R&D), TGF-β 재조합 단백질(5 ng/ml, R&D), anti-IL-4(5 μg/ml, Biolegend) 및 anti-IFN-γ(5 μg/ml, Biolegend)항체를 포함하는 배지에서 배양되었다. Th1 분화를 위해, CD4+ 비장 세포는, IL-12 재조합 단백질(5 ng/ml, R&D) 및 항-IL-4 항체(1 μg/ml, Biolegend)가 포함된 배지에서 배양되었다.
세포 이동 분석(Cell migration assays).
일차 세포 이동 분석을 위해, 10% FBS를 포함하는 200 ml IMDM에 2x105개 세포가 트랜스웰의 상부 챔버(8 μm 기공 크기, Corning)에 시딩되었고, 하단 챔버에 20% FBS를 포함하는 500 μm IMDM가 로딩되었다. 암세포 이동 분석을 위해, 10% FBS가 포함된 200 μl의 RPMI 1640에 있는 5x104 세포를 트랜스웰의 상부 챔버(8 μm 기공 크기, Corning)에 시딩하고, 하부 챔버에 10% FBS가 포함된 500 mm의 RPMI 1640가 로딩되었다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 하부 챔버로 이동하는 세포를 이미지화하고 절대 메탄올(absolute methanol)로 고정하고 1% 크리스탈 바이올렛 용액(1% crystal violet solution)으로 염색한 후, 명시야 현미경(bright-field microscopy)으로 계수했다.
액체 크로마토 그래피-질량 분석법(Liquid chromatography-mass spectrometry). 시험관내 키나아제 분석 후, INSTANTBLUE™ 염색 SDS-PAGE 겔에서 Flag-태그된 RORγt의 단백질 밴드를 수집했다. 단백질을 트립신(trypsin)으로 분해하고 앞서 설명한대로 LTQ-Orbitrap Elite 하이브리드 질량 분석기(LTQ-Orbitrap Elite hybrid mass)로 LC-MS/MS 분석을 수행했다.
통계 분석(Statistical analyses). 모든 실험은 적어도 세 번 반복되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 쌍을 이루지 않은 두 그룹간의 통계적 유의성(statistical significance)은 양측 스튜던트 t-검정(two-tailed Student's t-test)을 사용하여 분석되었다. 0.05 미만(less than)의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
다음과 같은 본 발명의 제조(making) 및 실행(practice)에 세포 배양 및 다양한 분석이 사용될 수 있다:
세포 기반 분석(Cell-based assays): Lck-GLK 형질 전환 마우스의 T 세포, GLK-과발현 T 세포, 또는 IL-17A ELISA, IL-17A 전사 리포터 분석 또는 면역블 롯팅에 의해 결정된 활성화된 T 세포(activated T cells)를 사용한 약물 스크리닝(drug screening).
GLK-과발현 안정 세포 확립(Establish GLK-overexpressing stable cells) 주르카트 세포는 Neon Transfection System(Invitrogen Corporation)을 사용하여 GLK 플라스미드 및 2-kb IL-17A 프로모터 구동 반딧불이 루시페라제 리포터 플라스미드로 형질 감염되었다. GLK-과발현 안정 세포를 선택하기 위해, 세포들은 네오마이신을 포함하는 RPMI-1640에서 2주 이상 배양되었다.
IL-17A 효소 결합 면역 흡착 분석(IL-17A enzyme-linked immunosorbent assay). Lck-GLK 형질 전환 마우스, GLK-과발현 T 세포 또는 TCR 활성화 T 세포의 T 세포는 RPMI 배지(200 ml)에서 72시간 동안 인큐베이션되었다. 상층액(supernatants)에서 IL-17A의 수준은 IL-17A에 대한 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정되었다.
IL-17A 프로모터 활성에 대한 루시페라제 리포터 분석(Luciferase reporter assay for IL-17A promoter activity). 106개의 GLK-과발현 안정 주르카트 세포는 60 μl RPMI 배지와 60 μl 용해/루시페라제 완충액에 재현탁되었다. 데이터는 평균(SEM) 오차 막대(error bar)의 표준 오차와 함께 반딧불이-루시페라제 활성의 평균을 나타낸다.
RORγt 세린-489 인산화(RORγt serine-489 phosphorylation). Lck-GLK 형질 전환 마우스, GLK-과발현 T 세포 또는 TCR 활성화 T 세포의 T 세포를 항-포스포-RORγt [S489] 항체를 사용하여 면역블롯팅이 수행되었다.
단백질-단백질 상호 작용 분석. 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석, 증폭된 발광 근접 균질 분석(ALPHA; PerkinElmer), 근접 결찰 분석(PLA) 및 염색질 면역 침전(ChIP) 분석.
형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석.
HEK293T 세포는 CFP-AhR, YFP-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염되었고 형광 강도는 24시간 후에 ENSPIRE™ 2300 Multilabel Reader를 사용하여 검출되었다. CFP는 432 nm에서 여기되었다; 485 nm에서 방출된 결과적인 형광 강도가 측정되었다. YFP는 485 nm에서 여기되었다; 540 nm에서 방출된 결과적인 형광 강도가 측정되었다. FRET 신호는 432 nm에서 여기되었다; 540 nm에서 방출된 결과적인 형광 강도가 측정되었다.
증폭된 발광 근접 균질 분석(ALPHA). AlphaScreen 결합 분석은 총 부피 20 μl의 384-웰, 흰색 Proxiplate에서 수행되었다. AlphaScreen Flag 탐지 키트는 PerkinElmer Life Science에서 제공되었다. AlphaScreen 공여자 비드는 Flag-코팅되어(coated) 공급되었으며 수용체 비드는 항-Myc 항체에 접합되었다. 플래그-태그된 AhR 단백질과 인산화된 Myc-태그된 RORγt 단백질을 384-웰 플레이트(5 μl/웰)에서 함께 혼합했다. HEK293T 형질감염체(transfectants)(Flag-AhR, Myc-RORγt 및 IKKβ 플라스미드와 공동 형질 감염된 세포)를 사용할 때, 웰당 0.2 μg 용해물을 첨가했다. GLK-IQGAP1 상호 작용을 검출하기 위해, 세포를 Flag-GLK 및 Myc-IQGAP1로 공동 형질 감염시켰다. 수용체 비드(5 μl/웰)를 첨가하고 30분 동안 인큐베이션했다. 이후 공여자 비드(5 μl/웰)가 첨가되고 EnVision 멀티 라벨 판독기(multilabel reader)(PerkinElmer life Science)로 측정하기 전에 3시간 동안 인큐베이션했다. 공여자 및 수용체 비드의 최종 농도는 20 μg/ml였다. 모든 희석은 HEPES 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, 0.5 mM DTT)에서 이루어졌다.
인 시츄 근접 연결 분석(PLA). Lck-GLK 형질 전환 마우스의 T 세포, GLK-과발현 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 AhR+RORγt+IKKβ-과발현 세포가 사용되었다. PLA 분석은 제조업체의 지침에 따라 DUOLINK® In Situ Red Starter 키트를 사용하여 수행되었다. 간단히 말해서, 세포를 각 분자쌍(항-AhR 항체+항-RORγt 항체 또는 항-AhR 항체+항-포스포-RORγt [Ser489] 항체)에 대한 토끼 또는 마우스 일차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 종 특이적 이차 항체-올리고뉴클레오티드(PLA 프로브)와 접합되었다. 연결 및 증폭 반응 후, 인접한(<40 nm) PLA 프로브의 각 쌍으로부터의 PLA 신호는 형광 또는 공초점 현미경에 의해 개별 빨간색 점으로 시각화되었다. 각 빨간색 점은 직접적인 상호 작용을 나타낸다.
공동 면역 침전 분석. HEK293T 세포는 Myc-AhR, Flag-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염되었다. 면역 침전을 위해 세포 추출물은 항-Flag 아가로스 비드 또는 용해 완충액에서 항-Myc 아가로스 비드와 함께 4℃에서 2시간 동안 연속 회전하면서 인큐베이션되었다. 생성된 면역 침전물(resultant immunoprecipitates)을 용해 완충액으로 3회 세척하고 항-Myc 또는 항-Flag로 면역블롯팅되었다.
염색질 면역 침전 (ChIP) 분석(IL-17A 프로모터의 AhR 결합 부위에 결합하는 RORγt 검출용). Lck-GLK 형질 전환 마우스, GLK-과발현 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 AhR+RORγt+IKKβ-과발현 세포의 T 세포를 실온에서 10분 동안 1% 포름알데히드와 가교 결합시켰다. 용해물을 얼음 위에서 초음파 처리(3 x 9 초)하여 200-1,000 bp DNA 단편을 발생시켰다. 세포 추출물은 5 μg의 항-RORγt 항체와 단백질 G DYNABEADS™로 4℃에서 4시간 동안 회전하는 바퀴에서 면역 침전되었다. 3회 세척 후 면역 복합체를 94℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 역 가교시킨 후 프로테아제 K로 처리하였다. DNA 단편은 PCR 정제 키트를 사용하여 정제되었고, 35 주기 동안 PCR을 받았다. AhR-결합 부위(-254 ~ -249)를 포함하는 IL-17A 프로모터의 프라이머는 정방향 5'-GAGACTCACAAACCATTACTATG-3 (서열 번호: 26), 역방향 5'-CACAGATGAAGCTCTCCCTGG-3' (서열 번호: 27)이었다.
결과
Lck-GLK 형질 전환 마우스는 IL-17A를 통해 자가면역질환을 개발한다.
생체내에서 GLK 과발현의 결과를 연구하기 위해, 우리는 T-세포-특이적 GLK 형질 전환(Lck-GLK Tg) 마우스를 발생시켰다. Lck-GLK Tg 마우스는 T 세포 및 B 세포의 정상적인 발달을 나타냈다; 그러나, 마우스는 8 ~ 16 주령 사이에 뒷다리(hind-limb)와 꼬리(tail)의 마비(paralyses), 눈의 흐림(clouding), 직장염(proctitis) 및 피부염(dermatitis)의 증상을 나타냈다. Lck-GLK Tg 마우스는 또한 간비장종대증(hepatosplenomegaly)과 림프절(lymph nodes) 및 신장(kidneys) 비대(enlargements)를 보였다. 조직학 염색(histology staining)은 이들 마우스에서 폐렴(pneumonia), 신장염(nephritis) 및 비장 이상(spleen abnormality)의 유도를 보여주었다(도 1A). Lck-GLK Tg 마우스 (도 1B)에서 혈청 자가 항체의 유도는 또한 이들 마우스에서 자가면역반응의 발달을 시사한다. Lck-GLK Tg 마우스에서 어떠한 전 염증성(proinflammatory) 사이토카인이 자가면역질환에 기여하는지 연구하기 위해, ELISA에 의해 혈청 사이토카인을 결정했다. 놀랍게도, 4 주령 Lck-GLK Tg 마우스의 혈청에서는 IL-17A 만이 선택적으로 유도된 반면(도 1C), 전 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α는 유도되지 않았다. 일관되게, Lck-GLK Tg T 세포의 시험관내 Th17 분화는 야생형 T 세포에 비해 증가된 반면, Lck-GLK Tg T 세포의 시험관내 Th1 분화는 영향을 받지 않았다. 더욱이, IL-17A 생산은 야생형 마우스에 비해 Lck-GLK Tg 마우스의 자극되지 않은 T 세포에서 유도되었다. 이식 유전자(transgene)의 잠재적 위치 효과를 배제하기(rule out) 위해 두번째 Lck-GLK Tg 마우스 라인(Lck-GLK #2)도 특성화되었다. Lck-GLK Tg 마우스의 두번째 라인은 또한 T 세포에서 GLK 과발현 및 혈청 IL-17A 수준의 유도를 나타냈다. 이러한 데이터는 T 세포에서 GLK 과발현이 마우스에서 IL-17A 생산을 유도함을 시사한다.
Lck-GLK Tg 마우스에서 IL-17A의 병원성 역할을 입증하기 위해, Lck-GLK Tg 마우스를 IL-17A 결핍 마우스와 함께 사육했다. GLK-유도된 혈청 IL-17A 수준은 IL-17A 결핍으로 인해 유의하게 감소한 반면, 다른 염증성 사이토카인 수준은 영향을 받지 않았다. 더욱이, 자가 항체 수준은 Lck-GLK Tg 마우스에서의 자가 항체 수준과 비교하여 Lck-GLK Tg/IL-17A 결핍 마우스에서 또한 유의미하게(significantly) 감소되었다(도 1D). Lck-GLK Tg/IL-17A 결핍 마우스는 Lck-GLK Tg 마우스와 비교하여, 신장, 간 및 폐에서 침윤성(infiltrating) 염증성(inflammatory) 세포의 감소를 보인 반면, 비장에서 백색 펄프(white pulp) 및 적색 펄프(red pulp)의 정상적인 분포를 보여준다. 데이터는 IL-17A가 Lck-GLK Tg 마우스에서 자가면역반응에 기여함을 시사한다. IL-17A의 유도가 GLK 과발현에 기인함을 추가로 입증하기 위해, Lck-GLK T 세포를 GLK shRNA로 처리했다. IL-17A 과잉 생산(overproduction)은 Lck-GLK Tg 마우스로부터 정제된 T 세포에서 GLK shRNA 녹다운에 의해 제거되었다(도 1E). 이러한 결과는 GLK 과발현이 마우스에서 IL-17A 과잉 생산 및 후속 자가면역 표현형을 유도함을 입증한다.
GLK는 AhR 및 RORγt를 활성화하여 IL-17A 전사를 유도한다.
IL-23 수용체 및 인산화된 STAT3의 수준은 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포에서 증가하지 않았으며, 이는 IL-17A 과발현이 IL-23 신호 전달 또는 IL-6/STAT3 신호 전달의 향상 때문이 아니라는 것을 시사한다. IL-17A 단백질 수준과 일치하여, IL-17A의 mRNA 수준은 야생형 마우스와 비교하여 Lck-GLK Tg 마우스의 정제된 T 세포에서 유의미하게 증가하였다(도 2A). 우리는 IL-17A 과발현이 IL-17A 프로모터의 전사 활성화(transcriptional activation) 때문인지 연구했다. 주르카트 T 세포에서 IL-17A 프로모터 활성은 GLK 과발현에 의해 향상되었지만 GLK 키나아제-사멸(K45E) 돌연변이체에 의해 향상되지 않았다(도 2B). 다음으로, IL-17A 프로모터에 대한 개별 IL-17A 전사 인자의 결합을 연구했다(도 2C-D). 염색질 면역 침전(ChIP) 분석은 IL-17A 프로모터에 대한 AhR 및 RORγt(-877)의 결합이 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포에서 유도되는 반면(도 2D), STAT3, IRF4, KLF4 및 IL-17A 프로모터에 대한 BATF는 강화되지 않았다는 것을 보여준다(도 2D). 흥미롭게도, IL-17A 프로모터의 -120 영역에 대한 RORγt의 결합은 유의미하게 유도되지 않았다(도 2D); 유사한 결과가 다른 사람들에 의해 보고되었다 (Jain et al., 2016; Zhang et al., 2008). ChIP 데이터와 일치하여, GLK-향상 IL-17A 리포터 활성(GLK-enhanced IL-17A reporter activity)은 AhR-결합 요소 또는 RORγt-결합 부위(-877)의 돌연변이에 의해 폐지된 반면, GLK-유도된 IL-17A 리포터 활성은 STAT3-결합 부위(도 2E) 또는 RORγt(-120) 결합 부위의 돌연변이에 영향을 받지 않았다. 특히, AhR 반응 요소 구동 리포터(XRE-Luc) 활성은 GLK 과발현에 의해 유도된 반면(도 2F), RORγt(-877) 또는 STAT3 반응 요소 구동 리포터(RORγt-Luc 또는 SIE-Luc) 활성은 영향을 받지 않았다(도 2F). 이러한 결과는 GLK 신호 전달이 AhR 및 아마도 RORγt 활성화를 통해 IL-17A 전사를 유도함을 시사한다.
GLK는 AhR을 통해 IL-17A 생산 및 자가면역반응을 제어한다.
Lck-GLK Tg 마우스에서 IL-17A 생산을 촉진하는데 AhR의 역할을 추가로 입증하기 위해, Lck-GLK Tg 마우스를 T-세포-특이적 AhR 녹아웃(AhR cKO: AhRf/f; CD4-Cre) 마우스로 사육했다. 혈청 IL-17A 수준은 Lck-GLK/T-AhR cKO(Lck-GLK; AhRf/f; CD4-Cre) 마우스에서 급격히 감소한 반면, 혈청 TNF-α 및 IFN-γ 수준은 AhR 결핍의 영향을 받지 않았다(도 3A). 항-핵 항체(ANA), 항-dsDNA 항체 및 류마티스 인자(RF)의 수준도 Lck-GLK/AhR cKO 마우스에서 Lck-GLK Tg 마우스에 비해 감소했다(Chuang Huai-Chia et al. "MAP4K3/GLK는 IQGAP1을 인산화하고 활성화함으로써 폐암 전이를 촉진한다" Cancer Research, 2019, 도 S5A). 조직학 염색은 Lck-GLK Tg 마우스에서 신장염 및 비장 이상의 유도가 AhR 녹아웃에 의해 폐지되었음을 보여주었다. Lck-GLK Tg 마우스의 간에서 염증성 면역 세포의 침윤(infiltration)도 AhR 녹아웃에 의해 억제되었다. 데이터는 AhR이 Lck-GLK Tg 마우스에서 IL-17A 과잉 생산 및 자가면역반응에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
PKC
Figure pct00001
는 Ser-36에서 AhR을 인산화하고 AhR 핵 전좌(translocation)를 유도한다.
공초점 이미지(2개의 상이한 항-AhR 항체 사용; 도 3B) 및 세포 내 분별법(fractionation) 실험(도 3C)은 AhR 핵 전좌가 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포에서 향상되었음을 보여주었다. 또한, GLK 신호 전달이 AhR의 인산화를 향상시켜 AhR 핵 전좌를 유도하는지 여부를 검사하였다(examined). 포스포-Ser-36 AhR을 검출하는 상용(commercial) 항-포스포-AhR 항체는 단 하나뿐이다; 그러나, AhR 핵 전좌에서 Ser-36 인산화의 역할은 입증되지 않았다. 흥미롭게도, AhR 인산화에 대한 항-포스포-AhR 항체를 사용한 면역블롯팅 분석은 AhR Ser-36 인산화가 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포뿐만 아니라 항-CD3 자극된 T 세포(anti-CD3-stimulated T cells)에서 향상되었음을 보여주었다(도 3D). 이러한 데이터는 GLK 과발현 (및 TCR 신호 전달)이 T 세포에서 AhR Ser-36 인산화 및 핵 전좌를 향상시킴으로써 AhR 활성을 유도할 수 있음을 시사한다.
우리는 GLK Tg 마우스의 T 세포에서 AhR의 인산화 및 핵 전좌를 담당하는 키나아제를 연구했다. SGK1은 Th17 집단(population)을 안정화시킬 수 있다(Wu et al., 2013). 기저(basal) 또는 TCR-유도된 SGK1 활성화는 Lck-GLK T 세포에서 변경되지 않았으며, 이는 SGK1이 GLK-유도된 AhR 인산화에 관여하지 않음을 시사한다. T 세포에서 GLK 신호 전달은 PKCθ, IKKα 및 IKKβ의 키나아제 활성을 유도한다. AhR, GLK, PKCθ, IKKα, IKKβ 및 AhR을 인산화하는 키나아제를 결정하기 위해 개별적으로 형질 감염된 HEK293T 세포에서 각각 면역 침전되고 시험관내 키나아제 분석을 실시했다. 데이터는 AhR Ser-36 인산화가 시험관내에서 PKCθ에 의해 급격하게 유도되었음을 보여주었다(도 3E). AhR Ser-36 인산화에 대한 항체의 특이성은 야생형 AhR 또는 S36A 돌연변이체 형질감염체를 사용하여 면역블롯팅을 통해 확인되었다. 면역 형광법 및 공초점 영상 분석(confocal imaging analyses)은 PKCθ 과발현이 주르카트 T 세포 및 HEK293T 세포에서 AhR 핵 전좌를 향상시킨 반면, AhR-S36A 돌연변이는 PKCθ-과발현 세포에서조차 세포질(cytoplasm)에 머물렀다는 것을 보여주었다. 데이터는 AhR의 PKCθ 매개 Ser-36 인산화(PKCθ-mediated Ser-36 phosphorylation)가 AhR 핵 전좌를 자극한다는 것을 나타낸다. PKCθ와 AhR 간의 상호 작용은 Lck-GLK Tg 마우스의 정제된 T 세포에서 유도되었다(도 3F). 더욱이, 단백질-단백질 상호 작용/ALPHA 기술 분석(protein-protein interaction/ALPHA technology assays)은 PKCθ와 AhR간에 상호 작용(<200 nm)을 보여주었지만, GLK와 AhR간에는 그렇지 않았다. 더욱이, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석은, PKCθ/AhR 공동 형질 감염된 주르카트 T 세포에서 PKCθ와 AhR 간의 직접적인 상호 작용(1-10 nm)을 보여주었다. 생체내에서(in vivo) 세포 내 국소화(subcellular localization) 및 단백질 상호 작용 (<40 nm)을 연구하기 위해 PKCθ 및 AhR에 해당하는 프로브를 사용하여 인 시츄 근접 연결 분석(PLA)을 수행했다. PLA 데이터는 Lck-GLK Tg 마우스로부터의 T 세포의 세포질에서 강한 신호를 보여주었다(도 3G). Myc 및 Flag 태그에 해당하는 프로브를 사용한 인 시츄 PLA는 Myc-PKCθ 및 Flag-AhR-과발현 HEK293T 세포에서 유사한 결과를 나타냈다. 정제된 PKCθ 및 AhR 단백질을 사용한 시험관내 결합 분석은 이러한 직접적인 상호 작용을 추가로 확인했다. 더욱이, 정제된 PKCθ는 실제로 Ser-36에서 AhR을 인산화한 반면, PKCθ의 정제된 키나아제-사멸 (K409W) 돌연변이체는 그렇지 않았다(도 3H). 이러한 데이터는 PKCθ가 Ser-36에서 AhR과 직접 상호 작용하고 인산화하여 AhR 핵 전좌를 유도한다는 것을 보여준다.
AhR 핵 전좌에서 PKCθ의 역할과 이것의 생체 내 기능을 확인하기 위해, TALEN 기술을 사용하여 PKCθ 녹아웃(KO) 마우스를 발생시켰다. Lck-GLK Tg 마우스는 PKCθ KO 마우스와 사육되었고, Lck-GLK; PKCθ-/-마우스를 발생시켰다. 예상대로, T 세포에서 GLK-유도된 AhR Ser-36 인산화는 PKCθ 녹아웃에 의해 폐지되었다(도 3I). 면역 형광법 및 공초점 영상 분석은 AhR이 Lck-GLK Tg 마우스로부터의 T 세포의 핵에서 풍부하게 검출되었음을 보여주었다(도 3J). 대조적으로, AhR 발현은 야생형 및 Lck-GLK 형질 전환/PKCθ 녹아웃(Lck-GLK; PKCθ-/-) 마우스로부터의 T 세포의 핵이 아닌 세포질에서 검출되었다(도 3J). IL-17A 및 자가 항체의 혈청 수준은 Lck-GLK Tg 마우스와 비교하여 Lck-GLK;PKCθ-/-마우스에서 유의하게 감소했다. 더욱이, 염증성 표현형은 Lck-GLK 형질 전환/PKCθ 녹아웃 마우스에서 폐지되었다. 종합하면, 이러한 결과는 GLK가 T 세포에서 PKCθ-AhR 신호 전달을 활성화하여 IL-17A 생산을 유도함을 나타낸다.
AhR은 RORγt와 상호 작용하고 RORγt를 핵으로 운반한다.
역설적으로, AhR-결합 및 RORγt-결합 요소는 모두 GLK-유도된 IL-17A 리포터 활성에 필요하다(도 2E); 그러나, GLK는 반응 요소인 RORγt가 아닌 AhR의 활성을 유도했다(도 2F). AhR이 RORγt 활성 유도를 촉진할 수 있다고 의심했다. 우리는 먼저 GLK가 AhR을 통해 IL-17A 프로모터에 RORγt 결합을 유도하는지 여부를 연구했다. 염색질 면역 침전(ChIP) 데이터는 실제로 IL-17A 프로모터에 대한 GLK-유도된 RORγt 결합이 AhR 녹아웃 T 세포에서 폐지되었음을 보여주었다(도 4A). 데이터는 AhR이 IL-17A 프로모터에 대한 RORγt의 결합을 촉진함을 시사한다. 다음으로, AhR이 RORγt와 상호 작용하는지 여부를 연구했다. 내인성 AhR과 RORγt 간의 상호 작용은 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포에서 크게 향상되었다 (도 4B). 공초점 영상 분석은 Lck-GLK Tg 마우스로부터의 T 세포의 핵에서 AhR 및 RORγt의 공동 국소화를 보여주었다(도 4C). 항-RORγt 항체를 사용한 ChIP 분석은 또한 Lck-GLK 마우스의 T 세포에서 IL-17A 프로모터의 AhR-결합 요소에 대한 RORγt의 결합을 보여주었으며(도 4D), 이는 RORγt가 AhR-RORγt 복합체 형성을 통해 AhR-결합 요소에 결합함을 시사한다. 더욱이, AhR 및 RORγt에 해당하는 프로브를 사용한 인 시츄 근접 연결 분석(PLA)은 야생형 마우스의 상호 작용 신호보다 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포의 핵에서 강한 상호 작용 신호를 나타냈다(도 4E). 이 데이터는 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포 핵에서 AhR과 RORγt 간의 직접적인 상호 작용을 나타낸다. 또한, AhR 핵 전좌와 유사하게, GLK-유도된 RORγt 핵 전좌는 PKCθ 녹아웃에 의해 폐지되었다(도 4C). 데이터는 PKCθ-인산화된 AhR이 RORγt를 핵으로 모집한다(recruits)는 것을 뒷받침한다. AhR 매개 RORγt 핵 전좌는 AhR 녹아웃에 의해 추가로 확인된다; RORγt는 기능성 PKCθ의 존재하에서도 Lck-GLK;AhRf/f;CD4-Cre 마우스의 T 세포에서 세포질에만 독점적으로 국소화되었다(도 4C, 하단 패널). 따라서, 이 결과는 PKCθ가 RORγt 핵 전좌를 직접 조절할 가능성을 배제한다. 종합적으로, 이러한 결과는 AhR이 GLK-과발현 T 세포에서 RORγt와 직접 상호 작용하고 핵 안으로 RORγt를 운반한다는 것을 나타낸다.
AhR-RORγt 상호 작용은 IKKβ 매개 RORγt Ser-489 인산화에 의해 유도된다.
놀랍게도, 인 시츄 근접 연결 분석(PLA)은 Lck-GLK;PKCθ-/- T 세포의 세포질에서도 AhR과 RORγt 간의 상호 작용을 보여주었다(도 4E). 이 결과는 AhR과 RORγt 간의 상호 작용이 AhR 인산화에 의해 조절되지 않음을 시사한다. AhR과 RORγt 사이의 상호 작용은 Lck-GLK; PKCθ-/- T 세포에서 여전히 검출 가능하다(도 4E); 이 결과는 PKCθ 녹아웃 마우스의 보상(compensatory) 신호 전달 이벤트 때문일 수 있다. AhR과 RORγt 간의 상호 작용을 자극하는 키나아제를 식별하기 위해 처음에 AhR-RORγt 상호 작용의 유도에서 GLK, IKKα 또는 IKKβ의 잠재적 역할을 테스트했다. 키나아제 GLK, PKC아웃 마우스의 보상(compensatory) 신호 전달 이벤트 때문일 수 있다. AhR과 RORγt 간의 상호 작용을 자극하는 키나아제를 식별, IKKα 또는 IKKβ를 AhR+ RORγt와 함께 HEK293T 세포로 공동 형질 감염시킨 다음, 공동 면역 침전 분석을 수행했다. 데이터는 IKKβ 과발현이 AhR과 RORγt 간의 상호 작용을 향상시키는 반면, GLK, PKCθ 및 IKKα의 과발현은 그렇지 않음을 보여주었다(도 4F). 다음으로, IKKβ가 RORγt 인산화를 자극하여 RORγt와 AhR의 상호 작용을 유도하는지 여부를 테스트했다. Flag-태그된 RORγt는 RORγt와 IKKβ 또는 벡터로 공동 형질 감염된 HEK293T 세포로부터 정제되었다. GST-풀다운 분석은 정제된 GST- 태그된 AhR 재조합 단백질이 RORγt+IKKβ 공동 형질 감염된 세포로부터의 정제된 RORγt 단백질과 강하게 상호 작용함을 보여주었다(도 4G). 데이터는 IKKβ가 RORγt 인산화를 유도함으로써 AhR과 RORγt 간의 직접적인 상호 작용을 자극한다는 것을 시사한다. 반대로, PLA 데이터는 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포에서 AhR과 RORγt 간의 GLK-유도된 상호 작용이 IKKβ 녹아웃에 의해 폐지되었음을 보여주었다(도 5A). 또한, 공초점 영상 분석은 IKKβ 녹아웃이 GLK 형질 전환 T 세포에서 RORγt의 핵 전좌를 특이적으로 폐지하였지만, AhR은 아님을 보여주었다(도 5B). 일관되게, 혈청 IL-17A 수준은 Lck-GLK Tg 마우스의 혈청 IL-17A 수준과 비교하여 Lck-GLK; IKKβf/f;CD4-Cre 마우스에서도 감소했다(도 5C). 다음으로, IKKβ가 RORγt와 직접적으로 상호 작용하는지 여부를 연구했다. 정제된 재조합 GST-태그된 IKKβ 및 His-태그된 RORγt 단백질을 사용한 GST-풀다운 및 His-풀다운 분석은 IKKβ와 RORγt 간의 직접적인 상호 작용을 보여주었다 (도 5D).
IKKβ가 RORγt를 인산화하는지 여부를 연구하기 위해, Flag-태그된 RORγt, IKKβ 및 IKKβ 키나아제-사멸(K44M) 돌연변이체를 HEK293T 형질 감염 체로부터 개별적으로 면역 침전시킨 다음 시험관내 키나아제 분석을 실시했다. 데이터는 RORγt 인산화가 IKKβ에 의해 시험관내에서 유도되었지만, IKKβ-K44M 돌연변이체에 의해 유도되지 않았음을 보여주었다(도 5E). IKKβ-표적화된(targeted) RORγt 인산화 부위를 확인하기 위해, 시험관내 인산화 Flag-태그된 RORγt를 분리한 다음, 질량 분석법 분석을 수행했다. Ser-489는 IKKβ에 의해 RORγt 인산화 부위로 식별되었다(도 5F). RORγt Ser-489 부위의 인산화를 입증하기 위해, IKKβ로 공동 형질 감염되었을 때, RORγt WT를 특이적으로 인식하지만 S489A 돌연변이체를 인식하지 않는 항-포스포-RORγt (Ser-489) 항체를 발생시켰다(도 5G). 이 포스포-항체를 사용한 면역블롯팅은 Lck-GLK Tg 마우스의 T 세포에서 RORγt Ser-489 인산화가 유도되었고, IKKβ 녹아웃에 의해 인산화가 폐지되었음을 보여주었다(도 5H). 일관되게, RORγt-S489A 돌연변이체는 IKKβ 과발현 하에서 AhR과 상호 작용하지 못했다(도 5I). 종합하면, GLK-과발현 T 세포에서 IKKβ는 Ser-489에서 RORγt를 인산화하고 AhR과의 상호 작용을 유도한 다음 RORγt를 핵으로 수송하고 RORγt와 협력하여 IL-17A 전사를 자극한다.
인산화된 RORγt는 TCR-유도된 또는 인간 자가면역 T 세포에서 AhR과 상호 작용한다.
인산화된 RORγt 매개 AhR-RORγt 상호 작용도 TCR 신호 전달에 의해 유도되는지 여부를 물었다. 우리는 IKKβ 활성화 후, 뮤린 T 세포에서 RORγt Ser-489 인산화가 실제로 항-CD3 자극에 의해 유도된다는 것을 발견했다(도 6A). 더욱이, 공동 면역 침전 분석과 PLA는 내인성 RORγt와 AhR 사이의 상호 작용이 TCR 신호 전달에 의해 유도되었음을 보여주었다(도 6B). AhR과 Ser-489로 인산화된 RORγt 간의 상호 작용도 TCR 신호 전달에 의해 자극되었다. 반대로, T 세포에서 TCR-유도된 RORγt Ser-489 인산화(도 6C) 및 AhR-RORγt 상호 작용(도 6D)은 IKKβ 조건부 녹아웃에 의해 폐지되었다. 이러한 데이터는 IKKβ 매개 RORγt 인산화 및 후속 AhR-RORγt 상호 작용이 T 세포 활성화 동안 유도됨을 시사한다. IKKβ 매개 RORγt 인산화가 실제로 TCR 자극(TCR stimulation) 후 IL-17A 생산을 조절하는지 여부를 연구하기 위해, 항-CD3 자극된 T 세포에서 분비된 사이토카인을 ELISA로 결정했다. 이전 보고서(Gomez-Rodriguez et al., 2009; Liu et al., 2005)와 일치하여, TCR 신호 전달은 T 세포에서 IL-17A 생산을 유도했다(도 6E-F). T 세포에서 TCR-유도된 IL-17A 생산은 IKKβ 조건부 녹아웃(도 6E)에 의해 폐지되었으며, 이는 TCR-활성화된 IKKβ가 정상 T 세포에서 IL-17A 생산을 유도함을 뒷받침한다. 예상대로, 여러 IKKβ/NF-κB 매개 사이토카인 (IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-6 및 TNF-α)의 TCR-유도된 수준도 IKKβ 조건부 녹아웃 마우스의 T 세포에서 감소되었다(도 6E). IKKβ-RORγt-IL-17A 경로를 추가로 확인하기 위해, T-세포-특이적 RORγt 조건부 녹아웃 마우스의 일차 비장 T 세포를 사용했다. IKKβ 조건부 녹아웃과 달리, RORγt 조건부 녹아웃은 TCR 자극시 IL-17A 생산만을 폐지했다(도 6F). RORγt cKO 마우스의 T 세포에서 RORγt 발현의 폐지는 면역블롯팅 분석에 의해 확인되었다(도 6G). 데이터는 IKKβ-RORγt 활성화가 주로 TCR 신호 전달 동안 IL-17A 생성을 유도하는 반면, IKKβ-NF-κB 활성화는 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-6 및 TNF-α을 포함하는 다중 사이토카인의 생성을 조절한다(도 6H).
GLK + IL-17A + T 세포는 활성 SLE에 대한 진단 바이오 마커이다.
GLK 과발현이 SLE 환자의 T 세포에서 IL-17A 생산을 유도하는지 확인하기 위해, 우리는 유동 세포 분석을 사용하여 18명의 SLE 환자와 6명의 건강한 대조군([표 1])의 T 세포를 특성화했다. 유동 세포 분석 데이터는 GLK 과발현이 모든 SLE 환자의 T 세포에서 IL-17A 생산과 배타적으로(exclusively) 공존한다는 것을 보여주었다(도 7A). 더욱이, CD4+ T 세포에서 GLK+IL-17A+ 세포의 빈도는 건강한 대조군(도 7B, E)에 비해 18명의 SLE 환자 모두에서 급격히 증가한 반면, CD8+ T 세포의 빈도는 약간 증가했다(도 7C, E). 대조적으로, CD4-CD8-(이중 음성, DN) T 세포에서 GLK+IL-17A+세포의 빈도는 건강한 대조군 그룹에 비해 SLE 그룹에서 유의미하게 증가하지 않았다; 단지 3명의 SLE 환자 만이 매우 약간의 증가를 보여주었다(도 7D-E). 이러한 결과는 SLE 환자의 GLK+IL-17A+ T 세포가 주로 CD4+ T 세포였으므로 이러한 CD4+ T 세포는 GLK+ Th17 세포임을 보여주었다. 또한, GLK+IL-17A+ T 세포 집단이 활성 SLE(SLEDAI ≥ 12)에 대한 유용한 진단 바이오 마커인지 여부를 연구하기 위해, GLK+IL-17A+ T 세포 하위 집단의 빈도의 진단 유틸리티(diagnostic utility)를 라이너 회귀 분석(liner regression) 및 리시버 작동 특성(ROC) 곡선 분석(receiver operating characteristic (ROC) curve analyses)으로 분석되었다(도 7F-G). CD4+ T 세포에서 GLK+IL-17A+ 세포의 빈도는 SLEDAI(도 7F)와 상관 관계(correlated)가 있었다(r = 0.729, P = 0.00053). ROC 곡선의 좌표(coordinates)에 따르면 CD4+ T 세포 집단에서 GLK+IL-17A+ 세포의 빈도에 대한 최상의 컷오프(cutoff) 값은 15.5% 였다. 더욱이, CD4+ T 세포에서 GLK+IL-17A+ 세포의 빈도는 활성 SLE 환자를 식별하기 위해 100%의 민감도(sensitivity)와 88.9%의 특이도(specificity)를 가졌다(도 7G). 따라서, GLK+Th17 세포는 활성 SLE에 대한 진단 바이오 마커이다. 특히, CD4+ T 세포에서 GLK+IL-17A+ 빈도의 곡선 아래 면적(AUC)값 (0.939, P <0.001)은 CD8+ 또는 DN T 세포에서 보다 유의미하게 높았다. 종합적으로, 이러한 결과는 T 세포에서 GLK 과발현이 IL-17A 생산 및 병원성 Th17 세포를 유도하여 SLE 환자 하위 집단의 발병에 기여함을 시사한다.
[표 1]은 도 1에 사용된 SLE 환자 및 건강한 대조군의 인구통계학적(demographic) 및 질병 특성을 보여준다. 1. 인구통계학적 특성은 SLE 진단 초기에만 결정되었다. 기간은 SLE 진단(SLE diagnosis) 후 질병 시간의 길이를 나타낸다. 플러스-마이너스 값은 평균 ± SD를 의미한다.
약어(Abbreviations): SLE, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus); HC, 건강한 대조군; SLEDAI, SLE 질병 활동 지수(SLE disease activity index); WBC, 백혈구(white blood cell); HgB, 헤모글로빈(hemoglobin); dsDNA, 이중 가닥 DNA(double-stranded DNA); WHO, 세계 보건기구(World Health Organization); C3 및 C4, 보체 성분 3(complement component 3) 및 성분 4; 해당 사항 없음.
[표 1]
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GLK는 인간 자가면역 환자 T 세포에서 RORγt Ser-489 인산화와 AhR-RORγt 복합체를 유도한다.
우리의 이전 보고서는 GLK 과발현이 RORγt Ser-489 인산화와 AhR-RORγt 복합체를 유도한다는 것을 입증한다. 우리는 또한 AhR과 RORγt 간의 상호 작용이 S489-인산화된 RORγt 펩티드에 의해 차단될 수 있음을 발견했다(도 8A). 데이터는 RORγt S489 인산화가 AhR-RORγt 복합체의 형성을 제어한다는 것을 추가로 뒷받침한다. 다음으로, 면역블롯팅과 PLA를 사용하여 인간 자가면역 환자의 T 세포에서 RORγt Ser-489 인산화와 AhR-RORγt 복합체가 발생하는지 여부를 추가로 연구했다. 면역블롯팅 데이터는 RORγt Ser-489 인산화가 SLE 및 RA 환자로부터 새로 분리된 자극되지 않은 말초혈 T 세포에서 현저하게 향상되었음을 보여주었다(도 8B). 더욱이, 인간 SLE 및 RA 환자로부터의 자극되지 않은 말초혈 T 세포는 AhR과 RORγt(도 8C) 또는 AhR과 인산화된 RORγt(도 8D) 간에 수많은 PLA 상호 작용 신호를 나타냈다. 따라서, GLK-PKCθ/IKKβ-AhR/RORγt 신호 전달 캐스케이드는 TCR-자극 또는 자가면역 T 세포에서 IL-17A 유도의 일반적인 메커니즘이다.
인간 자가면역 환자 T 세포에서 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체에 대한 소분자 억제제(small molecule inhibitors)의 식별(Identification)
AhR-RORγt 복합체는 GLK 신호 전달에 의해 유도되기 때문에, GLK-PKCθ-IKKβ 신호 전달의 억제제가 AhR-RORγt 복합체를 차단하는지 여부를 테스트했다. 우리는 GLK 억제제 처리를 예로서 사용했다. 상업적인 GLK 억제제가 없기 때문에, 101,200개의 화합물을 스크리닝하여 루시페라제 리포터 분석 및 시험관내 키나아제 분석을 모두 사용하여 GLK 억제제를 확인했다. 세포주에서 GLK 신호 전달을 효율적으로 억제한 이들 화합물 중, 두 가지 화합물(각각 C1 및 C2로 명명된 베르테포르핀 및 알렉시딘 디하이드로클로라이드)은 세포주에서 GLK 신호 전달과 시험관내 GLK 키나아제 활성을 모두 효과적으로 억제했다(도 9A-B). GLK 억제제 C1은 SLE 및 RA 환자의 T 세포에서 AhR-RORγt 복합체를 차단했다(도 9C). PLA 신호(도 9D) 및 FRET 신호(도 9E)는 C1(베르테포르핀) 처리에 의해 억제되었다.
GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체의 억제제는 마우스의 IL-17 생성 및 자가면역반응을 억제한다.
GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체는 마우스에서 IL-17 생산과 자가면역반응을 제어하기 때문에, AhR-RORγt 복합체를 차단하는 GLK 억제제 C1(베르테포르핀)이 T-세포-특이적 GLK 형질 전환(Lck-GLK Tg) 마우스에서 IL-17 생산과 자가면역 반응을 억제하는지 여부를 연구했다. 30일 동안 3일마다 정맥 주사(intravenous injection)하여 GLK 억제제 C1(베르테포르핀) 처리(0.556 nmole/g) 후 (도 10A), Lck-GLK Tg 마우스의 혈청 IL-17A 수준은 PBS 처리시의 혈청 IL-17A 수준에 비하여 C1(베르테포르핀)에 의해 현저하게 감소했다(도 10B). 더욱이, Lck-GLK Tg 마우스에서 자가 항체의 과잉 생산도 C1(베르테포르핀) 처리에 의해 폐지되었다 (도 10C). 이러한 결과는 GLK 과발현이 IL-17A 과잉 생산 및 자가 항체 생산을 유도함을 입증한다. GLK 억제제가 IL-17A 매개 동물 모델에서도 작동하는지 추가로 확인하기 위해 EAE 및 CIA 유도(induction) 동안 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)로 야생형 마우스에 도전했다. C1(베르테포르핀) 처리(0.556 nmole/g) 및 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리(0.085 nmole/g) 모두 EAE 유도에서 마우스의 질병 중증도(diseases severity)와 혈청 IL-17A 수준을 유의미하게 억제했다(도 10D). C1(베르테포르핀) 처리는 또한 CIA 유도에서 마우스의 질병 중증도 및 혈청 IL-17A 수준을 억제했다(도 10E). 데이터는 베르테포르핀(C1) 처리가 3 가지 자가면역질환 모델 모두에서 IL-17A 과잉 생산을 우선적으로(preferentially) 억제했음을 보여주었다. 또한, 베르테 포르핀(C1) 처리는 시험관내 분화된 Th17 세포로부터 Th17 분화 및 IL-17A 생산을 모두 억제하였다(도 11A-B). 대조적으로, 베르테포르핀 (C1) 처리는 시험관내 Treg(Foxp3-발현 CD4+ T 세포) 분화를 향상시켰다(도 11C); 일관되게, Lgk-GLK 형질 전환 마우스의 Treg 분화는 야생형 마우스에 비해 감소되었다(도 11D). 이러한 결과는 GLK 억제제가 Th17 세포 집단을 감소시키지만 Treg 세포 집단을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
GLK 유도 AhR-RORγt 복합체의 억제제는 인간 T 세포의 IL-17 생산을 차단한다.
우리는 IL-17A 생산이 인간 및 뮤린 T 세포에서 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체의 억제제에 의해 폐지되는지 여부를 추가로 연구했다. 우리는 먼저 TCR 신호 전달(항-CD3 + 항-CD28 항체)로 자극된 뮤린 T 세포를 사용하여 억제제 실험을 테스트했다. 우리는 뮤린 T 세포의 TCR-유도된 IL-17A 생산이 C1(베르테포르핀) 처리에 의해 급격히 폐지된 반면, TCR-유도된 IL-17B, IL-17E 및 IL-17F 수준은 감소되지 않았음을 발견했다(도 12A). TCR-유도된 TNF-α 및 IFN-γ 수준은 C1(베르테포르핀) 처리에 의해 부분적으로 감소되었다(도 12A); 이러한 감소는 C1(베르테포르핀) 처리에 의한 NF-κB 활성화의 억제로 인한 것 같다. 다음으로, 인간 말초혈 T 세포를 이용한 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리에 의한 IL-17 생성 차단 효과를 연구하였다. TCR-유도된 IL-17A 생산은 건강한 대조군의 말초혈 T 세포에서 C1(베르테포르핀) 처리에 의해 유의미하게 감소되었다(도 12B). 인간 자가면역질환 환자의 항-CD3/CD28-자극 T 세포에서 IL-17A 생산은 C1(베르테포르핀) 처리 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리에 의해 급격히 억제되었다(도 12B). 종합하면, GLK 억제제(베르테포르핀 및 알렉시딘 디하이드로클로라이드)는 인간 자가면역 환자 T 세포에서 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체 및 IL-17A 생성과 자가면역 동물 모델의 질병 중증도를 억제한다. 따라서, GLK, GLK 신호 전달 또는 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체는 자가면역질환에 대한 유망한 치료 표적이 될 수 있다.
GLK 억제제는 암세포 이동(migration) 및 암 전이(metastasis)/재발(recurrence)을 차단한다.
암 전이/재발에서 GLK의 역할을 연구하기 위해, RNA 중합 효소 Ⅱ(PolⅡ) 프로모터 구동 인간 GLK cDNA를 사용하여 전신(whole-body) GLK 형질 전환 (PolⅡ-GLK Tg) 마우스를 발생시켰다(도 13A). GLK 과발현은 실시간 PCR에 의해 확인되었다(도 13B). GLK가 암 진행에 미치는 영향을 연구하기 위해, PolⅡ-GLK Tg 마우스는 유전적으로 변형된 폐암 마우스 계통인 폐-특이적 폐(pulmonary) 계면활성제 단백질 A(surfactant protein A, SPA) 프로모터 구동 EGFR-결실 돌연변이체 형질 전환(SPA-EGFRdel Tg) 마우스 계통(line)으로 사육되었다. 1 세(1-year-old)인 모든 SPA-EGFRdel Tg 마우스(9/9)는 실제로 폐암(PCNA 양성)이 생겼고(developed)(도 13C), SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg 마우스(15/15)도 실제로 폐암이 발생했다(도 13C). 항 EGFR-결실 돌연변이체(anti-EGFR-deletion mutant) 항체를 이용한 면역조직화학 분석은 SPA-EGFRdel Tg 마우스와 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg 마우스 모두의 폐암에서 EGFRdel-발현 세포(EGFRdel-expressing cells)가 검출되는 것을 보여주었다(도 13D). 우리는 다음으로 GLK 이식 유전자가 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg 마우스에서 다른 기관으로의 폐암(EGFRdel 양성) 전이를 유도하는지 여부를 연구했다. 우리는 야생형 및 세가지 다른 형질 전환 마우스의 자궁 경부 림프절, 간 및 뇌의 조직에 항-EGFR-결실 돌연변이체 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행했다. 자궁 경부 림프절로의 국소 전이(regional metastasis)의 경우, 하나(14/15)의 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg 마우스를 제외한 모든 마우스는 자궁 경부 림프절에서 수많은 전이성(metastatic) EGFRdel-발현 폐암 세포(EGFRdel-expressing lung cancer cells)를 나타냈다. 대조적으로, 9마리의 SPA-EGFRdel Tg 마우스 중 3마리만이 자궁 경부 림프절에서 소수의 전이성 EGFRdel-발현 폐암 세포를 나타냈다(도 12E). 원격 전이(distant metastasis)의 경우 모든 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg 마우스는 EGFRdel-발현 폐암 세포가 뇌(14/15) 또는 간(15/15)으로 전이된 것으로 나타났다(도 13E 및 [표 2]). 9마리의 대조군 SPA-EGFRdel Tg 마우스에서, 단 1마리의 SPA-EGFRdel Tg 마우스(1/9)만이 뇌 전이와 간 전이를 발생시켰으며, 단 1마리(1/9)만이 간 전이를 발생시켰으며, 나머지 7마리의 마우스는 검출 가능한 어떠한 원격 전이도 발생하지 않았다(도 13E 및 [표 2]). 이러한 결과는 GLK가 폐암의 뇌와 간으로의 원격 전이를 유도함을 시사한다. [표 2]는 개별 그룹의 표시된 조직에서 EGFR-결실 돌연변이체 발현의 비교를 보여준다.
[표 2]
Figure pct00003
기호 §(symbol §)는 9마리의 SPA-EGFRdel Tg 마우스 중 3마리만이 자궁 경부 림프절에서 몇 가지 전이성 EGFRdel-발현 폐암 세포를 보였음을 나타낸다.
우리는 GLK 억제제가 암세포 이동을 억제하는지 여부를 연구했다. 트랜스웰(transwell) 이동 분석은 신경교종(glioma), 췌장암(pancreatic cancer), 폐암(lung cancer) 또는 간종(hepatoma)으로부터 세포의 이동이 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)의 처리에 의해 억제됨을 보여주었다(도 14). 더욱이, C1(베르테포르핀) 및 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리 모두 TC-1 폐암 세포를 사용하는 이종 이식(xenograft) 마우스 모델에서 종양 성장을 억제했다(도 15). GLK 결핍으로 인해 폐암 전이가 감소하는지 여부를 연구하기 위해, 루시페라제-발현 LLC(LLC/luc) 세포의 꼬리 정맥(vein) 주사(injection)에 의한 전이성 루이스 폐암(Lewis lung carcinoma, LLC) 마우스 모델을 사용했다. 우리는 세포 기반 분석 및 시험관내 키나아제 분석을 사용하여, 두가지 GLK 억제제(베르테포르핀 및 알렉시딘 디하이드로클로라이드)를 확인했다. GLK 키나아제 활성에 대한 C1(베르테포르핀) 및 C2의 IC50은 각각 1.15 및 10.05 nM이었다([표 3]). 분자 도킹(docking) 분석은, GLK 억제제 C1(베르테포르핀) 및 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)가 GLK 이량체(dimers)의 계면(interface)과 GLK 키나아제 도메인의 활성 부위에서 활성 GLK 키나아제 도메인(포스포-GLK [Ser-170])에 안정적으로 결합되었음을 보여준다(각각, 도 16A-B). Flag-태그된 GLK 단백질 및 GFP-GLK 융합 단백질의 이량체화(dimerization)는 실제로 C1(베르테포르핀) 처리에 의해 차단되었(도 16C). LLC/luc 세포-포함 마우스를 GLK 억제제 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드)로 30일 동안 3일마다 정맥 주사하여 처리했다(도 16D). 마우스에서 LLC/luc 세포의 루시페라제 활성은 In Vivo Imaging System에 의해 검출되었다. 절제된(excised) 폐의 무게를 재고 H&E 염색을 실시했다. 주사된 마우스의 폐에서 LLC/luc 세포의 루시페라 제 활성은 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리에 의해 감소되었다(도 16E-F). 일관되게, 면역조직화학 분석은 또한 C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리된 마우스에서 암 콜로니(colony)의 감소를 보여주었다(도 16G). 또한, C1(베르테포르핀) 또는 C2(알렉시딘 디하이드로클로라이드) 처리에 의해 폐 조직에서 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용이 억제되었고(도 16H, 상부 패널), 폐 조직에서 IQGAP1 인산화가 억제되었다(도 8b)(도 16H, 하단 패널). 종합적으로, 데이터는 GLK가 폐암 전이에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 GLK 억제제가 암 전이 및 암 진행을 차단함을 나타낸다. [표 3]은 MAP4K에 대한 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드의 최대(maximal) 억제 농도(inhibitory concentration)의 절반(IC50)을 보여준다. GLK(MAP4K3) 또는 다른 MAP4K의 키나아제 활성의 억제는 기질로 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP)을 사용하는 시험관내 키나아제 분석에 의해 결정되었다. 다양한 MAP4K의 키나아제 도메인의 재조합 단백질이 사용되었다. C1, 베르테포르핀; C2, 알렉시딘 디하이드로클로라이드.
[표 3]
Figure pct00004
GLK가 부족한 마우스는 수명이 연장되었다(prolonged).
GLK의 억제가 자발적인(spontaneous) 질병을 유발할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 야생형 및 GLK-결핍 마우스의 일생동안 모니터링했다. 놀랍게도, GLK-결핍 마우스는 야생형 마우스에 비해 상당한 수명 연장을 나타냈다(도 17A). 가장 나이 많은 GLK-결핍 마우스는 40.8개월령이었다. 노화된 GLK-결핍 마우스 (26.0 - 40.8개월)는 종양이나 식별 가능한(discernible) 질병이 발생하지 않았다. 흥미롭게도, 노화된 GLK-결핍 마우스는 여전히 건강한 모발을 보인 반면, 노화된 야생형 마우스는 백발을 보였다(도 17B). 이전 간행물에 따르면 항원-유도된 IFN-γ, IL-2, IL-17A 생산을 포함한, T 세포 매개 면역 반응이 GLK-결핍 T 세포에서 감소한다. 또한, Th1/Th2/Th17 분화는 GLK 결핍으로 인해 감소된다. GLK-결핍 마우스는 또한 MOG-유도된 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도에 내성(resistant)이 있다. GLK-결핍 마우스의 장수(longevity)는 GLK 결핍에 의한 염증 반응의 억제 때문일 수 있다. 이 개념(notion)은 20개월된 GLK-결핍 마우스에서 전 염증성 사이토카인 IL-6, IL-17A, TNFα, IFN-γ 및 IL-1β의 혈청 수준이 연령-일치하는 야생형 마우스에 비해 급격히 감소했다는 데이터에 의해 뒷받침된다(도 17C). Th1 사이토카인(IFN-γ) 및 Th17 사이토카인(IL-17A) 이외에도 Th2 사이토카인(IL-4) 수준은 노화된 GLK-결핍 마우스의 혈청에서도 감소했다 (도 17C). 데이터는 GLK의 억제가 어떠한 부작용(adverse effects)도 일으키지 않고, 대신 염증(inflammation)을 예방할 수 있음을 시사한다.
우리의 연구 결과는 GLK-유도된 AhR-RORγt 복합체가 IL-17A 매개 자가면역질환에 대한 바이오 마커 및 치료 표적임을 나타낸다. 또한, GLK 억제제 (베르테포르핀 및 알렉시딘 디하이드로클로라이드)는 잠재적인 치료법(therapeutics)이다.
GLK는 IQGAP1과 직접 상호 작용한다.
GLK의 면역 침전 후, GLK-상호 작용 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되고(resolved) 은 염색으로 시각화 되었다(도 18A). GLK-형질 감염된 세포에서 강화된 7개의 가장 두드러진 단백질 밴드를 슬라이스 한 다음, 트립신으로 분해하고(digested) 생성된 단백질 펩타이드를 질량 분석법 분석에 적용했다. 더욱이, GLK 단백질 상의 4개의 퍼바나데이트-유도된 티로신 인산화 부위(pervanadate-induced tyrosine phosphorylation sites)(Tyr-366, Tyr-379, Tyr-574 및 Tyr-735)는 질량 분석법 분석에 의해 확인되었다(도 18B). 우리는 미오신(myosin), IQGAP1, 비멘틴(vimentin), 드레브린(drebrin) 및 열충격 단백질 70(heat shock protein 70, HSP70)(데이터베이스 검색 점수가 높은 것부터 낮은 것 순으로 정렬됨)을 포함하여 몇 가지 추정되는(putative) GLK-상호 작용 단백질을 확인했다. 이들 단백질 중, 세포 이동의 양성 조절자(positive regulator)인 IQGAP1이 추가 연구를 위해 선택되었지만, 미오신, 열충격 단백질 및 세포 골격(cytoskeletal) 단백질은 질량 분석법으로 검출할 수 있는 일반적인 오염(contaminant) 단백질이다. 다음으로, 상호(reciprocal) 공동 면역 침전 분석을 사용하여 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용을 확인했다(도 18C-D). GLK는 항-Flag 항체와 함께 Flag-태그된 IQGAP1 단백질과 공동 면역 침전되었다(도 18C-D). GLK와 IQGAP1 간의 이러한 공동 면역 침전은 GLK(Y735F) 돌연변이에 의해 폐지되었으며(도 18E), 이는 GLK 단백질의 Tyr-735 인산화가 GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용에 중요하다는 것을 시사한다. Flag(Flag-태그된 GLK) 및 Myc(Myc-태그된 IQGAP1)에 해당하는 PLA 프로브의 조합을 사용한 인 시츄 근접 연결 분석(PLA)은, 단백질을 각각 단독으로 과발현하는 것보다 두 단백질을 모두 과발현하는 세포에서 강한 PLA 신호를 보였다(도 18F-G). PLA 신호는 GLK와 IQGAP1 간의 직접적인 상호 작용(<40 nm)을 시사한다. 더욱이, CFP-태그된 GLK 및 YFP-태그된 IQGAP1 융합 단백질을 사용한 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석은, 이들 두 분자 사이에 직접적인 상호 작용 (1-10 nm)을 보여주었다(도 18H). GLK-IQGAP 상호 작용의 FRET 신호는 C1(베르테포르핀)의 처리에 의해 억제되었다(도 18H, 오른쪽 패널). 직접적인 상호 작용을 추가로 확인하기 위해, 정제된 단백질을 사용하여 공동 면역 침전 실험을 수행했다. HEK293T 세포 용해물에서 Flag-태그된 GLK 및 Myc-태그된 IQGAP1 단백질은 각각 Flag 및 Myc 펩티드로 면역 복합체를 용리하여 정제되었다. 공동 면역 침전 분석은 정제된 GLK와 IQGAP1 단백질 간의 상호 작용을 보여주었다(도 18I). 다양한 접근법(PLA, FRET 및 정제된 단백질)의 데이터는 GLK가 IQGAP1과 직접 상호 작용함을 시사한다.
GLK는 Ser-480에서 IQGAP1을 인산화하여 세포 이동을 촉진한다.
GLK는 IQGAP1에 직접 결합하기 때문에, GLK는 IQGAP1 매개 세포 이동을 조절하는 키나아제 일 수 있다고 추측했다. GLK가 IQGAP1을 인산화하는지 여부를 확인하기 위해, GLK, GLK 키나아제-사멸(K45E) 돌연변이체 및 IQGAP1의 정제된 단백질을 사용하여 시험관내 키나아제 분석을 수행했다. IQGAP1 인산화는 GLK에 의해 유도되었지만, GLK 키나아제-사멸(K45E) 돌연변이체가 아니었다(도 19A). SDS-PAGE 분별법(fractionation) 및 질량 분석법 분석 후, Ser-480은 IQGAP1에서 GLK-인산화된 잔기로 확인되었다. 다음으로, 우리는 GL-유도된 IQGAP1 Ser-480 인산화가 Cdc42 또는 Rac1의 활성화뿐만 아니라 IQGAP1과 Cdc42 또는 Rac1의 상호 작용을 조절하는지 여부를 테스트했다. 면역 침전 데이터는 활성(GTP- 결합) Cdc42 단백질이 GLK + IQGAP1-과발현 세포에서 증가했음을 보여주었다; 반대로, 활성 Cdc42 단백질 수준은 GLK + IQGAP1(S480A) 돌연변이체의 과발현에 의해 약화되었다(도 19B, 하단 패널). 대조적으로, 활성(GTP-결합) Rac1 단백질 수준은 GLK + IQGAP1 과발현에 의해 증가되지 않았다(도 19C, 하단 패널). 이러한 결과는 Cdc42 및 Rac1 활성화의 ELISA 결과에 의해 추가로 뒷받침되었다(도 19D-E). 또한, 공동 면역 침전 데이터는 IQGAP1과 Cdc42 또는 Rac1의 상호 작용이 IQGAP1(S480A) 돌연변이의 영향을 받지 않음을 보여주었다(도 19B-C의 상부 패널). IQGAP1 매개 세포 이동에서 IQGAP1 Ser-480 인산화의 역할을 평가하기 위해, HCC827 세포를 IQGAP1(S480A) 인산화-결함 돌연변이체(phosphorylation-defective mutant) 및 GLK 플라스미드와 함께 공동 형질 감염시켰다. 트랜스웰 이동 분석은 GLK-과발현 세포의 이동된 세포수가 IQGAP1(S480A) 돌연변이체의 과발현에 의해 감소되었음을 보여주었다(도 19F, 상단 우측 패널; 도 19G-H). 반대로, 2개의 IQGAP1 Ser-480 인산모방체(phosphomimetic) (S480D 및 S480E) 돌연변이체의 과발현은 HCC827 폐암 세포에서 IQGAP1 또는 IQGAP1(S480A) 돌연변이체의 과발현보다 높은 세포 이동 능력을 유도했다. 이러한 결과는 IQGAP1 Ser-480 인산화가 IQGAP1 활성화 및 IQGAP1/Cdc42 매개 세포 이동에 책임이 있음을 시사한다.
우리의 결과는 GLK가 IQGAP1과 상호 작용하고 인산화한다는 것을 시사한다. 우리는 다음으로 GLK 프롤린(proline) 영역과 IQGAP1 WW 도메인 간의 상호 작용이 실제로 GLK-IQGAP1-유도된 세포 이동을 제어하는 것을 연구했다. GLK 및 IQGAP1로 공동 형질 감염된 HCC827 폐암 세포는, 벡터 대조군 세포보다 이동의 향상을 나타내는 반면, GLK + IQGAP1(WW) 돌연변이체의 공동 형질 감염은 향상된 세포 이동을 폐지했다(abrogated)(도 19F-G). GLK(P436/437A), (P478/479A) 또는 (P436/437A;P478/479A) 돌연변이체의 과발현은 GLK-유도된 세포 이동을 약화시켰다(도 19F-G). GLK 및 IQGAP1의 과발현은 면역블롯팅 분석에 의해 확인되었다(도 19H). IQGAP1 Ser-480 잔기의 인산화를 입증하기 위해, 우리는 항-포스포-IQGAP1(Ser-480) 단일 클론 항체를 생성했으며, 이는 IQGAP1 WT를 특이적으로 인식하지만 S480A 돌연변이체는 인식하지 못했다(도 19I).
IQGAP1은 GLK-유도된 암 전이를 매개한다.
우리는 다음으로 GLK가 IQGAP1 매개 암세포 이동을 통해 폐암의 전이를 촉진하는지 여부를 연구했다. SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg 마우스에서 폐암 전이 발생에 필요한 시간(12개월)을 단축하기 위해, 구성적으로(constitutively) 활성화된 GLK(E351K ) 돌연변이체를 발현하는 GLK 돌연변이체 형질 전환 마우스 라인을 발생시켰다(도 20A-C). 특히, GLK(E351K) 돌연변이는 이전 간행물의 보충 정보에 보고되었다; 그러나, GLK(E351K) 돌연변이의 기능적 결과는 이 연구까지 입증되지 않았다(도 20A-B). GLK(E351K) 돌연변이체의 과발현은, 실시간 PCR에 의해 확인되었다(도 20D). 다음으로, Pol-GLKE351K Tg 마우스와 SPA-EGFRdel Tg 마우스를 사육하여, SPA-EGFRdel Tg 마우스에 비해 폐의 GLK 단백질 수준이 향상된 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K Tg 마우스를 발생시켰다(도 20E). SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K Tg 마우스(8/8)는 실제로 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLK Tg마우스보다 어린 나이(7 개월)에서 폐암(도 20F) 및 국소/원격 전이가 발생했다. 모든 7 개월령 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K Tg 마우스는 EGFRdel-발현 폐암 세포가 뇌 및/또는 간으로 원격 전이를 나타냈다(뇌와 간 모두 [6/8], 뇌만 [1/8], 및 간만 [1/8] (도 19G 및 [표 4])). 대조적으로, 모든 SPA-EGFRdel;PolⅡ-GLKE351K; IQGAP1-/- 마우스는 7개월에 원격 전이(3/3)가 발생하지 않았다. 이 데이터는 GLK가 SPA-EGFRdel 폐암 모델에서 IQGAP1을 통해 원격 전이를 유도함을 시사한다. 이 개념을 검증하기 위해, GLK와 IQGAP1 간의 상호 작용과 인간 비소 세포 폐암 (human non-small cell lung cancer, NSCLC) 조직에서의 IQGAP1 Ser-480 인산화를 연구했다.
[표 4]
Figure pct00005
GLK-IQGAP1 복합체는 인간 NSCLC의 불량한 생존과 상관 관계가 있다.
NSCLC 조직에서 GLK와 IQGAP1의 상호 작용을 연구하기 위해, 폐 절제술(pulmonary resection)을 받은 7명의 인간 NSCLC 환자로부터 임상 폐 조직을 수집했다. 우리는 또한 85개의 NSCLC 조직(편평 세포 암종 49개, 선암 17개, 기관지 폐포 암종 11개, 대세포 암종 8개 포함) 및 68개의 정상 인접 조직 및 3개의 소세포 폐암종 조직을 포함하는 시판되는 폐 조직 어레이를 사용했다. 이러한 조직은 GLK 및 IQGAP1에 해당하는 한 쌍의 PLA 프로브의 조합으로, 인 시츄 근접 연결 분석 (PLA)에 사용되었다. 데이터는 대부분의 NSCLC 조직(81/92)에서 다수의 강력한 PLA 신호를 보여주었지만, 어떠한 소세포 암종 조직에서도 그렇지 않았다(도 21A-B). NSCLC 환자의 정상 인접 조직의 대부분(61/68)은 PLA 신호를 표시하지 않은 반면, 68개의 정상 인접 조직 중 7개는 PLA 신호가 훨씬 적었다. NSCLC 환자의 정상적인 인접 조직에 있는 몇 가지 PLA 신호는 원래 병변(lesion)에서 이동하는 전이성 암 세포 일 수 있다. 이러한 결과는 폐 조직의 GLK-IQGAP1 복합체가 NSCLC에 대한 진단 바이오 마커 일 수 있음을 시사한다. 다음으로, 우리는 GLK-IQGAP1 복합체가 NSCLC에 대한 잠재적인 예후(prognostic) 바이오 마커로 작용할 수 있는지 여부를 연구했다. 생존 데이터를 이용할 수 있는 NSCLC(편평 세포 암종 및 선암) 환자는, 클러스터(cluster) 분석 후 4개의 PLA 신호 하위 그룹으로 나누어졌다. PLA 신호가 가장 높은 두 하위 그룹에는 각각 한명과 두명의 환자만 포함되어 있었으므로, 이 두 하위 그룹은 추가 분석에서 제외되었다. 나머지 두 하위 그룹(n = 63)은 생존 데이터(제공자(provider)로부터 입수 가능)를 사용하여 Kaplan-Meier 생존 분석을 받았다. 높은 PLA 신호를 갖는 NSCLC 환자는, 추적 기간(follow-up periods) 동안 불량한 생존을 나타냈다 (n=63, PLA 신호-높음 vs PLA 신호-낮음, P = 0.069)(도 21C). 더 높은 P 값(P = 0.069)은 PLA 신호가 가장 높은 데이터 3개를 제외했기 때문일 수 있다. 그럼에도 불구하고, GLK-IQGAP1 복합체가 더 많은 NSCLC 환자는, GLK-IQGAP1 복합체가 적은 환자보다 낮은 생존율을 갖는다. NSCLC 환자의 40 ~ 60%가 암 절제(resection) 후, 암 재발로 사망하기 때문에, GLK-IQGAP1 복합체가 NSCLC 전이와 관련이 있는지 여부를 연구했다. GLK-IQGAP1 복합체를 갖는 암 세포는, 특히 폐의 혈관벽 상에/근처에 축적되었다(도 21D); GLK-IQGAP1 복합체-양성 세포는 혈관 내강(lumen)에도 존재했다(도 21D). 더욱이, 전이성 암종이 있는 뼈(bone), 림프절 또는 연조직 절편(soft tissue section)은 GLK-IQGAP1 복합체-양성 세포를 나타냈으며(도 21D), 암세포는(증식 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen)) PCNA 염색을 사용하여 확인되었다(도 21D). 병합된 이미지는 이들 조직의 GLK-IQGAP1 복합체-양성 세포가 실제로 암 세포임을 보여준다(도 21D). 데이터는 GLK-IQGAP1 복합체를 가진 폐암 세포가 전이되는 경향이 있음을 시사한다. 다음으로, 우리는 인간 NSCLC 조직에서 GLK-유도된 IQGAP1 Ser-480 인산화를 검사했다. 몇 번의 시도 실패 후, 우리는 마침내 IQGAP1 Ser-480 인산화에 대한 단클론 항체(mAb)를 얻었다. 그러나 포스포-IQGAP1 mAb를 사용한 면역블롯팅 신호는 인식할 수 있는(discernible) 신호를 제공 할만큼 충분히 강하지 않았다. 항-포스포-IQGAP1 mAb의 특이성과 염색 신호를 향상시키기 위해, 우리는 IQGAP1 및 포스포-IQGAP1 Ser-480에 해당하는 한 쌍의 PLA 프로브 조합으로 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)과 같은 인산화 신호를 증폭하는 PLA를 수행했다. 항체 특이성은 IQGAP1 S480A 돌연변이체-발현 세포와 IQGAP1-녹아웃 폐암 조직(SPA-EGFRdel; PolⅡ-GLKE351K; IQGAP1-/-)을 사용하여 입증되었다. 인간 NSCLC 조직을 사용하여, 우리는 시험된 종양 조직의 82.7% (72/87)에서 IQGAP1 Ser-480 인산화의 다중 PLA 신호를 발견했다(도 21E-F). 포스포-IQGAP1 PLA 신호는 동일한 세포에서 PCNA 염색과 공존했다(도 21E). 또한, NSCLC(편평 세포 암종 및 선암) 환자는 클러스터 분석 후, PLA 신호 높음 및 PLA 신호 낮음 하위 그룹으로 구분되었다. Kaplan-Meier 생존 분석은 높은 포스포-IQGAP1 PLA 신호를 가진 NSCLC 환자가 추적 기간(follow-up periods) 동안 불량한 생존을 보인 것으로 나타났다(n = 63, PLA 신호 높음 vs PLA 신호 낮음, P = 0.037)(도 21G). 종합적으로, 우리의 발견은 GLK가 IQGAP1에 직접 결합하고 인산화함으로써 세포 이동과 암 전이를 촉진한다는 것을 시사한다.
본 명세서에서 인용되고 논의된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 여기에 포함되며, 마치 각 참고 문헌이 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 포함된다.
<110> NATIONAL HEALTH RESEARCH INSTITUTES TAN, Tse-Hua <120> AhR-ROR-gamma t COMPLEX AS A BIOMARKER AND THERAPEUTIC TARGET FOR AUTOIMMUNE DISEASE AND IL-17A-ASSOCIATED DISEASE <130> 10008-052NPA <150> 62719416 <151> 2018-08-17 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-tag <400> 1 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 2 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKC theta intron 1 and exon 2 deleted sequence <400> 2 ggtggaacac taaaaataat atgtcttaga gccccataca tacagtgttt gtcttttgtc 60 atttttctag ggaacaacca tgtcaccgtt tc 92 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine GLK epitope 4 to 19 <400> 3 Gly Phe Asp Leu Ser Arg Arg Asn Pro Gln Glu Asp Phe Glu Leu Ile 1 5 10 15 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine GLK epitope 514 to 533 <400> 4 Glu Gln Arg Gly Thr Asn Leu Ser Arg Lys Glu Lys Lys Asp Val Pro 1 5 10 15 Lys Pro Ile <210> 5 <211> 13 <212> PRT 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Thr Glu Ser Gly Gln Gly Ile Glu Glu 180 185 190 Ala Thr Gly Leu Pro Gln Thr Val Val Cys Tyr Asn Pro Asp Gln Ile 195 200 205 Pro Pro Glu Asn Ser Pro Leu Met Glu Arg Cys Phe Ile Cys Arg Leu 210 215 220 Arg Cys Leu Leu Asp Asn Ser Ser Gly Phe Leu Ala Met Asn Phe Gln 225 230 235 240 Gly Lys Leu Lys Tyr Leu His Gly Gln Lys Lys Lys Gly Lys Asp Gly 245 250 255 Ser Ile Leu Pro Pro Gln Leu Ala Leu Phe Ala Ile Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Gln Pro Pro Ser Ile Leu Glu Ile Arg Thr Lys Asn Phe Ile Phe Arg 275 280 285 Thr Lys His Lys Leu Asp Phe Thr Pro Ile Gly Cys Asp Ala Lys Gly 290 295 300 Arg Ile Val Leu Gly Tyr Thr Glu Ala Glu Leu Cys Thr Arg Gly Ser 305 310 315 320 Gly Tyr Gln Phe Ile His Ala Ala Asp Met Leu Tyr Cys Ala Glu Ser 325 330 335 His Ile Arg Met Ile Lys Thr Gly Glu Ser Gly Met Ile Val Phe Arg 340 345 350 Leu Leu Thr Lys Asn Asn Arg Trp Thr Trp Val Gln Ser Asn Ala Arg 355 360 365 Leu Leu Tyr Lys Asn Gly Arg Pro Asp Tyr Ile Ile Val Thr Gln Arg 370 375 380 Pro Leu Thr Asp Glu Glu Gly Thr 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Gln Gln Gln Ser Leu Ala Leu Asn 595 600 605 Ser Ser Cys Met Val Gln Glu His Leu His Leu Glu Gln Gln Gln Gln 610 615 620 His His Gln Lys Gln Val Val Val Glu Pro Gln Gln Gln Leu Cys Gln 625 630 635 640 Lys Met Lys His Met Gln Val Asn Gly Met Phe Glu Asn Trp Asn Ser 645 650 655 Asn Gln Phe Val Pro Phe Asn Cys Pro Gln Gln Asp Pro Gln Gln Tyr 660 665 670 Asn Val Phe Thr Asp Leu His Gly Ile Ser Gln Glu Phe Pro Tyr Lys 675 680 685 Ser Glu Met Asp Ser Met Pro Tyr Thr Gln Asn Phe Ile Ser Cys Asn 690 695 700 Gln Pro Val Leu Pro Gln His Ser Lys Cys Thr Glu Leu Asp Tyr Pro 705 710 715 720 Met Gly Ser Phe Glu Pro Ser Pro Tyr Pro Thr Thr Ser Ser Leu Glu 725 730 735 Asp Phe Val Thr Cys Leu Gln Leu Pro Glu Asn Gln Lys His Gly Leu 740 745 750 Asn Pro Gln Ser Ala Ile Ile Thr Pro Gln Thr Cys Tyr Ala Gly Ala 755 760 765 Val Ser Met Tyr Gln Cys Gln Pro Glu Pro Gln His Thr His Val Gly 770 775 780 Gln Met Gln Tyr Asn Pro Val Leu Pro Gly Gln Gln Ala Phe Leu Asn 785 790 795 800 Lys Phe Gln Asn Gly Val Leu Asn Glu Thr Tyr Pro Ala Glu Leu Asn 805 810 815 Asn Ile Asn Asn Thr Gln Thr Thr Thr His Leu Gln Pro Leu His His 820 825 830 Pro Ser Glu Ala Arg Pro Phe Pro Asp Leu Thr Ser Ser Gly Phe Leu 835 840 845 <210> 30 <211> 495 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Met Arg Thr Gln Ile Glu Val Ile Pro Cys Lys Ile Cys Gly Asp Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ile His Tyr Gly Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly 20 25 30 Phe Phe Arg Arg Ser Gln Gln Cys Asn Val Ala Tyr Ser Cys Thr Arg 35 40 45 Gln Gln Asn Cys Pro Ile Asp Arg Thr Ser Arg Asn Arg Cys Gln His 50 55 60 Cys Arg Leu Gln Lys Cys Leu Ala Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val 65 70 75 80 Lys Phe Gly Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Asp Ser Leu His Ala Glu 85 90 95 Val Gln Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln Val Ala Lys 100 105 110 Thr Pro Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Asp Thr Leu Thr Tyr Thr Leu 115 120 125 Gly Leu Ser Asp Gly Gln Leu Pro Leu Gly Ala Ser Pro Asp Leu Pro 130 135 140 Glu Ala Ser Ala Cys Pro Pro Gly Leu Leu Arg Ala Ser Gly Ser Gly 145 150 155 160 Pro Pro Tyr Ser Asn Thr Leu Ala Lys Thr Glu Val Gln Gly Ala Ser 165 170 175 Cys His Leu Glu Tyr Ser Pro Glu Arg Gly Lys Ala Glu Gly Arg Asp 180 185 190 Ser Ile Tyr Ser Thr Asp Gly Gln Leu Thr Leu Gly Arg Cys Gly Leu 195 200 205 Arg Phe Glu Glu Thr Arg His Pro Glu Leu Gly Glu Pro Glu Gln Gly 210 215 220 Pro Asp Ser His Cys Ile Pro Ser Phe Cys Ser Ala Pro Glu Val Pro 225 230 235 240 Tyr Ala Ser Leu Thr Asp Ile Glu Tyr Leu Val Gln Asn Val Cys Lys 245 250 255 Ser Phe Arg Glu Thr Cys Gln Leu Arg Leu Glu Asp Leu Leu Arg Gln 260 265 270 Arg Thr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Glu Val Thr Ser Tyr Gln Arg Lys 275 280 285 Ser Met Trp Glu Met Trp Glu Arg Cys Ala His His Leu Thr Glu Ala 290 295 300 Ile Gln Tyr Val Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Ser Gly Phe Met Glu 305 310 315 320 Leu Cys Gln Asn Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Met Glu 325 330 335 Val Val Leu Val Arg Met Cys Arg Ala Tyr Asn Ala Asn Asn His Thr 340 345 350 Val Phe Phe Glu Gly Lys Tyr Gly Gly Val Glu Leu Phe Arg Ala Leu 355 360 365 Gly Cys Ser Glu Leu Ile Ser Ser Ile Phe Asp Phe Ser His Phe Leu 370 375 380 Ser Ala Leu Cys Phe Ser Glu Asp Glu Ile Ala Leu Tyr Thr Ala Leu 385 390 395 400 Val Leu Ile Asn Ala Asn Arg Pro Gly Leu Gln Glu Lys Arg Arg Val 405 410 415 Glu His Leu Gln Tyr Asn Leu Glu Leu Ala Phe His His His Leu Cys 420 425 430 Lys Thr His Arg Gln Gly Leu Leu Ala Lys Leu Pro Pro Lys Gly Lys 435 440 445 Leu Arg Ser Leu Cys Ser Gln His Val Glu Lys Leu Gln Ile Phe Gln 450 455 460 His Leu His Pro Ile Val Val Gln Ala Ala Phe Pro Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 Glu Leu Phe Ser Thr Asp Val Glu Ser Pro Glu Gly Leu Ser Lys 485 490 495 <210> 31 <211> 1520 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 atgggaaaag acctggcaat cagaggtgtg tgtgagcatt atcccaggga taatgccaag 60 ggtattatcc caagggtatc ccaagaagtg tcagaaaagc aaacatgatc caaacaggtg 120 aaagtcagag ttaccagcca gcaaaagacc tagaaagaag agcaaggtgt gaggtgctgc 180 aacttctgag aacacggtga tcatgaacag aatccagcaa tcctaccaga catgccatct 240 attgaacagg agctatcggt ccacctcatg ctgcatgtca gacaaaagct gaagagctgg 300 gacctaatga cccccatatt caccatcttg tcctcatatc tgctattcct gaagaaaaag 360 acttctcaaa gacataaagg caaaggtcat ctcatggaga ggagagaaca tgagagagct 420 gtttccatct tcccttctca tccctcatct cctcctgtta gtagtctcca cccggcagtg 480 cctcagtgtc tccactgtct ttcagccttc atcttgattt ctaattcttt cttcgattta 540 tccaatcagt cccttattct ttcacttcat ttccttcctc cttaaaagaa aggcttgata 600 ccgaacctca aaacagcaaa tattaacagg tttcttgata acatgcaacc gtaatgactt 660 cactagtaaa cctcatgtct ctcgctactc cttaataact aactagcctt tgtgattgtt 720 tcttgcagag aatagacatt caaggaaaaa cagttgcggt actcagttaa atagaacgtg 780 ttccgttggt gttaaattat ttattttgta tgtctgttta catactaaga cattgagtgg 840 gtttctttgg gcaagggatg ctctctagcc agggaatttg gtagaaaagt gagaaagatc 900 aagtcaaaat tcaaagtgtg tgtcactagg agactgtcaa gagactcaca aaccattact 960 atggagccca gctctgcagc agcttcagat atgtccatac acacatgata ctgaatcaca 1020 gcaaagcatc tctgttcagc tcccaagaag tcatgcttct ttgcatagtg aacttctgcc 1080 cttcccatct accttcgaga cagatgttgc ccgtcataaa ggggtggttc tgtgctgacc 1140 tcatttgagg atggaatctt tactcaaatg gtgtcacccc ccaacccact cttgacgtaa 1200 gtgaccacag aggtagtaaa accgtataaa aagagagaaa ggagcactac tcttcatcca 1260 cctcacacga ggcacaagtg cacccagcac cagctgatca ggacgcgcaa acatgagtcc 1320 agggagagct tcatctgtgg tgagtcctgc actaatgtac aaggcgcttg ttgattgtga 1380 ccaggttgcg ttattgcacg tgatatgaaa tgctctattc cagctgttgg ggtccatgaa 1440 tctgtacatg tagaactgga aatgaaacct ttggtagatg tcgaaatcat tgtacagcat 1500 tttcaagaac tgataggcat 1520 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asn Thr Val Trp Lys Gln Leu Ser Ser Ser Val Thr Gly Leu Thr 1 5 10 15

Claims (20)

  1. AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체(AhR-phospho-RORγt protein complex)의 억제제를 식별하는(identifying) 방법에 있어서,
    (a) 배양물 내의 세포가 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon Receptor)(AhR) 단백질 및 포스포-레티노산-수용체 관련 고아 핵 수용체 감마 t (RORγt)(phospho-Retinoic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma t(RORγt)) 단백질을 발현하는, 세포 배양물(cell culture)을 제공하는 단계;
    (b) 시험 제제(test agent)의 존재 하에 상기 세포 배양물을 인큐베이팅(incubating) 하는 단계;
    (c) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준을 분석(assaying)하는 단계;
    (d) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준을 대조군(control)과 비교하는 단계; 및
    (e) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 수준이 감소가 있는 것으로 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별(identifying)하는 단계
    를 포함하는,
    AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체(AhR-phospho-RORγt protein complex)의 억제제를 식별하는(identifying) 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분석 단계는 항-포스포-RORγt [Ser489] 항체(anti-phospho-RORγt [Ser489] antibody)를 사용하여 면역블롯팅(immunoblotting)을 수행하는 것인,
    방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 Lck-GLK 형질 전환 마우스(Lck-GLK transgenic mice)의 T 세포, GLK-과발현 T 세포(GLK-overexpressing T cells), TCR-활성화 T 세포(TCR-activated T cells) 및 AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포(AhR + RORγt + IKKβ overexpressing cells)로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 제공 단계는 CFP-AhR, YFP-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된(co-transfected) 세포를 제공하고;
    (ii) 상기 분석 단계는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석을 수행하고; 및
    (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 상기 YFP-RORγt에 의해 방출되는 형광 강도(fluorescence intensity)의 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하는 것인,
    방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 제공 단계는 AhR 태그된 에피토프(epitope tagged AhR), Myc-RORγt 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된 세포를 제공하고;
    (ii) 상기 분석 단계는 항-Myc 항체-접합된 수용체 비드(anti-Myc antibody-conjugated acceptor beads) 및 항-에피토프 항체-코팅된 공여자 비드(anti-epitope antibody-coated donor beads)와 함께 ALPHA 분석을 사용하여 수행되고; 및
    (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 항-Myc 항체-접합된 수용체 비드에 의해 방출되는 신호(signal)의 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하고,
    상기 에피토프는 서열 번호: 1(SEQ ID NO: 1)의 서열로 이루어지는 것인,
    방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 제공 단계는 Lck-GLK 형질 전환 마우스의 T 세포, GLK-과발현 T 세포, TCR-활성화 T 세포 및 AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포를 제공하고;
    (ii) 상기 분석 단계는, 일차(primary) 항체로서 항-AhR 항체(anti-AhR antibody)와 항-RORγt(anti-RORγt) 또는 항-포스포-RORγt [Ser489] 항체를, PLA 프로브(PLA probes)로서 이차(secondary) 항체를, 및 신호 검출용 형광 표지된 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브(fluorescent-labeled complementary oligonucleotide probes)를 사용하여 인 시츄(in situ) 근접 연결 분석 (proximity ligation assay, PLA)을 수행하고; 및
    (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 형광 신호 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하는 것인,
    방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 제공 단계는 Myc-AhR, RORγt 태그된 에피토프(epitope tagged RORγt) 및 IKKβ 플라스미드로 공동 형질 감염된 세포를 제공하고;
    (ii) AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체를 침전시키기(precipitate) 위해 항-에피토프 아가로스 비드(anti-epitope agarose beads) 또는 항-Myc 아가로스 비드(anti-Myc agarose beads)와 함께 세포 추출물(cell extracts)을 인큐베이팅하고(incubating), AHR-포스포-RORγt 복합체를 항-Myc 또는 항-에피토프 항체와 함께 면역 침전시켜(immunoprecipitated) 면역블롯팅함으로써(immunoblotting), 상기 분석 단계는 공동 면역 침전 분석(co-immunoprecipitation assay)을 수행하고; 및
    (iii) 비교 결과(comparing result)가 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 신호의 감소가 있음을 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체의 억제제로 식별하고,
    상기 에피토프는 서열 번호 1의 서열로 이루어지는 것인,
    방법.
  8. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 제공 단계는 Lck-GLK 형질 전환 마우스의 T 세포, GLK-과발현 T 세포, TCR-활성화 T 세포 및 AhR + RORγt + IKKβ 과발현 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포를 제공하고;
    (ii) 상기 분석 단계는, AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체를 면역 침전시키기 위해 항-RORγt 항체를 사용하고, PCR 산물을 얻기 위해 IL-17A 프로모터 DNA 서열의 AhR-결합 부위 뉴클레오티드 서열(AhR-binding site nucleotide sequence)을 포함하는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 염색질 면역 침전-DNA 시퀀싱(chromatin immunoprecipitation(ChIP)-DNA sequencing) 분석을 수행하고; 및
    (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존해 하에 상기 PCR 산물의 양의 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 AhR-포스포-RORγt 복합체의 억제제로 식별하는 것인,
    방법.
  9. GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제를 식별하는 방법에 있어서,
    (a) 배양물 내의 세포가 GLK 단백질 및 IQGAP1 단백질을 발현하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    (b) 시험 제제의 존재 하에 상기 세포 배양물을 인큐베이팅하는 단계;
    (c) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 수준을 분석하는 단계;
    (d) 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및
    (e) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하의 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 수준이 감소가 있는 것으로 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 시험 제제를 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제로 식별하는 단계
    를 포함하는,
    GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제를 식별하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (i) 상기 제공 단계는 GLK 형질 전환 마우스, GLK-과발현 세포 및 GLK + IQGAP1-과발현 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 제공하고;
    (ii) 상기 분석 단계는 일차 항체로 항-IQGAP1 항체 및 항-GLK 또는 항-포스포-IQGAP1 [Ser480] 항체를, PLA 프로브로 이차 항체를, 신호 검출용 형광 표지된 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 인 시츄(in situ) 근접 연결 분석 (proximity ligation assay, PLA)을 수행하고; 및
    (iii) 상기 대조군과 비교해 상기 시험 제제의 존재 하에 형광 신호 감소가 있음을 상기 비교 단계가 나타낼 때, 상기 식별 단계는 상기 시험 제제를 상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제로 식별하는 것인,
    방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 분석 단계는 항-포스포-IQGAP1 [Ser480] 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행하는 것인,
    방법.
  12. IL-17A 관련 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IL-17A 관련 질환을 치료하기 위한 약제(medicament)의 제조에서, 제1항의 방법에 의해 식별된 유효량의 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제의 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀(verteporfin) 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드(alexidine dihydrochloride)인 것인,
    용도.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 IL-17A 관련 질환은 자가면역질환(autoimmune disease), GLK-과발현 암세포 전이(GLK-overexpressing cancer cell metastasis) 및 GLK-과발현 암세포 재발(recurrence)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    용도.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 IL-17A 관련 질환은 자가면역질환이고, 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드인 것인,
    용도.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 IL-17A 관련 질환은 GLK-과발현 암세포 전이이고, 상기 AhR-포스포 -RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드인 것인,
    용도.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 IL-17A 관련 질환은 GLK-과발현 암세포 전이이고, 상기 AhR-포스포-RORγt 단백질 복합체 억제제는 베르테포르핀인 것인,
    용도.
  18. GLK-과발현 암세포 전이의 치료를 필요로 하는 대상체에서 GLK-과발현 암세포 전이를 치료하기 위한 약제의 제조에서, 제9항의 방법에 의해 식별된 유효량의 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제는 베르테포르핀 또는 알렉시딘 디하이드로클로라이드인 것인,
    용도.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 GLK-IQGAP1 단백질 복합체의 억제제는 베르테포르핀인 것인,
    용도.

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