PT90019B - Processo para a preparacao e purificacao de factor de choque termico humano - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 019

REQUERENTE:

EPÍGRAFE:

THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION, norte-ame ricana, com sede em Fruit Street, Boston , Massachusetts 02114, Estados Unidos da América do Norte.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE FACTOR DE CHOQUE TÉRMICO HUMANO

INVENTORES: Robert E. Kingston e Thomas J. Schuetz.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte em 18 de Março de 1988 sob o n-. 169,965 e em 25 de Janeiro de 1989 sob o nL 301,417.

INPI. MOD. 113 RF 1C732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento está relacionado com o processo para a preparação de Factor de Choque Térmico e de seus derivados, antagonistas e agonistas. O invento tambémldiz respeito à purificação de tais compostos a partir de fontes naturais e recombinantes.

THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE FACTOR DE CHOQUE TÉRMICO HUMANO

invento diz ainda respeito a aplicações de tais compostos em diagnóstico e terapêutica.

Mais concretamente o Factor de Choque Térmico pode ser obtido através de métodos naturais, sintéticos ou por tecnologia recombinante, sendo o método preferido a obtenção do referido Factor de Choque Térmico por cl£ nagem e expressão de um gene ou sequência de cDNA que codifica a proteína Factor de Choque Térmico pré-activada. A purificação do composto referido é feita por cromatografia de afinidade de DNA e, adicionalmente, por cromatografia MONO Q FPLC.

REFERÊNCIA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente é uma continua ção em parte do Pedido de Patente U.S. N° de Série 169 965 entregue em 18 de Março de 1988.

Campo do invento

O presente invento está relacionado com um factor de choque térmico humano e com a utilização deste factor no diagnóstico e tratamento de doenças e tensão (stress). 0 invento também se relaciona com a produção deste factor por técnicas de DNA recombinante e com sequências de DNA que codificam este factor.

Fundamento do invento

Células expostas a temperaturas eleva das ou a certos agentes quimicos respondem a tal stress através da indução da síntese de uma pequena série de protéi_ nas. Esta resposta celular é deignada resposta a choque térmico. As proteínas sintetizadas em resposta ao stress são designadas proteínas de choque térmico ou HSP .

Esta resposta a choque térmico parece ser ubíqua e tem sido observada tanto em células procarióti cas como eucarióticas e organismos (incluindo o homem). A síntese das proteínas de choque térmico é altamente signifi^ cativa uma vez que a incapacidade de prcduzir estas proteínas como resposta ao stress está associada à morte celular e à destruição de tecidos e orgãos.

Pensa-se que as proteínas de choque térmico desempenham um papel na atenuação da qravidade do stress fazendo a célula afectada voltar a um estado quiesceri te. Existem excelentes revisões do fenómeno de choque térmico feitas por Lanks, K.W. (Exper. Cell. Res. 165: 1-10 (1986)) e Lindquist, S. (Ann. Rev. Biochem. 55: 1151-1191 (1986)), as referências das quais são aqui incluídas por re ferência.

Encontrou-se que as proteínas do choque térmico possuem funções que não estão relacionadas com o chq que térmico e independentes do seu papel neste fenómeno. Observou-se que os genes que codificam as proteínas de choque térmico (i.e. genes hsp) são diferencialmente expressos durante o desenvolvimento embrionário (Bensaude, O. et al., Nature 305: 331(1983)), durante a diferenciação de tipos celulares específicos tais como mioblastocitos, carcinoma embrionário, células eritróides (Atkinson, B.G. J. Cell. Biol. 89: 666 (1986); Atkinson B.G. et al., Can. J. Biochem. Cell. Biol . 61 : 404 (1983 ); Morange, M. et al. , Molec . Cell. Biol.

4_: 730 (1984); Singh, M.K. et al . , Nature 309: 631 (1984)).

A transformação neoplástica está também associada a uma alte_ ração no nivel de proteínas de choque térmico (Lanks, K.W., Exper. Cell. Res. 165: 1-10 (1986)).

Encontrou-se que os genes das proteínas de choque térmico possuem sequências 5' altamente conservadas que contêm uma sequência consensus rotationally symmetric conhecida como Elemento de choque Térmico ou HSE. Foi identificado um factor transcricional de choque térmico (HSTF ou HSF ) que se pensa poder ligar-se às sequências HSE e desempenhar um papel na transcrição dos genes que codificam as proteínas de choque térmico (Lindquist, S. (Ann. Rev. Biochem. 55: 1151-1191 (1986); Parker et al., Cell 37:

253-262 (1984); Wu C., Nature 286: 854-860 (1980); Wu; C., Nature 309:229-241 (1984); Wu, C. , Nature 317: 84-87 (1985)) Como tal este factor é capaz de regular e aumentar a respos ta a choque térmico de um indivíduo.

Assim, este factor e agentes que promovem a sua actividade, proporcionam uma terapia para doenças associadas à resposta a choque térmico. Devido a este factor não ter sido suficientemente caracterizado para permitir a sua utilização em terapia para tais doenças, ou para permitir a identificação de agentes que promovem a sua actividade, não foi anteriormente possível empregar HSF (a tais agentes) como base de tratamento de tais doenças. Assi existe a necessidade de um meio para purificar e produzir HSF e seus derivados, antagonistas e agonistas.

SUMARIO DO INVENTO

O presente invento está relacionado com o Factor de Choque Térmico e seus derivados, antagonistas e agonistas. O invento também diz respeito à produção e purificação de tais compostos a partir de fontes naturais e recombinantes. O invento relaciona-se ainda com as aplicações terapêuticas e em diagnóstico de tais compostos.

Detalhadamente, o invento diz respeito a um composto compreendendo o Factor de Choque térmico substancialmente livre de contaminantes naturais ou seus derivados .

O invento inclui ainda um medicamento terapêutico compreendendo Factor de Choque Térmico ou um agente que activa o Factor de Choque Térmico.

invento também inclui uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência que codifica o Factor de Choque Térmico.

invento ainda diz respeito ao compos to atrás , em que o composto é preparado por um processo que inclui cromatografia de afinidade com DNA.

invento também engloba um método de purificação do Factor de Choque Térmico que se caracteriza por se submeter a cromatografia de afinidade com DNA, uma amostra suspeita de conter o factor.

invento proprociona ainda um método para o tratamento de uma doença associada à resposta ao choque térmico que se caracteriza pela administração a um indivíduo, necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de factor de choque térmico activado ou de um agente que active o factor de choque térmico.

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

A resposta ao Choque Térmico

O presente invento deriva, em parte, de estudos da resposta de células humanas a alterações do ambien_ te externo. As células humanas respondem a uma variedade de alterações ambientais através da indução coordenada de uma série de genes adequados, frequentemente via ligação a sequências especifias de um factor de transcrição aos sitios reguladores do promotor (Serfling, E. et al., Trends in Genet 1:224 (1985); McKnight, S. et al., Cell 46: 795 (1986); Maniatis , T. et al., Science 236: 1237 (1987 )).

Em vários casos a regulação coordenada do genes de mamíferos parece envolver modificação de um factor de transcrição pré-existente para uma forma que pode ligar o elemento regulador de um promotor (Yamamoto, K. Ann.

Rev. Genet. 19: 209 (1985); Sen, R. et al., Cell 47: 921(1986) Preywes R. et al. , Cell 47: 777 (1986); Hayes, T.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 1272 (1987); Kingston, R.E. et al ., Mol. Cell. Biol. 7: 1530 (1987); Zimorino, V. et al. Nature 327: 727 (1987).

Pouco se conhece acerca das alterações bioquímicas que provocam esta alteração de capacidade de ligação de DNA. Estas alterações são claramente um elo essencial na tradução de um sinal do ambiente numa resposta adequa, da: indução de uma série especifica de genes. A determinação do mecanismo pelo qual a ligação do factor de transcrição se pode ser induzida é portanto essencial para uma compreensão de muitas vias reguladoras.

Os sinais ambientais conduzem a altera, ções pós-tradução da capacidade de ligação a DNA de vários factores que regulam a transcrição em mamíferos. Nos sistemas procarióticos os sinais ambientais podem conduzir à íos forilação de proteínas reguladoras que se ligam a DNA: por exemplo, o produto ntrB fosforila a proteína NtrC em respos ta à limitação de azoto, resultando na inactivação de NtrC. De modo semelhante, HSF de levedura torna-se fosforilado como resposta ao calor.

Conforme discutido atrás, a resposta ao choque térmico que ocorre em organismos que vão das bactérias ao homem, envolve o aumento de sintese de uma série de protei nas codificadas pelos genes hsp. A transcrição destes genes é regulada pelo factor de choque térmico (HSF).

HSF é normalmente produzido num nível baixo, mesmo em células quiescentes. Como resposta ao setress , no entanto a concentração de HSF numa célula aumenta e é convertido numa forma activada. A forma activada de HSF é capaz de se ligar às sequências HSE e assim mediar o aumento da transcrição dos genes codificadores de proteínas do choque térmico. Deste modo a resposta ao choque térmico é um exemplo da regulação coordenada de genes.

Quando as células humanas são aquecidas até 43°C observou-se que a transcrição dos genes de choque térmico é induzida (Ritossa, F.M., Experientia (Basel)18:571 (1962 ); Nover, L. , Heat Shock of Eukaryotic Cells. Springer Berlin (1984); Craig, E.A., CRC Cit. Rev, Biochem. 18:239 (1985); Pelham, H.R.B., Trends Genet.l:31 (1985); Lindquist,

S., Ann. Rev. Biochem 55:1151 (1986) através do elemento

palindrómico de choque térmico (HSEs)	situado	a montante	de
cada um dos promotores (Pelham, H.R.B.	et al .	, EMBO J.,1:	1473
(1982); Mirault, M.E. et al., EMBO J.	1:1279	(1982): Wu,	B.

et al., Mol. Cell , Biol. /:330 (1985); Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA /2:4949 (1985); Drabent B. et al.,

Nucl. Acids Res.14:8933 (1986); Berger, E.M. et al., Somat. Cell.Molec. Genet. 12:433 (1986); Wu. B.J. et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 8/:629 (1986 ) ).

A ligação de HSF ao HSE estimula directamente a transcrição em Drosophila e pensa-se que a expres são dos genes de choque térmico seja estimulada de modo semelhante noutros organismos (Kingston R.E. et al., Mol. Cell. Biol. /:1530 (1987); Wu, C., Nature 309:229 (1984); Parker,

C. S. et al., Cell, //:273 (1984); morgan, W.D. et al., Mol. Cell . Biol 7:1129 (1987); Wiederrecht, G. et al. , Mol. Cell. Biol. /:1129 (1987); Wiederrecht, G. et al., Cell 48:507

(1987 ) , Wu et al . , Science 238:1249 (1987); Sorger, P.K. et al., Nature 329:81 (1987)).

A indução da capacidade de um factor para se ligar ao Hse dos genes de choque térmico é aparente mente central para o cointrole da resposta de choque térmico em Dosophila e células humanas. A indução da capacidade de ligação ocorre como resposta directa à temperatura uma vez que a ligação é induzida no extracto citoplasmático com aproximadamente o mesmo perfil de temperatura das células intactas.

Esta alteração na capacidade de ligação não é a única alteração de HSE que ocorre quando as células são aquecidas HSF das células aquecidas é aparentemente fos^ forilado num grau significativamente superior ao do HSF activado unido em vitro. HSF é activado em células humanas através de pelo menos dois passos: uma infusão da capacidade de ligação seguido de fosforilação .

O aquecimento de um extracto citoplasmático recria apenas o primleiro destes passos resultando num factor com um peso molecular aparente mais baixo. Este acon tecimento de fosforilação rotativa pode aumentar a capacida. de de HSF para activar a transcrição ou pode alterar alguma outra caracteristica critica para a função de HSF.

Assim resumindo HSF é um factor trans cricional que quando activado por exposição de uma célula a calor ou tensão (stress), medeia um aumento de transcri ção dos genes hsp e portanto provoca um aumento de concentração celular da proteínas choque térmico. As proteínas de choque térmico actuam de modo a atenuar os efeitos prejudici. ais do stress .

A purificação de HSF

HSF·activado é de preferência purificado a partir de células Hela, no entanto, com esta finalidade po dem ser empregues outras células humanas. As células são cultivadas num meio de cultura adequado, de preferência Meio Minimo Essencial (Modificação de Joklik's) suplementado com soro .

Após as células terem atingido uma densi^ dade desejável, são colhidas e usadas para preparar extractos nucleares. Tais extractos são de preferência preparados de acordo com o método de Dignam, D. et al., (Nucl. Acids Res

11:1475 (1983)).

O extracto nuclear é então passado através de uma coluna de DNA de cadeia dupla-celulose. O material ligado é eluido de coluna usando um passo de eluição com 0,3 M KC1. A actividade de HSF é de preferência testada usan do o ensaio de electroforese de Kingston , R.E. et al (Molec. Cell, Biol.7:1530 (1987) referência que aqui é incluida como referência). As fracções contendo actividade de HSF são reunidas numa preparação para posterior purificação.

Preparou-se uma coluna de afinidade com DNA de cadeia dupla que de preferência usa um concatamero de um oligonucleotideo de 28 bases auto-complementar contendo HSE e tendo a sequência:

GATCCTAGAAGTTCTAGAAGCTTCTAG

Tal coluna é de preferência preparada de acordo com o método de Kadonaga et al., (Proc. Natl, Acad.

Sei. USA 83:5889 (1986), referência que aqui é incluída como referência). O oligonucleotideo é de preferência covalentemente ligado a Sepharose CL-2B (Pharmacia) usando brometo de cianogénio para formar a coluna de afinidade.

O conjunto de fracções contendo HSF foram então aplicadas na coluna de afinidade de DNA de cadeia dupla com sequência especifica atrás descrita. O HSF activado liga-se à coluna e pode ser eluido da coluna numa lavagem com sal KC1 0,75 M. As fracções apresentando actividade de HSF foram então reunidas numa preparação para posterior purificação.

As fracções reunidas foram então de preferência diluídas para 0,1 M KC1 e aplicadas numa coluna de FPLC MONO Q (Pharmacia). O material ligado é de preferência eluido com um gradiente linear de KCL (0,1 a l,0M). Testa-se a actividade de HSF de preferência como descrito atrás e as fracções activas são reunidas. A actividade de HSF é eluida da coluna a 0,3-0,6 M KC1.

Usando o processo acima descrito pode-se isolar e purificar HSF activado capaz de se ligar a DNA.

HSF e seus derivados funcionais, agonistas e antagonistas.

O presente invento respeita o factor de chogue térmico activado (HSF), fragmentos terapêuticos deste factor, assim como derivados funcionais, agonistas e antagonistas deste factor. O invento diz respeito especial mente a agentes que sãõ capazzes de activar HSF para a sua forma activa.

Um derivado funcional de HSF é um com posto que possui actividade biológica (funcional ou estrutural) que é substancialmente semelhante a uma actividade bio lógica de HSF. 0 termo derivados funcionais pretende incuir osfragmentos, variantes, análogos ou derivados qui_ micos de uma molécula.

Um fragmento de uma molécula como seja HSF pretende referir-se a qualquer subserie de polipeptideos da molécula. Uma variante de uma molécula como seja HSF pretende refe,rir-se a uma molécula substancialmente semelhan te em estrutura e função a uma molécula completa ou a um seu fragmento.

Diz-se que uma molécula é substancialmente semelhante a uma outra molécula se ambas as moléculas tiverem estruturas substancialmente semelhantes ou se ambas as moléculas possuírem uma actividade biológica semelhante.

Assim, desde que as duas moléculas possuan uma actividade semlhante elas são consideradas variantes uma vez que aquele termo é aqui usado mesmo se a estrutura de uma das moléculas não se encontrar na outra ou se a sequência de resíduos de aminoácidos não fôr idêntica.

HSF refere-se em função mas pleta ou a um

Um análogo de uma molécula tal como a uma molécula substancialmente semelhante não em estrutura relativamente à molécula com seu fragmento.

Tal como aqui é usado uma molécula é referida como sendo um derivado químico de uma outra molécula quando contêm fracções químicas adicionais normalmente não sendo uma parte da molécula. Tais fracções podem aumentar a solubilidade absorção, semi-vida biológica da molécula etc .

As fracções podem como alternativa dim_i nuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito secundário, indesejável da molécula, etc. As fracções capazes de mediar tais efeitos estão divulgadas em Remington¹s Pharmaceutical Sciences (1980). Os processos para acoplar tais fracções a uma molécula são do conhecimento geral.

Um antagonista de HSF é um composto que inibe a função de HSF. Tais antagonistas podem ser imu noglobulinas (tais como, por exemplo, anticorpos monoclonais ou policlonais de fragmentos activos de tal anticorpo). Os antagonistas do presente invento podem também incluir compos tos que não sejam imunoglobulinas (como sejam polipeptideos compostos orgânicos, etc.).

O anticorpo policlonal capaz de se ligar a HSF activado pode ser preparado por imunização de um mamífero com uma preparação de HSF activado ou derivado funcio nal de HSF. São do conhecimento geral os métodos para se conseguir tais imunização.

Os anticorpos monoclonais (ou sem fragmentos) podem também ser empregues para testar a presença (ou quantidade) HSF activado numa amostra biológica particu lar .

Tais anticorpos podem ser produzidos por imunização de esplenócitos com HSF activado (através da modificação dos processos de Kohler et al. (Nature256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6j511 (1976); Euro J. Immunol. 6_:292 (1976 ) ) .

Além dos métodos referidos, os anticorpos capazes de se ligarem a HSF activado podem ser produzidos num processo de dois passos através da utilização de anticor pos anti-idiotipicos.

Tal método tira partido do facto de os anticorpos serem eles próprios antigénios e de portanto, ser possível obter um anti-corpo que se liga a um segundo anticorpo. De acordo com este método, os anticorpos capazes de se ligarem a HSF activado são usados para imunizar um animal.

Os esplenócitos de tal animal são então usados para produzir células de nidridona e as células de hibridona não testadas para identificar clones que produzam anticorpos cuja capacidade para se ligar a anticorpos anti HSF activado pode ser especificamente bloqueada pela protei. na HSF activada.

Tais anticorpos compreendem anticorpos anti-idiotipicos contra o anticorpo anti-HSF. Tais anticor pos podem ser usados para imunizar um animal e assim induzir a formação de anticorpos capazes de se ligarem a HSF activado .

Além de proporcioanr HSF adicional (ou um derivado funcional) de HSF a um indivíduo, a eficácia de HSF num indivíduo pode ser aumentada pela administração de um aganista de HSF a um indivíduo. Em adição o invento refere-se a agonistas de HSF. Um agonista do HSF é qualquer composto capaz de aumentar a eficácia de uma função de HSF .

Exemplos de tais agonistas incluem um agente que promova a sintese de HSF pelo indivíduo, um agente que promova a- activação de HSF pré-existente, etc. Os agen_ tes que promovem a activação de HSF pré-existente são os agonistas e afentes terapêuticos preferidos do presente invento.

HSF ou agentes que promovem a activação de HSF podem ser obtidos por sintese química, através da utilização da tecnologia de DNA recombinante ou por protéoli^ se. As vantagens terapêuticas de tais agentes podem ser au mentadas através da administração combinada de vários agentes .

âmbito do presente invento pretende ainda incluir derivados funcionais de HSF que não possuam um dois ou mais resíduos de aminoácidos a que contenham resi duos de aminoácidos alterados, desde que tais derivados apresentam capacidade poara influenciar a resposta do choque térmico.

Os compostos do presente invento são referidos como estando substanciualmente livres de contaminantes naturais se as preparações que os incluem estiverem substancialmente livres de materiais com os quais estes pr£ dutos sejam normal e naturalmente encontrados.

Métodos para a preparação de HSF

O factor de choque térmico deste invento pode ser obtido por processos naturais (tais como, por exem pio, por indução da produção de HSF a partir de uma célula humana ou animal)) por métodos sintéticos (tais como, por exemplo, usando o método de Merrifield para a síntese de polipeptideos para sintetizar HSF , derivados funcionais de HSF ou agonistas ou antagonistas de HSF (quer imunoglobulina quer não imunoglobulina); ou através de aplicação da tecnologia de DNA recombinante (como seja, por exemplo para produzir o HSF do presente invento em diversos hospedeiros (i.e., leveduras, bactérias, fungos,células de mamíferos em cultura, etc.) ou a partir de plasmideos recombinantes ou vec tores virais ) .

A escolha do método a empregar dependerá de factores tais como conveniência, rendimento pretendido, etc. Não é necessário usar apenas um dos métodos, processos ou tecnologias atrás descritos para produzir HSF; os proces sos, métodos e tecnologias atrás descritos podem ser combi nados de modo a obter-se HSF. Ê preferida a preparação de HSF por clonagem e expressão de um gene ou sequência de cDNA que codifique a proteína HSF pré-activada. Tal sequência de cDNA do gene será aqui designada gene HSF ou quência de cDNA HSF.

se-

-17Qualquer um de uma série de processos pode ser usado para clonar o gene HSF (ou de modo equivaler^ te uma sequência de cDNA que codifique HSF). Tal método inclui a análise de uma biblioteca em vector vaivém de inserções de cDNA (derivadas de uma célula que expresse HSF) quanto à presença de uma inserção que contem o gene HSF ou sequência de cDNA . Tal análise pode ser conduzida por transfecção de células com o vector e depois observação da expressão de HSF.

O método preferido para a clonagem deste gene engloba determinação da sequência de aminoácidos da mo lécula de HSF. Para conseguir este objectivo a proteina HSF pode ser purificada como descrito atrás e analisada por sequen ciadores automáticos, como alternativa a molécula pode ser fragmentada, como seja com brometo de cianogénio com protea ses tais como a papaina, quinotripsina ou, de preferência tripsina (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257:9751-9758 (1982); Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215 (1983 ) ) .

Se bem que seja impossível determinar a sequência de aminoácidos de HSF na sua totalidade é preferi_ vel determinar a sequência de fragmentos peptidicos da mo lécula se os peptideos tiverem mais de 10 aminoácidos a in formação da sequência é geralmente suficiente para permitir a clonagem de um gene tal como o gene do HSF (ou uma sequên cia de cDNA do gene HSF).

Foram sequenciados um ou mais fragmentos peptidicos adequados e examinados as sequências de DNA capa zes de os codificar. Devido ao código genético ser degenera do pode-se usar mais do que um código para codificar um ami noácido particular (Watson, J.D.., In: molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park , CA (1977 ) pág. 356-357).

Os fragmentos peptidicos foram analidados para identificar sequências de aminoácidos que possam ser C£ dificados por- oligonbucleotideo tendo o menor grau de dege nerescência. Isto é de preferência conseguido através da identificação da sequências que contêm aminoácidos que são codificados por um único cordão. Se bem que ocasionalmente tais sequências da aminoácidos podem ser codificadas apenas por um único oligonucleotideo, frequentemente a sequência de aminoácidos pode ser codificada por qualquer um de uma série de oligonucleotideos semelhantes.

É importante que apesar de todos os mem bros da série conterem oligonucleotideos capazes de codificar o fragmento peptidico e assim potencialmente conterem a mes ma sequência de nucleotideos da sequência do gene que codifi^ ca o fragmento peptidico apenas um membro da serie contam uma sequência nucleótidica que é idêntica à sequência de nu cleotideos desta sequência do gene. Devido este membro estar presente na série e ser capaz de hibridar com DNA mesmo na presença de outros em membros da serie, é possível empre gar a série de oligonucleotideos não fraccionada do mesmo modo que se empregaria um único olionucleotideo para clonar o gene (ou sequência de cDNA) que codifica o peptideo.

De modo exactamente análogo ao descrito atrás, pode-se empregar um oligonucleotideo (ou serie de oli. gonuclutideos) gue tenha uma sequência de oligonucleotideo complementar da sequência o oligonucleotideo ou serie de sequências capaz de codificar o fragmento peptidico.

Um oligonucleotideo adequado, ou série de oligonucleotideos capaz de codificar um fragmento do ge ne HSF (ou que seja complementar de tal oligonucleotideo ou série de oligonucleotideos) foi identificado (usando o processo atrás descrito) sintetizado e hibridado por meios bem conhecidos contra um DNA ou de preferência, uma preparação de cDNA derivada de células humanas que sejam capazes de expressar sequências de genes HSF.

Técnicas de hibridação de ácidos nucleocos estão descritos em Maniatis, T. et al., In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982) e por Haymes, B.D. et al., In: Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), referências estas que aqui sao incluídas por referência.

A fonte de DNA ou cDNA usada de preferência estará enriquecida em sequências de HSF. Tal enriquecimento poderá ser facilmente obtido usando cDNA obtido por extracção de RNA de células cultivadas em condições que induzem a síntese de HSF.

Técnicas tais como as descritas atrás ou semelhantes permitiriam a clonagem com êxito de DNA complementar de genes aldeidos-desidrogenase humana (Hsu, L.C. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3771-3775 (1985)), fibronectina (Suzuki, S. et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J.4:2519-2524 (1985)), o gene do reeptor de estrogénios humano (Walter P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7889-7893 (1985)) activador do plasmideo e plasminogénio tipo tecido (Pennica,

D. et al., Nature 301:214-221 (1983)) e fosfatose alcalina de placenta humana (Kam, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 82:8715-8719 (1985 ) ) .

Numa via alternativa preferida para clinagem do uma sequência do gene HSF, preparou-se uma bibliot£ ca de vectores de expressão por clonagem de DNA, ou prefereri cialmente cDNA, derivado de uma célula capaz de expressar HSF, num vector de expressão.

A biblioteca foi então testada quanto aos membros capazes de expressar uma proteína que se liga a anticorpo anti-HSF e que tem numa sequência de nucleotideos capaz de codifocar polipeptideos que têm a mesma sequência de aminoácidos de HSF ou de fragmentos de HSF.

O gene HSF clonado, obtido através de métodos descritos atrás, pode ser operacionalmente ligado a um vector de expressão e introduzido em células bacterianas ou eucarióticas para produzir proteína HSF. As técnicas pa_ ra tais manipulações estão descritas por Maniatis, T. et al supra, e são bem conhecidos.

Utilizações do HSF e seus derivados funcionais agonistas e antagonistas

A. Utilizações em diagnóstico

Os compostos do presente invento podem ser usados para diagnosticar a presença de stress em orgãos ou tecidos, ou em extractos, secções, etc de orgãos ou tecidos. Os compostos do presente invento podem ser também usados para diagnosticar o nivel de stress em células ou extractos celulares. A capacidade para efectuar tal diagnóstico é especialmente desejável na avaliação de orgãos (tais como, por exemplo, rim, figado, heart, etc) ou tecidos (pele, medula ossea, etc) relativamente a serem adequados ou não para terapias de transplante ou substituição de orgãos ou tecidos.

A presença ou nivel, de stress numa amostra biológica particular pode ser determinada pela ide£ tificação ou quantificação do nivel de HSF activado presente naquela amostra.

Para esta finalidade podem ser usados qualquer um de uma variedade de métodos capazes de identif_i car (ou quantificar) o nivel de HSF activado numa amostra.

É no entanto, preferível testar o HSF activado usando um an ticorpo e especialmente um anticorpo monoclonal (ou um frag mento de um anticorpo policlonal ou monoclonal) capaz de se ligar a HSF activado.

Os ensaios de diagnóstico para detectar HSF activado podem compreender ensaios de visualização de imagens (tais como, por exemplo, visualização de imagens de todo o corpo ou orgãos) ou podem compreender uma biópsia ou ensaio in sito de células ou de secções de orgãos ou tecidos .

Conforme indicado atrás, tais ensaios po dem ser efectuados em extractos celulares de orgãos tecidos células, etc.

Os anticorpos (ou seus fragmentos) do pr< sente invento são particularmente adequados para usar em imunoensaios em que eles possam ser utilizados na fase liqui_ da ou ligados a um veiculo de fase sólida.

Os anticorpos ou seus fragmentos podem ser marcados usando qualquer uma de uma variedade de marcas e métodos de marcação. Exemplos de tipos de marcas que podem ser usados no presente invento incluem, mas não estão limitados, a enzimas, marcas radioactivas, marcas isotopicas não radioactivas, marcas fluorescentes e marcas quimioluminescentes.

Exemplos de marcas enzimáticas adequadas incluem malato-desidrogenase, nuclease de estafilococus, delta-S-esteroide-isomerase, álcool-desidrogenase de levedu ra, alfa-glicerol-fosfato-desidrogenase, triose-fosfato is£ merase , peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, gluc£ se-oxidase , bota-galactosidade, ribonuclease, urease , catalase, gluxose-6-fosfato-desidrogenase, glucoamilase, acetilq lina-estearase, etc.

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Cr

Y, “'Cu,---Ci,---At

In é um isótopo preferido

O seu uso pode ter vantagens adicionais uma vez que evita o problema da desalogenação do anticorpo monoclonal marcado com ³³³I ou ^³½ pelo figado. Em adição estes radionucleotideos têm uma energia de emissão gama mais favorável para visualização (Perkins, A.C.

Med. 10:296-301 (1985); Carasquillo, J et al Eur. J. Nucl

A. et al

Nucl

Med. 28:281-287 (1987)).

Exemplos de marcas isotópicas não radioactivas adequadas incluem etc.

157

Gd ¹⁶²D_Y, “Tr

Fe

Exemplos de marcas fluorescentes adequa 152 das incluem uma marca Eu, umomarca de fluoresceina, uma marca de isotiocianato, uma marca de rodamina, uma marca de f icoeritrina, uma marca de ficocianina, uma marca de alofi^ cocianina, uma marca de o-ftaldeido, uma marca de fluorescamina, etc.

Exemplos de marcas quimioluminescentes incluem uma marca luminal, uma marca isoluminal, uma marca de éster de acridinio aromático, uma marca de imidazole, uma marca de sal de acridinio, uma marca éster de oxalato, uma marca de luciferina , uma marca de luciferase, uma marca de aequorina, etc.

Os falsos familiarizados com a matéria saberão que outras marcas adequadas podem ser empreguas de acordo com o presente invento. A ligação destas marcas a anticorpos ou seus fragmentos pode ser conseguida usando té£ nicas convencionais normalmente conhecidas dos familiarizados com a matéria.

Técnicas típicas estão descritas por Kennedy, J. H. , et al (Clin. Chim. Acta 70 :1-31 (1976)) e Schurs , A. H. W. M., et al. (Clin. Chim. Acta 81 :1-40 (1977 )) As técnicas de acoplamento referidas no último são o método de glutaraldeido, o método do periodato, o método dimaleimi_ do, o método do éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxi-succin_i mida, todos estes métodos sendo aqui incluídos por referência .

A detecção dos anticorpos (ou fragmentos) de anticorpos do por presente invento pode ser melhorada atra vés do uso do veiculo. Veículos conhecidos incluem vidro, polistireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon amilases, celolose naturais e modificadas, poliacrilanina, agaroses e magnetite.

A natureza do veiculo pode ser solúvel até certo ponto ou insolúvel para os fins do presente inven to. O material de suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acopla da seja capaz de se ligar a HSF.

Assim a configuração do suporte pode ser esferica, como seja uma esfera, ou cilíndrica, como na super ficie interna de um tubo de ensaio ou na superfície externa de uma vareta. Como alternativa a superfície pode ser horizontal como seja uma folha, tira de teste, etc. Os famil_i arizados com a matéria verificarão existência de muito outros veículos adequados para a ligação do anticorpo monoclo nal ou serão capazes de usar o mesmo pela experimentação de rotina.

Os anticorpos ou fragmentos de anticornvento podem ser usados para detectar quari qualitativamente a presença de HSF activapode ser conseguida usando qualquer um de imunoensaios.

pos do presente i titativamente ou do. Tal detecção uma variedade de

Por exemplo por marcação radioactiva dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos, é possível detectar HSF activado através da utilização de radioimunoensaios. 0

HSF activado pode-se distingir do HSF “pré-activado pela sua capacidade para se ligar a DNA contendo HSF.

A quantidade de tal HSF activado preseri te numa amostra pode ser medida usando um radioimunoensaios. Uma boa descrição de um radioimunoensaio (RIA) pode ser encon trada em Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular

Biology, por Company , NY entitulado Techniques

Work, T.S., et al., North Holland Publishing (1978 ),com particular referência para o capitulo An Introduction to Radioimmune Assay and Related por Chard, T., aqui incorporado por referência.

Ο anticorpo ou fragmentos de anticorpos do presente invento podem também ser adaptados para utilização num ensaio imunométrico também conhecido como ensaio de dois-sitios ou sanduíche. Num ensaio imunométrico ti_ pico, uma quantidade de anticorpo não marcado (ou fragmento do anticorpo) é ligado a um suporte sólido que é insolúvel no fluido a ser testado (i.e., sangue, linfo, secreções liquefeitas, homogenatos de tecidos, extractos celulares, etc) e adicionada uma quantidade de anticorpo solúvel marcado de modo detectável para permitir a detecção e/ou quantificação do complexo t-ernário formado entre o anticorpo de fase sólida, HSF activado e anticorpo marcado.

ensaios forward é primeiro posto ra extrair o HSF plexo binário de

Os ensaios imunométricos típicos incluem ' em que o anticorpo ligado à fase sólida, em contacto com a amostra a ser testada pa_ activado da amostra pela formação de um com fase sólida anticorpo-HSF.

Após um periodo de incubação aquele que é adequado o suporte sólido é lavado para remover o resíduo da amostra liquido, incluindo o antigénio que não reagiu, se o houver, e depois posto em contacto com a solução contendo uma quantidade desconhecida de anticorpo marcado (que funciona como molécula repórter).

Após um segundo periodo de incubação pa_ ra permitir que o anticorpo marcado se complexe com o HSF acvtivado ligado ao suporte sólido através do anticorpo não marcado, o suporte sólido é lavado numa segunda vez para remover o anticorpo marcado que não.reagiu.

Este tipo de ensaio sanduíche forward pode ser um simples ensaio de tudo ou nada para determinar se o HSF activado está presente ou pode ser tomado quantita. tivo por comparação da medição de anticorpo marcado com a ' obtida para uma amostra padrão contendo quantidades conheci^ das de HSF.

Tais ensaios de dois sítios ou sandui. che estão descritos por Wide nas páginas 199-206 de Radioim mune Assay Method, editado por Kirkham e Hunter, E. § S. Livingstone, 'Edinburgh, 1970 .

Num outro tipo de ensaio sanduíche que também pode ser sitil para testar o HSF activado do presente invento são usados os chamados ensaios simultâneo e reverso. Um ensaio simultâneo envolve um único passo de incubação uma vez que o anticorpo ligado ao suporte sólido e o anticorpo marcado são ambos adicionados à amostra a ser testada ao mesmo tempo.

Após completada a incubação o suporte sc5 lido é lavado para remover o resíduo de amostra fluida e aq ticorpo marcado não complexado. A presença de anticorpo marcado associado ao suporte sólido é então determinada como seria um ensaio sanduíche forward convencional.

No ensaio reverso, utiliza-se uma adi ção em diferentes passos primeiro de uma solução de anticor po marcado à amostra ferida e fluida seguido de adição do aq ticorpo não marcado a um suporte sólido após um periodo de incubação adequado.

-28Após um segundo incubação, a fase sólida é lavado de modo convencional para a libertar do resíduo de amostra a ser testada e da solução de anticorpo marcado que não reagiu. A determinação do anticorpo marcado associa do ao suporte sólido foi entãõ determinado como nos ensaios simultâneo e forward.

Conforme explicado atrás, os ensaios imunométricos para HSF requerem que a molécula de ligação particular seja marcada com uma molécula repórter. Estas moléculas ou marcas repórter, conforme identificadas atrás são convencionais e bem conhecidas. Na realização do presen te invento as marcas enzimáticas são uma execução preferida.

Não existe uma enzima única ideal para usar como marca em tecidos todos os ensaios imunométricos con cebidos. Em vez disso deve-se determinar qual a enzima ade quada para um sistema de ensaio particular. Os critérios importantes para a escolha de enzimas são o número de remoção da enzima pura (o número de moléculas de substracto con vertidas em produto por sitio enzimático por unidade de tem po) pureza de preparação de enzima, sensibilidade da detecção do seu produto, facilidade e velocidade de reacção enzimáti, ca ausência de factores interferentes ou de actividade do tipo enzimático no fluido a testar, estabilidade da enzima e do seu conjugado, disponibilidade e custo da enzima e seu conjugado e similares.

Entre as enzimas usadas como marcas pre feridas nos ensaios imunométricos do presente invento incluem-se peroxidase , fosfatase alcalina, beta-galactosidade urease , glucose-oxidase , glicoamilase, malato-desidrogenase glucose-6-fosfato-desidrogenase. A urease está entre as marcas enzimáticas mais preferidas, particularmente devido aos indicadores de ph cromogénicos gue tomam a sua activida^ de fácilmente viisivel a olho nu.

B. Utilização dos compostos do presente invento para detectar agentes gue activam HSF.

Conforme descrito atrás, a presença de HSF activado numa célula permite à célula sobreviver ao cha péu térmico a outras condições de stress. Portanto, um agente gue seja capaz de activar HSF ou gue seja capaz de estimular ou aumentar a activação natural de HSF seria extremamente desejável.

Tal agente poderia ser usado para evitar a morte celular (i.e. para evitar a morte de orgãos, tecidos etc.) enguanto na preparação para transplante para um recipiente ou para tratar um indivíduo em stress cuja própria capacidade natural para activar HSF é insufeciente para evq tar destruição ou morte.

Os agentes gue activam HSF podem ser iden tificados como se segue HSF é incubado na presença de uma guantidade adequada de um agente cuja capacidade para activar HSF se vai determinar.

A mistura de incubação contem enzimas, co-enzimas, co-f actores , etc, que são necessários para perm_i tir que ocorra a activação de HSF. De preferência, tais mis turas de incubação são compostos por extractos celulares de células de mamíferos. Após incubação durante um período de tempo adequado o HSF na mistura de incubação é testado quari to à sua capacidade para se ligar a DNA.

Uma vez que o HSF se liga a DNA apenas quando activado, a presença de HSF ligado a DNA (ou como al_ ternativa, um aumento na quantidade de HSF ligado a DNA) iri dica que o agente testado foi capaz de activar o HSF da mi£ tura de incubação. Tal agente foi identificado, a sua estru tura, a sua pode ser determinada através de análise química ou bioquímica de rotina. O ensaio atrás descrito para tais agezntes de activação é especialmente adequado para usar no despiste de grandes números de potenciais agentes farmacoló gicos.

C. Utilizações terapêuticas.

Os agentes que aumentam o nivel de HSF activado num indivíduo (i.e. um ser humano ou animal) podem ser usados na terapia de qualquer doença associada à respos ta a stress de choque térmico. Conforme descrito atrás, a resposta a chogue térmico é uma via altamente conservada sob o ponto de vista evolutivo que um organismo usa para responder a uma variedade situações de stress. Nestas condições de stress estão incluídas a hipoxia e o etanol.

As manifestações patofisiológicas da h.i poxia estão bem documentadas. A hipoxia é o mecanismo dire_ tamente responsável por enfartes do miocárdio e enfartes ce rebrais. Portanto se um ser humano ou animal fôr melhor ca paz de responder a uma agressão hipóxica potencialmente sobreviverá à agressão com menos danificação permanente.

A limitação do tamanho do enfarte do mio cárdio observou-se afectar directamente a sobrevivência do paciente . Os agentes gue aumentam o nível de HSF activado num indivíduo· tem assim a utilidade de potenciação de tal stress. Tal terapia é também importante no tratamento de stress induzido por etanol devido à sua capacidade para li_ mitar o desarrajo metabólico gue rtesulta de uma overdose de etanol .

Ao administrar-se a um paciente anticor pos ou seus fragmentos capazes de se ligarem a HSF ou guando se adminstra HSF (ou um seu fragmento, variante ou derivado) ou um agente capaz de promover a activação de HSF a um paciente recipiente, a dosagem de agente administrado variará dependendo de factores tais como idade do paciente, peso, al_ tura, sexo estado clinico geral, história clinica geral, etc

Em geral é desejável piente uma dosagem de anticorpo que está de 1 pg/kg a 10 mg/kg (peso do corpo do que uma dosagem mais baixa ou mais alta administ na gama, paciente) possa ser

r ar	ao reci
de	cerca
se	bem

administra da .

Quando se administra os compostos atrás descritos a um paciente, é preferido administrar tais compostos numa dosagem que também varia entre cerca de Ipg/kg e 10 mg/kg (peso do corpo do paciente) se bem que se possa administrar uma dose mais baixa ou mais alta.

Os compostos do presente invento podem ser administrados a pacientes por via intravenosa, intramus cular, subcutaneamente, entéricamente ou parenteralmente. Quando da administração de tais coimpostos por injecção, a administração pode ser por infusão continua ou por bolos úni cos ou múltiplos.

Os compostos do presente invento destinam-se a proporcionar a indivíduos recipientes uma quantidade suficiente para efectuar a resposta a choque térmico.

Uma quantidade é referida como sendo suficiente para efectuar a resposta de choque térmico se a dosagem, via de admd nistração, etc do agente forem sufecientes para influenciar tal resposta.

Os compostos do presente invento podem ser administrados antes do estabelecimento da condição indutora de stress (de medo a suprimir os danos previstos pa ra tal condição) ou após a iniciação da condição.

Uma composição é referida como sendo far macologicamente aceitável se a sua administração puder ser tolerada por um paciente recipiente.

Tal agente é referido como sendo administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz se a quantidade administrada fôr fisiológicamente importante. Umagente é fisiológicamente importante se a sua presença re sultar numa alteração detectável na fisiologia de um pacien te recipiente.

Os compostos do presente invento podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, através das quais estes materiais ou seus derivados funcionais são combinados e misturados com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Veículos adequados e sua formulação, in cluem inclusive de outrs proteínas humanas, e.g. albumina do soro humano, estão descritos por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (16ã edição, Osol , A., Ed. , Mack, Easton PA (1980)). Para formar uma composição farmacêutica mente aceitável adequada a uma administração eficaz, tais com posições conterão uma quantidade eficaz dos compostos atrás descritos juntamente com uma quantidade adequada de veiculo.

Métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregues para controlar a duração da acção. As preparações de libertação controlada podem ser conseguidas atra vés da utilização de polímeros para complexar ou absorver os compostos. A libertação controlada pode ser exercida através da selecção de macromoléculas adequadas (por exemplo po liesteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, etilenovinilacetato, metilcelulose, carboximetilcelulose ou sulfato de protamina) e a concentração das macromoléculas assim como os métodos de incorporação para se controlar a liberta^ ção .

Um outro método possível para controlar a duração da acção por preparações de libertação controlada é incorporar os compostos do presente invento em partículas de um material polimérico tais como poliesteres, poliamino£ eidos, hidrozeis, poli (ácido láctico) ou copolimeros de etil etilenovinilacetato. Como alternativa, em vez da incorpora ção destes agentes em partículas poliméricas é possível en cerrar estes materiais em microcápsulas preparadas, por exem pio, por técnicas de conservação ou por polimerização inter_ facial , por exemplo hidroxi microcápsulas de gelatina ou de hidroximetilcelulose e microcápsulas e poli (metilmetacilato) respectivamente ou em sistemas coloidais de libertação de drogas, por exemplo lipossimas, microesferas de albumina microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences. (1980).

Tendo descrito de um modo geral o\inven to, o mesmo será fácilmente compreendido através da referên cia aos exemplos que seguem os quais são dados como ilustra, tivos e não devem ser considerados como limitantes do preseri te invento a menos que seja especificado.

EXEMPLO 1

ENSAIO PARA O FACTOR DE CHOQUE TÉRMICO

O HSF humano ligado ao HSE pode ser detectado como um complexo que migra com uma mobilidade caracte ristica num gel de poliacrilamina não desnaturante (Kingston R.E. et al., Mol. Cell. Biol. 7:1530 (1987); Sorger, P.K. et al., Nature 329:81 (1987) cuja referência é aqui incluída como referência). Extractos nucleares de células HeLa a cres cer a 43°C contem significativamente mais desta actividade de ligação do que os extractos nucleares de células HeLa a crescerem a 37°C.

Para se desenvolver um sistema in vitro para estudar esta indução, preparam-se extractos nucleares e citoplasmáticos a partir de células HeLa que cresceram a 37°C (Dignam, D. et al. , Nucl. Acids Res 11:1475 (1983 ) , cu ja referência é aqui incluída como referência).

Estes extractos foram aquecidos a 43°C durante uma hora e o nivel de actividade de ligação a HSE foi determinado usando a técnica de retenção de bandas.

Os extractos nucleares e citoplasméticos de 4 L de células HeLa que cresceram a 37°C (designados NE e S100 respectivamente) e os extractos nucleares de 1L de cé lulas HeLa imediatamente após 1 hr de incubação a 43°C (HSNE) foram preparados como descrito por Digmnam et al, (Nucl. Acids Res 11:1475 (1983)).

Os extractos foram dialisados contra tara pão (20 mM Hepes, ph 7,9, 20% (vol/vol) glicerol, 100 mM KC1 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 0,5 MM ditiotreitol) e foram incubados sem qualquer adição.

As proteínas (0,5 ug de proteina do NE ou 8,5 ug de S100 ou ambos) foram incubados durante 1 hora a 0°C ou a 43°C. Os extractos foram então incubados a 30°C durante 30 minutos com um oligonucleotideo sintético marcado 3 2 com P contendo o HSE (bases -11 a -80) do promotor de hsp 70 humana (Sen, R. et al . , Cell 47:921 (1986); Prywes , R. e t al., Cell 47:777 (1986); Hayes, T.E. et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 84:1272 (1987)).

As misturas de reacção de ligação (20 ul) continham 12 mM HEPES ph 7,9, 12% (vol/vol) glicerol, 60 mM KC1, 0,12 mM EDTA, 0,3 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo,

0,3 mM ditiotreitol, 2 mM MgC^, 100 ug de poli (dl-dC) por mole, aproximadamente 0,2 mg de DNA marcado o extracto. As misturas de reacção foram então sujeitas a electroforese num gel de 4% e poliacrilamina não desnaturante.

Um oligonucleotideo 16-meros de cadeia dupla contendo o HSE (bases -80 a -115 do promotor de hsp 70 humano) foi usado como sonda marcada. O extracto nuclear não continha actividade de ligação antes ou após aquecimento enquanto que o extracto citoplasmático tinha niveis signifi_ cativos de actividade de ligação apenas após incubação a 43°C a adição de extracto nuclear ao extracto citoplasmático não altera o grau de indução.

Os resultados desta experiência, mostram que os extractos citoplasmáticos de células HeLa não induz/ dos pelo calor contêm uma actividade induzivel pelo calor que se liga na região do elemento de choque térmico determinado por um ensaio de alteração de mobilidade em gel.

EXEMPLO 2

PURIFICAÇÃO DO FACTOR DE CHOQUE TÉRMICO

A) Preparação do extracto nuclear

Células humanas HeLa foram cultivadas em cultura em suspensão e alimentadas com Minimal Essebtial Media (modificação de Joklik’s) que foi suplementado com 5% de s£ ro de cavalo. As células foram cultivadas até uma densidade de aproximadamente 500.000 células por mililitro.

As células foram então colhidas e os ex_ tractos nuclerres preparados essencialemnte como descrito por Dignam et al. (Nucl. Acids Res 11:1475 (1983). O extracto nuclear foi dialisado contra tampão Dignam D (20% v/v glicerol, 20 mM HEPES (ph 7,9) o,l M KC1, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 0,2 mM EDTA).

B) Passo de fraccionamento # 1 extracto nuclear de células HeLa em tampão Dignam D foi passado numa coluna de DNA de cadeia dupla de timo de vitela-Celulose (Pharmacia) que tinha sido pré-equilibrada com tampão D. A coluna foi eluida com aumentos graduais de tampão D contendo 0,3 M KC1 e 1,5 KC1.

A actividade de HSF foi controlada pelo ensaio de alteração de mobilidade na electroforese em gel de Kingston et al . (Mol. Cell. Biol . 7_:1530 (1987)). Obse£ vou-se que a actividade de HSF elui a 0,3 M KC1. As fracções contendo actividade de HSF foram reunidas e adicionado detergente NP - 40 para 0,1 % (v/v).

C) Passo de fraccionamento 2

O segundo passo da purificação baseou-se na ligação especifica de HSF à sua sequência cognata -- o HSE. Para este passo construiu-se uma coluna de afinidade com sequências especificas oligonucleotidicas de cadeia du pias de acordo com o método de Kadonaga et al. (Proc. Natl. Acad. Sei . USA 83:5889 (1986)). Sintetizou-se um oligonucleotideo auto-complementar de 28 bases com a seguinte sequêri cia:

GATCCTAGAAGCTTCIAGAAGCTTCTAG

-39Este oligonucleotideo foi auto-emparelha^ do para formar uma molécula de cadeia dupla com protuberância 5' GATC e dois HSEs sobreponiveis. Estas moléculas foram fos. foriladas e ligadas concatemeros com um comprimento médio de cerca de 5 a 10 unidades. Este DNA foi convalentemente ligado a Sepharose CL-2B (Pharmacia) usando brometo de cianogénio. Isto constitui então a coluna de afinidade.

O conjunto de fracções do Passo # 1 foi aplicado na coluna de afinidade que tinha sido previamente esquilibrada -com Tampão 0,3 D'ins (Tampão D com 0,3 M KCl, 0,1% v/v NP - 40 e 0,1 mg/ml de insulina bovina). A activi. dade de HSF foi eluida com um passo de lavagem com Tampão 0,8 D'ins (0,8 M KCl, 0,1% (v/v) NP-40 e 0,1 mg/ml de insulina bovina).

D) Passo de fraccionamento a 3

O conjunto de fracções do passo anterior foram diluídas para 0,1 M KCl e aplicadas numa coluna MONO Q de FPLC (Pharmacia). A coluna foi eluida com um gradien. te linear de KCl de 0,1 a 1,0 M KCl em tampão D'ins. Testou -se a actividade de HSF e as fracções activas foram reunidas o material eluido produziu duas bandas quando analisado por electroforese em gel de SDS. Pensa-se que uma destas bandas seja um produto de degradação da outra. Asim, o material es tá entre 50% puro (se as duas bandas não estiverem relacionadas) e 95% puro (se as duas bandas estiverem relacionadas)

EXEMPLO 3

CARACTERIZAÇÃO DO FACTOR DE CHOQUE TÉRMICO

A actividade citoplasmática de ligação induzivel pelo calor formou uma única banda retida que comigrou com a mais inferior das duas bandas retidas obtidas com o extracto nuclear das células sujeitas a choque térmico .

O fraccionamento dc extracto citoplasmá_ tico em fosfocelulose ou Biorex 70 deu uma respectiva fracção que produz duas bandas de mobilidade adequada após incu bação a 43°C . A presença de apenas a banda inferior após indução do extracto não fraccionado a 43°C pode portanto ser devida a um inibidor no extracto. As especificidade da sequên cia desta ligante foi examinada para se verificar que a liga^ ção representava uma intenção com o HSE.

A espicificidade da sequência da actividade de ligação induzivel pelo calor presente no extracto S 100 foi caracterizado através da análise de competição da bari da induzida pelo calor com fragmentos contendo o elemento de choque térmico e fragmentos não específicos.

A competição da banda induzida pelo calor com fragmentos contendo o elemento de choque térmico e fragmentos não específicos foi investigado como se segue 8,5 ug da proteína S100 foi incubado (ou não incubado) a 43°C durante 1 hora antes da incubação com a sonda de DNA.

Os extractos S100 foram preparados e as incubações com DNA e electroforese efectuadas como descrito atrás. As misturas de incubação também continham DNA compe tidor não radioactivo (bases -84 a + 5 do gene hsp 70 humano (que não contem o elemento de choque térmico) num excesso molar de 5 ou 10 vezes ou as bases -148 a -74 do gene hsp 70 humano (que contem o elemento de choque térmico centrado na base -100) ou um fragmente de 310 pares de bases de um ge ne de choque térmico de D. melanogaster contendo três elementos de choque térmico (Xho I /base - 200 _7 a EcoRl Γ base +100 7 do plsmideo pSP6-HS-9 (Wurm, F.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5415 (1986 )), derivado do fragmento clonado 232 descrito por Holmgren et al. (Cell 18:1359 (1979) ou um oligonucleotideo sintético de cadeia dupla de 39 pares de a bases contende a sequência CAAT (cadeia do topo, 5' CA CCG TCG ATT TCC CTT CTG AGC CAA TCA CCG AGC TCG A); ou a sonda oligonucleotidica sintética de cadeia dupla de 36 pa, res de bases. As concentrações de DNA foram calculadas por electroforese em gel de agarose.

Para caracterizar melhor a espicificida, de da ligação, faz-se uma análise de interferências da meti, lação ( Siebenlist, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:122 (1980); Gilman, M.Z. et al . , Mol . Cell. Biol . 6,:4305 (1986)).

Um fragmento parcialmente metilado conteri do o HSE foi incubado o extracto citoplasmático aquecido e os fragmentos ligados e livres foram separados e analisados.

A análise foi efectuada com marca radioactiva na cadeia do topo ou do fundo.

O extracto citoplasmático foi aquecido a 43°C durante 1,5 hora. As reacções de ligação foram efectu adas como descrito atrás. Em tais ensaios 120 ug de extracto citoplasmático aquecido (INVITRO) ou (16 ug de HSNE) (IN VIVO) foram incubados com 20 ug de um fragmento marcado contendo as bases -148 a -74 do promotor.

Os complexos ligados e livres foram separados num gel não desnaturante, eluidos e analisados como descrito por Gilman, Μ. Z. et al (Mol. Cell. Biol . (5:4305 ( 1986)). A sequência de consensus de choque térmico é C-GAA — TTC—G.

Todos os fragmentos que continham um HSE competiram para a ligação enquanto que não houve competição pelos fragmentos que não continham o HSE. Cinco residuos G no HSE ou adjacentes a ele estavam sub-representados no DNA ligado, indicando que o factor ligado está em contacto estreito com estes residuos.

Um padrão semelhante é observado com o factor ligado em extractos nucleares de células submetidas a choque térmico. Os dados de competição e estes dados de interferência DMS mostram que a actividade de ligação induz/ da in vitro tem a mesma especificidade de sequência que a observada em células totais após indução (Kingston R.E. et al., Mool. Cell. Biol. 7:1530 (1987)).

EXEMPLO 4

CARACTERIZAÇÃO DA INDUÇÃO DE LIGAÇÃO

A indução da actividade de ligação em células HeLa intactas foi comparada com a indução de HSE num sistema acelular. A indução da actividade de ligação em cé lulas HeLa intactas verifiou-se ocorrer com uma cinética rá_ pida, enquanto que a indução no sistema acelular ocorre mais lentamene. As determinações das cinéticas e dependência da temepratura da actividade de ligação induzivel pelo calor presente no extracto S100 foi efectuado como se e segue.

Extracto S100 foram preparados e a incubação c.otr DNA e electroforese efectuadas como descrito atrás. As amostras continham 8,5 ug de proteina do extracto S100. Incubaram-se as amostras durante 1 hora a 43°C antes de ef£ ctuar as reacções de ligação. Após esta incubação algumas amostras foram então incubadas durante mais 1 hora a 37°C, 30°C ou 0°C antes das reacções de ligação.

Os extractos S100 foram incubados a 43°C antes das reacções de ligação. Observaram-se picos de act^L vidade de ligação após 45 a 60 minutos de incubação a 43°C.

A temperatura óptima para a indução da actividade de ligação está esteitamente relacionada com a temperatura a que as células HeLa sofrem a resposta ao choque térmico.

Hov.ve uma indução muito ligeira da capacidade de ligação a 2 7°C in vitro , com um aumento de indu ção observado a 40°C e 43°C e sem observação de indução a 50°C. Uma vez induzida a capacidade de ligação verifica-se ser estável; após indução a 43°C, posterior incubação em ge lo a 30°C ou a 37°C até durante 1 hora não resultou numa de sactivação do factor activado.

EXEMPLO 5

INDUÇÃO DE HSF EM CÉLULAS HELA extracto hora a 43 em gel e nearmente

A guantidade de HSF num mático guer tinha sido aguecido durante uma determinada usando a alteração de mobilidade ções tais gue a guantidade de HSF aumenta li aumento de proteína.

citoplas °C foi m cond_i com o

A quantidade de HSF num extracto nuclear derivado de células HeLa aquecidas intactas a 43°C foi medido do mesmo modo. As actividades foram então corrigidas para o número de células que tinharr sido usados para produzir os respectivos extractos. A quantidade de HSF no extracto citoplasmático aquecido foi de 12 200 unidades por 10 células enquanto que o extracto nuclear de células aquecidas continham 11 800 unidades por 10 células. As unidades foram definidas pela quantidade de sonda HSE marcada retida num gel de alterações da mobilidade.

A

As caracteristicas de indução in vitro da capacidade de ligação do HSF sugere fortemente que esta activação é estremamente semelhante à observada quando células HeLa intactas são submetidas a choque térmico. A especificidade da ligação a HSE após activação in vitro é idêntica à observada quando o factor é isolado a partir de células HeLa submetidas a choque térmico.

O perfil de temperatura para indução in vitro é semelhante ao observado em células intactas. Em adi^ ção a activação da actividade de ligação a HSE in vitro é eficaz. A indução de um extracto citoplasmático in vitro resulta em 12,2 unidades de HSF por 10^ células, enquanto que os núcleos de células HeLa submetidas a choque térmico contem 11,8 unidades de HSF por 10^ células.

EXEMPLO 6

EFEITO DA TEMPERATURA NA ACTIVAÇÃO DE HSF

As células aquecidas contêm niveis aumentados de proteína desnaturada e foi sugerido que isto tra va a activação de HSF através de uma via de degradação de pro. teinas ( Anantham, J. etal. , Science 232:522 ( 1986) ; Finley D. et al., Cell 17:43 (1984); Goff, S.A. ET AL., Cell 41:587 (1985); Munro, S. et al., Nature (London) 317:477 (1985)).

Este modelo prevê que a activação ocorra de mais um modo dependente da temperatura no sistema in vitro devido a haver mais proteina desnaturada a 43°C do que a 37°C.

Ao contrário a adição de BSA fervida ao extracto citoplasmático não altera a velocidade de indução de HSF a 37°C ou a 43°C (ver atrás) nem altera o grau de in dução. A adição de extracto citoplasmático fervido também teve muito pouco efeito na activação. Assim, a proteína de£ naturada não desempenhou uma função na alteração de HSF para uma forma que possa ligar DNA, sugerindo que esta alteração pode resultar de um efeito directo de temperatura.

EXEMPLO 7

MECANISMO

MOLECULAR DA ACTIVAÇÃO DE HSF

O fraccionamento do extracto citoplasnuá tico em várias colunas de permuta iónica resulta em fracções individuais que retem a capacidade de CiCtivar HSF de modo iri duzivel pelo calor.

Estas fracções foram usadas para mostrar que a adição de ATP não tem efeito na velocidade ou grau de activação de actividade de ligação. Um extracto citoplasmá^ tico foi aplicado numa coluna Biorex 70 e eluido con' lavagens contendo 0,1, 0,2, 0,5 e 1,0 M KC1. As fracções foram testadas individualmente e em combinação quanto à capacidade pa_ ra formar HSP activo quando da incubação a 43°C. Toda esta actividade elui na alavagem de 0,1 M KC1. Um dos factores proteicos retidos nesta coluna (X) encontrou-se ter uma mobilidade mais rápida do que HSF. A actividade que forma X elui na lavagem com 0,5 MKC1. a lavagem com 5,5 M KC1 não tem capacidade para formar HSF activo e não alterou a quanti_ dade de HSF formado quando adicionado à lavagem com 0,1 MKC1.

Este resultado é consistente com um mode lo em que uma molécula individual de HSF inactiva sofre uma alterando de conformação induzida pelo calor para numa forma de ligação a DNA. No entanto, o grau de activação de HSF é primorosamente sensível à diluição do extracto citoplasmáti_ co indicando que pelo menos duas moléculas são necessárias para activar HSF. Estes resultados indicam que (1) HSF ma tivo existe como monómero que sofre uma alteração corformacio nal e dimerização para formar uma espécie activa capaz de ligação ou (2) existe um segundo factor sensível ao calor que modifica -HSF para uma forma de ligação a DNA.

Conforme indicado atrás , o ensaio de acti. vação de HSF revelou a presença de uma banda ( X ) cujc nivel estava inversamente relacionado com a quanitdade de HSF Este facto sugere que esta banda represente um precursor de HSF activo. No entanto, a actividade que forma esta banda separa-se da actividade que forma HSF activo em colunas com carga negativa. Assim 'e improvável que o factor que produz X seja um precursor de HSF activo, se bem que se mantenha co mo possível um papel para X na regulação da resposta do cho

EXEMPLO 8

ESTUDOS DE LIGAÇÃO INTER-CRUZADA

As caracteristicas de activação do HSF in vitro foram investigadas através da avaliação do nível de HSF presente após as manipulações que se seguem conforme determinado pelo ensaio de alteração de mobilidade em gel des_ crito atrás usando no oligonucleotideo sintético contendo um HSE (ver atrás).

A) 20 ug de proteina S100 foram incubadas durante 20 minutosna presença ou ausência de albumina do S£ ro bovino fervido (20 ug de proteina BSA/20 ug de proteina SIGO). Esta experiência revelou que a adição de proteina desnaturada não altera a activação.

B) 0 extracto citoplasmático foi diluído com um volume igual, 4 vol ou 9 vol de extracto citoplasmático fervido antes da incubação durante 50 minutos. A actividade foi então testada em reacções de ligação (20 ul ) que continham todas 13 ug de extractos citoplasmáticos activo (não fervido). Esta experiência revelou que a diluição reduziu a activação de HSF in vitro. Resultados semelantes foram obtidos após diluição com tampão.

C) Extracto citoplasmático (13 mg/ml) foi aquecido durante 1 hora a 43°C (extracto de 43°C) ou incu bado em gelo durante 1 hora, (extracto de 0°C). O extracto de 43°C (1 ul, 3 ul ou 0 ul) foi incubado com uma quantidade de extracto de 0°C ( o ul, 12 ul ou 4 ul) a 30°C durante 1 hora. Esta experiência revelou que a adição de extractos não aquecido não inibe a ligação ao HSE.

A banda de HSF tinha aa seguintes caracteristicas. não está presente nos extractos nucleares testemunhas; está presente nc complexo HSF-HSE identificado nos geis de alteração de mobilidade, e na formação é competida eficazmente por um oligonucleotideo que contem um HSE mas não por um oligonucleotideo testemunha que especifica o elemento CCAAT.

Os estudos de ligação intercruzada em UV foram efectuados para determinar o tamanho aparente de cadei dos factores.. Os extractos foram incubados com um HSE sint£ 32 tico dimerizado que foi substituido com um P-CTP e bromodesoxiuridina e o complexo resultante contendo HSF foi sepa rado dos complexos não especificos num gel de agarose e irradiado com luz UV. A análise das espécies proteicas marca das resultantes num gel de SDS-poliacrilamina revelou uma ba da que migrou a 93 Kd e que estava presente em extractos nu cleares de células HeLa aquecidas.

Surpreendentemente experiências semelhan tes com o extracto citoplasmático aquecido revelaram que HSF activado in vitro corre marcadamente mais depressa (90 Kd) num gel de poliacrilamina) doque HSF isolado a partir de nu cleos de células aquecidas.

Ele não está presente no extracto citopl mático que não foi aquecido e a formação do complexo de ligação intercruzada é competida por um hse mas não por um oli_ gonucleotideo testemunha CCAAT.

Assim, HSF activado para especificidade de ligação a DNA in vitro difere de alguma forma de HSF is£ lado a partir de células submetidas a choque térmico. Esta diferença não é provocada por uma actividade nos extractos citoplasmáticos que modifica HSF activo, umavez que ambas as formas de 93 Kd e 90 Kd do HSP são observadas após aquecimen to de um extracto citoplasmático na presença de extracto nu clear.

Uma possibilidade para esta diferença de mobilidade, por analogia em HSF de levedura é a fosforilação Hsf de levedura aumenta de peso molecular para aparentemente quando da submissão das células a choque térmico e esta alte_ ração parece ser devida a fosforilação HSF de células HeLa aquecidas e HSF activado in vitro foram tratados com fosfata_ se ácida antes da ligação intercruzada ao DNA.

O tratamento com fosfatase ácida aumen tou a mobilidade aparente de HSF que tinha sido isolado a pa£ tir de células HeLa aquecidas, enquanto que o tratamento com fosfatase alcalina do intestino de vitela tem um efeito limitado. O trtamento de HSF derivado de células aquecidas com ambas as fosfatases resultou numa banda difusa que vai desde aproximadamente 90 Kd até 92 Kd.

Ao contrário, não houve um efeito detectável de fosfatase ácida na mobilidade do HSF activado in vitro. Apesar do tratamento com fosfatase não ter alterado a mobilidade de HSF das células aquecidas precisamente até à do HSF activado in-vitro, estes seus resultados implicam que o HSF encontrado em células aquecidas intactas é mais fos forilado do que o HSF activado in vitro-.

As capacidades de ligação a HSE do HSF humano podem assim ser activadas por aquecimento de um extracto citoplasmático de HeLa. A proteína desnaturada não altera a velocidade ou grau de activação da actividade de l_i gação a HSE in vitro. HSF que foi activado in vitro tem ca. pacidades de ligação a DNA que são idênticas às de HSF isola, do a partir de núcleos de células humanas aquecidas, no entanto, o HSF activado in vitro corre com uma mobilidade mais rápida em géis de poliacrilamina do que o HSF activado em células intactas. Esta diferença de mobilidade parece ser devida a diferenças de fosforilação. Assim, as células huma nas respondem ao calor pela activação de HSF em pelo menos dois passos primeiro, uma alteração induzida pelo calor independente de ATP na capacidade de ligação a DNA seguido de fosforilação.

Se bem que o invento tenha sido descrito em relação a execução especificas dele, será entendido que poderá sofrer outras modificações e este pedido pretende co brir quaisquer variações, utilizações ou adaptações do invento seguindo, em geral os princípios do invento e incluiri do tais saidas da presente divulgação como é hábito corrente dentro do âmbito a que o invento pertence e como pode ser aplicado às caracteristicas esseciais aqui estabelecidas e como se segue no âmbito de reivindicações apensas.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a preparação de um composto compreendendo Factor de Choque Térmico substancia/ mente livre de contaminantes naturais ou seus derivados, ca racterizado por:

   a) Se utilizar métodos naturais, nomeadamente a indução da produção do Factor de Choque Térmico a partir de uma célu la humana ou animal ; ou

   b) Se utilizar métodos sintéticos, nomeadamente, a utilização do método Merrifield para sintetizar as proteínas que siri tetizam o Factor de Choque Térmico, seus derivados funcionais, ou seus agonistas ou antagonistas; ou

   c) Se utilizar tecnologia recombinante, nomeadamente a produção de Factor de Choque Térmico em diversos hospedeiros ou a partir de plasmideos recombinantes ou vectores virais podendo qualquer dos métodos ser utilizado só ou combinado com os outros, e sendo o método preferencial a preparação do Factor de Choque Térmico por clonagem a expressão de um gene ou sequência de cDNA que codifica a proteína Factor de Choque Térmico pré-activada.
2. 2ã. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto preparado ser o Factor de Choque Térmico.

   35. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto preparado ser um derivado do Factor de Choque Térmico.

   45. - Processo para a preparação de um medicamento terapêutico caracterizado por se incluir no referido medicamento um composto de acordo com a reivindicação

   1.

   55. - Processo para a preparação de uma molécula de ácido nucleico recombinante caracterizado por se incorporar na referida molécula uma sequência que codifica o composto de acordo com a reivindicação 1.

   65. - Processo para a preparação de uma molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizado por se incorporar na referida molécula uma sequência que codifi_ ca o composto de acordo com a reivindicação 2.

   dicação 1 subme t ido nidade de

   75. - Processo de acordo com a reivincaracterizado por o referido composto ser ainda a um processo compreendendo cromatográf ia de af_i

   DNA.

   incluir

   85. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido processo ainda cromatográfia MONO Q FPLC.

   95. - Processo de acordo com a reivin dicaçao 1 , caracterizado por se preparar um agente capaz de activar o Factor de Choque Térmico.

   10^. _ Processo para a preparaçao de um medicamento terapêutico caracterizado por se incluir no referido medicamento o composto de acordo com a reivindica çao 9 .

   115. _ Método para a purificação do factor de Choque Térmico, caracterizado por se submeter uma amostra suspeita de conter o referido factor a cromatografia de afinidade de DNA.

   125. _ Método da reivindicação 11 caracte rizado ainda por se submeter a amostra suspeita de conter o referido factor a cromatografia MONO Q fPLC.

   135. _ Método para o tratamento de uma dq ença associada a resposta de choque térmico, em especial de uma doença seleccionada do grupo constituído por hipoxia, stress induzido por etanol, enfarte do miocárdio e enfarte cerebral, caracterizado por se administrar a um indivíduo necessitado de tal tratamento uma quantidade eficaz do composto da reivindicação 1, sendo a gama de dosagem de 1 pg/kg a 10 mg/kg de peso corporal do paciente.

   145. - Método para o tratamento de uma doença associada a resposta de choque térmico, em especial de uma doença seleccionada do grupo constituído por hipoxia, stress induzido por etanol, enfarte do miocárdio e enfarte cerebral, caracterizado por se administrar a um indivíduo necessitado de tal tratamento uma quantidade eficaz do com posto de acordo com a reivindicação 9, sendo a gama de dosagem de 1 pg/kg a 10 mg/kg de peso corporal do paciente.

   -5515-. - Método para o diagnostico do estado de stress, de um tecido ou orgao, caracterizado por se testar o referido tecido ou orgao quanto à presença do Factor de Choque Térmico activado, sendo o referido Factor de Choque Térmico activado caracterizado por se ligar a HSE.

   16^. _ Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido ensaio compreender o uso de um antagonista do Factor de Choque Térmico.

   175. _ Método de acordo com a reivindi caçao 16, caracterizado por o referido antagonista ser administrado ao referido indivíduo.

   1Q5. - Método de acordo com a reivindi caçao 16, caracterizado por o referido antagonista ser um ari ticorpo ou um fragmento de um anticorpo.

   195. _ Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido anticorpo ser um anticorpo monoclonal.

   205. _ Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido ensaio compreender uma biopsia .

   215. - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido ensaio compreender visualização de todo o corpo ou orgao.