JPH03503410A - ヒト熱ショック因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒ　　　ト　　熱　　　／　　　：Ｉ　　　ノ　　　り　　　因　　子関連出願 本願は１９８８年３月１８日出願の米国特許出願第１６９，９６５の一部継続出 願である。

発明の技術分野 本発明はヒト熱シヨツク因子に関連し、さらには疾患およびストレスの診断およ び治療における該因子の使用に関する。本発明はまた組換えＤＮＩ：による該因 子の製造、並びに該因子をコードするＤＮＡ配列に関する。

発明の背景 高められた温度、またはある種の化学物質にさらされた細胞はそのようなストレ スに応答して少数のタン／　Ｎ＋り質群の産生を増大する。

この細胞性の応答を“熱シ１．り応答”と称する。ストレスに応答して産生され るタンパク質を“熱ンヨ、クタン／　ｚＨり質”または“ＨＳ　Ｐ”と称する。

熱ンヨノク応答はユビキタスであると考えられており、それは真核性細胞と同様 、原核性細胞および生物にも観察されている（ヒトをも含む）。ストレスに応答 するこれらタンパク質か生産されないことは細胞の死に連り、組織および器官の 損傷に関連するので、この熱ンヨックタンパク質の産生は非常に重要である。熱 ンヨノクタンパク質はストレスの重篤性を軽減し、それにより、影響下にある細 胞を安静状態に復帰させる役割を担っていると考えられている。熱ンヨノク状況 に関する優れた総論がランクス［Ｌ　ａｎｋｓ、　Ｋ　、　Ｗ、。

Ｅｘｐｅｒ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　　１６：）　：　１−１０（１９８６）］ およびリンドキストＪＬ　１ｎｄＱｕｉｓｔ、　ｓ−＋　　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、　二５：１１５１−１１９１（１９８６）コによって出 された。

熱ンヨノクタンパク質は熱ショ／り現象におけるそれらの役割と無関係な、また は独立した機能をも有することが見出たされた。熱シヨツクタンパク質をフード する遺伝子（即ちｈｓｐ遺伝子）は胚発達期に差水次的に「ベンソードら（Ｂｅ ｎｓａｕｄｅ、Ｏ，）、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３０５：　３３１（１９８３） Ｅ、筋芽細胞細胞、胚＠瘍細胞および赤血球系細胞等の特殊な細胞の分化期間中 に［アトキンソン（Ａ　ｔｋｉｎｓｏｎ、　ＢＧ）、去＝ｑ旦に且角其、灸旦　 ６６６（１９８６）：アトキンソンら、　　Ｃａｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　　６１　：　４０４（１９８３）；モラングら（Ｍｏｒ ａｎｇｅ、Ｍ、　）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂ　ｉｏｌ、、　　４　： 　７３０　（１９８４）：シングら（Ｓ　ｉｎｇｈ、Ｍ、　Ｋ、）、　　Ｎａｔ ｕｒｅ、　　３０旦：６３１（１９８４）（発現されることが見出だされた。新 生物形質転換もまた熱シヨツクタンパク質の濃度の変化をもたらすＥランクス（ Ｌａｎｋｓ、Ｋ。

Ｗ、）、　　Ｅｘｐｅｒ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　　１炙−５：　１−１０（１ ９８６）］。

熱ショックタンパク質の遺伝子は高度に保存された５′配列を有し、それは“熱 ショ、クエレメンビまたは“ＨＳＥ”と称する回転対称性のコンセンサス配列を 含有する。熱シヨツク転写因子（“Ｈ３ＴＦ”または“ＨＳＥ”）はＨ３Ｅ配列 と結合すると共に、熱ンヨ・ツクタンパク質をコートする遺伝子の転写に加担す ると考えられるものと同定された［リンドキスト、　　Ａ　ｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　、　旦５：１１５］−１，１９１（１９８６）；バーカー ら（Ｐａｒｋｅｒ、Ｃ，Ｓ、）、　　Ｃｅｌユ、纂２８６　：　８５４−８６０ （１９８０１ウー（Ｗｕ、Ｃ，）、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３７　：　８４−８ ７（１９８５１１ｏ従って、この因子は個体の熱ンヨ。

り応答を調節および促進し得る。

このように、該因子および該因子を活性化する物質は熱ンヨノク応答に関連した 疾患の治療手段を提供するものである。それらの疾患に該因子を用いる、あるい はその活性を促進する物質を同定するのに十分な程、該因子は特性化されていな いので、これまで、それら疾患の基礎にＨ３Ｐ（またはそれらの物質）を用いた ことはながった。即ち、Ｈ３Ｐおよびその誘導体、アンタゴニスト（拮抗物質） 、およびアゴニスト（作動薬）を精製並びに生産する手段が望まれていた。

発明の罠杓 本発明は熱シヨツク因子に関し、さらにその誘導体、アンタゴニスト、アゴニス トに関する。本発明はまた、それら化合物を天然および組換え起源から生産およ び精製することにも関する。本発明はさらにそれら化合物の診断および治療への 適用に関す２る。

詳細には、本発明は実質上、天然の不純物を伴わない熱ンジ、り因子またはその 誘導体を含む化合物に関する。

本発明はまた、熱ショック因子または熱シヨツク因子を活性化する物質を含有す る治療用医薬に関する。

本発明はまた、熱シヨツク因子をコードする配列を含有する組換え核酸分子に関 する。

本発明はまた、ＤＮＡアフィニティークロマトグラフィーを含む工程で調製され た上記化合物に関する。

本発明はまた、熱シヨツク因子の精製法であって、該因子を含有すると考えられ る試料をＤＮＡアフィニティークロマトグラフィーに付すことからなる方法に関 する。

本発明はさらに、熱シヨツク応答に関連する疾患を治療する方法であって、その ような治療を必要とする個体に有効量の活性化熱シヨツク因子または熱シ＝１． ／り因子を活性化する物質を投与することからなる方法に関する。

また、本発明は患者のストレス状況を診断する方法であって、活性イヒ熱ショッ ク因子の存在を分析することを含む方法に関する。

好ましい態様の記載 熱シヨツク応答 本発明の一部は、外部環境の変化に対するヒト細胞の応答の研究から導かれた。

ヒト細胞は種々の環境の変化に対し、適当な遺伝子群の協調的な刺激、しばしば 転写因子の調節プロモータ一部位への配列−特異的結合を介して応答する［サー フリングら（Ｓ　ｅｒｆｌｉｎｇ。

Ｅ、）、　　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔ、、　　上：　２２４（１９８５ ）：マノフナイトろ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ、）、　Ｃｅ１ｌ、　　４６　：　 ７９５（１９８６）：マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）、　　５ｃｉ ｅｒＨｃｅ、　　２３６　：　ｔ　２３７（１９８７）］。

ある場合には、ヒト遺伝子の協調的な調節は既存の転写因子をプロモーターの調 節要素に結合し得る形・＼変化させることに関するよう；ヘイニスら（Ｈａｙｅ ｓ、　Ｔ、　Ｅ、）、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ’ｃｉ、　 Ｕ　Ｓ　Ａ。

旦：　１２７２（１９８７）；キングストンら（Ｋ　ｉｎｇｓｔｏｎ、　Ｒ，Ｅ 、）。

Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　　７　：　１５３０（１９８７）；ジ マリーノら（Ｚｉｍａｒｉｎｏ、Ｖ、）、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３２ヱ：　７ ２７（１９８７）コ。このＤＮＡ結合能力の変化を起こす生化学的変化に関して は殆ど知られていない。これらの変化は明らかに環境シグナルの形質導入と、適 切な応答との基本的な連鎖：特異的な遺伝子群の誘導、である。従って、多くの 調節経路を理解する上で、転写因子の結合を誘導し得る機構を決定することは必 須である。

環境シグナルは哺乳類の幾つかの転写調節因子のＤＮＡ結合能力に、躬訳後変化 をもたらす。原核性生物系では環境シグナルはＤＮＡ−結合調節タンパク質のり ん酸化を導き得る。例えば、ｎｔｒＢ産物は窒素制限下でＮ　ｔｒｃタンパク質 をりん酸化し、ＮｔｒＣを活性化する。同様に、酵母Ｈ３Ｆは熱に応答してりん 酸化される。

上記のごとく、細菌からヒトにおよぶ生物で起きる熱ショックはを誘導する。こ れらの遺伝子の転写は“熱／ヨノク因子”ぐ“ＨＳＦ”）によって調節されてい る。通常、ＨＳＦは活動していない細胞においてさえ、低レベルで生産されてい る。ストレスに対する応答に際し、細胞内のＨ３Ｆ濃度が上昇し、活性形に変化 する。活性形Ｈ３ＦはＨ３Ｅ配列と結合し、それにより熱ンヨ、クタンパク質を コードする遺伝子の転写を促進し得る。このように、熱ンヨノク応答は協調的な 遺伝子調節の１例である。

ヒト細胞が４３°Ｃに加熱されると各プロモーターの上流にある回文性熱ンヨノ クエレメント（ＨＳ　Ｅ　）［ペルハムら（Ｐ　ｅｌｈａｍ、　Ｈ、ＲＪ、）、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３　：　６２９（１９８６ ）］を通して、熱ンヨ、り遺伝子の転写が刺激されることが分かった［す４；フ レイブ（Ｃｒａｉｇ、Ｅ、Ａ、）、　ＣＲＣＣｉｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、上ショウジヨウバエにおいて、ＨＳＦのＨ３Ｅへの結合で、直接、転写が刺激 されることが認められ、他の生物においても同様に熱シヨツク遺伝子の発現が刺 激されると考えられるＥキングストンら（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ　Ｒ、Ｅ　、　）、 　ＭｏｌＣｅｌｌ、Ｂ１０）１．７　：　１５３０（１９８７）；ウー、Ｎａｔ ｕｒｅ、３０９　：　２２９（１９８’４）：バーカーら、　Ｃｅｌユ、纂ｃｈ ｔ、　Ｇ、　）、　Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ、　Ｂ　ｉｏｌ、　、　　７　：　１１ ２９（１９８７）：ライ−は、ショウジヨウバエおよびヒト細胞において、転写 後の機構によ７）］。

ある因子に対する、熱シヨツク遺伝子のＨ３Ｅへの結合能力の誘導は、ショウジ ヨウバエおよびヒト細胞における熱シヨツク応答のコントロールに集中している と思われる。無傷の細胞とほぼ同様の温度状況で、細胞質抽出物において結合か 誘導されることから、結合能力の誘導は温度に対する直接応答である。この結合 能力における変化は細胞を加熱したときに起きる、単なるＨ　Ｓ　Ｆの変化では ない。加熱された細胞のＨＳＦはインビトロで活性化されたＨＳＦよりも有意に 多くりん酸化されている。ヒト細胞内でＨＳＦは少なくとも２段階を経て活性化 される。即ち、結合能力の誘導、次いでりん酸化である。細胞質抽出物を加熱す るとこれらの工程の最初の工程のみか再生され、見掛は上、低分子量の因子が得 られる。この推定のりん酸化事象はＨＳＦの転写活性化機能を増大するか、ＨＳ Ｆの機能にとって重要な他の幾つかの特性を変化させるもしれない。

要約すると、ＨＳＦは細胞が熱またはストレスにさらされることにより活性化さ れて炉」遺伝子の転写促進を仲介し、そのことにより熱ンヨノクタンパク質の細 胞内濃度を上昇させる転写因子である。

熱シヨツクタンパク質はストレスの悪影響を軽減する作用を有する。

ＨＳＦの精製 活性化Ｈ３ＦはＨｅｌ、ａ細胞から好適に精製されるが、精製目的には他のヒト 細胞を用いることもてきる。適当な培養培地、好ましくは血清を補充した最少必 須培地（Ｊｏｋｌｉｋの改良培地）に細胞を培養する。所望の細胞濃度に達した 後、収穫し、核抽出物の調製に用いた。そのような抽出物はデイグナムらＥＤｉ ｇｎａｍ、Ｄ、、　Ｎｕｃｌ、Ａｃｉｄｓ−ドμｍ、↓１　：　１４７５（１９ ８３：Ｂの方法で調製される。

次いて核抽出物を２本鎖ＤＮＡ−セルロースカラムに通す。結合した物質を０． ３Ｍ　ＫＣｆ２を用いる段階的溶離てカラムから溶出させる。Ｈ３Ｆ活性の測定 は、キングストンら［Ｋ　ｉｎｇｓｔｏｎ　Ｒ，Ｅ、。

＼眼り月−Ｂ　ｉｏｌユ、工：　１．５３０（１９８７）］のゲル電気泳動アッ セイによって行うことが好ましい。ＨＳＦ活性を含有する画分を分取し、以下の 精製に備える。

２本鎖ＤＮＡアフィニティーカラムは、配列５°−ＧＡＴＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴ ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧ　−３゜て示される自己相補的、Ｈ３Ｅ含有の ２８塩基オリゴヌクレオチドのコンカテマーを用いて調製することが好ましい。

そのようなカラムの調製はカドナガらＣＫ　ａｄｏｎａｇａ、　　Ｐ　ｒｏｃ、 　Ｎ　ａｔ　Ｉ、Δｃａｄユ且ａユ膓ジＡ、灸旦　５８８９（１９８６との方法 に従って行うことか好ましい。好ましくは、臭化シアンを用いてオリゴヌクレオ チドをセファロースＣＬ−２Ｂ（ファルマンア）に共有結合によって結合させ、 アフィニティーカラムを調製する。

分取したＨ３’Ｆ含有画分を次いで、上記の特定配列に関する２本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ アフィニティーカラムに適用する。活性化Ｈ３Ｆはカラムに結合し０．７５ＭＫ Ｃρ塩洗浄てカ予洗浄ら溶出する。Ｈ３Ｆ活性を示す画分を以後の精製のために 分取する。

次いで、分取した画分を好ましくは０．１ＭＫＣｉ７で希釈し、ＭｏＮｏ　Ｑ　 ＦＰＬＣ力５ム（７アルマンア）に適用する。結合した物質を好ましくは線状Ｋ Ｃρグラジエン１−（０，１→１．ＯＭ）で溶離する。Ｈ３Ｆ活性を好ましくは 上記の方法で分析し活性画分を分取する。Ｈ３Ｆ活性は、０１→０．６Ｍ　ＫＣ （２でカラムがら溶出する。

上記方法を用い、ＤＮＡと結合し得る活性化Ｈ３Ｆを単離、精製することができ る。

ＨＳＦおよびその機能的な誘導体、アゴニストおよびアンタゴニスト 本発明は活性化熱シヨツク因子（“ＨＳＦ”）、該因子の治療的フラグメント、 並びに機能的誘導体、および該因子のアゴニストおよびアンタゴニストに関する 。特に、本発明はＨＳＦを活性化して活性形にすることができる物質に関する。

ＨＳＦの“機能的誘導体”とは、ＨＳＦの生物学的活性と実質上、同様の生物学 的活性（機能上または構造上）を有する物質を指す。

“機能的誘導体”という語句は、分子の“フラグメント（断片）”、“変異体” 、“同族体”または“化学的誘導体”を包含することを意図している。ＨＳＦ等 の分子の“フラグメントとは分子のあらゆるペプチドサブセットを意味する。Ｈ ＳＦ等の分子の“変異体”とは分子全体またはそのフラグメントと実質上、構造 および機能が同様である分子を意味する。２分子が実質上、同様の構造を有する が、２分子が同様の生物学的活性を有するとき、ある分子は他の分子と“実質」 二同様”であるとされる。従って、２分子が同様の活性を有する場合には、たと え１方の分子の構造が他の分子には見いたされなｔＢものであったり、アミノ酸 残基配列が同一でなくとも、上記の本明細書中の語句を用いて変異体と考えられ る。ＨＳＦ等の分子の“同族体”とは、機能は実質上同様であるか、構造は分子 全体またはそのフラグメントのいずれかにおいても同様でない分子を指す。本明 細書中、ある分子が正常分子の部分ではない、付加的な化学部分を有する場合、 他の分子の“化学的誘導体”であると言う。そのような部分は、分子の溶解性、 吸収性、生物学的半減期等の改善に寄与するものであり得る。そのような部分は また分子の毒性を減少し、分子の望ましくない副作用を、それが何であれ、消滅 させるものであってもよい。そのような効果をもたろし得る部分はレミングトン の基旦字（１９８０）に記載されている。それらの部分を分子に結合させる方法 は当業者にとって周知である。

ＨＳＦの“アンタゴニストとは、ＨＳ　Ｆの機能を阻害し得る物質を指す。その ようなアンタゴニスト（ｊ免疫グロブリン（例えば、モノクローナルまたはポリ クローナル抗体、そのような抗体の活性フラグメント）であってよい。本発明の アンタゴニストは非−免疫グロブリン化合物（ポリペプチド、有機化合物等）を 含む。

活性化Ｈ３Ｆと結合し、得るポリクローナル抗体は哺乳類を活性化Ｈ５Ｆ製品ま たは機能的なＨＳＦ誘導体製品によって免疫することで調製することができる。

そのような免疫の実施方法は当業者に周知である。特定の生物学的試料中の活性 化Ｈ３Ｆの存在（または量）の分析に、モノクローナル抗体（またはそのフラグ メント）も用い得る。そのような抗体は牌細胞を活性化Ｈ３Ｆで免疫することに より上記の方法に加えて、抗−イディオタイプ抗体を用いる２工程によっても活 性化Ｈ８Ｆと結合し得る抗体を産生ずることができる。

そのような方法は、抗体そのものが抗原であり、それ故、第２抗体と結合し得る 抗体を得ることができるという事実を利用している。

この方法によれば、活性化Ｈ３Ｆと結合し得る抗体を用いて動物を免疫する。次 いで、そのような動物の牌細胞を用い、ノ＼イブリドーマ細胞を製し、このハイ ブリドーマ細胞をスクリーニングして、抗−活性化Ｈ３Ｆ抗体と結合する能力が 活性化Ｈ５Ｆタンパク質によって特異的に阻害される抗体を産生ずるクローンを 同定する。そのような抗体は抗−Ｈ３Ｆ抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を 含んでいた。そのような抗体を用いて動物を免疫し、活性化Ｈ５Ｆと結合し得る 抗体の形成を促進することができる。

他のＨＳＦ（またはＨＳＦの機能的な誘導体）を対象に与える外に、ＨＳＦアゴ ニストを対象に投与することで対象内でのＨＳＦの効果を増大することができる 。本発明はまた、そのようなＨ３Ｆアゴニストを提供するものである。Ｈ８Ｆア ゴニストは、ＨＳＦの作用効果を増大し得る限り、いかなる化合物であってもよ い。アゴニストの例には、対象によるＨＳＦ産生を促進する物質、既に存在する ＨＳＦの活性を高める物質等が含まれる。既存のＨＳＦの活性化を促進する物質 が好ましいアゴニストであり、本発明の治療用物質である。

ＨＳＦまたはＨＳＦの活性化を促進する物質は組換えＤＮＡ技術を用いて合成す るか、タンパク分解的に得ることができる。そのような物質の治療上の利点は、 幾つかの物質を併用投与することで増大され得る。本発明は、１．２、またはそ れ以上のアミノ酸残基を欠く、あるいは異なるアミノ酸残基を含有している機能 的なＨ３Ｆ誘導体であって、それが熱シ：Ｉ／り応答に対して影響を及ぼす能力 を有する限り、そのような誘導体も発明の範囲に包含することを意図している。

本発明の化合物は、それを含有する標品がこれらの生産物に通常、および天然で 伴なっている物質を実質上、含有しない時には、“実質上、天然の不純物を含有 しない”と表す。

Ｈ３Ｆ調製法 本発明の熱シヨツク因子は天然工程（例えばヒトまたは動物細胞のＨＳＦ産生を 誘導する）；合成法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのポリペプチド合成法を用 いてＨＳＦ、機能的なＨ３Ｆ誘導体、またはＨＳＦのアゴニストまたはアンタゴ ニスト（免疫グロブリンまたは非−免疫グロブリン）を合成する）；あるいは組 換え技術の適用（例え（ｆ１本発明のＨＳＦを多様な宿主（即ち、酵母、細菌、 真菌、培養哺乳類細胞等）で生産するか、組換えプラスミドまたはウィルスベク ターを用いて生産する））ことにより得られる。いずれの方法を選択するかは、 便宜性、所望の収量等の因子による。ＨＳＦの生産１；１マ、上記した方法、工 程、または技術の１つのみ用いることを必要としない。上記の工程、方法および 技術をＨＳＦの製造のために組み合わせることができる。あらかじめ活性化され たＨＳＦをコードする遺伝子またはＣＤＮＡ配列をクローニングし、発現させる ことが好ましいＨ３Ｆ調製法である。そのような遺伝子ＣＤＮＡ配列を以後、“ ＨＳＦ遺伝子”または“Ｈ３ＦｃＤＮＡ配列”と称する。

Ｈ３Ｆ遺伝子（または、同等に、ＨＳＦをコードするＣＤＮＡ配列）をクローニ ングするには、様々な方法のいずれを用いても良い。そのような方法の１つでは ｃＤＮＡ挿入体（Ｈ３Ｆ発現ベクターから導かれた）のシャトルベクターライブ ラリーをＨ３Ｆ遺伝子またはＣＤＮＡ配列に関して分析することを含む。そのよ うな分析は細胞をベクターで形質転換し、ＨＳＦの発現に関して分析することに より行われる。

この遺伝子のクローニングでは、Ｈ３Ｆ分子のアミノ酸配列を決定することが好 ましい。この作業を行うには、上記のごと＜Ｈ３Ｆタンパク質を精製し自動配列 決定機で分析する。または分子を臭化／アン、またはプロテアーゼ類、例えばパ パイン、キモトリプシンまたはトリプシン、好ましくはトリプシンで断片化して もよい［第１、て１：２０９−２１５（１９８３）Ｅ。ＨＳＦの全アミノ酸配列 を決定することは可能であるが、分子のペプチドフラグメントの配列を決定する ことが好ましい。ペプチドの大きさが１０アミノ酸長さ以上であれば、通常、Ｈ ３Ｆ遺伝子等の遺伝子（またはＨ３Ｆ遺伝子のｃＤＮＡ遺伝子配列）のクローニ ングに十分な配列情報が得られる。

１またはそれ以上の適当なペプチドフラグメントの配列が決定されれば、それら をコートし得るＤＮＡを調へることかできる。遺伝コードには縮重かあるので、 特定のアミノ酸をコードするのに用いｃ、、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ＣＡ（１９ ７７）、３５６−３５７頁］。ペプチドフラグメントを分析して最低の縮重間を 有するオリゴヌクレオチドによってツー１−されていると思われるアミノ酸配列 を同定する。

これは、ただ１個のコドンによってコードされているアミノ酸類を含有する配列 を同定することにより好適に行われる。そのようなアミノ酸配列は唯一のオリゴ ヌクレオチドによってコードされていることもあるか、アミノ酸配列は同様の１ セツトのオリゴヌクレオチドのいずれかでコードされていていることも多い。重 要なのは、そのセットの全メンバーがペプチドフラグメントをコードし得るオリ ゴヌクレオチドを含有しており、ペプチドフラグメントをコードする遺伝子配列 として同じヌクレオチド配列を含有している可能性があるが、この遺伝子配列の ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有しているのはその内の１つの みだということである。これがセットに含まれており、しかもこのセットの他の メンバーの存在下でもＤＮＡとハイブリダイズし得るので、分画されていないオ リゴヌクレオチドセットを、単一のオリゴヌクレオチドでペプチドをコートする 遺伝子（またはｃＤＮＡ配列）をクローンすると同様の方法で用いることができ るのである。

上記と全く同様の方法で、ペプチドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオ チドまたは配列セントに相補的なオリゴヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレ オチドセット）を用いることができる。

Ｈ８Ｆ遺伝子のフラグメントをコードし得る適当なオリゴヌクレオチド、または オリゴヌクレオチドセット（あるいはそのようなオリゴヌクレオチド、またはオ リゴヌクレオチドセットに相補的なもの）を同定しく上記の方法を用いて）、合 成し、当業者既知の方法でＤ　Ｎ　Ａ、より好ましくはＨ３Ｆ遺伝子配列を発現 し得るヒト細胞から導かれたｃＤＮＡ製品とハイブリダイズさせる。核酸ハイブ リダＮＹ（１９８２）］およびヘイムスＶＬＨａｙｍｅｓ、　Ｂ　、　Ｄ　、　 、上！！　：、　Ｎｕｃｊｅｊｃ　−ノ５ｃｉｄ　　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ ｎ、　　、ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃａ↓−！〜ｐｐｒｏａｃｈ、　　　Ｉ　　ＲＬ 　　Ｐｒｅｓｓ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ　Ｃ（１９８５）］によって示された。Ｄ　Ｎ　Ａ またはｃＤＮＡの起源はＨ３Ｆ配列に富むものが好ましい。そのような富裕化は 、ＨＳＦの合成を刺激するような条件下で培養した細胞からＲＮＡを抽出するこ とによって得られるｃＤＮＡを用いることにより容易に得られる。

上記の方法または同様の方法でヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［スーら（Ｈｓ ｕ、Ｌ、Ｃ，）、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１名： ３７７１−３７７５（１９８５）］、フィブロネクチン［スズキら（Ｓｕｚｕｋ ｉ、　Ｓ　、　）、　　Ｅ　ｕｒ、　Ｍｏ１一旦ｉ蛙コヒｕＬ見、、　　４　： 　２５１９−２５２４（１９８５）Ｅ、ヒトニストロジエンレセプター遺伝子［ ウオルターら（Ｗａｉｔｅｒ、　Ｐ、）、　　Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　８２　：　７８８９−７８９３（１９８５）］、組織型プ ラスミノゲン活性化因子［ベニ力ら（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、）、　　Ｎａｔｕｒ ｅ、　　３０１−：　２１４−２２　］（１９８［カムら（Ｋａｍ、Ｗ、）、　 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、５ｃｉＪ７ＳＡ、１名：８７１５−８７１９ （１９８５）］をフツーする遺伝子が成功裏にクローニングされた。

ＨＳ　Ｆ遺伝子配列クローニング法の好ましい変法では、ＤＮＡまたはＨ３Ｐを 発現し得る細胞から得たｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングして発現ベクタ ーライブラリーを調製する。次いて、ライブラリーを抗Ｈ３Ｆ抗体と結合するタ ンパク質を発現し、Ｈ３ＰまたはＨ３Ｆフラグメントと同じアミノ酸配列を有す るポリペプチドをコードし得るヌクレオチド配列を有するメンバーに関してスク リーニングする。

上記の方法で得られたクローン化Ｈ３Ｆ遺伝子を操作可能に発現ベクターに結合 させ、細菌または真核性細胞に導入し、Ｈ３Ｆタンパク質を産生ずることができ る。そのような操作方法はマニアティス（前ｔｌ）によって示されており、当業 者に周知である。

Ｈ３Ｐ、その機能的誘導体、アコニストおよびアンタゴニストの使用 Ａ９診断的使用 本発明化合物は器官または組織、あるいは器官または組織の抽出物または切片に おけるストレスの存在を診断するのに使用できる。

また、本発明化合物は、細胞また細胞抽出物中のストレスのレベルを診断するの に使用できる。そのような診断実施能力は、特に、器官または組織移植あるいは 置換治療における器官（例えば、腎臓、肝臓、心臓等）または組織（皮膚、骨髄 等）の適合性の評価において望ましい。

特定の生物学的試料中のストレスの存在またはストレスのレベルは試料中に存在 する活性化ＨＳＦの同定または量の測定によって行われる。このためには試料中 の活性化Ｈ３Ｆを同定（または定量）し得る任意の方法が用い得る。しかしなが ら、活性化Ｈ３Ｆと結合し得る抗体、特に、モノクローナル抗体（またはポリク ローナルまたはモノクローナル抗体のフラグメント）を用いて活性化Ｈ３Ｆを分 析することが好ましい。

活性化Ｈ３Ｆの診断分析はイメージングアッセイ（例えば、全身または器官イメ ージング）を含んでいるか、あるいは細胞の、または組織または器官切片の、生 検またはインシトウ（ｉｎ　５ｉｔｏ）アッセイを含んでいることもある。上記 のごとく、そのようなでノセイは器官、組織、細胞などの細胞上抽出物に関して 行われ得る。

本発明の抗体（またはそのフラグメント）はそれらを溶液相に含有する、または 固相担体に結合させて用いるイムノア、セイに使用するのに好適である。

抗体またはそのフラグメントを櫟識法で用いられている様々なラベルの内、任意 のものを用いて標識することができる。本発明に用い得るラベル型の例として、 酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識および化学発光性 標識を挙げることができるが、これらに限定されない。

適当な酵素標識の例にはマレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌク レアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナ ーゼ、アルファーグリセロール・ホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホ スフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパ ラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、リボヌクレ アーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ ーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が含まれる。

適当な放射性同位体標識の例には、３）（、＋１１ｉｎ、１２５１、＋３１１． ３”　Ｐ　１”　Ｓ　％　”　Ｃ−、５１Ｃ！’ｘ　５７Ｔ　０％　”　Ｃ０％ 　”　Ｆ　ｅｓ　７５Ｓ　ｅｚ　ｌ５ｔＥ　ｕｓ”Ｙ、”Ｃｕ、”’ＣｉＳ”’ Ａｔｓ　”Ｐｂ、　４７Ｓｃ、””Ｐｄ等が含まれる。１′１は好ましい同位体 である。これを使用すると、＋ｔｓＩまたは′３１Ｉ標識、モノクローナル抗体 における肝臓での脱ハロゲン化を避けることができるので、実質的に有利である 。さらに、このラジオヌクレオチドはイメージングにおいてより好都合なガンマ 線数適当な非放射性同位体標識の例には、１５７Ｇｄ、”　Ｍ　ｎ、ＩＳ！ｌ） 、、　５ｔ７ｒ、５＠Ｆｅ、適当な蛍光性標識の例には＋５″Ｅｕ標識、フルオ レスセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン ＩＬフィコシアニン標識、アロフィコンアニンＬｔ識、０−フタルアルデヒド標 識、フルオレサミン標識等か含まれる。

化学発光物質標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香性アク リジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリンニウム塩標識、オキサレ ートエステル標識、ルシフェリン標識、エクオリン標識等が含まれる。

当業者は、本発明に用い得る他の適当な標識を知っているであろう。これら標識 と抗体またはそのフラグメントとの結合は当該技術分野によく知られた一般的手 法を用いて行うことか出来る。代表的な方法はケ不ティーＪＫｅｎｎｅｄｙ、　 Ｊ　、　Ｈ，、Ｃｆｉｎ、　Ｃｈｉｔ　φＡ粋、　　７０後者の文献記載のカッ プリング法はグルタルアルテヒト法、ベルアイオテー＋４、シマレイミド法、ｍ −マレイミドヘン／ルーＮ−ヒドロキシースクンンイミドエステル法であり、本 明細書において引用している。

本発明の抗体（または抗体フラグメント）の検出は担体を用いることで改善され る。周知の担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、 テキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリ ルアミド、アガロース、マグネタイトなどが含まれる。本発明目的から、用いる 担体はある程度可溶から不溶性の性質を有する。支持体は、実際上、カップリン グした分子かＨＳＦに結合するかぎり、取り得る立体配置構造のいずれであって もよい。即ち、支持体の立体配置はビーズの場合の球形、試験管の内側のような 円筒形、またはロフトの外表面等であってよい。あるいは、シート、テストスト リップ等のようにフラットであってもよい。当業者は、モノクローナル抗体を結 合させる上で適当な他の担体について知っており、あるいは日常的な実験で同様 のものを確認することかできる。

本発明の抗体または抗体フラグメントは、定量的または定性的に活性化Ｈ５Ｆを 検出するのに有用である。そのような検出は種々のイムノアッセイの内、任意の ものを用いて行う口とができる。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射活 性に標識し、ラジオイムノアッセイで活性化ＨＳ　Ｆを検出することかできる。

活性化Ｈ３Ｆは、ＨＳＥ含有ＤＮＡとの結合能力に関して、“ブレ（未）活性化 ”ＨＳＦと識別することかできる。試料中に存在するそのような活性化Ｈ３Ｆの 量はラジオイム／アッセイを用いて測定し得る。う／オイムノアノセイ（ＲＩＡ ）に関する優れた論文がワークら＋ＩＷｏｒｋ、　Ｔ　。

Ｓ、、　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｃｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍｏ！ｅｃｕｌａｒ」Ｌ掩１ｏｇｙ、　Ｎｏｒｔｈ　 Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ＮＹ（１９７８） ］に見られ、とりわけ、チャード、Ｔ執筆の“ラジオイムノアッセイおよび関連 技術への導入”という標題を付した章に示されている。

本発明の抗体または抗体フラグメントは“２部位”または“サンドイッチ”アッ セイと称するイムノメトリックアッセイにも適用可能である。代表的なイム／メ トリ、クアノセイにおいては、ある量の非標識抗体（または抗体フラグメント） を被検溶液（例えば、血液、リンパ、液状化糞便、組織ホモンネート、細胞抽出 物等）に不溶性の固体支持体に結合させ、検出可能に標識した可溶性抗体を加え て固相抗体、活性化Ｈ３Ｆ、および標識抗体の３重複合体を検出および／または 定量する。

代表的なイムノメトリックアッセイには“類アッセイ”がある。このアッセイで は固相に結合した抗体をまず被検試料と接触させ、固相抗体−Ｈ３Ｆ２成分複合 体を形成させることにより試料から活性化ＨＳＦを抽出する。適当なインキュベ ーション時間の後、固相を洗浄して液体試料中に存在し得る、未反応抗原をも含 む残渣を除去し、未知量の標識抗体（これは“リポータ−分子”として働く）を 含有する溶液を接触させる。非標識抗体を介して固相に結合している活性化Ｈ３ Ｆと標識抗体とがコンプレックスを形成する第２のインキュベーション期間の経 過後、固相を再洗浄して未反応の標識抗体を除去する。この順型サンドイッチア ッセイは活性化Ｈ３Ｆが存在するか否かを単純に決定するイエス／ノーアッセイ か、あるいは標識抗体の測定を既知量のＨＳＦを含有する標準試料から得られた 測定値と比較して定量するものであろう。そのような″２部位”または“サンド イッチ”アッセイはワイドらのラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉ。

ｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｍｅｔｈｏｄ）の１９９−２０６頁に記載されてい る。

本発明の活性化Ｈ３Ｆの分析に宵用な他の型の“サンドイッチ”アッセイはいわ ゆる“同時”および“逆”アッセイである。同時アッセイでは、インキュベーシ ョン工程は一回のみであり、固体支持体に抗体を結合させる時に標識抗体をも被 検試料と一緒に加える。インキ二ベーションが完了した後、固体支持体を洗浄し て液体試料中の残渣と複合体を形成しなかった標識抗体とを除去する。固体支持 体と結合した標識抗体を通常の“順”サンドイッチアッセイにおけあると同様に して決定する。

“逆”アッセイでは、標識抗体の溶液を液体試料に段階的に加え、適当なインキ ュベーション期間を用いた後、固体支持体と結合した非標識抗体を加える。２回 目のインキュベーンヨンの後、常法に従って固相を洗浄し、被検試料の残渣と未 反応の標識抗体とを除去する。

次いで、固相に結合した標識抗体を、“順”および“同時”サントイ。

チアッセイにおけると同様にして決定する。

上記のごと＜、Ｈ３Ｐのイムノメトリックアッセイには“リポータ−分子”で標 識された特定の結合性分子を必要とする。これらリポータ−分子またはラベルは 上で明らかにしたように従来からあり、当業者周知である。本発明の実施におい ては酵素標識が好ましい態様である。考えられるかぎりのあらゆるイムノメトリ ックアッセイに、標識として用いられる理想的な単一酵素はない。むしろ、特定 のアッセイ系に適当な酵素を決定する必要がある。酵素選択に重要な判定基準は 純化酵素のターンオーバー数（回転数）（単位時間あたりに酵素部位ごとに生成 物に変換される基質分子の数）、酵素製品の純度、その生成物の検出感度、酵素 反応の検出の容易さおよび速度、干渉因子または被検溶液中の酵素様活性の非存 在、酵素およびその抱合体の安定性、酵素およびその抱合体の入手容易性および 価格等である。本発明のイムノメトリックアッセイに用いるのに標識として用い るのに好適な酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラ クトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコアミラーゼ、マレ ニートデヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー ゼである。より好ましい酵素１ｍとしてウレアーゼがあり、色素産生性ｐＨイン ジケーターでその活性を肉眼で容易に観察することかできるので特に好ましい。

Ｂ、Ｈ３Ｐを活性化する物質の検出における本発明化合物の使用数に論じたよう に、細胞中の活性化Ｈ３Ｆの存在が熱ショックや他のストレス性状況下で細胞を 生存させる。従って、Ｈ３Ｐを活性化し得る物質、または天然のＨ３Ｆ活性化を 刺激または促進し得る物質が非常に望ましい。そのような物質を用いて細胞の死 滅を阻止する（即ち、器官、組織等を受容者に移植するための調整期間中にそれ らが死に至ることを防ぐ）か、ストレス状況下の個体であって、彼自身の固有の Ｈ３Ｆ活性化能力が、障害または死亡を免れるには不十分であるような個体を治 療することができる。

Ｈ３Ｐを活性化する物質は以下の方法で同定することができる。

Ｈ３Ｐを、適当量の、Ｈ３Ｆ活性化能力が決定されている物質の存在下でインキ ユベートする。インキュベーション混合物はＨ３Ｐの活性化が起きるのに必要な 酵素、補酵素、補助因子等を含有する。

好ましくは、そのようなインキュベーション混合物は哺乳類細胞の細胞抽出物か らなる。適当期間インキュベーションした後、インキュベーション混合物中のＨ ３ＰのＤＮＡとの結合能力を試験する。Ｈ３Ｐは活性化された場合にのみＤＮＡ と結合するので、ＤＮＡと結合したＨ３Ｐの存在（またはＤＮＡと結合したＨ３ Ｐ量の増加）は分析した物質がインキュベーション混合物中のＨ３Ｐを活性化し 得るということを示唆するものである。そのような物質の同定がなされたら、化 学的または生物学的な日常的手法でその構造を決定することができる。そのよう な活性化物質に関する上記分析は多数の潜在的な医薬物質をスクリーニングする のに特に適用される。

Ｃ０治療的用途 対象（ヒトまたは動物）におけるＨ３Ｆレベルを増大する物質は熱シヨツクスト レス応答に関連したあらゆる疾患の治療に用いることができる。上記のごとく、 熱シトンク応答は生物が種々のストレスに応答するのに用いる、極めて高度に進 化した保存的経路である。

これらストレスには低酸素およびエタノールも含まれる。

低酸素の病態生理学的現象は十分に議論されている。低酸素は心筋および脳梗塞 の両者の直接原因となる機構である。従って、ヒトまたは動物か低酸素発作に、 よりうまく応答することができれば、永久的な損傷がより少ないままに生き残り 得る可能性がある。心筋梗塞サイズの制限は患者の生存に直接的な影響を及ぼし た。従って、対象中での活性化ＨＳＦレベルを増大する物質は、そのようなスト レスの潜在化に有用である。そのような治療はまた、エタノール過剰摂取による 代謝障害を制限する能力により、エタノール誘発ストレスの治療にも価値かある 。

受容患者にＨ３Ｐと結合し得る抗体またはそのフラグメントを投与する場合、Ｈ ３Ｐ（またはそのフラグメント、変異体、または誘導体）、あるいはＨ３Ｐの活 性化を促進する物質を投与する場合、投与する物質の量は患者の年令、体重、身 長、性、全身の健康状態、以前の病歴等の因子によって変化する。一般に、患者 に抗体を投与する場合、患者の体重あたり約１ｐｇ／ｋｇから１０　ｍｇ／　ｋ ｇの範囲の用量で投与することか望ましいか、それ以上または以下の投与量ても よい。上記化合物を患者に投与する場合、そのような化合物を患者の体重あたり 約１　ｐｇ／　ｋｇから１．　Ｏｍｇ／　ｋｇの範囲の用量で投与することか望 ましいが、それ以上または以下の投与量でもよい。

本発明化合物は、静脈内、筋肉内、皮下、腸内、または非経口的に患者に投与さ れ得る。そのような化合物を注射によって投与する場合、連続注入、または−回 または多数回のポーラス注入で行われるであろう。

本発明化合物は受容対象に熱ンユソク応答を起こさせるに充分な量、投与するこ とを意図する。ある物質の投与量、投与経路等がそのような応答に影響するのに 充分であるとき、ある量を熱シヨツク応答を“起こさせる”に充分な量と言う。

本発明化合物は、ストレスによる症状の発現前（そのような状況から予期される 損傷を抑制するため）、または症状発現後に与えることができる。

ある組成物は、受容患者がその投与に耐え得るとき、“薬学的に許容し得る”と される。そのような物質は、投与した量が薬学的に有意であれば、“治療有効量 ”であると言う。もしもある物質の存在か患者の生理学に検出可能な変化をもた らす場合、それは生理学的に有意であるという。

本発明化合物は、これら物質またはその機能的な誘導体を薬学的に許容し得る担 体ビヒクルと混合することからなる、薬学的に有用な組成物の調製法に従って調 製することができる。池のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンをも含め て、適当なビヒクルがレミントンの薬科学［第１６版、オソール（Ｏｓｏｌ、Ａ 、）ｉ、　Ｍａｃｋ、　　Ｅａｓｔｏｎ　Ｐ　Ａ（１９８０）］に記載されてい る。有効な投与のために適した薬学的に許容し得る組成物を調製するためには、 そのような組成物は有効量の上記化合物と適当量の担体ビヒクルとを含有するで あろう。

作用持続期間のコントロールのためにさらに薬学的な方法が用いられる。フント ロールリリース（放出制御）製剤は化合物と複合体を形成するか、化合物を吸収 するポリマーを用いて得られる。制御されたテリバリーは適当な高分子（例えば 、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセ テート、メチルセルロース、カルボキンメチルセルロース、プロタミン硫酸塩等 ）の選択、高分子の濃度および放出制御のための導入法を選択することで行われ る得る。放出制御製剤による他の可能な作用持続化法は、ポリエステル、ポリア ミノ酸、ハイドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレンビニルアセテート共重合 体の粒子に本発明化合物を導入することである。あるいは、これらの物質を高分 子粒子に導入するかわりに、これらの物質をコアセルベーション法または界面重 合で調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキンメチルセルロ ースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセル、あるいはコロイド状薬 物デリバリ−システム、例えばりポゾーム、アルブミンミクロスフェア−、マイ クロエマルジョン、ナノ粒子、オよびナノカプセルまたはマクロエマルジョンに 捕獲（エントラップ）することができる。そのような方法はレミントンの薬科学 （１９８０）に記載されている。

以上、本発明を総合的に記載したが、本発明は以下の実施例により一層よく理解 されるてあろう。これらの実施例は例示にすぎず、特に明記しないかぎり、本発 明を制限することを意図しない。

実施例１　熱ンヨノク因子の分析 １（ＳＥと結合するヒトＨ３Ｆは非−変性ポリアクリルアミドゲル上で特徴ある 移動度て泳動する［キングストンら、　Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ、　Ｂ　ｉ。

１、．７　：　１　：１５３０（１９８７）；ンーガーら、　　Ｎａｔｕｒｅ、 　　３２９　：　８１（１９８７）］。４３°Ｃで増殖しているＨｅ１ａ細胞の 核抽出物は３７°Ｃて増殖するＨ　ｅｌａ細胞から得た核抽出物のそれよりも有 意に高い結合活性を含有している。この誘導の研究用インビトロ系を開発するた めに、３７°Ｃで培養したＨｅ１ａ細胞の核および細胞質抽出物を調製した［デ ィグナムら（Ｄｉｇｎａｍ、Ｄ、）、　　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　 　１１１４７５（１９８３）Ｅ。これらの抽出物を４３°Ｃで１時間加熱し、バ ンド保持法によってＨ８Ｅ結合活性のレベルを測定した。

３７°Ｃで増殖する４ＬのＨｅｊａ細胞の核および細胞質抽８物（それぞれ、Ｎ Ｅおよび５１００と称する）と４３℃で１時間インキュベーションした直後のＩ ＬのＨｅｌａ細胞から得た核抽出物（Ｈ３ＮＥ）をディグナムの方法（ディグナ ム：）（Ｄｉｇｎａｍ、Ｄ、）、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓシ五、１上：１４７５ （１９８３乃で調製した。抽出物をバッファー（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ ７，９，２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、１００ｍＭ　ＫＣＮ、０−２ ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．５１１ １Ｍ　ジチオスレイトール）に対して透析し、何も添加せずにインキュベーショ ンした。タンパク質（ＮＥタンパク質５．０μ９または３１００タンパク質８． ５μ９、または両方）を０℃または４３℃でインキュベーションした。次いで抽 出物をヒトｈｓｐ７０プロモーターのＨＳＥ（塩基−１１から−８０）を含有す る、。Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドと一緒に３０℃で３０分間インキュベーシ ョンした［センら（Ｓｅｎ、Ｒ，）、　Ｃｅ１ｌ、　　４７　：　９２１（１９ ８６）；プリウェスら（Ｐｒｙｗｅｓ、　Ｒ，）、　Ｃｅ１ｌ、　　４７　：　 ７７７（１９８６）；ヘイニスら（Ｈａｙｅｓ、Ｔ、Ｅ、）、　　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　＋　旦４：　１２７２（１９８７） コ。持合反応混合物（２０ｔｔＩ２）は２０ｗ＋Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，９ ，１２％（ｖｏｌ／　ｖｏｌ）グリセロール、６０ｍＭ　ＫＣ６，０，１２ｍＭ 　ＥＤＴＡ、０．３ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリド、０．３ｍＭ　 ジチオスレイトール、２ｍＭ　ＭｇＣｒ２、モルあたり１００μ９のｐｏｌｙ（ ｄｌ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄｌ　−ｄＣ）および標識ＤＮＡ約０．２ｎｇ、およ び抽出物を含有していた。反応混合物を４％非変性ポリアクリルアミドゲルによ る電気泳動にかけた。

ＨＳＥ（ヒトｈｓｐ７０プロモーターの塩基−８０から−１１５）を含有する３ ６７−の２本鎖オリゴヌクレオチドを標識プローブとして用いた。核抽出物は加 熱の前後いずれにも結合活性を含有していなかったが細胞質抽出物は４３°Ｃで 加熱した後にのみ、有意レベルの結合活性を有することが分かった。細胞質抽出 物に核抽出物を加えても誘導の程度には変化がなかった。

本実験の結果は、非熱誘導Ｈｅ１ａ細胞の細胞質抽出物がゲル移動度のシフトア ッセイで測定される、熱誘導可能な熱シヨツクエレメントの領域への結合活性を 有することを示１７ている。

実施例２　熱ショ・／り因子の精製 Ａ）核抽出物の調製 ヒｈＨｅｌａ細胞を最少必須培地で支持した５％ウマ血清を補充した浮遊培地（ Ｊ　ｏｋｌｉｋの改良）で培養した。およそ５００．　Ｏ’ＯＯ細胞／ｍＱの密 度に達するまで細胞を培養した。細胞を収穫し、実質上デイグナムらＪＤｉｇｎ ａｍ、　　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　１ユニ１４７５（１９８３） コの方法に従って核抽出物を調製した。核抽出物をジグナムバソフｙ−（ＤｉＸ ｎａＩＩＢｕｆｆｅｒ）Ｄ（２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２０ｍＭＨＥＰＥ Ｓ（ｐＨ７，９）、０．１Ｍ　ＫＣＱ、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｎ＋Ｍ　Ｅ ＤＴＡ）に対して透析した。

Ｂ）分画ステップ＃１ ジグナムバッファーＤ中のＨｅｌａ細胞核抽出物を予めバッファーＤ中で平衡化 したウシ胸腺２本鎖ＤＮＡ−セルロースカラム（ファルマシア）に適用した。カ ラムをバッファーＤ中０．３Ｍ　ＫＣｌ２および１．５Ｍ　ＫＣｌ２の段階的増 加溶離で処した。Ｈ３Ｆ活性をゲル電気泳動による移動度シフトアッセイ［キン グストンら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　　７　：　１５３０（１９８７）］によって監視した。ＨＳＦ活 性は０．３Ｍ　ＫＣ（で溶出した。Ｈ３Ｆ画分含有フラクションを分取し界面活 性剤ＮＰ−４０を０．１％（ｖ／ｖ）まで加えた。

Ｃ）分画ステップ＃ 第２の精製工程はＨ３Ｐとその関連配列・・Ｈ３Ｅとの特異結合による。この工 程のために配列特異的２本鎖オＪＪフヌクレオチトアフイニテイーカラムをカド ナガらＦＫ　ａｄｏｎａｇａ、　　Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ　１．　Ａ　ｃａｄ 。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３　：　５８８９（１９８６）２の方法に従って構築した。

下記の配列で示される自己相補的な２８塩基オリコヌクレオチドを合成した。

５“　−ＧＡＴＣＣ丁ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧ　　−３ ゜このオリコヌクレオチドを自己アニーリングさせてＧＡＴＣ５“突出を有する ２本鎖分子と２個のオーバーラツプＨ３Ｅの２本鎖分子を得た。これらの分子を りん酸化して平均長さ約５〜１０単位のコンカテマーに結合（リケーション）さ せた。このＤ　Ｎ　’ＡをセファロースＣＬ−２Ｂ（ファルマ／ア）に、臭化７ アンを用いて共有結合させた。これは、アフィニティーカラムを構成している。

ステップ＃ｌて分取したフラクションを、予め、バッファー〇３Ｄ’１ｎｓ（０ ，３Ｍ　ＫＣｆｆ、　Ｏ，１％ｖ／ｖ　Ｎ　Ｐ　　４０、Ｏ、ｌ−ｒｔｒ９／　 ｍＱウシインンユリンを補充した／　匂ファーＤ）で平衡化してお（為テこアフ ィニティーカラムに適用した。Ｈ３Ｆ活性はノマノファ−０，８Ｄ’１ｎｓ（０ ，８Ｍ　ＫＣＱ、　０．１％ｖ／ＶＮｌ’−４０，０゜１　ｙｎｙ／　１１１２ ウシインシユリンを補充したバッファーＤ）による１回の洗浄で溶離された。

Ｄ）分画化ステップ＃３ 上記ステップて分取したフラクションを０．１ＭＫＣ＋２＋こ希釈しＭＯＮＯＱ 　　ＦＰＬＣカラム（ファルマンア）に適用した。ノＸＩ・／ファーＤ’ｉｎｓ 中ＫＣｌ２の０．１　Ｍ−１、０Ｍの線状グラジェントで溶離した。Ｈ３Ｆ活性 を分析し、活性フラクションを分取した。溶出した物質はＳＤＳゲル電気泳動分 析で２ノくンドを示した。こ１ｔらノくンＩＪの１方は他の分解産物と考えられ た。即ち、この物質（よ純度５０％（２バンドが無関係であるとした場合）から 純度９５％（２）くンドカく関連性を有するとした場合）の範囲にある。

実施例３　熱ンＢ’）り因子の特性化 細胞質の熱誘導可能な結合活性は熱ンヨノク細胞の核抽出物力１ら得られた２本 の遅いバンドの内、低い方と一緒に移動する、ただ１本の遅いバンドを与えた。

細胞質抽出物をホスホセルロースまたはＢ　１ｏｒｅｘ　７０て分画化して得た フラクションは４３°Ｃて加熱した後、適当な移動度の２バンドを形成する。従 って、未分画化細胞質抽出物を４３℃で誘導した場合には、低い方の１本のパン ｌ”Ｌか存在しないのは、抽出物中の不純物が原因であるのかもしれない。結合 かＨ３Ｅとの相互作用を表していることを証明するために、この結合の配列特異 性を調へた。

５１００抽出物中に存在する熱誘導可能な結合活性を、熱誘導ノ・ンドと、熱シ ヨツク要素（エレメント）および非特異的フラグメントを含有するフラグメント との競合を調べることで特性化した。熱−誘導ハンドと、熱シヨツク要素および 非特異的フラグメントを含有するフラグメントとの競合を以下の方法で検査した 。ＤＮＡプローブとインキユヘーンヨンする前に、５１００タンパク質８．５μ ９を４３°Ｃで１時間インキコヘーシコンした（またはインキユヘーンヨンしな かった）。上記の方法に従って５１００タンパク質の調製、Ｄ　Ｎ　Ａとのイン キュベーション、および電気泳動を行った。インキユヘーシジン混合物はまた、 非放射活性競合ＤＮＡ（５〜１０倍モル過剰量のヒトｈｓｐ遺伝子の塩基−８４ 〜二５（これは熱シヨツク要素を含有しない）またはヒトｈｓｐ遺伝子の塩基− １４８〜−７４（塩基−１００を中心とする熱シヨ、り要素を含有する）または り、ｍｅｌａ、ｎ。

ｇａｓｔｅｒ熱／：ｉ／り遺伝子の、３個の熱シヨツク要素を含有する３１０塩 基対フラグメント（プラスミドｐＳＰ−Ｈ３−９のＸｈｏｌ［塩基−２００１か らＥｃｏＲＩ［塩基＋１００］まで［ウームら（Ｗｕｒｍ、　ＦＭ、）、　　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　８３　：　５４１５　（１ ９８６）］）であって（ホホルムブレら（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）、　Ｃ匣１　１８ ：１３５９（１９７９））記載のクローン化断片２３２から導かれたもの、また はＣＡＡＴ配列を含有する３９塩基対２本鎖合成オリコヌクレオチド（上側の鎖 ：　５’　−ＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＴＴ丁ＣＣＣ丁Ｔ　ＣＴＧ　ＡＧＣＣＡ Ａ　ＴＣＡ　ＣＣＧＡＧＣＴＣＧ　Ａ）　：あるいは３６塩基対の２本鎖合成オ リゴヌクレオチドプローブをも含有していた。Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉａ度はアガロース ゲル電気泳動で推測した。

さらに結合特異性を特性化するためにメチル化干渉分析を行った部分メチル化断 片を加熱した細胞質抽出物と一緒にインキュベーションし、結合した断片と遊離 断片を分離し、分析した。上方または下方の鎖のいずれかの放射能レベルによっ て分析した。細胞質抽出物を４３℃で１．５時間加熱した。結合反応は上記の方 法で行った。

それらの分析では加熱した細胞質抽出物１２０μ９（インビトロ）またはＨ３Ｎ Ｅ　１６μｇ（インビボ）を、プロモーターの塩基−１４８〜−７４を含有する 標識断片２０ｎｇと一緒にインキュベーションした。非変性ゲルで結合した複合 体と遊離の複合体とを分離し、溶離し、ギルマンらｊＧｉｌｍａｎ、Ｍ、　Ｚ、 、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　　６　：　４３０５（１９８６）ｌ の方法で分析した。熱シｆｆ　’７クコンセンサス配列はＣ・・ＧＡＡ・・ＴＴ Ｃ・・Ｇである。ＨＳＦを含有する全断片が結合に競合したが、ＨＳＦを含有し ない断片は競合しなかった。ＨＳＦ内またはＨＳＦに隣接する５個のＧ残基は結 合ＤＮＡには表れておらず、このことは結合因子がこれら残基と密接に関連して いるということを示唆している。同様のパターンが熱シヨツクＨｅ１ａ細胞の核 抽出物にも認められた。競合データおよびこのＤＭＳ干渉データはインビトロで 誘導された結合活性が、全細胞のインキュベーション後に見られると同様の配列 特異性を有することを示唆している［キングストンら（Ｋ　ｉｎｇｓｔｏｎ、　 Ｒ，Ｅ、）、　Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ、　Ｂ　ｉｏｌ　、ユ。

１５３０（１９８７）］。

実施例４　結合誘導の特性化 無傷のＨｅ１ａ細胞と、細胞不含系（細胞抽出物）での結合活性の誘導を比較し た。無傷のＨｅ１ａ細胞での結合活性の誘導における反応速度は速いが細胞不含 系での誘導の反応速度は遅いことが分かった。

８１００抽出物での熱誘導性結合活性の反応速度と熱依存性を以下の方法で決定 した。上記のごと＜５１００抽出物を調製し、電気泳動した。試料は８１００抽 出物に由来するタンパク質８゜５μ９を含有していた。試料を４３時間で１時間 インキュベーションした後、結合反応を行った。幾つかの試料は、このインキュ ベーションの後、さらに１時間、３７℃、３０℃または０℃でインキュベーショ ンしてから結合反応に付した。結合反応の前に８１００抽出物を４３°Ｃでイン キュベーションした。結合レベルのピークは４３℃で４５〜６０分間インキュベ ーションした後に認められた。結合活性誘導の至適温度は、Ｈｅ１ａ細胞が熱シ ヨツク応答を示す温度と密接な関係にあった。インビトロでの３７℃は殆ど結合 活性を誘導せず、４０°Ｃおよび４３°Ｃでは誘導が増加し、５０℃では誘導を 認めなかった。

−ｉ結合活性が誘導されると、氷上、３０℃または３７℃でさらに１時間インキ ュベーションしても活性化因子の活性が除去されることはなかった。

実施例５−　　Ｈｅ１ａ細胞からのＨＳＦの誘導４３°Ｃで１時間加熱された細 胞質抽出物中のＨＳＦの量をＨ３Ｆ測定値がタンパク質の増加に伴って直線的に 増加するような条件下で、移動度シフトゲルを用いて測定した。Ｈｅｌａ細胞の 核抽出物中のＨＳＦの量を同様にして測定した。次いで、活性をそれぞれの抽出 物の調製に用いた細胞の数に関して補正した。加熱した細胞質抽出物中のＨＳＦ の雪は細胞１０８あたり１２．２００単位であり、加熱した細胞由来の核抽出物 は、細胞１０ａあたり１１．８００単位を含有していた。単位は移動度シフトゲ ル上に保持された標識Ｈ３Ｆプローブの量で定義される。

インビトロでのＨ３Ｆ結合活性誘導の特徴は、この活性化が、無傷のＨｅｌａ細 胞に熱ショックを与えた場合に見られる活性化を反映していることを強く示唆し ていた。インビトロでの誘導の温度プロフィルは無傷細胞で見られるそれと同様 である。さらに、インビトロでのＨ３ｅ−結合活性の誘導は有効である。インビ トロにおける細胞質抽出物の誘導は１０８細胞あたりＨ３Ｆ１２．２単位を誘導 し、熱ショックＨｅｌａ細胞の、核には１０８細胞あたり１１，８単位のＨＳＦ が存在していた。

実施例６　　Ｈ３Ｆ活性化における温度の影響°　加熱した細胞では変性タンパ ク質の量が増加しており、このことがタンパク分解経路を介するＨ３Ｆ活性化の 引金であると示唆された［アナンサムら（Ａｎａｎｔｈａｍ、　Ｊ、）、　　５ ｃｉｅｎｃｅ、　　２３２　：　５２２（１８５）］。このモデルから、４３° Ｃでは３７°Ｃにおけるよりも多くの変性タンパク質が存在するという理由で、 インビトロ系での活性化の発現は温度依存性であると予言される。対照的に、細 胞質抽出物に沸騰ＢＳＡを加えても、３７°Ｃまたは４３°Ｃのいずれにおいて もＨ３Ｆ誘導誘導灯上記参照）は変化せず、誘導程度も変化しなかった。また、 沸騰細胞質抽出物の添加も活性化に殆と影響しなかった。

これは、変性タンパク質か、Ｈ３ＰのＤＮＡ結合形への変化に１１受を担ってい るのではなく、この変化は温度の直接作用によるものであることを示唆している 。

１ＪＩ７．、Ｈ３Ｆ活性化の分子機構 細胞質抽出物を幾つかのイオン交換カラムで分画上熱誘導可能な方法でＨ３Ｐを 活性化する能力を保持している各両分を得た。これら画分を用いてＡＴＰの添加 か結合活性の活性化速度や程度になんら影響しないことを示した。細胞質抽出物 をＢｉｏｒｅｘ７０カラムに適用し、０．１．０．２．０．５および１．ＯＭ　 ＫＣ（！を含有する洗浄液で希釈した。フラクションを個別に、および−緒に、 ４３°Ｃでのインキュヘーションに際する活性化Ｈ３Ｆの形成能力に関して分析 した。全活性がＯ，ＩＭ　ＫＣＱ、洗浄で溶出した。カラムに保持されたタンパ ク因子の１つく“Ｘ”）がＨ３Ｐよりも速（移動することが分かった。Ｘを形成 する活性は、０．５Ｍ　ＫＣ（洗浄で溶出した。

０．５ＭＫＣ（！洗浄液は活性Ｈ３Ｆ形成能力を持たず、これを０．１Ｍ　ＫＯ ｆｆ洗浄液に加えても、ＨＳ　Ｆ形成世は変化しなかった。この発見は、不活性 な各Ｈ３Ｆ分子が熱で誘導されてＤＮＡ結合形フンホメーションに変化するとい うモデルと一致する。しかしながらＨ３Ｆ活性化の程度は細胞質抽出物の希釈に 対して非常に敏感であり、Ｈ３Ｐの活性化には少なくとも２個の分子か必要であ る口とを示唆している。これらの結果は（１）フンホメーンヨン変化を受け２１ 体化して結合し得る活性種を与える無傷のモノマーＨＳ　Ｆか存在するか、（２ ）Ｈ３ＰをＤＮＡ結合形に変化させる第２の熱感受性因子か存在する、のいずれ かであることを示唆している。

上記のように、Ｈ８Ｆ８Ｆ活性化によって、その濃度がＨ３ＦＩに逆関係にある バンド（“Ｘ”）が存在することが判明した。この発見は、該バンドが活性Ｈ３ Ｆの前駆体であることを示唆している。しかしながら、負に荷電したカラムでは 、このハントを形成する活性と活性Ｈ３Ｆを形成する活性とは分離する。即ち、 Ｘが熱シヨツク応答の調節に関与している可能性はあるが、Ｘを産生ずる因子が 活性Ｈ３Ｆの前駆体であることないよってある。

実施例８　クロスリンキング研究 インビトロでのＨ３Ｆ活性化の特徴を、下記の操作の後に存在するＨ３Ｐの濃度 を、上記のＨ４Ｆを含む合成オリコヌクレオチトを用いるゲル移動度シフトアッ セイ（上記参照）で測定することにより、調査した。

Ａ）Ｓ１００タンパク質２０μ９を沸騰ウシ血清アルブミンの存在下（ＢＳＡｌ 、Ｏμｇ／５１００タンパク質２０μ？）または非存在下て２０分間インキユベ ーンヨンした。この実験で変性タンパク質を添加しても活性化は変化しないこと が分かった。

Ｂ）細胞質抽出物を沸騰した細胞質抽出物の等量、４倍量、および９倍量て希釈 してから、９０分間インキユベーンヨンした。次いで、すべて、活性（非沸騰） 細胞質抽出物１３μ９を含有する結合反応混合物２０μａ中で活性を測定した。

この実験で希釈によってインビトロでのＨ３Ｆ活性化が減少されることが分かっ た。バッファーによる希釈後にも同様の結果か得られた。

Ｃ）細胞質抽出物１３μ９／屑Ｑを４３°Ｃで１時間加熱する（”４３°Ｃ抽出 物”）か、水上で１時間インキユベーンヨンした（“Ｏ′Ｃ抽出物”）。

４３°Ｃ抽出物（１μｇ、３μρ、または０μρ）とある量のＯ′Ｃ抽出物（Ｏ μＱ、　２μＱ１または４μのとを３０’Ｃで１時間インキコヘーンヨンした。

この実験で、加熱していない抽出物の添加はＨＳ　Ｅへの結合を阻害しないこと が分かった。

Ｈ３Ｆバンドは以下の特徴を有していた。それは対照（コントロール）核抽出物 には存在しない：それは移動度シフトゲル上、Ｈ３Ｆ−Ｈ３Ｅ複合体（コンプレ ックス）中に検出される；その形成はＨＳＥ含有オリゴヌクレオチドにより有効 に競合されるがＣＣＡＡＴ要素を特定する対照オリゴヌクレオチドでは競合され ない。

各因子の見掛けの大きさを決定するためにＵＶクロスリンキング研究を行った。

”Ｐ−ＣＴＰおよびプロモーデオキシウリジンで置換しておいた合成Ｈ３Ｅダイ マーと一緒に抽出物をインキュベーションし、アガロースゲル上、ＵＶ光の照射 によって、生成したＨ３Ｆ含有複合体を非特異的複合体から分離した。得られた 襟識タンパク質種をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、加熱Ｈｅｌａ細 胞からの核抽出物中に存在する、９３ｋｄに移動するバンドを認めた。

驚くべきことには、加熱細胞質抽出物を用いて行った同様の実験において、イン ビトロで活性化されたＨＳＦは、ポリアクリルアミドゲル上で加熱細胞の核から 単離したＨＳＦよりも速＜（９０ｋｄ）移動した。これは加熱されていない細胞 質中には存在しておらず、交差結合による複合体形成はＨＳＦで競合されたが対 照ＣＣＡＡＴオリゴヌクレオチドでは競合されなかった。このように、インビト ロでのＨＳＦのＤＮＡ結合特異性への活性化は、熱ンヨノクを受けた細胞から単 離されたＨＳＦのそれと幾分具なっている。核抽出物の存在下で細胞質抽出物を 加熱した後には９３ｋｄおよび９０ｋｄの両バンドが観察されることから、この 相異は、細胞質抽出物中の活性Ｈ３Ｆ修飾作用によるものではない。

この移動度の相異について可能なことは、酵母ＨＳＦからの類推により、リン酸 化である。酵母Ｈ３Ｆの見掛けの分子量は、酵母細胞の熱シヨツク後、増大し、 この増加はりん酸化によると思われる。

加熱Ｈｅｌａ細胞から得たＨＳＦおよびインビトロで活性化したＨＳＦを酸ホス ファターゼ処理してから、因子とＤＮＡとのクロスリンキングに付した。酸ホス ファターゼ処理によって加熱Ｈｅｌａ細胞から単離されたＨＳＦの見掛けの移動 度は増大したが、ウシ腸ホスファターゼ処理の効果には限界があった。加熱細胞 由来のＨＳＦを両ホスファターゼで処理した結果、約９Ｏ＋ｄから９２ｋｄに広 がるバンドが得られた。反対に、インビトロで活性化したＨＳＦの移動度に対し 、酸ホスファターゼは検出し得る効果を示さなかった。ホスファターゼ処理によ る加熱細胞由来のＨＳＦの移動度の変化は、インビトロで活性化されたＨＳＦの それに正確に一致するほどではなかったが、これらの結果は無傷の加熱細胞中に 認められるＨＳＦがインビトロで活性化されたＨＳＦよりも広範なりん酸化を受 けることを暗示している。

このようにヒトＨ３ＦのＨ３Ｅ結合能力はＨｅ１ａ細胞質抽出物を加熱すること によって活性化される。変性タンパク質はインビトロでのＨ８Ｅ結合活性を活性 化の速度または程度を変化させない。インビトロで活性化されたＨＳＦは加熱ヒ ト細胞の核から単離されたＨＳＦと同一のＤＮＡ結合能力を有するが、インビト ロで活性化されたＨＳＦはポリアクリルアミドゲル上で、無傷の細胞中で活性化 されたＨＳＦよりも速い移動度で泳動する。この移動度の相異はりん酸化の相異 によると思われる。即ち、ヒト細胞は、熱に対し、少なくとも２ステツプのＨ８ Ｆ活性化によって応答する：まず、ＡＴＰ依存性の、熱誘導性のＤＮＡ−結き能 力における変化、次いでりん酸化である。

本発明をその特定の実施態様について説明したが、さらに改変することができ、 本願は、一般に、本発明の原理に従って行う発明の改変、使用、または適用のす べてを包含することを意図しており、本発明が属する技術分野で既知または通常 のブラクティスであり、そして既述の基本的な特徴に適用される、そして後述す る請求の範囲の記載に包含される、それらからの派生をも包含するものと理解さ れるであろう。

国際調査報告 栖”””４”’””””−”ＰＣＴ／ＵＳ８９１００９６３Ｉｎｔｅｒｎａｔ５ ．ｏｎａｌ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　Ｎｏ、＝　　　ＰＣＴ／ｌゴＳＰ○ １０ｏＣ６３Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　　ｃｌａｓｓｉｒｉｅａｔｉｏｎ！

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．実質上、天然の不純物を伴っていない熱ショック因子を含有する化合物、ま たはその誘導体。
2. ２．該化合物が熱ショック因子である請求項１記載の化合物。
3. ３．該化合物が熱ショック因子の誘導体である請求項１記載の化合物。
4. ４．請求項１記載の化合物を含有する治療用薬物。
5. ５．請求項１記載の化合物をコードする配列を含有する組換え核酸分子。
6. ６．請求項２記載の化合物をコードする配列を含有する組換え核酸分子。
7. ７．該化合物がＤＮＡアフィニティークロマトグラフィーを含む工程によって調 製されたものである請求項１記載の化合物。
8. ８．該工程がさらにＭＯＮＯＱＦＰＬＣクロマトグラフィーをも含んでいる請求 項７記載の化合物。
9. ９．熱ショック因子を活性化し得る物質。
10. １０．請求項９記載の物質を含有する治療用薬物。
11. １１．熱ショック因子を含有すると思われる試料をＤＮＡアフィニティークロマ トグラフィーにかけることを含む該因子の精製法。
12. １２．該因子を含有すると思われる試料をさらにＭＯＮＯＱＦＰＬＣクロマトグ ラフィーにかけることをも含んでいる請求項１１記載の方法。
13. １３．熱ショック応答に関連する疾患の治療法であって、そのような治療を必要 とする個体に有効量の請求項１記載の化合物を投与することを含む方法。
14. １４．該疾患が、低酸素、エタノール誘導ストレス、心筋梗塞、および脳梗塞か らなる群から選択されるものである請求項１３記載の方法。
15. １５．熱ショック応答に関連する疾患の治療法であって、そのような治療を必要 とする個体に有効量の請求項９記載の化合物を投与することを含む方法。
16. １６．該疾患が、低酸素、エタノール誘導ストレス、心筋梗塞、および脳梗塞か らなる群から選択されるものである請求項１５記載の方法。
17. １７．患者のストレス状態を診断する方法であって、個体の細胞中の活性化熱シ ョック因子の存在を分析することからなる方法。
18. １８．該分析が熱ショック因子のアンタゴニストの使用を含んでいる請求項１７ 記載の方法。
19. １９．該アンタゴニストを該個体に投与する、請求項１８記載の方法。
20. ２０．該アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである請求項１８記載の 方法。
21. ２１．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１８記載の方法。
22. ２２．該分析が生検を含むものである請求項１７記載の方法。
23. ２３．該分析が全身または器官イメージングを含んでいる請求項１７記載の方法 。