DE68918479T2

DE68918479T2 - Menschlicher Hitzeschock-Faktor.

Info

Publication number: DE68918479T2
Application number: DE68918479T
Authority: DE
Inventors: Robert E Kingston; Thomas J Schuetz
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1988-03-18
Filing date: 1989-03-17
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2009-03-18
Also published as: IE62447B1; EP0333201A2; ATE112168T1; AU3280489A; EP0333201A3; ES2064375T3; FI904564A0; DK224790D0; WO1989008661A1; JPH03503410A; IE890817L; PT90019A; EP0333201B1; PT90019B; AU645243B2; DK224790A; DE68918479D1

Description

Diese Anmeldung ist eine "continuation in part" der am 18. März 1988 eingereichten US-Patentanmeldung Serial No. 169 965.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Human-Hitzeschock-Faktor sowie diesen Faktor für die Diagnose und Behandlung von Krankheit und Streß. Die Erfindung betrifft auch die Erzeugung dieses Faktors nach Verfahren unter Verwendung von rekombinanter DNA sowie die DNA-Sequenzen, welche für diesen Faktor kodieren.
Zellen, welche der Einwirkung erhöhter Temperaturen oder gewisser chemischer Mittel ausgesetzt sind, antworten auf einen solchen Streß dadurch, daß sie die Synthese eines kleinen Satzes von Proteinen induzieren. Diese zelluläre Antwort wird als "Hitzeschock-Antwort" bezeichnet. Die Proteine, welche als Antwort auf Streß synthetisiert werden, werden als "Hitzeschock- Proteine" oder "HSP" bezeichnet. Die Hitzeschock-Antwort wird als allgegenwärtig angesehen, und sie ist sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen und Organismen (einschließlich des Menschen) beobachtet worden. Die Synthese der Hitzeschock-Proteine ist in hohem Maße signifikant, weil das Fehlen der Produktion dieser Proteine als Antwort auf Streß mit dem Zelltod und mit der Schädigung von Geweben und Organen verbunden ist. Es wird angenommen, daß die Hitzeschock-Proteine beim Abschwächen der Heftigkeit des Stresses eine Rolle spielen, und daß sie dadurch die betroffene Zelle in einen Ruhezustand zurückbringen. Ausgezeichnete Abhandlungen über das Hitzeschock-Phänomen sind jene von Lanks, K.W. (Exper. Cell Res., 165:1-10 (1986); und von Lindquist, S. (Ann. Rev. Biochem., 55:1151-1191 (1986)).
Es hat sich gezeigt, daß die Hitzeschock-Proteine Funktionen besitzen, welche mit ihrer Rolle in dem Hitzeschock-Phänomen nichts zu tun haben und davon unabhängig sind. Es ist festgestellt worden, daß die Gene, welche für die Hitzeschock-Proteine kodieren (nämlich die hsp-Gene), während der embryonalen Entwicklung unterschiedlich exprimiert werden (Bensaude O. et al., Nature, 305:331 (1983)), und daß sie während der Differenzierung von spezifischen Zelltypen, wie z.B. Myoblasten, in embryonalem Karzinom, und in Erythroid-Zellen unterschiedlich exprimiert werden (Atkinson, B.G., J. Cell. Biol., 89:666 (1986); Atkinson, B.G. et al., Can. J. Biochem. Cell. Biol., 61:404 (1983); Morange, M. et al., Molec. Cell. Biol., 4:730 (1984); Singh, M.K. et al., Nature, 309:631 (1984)). Die Umwandlung zu einer Neoplasie ist ebenfalls mit einer Veränderung in der Menge der Hitzeschock-Proteine verbunden (Lanks, K.W., Exper. Cell Res., 165:1-10 (1986)).
Es hat sich gezeigt, daß die Gene für die Hitzeschock-Proteine hochgradig konservierte 5'-Sequenzen besitzen, welche eine als "Hitzeschock-Element" oder "HSE", bekannte, abwechselnd symmetrische, übereinstimmende Sequenz enthalten. Ein Hitzeschock-Transkriptionsfaktor ("HSTF" oder "HSF") ist identifiziert worden, von welchem angenommen wird, daß er sich an die HSE-Sequenzen bindet, und daß er eine Rolle in der Transkription der Gene spielt, welche für die Hitzeschock-Proteine kodieren (Lindquist, S. (Ann. Rev. Biochem., 55:1151-1191 (1986); Parker, C.S. et al., Cell, 36:357-369 (1984); Parker, C.S. et al., Cell, 37:253-262 (1984); Wu, C., Nature, 286:854-860 (1980); Wu, C., Nature, 309:229-241 (1984); Wu, C., Nature, 317:84-87 (1985)). Als solcher ist dieser Faktor befähigt, die Hitzeschock-Antwort eines Individuums zu regulieren und zu erhöhen.
Somit ergeben dieser Faktor, und Mittel, welche die Aktivität dieses Faktors fördern, eine Therapie für Krankheiten, welche mit der Hitzeschock-Antwort verbunden sind. Da dieser Faktor nicht ausreichend gekennzeichnet worden ist, um seine Verwendung in der Therapie für solche Krankheiten zuzulassen, oder um die Identifizierung von Mitteln zu ermöglichen, welche seine Aktivität fördern, war es bisher nicht möglich, den HSF (oder solche Mittel) als Basis für die Behandlung solcher Krankheiten zu verwenden. Es besteht daher ein Bedarf nach einem Mittel zum Reinigen und Erzeugen des HSF und seiner Derivate, Antagonisten und Agonisten.
Die vorliegende Erfindung betrifft den Hitzeschock-Faktor, sowie dessen Derivate, Antagonisten und Agonisten. Die Erfindung betrifft auch die Erzeugung und Reinigung solcher Verbindungen aus natürlichen und rekombinanten Quellen. Die Erfindung betrifft zusätzlich diagnostische und therapeutische Anwendungen für solche Verbindungen.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine den Hitzeschock- Faktor oder Derivate hievon enthaltende Verbindung, welche im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein therapeutisches Medikament, welches den Hitzeschock-Faktor oder ein den Hitzeschock- Faktor aktivierendes Mittel enthält.
Die Erfindung umfaßt auch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz enthält, welche für den Hitzeschock-Faktor kodiert.
Die Erfindung betrifft auch die obige Verbindung, wobei die Verbindung nach einem Verfahren hergestellt wird, welches eine DNA-Affinitätschromatographie umfaßt.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen des Hitzeschock-Faktors, welches eine Stufe umfaßt, bei welcher eine Probe, von welcher vermutet wird, daß sie den Faktor enthält, der DNA-Affinitätschromatographie unterworfen wird.
Die Erfindung betrifft zusätzlich ein Verfahren zum Diagnostizieren des Streßzustandes eines Patienten, welches das Prüten auf das Vorliegen des aktivierten Hitzeschock-Faktors umfaßt.
Die Hitzeschock-Antwort
Die vorliegende Erfindung stammt - teilweise - aus Untersuchungen der Antwort von Humanzellen auf Veränderungen in der äußeren Umwelt. Humanzellen antworten auf eine Vielfalt von Veränderungen in ihrer Umwelt dadurch, daß sie einen entsprechenden Satz von Genen koordiniert induzieren, und zwar häufig auf dem Wege über das sequenzspezifische Binden eines Transkriptionsfaktors an Stellen von regulierenden Promotoren (Serfling, E. et al., Trends in Genet., 1:224 (1985); McKnight, S. et al., Cell, 46:795 (1986); Maniatis, T. et al., Science, 236:1237 (1987)). In mehreren Fällen scheint an der koordinierten Regulierung von Säugetiergenen die Modifizierung eines schon zuvor vorhandenen Transkriptionsfaktors auf eine Form beteiligt zu sein, welche sich an das regulierende Element eines Promotors binden kann (Yamamoto, K., Ann. Rev. Genet., 19:209 (1985); Sen, R. et al., Cell, 47:921 (1986); Prywes, R. et al., Cell, 47:777 (1986); Hayes, T.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1272 (1987); Kingston, R.E. et al., Mol. Cell. Biol., 7:1530 (1987); Zimarino, V. et al., Nature, 327:727 (1987). Über die biochemischen Veränderungen, welche diese Änderung in der DNA-Bindungsfähigkeit verursachen, ist wenig bekannt. Diese Veränderungen sind offensichtlich ein wesentliches Verbindungsglied bei der Umwandlung eines Umweltsignals in eine entsprechende Antwort: die Induktion eines spezifischen Satzes von Genen. Die Feststellung des Mechanismus, durch welchen das Binden des Transkriptionsfaktors induziert werden kann, ist daher wesentlich für das Verständnis vieler regulierender Abläufe.
Die Umweltsignale führen zu post-translationalen Veränderungen in der DNA-Bindungsfähigkeit von mehreren Faktoren, welche die Transkription bei Säugetieren regulieren. In prokaryontischen Systemen können die Umweltsignale zur Phosphorylierung von die DNA-Bindungsfähigkeit regulierenden Proteinen führen: beispielsweise phosphoryliert das ntrB-Produkt das NtrC-Protein als Antwort auf eine Stickstoffbeschränkung, was zu einer Aktivierung von NtrC führt. In ähnlicher Weise wird Hefe-HSF als Antwort auf Wärme phosphoryliert.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, umfaßt die Hitzeschock-Antwort, welche in Organismen von Bakterien bis zum Menschen vorkommt, die verstärkte Synthese eines Satzes von Schutzproteinen, welche von den hsp-Genen kodiert werden. Die Transkription dieser Gene wird durch den Hitzeschock-Faktor ("HSF") reguliert. Der HSF wird normalerweise - sogar in Zellen im Ruhezustand - in einer niedrigen Menge erzeugt. Als Antwort auf Streß nimmt die HSF-Konzentration in einer Zelle jedoch zu, und der HSF wird in eine aktivierte Form umgewandelt. Die aktivierte Form des HSF ist befähigt, sich an die HSE-Sequenzen zu binden, und dadurch die Verstärkung der Transkription der für das Hitzeschock-Protein kodierenden Gene zu vermitteln. Die Hitzeschock-Antwort stellt somit ein Beispiel für eine koordinierte Gen-Regulierung dar.
Es hat sich gezeigt, daß die Transkription der Hitzeschock-Gene dann induziert wird, wenn Humanzellen auf 43ºC erwärmt werden (Ritossa, F.M., Experientia (Basel), 18:571 (1962); Nover, L., Heat Shock of Eukaryotic Cells, Springer, Berlin (1984); Craig, E.A., CRC Cit. Rev. Biochem., 18:239 (1985); Pelham, H.R.B., Trends Genet., 1:31 (1985); Lindquist, S., Ann. Rev. Biochem., 55:1151 (1986)), und zwar induziert durch das palindromische Hitzeschock-Element s(HSEs), welches stromaufwärts von jedem Promotor angeordnet ist (Pelham, H.R.B. et al., EMBO J., 1:1473 (1982); Mirault, M.E. et al., EMBO J., 1:1279 (1982); Wu, B. et al., Mol. Cell. Biol., 5:330 (1985); Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4949 (1985); Drabent, B. et al., Nucl. Acids Res., 14:8933 (1986); Berger, E.M. et al., Somat. Cell. Molec. Genet., 12:433 (1986); Wu, B.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:629 (1986)).
Es hat sich gezeigt, daß das Binden des HSF an das HSE die Transkription in Drosophila direkt stimuliert, und es wird angenommen, daß die Expression der Hitzeschock-Gene in anderen Organismen dadurch in ähnlicher Weise stimuliert wird (Kingston, R.E. et al., Mol. Ce.. Biol., 7:1530 (1987); Wu, C., Nature, 309:229 (1984); Parker, C.S. et al., Cell, 37:273 (1984); Morgan, W.D. et al., Mol. Cell. Biol., 7:1129 (1987); Wiederrecht, G. et al., Mol. Ce.. Biol., 7:1129 (1987); Wiederrecht, G. et al., Cell, 48:507 (1987); Wu et al., Science, 238:1249 (1987); Sorger, P.K. et al., Nature, 329:81 (1987)). Die Fähigkeit des HSF, sich an das HSE zu binden, ist in Drosophila- und Humanzellen aufgrund eines post-translationalen Mechanismus durch Wärme induzierbar (Kingston, R.E. et al., Mol. Ce.. Biol., 7:1530 (1987); Zimarino, V. et al., Nature, 327:727 (1987); Sorger, P.K. et al., Nature, 329:81 (1987)). Das Induzieren der Fähigkeit eines Faktors, sich an das HSE von Hitzeschock-Genen zu binden, ist offensichtlich von zentraler Bedeutung für die Regulierung der Hitzeschock-Antwort in Drosophila- und Humanzellen. Das Induzieren der Bindungsfähigkeit stellt sich als direkte Antwort auf die Temperatur ein, weil die Bindungsfähigkeit in dem Zytoplasmaextrakt mit etwa dem gleichen Temperaturprofil wie in einer intakten Zelle induziert wird. Diese Veränderung in der Bindungsfähigkeit ist nicht die einzige Änderung in dem HSF, welche auftritt, wenn die Zellen erhitzt werden. Der HSF aus erhitzten Zellen ist offensichtlich in einem signifikant höheren Ausmaß phosphoryliert als der in vitro aktivierte HSF. Der HSF wird in Humanzellen durch wenigstens zwei Stufen aktiviert: ein Induzieren der Bindungsfähigkeit mit anschließender Phosphorylierung. Durch das Erhitzen eines Zytoplasmaextraktes wird nur die erste dieser Stufen reproduziert, was zu einem Faktor mit einem niedrigeren scheinbaren Molekulargewicht führt. Dieses vermutete Phosphorylierungsereignis kann die Fähigkeit des HSF, die Transkription zu aktivieren, erhöhen, oder es mag irgendeine andere Eigenschaft verändern, welche für die HSF-Funktion von kritischer Bedeutung ist.
Zusammenfassend läßt sich daher sagen, daß der HSF ein Transkriptionsfaktor ist, welcher dann, wenn er dadurch aktiviert worden ist, daß eine Zelle der Einwirkung von Wärme oder Streß ausgesetzt war bzw. ist, die vermehrte Transkription der hsp-Gene vermittelt, und dadurch eine Zunahme in der zellulären Konzentration der Hitzeschock-Proteine bewirkt. Die Hitzeschock-Proteine wirken sich dahingehend aus, daß sie die schädlichen Wirkungen des Stresses abschwächen.
Die Isolierung und Reinigung des HSF
Der aktivierte HSF wird vorzugsweise aus HeLa-Zellen isoliert und gereinigt; es können jedoch auch andere Human-Zellen für diesen Zweck verwendet werden. Die Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium, vorzugsweise in einem mit Serum ergänzten "Minimal Essential Medium" (Modifizierung gemäß Joklik) kultiviert. Nachdem die Zellen eine erwünschte Dichte erreicht haben, werden sie geerntet und zur Herstellung von Zellkernextrakten verwendet. Solche Extrakte werden vorzugsweise nach dem Verfahren von Dignam, D. et al. (Nucl. Acids Res., 11:1475 (1984)), hergestellt.
Der Zellkernextrakt wird dann durch eine Zellulose-Säule mit doppelsträngiger DNA geführt. Das gebundene Material wird aus der Säule unter Verwendung einer stufenweisen Elution mit 0,3M KCl eluiert. Auf die HSF-Aktivität wird vorzugsweise unter Anwendung des Gel-Elektrophoresetests von Kingston, R.E. et al. (Molec. Cell. Biol., 7:1530 (1987), welche Literaturstelle durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird), geprüft. Fraktionen, welche HSF-Aktivität enthalten, werden als Vorbereitung für die weitere Reinigung vereinigt.
Eine Affinitätschromatographie-Säule mit doppelsträngiger DNA wird hergestellt, bei welcher vorzugsweise eine Kette aus sich wiederholenden Einheiten (ein "Concatemer") eines zu sich selbst komplementären, HSE-enthaltenden, 28 Basen umfassenden Oligonukleotides mit der Sequenz:
5' - GATCCTAGAAGCTTCTAGAAGCTTCTAG - 3'
verwendet wird. Eine solche Säule wird vorzugsweise nach dem Verfahren von Kadonaga et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5889 (1986), hergestellt. Das Oligonukleotid wird vorzugsweise zur Bildung der Affinitätschromatographie-Säule unter Verwendung von Bromcyan kovalent an Sepharose CL-2B (Pharmacia) gebunden.
Die vereinigten, HSF-enthaltenden Fraktionen werden dann auf die Affinitätschromatographie-Säule mit der oben beschriebenen, sequenzspezifischen, doppelsträngigen DNA aufgegeben. Der aktivierte HSF bindet sich an die Säule, und er kann aus der Säule mit einer Salz-Waschlösung mit 0,75M KCl eluiert werden. Die Fraktionen, welche HSF-Aktivität zeigen, werden dann als Vorbereitung für die weitere Reinigung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen werden dann vorzugsweise auf 0,1M KCl verdünnt und auf eine MONO Q FPLC-Säule (Pharmacia) aufgegeben. Das gebundene Material wird vorzugsweise mit einem linearen Gradienten von KCl (0,1 bis 1,0M) eluiert. Dann wird - vorzugsweise in der oben beschriebenen Weise - auf die HSF-Aktivität geprüft, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Die HSF-Aktivität wird aus der Säule bei 0,3 bis 0,6M KCl eluiert.
Unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahrensweise kann der aktivierte HSF, welcher befähigt ist, sich an DNA zu binden, isoliert und gereinigt werden.
Der HSF und seine funktionellen Derivate, Agonisten und Antagonisten
Die vorliegende Erfindung betrifft den aktivierten Hitzeschock-Faktor ("HSF"), therapeutische Fragmente dieses Faktors sowie funktionelle Derivate, Agonisten und Antagonisten dieses Faktors. Die Erfindung betrifft insbesondere Mittel, welche befähigt sind, den HSF auf seine aktive Form zu aktivieren.
Ein "funktionelles Derivat" des HSF ist eine Verbindung, welche eine (entweder funktionelle oder strukturelle) biologische Aktivität aufweist, die im wesentlichen einer biologischen Aktivität des HSF gleicht. Der Ausdruck "funktionelle Derivate" soll die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemischen Derivate" eines Moleküls umfassen. Unter einem "Fragment" eines Moleküls, wie z.B. des HSF, soll irgendeine Polypeptid-Untergruppe des Moleküls verstanden werden. Mit dem Ausdruck "Variante" eines Moleküls, wie z.B. des HSF, soll ein Molekül bezeichnet werden, das in seiner Struktur und Funktion entweder dem ganzen Molekül oder einem Fragment hievon im wesentlichen gleicht. Von einem Molekül gilt, daß es einem anderen Molekül "im wesentlichen gleicht", wenn beide Moleküle im wesentlichen die gleiche Struktur haben, oder wenn beide Moleküle die gleiche biologische Aktivität aufweisen. Unter der Voraussetzung, daß zwei Moleküle die gleiche Aktivität besitzen, gilt somit, daß diese Moleküle als Varianten im Sinne des hierin verwendeten Ausdrucks angesehen werden, und zwar selbst dann, wenn sich die Struktur von einem der Moleküle in dem anderen nicht vorfindet, oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist. Unter einem "Analogon" eines Moleküls, wie z.B. des HSF, ist ein Molekül zu verstehen, welches dem gesamten Molekül oder einem Fragment hievon in seiner Funktion, aber nicht in seiner Struktur, im wesentlichen gleicht. Ein Molekül ist im Sinne des hierin verwendeten Ausdrucks ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls dann, wenn es zusätzliche chemische Reste enthält, welche normalerweise nicht Bestandteil des Moleküls sind. Solche Reste können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit des Moleküls usw. verbessern. Die Reste können alternativ die Toxizität des Moleküls verringern, sowie allfällige unerwünschte Nebenwirkungen des Moleküls eliminieren oder abschwächen usw. Reste, welche befähigt sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben. Verfahren zum Ankoppeln solcher Reste an ein Molekül sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Ein "Antagonist" des HSF ist eine Verbindung, welche die Funktion des HSF hemmt. Solche Antagonisten können Immunglobuline sein (wie z.B. ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper oder aktive Fragmente eines solchen Antikörpers).
Ein polyklonaler Antikörper, welcher befähigt ist, den aktivierten HSF zu binden, kann durch Immunisierung eines Säugetieres mit einer Präparation aus aktiviertem HSF oder einem funktionellen Derivat des HSF hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung solcher Immunisierungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Monoklonale Antikörper (oder Fragmente hievon) können auch verwendet werden, um auf das Vorliegen (oder die Menge) des aktivierten HSF in einer speziellen biologischen Probe zu prüfen. Solche Antikörper können durch Immunisieren von Milzzellen mit aktiviertem HSF erzeugt werden (durch Modifizieren der Verfahren von Kohler et al. (Nature, 256:495 (1975); Eur. J. Immunol., 6:511 (1976); Eur. J. Immunol., 6:292 (1976)).
Außer nach den obigen Verfahren können Antikörper, welche befähigt sind, den aktivierten HSF zu binden, nach einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern erzeugt werden. Bei einem solchen Verfahren macht man sich die Tatsache zunutze, daß Antikörper selbst Antigene sind, und daß es daher möglich ist, einen Antikörper zu erhalten, der sich an einen zweiten Antikörper bindet. Gemäß diesem Verfahren werden Antikörper, welche befähigt sind, sich an den aktivierten HSF zu binden, zum Immunisieren eines Tieres verwendet. Die Milzzellen eines solchen Tieres werden dann zur Erzeugung von Hybridomenzellen verwendet, und die Hybridomen werden dann durchgeprüft, um jene Klone zu identifizieren, welche Antikörper produzieren, deren Fähigkeit, sich an Anti-aktivierten HSF- Antikörpern zu binden, durch aktiviertes HSF-Protein spezifisch blockiert werden kann. Solche Antikörper umfaßten anti-idiotypische Antikörper gegen den Anti-HSF-Antikörper. Solche Antikörper können dazu verwendet werden, ein Tier zu immunisieren, und dadurch die Bildung von Antikörpern zu induzieren, welche befähigt sind, aktivierten HSF zu binden.
Zusätzlich zum Zurverfügungstellen von zusätzlichem HSF (oder einem funktionellen Derivat des HSF) an ein Subjekt kann die Wirksamkeit des HSF in einem Subjekt auch noch durch Verabreichung eines Agonisten des HSF an ein Subjekt erhöht werden. Die Erfindung betrifft zusätzlich solche Agonisten des HSF. Ein Agonist des HSF ist irgendeine Verbindung, welche befähigt ist, die Wirksamkeit einer Funktion des HSF zu verstärken. Beispiele solcher Agonisten umfassen ein Mittel, welches die Synthese des HSF durch das Subjekt fördert, ein Mittel, welches die Aktivierung von zuvor vorhandenem HSF fördert, usw. Mittel, welche die Aktivierung von zuvor vorhandenem HSF fördern, sind die bevorzugten Agonisten und therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung.
Der HSF oder die Mittel, welche die Aktivierung des HSF fördern, können entweder synthetisch, unter Anwendung der Technologie mit rekombinanter DNA, oder durch Proteolyse gewonnen werden. Die therapeutischen Vorteile solcher Mittel können durch die kombinierte Verabreichung mehrerer Mittel erhöht werden. Der Rahmen der vorliegenden Erfindung soll weiterhin funktionelle Derivate des HSF umfassen, welchen ein, zwei oder mehrere Aminosäurenreste fehlen, oder welche veränderte Aminosäurenreste enthalten, vorausgesetzt, daß solche Derivate die Fähigkeit zeigen, die Hitzeschock-Antwort zu beeinflussen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gelten als "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen", wenn die sie enthaltenden Präparationen im wesentlichen frei von Materialien sind, mit welchen zusammen diese Produkte normalerweise und natürlicherweise vorgefunden werden.
Verfahren zur Herstellung von HSF
Der Hitzeschock-Faktor der vorliegenden Erfindung kann durch natürliche Verfahren (wie z.B. dadurch, daß man die Erzeugung des HSF aus einer Humanzelle oder einer tierischen Zelle induziert); durch Syntheseverfahren (wie z.B. dadurch, daß man zum Synthetisieren des HSF, von funktionellen Derivaten des HSF oder von Agonisten oder Antagonisten des HSF (entweder Immunglobulin- oder Nicht-Immunglobulin-Antagonisten) das Merrifield-Verfahren zum Synthetisieren von Polypeptiden anwendet); oder durch Anwendung der Technologie unter Verwendung von rekombinanter DNA (wobei man z.B. den HSF der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Wirtsorganismen oder -zellen (nämlich in Hefe, Bakterien, Pilzen, kultivierten Säugetierzellen usw.); oder aus rekombinanten Plasmiden oder viralen Vektoren produziert) gewonnen werden. Die Wahl, welches Verfahren angewendet werden soll, wird von solchen Faktoren, wie z.B. der leichten Handhabung oder Bequemlichkeit, der gewünschten Ausbeute usw. abhängen. Es ist nicht notwendig, daß man zur Erzeugung des HSF nur eine der oben beschriebenen Methoden oder nur eines der oben beschriebenen Verfahren oder nur eine der oben beschriebenen Technologien anwendet; vielmehr können die oben beschriebenen Verfahren, Methoden und Technologien zur Gewinnung des HSF miteinander kombiniert werden. Es wird in höchstem Maße bevorzugt, den HSF durch Klonieren und Exprimieren eines Gens oder einer cDNA-Sequenz herzustellen, welches bzw. welche für das präaktivierte HSF-Protein kodiert. Ein solches Gen oder eine solche cDNA-Sequenz wird nachstehend "HSF-Gen" oder "HSF-cDNA- Sequenz" genannt.
Es kann irgendeines aus einer Vielfalt von Verfahren zum Klonieren von entweder dem HSF-Gen (oder, in äquivalenter Weise, einer für den HSF kodierenden cDNA-Sequenz) angewendet werden. Ein solches Verfahren umfaßt das Analysieren (Durchmustern) einer Klonierungsvektor-Genbank von cDNA-Inserts (welche aus einer HSF-exprimierenden Zelle stammen) auf das Vorliegen eines Inserts, welches das HSF-Gen oder die HSF-cDNA- Sequenz enthält. Eine solche Analyse kann durchgeführt werden, indem man Zellen mit dem Vektor transfiziert und dann auf HSF- Expression prüft.
Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren dieses Gens erfordert die Bestimmung der Aminosäurensequenz des HSF-Moleküls. Zur Erfüllung dieser Aufgabe kann das HSF-Protein wie oben beschrieben isoliert und gereinigt und mit automatisierten Sequenziermaschinen analysiert werden. Alternativ kann das Molekül, etwa mit Bromcyan, oder mit Proteasen, wie z.B. Papain, Chymotrypsin oder vorzugsweise Trypsin, fragmentiert werden (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem., 257:9751-9758 (1982); Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein Res., 21:209-215 (1983)). Obwohl es möglich ist, die gesamte Aminosäurensequenz des HSF zu bestimmen, so ist es doch vorzuziehen, die Sequenz der Peptidfragmente des Moleküls zu bestimmen. Sind die Peptide mehr als 10 Aminosäuren lang, dann reicht die Sequenzinformation im allgemeinen aus, um ein Klonieren eines Gens, wie z.B. des Gens für den HSF (oder einer cDNA-Gensequenz des HSF-Gens), zu ermöglichen.
Sobald ein oder mehrere geeignete Peptidfragmente sequenziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen, welche befähigt sind, für diese Fragmente zu kodieren, geprüft. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon zum Kodieren für eine besondere Aminosäure herangezogen werden (Watson, J.D., in: Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977); S. 356-357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um die Aminosäurensequenzen zu identifizieren, welche durch Oligonukleotide kodiert werden können, die den niedrigsten Degenerationsgrad aufweisen. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß man die Sequenzen identifiziert, welche Aminosäuren enthalten, welche nur durch ein einziges Codon kodiert werden. Obwohl solche Aminosäurensequenzen gelegentlich durch nur ein einziges Oligonukleotid kodiert werden können, so kann dennoch die Aminosäurensequenz häufig durch irgendeines aus einem Satz von Oligonukleotiden kodiert werden. Wichtig dabei ist, daß zwar alle Glieder des Satzes Oligonukleotide enthalten, welche befähigt sind, für das Peptidfragment zu kodieren, und somit potentiell die gleiche Nukleotidsequenz wie die Gensequenz, welche für das Peptidfragment kodiert, enthalten, daß aber dennoch nur ein Glied des Satzes eine Nukleotidsequenz enthält, welche mit der Nukleotidsequenz dieser Gensequenz identisch ist. Da dieses Glied in dem Satz vorhanden ist und befähigt ist, sich auch in Gegenwart der anderen Glieder des Satzes an DNA zu hybridisieren, ist es möglich, den nicht-fraktionierten Satz von Oligonukleotiden in der gleichen Art und Weise zu verwenden, in der man ein einzelnes Oligonukleotid verwenden würde, um das Gen (oder die cDNA-Sequenz), welches (bzw. welche) für das Peptid kodiert, zu klonieren.
Auf eine Art und Weise, die zu der oben beschriebenen genau analog ist, kann man ein Oligonukleotid (oder einen Satz von Oligonukleotiden) verwenden, welches (bzw. welcher) eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu der Oligonukleotidsequenz oder zu dem Satz von Sequenzen ist, welche bzw. welcher befähigt ist, für das Peptidfragment zu kodieren.
Ein geeignetes Oligonukleotid, oder ein geeigneter Satz von Oligonukleotiden, welches bzw. welcher befähigt ist, für ein Fragment des HSF-Gens zu kodieren (oder welches bzw. welcher komplementär zu einem solchen Oligonukleotid oder Satz von Oligonukleotiden ist), wird (unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahrensweise) identifiziert, synthetisiert, und mit auf dem Fachgebiet wohlbekannten Mitteln, gegen eine DNA-Präparation, oder - in höherem Maße bevorzugt - gegen eine cDNA-Präparation hybridisiert, welche aus Humanzellen stammt, welche befähigt sind, HSF-Gensequenzen zu exprimieren. Die Techniken der Nukleinsäure-Hybridisierung sind von Maniatis, T. et al., in: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982); und von Haymes, B.D. et al., in: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), beschrieben worden, welche Publikationen durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden. Die dabei verwendete Quelle für die DNA oder cDNA ist vorzugsweise hinsichtlich der HSF-Sequenzen angereichert worden. Eine solche Anreicherung läßt sich am leichtesten dadurch erzielen, daß man eine cDNA verwendet, welche durch Extrahieren von RNA aus Zellen gewonnen worden ist, die unter Bedingungen kultiviert worden sind, welche eine HSF-Synthese induzieren.
Techniken, wie z.B. die oben beschriebenen, oder ähnliche Techniken, haben das erfolgreiche Klonieren von Genen für Human-Aldehyd-Dehydrogenasen (Hsu, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3771-3775 (1985)), Fibronektin (Suzuki, S. et al., Eur. Mol, Biol. Organ. J., 4:2519-2524 (1985)), des Human-Östrogenrezeptor-Gens (Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7889-7893 (1985)), von Genen für den Plasminogen- Aktivator vom Gewebeaktivatortypus (Pennica, D. et al., Nature, 301:214-221 (1983)) und von komplementärer DNA für Human-Entbindungstermin-Plazenta-alkalische Phosphatase (Kam, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8715-8719 (1985)), ermöglicht.
Gemäß einer bevorzugten, alternativen Art und Weise des Klonierens einer HSF-Gen-Sequenz wird eine Genbank aus Expressionsvektoren dadurch hergestellt, daß man die DNA oder - in höherem Maße bevorzugt - die cDNA aus einer Zelle, welche zur Expression des HSF befähigt ist, in einem Expressionsvektor kloniert. Die Genbank wird dann auf Glieder durchgemustert, welche zur Expression eines Proteins befähigt sind, das sich an einen Anti-HSF-Antikörper bindet, und das eine Nukleotidsequenz aufweist, welche befähigt ist, für Polypeptide zu kodieren, welche die gleiche Aminosäurensequenz wie der HSF oder Fragmente des HSF aufweisen.
Das klonierte HSF-Gen, welches nach den oben beschriebenen Verfahren erhalten worden ist, kann in wirksamer Weise an einen Expressionsvektor gebunden und zur Erzeugung des HSF-Proteins in Bakterien- oder Eukaryontenzellen eingeführt werden. Die Techniken für solche Manipulationen sind von Maniatis, T. et al., supra, beschrieben worden und sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.

Anwendungen des HSF und seiner funktionellen Derivate, Agonisten und Antagonisten

A. Diagnostische Anwendungen

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zum Diagnostizieren des Vorliegens von Streß in Organen oder Geweben, oder in Extrakten, Sektionen usw. von Organen oder Geweben verwendet werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zum Diagnostizieren des Ausmaßes von Streß in Zellen oder Zellextrakten verwendet werden. Die Möglichkeit, eine solche Diagnose durchzuführen, ist dann besonders erwünscht, wenn es darum geht, die Eignung von Organen (wie z.B. Niere, Leber, Herz usw.) oder von Geweben (Haut, Knochenmark usw.) für Therapien zu bewerten, bei denen Organe oder Gewebe transplantiert oder ersetzt werden sollen.
Das Vorliegen oder das Ausmaß von Streß in einer besonderen biologischen Probe können durch Identifizieren oder Quantifizieren der Menge an aktiviertem HSF, die in dieser Probe vorhanden ist, festgestellt werden. Zu diesem Zweck kann irgendein Verfahren aus einer Vielfalt von Verfahren angewendet werden, mit welchem bzw. welchen man die Menge an aktiviertem HSF in einer Probe identifizieren (oder quantifizieren) kann. Es ist jedoch in höchstem Maße bevorzugt, auf den aktivierten HSF unter Verwendung eines Antikörpers, und insbesondere eines monoklonalen Antikörpers (oder eines Fragmentes von entweder einem polyklonalen oder einem monoklonalen Antikörper) zu prüfen, welcher befähigt ist, sich an den aktivierten HSF zu binden.
Die diagnostischen Tests für den Nachweis des aktivierten HSF können bildgebende Tests (wie z.B. Ganzkörper- oder Organbilder) umfassen, oder sie können eine Biopsie oder einen insitu-Test von Zellen oder von Organ- oder Gewebeschnitten umfassen. Wie oben bereits erwähnt worden ist, können solche Tests anhand von subzellulären Extrakten aus Organen, Geweben, Zellen usw. durchgeführt werden.
Die Antikörper (oder Fragmente hievon) der vorliegenden Erfindung sind besonders gut geeignet für eine Verwendung in Immunoassays, wo sie in flüssiger Phase oder an einen Festphasenträger gebunden, eingesetzt werden können.
Die Antikörper oder Fragmente hievon können unter Verwendung von irgendeinem aus einer Vielfalt von Markern und Markierungsverfahren markiert werden. Beispiele von Typen von Markern, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, aber ohne Beschränkung darauf, Enzym- Labels, Radioisotopen-Labels und nicht-radioaktive Isotopen- Labels, Fluoreszenz-Labels, und Chemilumineszenz-Labels.
Beispiele geeigneter Enzym-Labels umfassen Malat-Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha-Glycerinphosphat-Dehydrogenase, Triosphosphat-Isomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribunuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholin-Esterase usw.
Beispiele geeigneter Radioisotopen-Labels umfassen ³H, ¹¹¹In, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²P, ³&sup5;S, ¹&sup4;C, &sup5;¹Cr, &sup5;&sup7;Co, &sup5;&sup8;Co, &sup5;&sup9;Fe, &sup7;&sup5;Se, ¹&sup5;²Eu, &sup9;&sup0;Y, &sup6;&sup7;Cu, ²¹&sup7;Ce, ²¹¹At, ²¹²Pb, &sup4;&sup7;Sc, ¹&sup0;&sup9;Pd usw. ¹¹¹In ist ein bevorzugtes Isotop. Seine Verwendung kann wesentliche Vorteile haben, weil dabei das Problem der Enthalogenierung des mit ¹²&sup5;I oder ¹³¹I-markierten, monoklonalen Antikörpers durch die Leber vermieden wird. Außerdem hat dieses Radionuklid eine für die Bildgebung günstigere Gammastrahlen-Emissionsenergie (Perkins, A.C. et al., Eur. J. Nucl. Med., 10:296-301 (1985); Carasquillo, J.A. et al., J. Nucl. Med., 28:281-287 (1987)).
Beispiele geeigneter, nicht-radioaktiver Isotopen-Labels umfassen ¹&sup5;&sup7;Gd, &sup5;&sup5;Mn, ¹&sup6;²Dy, &sup5;²Tr, &sup5;&sup6;Fe usw.
Beispiele geeigneter Fluoreszenz-Labels umfassen ein ¹&sup5;²Eu-Label, ein Fluorescein-Label, ein Isothiocyanat-Label, ein Rhodamin-Label, ein Phycoerythrin-Label, ein Phycocyanin- Label, ein Allophycocyanin-Label, ein o-Phthalaldehyd-Label, ein Fluorescamin-Label usw.
Beispiele von Chemilumineszenz-Labels umfassen ein Luminal-Label, ein Isoluminal-Label, ein Label aus einem aromatischen Acridiniumester, ein Imidazol-Label, ein Label aus einem Acridiniumsalz, ein Oxalatester-Label, ein Luciferin-Label, ein Luciferase-Label, ein Aequorin-Label usw.
Dem Durchschnittsfachmann werden andere geeignete Labels geläufig sein, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Das Binden dieser Labels an Antikörper oder Fragmente hievon kann unter Anwendung von Standardtechniken bewirkt werden, die dem Durchschnittsfachmann gewöhnlich bekannt sind. Typische Techniken sind von Kennedy, J.H. et al. (Clin. Chim. Acta, 70:1-31 (1976)), und von Schurs, A.H.W.M. et al. (Clin. Chim. Acta, 81:1-40 (1977)), beschrieben worden. In dieser letztgenannten Publikation erwähnte Kupplungstechniken sind das Glutaraldehyd-Verfahren, das Periodat-Verfahren, das Dimaleinimid-Verfahren und das m-Maleinimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren, welche Verfahren allesamt durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden.
Der Nachweis der Antikörper (oder von Fragmenten von Antikörpern) gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch die Verwendung von Trägern verbessert werden. Wohlbekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextrane, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Natur des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder etwas löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch irgendeine mögliche, strukturelle Konfiguration aufweisen, vorausgesetzt, daß das zu kuppelnde Molekül befähigt ist, sich an den HSF zu binden. So kann die Trägerkonfiguration kugelförmig, wie z.B. bei Perlen, oder zylindrisch, wie bei der Innenseite eines Proberöhrchens, oder bei der Außenseite eines Stäbchens, sein. Alternativ kann die Oberfläche flach, wie z.B. bei einem Blatt, einer Platte, einem Teststreifen usw., sein. Dem Fachmann werden sich viele andere geeignete Träger zum Binden eines monoklonalen Antikörpers anbieten, oder wird er in der Lage sein, solche Träger durch Anwendung von Routineversuchen festzustellen.
Die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung können für den quantitativen oder qualitativen Nachweis des Vorliegens von aktiviertem HSF verwendet werden. Ein solcher Nachweis kann unter Anwendung irgendeines aus einer Vielfalt von Immunoassays bewirkt werden. Beispielsweise ist es durch radioaktives Markieren der Antikörper oder von Fragmenten von Antikörpern möglich, den aktivierten HSF durch die Anwendung von Radioimmunoassays festzustellen. Der aktivierte HSF läßt sich von "präaktiviertem" HSF durch seine Fähigkeit, sich an HSE-hältige DNA zu binden, unterscheiden. Die Menge eines solchen aktivierten HSF, die in einer Probe vorliegt, kann unter Anwendung eines Radioimmunoassays gemessen werden. Eine gute Beschreibung eines Radioimmunoassays (RIA) findet sich in "Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology", von Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), unter besonderer Bezugnahme auf das Kapitel mit dem Titel: "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., welches durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird.
Der Antikörper oder die Antikörperfragmente der vorliegenden Erfindung können auch für die Verwendung in einem immunometrischen Test adaptiert werden, der auch als "Zweistellen"-Test oder "Sandwich"-Test bekannt ist. Bei einem typischen immunometrischen Test wird eine Menge des unmarkierten Antikörpers (oder Antikörperfragmentes) an einen festen Träger gebunden, der in der zu prüfenden Flüssigkeit (nämlich in Blut, Lymphe, verflüssigtem Stuhl, Gewebehomogenisat, Zellextrakt usw.) unlöslich ist, und eine Menge des nachweisbar markierten, löslichen Antikörpers wird zugegeben, um einen Nachweis und/oder eine Quantifizierung des ternären Komplexes zu ermöglichen, der sich zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem aktivierten HSF und dem markierten Antikörper gebildet hat.
Typische immunometrische Tests umfassen "Vorwärts"-Tests, bei denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zuerst mit der zu prüfenden Probe in Berührung gebracht wird, um den aktivierten HSF aus der Probe durch Bildung eines binären Komplexes aus dem Festphasen-Antikörper und dem HSF zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe, einschließlich des nicht-umgesetzten Antigens, falls ein solches vorhanden ist, zu entfernen, wonach er mit der Lösung in Berührung gebracht wird, welche eine unbekannte Menge des markierten Antikörpers enthält (welcher als ein "Reporter-Molekül" fungiert). Nach einer zweiten Inkubationszeit, welche dazu dient, es dem markierten Antikörper zu ermöglichen, mit dem aktivierten HSF einen Komplex zu bilden, welcher HSF an den festen Träger durch den nicht-markierten Antikörper gebunden ist, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nicht-umgesetzten, markierten Antikörper zu entfernen. Diese Art von Vorwärts- Sandwich-Test kann ein einfacher "Ja/Nein"-Test sein, um festzustellen, ob aktivierter HSF vorhanden ist, oder sie kann dadurch quantitativ gemacht werden, daß man den Meßwert für den markierten Antikörper mit jenem Meßwert vergleicht, der für eine Standardprobe erhalten worden ist, die bekannte Mengen des HSF enthält. Solche "Zweistellen"- oder "Sandwich"-Tests sind von Wide in "Radioimmune Assay Method" auf den Seiten 199-206 beschrieben worden, welches Buch von Kirkham und Hunter, bei E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970, herausgegeben worden ist.
Bei einer anderen Art von "Sandwich"-Test, welche ebenfalls nützlich sein kann, um auf den aktivierten HSF der vorliegenden Erfindung zu prüfen, werden sogenannte "Simultan"- oder "Umkehr"-Tests verwendet. Ein Simultantest umfaßt eine einzige Inkubationsstufe, weil der an den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig zu der zu prüfenden Probe zugegeben werden. Nach Beendigung der Inkubation wird der feste Träger gewaschen, um den Rückstand aus flüssiger Probe und nicht komplex gebundenem, markiertem Antikörper zu entfernen. Dann wird das Vorliegen des an den festen Träger gebundenen, markierten Antikörpers in der gleichen Weise bestimmt, wie dies bei einem herkömmlichen "Vorwärts"- Sandwich-Test der Fall wäre.
Bei dem "Umkehr"-Test wird eine stufenweise Zugabe angewendet, wobei erstens eine Lösung des markierten Antikörpers zu der flüssigen Probe zugegeben wird, und wobei daran anschließend, nachdem eine geeignete Inkubationszeit verstrichen ist, der an einen festen Träger gebundene, unmarkierte Antikörper zugegeben wird. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase in herkömmlicher Weise gewaschen, um sie von dem Rückstand aus der zu prüfenden Lösung und der Lösung aus nicht umgesetztem, markiertem Antikörper zu befreien. Die Bestimmung des an einen festen Träger gebundenen, markierten Antikörpers wird dann wie bei den "Simultan"- und "Vorwärts "-Tests vorgenommen.
Wie oben bereits erläutert worden ist, erfordern die immunometrischen Tests auf HSF, daß das spezielle Bindungsmolekül mit einem "Reportermolekül" markiert ist. Diese wie oben identifizierten Reportermoleküle oder Labels sind herkömmlich und auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung stellen Enzym-Labels eine bevorzugte Ausführungsform dar. Kein einziges Enzym ist ideal für die Verwendung als Label in jedem denkbaren immunometrischen Test. Vielmehr muß man feststellen, welches Enzym für ein besonderes Testsystem geeignet ist. Wichtige Kriterien für die Wahl der Enzyme sind die Umsatzzahl des reinen Enzyms (die Anzahl von Substratmolekülen, welche in das Produkt pro Enzymstelle und pro Zeiteinheit umgewandelt werden), die Reinheit der Enzympräparation, die Nachweisempfindlichkeit des Enzym-Produktes, die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Nachweises der Enzymreaktion, das Fehlen von störenden Faktoren oder von enzymartiger Aktivität in der Testflüssigkeit, die Beständigkeit des Enzyms und von dessen Konjugat, die Verfügbarkeit und die Kosten des Enzyms und von dessen Konjugat, und dgl. mehr. Die Enzyme, welche als bevorzugte Labels in den immunometrischen Tests der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen Peroxidase, alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase, Glycoamylase, Malat-Dehydrogenase und Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase. Urease befindet sich unter den in höherem Maße bevorzugten Enzym-Lagels, und zwar insbesondere wegen der chromogenen pH-Indikatoren, welche die Urease-Aktivität für das unbewaffnete Auge leicht sichtbar machen.

B. Therapeutische Anwendungen

Mittel, welche die Menge an aktiviertem HSF in einem Subjekt (nämlich einem Human-Subjekt oder einem tierischen Subjekt) erhöhen, können in der Therapie von irgendeiner Krankheit angewendet werden, welche mit der Hitzeschock-Streß-Antwort verbunden ist. Wie oben bereits erörtert worden ist, ist die Hitzeschock-Antwort ein in hohem Maße evolutionär konservierter Ablauf, den ein Organismus anwendet, um auf eine Vielfalt von Stresses zu antworten. Unter diese Stresses fallen Hypoxie und Ethanol.
Die pathophysiologischen Manifestationen der Hypoxie sind gut dokumentiert. Die Hypoxie ist jener Mechanismus, der direkt sowohl für Myokardinfarkte als auch für Hirninfarkte verantwortlich ist. Wäre daher ein Mensch oder ein Tier besser in der Lage, auf einen Hypoxie-Insult zu antworten, dann würde das betreffende Subjekt potentiell den Insult mit geringeren bleibenden Schäden überleben. Es ist aufgezeigt worden, daß die Begrenzung der Größe eines Myokardinfarktes einen direkten Einfluß auf das Überleben des Patienten hat. Mittel, welche die Menge an aktiviertem HSF in einem Subjekt erhöhen, sind daher dahingehend nützlich, daß sie einen solchen Streß abschwächen. Eine solche Therapie ist auch bei der Behandlung von Ethanolinduziertem Streß wertvoll, weil sie in der Lage ist, die Stoffwechselstörung zu begrenzen, welche das Ergebnis einer Überdosis von Ethanol ist.
Versorgt man einen Patienten mit Antikörpern, oder Fragmenten hievon, welche befähigt sind, den HSF zu binden, oder verabreicht man an einen Empfänger-Patienten den HSF (oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat hievon), oder ein Mittel, das in der Lage ist, die Aktivierung des HSF zu fördern, dann wird die Dosierung des verabreichten Mittels in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie z.B. dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, der früheren medizinischen Geschichte des Patienten usw., variieren. Im allgemeinen ist es erwünscht, an den Empfänger eine Dosierung des Antikörpers zu verabreichen, welche in einen Bereich von 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) fällt, obgleich auch eine niedrigere oder höhere Dosierung verabreicht werden kann. Verabreicht man die oben beschriebenen Verbindungen an einen Patienten, dann ist es vorzuziehen, solche Verbindungen in einer Dosierung zu verabreichen, welche ebenfalls in einen Bereich von 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) fällt, obgleich auch eine niedrigere oder höhere Dosierung verabreicht werden kann.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können an die Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Werden solche Verbindungen durch Injektion verabreicht, dann kann die Verabreichung durch eine kontinuierliche Infusion oder durch einen einzelnen Bolus oder durch mehrere Boli vorgenommen werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sollen an die Empfänger-Subjekte in einer Menge verabreicht werden, welche ausreicht, um die Hitzeschock-Antwort zu bewirken. Eine Menge gilt dann als ausreichend, um eine Hitzeschock-Antwort zu "bewirken", wenn die Dosierung, der Verabreichungsweg des Mittels usw. ausreichen, um eine solche Antwort zu beeinflussen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können entweder vor dem Einsetzen eines Streß-verursachenden Zustandes (um die erwartete Schädigung durch einen solchen Zustand zu unterdrücken) oder nach dem Beginn des Zustandes verabreicht werden.
Von einer Zusammensetzung gilt, daß sie "pharmakologisch annehmbar" ist, wenn ihre Verabreichung von einem Empfänger-Patienten vertragen werden kann. Von einem solchen Mittel sagt man, daß es in einer "therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn sein Vorhandensein zu einer nachweisbaren Veränderung in der Physiologie eines Empfänger-Patienten führt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei diese Materialien, oder deren funktionelle Derivate, im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger-Vehikel vereinigt werden. Geeignete Vehikel und deren Formulierung, einschließlich anderer Human- Proteine, z.B. Human-Serumalbumin, sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Aufl., Osol, A., Hsg., Mack, Easton, PA (1980)), beschrieben. Zur Ausbildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, welche für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge der oben beschriebenen Verbindungen zusammen mit einer geeigneten Menge des Träger-Vehikels enthalten.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können angewendet werden, um die Wirkungsdauer zu regeln. Präparationen mit geregelter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren erzielt werden, welche die Verbindungen komplex binden oder absorbieren. Die geregelte Freigabe kann durch die Auswahl entsprechender Makromoleküle (z.B. von Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose oder Protaminsulfat) und die Konzentration von Makromolekülen sowie durch die Verfahren der Einverleibung, zu dem Zwecke der Regelung der Freigabe, erreicht werden. Ein anderes mögliches Verfahren zur Regelung der Wirkungsdauer durch Präparationen mit geregelter Freigabe besteht darin, die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Teilchen aus einem polymeren Material, wie z.B. aus Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Poly (milchsäure) oder Ethylenvinylacetatcopolymeren, einzuverleiben. Alternativ ist es möglich, diese Materialien in Mikrokapseln einzufangen, statt diese Mittel in Polymerteilchen einzuverleiben, wobei diese Mikrokapseln z.B. durch Koazervierungstechniken, oder z.B. durch Grenzflächenpolymerisierung, hergestellt worden sind, wie z.B. in Hydroxymethylzellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat) -Mikrokapseln, oder in kolloidalen Arzneimittel- Freigabesystemen einzuverleiben, wie z.B. in Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben.
Nachdem die Erfindung nunmehr generell beschrieben worden ist, wird dieselbe unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele leichter verständlich sein, welche Beispiele zum Zwecke der Veranschaulichung zur Verfügung gestellt werden, und welche die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen, sofern nichts anderes angegeben ist.

BEISPIEL 1

Test auf den Hitzeschock-Faktor

Der an die HSF gebundene Human-HSF kann als Komplex nachgewiesen werden, der als charakteristische Mobilität auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel wandert (Kingston, R.E. et al., Mol. Cell. Biol., 7:1530 (1987); Sorger, P.K. et al., Nature, 329:81 (1987)). Zellkernextrakte aus HeLa-Zellen, welche bei 43ºC gezüchtet worden sind, enthalten signifikant mehr von dieser Bindungsaktivität als Zellkernextrakte aus HeLa-Zellen, welche bei 37ºC gezüchtet worden sind. Zur Entwicklung eines in-vitro-Systems zur Untersuchung dieses induzierenden Einflusses wurden Zellkernextrakte und Zytoplasmaextrakte aus HeLa-Zellen hergestellt, welche bei 37ºC gezüchtet worden sind (Dignam, D. et al., Nucl. Acids Res., 11:1475 (1983), welche Literaturstelle durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird). Diese Extrakte wurden während einer Stunde auf 43ºC erhitzt, und die Menge der HSE-Bindungsaktivität wurde unter Anwendung der Bandenretentionstechnik bestimmt.
Es wurden Zellkernextrakte und Zytoplasmaextrakte von jeweils 4 l aus HeLa-Zellen hergestellt, welche bei 37ºC gezüchtet worden sind (und welche mit NE bzw. S100 bezeichnet wurden), und es wurden Zellkernextrakte von jeweils 1 l aus HeLa- Zellen sofort nach einer einstündigen Inkubation bei 43ºC (HSNE), wie von Dignam et al. (Nucl. Acids Res., 11:1475 (1983)) beschrieben, hergestellt. Die Extrakte wurden in Puffer (20 mM Hepes, pH 7,9, 20% (Vol./Vol.) Glycerin, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,5 mM Dithiothreit) dialysiert und wurden ohne Zugabe inkubiert. Die Proteine (5,0 ug des Proteins des NE oder 8,5 ug S100, oder beide) wurden während 1 h bei entweder 0ºC oder 43ºC inkubiert. Die Extrakte wurden dann bei 30ºC während 30 min mit einem mit ³²P markierten, synthetischen Oligonukleotid, welche das HSE (Basen -11 bis 80) des Human-hsp70-Promotors enthielt, inkubiert (Sen, R. et al., Cell, 47:921 (1986); Prywes, R. et al., Cell, 47:777 (1986); Hayes, T.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1272 (1987)). Die Bindungsreaktionsgemische (20 ul) enthielten 12 mM HEPES, pH 7,9, 12% (Vol./Vol.) Glycerin, 60 mM KCl, 0,12 mM EDTA, 0,3 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,3 mM Dithiothreit, 2 mM MgCl&sub2;, 100 ug Poly(dI-dC) Poly(dI-dC) pro Mol, etwa 0,2 ng der markierten DNA und den Extrakt. Die Reaktionsgemische wurden dann auf einem 4%igen, nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterworfen.
Als markierte Sonde wurde ein 36-meres, doppelsträngiges Oligonukleotid verwendet, welches das HSE (die Basen -80 bis -- 115 eines Human-hsp70-Promotors) enthielt. Der Zellkernextrakt enthielt weder vor noch nach dem Erhitzen eine Bindungsaktivität, während gefunden wurde, daß der Zytoplasmaextrakt nur nach einem Inkubieren bei 43ºC signifikante Mengen von Bindungsaktivität enthielt. Durch die Zugabe des Zellkernextraktes zu dem Zytoplasmaextrakt wurde das Ausmaß der Induktion nicht verändert.
Die Ergebnisse dieses Versuches zeigen, daß Zytoplasmaextrakte aus nicht durch Wärme induzierten HeLa-Zellen eine durch Wärme induzierbare Aktivität enthalten, welche sich in der Region des Hitzeschockelementes bindet, wie dies durch einen Gel- Mobilitätsverschiebungs-Test bestimmt wurde.

BEISPIEL 2

Isolierung und Reinigung des Hitzeschock-Faktors

A) Herstellung eines Zellkernextraktes

Human-HeLa-Zellen wurden in einer Suspensionskultur gezüchtet, welche durch ein "Minimal Essential Medium" (in der Modifikation gemäß Joklik), das durch 5% Pferdeserum ergänzt war, unterhalten wurde. Die Zellen wurden bis zu einer Dichte von etwa 500.000 Zellen pro ml gezüchtet. Die Zellen wurden dann geerntet, und die Zellkernextrakte wurden im wesentlichen auf die Art und Weise hergestellt, wie dies von Dignam et al. (Nucl. Acids Res., 11:1475 (1983)) beschrieben worden ist. Die Zellkernextrakte wurden in Dignam-Puffer D (20% Vol./Vol.) Glycerin, 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,1M KCl, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 0,2 mM EDTA) dialysiert.

B) Fraktionierungsstufe Nr. 1

Der HeLa-Zellkernextrakt in Dignam-Puffer D wurde über eine Zellulosesäule mit doppelsträngiger DNA aus Kälberthymus (Pharmacia) geführt, welche mit dem Puffer D prääquilibriert worden war. Die Säule wurde mit abgestuften Zuwächsen des Puffers D eluiert, welche 0,3M KCl und 1,5M KCl enthielten. Die HSF-Aktivität wurde mit dem Gel-Elektrophorese-Mobilitätsverschiebungs-Test von Kingston et al. (Mol. Cell. Biol., 7:1530 (1987)) überwacht. Es wurde gefunden, daß die HSF-Aktivität bei 0,3M KCl eluiert wird. Die die HSF-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, und das Detergens NP-40 wurde bis zu einer Konzentration von 0,1% (Vol./Vol.) zugegeben.

C) Fraktionierungsstufe Nr. 2

Bei der zweiten Reinigungsstufe verließ man sich auf das spezifische Binden des HSF an die ihm verwandte Sequenz, nämlich das HSE. Für diese Stufe wurde eine Affinitätschromatographie-Säule mit einem sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid nach dem Verfahren von Kadonaga et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5889 (1986)) konstruiert. Es wurde ein zu sich selbst komplementäres, 28 Basen umfassendes Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz:
5' - GATCCTAGAAGCTTCTAGAAGCTTCTAG - 3'
synthetisiert.
Dieses Oligonukleotid wurde zur Bildung eines doppelsträngigen Moleküls mit 5'-überhängenden GATC-Enden und zwei überlappenden HSEs mit sich selbst hybridisiert. Diese Moleküle wurden phosphoryliert und zu Ketten aus sich wiederholenden Einheiten ("Concatamers") mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 5 bis 10 Einheiten ligiert. Diese DNA wurde unter Verwendung von Bromcyan kovalent an Sepharose CL-2B (Pharmacia) gebunden. Dies stellte dann die Affinitätschromatographie-Säule dar.
Vereinigte Fraktionen aus der Stufe Nr. 1 wurden auf die Affinitätschromatographie-Säule aufgegeben, welche mit dem Puffer 0,3D'ins (nämlich dem Puffer D mit 0,3M KCl, 0,1% (Vol./Vol.) NP-40, und 0,1 mg/ml Rinderinsulin) prääquilibriert worden war. Die HSF-Aktivität wurde mit einem einstufigen Waschvorgang mit dem Puffer 0,8D'ins (0,8M KCl, 0,1% (Vol./Vol.) NP-40, und 0,1 mg/ml Rinderinsulin) eluiert.

D) Fraktionierungsstufe Nr. 3

Die vereinigten Fraktionen aus der vorhergehenden Stufe wurden auf 0,1M KCl verdünnt und auf eine MONO Q FPLC-Säule (Pharmacia) aufgegeben. Die Säule wurde mit einem linearen KCl- Gradienten von Fraktionen aus 0,1 bis 1,0M KCl in dem Puffer D'ins. eluiert. Es wurde auf die HSF-Aktivität geprüft, und die aktiven Fraktionen wurden vereinigt. Das eluierte Material ergab bei der Analyse durch eine SDS-Gel-Elektrophorese zwei Banden. Es wird angenommen, daß eine dieser Banden ein Abbauprodukt der anderen darstellt. So zeigt das Material einen Reinheitsgrad zwischen 50% (wenn die zwei Banden nicht miteinander in Beziehung stehen) und einen Reinheitsgrad von 95% (wenn die zwei Banden miteinander in Beziehung stehen)

BEISPIEL 3

Kennzeichnung des Hitzeschock-Faktors

Die aus dem Zytoplasma stammende, durch Wärme induzierbare Bindungsaktivität bildete eine einzelne, beibehaltene Bande, welche gemeinsam mit der unteren der zwei beibehaltenen Banden wanderte, welche mit einem Zellkernextrakt aus hitzegeschockten Zellen erhalten worden waren. Die Fraktionierung des Zytoplasmaextraktes auf entweder Phosphozellulose oder Biorex 70 ergibt eine Fraktion, welche nach einer Inkubation bei 43ºC zwei Banden von entsprechender Mobilität erzeugt. Das Vorliegen von nur der unteren Bande nach dem Induzieren des nicht-fraktionierten Extraktes bei 43ºC kann daher auf einen Inhibitor in dem Extrakt zurückzuführen sein. Die Sequenzspezifität dieses Bindens wurde geprüft, um zu verifizieren, daß das Binden eine Wechselwirkung mit dem HSE darstellte.
Die Sequenzspezifität der durch Wärme induzierbaren Bindungsaktivität, welche in dem S100-Extrakt vorhanden ist, wurde durch Prüfen der Kompetition der durch Wärme induzierten Bande mit Fragmenten, welche das Hitzeschock-Element und nicht-spezifische Fragmente enthalten, gekennzeichnet. Die Kompetition der durch Wärme induzierten Bande mit Fragmenten, welche das Hitzeschock-Element und nicht-spezifische Fragmente enthielten, wurde wie folgt untersucht. 8,5 ug des S100-Proteins wurden vor der Inkubation mit der DNA-Sonde während 1 h bei 43ºC inkubiert (oder auch nicht inkubiert). Die S100-Extrakte wurden hergestellt, und die DNA-Inkubationen und die Elektrophorese wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Inkubationsgemische enthielten auch entweder eine nicht-radioaktive Kompetitor-DNA (die Basen -84 bis +5 des Human-hsp70-Gens (welches kein Hitzeschock-Element enthält) in einem 5- oder 10-fachen molaren Überschuß, oder die Basen -148 bis -74 des Human-hsp70-Gens (welches das Hitzeschock-Element um die Base -100 zentriert enthält) oder ein 310 Basenpaare umfassendes Fragment eines D. melanogaster-Hitzeschock-Gens, welches drei Hitzeschock-Elemente enthält (XhoI [Base -200] bis EcoRI [Base +110] des Plasmides pSP6-HS-9 (Wurm, F.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5415 (1986)), und welches aus dem von Holmgren et al. (Cell, 18:1359 (1979)) beschriebenen, klonierten Fragment 232 stammt, oder ein 39 Basenpaare umfassendes, doppelsträngiges, synthetisches Oligonukleotid, welches die CAAT-Sequenz enthält (oberer Strang, 5'-CA CCG TCG ATT TCC CTT CTG AGC CAA TCA CCG AGC TCG A); oder die 36 Basenpaare umfassende, doppelsträngige, synthetische Oligonukleotid-Sonde. Die DNA-Konzentrationen wurden durch Agarose-Gelelektrophorese abgeschätzt.
Zur weiteren Kennzeichnung der Bindungsspezifität wurde eine Methylierungs-Interferenzanalyse durchgeführt (Siebenlist, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:122 (1980); Gilman, M.Z. et al., Mol. Cell. Biol., 6:4305 (1986)). Ein teilweise methyliertes Fragment, welches das HSE enthielt, wurde mit erhitztem Zytoplasmaextrakt inkubiert, und die gebundenen und freien Fragmente wurden abgetrennt und analysiert. Die Analyse wurde mit einem radioaktiven Label auf entweder dem oberen oder dem unteren Strang durchgeführt. Der Zytoplasmaextrakt wurde während 1,5 h auf 43ºC erhitzt. Die Bindungsreaktionen wurden wie oben beschrieben durchgef+hrt. Bei diesen Tests wurden 120 ug des erhitzten Zytoplasmaextraktes (in vitro) oder 16 ug HSNE (in vivo) mit 20 ng eines markierten Fragmentes inkubiert, welches die Basen -148 bis -74 des Promotors enthielt. Die gebundenen und freien Komplexe wurden auf einem nicht-denaturierenden Gel aufgetrennt, eluiert und wie von Gilman, M.Z. et al. (Mol. Cell. Biol., 6:4305 (1986)), beschrieben analysiert. Die Hitzeschock-Übereinstimmungssequenz ist C--GAA--TTC--G. Alle Fragmente, welche ein HSE enthielten, traten um das Binden in Konkurrenz, während die Fragmente, welche das HSE nicht enthielten, nicht in Konkurrenz traten. Fünf G-Reste in dem HSE oder neben demselben waren in der gebundenen DNA unterrepräsentiert,, was darauf hinweist, daß der gebundene Faktor mit diesen Resten in engem Kontakt steht. Ein ähnliches Muster zeigt sich bei dem Faktor, der in Zellkernextrakten aus hitzegeschockten HeLa-Zellen vorgefunden wird. Die Kompetitionsdaten und diese DMS-Interferenzdaten zeigen, daß die in vitro induzierte Bindungsaktivität die gleiche Sequenzspezifität wie jene aufweist, die nach der Induktion in ganzen Zellen beobachtet wird (Kingston, R.E. et al., Mol. Cell. Biol., 7:1530 (1987)).

BEISPIEL 4

Kennzeichnung der Auslösung des Bindens

Das Auslösen der Bindungsaktivität in intakten HeLa-Zellen wurde verglichen mit dem Induzieren des HSE in einem zellfreien System. Es wurde gefunden, daß das Auslösen der Bindungsaktivität in intakten HeLa-Zellen mit einer schnellen Kinetik stattfindet, während das Induzieren in dem zellfreien System langsamer vor sich geht. Die Bestimmung der Kinetik und der Temperaturabhängigkeit der durch Wärme induzierbaren, in dem S100-Extrakt vorhandenen Bindungsaktivität wurden wie folgt durchgeführt. Die S100-Extrakte wurden wie oben beschrieben hergestellt, und die DNA-Inkubation und die Elektrophorese wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Proben enthielten 8,5 ug Protein aus dem S100-Extrakt. Vor der Durchführung der Bindungsreaktionen wurden die Proben während 1 h bei 43ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden dann einige Proben vor den Bindungsreaktionen während einer zusätzlichen Stunde bei 37ºC, 30ºC oder 0ºC inkubiert. Die S100-Extrakte wurden vor den Bindungsreaktionen bei 43ºC inkubiert. Die Spitzenhöhen der Bindungsaktivität wurden nach 45 bis 60 min des Inkubierens bei 43ºC beobachtet. Die optimale Temperatur für das Auslösen der Bindungsaktivität stand in naher Wechselbeziehung mit der Temperatur, bei welcher die HeLa-Zellen die Hitzeschock-Antwort durchmachen. Es gab nur eine sehr geringfügige Auslösung der Bindungsfähigkeit bei 37ºC in vitro, während ein erhöhtes Induzieren bei 40ºC und bei 43ºC beobachtet wird, und keine Induktion bei 50ºC beobachtet wurde. Sobald die Bindungsfähigkeit induziert worden war, wurde sie als beständig befunden; und nach dem Auslösen bei 43ºC ergab eine weitere Inkubation auf Eis, bei 30ºC oder bei 37ºC während bis zu einer Stunde, keine Entaktivierung des aktivierten Faktors.

BEISPIEL 5

Auslösen des HSF aus HELA-Zellen

Die Menge des HSF in einem Zytoplasmaextrakt, der während 1 h auf 43ºC erhitzt worden war, wurde unter Anwendung der Mobilitätsverschiebungs-Gelelektrophorese unter Bedingungen bestimmt, bei denen die Menge des gemessenen HSF linear mit dem zunehmenden Protein zunahm. Die Menge des HSF in einem Zellkernextrakt aus HeLa-Zellen, welche intakt auf 43ºC erhitzt worden waren, wurde in der gleichen Weise gemessen. Die Aktivitäten wurden dann unter Berücksichtigung der Anzahl der Zellen, welche zur Herstellung der betreffenden Extrakte verwendet worden waren, korrigiert. Die Menge des HSF in dem erhitzten Zytoplasmaextrakt betrug 12.200 Einheiten pro 10&sup6; Zellen, während der Zellkernextrakt aus erhitzten Zellen 11.800 Einheiten pro 10&sup6; Zellen enthielt. Die Einheiten werden definiert als die Menge an markierter HSE-Sonde, welche auf einem Mobilitätsverschiebungsgel zurückgehalten wird.
Die Kennmerkmale des In-vitro-Auslösens der Bindungsfähigkeit des HSF legen es durchaus nahe, daß diese Aktivierung jene widerspiegelt, welche beobachtet wird, wenn intakte HeLa-Zellen hitzegeschockt werden. Die HSE-Bindungsspezifität nach der Invitro-Aktivierung ist identisch mit jener, welche beobachtet wird, wenn der Faktor aus hitzegeschockten HeLa-Zellen isoliert wird. Das Temperaturprofil für die In-vitro-Induktion gleicht jenem, das für intakte Zellen beobachtet wird. Außerdem ist die Aktivierung der HSE-Bindungsaktivität in vitro wirksam. Das Induzieren eines Zytoplasmaextraktes in vitro führt zu 12,2 Einheiten des HSF pro 10&sup6; Zellen, während die Kerne von hitzegeschockten HeLa-Zellen 11,8 Einheiten des HSF pro 10&sup6; Zellen enthalten.

BEISPIEL 6

Wirkung der Temperatur auf die HSF-Aktivierung

Die erhitzten Zellen enthalten erhöhte Mengen an denaturiertem Protein, und diese Tatsache hat zu der Annahme geführt, daß dadurch die Aktivierung des HSF auf einem Weg des Proteinabbaues ausgelöst wird (Anantham, J. et al., Science, 232:522 (1986); Finley, D. et al., Cell, 17:43 (1984); Goff, S.A. et al., Cell, 41:587 (1985); Munro, S. et al., Nature (London), 317:477 (1985)). Dieses Modell sagt voraus, daß die Aktivierung in dem In-vitro-System auf eine temperaturabhängige Art und Weise vor sich geht, weil bei 43ºC mehr denaturiertes Protein als bei 37ºC vorhanden ist. Im Gegensatz hierzu wurde durch die Zugabe von gekochtem BSA zu dem Zytoplasmaextrakt keine Änderung in der Geschwindigkeit des Induzierens des HSF bei entweder 37ºC oder 43ºC (siehe oben) hervorgebracht, noch wurde dadurch das Ausmaß der Induktion verändert. Die Zugabe von gekochtem Zytoplasmaextrakt hatte ebenfalls nur eine sehr geringe Wirkung auf die Aktivierung. Somit spielt das denaturierte Protein keine Rolle im Verändern des HSF auf eine Form, welche die DNA binden kann, was nahelegt, daß diese Anderung das Ergebnis einer direkten Einwirkung der Temperatur sein kann.

BEISPIEL 7

Der molekulare Mechanismus der HSF-Aktivierung

Die Fraktionierung des Zytoplasmaextraktes auf verschiedenen Ionenaustauschersäulen führt zu Einzelfraktionen, welche die Fähigkeit, den HSF auf eine durch Wärme induzierbare Art und Weise zu aktivieren, beibehalten. Diese Fraktionen wurden dazu verwendet, um zu zeigen, daß die Zugabe von ATP keine Wirkung auf die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Aktivierung der Bindungsaktivität hat. Ein Zytoplasmaextrakt wurde auf eine Biorex 70-Säule aufgebracht und mit Waschflüssigkeiten verdünnt, welche 0,1, 0,2, 0,5 und 1,0M KCl enthielten. Die Fraktionen wurden einzeln und in Kombination auf ihre Fähigkeit geprüft, bei einer Inkubation bei 43ºC den aktiven HSF auszubilden. Die gesamte derartige Aktivität wurde mit der 0,1M KCl- Waschflüssigkeit eluiert. Es zeigte sich, daß einer der auf dieser Säule zurückgehaltenen Protein-Faktoren ("X") eine schnellere Mobilität als der HSF aufweist. Die Aktivität, welche den Faktor X ausbildet, wurde mit der 0,5M KCl-Waschflüssigkeit eluiert. Die 0,5M KCl-Waschflüssigkeit hatte keinerlei Fähigkeit, den aktiven HSF auszubilden, und sie veränderte auch nicht die Menge des HSF, welche dann ausgebildet wurde, wenn sie zu der 0,1M KCl-Waschflüssigkeit hinzugefügt wurde. Dieser Befund steht im Einklang mit einem Modell, gemäß welchem ein einzelnes, inaktives HSF-Molekül eine wärmeinduzierte Strukturänderung auf eine DNA-Bindungsform durchmacht. Das Ausmaß der Aktivierung des HSF ist jedoch äußerst empfindlich gegenüber einer Verdünnung des Zytoplasmaextraktes, was darauf hinweist, daß wenigstens zwei Moleküle zum Aktivieren des HSF erforderlich sind. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß entweder (1) der inaktive HSF als ein Monomer vorliegt, welches eine Strukturänderung und eine Dimerisierung zur Bildung der aktiven Spezies, die zum Binden befähigt ist, durchmacht; oder daß (2) ein zweiter, wärmeempfindlicher Faktor vorhanden ist, welcher den HSF auf eine DNA-bindende Form modifiziert.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, zeigte der Test auf die HSF-Aktivierung das Vorhandensein einer Bande ("X"), deren Menge in umgekehrter Wechselbeziehung zu der Menge des HSF stand. Dieser Befund legt es nahe, daß diese Bande einen Vorläufer des aktiven HSF repräsentiert. Die Aktivität, welche diese Bande ausbildet, trennt sich jedoch auf negativ geladenen Säulen von der Aktivität ab, welche den aktiven HSF ausbildet. Es ist daher unwahrscheinlich, daß der Faktor, welcher das X produziert, ein Vorläufer des aktiven HSF ist, obgleich eine Rolle für den Faktor X bei der Regulierung der Hitzeschock-Antwort möglich bleibt.

BEISPIEL 8

Untersuchungen über Vernetzungen

Die Kennmerkmale der Aktivierung des HSF in vitro wurden untersucht, indem man die Menge des HSF feststellte, welche nach den folgenden Manipulationen vorhanden war, wobei diese Menge nach dem oben beschriebenen Gel-Mobilitätsverschiebungs- Test unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotides, welches ein HSE enthält (siehe oben), bestimmt wurde:
A) 20 ug des S100-Proteins wurden während 20 min in der Gegenwart oder bei Fehlen von gekochtem Rinderserumalbumin (10 ug BSA-Protein/20 ug S100-Protein) inkubiert. Dieser Versuch zeigte, daß die Aktivierung durch die Zugabe des denaturierten Proteins nicht verändert wird.
B) Ein Zytoplasmaextrakt wurde mit einem gleichen Volumen, mit 4 Volumensanteilen oder mit 9 Volumensanteilen von gekochtem Zytoplasmaextrakt vor dem 90-minütigen Inkubieren verdünnt. Dann wurde die Aktivität in Bindungsreaktionsgemischen (20 ul) geprüft, die alle je 13 ug an aktivem (nicht-gekochtem) Zytoplasmaextrakt enthielten. Dieser Versuch zeigte, daß die Aktivierung des HSF in vitro durch die Verdünnung reduziert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden nach einem Verdünnen mit Puffer erhalten.
C) Ein Zytoplasmaextrakt (13 mg/ml) wurde entweder während 1 h auf 43ºC erhitzt ("43ºC-Extrakt"), oder er wurde während 1 h auf Eis inkubiert ("0ºC-Extrakt"). Der 43ºC-Extrakt (entweder 1 ul, 3 ul oder 0 ul) wurde mit einer Menge des 0ºC-Extraktes (entweder 0 ul, 2 ul oder 4 ul) bei 30ºC während 1 h inkubiert. Dieser Versuch zeigte, daß das Binden an das HSE durch die Zugabe des nicht-erhitzten Extraktes nicht gehemmt wurde.
Die HSF-Bande hatte die folgenden Eigenschaften: Sie ist in Kontroll-Zellkernextrakten nicht vorhanden; sie ist in dem HSF-HSE-Komplex vorhanden, wie dies auf Mobilitätsverschiebungsgelen identifiziert worden ist; und ihre Bildung wird in wirksamer Weise durch ein Oligonukleotid konkurrenziert, welches ein HSE enthält; ihre Bildung wird aber nicht durch ein Kontroll-Oligonukleotid konkurrenziert, welches das CCAAT-Element spezifiziert.
Die UV-Vernetzungs-Untersuchungen wurden durchgeführt, um die scheinbare Größe jedes Faktors zu bestimmen. Die Extrakte wurden mit einem synthetischen, dimerisierten HSE inkubiert, welches mit einem ³²P-CTP und mit Brom-desoxyuridin substituiert worden war; und der so entstandene, HSF-enthaltende Komplex wurde von nicht-spezifischen Komplexen auf einem Agarosegel abgetrennt und mit UV-Licht bestrahlt. Die Analyse der so entstandenen, markierten Proteinspezies auf einem SDS-Polyacrylamidgel zeigte eine Bande, welche bei 93 kd wanderte und welche in Zellkernextrakten aus erhitzten HeLa-Zellen vorhanden war.
Überraschenderweise zeigten ähnliche Versuche mit dem erhitzten Zytoplasmaextrakt, daß der in vitro aktivierte HSF auf einem Polyacrylamidgel viel schneller läuft (90 kd) als ein aus den Zellkernen von erhitzten Zellen isolierter HSF. Der HSF ist nicht vorhanden in einem Zytoplasmaextrakt, der nicht erhitzt worden ist, und die Bildung des vernetzten Komplexes wird durch ein HSE konkurrenziert, wird aber nicht durch ein Kontroll- CCAAT-Oligonukleotid konkurrenziert. Der für seine DNA-Bindungsspezifität in vitro aktivierte HSF unterscheidet sich daher auf irgendeine Weise von dem HSF, der aus hitzegeschockten Zellen isoliert worden ist. Dieser Unterschied wird nicht durch eine Aktivität in Zytoplasmaextrakten verursacht, welche den aktiven HSF modifiziert, weil sowohl die 93-kd-Form des HSF als auch die 90-kd-Form des HSF nach einem Erhitzen eines Zytoplasmaextraktes in Gegenwart eines Zellkernextraktes beobachtet werden.
Eine mögliche Ursache für diesen Unterschied in der Mobilität liegt, aufgrund einer Analogie zu dem Hefe-HSF, in der Phosphorylierung. Das scheinbare Molekulargewicht des Hefe-HSF nimmt nach einem Hitzeschock der Hefezellen zu, und diese Veränderung scheint durch eine Phosphorylierung verursacht worden zu sein. Der HSF aus erhitzten HeLa-Zellen und in vitro aktivierter HSF wurden, bevor der Faktor mit der DNA vernetzt wurde, mit saurer Phosphatase behandelt. Durch die Behandlung mit der sauren Phosphatase wurde die scheinbare Mobilität des HSF erhöht, der aus erhitzten HeLa-Zellen isoliert worden war, während die Behandlung mit Kälberdarm-Phosphatase eine beschränkte Wirkung hatte. Die Behandlung des HSF aus erhitzten Zellen mit beiden Phosphatasen führte zu einer diffusen Bande, welche sich von etwa 90 kd bis zu etwa 92 kd erstreckte. Im Gegensatz hierzu gab es keine nachweisbare Wirkung der sauren Phosphatase auf die Mobilität des in vitro aktivierten HSF. Obgleich die Phosphatasebehandlung die Mobilität des HSF aus erhitzten Zellen nicht genau auf jene von in vitro aktiviertem HSF veränderte, so ergibt sich aus diesen Ergebnissen dennoch, daß der in intakten, erhitzten Zellen vorgefundene HSF ausgedehnter phosphoryliert als der HSF ist, der in vitro aktiviert worden ist.
Die HSE-Bindungsfähigkeit des Human-HSF kann somit durch Erhitzen eines HeLa-Zytoplasmaextraktes aktiviert werden. Denaturiertes Protein verändert die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Aktivierung der HSE-Bindungsaktivität in vitro nicht. Der HSF, der in vitro aktiviert worden ist, hat eine DNA-Bindungsfähigkeit, welche identisch mit jener des HSF ist, der aus den Kernen von erhitzten Humanzellen isoliert worden ist; der in vitro aktivierte HSF läuft jedoch mit schnellerer Mobilität auf Polyacrylamidgelen als ein HSF, der in intakten Zellen aktiviert worden ist. Dieser Unterschied in der Mobilität scheint auf Unterschiede in der Phosphorylierung zurückzuführen zu sein. Humanzellen antworten daher auf Wärme durch Aktivieren des HSF durch wenigstens zwei Stufen: zuerst durch eine ATP-unabhängige, wärmeinduzierte Veränderung im DNA-Bindungsvermögen, und anschließend durch eine Phosphorylierung.

Claims

1. Human-Hitzeschock-Faktor (hHSF), erhältlich durch:

(a) Herstellen von Zellkernextrakten;

(b) Aufgeben dieser Extrakte aus der Stufe (a) auf eine Zellulose-Säule mit doppelsträngiger DNA;

(c) Aufgeben der aktiven Fraktionen aus der Stufe (b) auf eine Affinitätschromatographie-Säule mit einem sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid; und

(d) Aufgeben der aktiven Fraktionen aus der Stufe (c) auf eine MONO Q FPLC-Säule.

2. hHSF nach Anspruch 1, wobei dieser hHSF ein Human-HELA-Hitzeschock-Faktor oder ein Derivat des Human-HELA-Hitzeschock-Faktors ist.

3. Therapeutisches Medikament, welches den isolierten hHSF nach Anspruch 1 oder Derivate hievon enthält.

4. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz enthält, welche für den hHSF nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.

5. Immunglobuline, welche als Antagonisten eines Hitzeschock- Faktors wirken.

6. Verfahren zum Isolieren und Reinigen von hHSF, welches umfaßt:

(a) Herstellen von Zellkernextrakten;

7. Verfahren zum Diagnostizieren des Streßzustandes eines Patienten, welches das Prüfen, vorzugsweise in einer Biopsie, auf das Vorliegen des aktivierten Hitzeschock-Faktors in einer Zelle eines Individuums umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Test die Verwendung eines Antagonisten des Hitzeschock-Faktors umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Antagonist ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, oder ein Fragment eines Antikörpers ist.