ES2350078B1 - Celula del smf modificada geneticamente para sobreexpresar ngal y su uso como medicamento - Google Patents
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Abstract
Célula del SMF modificada genéticamente para sobreexpresar NGAL y su uso como medicamento.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere a una célula del Sistema Mononuclear Fagocítico o SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL, en sus siglas en inglés), a un método para su obtención y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, fallo agudo o rechazo al trasplante de un órgano.
Description
Célula del SMF modificadagenéticamente para sobreexpresar NGALy su uso como medicamento.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere a una célula del Sistema MononuclearFagocíticoo SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL, en sus siglas en inglés),a un método para su obtencióny a su uso parala elaboraciónde un medicamento parala prevencióno el tratamiento del dañocausado por isquemia, isquemia seguidade reperfusión o toxinas,fallo agudoo rechazoal transplante de un órgano.
Estado de la técnica anterior
La patología de origen isquémico es la principal causa de muerte en los países desarrollados. En el caso del riñón,elfallorenalagudo(FRA)es una enfermedadque conlleva una mortalidaddemásdel50%, cifraquenoha experimentado cambios significativos en las4últimas décadas. Normalmente los pacientes con síntomas clínicos de fallo renal, son tratados despuésdequeeldañosehaya desarrollado,exceptoenel casode pacientesalosqueseles va practicar un trasplante renal. Puesto que la enfermedad está desarrollada cuando el paciente llega al hospital, se requiere urgentemente disponer de vías de curación mediante la estimulación del proceso regenerativoycurativo en general.
Unaaproximación terapéutica dirigidaa disminuirla inflamaciónyel daño renalha sidola terapiacelular con macrófagos modificados genéticamente. En este sentido, la alteración genética de los macrófagos hacia un fenotipo antiinflamatorio, medianteeltratamiento con adenovirus recombinante paraexpresar IL-1 ray su posteriorinyección en modelos inflamatoriosde enfermedad renal puede reducirla infiltración,la inflamación glomerular e inclusola proteinuria (Holdsworth et al. Lab Invest. 1984, 51:172-180; Kitamura et al. KidneyInt. 2000, 57:709-716;Kluth et al. Gene Ther. 2000, 7:263-270).
En cuantoala regeneración del riñóndañado, las medidas terapéuticas empleadas hasta ahora, han sido:la aplicación defactores de crecimiento (Hirschberg et al. KidneyInt. 1999, 55:2423-2432; MilleryPadanilam. Chapter 17: Molecular responsesandgrowthfactors,in: Atlasif diseasesofthe kidney,RobertWSchrier,p. 17.1-17.16, Blackwell Science Press, Philadelphia, USA. 1999) o ensayos con células madre (Brodsky et al. AmJPhysiol Renal Physiol. 2002, 282: F1140-F1149; Kale et al.JClin Invest. 2003, 112:42-49; LinF et al.JAm Soc Nephrol. 2003, 14:11881199; Gupta et al. KidneyInt. 2002, 62: 1285-1290; Oliver et al. Clin Invest. 2004, 114: 795-803), pero no se ha conseguidoel resultadoregenerativo deseado. Estudiosprevioshan demostradola capacidaddela terapia con macrófagos para inducirla regeneración en modelos animalesde isquemia/reperfusión (l/R),si éstos eran administrados enlafase no inflamatoria (Vinuesa et al. JournalofPathology; 2007, 213: 2008 Jan; 214(1):104-13).
NGAL es una proteína de 25 kDa de la superfamilia de las lipocalinas (Flower. FEBS Lett. 1994, 354:7-11) que actúa sobre la proliferación en múltiples tipos celulares (Cowland et al.J Immunol. 2003, 171: 6630-6639; Gwira et al. J Biol Chem. 2005, 280: 7875-7882). Se trata de una proteína expresada en células tubulares, que aumenta notablementeen respuestaaestímulos dañinos comola isquemiao toxicidad.Tambiénseha descritoque mejorala apoptosis de la célula tubular (Mishra et al.JAm Soc Nephrol. 2004, 15: 3073-3082). Estudios previos han demostrado la capacidaddeNGALpara inducirlaregeneraciónen modelos animalesde isquemia/reperfusión(I/R)enlafaseno inflamatoria del daño renal, peroel efecto esel contrarioenlafase inflamatoria(VinuesaE et al.AmJPhysiol Renal Physiol. 2008 Nov; 295(5):F1554-62.).
Por tanto,existen estudiosque indicanla capacidaddelmacrófago para modulary resolverla inflamación renal, dependiendodesu fenotipo,ytambiénexisten estudiosque indicanquesepuederegenerarel riñón dañado,peronose conocen terapiasque poseanla doble función antiinflamatoriapor una parteypotenciadoradelaregeneraciónporotra. Existepor tantola necesidadde disponerde terapiasque permitan reducirla inflamaciónyeldañorenal, potenciando la regeneración renal durantelafase inflamatoria del daño renal.
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a una célula del SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamentepara sobreexpresarNGAL,aun métodoparasuobtenciónyasuusoparala elaboracióndeunmedicamento para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, de unfallo agudoo del rechazoal transplantede unórgano.
En la presente invención se demuestra que macrófagos modificados genéticamente para que sobreexpresen NGAL, son capaces de disminuir la inflamacióny el daño renal, además de inducir la regeneración en un modelo animal de isquemia-reperfusión renal, cuando son administrados en la fase inflamatoria del daño renal. La invención, por tanto, proveeuna terapia que reducela inflamaciónyel daño renal, potenciandola regeneración renal durantelafase inflamatoria del daño renal. Esta terapia asimismo puede emplearse en la prevención o el tratamiento del daño por isquemia, isquemiaseguidade reperfusióno causadapor toxinas,deunfalloagudoodel rechazoal transplantede otros órganos.
El macrófago tiene su origen en las células progenitoras pluripotenciales granulo-monocíticas (CGp-GM) de la médulaósea.Por accióndelosfactoresde estimulación colonial(CSF),laCGp-GMse diferenciaencélula progenitora monopotencial monocítica (CGm-M),lacual,se diferenciaen monoblasto,yéste,asuvez,en promonocito,laprimera célula morfológicamente identificable como precursora del macrófagoyqueya posee algunas de sus características, como adherencia al vidrioycapacidadfagocítica. Por división del promonocitoyposterior diferenciación aparecen los monocitos, que abandonan la médula ósea pasando a la sangre. Los monocitos circulantes pasan por diapédesis a travésdel endoteliovascular, emigrando hacia los tejidos en los que se diferenciarán en macrófagos, que,a suvez, pueden presentarse en diferentes estados funcionales: residentes, inflamatoriosyactivados. El conjunto formado por los precursores medulares, los monocitosylos macrófagos tisulares, se engloba actualmente bajola denominaciónde Sistema MononuclearFagocítico (SMF).
Un primer aspecto de la invención se refiere a una célula del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) aislada modificada genéticamente caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno (en adelante, el polinucleótido delainvención)que presentauna identidadconlaSEQIDNO:1seleccionadadelalistaque consisteen:
- a.
- al menos, un 50%,
- b.
- al menos, un 60%,
- c.
- al menos, un 70%,
- d.
- al menos, un 80%, y
- e.
- al menos, un 90%,
donde dicha célula del SMF es capaz de inducir la regeneración renal durante lafase inflamatoria del daño renal. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo que acompaña estadescripción.
Laexpresión“fase inflamatoria”taly comose utiliza enla presente descripción,se refiere a una primerafase deldaño renal caracterizada por un aumento de mediadores inflamatorios, típicamente durante las primeras 24 horas despuésde un insulto isquémico.A suvez, este ambiente promueveel daño del tejido renal por apoptosisynecrosis. Lafase regenerativa se inicia con un cambio del ambiente inflamatorio. El macrófago juega un papel importante en eliminar células muertas quea suvez, estimulan su cambiode fenotipo hacía anti-inflamatorioy pro-proliferativo, permitiendo asimismo la inducción de la regeneración renal.
Laexpresión “modificada genéticamente”taly comose utilizaenla presente descripción, incluyeaquí cualquier célula del SMF en la cual el genotipo ha sido alterado de manera que comprende un polinucleótido exógeno, introducidoexperimentalmente,que presenta una identidad conlaSEQIDNO:1 seleccionadadelalistaque consiste en:
- a.
- al menos, un 50%,
- b.
- al menos, un 60%,
- c.
- al menos, un 70%,
- d.
- al menos, un 80%,y
- e.
- al menos, un 90%,
donde dicha célula del SMF es capaz de inducir la regeneración renal durante la fase inflamatoria del daño renal.
Los términos “polinucleótido”y“ácido nucleico” se usan aquíde manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARNóRNA) como desoxiribonucleótidos (ADNóDNA).
En una primera realización preferida de este primer aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con la SEQ ID NO: 1, que corresponde a la secuencia nucleótidica del cDNA de la proteína NGAL humana (Número de referencia del Genbank: NM_005564).
En una segunda realización preferida de este primer aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con la SEQ ID NO: 2, del cDNAde la proteína NGAL de ratón (Número de referencia del Genbank:NM_008491).
En una tercera realización preferida de este primer aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamente estácaracterizada porque comprende el polinucleótido de la invención unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende:
- a.
- un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido,
- b.
- una señal de inicio de la transcripción,
- c.
- una señal de terminación de la transcripción,
- d.
- una señal de poliadenilación, o
- e.
- un activador transcripcional.
“Secuencia de control” se refiere a secuencias de polinucleótidos que afectan la expresión de las secuencias a las que están ligadas. En células eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores o silenciadores. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo,todoslos componentescuya presenciaes necesariaparalaexpresión,ytambiénpuede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
“Unidos operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” al polinucleótido, estáligadaal mismode tal manera que se consiguelaexpresióndela secuencia codificadoradel polinucleótido.
Comoseusaaquí,el término“promotor”hace referenciaaunaregióndelDNAsituadaenposición5’conrespecto al puntode iniciodela transcripciónyque resulta necesariaofacilita dicha transcripciónenuna célula animal.Este término incluye,por ejemplo,perosin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicosdetipo celularode tejido o promotores inducibles o reprimibles.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica la proteína NGAL.
En una cuarta realización preferida de este primer aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótidoexógeno que codifica una secuencia aminoacídicaque presenta una identidad conlaSEQIDNO:3seleccionadadela listaque consisteen:
- a.
- al menos, un 50%,
- b.
- al menos, un 60%,
- c.
- al menos, un 70%,
- d.
- al menos, un 80%,y
- e.
- al menos, un 90%,
donde dicha célula del SMF es capaz de inducir la regeneración renal durante lafase inflamatoria del daño renal. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo que acompaña a esta descripción.
Los términos “secuencia aminoacídica”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido”y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable,y se refierena una forma poliméricade aminoácidosde cualquier longitud, que pueden estar,
o no, química o bioquímicamente modificados.
En una quinta realización preferida de este primer aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamenteestá caracterizada porque comprendeun polinucleótidoexógenoque codificala secuenciaaminoacídicaSEQ ID NO: 3, que corresponde a la secuencia aminoacídica de la proteína NGAL humana (Númerode referencia del Genbank:NP_005555).
En una sexta realización preferida de este primer aspecto de la invención, la célula del SMF modificada genéticamenteestá caracterizada porque comprendeun polinucleótidoexógenoque codificala secuenciaaminoacídicaSEQ ID NO: 4, que corresponde a la secuencia aminoacídica de la proteína NGAL de ratón (Número de referencia del Genbank:NP_032517).
Los términos “NGAL”, “lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos” o “lipocalina-2” se refieren a una proteína de 25 kDa de la superfamilia de las lipocalinas.
El término “identidad”, taly como se utiliza en esta memoria, hace referencia ala proporciónde nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan.El tanto por cientode identidadexistenteentredos secuenciaspuedeserverificado fácilmenteporunexpertoenlamateria,por ejemplo,con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Preferiblemente,la célula del SMF es una célulade mamífero,y más, preferiblemente,de un humano. Aún más preferiblemente, la célula delSMF es un monocito o un macrófago.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la célula del SMF, preferiblemente, un monocito o un macrófago, modificada genéticamente según se hadescrito anteriormente en este documento (de ahora en adelante, célula de la invención) para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula de lainvención para la elaboración de un medicamento de terapia génica. En general, se entiende por medicamento de terapia génica cualquier producto obtenido mediante un conjuntodeprocesosdefabricación destinadosa transferir,bien in vivo bien ex vivo, un ácido nucléico profiláctico, de diagnósticoo terapéuticoa células animales, preferiblemente humanas,y su posteriorexpresión in vivo. Entre los medicamentos de terapia génica se encuentran, pero sin limitarse los siguientes, ácido nucleico desnudo, vectores novirales,vectores viraleso células modificadas genéticamente.Taly como se utiliza enla presente descripción,el término “medicamento de terapia génica”, se refiere a cualquier medicamento que comprende una célula del SMF modificada caracterizada porque comprende el polinucleótido de la invención. Puede tratarse de medicamentos de terapia génica basados en células autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano)
- o xenogénicas (de animales).
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento de terapia génica para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión
- o toxinas en un tejido o un órgano. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñón.
El término “isquemia” se refiere a una disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo en un tejido o un órgano, conla consecuente disminucióndel aportede oxígeno.El conjuntodelos dañosque sufreel tejidooelórgano debido a la isquemia se conoce como “daño causado por isquemia”.
El término “reperfusión” se refiere a la restauración del suministro de sangre a un tejido o un órgano que está isquémico como consecuencia de una disminución del riego normal de sangre. La recuperación del riego sanguíneo restaurael aportede oxígenoynutrientesal tejido, permitiendola recuperación del tejidoo delórgano isquémico.Sin embargo, la reperfusión en sí misma puede lesionar el tejido o el órgano isquémico, ocasionando lo que se conoce como “daño causado por reperfusión”.
La expresión “daño por isquemia-reperfusión” se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).
La expresión “daño causado por toxinas” se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano como consecuencia de su exposición a toxinas como, por ejemplo, pero sin limitarse, antibióticos, anestésicos, quimioterapéuticos, contrastes radiológicos, metales pesados, fungicidas, pesticidas, solventes orgánicos, venenos animales, tóxicos fúngicos o tóxicos de origen endógeno.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia en el riñón o isquemia renal.La isquemia renal consiste en una disminución transitoriao permanente del riego sanguíneo, conla consecuente disminución del aporte de oxígeno al riñón, como consecuencia, por ejemplo, pero sin limitarse de una disminución del volumen sanguíneo total, una redistribución de la sangre o una obstrucción. La disminución del riego sanguíneo puedeser unilateral, cuando afecta únicamentea un riñón,o bilateral, cuando afectaa los dosriñones.El conjuntodelos dañosque sufreel tejidooelórgano debidoala isquemiase conoce como “daño causadopor isquemia renal”.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia-reperfusión en el riñóno isquemia-reperfusión renal.Laexpresión “dañopor isquemia-reperfusión renal”se refiereal conjuntodelos daños que sufre el riñón debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia renal) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).
Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del daño que sufre el tejido renal o el riñón como consecuencia de su exposición a toxinas como, por ejemplo, pero sin limitarse, antibióticos, anestésicos, quimioterapéuticos, contrastes radiológicos, metales pesados, fungicidas, pesticidas, solventes orgánicos, venenos animales, tóxicos fúngicos o tóxicos de origen endógeno.
Como consecuencia de los daños causados por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un órgano puede producirseunfallo agudoorgánico.Los términos“fallo agudo”,“falloorgánico agudo”o “fracasoorgánicoagudo”, se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de la función de un determinado órgano.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñón.
Como consecuenciadelosdaños causadospor isquemia, isquemia-reperfusióno toxinasenel riñónpuedeproducirse unfallo renal agudo (FRA).Los términos“fallo renal agudo”, “fracaso renal agudo”o “insuficiencia renal aguda (IRA)”se refierenaun síndrome clínicoquese caracterizaporun deterioro bruscodela función renalquetiene como consecuenciauna disminucióndel filtrado glomerularyuna acumulaciónde productos nitrogenadosséricos(como, por ejemplo, ureao creatinina), pudiendo también producirse alteraciones del equilibrio hidroelectrolíticoydel equilibrio ácido base. El FRA puede clasificarse en tres grandes grupos: FRA funcional, FRA parenquimatoso o FRA obstructivo. En el FRA funcional existe una inadecuada perfusión renal que compromete el filtrado glomerular, pero el parénquima glomerular está íntegro. La insuficiencia renal que se produce durante el FRA funcional es reversible tras restaurar el flujo plasmático, pero si persiste la situación que lo ha desencadenado evolucionará hacia un FRA parenquimatoso. En el FRA parenquimatoso la causa del deterioro de la función renal es un daño en las diferentes estructuras anatómicas renales, que da lugar a diferentes síndromes clínicos: el túbulo (necrosis tubular aguda), el glomérulo (necrosis glomerular),el intersticiotubular (necrosistubular intersticial)olosvasos sanguíneos.EnelFRA obstructivo se produce un aumento de la presión en la vía urinaria, que se transmite retrógradamente, comprometiendo el filtrado glomerular normal, como consecuencia de la obstrucción de alguno de los conductos del riñón.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un FRA.
Una de las situaciones más frecuentes de daño causado por isquemia-reperfusión tiene lugar en el transplante de órganos.De hecho,elfalloorgánicoagudoes unadelas primeras causasporlasquese produceelrechazodeórganos transplantados.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñón.
El FRA asociado al daño causado por isquemia-reperfusión es una de las principales causas por las que se produce el retraso inicial en la función o el rechazo de un riñón transplantado.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del rechazo de un riñón transplantado.
Otro aspectodelainvenciónse refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladelainvención.
Otro aspectodela presenteinvención se refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladela invención para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un tejidoounórgano.Una realización preferidade este aspectodelainvenciónse refierea una composiciónfarmacéutica que comprende la célula de la invención para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemiareperfusión o toxinas en un órgano de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere auna composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladelainvenciónparalaprevenciónoel tratamientodeldaño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en el riñón.
Otro aspectodela presenteinvención se refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladela invención para la prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano. Una realización preferida de este aspectodelainvención se refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladelainvención parala prevenciónoel tratamientodeunfalloagudodeunórganodela listaque comprende: riñón,hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización más preferida de este aspecto de la invenciónse refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladelainvenciónparalaprevenciónoel tratamiento de un FRA.
Otro aspectodela presenteinvención se refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladela invención para la prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Una realización preferida de este aspectodelainvenciónse refiereauna composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladelainvenciónparala prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado de la lista que comprende riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas,vejiga, úteroo piel. Una realización preferidade este aspecto delainvención se refierea una composiciónfarmacéutica que comprendela céluladelainvención parala prevención
o el tratamiento del rechazo de un riñón transplantado.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composiciónfarmacéutica según se ha descrito anteriormenteen este documento, comprende, además,unvehículofarmacéuticamente aceptable.En una realización más preferidadela presenteinvención,lacomposiciónfarmacéutica comprende además otro principio activo.En una realización más preferidadela presenteinvención,la composiciónfarmacéutica comprende junto con unvehículo farmacéuticamente aceptable, además, otro principio activo.
Como se emplea aquí, los términos “principio activo”, “sustancia activa”, “sustanciafarmacéuticamente activa”, “ingrediente activo”o “ingredientefarmacéuticamente activo” se refierea cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales.
Las composiciones pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado dela técnica.Tales composicionesy/o sus formulaciones puedenadministrarse aunanimaly,más preferiblemente, a un mamífero, incluyendo a un humano, por una variedad de vías, incluyendo, pero sin limitarse a parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraaricular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular o tópica.
Ladosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva dependede unavariedaddefactores, como, porejemplo,edad,peso,sexootoleranciadel animal.Enel sentido utilizadoenesta descripción,laexpresión “cantidad terapéuticamente efectiva”se refiereala cantidaddelacomposiciónfarmacéuticamente efectivaque produzcaelefecto deseadoy, en general,vendrá determinada entre otrascausas, por las características propiasdedicha composición farmacéuticaydel efecto terapéuticoa conseguir. Los “adyuvantes”o“vehículos”farmacéuticamente aceptablesque pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la técnica.
Otro aspectodela presenteinvenciónserefiereaun métodoparaobtenerla céluladelainvenciónque comprende:
- a.
- obtener una célula del SMF aislada,y
- b.
- transfectar la célula del paso (a) con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido, donde dicho polinucleótido presenta una identidad conlaSEQIDNO:1seleccionadadela lista consisteen:
i) al menos, un 50%,
ii) al menos, un 60%,
iii) al menos, un 70%,
iv) al menos, un 80%,y
v) al menos, un 90%.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) delmétodo de la invención es la SEQ ID NO: 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) delmétodo de la invención es la SEQ ID NO: 2.
En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso(b) está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la listaque comprende:
- a.
- un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido,
- b.
- una señal de inicio de la transcripción,
- c.
- una señalde terminacióndela transcripción,
- d.
- una señal de poliadenilación, o
- e.
- un activador transcripcional.
El término “transfectar”,taly comoseutilizaenla presente descripción,serefierea introducirunácido nucleico exógeno al interior de una célula eucariota.
El ácido nucleico del paso (b) del método de la presente invención puede ser introducido al interior de la célula del SMF aislada obtenida en el paso (a), por ejemplo, pero sin limitarse, como ácido nucleico desnudo o mediante un vector.
Tal comose utilizaenla presenteinvenciónlos términos“vector”o“vectorde transferencia géncica”,se refieren a sistemas utilizados enel procesode transfecciónde un ácido nucleicoexógenoal interiorde una célula, permitiendo de este modo la vehiculación del ácido nucleico al interior de la célula.
Enuna realización preferidadeesteaspectodelainvención,lacéluladelSMFseponeen contactoconunvectorde transferencia génica, el cual comprende el ácido nucleico que comprende el polinucleótido del paso (b), de tal manera que el ácido nucleico es introducido en la célula bajo las condiciones apropiadas para que dicho polinucleótido sea expresado enel interiordela célula.Elvector puede ser viralo no viral. Existen numerosos vectores viralesy no virales para introducir DNA exógeno dentro de las células madre que son bien conocidos para aquellos expertos en la materia.Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realizacióndelainvención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectoresalfavirales,vectores herpesviralesy vectores derivadosde coronavirus.Vectoresdetipono viral apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: gene gun, liposomas, poliaminas, péptidos, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínasy sistemas de transferencia génica mediados por receptor.
En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, la transfección del ácido nucleico del paso
(b) se realiza empleando un vector adenoviral.
Preferiblemente,la céluladelSMF obtenidaenelpaso(a)esuna célulademamífero,ymás, preferiblemente,de un humano. Aún más preferiblemente, la célula del SMF es un monocito o un macrófago.
Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientesfigurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención.
Descripción de las figuras
Figura1. Muestrael efectodela administraciónde los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobreel daño renal.A. Efecto sobrelaexpresión del marcadorde daño funcional del riñónBUN.B. Efecto sobrelaexpresióndel marcadorde daño funcionaldel riñón creatina.AyB. Datos representados comola media+/SEM;p<0,05; n=5. C. Efecto sobre el daño histológico analizado en secciones de tejido teñidas con hematoxilinaeosina. Magnificación original x 400.
Figura2. Muestrael efectodela administraciónde los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobrela proliferaciónyla regeneración renal.A. Efecto sobrelaexpresión del marcadorde proliferacióny regeneración renal Ki67.B. Efecto sobrelaexpresión del marcadorde proliferacióny regeneración renal creatina. AyB. Datos representados como la media +/-SEM;p<0,05; n=5. C. Efecto sobre la expresión de los marcadores regenerativos PCNAy Statmina analizada mediante inmunofluorescencia. El PCNA se caracteriza por una tinción nucleardelas células durantelafaseG1 tardíayfaseS.La Statminasin embargoes una proteína citosólicaqueactúa enla transicióndelafaseG2 aM(ver flechas). Magnificación originalx 400.
Figura3. Muestrael efectodela administraciónde los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre la inflamación. Efecto sobre la expresión de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α (A) e IL-1 (B). Efecto sobrelaexpresiónde las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 (C) e IL-4 (D). A-C. Datos representados como la media +/-SEM;p<0,05; n=5.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo1
Macrófagos modificadosgenéticamente parala sobreexpresiónde NGAL para inducirlaregeneración en un modelo animal de isquemia-reperfusión renal
Materialymétodos empleados
Modelo de isquemia-reperfusión renal
Se utilizaron ratasdela cepa SpragueDawley, machosde un pesoaproximadamentede 225-250g(CharlesRiver, Francia).Todas las intervenciones se realizaron bajola supervisión del comité éticode nuestra instituciónysiguieron las pautas de la Unión Europea. Las condiciones ambientales se mantuvieron constantes, la temperatura fue de 21
22ºC,la humedad relativa del 70%ylos ciclos alternativosde luz/oscuridadde12h. Los animales fueron alimentados con una dieta estándarde piensoAO4(Panlab, Barcelona)yaguadela redde Barcelona ad libitum.
Los animales fueron anestesiados con Isoflurane, se colocaron en posición supinay se mantuvo la temperatura corporal entre36y37ºC. Despuésde realizar una laparotomía media para accederal riñón apartando cuidadosamente el paquete intestinal, se indujo la isquemia bilateral mediante el clampaje de ambos pedículos arteriovenosos renales durante 45 minutos con un clamp microvascular no-traumático.Posteriormente se inició el período de reperfusión, conla retiradadelclampy severificó visualmente conla observacióndelregresodelflujo sanguíneoal riñón.A continuación se suturóel animaly se administró Buprex subcutáneo (4,16 µg/100gde peso). Animales sujetosa una operación sham fueron utilizados como controles. Durante todo el proceso de operación, los animales fueron bien hidratadosyla temperatura corporalse mantuvo alrededorde37ºC. Duranteeltiempodereperfusión,losanimalesse estabularon bajoel controlde unveterinario.Pasadas24hde reperfusión,el animal se sacrificó paralaextracciónde los riñonesyde sangre.El tejido fue conservado inmediatamente en formol para las pruebas histológicaso congelado en nieve carbónicayposteriormente almacenadoa -80ºC.
Grupos de estudio
I/R.-Animales sometidosa45minutosde isquemiay24 horasde reperfusión.
I/R NGAL.-Animales sometidos a I/R pero con inyección de 10x106 macrófagos genéticamente modificados para expresarNGALporanimal, mediantepunción directadelavenacava inferior,1horadespuésdeliniciodeltiempode reperfusión.
I/R bgal.-Animales sometidos a I/R pero con inyección de 10x106 macrófagos con el virus control para expresar la β-Galactosidasaporanimal, mediantepunción directadelavenacavainferior,1horadespuésdeliniciodeltiempo de reperfusión.
Sham NGAL.-Animales control,no sometidosa isquemia/reperfusiónyconadministraciónde 10x106 macrófagos modificados genéticamenteparaexpresar NGAL por animal.
Sham bgal.-Idem que SHAM NGAL, pero con inyección de macrófagos con el virus control para expresar la β-Galactosidasa.
Cultivo celular de macrófagos primarios derivados de la médula ósea, transfección viralyposterior infusión al animal
Célulasderivadasdela médulaóseade ratasSpragueDawleyfueron recogidas mediantela aspiracióndelos fémuresy se cultivaron en Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM):F-12 1:1(volumen/volumen) con concentración altade glucosa,15mM Hepesyglutamina estable, suplementado con 100 U/mlde penicilina, 100 µg/ml estreptomicina,10%(volumenfinal) suerobovinofetal inactivado,y10ng/mldelfactorestimulantede coloniasde granulocitos y monocitos (GM-CSF) (Invitrogen, Barcelona). Las células se mantuvieron en flascones de teflón, no adherentes, durante7días parala maduracióna macrófagos.
Posteriormente, los macrófagos fueron separados mediante adherencia diferencial. Las células se mantuvieron en una atmósfera con 5% CO2 en aire, a 37ºC.
Para la transfección viral, 10x106 células fueron transfectadas con un adenovirus para sobreexpresar el NGAL (Ad-NGAL; producidoy purificado porViraquest, USA). Como virus control utilizamos unvector similar parala expresión de β-Galactosidasa (Ad-bgal), que fue producido en células HEK 293ypurificado por gradientede cloruro de cesio. El título de cada virus fue determinado mediante análisis en placa en células HeLa. La eficiencia de cada transfección fue medida mediante la determinación de proteína por ELISA en el sobrenadante delcultivo celular. La transfección viral se estableció con una multiplicidadde infección (MOI)de 50.Alas48 horas post-transfección,los macrófagos fueron recogidosen un tuboyse mantuvieron en PBS hasta su posterior infusión enel animal.
Marcadoresde daño funcionaldel riñón
Nitrógeno ureico en sangre(BUN)ycreatinina en plasma fueron analizados como marcadoresde función renal utilizando unADVIA 2400 (Siemens Medical Diagnostics) del Hospital ClínicodeBarcelona.
Análisis histológico
Las muestras fueron incluidas en parafina, cortadas en secciones de 4 µm,y teñido con hematoxilinay eosina (H&E). Evaluación del daño histológico fue determinado mediante microscopía convencional.
Inmunofluorescenciade los marcadoresregenerativos PCNAyStatmina
Todas las muestras se fijaron en formaldehído al 4%y posteriormente se incluyeron en parafina. Se realizaron cortes de4 µmque fueronlavadosen xilol,ydeshidratados mediante alcoholesde graduación decreciente, conlavado
enPBSyposterior bloqueode unionesinespecíficas con suerode cabra durante1horaa temperatura ambiente.Posteriormente se incubaron las muestras con PCNA(Santa Cruz Biotechnology)yStatmina (Calbiochem) para detectar la regeneración en eltejido renal. Las muestras se incubaron con anticuerpos fluorescentes secundarios para revelar la tinción con PCNAyStatmina en el tejido (rabbit anti-goat IgG conjugado con Alexa Fluor 488 para Statminay goat anti-mouseIgGconjugadoconAlexaFluor568paraPCNA; MolecularProbes)durantedoshorasatemperatura ambiente en oscuridad. Los cortes fueron montados con mowiol(Calbiochem)ylas imágenes se obtenían mediante un microscopio confocal láser Leica TCSNT (Leica Microsystems,Wetzlar, Alemania)a una magnificación original de x400.
RT-PCR a tiempo real
El RNA de las muestras de riñón fue extraído mediante el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Barcelona). Se extrajo el RNAtotal de las células con el RNeasy mini Kit de Qiagen (Madrid) acordea las instruccionesdelfabricante. Las concentracionesdeRNAfueron calculadas por determinaciónde absorbancia a 260 nm. La integridad del RNAasí obtenido se examinó mediante análisis de las bandas de RNAribosomal 18Sy28S detectadoyanalizado enel Bioanalyzer del Hospital Clínico Barcelona(Agilent).
Laexpresióndelos genes analizados se midió medianteRT-PCR cuantitativaa tiempo real normalizada conel gen constitutivo (o houskeeping, en inglés)de gliceraldehido3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). LasRT-PCRsa tiempo real se llevarona cabo en unTermociclador Bio-Rad (iCycleriQ Real-Time PCR detection System, Bio-Rad, Barcelona)y las amplificaciones se hicieron en reacciones de 20 µl con el RT-PCR Kit con SYBR-Green en dos pasos (Bio-Rad) según las instrucciones delfabricante. Los primeros fueron los siguientes: Ki-67: directo, SEQ ID NO: 5; inverso, SEQ ID NO: 6; PCNA: directo, SEQ ID NO: 7; inverso, SEQ ID NO: 8; NGAL: directo, SEQ ID NO: 9; inverso, SEQ ID NO: 10; TNF-α: directo, SEQ ID NO: 11; inverso, SEQ ID NO: 12; GAPDH: directo, SEQ ID NO: 13; inverso, SEQ ID NO: 14. Los datos de las demás citoquinas(IL-1, IL-10, IL-4)fueron obtenidas usando primeros pre-validados de Qiagen (Barcelona, España) con los números de referencia QT00181657, QT00106169y QT00160678, respectivamente.
ELISA de NGAL
El sobrenadantedelas células fue recogido, centrifugadoyguardadoa -80ºC hasta su uso.La placade ELISAde 96 pocillos se preincubó con Anti-mouse Lipocalin-2/NGAL (R&D Systems, Madrid), mediantela adiciónde1 µlde la solución madre del anticuerpo, diluido en 99 µldetampón carbonato 1:100 durante18 horasa 4ºC.Traslavadode la placa, se bloquearon las uniones inespecíficas durante1ha temperatura ambiente.
Se añadieron 50 µLde cada muestraala placade ELISAyse mantuvieron1horaa temperatura ambiente.Tras otro lavado, se añadieron 100 µlde un anticuerpo de detección biotiniliado, Anti-Mouse Lipocalin-2/NGAL (R&D Systems, Madrid), obtenido tras dilución de 1 µl de la solución madre en 99 µl de tampón de dilución 1:100. El anticuerpo biotinilado seincubó durante1h a temperatura ambiente.
Posteriormente se añadieron 100 µl de avidina HRP-conjugada (Zymed, Invitrogen, Barcelona), obtenida tras dilución de1 µlde la solución madre en 1999µlde tampónde dilución1:2000.Se incubó durante1hatemperatura ambiente, para reconocer la unión del anticuerpo biotiniliado.
Finalmente se aplicó el agente colorante (OPD tablets, Dako, Barcelona) para medir la absorbancia a 492 nm.
Análisis estadístico
Losdatosse muestran comomedia+/-el error estándardelamedia(SEM),ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisisdevarianza (ANOVA),yen caso de significancia se aplicó la t-Student.
Resultados obtenidos
Efecto de la administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre el daño renal
Comoseobservaenlafigura1A,elnitrógenoureicoensangre(BUN), marcadordedañorenal funcional,seincrementa significativamente en el grupo de isquemia-reperfusión. Sin embargo, al administrar macrófagos genéticamente modificados para sobreexpresar NGAL se observa un descenso significativo de este parámetro de daño. En ninguno delos gruposalosquese administró macrófagos transfectados conel virus control (Shambgal;I/Rbgal)sepudo detectar ningún efecto protector respecto a sus respectivos controles (Sham; I/R). Los datos se muestran como media +/-SEM,ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre gruposse analizaron con un análisis ANOVA,y en casode significancia se aplicóla t-Student.
Como se observa en la figura 1B, la creatinina en sangre, marcador de daño renal funcional, se incrementa significativamente en el grupo de isquemia-reperfusión. Sin embargo, al administrar macrófagos genéticamente modificados para sobreexpresar NGALse observaun descenso significativode este parámetrode daño.En ningunodelos gruposa
los que se les administró macrófagos transfectados con el virus control (Sham bgal; I/R bgal) se pudo detectar ningún efecto protector respectoasus respectivos controles(Sham;I/R).Losdatosse muestran comomedia+/-SEM,ylos valores dep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA,y en casode significancia se aplicóla t-Student.
El análisis histológico de cortes del tejido renal (figura 1C) revela que el área más afectada se encuentra en la médula del riñón.Alas 24 horas de reperfusión se observa edema intersticial grave, infiltración de células, necrosis, y la deposición de material proteico en el lúmen tubular. Sin embargo, el tratamiento con macrófagos previamente modificados para sobreexpresar el NGAL preserva la integridad del tejido renal. Los macrófagos tratados con el virus control no tienen este efecto protectory se observa un gradode daño parecidoa las24 horasde reperfusión.Enla figura 1C se muestran fotos representativas de los tres grupos principales (Sham; I/R;I/R NGAL).
Efecto de la administración de los macrófagos modificadosgenéticamentepara sobreexpresar NGAL sobre la proliferaciónyla regeneración
Enla figura2Ase muestralaexpresiónde Ki-67,marcadorde proliferación celulary regeneración que seexpresa durante todas las fases del ciclo celular, excepto G0. Los resultados de la RT-PCR a tiempo real muestran que a las24 horasde reperfusión no seexpresaKi-67 en las células epiteliales tubulares del riñóny porlo tanto nohay regeneración en este tiempo en que las células probablemente están muriendo por apoptosis inducida por la isquemiareperfusión. Al contrario, al administrar macrófagos sobreexpresando elNGAL detectamos un aumento significativo dela proliferación celular enel tejidoyporlo tanto unaavanzada regeneraciónal tiempode24 horasde reperfusión. Los macrófagos tratados con el virus control no tuvieron la capacidad de inducir la proliferación en el tejido renal lo que nos indica que es el NGAL el responsable de promover la regeneración renal. Los datos se muestran como media +/-SEM,ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre gruposse analizaron con un análisis ANOVA,y encasode significancia se aplicóla t-Student.
Enlafigura2Bse muestralaexpresióndePCNA(proliferating cell nuclear antigen), marcador de proliferación celulary regeneración quetiene un picodeexpresión enlafaseSdel ciclo celular,y porlo tanto en células mitóticamenteactivas.Los resultadosdelaRT-PCRatiemporeal muestranquesolose encuentra sobreexpresadoenel grupode macrófagos sobreexpresando NGAL.Los datosse muestran como media+/-SEM,ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA,y en caso de significancia se aplicó la t-Student.
La figura2C muestrael perfilde regeneración mediante inmunofluorescenciadePCNAyStatmina. Recientemente,la Statminaseha descubierto como nuevo marcadorde proliferación enla reparación tras un insulto agudopor isquemiarenal.Es una fosfoproteína citosólicayestá asociadaalainducciónde proliferaciónyla reentradade células enel ciclo celular.El PCNA sin embargo interactúa condiversas moléculas,y afectaal metabolismo celular,alos mecanismosde reparacióndelDNAy asu síntesis.Detectamos mediante miscroscopía confocalqueel tratamiento con macrófagos sobreexpresando la NGAL efectivamente inducen tanto las expresión de PCNA como de Statmina a un nivel muy alto. Estas observaciones confirman el papel clave de la NGAL en la inducción de la regeneración renal. Al contrario, cuando administramos macrófagos transfectados con el virus control, no se detecta ningún efecto sobre la proliferación celularylosnivelesdeexpresióndePCNAyStatminase parecenal grupode24 horasde reperfusión.
Efecto de la administración de los macrófagos modificadosgenéticamentepara sobreexpresar NGAL sobre la inflamación
Lafigura3 muestralos resultadosdeRT-PCRque indicanlaexpresiónde citoquinas tantopro-como antiinflamatorias tras el tratamiento con macrófagos genéticamente modificadas con Ad-NGAL. Los resultados muestran una disminución de citoquinas proinflamatorias, representadas por TNF-α eIL-1, cuando administramos macrófagos tratadosconelvirus portadordeNGAL(enlos animalesdelgrupoI/RNGAL) comparadoconlosnivelesde inflamacióna las24horasde reperfusiónenlos animalesnotratados(I/R)o tratadosconelvirus control(I/Rbgal).Al contrario,las citoquinas antiinflamatorias, representadas por IL-10 e IL-4, muestran un aumento tras el tratamiento con macrófagos que sobreexpresan NGAL. Por lo tanto podemos deducir un efecto protectoryantiinflamatorio con eltratamiento de macrófagos genéticamente modificadosy el papel clave de NGAL en estos procesos. Los datos se muestran como media+/-SEM,ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisisANOVA,yen casode significancia se aplicóla t-Student.
Claims (24)
- REIVINDICACIONES1. Célula del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) aislada modificada genéticamente caracterizada porque comprendeun polinucleótidoexógenoque presenta una identidad conlaSEQIDNO:1seleccionadadela listaque
- consiste en:
- a.
- al menos, un 50%,
- b.
- al menos, un 60%,
- c.
- al menos, un 70%,
- d.
- al menos, un 80%, y
- e.
- al menos, un 90%,
donde dicho polinucleótido codifica para una variante funcional de SEQ ID NO: 1. -
- 2.
- Célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación1 caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con la SEQ ID NO: 1.
-
- 3.
- Célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación1 caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con la SEQ ID NO: 2.
-
- 4.
- Célula del SMF modificada genéticamente según cualquierade las reivindicaciones1 a3, dondeel polinucleótido exógeno está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende:
- a.
- un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido,
- b.
- una señal de inicio de la transcripción,
- c.
- una señal de terminación de la transcripción,
- d.
- una señal de poliadenilación, o
- e.
- un activador transcripcional.
-
- 5.
- CéluladelSMF modificada genéticamentesegún cualquieradelasreivindicaciones1a4dondeel polinucleótido exógeno codifica una secuencia aminoacídicaque presenta una identidadconlaSEQIDNO:3seleccionadadelalista que consiste en:
- a.
- al menos, un 50%,
- b.
- al menos, un 60%,
- c.
- al menos, un 70%,
- d.
- al menos, un 80%,y
e. al menos, un 90%, donde dicho polinucleótido codifica para una variante funcional de SEQ ID NO: 3. -
- 6.
- CéluladelSMF modificada genéticamentesegúnlareivindicación5dondeel polinucleótidoexógeno codifica la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.
-
- 7.
- CéluladelSMF modificada genéticamentesegúnlareivindicación5dondeel polinucleótidoexógeno codifica la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4.
-
- 8.
- Célula delSMFmodificada genéticamente según cualquierade las reivindicaciones1 a7donde dicha célula es un monocito o un macrófago.
-
- 9.
- Composiciónfarmacéuticaque comprendela céluladelSMF modificada genéticamentesegúncualquieradelas reivindicaciones1 a 8.
-
- 10.
- Composiciónfarmacéutica segúnlareivindicación9que además comprendeunvehículofarmacéuticamente aceptable.
-
- 11.
- Composiciónfarmacéuticasegúncualquieradelasreivindicaciones9ó10queademáscomprendeotroprincipio activo.
-
- 12.
- Usodela célula del SMF modificada genéticamente según cualquierade las reivindicaciones1 a8 parala elaboración de un medicamento.
-
- 13.
- Uso de la célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación 12 para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un tejido o un órgano.
-
- 14.
- Uso de la célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación 12 para la elaboración de un medicamento parala prevenciónoel tratamientode unfallo agudode unórgano.
-
- 15.
- Uso de la célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación 12 para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado.
-
- 16.
- Uso de la célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 donde el órgano es de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel.
- 17. Uso de la célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación 16 donde el órgano es el riñón.
- 18. Método de obtención de la célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1a8que comprende:
- a.
- obtener una célula del SMF aislada,y
- b.
- transfectar la célula del paso (a) con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido, donde dicho polinucleótido presenta una identidad conlaSEQIDNO:1seleccionadadela listaconsisteen: i) al menos, un 50%, ii) al menos, un 60%, iii) al menos, un 70%, iv) al menos, un 80%,y
v) al menos, un 90%. yademás dicho polinucleótido codifica para una variante funcional de SEQ ID NO: 1. -
- 19.
- Método de obtención de la célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación 18 donde el polinucleótido del paso (b) es la SEQ ID NO: 1.
-
- 20.
- Método de obtención de la célula del SMF modificada genéticamente según la reivindicación 18 donde el polinucleótido del paso (b) es la SEQ ID NO: 2.
-
- 21.
- Método de obtención de la célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde el polinucleótido del paso (b) está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende:
- a.
- un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido,
- b.
- una señal de inicio de la transcripción,
- c.
- una señal de terminación de la transcripción,
- d.
- una señal de poliadenilación, o
- e.
- un activador transcripcional.
-
- 22.
- Método de obtención de la célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 18a21 dondela transfeccióndel ácido nucleicodelpaso(b)se realiza empleandounvector adenoviral.
-
- 23.
- Método de obtención de la célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 donde la célula del SMFaislada en el paso (a) es un monocito o un macrófago.
13 14 15 16 17 18 19LISTADE SECUENCIAS<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)<120> Célula del SMF modificada genéticamente para sobreexpresar NGALy su uso comomedicamento<130> ES1641.214<160> 14<170> PatentIn versión 3.5<210> 1<211> 597<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 1<210> 2<211> 603<212> DNA<213> Mus musculusES2350 078A1<400> 2<210> 3<211> 198<212> PRT<213> Homo sapiensES2350 078A1<400> 3<210> 4<211> 200<212> PRT<213> Mus musculus<210> 5<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador directo para la secuencia del gen Ki67 de Mus musculus<400> 5<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador inverso para la secuencia del gen Ki67 de Mus musculus<210> 7<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador directo para la secuencia del gen PCNAde Mus musculus<400> 7<210> 8<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador inverso para la secuencia del gen PCNAde Mus musculus<400> 8<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador directo para la secuencia del gen NGAL de Mus musculus<400> 9<210> 10<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador inverso para la secuencia del gen ngal de Mus musculus<400> 10<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador directo para la secuencia del gen TNFalfa de Mus musculus<210> 12<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador inverso para la secuencia del gen TNFalfa de Mus musculus<400> 12<210> 13<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador directo para la secuencia del gen GAPDH de Mus musculus<400> 13<210> 14<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> cebador inverso para la secuencia del gen Gapdh de Mus musculus<400> 14OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS N.º solicitud: 200930183 ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 19.05.2009- INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
- Fecha de prioridad: 00-00-0000 00-00-0000 00-00-0000
- 51 Int. Cl. :
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DOCUMENTOS RELEVANTES- Categoría
- 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- Y
- MISHRA, J., et al. Amelioration of ischemic acute renal injury by neutrophil gelatinase-associated lipocalin. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. Diciembre-2004. Vol. 15, nº 12, páginas 3073-3082. ISSN 1046-6673. Ver todo el documento. 1-23
- Y
- KLUTH, D.C., et al. Gene transfer into inflamed glomeruli using
- macrophages transfected with adenovirus. Gene therapy. Febrero2000. Vol. 7, nº 3, páginas 263-270. ISSN 0969-7128. Ver resumen, resultados (primer párrafo) y materiales y métodos.
- 1-23
- Y
- VINUESA, E., et al. Lipocalin-2-induced renal regeneration depends on cytokines. American journal of physiology. Renal Physiology. Noviembre-2008. Vol. 295, nº 5, páginas F1554-F1562. ISSN 0363-6127. Ver resumen y resultados. 1-23
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- KITAMURA, M. Adoptive transfer of nuclear factor-kappaBinactive macrophages to the glomerulus. Kidney international. Febrero-2000. Vol. 57, nº 2, páginas 709-716. ISSN 0085-2538. Ver resumen y métodos (2º epígrafe). 1-23
- A
- WO 2006066587 A1 (ANTIBODYSHOP A/S) 29.06.2006, todo el documento.
- A
- ROUDKENAR, M.H., et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin acts as a protective factor against H(2)O(2) toxicity. Archives of medical research. Agosto-2008. Vol. 39, nº 6, páginas 560-566. ISSN 0188-4409. Ver todo el documento.
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 16.09.2010
- Examinador B. Pérez Esteban Página 1/5
Nº de solicitud: 200930183INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICACLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUDC12N 5/10 (2006.01) C12N 5/0786 (2010.01) C12N 15/12 (2006.01) A61P 13/12 (2006.01)Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)C12N, A61PBases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)INVENES, EPODOC, WPI, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, EBI (UniProt, Euro Patents, Japan Patents, US Patents, PDB, EMBL All, EMBL human, EMBL Mouse).OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 200930183Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.09.2010- Declaración
- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones 1-23 SÍ
- Reivindicaciones _____________________________________
- NO
- Actividad inventiva
- Reivindicaciones _____________________________________ SÍ
- (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones 1-23 NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como ha sido publicada.OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2009301831. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- MISHRA, J., et al. Dic-2004
- D02
- KLUTH, D.C., et al. Febr-2000
- D03
- VINUESA, E., et al. Nov-2008
- D04
- KITAMURA, M. Febr-2000
- D05
- WO 2006066587 A1 29.06.2006
- D06
- ROUDKENAR, M.H., et al. Ago-2008
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónLa presente solicitud de patente describe una célula del sistema mononuclear fagocítico (SMF), más concretamente un macrófago, modificada genéticamente de modo que contiene las secuencias del gen NGAL (lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos), o de la proteína correspondiente. La solicitud reivindica también el método de obtención de esta célula y su uso como medicamento para el tratamiento de daño causado por isquemia, toxinas, fallo agudo o rechazo a transplante de un órgano.No se ha encontrado en el estado de la técnica ningún documento que divulgue la célula reivindicada ni su uso, por lo que la invención es nueva según el artículo 6 de la Ley de Patentes.Sin embargo, no se considera que la solicitud cumpla el requisito de actividad inventiva del artículo 8 de la Ley de Patentes, pues se han encontrado algunos documentos cuya combinación, obvia para el experto en la materia, conduciría al objeto de la invención, como se explica a continuación.En el documento D01 se describe el uso de la proteína NGAL para el tratamiento del fallo renal agudo producido tras la isquemia. En este trabajo se demuestra que la administración intravenosa de NGAL en ratones modelo con isquemia renal inducida, resulta en un aumento de la proliferación celular, y mejora tanto el daño histopatológico (ver figura 4) como la alteración de la función renal inducida por la isquemia (ver figura 6). La diferencia entre D01 y la presente solicitud es que en ésta la proteína NGAL se aporta al organismo en forma de macrófagos modificados para sobreexpresar el gen correspondiente.En el documento D02 se divulga un método para transfectar macrófagos mediante adenovirus recombinantes. En este artículo los macrófagos transfectados son dirigidos a la región afectada para, de este modo, reducir la inflamación. Los autores proponen este sistema como una forma muy efectiva de liberar genes en la región renal.El experto en la materia combinaría de forma evidente la información de los documentos D01 y D02, y emplearía el método de D02 para transfectar macrófagos con el gen de NGAL, obteniendo de este modo las células de la invención. Por tanto, a la luz de lo divulgado en estos dos documentos, la presente solicitud no tendría actividad inventiva.El documento D03 es un estudio de cómo la lipocalina endógena (Lcn2 o NGAL) induce la regeneración renal en ratones modelo con isquemia renal inducida. Este documento, además de analizar el efecto que determinadas citoquinas tienen en este gen (y, por tanto, en la regeneración renal), evidencia el uso de la proteína NGAL en el tratamiento de la isquemia renal aguda. Para llegar al objeto de la solicitud, el experto en la materia únicamente tendría que introducir esta proteína (o su gen correspondiente) en macrófagos para así dirigirla a la región del daño isquémico.Esta información la puede obtener de lo divulgado en el documento D04. En este artículo se describe cómo introducir un factor nuclear en macrófagos empleando vectores virales (en este caso, retrovirus), y cómo estos macrófagos recombinantes son empleados para estudiar el posible papel de los macrófagos en estados normales o patológicos del riñón.El experto en la materia podría, a partir de la información de D03 y D04, deducir de forma evidente la introducción de NGAL en macrófagos, por lo que estos dos documentos anticiparían la solicitud que, por tanto, no tendría actividad inventiva según el artículo 8 de la Ley de Patentes.Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 4/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 200930183Hoja adicionalLos documentos D05 y D06 se citan como información general del estado de la técnica, puesto que no afectan la novedad ni la actividad inventiva de la presente solicitud.Así, el documento D05 divulga la utilización de métodos de medida de la lipocalina NGAL para diagnosticar, predecir o determinar la probabilidad de sufrir desórdenes renales en humanos, incluyendo tumores, daño post-isquémico o por toxinas. Aunque la finalidad y el uso coinciden con los del método de la solicitud, en D05 no se aporta lipocalina exógena, ni se emplean técnicas para aumentar la expresión del gen en riñón, por lo que se considera un método diferente al de la solicitud.En el documento D06 se describe la clonación del gen NGAL en un vector plasmídico, y su transfección a células humanas. Mediante esta técnica (semejante a la reivindicada en la presente solicitud), se observa el efecto de NGAL en la línea celular utilizada (en este caso, se aprecia que el gen ejerce una función protectora frente a toxicidad inducida por H2O2).Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión Escrita hoja adicional) Página 5/5
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