MXPA01006998A - Uso de agentes inductores de apoptosis en el tratamiento de enfermedades (auto) inmunitarias. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a terapias para enfermedades (auto) inmunitarias). La sintesis o presencia de actividad apoptotica en celulas que provocan o estan relacionadas a enfermedades .(auto) inmunitarias, tal como sinoviocitos en artritis reumatoide, dara por resultado la induccion de apoptosis. La invencion tambien se refiere a vehiculos de distribucion genica, que comprende moleculas de acido nucleico que codifican para las proteinas que inducen apoptosis con actividad tipo apoptina.

Description

USO DE AGENTES INDUCTORES DE APOPTOSIS EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES (AUTO) INMUNITARIAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de las terapias basadas en biología molecular. La invención se refiere adicionalmente a la diagnosis del riesgo de una enfermedad futura. De manera más particular, la invención se refiere al campo del tratamiento y diagnosis de riesgo de enfermedades (auto) inmunitarias y/o trastornos inflamatorios. En donde se haga referencia, en esta especificación, a cualquiera, la otra se debe incluir a menos que se excluya de forma expresa. La invención también se refiere a la inducción de apoptosis en ciertas células asociadas con, o relacionadas a, las enfermedades (auto) inmunitarias . Las enfermedades auto- inmunitarias son un grupo de enfermedades severas que se caracterizan por trastornos inflamatorios, tal como la enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica, algunas formas de diabetes, colitis ulcerativa y artritis reumatoide (Bischoff et al., 1996; Firestein, 1995, 1998; Liblau et al., 1995). Como una de las representantes principales de esta familia de enfermedades, se describirá la artritis reumatoides (RA) en mayor detalle como representante de las aplicaciones de la presente invención. La RA afecta las articulaciones pero REF: 131647 también otros órganos. La enfermedad afecta al 1-2% de la población adulta a escala mundial. Las mujeres se ven afectadas más frecuentemente que los hombres en una relación por sexo de 3 : 1. El espectro clínico así como el transcurso de la enfermedad varía considerablemente. En una enfermedad moderada, la inflamación de las articulaciones se puede presentar durante un periodo limitado de tiempo y puede no presentarse la destrucción de las articulaciones. Este patrón es relativamente raro. La mayoría de los pacientes tienen niveles continuamente altos o variables de la actividad de la enfermedad. Esto se asocia con un peor resultado de la enfermedad con respecto a la incapacidad y destrucción de articulaciones (Van Zeben et al. , 1994) . La RA está asociada con un riesgo incrementado de mortalidad (Wolfe, 1990) . La destrucción de las articulaciones empieza de manera temprana en la RA. La proporción más alta de formación de erosión parece ser durante los primeros 2 años después del comienzo de la RA. Recientemente, se proporcionó evidencia que en los siguientes años tomará lugar un progreso continuo de erosiones (Sharp et al., 1991; Van der Heijde et al., 1992) . La etiología de la RA permanece sin resolver, aunque la patofisiología de la RA es un área dinámica de investigación (Breedveld, 1998) . Un esquema simple que explica esta enfermedad dramática es que la inflamación y destrucción de tejido se inicia por el influjo de linfocitos en el sinovio. Estos estimulan las células 5 plasmáticas, las células cebadas, macrófagos y especialmente los sinoviocitos tipo fibroblasto para producir mediadores inflamatorios tal como el factor-alfa de necrosis de tumor e interleucina-1. Estos mediadores pueden inducir a actividades de degradación de la matriz 10 que eventualmente conducen a la destrucción de las articulaciones. Estas actividades incluyen la activación de los sinoviocitos tipo fibroblasto para producir colagenasa, la inducción de hueso y reabsorción de cartílago, y la expresión incrementada de quimiocinas y de 15 moléculas de adhesión y HLA, todos los cuales conducen a la estimulación adicional de la respuesta inmunitaria o al influjo adicional de células en el espacio de las articulaciones (Breedveld, 1998) . Recientemente, se han proporcionado datos que los 20 FLS se alteran de manera irreversible en la RA y que un proceso autónomo les permite permanecer inactivados aún después de la remoción del milieu inflamatorio, articular. Las células continúan migrando e invadiendo sin estimulación exógena adicional, aunque reducida en 25 comparación a la situación estimulada (Firestein, 1995) .

*^"-""-*"*-- -" En tanto que la división celular es un posible mecanismo de la acumulación de FLS, es limitada la evidencia de la división celular disoluta y la síntesis de ADN en el forro intimal. La presente invención describe que la inducción 5 de la apoptosis en estas células es útil en el combate de los efectos de la enfermedad. Si la proliferación es relativamente baja, en realidad, entonces las anormalidades en la proporción de la muerte celular pueden contribuir a la hiperplasia del forro en la sinovitis. El grado de 10 apoptosis en el sinovio reumatoide sólo se ha examinado recientemente (Firestein et al., 1995, 1995a). La apoptosis se caracteriza por encogimiento de células, segmentación por encogimiento de células, segmentación del núcleo, condensación e incisión del ADN en los fragmentos 15 del tamaño del dominio, en la mayoría de las células seguido por degradación inter-nucleosómica. Finalmente, el fragmento de las células apoptóticas en los cuerpos apoptóticos encerrados en la membrana, que se fagocitan rápidamente por las células vecinas. Por lo tanto, la 20 apoptosis provoca mucho menos destrucción de tejido que la necrosis, el tipo no fisiológico de muerte celular. (Wyllie et al., 1980; Arends y Wyllie, 1991). Sin embargo, el mecanismo de apoptosis reducida, normal en la RA no se ha puesto en claro completamente, un 25 papel prominente de la función p53 defectuosa parece estar ^t í iá i í^ ?mám comprendido con la supervivencia y muerte de los sinoviocitos (Conway et al., 1995). Mountz et al., (1994) ha reportado que la apoptosis defectuosa se relaciona con otras enfermedades auto-inmunitarias tal como lupus 5 éritematoso sistémico, síndromes de vasculitis, enfermedad de Behcet, y enfermedad inflamatoria del intestino. Por lo tanto, de acuerdo a la presente invención, un planteamiento terapéutico para curar la RA y otras enfermedades (auto) inmunitarias será evadir el bloque apoptótico en 10 estas células al inducir una ruta apoptótica (alternativa) . Por lo tanto, la invención proporciona el uso de un agente inductor de apoptosis en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos inflamatorios y/o enfermedades inmunitarias. En particular, la invención 15 proporciona el uso de un agente inductor de apoptosis en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades auto-inmunitarias. El daño de todos los trastornos/enfermedades mencionados con anterioridad comprende usualmente el daño provocado de forma directa o 20 indirecta por un cierto sub-conjunto de células (tal como FLS en la RA) que están de alguna manera fuera de control (proliferación excesiva u otra actividad, o carencia de muerte celular regulada, o necrosis o similar) . Por lo tanto, es útil poder ser capaces de inducir la apoptosis en 25 este sub-conjunto de células al proporcionar a estas i „~r imt*a aa ¡*m^?m células un agente inductor de apoptosis. La apoptosis es preferible a la muerte celular necrótica, debido a que conduce a menos productos de descomposición, ver anteriormente. Es útil cualquier manera en la cual se 5 puedan proporcionar las células objetivo con la actividad apoptótica, de acuerdo con la invención. Sin embargo, se prefiere que la actividad apoptótica se proporcione por una sustancia proteica que se codifique por un gen, se distribuya a la célula objetivo por un vehículo de 10 distribución génica. Un vehículo de distribución génica se define en la presente como cualquier vehículo capaz de distribuir un gen a una célula, sea de origen viral o no viral. El gen debe de distribuirse de una manera tal que se puede expresar de manera funcional en la célula 15 objetivo. La formulación farmacéutica del agente inductor de apoptosis o el vehículo de distribución génica será similar a las formulaciones farmacéuticas para otros agentes para inducir la muerte celular para una cierta 20 población de células objetivo. Para los vehículos de distribución génica, tal como adenovirus, muchas formulaciones para distribuir genes a ciertos números de células se han descrito ya por muchos otros y por lo tanto estas formulaciones no necesitan elaboración adicional en 25 la presente. Otras formulaciones para otros vehículos de ""»*"- »»-g«fr"**»-«~ -n distribución génica se pueden poner conjuntamente, de manera análoga o como se describe en la técnica pertinente. A fin. de ser capaces de eliminar cualquier efecto indeseado de los vehículos de distribución génica de acuerdo con la invención, se prefiere adicionar un gen suicida a su información genética. De esta manera, la invención también proporciona un uso en donde el vehículo de distribución génica comprende adicionalmente un gen suicida. Por supuesto, se prefiere que este gen esté bajo el control de un promotor inducible. Los genes suicidas conocidos incluyen genes que codifican para timidina-cinasas u otras sustancias proteicas, citotóxicas. A fin de reducir adicionalmente los efectos indeseados de los vehículos de distribución génica de acuerdo a la invención, se prefiere que el vehículo de distribución génica tenga (o se proporcione con) , un tropismo para sus células objetivo, queriendo decir que tiene una mayor afinidad de unión y/o introducción para las células objetivo que para otras células. Esto se puede lograr simplemente al seleccionar un vehículo de distribución génica que tenga este tropismo, o al proporcionar un vehículo de distribución con este tropismo a partir de un logaritmo o sustancia que tenga una afinidad mejorada por la célula objetivo. Si no está disponible ni el organismo ni la sustancia, se puede proporcionar a través de una selección de exhibición de fagos de secuencias aleatorias que tienen afinidad para las células objetivo u otras técnicas de selección. Se proporciona un vehículo de distribución génica con tropismo para una célula objetivo diferente que su tropismo original, esto se refiere frecuentemente como una terapia génica dirigida al objetivo. De esta manera, la invención también proporciona un uso de acuerdo a la invención, en donde el vehículo de distribución génica tiene un tropismo para células hematopoyéticas, o de manera preferente para sinoviocitos tipo fibroblasto. En la alternativa, la invención proporciona un uso de acuerdo a la invención, en donde el vehículo de distribución génica se ha proporcionado con un medio de dirección al objetivo, especialmente un medio de dirección al objetivo para sinoviocitos tipo fibroblasto. Un vehículo de distribución génica, preferido, de acuerdo con la invención, es un adenovirus recombinante. Los adenovirus recombinantes son bien conocidos en el campo de la terapia génica y no necesitan elaboración adicional en la presente. Las maneras seguras para producir y usarlos se han descrito en numerosas publicaciones. El agente preferido de inducción de apoptosis de acuerdo con la invención es apoptina o un fragmento funcional, derivado o equivalente de la misma. La apoptina es una proteína derivada de un virus de anemia de pollo y se analizará en más detalle posteriormente. Un derivado funcional incluye una proteína en la cual se han modificado varios residuos de aminoácido o se han adicionado, sin afectar la actividad (queriendo decir que aún induce la 5 apoptosis, aunque a otro grado (mayor o menor) ) . Por supuesto, lo mismo aplica para fragmentos o combinaciones de fragmentos con derivatizaciones. Los equivalentes funcionales son contrapartes de la apoptina (proteína 3 del virus de anemia de pollo) en otros organismos. Una ventaja 10 muy importante de la apoptina con respecto a otros agentes inductores de apoptosis es que no exhibe su actividad a ningún grado significativo en células normales, en tanto que la presente invención muestra que exhibe su efecto en las células anormales comprendidas con o relacionadas a 15 enfermedades (auto) inmunitarias . También se refiere que la expresión de apoptina se haga inducible. La invención proporciona adicionalmente una prueba para la probabilidad de las células para llegar a 20 ser anormales a la manera de enfermedades (auto) inmunitarias . Esta prueba comprende la provisión de células que se sospecha que son capaces de llegar a ser anormales con actividad apoptótica, tal como un gen que codifica para apoptina o un derivado o fragmento del mismo, 25 y someter posteriormente las células a esfuerzo, tal como &ataMS±füaHaii ÉtoáMÉ esfuerzo osmótico, choque térmico, esfuerzo infeccioso, UV, etc. Las células que están propensas a la anormalidad, irán a la apoptosis después de este tratamiento. Las células que no tengan este potencial estarán principalmente sin afectar. De esta manera, se puede examinar la probabilidad de un individuo para enfermedades (auto) inmunitarias, futuras.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La síntesis in vi tro de la proteína apoptina derivada del virus de anemia de pollo (CAV) , en células transformadas de pollo, da por resultado la inducción de apoptosis (Noteborn et al., 1994; Noteborn y Koch, 1995; Noteborn et al., Noteborn y Van der Eb, 1998) . La apoptina es una pequeña proteína, de sólo 121 aminoácidos de largo, que es más bien básica, y con un alto contenido de prolinas, serinas y treolinas (Noteborn et al., 1991). La apoptina, y otras proteínas con actividad tipo apoptina, también pueden inducir la apoptosis en líneas de células humanas malignas y transformadas, pero no en células humanas no transformadas (Danen-Van Oorschot et al., 1997; Noteborn et al., 1998a). Se ha establecido que la apoptosis inducida por apoptina se presenta en la ausencia de p53 funcional (Zhuang et al., 1995a), y no pueden bloquearse por Bcl-2, Bcr-Abl (Zhuang et al., 1995; 1995b) , la proteína BAG-1 de asociación bcl-2 y la proteína CrmA de viruela de vaca (Noteborn, 1996; Danen-Van Oorschot et al., 1997a; Danen-Van Oorschot et al., 1998). In vi tro, la apoptina falla en inducir la apoptosis en células del músculo liso o linfoides diploides normales, dérmicas, epidérmicas, o endoteliales. Sin embargo cuando las células normales co-expresan apoptina y una proteína de transformación, tal como el antígeno T grande de SV40, las células se someterán a apoptosis. Estos datos indican que la apoptosis inducida por apoptina también tomará lugar bajo situaciones tumorigénicas no establecidas (Noteborn et al., 1998b). En las células transformadas, analizadas, que sufren todas apoptosis inducida por apoptina, la apoptina se localiza dentro del núcleo celular (Noteborn et al., 1998). En contraste, se encontró apoptina predominantemente en el citoplasma de células normales no transformadas (Danen-van Oorschot, 1997). Sin embargo, la co-expresión con una proteína de transformación permite que la apoptina esté presente en el núcleo, dando por resultado la inducción de apoptosis (Noteborn et al., 1998a). La apoptina no induce apoptosis, y no se localiza en el núcleo de los fibroblastos derivados de individuos propensos a cáncer. Sin embargo, después de la irradiación con UV (que provoca una respuesta SOS anormal en estas células que se asemeja a un estado de transformación transitoria, la apoptina puede inducir apoptosis en estas células (Zhang et al., 1999). Por otra parte, los fibroblastos de individuos saludables no responden a la apoptosis inducida por apoptina en el tratamiento con UV. Esto ilustra que es necesario una predisposición, que en la inducción activará la apoptina. Recientemente, Noteborn y Pietersen (1998) han descrito la generación y caracterización de un vector adenoviral AdMLPvp3 que expresa apoptina. Este vector permite una síntesis eficiente de apoptina in vi tro así como in vivo . Demuestran que la apoptina mantiene su especificidad para células tumorigénicas/transformadas cuando se introduce y expresa por un vector adenoviral. Los experimentos en ratas demostraron que AdMLPvp3 se puede administrar de manera segura por ejemplo por inyección intravenosa. Las dosis intravenosas repetidas de AdMLPvp3 también fueron bien toleradas, indicando que el virus que expresa la apoptina se puede administrar sin efectos adversos, severos. Estos resultados se refuerzan por el hecho que se generaron ratones transgénicos, que producen apoptina en un gran número de sus células (Noteborn y Zhang, 1998). Una inyección intratumoral, individual de AdMLPvp3 en un tumor xenogeneico dio por resultado una reducción significativa del crecimiento de tumor (Pietersen et al. , 1999) .

La especificidad intrínseca y la baja toxicidad inherente hacen a los vectores de adenovirus de síntesis de apoptina, herramientas promisorias para el tratamiento de tumores sólidos. La invención en una modalidad proporciona ahora una terapia génica, que permite el uso de las características de la apoptina de proteína inductora de apoptosis, u otras proteínas con actividad tipo apoptina, para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tal como la RA. Este vehículo de distribución génica, que es un vector independientemente infeccioso; por ejemplo, un virus o un vector derivado de virus, una liposoma o un polímero, o similar, que en sí mismo puede infectar o de cualquier otra manera distribuye información genética por ejemplo a células que provocan o están comprendidas en las enfermedades autoinmunitarias. La información genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para la actividad tipo apoptina. La invención también proporciona un vehículo de distribución génica que se ha incrementado grandemente en su capacidad para expresar actividad apoptótica tipo apoptina . El vehículo de distribución génica proporcionado de esta manera por la invención puede ser por ejemplo un adenovirus, o un retrovirus, parvovirus 'u otros virus recombinantes de ADN o ARN que se pueden usar como un vehículo de distribución o un plasmovirus. Adicionalmente, la invención proporciona un vehículo de distribución 5 génica, que también se ha complementado con un ligando específico o molécula objetivo o moléculas objetivo, por el cual el vehículo de distribución génica se puede dirigir específicamente para distribuir su información genética a una célula objetivo de elección. Esta molécula objetivo 10 puede ser por ejemplo una proteína de penetración viral, molécula receptora, o anticuerpo reactivo con un receptor de superficie o proteína de células relacionadas a las enfermedades autoinmunitarias. También, la invención proporciona un vehículo de 15 distribución génica, que se puede usar en la diagnosis, es decir, de enfermedades auto-inmunitarias, tal como RA. Este vehículo de distribución génica se puede usar, es decir, para la diagnosis in vi tro, en donde las muestras de tejido o de células o las biopsias se toman de un humano o 20 animal. Estas muestras luego se pueden evaluar o probar al infectarlas, en cultivo o directamente, con el vehículo de distribución génica capaz de expresar, es decir, la actividad tipo apoptina. Las células relacionadas con RA, tal como los sinoviocitos tipo fibroblasto, o las células 25 relacionadas a otras enfermedades inmunitarias se someterán MittiMitfüaltaÉb a la apoptosis en la síntesis de apoptina. Especialmente, cuando estas células se estimulan con factores de crecimiento, séricos, y de citosina y/o otros factores que inducen un "crecimiento aún más agresivo" de estas células. 5 De manera alternativa, la localización nuclear de la apoptina en las células relacionadas con las enfermedades auto-inmunitarias es otro marcador para el análisis de diagnóstico de las células de RA o las células, que se deriven de otras enfermedades auto-inmunitarias. La 10 presencia de apoptina se puede demostrar, es decir, con técnicas (inmuno) histoquímicas clásicas es decir, microscópicamente o con técnicas de clasificación celular, automatizadas. En particular, la invención se refiere a terapias 15 anti-inmunitarias . El tratamiento de células relacionadas con enfermedades auto-inmunitarias tomará lugar, por ejemplo, por la expresión de apoptina por medio de infección directa de estas células con vehículos de distribución génica tal como vectores de adenovirus que 20 contienen una secuencia de codificación para una proteína con actividad tipo apoptina. Por lo tanto, la invención en aún otra modalidad proporciona vehículos de distribución génica tal como el vector de adenovirus que expresa apoptina, que es un agente anti-autoinmunitario, potente. 25 Además, la expresión de apoptina en las células ---'-"-'----*-"»-relacionadas con la enfermedad auto-inmunitaria también provocará indirectamente la muerte celular en aquellas células relacionadas con la enfermedad auto-inmunitaria, que no estén expresando apoptina. Este llamado efecto curioso mejorará aún más el tratamiento con apoptina de las enfermedades auto-inmunitarias. La síntesis de apoptina no induce o al menos no de manera detectable o significativa la apoptosis en células saludables, normales, indicando que es baja la toxicidad del tratamiento in vivo con vehículos de apoptina recombinantes, tal como el vector de adenovirus que regula la síntesis de apoptina. La expresión de apoptina en las células, que están relacionadas a las enfermedades autoinmunitarias también puede tomar lugar al infectar células con otros vectores virales de ADN y/o ARN, además de los vectores de adenovirus, que contienen una secuencia de codificación para la apoptina, tal como retrovirus y parvovirus (Lopez-Guerro et al., 1997). Además, los sistemas de los vectores derivados de virus, tal como los plasmovirus (Noguiez-Hellin, 1996) se pueden usar para la inducción de apoptosis inducida por apoptina en las células relacionadas a las enfermedades auto-inmunitarias. La invención también permite la identificación de los factores celulares esenciales que juegan un papel en el desarrollo de las enfermedades auto-inmunitarias tal como la RA.

Ensayo de diagnostico para la propensión (auto) inmunitaria ' Los datos presentados en este informe permiten desarrollar un ensayo para determinar si un individuo con un antecedente celular/génico desconocido, está propenso a enfermedades (auto) inmunitarias en comparación a personas saludables, normales. Las células diploides normales (tal como las FLS) de un individuo propenso a un evento (auto) inmunitario, son insensibles a la apoptosis inducida por apoptina, pero llegan a ser después del tratamiento con tensión, tal como tensión química, osmótica, térmica, infecciosa y/o por radiación, tal como rayos UV y rayos X. A continuación, se describe un ejemplo de este ensayo de diagnostico en base al efecto de una irradiación con UV. Se aislan células primarias (por ejemplo FLS) del individuo que se va a probar y se cultivan en un medio adecuado. Luego, las células se irradian con UV y se transfectan subsecuentemente con un plásmido que codifica para apoptina, o las células se transfectan/infectan primero y luego se irradian. En paralelo, se usarán como control células diploides de un individuo saludable, normal . Al usar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta en base a los Mab específicos de apoptina, las células se analizan para la presencia de apoptina en el núcleo y/o para la experimentación de la apoptosis. Si el porcentaje de células que experimentan apoptosis entre las 5 células tratadas con UV positivas a apoptina es significativamente mayor que el porcentaje que la apoptosis en las células tratadas con UV de un individuo normal, esto será una fuerte evidencia que el individuo de quien se aislaron las células, estará propenso a enfermedades 10 (auto) inmunitarias. La invención se explicará en más detalle en base a la siguiente parte experimental. Esto es solo para el propósito de ilustración y no se debe interpretar como una limitación el alcance de la protección. 15 PARTE EXPERIMENTAL Células y condiciones de cultivo celular Líneas de células PER.C6 de la retina embriónica humana (HER) transformadas con Ad5 El se cultivaron en el 20 medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS) en una atmósfera de C02 al 5% a 37°C. La línea celular PER.C6 se obtuvo de Fallaux et al., (1996). Los medios de cultivo celular, reactivos y sueros se compraron de GIBCO Laboratories (Grand Island, 25 NY) . Los plásticos de cultivo se compraron de Greiner -"ft-dTunHM (Nurtingen, Alemania) . Se derivaron sinoviocitos a partir de un paciente que sufre artritis reumatoide (RA) . Las células se cultivaron en el medio MDM que contiene FCS al 10%. Después de la infección adenoviral, se cultivaron los sinoviocitos en el medio MDM complementado con FCS al 10% o con un suero humano normal al 40%. Los sinoviocitos se obtuvieron de P. Goossens, Departament of Rheumatology, Leiden University Medical Centre (LUMC) , Leiden, Los Países Bajos.

Virus El vector AdMLPvp3 adenoviral recombinante se usó para la expresión viral de la apoptina (Pietersen et al., 1999) . El vector AdMLPvp3 contiene un intensificador E1A enlazado al promotor tardío principal (MLP) de adenovirus para impulsar el gen de apoptina, que comprende la región derivada del virus de anemia de pollo (CAV) (posiciones nt 427-868; Noteborn et al., 1991). El AdCMVLacZ adenoviral recombinante se usó como un adenovirus de control. El AdCMVLacZ porta el gen LacZ de E. Coli para beta-galactosidasa bajo el control del intensificador/promotor de citomegalovirus (Pietersen et al., 1999).

Técnicas de virus Se realizaron ensayos en placa, como se describe previamente (Graham y Prevec, 1991) . De manera breve, soluciones concentradas de adenovirus se diluyeron en serie en 2 ml de DMEM que contiene 2% de suero de rábano y se adicionó a PER.C6 casi-confluente en placas de 6 cavidades. Después de 2 horas de incubación a 37 °C el medio se reemplazó por el medio esencial mínimo F-15 (MEM) que contiene 0.85% de agarosa (Sigma, USA), HEPES 20 mM (pH 7.4), MgC12 12.3 mM, L-glutamina al 0.0025%, y 2% de suero de rábano (inactivado térmicamente a 56°C durante 30 minutos) . Se realizó una producción a pequeña escala de lotes de adenovirus como se describe por Fallaux (2996) . De manera breve, monocapas de PER.C6 casi-confluentes se infectaron con aproximadamente 5 unidades de formación de placa (pfu) por célula, en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 1% de suero de rábano. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se reemplazó el inoculo por medio fresco (DMEM/2% de suero de rábano) . Después de 48 horas, las células casi completamente desunidas se recolectaron, y se colectaron en 1 ml de PBS/1% de suero de rábano. Se aisló el virus de las células productoras por 3 ciclos de congelación/descongelación instantánea. Los rizados se limpiaron por centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos y se almacenaron a -20 °C. Las soluciones concentradas de rAdV producidas por PER.C6 se seleccionaron para la presencia de adenovirus competentes-recombinante al realizar el análisis de PCR con cebadores derivados de la región Ad5 ITR (5'-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3' ) y la región de codificación ElA (5' -TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3' ) como se describe por Noteborn y De Boer (1995) usando un aparato de PCR Perkin Elmer. La presencia de un fragmento amplificado de 600 pb indica que existe el adenovirus competente en la replicación (que contiene la región El) en la solución concentrada analizada del virus (Pietersen et al., 1999).

Inmunofluorescencia y tinción de DAPI Se realizó la inmunofluorescencia indirecta como se describe por Noteborn et al., (1990). Para demostrar la presencia de apoptina y para establecer su localización celular en células infectadas, las células se fijaron con acetona al 80%. El ensayo indirecto de inmunofluorescencia se realizó con una dilución 3 veces del anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) CVI-CAV-111.3 para apoptina y una dilución de 100 veces de mAb LacZ (Boehringer Mannheim, Los Países Bajos) para beta-galactosidasa. El anticuerpo antiratón de cabra marcado con fluoresceína-isotiocianato (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove PA, USA)' se usó como un segundo anticuerpo. El ADN nuclear se tiñó con un microgramo por mililitro de 2, 4-diamino-2-fenilindol (DAPI), 2% de 1, 4-diazabiciclo [2 , 2, 2 ] -octano (DABCO) en glicerol/Tris-HCl 0. ÍM pH 8.0 (Telford et al., 1992).

Ensayo de TÚNEL Se realizó un marcado del extremo de mella de dUTP mediado por desoxinucleotidil-transferasa terminal (Tdt) (TÚNEL) con el uso del equipo de detección de muerte celular in situ (Boehringer Mannheim, Alemania) . Veinticuatro horas después de la infección, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7.4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la permeabilización (Tritón X-100 al 0.1%, citrato de sodio al 0.1%, 2 minutos a 4°C) las células se incubaron con la mezcla de reacción de TÚNEL (que contiene polímeros de nucleótidos marcados con fluoresceína y desoxinucleotidil-transferasa terminal) durante 1 hora a 37°C. Después del lavado con PBS, las células se analizaron por microscopía de fluorescencia.

Ensayos de tinción con Giemsa y beta-galactosidasa Para la detección del número de células unidas, las células se tiñeron con Giemsa. Después de la infección (en falso) , las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en metanol : ácido acético (3:1) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Durante 30 minutos, las células se incubaron en una solución de Giemsa al 3% (Merck, Darmstad, 5 . Alemania) en Na2HP04 lmM, pH 7.0) a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se lavaron 4 veces con agua desionizada y se dejaron secar con aire. Para la detección de la actividad de beta-galactosidasa codificada por LacZ, las células en el cultivo de tejido se fijaron 24 10 horas después de la infección en solución de paraformaldehído al 2%/glutaraldehído al 0.2% enfriada con hielo, se lavaron con PBS enfriada con hielo (que contiene MgCl2 2 mM) , y se incubaron .en 3 ml de la mezcla de reacción (1 miligramo por mililitro X-galón (Boehringer 15 Mannheim, Alemania) , ferrocianuro de potasio 5 mM, ferricianuro de potasio 5 mM, MgC12 2 mM en PBS) a 37°C durante 4-16 horas (Sanes et al., 1986).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20 Un modelo in vi tro para la enfermedad auto- inmunitaria humana, artritis reumatoide (RA) . Para estudiar los posibles efectos terapéuticos de la síntesis de apoptina para pacientes con RA, se ha establecido un modelo in vi tro para la RA. Para ese fin, 25 los sinoviocitos tipo fibroblasto (FLS) de un paciente OH, - ,---a*.'j1ákm*?Am. que sufre de RA se aislaron. Las células se cultivaron en un medio "no estimulante" que contiene suero de becerro fetal o en el llamado medio "estimulante", que contiene suero humano normal al 40%. De manera especial, este último medio contiene citocinas y otros factores estimulantes, que se asemejan cercanamente a la situación de RA in vivo . Estos LFS "estimulados" imitan las condiciones de RA que se relacionan a otros aspectos muy importantes. El crecimiento normal de LFS in vivo e in vi tro provocará secreción de varios factores celulares que estimulan su propio crecimiento celular y aquellos de otros (por ejemplo, LFS) aún más (Firestein, 1995). Sin embargo, los LFS relacionados a RA (cultivados) también se han sometido a cambios genéticos intrínsecos, que los hacen ya diferentes en comparación a las células saludables normales . Los vectores de adenovirus son muy adecuados para la expresión de un transgen en LFS relacionado a RA. En la actualidad, en los sistemas más eficientes para lograr la transducción de un transgen para la mayoría de los tipos celulares hace uso de vectores adenovirales. Estos vectores tienen varias ventajas que los hacen particularmente adecuados para la transferencia génica in vivo . Los vectores adenovirales recombinantes se pueden cultivar a altos títulos, tienen la capacidad de transducir células no mitóticas, y no integran sus genomas en el ADN de las células huésped. Además, se han aplicado ya vectores de adenovirus para ensayos clínicos de terapia génica. Se ha estudiado si un vector de adenovirus de apoptina recombinante puede dar por resultado una transducción eficiente de células LFS de RA. Para este fin, estas células de LFS se infectaron con el vector AdLacZ (moi 50) deficiente de replicación, que codifica para la proteína beta-galactosidasa. Dos días después de la infección, las células LFS se fijaron y analizaron para la síntesis de beta-galactosidasa. Aproximadamente, 40% de las LFS infectadas fueron positivas en el ensayo de beta-galactosidasa. En comparación a otros tipos celulares infectados con vectores de adenovirus recombinantes que expresan beta-galactosidasa, este porcentaje de transducción es alto. Por lo tanto, se concluye que un vector de adenovirus es muy adecuado para producir transgenes en los LFS de RA. Un ejemplo de un vector de adenovirus adecuado para la expresión de apoptina se muestra en la Figura 1. Infección de LFS de RA estimulado con suero con AdMLPvp3 que da por resultado un nivel dramático de muerte celular.

A continuación, se ha determinado el efecto citotóxico de la síntesis de apoptina en los LFS de RA. Para este fin, las células se infectaron con virus de control negativo AdLacZ, AdMLPvp3 (ambos moi: 50 que 5 codifican para apoptina o infectados en falso. Subsecuentemente, las células se cultivaron en un medio "no estimulante" o "estimulante". Tres y seis días después de la infección, las células se analizaron para la densidad celular por tinción con Giemsa. 10 Tres días y seis días después de la infección, las células que se infectaron con el vector AdLacZ de adenovirus recombinante no mostró una reducción significativa en la densidad celular, en comparación con aquellas que se trataron en falso. Estos datos se 15 observaron tanto para las condiciones del medio "no estimulante" así como el "estimulante". Por otra parte, la densidad celular en las cajas con los LFS de RA que se infectaron con el vector recombinante AdMLPvp3, sin embargo, se redujeron de manera 20 significativa. Ya, tres días después de la infección (dos días después de la "estimulación") , los FLS de RA casi todos "murieron". Las cajas que no se estimularon no parecen tener una reducción significativa de células provocadas por infección con AdMLPvp3. Sin embargo, seis 25 días después de la infección, la cantidad de células mtáu í ^^^ m ?lÉ tratadas con AdMLPvp3 también se redujo significativamente en comparación con los FLS de RA tratados en falso. Los resultados de los experimentos, que muestran el efecto en la densidad celular de los cultivos de FLS de RA infectados con AdLacZ, AdMLPvp3 o tratados en falso a los seis días después de la infección, se muestran en la Figura 2. Estos resultados prueban que la síntesis de apoptina provoca específicamente muerte celular en FLS, que se derivan de un paciente que sufre la enfermedad auto-inmunitaria, RA. La infección de vectores de adenovirus, como tal, no tiene efecto citotóxico significativo en los FLS de RA. La apoptina tiene ya un efecto negativo moderado en la densidad celular los FLS de RA, cuando se cultivan bajo condiciones "no estimulantes". Estos datos implican, que los FLS de RA son diferentes de las células saludables, normales, humanas, como se ha sugerido por Firestein (1995, 1997, 1998) y otros (Breedveld, 1997). Esta diferencia parece ser "reconocida" por la apoptina. El hecho que la apoptina tenga un efecto de aniquilamiento celular más potente cuando los FLS de RA se estimulan con suero, indican que la apoptina llega a ser aún más activada cuando los FLS empiezan a segregar varios factores tal como citocinas, quimiocinas, etc., que tienen todos un efecto intensificador en la proliferación celular (Firestein, 1997) que conduce a un estado tipo más ?U ß¡ll ¡ transformado. Los resultados son aún más interesantes cuando se toma en cuenta que la infección con AdMLPvp3 provoca la producción de apoptina en aproximadamente 30-40% de los FLS derivados de RA (como se determina por el análisis de inmunofluorescencia en cultivos de FLS infectados en paralelo) , mientas que casi todos los FLS se aniquilan. No solo los FLS positivos a apoptina, sino también las células negativas apoptina se aniquilan. Este resultado indica que el tratamiento con AdMLPvp3 tiene un efecto curioso. Más probablemente, una reducción traumática de los factores de estimulación de crecimiento y/o prevención de la apoptosis, debido a la apoptosis inducida por apoptina provocará también la muerte de las células negativas a apoptina. Se concluye que la apoptina puede inducir la muerte celular en los FLS de RA, que se mejora aún por factores exógeno y endógenos. Estas características implican que la apoptina será un agente terapéutico para curar RA y otras enfermedades auto-inmunitarias. El análisis de TÚNEL prueba que la síntesis de apoptina mediada por AdMLP induce apoptosis en los LFS de RA. Para caracterizar la naturaleza de la muerte celular inducida por AdMLPvp3, se visualiza la presencia de roturas de hebra de ADN con la ayuda de dUTP (marcado con Fitc y desoxinucleotidil-transferasa terminal (ensayo de TÚNEL) . Los FLS de RA se infectaron ya sea con AdMLP-vp3 y después de 24 horas las células se estimularon con suero humano al 40%. Un día después, las células se recolectaron y se tiñeron para el transgen para confirmar la similitud en las eficiencias de transducción y las-cajas infectadas en paralelo se sometieron al ensayo de TÚNEL. Aunque 40% de los FLS de RA estaban expresando beta-galactosidasa, solo ocasionalmente una célula individual exhibió roturas de ADN que se pudieron detectar por el ensayo de TÚNEL. En contraste, la frecuencia de células positivas a TÚNEL después de la infección con AdMLPvp3 pareció estar en el mismo intervalo como la frecuencia de células positivas a apoptina después de la infección. Por lo tanto, se concluye que la apoptina puede inducir apoptosis en células, que han perdido o tienen reducido su propio potencial para someterse a la apoptosis. El hecho, que la apoptina puede inducir apoptosis en estas células LFS de RA, indica que el tratamiento con apoptina in vivo provocará un nivel muy bajo de efectos laterales tal como reacciones inflamatorias.

Localización nuclear de apoptina en LFS de RA, estimulados con suero humano Para examinar, la localización celular de la apoptina en los FLS derivados de RA "estimulados", las células se infectaron con AdMLP-vp3 durante 1 día, se estimularon con suero durante un día adicional y se analizaron por inmunofluorescencia usando un anticuerpo monoclonal específico de apoptina y tinción con DAPI . Casi todas las células positivas a apoptina contuvieron apoptina en el núcleo celular. Ya, una cantidad alta de células positiva a apoptina contuvo ya estructuras DAPI brillantes, normales, que son indicativas de condiciones apoptóticas muy tardías; específicamente cromatina condensada/ADN. Estos resultados prueban nuevamente que la síntesis de apoptina da por resultado la inducción de apoptosis en los FLS de RA. De esta manera, todas las células sensibles a apoptina para las condiciones celulares mostraron una localización nuclear de apoptina (Noteborn et al., 1998b). Los datos presentados prueban que la actividad de apoptina en los FLS de RA también se correlaciona con su localización nuclear. Infección de FLS estimulados con suero derivados de otros dos pacientes de EA con AdMLP-vp3 da por resultado un nivel dramático de muerte celular. Para examinar si la síntesis de apoptina da por resultado la inducción de apoptosis en varios pacientes de RA, los FLS relacionados a RA también se han extraído de los pacientes de RA designados "E" y "Lo". Los FLS relacionados a RA derivados de estos pacientes de RA se han obtenido del Departamento de Reumatología, Leiden 5 el virus de control ^n-e^ativo AdLacZ que codifica para la proteína no apoptótica beta-galactosidasa (ambos moi: 50) o se infectaron en falso. Subsecuentemente, las células se 10 cultivaron en un medio "no estimulante" o "estimulante". Tres días después de la infección (dos días después de la estimulación con suero) , las células se analizaron para la densidad celular por tinción con DAPI (Noteborn et al., 1998b) . Las células "no estimuladas" así como las 15 "estimuladas" que se infectaron con adenovirus recombinante AdLacZ no mostraron una reducción significativa en la densidad celular, en comparación con aquellas que fueron tratadas en falso. En contraste, la densidad celular en estas cajas 20 con los FLS de RA derivados de ambos pacientes "E" y "Lo" que se infectaron con el vector recombinante AdMLPvp3 fue significativamente menor. Ya, las cajas tratadas con AdMLPvp3 que no se estimularon fueron menos densas que las infectadas con AdLacZ o las tratadas en falso. Este efecto 25 fue aún más significativo en los casos donde los FLS de RA t tuémUá 'v' - ' n "11" ' ' • - «" * --^-^ se han "estimulado" con suero humano normal al 40%. Los resultados obtenidos de estos experimentos y los basados en los FLS de RA derivados del paciente OH, prueban que la síntesis de apoptosis provoca específicamente muerte celular en los FLS, que se derivan de varios pacientes que sufren la RA auto-inmunitaria. La infección de vectores de adenovirus, como tal, no tiene efecto negativo significativo en la densidad celular de los FLS de RA. Estas características fortalecen la declaración anterior que la apoptina es un agente terapéutico para curar la RA y otras enfermedades autoinmunitarias.

Construcción del vector de adenovirus AdApt-apoptina El vector de adenovirus AdMLP-vp3 regula la expresión del gen de apoptina bajo el control del promotor tardío principal (MLP) de adenovirus. El nuevo vector adenoviral AdApt contiene el promotor de citomegalovirus (CMV) , que también se ha adaptado óptimamente a la línea de células auxiliares PER.C6. Para examinar si es posible producir apoptina pro medio de un vector de adenovirus bajo la regulación de CMV, se ha construido AdApt-Apoptina . Para este fin, el fragmento de BamHI del plásmido pCMV-vp3 (Noteborn, 1996) que contiene las secuencias que codifican para apoptina (Noteborn et al., 1991) se clonó en el sitio de BamHl en el vector de transferencia de 6.1 kb, AdApt, que se obtuvo de IntroGene, Leiden, Los Países Bajos. Por el análisis de secuencia y las digestiones con enzimas de restricción, se determinó la orientación correcta del gen de apoptina bajo la regulación del CMV. Este vector de transferencia se ha nombrado pAdApt-Apoptina. Como un vector de transferencia de adenovirus de control, negativo, se seleccionaron los plásmidos, que contienen el gen de apoptina en la orientación errónea, opuesta al promotor de CMV y se nombran AdApt-AS. Luego, los vectores de adenovirus recombinantes que expresan el gen de apoptina bajo la regulación del promotor CMV se generaron. Además, también el adenovirus de control que tiene el gen de apoptina en la orientación opuesta con relación al promotor de CMV se elaboró. Para este fin, se co-transfectaron células PER.C6 (IntroGene, Leiden, Los Países Bajos) con el plásmido pAd5AlfII-ITR (El-, E3+) de vector de adenovirus y con los plásmidos de transferencia pAdApt-Apoptina o pAdApt-AS. Después de la observación de los efectos cito-patógenos de las PER.C6 transfectadas, el medio que contiene los vectores recombinantes de adenovirus se recolectó y se purificó en placa (Noteborn y Pietersen, 1998). Los varios lotes de adenovirus recombinantes, purificados en placa, AdApt-Apoptina que codifica para la apoptina y el vector de control AdApt-AS se examinaron por análisis de PCR para la presencia del gen de apoptina en la orientación "correcta" contra la orientación "errónea", respectivamente (Pietersen et al., 1999). Todos los lotes de adenovirus recombinantes analizados (en total para cada tipo de vector al menos 10) , contuvieron el gen de apoptina esperado. El análisis por RCA por medio de PCR (Pietersen et al., 1999) reveló que en todos los lotes analizados no se generó un adenovirus competente en la replicación. Finalmente, la producción de la proteína a apoptina por células HepG2 humanas infectadas con-. AdApt se examinaron por medio de la inmunofluorescencia indirecta usando el anticuerpo monoclonal 111.3 (Noteborn y Pietersen, 1998). Las células mostraron casi todas que producen la proteína apoptina y llegan a ser muy apoptóticas muy pronto después de la infección. Este hallazgo es indicativo para el hecho que la apoptina producida es completamente activa como un inductor apoptótico. Como se espera, todas las células infectadas con AdApt-AS no tiñeron para el anticuerpo monoclonal y no llegaron a ser apoptóticas. En conclusión, el hecho que fue capaz de producir apoptina por medio de varios vectores recombinantes de adenovirus, ya sea bajo la regulación del adenovirus MLP o del promotor CMV, indican que la apoptina se puede producir en cualquier vector adenoviral sin limitar la producción del vector de virus. La infección de los FLS de RA "estimulados con suero", derivados del paciente "E" de RA, con AdApt-Apoptina dio por resultado una inducción significativa de muerte celular como se ha descrito anteriormente para el vector recombinante de adenovirus AdMLP-vp3. Por lo tanto, se puede concluir que además del vector recombijia-?rt-e ríe adenovirus AdMLP-vp3 también se pjaede'isár otro vector de adenovirus que exprese el gen de apoptina tal como el adenovirus recombinante AdApt-Apoptina como el vector de adenovirus como la base para una terapia contra enfermedades auto-inmunitarias tal como RA.

Ensayo de diagnóstico para células de enfermedad auto-. inmunitaria en base a la rAd-apoptina Un marcador para las células relacionadas con la enfermedad auto-inmunitaria es la respuesta a la apoptosis inducida por apoptina. Especialmente, la estimulación de estas células con factores relacionados a las enfermedades auto-inmunitarias, tal como ciertas citocinas y factores de crecimiento, dará por resultado la muerte celular programada inducida por síntesis de apoptina. Adicionalmente, otro marcador es la localización celular de la apoptina, que es diferente para las células sensibles a apoptina relacionadas a la enfermedad auto-inmunitaria en comparación a las células saludables normales. Al infectar células con un vehículo que expresa apoptina, tal como un adenovirus recombinante que regula la síntesis de apoptina, y al analizar la localización celular de apoptina y/o inducción de apoptosis dentro de estas células, se es capaz de probar si una célula se deriva de 5 un paciente que sufre una enfermedad auto-inmunitaria, o no. Especialmente, en la estimulación "por suero" se incrementará significativamente la localización de la apoptina nuclear y la inducción de la apoptosis. Por ejemplo, las células se infectan con un 10 adenovirus que expresa apoptina y en paralelo con un adenovirus de control, tal como AdLacZ. Las células se verificarán para la apoptina en el citoplasma o en el núcleo (células relacionadas al proceso autoinmunitario) por medio de por ejemplo un ensayo de inmunofluorescencia 15 basado en anticuerpos monoclonales específicos para apoptina, tal como 111.3 (Danen-Van Oorschot et al., 1998). Además, o en cambio, se estimará el porcentaje de células apoptóticas. Si el porcentaje de células apoptóticas es significativamente mayor para las células que sintetizan 20 apoptina en comparación a las células que contienen una proteína de control exógena, tal como beta-galactosidasa, estas células se derivan de pacientes que sufren una enfermedad auto-inmunitaria. 25 adtfM ttiiUíknáHi^. Ensayo de diagnóstico para la identificación de factores que provocan enfermedades auto-inmunitarias Además de los cambios intrínsecos de las células de las enfermedades auto-inmunitarias, la secreción de 5 varios factores por estas células y más probablemente por otras células (inmunitarias) incrementará la severidad de la enfermedad auto-inmunitaria, tal como RA. Por lo tanto, el ensayo y diagnostico descrito anteriormente para la identificación de las células 10 relacionadas a las enfermedades autoinmunitarias, también se puede usar para la identificación de factores, que provocan y/o mejoran la "agresividad" de las células que provocan signos clínicos de RA u otras enfermedades autoinmunitarias. 15 En el tratamiento con este factor, las células tal como los sinoviocitos tipo fibroblasto, humanos, (RA) , sufrirán una apoptosis extensiva inducida por apoptina y/o tienen apoptina en su núcleo. La apoptosis inducida por apoptina es indicativa 20 de las condiciones tipo transformadas dentro de células relacionadas a las enfermedades auto-inmunitarias. El hecho que al apoptina puede inducir apoptosis en los FLS de RA ("estimulan") indica que estas células están en la condición transformada. De esta manera, la 25 apoptina se probó que no induce apoptosis en células M? mi i tieUmMM normales no transformadas, que fueron de origen humano o de mamífero (Danen-Van Oorschot et al., 19997, Noteborn et al., 1998b, Zhang et al., 1999). Estos datos se fortalecen por el hecho que los ratones transgénicos, que expresan 5 apoptina en varios de sus tejidos, se miran normales. Ninguno de estos órganos parece sufrir apoptosis intensificada, debido a la síntesis de apoptina en sus células. (Noteborn y Erkeland, resultados no publicados). La inducción con UV de procesos anormales 10 relacionados al esfuerzo o tensión en células normales no transformadas, derivadas de individuos con síndromes propensos a cáncer, sin embargo, permite que la apoptina induzca apoptosis en estas células (Zhang et al., 1999) durante un periodo momentáneo. La apoptina no induce 15 apoptosis en células tratadas con UV de individuos saludables. La apoptina puede inducir apoptosis más bien ^ moderadamente en los FLS de RA. Por ejemplo, la estimulación sérica de los FLS de RA incrementa el nivel de la apoptosis inducida por apoptina en, es decir, los FLS de 20 RA. Parece que estos FLS de RA son ya diferentes de las células saludables normales, pero llegan a ser aún más anormales (transformados) después de la "estimulación". Estas características se asemejan a aquellas descritas para las células tratadas con UV derivadas de individuos 25 propensos a cáncer (Zhang et al., 1999). En ambos casos, ^^i^^^^^^^^^^ se ha cambiado un proceso celular, que bajo condiciones "normales" se pueden manejar por la célula, pero en el estimulo específico dará por resultado procesos celulares anormales que conducen al desarrollo acelerado de cáncer o enfermedades auto-inmunitarias. Las FLS reumatoides aparecen frecuentemente y se comportan tipo fibroblastos normales, que han conducido a la noción que responden a su ambiente—en lugar""de -actuar"" como agresores independientes (siendo transformados) . Sin embargo, alguna evidencia fragmentaria se ha proporcionado de que también exhiben características de células transformadas. Por ejemplo, se requiere en general la adherencia a la matriz plástica o extracelular para los fibroblastos normales para que proliferen y sobrevivan en cultivo durante periodos prolongados de tiempo. Sin embargo, las células transformadas pueden crecer en suspensión en un medio semisólido sin contacto con una superficie sólida. En tanto que los FLS crecen típicamente y prosperan bajo condiciones que permiten la adherencia, pueden, en algunas circunstancias proliferar de una manera independiente de la fijación (Lafyatis et al., 1989). Adicionalmente, la expresión de varios oncogenes tal como c-myc se ha reportado para los FLS cultivados (Gay y Gay, 1989) . Una liberación endógena mayor de factores de crecimiento tal como el factor-beta de crecimiento de tumor y otras citocinas también se ha descrito para los FLS (Bucala et al., 1991; Rammers et al., 1990; Geiler, 1994; Firestein, 1995 y 1995a) . También, en algunos casos, se ha relacionado el supresor de tumor p53 no funcional con la RA (Aupperle et al., 1998). Aunque el p53 mutante no es un oncogen, previene la inducción de apoptosis por agentes endógenos o exógenos diferentes de la apoptina. Todos estos datos indican que los FLS se alteran irreversiblemente en la RA y que un proceso autónomo les permite permanecer activados aún después de la remoción de su milieu inflamatorio articular (Firestein, 1995) . Se ha proporcionado evidencia que la apoptina puede reconocer estas condiciones autoinmunitarias tipo transformadas, que permiten la identificación de los factores celulares que son importantes en estas enfermedades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la representación esquemática de las partes esenciales del adenovirus recombinante AdMLP-vp3 , que contiene el gen que codifica para apoptina, bajo la regulación del promotor tardío principal, adenoviral. La Figura 2 muestra la representación esquemática del efecto citotóxico inducido por apoptina en sinoviocitos tipo fibroblasto (FLS) cultivados, derivados del sinovio de un paciente que sufre de artritis reumatoide. Se cultivaron 1.5 x 104 células en cajas de 24 cavidades durante 24 horas, infectadas con adenovirus recombinante AdLacZ que expresa beta-galactosidasa (LacZ) , con AdMLP-vp3 que codifica para apoptina (apoptina) o infectados en falso (NON) . Los FLS se cultivaron bajo condiciones normales (NST) ó 1 día después de la infección, se estimularon con suero humano normal al 40% (ST) que induce un crecimiento más agresivo de los FLS, que asemeja la situación de RA in vi tro . Finalmente, seis días después de la infección con el virus de adenovirus o infección en falso, las monocapas celulares se fijaron y tiñeron con solución de GIEMSA (+: representa una cantidad de células vivas/unidas; -; significa ninguna célula sobreviviente/unida) . , *?l?ítíSma REFERENCIAS 1. Arends, M.J., and Wyllie, A.H. 1991. Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. International Rview of Experimental Pathology 32, 223-254. 2. Aupperle, K.R., Boyle, D.L., Hendrix, M., Seftor, E.A., Zvaifler, N.J., Barbosa, M., and Firestein, G.S. Regulation of synoviocyte proliferation, apoptosis, and invasión by the p53 tumor-suppressor gene. (1998). American J. Pathology 152, 1091-1098. 3. Bischoff, J.R., Kirn, D.H., Williams, A., Heise, C, Horn, S., Muña, M. , Ng, L., Nye, J. , Sampson-Johannes, A., Fatteay, A., and McCormick. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. (1996). Science 274, 373-376. 4. Breedveld, F. New insights in the pathogenesis of Rheumatoid arthritis. (1998). The J. of Rheumatology 25, 3-7. 5. Bucala, R., Ritchlin, C, Winchester, R., Cerami, A. Constitutive production of inflammatory and mitogenic cytokines by rheumatoid synovial fibroblasts. (1991). J. Experimental Medicine 173, 569-574. 6. Conway, J.G., Wakefield, J.A. , Brown, R.H., Marrón, B.E., Sekut, L., Stimpson, S.A., McElroy, A., Menius, J.A., Jeffreys, J.J., Clark, R.L., McGeehan, G.M., and Conolly, K.M. Inhibition of cartilage and bone destruction in adjuvant arthritis in the rat by a matrix metalloproteinase inhibitor. (1995). J. Experimental Medicine 182, 449-457. 7. Danen-Van Oorschot, A.A.A.M., Den Hollander, A., Takayama, S., Reed, J.C., Van der Eb, A.J., 5 and Noteborn, M.H.M. Bag-1 inhibits p53-induced apoptosis but not apoptin-induced apoptosis. (1997). Apoptosis 2, 395-402. 8. Danen-Van Oorschot A.A.A.M., Fischer D., Grimbergen J.M., Klein B., Zhuang S.-M., Falkenburg J.H.F., 10 Backendorf C, Quax P.H.A., Van der Eb A.J., Noteborn M.H.M. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. (1997a). Proceedings National Academy Sciences, USA 94: 5843-5847. 9. Danen-van Oorschot, A.A.A.M., van der Eb, 15 A.J., and Noteborn, M.H.M. Apoptin-induced apoptosis: antitumor potential? (1998) . In: Proceedings of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences Pharmaceutical Intervention in apoptotic pathways, pp 199-212. 10. Gay, S. and Gay, R.E. Cellular basis and 20 oncogene expression of rheumatoid joint destruction. (1989). Rheumatology International 9, 105-113. 11. Geiler, T., Kriegsmann, J. , Keyzer, G.M. , Gay, R.E., Gay, S. A new model for rheumatoid arthritis generated by engraftment of rheumatoid synovial tissue and 25 normal human cartillage into SCID mice. (1994) . Arthritis »^&^a¿«fe^..

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. ^^^^^^^

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención cerno antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Uso de un agente inductor de apoptosis, que 5 exhibe su efecto en células anormales comprendidas o relacionadas a enfermedades (auto) inmunitarias, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos inflamatorios.
2. 2. Uso de un agente inductor de apoptosis, que 10 exhibe su efecto en células anormales comprendidas o relacionadas a enfermedades (auto) inmunitarias, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias .
3. 3. Uso de un agente inductor de apoptosis según 15 la reivindicación 2, en donde el tratamiento de enfermedades inmunitarias es el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias .
4. 4. El uso de un vehículo de distribución génica que comprende un gen capaz de expresar un agente inductor 20 de apoptosis, que exhibe su efecto en células anormales comprendidas con, o relacionadas a enfermedades (auto) inmunitarias, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos inflamatorios.
5. 5. El uso de un vehículo de distribución génica 25 que comprende un gen capaz de expresar un agente inductor de apoptosis, que exhibe su efecto en células anormales comprendidas con, o relacionadas a enfermedades (auto) inmunitarias, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunitarias. 5
6. 6. El uso de un vehículo de distribución génica según la reivindicación 5, en donde el tratamiento de enfermedades inmunitarias es el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias .
7. 7. El uso según cualquiera de las 10 reivindicaciones 4-6, en donde el vehículo de distribución génica comprende además un gen suicida.
8. 8. El uso según la reivindicación 7, en donde el gen suicida es inducible.
9. 9. El uso según cualquiera de las 15 reivindicaciones 4-8, en donde el vehículo de distribución génica tiene un tropismo para células hematopoyéticas.
10. 10. El uso según la reivindicación 4-8, en donde el vehículo de distribución génica tiene un tropismo para los sinoviocitos tipo fibroblastos. 20 áj& kmámu ¿^MtlMI