DE19704979A1 - Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen - Google Patents
Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane hämatopoetische StammzellenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen retroviralen Vektor für den
Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane
hämatopoetische Stammzellen zur Behandlung des multiplen
Myeloms. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die
Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Das multiple Myelom, oder auch Plasmozytom, ist eine
unheilbare maligne Erkrankung der Antikörper-sezernierenden
B-Zelle mit einer jährlichen Inzidenz von 4 Neuerkrankungen
pro 100 000 Einwohner in Deutschland Hauptlokalisation der
Plasmazytomzellen sind Knochen und Knochenmark, wo sie zu
Osteolysen bzw. Verdrängung der Hämatopoese, mit den Folgen
Anämie, Leukozytopenie und Thrombozytopenie führen. Trotz
der Einführung unterschiedlicher Polychemotherapieprotokolle
und der Strahlentherapie besteht für das multiple Myelom
nach wie vor kein kurativer Ansatz. Die mittlere
Überlebenszeit nach Erkrankungsbeginn beträgt 3 Jahre (W.
Siegenthaler et al., Lehrbuch der inneren Medizin, 3.
Auflage (1992), S. 723-727).
In den letzten Jahren konnte mit Interleukin-6 (IL6) ein
Zytokin charakterisiert werden, das für das Wachstum von
Plasmazytomzellen von entscheidender Bedeutung ist. So
konnte vor kurzem gezeigt werden, daß es nicht möglich
ist, bei transgenen IL6 "knock-out" Mäusen, also Mäusen,
die kein funktionelles IL6 Gen mehr besitzen,
Plasmozytome zu induzieren oder bereits etablierte
(syngene) Plasmozytomzellen zu propagieren, während dies
bei nicht-"knock-out" Mäusen ohne weiteres möglich war.
(Hilbert, D.M., M. Kopf, B.A. Mock, G. Köhler, and S.
and Rudikoff. 1995. Interleukin-6 is essential for in
vivo development of B neoplasms. J. Exp. Med.: 182:
243-248). Erste klinische Einsätze von IL-6-
neutralisierenden Antikörpern führten zu vorübergehenden
partiellen Remissionen (Klein, B., Wÿdenes, J., Zhang,
X.G., Jourdan, M., Boiron, J.M., Brochier, J., Liautard,
J., Merlin, M., Clement, C., Morel-Fournier, B. et al.
1991. Murine anti-interleukin-6 antibody therapy for a
patient with plasma cell leukemia. Blood. 78:
1198-1204.3). Allerdings ist aufgrund der hohen lokalen IL6-
Konzentration im Knochenmark nicht zu erwarten, daß die
systemische Gabe von Antikörpern zu einer ausreichenden
Antagonisierung führt, so daß klinische Versuche in
dieser Richtung keinen Erfolg versprechen.
Die Erfindung hat das Ziel, eine gentherapeutische
Strategie zur Bekämpfung des multiplen Myeloms mit Hilfe
von IL6-Antagonisten zu entwickeln. Mit dieser Strategie
soll erreicht werden, daß die biologisch wirksame
Konzentration dieses Antagonisten im Knochenmark bei
einer klinischen Anwendung ausreichend hoch ist, um das
vorhandene IL6 zu neutralisieren.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen
Vektor zu konstruieren, der nach Transfer in autologe
hämatopoetische Stammzellen einen geeigneten IL6-
Antagonisten stark und stabil zur Expression bringt.
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die
Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Wesentliche Basis der Erfindung ist ein retroviraler
Ausgangsvektor, bevorzugt ein MoMLV-Derivat, besonders
bevorzugt der Vektor pSF1N, der für den Gentransfer in
hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen eine
besonders hohe Expressionsstärke zeigt. In diesen Vektor
wird mit in der Gentechnik an sich bekannten Methoden
das Gen eines IL6-Antagonisten und ein Suizid- bzw. ein
Selektionsgen eingebaut. Als Suizidgen sind vor allem
das Thymidinkinasegen und das Cytosin-Desaminasegen
geeignet. Als Selektionsgen werden bevorzugt das
Puromycin-, das Neomycin-Acetyltransferasegen oder das
mdr-1-Gen eingesetzt.
Das Gen des IL6-Antagonisten und das Suizid- bzw.
Selektionsgen liegen bevorzugt auf derselben mRNA,
werden also von demselben für Stammzellen besonders
geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und
werden dennoch getrennt translatiert. Somit könnten im
Falle des Suizidgens bei unvorhergesehenen
Nebenwirkungen des therapeutischen Gens, z. B. auf die
normale Hämatopoese des Patienten, gezielt diejenigen
Zellen abgetötet werden, die den IL6-Antagonisten
produzieren. Im Falle des mdr-1-Gens werden Stammzellen,
die unter dem Selektionsdruck einer Chemotherapie hohe
Mengen an mdr-1 produzieren, auch gleichzeitig große
Mengen IL6-Antagonist exprimieren.
Von besonderer Bedeutung für die Wirkung des Vektors ist
die Auswahl des IL6-Antagonisten. Grundsätzlich können
alle bekannten IL6-Antagonisten eingesetzt werden,
bevorzugt sind jedoch an bis zu 20 Kodons gegenüber dem
humanen Interleukin-6 mutierten Antagonisten.
Eine wichtige Ausführungsform des Vektors ist die
Einfügung des Gens des an 7 Kodons mutierten IL6-
Antagonisten folgender Sequenz (Mutationen sind durch
kleine Buchstaben gekennzeichnet):
Eine weitere wichtige Ausführungsform ist ein an 12
Kodons Mutationen enthaltender IL6-Antagonist
(zusätzlich myc-Tag) folgender Sequenz (Mutationen sind
durch kleine Buchstaben gekennzeichnet):
Eine bevorzugte Kombination der Merkmale des Vektors ist
die Verwendung
- - des retroviralen Ausgangsvektors pSF1N,
- - des Gens des an 7 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten der Sequenz "Gen 1"
- - und eines Suizid- bzw. Selektionsgens.
Eine weitere wichtige Kombination ist ein Vektor
- - pLXSN als retroviralem Ausgangsvektor,
- - dem "Gen 2" als IL6-Antagonisten,
- - dem Gen für Neomycin-Acetyltransferase als Selektionsgen und
- - dem Simian Virus 40 early Promotor (SV40) als internem Promotor zur Transkription des Selektionsgens im Ausgangsvektor.
Der Aufbau der erfindungsgemäßen Vektoren ist in den
Abb. 1 und 2 schematisch dargestellt.
Die Verpackung des Vektors erfolgt mit Hilfe bekannter
viraler Vektor-Verpackungslinien, welche nicht
replikationsfähige Retroviren generieren können. Die
Auswahl der verwendeten Virushülle hat erhebliche
Auswirkungen auf die Effizienz des Gentransfers.
Besonders geeignet sind die Linien FLY13 und GP+envAm12.
Die Anwendung des Vektors erfolgt in der Weise, daß
hämatopoetische Stammzellen aus peripherem Blut bzw.
Knochenmark von Patienten durch Zytokin stimuliert
werden, der Transfer des Vektors in diese Stammzellen
erfolgt und sie anschließend, bevorzugt durch
intravenöse Injektion, wieder in den Patienten
zurückgegeben werden. Da hämatopoetische Stammzellen nach
systemischer Gabe bevorzugt im Knochenmark ′homen′, ist
die Expression des IL6-Antagonisten in diesem Organ
gesichert.
Der erfindungsgemäße Vektor hat eine hohe Gen
expressionsrate in hämatopoetischen Stammzellen und ist
dadurch effektiv einsetzbar. Er ermöglicht einen
kurativen Ansatz zur Behandlung des multiplen Myeloms,
der bisherigen Therapieverfahren potentiell überlegen
ist.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Anwendungsbeispiele
näher erläutert werden.
- 1) Die cDNA des in der Literatur beschriebenen humanen IL6- Antagonisten wurde mittels RT-PCR hergestellt. Es wurden dabei auf Grundlage der humanen Interleukin-6 Sequenz Punktmutationen eingeführt, die zu folgenden sieben Aminosäuren-Austauschen führen: Pos 31 (Aspartat für Tyrosin), Pos 35 (Phenylalanin für Glycin), Pos 118 (Arginin für Serin), Pos 121 (Aspartat für Valin), Pos 175 (Isoleucin für Glutamin), Pos 176 (Arginin für Serin), Pos 183 (Alanin für Glutamin) Lit.: Savino, R., Ciapponi, L., Lahm, A., Dematis, A., Cabibbo, A., Toniatti, c., Delmastro, P., Altamura, S., and Ciliberto, G. 1994. Rational design of a receptor super-antagonist of human IL-6. EMBO.J. 13: 5863-5870.
- 2) Die cDNA des IL6-Antagonisten wurde im nächsten Schritt in den von Baum et al. beschriebenen retroviralen Vektor pSF1N( Baum, C., Hegewisch.Becker, S., Eckert, H-G., Stocking, C., and Ostertag, W. 1995. Novel retroviral vectors for efficient expression of the multidrug resistance (mdr-1) gene in early hematopoietic cells. LT. Virol. 69: 7541-7547; Patentanmeldung PCT/EP95/03175) kloniert. Dieser Vektor ist ein MoLMV- Derivat und enthält regulatorische Elemente der Viren FUCF und MESV , die dazu führen, daß die mit diesem Vektor pSF1N transferierten Gene besonders stark in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert werden. Dieser Vektor ist daher in Bezug auf Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen bisherigen Vektoren überlegen und daher für einen möglichen gentherapeutischen Einsatz des IL6-Antagonisten in hämatopoetische Stammzellen besonders geeignet. Um den Il6-Antagonisten von endogenem IL6 unterscheiden zu können, wurde der Antagonist mit einem myc-Tag ausgestattet. Auf diese Art und Weise ist es leicht möglich, die IL6-Antagonisten-Expression im Serum oder Knochenmark des Patienten mittels immunologischer Methoden (z. B. ELISA) nachzuweisen. Das Neomycin- Resistenzgen im pSF1N wurde durch ein Puromycin- Resistenzgen ersetzt und über eine IRES Sequenz mit dem IL6-Antagonisten verbunden. Der neue durch den Einbau des IL6-Antagonisten resultierende Vektor wird pSF-IL- 6AP bezeichnet.
- 3) Um den Vektor für eine mögliche therapeutische Anwendung am Menschen sicherer zu machen, wurde in einem weiteren Schritt ein Suizidgen, die Herpes simplex Thymidinkinase, in den Vektor eingebaut. Dies ermöglicht die Abtötung der durch den Vektor genmodifizierten Zelle im Patienten durch die systemische Gabe von Ganciclovir. Um die gleichzeitige Expression von IL6-Antagonist und Tk-Gen zu gewährleisten, wurden beide cDNAs im Vektor über eine IRES (Inter-Ribosomale-Erkennungsstelle) Sequenz verbunden. Auf diese Art und Weise liegen beide Gene auf derselben mRNA , werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit könnten im Falle unvorhergesehener Nebenwirkungen des therapeutischen Gens z. B. auf die normale Hämatopoese des Patienten gezielt diejenigen Zellen abgetötet werden, die den IL6- Antagonisten produzieren. Der neue durch den Einbau des Tk-Suizidgens resultierende Vektor wird pSF-IL-6AT bezeichnet.
- 4) Um eine in vivo Selektion von Stammzellen erzielen zu können, wurde das Multidrug Resistenzgen (mdr-1) zusätzlich in den Vektor eingebaut. Auf diese Art und Weise können durch eine Chemotherapie, die im Rahmen der konventionellen Plasmozytomtherapie angewendet wird, diejenigen Stammzellen im Patienten angereichert werden, die auch den IL6-Antagonisten tragen. Dies würde zur Erhöhung der IL6-Antagonisten-Konzentration im Patienten führen und die therapeutische Wirksamkeit des Vektors erhöhen. Um die gleichzeitige Expression von IL6- Antagonist und mdr-1-Gen zu gewährleisten, wurden beide cDNAs im Vektor über eine IRES (Inter-Ribosomale- Erkennungsstelle) Sequenz verbunden. Auf diese Art und Weise liegen beide Gene auf derselben mRNA , werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit werden Stammzellen, die unter dem Selektionsdruck einer Chemotherapie hohe Mengen an mdr-1 exprimieren auch gleichzeitig große Mengen IL6- Antagonist exprimieren. Der neue durch den Einbau des mdr-1-Gens resultierende Vektor wird pSF-IL- 6AN bezeichnet.
- 5) Die Vektor-DNA wird mit Hilfe der retroviralen Verpackungszellinien FLY13 und FLYRD18 zu Viren verpackt. Diese Verpackungslinien haben den Vorteil, daß sie wesentlich höhere (10-100fach) Virustiter erzeugen als bislang verwendete Linien (Cosset et al., Journ. Virol. 69: 7430-36, 1995). Dies führt zu einer Verbesserung der Gentransfereffizienz in hämatopoetische Stammzellen. Ein weiterer Vorteil dieser Linien besteht darin, daß sie virale Vektoren produzieren, die in humanem Serum stabil sind. Da bei einer klinischen Anwendung der Gentransfer in humanem Serum als Kultivierungsmedium durchgeführt werden muß, sind diese Verpackungslinien für diesen Zweck sehr gut geeignet . . Beim Gentransfer in primäre hämatopoetische Stammzellen wird der virushaltige Überstand der Verpackungslinien verwendet. Die Stammzellen werden vorher 24 Stunden mit einem Zytokin-Cocktail (Brugger et al., Blood 81: 2579-84, 1993) behandelt. Danach wird der Virusüberstand dazugegeben und für 48 Stunden kultiviert. Die führt zu einer Gentransfereffizienz von 10-20%.
- 6) Die Anwendung der Erfindung ist vor allem zur Behandlung des multiplen Myeloms vorgesehen. Da gezeigt wurde, daß das Zytokin IL6 ein essentieller Wachstumsfaktor für Plasmotytomzellen ist und der Entzug dieses Faktors zum Absterben der malignen Zellen führt, stellt die Expression hoher Konzentrationen des IL6-Antagonisten im Knochenmark mittels Gentransfer in Stammzellen einen kurativen Ansatz zur Behandlung des multiplen Myeloms dar und ist deshalb bisherigen Therapieverfahren potentiell überlegen.
- 1. Die c-DNA des Sant 7 ( = "Gen 2") (Lit. Sporeno et al.,
Blood, Vol. 87 (1996), S. 4510-4519) wurde, wie bereits im
Beispiel I beschrieben, mit Hilfe einer RT-PCR mit mutagenen
Primern konstruiert. Dadurch entstehen zusätzlich zu den im
Beispiel I aufgeführten Änderungen folgende Aminosäure-
Austausche:
Pos. 57 (Aspartat für Leucin), Pos. 59 (Phenylalanin für Glutamat), Pos. 60 (Tryptophan für Asparagin). Pos. 75 (Tyrosin für Glutamin), Pos. 76 (Lysin für Serin)
Die Schritte 2-4 erfolgen analog Beispiel I. - 5. Die Vektor-DNA wird mit Hilfe der retroviralen Verpackungslinie GP+envAm12 (Markowitz et al., Virology 167, 400-406, 1988) zu Viren verpackt. Diese Verpackungslinie hat den Vorteil, daß
- - die Titer nicht wesentlich unter denen der Fly liegen
- - die hier verwendete Virushülle besonders zur Infektion hämatopoetischer Stammzellen geeignet ist (Xu et al., Exp.- Hematology 22(2), Feb 223-30, 1994).
Die weitere Bearbeitung erfolgt gemäß Beispiel I.
Diese zusätzlichen 5 Mutationen im Interleukin 6 Molekül
erhöhen die Wirksamkeit des IL6 Rezeptor-Antagonisten etwa
um Faktor 60 (Sporeno et al.). Die nun verbesserte
Antagonisten-Version kann nun analog Beispiel I in den oben
aufgeführten Vektoren zum Einsatz kommen, wobei Position und
Größe des IL-6 Rezeptorantagonisten innerhalb des
Konstruktes unverändert bleiben.
Ein weiterer Vorteil der Anwendung des Sant 7 ist die
Tatsache, daß für diese Variante zum jetzigen Kenntnisstand
jede biologische Restaktivität am IL-6 Rezeptor
ausgeschlossen werden kann, was für andere Ausführungen
nicht gewährleistet sein muß.
Die c-DNA der in Beispiel I und II eingesetzten IL-6-
Antagonisten ("Gen 1" und "Gen 2") wurde in den retroviralen
Vektor pLXSN, ebenfalls ein MoMLV-Derivat, kloniert. Dieser
Vektor enthält außer dem viralen Vektor LTR noch einen
weiteren internen Promoter (SV 40 oder CMV) für die
unabhängige Transkription des Resistenzgens, in diesem Fall
das Gen für die Neomycin-Resistenz. Diese bewährte
Vektorkonstruktion erlaubt die in-vitro-Selektion
infizierter Stammzellen mittels Neomycin oder Neomycin-
Analoga und wurde schon mit Erfolg in mehreren Stammzell-
Gentherapiestudien eingesetzt (z. B. Xu et al., Experimental
Hematology 22: 223-230 (1994)), so daß die Funktion dieses
Vektors im oben genannten System gesichert ist, auch wenn er
nicht speziell für hohe transkriptionelle Aktivität in
humanen hämatopoetischen Stammzellen ausgelegt ist.
Die Verpackung dieser retroviralen Vektoren erfolgt analog
zu Beispiel I und II in den dort verwendeten
Verpackungszellinien, auch das Infektionsprotokoll ändert
sich nicht (mit Ausnahme der Verwendung von Neomycin als
Selektionsantibiotikum).
Claims (19)
1. Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6-
Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen,
bestehend aus
- - einem retroviralen Ausgangsvektor,
- - dem Gen eines IL6-Antagonisten,
- - einem Suizid- bzw. Selektionsgen
- - und ggf. Promotoren zur Transkription der Suizid bzw. Selektionsgene.
2. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein
MoMLV-Derivat als retroviralen Ausgangsvektor.
3. Vektor nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch
den retroviralen Ausgangsvektor pSF1N.
4. Vektor nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch
den retroviralen Ausgangsvektor pLXSN.
5. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Gen eines an bis zu 20 Kodons gegenüber dem humanen
Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten eingesetzt
wird.
6. Vektor nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet,
daß das Gen eines an 5-10 Kodons gegenüber dem humanen
Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten eingesetzt
wird.
7. Vektor nach Anspruch 1, 5 und 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Gen des an 7 Kodons gegenüber
dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten
folgender Sequenz eingesetzt wird:
8. Vektor nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Gen eines an 12 Kodons gegenüber dem humanen
Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten (zusätzlich
myc-Tag) eingesetzt wird:
9. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das
Thymidinkinasegen als Suizidgen.
10. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das
Cytosin-Desaminasegen als Suizidgen.
11. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das
Puromycingen als Selektionsgen.
12. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das
mdr-1-Gen als Selektionsgen.
13. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das
Neomycin-Acetyltransferasegen als Selektionsgen.
14. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die viralen immediate-early-Promotoren des humanen
Zytomegalievirus (CMV) und Simian Virus 40 early
Promotor (SV40) als interne Promotoren zur Trans
kription der Suizid- bzw. Resistenzgene in den Ausgangs
vektoren eingesetzt werden.
15. Vektor nach Anspruch 1 bis 3, 6, 7 und 9-13,
gekennzeichnet durch
- - den retroviralen Ausgangsvektor pSF1N,
- - das Gen des an 7 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten der Sequenz "Gen 1"
- - und einem Suizid- bzw. Selektionsgen.
16. Vektor nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 8 und 14,
gekennzeichnet durch
- - den retroviralen Ausgangsvektor pLXSN,
- - das Gen des an 12 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL 6-Antagonisten der Sequenz "Gen 2",
- - dem Gen für Neomycin-Acetyltransferase als Selektionsgen,
- - dem viralen Simian Virus 40 early Promotor (SV40) als interner Promotor zur Transkription des Selektionsgens im Ausgangsvektor.
17. Vektor nach Anspruch 1-3, 5, 8 und 9-14,
gekennzeichnet durch
- - den retroviralen Ausgangsvektor pSF1N,
- - das Gen eines an 12 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten der Sequenz "Gen 2",
- - und einem Suizid- bzw. Selektionsgen.
18. Vektor nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet,
daß das Gen des IL6-Antagonisten und das Suizid- bzw.
das Selektionsgen auf derselben mRNA, getrennt durch
eine interribosomale Erkennungsstelle, angeordnet sind.
19. Verfahren zur Anwendung der Vektoren nach Anspruch
1-13, dadurch gekennzeichnet, daß hämatopoetische
Stammzellen aus peripherem Blut bzw. Knochenmark von
Patienten durch einen Zytokin-Cocktail stimuliert
werden, der Transfer des Vektors in diese Stammzellen
erfolgt und sie anschließend, bevorzugt durch
intravenöse Injektion, wieder in den Patienten
zurückgegeben werden.
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DE19704979A DE19704979A1 (de) | 1996-02-07 | 1997-01-29 | Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen |
Publications (1)
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DE19704979A Withdrawn DE19704979A1 (de) | 1996-02-07 | 1997-01-29 | Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen |
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